JPS61501657A - 抗体、製法と用途 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 抗体、製法と用途 この発明は、遊離かもしくはコンプレックス中に存在してもよい一群のモノクロ ナール抗体、このような抗体の製法及び抗原−抗体反応を使用する反応への利用 に関する。

抗原とその抗体との反応は、バイオテクノロジーでの多くの応用が見出され、と くに診断テスト、たとえば医療用診断テスト、遺伝子調査などで見出されている 。モノクロナール抗体〔たとえばジー、ガルフレとシー、ミルスタイン：メソー ヅイン　エンチモロギ−（Ｇ、　ＱａＨｒｅ　ａｎｄ　Ｑ、　１ｖｌｉｌｏｔａ ｉｎ　、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　）　７３巻、３〜５ １頁、　１９８１年参照〕が、バイオテクノロジー、特に診断テストで特別な用 途があることが見出されている。

モノクロナール抗体は、デー。ニー、ネマジーとブイ、ジエイ、サトー（Ｄ、　 Ａ、　Ｎｅｇ＋ａｚｅｅ　ａｎｄ　Ｖ、Ｊ、３ａｔｏ　；　Ｎａｔｌ　。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ、　Ｖ　２．７９．３８２８〜３８２２頁、１９ ８２年参照）により、新しいエピトープを原抗体の一つのＦｃ部位中で露出して その結果としての２つの他の抗体のコンプレックスに対する抗体であったと記述 されている。原抗体は共に巨大分子であるので、Ｆｃ部位での形態変化は、予期 できないものではなかった。仮に小分子が用いられたとすると同様な変化を生ず ることは期待できないであろう。同様に、小分子は、同時多発生エピトープを有 することができず、かつこのためそれ自体１以上の抗体と結合できないので〔た とえば、アール、ジエー、トンプソンとニー５ピー、ジャクソン（Ｒ，Ｊ、　７ ｈｏｉｐｓｏｎ　ａｎｄ　Ａ、Ｐ、　Ｊａｃｋｓｏｎ、　Ｔ　Ｉ　ＢＳ、　９． １〜３頁、　１９８４年１照）　）Ｎ　ｅａ＋ａｚｅｅと３ａｔｏが記述した効 果は、小分子を用いているコンプレックスを用いると期待し得ないであろう。こ の期待に反し、恐らく異なったメカニズムのため、新しい群のモノクロナール抗 体を作ることができ、驚くべきことにバイオテクノロジー、たとえば診断テスト に有用であることがここに見出された。

従って、この発明は、モノクロナール抗体が、小分子とその小分子に対する結合 蛋白とのコンプレックスに対する二次抗体であり、その二次抗体が、小分子に対 して又はその結合蛋白に対する抗体ではないことを特徴とするモノクロナール抗 体を提供する。

ここで使用する用語“小分子“は、５０００より小さい分子量の分子を意味する 。このような小分子は、２０００より小さい分子量を有するのが最も適切で、１ ２００より小さい分子量を有するのが好ましい。

この発明の蛋白類としては、抗体類、又は酵素類、ストロイド結合蛋白類もしく はビタミン結合蛋白類のごとき結合蛋白類のような蛋白の物質を用いることがで きる。この発明に用いる蛋白は、モノクロナール抗体であるのが好ましく、その 場合小分子がここで小抗原と呼ぶことができる。当業者であれば、この発明で使 用する小分子が普通非免疫性であること、しかし、それの抗体は、動物を非免疫 性分子（もしくは非常に密接な類似体）とウシの血清アルブミンもしくはその均 等剤との抱合（ｃｏｎｊｕ　ｇａｔｅ）で免疫化することにより得られることを 理解されるであろう。望ましい抗体は、それ自体公知の方法で得ることができる 。

したがって、この発明の好ましい形態によれば、小抗原とその小抗原のモノクロ ナール抗体とのコンプレックスに対する二次モノクロナール抗体（ｓｅｃｏｎｄ ａｒｙ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　）で、その二次モノクロナ ール抗体が小抗原に対しもしくはそのモノクロナール抗体に対する抗体ではない ことを特徴とするモノクロナール抗体を提供するものである。

以後使用される用語“二次モノクロナール抗体”とは上で定義したようなこの発 明で提供される抗体を意味するものである。

以後使用される用語“−次（原発性）モノクロナール抗体（ｐｒｉｓａｒｙ　ｍ ｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　）は抗原に対するモノクロナール抗体 （すなわち通常のモノクロナール抗体）を意味する。

モノクロナール抗体は、記述した結合活性を有する完全免疫グロブリン又はその フラグメントであってもよい。以後に明らかになるように、この発明のある具体 例によれば、完全免疫グロブリンの使用がそのフラグメントより有利で、他の具 体例ではＦａｂ及びＦ（ａｔ）’）２フラグメントのような完全免疫グロブリン のフラグメント類の使用がより有利であろう。このことは、二次抗体とコンプレ ックスとの結合が、小分子の結合部位又はそのあたりで行われると考えられる。

二次モノクロナール抗体が小抗原の抗体またはその結合蛋白抗体（−次モノクロ ナール抗体）でないという場合、二次モノクロナール抗体及び小抗原もしくは結 合蛋白は一般にモル当り１０３リツトルより小さい平衡定数を有し、より望まし くはモル当り１０７１リツトルより小さくかつ好ましくはモル当り１０２リツト ルより小さい。普通、二次モノクロナール抗体は、小抗原もしくは一次モノクロ ナール抗体と、無関連の小分子もしくは蛋白と結合するほど大きく結合しないで あろう。

