JPH0772152A

JPH0772152A - 特異的バインディングアッセイ方法及び分析要素

Info

Publication number: JPH0772152A
Application number: JP5321861A
Authority: JP
Inventors: Annie Liu Wu; リウウアニー
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Eastman Kodak Co
Priority date: 1992-12-21
Filing date: 1993-12-21
Publication date: 1995-03-17
Also published as: EP0603958A1; SG73392A1

Abstract

(57)【要約】【目的】広い濃度範囲を有するリガンドを測定するの
に特に有用な特異的バインディングアッセイ方法及びそ
れに用いる分析要素を提供する。【構成】Ｃ反応性タンパク質を測定するための特異的
バインディングアッセイ方法は、Ｃ反応性タンパク質に
特異的な標識非結合レセプター対Ｃ反応性タンパク質に
特異的な非標識非結合レセプターの割合を約１：50〜約
１：1000の範囲で用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は臨床化学に関する。より
詳細には、本発明は特異的バインディングアッセイにお
ける動的範囲の改良された方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】数多くの分析物（本明細書では「リガン
ド」と称される）が、生物学的被検体中に存在する変動
濃度範囲に亘って見いだされる可能性がある。リガンド
がアッセイ系により定量的に測定可能である濃度範囲
は、本明細書では動的範囲と称される。有用な臨床的手
段であることが多いとはいえ、広い濃度範囲を有するリ
ガンドを定量することは困難である。

【０００３】広い濃度範囲を有するリガンドは、例え
ば、急性期タンパク質（acute phaseproteins）を包含
する。急性期タンパク質の濃度は、刺激、例えば、組織
損傷、炎症及び種々の感染によって劇的に変化する。典
型的には、タンパク質の濃度は損傷もしくは感染の進行
過程に匹敵する。急性期血漿タンパク質としては、例え
ば、セルロプラスミン、Ｃ３（補体の第３成分）、α₁
−酸性糖タンパク質、α ₁−抗トリプシン、α₁−抗キ
モトリプシン、フィブリノーゲン、ハプトグロビン、Ｃ
反応性タンパク質（ＣＲＰ）、及び血清アミロイドＡタ
ンパク質（ＳＡＡ）が挙げられる。ＣＲＰ及びＳＡＡ
は、特に広い濃度範囲を有する。例えば、通常ＣＲＰは
血液中の微量成分であり、健康な成人の血清濃度が通常
５mg/Lより低く保たれている。刺激の始まった後に、濃
度は急速且つ劇的に1000倍以上に上昇する。患者の治癒
もしくは回復及びその後の刺激の低減によって、ＣＲＰ
濃度は微量値に戻る。急性期タンパク質濃度を測定する
ことによって疾病の状態をモニターすることが、臨床化
学においてよく使用される慣習となってきた。

【０００４】非競合アッセイは臨床化学における有用な
手段である。しかしながら、広い濃度範囲を有するリガ
ンドを測定する場合には、課題が存在する。或るタイプ
の非競合アッセイは、典型的には２つの特異的バインデ
ィングレセプターの間にリガンドを「サンドイッチ」す
る形式（従って、一般的にはサンドイッチアッセイと称
される）を含む。レセプターの１方は水不溶性支持体に
付着せしめられ、そしてもう一方のレセプターは、一般
的に測定可能なシグナルを発生する物質で標識される。
典型的には２つのレセプターはリガンド上の２つの特別
な異なる部位を認識する。レセプターの一方が不溶性支
持体に付着せしめられるため、リガンドと２つのレセプ
ターの「サンドイッチ」全体も、一旦形成されると不溶
性である。それゆえに、不溶性「サンドイッチ」は可溶
性物質（反応していない標識レセプターを包含する）か
ら容易に分離できる。分離後、不溶性「サンドイッチ」
を測定して（又は非結合標識レセプターを測定して）、
リガンドの濃度を示すことができる。アッセイのシグナ
ル系の測定法は、飽和することなく微量値と同様に極め
て高濃度で標的リガンドを定量するのに十分な感度であ
るべきである。一度シグナル系の飽和が生じると、有意
義な定量分析は制限される。典型的には、飽和が生じな
いように動的範囲を拡大するためには、流体試料の希釈
及び第２サンドイッチアッセイを必要とする。

【０００５】米国特許第 4,595,661号明細書は、高濃度
で偽陰性の結果もしくは「フック（hook）」効果を回避
するために、高濃度の抗原を測定する場合にサンドイッ
チイムノアッセイに更なる物質を使用することを記載す
る。米国特許第 4,788,132号明細書は、直線状標準曲線
を作成する疑似第１オーダー反応を得るための、サンド
イッチイムノアッセイにおける調整を記載する。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】特異的バインディング
アッセイに関して多くの進歩がなされてきたとはいえ、
広い濃度範囲を有するリガンドを定量できる、別の特異
的バインディングサンドイッチアッセイ系を発見するこ
とが強く望まれる。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、Ｃ反応性タン
パク質に特異的な標識非結合レセプター対Ｃ反応性タン
パク質に特異的な非標識非結合レセプターの割合を約
１：50〜約１：1000の範囲で用いることを含む特異的バ
インディングアッセイ方法を提供する。

【０００８】より詳細には、広い濃度範囲を有するリガ
ンドを測定するのに特に有用な特異的バインディングア
ッセイ方法は、（ｉ）測定しようとするリガンドを含有
する液体試料と、（ａ）水不溶性支持体に固定化されて
いる、リガンドに特異的な第１レセプターＲ₁；（ｂ）
リガンドに特異的な標識非結合第２レセプターＲ₂；及
び（ｃ）リガンドに特異的な非標識非結合第３レセプタ
ーＲ₃（但し、Ｒ₂及びＲ₃は、Ｒ₂：Ｒ₃の割合が約
１：50〜約１：1000で存在し、かつＲ₃はＲ₁、Ｒ₂も
しくはそれらの混合物と同様である）とを接触させるこ
と、（ii）水不溶性複合体を、液体試料及び非結合Ｒ₂
から分離すること、そして（iii)前記水不溶性複合体に
結合したＲ₂の量又は反応していないＲ₂の量のどちら
かを、試料中のリガンドの量の指標として測定すること
を含む。

