JPH10505904A - 被検体を測定することにおける脂質層における分光光度的変化の直接的及び間接的変調 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 相互に結合するメンバーへの結合リガンド（被検体又は被検体擬似物）の結合を含む被検体を検出するための方法であって、重合層への前記結合リガンドの結合の結果としての色彩シフトが測定され；又は前記重合層の環境における変化から生ずる色彩シフトに対する前記結合リガンドの結合の効果が測定されることを特徴とする方法が提供する。ポリマーにおける光学的変化を誘発するための温度、pH、又は他のメカニズムにおける変化が色彩シフトを供する。前記重合層に結合したリガンドに結合した被検体の結合は、ポリマーの色彩特性における光学的変化を誘発することができる温度変化、pH変化、又は他のメカニズムから生ずる色彩シフトを変調することが示される。

Description

【発明の詳細な説明】 被検体を測定することにおける脂質層における分光光度的変化の直接的及び間接 的変調 導入 技術分野 本発明の分野は、重合した脂質層を用いる被検体の検出である。 背景 世界がより複雑になり種々の現象の理解が増えるにつれて、今日の使用におけ る広範囲の種々の物質を測定する方法を改良することが付随して必要となってい る。臨床実験室から、本分野における医者の診療所、家、ベッドサイド及び他の 場所において種々の物質を測定することができることへの関心が増加している。 天然及び合成の両方の生理学的に活性な物質の数が連続的に増加すると共に、治 療投与量をモニターするため、及び調査するため等のため、個体の健康状態を示 すものとして物質を測定することができることが要求されている。その物質は、 それらの活性の機能的範囲のための濃度において多大なオーダーの大きさにわた る範囲の広範囲のサンプルにおいて見い出され得、それらの存在を検出し得る容 易さに関して異なる。現在想定される実質的に商業的な重要性のみを有し、重要 性が増加するであを領域は、特定のヌクレオチド配列の検出である。ヌクレオチ ド配列は、遺伝的カウンセリング、法医学及び病気の検出等において適用が見い 出される。それゆえ、広範囲の目的のために、異なるセンシティブイティーで異 なるソースからの異なる物質を測定する機会の多様性がある。 検出するための方法は、放射線標識、光吸収、蛍光、化学発光、凝集等から広 範囲にわたる。これらの方法の各々は適用が見い出され、代わりの方法に対して 不利な点及び利点を有する。全ての状態において適用可能であることが判明して いる単一の方法はまだない。それゆえ、そのプロトコル、装置、又は試薬が他の 技術に優る利点を供し得る関心の化合物を測定することにおいて重大な機会を供 し得る新しい方法を案出することに実質的な関心がある。 関連文献 米国特許第 4,489,133号は、界面活性剤に結合した規則正しく並んだ蛋白質分 子に関する方法及び組成物を記載する。J.Am.Chem.Soc.（1988）110 : 7571〜75 92は、多層薄層重合フィルムを形成するための方法を記載する。Lieser et al. （1979）17 : 1631〜1644は、種々の長鎖ジアセチレン−炭酸の調製、広がる性 質、多層形成、及び重合現象を記載する。Bhattachargee et al.，J.Chem.Phys ．(1980)73 : 1478〜1480は、ポリジアセチレンの吸収及び蛍光スペクトルに対 するpH及び被検体の効果を報告する。Chance et al.，J.Chem Phys.（1979）71 : 206〜211 は、ポリジアセチレンフィルムの光学的特性への温度増加の効果を 報告する。Olmsted et al.，J.Phys.Chem（1983）87 : 4790〜4792は、フィルム の温度を上昇させることによるポリジアセチレンフィルムの青からピンクへの遷 移を記載する。Fouassier et al.，Israel J．of Chem.（1979）18 : 227〜232 は多層ポリジアセチレンの重合の光化学を記載する。Kanetake et al J.Phys.So c．of Japan（1985）54 : 4014〜4026，Day et al．Israel J．of Chem（1979） 18 : 325〜329，Mino et al.，Langmuir(1992)8 : 594〜598、及びMino et al. ，Langmuir(1991)7 : 2336〜2341はポリジアセチレンフィルムの色遷移を記載す る。 キャスト層又はリポソームとしての重合可能脂質層を調製するための方法は、 Kuo and O'Brien，J.Am.Chem.Soc.，1988 110，7571 ; Kuo and O'Brien，J.Che m.Soc.Chem.Commun ． ，1990，839-841; Kuo and O'Brien, Macromolecules，19 90，23，3225-3230 ; Kuo and O'Brien, Langmuir，1991，7，584-589 ; and R hodes et al.，Langmuir，1994，10，267-275 に見い出され得る。 Preziosi et al.,“Water Soluble Polydiacetylenes : Synthes is and Prop erties,”Polymer Preprints.Amer.Chem.Soc.（1980）166-168．Bhattacharjee et al.,“Visual Conformational Transitions of Water Soluble Polydiacetyl enes : Effects of pH and Electrolyte on Absorption and Fluorescence Spec tra,” J.Chem.Phys.（1980）73。 原子力顕微鏡はMarti et al.,“Atomic Force Microscopy of an Organic Mon olayer,”Science（1988）293 : 50-52 に記載される。 発明の概要 その条件における変化に関する分光光度的又は光学的変化、例えば色彩のシフ トをうけることができる重合層又は材料を用いて被検体の存在を測定するための 方法及び組成物であって、このような変化の少くとも１つの要素が、前記重合層 に関連し得るか又は結合に関して前記重合層の環境における変化を作ることがで きる化合物の一部である特異的結合要素への被検体又は被検体擬似物の特異的結 合であり、結果として色彩シフトを生ずるであろうことを特徴とする方法及び組 成物を提供する。測定される色彩のシフトは：前記重合層への前記結合リガンド の結合により引きおこされる前記重合層 の分光光度的特性における変化：前記結合リガンドの結合に関して前記重合層の 環境における変化を作る化合物への前記結合リガンドの結合；又は前記重合層の 環境における変化又は誘発する間の光学的変化の逆転の結果として増強又は遅延 された光学的変化の誘発への前記重合層への前記結合リガンドの結合の結果から 生じ得る。種々の薬剤が分光光度のシフトの誘発を誘導するのに用いられ得る。 対照値とサンプルで得られた結果を比較することにより、被検体の存在が検出さ れ得る。 図面の簡単な記載 図１は、エチルモルホリン PDAフィルムの色シフトへのストレプトアビジン結 合の結果を研究するのに用いられる４つのパラメーターについてのデータを供す る。 図２は、５％ビオチン／１，２−プロパンジオールペンタコサジイノイックエ ステルフィルムの色シフトへのストレプトアビジン結合の効果を研究するのに用 いられる４つのパラメーターについてのデータを供する。 特定の実施形態の記載 サンプル中の被検体の存在を検出するための方法及び組成物を提供する。本方 法は、被検体又は被検体擬似物（“結合リガンド”）と重合したジアセチレン（ ダイイン(dyine)材料又はポリマー）酸との間の結合に応じた吸収され又は蛍光 が発された光における色彩又は分光光度のシフトの検出を用いる。ここで、重合 層のスペクトル（吸収又は蛍光）は：重合層への結合リガンドの結合により引き おこされる重合層の分光光度特性の変化；応答する層の能力の変化を生ずる結合 リガンドの結合に関連した重合層の環境の変化を形成 する化合物への結合リガンドの結合；重合した脂質の環境の変化又は誘発する間 の光学的変化の反転の結果としての増強又は遅延された光学変化の誘発に対する 重合層への結合リガンドの結合の効果；の結果として変化する。 