KR19990082034A - 분석물의 직접 비색 검출용 중합체 필름 및 분석 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 분석물이 필름에 대해 선택적으로 결합하는 경우에 발생하는 단분자 필름에서 관찰 가능한 스펙트럼 변화를 사용하여 분석물을 직접 검출하는 중합체 필름 및 분석 방법에 관한 것이다.

Description

분석물의 직접 비색 검출용 중합체 필름 및 분석 방법

대부분의 화학적 및 생물학적 분자 및(또는) 분석물의 검출을 위한 분석 화학적 방법은 제조 및 분석 단계 동안에 분석물 특성이 소실되고, 전형적으로는 시험 샘플 중에 존재하는 소량의 분석물이 소실되기 때문에 실질적으로 사용할 수 없다.

분석 화학 방법은 그 자체로는 유용한 반면, 평가가 중요한 많은 생물학적 물질에 실질적으로 적용할 수 없거나 제한이 있다. 비싸고 성가신 기체 크로마토그래피 방법을 사용하지 않는다면, 일반적으로 검출을 수행하기 위해서는 다량의 분석물이 필요하다. 종종 정량적인 결과치는 제한되거나 사용할 수 없다.

또한, 각종 세포-염색 및 종래의 병리학 기술을 사용하는 직접적인 현미경 관찰을 포함하는 의학-생물학 시스템 분석은 한계를 갖는다. 배양, 균체 특성화 및 대사 및 영양 제한의 관찰과 같은 잘 개발된 미생물학적 기술을 사용하여 이러한 기술을 증대시킨다. 배양 및 직접적인 조직 관찰 기술이 수년간 의학적 검출 방법의 보루로서 사용되어 왔으나, 이들은 또한 심각한 한계를 갖는다. 질환의 전개 상황 및 원인이 되는 병원체를 찾아내기 위한 환자 조직의 병리학적 분석은 일반적으로 침해 과정을 필요로 한다. 반면, 각종 체액 또는 다른 샘플로부터 병원체를 배양하는 것은 시간이 걸리고 비싸다.

의약 분야에서의 큰 발전은 면역 측정 방법의 개발과 함께 일어났다. 이러한 방법에서, 목적하는 표적에 특이하게 결합하는 항체가 개발되었다. 이들은 개발 및 제조 모든 면에서 비용이 비싼 반면, 통상적으로 동물로부터의 항체는 이전에는 연구 및 임상적인 상황 모두에서 실질적으로 평가할 수 없었던 다수의 분석물의 매우 정확한 분석을 가능하게 한다.

면역 측정 방법에서의 중요한 기술적인 진보는 단세포에서 유도된 항체의 개발이었다. 항체 자체가 작은 분자이므로, 이것은 결합 작용이 검출될 수 있게 하는 몇 가지 방법으로 표지화되는 것이 바람직하다. 이것은 염료, 형광, 방사능 또는 기타 표지로 수행할 수 있다. 역으로, 공지된 양으로 유도된, 표지화된 분석물 및 분석된 물질 사이에 결합 억제가 발생하는 경우, 신호의 감소가 시험 분석물의 존재를 나타낸다. 또한, 항체 입자의 응집이 충분한 부피 및 밀도를 갖는 경우, 침전제의 형성이 분석물의 존재를 나타내는 것으로 작용할 수 있다.

최근 몇 년간, 연구 및 의학적 관심사는 주로 생물학적 물질을 검출하고 정량화하는 면역측정 기술에 관한 것이었다. 많은 분야에서 성공한 반면, 면역측정 방법의 항체 물질에의 의존도뿐만 아니라 이것의 간접적 성질이 각종 분규, 문제 및 검정 한계를 초래하였다. 항체의 개발 및 제조는 비용이 비싸며, 이들 분자는 환경 변화에 민감하다. 또한, 항체가 생성될 수 있는 물질들만이 이러한 시스템에 의해 검출될 수 있다.

많은 작은 생물학적 분자들은 그들의 특정 성질들을 잃지 않고 견딜 수 있는 환경 범위가 심각하게 제한됨으로 인하여 직접적인 방식으로는 검정하기가 매우 어렵다. 이러한 분자들에 대하여는, 면역측정 방법이 많이 사용되어 왔다. 항체가 각각의 가능한 표적에 대하여 항체가 개발되고 생성되는 요건은 약제 개발 설계 및 심사와 같은 적용에서 면역 측정 방법의 효능을 제한한다.

면역 측정 시스템의 단점은 인플루엔자 바이러스와 같은 병원체를 급속하게 진화시킨다는 점에서 명백하며, 면역 반응에 대하여 통상적으로 시판되는 병원체의 외부 코트가 그의 항체 인식 성분을 제거함으로써 면역적으로 인식할 수 없게 된다.

특정 유형의 분석 화학 기술은 하나 이상의 반응 성분을 고정화함으로써 최적화되었다. 예를 들면, 피검 물질이 시험 샘플에 소량으로만 존재하는 경우, 검출 가능한 분석물의 농도는 매우 낮아서, 통상적인 검정 시스템의 검출능에서 벗어난다. 이러한 경우에는, 고정화 시스템이 유리하다고 판명되었다.

세파덱스 (Sephadex) 칼럼과 같은 많은 고정화 물질이 시판된다. 이러한 물질에 대한 요건으로는 특이적 결합 특성, 이들 자체가 시험 반응에서 고정화시키기 위한 검정물과 반응하거나 이를 손상시키지 않도록 하는 다른 물질에 대한 상대적인 불활성 반응 및 시험되는 조건에서 예측가능성을 제공하는 구조적 규칙성이 있다.

종래에는, 고정화가 칼럼, 리포좀 또는 다른 표면상에서 수행되어 왔다. 이러한 물질의 사용은 검정 시스템에 많은 잇점을 제공하였다. 예를 들면, 이러한 물질은 다른 샘플 성분으로부터 반응물의 분리를 용이하게 한다.

전형적인 고정화 기술에서, 분석물은 그에 대해 특정 친화성을 갖는 고정화 물질에 부착시킴으로써 농축시킨다. 계속하여, 테스트는 최초 샘플 유체의 복잡한 3 차원적 검정법 대신에 고정화된 표면으로 제한된 표면적 상에서 수행한다. 생성물은 더 작은 면적으로 응집되고, 보다 용이하게 검출된다.

표면상에 설치된 이중층 필름은 고정화된 매트릭스를 제공하기 위해 사용되어 왔다. 최근에는, 새로운 물질을 개발하기 위한 노력으로, 유기 단분자 필름에 의한 이들 표면의 화학적 변형을 사용하였다. 문헌 [Langmuir, 3, 932, (1987)]에 기재된 바와 같이, 분자의 자가-형성 기술을 사용하여 분자의 잘 정의된 2 차원 검정법으로 표면을 코팅하였다. 이러한 이중층 필름은 검정 반응에 대한 고정용 지지체로서 유용하였다. 예를 들면, 문헌 [Thin Solid Films, 180:65, (1989) 및 210:443 (1992)]에 기재된 바와 같이, 이러한 필름을 기재로 한 바이오-센서는 글루코스 및 우레아와 같은 진단상 중요한 분자를 검출할 수 있다. 이러한 경우, 종래의 분석 화학 시스템은 테스트 결과의 판독을 향상시키거나, 테스트 방법의 검출능을 단순화하고 향상시키기 위해 필름 상에 고정된다.

유사하게, 수용체-리간드 상호 작용의 검출은 효소-결합된 면역흡착제 검정법과 같은 간접 검정법에 의해 수행된다. 생명공학적으로 기능화된 필름이 계면에서 분자 인식을 가능하게 하였음에도 불구하고, 본 발명이 나타날 때까지 분자 인식 결과를 측정 가능한 신호로 번역하는 문제가 남아있었다.

일반적으로, 고정화된 반응 생성물의 검출은 고정화된 매트릭스를 광섬유 [Colloid Interface Sci., 124: 146 (1988)], 석영 진동자 [Thin Solid Films, 210: 471 (1992)] 또는 전극 표면 [Chemical Letters, 627 (1990)]과 같은 다른 장치에 연결하여 수행한다.

고정화된 매트릭스에 결합된 몇몇 분석물은 형광 표지에 의해 검출가능하며, 그의 형광 또는 소광된 상태가 결합 작용의 발생을 나타낸다. 추가로, 고정화된 매트릭스는 검출 물질이 지지용 이중층의 표면에 매립된 이중-지질층으로 제조될 수 있다 [Advanced Materials, 3: 532 (1991)].

폴리디아세틸렌 필름이 공액 주쇄에서의 형태적인 변화로 인하여 온도를 증가시키거나 pH를 변화시키면서 청색에서 적색으로 색을 변화시키는 것으로 공지되어 있다 [Langmuir, 8:594 (1992)]. 결합 작용의 검출에서 이러한 특징을 개발하는 것이 연구 관심사였으나, 연구자들은 실질적인 적용에서 이러한 현상을 사용하는 방법을 아직 개발하지 못했었다.

따라서, 직접 검출 방법이 소량으로 존재하는 매우 적은 화학적 및 생물학적 분자의 검출용으로 제공될 수 있다면, 이것이 매우 바람직하다. 결합이 지지체 물질에서 쉽게 관찰 가능한 변화를 초래하여 직접 검출될 수 있도록 하는 단순하고 독창적인 방법으로 단분자 필름 지지체 기술을 개발하는 것이 매우 바람직하다.

따라서, 본 발명의 제1 목적은 분석물의 직접 비색 검출을 위해 신규한 중합체 필름을 사용하여 소량의 각종 화학적 및 생물학적 분석물의 단순하고 신뢰성 있는 검출 방법을 제공하는 것이다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 소량의 화학적 또는 생물학적 분석물의 검출을 위한 분석법에 유용한 중합체 필름, 분자가 필름 중합체 이중층의 리간드에 결합할 때 발생하는 단분자 중합체 필름에서의 관찰 가능한 색변화를 사용하여 각종 분석물의 작은 분자를 직접 비색 검출하기 위한 분석법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 분석물이 중합체 이중층의 리간드에 특이적으로 결합할 때 결합 작용을 직접 측정함으로써 소량의 화학적 또는 생물학적 분자의 존재를 검출하기에 적합한 분석법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 다른 생물학적으로 연관된 물질뿐만 아니라, 바이러스, 박테리아, 기생충, 및 기타 병원체, 또는 약물, 호르몬, 세포벽 세그먼트, 효소 및 이들의 상호 작용체의 직접 검출을 위한 분석법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 중합체 필름의 일부 또는 전 면적 및 시험되는 생체 분자의 자연 발생적 생 활성 리간드 사이의 경쟁적 결합 또는 자연 발생적 결합 작용의 억제를 관찰함으로써 약제의 개발 및 약제 활성의 개선을 위한 방법 및 검정법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 이중층에 대한 생체 분자의 특이적 결합 결과로서 색 변화가 일어나는 본 발명의 중합체 필름의 지질 이중층에서 시각적인 색 변화 또는 비색 측정법을 사용하여, 생체 분자의 존재를 검출하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 사용이 간단하고, 값이 저렴하며 신뢰성 있는 검정법 및 소량의 작은 분자를 정성적 및 정량적으로 검출하기 위한 테스트 키트를 제공하는 것으로, 이 검정법은 분석물을 다수의 다른 물질과 혼합하는 경우 광범위한 환경 및 실험실 조건에서 안정하다.