【０００９】第２態様では、新規分析要素が、リガンド
を測定するために発見された。該分析要素は多孔質展開
区画を含み、該多孔質展開区画もしくは異なる区画に、
水不溶性支持体に固定化されている、リガンドに特異的
な第１レセプターＲ₁；リガンドに特異的な標識非結合
第２レセプターＲ₂；及びリガンドに特異的な非標識非
結合第３レセプターＲ₃（但し、Ｒ₂及びＲ₃は、
Ｒ₂：Ｒ₃の割合が約１：50〜約１：1000で存在し、か
つＲ₃はＲ₁、Ｒ₂もしくはそれらの混合物と同様であ
る）を含む。

【００１０】

【具体的な態様】本発明は、本明細書ではリガンドと称
される化学的もしくは生物学的物質の定量検出に関す
る。「リガンド」の語は、分析物と交換でき、それは、
限定されるものではないが、抗原類、ハプテン類、抗体
類、毒素類、ホルモン類、治療薬類、天然及び合成ステ
ロイド類、タンパク質類、ウイルス類、細菌類、ペプチ
ド類、及びヌクレオチド類などを包含する。

【００１１】本発明は、生物学的流体又はヒトもしくは
動物組織の流体調製物をアッセイするのに使用できる。
アッセイできる生物学的流体としては、限定されるもの
ではないが、全血、血漿、血清、リンパ液、胆汁、尿、
脊髄液、痰及び汗など、並びに便分泌物が挙げられる。
アッセイできるヒトもしくは動物組織の流体調製物とし
ては、例えば、骨格筋、心臓、腎臓、肺、脳、骨髄及び
皮膚などが挙げられる。

【００１２】より詳細には、本発明で測定可能なリガン
ドとしては、限定されるものではないが、抗原性物質
類、例えば、１）血清タンパク質類、例えば、アルファフェトプロテ
イン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、免疫グロブ
リンＥ（ＩｇＥ）、ベータ₂−ミクログロブリン、チロ
キシンバインディンググロブリン（ＴＢＧ）、Ｃ反応性
タンパク質（ＣＲＰ）、アルファ₂−ミクログロブリ
ン、アルファ₁−ミクログロブリン、免疫グロブリンＡ
（ＩｇＡ）、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、免疫グロブ
リンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）、トラ
ンスフェリン、糖タンパク質類、アルブミン、セルロプ
ラスミン、Ｃ３（補体の第３成分）、α₁−酸性糖タン
パク質、α₁−抗トリプシン、α₁−抗キモトリプシ
ン、フィブリノーゲン、ハプトグロビン、及び血清アミ
ロイドＡタンパク質（ＳＡＡ）などが挙げられる。２）ホルモン類、例えば、インスリン、ヒト絨毛性ゴナ
ドトロピン（そのまま（intact））、アルファサブユニ
ット（そのまま又は遊離）又はベータサブユニット（そ
のまま又は遊離）成長ホルモン（ｈＣＧ，ｈＣＧ−アル
ファ，又はｈＣＧ−ベータ）、甲状腺刺激ホルモン（Ｔ
ＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン
（ＦＳＨ）、プロラクチン、ソマトスタチン、チロキシ
ン、トリヨードチロニン、及びテトラヨードチロニンな
ど、３）癌関連抗原類、例えば、フェリチン、ＰＯＡ、ＣＡ
−１９−９、及びＣＡ−１２−５など、４）病原体類、例えば、病原性細菌類（マイコバクテリ
ウム及びストレプトコッカスなどを包含する）、原生動
物類、寄生体類（マラリア寄生虫及びトキソプラスマな
どを包含する）、ウイルス類（レトロウイルス類、ＥＢ
ウイルス、肝炎ウイルス類、サイトメガロウイルス、風
疹ウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ−Ｉ及びＨＴＬ
Ｖ−Ｉなどを包含する）、並びに５）酵素類、例えば、エラスターゼ、ＤＮＡポリメラー
ゼ、アミラーゼ、プロテイナーゼ、及びリパーゼなどが
挙げられる。

【００１３】本発明は、広い動的範囲を有するリガン
ド、例えば、ＡＦＰ、ベータ₂−ミクログロブリン、Ｔ
ＢＧ、ＩＡＰ、ＣＲＰ、アルファ₂−ミクログロブリ
ン、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、セルロ
プラスミン、Ｃ３、α₁−酸性糖タンパク質、α₁−抗
トリプシン、α₁−抗キモトリプシン、フィブリノーゲ
ン、ハプトグロビン、ＳＡＡ、及びトランスフェリンに
特に適切である。本発明のアッセイによる測定に更によ
り適切なものはＣＲＰである。

【００１４】本発明のアッセイのレセプター（Ｒ₁、Ｒ
₂及びＲ₃）は、標識リガンドに特異的にバインドする
いずれかの物質であり、それらとしては、限定されるも
のではないが、抗体（モノクローナル、ポリクローナ
ル、全体、断片、誘導体及びそれらの混合物を包含す
る）、抗原、アビジン、ビオチン、チロキシン、チロキ
シンバインディンググロブリン、多糖類、ホスホリルコ
リン、リン酸二水素アミノエチル残基、エストロゲン、
ビタミンＢ−１２内因子、ヨウ酸（folate）結合タンパ
ク質、性ホルモン結合タンパク質及びそれらの混合物な
どが挙げられ、その各々が多数の既知供給源より入手可
能である。レセプターは、免疫反応並びに非免疫反応に
よって標的リガンドに結合できる。本明細書で用いられ
るレセプターは、第１レセプター（「Ｒ₁」）、第２レ
セプター（「Ｒ₂」）及び第３レセプター（「Ｒ₃」）
と称される。第１、第２及び第３レセプターの名称は、
いずれかの種類のアッセイ系の検出もしくはメカニズム
を示すためというよりはむしろ明瞭にすることを目的と
して使用されている。