重合層は、不溶性材料、例えばラテール(later)、又は可溶性材料もしくは水 性溶媒中のコロイド状態であり得る。本適用に用いる場合、脂質という言葉は少 くとも６炭素原子長の炭化水素鎖を有するモノマーをいう。本発明の脂質は、１ 以上のジアセチレン基、並びに例えば極性親油性モノマーもしくは２つの極性ヘ ッド基のいずれか一を含み得る。ここで２つの極性ヘッド基を含むモノマーは結 合性脂肪族基、例えばデュアル・ヘッドの末端に対して近位にある。しかしなが ら、いずれの状況も本発明に従う分析を行うのに用いられ得る。脂質層として言 及されるコロイド状重合脂質は、広範囲の種々の方法で調製され得、ここで脂質 組成物は、関連する脂質の性質及び脂質に結合した成分等に関して同種又は異種 であり得る。同様に、可溶性ポリマー鎖は２つの極性ヘッド基を含むモノマーを 用いて行われ得る。これらの組成物は可溶性ポリマー脂質として言及される。脂 質層のために、層は単層又は多重層フィルムであり得る。更に、それはリポソー ムを形成し得、ここでリボソームは集塊又は凝集構造を有する重合層により画成 される中にも存在し、その後リポソームは適切な支持体上に被覆されるか、又は 固体支持体の必要性がないように溶液中に保持され得る。 重合層が調製される様式は広範囲で種々であり得るが、他に優るいくつかの手 順が好ましい。更に脂質の組成物は広範囲で種々であり得、ここで再び他に優る モノマーが調製され得る。 本方法に用いられる重合フィルムは、ほとんどが慣用的技術を用いて、そして 要求される質の層に達する特定の条件を用いて先の脂 質モノマーから調製され得る。慣用的な Langmuir-Blodgett技術が用いられ得る 。可溶性相重合及び次の可溶化が用いられ得る。押出しのようなベシクルを作る ための方法が用いられ得る。生成物の性質に影響を与えるために用いられ得る多 数のパラメーターが利用できる。これらのパラメーターは、それらの全てが単層 又は多重層の形成に影響を与えるであろう界面活性剤及び溶媒の濃度、溶媒の性 質、広げる方法、用いられる界面活性剤の量、サブ相組成、超相組成を含む鎖の 長さ、重合可能機能性、極性ヘッド基の性質、界面活性剤が形成される様式のよ うな考慮を含む重合可能界面活性剤と非重合可能界面活性剤との両方に関する界 面活性剤のpH、イオン強度、用いられるカチオン、例えば一又は二価を含む緩衝 タイプを含む。更に、フィルム応力、結晶化時間、温度、湿度、横断比のような 物理的パラメーターが重合フィルムの性質に影響を与えるだろう。 本方法に用いられる重合層を作るためのモノマーは、層内に詰めた後、いずれ かの便利な手段、例えば紫外線を用いて重合される。重合時間はフィルムのよう な層のアッセイ応答性を調節するために重要である。長い重合時間（10分）はよ り応答性の少い層を導き得る。20秒〜５分間の間の重合時間は放射線強度により より応答性の高い層を導き得る。典型的には、１秒〜30秒間の範囲の時間が最も 優れた応答を供する。他方、重合の程度は、直ちに測定可能である光学密度の変 化を供し、正確な測定を許容するのに十分でなければならない。UV光源の距離は 、重合層の形成の因子でもあり得る。距離は典型的には１〜４インチ、通常１〜 ３インチの範囲である。表面へのUV光の影響は、１ｍジュール／cm²〜100ｍジュ ール／cm²、通常30ｍジュール／cm²の範囲であろう。 不活性ガス又はフリーラジカルインシェーターの存在を含む他のパラメーター は重合比及び材料応答性を調節するのに用いられ得る 。他の開始システムは光及び光センシティブイニシエーター又は熱不安定化学イ ニシエーター等の組合せを含む。このようなイニシエーターは慣用的であり、本 明細書に記載する必要はない。少くとも実質的に完全な重合が達成されるまで活 性化が維持される。重合は、電子ビーム、Ｘ線ソース、及びシンクロトロン放射 等を用いることによっても行われ得る。 重合は、遊離酸素の欠如下で行われるべきである。従って、フィルムは、サブ 相内に入れられた不活性ガスの存在下、又は遊離酸素が存在しないいずれかの他 の環境下で重合され得る。 その後、重合した層又は材料は、次の吸収された又は発せられた光の視覚化の ためのいずれかの便利な支持体に移され得る。層は溶液内に残り、流体支持体上 におかれ、又は多孔質膜もしくはテープに移され得る。層がより剛性の少い支持 体に移される場合、被検体結合の結果として吸収又は放射された光の量に関して より優れたフレキシビリティーが達成され得る。特に、重合したグループが剛性 支持体上でなされるより大きい程度のフレキシビリティーを有し、これにより吸 収又は放射された光の可逆的シフトが可能となる。層をより剛性の高い支持体に 移すことはフィルムのフレキシビリティーを制限し、これにより色のシフトを可 逆的にし得る。しかしながら、フィルムを多孔質表面に移すことは、層を通して サンプルを吸引し、これにより被検体をフィルム表面上に濃縮するのに用いられ 得る。これは、フィルム表面上のリガンドへの被検体の結合を増強し得る。 種々の利用できる支持体への層の移動は、いずれかの慣用的な手段、特に Lan gmuir-Blodgett技術〔George L.Gaines Jr．：Insoluble Monolayers at Liquid Gas Interfaces，Interscience Publisher，I.Prigogine Editor，John Wiley and Sons（1964）〕を用い て行われ得る。重合材料は、重合の前に支持体に移され、支持体上で重合され得 る。適切な支持体へ重合材料を移した後、その重合材料は被検体の存在を検出す るのに用いる用意がされる。 種々の重合した液体組成物が用いられ得るが、適切には１つの特定の形態が他 と比較して利点を有し得る。重合液体の特定の形態を選択することにおいて、製 造の経済性、再生産性、サンプルの性質、アッセイにおける応答性、輸送に対す る安定性を含めて考慮されよう。 重合層は、新しい温度勾配技術が用いられる89年６月15日に出願された米国出 願通し番号 366,651号及び89年12月20日に出願された 453,784号に記載される方 法を用いて形成され得る。界面活性剤フィルムは、脂質単層、蒸気析出、キャス ト、キャストリポソーマル、スピン又はゲル相のための標準的技術により水性サ ブ相の表面上に形成され得る。有機溶媒中に溶解されたモノマーの界面活性剤組 成物を含む溶液がマイクロシリンジによりサブ相表面に適用される。溶媒はペン タン、ヘキサン、ヘプタン及びデカンのような炭化水素を含み得る。炭化水素は 直鎖、分枝、環式、又は不飽和のものであり得る。溶媒はモノ−、ジ−、トリ− 又はテトラクロロエタンのようなクロロ炭素を含み得る。アルコール、フラン、 エーテル、又はエステル等のようなより極性の強い溶媒の添加は界面活性剤組成 物の可溶性を増強し得る。 サブ相組成物は、形成された界面活性剤層の物理的特徴を示す１つの方法で種 々である。サブ相は、純水、グリセリン、ポリエチレングリコール、又は DMF， DMSO、アセトン、アルコール、ケトン、フラン、ジオキサン、エタノールアミン 、フェノールを含む水と混合できる他の極性有機溶媒、又は分散した炭素粉体を 含むコロイド状物質単独、又はそれらの組合せ等からなり得る。グリセリンのよ うな高沸点溶媒は、加熱の間の蒸発を削減し、他方低沸点溶媒は蒸発を促進する だろう。界面活性剤フィルムを安定化するために他の有機溶媒が用いられ得る。 特に好ましくは極性ヘッド基、リンカー及び界面活性剤のリガンドである。サブ 相はイオン相互作用を通して界面活性剤に影響を与える、即ち電荷を安定化する 有機又は無機酸又は塩基も含み得る。イオン性構成物は一又は多価イオン及びカ チオン、並びにモノ−及びオリゴサッカリドを含み得る。 モノマーの重合可能界面活性剤は広げる溶媒中0.01〜50.0mMの範囲の濃度でサ ブ相上に広げられる。典型的には、0.1〜5.0mM が最も有用である。フィルムは 、重合可能界面活性剤の均一溶液から形成され得るか、又は重合可能界面活性剤 と重合可能基を有さない充填界面活性剤との混合物で形成され得るかのいずれか である。界面活性剤は、界面活性剤の極性ヘッド基に結合したリガンドを有し得 るか又は有し得ない。充填界面活性剤は、生物学的物質の非特異的接着を防ぐよ うに作用するヒドロキシ、ポリヒドロキシ又はポリエチレンオキシドヘッド基を 有し得る。リガンドが界面活性剤に結合する時、充填界面活性剤へのリガンド界 面活性剤の組込みモル比は特定のアッセイにより種々であり、一般的に0.01〜10 0 ％、更に通常は 0.1〜10％、通常約 1.0〜５％の範囲であろう。