본 발명의 또 다른 목적은

a) 분석물에 대하여 직접적인 친화도를 갖거나 분석물에 대한 경쟁적 결합제로서 작용하는 리간드;

b) 그의 제1 말단에서 상기 리간드에 부착된, 두 개의 말단을 갖는 선형 구조의 링커;

c) 상기 구조의 링커가 그의 제2 말단에서 결합된 공액 중합체 주쇄;

d) 상기 구조의 링커에 의해 점유되지 않은 위치에서 공액 중합체 주쇄의 표면에 결합된 배향성 헤드 (head) 기; 및

e) 지지 구조체

로 이루어지는, 분석물의 존재를 직접 검출하기 위한 중합된 이중층 필름을 제공하는 것으로, 상기 필름은 표적 분석물이 리간드 잔기에 결합될 때 검출 가능한 분광 특성 변화를 겪는다.

본 발명은 작은 분자, 생체 분자 및 검출 가능한 분석물의 직접 검출을 위한 분석 방법에서 유용한 중합체 필름에 관한 것이다. 상기 분석 방법은 단분자 중합체 필름에서 관찰 가능한 스펙트럼 변화를 이용하는 것으로, 이러한 변화는 분자, 생체 분자 또는 분석물이 중합체 필름에 선택적으로 결합할 때 발생한다. 중합체 필름은 분석물에 대해 특정 리간드 친화성이 있는 지질 이중층으로 구성되며, 흡광 스펙트럼의 변화에 의해 분석물이 리간드에 결합하는 것에 대하여 반응한다. 변화는 정성적 및 정량적으로 검출 가능하다.

도 1은 본 발명의 한 가지 실시태양의 개략도를 제공한다.

도 2는 본 발명의 중합체 필름 중 하나의 광학 현미경 사진 (도 2a) 및 인플루엔자 바이러스에 대한 비색 반응성을 나타내는 광학 현미경 사진 (도 2b)이다.

도 3은 경쟁적인 억제 실험에서 시험된 필름 형성에 사용된 화합물의 구조를 나타낸다.

도 4는 바이러스를 인큐베이션하기 전과 후의 가시광선 흡광 스펙트럼의 정량화를 나타낸다.

도 5는 증가하는 인플루엔자 바이러스 농도에 대한 시알로사이드 (sialoside) 이중층 필름의 비색 반응성의 도표이다.

도 6은 결합 억제제의 존재 또는 부재 하에 비색 반응성을 검출함으로써 인플루엔자 바이러스의 검출에 대한 본 발명의 유용성을 나타낸다.

정의

본 발명에서 사용된 "분석물"은 본 발명의 중합체성 필름의 리간드에 특정 결합함으로써 검출될 수 있고, 중합체성 필름의 스펙트럼 특성에 변화를 일으키는, 검출 가능한 화학 분자, 생체 분자 또는 그의 일부를 의미한다.

"리간드"는 특정 인식 및 검출 부위에서 시험된 분석물이 결합한 친수성 지질 단량체 또는 그의 유도체를 의미하고, 이는 중합된 얇은 이중막 필름에 연결 암 (arm)을 통해 리간드에 연결함으로써 중합체성이 될 수 있다. 리간드는 개개의 분석물 또는 그의 기에 대해 전형적으로 특이적이다. 리간드는 중합체성 필름의 검출 헤드의 일부를 형성한다. 리간드는 스페이서 또는 링커 분자의 한 말단에 부착되고, 소수성 매트릭스 지질 단량체와 혼합물에서 중합된다. 리간드는 일가 또는 다가 일 수 있다.

"링커" 또는 "스페이서"는 리간드에 대한 한 말단 및 베이스 필름에 대한 제2 말단을 통해 연결된 직선형 구조 분자를 의미한다. 구체적으로는, 링커는 비색 검출 요소에 중합된 몇몇 단량체 중 하나에 부착된다. 구조성 링커는 충분한 길이 및 적합성을 가져서 분석물 상 다수 부위의 결합을 허용한다. 링커는 예를 들면, 테트라에틸렌 글리콜일 수 있다.

"공액 중합체", "중합체 주쇄", "공액 중합체 주쇄"는 중합된 리간드의 층을 의미하고, 매트릭스 단량체 이중막 어셈블리는 비색 전이에 의해 필름의 표면에 나타난 결합을 시그널화시킬 수 있다. 중합체 주쇄는 예를 들면, 폴리디아세틸렌일 수 있다. 중합체 주쇄는 구조성 링커에 결합되어 있다.

"중합체 이중막"은 중합 가능한 리간드 및 매트릭스 지질 단량체로 제조되고, 비색 검출 요소 내로 중합된다. 중합체 주쇄에 연결된 리간드에 대한 분석물의 결합은 이중막내 중합체 주쇄의 유효 공액 길이를 변화시키는 스트레스를 유도한다. 중합에 적합한 매트릭스 지질 단량체는 지질 단량체이다. 이러한 잔기는 아세틸렌, 디아세틸렌, 알켄, 티오펜, 이미드, 아크릴아미드, 메타크릴레이트, 비닐에테르, 말레산 무수물, 우레탄, 알릴아민, 실록산 또는 비닐피리디늄 등을 포함한다. 이러한 기를 함유한 지질은 단독중합체 또는 혼합된 중합체로 제조될 수 있다. 본 발명의 사용에 바람직한 기는 디아세틸렌인데, 이는 폴리디아세틸렌 중합 형태에서 특이한 광학 성질을 나타내기 때문이다. 그러나, 기타 중합기도 결합시 관찰가능한 성질의 변화를 제공하면 사용될 수 있다.

"리간드 지질 단량체"는 탄수화물, 아미노산 및 카르복실기를 가진 기타 분자이다.

"지질 단량체"는 자외선 또는 기타 중합체 주쇄 형성을 위한 수단에 의해 중합체성 필름에 쉽게 중합될 수 있다. 가장 바람직한 단량체는 폴리디아세틸렌 및 옥타디실트리클로로실란 등의 디아세틸렌 단량체이다.

"지질 배향 헤드기"는 분석물의 결합이 기를 교란시킬 때까지 색상 안정을 용이하게 하기 위해 중합체 이중막을 형성하고, 안정화시키고 구조적으로 배향시키는 지질을 의미한다.

"지질 테일"은 지지체 표면에 중합된 필름을 정착시키는 잔기를 의미한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 신규 중합체성 얇은 필름 구조체를 사용하여 수용체-리간드 양태의 상호작용 내 결합된 소분자, 생체 분자 및 분석물의 직접 비색 검출용 분석 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 얇은 중합체성 필름뿐만 아니라 리간드에 결합된 다양한 분석물의 특정 검출을 위한 중합체성 필름을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다(여기서, 리간드 또는 그의 유도체는 중합된 얇은 이중막 필름에 연결 암을 통한 리간드의 중합체성 연결에 의해 중합체성이 됨).

리간드에 대한 분석물의 결합에 의해 검출된 조사할 분석물의 존재는 중합체성 필름의 스펙트럼 특성 변화를 통해 관찰된다. 중합체-리간드 어셈블리는 특정 분자성 인지 및 검출 부위를 포함하고, 이들 모두는 단일 분자성 어셈블리내에 포함된다.

본 발명은 처음으로 단분자성 필름에서 관찰 가능한 스펙트럼 변화를 사용하여 병원체 및 약물 등의 작은 화학 분자 및 생체 분자의 직접 검출을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명은 이러한 물질이 표적 분자에 특이적으로 결합하는 경우, 변화가 생기는 단분자성 필름에서 색상 변화를 이용하여 소분자, 생체 분자 및 분석물을 직접 검출하는 전혀 새로운 접근을 타나낸다.

본 발명의 목적은 작고, 그렇지 않으면 비검출성, 화학 분자, 생체 분자 및(또는) 샘플내 확인 가능한 분석물을 간단하고 빠르고 실용적인 방법으로 정성 및 정량 검출을 모두 가능하게 하는, 화학 및 면역분석 시스템 모두에서 획기적인 발전을 가져왔다. 본 발명은 단일 시스템에서 면역분석 및 화학 분석 모두의 잇점을 결합한다.

또한, 본 발명의 분석은 가장 이로운 환경적 조건에서 다양한 분석물의 검출, 심지어 매우 좁은 환경적 범위에서 나타나는 정확하고, 직접적 분석을 허용함으로써 환경적 시험을 위해 유용하다. 본 발명의 색상 변화 지시계의 속도 및 단순성은 그의 품질 증명 잇점이다.

일반적으로, 본 발명은 예비-분석 정제 단계를 필요로 하지 않는다. 그 결과는 비숙련인에게 쉽게 판독되고, 시험은 보통의 조건에서 행해질 수 있다. 매우 온화한 시험 조건은 중성 상태에 가까운 작은 생체 분자의 검출을 허용하고, 그들의 상호작용에 대한 정보를 제공하고, 분석물의 변형 또는 분해의 위험을 피하게 한다. 본 발명의 이러한 특징은 검출할 필름내로 혼합된 리간드의 높은 특이성에 기인한다. 또한, 본 발명의 직접 분석 시스템은 현재 시판되는 간접 시스템에서 지출, 복잡성 및 고유의 증가된 부정확도를 피할 수 있다.

I. 중합된 이중막 필름

본 발명에 따른 중합체성 필름은 색상 스펙트럼 기준의 변화로 분석물의 광범위한 존재를 직접 검출할 수 있는 다중막 어셈블리이다.

A. 중합체 필름의 제조

본 발명의 중합체성 검출 필름은 단순하고 제조하기 쉽다.

