JPS63501096A - 小型分子の免疫測定法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 小型分子の免疫測定法 発明の利用分野 本発明は、小型分子の２部位免疫測定の実施方法に関連するものである。ここで 用いる小型分子とは、２つの抗体分子を結合するには小さすぎるから、このタイ プの測定法を用いて検出できないと従来から一般に考えられていた免疫原または ハプテンのことである。

本発明は、免疫測定の在来法のみならず、最近開発された方法をも含む実際上す べての免疫測定法に対して適用し得ると考える。

好ましい測定法は１つの抗体が同相にあり、他の抗体が標識されて液相にあると いうものである。

本発明は、ステロイド、マイコトキシン、抗生物質。

小型ホルモンおよび小型ペプチド等の農業と医学面で重要な低分子量分子の微小 量を正確に検出する方法を提供するものである。

発明の背景 ２部位免疫測定法は、１部位法より、測定の感度、特異性、速さ、および安定性 が向上することの他に多くの有利性を持っている。（Ｗ、Ｈ，ハンター、特表昭 ６３−５０１０９６　（３） Ｊ、Ｅ、Ｔ、コリー編゛′臨床化学のための免疫測定・’１９８３年版５００頁 （ニブインバラ、ロンドン、メルボルン、ニューヨーク、チャーチル、リビング ストン）中のパステロイド免疫測定法のためのモノクローナル抗体″Ａ、ホワイ ト著〕。例えば、免疫放射定量分析法（ＬＲＭＡ）は、特にモノクローナル抗体 技法と併用すると、実施が容易であり、検出限界が低く、培養期間および計数時 間が短く、放射免疫３Ｉｌｌ定法（ＲＩ　Ａ）よりも適用範囲が広い〔″免疫性 ジャーナル″第５０巻（１９８２年）１３３〜１４４頁″アルファ胎児性タンパ クの免疫放射定量分析に使用するモノクローナル抗体″Ｗ、Ｈ，ハンターら。免 疫法ジャーナル　第４５巻（１９８１年）２５５〜２７３頁″免疫放射定量分析 法　対　放射免疫測定法：押型型分析物としてアルファ胎児性タンパクを用いた 比較”Ｗ、Ｈ，ハンター、Ｐ、Ｓ　、プツト〕。

２つのモノクローナル抗体の組合せを用いて協同作・用的な免疫測定を構成でき ることが、近年、明らかにされた。すなわち、この免疫測定法では、特定の抗原 に対して培養されたモノクローナル抗体の混合物は、それぞれの抗体がその抗原 に対して個別にもつ親和性よりも、大きな親和性を持つという・ものである〔″ サイエンス″第２２１巻（１９８３年７月１５日発行）２７９〜２８１頁″協同 作用的な免疫測定：混合したモノクローナル抗体を用いた超高感度測定法”Ｐ、 Ｈ，エールリッヒ、Ｗ、Ｒ，モイル（以後、エールリッヒとモイルの゛サイエン ス″論文と呼ぶ）、“免疫法ジャーナル″第１２８巻（１９８２年）　２７０９ 〜２７１３頁１１２つのモノクローナル抗体の混合は抗原親和性を増大する”、 Ｐ、Ｈ，エールリッヒら（以後エールリッヒらの″免疫法ジャーナル″論文と呼 ぶ）〕。

しかしながら、２部位免疫測定法では、その名が意味する通り、検定対象分子に 同時に２つの抗体が結合できる事が必要とされる。一般に考えられている事は、 １つの抗体が小さな免疫原またはパブテンの１つのエピトープに結合すると、そ の抗体は他の抗体が別のエピトープに結合するのを空間的にブロックできるから 。

２つの抗体を同時に結合させるには対象とする分子がある最少限度のサイズは持 っていなければならないと、いうことである、〔ニューヨーク、アカデミツク・ プレス（１９７５年）“抗体分子２６５頁Ａ・ニソノフら〕。

したがって、２つの抗体を同時に結合する必要があるから、２部位免疫測定法は 、今迄は大きな分子の検定にのみ使用されてきた。例えば、アルファ胎児性タン パクとヒト繊毛性性腺刺激ホルモンは前述の免疫放射定量分析法および協同作業 的な測定技法を用いてそれぞれ検定された。