【００１５】捕捉試薬として供給するために、Ｒ₁は水
不溶性支持体に固定化される。Ｒ₂は標識レセプターを
表す。Ｒ₁及びＲ₂が標的リガンドに特異的に結合する
いずれかの物質より選択できるとはいえ、Ｒ₁及びＲ₂
は、Ｒ₁及びＲ₂が標的リガンド上の２つの異なる部位
に特異的に結合するような２つの異なる物質を表す。Ｒ
₃は、非結合Ｒ₁、非結合Ｒ₁の断片、非標識Ｒ₂、非
標識Ｒ₂の断片、それらの誘導体もしくはそれらの混合
物と定義される非結合且つ非標識レセプターを表す。

【００１６】多種多様な標的リガンド及びレセプター型
が本発明に包含される。例えば、或る好ましいアッセイ
は、標的リガンドが抗原性物質であり、Ｒ₁が該抗原性
物質に特異的なポリクローナル抗体であり、Ｒ₂が該抗
原性物質に特異的な標識モノクローナル抗体であり、且
つＲ₃がＲ₂と同じモノクローナル抗体である（Ｒ
₃は、標識されていないことによってのみＲ₂と異な
る）ような免疫反応により行われる。あるいは、別の好
ましいアッセイ（特にＣＲＰの測定には好ましい）は、
リガンドがＣＲＰであり、Ｒ₁がホスホリルコリンであ
り、Ｒ₂が標識モノクローナル抗体であり、且つＲ₃が
Ｒ₂と同じモノクローナル抗体である（Ｒ₃は、標識さ
れていないことによってのみＲ₂と異なる）ような免疫
及び非免疫メカニズムの両方を組み合わせたものであ
る。

【００１７】Ｒ₁を捕捉するために使用される水不溶性
支持体は、水もしくは生物学的流体に暴露したときに、
それらの構造保全性を維持するであろう無機及び／又は
有機物質から製造できる。水不溶性支持体を製造するの
に使用できる適当な無機物質としては、珪質物｛例え
ば、ガラス（多孔質ガラス及び艶消ガラスなど）、シリ
カ（シリカゲル及びコロイド状シリカなど）、ベントナ
イト、珪灰石及び菫青石など｝、並びに非珪質金属酸化
物｛例えば、アルミナ、スピネル、アパタイト、ヒドロ
キシアパタイト、チタニア、ジルコニア及び磁気物質
（例えば、酸化鉄、フェライト、酸化ニッケル及び酸化
コバルトなど）｝が挙げられる。水不溶性物質を製造す
る際に使用できる適当な有機物質としては、ポリマー粒
子（例えば、ポリスチレン及びその誘導体、アクリル系
ポリマー、ポリメタクリレート、ポリオレフィン、ハロ
ゲン含有ポリマー、ポリエステル及びポリアミド）、多
糖類、セルロース、デキストラン、アガロース、紙、ポ
リペプチド並びにコラーゲンなどが挙げられる。

【００１８】水不溶性支持体は、（微粉砕粉末、例え
ば、強磁性流体（ferrofluid）から粗顆粒状物質までの
多様な）事実上粒子状であるか、又は造形品、例えば、
ビーズ、試験管、トレイ、マイクロタイタープレート、
膜、フィルム、濾紙及びディスクなどでありうる。好ま
しくは、Ｒ₁が、0.01μｍ〜20μｍ、より好ましくは
0.1μｍ〜１μｍ、そして最も好ましくは 0.2μｍ〜 1.
2μｍの範囲の粒径を有する水不溶性粒子状支持体上に
固定化される。

【００１９】本発明に特に有用な水不溶性支持体には、
Ｒ₁と容易に反応する反応性基を有するポリマーより調
製された粒子が挙げられる。そのような反応性基の具体
例としては、活性ハロゲン基、活性エステル基、ビニル
基、アルデヒド基、アジリジン基、エポキシ基、カルボ
キシ基、ビニルスルホニル、活性化２−置換エチルスル
ホニル及び第１アミン基が挙げられる。これらの反応性
基を組み入れたポリマーの有用な製造方法及びこれらの
ポリマーとＲ₁のような物質とを反応せしめる方法は周
知であり、且つ例えば、EPA 0 323 692; EPA 0 496 47
2; EPA 0 496 472; EPA 0 466 220; EPA 0 308 235; EP
A 0 426 670; 及びEPA 0 411 711 に記載されている。
また不溶性支持体として使用可能なものは、米国特許第
4,997,772号明細書に記載されるようなコア／シェルポ
リマー、及び米国特許第 5,053,443号明細書及びEPA 0
308 233 、米国特許第 5,147,777号、同第 5,149,737号
及び同第 5,210,289号明細書並びにEPA 91,201,419.8に
記載されるような着色できるポリマー粒子である。

【００２０】水不溶性支持体の中でＲ₁の固定化により
好ましいものは、活性化２−置換エチルスルホニル基、
特に２−ハロエチルスルホニル基を含有するポリマーも
しくは反応性カルボキシル基を含有するポリマーより製
造された粒子である。Ｒ₁は、例えば、当該技術分野で
既知の、例えば、化学的カップリング、単純な吸着、又
は特異的バインディングペアを使用することを包含す
る、当業者らに既知であるいずれかの手段により水不溶
性支持体上に固定化できる。例えば、化学的カップリン
グは、不溶性支持体を１つ以上の化学化合物（シラン及
びポリイソシアネートなど）で処理し、続いて処理した
水不溶性支持体をＲ₁の水性溶液と接触せしめることを
含む。あるいは、支持体が、Ｒ₁と共有結合する反応性
基を有していてもよい。当該技術分野で既知であるよう
に、例えば、吸着は、Ｒ₁の水性溶液と不溶性支持体と
を、所望の又は最大級の固定化が行われるのに十分な時
間接触せしめることにより達成できる。EPA 0 302 715
に記載されるように、特異的バインディングペア、例え
ば、アビジンとビオチン、レクチンと糖も、使用でき
る。