간략하게는, 생물학적 물질과 결합할 수 있는 탄수화물, 아미노산 등의 친수성기를 갖는 단량체성 지질은 이러한 물질의 검출을 위한 리간드로서 사용된다. 소수성기를 갖는 단량체성 매트릭스 지질은 필름을 어셈블리하고 배향시키는데 사용된다. 두 가지 지질은 클로로포름, 벤젠, 헥산, 크실렌 등의 유기 용매 또는 클로로포름/메탄올 (바람직하게는 약 9:1)의 혼합물 등의 수성 용매와 유기 용매의 혼합물에서 약 5 내지 40 %의 리간드/매트릭스 지질의 비율로 혼합된다. 용매 중 리간드/매트릭스 지질의 용액은 전형적으로 작은 방울로 물의 표면상에 천천히 첨가되고, 물에 친수성기가 부착되고 물의 밖으로 소수성기가 돌출됨으로써 스스로 배향된다. 이 과정 중, 유기 용매는 증발되거나 물 표면에 위치된 액체 필름으로서 지질과 떨어져 제거된다. 더 좋은 필름 형성 및 성능을 위해, 지질은 작은 물 영역 상에 고농도로 도포되거나, 전형적으로 지질 필름의 양면 상에 배리어를 위치시킴으로써 샌드위치형 방법으로 압축된다. 이어서, 지질 단량체는 예를 들면, 자외선에 노출시킴으로써 중합체를 부유시켜 맨눈으로 파랗게 보인다. 이어서, 이 중합체는 예를 들면, 유리, 현미경용 유리, 셀룰로이드 등의 개별적으로 제조된 지지체 구조물 또는 옥타디실실록산 또는 헥사메틸디실록산 등의 정착된 소수성 계면활성제로 코팅될 수 있는 기타 단단한 지지체 구조물에 설치되거나 부착된다(실록산기는 정착을 제공한다). 최종 어셈블리는 청색을 가진다.

화합물 (1) 등의 본 발명의 디아세틸렌성 지질 단량체 (도 1)는 자외선에 의해 단일층에서 쉽게 중합되어 당업계의 표준 방법(문헌[Colloid Polymer Science, 255: 36 (1977), 및 J. of Polymer Science, Letters to the Editor, 16: 205 (1978)])을 사용하여 엔인(eneyne)기를 바꾸는 공액 폴리디아세틸렌 주쇄를 형성한다. 본 발명의 한 실시 태양에서, 열-비색 폴리디아세틸렌 이중막은 지지체 상에 어셈블리되고, 이어서 검출 과정을 위해 사용된다. 폴리디아세틸렌 층은 검출할 표적 분자용 수용체 특정 리간드와 관능화된다. 표적 물질의 존재에 대한 정성 및 정량 발견 모두는 본 발명의 다양한 실시 태양을 사용하여 수득될 수 있다.

본 발명의 한 실시 태양에서, 이중막은 옥타데실트리클로로실란의 자가-어셈블리된 단층 및 폴리디아세틸렌의 랑그뮈어-블로젯트 단층 (문헌[Langmuir-Blodgett Films, Roberts., Ed., Wiley New York, (1966)])으로 구성된다. 이 경우에 폴리디아세틸렌 층은 시알산의 동족체와 관능화된다. 시알산은 인플루엔자 바이러스 혈구응집소 뿐만 아니라 기타 병원체를 위한 수용체-특이 리간드이다. 시알산 리간드는 분자성 인지 요소로서 작용한다.

이 비색 기술은 화학 성질이 다양한, 유기 소분자와 결합하도록 만들어 질 수 있는 물질과 커플링된다. 많은 유기체 숙주는 이극성 양성자성 화합물 및 비양성자성 화합물과 내포 착물을 형성한다. 반응식 (1)에 나타낸 화합물 (1) 및 (2) 등의 특정 내포 화합물 또는 클라드레이트는 유기 용매 증기에 대해 높은 선택성 용매일 수 있다는 것이 나타나 있다 [Angew, Chem. Int. Ed. Engl., 32: 110 (1993)]. 예를 들면, 화합물 (1)은 디옥산에 대한 뚜렷한 친화도를 가지고, 부탄올, 아세톤, 메탄올, 2-프로판올, 시클로헥산, 톨루엔 및 물에 대해서는 친화도가 거의 없다. 시클로헥산에 대한 친화도의 부족은 구체적으로 화학 구조에서 주어진 단순성이 두드러진다. 반면에 화합물 (2)는 용매의 동일한 기에 대해 1-부탄올에 대한 뚜렷한 친화도를 나타낸다. 비색 검출과 결합한 이 성공은 표면에 움직이지 않는 화학적으로 민감한 물질의 신종을 가져온다. 단일 초분자성 어셈블리 내로 수립된 내포 요소 및 검출 요소 모두를 갖는 표면은 광범위한 환경 오염물의 직접 검출을 위한 방법의 신규성을 나타낸다.

폴리디아세틸렌 중합체에 커플링된 내포 형성 화합물은 화학적으로 민감하고, 강한 신종의 물질을 형성하고, 독특한 광학 성질을 갖는다. 이러한 물질은 화합물을 손상시키는 결합시 필름에 나타나는 색상 변화를 모니터링하여 유기 용매의 존재를 검출하는 신규하지만, 단순한 방법을 제공한다. 검출기 등을 사용하는 데 기술적 숙련은 필요 없다; 따라서, 기술적 경험이 거의 없거나 없는 사람이 현장 분석하는데 적합하다. 주어진 구조 착물의 내포-형성 화합물이 왜 주어진 시험 분자와 착물을 형성하는 지에 대한 분자 수준의 이해는 광범위한 내포-형성 중합체성 얇은 필름을 만들 수 있게 한다. 이 모든 것이 본 발명의 범위 내에 속한다.

B. 중합체성 필름의 조성물

본 발명의 분석 필름은 그의 표면이 헤드기를 배향하고 검출하는, 베이스 중합체성 이중막 필름으로 구성되어 있다. 검출 헤드기는 해당 분석물에 특이적인 리간드로 구성되고, 이는 직선형 구조성 링커의 한 말단에 결합된다. 이 링커는 제2 말단에 의해 베이스 필름에 결합되어 있다. 이 베이스 필름 표면은 또한 지질 배향 헤드기를 가지고 있다.

본 발명의 한 실시 태양의 개략적 묘사를 도 1에 나타낸다.

친수성인 수용체-결합 지질 리간드 (1)은 소수성인 중합체성 필름의 제2 지질 매트릭스 단량체에 대한 그의 링커 또는 스페이서 분자 (3)의 말단을 통해 부착된 것이 보여진다. 리간드 및 매트릭스 지질 모두는 비색 검출 요소 (5)내로 중합된다. 그의 소수성 면을 통해 비색 검출 요소 (5)는 또한 소수성인 단일막 지지체 층 (7)에 연결되고, 현미경 슬라이드 (9) 등의 지지체 구조물에 부착된다. 또한, 소수성 검출 요소 (5)에 적합할 임의의 표면은 요소 (7) 및 (9)와 대체될 수 있다. 예를 들면, 플라스틱 표면이 대신할 수 있다.

중합체성 필름은 리간드 지질 단량체, 임의로 링커 또는 스페이서로서 사용된 화합물 및 매트릭스 지질을 포함하고, 양쪽 다 검출 및 배향 헤드기를 갖는 검출 중합체성 필름에 중합되며, 상기 필름은 지지체 시스템 상에 설치된다.

1. 리간드기

리간드 또는 그의 유도체는 특정 인지 및 검출 부위에 결합된 시험될 분석물에 친수성 지질 단량체이며, 중합된 얇은 이중막 필름에 링커 또는 스페이서의 연결 암을 통한 리간드의 연결에 의해 중합체성이 될 수 있다. 리간드는 전형적으로 개개의 분석물 또는 그의 기에 대해 특이적이다. 리간드는 중합체성 필름의 검출 헤드의 부분을 형성하고, 이는 일가 또는 다가 일 수 있다.

도 1의 (1)로 나타낸 본 발명의 리간드기는 광범위한 물질로부터 선택된다. 이러한 선택의 주요 기준은 리간드가 선택 분석물에 대해 친화도 및 특이성을 가지는 것이다. 리간드는 단일물이거나 물질의 종류가 분석되는 경우, 넓은 범위의 물질일 수 있다. 적합한 리간드는 펩티드, 탄수화물, 핵산 또는 수용체에 결합하는 임의의 유기 분자를 포함한다. 예를 들면, 모든 인플루엔자 균주는 숙주 수용체 분자에 결합시 동일한 결합 부위를 사용한다. 따라서, 숙주 수용체 분자는 아직 특성화되지 못한 것을 포함한 모든 인플루엔자 균주를 스크리닝하기 위해 유리하게 사용될 수 있다.

리간드는 또한 분석물에 경쟁적 결합제로서 작용시, 예를 들면, 병원체가 수용체 분자의 존재를 시험하기 위한 시험 물질로 유입되는 경우에, 본 발명에서 유리하게 사용된다. 수용체 분자 부재 하에서, 병원체는 분석 이중막에 결합하고, 색상을 만든다. 결합은 병원체 표면이 시험 물질에 유입된 수용체 분자에 결합되는 정도로 감소된다. 이 방법으로, 수용체 분자의 존재가 검출되고 정량된다.

2. 링커

링커 또는 스페이서는 리간드에 대한 한 말단 및 베이스 필름에 대한 제2 말단 또는 리간드 또는 매트릭스의 부분을 통해 연결된 개별적인 직선형 구조 분자이다. 구체적으로는, 링커는 비색 검출 요소에 중합된 몇몇 단량체의 하나에 부착된다. 구조성 링커는 충분한 길이 및 적합성을 가져서 분석물 상 다수 부위의 결합을 허용한다. 링커는 예를 들면, 테트라에틸렌 글리콜일 수 있다.

3. 중합체 주쇄

중합체 주쇄는 청색에서 적색으로의 색상 변화로서 보이는 비색 전이에 의해 필름의 표면에서 시그널 결합이 발생하게 하는 중합된 이중막 어셈블리의 층이다. 중합체 주쇄는 예를 들면, 폴리디아세틸렌일 수 있다. 중합체 주쇄는 중합체 이중막과 결합되어 있다.

중합체 이중막은 중합 가능한 단량체, 바람직하게는 비색 검출 요소에 중합된 리간드/매트릭스 지질로 제조될 수 있다. 중합체 주쇄에 연결된 리간드에 분석물의 결합은 중합체 주쇄의 유효 공액 길이를 바꾸는 이중막내 스트레스를 유도한다.

중합에 적합한 단량체는 지질 단량체이다. 매트릭스 지질 단량체는 아세틸렌, 디아세틸렌, 알켄, 티오펜, 이미드, 아크릴아미드, 메타크릴레이트, 비닐에테르, 말레산 무수물, 우레탄, 알릴아민, 실록산 또는 비닐피리디늄 등의 잔기이다. 이러한 기를 함유한 지질은 단독중합체 또는 혼합된 중합체로 제조될 수 있다. 본 발명의 사용에 바람직한 기는 디아세틸렌기인데, 이는 폴리디아세틸렌, 그의 중합된 형태에서 특이한 광학 성질을 나타내기 때문이다. 가장 바람직한 매트릭스 단량체는 폴리디아세틸렌 및 옥타디실트리클로로실란 등의 디아세틸렌 단량체이지만, 기타 중합기도 결합시 성질에서 관찰 가능한 변화를 제공하는 경우는 사용될 수 있다. 이중막의 제2 부분은 전술한 리간드이다.

