JPS6230963A - 遅延型固相免疫検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 本発明は、抗原／抗体免疫複合体がビオチン／アビジン
結合反応の利用により形成され単離される免疫検定法に
関する。

背景技術の簡キな説明 試料中の抗原物質又は抗体を検出するための免疫検定法
は周知である。例えば、チュー（’Ｃｈｕ）（米国特許
第’１．２ｇ９．７’ｌｔ号明細書）は、体液中の様々
な物質を検出するための免疫定量検定法（”サンドイン
チ検定法”としても知られている）について開示する。

チューの特許に記載された検定法は、様々な種由来の非
限定的ポリクローナル抗血清を利用して、特定の抗原物
質とのサンドインチ体を形成させるものである。サンド
イツチ体は、次いで、レクチン／糖結合反応を利用して
溶液から除去される。この分析では、レクチン又は糖が
結合した同相から免疫複合体を可逆的に遊離させるため
に、レクチン及び糖量の低い結合親和力を利用している
という特徴がある。この分析は、同時的、ゆ帰的及び前
進的な方法について記載されている。

ウォルターズ（Ｗｏｌｔｅｒｓ）らの米国特許第４４．
３４１３，１９４号明細書もサンドインチ検定法につい
て記載する。サンドイツチ体は、液相中で、特定の抗原
とその抗原に対する一種の抗体との間で形成される。こ
のうち１種が標識化された、これら４種の抗体と抗原と
の反応は、未標識種の抗体と反応して免疫複合体を形成
する第二の抗体（抗グロブリン）が結合した固相マトリ
ックスと接触させる前に、液相中で行なわせることがで
きる。

パリク（Ｐａｒｉｋｈ　）らの米国特許第？、、２９ｇ
、ＡＨ！ｆ号明細書では、ビオチン及びアビジンを用い
る非サンドイッチ検定法について記載されている。この
特許は、存在しているであろう抗原が、ビオチン化抗体
の結合部位に対して酵素標識化抗原と競合するような競
合検定法を開示する。これら試薬のインキュベート後、
液相はアビジンが結合した同相と接触せしめられて、液
相から抗体／抗原複合体が除去される。

サンドインチ免疫検定法のもう一つの例は、デビット（
Ｄａｖｌｄ　）らの米国特許第り、３り６７７０号明細
書に記載されている。そこに開示された検定法では、一
種の異なるハイプリドーマ由来の一種の異なるモノクロ
ーナル抗体を使用する。デビット法では、モノクローナ
ル抗体の７種を、均一相で使用するよりもむしろ、分析
操作中固相と結合させておくことが必要である。同相の
モノクローナル抗体／は、存在可能性のある抗原を検出
するために、液相と反応せしめられる。標識化された、
液相に可溶性のモノクローナル抗体コは、抗原存在下に
おいて、固相モノクローナル抗体１１抗原及び標識化モ
ノクローナル抗体−間でサンドインチ体を形成するよう
になる。

カッツ（Ｋａｔｚ）らの米国特許第’ｌ、１ＩｔＡＪ、
！’Ｉ号明細書は、ピオチン−アビジン反応を利用して
、抗体を固相基質に強固に結合せしめる方法について記
載する。この特許では、アビジン化された固相を特定の
抗原に対するビオチン化抗体で被覆すると開示している
。この抗体被覆同相は、次いで、特定の抗原を含有した
試料及び特定の抗原に対する可溶性標識化抗体と反応せ
しめられる。インキュベート後、同相と結合しているが
、又は溶液中に残存する標識化抗体が測定される。

ガラチ（Ｇａ１ｌａｔｌ）らの英国特許出願第ＧＢコ、
０９４１，７２７Ａ号明４１１＋書では、液相中におい
て、（ｉ）同一抗原のλつの異なる抗原決定基（エビト
ーカに対して特異的な一種のモノクローナル抗体、（２
）同一抗原に対するモノクローナル抗体及び別種ノポリ
クローナル抗体、並びに、（３）同一抗原の異なる抗原
決定基に対する一つの異なるポリクローナル抗体の間で
行なうことができるサンドイッチ検定法について記載し
ている。

アレルゲン特異性ヒ）　ＴｇＥを測定するための検定法
は、ベニッチ（Ｂａｎｎ１ｅｈ　）らの米国特許第３、
’１１０，７６０号明細書に開示されている。この特許
では、試料が、まず特定のアレルゲンと結合した固相に
接触せしめられ、しかる後ヒトＩｇＥに対する放射性ヨ
ウ素化抗グロブリンが加えられる検定法について記載す
る。

前記免疫検定法は一つの主なカテゴ’）　−１ｃ分類さ
れる。第一は、結合対の一つ、即ち抗原又は抗体が同相
と結合し、標識化された第二の結合相手物、通常は抗体
が液相中に存在する免疫検定法（デビソド、ベニツチ、
カッツ）である。試料が被検物質を含有している場合は
、固相の第一結合相手物、被検物質及び検出可能な標識
化第二結合相手物からなる複合体が形成される。第二の
カテゴリー（チュー、ウォルターズ、ガラナ）は、試料
が被検物質を含有する場合において、第一及び第二の結
合相手物がともに液相中で自由に反応して免疫複合体を
形成するような免疫検定法である。

この免疫複合体は次いで、免疫複合体を結合させること
かできるように修正された担体に結合相手物のいずれか
を結合せしめることによって、液相から除去される。最
初の段階では結合相手物が固相と結合していないこの第
二のタイプの免疫検定法は、本発明において遅延型固相
法（ＤＥＳＰ法）と呼ばれる。

従来のＤＥＳＰ検定法における主要な問題の一つは、系
が、第一及び第二の結合相手物として非限定的ポリクロ
ーナル抗体を液相中で使用して〜するということである
。その結果、これら一種の抗体集団が抗原上の同一結合
部位（抗原決定基）に対して溶液中で競合し合い、全体
の分析感度をよく低下させることがある。これら従来の
ＤＥＳＰ免疫検定法における他の間踊は、免疫複合体を
溶液から除去するために利用されるリガンド反応性が低
く、適度の親和性となるまでに達していないということ
である。

従来技術において述べられたＤＥＳＰ検定法は、いずれ
も、第一の結合相手物としてのモノクローナル抗体と、
限定的特異性をもつ別のモノクローナル抗体もしくはポ
リクローナル抗体である検出可能に標識化された第二の
結合相手物とを、液相から免疫複合体を除去するための
高親和性リガンドと一緒に使用する系については開示し
ていない。

発明の要旨 本発明では、ビオチン又はビオチン結合タンノくり質は
、分析の第一段階において、溶液中に残存する第一の結
合相手物と結合している。第一の結合相手物が液相中に
おいて被検物質及び第二σ）結合相手物と反応する前に
固定された状態で分析が行なわれた場合は、ビオチン化
された（又は、ビオチン結合タンパク質が結合した）第
一の結合相手物及び標識化された第二の結合相手物が溶
液中遊離した状態で被検物質と反応する場合よりも、分
析感度が著しく低下する。これらの試薬を遊離溶液中で
反応させると、反応剤が動力学的に同相に移動しなけれ
ばならない固相系の場合よりも、被検物質上の結合部位
に対する反応性及び立体化学的接近性の動力学の面を改
善することができる。

そこでは、ビオチン／アビジン反応における高度の親和
性及び特異性の活用が図られているのである。

このように、本発明は、試料中に存在する物質の測定方
法において、 （−）　　該物質を含有する該試料を：（ｉ）　　核物
質に対する第、−の免疫学的結合相手物（該第一の免疫
学的結合相手物はビオチン又はビオチン結合タンノくり
質と結合している）、（ｉｉ）　　該物質に対する第二
の免疫学的結合相手物（該第二の免疫学的結合相手物は
検出可能となるように標識化されている）、及び （ｉｉｉ）　　担体に結合したビオチン結合タンパク質
又はビオチン、 と接触せしめ； （ｂ）　　該物質、該第一の免疫学的結合相手物、該第
二の免疫学的結合相手物及び相体間で免疫複合体を形成
させるのに充分な時間と条件下とで、工程（ａ）の成分
を同時に又は別々にインキーベートシ： （Ｃ）　　該担体を試料から分離し：続いて（ｄ）　　
試料又は担体いずれかにおける検出可能に標識化された
第二の免疫学的結合相手物を測定する； ことからなり、 該第一の免疫学的結合相手物及び該抗体間の反応が、該
第一の免疫学的結合相手物及び該物質間で免疫複合体が
形成された後、又は実質上その形成と同時に起ぎること
を特徴とする方法を提供するものである。

本発明の一態様における、モノクローナル抗体及び標識
化された部位特異性ポリクローナル抗体を利用するＤＥ
ＳＰ検定法は、異なる抗原決定基に対してコ種の異なる
モノクローナル抗体を用いる類似検定法、あるいは、第
一及び第二の結合相手物としてポリクローナル抗体のみ
を用いる検定法よりも一層感受性が優れていることが見
出された。

同様の結論は、第一の試薬、即ち結合相手物が七ツクロ
ーナル抗体ではな（ａ例えばアレルゲンのような抗原で
あって、第二の結合相手物が被検抗体のクラスレベルに
対して特異的なポリクローナル抗体である反応について
も妥当する。

