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JPH06102037B2 - 抗体、製法と用途 - Google Patents

抗体、製法と用途

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JPH06102037B2
JPH06102037B2 JP60501451A JP50145185A JPH06102037B2 JP H06102037 B2 JPH06102037 B2 JP H06102037B2 JP 60501451 A JP60501451 A JP 60501451A JP 50145185 A JP50145185 A JP 50145185A JP H06102037 B2 JPH06102037 B2 JP H06102037B2
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JP
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antibody
complex
small molecule
pair
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JP60501451A
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セルフ，コリン，ヘンリー
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ケンブリツジ パテント デベロツプメンツ エルテイデイ
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Publication date
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Publication of JPH06102037B2 publication Critical patent/JPH06102037B2/ja
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Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、遊離かもしくは複合体（又はコンプレック
ス、以下コンプレックスと称す）中に存在してもよい一
群のモノクロナール抗体、このような抗体の製法及び抗
原−抗体反応を使用する反応への利用に関する。
抗原とその抗体との反応は、バイオテクノロジーでの多
くの応用が見出され、とくに診断テスト、たとえば医療
用診断テスト、遺伝子調査などで見出されている。モノ
クロナール抗体〔たとえばジー．ガルフレとシー．ミル
スタイン：メソーヅイン エンチモロギー（G.Galfre a
nd C.Milotain,Methods in Enzymology）73巻、３〜57
頁,1981年参照〕が、バイオテクノロジー、特に診断テ
ストで特別な用途があることが見出されている。
モノクロナール抗体は、デー．エー．ネマジーとブイ．
ジェイ．サトー（D.A.Nemazee and V.J.Sato;Natl.Aca
d.Sci.USA,V 2,79,3828〜3822頁、1982年参照）によ
り、新しいエピトープを原抗体の一つのFc部位中で露出
してその結果としての２つの他の抗体のコンプレックス
に対する抗体であったと記述されている。原抗体は共に
巨大分子であるので、Fc部位での形態変化は、予期でき
ないものではなかった。仮に小分子が用いられたとする
と同様な変化を生ずることは期待できないであろう。同
様に、小分子は、同時多発生エピトープを有することが
できず、かつこのためそれ自体１より多くの抗体と結合
できないので〔たとえば，アール．ジェー．トンプソン
とエー．ピー．ジャクソン（R.J.Thompson and A.P.Jac
kson,TIBS,9,1〜３頁,1984年参照）〕 NemazeeとSatoが記述した効果は、小分子を用いている
コンプレックスを用いると期待し得ないであろう。この
期待に反し、恐らく異なったメカニズムのため、新しい
群のモノクロナール抗体を作ることができ、驚くべきこ
とにバイオテクノロジー、たとえば診断テストに有用で
あることがここに見出された。
従って、この発明は、モノクロナール抗体が、小分子と
その小分子に対する結合蛋白とのコンプレックスに対す
る二次抗体であり、その二次抗体が、小分子に値する抗
体でもなく、その結合蛋白に対する抗体でもないことを
特徴とするモノクロナール抗体を提供する。
ここで使用する用語“小分子”は、5000より小さい分子
量の分子を意味する。このような小分子は、2000より小
さい分子量を有するのが最も適切で、1200より小さい分
子量を有するのが好ましい。
この発明の蛋白類としては、抗体類、又は酵素類、ステ
ロイド結合蛋白類もしくはビタミン結合蛋白類のごとき
結合蛋白類のような蛋白の物質を用いることができる。
この発明に用いる蛋白は、モノクロナール抗体であるの
が好ましく、その場合小分子がここで小抗原と呼ぶこと
ができる。当業者であれば、この発明で使用する小分子
が普通非免疫性であること、しかし、それの抗体は、動
物を非免疫性分子（もしくは非常に密接な類似体）とウ
シの血清アルブミンもしくはその均等剤との抱合（conj
u gate）で免疫化することにより得られることを理解さ
れるであろう。望ましい抗体は、それ自体公知の方法で
得ることができる。
したがって、この発明の好ましい形態によれば、小抗原
とその小抗原のモノクロナール抗体とのコンプレックス
に対する二次モノクロナール抗体（secondary monoclon
al antibody）で、その二次モノクロナール抗体が、小
抗原に対する抗体でもなく、そのモノクロナール抗体に
対する抗体でもないことを特徴とするモノクロナール抗
体を提供するものである。
以後使用される用語“二次モノクロナール抗体”とは上
で定義したようなこの発明で提供される抗体を意味する
ものである。以後使用される用語“一次（原発性）モノ