지질 단량체는 자외선 또는 기타 수단에 의해 단층으로 쉽게 중합된다.

4. 지질 검출 및 배향기

지질은 필름의 이층 구조를 형성하고 구조적으로 배향시켜 분석 물질의 결합이 검출 가능한 색상 변화를 가져오도록 하는데 중요하다. 검출은 적절하게는 이층 구조의 물리적 구조를 안정화시키는 배향기의 구조화 효과를 기초로 하여 분자 인식 리간드에 대한 분석 물질의 결합이 일어날 때까지 색상 안정화를 촉진한다. 이 결합은 구조의 충분한 입체적 섭동 또는 변형력을 야기하여 색상 변화를 가져온다. 배향 지질에 의해 발생된 안정도 및 상대적인 강도는 이층 구조를 통합시켜, 한 영역의 입체적 변화가 쉽게 관찰될 수 있는 표면 전체에서 더욱 큰 효과를 일으킨다.

관찰된 스펙트럼 변화는 중합체 주쇄의 효과적인 공액 길이를 변화시키는 결합에 의해 유도된 변형력에 기인한다.

본 발명의 리간드 검출기로서 적절한 물질은 -CH₂OH, -CH₂OCONHPh, -CH₂OCONHEt, -CH₂CH(Et)OCONHPh, -(CH₂)₅OH, -CH₂OCOPh, -CH₂OCONHMe, -CH₂OTs, -CH(OH)Me; -CH₂OCOR₂(식 중 R₂는 n-C₅H₁₁, n-C₇H₁₆, n-C₉H₁₉, n-C₁₁H₂₃, n-C₁₃H₂₇, n-C₁₅H₃₁, n-C₁₇H₃₅, Ph, PhO 또는 o-(HO₂C)C₆H₄임); -OSO₂R₂(식 중 R₂는 Ph, p-MeC₆H₄, p-FC₆H₄, p-ClC₆H₄, p-BrC₆H₄, p-MeOC₆H₄, m-CF₃C₆H₄, 2-C₁₀H₇또는 Me임); 및 -CO₂M (식 중 M은 K, HNA 또는 Ba/2임)을 포함하는 친수성 지질이다.

본 발명의 헤드기로서 사용할 수 있는 바람직한 물질은 -CH₂OCONHR₂또는 -CH₂CONHR₂(식 중 R₂는 Et, n-Bu, n-C₆H₁₃, n-C₈H₁₇, n-C₁₂H₂₅, 시클로-C₆H₁₁, Ph, p-MeC₆H₄, m-MeC₆H₄, o-ClC₆H₄, m-ClC₆H₄, p-ClC₆H₄, o-MeOC₆H₄, 3-티에닐, Me, Et, Ph, 1-C₁₀H₇, Et, Ph, EtOCOCH₂, BuOCOCH₂, Me, Et, i-Pr, n-C₆H₁₃, EtOCOCH₂, BuOCOCH₂, Ph, 2,4-(NO₂)₂C₆H₃OCH₂ 또는 CH₂CH₂OH임)이다.

가장 바람직한 검출기는 X가 OH 또는 MeO인 CH₂COX 또는 임의의 그의 염으로부터 선택된다.

매트릭스 배향기로서 적절하게 사용되는 물질은 필름을 조립하고 배향시키는데 사용되는 친수성 지질이다. 지질의 테일을 포함하는 기는 다양하다. 중합된 필름을 지지체 표면에 부착시키는데 사용되는 이러한 잔기는 CH₃-, CH₃O-, 네오-C₅H₁₁O-, 시클로-C₆H₁₁O-, PhCH₂O-, p-AcC₆H₄O-, p-BzC₆H₄O-, p-BrC₆H₄COCH₂O-, p-(PhCH=CHCO)C₆H₄O-, p-(PhCOCH=CH)C₆H₄O-, o-BzC₆H₄NH-, p-BzC₆H₄NH-, MeOCH₂CH₂NH-, n-C₆H₁₄NH- 및 EtO- 중 임의의 잔기일 수 있다. 본 발명에 있어서 바람직한 기는 메틸기이다.

5. 필름 지지체

필름이 부착되는 지지체 구조(9)는 다양한 물질일 수 있다. 실시예 1과 같은 본 발명의 특정 실시 태양에 사용된 물질은 옥타데실트리클로로실란과 같은 적절한 계면 활성제로 처리하여 친수성으로 만든 현미경적 유리 슬라이드이다. 플라스틱, 운모 금속, 세라믹 또는 다른 상대적으로 균일한 중합체의 표면과 같은 어느 정도 친수성인 임의의 금속을 사용할 수 있다. 유리는 색상 변화를 쉽게 알 수 있는 투명성에 기인하는 본 발명의 바람직한 투명 지지체이다. 그러나, 불투명 물질은 반사율 유형을 측정하여 사용할 수 있다.

B. 리간드로서 사용되는 수용체-결합 분자

수용체-결합 분자는 병원균 자체가 전염에 대한 전조로서 부착되는 숙주 세포의 표면상의 물질이다. 본 발명의 리간드로서 그러한 분자를 선별하는 것은 병원균 생존에 명백한 위기가 있는 병원균에서 고도로 유전적으로 보존되려는 경향이 있는 이러한 분자로서 이러한 병원체에 대한 특이적 인식 부위를 제공한다. 동일 병원균의 상이한 균주는 일반적으로는 본 발명의 리간드와 같은 분자가 선택되는 경우, 가성 음성 결과를 산출하지 않는다. 수용체 분자는 보다 작고, 보다 덜 복잡하며, 종종 친수성이 덜하다.

상기된 바와 같은 수용체-결합 분자는 수용체 분자의 증가하는 수를 인식하고, 동정하고, 단리하고, 많은 병원체에 대해 합성함으로써 본 발명에 의해 검출 가능하다. 많은 이러한 수용체는 다양한 분석 및 처리계에 사용하기 위해 개선되었다.

본 발명의 유용한 좋은 예는 인플루엔자 또는 말라리아의 검출에 사용되는 시알산 유도체이다. 많은 병원균에 대한 수용체의 예는 표 1로서 본 출원에서 제공한다. 본 발명의 범주에 속하는 임의의 다른 리간드뿐만 아니라, 이들 모두는 본 발명의 범주이다.

실시예 1에는 수용체-결합 분자의 용도를 위한 바람직한 실시 태양으로서 시알산 유도체의 한 예가 기재되어 있다.

II. 평가 시험 조건

본 발명의 평가는 시험될 분석 물질에 민감한 온화한 시험 조건하에 수행한다. 본 발명의 중합체성 얇은 필름 구조는 안정하거나 제한된 생체내 또는 좁은 환경 범위의 조건 내에서 특이적으로 적절한 결합 특성을 갖는 리간드 및 분석 물질을 사용한다. 본 발명은 이러한 좁은 범위의 조건 내에서 엄중하게 제한된다. 이것은 예를 들면, 시험 방법 동안에 민감한 생화학 물질 및 생물분자의 3차원 형태를 유지시킨다.

시험은 시험될 분석 물질 또는 분자가 본 발명의 중합체성 필름과 접촉하고, 색상 변화 및 그의 강도가 관찰되고 양을 측정한다는 점에서 극히 단순하다. 전형적으로는, 이 방법은 단지 약 30 분이 소요된다.

본 발명은 극히 제한된 조건에서만 잘 기능 한다. pH, 염도 및 온도와 같은 평가 조건은 분석의 정확도 또는 민감도에 영향을 주지 않으면서 피드백 제어, 적정 및 다른 기술에 의해 조심스럽게 제어할 수 있다.

본 발명의 이러한 광범위한 실험 이점 때문에, 완전한 세포 또는 민감한 세포 함유물은 그의 구조적 완전성이 교란되지 않으면서 평가된다. 말라리아 감염의 다양한 단계와 같은 적절한 세포의 발달 단계를 모니터할 수 있다. 이외에도, 본 발명의 방법을 사용하여 상호 작용 방법 동안에도 다양한 인자들 사이의 연합을 시험하거나 모니터할 수 있다.

본 발명의 필름 및 방법은 항체가 생성될 수 없는 매우 작은 생물 또는 다른 분자를 평가하는데 적절하다. 이러한 표적 물질은 극히 낮은 함량으로 존재하는 유기 용매 또는 오염 물질을 포함한다. 특정 기회는 법의학 및 임상 용도 모두에 있어서 약제 스크리닝에 대해 본 발명에 의해 성취된 진보에 의해 가능하다. 본 발명에 사용되는 억제 기술은 크기가 작거나 일가를 갖는 물질의 시험을 허용한다.

본 발명에 의해 얻어지는 기대되지 않은 스펙트럼 신호는 예를 들면, 바이러스 및 세포막 단편과 같은 다가 물질의 결합의 결과로서 일어나는 이층 구조의 물리적 섭동에 기인하며, 섭동은 본 발명의 방법을 사용하여 검출한다. 따라서, 다가 물질은 일반적으로는 구조의 물리적 재배치를 가져오면서, 결합의 결과로서 이층 구조의 지질층 중으로 도입되는 형태의 변화 때문에 평가계에서 특히 강한 반응을 이끌어낸다.

보다 작은 일가의 분석 물질을 담체에 예비 결합시키는 것은 또한 본 발명의 효능을 증가시키는 것에 대한 이점을 시험할 수 있다. 예를 들면, 분석 물질은 중합체 또는 리포좀의 표면에 결합할 수 있다. 이것은 각각의 접촉점에서 스펙트럼의 변형을 증가시키면서 본 발명의 이층 구조의 지질 표면상에서 결합을 특정 지점으로 집중시킨다. 이외에도, 분석 물질이 부착되는 리포좀의 만곡된 표면은 주변부에 결합된 분석 물질을 이층 구조의 지질 표면으로부터 끌어내고, 리포좀의 중앙에 위치된 분석 물질을 이층 구조의 지질 표면 중으로 가게 한다. 이어서, 이러한 예비 결합 단계는 이층 구조의 표면상에 뒤틀림, 섭동 및 신호 발생을 증가시킨다.

본 발명의 평가는 약한 결합 분석 물질뿐만 아니라 다가의 분석 물질의 검출에도 적절하다. 본 발명의 중합체-결합된 리간드의 다면적인 특성은 천연의 다가의 분석 물질의 경우에 있어서 높은 결합 능력을 제공한다. 다원자가는 제한된 원자가의 분석 물질을 시험 방법 전에 제공하여 본 발명의 이러한 이점을 고취시킬 수도 있다. 본 발명에서 다원자가를 이용하는 것은 약한 상호 작용을 제외하고는 특이적이어서 여러 배로 증폭되게 한다.

충분한 길이 및 적합성을 갖는 구조적 링커는 만곡된 표면상에서 형태적으로 분리되는 경우에도 분석 물질 상에서 여러 자리의 결합을 돕는다. 이러한 특성의 결과로서, 본 발명은 종래에는 적절하지 않았던 분석으로 많은 리간드를 검출할 수 있다.