好ましい態様の説明 本発明の方法において、被検物質含有試料は、第一の結
合相手物、第二の結合相手物、及びビオチンもしくはビ
オチン結合タンパク質が結合した担体と接触せしめられ
る。被検物質は抗原又は抗体のいずれであってもよい。

第一及び第二の結合相手物は、両相平物がともに物質と
結合できるように、物質中の異なる部位と反応する。第
一の結合相手物はビオチン又はビオチン結合タンパク質
のいずれかと結合している。この第一の結合相手物は、
試料中の被検物質が抗原である場合は抗体であって、試
料中の被検物質が抗体である場合は抗体と結合可能な物
質である。第二の結合相手物は、試料中の被検物質に対
して特異的な、検出可能となるように標識化された抗体
である。担体は、第一の結合相手物がこれと結合するビ
オチン結合タンパク質を有している場合はビオチンと結
合し、又は、第一の結合相手物がそれと結合するビオチ
ンを有している場合はビオチン結合タンパク質と結合せ
しめられることになる。

ビオチンという用語は、例えばビオチンのＮ−ヒドロキ
シスクシンアミドエステルのようなビオチン誘導体をも
包含する、というように理解してもらいたい。ビオチン
結合タンパク質という用語はアビジン、ストレプトアビ
ジン等を包含する。

本発明の方法を利用した試料中の物質の測定は、様々な
態様で実施することかできる。

第一の態様では、試料は第一及び第二の結合相手物とイ
ンキュベートされる。インキュベートは、試料中の物質
並びに第一及び第二の結合相手物を反応せしめるために
要する時間の間継続される。

最初のインキュベート後、担体が反応混合物中に加えら
れ、次いで、担体及び第一の結合相平物間の結合を生じ
させるために要する時間の間インキュベートせしめられ
る。二回目のインキュベート後、担体は、非特異的に結
合した標識化抗体を除去するために洗浄される。担体と
結合したか又は試料中に残存した標識化抗体がしかる後
測定される。このような態様を実施する場合、その方法
は、更に詳しくは： （ａ）　　最初に、試料と第一及び第二の免疫学的結合
相手物との混合物を調製し、続いて、試料中の被検物質
が第一及び第二の免疫学的結合相手物と反応するために
要する時間及び条件下で混合物をインキュベートし； （ｂ）　　前記工程（＆）のインキュベート後、混合物
にビオチン又はビオチン結合タンパク質が結合した担体
を加え、担体及び第一の免疫学的結合相平物間で結合が
生じるために要する時間及び条件下で新しい混合物をイ
ンキュベートし；（ｃ）　　担体を混合物から分離し；
次いで（ｄ）　　担体と結合し、た第二の標識化結合相
手物を検出するか、あるいは、それとは結合していない
第二の結合相手物を検出する； ことからなる。

第二の態様では、試料はまず、ビオチン又はビオチン結
合タンパク質が結合した担体とインキュベートされ、し
かる後、第一及び第二の免疫学的結合相手物が加えられ
、インキュベートが行なわねる。このような態様を実施
する場合、その方法は、更に詳しくは： （＆）　　最初に、試料とビオチン又はビオチン結合タ
ンパク質が結合した担体との混合物を調製し；（ｂ）　
　工程ｔａ＋の混合物に第一及び第二の免疫学的結合相
手物を加え、しかる後、被検物質が両結合相手物と反応
し、かつ担体及び第一の結合相平物間で結合が生じるた
めに要する時間及び条件下で新しい混合物をインキュベ
ートし；（ｃ）相体を混合物から分離し；次いで（ｄ）
相体と結合した第二の標識化結合相手物を検出するか、
あるいは、それとは結合していない第二の結合相手物を
検出する； ことからなる。

第三のり！ミ様では、試料、ビオチン又はビオチン結合
タンパク質が結合した担体、並びに第一及び第二の免疫
学的結合相手物は同時にインキ−ベートされる。このイ
ンキュベートは、被検物質が第一及び第二の結合相手物
と反応し、かり担体及び第一の結合相手物量で結合が生
じるために要する条件及び時間下で行なわれる。

このような態様を実施する場合、その方法は、更に詳し
くは： （ａ）　　試料、ビオチン又はビオチン結合タンパク質
が結合した相体、並びに第一及び第二の免疫学的結合相
手物からなる混合物を同時に調製し；（ｂｌ　　工程（
ａ）の混合物を、被検物質が両結合相手物と反応し、か
つ担体及び第一の結合相手物量で結合が生じるために要
する時間及び条件下でインキュベートし； （Ｃ）　　担体を混合物から分離し；次いで（ｄ）　　
担体と結合した第二の標識化結合相手物を検出するか、
あるいは、それとは結合していない第二の結合相手物を
検出する； ことからなる。

第四の態様では、試料はまず、ビオチン又はビオチン結
合タンパク質が結合した１［を体、並びに第一の免疫学
的結合相手物と御粘に・インギーベートされる。担体は
次いで、ずべての未結合物質を除去するために洗浄され
る。第二の免疫学的結合相手物がしかる後加えられ、被
検物質及び第二の免疫学的結合相手物量で結合が生じる
ために要する時間の間インキュベートされる。このよう
な態様を実施する場合、その方法は、更に詳しくは：（
＆）　　最初に、試料と、ビオチン又はビオチン結合タ
ンパク質が結合した担体並びに第一の免疫学的結合相手
物との混合物を調製し、試料中の被検物質が第一の免疫
学的結合相手物と反応し、かつ担体及び第一の免疫学的
結合相手物量で結合が生じるために要する時間及び条件
下で混合物をインキュベートし； （ｂｌ　　工程（ａ）の混合物に第二の免疫学的結合相
手物を加え、被検物質が第二の免疫学的結合相手物と反
応するために要する時間及び条件下で新しい混合物をイ
ンキ−ベートし； （ｃ）　　担体を混合物から分齢し；次いで（ｄ）　　
相体と結合した第二の標識化結合相手物を検出するか、
あるいは、それとは結合していない第二の結合相手物を
検出する； ことからなる。

上記態様では、ビオチン又はビオチン結合タンパク質が
結合した担体を加える点において変更をしてもよいこと
が特ｄ己される。したがって、最初の態様では、担体及
び第一の免疫学的結合相手物は、第二の免疫学的結合相
手物が加えられる前に、試料に加えられてもよ（；第二
の態様では、担体及び第二の免疫学的結合相手物は、第
一の免疫学的結合相手物が加えられる前に、試料に加え
られてもよく；第三の態様では、担体は、第一及び第二
の免疫学的結合相手物を加えるのとほぼ同時に加えられ
てもよく；更に、第四の態様では、第一の免疫学的結合
相手物は、担体及び第二のψ疫学的結合相手物が加えら
れる前に、試料中に加女られてもよい。

第一及び第二の免疫学的結合相手物の具体的濃度、イン
キュベート温度及び時間、並びに他の分析条件は、試料
中の抗原濃度、試料の性質等のような要因に基づき変更
を加えることができる。当業者であれば、日常的実験を
行なうことによって、各測定毎に効果的かつ最適な分析
条件を決定することができる。

例えば、免疫検定は！Ｉ〜３７℃、好ましくけ、２６℃
で行なうことができ、各インキュベート工程はη時間に
及んでもよい。

洗浄、攪拌、振盪、ｐ過、又は抗原もしくは抗体の予備
分析抽出等のような他の工程も、特定の状況下において
望まれるか又は必要とされる場合は、当然のことながら
分析に追加することができる。

ビオチン又はビオチン結合タンパク質が結合することが
でき、しかも本発明において使用することかできる担体
としては数多くのものがある。周知の担体としては、ガ
ラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、
デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び改質セ
ルロース、ポリアクリルアミド、アガロース及びマグネ
ターｆ　）がある。担体の性質は、本発明の目的を達成
するためには、ある程度可溶性でも、あるいは不溶性で
あってもよい。当業者であれば、ビオチン又はビオチン
結合タンパク質を結合する他の数多くの適切な担体を知
っているであろうし、あるいは日常的実験によってその
ようなものを確認することができるであろう。

第一の免疫学的結合相手物は、１種以上のモノクローナ
ル抗体でも、抗体と結合可能な物質であってもよいが、
ビオチン又はビオチン結合タンパク質のいずれかと結合
している。ビオチンは、例えば米国特許第ダ、ユｑｇ、
ｂｇｓ号明細書に記載されているような容易に利用可能
な従来技術を用いることによって、この相手物と結合さ
せることができる。

アビジンその他のビオチン結合タンパク質を第一の結合
相手物に結合させるには、ゲードン・ジェイら、ザージ
ャーナル・オプ・ヒストケミストリー・アンド・サイト
ケミストリー、第２７巻、第１／３／　−／／、３デ頁
、　７９７９年　［Ｇｕｅｓｄｏｎ、Ｊ、ａｔ　ａｌ、
。

Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｌａｔｏｃｈｅｍｉ
ｇｔｒｙ　ａｎｄＣｙｔｏｅｈｅｍｌ＠ｔｒｙ、　２７
　：　／１３／−／１３９　（／９７９）］に記載され
た技術の如き標準的結合技術を用いて容易に行なうこと
かできる。