立体的置換は 蛋白質結合を増強し得、立体的障害は蛋白質結合を阻害し得るだろう。充填脂質 の極性ヘッド基の組成は、これにより、アッセイにおける応答性を含む結合アフ ィニティー及び相互作用を調整するための制御メカニズムを供し得る。 単層フィルム形成は、サブ相を表面又はウエルに適用することを含む。モノマ ーの界面活性剤を含む溶液は、その表面が実質的に飽和されるまで予め洗浄され た（吸引された）サブ相表面に適用される。水性媒体は界面活性剤を溶かして分 散させるために、広げる溶 媒の蒸発を引きおこす通常約 130℃未満、更に通常には約 110℃未満の温度に予 め加熱される。その後、媒体は室温未満、通常約７℃に冷却される。高度に結晶 性のフィルムを作るための重要な過程である冷却の比率は、加熱要素から冷却要 素へのサブ相移動の横断比率を調節することにより調節される。典型的な横断比 率は0.06cm／分〜1.0cm／分、通常 0.3cm／分で種々である。多重層フィルムは 、同じ支持表面への多層フィルム移動によるか、多重層が自然に形成されるよう にフィルム組成物を改良することにより形成され得る。 キャストフィルム又はリポソームは、先に記載された Kuo及び O'Brienの引用 に記載される手順に従って調製され得る。キャストフィルム又はリポソームを供 することにおける最初の段階は、脂質の水性分散物を調製することである。ここ で、その媒体は約 0.1〜５、更に通常は約 0.5〜２mMの脂質、緩衝液、例えばTr is，PBS，HEPES等及び有機、多価イオン、グリセリン等のような他の添加物を含 むだろう。その後、水性脂質分散物は一般的に約20〜60℃の範囲の温度で、通常 約５秒超、約30秒以下の時間、慣用的方法に従って音波処理される。個々のベシ クルを供するために、その後水懸濁液は少くとも50％が完了、好ましくは少くと も約75％が完了するまで重合過程に十分な時間、実質的に酸素の欠如下UV光が照 射され得る。重合過程は分光光度でモニターされ得る。リポソームの大きさの均 一化のため、リポソームはHope et al.，Biochimica Et.Biophysica Acta（1985 ）812 : 55〜65に記載されるように押出され得る。大部分は、そのリポソームは 直径約 100nm〜数ミクロンの範囲の大きさのものであろう。 キャストウイルスが要求されるなら、未重合の又は重合したベシクルは適切な 支持体、例えばガラス、ニトロセルロース、膜、ナイ ロン膜、紙又は他の多孔質材料上に広げられ得、実質的に完全に水を除去するよ う乾燥される。未重合であれば、そのフィルムはその後照射され、次に先に示さ れる要求される重合度に重合過程が行われる。 水溶性ポリマーのために、モノ−又は二酸ジアセチレン酸化合物が用いられ得 、特にカルボキシル基が普通に末端位置にある二カルボン酸が用いられ得る。カ ルボン酸はオキシ、アミノ、カルボキシ、亜リン酸、硫酸のような無機酸基等の ような広範囲の種々の親水基、特に非電荷性又は電荷性親水基で修飾され得る。 種々の多価アルコール、ポリエーテル、ポリアミン、ポリ酸、又はそれらの組合 せが用いられ得る。カルボキシル基は非官能化又は官能化され得、通常カルボキ シル基の少くとも約50％の数が鎖の長さ、ポリマーへ結合した結合基の性質、及 びアッセイが行われる媒体の性質により官能化される。可溶性ポリマーのために 、典型的には、ジアセチレン酸モノマーは有機溶媒から結晶化される。その後、 その結晶性モノマーは、UV又はＸ線照射を用いてバルク内に重合される。その後 、重合した材料は水性又は有機媒体中に溶かされ、重合していないモノマーが抽 出され、その後アッセイのために重合材料が処理される。超音波処理、界面活性 剤及び他の乳化剤が可溶性を増加するために用いられ得る。それらが形成された 後に可溶性ポリマーを官能化するために標準的生化学的方法が用いられ得る。そ の後、官能基は種々のリガンドを結合し、又は構成物を結合するために用いられ 得る。 界面活性剤又は脂質分子は単一の脂質鎖、例えばジイノイック酸（diynoic ac id）又は複数の脂質鎖、例えばジエステルグリセリド、トリエステルグリセリド ；モノ−又はポリカルボン酸のモノ−又はポリエステル、例えばＮ−アシルビス （ドコサ−10，12−ジイニ ル）Ｌ−グルタメート；又はコサ−８，10−ダイイン−１，20−ジオイック酸等 を有し得る。 種々の他の界面活性剤は、重合可能界面活性剤の希釈剤として存在し得る。こ れらの界面活性剤は、天然、合成、又はそれらの組合せであり得、ラウリン酸、 ステアリン酸、アラキドン酸、コレステロール、胆汁酸、ガングリオシド、スフ ィンゴミエリン、又はセレブロシド等により示され得る。 の光学的特性を供するために材料内に存在し得る。活性化モノイン、例えばα− ケトモノインのような他のポリ不飽和分子が用いられ得るが、ほとんどの場合、 官能基はダイインを含むだろう。 ほとんどの場合、重合可能モノマーの疎水性部分は、少くとも６の脂肪族炭素 原子、通常少くとも８の炭素原子の直鎖、そして一般的に全部で約 100炭素原子 以下、通常約34炭素原子以下の鎖を有するだろう。好ましくは、炭素原子の数は 約６〜32、更に通常10〜30、更に好ましくは12〜29の炭素原子の間で種々であろ う。 そのモノマーは、親水性成分、カチオン性、アニオン性又は中性（非イオン性 ）で終わるだろう。ここでその官能性は、非オキソカルボニル、例えばカルボン 酸、エステル及びアミド、アルデヒド又はケトンのようなオキソカルボニル、エ ーテル、ポリエーテル及びヒドロキシのようなオキシ、第１、第２、及び第３ア ミン及びアンモニウムのようなアミン、ホスフェート、ホスホネート、及びホス ホンアミドのようなリン酸エステル及びアミド、チオール、スルホネート、スル フェート、及びスルホンアミドのような硫黄官能基等を含み得る。親水性基は薬 物、ペプチド、リガンド、レセプター、電荷転移複合体、又は発色団を含み得る 。通常、重合可能官能性は、少くとも１の炭素原子、一般に約１〜50の炭素原子 、更に通常約 １〜８の炭素原子により極性及び非極性末端から分離されるだろう。重合可能な 基は、界面活性剤フィルムの疎水性内部内に典型的に組み込まれる。重合可能基 は、典型的にはジアセチレン成分であるが、他の光学的ポリマーも用いられ得る 。個々の重合可能基は０〜50炭素原子離れて、典型的には０〜10炭素原子離れて 規則正しい間隔で配され、最も好ましくは結合によりつながれ得る。その長さが 許容するだけ多くのこれらの基が鎖内に存在し得る。ヘッド基のバリエーション は、フィルムの安定性、表面電荷、ヘッド基間水素結合の調節、非特異的結合も しくは流体マトリックス効果の削減、並びに化学修飾の容易さのようなフィルム 特性におけるバリエーションを提供する。単一又は多重の重合可能疎水性鎖は脂 質単位当りに存在し得る。重合可能基は２つの極性ヘッド基の間にも組み込まれ 得る。これらのモノマーは、バルク結晶において重合され得、次に可溶性ポリマ ーストランド内に可溶化される。それらの可溶性は、ヘッド基の極性により示さ れる。界面活性剤の炭化水素尾は、その界面活性剤が二極性であるように親水基 内で終わり得る(Sher，Justus Liebigs Ann.Chem.（1954）589 : 234 ; 及びAki moto et al. Angen.Chem.（1981）20（1）: 91)。 リガンド又は結合分子は、特定の結合対メンバー複合体形成を供し、ここで複 合体形成の量はアッセイ媒体中の被検体の量に関連する。リガンド又は結合分子 は、脂質材料に会合し得、脂質材料に、又は脂質材料に物理的に会合した高分子 に直接的又は間接的に共有結合し得、又はその活性が複合体形成の結果として調 節されるもの、例えばその活性が複合体形成により変化する酵素接合体であり得 る。それゆえリガンド又は結合分子は、脂質材料がマクロ還境における直接的結 合及び変化のような広範囲の出来事のためのセンシティブなディテクターである ので、多くの形態をとることができる。 結合分子を含む複合体は、被検体、被検体擬似物又はその効果的な濃縮が被検体 の量と共に種々である分子、例えば被検体に対する抗体を含み得る。 被検体検出に用いられるリガンド及び結合分子は独立した高分子に、又は界面 活性剤に結合し得、ここでその能力は、重合材料の性質によるだろう。その材料 において、その能力は、蛋白質、ペプチド、糖、又は他のリガンドのような独立 した高分子のためであろう。リガンドに関しては、他の分子に特異的に結合する いずれかの分子が意図される。高分子は、少くとも約 0.2kD、通常50kD以上であ り、フィルムのための支持体に共有結合又は非共有結合し、又は重合材料に直接 結合し得る。