もう一つの例としては、Ｈ，Ａ、ケータスらが心性に対する２つの異なるエピト ープを測定する″ダブル・サンドイッチ″放射免疫測定法を用いた〔分子免疫学 、第１９巻（１９８２年）４５１〜４５５頁“２つのモノクローナル抗体をダブ ル・サンドインチ検定に用いて、ヒト心臓性ミオシンの放射免疫測定における特 異性が増大″〕、デーピットとグレン（１９８３年３月８日発行米国特許第４， ３７６．１１０号）は、モノクローナル抗体を用いた多数の２部位免疫測定に関 して述べている。彼らは、多くの抗原部位をもつ大きな免疫原性プロティンの検 定にふれている。さらに、彼らは、広範囲の多価抗原物質の存在またはその濃度 の決定に彼らの発明が有用であると述べている。

前述の通り、２部位免疫測定では、同一分子上゛に少なくても２つのエピトープ が存在し、２つの抗体が立体障害なしに同時に結合できるようこれらのエピトー プ間に十分な距離があることが必要である。立体干渉をさけ、そしてハプテンま たは免疫原が２つの抗体分子を結合できるのに必要な距離は最低２０〜２６オン グストロームであると考えら九る〔Ａ・ニソノフら、″抗体分子”、ニューヨー ク、アカデミツク・プレス（１９７５年）６５頁〕、シかし、これらの実験が二 機能を有するジニトロフェノール（ＤｎＰ）誘導体、ＤｎＰ−ｎ−ＤｎＰ上の空 間妨害をさけるのに必要とされる結合部位間の距離決定のために実施さ九たこと に留意しなければならない、このＤｎＰ−ｎ−ＤｎＰでは、ｎは。

長さで変動するスペーサーを表わす。これらの合成ハプテンは実験用にのみデザ インされたちのマ必ずしも自然に産する小ハプテンを模倣しているとは限らない 。

特に、これらの二機能性ジニトロフェノール誘導体の持ちうる配列の数が限られ ている点に関してそうであると言える。２６オングストロームよりもはるかに大 きな分子である二機能性ジニトロフェノール誘導体は、２部位免疫測定の実際上 の限界であると、一般に考えられている。

例えば、ステロイドに体するモノクローナル抗体を用いた免疫測定法の記述に続 く解説の中でエキンスはモノクローナル抗体は２部位サンドインチ測定法を用い て大きな分子を検定することにのみ重要であるように思う、と述べている（Ｒ， Ｐ、エキンス″解説（１１，５章）”で引用：゛臨床化学のための免疫測定″″ Ｗ、Ｈ。

トン、メルボルン、ニューヨーク、チャーチル、リビングストン（１９８３年） ５００頁〕、２部位免疫測定を用いてテストされてきた最小で臨床的に重要な分 子は１分子量が約６０００のインシュリンである。２部位測定を用いてテストで きる最小分子は分子量約３２００以上のものであると、一般に考えられている。

しかし、マイコトキシンやステロイド等、農学、医学面で重要な小分子の存在ま たは濃度を決定するには。

免疫放射定量分析の免疫測定法。協同作用的な免疫測定法およびその他の２部位 免疫測定法によって与えられる感度や特異性をさらに上げる必要がある。これら の化合物は採取試料中にきわめて低い濃度で存在しているから感度と特異性の欠 如は、これらの物質の検出する際に制限因子となる。感度および特異性が向上す ると、高価で繁雑な抽出段階のいくつかを取り除くことができるので、これら各 種免疫測定法を改善することになる。抗体の１つが標識されている２部位免疫測 定を用いて、蛍光標識、酵素標識または放射標識で抗原を標識するのをさけると 、マイコトキシンやステロイドのような少ない抗原が破壊されるかもしれない段 階を除くことができる。ステロイドに対する抗体の交差反応性は、これらの化合 物の測定法が現在利用可能な測定法より感度が高く特異的でなければならない、 もう一つの理由である。各ステロイドの相対的存在度（比）を決定することは、 臨床的には有益である場合が多い、しかし、現在可能な検定法の不十分な特異性 発明の概要 本発明は、２部位免疫測定法を用いて検定するには小さすぎると従来考えられて いたサイズの小抗原および小ハプテンの検出またはこれらの濃度測定に、２部位 免疫測定が実施できるという発見に基づいている。

本発明の範囲内にある小分子は分子量が約２５０から２５００〜３０００、望ま しくは約２７５から１０００までのサイズのものである。最も望ましい範囲は分 子量２７５から５００までである。