第二の免疫学的結合相手物は、試料中の被検物質に対し
て特異的な１種以上のモノクローナル抗体、部位特異性
ポリクローナル抗体又はポリクローナル抗体である。こ
の抗体は、酵素、放射性同位元素、蛍光性化合物、化学
ルミネセンス化合物又は生物ルミネセンス化合物のよう
な検出可能な標識と結合せしめられる。

通常の当業者であれば、第二の相手物と結合するその他
の適切な標識を知っているであろうし、あるいは日常的
実験を通じてこのようなものを確認することかできるで
あろう。更に、これらの標識を第二の結合相手物に結合
させるには、当業者において慣用的な標準的技術を用い
て行なうことができる。

免疫検定法において、第二の免疫学的結合相手物を検出
可能なように標識化することができる方法の一つは、こ
の結合相手物を酵素と結合せしめることである。この酵
素は、次いで、その基質と接触した場合に、例えば分光
測定法又は蛍光測定法によって検出できる化学基を生じ
るような方法で、基質と反応するようになる。検出可能
な標識として使用することができる酵素の例としては、
リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ状球菌ヌクレアーゼ
、Δ−３−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデ
ヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ
、トリオースリン酸インメラーゼ、西洋ワサビベルオキ
シダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ
、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リ
ボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコ−ル
ー乙−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及び
アセチルコリンエステラーゼがある。

第二の免疫学的結合相手物の存在は、第二の免疫学的結
合相手物を放射性同位元素で標識化する０、１より□ニ
オ６３カ、□６゜、□、　　　　１位元素の存在は、次
いで、ガンマ−カウンター及びシンチレーションカウン
ターを使用する方法によって測定することかできる。特
に有用な同位元２ｔ’ｉ、３Ｈ１１２５■、１５１■、
５２Ｐ、３５ｓ、１４ｃ、５１ｃｒ、５６ｃｌ、５７ｃ
ｏ、５８ｃｏ、５９Ｆａ及び７５ｓｏである。

第二の結合相手物を蛍光性化合物で標識化することによ
って第二の結合相手物の存在を検出することも可能であ
る。蛍光性標識がなされた第二の結合相手物が適切な波
長光中に露出された場合は、その存在は、次いで、色素
蛍光に基づぎ検出することかできる。最も重要な蛍光標
識化合物の中には、イソチオシアン酸フルオレセイン、
ローダミン、フィコエリトリノ、フィコシアニン、アロ
フィコシアニン、０−フタルデヒド及びフルオレスアミ
ンがある。

第二の免疫学的結合相手物を検出可能なように標識化す
ることができる他の方法は、それを化学ルミネセンス化
合物と結合させることである。化学ルミネセンス標識化
免疫学的結合相手物の存在は、次いで、化学反応時に発
生するルミネセンスの存在を検出することによって測定
される。特に有用な化学ルミネセンス標識化合物の例と
しては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジ
ニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及び
シュウ酸エステルがある。

同様に、生物ルミネセンス化合物が、第二の免疫学的結
合相手物を標識化させるために使用されてもよい。生物
ルミネセンスは生物系圧おいて見られる特殊な型の化学
ルミネセンスであり、その系においては触媒タンパク質
が化学ルミネセンス反応効率を増大せしめる。第二の生
物ルミネセンス結合相手物の存在は、ルミネセンスの存
在を検出することによって測定される。標識化するため
に重要な生物ルミネセンス化合物は、ルシフェリン、ル
シフェラーゼ及びエクオリンである。

本発明の目的のためには、免疫検定法により検出される
物質は、生物学的液体及び組織並びに環境的及び生態学
的な供給源由来の試料中に存在１７ていてもよい。

検出可能であって、未知量の抗原又は抗体を含有する試
料であれば、いがなるものも使用するととができる。通
常、試料は、液体（例えば、尿、唾液、脳背髄液、血液
、血清等）又は固体もしくは半固体（例えば、組織、糞
等）である。

本発明の方法において、第一及び第二の結合相手物が抗
体である場合は、被検物質は少なくとも二つの抗原決定
基を有していることになる。これらの決定基のうち第一
の基は第一の結合相手物と結合し、これらの決定基のう
ち第二の基は第二の結合相手物と結合するようになる。

本発明が、第二の結合相手物のみが抗体である形式で行
なわれる場合は、試料中の被検物質は第二の結合相手物
に対して特異的な７つの抗原決定基のみを有するもので
なければならない。

本発明において用いられる”抗原決定基（エピトープ）
”という用語は、抗体分子との特異的相互反応について
応答性のある決定基であればいかなるものをも包含する
ことを意味する。抗原決定基は通常、アミノ酸又は糖側
鎖のように化学的に活性な表面分子群からなり、特異的
三次元構造特性と特異的荷電特性とを有している。

本発明で使用されるモノクローナル抗体は、当業者間で
周知の技術を用い、様々な方法で産生ずることができる
ため、本発明では繰返さない。これらの技術の詳細につ
いては、ロジャーΦエッチ争ケネット（Ｒｏｇｅｒ　Ｈ
ｏＫａｎｎｅｔｔ　）らが編集し、プレナムプレス社（
Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ　）から／　９ｇＯ年に発行
された”モノクローナル抗体−ノ・イブリドーマ：生物
学的分析における新しい展開（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｉ（ｙｂｒｉｄｏｍａｓ　：　
ＡＮｅｗ　Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ　Ａｎａｌｙａｉｍ）”のような書籍に記載され
ている。

本発明の方法において、免疫検定法は、同一の細胞系又
は異なる細胞系のいずれかから誘導される第一及び第二
のモノクローナル抗体を用いて行なわれてもよい。抗体
が同一細胞系由来である場合、それらは結合特異性が同
一になる。しかしながら、第一及び第二の抗体が異なる
細胞系由来である場合は、各々の特異性の違いＫよって
、被検物質上の異なる抗原決定基の方向に向かうように
なる。

第二の免疫学的結合相手物を説明するために本発明で用
いられる”部位特異性ポリクローナル抗体”という用語
は、それが第一の免疫学的結合相手物とは異なる被検物
質上の部位と結合するように予め吸着され又は精製され
たポリクローナル抗体を意味する。

部位特異性ポリクローナル抗体を産生ずる場合、その方
法は： （ｉ）物質を担体に、該物質の抗原決定基に対して％Ｊ
％的な１種以上のモノクローナル抗体を介して結合させ
（該モノクローナル抗体及び該物質は該担体と強固に結
合する）； （ｂ）　　該担体結合物質に対して特異的なボリクロー
ナル抗体を結合させ； （ｃ）該結合ポリクローナル抗体を洗浄し；（ｄ）　　
該モノクローナル抗体及び該物質が該担体と結合し続け
るような条件下で、結合ポリクローナル抗体を該物質か
ら溶離させ；次いで（ａ）　　該部位特異性ポリクロー
ナル抗体を回収する；ことからなる。

モノクローナル抗体、モノクローナル抗体と結合する物
質及びポリクローナル抗体の具体的濃度、並びに、ポリ
クローナル抗体が結合するためのインキュベート温度及
び時間のようなパラメーター、及び溶離条件は、変更が
可能である。

例えば、物質特異性ポリクローナル抗体は、ポリクロー
ナル抗体及び物質を９〜３７℃で７２時間以下インキエ
ベートすることにより、担体と結合した物質に吸着させ
ることかできる。吸着されたポリクローナル抗体は、次
いで、ｐＨ，２，０−！ｒ、０の０、／〜／、ＯＭグリ
シンーＭＣＩ緩衝液のような酸性溶液又はｐＨダ、θ〜
７．夕のｉ、ｏ−ｓ、０Ｍチオシアン酸カリウムのよう
なカオトロピック剤を使用する如ぎ通常の技術によって
、担体結合物質から溶離させることかできる。

数種類の物質が本発明の方法により検出可能となるが、
それらの中には外来性、内在性その他の物質が含まれる
。

本発明において用いられる“外来性物質”という用語は
、供給源には通常存在しない物質、並びに、試料中に人
工的に導入された天然物質をもすべて包含する意味であ
る。採取試料源には通常存在しない外来性物質の例とし
ては、ウィルス、細菌及び寄生虫のような病原性起源由
来の抗原がある。試料源中に人工的に導入される天然物
質の例としては、インターフェロン又はインターロイキ
ンのような生物学的応答修正物がある。

“内在性”の物質は、採取試料源に由来する物質である
。このような内在性物質の例としては、ホルモン、ステ
ロイド、脂質、酵素及びレセプターがあるが、その含有
レベルは試料源の全体的な状態を表わす。

ハプテンは自らは抗体産生な誘導しない小分子であるが
、抗体分子とは結合することかできる。

しかしながら、ハプテンが免疫操作前に予め担体と結合
されている場合は、ハプテンに対する抗体を産生ずるこ
とかできる。

本発明において、業物とは、その用語が通常用いられて
いる、例えば、抗生物質のような物質、及び生物学的応
答修正物であってもよい。

抗原は、抗体産生を誘導することができる物質である。

抗原は自然界全般に見出され、多数の異なる供給源から
得ることかできる。ある供給源の抗原は、病原体に関連
して見出される抗原である。

病原体は、例えば、病気を起こすことかできるウィルス
、細菌又は寄生虫であってもよい。

本発明により検出することが可能な他の物質としては、
ホルモン、ステロイド、脂質及び酵素がある。

ホルモンとは代謝活性を阻害し又は促進するように作用
する物質である。非常に重要なホルモンの例としては、
再生に関連するホルモン、例えば、ヒト絨毛性性腺刺激
ホルモン、黄体形成ホルモン、プロラグチン及び卵胞刺
激ホルモン、並びに１成長に関連するホルモン、例えば
、ヒト生長ホルモン、ソマトメジン及び甲状腺刺激ホル
モン、及びその他のホルモン、例えば、副甲状腺ホルモ
ン、副腎皮質刺激ホルモン、ビタミンＤ及びその代謝産
物、及びカルシトニンがある。