高分子は、重合材料が支持体に適用される前又は後に支持体に適用 され得る。リガンドは、重合材料に化学的に結合し、酵素的に結合し、又は吸着 し得る。リガンドの密度は表面領域の0.01％〜100％の範囲であろう。リガンド が層に結合するなら、層に結合したリガンドの要求される密度、リガンドサイズ 及びリガンドの物理的／化学的特性により、リガンドは、界面活性剤の約0.01〜 100mol％、更に通常少くとも約0.1mol％、好ましくは少くとも約１ mol％、一般 に約 10mol％以下で存在し得る。モル比は、リガンドのサイズ及び性質、及び層 内に含まれるリガンドが要求されるか否か等によるであろう。リガンドは、エス テル、例えばカルボキシレート及びホスフェート、エーテル、オキシもしくはチ オのいずれか、アンモニウムを含むアミノ、ヒドラジン、ポリエチレンオキシド 、カルボキシアミド、スルホンアミドもしくはホスホルアミド、炭素もしくはポ リ炭素、又はその組合せ等を含むいずれかの慣用的官能基により結合され得る。 特定の基は、アミノサッカリド、カルボキシサッカリド、還元サッカリドを含む モノ及びポリサッカリドの両方のサッカリド、ペプチド、ポリペプチド、ヌクレ オチド、又はオリゴヌクレオチド等を含み得る。特定の基は双性イオン、例えば ベタイン、ペプチド、グルコースのような糖、グルコン酸、β−ガラクトサミン 、シアル酸等、ホスファチジルグリセロールのようなホスファチジルエステル、 セリン、イノシトール等を含む。 リガンド又は結合分子は、通常反応基を含む小さな分子であるいずれかの分子 であり得る。典型的なリガンドは、ビオチン、アルカロイドのような薬剤、発色 団、抗原、キレート化化合物、クラウンエーテル、分子認識複合体、ポリサッカ リド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、イオン性基、重合可能基、蛍光消光基 、リンカー基、電子供与体又は受容体基、疎水基又は親水基であり得る。リガン ドは、新しい物理的特性又はフィルムの特徴について更に化学的に修飾され得る 部位としても働く。 界面活性剤に共有結合したリガンド又は結合分子は、通常特定の結合対のメン バーであろう。これにより、リガンドは、広く種々であり得、通常約２kD未満、 更に通常は約 0.5kD未満の分子であり得る。ほとんどの場合、リガンドは、オリ ゴペプチド、オリゴヌクレオチド、サッカリド又はオリゴサッカリド等を含む小 さな有機分子を含み得るレセプター又はハプテン様であると考えられよう。しか しながら、いくつかの状態において、界面活性剤に結合したリガンドは、通常約 500kD以下、更に通常約 200kD以下の高分子であり得る。これにより蛋白質、核 酸、又は高分子量の他の重合もしくは非重合化合物も用いられ得る。特定のイオ ンに結合するであろうクラウンエーテルを用いることも可能である。１以上の界 面活性剤がリガンドに結合され得る特定の方法は本発明に重要でなく、ほとんど の場合、便利さ、合成の容易さ、安定性及び利用できる官能基、等によるだろう 。合成マクロ環式化合物は、種々の天然及び非天然化 合物の分子認識の目的のために界面活性剤層内に組み込まれ得る。 多くの場合、種々の目的のために特定の成分が用いられるだろう。例えば、ビ オチンはアビジン又はストレプトアビジンに結合するのに用いられ得、その相補 的メンバーは広範囲の他の分子に結合するのに用いられ得る。種々のレクチンは 、関心の分子に付着し得る種々の糖に結合するのに用いられ得る。表面膜レセプ ター又は可溶性レセプター等の相補的レセプターに結合する特定のリガンドが用 いられ得る。 特に関心のものは、界面活性剤への直接的又は間接的のいずれかでのレセプタ ーの結合である。直接的結合は通常共有結合であろうが、間接的結合は通常、非 特異的又は特異的吸収のような非共有結合であろう。特に関心のレセプターは、 モノクローナル又はポリクローナルのいずれかであり得るIgA，IgD，IgE，IgG及 び IgMを含む抗体であろう。抗体完全なもの、それらのスルフヒドリルブリッジ で全体的又は部分的に切断され、F(ab′)₂又は Fab等に断片化されたものであり 得る。完全な及び全体的に切断された抗体は、アッセイに組み込むために組換え 蛋白質Ａ抗体ハイブリッドを作るために用いられ得る。抗体のオリゴサッカリド 成分を通してのヒドラジンへの結合は、完全な、部分的な、そして全体的に切断 された抗体で達成される。マレイミド結合は、完全な、部分的な、そして全体的 に切断された抗体、並びにF(ab′)₂フラグメントのために用いられ得、Fabフラ グメントは抗体ハイブリッド内に組み込まれ得る。ポリマーフィルムに結合する 抗体の他の例は、組換ハイブリッドリンカー蛋白質及び組換え抗体分子の使用を 含むだろう。抗体は、更なる結合のための結合部位の利用性を確かにするために Fc蛋白質において官能化され得る。他のレセプターは、ウイルスレセプター、表 面膜蛋白質レセプター、血液蛋白質レセプター等のような天然のレ セプターを含む。 被検体検出のための重合材料を用いることにおいて、サンプルを含む被検体は 、いずれかの慣用的手段を用いて重合した層に接触され得る。サンプルを含む被 検体は細胞の除去、ろ過、希釈、濃縮、抗原を遊離させるための界面活性剤破壊 、又は遠心等のような先の処理が行われ得る又は行われ得ない。 サンプル中の被検体が水性環境内に維持される場合、次の手順が役立つことが 見い出され、例として処理され得る。水性媒体が形成され、これは通常約４〜９ 、好ましくは５〜９の範囲のpHで緩衝される。塩濃度は一般的には約10mM〜１Ｍ の範囲であろう。典型的な緩衝液はリン酸、ホウ酸、バルビトロン、炭酸、Tris ，MOPS，MES等を含む。典型的な緩衝液組成は、リン酸緩衝塩類溶液；138mM NaC l、50mMリン酸カリウム、pH 7.2； 200mMホウ酸ナトリウム、pH 8.2等を含む。 多価イオンの使用がしばしば要求される。多価カチオンの濃度は、約 0.1〜200m M、更に通常約10〜100mM の範囲である程度までカチオンの性質により、全部の 塩濃度の決定に含まれるだろう。 界面活性剤の添加は、特に試薬が蛋白質である場合にフィルムに結合するため の試薬の非特異的結合を削減するために重大である。界面活性剤の量は一般に 0 .001％〜10％、更に通常約0.01％〜２％の範囲で蛋白質の性質によるだろう。フ ィルムの結合メンバーの非特異的吸着が要求される場合、界面活性剤は除外され 得る。約10〜140mM NaCl、４〜40mMトリスpH 6.5〜7.5、並びにいずれかの更な る適切な結合もしくは他の試薬及びレセプターを含む水性緩衝液中にポリマー表 面を浸漬した後、その反応混合物は反応の完了のために十分な時間、放置され、 次に洗浄される。 サンプルは、層を覆うリザーバー緩衝液内への直接の注入により 、層を覆う浅いフローセルを通した毛管作用により、フローセルを通した流体ポ ンピングにより、又は層を覆う湿った表面上への気相吸着及び拡散等により重合 層に接着され得る。極めて低濃度の被検体、例えば約10^-12Ｍ未満のものを検出 するために、それが表面上で特異的に結合するメンバーを濃縮するようにフィル ム表面上を大量のサンプルが通過することを許容するため、フローセル法及び多 孔質膜法が好ましい。より高い濃度においては、その拡散比率が低くなるのでリ ザーバー装置構成が役立つ。 結合は、結合、即ち層の吸収又は放射された光の変化と関連する限り重合層に 直接又はそれから遠位であり得る。これにより、色彩シグナルの変化は、脂質材 料への特異的結合メンバーの結合の効果、還境変化のための色彩シグナルにおけ る変化の脂質材料への特異的結合メンバーの特異的結合の効果、又はその結合の 結果が環境における環境的変化を形成するものへの特異的結合メンバーの結合の 効果の結果としてである。環境における環境変化は、通常、例えばアッセイ媒体 、又は照射光等のマクロ環境の変化である。各々の状況において、特異的結合メ ンバーの異なる対が含まれ、ここで特異的結合対複合体の形成がものの特徴の変 調を引きおこし、特異的結合対複合体形成の欠如下での色彩シフトから異なる色 彩シフトを生ずる。アッセイは、脂質材料へ又は異なる材料への結合リガンド（ 被検体又は被検体擬似物）の結合を含み得、これにより脂質材料の環境における 変化の変調を生じ、これにより被検体の存在又は欠如下での色彩シフトの差異が 生ずる。