これらの変動の主要な理由は分子量が空間における分子の寸法を決定する唯一の パラメータではないことである。最大寸法において同じ長さであっても、小型の 球状分子の方が細長い分子よりも重い場合があるからである。さらに、２つの抗 体を結合するのに適した２つのエピトープが互いから最も遠い分子上の２点に位 置していない場合には、もしこれらの２つの結合部位が実際に研究対象の小分子 の反対の端にある場合よりも、分子の大きさが同時結合の起こる前でさらに大き いことが必要である。従って１本発明は分子量またはその他の簡単なパラメータ によって単純に束縛されるものではない、しかしながら、分子が多くの異なる配 列をとるとしても、分子量は少なくとも本発明の主題である小分子を説明するこ とになる。さらに、上述の分子量範囲にある分子が当業者にとって予期できない 領域内にあると我々は考える。

２部位免疫測定法が農業および医学分野で重要な小分子の存在の検出と濃度と測 定に特に有益であることを我々は発見した。臨床的に関連性があって、とりわけ ２部位免疫測定を用いて検査することのできる小分子には、アルドステロン、コ ルチゾン、エストラジオール、プロゲステロンおよびテストテロンのようなステ ロイド、トリヨードサイロニンおよび黄体化ホルモン放出因子（ＬＨ−ＲＨ）の ような小ホルモン、ゲンチミシンおよびペニシリンのような抗生物質が含まれる 。同様に、アフタ１−キシンおよびトリコセシンのようなマイコトキシンも２部 位法を用いてきわめて微小な濃度で検出可能である。そのため、これらの測定法 は穀物およびその他の農産物の検査に有益である。アスパルテームのような小ペ プチドおよび前述のホルモンもまた２部位法による検定に適している。

発明の詳細な説明 ２部位免疫測定法を用いて検定するには、小さすぎると従来考えられていた分子 の検定には、まず最初に。

これらの分子に対する抗体を培養しなければならない。

小分子が免疫原である場合は小分子の精製試料を複数の動物に注入して、２つの 別々の異なる抗血清を作らねばならない、同様に、−１二匹の動物を望ましい免 疫原性小分子で免疫することができる。こうして、最初にミルスタインとコーラ −によって報告されたように、モノクローナル抗体産出ハイブリドーマをつくる ための周知の方法を用いてモノクローナル抗体を得ることができる〔゛ネイチャ ー”第２５６巻（１９７５年）４９５〜４９７頁、Ｈ，ジータ、Ｄ、ブルックス 著″モノクローナル・ハイブリドーマ抗体の産出法と特性”Ｊ、Ｇ、Ｒ。

バレルＩ１１″モノクローナル・ハイブリドーマ抗体″、その技法と応用ボカレ ートン、フロリダ州、ＣＲＣプレ入社（１９８２年）１頁（以後、Ｈ，ジータ、 Ｄ、ブルソクス″法と呼ぶ）を参照〕。

ここに述べる方法を用いて検定することのできる小分子の大部分はハプテンであ り、従って、プロティンまたはその他の適当な基とカップリングしないかぎり、 免疫原性ではない０本発見の対象である分子のサイズが小さいために、ある場合 には、２つの接合小分子を作成する必要が生じる。すなわち、検定する小分子は 、小分子上の２つの異なる部位にプロティンまたはその他の適切な基を付着させ る事によって、接合される６次いで、これらの２組の接合小分子は２匹のマウス または他の適当な動物を免疫するのに使用され、ポリクローナル抗血清または上 述のモノクローナル抗体を産出する。−匹のマウスまたはその他の適当゛な動物 は。

２組の複合小分子を用いて免疫され、本発明を実行するのに適した２つのモノク ローナル抗体をつくることができる。接合ハプテンの作成法は技術上周知であり 。

対象ハプテンの特殊性に見合って変化することが多い。

ステロイド及びアルドステロン□に異なる位置での２つの接合体を作る手順は以 下の実験例で述べる。

一対の組合せがモノクローナル抗体、ポリクローナル抗血清、またはモノクロー ナル抗体とポリクローナル抗血清のいずれであれ、少なくとも一対の抗体が検定 する小分子に対して産出されると１次にこれらの抗体は本発明の教える所と調和 して検定する小分子への同時結合のためにテストされる。当業者に周知である多 数の異なる２部位免疫測定法をこの目的のために用いることができる０例えば免 疫放射定量分析測定法を用いることができる。さらに詳゛脱すれば、例えばＸが 小分子、ＡがＸに対して作成さ〉れたモノクローナル抗体、ＢがＸに対するモノ クローナル抗体でＡとは異なるものとする。簡単に言えば、免疫放射定量分析測 定は１次のような過程をたどる０、固体支持物に付着した抗体Ａを、既知量の小 分子又と混合した放射標識抗体Ｂと接触させる；小ハプテンと供に、抗体ＡとＢ の混合物は培養される；次いで、液相を固相から除去し洗浄する。固体支持物の 放射能をチェックする。抗体ＡとＢが両者とも小分子Ｘに同時に結合することが できるならば放射能は固体支持物にのみ認められる。