분석 물질의 존재를 효과적으로 나타내는 주된 특징은 이층 구조를 나타내는 표면이 충분히 섭동하여 필수적으로 스펙트럼의 변화를 가져온다는 것이다. 분석 물질을 고정화 입자에 결합시키는 것은 분석 물질을 작은 영역으로 집중시키는 것과 같이 이러한 목적으로 제공되고, 단지 작은 분석 물질에 대해 상대적으로 큰 영역에 걸친 3차원적인 면을 추가로 제공한다.

여러 종류의 리간드는 다가의 시험 표적을 검출하는데 있어서, 가요성을 크게 허용하면서 본 발명에 사용할 수 있다. 리간드 선택은 시험계의 편의보다는 가장 유리한 결합 및 입체적 특성을 기초로 한다. 따라서, 가장 유리한 리간드는 소수성 및 친수성, 크기, 결합부위의 위치 및 분석 물질과 상충되는 친화도와 같은 요인을 기초로 하여 검출한다. 본 발명에 유리하게 사용되는 리간드는 탄수화물, 펩티드, 뉴클레오티드, 헤테로시클릭 화합물 및 다른 유기 분자를 포함한다.

본 발명의 중합된 이층 구조는 필름 구조를 조립하며, 그 형태는 도 1에 중합된 이층 구조 조립의 개략도로서 나타나있다. 하부 단일층의 실록산 결합은 나타내지 않았다. 도 2A는 교차된 편광판 사이의 시알로시드 이층 구조의 조립을 나타내는 광학현미경 사진이다. 150 ㎛에 이르는 큰 도메인을 볼 수 있다. 축척: 1 ㎝ = 20 ㎛.

초기의 연구는 비색계로 검출하는 모델계로서 인플루엔자 바이러스의 시알산에 대한 결합에 집중되었다. 이 연구는 실시예 1에 보고되어 있다. 지질 단량체는 탄소-결합된 시알산 헤드기를 함유하여 바이러스성 렉틴, 헤마글루티닌에 대한 분자 인식 부위를 제공한다. 도 3은 LB 필름 형성에 사용되는 매트릭스 지질 (11), 시알로시드 지질 (13) 및 락토스 지질 (15), 및 실시예 4에 기재된 경쟁적 억제 실험에 사용되는 화합물 α-NeuAc (17), β-O-NeuAc (19) 및 α글루코스 (21)를 나타낸다. 화합물 (13)의 합성은 문헌 [J. of The American Chemistry Society, 115: 1146 (1993)]에 보고되어 있다. 바이러스의 표면에도 또한 존재하는 탄소 글리코사이드는 천연의 산소 글리코사이드 대신에 사용되어 뉴라미니다아제에 의한 가수분해를 예방한다.

III. 표적 물질

본 발명의 이점 중 하나는 본 발명의 기술을 사용하여 분석에 대한 광범위한 표적 물질, 결합 및 생화학 반응을 검출하는 유용함이다. 많은 이러한 물질은 종래에는 이용 가능한 평가 방법을 사용하여 검출할 수 없었다. 본 발명은 복잡하게 면역 글로불린을 생산하지 않는 특이적 결합을 이용한다.

본 발명의 평가계의 정확하고 뚜렷한 이점은 당 기술 분야 방법의 한계 때문에 종래에는 성취될 수 없었던 물질의 검출 및 정량 분석이다. 본 발명은 실시예 9에 기재된 바와 같이 말라리아 기생충 감염을 정확히 검출하는데 이미 독특한 평가 방법으로 시험되었다. 일시적인 단계에서 말라리아를 효과적으로 평가하는 방법의 개발은 현재까지 면역학적 평가 또는 분석 화학 분야의 방법에 난제로 여겨져 왔다.

IV. 정성 및 정량 분석

본 발명 및 평가 방법에 있어서, 이층 구조에 대한 다양한 스펙트럼의 변화를 사용하여 표적 물질의 존재 또는 부재를 검출한다. 중합된 이층 구조의 공액 중합체 주쇄는 색상 변화에 의해 필름의 표면에서 결합하는 신호를 조립한다. 색상 또는 다른 스펙트럼 변화는 청색으로부터 적색으로의 색상 변화로서 육안으로 쉽게 알 수 있고, 가시광선 흡수 분광법에 의해 정량한다.

필름은 오직 이층 구조의 표면에서 일어나는 수용체-리간드 상호 작용에 기인하여 청색으로부터 적색으로 색상이 변화하도록 고안하였다. 이층 구조의 조립은 분자 인식 부위 및 검출 요소를 포함한다. 색상을 기초로 한 이러한 단순한 센서는 필름의 가시적인 검사에 의한 신속하고 정성적인 결합의 검출 또는 가시광선 흡수 분광법에 의한 정량적인 검출을 가능하게 한다.

상기된 바와 같이, 본 발명의 화학적으로 관능화된 폴리디아세틸렌의 얇은 필름은 단순한 비색계 바이오센서로서 작용한다. 이러한 필름을 바이러스와 같은 미생물에 특이적으로 결합하는 탄수화물-기재 리간드로 유도한다. 공액 중합체성 필름은 초기에는 청색이다. 바이러스 또는 다른 분석 물질이 유도된 중합체에 결합하면 필름의 색상은 청색으로부터 적색으로 변화한다. 생성된 적색의 강도는 대략 바이러스의 양에 상응한다. 정량을 위해 스펙트럼의 신호를 증폭시키는 수단은 신틸레이터와같이 당 기술 분야에 잘 알려져 있고, 분석 물질이 낮은 함량으로 존재하는 경우 유리하게 사용할 수 있다. 신호의 실험적 특성 때문에 본 발명의 평가계로부터 읽혀진 것을 자동화할 기회가 많다.

본 발명의 한 실시 태양에 있어서, 청색 쉬프트는 시험자에 의해 가시적으로 관찰된다. 반응의 단순성 때문에, 그러한 관찰은 적절한 평가, 예를 들면, 재택 시험으로 훈련받지 않은 사람에 의해 쉽게 수행할 수 있다. 다른 방법으로는, 특정 조명 광 파장에 대한 광학 밀도를 포함하는, 당 기술 분야에 공지된 스펙트럼 시험 장비를 사용하여 단순한 육안 관찰의 한계를 넘는 범위의 색상 쉬프트의 변화를 결정한다.

인간의 가시 범위를 넘는 스펙트럼 변화는 광 미터와 같은 다양한 스펙트럼 분석기를 사용하거나, 적외선 및 자외선 검출기와 같은 다양한 판독 장치를 사용하여 기술자가 표면을 관찰함으로써 본 발명에 유효하게 사용할 수 있다.

정량을 위해 스펙트럼 신호를 증폭시키는 수단은 신틸레이터와같이 당 기술 분야에 잘 알려져 있고, 분석 물질이 낮은 함량으로 존재하는 경우 유리하게 사용할 수 있다. 신호의 실험적 특성 때문에 본 발명의 평가계로부터 읽혀진 것을 자동화할 기회가 많다.

보다 정확한 정량적 측정을 위해, 필름은 620 ㎚ (청색) 내지 550 ㎚ (적색) 사이의 강도의 상대적인 변화가 도 4에 나타낸 바와 같이 쉽게 평가되는 가시광선 흡수 분광계로 스캐닝한다 (표 2). 색상 반응의 한도는 분석 물질의 농도에 직접적으로 비례한다. 본 실시예는 종래에 작은 유기 분자를 결합하는데 존재하는 새로운 부류의 리간드를 연구함으로써 이러한 기술을 생물 진단의 영역으로부터 환경 진단의 영역으로 이동시킨다. 이러한 리간드는 유사하게는 폴리디아세틸렌 주쇄에 결합되어 비색계 검출이 이루어진다.

본 발명은 분석물의 광범위한 변형에 따라서 다양한 용도를 갖고 있다. 이들은 작은 생체 분자, 결합 및 다른 화학 작용의 관찰, 및 미소량의 많은 물질의 검출을 포함한다.

매우 다양한 응용가능성으로 인하여, 예전에 선행 기술 방법에 의하여 검출하기가 어렵거나 불가능하다고 입증된 분석물의 중요한 군을 본 발명에 의하여 발견할 수 있었다. 이들과 관련된 다양한 바이러스, 박테리아 및 단백질, 또는 이들에 기인한 감염을 발견할 수 있다. 이들은 다른 것들 중에서 인플루엔자, HIV, 및 말라리아와 같은 병원체를 포함한다. 본 발명의 중합체 필름에 의한 직접 비색 검출은 진단상의 응용 및 지원 약물 또는 결합 리간드에 대한 새로운 스크리닝 가능성을 제공한다.

본 발명은 약제 개발 및 스크리닝 계획에 있어 유용하다. 현재에는, 약제 수용체 분자의 경쟁적인 억제를 평가하기 위하여, 전형적으로 방사-라벨된 물질이 사용된다. 그러나, 이 방법은 시간이 소요되고 방사-라벨된 물질에 접근 및 취급을 필요로 한다. 형광 소광과 같은 다른 기술은 각각의 시험이 독립적이기 때문에, 커다란 스크리닝 노력이 과도하게 시간을 소비하고, 고비용이라는 점에서 제한되어 있다.

본 발명의 태양에 의하여 목표된 유전적으로 유지된 숙주 결합 위치에 많은 잇점이 있다. 예를 들어, 인플루엔자로의 환자의 노출을 측정하는 것이 제한적일 것이고, 인플루엔자 병원체 수용체 리간드와의 결합이 발견되는 경우, 특정 변종에 제한되지 않을 것이다. 또한, 이러한 본 발명의 잇점은 임상학자가 단일 분석에 의존할 수 있기 때문에, 수회의 면역 시험의 필요를 없게 한다. 또한, 새롭게 발전된 특징지워지지 않은 인플루엔자 변종 조차도 추가로 잘못된 음성 시험을 피하고 확인할 수 있다.

면역분석에 대한 유사한 제한이 말라리아 기생충과 같은 잘 알려진 병원체에서 발생한다. 이러한 유기체에 있어서, 면역 반응이 허용될 수 있는 생활사 상태가 장시간 제한되어 면역 반응을 제거시킨다.

본 발명은 병원체를 확인하기 위하여 유전적으로 유지된 숙주 결합 위치를 개선하였다. 비교적 커다란 기생충에서조차도, 숙주 결합 위치는 기생충의 세대를 통하여 장시간 균일하게 유지되는 경향이 있다. 또한, 기생충은 통상적으로 몸체 내에 다수의 다양한 생활 상태로 존재한다. 잘 알려진 기생충에 있어서, 면역 접근가능 위치는 종종 단계에 따라 현저하게 다양하고, 그 잇점은 숙주 유기체가 면역적 반응을 충분한 속도로 나타낼 수 없어서 기생충의 침해를 피하게 한다는 것이다.