結合リガンドは、色彩シフトにおける差を供する出来事として脂質材料 への結合を供し、色彩シフトにおける差を供する出来事として脂質材料への異な るものの結合を阻害もしくは供し、色彩シフトにおける差を供する出来事として 脂質材料の環境における変化を変調するために脂質材料以外のもの に結合する等し得る。それゆえ、大きな要因は、目的のシステムが、直接又は間 接的に被検体の存在及び欠如下での色彩シフトの差を生ずるアッセイ媒体におけ る被検体の量に関連する出来事に関連する吸収又は蛍光における色彩シフトを許 容することである。 その結合が共有又は非共有であり得る多数の結合対が用いられ得る。酵素、レ クチン、毒素、可溶性レセプター、及び抗体等のような相補的リガンドに特異的 に結合する種々の蛋白質が用いられ得る。典型的な蛋白質は、DHFR、ストレプト アビジン、アビジン、コレラ毒素、レクチン、c-H-rasオンコジーン産物、酵素 、抗体及びヌクレアーゼを含む。オリゴサッカリドとの結合のために、ヒドラジ ンはそれ自体又はポリマー、例えばポリ（アクリルヒドラジン）と結合すること により用いられ得る。あるいは、ビオチン、ヌクレオチド、又は他の分子認識ア ナログが用いられ得る。ssDNA又は RNAのような核酸が用いられ得る。マレイミ ド結合は、ビオチン、アビジン、いずれかのリガンドもしくは結合蛋白質、スル フヒドリル含有ポリマー、核酸、又は分子認識アナログであり得るチオール含有 分子への結合のために用いられ得る。例えば、官能的オリゴサッカリド成分を有 する完全な抗体は過ヨウ素酸で切断され、結果として生ずるアルデヒドが還元条 件下でヒドラジンと反応して安定した炭素−窒素結合を形成する。マレイミドと 反応するためにスルフヒドリル基を供するために、抗体はそのヒンジ領域で還元 され、特にヒンジ領域で部分的に切断されるか、又は活性化オレフィンとチオエ ーテルを形成するためにヒンジ領域近くで蛋白質分解的に切断され得る。各々の 場合、特異的結合対の相補的メンバーに結合するために要求される部位が結合の ために利用できることを確かにするために結合の方法を選択することに注意が払 われよう。あるいは、スルフヒドリル界面活性剤は抗体分子上のスルフヒドリル 基に付着され 得る。 分子が重合材料に付着した相補的リガンドに結合する場合、その結合は材料の 吸収又は放射変化を誘導又は変調し得る。更に、種々の試薬又は方法が結合のよ うな材料における光学的変化を増強するために用いられ得る。例えば、ポリジア セチレンフィルム又は材料の光学的特性は、pH、温度、機械的応力（例えば原子 力法）、種々の溶媒、イオン強度、界面活性剤、ポリマーが応答し得る特定の波 長を用いる光学的誘導又は無機媒体等のため変化し得る。 結合は、重合層に対して遠位でもあり得、なお層により検出可能であり得る。 結合は、重合層の周囲溶液内でおこり得、層の環境における変化、例えばpHの変 化を生ずる。ヒドロラーゼ、例えばホスファターゼ、グリコシダーゼ又はエステ ラーゼを用いることにより、pHの変化を生ずる生成物が生成され得る。重合した フィルムにより吸収又は放射された光は、フィルムの周囲条件の酸性度の変化に 応じてシフトすることが見い出されている。例えば、重合したフィルムの非蛍光 の青色形態により吸収された光は酸性度の変化に応じて蛍光赤色形態にシフトす ることが見い出されている。この発見を用いて、結合リガンドは、酵素に結合し た結合リガンドとレセプターについて競合し得、ここでその酵素接合体は、基質 を培地のpHを増加させる組成物に酵素的に転化する酵素を含む。このようなアッ セイ技術は米国特許第 3,817,837号に記載される。pHを増加させ得る基はフェノ ール、エステル、カルボキシレート及びホスフェートを含むが、硝酸塩又は硫酸 塩を含まない。この方法は、ヌクレオチドがそれらに付着したこのような基を有 し、基質として作用し得る場合、ヌクレオチドの検出のためにも用いられ得る。 その結合は遠位でもあり得、被検体が重合層に関連した抗体に後に結合する結合 分子に結合する重合した脂質層の吸収又は放射した光のシフトに影 響を与え得る。 結合が色彩変化の主要部を供するようにするかわりに、結合により変調される 主要な変化を導く試薬を供し得る。例えば、溶媒、pH、イオン強度、機械的応力 （例えば摩擦、原子力顕微鏡又は他の機械的摂動）における変化、又は重合した 脂質の還境における他の変化は重合した脂質の色彩の特徴の実質的修飾を供し得 る。環境の変化の効果は、環境における変化と共同した結合が重合した脂質に結 合することから生ずるより大きい反応をおこし得るように結合により変調され得 る。この様に、結合のため色彩変化に耐性があるが環境の変化に特異的に応答す る高度に安定した層を用いることができる。この場合において、結合は環境の変 化のためポリマーの光学的反応性を遅らせるのに用いられ得る。 温度と共に、加熱プロトコル又は加熱と冷却との組合せを有し得る。加熱プロ トコルの場合、90℃以下、通常約60℃以下、好ましくは約30〜50℃にわたって温 度プロファイルを得ることができる。加熱の比率は通常、分当り約 0.5〜50℃、 更に通常は分当り約１〜10℃であろう。読みとりは、１℃毎から10℃毎、便利に は５℃間隔のいずれでもあり得る。データ、関連する温度範囲及び加熱の比率の ために利用できる論理により平均温度、遷移の勾配、又は他の特徴のような温度 プロファイルに関連した種々のパラメーターを測定し得る。あるいは、もとの色 彩条件から最終的色彩条件への実質的な変化を供するように、通常最大変化の少 くとも約60％変化、好ましくは最大変化の少くとも約80％の変化を供するように 溶液を加熱し得る。 既に示されたように、pHを用いることができ、それによってpHの変化の効果が 被検体の存在及び欠如下で比較され得る。通常、pH範囲はヘッド基電荷により種 々であろう。約１〜４のpH範囲が正電荷 のヘッド基を誘発するのに用いられ、約８〜11のpH範囲が負電荷のヘッド基を誘 発するのに用いられる。同様に、イオン強度を変化させることができ、イオン強 度は１μｍ〜５Ｍ、通常 0.1mM〜50mMで種々であろう。イオン強度はイオンの原 子価、例えば一価又は多価による。溶媒において、結合がおこった水性溶媒を除 去することができ、次に任意に洗浄、乾燥した後、異なる溶媒、特に非黙従溶媒 （non-acquiesced solvent）を加えるか、又はもとのアッセイ媒体に溶媒を加え ることができ、ここで、その溶媒はアッセイ媒体中に溶かされるか又は重合脂質 層に接触することによりアッセイ媒体を置換し得る。あるいは、極性又は非極性 溶媒が重合材料を囲む水性媒体に直接加えられ得る。 摩擦もしくは原子力顕微鏡又は機械的応力の他の手段は、重合した材料におけ る構造的変化を促進するのに用いられ得る。構造的変化は、ポリマーの方向を乱 すために光学的変化を生ずる。原子力顕微鏡は、非蛍光形態である青から赤への 重合層の領域を選択的に変化させるためのタッピング又はスキャニングモードに 用いられ得る。蛋白質と結合した重合層は、未結合の重合層と異なって機械的な 力に応答するだろう。これにより、機械的／光学的誘発法を利用するアッセイが 用いられ得る。 重合材料は、ポリマー又は他の置換基が応答し得る特定の波長に露出され得る 。重合した材料内に入った光／エネルギーは光／エネルギーと吸収性接合体ポリ マーとの間の相互作用のため材料の構造的状態における変化を生ずる。光／エネ ルギーを入れることは材料を誘発して青色形態のポリマーから赤色形態のポリマ ーへの光学的変化を行わせることができる。この光学的変化は、アッセイにおい て環境変化として用いられ得る。 多くの例において、環境の変化は結合より大きなシグナルを供し 、環境の変化から生ずるシグナルの変化への結合の効果は結合の結果としてのシ グナルの変化より大きいことが見い出されているので、環境を変化させることに よるこの誘発性のメカニズムはよりセンシティブなアッセイを供する。他の例に おいて、結合は環境における変化のためポリマー骨格における光学的変化を阻害 し得る。この場合において、センシティブなアッセイは、結合したテストフィル ムを未結合の対照フィルムと比較することによって行われ得る。環境変化により 誘発した後、対照フィルムは劇的に変化するであろうが、テストフィルムはポリ マー材料に結合した被検体の量に関連した変化から部分的に阻害されるだろう。 検出の方法は、被検体の存在から生ずる重合層の吸収又は放射された光におけ る変化に焦点がある。スペクトルのシフトは層の吸収した光における変化の結果 である。本方法の目的のために、吸収又は放射された光が偏光されている又は偏 光されていないことは問題ではない。あるいは、ポリマーの結合への応答を測定 するために他の分光法、例えばIR分光、Raman分光、及び他の線形的（linear） 及び非線形的技術が用いられ得る。 