ステロイドは、シクロベンテノペルヒドロフェナントラ
ンの基本化学構造を有する。ある種のステロイドは全般
的な生物学的活性において重大な役割を果たす。最も重
要なステロイドとしては、コルチゾール、アルドステロ
ン、フロゲステロン、エストラジオール及びテストステ
ロンがある。

脂質は、クロロホルム、エーテル及びベンゼンのような
非極性溶媒から抽出可能な水不溶性有機物質である。生
物学的に重要な脂質の類としては、天然脂肪、ホスホグ
リセリド、糖脂質及びコレステロールエステルがある。

特に重要なものとして、コレステロール、レシチン、カ
ロチン、スフィンゴミエリン、セレプロシド及びガング
リオシドが　　　　　　、：ある。

酵素は生化学反応を触媒するタンパク質分子である。酵
素は恒常的環境を維持する上で重要であって、生体内に
おける中間体の代謝状態を適切に表現する。特定の生化
学経路に関与する酵素の濃度変化は、病的状態を評価す
る際において、重要な診断上の意味をもつ。重要な酵素
の例としては、ウレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ
、リボヌクレアーゼ、クレアチニンホスホギナーゼ、乳
酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸−オキサロ酢酸トラ
ンスアミナーゼ、アルカリホスファターゼ、Ｓ′−ヌク
レオテダーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラー
ゼ、アラニンアミノトランスアミナーゼ及びγ−グルタ
ミルトランスペプチダーゼがある。

試料中に存在する抗体のレベルは、宿主免疫系が直前に
接触した因子を時々示すことかできる。

ヒトの場合、抗体は、ＴｇＧ、　ＩｇＭ、　ＩｇＡｌｌ
ｇＤ及びＴｇＥに分類される３一つのクラスに分けられ
る。

ＩｇＥは主にアレルギー反応に関与する。アレルギー反
応は、アレルゲンとして知られる特定の感作物質と相互
反応するＩｇＥを通じて媒介される３、アレルゲンが肥
満細胞に局在したＩｇＥ分子と結合する場合は、一連の
現象が発生して、アレルギーに通常伴う症状を表わすよ
うになる。試料中の総ＩｇＥレベルを測定し、この情報
から、患者が序〕る釉のアレルゲンに対するアレルギー
反応を有しているか否かを一般的に決定することは可能
であるが、アレルギー反応を引ぎ起こしているアレルゲ
ンそのものを測定することができるならば、史に大ぎな
臨床的価値が得られる。このことは、特定のアレルゲン
に対し特異的で、かつそれに結合可能であるＩｇＥ抗体
を試料が含有しているかどうかについて測定することに
より実施するととができる。

本発明は、そこで、試料中のアレルゲン特異性ＩｇＥの
測定方法を提供するものであるが、この方法は： （ａ）　　アレルゲン特異性ＩｇＥ含有試料を、（ｉ）
該アレルゲン特異性ＩｇＥに対して特異的反応性をもつ
第一の免疫学的結合相手物（第一の免疫学的結合相手物
はビオチン又はビオチン結合タンパク質と結合している
）、及び（ｉ１）該アレルゲン特異性ＩｇＥに対ｔ、て
特異的反応性をもつ第二の免疫学的結合相手物（該第二
の免疫学的結合相手物は検出可能なように標識化されて
いる）、 と接触させ； （ｂ）　　該アレルゲン特異性ＩｇＥ、該第一の免疫学
的結合相手物及び該第二の免疫学的結合相手物からなる
免疫複合体を形成するために要する時間及び条件下で、
工８（ａ）の成分をインキュベートし； （ｃ）　　工程（ｂ）の該免疫複合体含有試料を、担体
と結合したビオチン結合タンパク質又はビオチンに、該
複合体が該担体と結合するために要する時間及び条件下
で接触させ； （ｄ）　　該担体を試料から分離し；次いで（ａ）　　
該試料又は該担体中のいずれかにおける検出可能に標識
化された第二の免疫学的結合相手物を測定する； ことからなるが、 ここで、該第一の免疫学的結合相手物及び該担体間の反
応は、該第一の免疫学的結合相手物及び該物質間で免疫
複合体が形成された後、又は実質上その形成と同時に起
ぎることを特徴とする。

この方法を用いることにより、試料中から直接、あるい
は、アレルゲン特異性ＩｇＥが例えばアフィニテークロ
マトグラフィーによって実質上精製された後のいずれか
において、アレルゲン特異性ＩｇＥを検出することがで
きる。

この場合における第一の結合相手物は、アレルゲンが試
料中のアレルゲン特異性ＩｇＥと結合し続けることかで
きるように、ビオチンヌはビオチン結合タンパクのいず
れかが結合せｔ２められたアレルゲンである。第二の結
合相手物はＩｇＥに対して特異的な１種以上のモノクロ
ーナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれかである。

更に、第二の結合相手物は検出可能どなるように標識化
されている。担体は、第一の結合相手物がそれと結合す
るビオチン結合タンパク質を有する場合はビオチンと結
合せしめられ、あるいは、第一の結合相手物がそれと結
合するビオチンを有する場合はビオチン結合タンパク質
と結合せしめられることになる。

ビオチンは、当業者に周知の技術を用いて、例えば： （ａｌ　　抗原抽出物をＮ−ヒドロキシスクシンイミド
ビオチン（ＮＨ８−ビオチン）と混合し；（ｂ）　　該
混合物をｑ〜３７℃で９〜２９時間インキ−ベートし； （Ｃ）　　該混合物を透析して、未反応ＮＨ３−ビオチ
ンを除去する； ことによって、アレルゲン又はアレルゲン抽出物に結合
させることができる。

本発明の方法を用いる試料中アレルゲン特異性ＩｇＥの
測定は、前記ダつの態様のいずれかにより行なうことか
できる。

本発明の免疫検定法により検出することが可能なアレル
ゲン又はそれらの抽出物の例としては、カビ、菌類、寄
生虫、花粉、動物の鱗屑、唾液タンパク質、薬物、毒素
及び毒液に由来するものがある。

本発明の分析において使用される物質は、観念的にはキ
ットの製造に適している。このようなキットは、バイア
ル、管等のよりな７以上の容器手段を密封状態で収納す
る、仕切られた運搬体手段からなっていてもよく、該容
器手段は各々、本発明の方法に使用される各種要素のう
ちの一つを収容している。

例えば、該容器手段の一つは、ビオチン化されたモノク
ローナル抗体又はビオチン化された抗原を収容していて
もよい。第二の容器は、可溶性の、検出可能に標識化さ
れたモノクローナル抗体、部位特異性ポリクローナル抗
体又はポリクローナル抗体を、凍結乾燥体又は溶液とし
て収容していてもよい。運搬体手段は、相体と結合した
アビジン又はストレプトアビジンのようなビオチン結合
タンパク質を収容した第三の容器手段を収納することも
できる。

更に、運搬体手段は、各々が異なる公知の抗原を既知量
収容した多数の容器を収納していてもよい。これら後者
の容器を用いて標準曲線を作成することができ、未知量
の抗原を含有する試料から得た結果をその標準曲線にあ
てはめることかできる。

キットを使用する場合にユーザーが行なわねばならない
ことは、測定可能であって未知量の被検物質を含有した
既知量の試料が入った容器に、第一の容器に存在するビ
オチン化された第一の結合相手物たる内容物、第二の容
器に存在する標識化抗体たる内容物、及び、ビオチン結
合タンパク質が結合した担体を収容する第三の容器の内
容物を加えることである。あるいは、ピオチン結合タン
パク質は、試料並びに第一及び第二の容器の内容物が入
った容器に加えることもできる。゛適当な時間インキュ
ベートした後、免疫複合体が形成され、上澄液から分離
されて、牙疫複合体又は上澄液が放射線計測、酵素基質
の添加又は発色によって検出される。

一般的な例として、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）につい
てのザンドイッチ免疫検定法は、第一の結合相手物とし
てｈＧＨに対するビオチン化モノクローナル抗体を用い
、第二の結合相手物として、モノクローナル抗体とでは
なりｈ（’、Ｈ分子上の部位と反応する　　Ｉ　ポリク
ローナル抗体を用いて実施された。実験は一つの方式で
実施され、各々のｈＧＨ検出感度が比較された。

第一の実験方式では、ビオチン化モノクローナル抗体は
、（カノツらの米国特許第１Ｉ、ｙｑｂ、ｂｓｙ号明細
書のように、）　ｈＧＨ含有試料中に　　■ポリクロー
ナル抗体と一緒に加えられる前に、アビジン被覆プラス
チックビーズに固定された。これらの条件下では、第二
の結合相手物のみが溶液中で遊離して、ｈＧＨと反応す
る。