【００２１】最も好ましくは、Ｒ₁が抗体を表す場合、
水不溶性支持体はポリ〔スチレン−コ−ｍ及びｐ−（２
−クロロエチルスルホニルメチル）スチレン〕ビーズよ
り製造され、例えば、EPA 0 323 692 に記載されるよう
な技法を用いてＲ₁が共有結合せしめられる。最も好ま
しくは、Ｒ₁がホスホリルコリン（好ましくはホスホリ
ルコリンのアミンもしくはスルフヒドリル基含有エステ
ルを含む修飾ホスホリルコリン、より好ましくはホスホ
リルコリンの４−アミノフェニルエステル）を表す場
合、不溶性支持体はカルボン酸含有ポリマー、好ましく
はポリ｛スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチ
オ）プロピオン酸｝より製造され、米国特許第 4,421,8
47号明細書に記載されるように、活性化剤、例えば、カ
ルボジイミドの援助によって、修飾ホスホリルコリンの
アミンもしくは修飾ホスホリルコリンのスルフヒドリル
基（好ましくはアミン基）とポリマーのカルボキシル基
との反応により、Ｒ₁がポリマーに共有結合される。

【００２２】比較例２（本明細書に下記）で具体的に説
明されるように、リガンドが高濃度で存在するときに測
定シグナル系の飽和を低減するために、Ｒ₂：Ｒ₃の割
合を使用すべきである。好ましくはＲ₂及びＲ₃は、ア
ッセイ中、Ｒ₂：Ｒ₃の割合が１：50〜１：1000の範囲
内で、より好ましくは１：65〜１：750 の範囲内で、そ
して最も好ましくは１：80〜１：155 の範囲内で存在す
る。

【００２３】アッセイは、いずれかの順序で実施でき
る。例えば、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃を、流体試料がすべて
のレセプターと同時に相互作用するように含めてもよ
く、又は流体試料の導入前後に、各レセプターを別個に
含めてもよい。

【００２４】本発明によれば、Ｒ₂は、当業者らに既知
であるように、単独に又は別の反応体と組み合わせて、
測定可能なシグナルを発生できる１つ以上の適当な物質
で標識される。標識としてＲ₂に付着可能である適当な
物質としては、限定されるものではないが、１つ以上の
以下のもの：放射性同位体類（例えば、Ｉ¹²⁵など）、
酵素類（例えば、ベータ−ガラクトシダーゼ、アルカリ
性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ及び西洋ワ
サビペルオキシダーゼなど）、蛍光性物質類（例えば、
ユーロピウム及びユーロピウム誘導体など）、化学ルミ
ネセンス物質類（例えば、ルミノール誘導体など）、並
びに色素（例えば、ロイコ色素及び蛍光色素）などが挙
げられる。好ましい標識は、酵素標識、例えば、アルカ
リ性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ及び西洋
ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。Ｒ₂につい
ての最も好ましい標識はＨＲＰである。

【００２５】当業者らに既知である数多くの技術を使用
して、Ｒ₂に標識物質を付着せしめることができる。好
ましくは、標識物質がいずれか適する技法でＲ₂に共有
結合される。Ｒ₂が酵素物質で標識される場合には、別
の反応体（典型的には酵素の基質）がアッセイ系に含ま
れる。本発明のアッセイがそのように調製される場合に
は、当業者らに既知であるように、液体試料の導入の前
に、液体試料と同時に、又はサンドイッチのバインディ
ング反応完了後に、アッセイ系に酵素の基質を含ませて
もよい。酵素基質は、酵素標識によって直接作用を受け
る物質であるか、又は標識の酵素反応を包含する一連の
反応に含まれる物質でありうる。例えば、酵素標識がＨ
ＲＰである場合には、基質は過酸化水素である。酵素が
グルコースオキシダーゼである場合には、基質はグルコ
ースである。

【００２６】更に、酵素標識を使用するときには、標識
の反応の結果として検出可能な種を提供する１つ以上の
試薬を含む指示組成物をアッセイ系に使用してもよい。
好ましくは、指示組成物は、基質との酵素反応の結果と
して比色定量的に検出可能な種を提供する比色定量用指
示薬である。指示組成物は、当該技術分野で既知であり
且つ米国特許第 4,729,950号及び同第 4,598,044号明細
書に記載されるように、単一化合物であるか、もしくは
酵素反応の際に検出可能な色素を生成するか又は化学ル
ミネセンス発光を生じる試薬の組み合わせである。例え
ば、グルコースオキシダーゼが酵素標識として使用され
る場合には、グルコースが基質として使用され、反応に
よってグルコン酸が生成し、そこでグルコン酸と反応し
て色素を生成するカプラー及び酸化可能な化合物を有す
る比色定量用指示薬組成物を使用してもよい。あるい
は、ＨＲＰ（もしくは別の適当な過酸化化合物）を酵素
標識として使用する場合には、次いでペルオキシダーゼ
及び過酸化水素の存在下で検出可能な色素を生成するロ
イコ色素を使用してもよい。適当なロイコ色素として
は、限定されるものではないが、米国特許第 4,089,747
号、同第 4,670,385号及び同第 4,828,983号明細書に記
載のものが挙げられる。

【００２７】本発明方法は、溶液アッセイ並びに乾式分
析要素の両者に適用できる。イムノアッセイが溶液アッ
セイとして調製される場合には、分析組成物（及び含め
る場合には指示組成物）が、適当な容器（例えば、試験
管、ペトリ皿、ビーカー及びキュベットなど）中でリガ
ンドを含有する液体試料と接触せしめられる。

【００２８】本発明方法が乾式分析要素を用いて実施さ
れる場合には、最も単純な要素は、分析組成物を含有す
る吸収性担体物質、例えば、自立吸収体もしくは吸水性
（bibulous）物質の薄いシート、例えば、濾紙又はフィ
ルターストリップから構成されうる。また要素は、物質
の別個の区画に導入された分析組成物の異なる成分を備
えた２つ以上の不連続な区画に区分できる。そのような
要素としては、試験ストリップ、診断要素、ディップス
ティック及び診断剤などが挙げられ、それらの調製方法
及び用途は当業者らに既知である。

【００２９】本発明の実施に特に有用な乾式分析要素フ
ォーマットは、多孔質展開区画（多孔質粒子状構造物、
多孔質ポリマーフィルム、多孔質反射ポリマービーズ、
セルロース、ガラス繊維、並びに織布及び不織布などか
ら作製される）及び非孔質の透明な支持材（紙、金属ホ
イル、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネー
ト、セルロースエステル及びゼラチンなど）を有するも
のである。