色のシフトは通常青から赤であろう。赤形態は蛍光であるが、青形態は蛍光で ない。他の色のシフトも本方法に用いられ得る。赤から黄色を含む他の可能な色 のシフトは引用文献に記載される。逆のクロミズム（chromism）、例えば黄色か ら青も用いることができる。 異なる波長は色彩シグナルにおいてより大きな変化を供することにおいてより センシティブな応答を供し得る。特に、より大きなセンシティビティーが、吸収 の比率の変化、例えばA646／A540と比較したA636／A540を決定することにより達 成され得る。 重合層における吸収シフトの程度はサンプル中にある被検体の量 に比例し得る。フィルムに結合する被検体成分の作用は、ポリマー／フィルム組 成物の物理的、化学的又は電気的変化を引きおこし得る。結合は、１つの吸収ス ペクトルから他への遷移を受けるフィルムの能力を誘導又は阻害し得る。同様に 、結合は、フィルムの放射スペクトルを誘導又は阻害し得る。両方の場合におい て、結合の実際の濃度はフィルムが受ける光学的変化の程度に比例し得る。色彩 シフトは、565〜850nm から 400〜560nm の範囲内で最大吸収の変化を生じ得る 。 本方法は、シグナルの増強を供するために種々であり得る。シグナルの増強の １つの形態は重合した多層フィルムの使用に焦点がある。多層フィルムの使用は 、被検体の検出を容易にする増強されたシフトを生ずる。あるいは、更にシグナ ルを増強するカスケード酵素が用いられ得る。種々の量又はサイズ依存性ラベル が、ポリマーへの分子の効果を増強するために用いられ得る。酵素的方法は、フ ィルムが受けるシグナル変化を増幅するのに用いられ得る。例えば、大きな被検 体分子がフィルムに最初に結合され得る。サンドイッチアッセイ形態において、 酵素的標識を含む第２の抗体が被検体上の第２の部位に結合し得る。酵素のタイ プにより、酵素はフィルムと代わりに反応する豊富な生成分子の形成を触媒する のに用いられ得、フィルムの吸収又は放射におけるシグナル変化をふやす。１つ の酵素生成物は、増幅カスケードを供するフィルムに既に埋め込まれ又は付着さ れた他の酵素により利用され得る。特定の重合層において、結合は、少量の被検 体が層の大部分のシフトを誘発するであろう共同的応答を導き得る。 被検体の存在が重合層の吸収した光におけるシフトにより検出される限り、本 方法の範囲内である異なるタイプのアッセイがデザインされ得る。DNAアッセイ の場合、一本鎖 DNAは１又は２点の結合 を用いてフィルム上に固定化される。結合は共有又は非共有、例えばビオチン、 アビジン、ハイブリダイゼーション等であり得る。DNAの相補的鎖を含むサンプ ルが加えられる場合、DNA二本鎖形成はシグナル発生を導く。ウイルスのアッセ イの場合、ウイルスキャプシド又はエンベロープは、固定化され抗体に、又はフ ィルムに結合した特定のウイルスレセプターに直接結合され得る。高分子はウイ ルスのアッセイに似た様式でアッセイされ得る。血清学のために同じ原理が適用 されるが、抗原が固定化され、抗体が測定される。ポリマーフィルムに固定化さ れたα−ガラクトース−１，４−β−ガラクトースは、Ｐ．フィムブリエア(P． fimbriea) バクテリアに結合し得る。 被検体の結合は、ポリマー層における構造的変化を導く規則正しいパッキング を乱し得る。多価抗原コッキング(cocking)が行われ得、コッキングが多価抗原 の結合を意図する場合、吸収した光のシフトを生ずるポリマーの構造の変化と共 にフィルムの曲がりを引きおこす。多価結合が材料への効果を増強するのに用い られ得る。同様に、金の粒子、ラテックス小球体、又は赤血球等を含む大きな成 分が、結合及び未結合の被検体の間の効果的なシグナルにより大きな影響を与え るために標識として用いられ得る。 アッセイ媒体内に分散され、又は層を形成するのに用いられる２つのリポソー ムは、両リポソーム間に被検体を橋かけすることによりサンドイッチが形成され 得るように異なる結合成分を有し得る。これは、リポソームが増加された特異性 及び凝集を通したシグナル増強のための能力を有する溶液内に分散される場合に 利益が与えられる。 以下の実験は、実例の手段により供され、限定の手段ではない。 実験 以下の実験は、周囲の条件と DNAの結合との両方の変化に応じた重合したフィ ルムの放射された光におけるシフトを証明する。 実験１．多層青色フィルムの作製 領域内の１インチ×３インチのガラス顕微鏡スライドを0.22Ｍ KOH／メタノー ル溶液で２時間、中和した。そのスライドを Milli-Q水で洗浄して純粋な窒素で 乾燥させた。次にそのスライドをジメチル−ｎ−オクタデシルクロロシランでの 処理により疎水性にした。そのスライドを 110℃の温度に維持されたホットプレ ート上においた。そのホットプレートを次に、熱くも冷たくもない絶縁空隙によ りホットプレートから分離された７℃の温度に維持された冷却プレートにおいた 。スライドをホットプレートの温度に合わせた場合、スライドの１／６が冷却プ レートか冷却プレートを超えて動かした。 液体サブ相としてHPLC水を用いた。そのサブ相をスライドの全体の表面の暖か い側上においた。２mMエチルモルホリンペンタコサジイノイックアミド／クロロ ホルム溶液を含む脂質モノマーをマイクロシリンジでサブ相に滴下して適用した 。サブ相の表面全体にわたって脂質モノマーが均一に広がることを確実にするた めクロロホルムを広げる試薬として作用させた。表面全体に単層を形成するのに 必要とされる量を大きく超え、多重層を形成する 100μｌのモノマーを適用した 。過剰なモノマーの濃度のため、いくらかのモノマーがスライドからはみ出すよ うに均一に形成した。 次にスライドをホットプレートから冷却プレートに 0.3cm／secの速度で移し た。スライドを冷却プレートに移すことにより多重層の高度に均一な結晶方位を 形成した。次に多重層を 100秒間、UV光(UVP，Inc.Model UVG-54 Mineralight) を照射することにより重合 した。フィルム表面における光の感応は 30mjule／cm²であった。ランプからの フィルムの距離は 2.5インチであった。青色多層フィルムの形成を確実にする無 酸素環境下で重合を行った。 次に結果として生ずる青色多重層フィルムを、ジメチル−ｎ−オクタデシルコ ロルシランでの処理により疎水性にした疎水性ガラススライドをきれいにし、次 被検体の検出に用いるために室温に維持した。 実験２．単層青色フィルムの作製 ガラス管（６インチ×６インチ×12インチの寸法）に 1.0Ｌの 0.0℃ Milli-Q 水を満たした。先のように、2.0mMエチルモルホリンペンタコサジイノイックア ミドモノマー(EMPDA)／クロロホルム溶液をマイクロシリンジの使用により滴下 して水の表面に適用した。水の表面全体に単一のレンズを形成するためにちょう ど十分な脂質を加えることに注意を払った。単一のレンズを形成するために25μ ｌを加えた。 （１インチ×３インチ）ガラス顕微鏡スライドを、ジメチル−ｎ−オクタデシ ルクロロシランでの処理により疎水性にした。次に上側表面を界面活性剤脂質単 層上にその上側表面を下にしておいた。先の表面上の界面活性剤脂質単層の疎水 性部分をスライドに接着した。スライドに接着しなかった過剰の脂質モノマーを 水表面から吸引した。 次にスライドを親水基が上側を向くように水の下に 180°回転させた。その単 層を水の表面から 0.5インチの距離で Milli-Q水中に沈めて維持した。 重合を水の表面から 1.5インチ（単層表面から 2.0インチ）の距離で 100秒間 、250UVランプ(UVPモデルUVG-54 Mineralight)での照射により行った。サブ相表 面における光の感応は30ｍジュール／ cm²であった。 実験３．周囲のpHの変化に応じるフィルムの青から赤色のシフト 先に記載の青色フィルムをフィルムの周囲pHの変化に応じて青から赤への色シ フトを行うために観察した。色のシフトを以下の通り証明した。最初に、先に調 製された青色フィルムを有する１インチ×３インチスライドを白のバックグラウ ンド上においた。次に、0.8，1.2，2.2、及び 2.8のpH値を有するいくつかの溶 液を、１Ｍ H₂SO₄及び適切な量の Milli-Q水を用いて作った。種々のpH値の溶液 を青色フィルム上にピペットでとり、次のデータを得た。 先の表に示されるように、周囲のpHの酸性度を減少させることは、層が青から ピンクに色を変化させ、遷移の間に蛍光となるので、重合した層の吸収又は放射 された光のシフトを生じた。 実験４．