クロナール抗体（primary monoclonal antibody）は抗
原に対するモノクロナール抗体（すなわち通常のモノク
ロナール抗体）を意味する。
モノクロナール抗体は、記述した結合活性を有する完全
免疫グロブリン又はそのフラグメントであってもよい。
以後に明らかになるように、この発明のある具体例によ
れば、全体免疫グロブリンの使用がそのフラグメントよ
り有利で、他の具体例ではFab及びＦ（ab′）2フラグメ
ントのような完全免疫グロブリンのフラグメント類の使
用がより有利であろう。このことは、二次抗体とコンプ
レックスとの結合が、小分子の結合部位又はそのあたり
で行われると考えられる。
二次モノクロナール抗体が小抗原の抗体またはその結合
蛋白抗体（一次モノクロナール抗体）でないという場
合、二次モノクロナール抗体及び小抗原もしくは結合蛋
白は一般にモル当り103リットルより小さい平衡定数を
有し、より望ましくはモル当り102.5リットルより小さ
くかつ好ましくはモル当り102リットルより小さい。普
通、二次モノクロナール抗体は、小抗原もしくは一次モ
ノクロナール抗体と、無関連の小分子もしくは蛋白と結
合するほど大きく結合しないであろう。
二次モノクロナール抗体及び小抗原と一次モノクロナー
ル抗体のコンプレックスは、少なくともモル当り104リ
ットルの平衡定数を有するのが適し、望ましくは少なく
ともモル当り105リットル、より望ましくは少なくとも
モル当り106リットル、好ましくはモル当り少なくとも1
07リットルを有する。
上記のことは、また、他の小分子を結合蛋白に結合する
類似の方法に適用できると考える。
（ａ）二次モノクロナール抗体とコンプレックス及び
（ｂ）二次モノクロナール抗体とコンプレックスの何れ
かの成分間の平衡定数の割合は、100:1より大であるべ
きで、1,000:1より大がより適し、10,000:1より大が好
ましいと今思われている。
二次モノクロナール抗体（すなわち、小抗原の抗体でも
なく、その小抗原の一次モノクロナール抗体に対する抗
体でもないが、抗原と一次モノクロナール抗体とのコン
プレックスのモノクロナール抗体であるもの）を選択す
るのに適する方法は次の通りである。
1a. 可能な二次モノクロナール抗体を、ポリスチレン
テストチューブの内側のような固体表面に結合させる。
1b. チューブの各々に同量のラベル化一次モノクロナ
ール抗体（たとえば、放射能ラベル化）を入れる。
1c. 一連の濃度の抗原を作り、かつ異なる濃度のもの
を各チューブに加え、一つのは何も入れない。
1d. チューブを培養する。
1e. 未結合物質をチューブから洗い出す。
1f. 保持されたラベルを測定する。
抗原を入れなかったチューブ中の保持ラベル量が、チュ
ーブの何れかに保持されたラベルの最大量の（１％より
少ない、より適切には0.1％より少ない、好ましくは0.0
1％より少ないような）小フラクションより少ない場合
は、二次モノクロナール抗体が小抗原の抗体でもなく、
一次モノクロナール抗体に対する抗体でもなく一次モノ
クロナール抗原コンプレックスのモノクロナール抗体で
あると考えられる。
当業者に理解されるように、小分子は通常抗原性ではな
く、しかし、二次モノクロナール抗体が小分子と結合し
ない確認として、次の確認テストが使用できる。
2a. 可能な二次モノクロナール抗体をポリスチレンテ
ストチューブの内側のような固体表面に結合させる。
2b. 一群のチューブの各々に同じラベル化抗原（たと
えば放射能ラベル化）を入れる。
2c. 一連の濃度の小抗原に対する一次モノクロナール
抗体を作り、かつ異なる濃度のものを各チューブに加
え、一つのチューブは何も入れない。
2d. チューブを培養する。
2e. 未結合物質をチューブから洗い出す。
2f. 保持されたラベルを測定する。
一次モノクロナール抗体を入れなかったチューブ中の保
持ラベル量が、何れかのチューブに保持されたラベルの
最大量の（１％より少ない、より適切には0.1％より少
ない、好ましくは0.01％より少ないような）小フラクシ
ョンより少ない場合、可能な二次モノクロナール抗体
は、小抗原の抗体ではないと考えられる。
同様な手法が、小分子及び小抗原や一次モノクロナール
抗体以外の結合蛋白に使用できる。
この発明の二次抗体の望ましい用途は診断テストであ
る。反応における可逆性での低減が、リガンドと抗体リ
ガンド間の高い明白な親和性（洗浄に対する安定性の改
良をもたらし得る）、早い反応時間等をもたらす。ま
た、この発明の二次モノクロナール抗体の用途は、小分
子をサンドイッチ法のような非競合法によって測定でき
ることで、この方法では幅広い濃度で操作できかつ試剤
の性質や使用モードに感受性が少ない。これは、後述で
明らかにされるであろう。
診断的に有用である一群の小抗原にはホルモンが含まれ
る。特に関連ホルモンとしては、タイロイド、ホルモン
や、プロゲステロン及びエストロゲンのようなステロイ
ド系ホルモンが含まれる。他の望ましいステロイドに
は、ハイドロコーチゾン、テストステロン、エストラジ
オール、エストラトリオールやアンドロスタンジオール
が含まれる。
かくして、この発明の特に適切な観点によれば、ホルモ
ンとそのホルモンのモノクロナール抗体（このモノクロ
ナール抗体はホルモンに対する抗体でもなく、そのホル
モンの抗体に対する抗体でもない）とのコンプレックス
に対するモノクロナール抗体を提供するものである。
抗体とコンプレックスを形成する特に興味のある他の抗
原は、医薬である。このような医薬には、ゲンタマイシ
ンのようなアミノグリコシドのような抗生物質、ジゴキ
シンのような心臓作用剤などが含まれる。乱用薬物が同
様に測定できる。
かくして、特に適切な観点によれば、この発明は、医薬
とその医薬のモノクロナール抗体との複合体に対するモ
ノクロナール抗体（このモノクロナール抗体は医薬に対
する抗体でもなく、その医薬の抗体に対する抗体でもな
い）を提供するものである。
二次モノクロナール抗体の非常に好ましい用途は、診断
テストであり、この発明のモノクロナール抗体又は抗原
−抗体コンプレックスは、シグナール発生手段（signal
generating means）からなるのが好ましい。シグナル
発生手段は測定すべき二次モノクロナール抗体と小抗原