【００３０】展開層が、区画の各方向について同一の多
孔性を有する等方性多孔質であることが望ましい。その
ような展開区画は、例えば、米国特許第 4,258,001号明
細書に記載されるような付着粒子そして例えば、米国特
許第 3,992,158号明細書に記載されるものを初めとする
着色区画の構造物を包含する数多くの材料から作製され
る。ビーズ展開区画を含む粒子の相互連絡は、粒子、繊
維及びポリマー鎖などの間の空間もしくは孔を相互連絡
可能にする。

【００３１】好ましい展開区画は、「ブラッシングポリ
マー（blush polymer)」区画と米国特許第 3,992,158号
明細書に記載されるものである。そのような区画は、一
方がポリマーについて低沸点の良溶剤であり、もう一方
がポリマーについて高沸点の非溶剤もしくは不良溶剤で
ある、２つの有機液体の混合物にポリマーを溶解せしめ
ることにより、支持性材料の上に形成できる。

【００３２】得られたポリマー溶液を支持性材料の上に
被覆し、そして調節された条件下で乾燥すると、等方性
多孔質区画が得られる。種々ポリマーがこれに関して有
用であることが知られており、それらとしては、限定す
る訳ではないが、ポリカーボネート類、ポリアミド類、
ポリウレタン類及びセルロースエステル類、例えば、酢
酸セルロース（これが好ましい）が挙げられる。

【００３３】任意に、多孔質区画内に気孔率を増大する
種々サイズの粒子状物質を導入することができる。有用
な粒子状物質としては、限定する訳ではないが、無機顔
料、例えば、二酸化チタン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、
酸化鉛が挙げられ、二酸化チタンが好ましい。更に詳細
な「ブラッシングポリマー」の製法は、米国特許第 3,9
92,158号明細書に記載されている。

【００３４】好ましくは、多孔質展開区画が要素の最外
区画である（１つ以上の区画が使用される場合）。多孔
質展開区画は、例えば、米国特許第 4,292,272号、同第
3,992,158号、第 4,258,001号及び同第 4,430,436号明
細書並びに関連米国特許明細書、そして特開昭57-10176
0 号公報(1982)に記載されるような区画に使用される、
いずれかの既知材料より作製できる。好ましくは、展開
区画の粒子状物質が付着量20〜150 g/m²で、より好まし
くは50〜150 g/m²で存在する。

【００３５】好ましくは、本発明の乾式要素が流体浸透
性である２つ以上の隣接区画（又は層）を有する。区画
は、区画が水性流体に暴露されたときにそれらの保全性
を維持する材料でそれらが構成されうることを意味する
「自立性」であるもの、例えば、濾紙もしくは微孔質膜
でありうる。しかしながら、好ましくはそのような区画
は、寸法安定性であり化学反応に不活性であり且つ好ま
しくは透明（即ち、 200〜900nm 間の波長について輻射
線透過性）である別個の非孔質支持材の上に配置され
る。しかしながら、検出モードとして透過分光法の代わ
りに反射分光法を用いる場合には、不透明な支持材が使
用できる。有用な支持材は当該技術分野で周知であり、
それらとしては、限定する訳ではないが、ポリエステ
ル、紙、金属ホイル、ポリスチレン、ポリカーボネート
及びセルロースエステルが挙げられる。

【００３６】好ましい乾式分析要素は、アッセイに必要
とされる１つ以上の試薬を含有する少なくとも１つの別
の区画を含むことができる。そのような区画は試薬区画
もしくは記録（registration) 区画として当該技術分野
で既知であることが多いが、しかし加えてまたそれは、
所望であれば第２多孔質展開区画もしくは別の区画に置
かれた印刷層を含むことができる。一般的には、区画は
互いに流体接触状態であり、これは、もちろん、当業者
らに既知であるように、区画範囲内を又は区画範囲外を
移動しないように何らかの手段で試薬が固定化されてい
ることを除いて、流体、試薬及び試薬生成物が、隣接す
る区画の重なった領域間を通過又は輸送されうることを
意味する。好ましくは、区画が別個に被覆され、そして
不活性支持材上の層に重ね合わされる（下記実施例１を
参照されたい）。試薬区画もしくは層は、１つ以上のバ
インダー材料（例えば、ゼラチン及び別のコロイド物
質、親水性ポリマー、例えば、ポリビニルアルコール、
ポリアクリルアミド並びに当該技術分野で既知の別のも
の）から構成でき、そこに試薬が組み入れられる。

【００３７】そのような要素の製造方法は当該技術分野
で周知であり、そしてそれは支持材の上に区画組成物の
湿潤製剤を塗布して適当な条件下で乾燥させることを含
む。コーティング方法は、展開区画について記載した前
記従来技術文献に詳細に記載されている。

【００３８】Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃が要素内の異なる区画
もしくは同一の区画に配置できるとはいえ、特に好まし
い乾式分析要素は、Ｒ₁が区画内に組み入れられている
ポリマービーズ展開区画を含む。組み入れる際に、Ｒ₁
は水不溶性粒子状支持体上に固定化されて、展開区画内
に分散される。前記粒子状支持体のサイズは（前述の通
り） 0.001μｍ〜20μｍの範囲内である。好ましくはＲ
₂及びＲ₃が要素中の多孔質展開区画とは別個の区画に
組み入れられるが、とはいえＲ₂及びＲ₃を両方とも
（又は別々に）溶液中に存在させて要素中に組み入れな
くてもよい（流体試料を要素と接触せしめる前、最中も
しくは後に、要素と接触させる）。

【００３９】本発明に従って、ＣＲＰが測定しようとす
るリガンドであるとき、アッセイ系にカルシウムイオン
を含めることによってアッセイの挙動が改良されること
が見いだされた。例えばカルシウムは、溶液アッセイで
は流体試料中に含めてもよく、又は乾式分析要素中に組
み入れてもよい。好ましくは、カルシウムイオンを含め
る場合、カルシウム0.01Ｍ〜 0.5Ｍの範囲内で、好まし
くは0.02Ｍ〜 0.2Ｍの範囲内で、そして最も好ましくは
0.1Ｍで、カルシウムイオンを存在させる。いずれか適
当な形のカルシウムイオン、例えば、広く市販されてい
る、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、臭化カルシウ
ム、ヨウ化カルシウム及び硝酸カルシウムなど（好まし
くは溶液状）が使用できる。経費及び入手し易さの点か
ら便利なカルシウムイオンの形態は、 CaCl₂・H₂O であ
る。