二次モノクロナール抗体及び小抗原と一次モノクロナール抗体のコンプレックス は、少なくともモル当り１０’リツトルの平衡定数を有するのが適し、望ましく は少なくともモル当り１０５リツトル、より望ましくは少なくともモル当り１０ ”リットル、好ましくはモル当り少なくとも１０７リツトルを有する。

上記のことは、また、他の小分子を結合蛋白に結合する類似の方法に適用できる と考える。

（ω二次モノクロナール抗体とコンプレックス及び＋ｂ）二次モノクロナール抗 体とコンプレックスの何れかの成分間の平衡定数の割合は、１００：１より大で あるべきで、１，０００：　１より大がより適し、１０，０００：　１より大が 好ましいと今思われている。

二次モノクロナール抗体（すなわち、小抗原の抗体またはその小抗原の一次モノ クロナール抗体ではないが、抗原と一次モノクロナール抗体とのコンプレックス のモノクロナール抗体であるもの）を選択するのに適する方法は次の通りである 。

１ａ、可能な二次モノクロナール抗体を、ポリスチレンテストチューブの内側の ような固体表面に結合させる。

１ｂ、チューブの各々に同量のラベル化−次モノクロナール抗体（たとえば、放 射能ラベル化）を入れる。

ｌｃ、一連の濃度の抗原を作り、かつ異なる濃度のものを各チューブに加え、一 つのは何も入れない。

１ｄ、チューブを培養する。

１ｅ、未結合物質をチューブから洗い出す。

Ｉｆ、保持されたラベルを測定する。

抗原を入れなかったチューブ中の保持ラベル量が、チューブの何れかに保持され たラベルの最大量のく１％より少ない、より適切には０．１％より少ない、好ま しくは０．０１％より少ないような）小フラクションより少ない場合は、二次モ ノクロナール抗体が小抗原の抗体又は−次モツクＯナール抗体ではなく一次モノ クロナール抗原コンプレックスのモノクロナール抗体であると考えられる。

当業者に理解されるように、小分子は通常抗原性ではなく、しかし、二次モノク ロナール抗体が小分子と結合しない確認として、次の確認テストが使用できる。

２ａ、可能な二次モノクロナール抗体をポリスチレンテストチューブの内側のよ うな固体表面に結合させる。

２ｂ、一群のチューブの各々に同じラベル化抗原（たとえば放射能ラベル化）を 入れる。

２ｃ、一連の濃度の小抗原に対する一次モノクロナール抗□　体を作り、かつ異 なる濃度のものを各チューブに加え、一つのチューブは何も入れない。

２ｄ、チューブを培養する。

２ｅ、未結合物質をチューブから洗い出す。

２ｆ、保持されたラベルを測定する。

−次モツクＯナール抗体を入れなかったチューブ中の保持ラベル量が、何れかの チューブに保持されたラベルの最大量の（１％より少ない、より適切には０．１ ％より少ない、好ましくは０．０１％より少ないような）小フラクションより少 ない場合、可能な二次モノクロナール抗体は、小抗原の抗体ではないと考えられ る。

同様な手法が、小分子及び小抗原や一次モノクロナール抗体以外の結合蛋白に使 用できる。

この発明の二次抗体の望ましい用途は診断テストである。反応における可逆性で の低減が、リガンドと抗体リガンド間の高い明白な親和性（洗浄に対する安定性 の改良をもたらし得る）、早い反応時間等をもたらす。また、この発明の二次モ ノクロナール抗体の用途は、小分子をサンドイツチ法のような非競合法によって 測定できることで、この方法では幅広い濃度で操作できかつ試剤の性質や使用モ ードに感受性が少ない。これは、後述で明らかにされるであろう。

診断的に有用である一群の小抗原にはホルモンが含まれる。

特に関連ホルモンとしては、タイロイド　ホルモンや、プロゲステロン及びエス トロゲンのようなステロイド系ホルモンが含まれる。他の望ましいステロイドに は、ハイドロコーチシン、テストステロン、エストラジオール、エストラトリオ ールやアントロスタンジオールが含まれる。

かくして、この発明の特に適切な観点によれば、ホルモンとそのホルモンのモノ クロナール抗体（このモノクロナール抗体はホルモンに対する抗体又は、そのホ ルモンの抗体に対する抗体ではない）とのコンプレックスに対するモノクロナー ル抗体を提供するものである。

抗体とコンプレックスを形成する特に興味のある他の抗原は、医薬である。この ような医薬には、ゲンタミシンのようなアミノグリコシドのような抗生物質、ジ ゴキシンのような心臓作用剤などが含まれる。乱用薬物が同様に測定できる。

かくして、特に適切な観点によれば、この発明は、医薬とその医薬のモノクロナ ール抗体とのコンプレックスに対するモノクロナール抗体（このモノクロナール 抗体は医薬に対するか又はその医薬の抗体に対する抗体ではない）を提供するも のである。

二次モノクロナール抗体の非常に好ましい用途は、診断テストであり、この発明 のモノクロナール抗体又は抗原−抗体コンプレックスは、ジグナール発生手段（ ｓｉｇｎａｌ　ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇｍｅａｎｓ）からなるのが好ましい。シグ ナル発生手段は測定すべき二次モノクロナール抗体と小抗原−抗体コンプレック スとのコンプレックスの存在を許す何れでもよい。シグナル発生手段は直接的に 測定できるもの（たとえば放射能活性ラベル）又は間接的に測定できるもの（た とえば酵素で、その存在はそれ自体測定できる場合に生ずる）である。シグナル 発生手段が、小抗原−抗体コンプレックスに存在さす場合、抗体にラベルとして 存在するのが最も適切である。しかしより望ましいのは、この発明の二次モノク ロナール抗体中にシグナル発生手段が存在することである。