−抗体コンプレックスとのコンプレックスの存在を許す
何れでもよい。シグナル発生手段は直接的に測定できる
もの（たとえば放射能活性ラベル）又は間接的に測定で
きるもの（たとえば酵素で、その存在はそれ自体測定で
きる場合に生ずる）である。シグナル発生手段が、小抗
原−抗体コンプレックスに存在さす場合、抗体にラベル
として存在するのが最も適切である。しかしより望まし
いのは、この発明の二次モノクロナール抗体中にシグナ
ル発生手段が存在することである。
前記のことから、この発明のことに望ましい観点は、モ
ノクロナール抗体が、小抗原に対する抗体でもなく、そ
のモノクロナール抗体に対する抗体でもない、小抗原−
モノクロナール抗体複合体に対する抗体であることを特
徴とするシグナル発生手段をラベルしたモノクロナール
抗体を提供することにあることが理解されるであろう。
同様に、望ましい観点によれば、この発明は、モノクロ
ナール抗体が、小抗原に対する抗体でもなく、そのモノ
クロナール抗体に対する抗体でもなく、かつそのコンプ
レックスがシグナル発生手段でラベル化されていること
を特徴とするモノクロナール抗体を提供することである
ことが理解されよう。
ラベル化の適切な方法には、ピー．アール．ラガットと
シー．エヌ．ハーレスの“ラベル化抗原又は抗体を用い
る免疫アッセイ”（P.R.Raggatt,C.N.Hales,“Immunoas
soaysusing labelled antigen or antibodies",Clinica
l Aspects of Immunology,Ea.Peters and Lachman,Blac
kwell Scientific Publications,Oxford,1983）に記載
されたものであろう。
放射能ラベルをシグナル発生手段として使用するとき、
このラベルの物質への導入は、放射線ラベルプレカーサ
ーを用いる生体外生合成によって抗体を生成するとか、
たとえばラクトパーオキシダーゼ ヨード化を用いる放
射活性ヨー素でのヨード化によるような既に生成した抗
体のラベル化で抗体を生成するような通常の方法を用い
て行うことができる。
別の直接的に測定しうるシグナル発生手段は、たとえば
フルオレッセンでの蛍光ラベルであって、抗原または抗
体をフルオレッセンイソシアナートなどとの反応でラベ
ル化できる。
抗原または抗体をシグナル発生手段でラベル化する好ま
しい方法には、色変化やスペクトル性の変化（たとえ
ば、赤外部で）のような測定可能とする酵素でラベル化
することがある。酵素ラベルは、抗体または抗原を、グ
ルタルアルデヒドのような、２官能性試薬を用いて結合
さすような通常の方法で行うことができる。
望ましい酵素ラベルには、ホスファターゼ、パーオキシ
ダーゼ、β−ガラクトシダーゼ，リゾチーム，マレート
やグルコース−６−ホスフェートのようなデヒドロゲナ
ーゼが含まれる。ホスファターゼは、デホスホリレート
化合物への能力により、検出される物質を作るので観察
できる。パーキシダーゼは、検出しうる過酸化水素を生
成する能力により観察できるβ−ガラクトシダーゼは、
検出しうる生成物を与えるβ−ガラクトサイドを加水分
解する能力により観察できる。リゾチームは、濁度変化
を生じることになる細菌細胞を破壊する能力により観察
できる。デヒドロゲナーゼは、NADとＮ′ADAの酸化状態
の変化を生ずる性質で観察できる。
望ましい酵素ラベルには、酸及びアルカリホスファター
ゼが含まれる。好ましい酵素ラベルは、アルカリホスフ
ァターゼである。
このような抱合ホスファターゼは、容易に検出しうる変
化を生ずるため、ジニトロフェノールのようなデホスホ
リレート物質に使用できる。このような抱合ホスファタ
ーゼは、NADPをNADに変化するのに用いることができ、
これらは検出容易な変化を与えるサイクル化学反応を開
始することも知られている。
望ましい酵素ラベルは、酸ホスファターゼである。好ま
しい酵素ラベルはアルカリホスファターゼである。
抗原又は抗体をラベル化する他の適切な方法には、これ
らを化学蛍光を生じうる物質とたとえば常法によりラベ
ル化することがある。
今後特に断らないかぎり、用途“抗原”は“小抗原”と
称する。
前に示したように、この発明は、物を診断する方法に適
用するのが最も適する。かくして、この発明は、対の疑
わしいソースの成分に、対の他の成分と及び対のコンプ
レックスに対する二次モノクロナール抗体とを接触さ
せ、測定すべき対の成分と、対の他の成分又は二次モノ
クロナール抗体間の会合を測定することからなる小分子
結合蛋白対の成分の測定法を提供するものである。
望ましい形態では、小分子が小抗原で結合蛋白がモノク
ロナール抗体であるので、この発明のさらに望ましい観
点によれば、対の疑わしいソースの成分に、対の他の成
分と及び対のコンプレックスに対する二次モノクロナー
ル抗体とを接触させ、測定すべき対の成分と、対の他の
成分又は二次モノクロナール抗体間の会合を測定するこ
とからなる抗原−次モノクロナール抗体対の成分の測定
法を提供するものである。
測定すべき対の成分と対の他の成分または二次モノクロ
ナール抗体の化合の測定は、定性的でも定量的でもよい
が、定量的が最も有利である。何れの適切な方法も使用
でき、その方法では抗体とその抗原の結合を測定する。
たとえば、一つの成分を固体基質に固定し、固体基質に
結合する他の成分を測定すること、又は一つの成分に酵
素を結合させること（この酵素活性は、他の成分が最初
の成分と結合した際変化する）、あるいは凝集反応、又
は沈澱反応によるものがある。
前記したように、反応に加える対の成分又は二次モノク
ロナール抗体は、シグナル発生手段でラベル化してもよ
い。このシグナル発生手段は、物質の化合を測定するの
に用いうる。
シグナル発生手段でラベル化されている二次モノクロナ
ール抗体を使用するのが好ましいため、望ましい観点に
よれば、不明の対の成分を対の他の成分およびシグナル
発生手段でラベル化されている対の複合体に対する二次
モノクロナール抗体に接触させ、測定すべき対の成分と
シグナル発生手段を測定に用いている二次モノクロナー
ル抗体との間の化合を測定することからなる抗原一次モ
ノクロナール抗体の成分を測定する方法がある。