同時結合のテストに用いる同じ２部位免疫測定を、次に採取試料の検定に用いて 、試料中の小分子の存在−や１浪度を１決定することができる。免疫定量分析測 定法、゛に゛は多くの異なるタイプがきる。これら多数の免疫定量分析測定法に 利用とその方法については、米国特許ｆｆ５４，３７６．１１０号にデーピッド とグリーンが解説を加えている。

概説すれば、検定する液体中で不溶の固体支持体に結合していて標識されてない 抗体を若干量と、同相抗体、抗原および標識抗体間に形成される三元複合体の検 出そして／または計量を可能にする放射性同位元素等のラベルをもつ可溶性抗体 の若干量を、用いた検定であると彼らは述べている。

先行技術で周知である免疫分析測定法の中で、代表的には、固相に結合した抗体 を二重の同相抗体の形成によって抗原を試料から抽出するためにテスト試料にま ず接触させる゛′フォワード”測定法が用いられる。

この時、抗原複合体を使用する。適当な培養期間後、固体支持体は未反応抗原（ もしあれば）を含む溶液中の残留物を除去するために洗浄され次いで既知量の標 識抗体を含む溶液に接触させる。　゛ 未標識抗原を介して固体支持体に結合した抗体と標識された抗体が複合するため の別の培養期間が終わった後、固体支持体は、未反応の標識抗体を除去するため に、２回目の洗浄を受ける。テスト試料中に抗原が存在するか否かを判定するた めの、単純な゛′イエス／ノー″検定で洗浄された固体支持体は１例えば標識が 放射性元素でされる場合は放射能を測定することによって、標識抗体を検出のた めにテストされる。検出された１ｓｒａ抗体量を抗原を持たないことがわかって いる陰性対照試料と比較する。陰性対照が示すバックグラウンド・レベルを著し く超える量の標識抗体の検出は抗原の存在が疑われることを示しているものとみ なされる。きわめて過剰な抗原はバックグラウンド示度を与えるので、抗原を含 む液体は数回希釈するのが最も望ましい、試料の希釈は、この可能性を効果的に 排除することになる。標識抗体量を、既知量の抗原を含む標準試料に対して得ら れる値と比較して定量的判定が可能になる。

この種の検定は、゛２部位″またはパサンドイッチ′″検定とよく呼ばれている 。これは抗原が異なる位置でその表面に結合する２つの抗体を持っているためで ある。これとその関連する技法はワイドによって記述されている〔カークハムと ハンター編、″放射免疫測定法″エディンバラ、Ｅ＆Ｓリビングストン（１９７ ０年）１９９〜２０６頁〕、ヒト繊毛性性線刺激ホルモン検出用にデザインされ たサンドイッチ検定は前述のエールリッヒらの“免疫ジャーナル”論文に述べら れている。

１固相／１液相で２部位免疫分析測定の特殊なシステムは、制限的なものではな くて、当業者は、さまざまな変法を考案することができるであろう。例えば塩化 ビニル樹脂のマイクロタイター板、濾紙、プラスチック・ビーズ、またはポリエ チレン、ポリスチレン、ポリプロピレンその他の適切な材料でできた試験管等の 多くの器具や、このタイプの検定の固相を固定化する支持体として適切である。

抗体もまた、アガロース、架橋デキストランおよびその他の多糖類のような特定 の物質に、米国特許第３，６４５，８５２号に述べられている抗体を多糖類に結 合する方法等の周知技法を用いて結合することができる。同様に、液体抗体を標 識するには多数の周知方法が存在する。Ｐ、Ｍ、クリンマンおよびＪ、Ｃ，ハワ ードの手法で、ヨー素１２５を用いて、液面抗体を放射標識する事ができる。〔 ″ハイブリドーマ抗体のＩｌｌのためのプロティンヨウ素化バイブリドニーヨー ク、プレナム・プレス（１９８０年）４０１〜４０２頁、これ以後、”Ｐ、Ｍ、 クリンマンとＪ、Ｃ，ハワード法″′と呼ぶ〕、同じく、この抗体は米国特許第 ３，９４０，４７５号の蛍光原性標識または米国特許第３，６４５，０９０号の 酵素マーカーを用いてＩｎｋすることができる。