前記のことから、この発明のことに望ましい観点は、モノクロナール抗体が、小 抗原に対し又はそのモノクロナール抗体に対する抗体ではない、小抗原−モノク ロナール抗体コンプレックスであることを特徴とするシグナル発生手段をラベル したモノクロナール抗体を提供することにあることが理解されるであろう。

同様に、望ましい観点によれば、この発明は、モノクロナール抗体が、小ｖ′Ｌ 原に対するか又はそのモノクロナール抗体に対する抗体ではなく、かつそのコン プレックスがシグナル発生手段でラベル化されていることを特徴とするモノクロ ナール抗体を提供することであることが理解されよう。

ラベル化の適切な方法には、ビー、アール、リガンドとシー。

エフ。バーレスの“ラベル化抗原又は抗体を用いる免疫アッセイ”（Ｐ、　Ｒ， Ｒａｏｏａｔｔ、　ｃ、　Ｎ、　Ｈａｔｅｄ、“ｌ　ｉｉｕｎｏａｓｓｏａｙｓ ｕｓｉｎｇ　１ａｂｅｌｌｅｄ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｏｒ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ”、　Ｃ１１ｎｉｃａｌＡｓｐｅｃｔｓ　ｏｒ　ｌ　ｔｇ■ｕｎｏｌｏｇｙ、Ｅ ａ、Ｐｅｔｅｒｓ　ａｎｄ　ｌ−ａｃｈｍａｎ。

８！ａｃｋｗｅｌｌ　３ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　０ ｘｆｏｒｄ、１９８３）に記載されたものであろう。

放射能ラベルをシグナル発生手段として使用するとき、このラベルの物質への導 入は、放射線ラベルプレカーサーを用いる生体外生合成によって抗体を生成する とか、たとえばラクトパーオキシダーゼ　ヨード化を用いる放射活性ヨー素での ヨード化によるような既に生成した抗体のラベル化で抗体を生成するような通常 の方法を用いて行うことができる。

別の直接的に測定しうるシグナル発生手段は、たとえばフルオレラセンでの蛍光 ラベルであって、抗原または抗体をフルオレラセンイソシアナートなどとの反応 でラベル化できる。

抗原または抗体をシグナル発生手段でラベル化する好ましい方法には、色変化や スペクトル性の変化（たとえば、赤外部で）のような測定可能とする酵素でラベ ル化することがある。酵素ラベルは、抗体または抗原を、グルタルアルデヒドの ような、２官能性試薬を用いて結合さすような通常の方法で行うことができる。

望ましい酵素ラベルには、ホスファターゼ、パーオキシダーゼ、β−ガラクトシ ダーゼ、リゾチーム、マレートやグルコース−６−ホスフェートのようなデヒド ロゲナーゼが含まれる。

ホスファターゼは、デホスホリレート化合物の能力により、検出される物質を作 るので観察できる。バーキシダーゼは、検出しうる過酸化水素を生成する能力に より観察できるβ−ガラクトシダーゼは、検出しつる生成物を与えるβ−ガラク トサイドを加水分解する能力により観察できる。リゾチームは、濁度変化を生じ ることになる細菌ｍ胞を破壊する能力により観察できる。デヒドロゲナーゼは、 ＮＡＤとＮＡＤＡの酸化状態の変化を生ずる性質で観察できる。

望ましい酵素ラベルには、酸及びアルカリホスファターゼが含まれる。好ましい 酵素ラベルは、アルカリホスファターゼである。

このような抱合ホスファターゼは、容易に検出しうる変化を生ずるため、ジニト ロフェノールのようなデホスホリレート物質に使用できる。このような抱合ホス ファターゼは、ＮＡＤＰをＮＡＤに変化するのに用いることができ、これらは検 出容易な変化を与えるサイクル化学反応を開始することも知られている。

望ましい酵素ラベルは、酸ホスファターゼである。好ましい酵素ラベルはアルカ リホスファターゼである。

抗原又は抗体をラベル化する他の適切な方法には、これらを化学蛍光を生じつる 物質とたとえば常法によりラベル化するこ今後特に断らないかぎり、用語“抗原 ”は“小抗原゛′と称する。

前に示したように、この発明は、物を診断する方法に適用するのが最も適する。

かくして、この発明は、対の疑わしいソースの成分に、対の他の成分と及び対の コンプレックスに対する二次モノクロナール抗体とを接触させ、測定すべき対の 成分と、対の他の成分又は二次モノクロナール抗体間の会合を測定することから なる小分子結合蛋白対の成分の測定法を提供するものである。

望ましい形態では、小分子が小抗原で結合蛋白がモノクロナール抗体であるので 、この発明のざらに望ましい観点によれば、対の疑わしいソースの成分に、対の 他の成分と及び対のコンプレックスに対する二次モノクロナール抗体とを接触さ せ、測定すべき対の成分と、対の他の成分又は二次モノクロナール抗体間の会合 を測定することからなる抗原−次モノクロナール抗体対の成分の測定法を提供す るものである。

測定すべき対の成分と対の他の成分または二次モノクロナール抗体の化合の測定 は、定性的でも定量的でもよいが、定量的が最も有利である。何れの適切な方法 も使用でき、その方法では抗体とその抗原の結合を測定する。たとえば、一つの 成分を固体基質に固定し、固体基質に結合する他の成分を測定すること、又は一 つの成分に酵素を結合させること（この酵素活性は、他の成分が最初の成分と結 合した際変化する）、あるいは凝集反応、又は沈澱反応によるものがある。