この発明の測定法は、小抗原又はその一次モノクロナー
ル抗体の測定に適用しうる。しかし、この発明の方法
は、抗原の測定に適用するのが最も望ましい。
従って、望ましい観点によれば、この発明は、不明の抗
原を、その抗原に対する一次モノクロナール抗体と接触
させかつその抗原と一次モノクロナール抗体とのコンプ
レックスと二次モノクロナール抗体を接触させ、抗原と
一次又は二次モノクロナール抗体間の会合を測定するこ
とからなる抗原を測定する方法を提供するものである。
会合の測定は、シグナル発生手段を用い、一次又は二次
モノクロナール抗体の何れかをラベル化して行うのが最
も適する。しかし、前述したように、シグナル発生手段
でラベル化されている二次モノクロナール抗体を使用す
るのが好ましい。
かくして、好ましい観点によれば、この発明は、不明の
抗原をその抗原に対する一次モノクロナール抗体と接触
させ、かつシグナル発生手段でラベル化されている、抗
原と一次モノクロナール抗体との複合体に対する二次モ
ノクロナール抗体と接触させ、抗原と二次モノクロナー
ル抗体との化合を、測定にシグナル発生手段を用い測定
することからなる抗原の測定法を提供する。
測定すべき原試料としては、血液、血清、血漿、尿、
乳、唾液又は組織抽出物のような生理的由来の液体、又
は食品産業由来の液体物質が普通である。かくして、た
とえば診断テストは、上記の試料を適当な二次抗体を用
いて行えばよい。
この発明の一つの特に適する形態によれば、抗原一次抗
体対のメンバーを表面に結合させ、対の不明な他のメン
バーをその表面に接触させ、またシグナル発生手段をラ
ベル化した二次モノクロナール抗体をその表面に接触さ
せ、対の他のメンバーと二次モノクロナール抗体が対の
最初のメンバーに結合しかくして表面に結合するまで培
養し、表面から液体を分離し、シグナル発生手段を二次
モノクロナール抗体を測定するのに用い、これにより結
合量を決定しかつ測定すべき対のメンバー量が決まる。
測定される二次モノクロナール抗体は、表面に結合して
区分（溶液中の残存量を測るのとは反対であり、その方
法はあまり適切ではない）であるのが普通で好ましい。
この発明のかかる観点から、抗原を測定するのに適し、
そのため表面に結合される対のメンバーは一次モノクロ
ナール抗体であるのが最も適する。
かくして、非常に望ましい形態によれば、この発明は、
抗原に対する一対モノクロナール抗体を表面に結合さ
せ、結合した一次モノクロナール抗体と不明な抗原とを
接触させ、かつシグナル発生手段をラベル化した二次モ
ノクロナール抗体と接触させ、抗原と二次モノクロナー
ル抗体が一次抗体に結合し、かつ結果的に表面に結合す
るまで系を培養し、表面から液体を分散し、シグナル発
生手段を使用して表面上の二次モノクロナール抗体を測
定することからなる抗体を含有することの疑われた源中
における抗原を測定する方法を提供する。
この発明の別の適切な形態によれば、抗原と一次モノク
ロナール抗体のコンプレックスに対する二次モノクロナ
ール抗体（何れか１つがシグナル発生手段でラベル化さ
れている）を表面に結合させ、コンプレックスの不明な
源の１成分を表面に接触させ、コンプレックスの他の成
分を表面に接触させ、系をコンプレックスが形成し、二
次モノクロナール抗体と結合し結果として表面に結合す
るまで低温放置し、液体と表面から分離し、シグナル発
生手段が結合したコンプレックスを測定し、結果として
測定すべきコンプレックスの成分の量を測定するのに用
いられる。
測定するコンプレックスのフラクションは、表面に結合
するようになったフラクション（溶液中の残存量を測る
のは対比され、この方法はあまり適切ではない）が普通
でかつ好ましい。
前の方法は、抗原の測定に適用するのが好ましく、その
ため一次モノクロナール抗体はシグナル発生手段でラベ
ル化される。
かくして、望ましい形態によれば、この発明は、抗原と
シグナル発生手段をラベル化した一次モノクロナール抗
体のコンプレックスに対する二次モノクロナール抗体を
表面に結合させ、結合した二次モノクロナール抗体と不
明な源の抗原と、及びラベル化一次モノクロナール抗体
と接触させ、抗原とラベル化一次モノクロナール抗体が
二次モノクロナール抗体と結合するまで系を培養し、表
面から液体を分離し、シグナル発生手段を用いて表面上
の一次モノクロナール抗体、これから抗原を測定するこ
とからなる抗原を含有することの疑われた源中の抗原を
測定する方法を提供する。
表面を使用するこ発明のこれらの方法は、1200〜5000の
分子量の範囲の分子に用いるのが有利であるが、1200以
下の小抗原の測定に用いるのに特に有利である（これは
小抗原がこれまでELISAや類似のアッセイでは測定が容
易でなかったからである）。
なお他の観点によれば、この発明は、対の一つを表面に
結合させ、その表面に対の疑問な源の他の成分、その対
のコンプレックスに対する二次モノクロナール抗体及び
シグナル発生手段をラベルした対の他の成分を接触さ
せ、系を低温放置し、表面から液体を分離し、ラベルし
た成分と表面との化合を測定し、それにより、含有が疑
われた源中に存在し測定すべき物質の量を決めることか
らなる抗原モノクロナール抗体対を測定する方法を提供
する。これには、結合したラベル化成分の量と、測定す
べき未ラベル物質の既知量の存在下で結合した量を比較
するのが普通である。
一次抗体が表面に結合する場合の抗体の検出に、この方
法を適用するのが通常好ましい。表面に結合した保持ラ
ベルが測定（溶液中に残存するフラクションとは反対）
するのが好ましい。
この発明の二次モノクロナール抗体は、凝集を用いる診
断テストにも使用できる。
一つの適切な観点によれば、この発明は、抗原を固体粒
子に結合させ、その抗原を結合した粒子を疑わしい源の
抗原と、及び抗原とそれに対する一次モノクロナール抗
体とのコンプレックスに対する二次モノクロナール抗体
とに接触させ、生成する凝集を測定することからなる抗
原の測定法を提供する。
あまり望ましくないものである凝集テストでは、一次モ
ノクロナール抗体を粒子と結合させ、二次モノクロナー
ル抗体と疑わしい源の抗原と接触させる。このようなテ
ストでは、凝集量がテストサンプル中の抗原の量を示
す。
この発明の測定は、通常の条件下、たとえば４〜45℃、