【００４０】また本発明に従って、ＣＲＰが測定しよう
とするリガンドであるとき、試薬としてトリアリールイ
ミダゾールロイコ色素を使用する場合に溶剤としてＳＤ
Ｓを用いることによってアッセイ系の測度が増強される
ことが見いだされた。より詳細には、乾式要素フォーマ
ットが使用されるとき、例えば、下記実施例３に示され
るような方法で、（好ましくは展開区画とは別個の試薬
区画に、より好ましくはゼラチン試薬区画に）ＳＤＳ及
びロイコ色素溶液が乳濁液として要素に組み入れられ
る。

【００４１】当業者らに既知であるように、被検体流体
試料は、多数の方法により、例えば、１〜 200μＬの量
の流体試料を用いて、アッセイ系と物理的に接触せしめ
ることができる。接触せしめた後、要素内の試料と試薬
は、１区画を越える区画が使用されるときには各種区画
内で混合状態になる。そのような接触は、いずれかの適
当な方法、例えば、要素を試料に浸漬すること（dippin
g or immersing) により、又好ましくは手もしくは適当
な機械により試料を要素上にスポットすることにより達
成できる。

【００４２】被検体がアッセイ系に導入された後にＲ₁
−リガンド−Ｒ₂の水不溶性複合体（以下本明細書では
「水不溶性複合体」）を得るために、当業者らに既知で
ある通常の条件下でアッセイを実施できる。例えば、試
料塗布後、試験結果の入手を速めるかその逆に促進する
ために望まれるかもしれないいずれかのコンディショニ
ング、例えば、インキュベーション、加熱又はその逆の
条件に、アッセイは暴露される。好ましくは、アッセイ
が、５〜50℃（好ましくは34〜40℃）の温度範囲内で数
秒間から24時間で達成できる。アッセイが広いpH範囲に
亘ってインキュベーション可能であるとはいえ、典型的
にはアッセイは５〜９のpH範囲内で実施される。

【００４３】リガンドの濃度は、水不溶性複合体に存在
するＲ₂の部分又は非結合且つ溶解性のままである反応
していないＲ₂を定量することにより測定できる。水不
溶性複合体を流体試料及び反応していないＲ₂から物理
的に分離することは、当業者らに既知であるいずれかの
適当な技法を用いて達成できる。例えば、反応期間の
後、過剰の非結合Ｒ₂は、当業者らに既知であるいずれ
かの適当な技法による洗浄工程によって水不溶性複合体
から除去できる。

【００４４】洗浄工程を利用するときには、使用する洗
浄液は当業者らに既知であるいずれか適当な溶液であり
うる。例えば、好ましい洗浄流体としては、蒸留水、生
理食塩水、リン酸緩衝剤（例えば、Na₂HPO₄もしくはNa
H₂PO₄）などが挙げられる。より詳細には、標識が酵素
であるときには、洗浄溶液は、また更に、例えば、酵素
に特異的な基質、界面活性剤〔好ましくは非イオン性界
面活性剤、例えば、ポリ（オキシアルキレンアルコー
ル）類〕、基質の酸化を援助する電子移動剤（例えば、
ｐ，ｐ′−ビフェノール、ｐ−メトキシフェノール、ｏ
−メトキシフェノール、ｐ−アニシジン、ｐ−ヒドロキ
シ−Ｎ，Ｎ′−ジメチルアニリンもしくはｏ−フェニレ
ンジアミン、及び４′−ヒドロキシアセトアニリド）、
並びに複合剤〔例えば、ジ−、トリ−、及びテトラ−ア
ミノ化合物の酢酸誘導体を包含する酸誘導体（例えば、
エチレンジアミン四酢酸及びジエチレントリアミン五酢
酸）〕を含んでもよい。標識が西洋ワサビペルオキシダ
ーゼであり且つ比色定量用指示薬がロイコ色素である場
合に洗浄液として特に有効であるものは、過酸化水素の
酸化を援助する電子移動剤（最も好ましくは４′−ヒド
ロキシアセトアニリド）及び複合剤（最も好ましくはジ
エチレントリアミン五酢酸）を含む過酸化水素（基質）
のリン酸緩衝溶液である。また別のアッセイフォーマッ
ト、例えば、EPA 0 462 644 に記載されるものを使用し
てもよい。

【００４５】リガンドの濃度を測定する目的でのＲ₂の
検出は、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイ
ムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、及び化学ルミネセ
ンスイムノアッセイなどを介してイムノアッセイのシグ
ナルを測定することを包含する、当業者らに既知である
方法により達成できる。本発明のアッセイが特に定量分
析に適切であるとはいえ、該アッセイは定性分析につい
ても同様に適切である。本発明を以下の例によりここで
更に具体的に説明するが、それらに限定することを意図
するものではない。

【００４６】

【実施例】実施例各実施例において、アッセイに乾式分析要素及び洗浄溶
液を使用した。ロイコ色素はトリアリールイミダゾール
ロイコブルーカラー色素４，５−ビス（４−ジメチルア
ミノフェニル）−２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメ
トキシフェニル）イミダゾールである。要素について言
及すると、q.s.は記載される各層についての総湿潤付着
量を満たすために必要であるイオン交換蒸留水の量を示
す。要素及び洗浄溶液に使用される別の材料は、以下の
ように入手した：SURFACTANT（界面活性剤） 10G（イソ
ノニルフェノキシポリグリシドール界面活性剤），Olin
Corporation (Stamford, Conn., U.S.A.)市販；TRITON
（商標）X-100 非イオン性界面活性剤，Rohm and Haas
(Philadelphia, Pa., U.S.A.）市販；ZONYL （商標）FS
N 非イオン性界面活性剤，DuPont (Wilmington, Del.,
U.S.A.) 市販；西洋ワサビペルオキシダーゼ，Sigma Ch
emical Co. (St. Louis, Mo., U.S.A.) もしくはMiles
Laboratories (Elkhart, Ind., U.S.A.)市販；及びフィ
ルム要素もしくは洗浄溶液中の下記成分の残りはEastma
n Kodak Company (Rochester, N.Y.,U.S.A.) 市販のも
のであるか、又は当業者らに既知である標準的な方法と
容易に入手可能な出発物質を用いて調製可能である。