前記したように、反応に加える対の成分又は二次モノクロナール抗体は、シグナ ル発生手段でラベル化してもよい。このシグナル発生手段は、物質の化合を測定 するのに用いろる。

シグナル発生手段でラベル化されている二次モノクロナール抗体を使用するのが 好ましいため、望ましい観点によれば、不明の対の成分を対の他の成分と接触さ せかつシグナル発生手段でラベル化されている二次モノクロナール抗体を対のコ ンプレックスに接触させ、測定すべき対の成分とシグナル発生手段を測定に用い ている二次モノクロナール抗体との間の化合を測定することからなる抗原−次モ ノクロナール抗体の成分を測定する方法がある。

この発明の測定法は、小抗原又はその−次モノクロナール抗体の測定に適用しつ る。しかし、この発明の方法は、抗原の測定に適用するのが最も望ましい。

従って、望ましい観点によれば、この発明は、不明の抗原を、その抗原に対する 一次モノクロナール抗体と接触させかつその抗原と一次モノクロナール抗体との コンプレックスと二次モノクロナール抗体を接触させ、抗原と一次又は二次モノ クロナール抗体間の化合を測定することからなる抗原を測定する方法を提供する ものである。

化合の測定は、シグナル発生手段を用い、−次又は二次モノクロナール抗体の何 れかをラベル化して行うのが最も適する。

しかし、前述したように、シグナル発生手段でラベル化されている二次モノクロ ナール抗体を使用するのが好ましい。

かくして、好ましい観点によれば、この発明は、不明の抗原をその抗原に対する 一次モノクロナール抗体と接触させ、かつその抗原と一次モノクロナール抗体の コンプレックスとシグナル発生手段でラベル化されている二次モノクロナール抗 体を接触させ、抗原と二次モノクロナール抗体との化合を、測定にシグナル発生 手段を用い測定することからなる抗原の測定法を提供する。

測定すべき原試料としては、血液、血清、血漿、尿、乳、唾液又は組織抽出物の ような生理的由来の液体、又は食品産業由来の液体物質が普通である。かくして 、たとえば診断テストは、上記の試料を適当な二次抗体を用いて行えばよい。

この発明の一つの特に適する形態によれば、抗原−次抗体対のメンバーを表面に 結合させ、対の不明な他のメンバーをその表面に接触させ、またシグナル発生手 段をラベル化した二次モノクロナール抗体をその表面に接触させ、対の他のメン バーと二次モノクロナール抗体が対の最初のメンバーに結合しかくして表面に結 合するまで培養い表面から液体を分離し、シグナル発生手段を二次モノクロナー ル抗体を測定するのに用い、これにより結合量を決定しかつ測定すべき対のメン バー量が決まる。

測定される二次モノクロナール抗体は、表面に結合した区分（溶液中の残存量を 測るのとは反対であり、その方法はあまり適切ではない）であるのが普通で好ま しい。

この発明のかかる観点から、抗原を測定するのに適し、そのため表面に結合され る対のメンバーは一次モノクロナール抗体であるのが最も適する。

かくして、非常に望ましい形態によれば、この発明は、抗原に対する一次モノク ロナール抗体を表面に結合させ、結合した一次モノクロナール抗体と不明な抗体 とを接触させ、かつシグナル発生手段をラベル化した二次モノクロナール抗体と 接触させ、抗原と二次モノクロナール抗体が結合し、かつ結果的に表面に結合す るまで系を培養し、表面から液体を分散し、シグナル発生手段を使用して表面上 の二次モノクロナール抗体を測定することからなる抗体を含有するこの疑われた ソース中における抗体を測定する方法を提供する。

この発明の別の適切な形態によれば、抗体と一次モノクロナール抗体のコンプレ ックスに対する二次モノクロナール抗体（何れか１つがシグナル発生手段でラベ ル化されている）を表面に結合させ、コンプレックスの不明なソースの１成分を 表面に接触させ、コンプレックスの他の成分を表面に接触させ、系をコンプレッ クスが形成し、二次モノクロナール抗体と結合し結果とに表面に結合するまで培 養し、液体と表面から分離し、シグナル発生手段が結合したコンプレックスを測 定し、これからの測定すべきコンプレックスの成分の量を測定するのに用いられ る。

測定するコンプレックスのフラクションは、表面に結合するようになったフラク ション（溶液中の残存量を測るのは対比され、この方法はあまり適切ではない） が普通でかつ好ましい。

前の方法は、抗原の測定に適用するのが好ましく、そのため−次モノクロナール 抗体はシグナル発生手段でラベル化される。

かくして、望ましい形態によれば、この発明は、抗原とシグナル発生手段をラベ ル化した一次モノクロナール抗体のコンプレックスに対する二次モノクロナール 抗体を表面に結合させ、結合した二次モノクロナール抗体と不明なソースの抗原 と、及びラベル化−次モノクロナール抗体と接触させ、抗原とラベル化−次モノ クロナール抗体が二次モノクロナール抗体と結合するまで系を培養し、表面から 液体を分離し、シグナル発生手段を用いて表面上の一次モノクロナール抗体、こ れから抗原を測定することからなる抗原を含有するこの疑われたソース中の抗体 を測定する方法を提供する。

表面を使用するこ発明のこれらの方法は、１２００〜５０００の分子量の範囲の 分子に用いるのが有利であるが、１２００以下の小抗原の測定に用いるのに特に 有利である（これは小抗原がこれまでＥＬＩＳＡや類似のアッセイでは測定が容 易でなかったからである）。