第二のグロトコールでは、ｈＧＨに対するモノクローナ
ル抗体は、ｈＧＨ含有試料に加えられる前に固定されな
かったものの、１′Ｉポリクロ一ナル抗体と一緒に溶液
中で自由に反応させた。これらの条件によって、両結合
相手物を試料中のｈＧＨと自由に反応させることができ
る。第二のプロトコールでは、ずべての面で第一のもの
と同様であったが、しかしなから、ビオチン化モノクロ
ーナル抗体は、ｈＧＨ含有試料に加えられる前にはアビ
ジン被覆ビーズに固定されなかった。ビオチン化モノク
ローナル抗体　１２５１ポリクロ一ナル抗体及びアビジ
ン被覆ビーズは、ｈＧＨ含有試料に同時に加えられた。

全く驚くべきことに、第二のプロトコールでは、試料中
に存在するｈＧＨの検出において、著しく増大した感度
を示した。この増大した感度は、おそらく、多くの抗体
分子がアビジン被覆固相ビーズに固定されているため動
力学上の制限がある第一のプロトコールとは異なり、す
べての抗体分子が溶液中遊離していて反応する場合にお
いて、より最適の分子動力学的な系となっていることに
起因する。

以上、本発明を概括的に説明してぎたが、これはいくつ
かの具体例を参考にするとより一層理解できるようにな
り、ところで、その具体例は、明記されない限り、本発
明を説明するだけの目的でここに記載されているのであ
って、本発明を限定するためのものではない。

例／ ＣＮＢｒ活性化セファロース（５ｅｐｈａｒｏａｅ　）
−４１８７ｇを洗浄し、７３分間にわたり数回に分けて
全部でコｏｏｍｉの／ｍＭＨＣＩにより膨潤さぜた。こ
ノ膨潤ゲルを、次いで、ｐｉ（＆、Ｊの０．／Ｍ炭酸塩
緩衝液曜ｒｎｌで洗浄し、この緩衝液を面ちに吸引除去
した。次いで、ゲルを予め？Ａ製されたタンパク質溶液
に移したが、この溶液は０．１　Ｍ炭酸塩緩衝液中にア
フィニティー単離されたウサギの抗マウスＩｇＧを２〜
含有している。このタンパク質溶液及びゲルの混合物を
室温で一夜充分に混合させた。

タンパク質溶液をしかる後ゲルから吸引し、ゲルをｐＨ
ｇ、０の仁ＯＭエタノールアミン阻止溶液に移し、室温
で３時間光分に混合した。この溶液を次いでゲルから吸
引し、ゲルを、３１／ずつの０．１Ｍ炭酸塩緩衝液及び
ｐＨ，２，、？の０．−ＭグリシンＨＣＩで交互に５回
洗浄した。洗浄されたゲルを、次いで、０．０／　Ｍ　
ＰＢＳ／ＢＳＡ緩衝液中にヒト成長ホルモンに対するマ
ウスモノクローナル抗体／ｍｙを含有したｐＨ７４の溶
液に懸濁し、室温で一夜充分に混合した。溶液をしかる
後ゲルから吸引し、ゲルをｏ、ｏｙ　Ｍ　ＰＢＳ／ＢＳ
Ａ緩衝液ｓｏ　ｍｌで洗浄し、その後、精製ヒト成長ホ
ルモン３ＳＯμｇを含有した０、０／　Ｍ　ＰＢＳ／Ｂ
ＳＡ緩衝液に再懸濁し、室温で一夜充分に混合した。次
いで、溶液をゲルから吸引し、ゲルを、ｐＨ７４の０，
０／　Ｍ　ＰＯ４，０，／！；Ｍ　ＮａＣ１，０゜７％
ＮａＮ３５θｍｌ　で、しかる後ｐＨｇ、３の０１．２
Ｍトリエタノールアミン２０ｖ＋ｌで洗浄した。ゲルを
、次いで、ｐＨ３，３のＯ，，２Ｍ）リエタノールアミ
ン中！００ｍ９％ジメチルスペリン酸イミドニ塩酸塩の
溶液１ｓｒｔ＋ｉに再懸濁し、室温で一夜充分に混合し
た。溶液をゲルから吸引し、ゲルを１．１０ｔｎｌずつ
のｐＨ７，４Ｉの０．θ／ＭＰ０４．０．／！；　ＭＮ
ａＣｌ、０，７％Ｎ　ａＮ　ｓ　　及、びｐＨコ。３の
０．１ＭグリシンＨＣＩで交互に７０回洗浄した。溶液
をゲルから吸引し、ゲルをｐＨ／０ｇ！；の希ＨＣＩで
洗浄し、しかる後ｐＨ７，４（の０．Ｏ／ＭＰ０４．０
．１ｇ　Ｍ　ＮａＣｌ　。

０　、／　％　Ｎａ　Ｎｓで平衡化した。アフィニティ
ーゲルマトリックスは、ヒト成長ホルモンに対する部位
特異性ポリクローナル抗体の精製のために使用すること
ができる。

アフィニティーゲルマトリックスを用いて部位特異性ポ
リクローナル抗体を精製するために、ゲルを液体クロマ
トグラフィーカラムに充填し、ｐＨ７、ダの０，０／　
Ｍ　ＰＢＳ／ＢＳＡ緩衝液で平衡化する。

ヒト成長ホルモンに対する抗血清を次いでカラムに通し
、ヒト成長ホルモンと結合せしめる。ゲルをしかる後０
，０／　Ｍ　ＰＢＳ／ＢＳＡ緩衝液で洗浄し、次いです
べての未結合タンパク質が除去されるまで水で希釈する
。カラムに結合した抗体を、次いで、ｐＨ，２，ｊのＯ
，コＭグリシンＨＣＩで溶離する。

この抗体溶液を、しかる後、ｐＨ７゜ダのθ。０／　Ｍ
ＰＯ４，０，／！　Ｍ　Ｎ５ｉＣ１、０，／　％　Ｎａ
Ｎ３に対して直接透析し、約１００μｙ　／　ｘｉ　ま
で濃縮する。この方法でアフィニティー精製された抗体
は、マウスモノクローナル抗体とは結合しないヒト成長
ホルモン分子の相当部分に対して部位特異性である。

倒−子 本発明のＤＥＳ　Ｐ法と従来のサンドインチ免疫検実験
は、様々な濃度のｈＧＨ存在蓋を検出するために、本発
明のＤＥＳＰ法と従来のサンドイッチ免疫検定法との感
度について比較することにより行なわれた。ｈＧＨの標
準希釈液を、ＷＨＯ基準調製法によって、１．０％牛血
清アルブミン（ＢＳＡ）含有０，０／　Ｍリン酸緩衝液
（ＰＢＳ）で、θ、Ｏ，Ｓ、／、５、！；、０．　　／
に、θ及び３り、θη／鳳ｌの濃度に調製した。

試料中の様々なレベルのｈＧＨを検出するための標準的
サンドインチ免疫検定法の感度を測定するに際し、ビオ
チン化された市販モノクローナル抗［−まずアビジン被
覆プラスチックビーズに固定し、しかる後、ｈＧＨ含有
試料に（例１で記載したようにして調製された）１２５
Ｈポリクロ一ナル抗体とともに加えた。試料管を室温で
コ時間１７、０ｒｐｍで臨床回転装置上に置いた。終了
時、ビーズをＰＢ８溶液中の０，１％ツイーン（Ｔｗｅ
＠ｎ　）　１０でユ回洗浄した。

ＤＥＥＰ検定法の場合は、アビジン被覆ビーズ、ビオチ
ン化された市販モノクローナル抗体、及び１２５Ｎ　　
部位特異性ポリクローナル抗体を、各種濃度のｈＧ）ｌ
を含有したもう一つの同一試料に同時に加えた。インキ
−ベート及び洗浄を標準的サンドイッチ免疫検定法の場
合と同様に行なった。

洗浄後、これら両横定法における同様のビーズをガンマ
−シンチレーションカウンターに置ぎ、それらの相対的
放射能を測定した。測定値を表７に掲げ、第１図に示す
。

表１ ０＋ＯＡＡ４’　　　　　　　　　　６グク０、！；　
　　／／Ａ’／　　　　／９７Ｗ１３　　　　　　　　
ココ？３　　　　　　　　４’ｑり７！、（７ｇｌｋ３
　　　／見４’９ ／Ｓ、０　　　　　　．２９に！３　　　　　　　　’
１６θ９り、３Ｎ　、０　　　’７０４　／タ　　Ａ’
ｌｌｔ／８　濃度ｎ　ｉｔ／ｒｔｒｌ ｂ　二回平均値ｃｐｍ これらの結果は、この例において、ＤＥＥＰ免疫検定法
が従来のサンドイッチ免疫検定法で使用される同様の試
薬の場合よりも全般的に高いｈＧＩ（検出感度を有する
ことを示す。

例３ 実験は、様々な濃度のｈＧＩ−１を検出するために、３
種の異なるＤＥＥＰ免疫検定法の相対的感度を比較して
行なわれた。ｈＧＨの標準希釈液を例コで記載されたよ
うにして調製した。

更に、これらのＤＥＳＰ免疫検定法における試料のイン
キュベーション、洗浄及び計数処理を、例コで記載され
たようにして行なった。表λは、評価される３種のＤＥ
ＳＰ免疫検定法の各々において使用された様々な免疫学
的結合相手物について示す。