ある場合には、本適用の対象物質である小分子が同一抗体に対する２つの結合部 位を持つのに十分な配列や化学構造を持っており、それ故に上述のどんな２部位 免疫測定法も２つの異なる抗体の代わりに１つの抗体を用いて行なう事ができる 。本発明のこの特別な実施態様に適する小分子の実施例はメルフィリンである。

他の大部分の場合では、２つの異なる抗体、すなわち、同一のエピトープに結合 しない２つの抗体が必要となる。

本発明に関連して使用するために考察された免疫放射分析測定の詳説は下記の実 施例３に述にら九でいる。

上述の免疫放射分析またはサンドイッチ検定以外の２部位免疫測定法もまた、こ の測定法を実施するのに適している。２つのモノクローナル抗体の混合物は前述 のエールリッヒおよびモイルの″サイエンス″論文。

およびエールリッヒらの゛′免疫ジャーナル″論文に記述されている協同作用的 な免疫測定法で測定することができるにのタイプの測定法を用いて共同的効果が 認められるならば、この結果は、２つのことなるモノクローナル抗体が同時に、 同一の小分子に結合することができることの例証としてみなすことができる。従 って、これらの特定の抗体および同じ測定手順を採取試料の検定に用いることが 可能である。特異的抗原に関して共同的効果を示す抗体は、その抗原ときわめて 安定な複合体を形成する事が多い。

実施例 実施例１ サンドイッチ免疫検定に使用する小ステロイドに対する２つのモノクローナル抗 体は、ズインメーリングとその共同切究者の方法を用いて、−匹のマウス、また はその他の適切な動物の免疫によって作ることができる（Ｐ、Ｅ、ズインメーリ ングら、生化学・第６巻（１９６７年）１５４〜１６４頁〕、抗血清をこのよう にして作ると、モノクローナル抗体を、上述のＨ，ジータとり。

ブルックスが述べた方法に従って産出する事ができる。

モノクローナル抗体を分離後、これらの抗体は、実施例３または実施例４に述べ る検定法で同時結合するのに検定される。

実施例２ 実施例１の方法で２つの異なる抗体を産出する事は。

必ずしも可能ではない、多くの場合、２つの異なるハプテン接合体を免疫原とし て使用しなければならない。

これは、小ハプテンのカップリング法が、同時に結合する事のできる２つの異な る抗体産出を許さないからである。−動物を２つの接合体で免疫する事は、２つ のタイプの抗体を産出する結果になる。しかし、抗血清の場合、抗体の２つの群 を分解できない場合がある。

（または、少なくとも、かなりの努力が、分離に必要となる）、従って、２つの 異なる動物の使用が、２つの抗体群を分離しておく前便な方法であろう、モノク ローナル・ハイブリドーマ抗体に関しては、２つの接合体を一動物中に注入する 事ができる。これは、タイプの異なる抗体の分離は、細胞系統のクローニングに よってできるからである。

一つのハプテンの２つの接合体の実施例として、アルドステロンが挙げられる。

アルドステロン−１８，２１−ジヘミサクシニルーウシ血清アルブミンは、エル ランガーラの方法によって調整する事ができる〔生化学ジャーナル、第２２８巻 （１９５７年）、７１３〜７２７頁〕、免疫プロトコールは、同論文に記述され ている。３−オキシム　アルドステロン接合体産出は、Ｊ、Ｔ、マツケンジーと 、Ｊ、Ａ、クレメンツによってえ報告されている〔臨床内分泌・代謝ジャーナル 、第３８巻（１９７４年）、６２２頁〕、免疫原としての、この接合体の使用法 は、Ｔ。

荻原らが報告している〔臨床内分泌・代謝ジャーナル。

第４５巻（１９７７年）、７２６頁〕。炭素３、および炭素１８．２１における 反応によるアルドステロンの接合化は、アルドステロン分子の反対の端のキャリ ヤー分子についた２つの接合体を産出する。従って、こ九らの接合体によって産 出された抗体は、アルドステロンに同時に結合する事ができる。２つの抗面清、 １つの抗血清と１つのモノクローナル抗体、または２つのモノクローナル抗体等 、これらの接合体を用いて生成されたものは、両者のアルドステロンに対する結 合能を実施例３または実施例４に概説される手法を用いてテストすることができ る。