なお他の観点によれば、この発明は、対の一つを表面に結合させ、その表面に対 の疑問なソースの他の成分、その対のコンプレックスに対する二次モノクロナー ル抗体及びシグナル発生手段をラベルした対の他の成分を接触させ、系を培養し 、表面から液体を分離し、ラベルした成分と表面との化合を測定し、それにより 、含有が疑われたソース中に存在し測定すべき物質の量を決めることからなる抗 原モノクロナール抗体対を測定する方法を提供する。これには、結合したラベル 化成分の量と、測定すべき未ラベル物質の既知ωの存在下で結合した量を比較す るのが普通である。

一次抗体が表面に結合する場合の抗体の検出に、この方法を適用するのが通常好 ましい。表面に結合した保持ラベルが測定（溶液中に残存するフラクションとは 反対）するのが好ましい。

この発明の二次モノクロナール抗体は、凝集を用いる診断テストにも使用できる 。

一つの適切な観点によれば、この発明は、抗原を固体粒子に結合させ、その抗原 を結合した粒子を疑わしいソースの抗原と、及び抗原とそれに対する一次モノク ロナール抗体とのコンプレックスに対する二次モノクロナール抗体とに接触され 、生成する凝集を測定することからなる抗原の測定法を提供する。

あまり望ましくないものである凝集テストでは、−次モノクロナール抗体を粒子 と結合させ、二次モノクロナール抗体と疑わしいソースの抗原と接触させる。こ のようなテストでは、凝集量がテストサンプル中の抗原の量を示す。

この発明の測定は、通常の条件下、たとえば４〜４５℃、より普通には１５〜３ ８℃、好ましくは１８〜２５℃の温度で、一般に実質的に等張である水溶液中、 −が２〜１０、より普通には５〜９、好ましくは６〜８、最も好ましくは約７、 で行うのが普通であろう。

この発明の二次モノクロナール抗体は、抗原（又は他の小分子）とそのモノクロ ナール抗体（又は他の結合蛋白）とのコンプレックスを形成することにより作る ことができ、次いでコンプレックスは、それ自体公知の方法でモノクロナール抗 体を生ずる免疫原として用いられる。

同系の動物が二次モノクロナール抗体を作るのに有利に用いることができる（す なわち、−次抗体を生ずるのに使用された動物に対して同系）。

二次モノクロナール抗体を作るセル系の選定はこれまで記載したようなやり方で よく、抗原又はその−次モノクロナール抗体に対する抗体を産生じないがコンプ レックスに対する抗体を産生ずるセル系を選定するのが本質的に含まれる。

診断法に関してこの発明は、小抗原とそれらの抗体とを用いる前述の方法に類似 のやり方で、結合蛋白とコンプレックスを形成する小分子の測定をも含むもので ある。

この発明の方法で使用され測定される小抗原及び他の小分子は、コンプレックス 形成が容易なことから水溶性のものが最も適する。このような分子は、一般にヒ ドロキシ、アミノ又はカルボキシ基を有する。コンプレックス（免疫化に対し） は、小分子と結合蛋白を水性媒体に溶解するか直接分散さすことにより作ること ができる。一般に、大過剰の小分子が用いられる。

コンプレックスは溶液で、任意に完全又は不完全なフロイントのアジュバントの ようなアジュバントと共に注射できる。又、コンプレックスは沈澱した形で用い ることができる。

この発明は、この発明の二次モノクロナール抗体と含有する診断用キットをも含 む。好ましいキットは、この発明のラベル化二次モノクロナール抗体からなる。

この発明のキットは、この発明の抗体を固体の形を（たとえば瓶の中で）、又は 固体表面中又は上に吸収させた型（たとえばプレート上のくぼみ）からなるのが 最も適する。

この発明の一つの方法では、−次抗体が、くぼみ又は他の分離表面の表面におか れ、測定すべき溶液を小抗原が表面に結合するのに十分な時間その表面に接触さ ぜ、任意に表面から溶液を除去し、ラベル化二次モノクロナール抗体を導入し、 溶液を培養する。溶液を固体表面から分離し、次いで洗浄し、結合したラベルを 測定する。別の方法では、測定すべき溶液と二次抗体とを本質的に同時に加える 。なお他の方法では、ラベル化二次抗体を、測定すべき溶液を導入する前に存在 させる。

類似のやり方で、ラベル化−次抗体を使用できる。小抗原と一次モノクロナール 抗体とのコンプレックスは、−次モノクロナール液体が最初に、アルカリホスフ ァターゼのような抗原物質と化合物されれば、より免疫化されることができる。

かくして、好ましい形態では、二次モノクロナール抗体を生ずるのに用いるコン プレックスは、−次モノクロナール抗体がアルカリホスファターゼのような抗原 物質で化合したものを含有するコンプレックスである。

次の実施例は、この発明を例証するものである。

実施例 次の実施例で、記載の異なる材料に対するモノクロナール抗体が作られ、その親 和性は、標準技法（たとえば５ｏｏｓ、Ｍ　＆に、　５ｉｄｄｌｅ、７ｈｅ　Ｊ ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｉｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ。

１９ｇ２．５１．．５７〜６８に記載）で測定される。アルカリホスファターゼ の結合は、Ｅ、　［：ｎｇｖａｌｌ＆Ｐ、　Ｐｅｒｌｍａｎｎ、１９７１゜ＪＩ ＩＩＩＩＵｎＯＣｈｅｌｌｉＳｔｒｙ、　８．８７１に従って行われる。