表− ビオチン化された　１２５■で標献化されたＡ　　非制
限的ポリクロ　非制限的ポリクローナル抗体　　　　−
ナル抗体 Ｂａ　　　モノクローナル抗　モノクローナル抗体・／
　　　　　体−− Ｃモノクローナル抗　部位特異性ポリク体　　　　　　
　　ローナル抗体５ １モノクローナル抗体−／及びモノクローナル抗体−２
ｕ　ｈＧＨの異なる抗原決定基と反応するｂ例／のよう
にして調製 これら３種のＤＥＳＰ免疫検定法を用いて得たデータを
表３に掲げ、第２図に図示する。

表３ ＤＥＳ　Ｐ検定法５ ［ｈＧＨａ〕Ａ　　　　　Ｂ　　　　　Ｃ０、θ　　　
　　　ＳＳ４’　　　　　　Ａ／、？　　　　　　６４
１？０、！ｉ　　　　　　　ｇ！；／　　　　　／／９
７　　　　　／９７’１／、５　　　　　　／’ｌ！；
、？　　　　７ｇｇ０　　　　４’？７？！；、０　　
　　　．３ｒ：ｌ：２　　　　　グ、３／ｇ　　　　／
！ｕ’１９／Ｓ、ＯｔＫ３Ａ　　　　　１１０７ｇ　　
　　’７４０９７３３．０　　　　　／；ｔｔ’１４１
　　　　コθ／ＫＯＡ’ｌｓ！；／８濃度ｎｌｉ／ｍ１ ５二回平均値ｅｐｍ ビオチン化されたモノクローナル抗体及び放射性標識化
された部位特異性ポリクローナル抗体を用いるＤＥＳＰ
検定法（検定法Ｃ）は、試験された他の一つのＤＥＳＰ
検定法のいずれよりも優れたｈＧＨ検出感度を有してい
た。この感度の差異を生じる原因は、これら他の検定法
における成分を嗣酌することに、Ｙり推定することがで
きる。

検定法Ａの主な欠点は、ビオチン化されたポリクローナ
ル抗体及び放射性標識化されたポリクローナル抗体のい
ずれもがｈＧＨ分子分子間一の抗原決定部位で競合する
ことである。したがって、異なる特異性をもつ多数の標
識化抗体が結合する可能性が高まっている反面、このよ
うな結合は、所定の抗原決定基がその同一結合部位に対
して特異的なビオチン化抗体によって最初に阻止されて
いない場合のみでしか起きない。

一方、検定法Ｂで用いられるモノクローナル抗体がｈＧ
Ｈ上の異なる抗原決定基に配向するという事実は、この
検定法において、ビオチン化抗体と放射性標識化抗体と
の集団間で競合が起きないということを意味する。しか
しながら、放射性標識化抗体に対して特異的な抗原決定
基が各ｈＧＨ分子分子間数存在するという可能性はほと
んどないため、放射性標識化モノクローナル抗体は所定
のｈＧＨ分子にけとんど結合することができない。

検定法ＣＶｉ、ｈＧＨ分子に多数の放射性標識化抗体を
結合ぜｌ〜める能力を介してシグナル増強を図す、一方
では、ビオチン化モノクローナル抗体結合部位に対し非
競合的な部位特異性放射性標識化抗体を用いて、ｈＧＨ
の同一の結合部位に対するビオチン化抗体及び放射性標
識化抗体間の抗原決定基競合を避けることにより、最大
の感度を達成している。

１ｌ−４ 実験は、３種の異なる放射性免疫検定法の感度を比較す
るために行なわれた。これらの検定法では、アビジン被
覆ポリスチレンビーズ、ビオチン化アレルゲン抽出物［
ケンタソキーブルーグラス（Ｋｅｎｔｕｃｋｙ　Ｂｌｕ
ｅ　Ｇｒａｓｓ　）　’］及びアレルゲン特異性ヒトＴ
ｇＥを用いた。

アレルゲン抽出物のビオチン化ｉｆ、ｐＨ７，４７のＯ
１θ／　Ｍ　ＮａＰＯＯ，／！；　Ｍ　ＮａＣ１、θ、
　／　％　Ｎａ　Ｎ３４′− に１〜／のケンタソキープルーグラス抽出物〔／、θｍ
ｙ　／ｗｒｌ　１　ボーア・プラテンシス（Ｐｏａ　ｐ
ｒａｔｅｎａｉａ　）、ポリスター−ステイア（Ｈｏｌ
ｌｌｓｔｅｒ−８ｔｌｅｒ）　。

ノド番号Ｋ　ｂ／ｑｑｇ　Ｍ　］を加え、これにＮ、　
Ｎ−ジメチルホルムアミド〔シグマ社（Ｓｉｇｍａ）　
ＭＷ７３、θデ〕中のＡ、ｌＩｍＭＮ−ヒドロキシスク
シミドビオチン（シグマ社ＭＷ　３１１／、ｌＩ　）溶
＃、　ｏ、、２．２〜／を加えることによって行なわれ
た。この混合物を室温で一夜（７，２〜／り時間）イン
キ、ベートし、次いでコつの０．／ｋ　Ｍ　Ｎａ１ｌ交
換液ダｌに対し室温でＳ時間透析した。この透析された
ビオチン化抽出物を使用時まで９℃で保存した。

アビジン被覆ポリスチレンビーズを、ビーズ（ｓ／ｎイ
ンチ（ｏ、ｇ口）、ブリシジａンゾラスチノクボール（
Ｐｒｅｃｌａｌｏｎ　Ｐｌｉｍｔｌｃ　Ｂａ１ｌ　）、
鏡面仕上〕を７チグルタルアルデヒド溶液と一緒にＳ時
間以」二の間回転装置上で穏やかに攪拌（７θｒｐｍ　
）　ｔ、ながらまず処理することによって調製した。次
いで、グルタルアルデヒドを除去し、ビーズを脱イオン
水で７０回洗浄した。グルタル°アルデヒド活性化ビー
ズを、次いで、ｐＨ７，４’の０．０７ＭＮａＰＯ４、
θ、１５　Ｍ　ＮａＣｌ　、　　０　、／　％　ＮｈＮ
ｓ　　中、ビーズ当たり７０μｌのビオチン化Ｂ５Ａｌ
１．ｆｆ度のビオチン化牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶
液（牛血清アルブミン画分Ｖ、シグマ社）で０，３ＴＩ
ｒｌ／ビーズにて、ｇ時間穏やかに攪拌しながら被覆ｌ
また。終了時、ビーズを脱イオン水で７０回洗浄した。

次いで、ビオチン化ＢＳＡで被覆されたビーズを、ｐＨ
７、ｌの０　、　Ｄ　／　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｐ　Ｏ４、０，
／Ｓ　Ｍ　ＮａＣ１、０，／　％ＮＩＬＮ５中で５時間
攪拌しながらアビジン（７０μｉ１０、ｏ３ｍｌ／ビー
ズ）と反応させ、しかる後脱イオン水で７０回洗浄した
。アビジン被覆ビーズを、ｐＨ７，４ｔの０　、０　／
　Ｍ　Ｎａ　Ｐ　Ｏ４、０，／！；　Ｍ　ＮａＣ１、０
，／　％Ｎａ　Ｎ　５中のｏ、ｉｃ４牛血清アルブミン
０．３ｍｌ／ビーズによって、少なくともユ。Ｓ時間穏
やかに攪拌しながらリンスした。ビーズを脱イオン水で
１０回洗浄し、しかる後ｐＨ７，４の０　、　／　！；
　Ｍ　Ｎａ　ＰＯ４，０，７５Ｍ　ＮａＣＩ　、　０．
／　％　ＮａＮ６中のλ。５％スクｐ−スｏ、、ｔｍｌ
／ビーズで３０〜６θ分間最終的に処理した。

スクロース溶液を除去シ、ビーズを室温で乾燥させて、
使用時まで９℃で保存した。

ヤギ抗ヒトＩｇＥ　［ＡＴＡＢアトランティック・アン
チボディーズ社（ＡＴＡＢ　Ａｔ１ａｎｔｉｃ　Ａｎｔ
ｉｂｏｄＳｅ＠）］をクロラミンＴ法でヨウ素化した。

３種の放射性免疫検定法のプロトコールは下記のとおり
であった： ０、／　％　ＢＳＡ、　　０．０／　Ｍ　ＮａＰＯ４，
０，７！；　Ｍ　ＮａＣ１゜０　、　／　ｌ　Ｎａ　Ｎ
ｓ中、濃度コ、Ｏｐｇ／ｒｔｒｌｃｌ）ビオチン化アレ
ルゲン抽出物（ｉ００μｌ）を、各種ＲＡＳＴ［放射性
アレルゲン吸着試験（ｒａｄｉａｌ　１ｅｒｇｏｉ＋ｏ
ｒｂｅｎｔｔｅｓｔ）　１単位で漸増する量のヒトアレ
ルゲン特異性ＩｇＥ（デー・ダン社（Ｄ、　Ｄｕｎｎ、
　Ｉｎｓ、　））を含有したヒト血清１００μ！又はウ
マ血清〔場合により透明、アーパイン・サイエンティフ
インク社（Ｔｒｖｉｎａ　５ｃｌｅｎｔｉｆｌｃ）　〕
１００１Ｊ　　と混合した。　　　　　　゛これらの溶
液を、室温で２時間、回転装置上の７２×７５關ポリス
チレンプラスチツク管内で混合した（　１７、Ｏｒｐｍ
　）。次いで、アビジン被覆ビーズを各管内に加え、反
応を更に一時間回転させながら継続した。終了時、アビ
ジンビーズが入った１ｉＦ’＆ｐＨ？、ｌＩｔの０．０
　／　Ｍ　Ｎａ　ＰＯ４，０，／！ｒ　Ｍ　ＮａＣ１、
０，／　％トリドアＸ　−１００，０，１％Ｎａ　Ｎ３
２ｔｎｔで３回洗浄した。結合したアレルゲン特異性ヒ
）ＴｇＥの存在を、′２５■ヤギ抗ヒト抗ヒト　（／！
００　ｃｐｒｒｖ’ｌｔｌ　、　０．ｇｉｐμＣ１／μ
ｇ）、２θ０μｌを加え、しかる後室温で一時間回転装
置上（／りθｒｐｍ　）でインキ−ベートすることによ
り検出した。ビーズが入った同様の管を上記のようにし
て３回洗浄し、ガンマ−カウンターで１分間計数した。