より普通には15〜38℃、好ましくは18〜25℃の温度で、
一般に実質的に等張である水溶液中、pHが２〜10、より
普通には５〜９、好ましくは６〜８、最も好ましくは約
７、で行うのが普通であろう。
この発明の二次モノクロナール抗体は、抗原（又は他の
小分子）とそのモノクロナール抗体（又は他の結合蛋
白）とのコンプレックスを形成することにより作ること
ができ、次いでコンプレックスは、それ自体公知の方法
でモノクロナール抗体を生ずる免疫原として用いられ
る。
同系の動物が二次モノクロナール抗体を作るのに有利に
用いることができる（すなわち、一次抗体を生ずるのに
使用された動物に対して同系）。
二次モノクロナール抗体を作るセル系の選定はこれまで
記載したようなやり方でよく、抗原に対する抗体及びそ
の一次モノクロナール抗体に対する抗体を産生しない
が、コンプレックスに対する抗体を産生するセル系を選
定するのが本質的に含まれる。
診断法に関してこの発明は、小抗原とそれらの抗体とを
用いる前述の方法に類似のやり方で、結合蛋白とコンプ
レックスを形成する小分子の測定をも含むものである。
この発明の方法で使用され測定される小抗原及び他の小
分子は、コンプレックス形成が容易なことから水溶性の
ものが最も適する。このような分子は、一般にヒドロキ
シ、アミノ又はカルボキシ基を有する。コンプレックス
（免疫化に対し）は、小分子と結合蛋白を水性媒体に溶
解するか直接分散さすことにより作ることができる。一
般に、大過剰の小分子が用いられる。コンプレックスは
溶液で、任意に完全又は不完全なフロインドのアジュバ
ンドのようなアジュバンドと共に注射できる。又、コン
プレックスは沈澱した形で用いることができる。
この発明は、この発明の二次モノクロナール抗体と含有
する診断用キットをも含む。好ましいキットは、この発
明のラベル化二次モノクロナール抗体からなる。この発
明のキットは、この発明の抗体を固体の形を（たとえば
瓶の中で）、又は固体表面中又は上に吸収させた型（た
とえばプレート上のくぼみ）からなるのが最も適する。
この発明の一つの方法では、一次抗体が、くぼみ又は他
の分離表面の表面におかれ、測定すべき溶液を小抗原が
表面に結合するのに十分な時間その表面に接触させ、任
意に表面から溶液を除去し、ラベル化二次モノクロナー
ル抗体を導入し、溶液を低温放置する。溶液を固体表面
から分離し、次いで洗浄し、結合したラベルを測定す
る。別の方法では、測定すべき溶液と二次抗体とを本質
的に同時に加える。なお他の方法では、ラベル化二次抗
体を、測定すべき溶液を導入する前に存在させる。
類似のやり方で、ラベル化一次抗体を使用できる。小抗
原と一次モノクロナール抗体とのコンプレックスは、一
次モノクロナール抗体が最初に、アルカリホスファター
ゼのような抗原性物質と結合されれば、より免疫原性を
示すことができる。かくして、好ましい形態では、二次
モノクロナール抗体を生ずるのに用いるコンプレックス
は、一次モノクロナール抗体がアルアリホスファターゼ
のような抗原性物質と結合したものを含有するコンプレ
ックスである。
次の実施例は、この発明を例証するものである。
実施例 次の実施例においては、たとえばSoos,M＆K.Siddle,The
Journal of Immunolo gical Methods,1982,51,57〜68
に記載の標準技法に準じて、記載の異なる材料に対する
モノクロナール抗体が作られ、その親和性が測定され
る。アルカリホスファターゼの結合は、E.Engvall＆P.P
erlmann,1971,Immunochemistry,8,871に従って行われ
る。
実施例１ プロデスロンとプロゲステロンに対するラベル化一次モ
ノクロナール抗体とのコンプレックスに対する二次モノ
クロナール（この二次モノクロナール抗体は、プロゲス
テロンに対する抗体でもなく、プロゲステロンに対する
一次モノクロナル抗体に対する抗体でもない）の製造 プロゲステロンに対するモノクロナール抗体（MabPro
g）を、免疫原としてプロゲステロン−HS−ウシ血清ア
ルブミンを用いて、The Journal of Immunological Met
hods,1982,51,57−68に記載の方法に準じたマウスハイ
ブリドーマ技法によって製造する。より詳しくは、ま
ず、免疫プロゲステロン−HS−ウシ血清アルブミンをフ
ロインドの完全アジュバントと混合したものを用いて、
バルブ／シー（BALB/c）マウスを免疫する。免疫後、マ
ウスの脾臓を取り出し、マウス脾細胞をポリエチレン
グリコール 1500を用いてマウス骨髄腫細胞と融合させ
る。細胞融合後、生じた融合細胞を、ハット（HAT）選
択培地の入ったプラスチック製のマイクロタイタ プレ
ートの各ウエルにまいて培養し、各ウエルの上澄につい
て抗体産生能を試験する。抗体産生が陽性のものを、ダ
ルベッコの正常培地（normal Dulbecco′s medium）の
入った各ウエルに移してクローニングする。その後、各
ウエルの上澄についてプロゲステロンに対する反応性を
スクリーニングしてプロゲステロンに対する抗体を産生
している融合細胞を選択し、プロゲステロンに対するモ
ノクロナール抗体を単離する〔以下の実施例において、
モノクロナール抗体は、全て上記のThe Journal of Imm
unological Methods,1982,51,57−68に記載の方法に準
じたマウスハイブリドーマ技法によって製造した。但
し、二次モノクロナール抗体（コンプレックスに対する
モノクロナール抗体）については、クローニング後、コ
ンプレックスに対する抗体であり、コンプレックスを形
成している抗原（1200より小さい分子量を有する分子）
に対する抗体でもなく、コンプレックスを形成している
抗体（1200より小さい分子量を有する分子に対する結合
蛋白）に対する抗体でもない抗体を産生している融合細
胞を選択し、二次モノクロナール抗体を単離する。〕。
MabProgは精製ウシ腸アルカリホスファターゼに結合さ
れる。
次いでpH7.4のリン酸緩衝食塩水中150μｇのこのMabPro
g−アルカルホスファターゼ コンジュゲート（MabProg
−Ap）の1ml溶液を100μｇプロゲステロン（prog）の0.