実施例１ プロデスロンとプロゲステロンに対するラベル化−次モノクロナール抗体とのコ ンプレックスに対する二次モノクロナール（この二次モノクロナール抗体は、プ ロゲステロンに対する抗体またはプロゲステロンに対する一次モツク０ナール抗 体ではない）の製造 プロゲステロン（ＭａｂＰｒｏａ　）に対するモノクロナール抗体を免疫プロゲ ステロン−Ｈ８−ウシ血清アルブミンを用いて作る。Ｍａｂｐｒｏｇは精製ウシ 腸アルカリホスファターゼに結合される。

次いでｐＨ７，４のリン酸緩衝食塩水中１５０μｇのこのＭａｂｐ　ｒｏｇ−ア ルカリホスファターゼ　コンジュゲート（Ｍａｂｐｒｏｇ　−ＡＤ　）の１′１ １溶液を１００μ（ｌプロゲステロン（ｐｒｏｇ）の０．１〃溶液をゆっくり、 一定に緩和に撹拌しつつ混合する。

混合物を室温（２３℃）で１時間ゆるやかに撹拌し、次いで４℃ＡＩ）−１１ｒ ｏｉｌｌコンプレツクスを得る。次いで元のモノクロナール抗体に由来したと同 系の生産マウスに免疫原として用いる。上記の同じハイブリドーマ技法を抗体− 抗原コンプレックスに対するモノクロナール抗体（二次モノクロナール抗体Ｍａ ｂＳ　Ｅ　Ｃ）を産生するセル系を生ずるのに用いられる。次いで、これらのセ ル系の培養液体が、平衡定数の条件でプロゲステロン単独に対する反応性をスク リーンする。１０１ノツトル１モル以上の平衡定数で、プロゲステトロに反応性 の抗体を産生ずるこれらのロゲステロン測定への利用性をテストする。

実施例２ 二次モノクロナール抗体使用のプロゲステロン測定ポリスチレンミクロ滴定用プ レートのくぼみを、常法によりプロゲステロンに対する一次モノクロナール抗体 でコートする。

０〜１１００ｎ　／ｘｉ範囲のプロゲステロンをカバーする標準プロゲステロン 溶液をたとえばプロゲステロンを含まないヒト血清中で作る。各溶液の１００貸 を別々のくぼみに加える。プロゲステロン測定がなされる各サンプルの１００− を別々のくぼみに加える。プロゲステロン（前述）とプロゲステロンに対する一 次モノクロナール抗体とのコンプレックスに対する５０ｎ（１／　ｄの精製二次 モノクロナール抗体の溶液（前述のような方法を用いてアルカリホスファターゼ とグルタルアルデヒドが化合されている）の１００４を各くぼみに加え、混合し 、ミクロ滴定用プレートを３７℃で１時間培養する。未結合の材料を振盪除去し 、くぼみを０．０５％ツイン−２０含有の−７，４のトリス緩衝正常食塩水で４ 回洗浄する。次いで各くぼみに、３．３１　Ｍｊｉ化マグネシウム含有の−１０ ，３の０．１５　Ｍ炭酸塩緩衝液中５ｓｌｙｌのバラニトロフェニルリン酸塩２ ００Ａを加える。プレートを空温で培養し、バラニトロフェノールの生成が４０ ５ｎ　Ｍでの溶液の吸収増大でみられた。培養を最大吸収変化が１，５光学濃度 単位まで続ける。この時に全部のくぼみを読み吸収変化に対するプロゲステロン 濃度の標準曲線を標準溶液を入れているくぼみの結果からかく。これから、サン プルを入れているくぼみの吸収変化をプロゲステロン濃度に換算する。

実施例３ 実施例１に代り、リン酸塩１１！！食塩水中１５０μｇのＭａｂＰｒｏａ−ＰＡ の１１オ溶液を、　１０ｍ　ｇのプロゲステロンが常に混合されている同じ緩衝 液の５ｇに対し、４℃で７日間透析して、プロゲステロンとそれに対するラベル 化モノクロール抗体のコンプレックスを作ることができる。

実施例４ プロピラノロールノ検定に用いる二次モノクロナール抗体の製造と選定 プロプラノロール−ウシ血清アルブミンとＮ−（４−ブロモブチル）フタリメー ト〔シグマケミカル社（ロンドン）、カタログ　Ｎ　Ｏ，Ｂ　３５０２　）との 抱合体からなる免疫原を用い常法によりプロピラノロール（ｐｒｏｐｒａｎｏｌ ｏｌ　）に対する一次モノクロナール抗体を得る。この抗体は精製子牛腸アルカ リホスファターゼに抱合される。

次いで−７，４のリン酸緩衝食塩水中このＭａｂｐｒｏｇ−アルカリホスファタ ーゼ抱合物（ＭａｂＰｒｏａ　−ＡＰ）　１５０ｕＱ　（７）　１ｙｆ溶液をゆ っくり一定にゆるやかに撹拌しつつ、プロプラノール（ρｒ０１１＞　１００μ ｇの０．１１！溶液と混合する。この混合物を室温（２３℃）で１時間ゆっくり 撹拌し、次いで４℃で１２時間放置すると、ＭａｂＰｒｏＣｌ　−Ａｌｌ−９ｒ ＯＤｌンブレツクスを生ずる。次いでこのものを、元モノクロナール抗体が由来 したのと同系の産生マウス中で免疫原として用いる。上記と同じハイブリドーマ 技法を用い、抗体−抗原コンプレックス（ＭａｂＳＥＣ）のモノクロナール抗体 産生のセル系を生じさせる。このセル系の培養液を次のようにプロプラノールの 検定への利用性のためスクリーニングする。