この検定法では、ビオチン化アレルゲン抽出物、アレル
ゲン特異性ヒ）　ＩｇＥ含有試料及びアビジン被覆ビー
ズを同時に混合し、室温で一時間回転させながら（１７
、θｒｐｍ　）インキュベートしたこと以外は、上記前
進法と同様にして処理した。その他すべての操作を上記
前進的検定法と同様にして行なった。

各種濃度のビオチン化アレルゲン抽出物（，１，θμｐ
／ｍｌで１００μｌ）が入Ｒた各々同一の管内で、ウマ
血清１０、θμｌ及びアビジンビーズと混合し、室温で
２時間回転装置上（／９Ｏｒｐｍ　）でインキ−ベート
した。前述したように管及びビーズを洗浄した後、各種
濃度でアレルゲン特異性ＩｇＥを含有したヒト血清１０
０μｌ又はウマ血清１００μｌを加え、しかる後ｐＨ７
，４（の０．０　／　Ｍ　Ｎａ　ＰＯ４，０，／！；Ｍ
　ＮａＣ１１０，１％Ｎａ　Ｎ　５中の０．／チ牛血清
アルブミン１００μｌを加えた。管を、室温で２時間回
転させながら（１７、０　ｒｐｍ　）再びインキュベー
トし、前記のようにして洗浄した。終了時、１２５Ｎヤ
ギ抗ヒ）ＩｇＥ、１００μｌを、結合したアレルゲン特
異性ＴｇＥを検出するために加え、室温でコ時間回転さ
せながら（１７、０　ｒｐｍ　）インキュベートした。

これら３種の検出法を利用して得られた結果を表ｑに掲
げ、第３図に図示した。

表ダ ／ｒ、Ｏｇ、１ｇｂ　　４．３ｇｇ　　　／４１！；０
７、ｔ　　　’１４００　．３’＃’ｌ　　　／、２ｇ
Ｏ，３，’ｌ！　　　２７（ｉ’）　　２／ｇ／　　　
９ｒＳ／　、１１１　　　　　　　／Ａ７り　　　　／
３：１．２　　　　　　’７４１０．９１Ｉ／、Ｖ１９
　　９ｇ９　　　Ａ４０θ、４ｔｋ　　　　　　　　ｇ
ｌｆｇ　　　　　　７．１　　　　　　　Ａ／θｏ、ｏ
ｃｓｇｇ　　　ｒ’ｔｑ　　　５ｉｔｔｙ１濃度ＲＡＳ
Ｔ単位／ｒｔｒ１ ５二回平均値ｅｐｍ ０ウマ血清コントロール 前進的及び同時的な遅延型固相検定法はいずれも、ビオ
チン化アレルゲンが遊離していてアレルゲン特異性Ｉｇ
Ｅと溶液中で反応し、しかる後アビジン被覆ビーズを通
じてこの複合体を除去するものであるが、アレルゲンが
最初ビーズに固定され、しかる後ＩｇＥ含有試料と接触
せしめられる従来の検定法よりも、予期ｌ−ないほど全
般的に高い感度を示した。遅延型固相検定法における感
度増加によって、アレルゲンが固相に結合されているた
めに従来の固定化アレルゲン検定法の如く立体障害及び
分子動力学の面で最初から制限が味されている場合にお
いては達成し得ないような立体障害の減少及び分子動力
学的な向上について、おそら（寄与できることになるで
あろう。予めアレルゲン抽出物を固定させた場合は、そ
れが結合した固相の表面にアレルゲン特異性ＩｇＥを移
行せしめる必要があり、しかもアレルゲン特異性ＩｇＥ
分子と結合可能な抗原決定基部位の利用性をも妨害する
おそれがある。