1ml溶液をゆっくり、一定に緩和に攪拌しつつ混合す
る。混合物を室温（23℃）で１時間ゆるやかに攪拌し、
次いで４℃で12時間放置するか又は必要なだけ放置する
と、MabProg−Ap−progコンプレックスを得る。次いで
元のモノクロナール抗体に由来したと同系の生産マウス
に免疫原として用いる。上記の同じハイブリドーマ技法
を抗体−抗原コンプレックスに対するモノクロナール抗
体（二次モノクロナール抗体MabSEC）を産生するセル系
を生ずるのに用いられる。次いで、これらのセル系の培
養液体が、平衡定数の条件でプロゲステロン単独に対す
る反応性をスクリーンする。103リットル／モル以上の
平衡定数で、プロゲステトロに反応性の抗体を産生する
これらのセル系を棄てる。残部について、次の実施例中
にあるようにプロゲステロン測定への利用性をテストす
る。
実施例２ 二次モノクロナール抗体使用のプロゲステロン測定 ポリスチレンミクロ滴定用プレートのくぼみを、常法に
よりプロゲステロンに対する一次モノクロナール抗体で
コートする。０〜100ng/ml範囲のプロゲステロンをカバ
ーする標準プロゲステロン溶液をたとえばプロゲステロ
ンを含まないヒト血清中で作る。各溶液の100μｌを別
々のくぼみに加える。プロゲステロン測定がなされる各
サンプルの100μｌを別々のくぼみに加える。プロゲス
テロン（前述）とプロゲステロンに対する一次モノクロ
ナール抗体とのコンプレックスに対する50ng/mlの精製
二次モノクロナール抗体の溶液（前述のような方法を用
いてアルカリホスファターゼとグルタルアルデヒドが化
合されている）の100μｌを各くぼみに加え、混合し、
ミクロ滴定用プレートを37℃で１時間培養する。未結合
の材料を振盪除去し、くぼみを0.05％ツイン−20含有の
pH7.4のトリス緩衝正常食塩水で４回洗浄する。次いで
各くぼみに、3.3mM塩化マグネシウム含有のpH10.3の0.1
5M炭酸塩緩衝液中5mMのパラニトロフェニルリン酸塩200
μｌを加える。プレートを室温で培養し、パラニトロフ
ェノールの生成が405nMでの溶液の吸収増大でみられ
た。培養を最大吸収変化が1.5光学濃度単位まで続け
る。この時に全部のくぼみを読み吸収変化に対するプロ
ゲステロン濃度の標準曲線を標準溶液を入れているくぼ
みの結果からかく。これから、サンプルを入れているく
ぼみの吸収変化をプロゲステロン濃度に換算する。
実施例３ 実施例１に代り、リン酸塩緩衝食塩水中150μｇのMabPr
og−PAの1ml溶液を、10mgのプロゲステロンが常に混合
されている同じ緩衝液の5lに対し、４℃で７日間透析し
て、プロゲステロンとそれに対するラベル化モノクロー
ル抗体のコンプレックスを作ることができる。
実施例４ プロプラノロールノ検定に用いる二次モノクロナール抗
体の製造と選定 プロプラノロール−ウシ血清フルブミンとＮ−（４−ブ
ロモブチル）フタリメート〔シグマケミカル社（ロンド
ン）、カタログ No.B3502〕との抱合体からなる免疫原
を用い常法によりプロピラノロール（propranolol）に
対する一次モノクロナール抗体を得る。この抗体は精製
子牛腸アルカリホスファターゼに抱合される。
次いでpH7.4のリン酸緩衝食塩水中このMabProg−アルカ
リホスファターゼ抱合物（MabProg−AP）150μｇの1ml
溶液をゆっくり一定にゆるやかに攪拌しつつ、プロプラ
ノール（prop）100μｇの0.1ml溶液と混合する。この混
合物を室温（23℃）で１時間ゆっくり攪拌し、次いで４
℃で12時間放置すると、MabProp−Ap−propコンプレッ
クスを生ずる。次いでこのものを、元モノクロナール抗
体が由来したのと同系の産生マウス中で免疫原として用
いる。上記と同じハイブリドーマ技法を用い、抗体−抗
原コンプレックス（MabSEC）のモノクロナール抗体産生
のセル系を生じさせる。このセル系の培養液を次のよう
にプロプラノールの検定への利用性のためスクリーニン
グする。
マイクロ−ELISAプレートのくぼみを、pH9.6の50mM重炭
酸塩緩衝液中100ng/mlの抗体からなる溶液200mlを４時
間、室温（23℃で培養して、MabSECで被覆する。次い
で、溶液をとり除き、同じ緩衝液の２％ラクトアルブミ
ン200μｌで置換し、プレートをさらに４時間室温で放
置し、くぼみをＮ−食塩水と0.02％ツイーン20を含むpH
7.4の50mMトリス緩衝液で４回洗う。pH7.4の50mMトリス
緩衝食塩水液中のプロプラノール溶液を、0.1ng/ml、1n
g/ml、10ng/ml、100ng/ml及び０のプロプラノールを含
有するよう作る。各溶液の0.3mlと同量の、pH7.4の50mM
トリス緩衝食塩水中のMabProp−Ap抱合の50ng/ml液と混
合し、１時間室温で低温放置する。この混合物のそれぞ
れ200μｌを、被覆マイクロ滴定プレートの重復くぼみ
に入れ、次いで室温でさらに１時間低温放置する。次い
で溶液をくぼみから振い落し、くぼみを0.05％ツイーン
20含有のトリス緩衝食塩水で４回洗う。次に、それぞれ
のくぼみに会合して残存するアルカリホスファターゼを
常法の酵素法で測定する。プロプラノール不存在下より
存在下でプレートでよりアルカリホスファターゼの会合
（かつこれよりMabProp−Ap−Propがプレートに結合）