본 발명의 이러한 특정 용도에 있어서, 약제의 다양한 반복은 병원체에 의한 전염성 결합을 방해하기 위하여 빠르게 스크린할 수 있다. 표 1에서는 전염에 있어 중요한 병원체의 부착 위치를 제공하는, 다수의 숙주 수용체 분자의 예가 나타나 있다. 모든 이들 예는, 많은 다른 것들과 더불어, 약제 개발 및 최적화를 위하여 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 단일 복층 시이트상에 제조될 수 있는 다중 통로는 다양한 수준의 pH 적정과 같은 것으로 시험될 지원 약제의 많은 민감한 반복을 허용한다. 약제 시험을 위하여 본 발명을 이용함으로써, 현재의 고비용 약제 연구, 각각의 샘플에 대한 개별적인 시험에 있어 냉담한 효과가 제거될 수 있다.

고부피 저비용 스크리닝의 이용가능성은 약제 개발의 속도를 현저하게 증가시킬 것이다. 이러한 목적을 위하여, 자연적으로 생성된 트랜스 멤브레인 수용체(TMR)는 지질 복층으로 재구성되고, 여기서 지질층은 중합성 단량체로부터 제조된다. 이는, 특히, 사슬에 두 개의 3 중 결합을 갖는 본 발명 화합물에 이용 가능하다. 수용체가 지질에 혼입되면, 지질은 조사되고 중합되어, 그 위치에 TMR을 고정시킨다. TMR중의 결합 위치로의 작은 분자의 결합은 TMR에 배위 변환을 제공하여 지질에 영향을 미치고 색변화를 일으킨다.

매우 다양한 TMR이 분리되었다. 호르몬, 신경 전달 물질 및 다른 생리학적으로 생성된 수용체를 포함하는 TMR은, 특히, 본 발명을 이용하는 약제의 개선 및 개발에 유용하다. 본 발명에서 자연적으로 생성된 TMR의 이용은 약제 스크리닝에 대하여 특정 용도를 갖는다. 본 발명은 신규한 약제의 개발에 있어서 아주 적절하고, 이의 생물학적 효과는 수용체를 보유한 멤브레인과의 결합에 의존한다. 예를 들어, 도파민 수용체는 천연 화합물 도파민과 결합한다. 도파민과 같은 작용을 하는 신규한 화합물을 연구하는데 있어 본 발명을 이용하기 위하여, 즉, 도파민 수용체와 결합시키기 위하여, 리간드로서 사용되는 도파민 수용체를 시험되는 신규한 도파민형 약제에 노출시킨다. 약제 시험에 대한 접근은 본 발명 중합체 필름의 하나의 특정 태양 및 그들의 용도로서 실시예 6에 나타내었다.

본 발명에 따라 이용 가능한 스크리닝의 용이성으로 인하여, 지원 약제 구조에 많은 작은 변화를 일으키고, 이를 즉시 분석할 수 있으며, 약제의 개발 및 최적화에 있어 현저한 속도 및 적응성을 제공할 수 있다. 효능에 가장 큰 변화를 제공하는 변형된 영역을 주목함으로써, 약제의 중요한 구조를 신속하게 확인할 수 있다. 이는 약제 개질 노력에 결정적인 초점을 제공하여, 약제 개발의 속도를 현저하게 증진시킬 것이다.

또한, 약제의 상호 작용, 최적화 및 신규한 약제 개발에 대한 기본적인 연구도 본 발명에 의하여 실용적이게 된다. 현존하는 약제를 분석하여, 그의 구조가 약제상 효과에 있어 가장 중요한 역할을 한다는 사실을 측정할 수 있다. 이어서, 이들 구조는 최적화되고, 보다 생물학적으로 수용가능하고, 보다 작거나, 보다 저비용이며, 비활성인 구조로 전환될 수도 있다. 혈액-뇌 배리어를 횡단하기 위한 능력으로서 이러한 성질을 부여할 수 있다.

두 개의 상이한 약제가 질병의 치료에 이용 가능한 경우, 그들의 구조는 본 발명의 기술을 이용하는 활성화에 따라 분석할 수 있다. 이어서, 그들의 활성 위치에 단일 약제를 혼입시킬 수 있다. 또한, 활성화를 최적화한 부수적인 구조를 신규한 변종 약제상에 적절하게 위치시킬 수 있다. 고비용 및 장시간의 동물 또는 사람의 처치 전에, 활성화에 있어 어떠한 방해를 측정하고 개선하거나 제거할 수 있다.

본 발명의 또다른 중요한 용도 및 방법은 감염된 상태 및 다른 의학적 조건에 따라 저비용의 정확한 분석이다. 예를 들어, 특정 병원체에 대한 항체 수준은 분석 용액 중에 위치한 병원체 물질의 고정된 양의 경쟁적인 억제를 통하여 손쉽고 저비용으로 모니터링할 수 있다. 또한, 특정 항체는 본 발명 멤브레인에 그들의 직접적이고 특정한 결합을 통하여 검출할 수 있다.

매우 다양한 생물학적으로 관련된 물질은 유익하게는 본 발명을 이용하는 정량 분석 및 정성 분석에 이용 가능하다. 다양한 병원체에 의한 감염은 의학적 징후가 발견되기 아주 전에 발견할 수 있다. 이는 면역성이 감소된 환자, 예를 들어, 신생아, 화학요법 환자, 기증 장기 수용자, 및 AIDS 감염자에게 있어서 특히 중요한 이익을 가져온다.

임산부에 대한 시험에 있어서, 장막 생장 호르몬을 본 발명을 이용하여 분석한다. 황체 형성 호르몬의 증가는 임신의 성공 및 자연 분만 조절 방법에 사용하기 위한 배란의 징후를 나타낸다.

정보의 간편성으로 인하여, 본 발명은 가정용으로서 매우 적당하다. 예를 들어, 이는 자연 분만 조절 방법 또는 수정 능력을 평가하여 임신의 기회를 최적화하기 위해 필요한 저비용의 다중 시험을 가능케 한다.

본 발명의 저비용의 다중 시험 용량은 단일 복층 시이트상의 다중 통로를 통하여 극히 초기의 임신의 발견을 위한 훌륭한 동기를 제공할 수 있다. 임신의 최초 수일 내에, 기간이 경과하기 전에 임신의 발견은, 최종 결과에 중요한, 유해 인자에의 노출을 피하는데 있어서 중요하다. 또한, 이는 임산부가 질병에 노출되게 될 때, 임산부에게는 의학적 징후가 나타나지 않거나 늦게 나타날 수 있으나, 산모가 보유하고 있는 태아의 발육에는 심각한 손상을 입힐 수 있다. 이들 질병에는 풍진, 주혈 원충병, 및 다른 병원체를 포함할 수 있다. 본 발명은 이들 질병에 대한 간단하고 저비용의 스크리닝을 허용한다.

본 발명의 또다른 중요한 용도는 당뇨병과 같은 만성 질병을 지닌 환자의 모니터링이다. 예를 들어, 현재 가정에서 본 발명을 사용하여 인슐린 혈액 수준을 규칙적으로 조절할 수 있다. 이는 당뇨병 환자에게 그의 인슐린 투약을 인슐린 요구량에 따라 보다 정확하게 하게 한다. 또한, 이는 인슐린 수준의 과도한 변화로부터 인플루엔자와 같은 합병증의 초기 징후를 구분하게 한다.

또한, 본 발명은 환자가 그의 콜레스테롤 수준을 자신의 집에서 개인적으로 측정할 수 있게 하고, 그의 콜레스테롤 수준의 시험을 보다 주의 깊게 할 수 있게 하며, 종종 이를 중요한 정보로 인식하게 하는. 간단한 가정용 콜레스테롤 수준 시험을 허용한다. 알려진 과콜레스테린혈증 환자에 있어서, 본 발명은 이상적인 수단을 제공하여, 처치 노력의 완화 효과를 긴밀하게 모니터링하게 한다. 본 발명에 의하여 가능해지고 실용화된 다중 통로 시험 키트는 이들 수준의 주간 모니터링 또는 일간 모니터링에서조차도 특히 유용하다.

약제 및 약제 수준의 모니터링은 본 발명 용도의 독창적인 영역이다. 환자들은 전형적으로는 넓은 범위의 대사 수준 및 간 활성을 나타낸다. 이는 특히 병원에 입원해 있는 환자들의 경우이다. 혈액 약제 수준을 쉽게 측정할 수 없기 때문에, 임상학자는 종종 보다 높은 투약 수준이 필요치 않을 수 있는 환자들을 강제적으로 치료하게 된다. 불운하게도, 의사는 독성 수준에 도달할 가능성을 피하기 위한 주의의 측면에서 실수를 하게 된다. 본 발명은 더욱 정확한 약제 투약의 적정을 허용하고, 보다 우수한 고통 억제 및 다른 약제 이익을 허용한다.

본 발명은 약물 남용에 있어서 중요한 용도를 갖는다. 환자가 약제를 과량 복용하게 될 때, 약제의 실제 혈액 수준 및 그의 확인은 본 발명을 이용하는 외과 의사의 처리에 의하여 매우 빠르게 평가할 수 있다. 이러한 정보는 실제적으로 과다 복용한 물질에서와 동일한 징후를 나타내는 약제 과다 복용에 대한 잠재적으로 유해한 처치를 방지한다. 또한, 본 발명을 이용하여 예상한 약제 수준 보다 낮은 수준이 발견되는 경우, 덜 엄격한 해독 방법을 취할 수도 있다. 반대로, 환자가 임상학자에게 실질적인 위험 수준을 경고할 수 있는 징후를 보이지 않을 때 조차로 독성 수준이 검출될 수도 있다.

본 발명은 광범위한 산업적 용도에서 추가로 유용하다. 예를 들어, 산업용 효소는 그들의 결합 강도 뿐만 아니라, 매질중의 그들의 존재에 따라 모니터링할 수 있다. 그들의 손실은 유출물 중에서 모니터링할 수 있고, 그들의 적절한 분산은 공급 원료 및 매질 중에서 모니터링할 수 있다.

본 발명은 어떠한 특정 기질 상에서 효소 활성에 대한 최적 조건을 결정하는데 있어서 매우 유용하다. 또한, 효소는 특정용도 또는 작업 환경에 맞추는 것을 포함하여, 손쉽게 최적화시킬 수 있다. 이는 다른 경우에 설명된 바와 같이, 약제 평가의 설계에서와 유사한 방법으로 수행된다. 따라서, 극한 pH 환경에 대한 허용오차, 농축된 공급원료, 냉각 및 가열, 방해 추가 물질, 및 다른 바람직한 허용오차가 산업용 효소 및 다른 활성 물질을 위하여 개발될 수 있다. 상기의 약제 개발 부분에서 기술한 바와 같이, TMR을 이용한 작은 분자 검출을 위한 본 발명 필름의 성능 또한 산업 및 환경적 용도에서 사용할 때 훌륭해진다. 이러한 목적으로 사용될 TMR중 두드러진 것은 후각 TMR이다. 이는 작은 취기제 분자와 결합할 수 있고 환경 감지기로서 다른 것들 중에서 중요한 용도를 갖는다.