実施例３ １つの同相抗体と１つの放射標識液相抗体を用いた免疫放射分析測定は、以下の ように実施することができる。小ハプテンＸ（実施例１および実施例２における ように）に対して産出したモノクローナル抗体ＡおよびＢを、上記に引用した、 Ｈ，ジータおよび、Ｄ、ブルックスの方法等の周知の手法により腹水液から精製 する。抗体ＡおよびＢの小ハプテンＸへの同時結合性を検定するために、リン酸 カリウム０．０１モル、塩化ナトリウム０．１５モル、アジ化ナトリウム０．０ ２％、ＰＨ７，５の混合液中にある０、１ｍｇ／ｍＱの抗体Ａ５０マイクロリッ トルを、塩化ビニール樹脂製マイクロタイター抜穴に４℃で一晩、培養する。抗 体Ｂは、前述のり、Ｍ。

クリマンとＪ、Ｃ，ハロードの方法によって、ヨウ素１２５で放射標識する。抗 体Ａの溶液を、マイクロタイター板から取り出し、プレートの穴を蒸留水で３回 すすぎ、紙タオル上にプレー１−をたたきつけるようにして、六を乾燥させる。

既知量の小ハプテンＸを含む試料は、放射標識された抗体Ｂと混合され、放射標 識抗体Ｂを約２０，０００〜５０，０ＯＯｃｐｏ＋含む混合物５０マイクロリツ トルをマイクロタイター板の各穴に加える。ｚｏ”ｃで約１７〜２４時間、室温 培養後、放射性溶液を吸上げ、穴を前と同じように洗う、各穴を、はさみでプレ ートから切り離し、ガンマ・カウンターで計算する。バックグラウンド・カウン ト以上の穴に付着した放射能（パックグラウンド・カウントは抗体Ｂがマイクロ タイターの穴に入れられる前に抗体Ｂと小ハプテンが混合しなか）たとしても、 結合した放射能量であろう）は。

抗体ＡおよびＢの小ハプテンＸへの同時結合能に依存する。各種濃度の小ハプテ ンＸを用いるのが最良の方法であろう。これは、ハプテンの量が過剰であると。

プラスティックに結合するバックグラウンド放射を生じさせるからである。濃度 のいずれかが、バックグラウンド放射能より高ければ、抗体ＡおよびＢは、ハプ テンＸに同時に結合する事ができる。

試料中の未知濃度の小ハプテンＸの存在は同様にして判定される。この試料を、 抗体Ａを固体支持体に吸着させながら、放射標識した抗体Ｂを混合する１次いで 、上記に挙げた一連の段階を実行する。穴に付着した放射能量は、試料中の小ハ プテン量に比例し、その濃度は、固体支持体に結合した放射能量を、既知濃度の 小ハプテン量とこのシステムで検定した時の結合した量とを比較して決定する。

実施例４ ２つの液相抗体を用いる協同作用的な免疫測定法は、最初に、放射標識した小ハ プテンＸ５０マイクロリツトルを用意し、測定する未標識の小ハプテン量含む試 料５０マイクロリツトル（両者とも、１％のウマの血清、９９％、　０．０１モ ルのリン酸カリウム、　０．１５モルの塩化す７．５）　１００マイクロリツト ルと混合する０次に、同時に結合する事のできる２つの抗体の混合液１００マイ クロリツトルを加える（抗体混合液は、１％ウマの血清、９９％のリン酸緩衝波 塩水に希釈する）、混合液中の２つの抗体の同時結合能は、既知量の小ハプテン Ｘに対する、混合物の放射免疫測定における親和性が、抗体それぞれのまたは、 交互に、サンドインチ検定法におけるこれら抗体の使用能力によるものより高い 事を示すことによって確立される。これは、エルリッヒらの免疫ジャーナル論文 に述べられた手法にもとづいたものである。抗体混合物は、次のように構成され る。こない条件下で、放射標識した小ハプテンＸの５０％を結合させる事が前も って判定された各抗体量（各個別抗体は、抗体混合液と置き換えられている）を １：１の比で混合する。未標識ハプテンＸが存在しない条件下でここに述べる方 法によって放射１１ｍ小ハ小ハプテン量０〜５０％を結合させる事が前もって判 定されたこの混抗体、緩衝液および放射標識した、小ハプテン、未標識の小ハプ テンを、３７℃で１時間、次に５℃で１８時間、定温培養する。リン酸緩衝塩水 中の、正常マウスの５０％血清を各検定管に添加する。適当量のウサギの抗マウ スＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）抗血清を次に加える。（適当量は、未標識小ハプ テンを用いた上述の検定法を行い、ウサギの抗マウスＩｇＧ抗血清の量を変えて 決定する。最高の放射能量を沈降させた抗血清養し、次に、室温で１時間培養す る。沈降物は遠心分離により沈降させ、上澄みテ液を吸い上げ、沈降物中の放射 能をカウントする。試料中の小ハプテン量と比例する。すなわち、カウントが低 ければ、試料中の小ハプテンＸは高濃度である。