マイクロ−ＥＬＩＳＡプレートのくぼみを、ｐＨ９，６の５０１　Ｍ重炭酸塩！ １Ｉｌｉ液中１１００ｎ／ｘｉの抗体からなる溶液２００４を４時間、室温（２ ３℃で培養して、ＭａｂＳＥＣで被覆する。次いで、溶液をとり除き、同じ緩衝 液の２％ラクトアルブミン２００Ａで置換し、プレートをざらに４時間室温で放 置し、くぼみをＮ−食塩水と０．０２％ツイーン２０を含むｐＨ７，４の５０Ｉ ＩＭトリス緩衝液で４回洗う。ｐｉ４７．４の５０−Ｍトリス緩衝食塩水液中の プロプラノール溶液を、０，１ｎＭｙｊ、１ｎＱ／Ｍ！、１０ｉＭｎ、１１００ ｎ　／ｌ及び０のプロプラノールを含有するよう作る。各溶液の０．３ｙｔ　ト ｎｏ　１１７）、ＰＨ７，４（７）５０ｉ　Ｍ　トリス！１ｌｉｉ食塩水中のＭ ａｂｐｒｏｐ−ＡＩ）抱合の５０ｎＯ／ｉｆ液と混合し、１時間室温で培養する 。この混合物のそれぞれ２００ｄを、被覆マイクロ滴定プレートの重複くぼみに 入れ、次いで室温でさらに１時間培養する。次いで溶液をくぼみから振い落し、 くぼみを０．０５％ツイーン２０含有のトリス緩衝食塩水で４回洗う。次に、そ れぞれのくぼみに会合して残存するアルカリホスファターゼを常法の酵素法で測 定する。プロプラノール不存在下より存在下でプレートでよりアルカリホスファ ターゼの会合（かつこれよりＭａｂｐｒｏｐ　−Ａｌｌ−ＰｒＯ１］がプレート に結合）を生じ、ＭａｂＳ　Ｅ　Ｃが選定され、従ってプロプラノールの検出に 用いることができる。

実施例５ ゲンタミシン検定用の二次モノクロナール抗体の製造と選定免疫原として、ゲン タミシンー牛血清アルブミンと１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル ）カルボジイミド（シグマケミカル社、１９８５年カタログ　ＮＯ，Ｅ７７５０ ）との抱合物を用い常法によってゲンタミシンに対する一次モノクロナール抗体 （ＭａｂＧｅｎｔ　）を得る。次いでこのＭａｂＧｅｎｔを精製子牛腸アルカリ ホスファターゼで抱合させる。次に、これは二次モノクロナール抗体を作るのに 用い、またプロプラノロールの検定におけるＭａｂＰｒｏＤ−Ａｐの使用につい て詳述している先の実施例と類似のしかたでゲンタミシンを分析するのに用いら れる。

実施例６ プロプラノロールとそれに対する一次モノクロナール抗体のコンプレックスに対 する二次モノクロナール抗体（この二次モノクロナール抗体は、プロプラノロー ルに対する抗体又はプロプラノロールに対する一次モノクロナール抗体ではない ）の製造と選定 プロプラノロールに対する一次モノクロナール抗体（Ｍａｂｐｒｏｐ）を、Ｎ− （４−ブロモブチル）フタリメート（シグマケミカル社（ロンドン）カタログ　 Ｎ　Ｏ，Ｂ　３５０２　）で作ったプロプラノロール牛血清アルブミン抱合物か らなる免疫原の手段で常法により得る。この抗体のいくらかを精製子牛腸アルカ リホスフ？ターゼと抱合させる。

−１，４のリン酸緩衝食塩水中の１５０μｇのＭａｂＰｒｏｐの１１！液を一定 にゆるやかに撹拌しつつ、１００μ９プロプラノロール（ｐｒｏｐ）の０．１１ 液にゆっくり混合する。混合物を室温（２３℃）で１時間ゆるやかに撹拌し、次 いで４℃で１２時間放置して、ＭａｂＰ　ｒｏＯ−Ｐ　ｒｏｐコンプレックスを 得る。次いで、これをマウスの免疫原として用いる。上記と同じハイブリドーマ 技法を抗体−抗原フンブレックスのモノクロナール抗体（ＭａｆｉＳＥＣ）を作 るセル系を作るのに用いる。このセル系の培養液が、前のプロプラノロールの実 施例と同様に、プロプラノロールの検出への有用性のスクリーンされる。

実施例７ プロプラノロールとプロプラノロールに対する一次モノクロナール抗体とのコン プレックスに対する二次モノクロナール抗体（この二次モノクロナール抗体はプ ロプラノロールに対する抗体又はプロプラノロールに対する一次モノクロナール 抗体ではない）の製造と選定 プロプラノロール（ＭａｂＰｒｏｐ　）に対する一次モノクロナール抗体とこれ とプロプラノロールとのコンブレラスフに対する二次モノクロナール抗体が前の 実施例と同様に行って得られる。

この二次抗体を常法で精製し、精製子牛腸アルカリホスファターゼと抱合させる 。

マイクロ滴定用プレートを一次モノクロナール抗体で、前述の抗体コーティング 法を用いてコートする。０から１１００ｎ　７１１の範囲のプロプラノロール標 品を、７．４の５０■Ｍトリス緩衝液中で作る。これの各々の１００．ａｔ）を 別々のくぼみに入れ、次いで抱合二次抗体の溶液１００Ａを入れる。混合物を３ ７℃で１時間培養し、次いで振って液をすてる。くぼみを前述のように洗浄し、 各々に会合して残存するアルカリホスファターゼを測定する。

かくして二次抗体アルカリホスファターゼ抱合を同体し、これは、プロプラノロ ールの不存在より存在下でよりくぼみに保持されるのでプロプラノロールの検出 に用いられる。