환경적인 분석 등에 있어서, 산업적 공정 제어 용도, 경고 및 안전 시스템에 대하여 분석물의 농도를 측정하기 위한 화학적 감지기의 필요성은 크다. 가스 크로마토그래피-질량 분광법과 같은 종래의 화학적 분석은 분석적 선회 시간, 고비용, 영역 이용을 위한 비실용적인 장치 및 기술적 숙련자에 대한 필요성으로 인하여 현지 조사 분석에 있어 도움이 되지 않는다. 따라서, 현지 조사 분석에 있어서 유용할 수 있는 감지기는, 분석물과 결합할 때, 화학적으로 민감하고 검사 분석물과 특별하게 결합할 수 있는 물질 및 간단하고, 사용자에게 용이한 검출 방법이 필요하게 된다. 오염물질을 위한 공공수 공급(예를 들어, 수영장, 음료수, 폐수 스트림)의 인-라인 모니터링을 개선시킬 수 있다.

<실시예 1>

인플루엔자 바이러스를 검출하기 위한 중합체 필름의 제조

이 실시예에서는 인플루엔자 바이러스 검출에 적절한 중합체 필름의 제조에 이용된 과정을 예시한다.

도 1에 나타낸, 옥타데실트리클로로실란(OTS)의 자가-결합 분자막 및 관능화된 폴리디아세틸렌의 분자막으로 구성된 중합된 복층 어셈블리를 제조하였다.

탄수화물 리간드 검출기가 복층의 표면에 존재하는 필름을 개량된 LB 기술에 의하여 제조하였다. 도 3에 나타낸 2 내지 5 % 글리코리피드 단량체 (13) 혼합물 및 매트릭스 지질 단량체 (11)을 표준 LB를 통하여 수표면상에 살포하였다.

매트릭스 지질은 시알로사이드 지질을 균일하게 분산시켜, 바이러스의 최적 결합을 허용하였다. 1 내지 5 %의 시알로사이드 지질 바이러스와 중합된 리포좀과의 최적 결합을 제공한다. 두 가지 성분의 이상적인 혼합을 랑그뮈어(Langmuir) 등온선의 분석에 의하여 측정하였다. 단량체 (11)과 (13)의 다양한 비율이, 혼화성에 대하여 예상된 바와 같이, 제한된 영역 및 붕괴 압력이 (2)의 몰분획에 대한 직접적인 비율로 변화하는 등온선을 나타내었다. 혼합된 분자막을 압축하고 수표면상에서 중합하였다.

부유된 중합 필름을 OTS의 자가-결합 분자막으로 코팅하기 전에 수평 접촉 방법에 의하여 글래스 슬라이드로 이송하였다. 생성된 복층 어셈블리는 표면에 탄수화물 리간드의 정렬을 나타낸다. 시알로사이드 지질 (13)중의 테트라에틸렌 글리콜 간극제는 매트릭스 지질 (11)의 카르복실산 상부기 아래의 탄수화물 리간드를 확장시키는 역할을 한다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 이러한 방식으로 제조한 필름은 격자 편광자를 사용하는 광학 현미경에 의하여 확인된 바와 같이 거시적인 범위(50 내지 150 μM)에 걸쳐 고도의 정돈을 나타낸다. 이 필름은 각-분석 X-선 광전자 분광법(XPS) 및 비색계에 의하여 추가로 특징지워진다. XPS는 상부기의 아미드 질소 원자 및 카르보닐 탄소 원자가 지질 사슬의 메틸렌 탄소와 관련된 표면에 위치한다는 사실을 지시하고, 시알로사이드 검출기가 필름의 표면에 존재한다는 사실을 나타낸다. HF-처리 실리콘상에 코팅된 폴리디아세틸렌 분자막의 비색계 분석은 분자 모델링을 기준으로 예상한 값과 일치하게 ∼40 Å의 필름 두께를 지시한다. 복층 어셈블리는 620 nm의 최대 가시광선 흡수 및 청색 필름으로 나타난다.

<실시예 2>

인플루엔자 바이러스 결합의 정성적 검출

이 실시예에서는 인플루엔자 바이러스와 실시예 1의 중합체 결합의 검출을 예시한다.

실시예 1에서 얻은 필름을 pH 4의 X31 포스페이트-완충 살린(PBS) 완충액 중에서 인플루엔자 A 바이러스로 배양하고, 표면상의 바이러스성 적혈구 응집소와 시알산 잔사의 결합으로 청색에서 적색으로의 전이가 발생하였다.

도 (2)B는 바이러스 존재의 정성적 평가를 위하여 맨눈으로 손쉽게 볼 수 있는, 유리 현미경 슬라이드상에 지지된 필름의 비색계 반응을 나타낸다. 좌측(청색)상의 필름을 PBS 바탕 용액에 노출시켰다. 우측(적색)의 필름을 바이러스 100 HAUs(CR = 77 %)에 노출시켰다. ∼15 %의 비색계 반응을 시각적으로 발견하였다. 청색 필름을 PBS 완충제 바탕 용액으로 배양하였을 때는 아무런 색변화도 발견할 수 없었다. 이는 열 아닐링(열변색성)보다 친화적 결합(친화변색성)으로부터 발생하는 폴리디아세틸렌 색 전이를 나타내었다.

종래의 연구는 지질 (1)로 구성된 LB 필름, 반응 식 (1)을 나타내고 70 ℃에서 가열될 때 청색에서 적색으로 변화를 겪고, 이는 지질 사슬 용융을 위한 흡열 전이에 상응한다. 지질 사슬 혼란 및 엉킴은 폴리디아세틸렌 주쇄의 효과적인 공액 길이를 감소시킨다. 유사하게, 퓨리어(Fourier) 변형 적외선 및 공명 로만(Roman) 분광법 뿐만 아니라 X-선 데이터는 중합체의 적색 형태의 지질 사슬 팩킹이 청색 형태의 것과 상이하다는 사실을 나타낸다. 따라서, 지질 사슬중의 배위 변화는 중합체 주쇄의 광학 성질에 영향을 미친다. 바이러스성 적혈구 응집소와 시알로사이드 복층 어셈블리의 결합은 열 아닐링과 유사한 방식 중에서 지질 사슬 배위에 영향을 미치는 듯하다.

실시예 3

인플루엔자 바이러스 결합의 정량적 검출

이 실시예는 본 발명의 중합성 필름에 인플루엔자 바이러스 결합의 정량적 검출을 설명한다.

시각적 정밀 검사에 의한 정량적 평가 이외에, 색변화의 정도가 표준 가시 흡수 분광법에 의해서 쉽게 정량화된다. 바이러스 인큐베이션 (실선) 전 및 (점선) 후에 이중막 어셈블리의 가시 흡수 분광을 도 4에 나타내었다. 이중막 어셈블리를 PBS 완충액(pH 7.4) 을 함유하는 수정 큐베트 중으로 삽입하고, 흡수 분광을 얻었다. PBS 완충액 (pH 7.4)중의 인플루엔자 바이러스의 첨가는 30 분 인큐베이션 후에 착색 전이를 일으켰다. 필름 색이 바이러스에 노출, 30 분 후 수 초 내에 변화하기 시작했지만, 교반하지 않은 용액 중에서 플래토우 (plateau) 값에 도달하는데 CR에 있어서 요구되는 평균 시간인 것으로 밝혀졌다. 이들 분광은 50 %의 CR이다.

바이러스에 노출되기 전, 청색 필름(솔리드 라인)은 620 nm에서 최대의 강한 흡수력 및 550 nm에서 보다 약한 흡수력을 가졌다. 인플루엔자 바이러스와 하께 인큐베이션 후(대쉬드 라인), 가시 흡수 분광에서 극적 변화가 일어났다. 620 nm에서의 최대 값이 동시 감소하면서 550 nm에서의 최대 값이 증가하였고, 적색 필름을 생성하였다.

주어진 양의 바이러스에 대한 필름 반응을 정량하기 위해서, 바이러스에 노출 전 필름의 가시 분광을 하기 등식 1로서 분석하였다.

등식 1. B_o=I₆₂₀/(I₅₅₀+ I₆₂₀)

(여기서, B_o는 550 nm 및 620 nm에서의 흡수 강도의 총합으로 나눈 620 nm에서의 흡수 강도로서 정의된다)

인플루엔자에 노출 후, 등식은 하기와 같았다.

등식 2. B_v=I₆₂₀/(I₅₅₀+ I₆₂₀)

(여기서, B_v는 바이러스와 함께 인큐베이션 후 흡수 강도의 새로운 비를 나타낸다)

필름의 비색 반응(CR)은 바이러스에 노출 시에 B의 백분율 변화로서 정의된다.

등식 3. CR=[(B_o-B_v)/B_o]·100 %

비색 반응은 적혈구 응집 단위(HAU)로 측정된 인플루엔자 바이러스의 양에 직접 비례하였고, HAU는 표준 적혈구 현탁액을 완전히 응집시키는 스톡 바이러스의 가장 높은 희석으로서 정의된다).

도 5는 시알로사이드 이중막 어셈블리의 비색 반응 대 인플루엔자 바이러스 연속적 첨가의 플롯을 나타낸다. 2 % 시알로사이드 지질 13을 함유하는 청색 필름(도 3) 및 98 % 매트릭스 지질 (도 3)을 PBS 완충액 중에서 30 분 동안 예비 인큐베이션한 후, X31 인플루엔자 A 바이러스의 연속적인 분취량을 가하였다. 바이러스의 각 첨가 후, 필름을 30 분 동안 인큐베이션하고, 가시 흡수 분광을 기록하였다. CR은 등식 3에 따라서 계산하였다. 처음 6 개 데이터 지점의 선회귀 분석은 0.93 %의 기울기(r²=0.985)를 나타내었다.

∼80 HAU에서 비색 반응의 포화가 일어났다. 적색 필름을 완충액 블랭크(바이러스를 포함하지 않음)와 함께 1 시간 동안 인큐베이션하는 것으로 청색의 회복은 일어나지 않았다. 따라서, 색변화를 일으키는 구조적인 변화는 이러한 조건하에서 비가역적인 것으로 보인다.

실시예 4

인플루엔자 바이러스 특이 검출을 위한 경쟁 억제 분석

이 실시예는 경쟁 억제 분석에서 본 발명의 유용성을 설명한다.