ここに解説し、そして主張する発明は、上述の実施例、又は１本適用例に記した 特定の小分子、小免疫原および小ハプテンに限定されない、これらの実施例と、 その選択は１本発明の態様を解説する目的で挙げたも□のにすぎないからである 。゛実際、ここに示し記述したものに加えて１種々の変法が前述の解説から当業 者によ）て明らかにされるであろう、そのような改良法はまた、添付の特許請求 の範■にもとづいてのみ限定される意図を持つ発明の範囲内に入る事が企図され る。

手続補正書（放） 昭和６３年　２月　９日 特許庁長官　小　川　邦　夫　殿 ２、発明の名称　小型分子の免疫測定法３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　エクス　インコーホレーテッド４、代理人 住　所　（〒１００）東京都千代田区丸の内−丁目５番１号５、補正命令の日付 　昭和６２年　１月２７日６、補正の対象　（１）特許法第１８４条の５第１項 の規定による書面の特許出願人の欄及び外国語特許出願の適正な翻訳文並びに委 任状。

７、補正の内容　（１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の特許出 願人の欄の代表音名を補充し、外国語特許出願の明細書及び請求の範囲の翻訳文 のタイプ印書による浄書及び委任状（原国際調査報告 １ｍａｍｊｌｌａ＋ｖｌ　Ａ１１ｌｌｌｅｌｌｌｏｎ　Ｎ。Ｐ（ニーｌＵＳ８４ １０１１３１