エチルモルホリン PDAフィルムへの DNAの結合に応じた色シフト サンプル中の DNAの存在のためのアッセイを次の通り行った。 Ａ．フローセルの形成 サンプル中の DNAの存在を検出するのに用いられたフローセルを、最初に２イ ンチ×３インチ顕微鏡スライドの表面上に粘着性シリコンゴムスペーサーから作 られた８ウエルフローセルをおくことにより製造した。顕微鏡スライドはフロー セルの底として作用する。次に、先に作られた青色重合フィルムを有する１イン チ×３インチ ガラススライドをゴムスペーサーの頂部上においた。仕上げたフローセル中の各 々のウエルは30μｌの容量を有している。頂部スライドは底部スライドより小さ いので、各々のセルの一部分はサンプルが各々のウエルに加えられ得るように露 出された。 Ｂ．オリゴヌクレオチドの検出 フローセルを LED蛍光モニターユニット内におき、セルのバックグラウンド蛍 光を測定した。次に、ウエルの４つを 2.6×10^-4Ｍオリゴヌクレオチド／滅菌水 （21-mer : 5′-LGG-CAG-TTA-TCT-GGA-AGA-TCA-3′）の30μｌサンプルで満たし た。残りの４つのウエルを滅菌水で満たして対照として供した。 フローセルを53℃で20分間、インキュベートしてフィルムへのオリゴヌクレオ チドの結合をおこさせた。インキュベーションの後、その溶液を各々のウエルか ら除去して、フローセルを高純度の窒素ガスを用いて乾燥させた。 次にフローセルを EPI蛍光モニター装置内にもどして、蛍光を測定した。蛍光 は、存在する DNAオリゴヌクレオチドを有するウエル内で増加することが見い出 された。青色フィルムは蛍光を発しないが赤色フィルムは蛍光を発するので、吸 収した光のシフトはフィルムへの DNAの結合に応じておこるにちがいないと結論 づけた。DNAを含まない対照ウエルは、DNAを含むウエルと比較して異なる50％低 い反応を示した。 実験５．UV重合時間を変えることに関連したエチルモルホリン PDAフィルムに 結合するストレプトアビジンに応じた色のシフト Ａ．フィルムの調製 ３の繰り返しのポリエチレングリコールスペーサー／95％エチルモルホリン P DAフィルムに付着した５％ビオチンを、10℃のサブ相 温度で撹拌しながら空気−水インターフェースにおいて脂質混合物を広げること により繰り返した。フィルムをホルダーにはめられた４／１×３″スライドに手 で水平に移した。空気乾燥した後、キセノンアークランプ下約３インチにホルダ ーをおいて、１，５，15、又は45秒間、ランプ上で回転させることによりフィル ムを重合させた。そのスライドを室温で箱の中に保管した。 スライドをガラス２×３′ｓ上に二重粘着テープを用いて８ウエル装置内にア センブルした。各々のウエルを 350〜800nm スキャンした（“プレ結合”）。次 に、各々のスライドのためのウエルを次のように満たした：ウエル１及び８を脱 イオン（“DI”）水で、ウエル３，５及び７をTBS(トリス緩衝塩類溶液)で、そ してウエル２，４及び６を TBS中15μｇ／nlのストレプトアビジン（“SA”）で 満たした。そのスライドを20分間、インキュベートした後、TBSで３回、DI水で ３回インキュベートした。次にスライドをSAがフィルムの色彩特性を改良する程 度を決定するためにスキャンした（“ポスト結合”）。 Ｂ．温度誘発へのストレプトアビジン結合の結果の決定 各々のウエルをDI水で満たし、DI水を含む槽内に各々のスライドを沈め、１分 間、固定した温度で循環している水浴内にそれ自体をおくことにより温度誘発を 行った。次にスライドを浴から除き、（室温である）空気で吹きつけて乾燥させ た。次にその過程を５℃の増加量で20〜80℃の範囲内でより高い温度で繰り返し た。 フィルム青及び赤色形態のための吸収ピークが各々 646及び 540nmでおこるこ とを最初に決定することによりデータを分析した。各々のスキャンを 750nm周辺 のスキャンのフラットな部分を減ずることによりベースラインのバリエーション について修正した。次にA646／A540(R)比をコンピューターで計算して温度に対 してプロット した。プログラムTablecurveを用いて４パラメーターＳ字状曲線に適合させた。 全ての３つの溶液（水、TBS及びSA）は少しの程度直接フィルムを誘発した。 統計学的に、いずれのUV時間においても３つの処理の間に大きな差はなかったが 、全ての16のスライドについてポスト及びプレ結合比の平均は TBSについてのも のよりSAについてのもので低かった。 １秒のUV重合について、SAが遷移の阻害を示したことを除いて水、TBS及びSA のための曲線におけるかなりのオーバーラップが観察された。 フィルムの開始状態又はその直接的誘発の後の状態のための差についての訂正 のために、１の開始値を供するためにデータを20℃スキャンに標準化した。１秒 及び５秒のUVにおいて、SAは阻害効果を有するが、他の２つの時間においては水 又は TBSからの明らかな差は現れなかった。Ｒ中のスライド間バリエーションは より低いＲ値において減少した。ここでＲは赤色形態のための最大吸光度に対す る青色形態のための最大吸光度の比として定義される。これは、スライドが（A6 46／A540により測定される）種々の程度の“青さ”で始まり得るが、それらは同 程度の“赤さ”で終わることを意味する。ｒ²又はＦ−統計値のいずれかにより 測定されるように、データを標準化することは適合の良好さを改良する：しかし ながら、それは適合したパラメーター値を大きく変化させない。 適合したパラメーター値を図１に示す。 パラメーターａは最終的なＲ値、即ちフィルムが完全に誘発された時のもの（ “最終的な赤さ”）に相当する。パラメーターｂは最初のＲ値に相当する。パラ メーターｃは開始及び最終状態の間の半分の感染点に相当する。パラメーターｄ は曲線の急勾配、即ちＲが その最終値の37％〜63％にある温度範囲に相当し；より小さいｄはより均一な誘 発である。 SAと TBSとの間に大きな差はない。ｂは TBSよりSAについてより低く、これは 直接的誘発を引きおこすSAで一定である。即ちSA処理したフィルムは温度を上昇 させる前に TBSフィルムより“赤く”始まる。ｃが一貫してSAについてより高い ことは、SAが遷移を阻害することを示す。この効果は、差は１秒のUVにおいて最 も大きく、UV時間が増えると減少するが、全ての４つのUV時間で見られた。ｄは TBSよりSAについて大きく異なって現れたが、UV時間の増加はｄについてのより 小さな値又はより均一な誘発をおこした。 実験６．５％ビオチン／１，２−プロパンジオールペンタコサジイオニック酸 エステルフィルムを用いるストレプトアビジンの決定 サブ相温度40℃で窒素で撹拌しながら空気−水インターフェースにおいて脂質 混合物を広げ、0.01cm／ｓで 25mNt／ｍに圧縮することにより５％ビオチン／ジ オールエステル PDAフィルムを調製した。そのフィルムを先の実験に記載される ように手で水平に移し、そこでガラスをシラン化した。二層を形成するためにそ の手順を繰り返した。それを移した後、空気乾燥し、キセノンアークランプ下約 ３インチにスライドのホルダーをおき、１，５，15又は45秒間、フィルムを露出 することにより重合させた。次にそのスライドを室温に保存した。 スライドを洗浄した後空気を吹きつけて乾燥させたことを除いてスライドを先 に記載されるように８ウエル装置内にアセンブルした。各々のウエルを 350〜80 0nm(“プレ結合”)でスキャンした後、先に記載されるのと同様に充填した。20 分間、インキュベートして、TBSで３回、DI水で３回、洗浄した後、スライドを 再びスキャン した（“ポスト結合”）。SAの効果をこの手順により決定した。 各々のウエルをDI水で満たし、１分間、固定された温度で循環する水浴中にそ れ自体が置かれたDI水を含む槽内に各々のスライドを沈めることにより、温度誘 発を行った。次にこのロッジを浴から除去し、空気で吹きつけ乾燥させた後、ス キャンした。この方法を５℃増加量で20〜80℃の範囲で繰り返した。 用いた赤色ピークが 536nmである他は先に記載されるように結果を分析した。 750nm周辺のスキャンの平らな部分を減ずることによりベースラインバリエーシ ョンのために修正した。各々のウエルのためのＲプレスキャンでＲポストスキャ ンを割ることにより“直接的効果”を測定した。各々のスライドのための３つの 異なる溶液は平均化され、次に各々のUV時間における４つのスライドを平均化し た。全てのUV時間のために、SAウエルは TBS又は水と比較してより低いポスト結 合／プレ結合を有し、その差は１″及び５″UVにおいて統計的に重要であるのみ であった。