【００４７】要素Ａ層成分付着量 (g/m²) 総湿潤付着量 270 イオン交換蒸留水 q.s. -02 ビーズＮ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２− 0.219 展開層アミノエタンスルホン酸緩衝剤（pH7.55）５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン 0.075 ４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）− 0.300 ２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）イミダゾールロイコ色素ジメチルスルホキシド 2.700 ポリ（メチルアクリレート−コ−ナトリウム２− 2.583 アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホネート−コ−２−アセトアセトキシエチルメタクリレート）ポリ（ｍ−及びｐ−ビニルトルエン−コ− 130.0 メタクリル酸）粒子（平均直径30μｍ） ZONYL FSN 0.054 メタノール 0.675 ＣＲＰポリクローナル抗体を共有結合せしめた 1.2 ポリ〔スチレン−コ−ｍ−及びｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）スチレン〕の粒子イソプロピルアルコール 0.405 界面活性剤 10G 0.238 -01 ゲル総湿潤付着量 100 イオン交換蒸留水 q.s. 骨ゼラチン 10.00 ４′−ヒドロキシアセトアニリド 0.15 Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２− 4.58 アミノエタンスルホン酸緩衝剤 TRITON X-100 0.020 ビス（ビニルスルホニルメチル）エーテル 0.15 支持材ポリ（エチレンテレフタレート）洗浄流体処方過酸化水素 0.03％リン酸ナトリウム，pH 6.8 0.01Ｍ４′−ヒドロキシアセトアニリド 0.005 Ｍジエチレントリアミン五酢酸 10μＭイオン交換蒸留水 q.s.

【００４８】要素の第１層（層01）を、下塗りしたゲル
洗浄ポリ（エチレンテレフタレート）支持材の上にコー
ティングし、第２層（層02）を最上部にコーティングし
た。Ｒ₁はポリクローナル抗ＣＲＰヤギ抗体（DiaMed C
ompany, South Windham, ME, U.S.A. より購入）であ
り、それをEPA 0 302 715 B1及び米国特許第 5,177,023
に記載のポリ〔スチレン−コ−ｍ−及びｐ−（２−クロ
ロエチルスルホニルメチル）スチレン〕の粒子状水不溶
性ポリマービーズ（重量比90/10;サイズ直径0.42μｍ）
に共有結合せしめた。

【００４９】抗原ＣＲＰ（Scripps Laboratoriesより購
入）の流体試料を、リン酸ナトリウム（0.02Ｍ，pH6.8
）及び塩化ナトリウム（0.15Ｎ）の溶液中、ＣＲＰを
含まないもの（対照）からＣＲＰ濃度25.6mg/Lのものま
で（本明細書に下記の第Ｉ表に示されるように）濃度を
変化させて調製した。Ｒ₂は、Clinical Chemistry, vo
l.30, 1446〜1451ページ（1984）に記載されるように、
チオール／マレイミド方法により西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ標識を付着せしめたモノクローナル抗ＣＲＰ抗体
（Medix Biochemica, Finland より購入）であった。Ｒ
₃は、標識していないモノクローナル抗ＣＲＰ抗体（Ｈ
ＲＰ標識を所有しないが、Ｒ₂と同一のもの）であっ
た。Ｒ₂及びＲ₃は、以下のように、Ｒ₂：Ｒ₃の割合
が、１：151でＣＲＰ溶液に含まれる：Ｒ₂＝4.455 ×1
0^-3μｇ（6.46×10^-4IU，１μｇ＝0.145 IU，IU＝ＨＲ
Ｐ活性の国際単位）及びＲ₃＝0.675 μｇ。総量10μＬ
のＣＲＰ、Ｒ₂及びＲ₃溶液を、各ＣＲＰ濃度について
フィルム要素上にスポットした。次いでスポットした要
素を37℃で５分間インキュベートし、その後上記洗浄溶
液10μＬで洗浄して過剰の標識Ｒ₂を要素の端に移動さ
せ、そしてＨＲＰ触媒色素酸化を開始させた。

【００５０】次いで要素を37℃のインキュベーターに戻
した。読み取り時間帯約０〜１分間に要素の中心におけ
る過酸化水素によるトリアリールイミダゾールロイコ色
素の酸化速度を測定することにより、Ｒ₁−ＣＲＰ−Ｒ
₂サンドイッチの免疫複合体の量を求めた。J. Optical
Soc. Am., 43, 595 (1953) に記載のように反射計によ
り各洗浄要素の透過濃度（Ｄ_t／分）の増加速度を測定
した。データを下記第Ｉ表に記録し、そのデータの較正
曲線を図面のライン１として示す。示した通り、測定シ
グナルが飽和することなく動的範囲全体に亘って測定を
行うことができた。

【００５１】比較例１ＣＲＰの流体試料を、実施例１に記載の濃度で調製し
た。この例は、Ｒ₂のみを4.455 ×10^-3μｇ〔6.46×10
^-4IU〕の濃度でイムノアッセイに使用した場合の比較を
具体的に示すものである。Ｒ₃は含まなかった。総量10
μＬのＣＲＰ及びＲ₂溶液を、各ＣＲＰ濃度についてフ
ィルム要素にスポットした。次いで実施例１に記載のよ
うに、スポットした要素をインキュベートし、洗浄し、
そして測定した。以下本明細書中、データを第Ｉ表に記
録し、そのデータの較正曲線を図面のライン２として示
す。較正曲線が示す通り、読み出しは急速に飽和し始
め、よって不十分なＣＲＰ動的範囲を示す。

【００５２】比較例２ＣＲＰの流体試料を、実施例１に記載の濃度で調製し
た。この例は比較するためのものであり、Ｒ₂及びＲ₃
は、以下のように、Ｒ₂：Ｒ₃の割合を１：0.291 (3.4
3:1)で使用した場合の比較を具体的に示すものである。
Tung他，米国特許第 4,788,138号明細書に教示されるよ
うに、Ｒ₂＝4.455 ×10^-3μｇ（6.46×10 ^-4IU）及びＲ
₃＝1.299 ×10^-3μｇで使用した。総量10μＬのＣＲ
Ｐ、Ｒ₂及びＲ₃溶液を、各ＣＲＰ濃度についてフィル
ム要素にスポットした。次いで実施例１に記載のよう
に、スポットした要素をインキュベートし、洗浄し、そ
して測定した。以下本明細書中、データを第Ｉ表に記録
し、そのデータの較正曲線を図面のライン３として示
す。較正曲線が示す通り、Ｒ₃（過剰の抗体）を使用し
たとはいえ読み出しは急速に飽和し始め、よってＣＲＰ
を測定するために過剰の抗体を使用しても、動的範囲が
改良されないことを示す。