以上、本発明を充分に説明してぎたが、本発明又はその
実施態様の精神又は範囲に影響を及ぼずことがなげ」ｔ
ば、パラメーター、条件その他の広汎かつ相当の範囲内
で同様のことを実施することが可能であることは極めて
明らかとなるであろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｈＧＨを検出する場合における、従来のサン
ドイッチ免疫検定法及び本発明のＤ　Ｅ　Ｓ　Ｐ免疫検
定法の比較応答曲線について示すグラフである。 第一図は、ｈＧＨを検出する場合における、３種の異な
るＤＥＳＰ免疫検定法の比較応答曲線について示すグラ
フである。 第３図は、アレルゲン特異性ヒ）　ＩｇＥを検出する場
合における、３種の異なる免疫検定法の感度について示
すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試料中に存在する物質の測定方法において、 （ａ）該物質を含有する該試料を： （ｉ）該物質に対する第一の免疫学的結合相手物（該第
   一の免疫学的結合相手物はビオチン又はビオチン結合タ
   ンパク質と結合している）、 （ｉｉ）該物質に対する第二の免疫学的結合相手物（該
   第二の免疫学的結合相手物は検出可能となるように標識
   化されている）、及び （ｉｉｉ）担体に結合したビオチン結合タンパク質又は
   ビオチン、 と接触させ； （ｂ）該物質、該第一の免疫学的結合相手物、該第二の
   免疫学的結合相手物及び担体間で免疫複合体を形成させ
   るために要する時間及び条件下で、工程（ａ）の成分を
   同時に又は別々にインキュベートし； （ｃ）該担体を試料から分離し；続いて （ｄ）試料又は担体中のいずれかにおける検出可能に標
   識化された第二の免疫学的結合相手物を測定する； ことからなり、 該第一の免疫学的結合相手物及び該担体間の反応が、該
   第一の免疫学的結合相手物及び該物質間で免疫複合体が
   形成された後、又は実質上その形成と同時に起きること
   を特徴とする方法。 ２、該物質が該試料供給源とは異なる外来性のものであ
   る、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、該外来性物質が、ハプテン、薬物及び病原体由来抗
   原からなる群より選択される、特許請求の範囲第２項記
   載の方法。 ４、該病原体由来抗原がウィルス、細菌又は寄生虫から
   由来している、特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５、該物質が該試料供給源と同じ内在性のものである、
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、該内在性物質がホルモンである、特許請求の範囲第
   ５項記載の方法。 ７、該ホルモンが、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、黄体
   形成ホルモン、プロラグチン、卵胞刺激ホルモン、ヒト
   成長ホルモン、ソマトメジン、甲状腺刺激ホルモン、副
   甲状腺ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、ビタミンＤ及
   びカルシトニンからなる群より選択される、特許請求の
   範囲第６項記載の方法。 ８、該内在性物質がステロイドである、特許請求の範囲
   第５項記載の方法。 ９、該ステロイドが、コルチゾール、アルドステロン、
   プロゲステロン、エストラジオール及びテストステロン
   からなる群より選択される、特許請求の範囲第８項記載
   の方法。 １０、該内在性物質が脂質である、特許請求の範囲第５
   項記載の方法。 １１、該脂質が、コレステロール、レシチン、カロチン
   、スフィンゴミエリン、セレブロシド及びガングリオシ
   ドからなる群より選択される、特許請求の範囲第１０項
   記載の方法。 １２、該内在性物質が酵素である、特許請求の範囲第５
   項記載の方法。 １３、該酵素が、ウレアーゼ、デオキシリボヌクレアー
   ゼ、リボヌクレアーゼ、クレアチニンホスホキナーゼ、
   乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸−オキサロ酢酸ト
   ランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼ、５′−ヌ
   クレオチダーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラ
   ーゼ、アラニンアミノトランスアミナーゼ及びγ−グル
   タミルトランスペプチダーゼからなる群より選択される
   、特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １４、該第一の免疫学的結合相手物が１種以上のモノク
   ローナル抗体であり、該第二の免疫学的結合相手物が部
   位特異性ポリクローナル抗体である、特許請求の範囲第
   ２項、第６項、第８項、第１０項又は第１２項記載の方
   法。 １５、該第一及び第二の免疫学的結合相手物が同一の細
   胞系から産生されたモノクローナル抗体である、特許請
   求の範囲第２項、第６項、第８項、第１０項又は第１２
   項記載の方法。 １６、該第一及び第二の免疫学的結合相手物が異なる細
   胞系から産生された異なるモノクローナル抗体である、
   特許請求の範囲第２項、第６項、第８項、第１０項又は
   第１２項記載の方法。 １７、該内在性物質が免疫グロブリンである、特許請求
   の範囲第５項記載の方法。 １８、該第一の免疫学的結合相手物が該免疫グロブリン
   と結合可能な物質であり、該第二の免疫学的結合相手物
   が該免疫グロブリンのクラスレベルに対して特異的な１
   種以上のモノクローナル抗体である、特許請求の範囲第
   １７項記載の方法。 １９、該第一の免疫学的結合相手物が該免疫グロブリン
   と結合可能な物質であり、該第二の免疫学的結合相手物
   が該免疫グロブリンのクラスレベルに対して特異的なポ
   リクローナル抗体である、特許請求の範囲第１７項記載
   の方法。 ２０、該物質がアレルゲンで、該免疫グロブリンがＩｇ
   Ｅである、特許請求の範囲第１８項又は第１９項記載の
   方法。 ２１、該アレルゲンが、カビ、菌類、寄生虫、花粉、動
   物の鱗屑、唾液タンパク質、薬物、毒素及び毒液からな
   る群より選択される、特許請求の範囲第２０項記載の方
   法。 ２２、該検出可能に標識化された第二の免疫学的結合相
   手物が酵素で標識化されている、特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ２３、該酵素が、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ状
   球菌ヌクレアーゼ、Δ−５−ステロイドイソメラーゼ、
   酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸
   デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西
   洋ワサビベルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、
   アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラ
   クトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラ
   ーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グル
   コアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼからなる
   群より選択される、特許請求の範囲第２２項記載の方法
   。 ２４、該検出可能に標識化された第二の免疫学的結合相
   手物が放射性同位元素で標識化されている、特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ２５、該同位元素が、＾３Ｈ、＾１＾２＾５Ｉ、＾１＾
   ３＾１Ｉ、＾３＾２Ｐ、＾３＾５Ｓ、＾１＾４Ｃ、＾５
   ＾１Ｃｒ、＾３＾６Ｃｌ、＾５＾７Ｃｏ、＾５＾８Ｃｏ
   、＾５＾９Ｆｅ及び＾７＾５Ｓｅからなる群より選択さ
   れる、特許請求の範囲第２４項記載の方法。 ２６、該検出可能に標識化された第二の免疫学的結合相
   手物が蛍光性化合物で標識化されている、特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ２７、該蛍光性化合物が、イソチオシアン酸フルオレセ
   イン、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン
   、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド及びフルオレ
   スアミンからなる群より選択される、特許請求の範囲第
   ２６項記載の方法。 ２８、検出可能に標識化された第二の免疫学的結合相手
   物が化学ルミネセンス化合物で標識化されている、特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ２９、該化学ルミネセンス化合物が、ルミノール、イソ
   ルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾ
   ール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルからなる
   群より選択される、特許請求の範囲第２８項記載の方法
   。 ３０、該検出可能に標識化された第二の免疫学的結合相
   手物が生物ルミネセンス化合物で標識化されている、特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ３１、該生物ルミネセンス化合物が、ルシフェリン、ル
   シフェラーゼ及びエクオリンからなる群より選択される
   、特許請求の範囲第３０項記載の方法。 ３２、抗体と結合することができ、かつ少なくとも２つ
   の異なる抗原決定基（エピトープ）を有する生体物質に
   対する部位特異性ポリクローナル抗体を形成するための
   方法であって、 （ａ）該物質の抗原決定基に対して特異的な１種以上の
   モノクローナル抗体を介して、該物質を担体に結合せし
   め（該モノクローナル抗体及び該物質は、該担体と強固
   に結合する）； （ｂ）該物質に対して特異的なポリクローナル抗体を該
   担体結合物質に結合せしめ； （ｃ）該結合ポリクローナル抗体を洗浄し； （ｄ）該モノクローナル抗体及び該物質が該担体と結合
   し続けるような条件下で、該結合ポリクローナル抗体を
   該物質から溶離せしめ；続いて （ｅ）該部位特異性ポリクローナル抗体を回収する； 工程を含むことを特徴とする方法。 ３３、ＩｇＥ産生を誘導することができる、ビオチン化
   された化合物。 ３４、試料中の物質の検出に使用されるキットであって
   、 （ａ）該物質に対する免疫学的結合相手物を収容する第
   一の容器（該相手物はビオチン又はビオチン結合タンパ
   ク質と結合している）； （ｂ）該物質に対する免疫学的結合相手物を収容する第
   二の容器（該相手物は検出可能な標識と結合している）
   ；及び （ｃ）ビオチン結合タンパク質又はビオチンが結合した
   担体を収容する第三の容器； のうち１以上の容器を密封状態で収納する、仕切られた
   運搬体からなることを特徴とするキット。 ３５、該第一の容器がモノクローナル抗体を収容し、該
   第二の容器が部位特異性ポリクローナル抗体を収容する
   、特許請求の範囲第３４項記載のキット。 ３６、該第一の容器及び該第二の容器がともに、同一の
   細胞系から産生されたモノクローナル抗体を収容する、
   特許請求の範囲第３４項記載のキット。 ３７、該第一の容器及び該第二の容器が、異なる細胞系
   から産生された異なるモノクローナル抗体を収容する、
   特許請求の範囲第３５項記載のキット。 ３８、該物質が免疫グロブリンである、特許請求の範囲
   第３４項記載のキット。 ３９、該第一の容器が該免疫グロブリンと結合可能な物
   質を収容し、該第二の容器が該免疫グロブリンのクラス
   レベルに対して特異的なモノクローナル抗体を収容する
   、特許請求の範囲第３８項記載のキット。 ４０、該第一の容器が該免疫グロブリンと結合可能な物
   質を収容し、該第二の容器が該免疫グロブリンのクラス
   レベルに対して特異的なポリクローナル抗体を収容する
   、特許請求の範囲第３８項記載のキット。 ４１、該物質がアレルゲンで、該免疫グロブリンがＩｇ
   Ｅである、特許請求の範囲第３９項又は第４０項記載の
   キット。 ４２、試料中の物質の検出に使用されるキットであって
   、 （ａ）ｉ）該物質に対する第一の免疫学的結合相手物（
   該相手物はビオチン又はビオチン結合タンパク質と結合
   している）及び ｉｉ）該物質に対する第二の免疫学的結合相手物（該相
   手物は検出可能な標識と結合している）を収容する第一
   の容器；並びに （ｂ）ビオチン結合タンパク質又はビオチンが結合した
   担体を収容する第二の容器； のうち１以上の容器を密封状態で収納する、仕切られた
   運搬体からなることを特徴とするキット。 ４３、該第一の容器がモノクローナル抗体及び部位特異
   性ポリクローナル抗体を収容する、特許請求の範囲第４
   ２項記載のキット。 ４４、該第一の容器が同一の細胞系から産生されたモノ
   クローナル抗体を収容する、特許請求の範囲第４２項記
   載のキット。 ４５、該第一の容器が異なる細胞系から産生された異な
   るモノクローナル抗体を収容する、特許請求の範囲第４
   ２項記載のキット。 ４６、該物質が免疫グロブリンである、特許請求の範囲
   第４２項記載のキット。 ４７、該第一の容器が、該免疫グロブリンと結合可能な
   物質、及び該免疫グロブリンのクラスレベルに対して特
   異的なモノクローナル抗体を収容する、特許請求の範囲
   第４６項記載のキット。 ４８、該第一の容器が、該免疫グロブリンと結合可能な
   物質、及び該免疫グロブリンのクラスレベルに対して特
   異的なポリクローナル抗体を収容する、特許請求の範囲
   第４６項記載のキット。 ４９、該物質がアレルゲンで、該免疫グロブリンがＩｇ
   Ｅである、特許請求の範囲第４７項又は第４８項記載の
   キット。 ５０、物質に対する第一の免疫学的結合相手物（該相手
   物はビオチン又はビオチン結合タンパク質と結合してい
   る）及び該物質に対する第二の免疫学的結合相手物（該
   相手物は検出可能な標識と結合している）を含み、該第
   一及び第二の免疫学的結合相手物が非水性形であること
   を特徴とする組成物。 ５１、モノクローナル抗体及び部位特異性ポリクローナ
   ル抗体を含む、特許請求の範囲第５０項記載の組成物。 ５２、同一の細胞系から産生されたモノクローナル抗体
   を含む、特許請求の範囲第５０項記載の組成物。 ５３、異なる細胞系から産生された異なるモノクローナ
   ル抗体を含む、特許請求の範囲第５０項記載の組成物。 ５４、試料中のｈＧＨの検出に使用されるキットであっ
   て、 （ａ）アビジンで被覆されたポリスチレンビーズを収容
   する第一の容器； （ｂ）＾１＾２＾５Ｉで検出可能に標識化された第一の
   マウスモノクローナル抗体及びビオチンと結合した第二
   のマウスモノクローナル抗体を収容する第二の容器（該
   モノクローナル抗体はｈＧＨの異なる抗原決定基（エピ
   トープ）と反応する）；及び （ｃ）それぞれ漸増させた量のｈＧＨを収容する一群の
   容器； のうち１以上の容器を密封状態で収納する、仕切られた
   運搬体からなることを特徴とするキット。