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. １．試料中の小分子の検出または濃度測定の為の２部位免疫測定を実施する方法 であって、次の（ａ），（ｂ）および（ｃ）からなることを特徴とする小型分子 の免疫測定方法。 （ａ）そのような小分子に対する第１の抗体の効果的な検定量と試料を接触させ ること。 （ｂ）そのような小分子に対する第２の抗体の効果的な検定量を試料と接触させ 、第１と第２の抗体の効果的な検定量が、第１抗体：小分子：第２抗体の複合体 を形成するに足るものであること。および （ｃ）第１抗体：小分子：第２抗体の形成された複合体の存在の検出または、量 の測定。
2. ２．第１抗体と第２抗体が同一でない場合の特許請求の範囲第１項に基づく方法 。
3. ３．小分子が小ハプテンである場合の特許請求の範囲第１項による方法。
4. ４．小分子の分子量が２５０以上、２５００〜３０００以下の場合の特許請求の 範囲第１項に基づく方法。
5. ５．小分子の分子量が２７５以上、１０００以下の場合の特許請求の範囲第１項 に基づく方法。
6. ６．小分子の分子量が２７５以上、５００以下の場合の特許請求の範囲第１項に 基づく方法。
7. ７．小分子がステロイドである場合の特許請求の範囲第１項に基づく方法。
8. ８．ステロイドがアルドステロンである場合の特許請求の範囲第７項に基づく方 法。
9. ９．ステロイドが、コーチソンである場合の特許請求の範囲第７項に基づく方法 。
10. １０．ステロイドがエストラジオルである場合の特許請求の範囲第７項に基づく 方法。
11. １１．ステロイドがプロジェスロンである場合の特許請求の範囲第７項に基づく 方法。
12. １２．ステロイドがテストステロンである場合の特許請求の範囲第７項に基づく 方法。
13. １３．小分子がマイコトキシンである場合の特許請求の範囲第１項に基づく方法 。
14. １４．マイコトキシンがアフラトキシンである場合の特許請求の範囲第１３項に 基づく方法。
15. １５．マイコトキシンがトリコセシンである場合の特許請求の範囲第１３項に基 づく方法。
16. １６．小分子が小ペプチドである場合の特許請求の範囲第１項に基づく方法。
17. １７．小ペプチドがアスパルテームである場合の特許請求の範囲第１６項に基づ く方法。
18. １８．小分子が抗生物質である場合の特許請求の範囲第１項に基づく方法。
19. １９．抗生物質がゲンチミシンである場合の特許請求の範囲第１８項に基づく方 法。
20. ２０．抗生物質がペニシリンである場合の特許請求の範囲第１８項に基づく方法 。
21. ２１．小分子が小ホルモンである場合の特許請求の範囲第１項に基づく方法。
22. ２２．小ホルモンがトリヨードサイロニンである場合の特許請求の範囲第２１項 に基づく方法。
23. ２３．小ホルモンが黄体化ホルモン放出因子（ＬＨ−ＲＨ）である場合の特許請 求の範囲第２１項に基づく方法。
24. ２４．小分子がメルフイリンである場合の特許請求の範囲第１項に基づく方法。
25. ２５．第１または第２抗体の少なくとも一つが検出信号を発する標識をもち、そ のような信号が、放射性同位元素、酵素、蛍光化合物、化学発光化合物、強磁性 原子または、粒子から成るグループの一員である場合の特許請求の範囲第１項に 基づく方法。
26. ２６．（ａ）検出信号を発する標識を小分子のアリコートが持ち、そのような信 号が放射性同位元素、酵素、蛍光化合物、化学発光化合物、強磁性原子または、 粒子から成るグループの成員で、第１、第２抗体の効果的検定量と、接触し、第 １抗体：小分子：第２抗体の複合体が形成された後、これらの複合体が、これら の複合体の一部ではない抗体と小分子から分離される場合。 （ｂ）（ａ）段階と同じく、標識をもつ小分子のアリコートが、検定試料と混合 され第１、第２抗体の効果的定量と接触し、第１抗体：小分子：第２抗体の複合 体形成後、これらの複合体が、複合体の一部ではない、標識または未標識小分子 に加えて、抗体からも分離される場合。 （ｃ）（ｂ）段階の複合体から検出できる信号の強さが、（ａ）段階から検出で きる信号の強さと比較され、（ｂ）段階の信号の強度低下が、検定試料中の小分 子の存在を示し、検定試料中の小分子濃度に反比例する場合。 以上の場合の特許請求の範囲第１項に基づく方法。
27. ２７．同一でない第１、第２抗体が少なくとも２つのモノクローナル抗体から成 っている場合の特許請求の範囲第２項に基づく方法。
28. ２８．同一でない第１、第２抗体が、ポリクローナル抗血清と、少なくとも１つ のモノクローナル抗体から成っている場合の特許請求の範囲第２項に基づく方法 。
29. ２９．同一でない第１、第２抗体が、２つの同一でないポリクローナル抗血清か ら成っている場合の特許請求の範囲第２項に基づく方法。
30. ３０．小分子に対する第１抗体と小分子に対する第２抗体。第１、第２抗体か、 第１抗体：小分子：第２抗体複合体を形成する事ができる場合。
31. ３１．第１抗体と、第２抗体が同一でない場合の特許請求の範囲第３０項に基づ く第１抗体と第２抗体。
32. ３２．同一でない第１抗体と第２抗体が、２つのモノクローナル抗体から成る場 合の特許請求の範囲第３１項に基づく第１抗体と第２抗体。
33. ３３．同一でない第１抗体と第２抗体がポリクローナル抗血清とモノクローナル 抗体から成っている場合の特許請求の範囲第３１項に基づく第１抗体と第２抗体 。
34. ３４．同一でない、第１抗体と第２抗体が２つの同一でないポリクローナル抗血 清からなっている場合の特許請求の範囲第３１項に基づく第１抗体と第２抗体。
35. ３５．第１抗体と第２抗体が同一でなく、第１抗体：小分子：第２抗体複合体を 、第１の接合小分子で少なくとも一匹の動物を免疫する事により、および、第２ の接合小分子で少なくとも、もう一匹の他の動物を免疫する事により形成でき、 第１と第２の接合小分子が、同一分子上の事なる部位において小分子と、接合す る事によって作成される場合の、小分子に対する少なくとも１つの第１抗体と、 小分子に対する少なくとも１つの第２抗体の産出方法。
36. ３６．第１抗体と第２抗体が、同一でないモノクローナル抗体で、第１と第２の 複合小分子が、同一分子上の異なる部位で小分子と接合する事により形成される 場合に、第１と第２接合小分子で一動物を免疫する事により、第１抗体：小分子 ：第２抗体複合体を形成する事ができる場合の小分子に対する少なくとも１つの 第１抗体を、小分子に対する少なくとも１つの第２抗体の産出方法。