【００５３】

【表１】

【００５４】第Ｉ表に示されるデータは、広い濃度範囲
に亘って抗原を測定できることを具体的に示している。
本発明により教示されたＲ₂：Ｒ₃の割合の範囲内で使
用する場合の思いがけない利点を図面に示す。実施例１
（図面中のライン１）のみが、試験した全濃度範囲に亘
ってＣＲＰを測定できたことを具体的に示す。実施例２
（ライン２）は、Ｒ₂のみを有する従来技術の典型的な
イムノアッセイを示すために含めたものであり、これは
読み出しが急速に飽和し始めている。実施例３（図面中
のライン３）は、本発明により教示された割合の範囲外
の過剰の標識していない抗体（Ｒ₃）を有する調製され
たアッセイを具体的に示すものである。思いがけなく、
Ｒ₂：Ｒ₃の割合が、特異的バインディングアッセイの
動的範囲を改良する際に重要であることが見いだされ
た。

【００５５】実施例２Ｒ₂：Ｒ₃の割合を１：86でＣＲＰ溶液に含めるのでは
なく、0.0045ＣＲＰモノクローナル抗体（Ｒ₂）及び0.
000053ＣＲＰモノクローナル抗体（Ｒ₃）をフィルム要
素のビーズ展開層に組み入れたことを除いて、実施例１
に記載の方法に従って要素を作製した。試験した流体試
料中のＣＲＰ濃度並びに試験した各試料のについてのシ
グナル測度を第II表に示す。第II表のデータは、抗原Ｃ
ＲＰが高濃度のときにもシグナル測度の飽和が生じなか
ったことを示す。

【００５６】

【表２】

【００５７】実施例３実施例２の方法を、本明細書の以下に示す要素Ｂを用い
て行った。

【００５８】要素Ｂ層成分付着量 (g/m²) 総湿潤付着量 270 イオン交換蒸留水 -02 ビーズＮ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２− 0.219 展開層アミノエタンスルホン酸緩衝剤（pH 7.0） ZONYL FSN 0.054 メタノール 0.675 ５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン 0.5 ウシ血清アルブミン 0.5 CaCl・H₂O 1.48 ４′−ヒドロキシアセトアニリド 0.15 ホスホリルコリンを共有結合せしめた 0.16 ポリ〔スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸〕（Ｒ₁）ポリ（ｍ−及びｐ−ビニルトルエン−コ− 130.0 メタクリル酸）粒子（平均直径30μｍ）モノクローナル抗体（Ｒ₃） 0.027 西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合せしめた 0.00035 モノクローナル抗体（Ｒ₂） -01 ゲル総湿潤付着量 139 イオン交換蒸留水 139 骨ゼラチン 5.00 Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２− 4.58 アミノエタンスルホン酸緩衝剤（pH＝7.0 ）４′−ヒドロキシアセトアニリド 0.15 ４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）− 0.15 ２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）イミダゾールロイコ色素及びドデシル硫酸ナトリウム乳濁液 1.34 ビス（ビニルスルホニルメチル）エーテル 0.15 TRITON X-100 0.004 支持材ポリ（エチレンテレフタレート）

【００５９】本例は、免疫反応、及びＲ₁が、ポリ〔ス
チレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオ
ン酸〕ビーズの粒子状水不溶性支持体に付着せしめられ
ている下記構造のホスホリルコリンの４−アミノフェニ
ルエステルである非免疫機構の両方を具体的に示すもの
である。

【００６０】

【化１】

【００６１】ポリマー主鎖のカルボキシ反応性基とアミ
ン基とを、カルボジイミド活性化剤〔１−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド，米国
特許第4,421,847号明細書に記載〕を用いて約４時間反
応させることにより、ビーズ（直径 0.4μｍ）にＲ₁を
共有結合させた。Ｒ₂及びＲ₃を１：77（Ｒ₂：Ｒ₃）
の割合で要素に導入した。カルシウムを1.48g/m²の付着
量でビーズ展開層に導入した。実施例１の方法に従っ
て、ＣＲＰ流体試料の濃度を変化させて測定を行った。
濃度レベル並びに発生したシグナルの測度を本明細書の
下記第III 表に示す。

【００６２】

【表３】

【００６３】

【発明の効果】特異的バインディング方法は、シグナル
系の飽和が実質的に排除されるため、広い濃度範囲を有
するリガンドに特に適することが見いだされた。被検体
を希釈することなく、標的リガンドが非常に低い又は非
常に高い濃度で被検体中に存在するかどうか定量でき
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、比較例１及び２に記載されるように、
従来の方法を使用する場合（ライン２及び３）に得られ
る測度シグナル系の飽和と比較した、本発明で達成され
た定量結果（ライン１）を具体的に示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｃ反応性タンパク質に特異的な標識非結
合レセプター対Ｃ反応性タンパク質に特異的な非標識非
結合レセプターの割合を約１：50〜約１：1000の範囲で
用いて、Ｃ反応性タンパク質を測定するための特異的バ
インディングアッセイ方法。
【請求項２】多孔質展開区画を含んでなる分析要素で
あって、前記多孔質展開区画もしくは異なる区画に、（ａ）水不溶性支持体に固定化されている、リガンドに
特異的な第１レセプターＲ₁、（ｂ）リガンドに特異的な標識非結合第２レセプターＲ
₂、及び（ｃ）リガンドに特異的な非標識非結合第３レセプター
Ｒ₃ （但し、Ｒ₂及びＲ₃は、Ｒ₂：Ｒ₃の割合が約１：50
〜約１：1000で存在し、かつＲ₃はＲ₁、Ｒ₂もしくは
それらの混合物と同様である）を含む分析要素。