実施例８ ジヒドロホレート・リダクターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅｒｅｄＵＯｔａ ｓｅ　）とメソトレキガート（１ｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ　）とのコンプレック スに対するモノクロナール抗体の製造と、その抗体に基づくメソトレキサートの 検定 ジヒドロホレート・リダクターゼ（ＤＨＦＲ＞を、メソ上レキサート親和性カラ ムを用いての親和クロマトグラフィーで非常に純粋な形で得る。これからコンプ レックスを作り、メソトレキサートを、１１！のリン酸緩衝食塩水中の１５０μ ｇＤＨＦＲの溶液と、同じ容量の緩衝液中の５０μｇメソトレキサートとをゆっ くり混合して作る。次いで、混合物を、１ｇのリン酸緩衝食塩水で４℃で４時間 ２回透析し、次いで、マウスの免疫原として用いコンプレックスに対するモノク ロナール抗体（ＭａｂＳＥＣ）を作る。次に、この生成物を、次のようにメソト レキサートの検出の有用性を付す。

ＤＨＦＲを、抗体について実施例１に記載した方法に従いマイクロ滴定用プレー トに結合させる。ＦＭ７．４の５０ｍＭトリス緩衝食塩水中の標品液を、０から １００ｎΩ／１！の範囲のメソトレキサートを含有するように作る。これらの各 々１００−を被覆プレートの重複くぼみ中に入れ、次いで０．１％牛血清アルブ ミンと５０ｉｇのＭａｂＳＥＣ含有の５０ｉｔｖｌトリス液１００４を入れる。

プレートを３７℃で１時間培養し、その後、溶液を、０．０２％ツイーン２０含 有のｐｓ　７．４の５０ＩＩＭトリスで４回洗浄する。次に、−７，４の５ｈＭ トリス中に１０００希釈でのアルカリホスフ７ターゼ（シグマ社（ロンドン）、 カタログ　Ｎ　ｏ、Ａ　０５３２　）でラベル化した抗マウスＩｇＧの溶液２０ ０−を加え、さらに１時間空温で培養する。溶液を振って除去し、プレートを上 記のようにさらに４回洗浄し、（ぼみに会合して残存するアルカリホスファター ゼを測定する。これらのＭａｂＳ　Ｅ　Ｃ抗体は、メソトレキサートの不存在下 より存在下でアルカリホスファターゼよりくぼみに会合されるのでメントレキサ ートのアッセイを可能とすることが確認される。

実施例９ メソトレキサートの測定用二次モノクロナール抗体の製造と選定 前記の実施例と同様に、ラベル化抗体が抗マウスＩａＧである代りにアルカリホ スファターゼ抗体マウスＩｇＭ　（シグマ社（ロンドン）、カタログ　Ｎ　ｏ、 　Ａ　７７８４　）を用いて行われる。

実施例１０ 実施例５の別のやり方として、プロプラノールの一次モノクロナール抗体のＦａ ｂフラグメントを形成し、常法により精製し、完全分子（１ｎｆａｃｔ　ｍｏｌ ｅｃｕｌｅ　）の代りに全体を通じて用いた。

閏　瞥　！１　本　報　牛

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．モノクロナール抗体が、小分子とその小分子に対する結合蛋白とのコンプレ ックスに対する二次抗体であり、その二次抗体が、小分子に対して又はその結合 蛋白に対する抗体ではないことを特徴とするモノクロナール抗体。
2. ２．モノクロナール抗体が、小抗原とその小抗原に対するモノクロナール抗体と のコンプレックスに対する二次抗体であり、その二次抗体は、小抗原に対し又は そのモノクロナール抗体に対する抗体ではないことを特徴とする請求の範囲１項 によるモノクロナール抗体。
3. ３．小抗原が１２００より少ない分子量を有する請求の範囲２項によるモノクロ ナール抗体。
4. ４．小抗原がステロイドホルモン又は医薬である請求の範囲２又は３項の何れか によるモノクロナール抗体。
5. ５．さらにシグナル発生手段でラベル化されていることを特徴とする請求の範囲 ２〜５項の何れかによるモノクロナール抗体。
6. ６．シグナル発生手段がホスファターゼである請求の範囲５項によるモノクロナ ール抗体。
7. ７．対の疑わしいソースの成分に、対の他の成分と及び対のコンプレックスに対 する二次モノクロナール抗体とを接触させ、測定すべき対の成分と、対の他の成 分又は二次モノクロナール抗体間の会合を測定することからなる小分子結合蛋白 対の成分の測定法。
8. ８．疑わしいソースの小抗原に、その小抗原の一次モノクロナール抗体と、及び 小抗原と一次モノクロナール抗体のコンプレックスに対する二次モノクロナール 抗体とを接触させ、抗原と一次又は二次モノクロナール抗体との会合を測定する ことからなる小抗原と測定する請求の範囲７項による方法。
9. ９．二次モノクロナール抗体がシグナル発生手段でラベル化されている請求の範 囲８項による方法。
10. １０．コンプレックスが、ある分子とその結合蛋白から作られ、そのコンプレッ クスが、それ自体公知の方法でモノクロナール抗体を生する免疫原として用いら れ、二次モノクロナール抗体を産生するが抗原又はその結合蛋白に対する抗体を 産生しないセル系を選定しかつ、それが所望によりその抗体をシグナル発生手段 でラベル化する請求の範囲１〜６項の何れか１つによる抗体の産生法。
11. １１．請求の範囲１〜６項の何れか１つによるモノクロナール抗体からなる診断 テスト用キット。