１″UVにおいて、SA処理はＲの70％減少を導いたのに対して、TBS又 は水のいずれも35％だけであった。５″UVにおいて、SA処理はＲの50％減少を引 きおこしたのに対して、TBS又は水については30％であった。温度に対してＲを プロットし、先に記載のようにTablecurveを用いて４パラメーターＳ字状曲線に 適合させることにより、“間接的効果”又は誘発を見た。 図２は４つのパラメーター値についての結果を供する。 理論的に、ａは０未満にならないはずであるが、１″のUVにおけるSA及び TBS においてそうなった。ｂについて、最も大きな差は１″UV時間において見られる 。ｂでの結果は、UV時間の増加がより低い開始値を有するフィルムを導くことを 示した；しかしながら、開始Ｒ値にかかわらず、SA結合の“直接的”効果は全て のフィルムを ほぼ同じ最終のＲ値に変えることである。ｃでの結果は、全ての場合において、 SA結合が１″UVについての最も大きな差を有する TBSに関する温度誘発性遷移を 阻害することを示した。 結論は、TBS又はDI水と比較したSA結合のため、より大きな“直接的効果”又 は青から赤にフィルムへの転化があることである。１及び５″UV時間において差 が統計的に大きかった。目的の重合層での結果は実験５の層に類似するが、より 明白であった。SAは、１″UVにおけるより大きな差と共に TBS又はDI水より大き く色彩シフトを阻害した。 広範囲の種々の被検体の検出のための簡単で容易な使用方法が供されることが 先の議論及び実験から明らかになる。本方法は、重合した層の吸収又は放射され た光のシフトに焦点がある。そのシフトは、層への被検体の結合の直接的結果で ある。層内に広範囲のリガンドを用いることにより、広範囲の被検体が先の方法 を用いて検出され得る。本方法は、層の視覚的な色のシフトの検出に限定されず 、層上の蛍光の出現も用いることができる。 本明細書に言及される全ての出版物及び特許出願は、各々個々の出版物又は特 許出願が引用により組み込まれて詳細かつ個々に示されるのと同程度まで引用に より本明細書内に組み込まれる。 本発明は十分に記載されており、添付の請求の範囲の要旨及び範囲から離れる ことなく多くの変換及び改良がそれになされ得ることは当業者に明らかであろう 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ガウプ，ヘルマン ドイツ連邦共和国，デー−85748 ガーヒ ンク，レールシュフル フュール ビオヒ シック エー−22，ファクルイット フュ ール ヒシック デル テーウー ミュン ヘン

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．重合材料と、該重合材料と会合するか、又はアッセイ媒体内に分散された 結合分子と、を用いてサンプル中の被検体の存在を前記アッセイ媒体中で検出す るための方法であって、前記結合分子は、前記被検体に結合することができる特 異的に結合する対のメンバーであり、前記重合材料は、前記結合分子への特異的 結合の結果として、そして前記重合材料の環境における変化に基づいて光学的変 化をうけ、前記方法が、 前記被検体を含むと推測される前記サンプルを含むアッセイ媒体に、前記重合 材料を、前記特異的に結合するメンバーへの前記結合リガンドによる特異的結合 のために十分な時間、接触させるステップと、 前記重合材料の環境を任意に変化させるステップと、 前記サンプル中の前記被検体の存在の指示として前記光学的変化に対する前記 特異的に結合するメンバーへの前記結合リガンドの前記結合の効果を決定するス テップと、 を含むことを特徴とする方法。 ２．前記結合分子が前記重合材料と会合し、前記光学的変化に対する前記特異 的に結合するメンバーへの特異的結合の効果が決定されることを特徴とする請求 項１に記載の方法。 ３．前記結合分子が前記重合材料と会合し、環境における変化の結果としての 前記光学的変化に対する前記特異的に結合するメンバーへの結合の効果が決定さ れることを特徴とする請求項１に記載の方法。 ４．前記環境における変化が温度における変化であることを特徴とする請求項 ３に記載の方法。 ５．前記環境における変化がpHにおける変化であることを特徴とする請求項３ に記載の方法。 ６．前記環境における変化がイオン強度における変化であることを特徴とする 請求項３に記載の方法。 ７．前記環境における変化が溶媒における変化であることを特徴とする請求項 ３に記載の方法。 ８．前記環境における変化が前記重合材料の機械的応力のためであることを特 徴とする請求項３に記載の方法。 ９．前記環境における変化が特定の波長の光への前記重合材料の露出のためで あることを特徴とする請求項３に記載の方法。 10．前記重合材料が水性サブ相に基づいてダイイン(dyine)モノマーの層を重 合させることにより作られることを特徴とする請求項１に記載の方法。 11．前記重合材料が、固体支持体上に凝集したダイインモノマーを広げて実質 的に均一な前駆層を形成し、該前駆層を重合させることにより作られることを特 徴とする請求項１に記載の方法。 12．前記重合層がリポソームを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。 13．前記重合層が可溶性重合層であることを特徴とする請求項１に記載の方法 。 14．前記光学的変化が色彩シフトであり、該色彩シフトが 565〜850nm から 4 00〜560nm の範囲における最大吸収の変化を生ずることを特徴とする請求項１に 記載の方法。 15．部分的に重合した脂質層と、該重合した脂質層と会合する結合分子と、を 用いてサンプル中の被検体の存在を検出するための方法であって、前記結合分子 が前記被検体に結合することができる特定の対のメンバーであり、前記重合した 脂質層が前記結合分子への 特異的結合に基づいて色彩シフトを受け、前記方法が、 前記被検体を含むと推測されるサンプルに、前記重合した脂質層を、前記特異 的に結合するメンバーへ特異的に結合するのに十分な時間、接触させるステップ と、 前記サンプル中の前記被検体の存在の指示として前記色彩シフトに対する前記 結合分子への前記結合の効果を決定するステップと、 を含むことを特徴とする方法。 16．前記結合分子が前記重合した脂質層に共有結合で付着されることを特徴と する請求項15に記載の方法。 17．前記結合分子が前記重合した脂質層に会合する高分子に共有結合で付着さ れることを特徴とする請求項15に記載の方法。 18．部分的に重合した脂質層と、該重合した脂質層と会合する結合部分と、を 用いてサンプル中の被検体の存在を検出するための方法であって、前記結合分子 が前記被検体に結合することができる特定の対のメンバーであり、前記重合した 脂質層が前記結合分子への特異的結合又は前記重合した脂質層の環境における変 化に基づいて色彩シフトを受け、前記方法が、 前記被検体を含むと推測されるサンプルに、前記重合した脂質層を、前記特異 的に結合するメンバーに特異的に結合するのに十分な時間、接触させるステップ と、 前記重合した脂質層の環境を変化させるステップと、 前記サンプル中の前記被検体の存在の指示として前記色彩シフトに対する前記 結合分子への前記結合の効果を決定するステップと、 を含むことを特徴とする方法。 19．前記環境における変化が温度における変化であることを特徴とする請求項 18に記載の方法。 20．前記温度における変化が少くとも30℃の変化であることを特 徴とする請求項19に記載の方法。 21．前記重合した脂質層が、前記環境における変化の間、前記サンプルに接触 されることを特徴とする請求項18に記載の方法。 22．部分的に重合した脂質層と、アッセイ媒体中に分散された物質と会合する 結合分子と、を用いてサンプル中の被検体の存在を前記アッセイ媒体中で検出す るための方法であって、前記結合分子が、該結合分子の活性の変化を生ずる複合 体を形成することができる特定の対のメンバーであり、前記結合分子が該結合分 子に特異的に結合することに基づいて色彩シフトを形成する前記重合した脂質層 の環境を変化させることができ、前記方法が、 前記被検体を含むと推測される前記サンプルを含む前記アッセイ媒体に、前記 重合した脂質層を、前記重合した脂質層の環境における変化を生ずる前記結合分 子に特異的に結合するのに十分な時間、接触させるステップと、 前記サンプル中の前記被検体の存在の指示として前記色彩シフトに対する前記 結合分子への前記結合の結果を決定するステップと、 を含むことを特徴とする方法。