を生じ、MabSECが選定され、従ってプロプラノールの検
出に用いることができる。
実施例５ ゲンタマイシン検定用の二次モノクロナール抗体の製造
と選定免疫原として、ゲンタマイシン−牛血清アルブミ
ンと１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド（シグマケミカル社、1985年カタログ
No.E7750）との抱合物を用い常法によってゲンタマイシ
ンに対する一次モノクロナール抗体（MabGent）を得
る。次いでこのMabGentを精製子牛腸アルカリホスファ
ターゼで抱合させる。次に、これは二次モノクロナール
抗体を作るのに用い、またプロプラノロールの検定にお
けるMabProp−Apの使用について詳述している先の実施
例と類似のしかたでゲンタマイシンを分析するのに用い
られる。
実施例６ プロプラノロールとそれに対する一次モノクロナール抗
体のコンプレックスに対する二次モノクロナール抗体
（この二次モノクロナール抗体は、プロプラノロールに
対する抗体でもなく、プロプラノロールに対する一次モ
ノクローナル抗体に対する抗体でもない）の製造と選定 プロプラノロールに対する一次モノクロナール抗体（Ma
bProp）を、Ｎ−（４−ブロモブチル）フタリメート
（シグマケミカル社（ロンドン）カタログ No.B3502）
で作ったプロプラノロール牛血清アルブミン抱合物から
なる免疫原の手段で常法により得る。この抗体のいくら
かを精製子牛腸アルカリホスファターゼと抱合させる。
pH7.4のリン酸緩衝食塩水中の150μｇのMabPropの1ml液
を一定にゆるやかに攪拌しつつ、100μｇプロプラノロ
ール（prop）の0.1ml液にゆっくり混合する。混合物を
室温（23℃）で１時間ゆるやかに攪拌し、次いで４℃で
12時間放置して、MabProp−Propコンプレックスを得
る。次いで、これをマウスの免疫原として用いる。上記
と同じハイブリドーマ技法を抗体−抗原コンプレックス
のモノクロナール抗体（MabSEC）を作るセル系を作るの
に用いる。このセル系の培養液が、前のプロプラノロー
ルの実施例と同様に、プロプラノロールの検出への有用
性のスクリーンされる。
実施例７ プロプラノロールとプロプラノロールに対する一次モノ
クロナール抗体とのコンプレックスに対する二次モノク
ロナール抗体（この二次モノクロナール抗体は、プロプ
ラノロールに対する抗体でもなく、プロプラノロールに
対する一次モノクロナール抗体に対する抗体でもない）
の製造と選定 プロプラノロール（MabProp）に対する一次モノクロナ
ール抗体とこれとプロプラノロールとのコンプレッスク
に対する二次モノクロナール抗体が前の実施例と同様に
行って得られる。この二次抗体を常法で精製し、精製子
牛腸アルカリホスファターゼと抱合させる。
マイクロ滴定用プレートを一次モノクロナール抗体で、
前述の抗体コーティング法を用いてコートする。０から
100ng/mlの範囲のプロプラノロール標品を、7.4の50mM
トリス緩衝液中で作る。これの各々の100μｌを別々の
くぼみに入れ、次いで抱合二次抗体の溶液100μｌを入
れる。混合物を37℃で１時間培養し、次いで振って液を
すてる。くぼみを前述のように洗浄し、各々に会合して
残存するアルカリホスファターゼを測定する。かくして
二次抗体アルカリホスファターゼ抱合を同体し、これ
は、プロプラノロールの不存在より存在下でよりくぼみ
に保持されるのでプロプラノロールの検出に用いられ
る。
実施例８ ジヒドロホレート・リダクターゼ（dihydrofolate redu
ctase）とメソトレキガート（methotrexate）とのコン
プレックスに対するモノクロナール抗体の製造と、その
抗体に基づくメソトレキサートの検定 ジヒドロホレート・リダクターゼ（DHFR）を、メソトレ
キサート親和性カラムを用いての親和クロマトグラフィ
ーで非常に純粋な形で得る。これからコンプレックスを
作り、メソトレキサートを、1mlのリン酸緩衝食塩水中
の150μgDHFRの溶液と、同じ容量の緩衝液中の50μｇメ
ソトレキサートとをゆっくり混合して作る。次いで、混
合物を、１のリン酸緩衝食塩水で４℃で４時間２回透
析し、次いで、マウスの免疫原として用いコンプレック
スに対するモノクロナール抗体（MabSEC）を作る。次
に、この生成物を、次のようにメソトレキサートの検出
を有用性を付す。
DHFRを、抵抗について実施例１に記載した方法に従いマ
イクロ滴定用プレートに結合させる。pH7.4の50mMトリ
ス緩衝食塩水中の標品液を、０から100ng/mlの範囲のメ
ソトレキサートを含有するように作る。これらの各々10
0μｌを被覆プレートの重複くぼみ中に入れ、次いで0.1
％牛血清アルブミンと50ngのMabSEC含有の50mMトリス液
100μｌを入れる。プレートを37℃で１時間低温放置
し、その後、溶液を、0.02％ツイーン20含有のpH7.4の5
0mMトリスで４回洗浄する。次に、pH7.4の50mMトリス中
に1000希釈でのアルカリホスファターゼ〔シグマ社（ロ
ンドン）、カタログ No.A0532〕でラベル化した抗マウ
スIgGの溶液200μｌを加え、さらに１時間室温で低温放
置する。溶液を振って除去し、プレートを上記のように
さらに４回洗浄し、くぼみに会合して残存するアルカリ
ホスファターゼを測定する。これらのMabSEC抗体は、メ
ソトレキサートの不存在下より存在下でアルカリホスフ
ァターゼよりくぼみに会合されるのでメソトレキサート
のアッセイを可能とすることが確認される。
実施例９ メソトレキサートの測定用二次モノクロナール抗体の製
造と選定 前記の実施例と同様に、ラベル化抗体が抗マウスIgGで
ある代りにアルカリホスファターゼ抗体マウスIgM〔シ
グマ社（ロンドン）、カタログ No.A7784〕を用いて行
われる。
実施例10 実施例５の別のやり方として、プロプラノールの一次モ
ノクロナール抗体のFabフラグメントを形成し、常法に
より精製し、完全分子（infact molecule）の代りに全
体を通じて用いた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｎ 8310−2Ｊ Ｇ 8310−2Ｊ 33/573 Ａ 8310−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 特開 昭59−99258（ＪＰ，Ａ) Ｊ，Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ，258（10）, 12582−12586（1983) Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｌｅｔｔ，１（３）, 165−172（1979)

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】1200より小さい分子量を有する分子（以
    下、小分子と称す）とその小分子に対する結合蛋白との
    複合体に対するモノクロナール抗体であり、小分子に対
    する抗体でもなく、小分子に対する結合蛋白に対する抗
    体でもないことを特徴とするモノクロナール抗体。
  2. 【請求項２】小分子とその小分子に対するモノクロナー
    ル抗体との複合体に対するモノクロナール抗体であり、
    小分子に対する抗体でもなく、その小分子に対するモノ
    クロナール抗体に対する抗体でもないことを特徴とする
    請求の範囲１項によるモノクロナール抗体。
  3. 【請求項３】小分子がステロイドホルモン又は医薬であ
    る請求の範囲１項によるモノクロナール抗体。
  4. 【請求項４】さらにシグナル発生手段でラベル化されて
    いることを特徴とする請求の範囲２〜３項の何れかによ
    るモノクロナール抗体。
  5. 【請求項５】シグナル発生手段がホスファターゼである
    請求の範囲４項によるモノクロナール抗体。
  6. 【請求項６】対の疑わしい源の成分に、対の他の成分及
    び対の複合体に対するモノクロナール抗体とを接触さ
    せ、測定すべき対の成分と対の他の成分とから形成され
    る対の複合体と該モノクロナール抗体との間の会合を測
    定することからなり、該測定すべき対の成分が1200より
    小さい分子量を有する分子（以下、小分子と称す）で、
    該モノクロナール抗体が、対の複合体に対する抗体であ
    り、対の疑わしい源の成分に対する抗体でもなく、対の
    他の成分に対する抗体でもないモノクロナール抗体であ
    ることを特徴とする、小分子とその結合蛋白対の成分の
    測定法。
  7. 【請求項７】測定すべき対の成分が小分子であり、かつ
    対の他の成分がその小分子のモノクロナール抗体である
    請求の範囲６項による方法。
  8. 【請求項８】モノクロナール抗体がシグナル発生手段で
    ラベル化されている請求の範囲７項による方法。
  9. 【請求項９】複合体が、ある1200より小さい分子量を有
    する分子とその結合蛋白から作られ、その複合体が、マ
    ウスハイブリドーマ技法でモノクロナール抗体を生ずる
    免疫原として用いられ、複合体に対するモノクロナール
    抗体を産生するが、小分子に対する抗体を産生せず、か
    つその小分子の結合蛋白に対する抗体を産生しないセル
    系を選定し、かつ所望によりその抗体をシグナル発生手
    段でラベル化することからなる、小分子とその小分子に
    対する結合蛋白との複合体に対するモノクロナール抗体
    であり、小分子に対する抗体でもなく、小分子に対する
    結合蛋白に対する抗体でもないことを特徴とするモノク
    ロナール抗体の産生法。
  10. 【請求項１０】1200より小さい分子量を有する分子とそ
    の小分子に対する結合蛋白との複合体に対するモノクロ
    ナール抗体であり、小分子に対する抗体でもなく、小分
    子に対する結合蛋白に対する抗体でもないことを特徴と
    するモノクロナール抗体からなる診断テスト用キット。
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GB848408193A GB8408193D0 (en) 1984-03-30 1984-03-30 Antibodies
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