인플루엔자 바이러스와 시알로사이드 필름 표면간의 상호 작용의 특이 성질이 경쟁 억제 분석에 의해서 확립되었다. 도 6은 바이러스 적혈구 응집소에 결합하는 화합물에 의해서 필름의 CR이 억제될 수 있다는 것을 보였다. 시알로사이드 이중막 어셈블리를 32 HAU의 인플루엔자 바이러스와 함께 인큐베이션하면 22.6 %의 비색 반응을 나타낸다. 그러나, 17.3 mM 농도의 화합물 17(K_d=2 mM)(도 6, 칼럼 4)의 존재에서 동일한 농도의 바이러스는 경쟁 억제로 인하여 CR을 0.5 % 미만으로 완전히 억제하였다. 바이러스 적혈구 응집소에 결합하는데 경쟁하지 않는 17.3 mM 농도(도 6, 칼럼 5)의 화합물 19 (K_d> 50 mM) 또는 화합물 21(도 6, 칼럼 6)의 존재에서 CR은 감소되지 않았다. 인플루엔자 적혈구 응집화의 공지된 억제(화합물 17은 도 3 참조)는 표준 적혈구 응집화 억제 분석 (HAI)에 의해서 결정된 해리 상수 (2 mM의 K_d)를 갖는다. 시알로사이드 이중막 어셈블리를 인플루엔자 바이러스와 함께 공지된 결합 억제자 17의 존재 하에서 인큐베이션 하면, CR(CR < 0.5 %)은 이루어지지 않고, 필름은 청색으로 남았다. 이 결과로서 억제자가 시알로사이드 표면과 바이러스에 결합하기 위해서 효과적으로 경쟁한다는 것을 입증하였다. 청색 필름이 논(non)억제자 존재 하에 동량의 인플루엔자에 노출되었을 때(도 3, 화합물 19, K_d> 50 mM, 또는 글루코오스, 화합물 21), 색변화는 단독 인플루엔자에 노출된 필름과 동일하였다.

억제자에 대한 K_d값을 예상하는 필름의 특성을 시험하기 위해서, 일련의 억제자 농도에 대한 CR을 측정하였다. CR은 억제자 17의 농도가 감소됨에 따라 선형으로 증가(r²=0.995)하였다. CR=0 %에 대한 이러한 플롯의 외삽법(extrapolation)으로 표면에 바이러스가 결합하는 것을 완전히 억제하는 억제자 농도를 얻었다. 이 값은 시알로사이드 표면과 효과적으로 경쟁하는데 요구되는 최소 억제자 농도를 나타낸다. 얻어진 값, 바이러스 4 HAU 당 2.5 ± 0.83 mM은 핵자기 공명 분광법에 의해서 얻어진 2.8 ± 0.30 mM 및 표준 HAI 분석에 의해 얻어진 2 ± 1.1 mM의 값과 일치한다.

본 명세서에 기재된 발명의 억제 분석은 직접적이고 수행하기가 용이하다. 이러한 접근법은 표준 HAI 분석에 사용되는 적혈구 세포에 있어서는 필요로 하지 않는다. 또한, 표준 HAI 분석에서 주관적인 확대 마이크로 리터 플레이트를 정량적인 분광광도법으로 대체한다. 이러한 방법은 신규 후보 약품들에 대한 스크리닝 또는 리간드를 결합시키는데 적용될 수 있다.

실시예 5

비-특이적 부착

이 실시예는 본 발명의 분석을 방해하는 비-특이적 부착이 존재하지 않는다는 것을 설명한다.

비-특이적 부착으로 인한 CR를 평가하기 위해서, 두 개의 실험을 수행하였다. 제1 실험에서는, 유당 지질 (15)을 삽입한 필름(도 3)을 인플루엔자 바이러스와 함께 인큐베이션 하였다. 유당은 적혈구 응집소 렉틴에 대한 리간드가 아니었다. 시알로사이드 필름에서 최대 반응에 해당하는 농도인 바이러스 100 HAU와 함께 인큐베이션한 결과, 단지 적은 효과를 보였다(CR 2 내지 4 %). 제2 실험에서, 시알로사이드 지질 13을 함유하는 필름이 소혈청 알부민의 농축 용액에 노출되었다. 다시, 동일한 적은 CR이 관찰되었다. 이 결과로 필름 표면에의 바이러스 또는 단백질의 비-특이적 부착이 특정 수용체-리간드 결합으로부터 관찰된 극적인 색변화를 생성하지 않는다는 것을 나타내었다.

실시예 6

약품 개발

이 실시예는 약품 개발을 위한 본 발명의 유용성을 설명한다.

중요한 생리학적 조절에 관련되는 것으로 공지된 수용체 및 그의 상호간 결합쌍 (수용체 결합 분자)가 선택된다. 결합쌍이 실시예 1에 따른 발명의 필름 중으로 삽입되었다.

신경전이 및 신경학적 약품 개발의 경우, 예를 들어, 도파민 수용체를 사용하였다. 인플루엔자와 같은 병원균에 대한 약품 개발의 경우, 예를 들어, 바이러스 적혈구 응집소 수용체를 사용하였다. 필름 중으로 삽입된 결합쌍은 도파민 또는 도파민 동족체, 또는 시알산 또는 시알산 동족체였다. 분석 목표는 생리학적 기능을 수행하는 방식으로 결합 위치와 상호 작용하는 약품을 선택하는 것이었다.

서술된 수용체가 존재하는 경우, 결합쌍을 삽입하는 발명의 멤브레인에 결합을 허용할 때 색변화를 일으켰다.

그 후, 후보 약품들을 계 중에 도입하였다. 약품이 수용체에 결합되거나 결합쌍의 결합 특성을 변화시킨다면, 경쟁 억제로 인하여 본 발명 멤브레인에서 관찰된 색변화에 있어서 동시적인 감소가 있었다. 대조군과 비교하여 시그널에서 감소된 정도를 관찰함으로써, 결합에 영향을 주는 후보 약품의 특성을 정량하였다.

상기 접근법의 변이들이 상이한 계에 맞도록 사용된다. 어떤 경우에는 중합체, 리포좀 또는 멤브레인으로의 삽입과 같이, 수용체를 큰 어셈블리 중에 조직화하는 것이 필요하다. 이러한 배열은 수용체가 결합시에 필름의 변화를 크게 한다. 그러나, 후보 약품이 도입되어 상기와 같이 수용체를 결합할 경우, 관찰된 색변화의 동시적인 감소가 있다.

이 발명에 적용할 수 있는 또다른 변이는 수용체 일부를 필름에 부착하는 것을 요구한다. 공지된 수용체는 하나 이상 지점의 필름에 공유적으로 부착된다. 필름 중합 전(결합쌍에 대한 상기 실시예에서와 같이) 또는 필름이 필름 표면 변형을 통하여 중합된 후, 수용체를 단량체에 부착시킴으로써 이를 달성할 수 있다. 그 후, 결합쌍은 고정된 수용체와 상호 작용하여 필름을 일그러뜨리며 색변화를 일으킨다. 이러한 방식으로, 시험 후보들을 수용체와 함께 직접 스크리닝 함으로써, 상기 변이에서와 같이, 색변화 없음보다 오히려 포지티브 필름 반응을 생성할 수 있다.

실시예 7

일반화된 접근법

이 실시예는 본 발명의 일반적인 유용성을 설명한다.

일반 필름은 결합쌍이 일정하게 유지되는 곳에서 제조되고, 중간체 결합쌍이 변하여 부속적인 새로운 결합쌍을 수용한다.

그의 표면상에 비오틴을 갖는 필름은 단백질 스트렙타비딘을 결합한다. 이 단백질은 4가이므로, 그의 결합 상태에서, 여전히 하나 이상의 비오틴 결합에 유용한 위치가 있다. 신규 결합쌍은 비오틴과 함께 유도되어 그들 스스로 스트렙타비딘 단백질의 중간 조절의 통하여 필름 표면에 부착된다. 단지 하나의 비오티닐화 필름이 제조되고, 스트렙다비딘과 함께 샌드위치 형태로 비오티닐화 시험 결합쌍을 제조하였다. 시험 수용체에 이러한 어셈블리의 노출은 바람직한 색변화를 일으킨다. 상기 실시예에서와 같이, 경쟁 분석을 수행하여 신규 후보 약품들을 확인하였다.

실시예 8

유기 소분자의 포획 및 검출

이 실시예는 특이적으로 유기 소분자를 포획하는 신규 종류의 기능적 물질의 개발을 나타내고, 시각적으로 인지 가능한 비색 변화에 의한 포획 사건을 보고한다. 이러한 물질은 대기 또는 물 흐름에서 용매 또는 기타 독성 오염물과 같은 화합물의 존재를 검출하는 단순 색-기재의 센서 장치로서 작용한다.

제1 단계는 2급 메틸기를 배향기 중에 도입함으로써 반응식 1에서 나타낸, 화합물 1 및 2의 지질 디아세틸렌 동족체의 합성과 관련된다. 펜타코사디이노산 3 (PDA)의 에난티오머성 순수 에스테르를 과산화 몰리브덴 산화를 경유하여 수산화하여 알코올 4를 얻는다. 디아스테리오머를 분리하고, 에스테르를 가수분해하여 키랄 락테이트 동족체 5 및 6을 얻는다. 에틸 에스테르를 생성하고, 그리나드(Grignard) 시약으로 처리하여 목적하는 키랄 지질 동족체 7 및 8을 얻는다. R 기의 변이는 특이적 포획 특성이 재고되는 신규 물질의 광범위한 변화를 초래한다.

단량체-지질 포접 화합물을 정렬하고, 랑그뮈어-블로젯트 필름 장치를 사용하여 물 표면상에 압착시켰다. UV 조사에 의한 단층막의 중합은 청색의 물질을 생산한다. 그들을 소수화 현미경 슬라이드 상으로 올린다. 디옥산 및 1-부탄올을 포획하고, 예상된 색 전이를 수행하는 필름 7 및 8의 특성을 시험하였다. 기술을 일반화할 수 있기 때문에, 1과 2의 적당한 유도체들이 선택되고, 특정 소분자를 특이하게 검출하는 화학 조정법을 결정한다. 지금까지, 물질 1과 2가 디옥산 및 1-부탄올 각각에 대하여 높은 선택도를 가지는 이유에 대하여 알려진 바가 없다. 일련의 화합물을 시험함으로써, 어떤 용매가 가장 적당한 화합물을 생성하지를 결정하는데 비색 검출 기술을 사용함으로써 여러 용매를 스크리닝 하였다. 컴퓨터 모델링을 사용함으로써, 공동(cavity)을 특정 크기가 되도록 기술 처리하고, 분석물 분자에 결합하는 형태가 되도록 처리하였다. 다양한 표준 표면 기술로 비복합적(uncomplexed) 필름과 복잡한 필름을 충분히 특징짓는다. 이들은 XPS, 오거 (Auger), 리드 Leed), 에립소메트리(ellipsometry), 라만(Raman) 분광기 및 STM이다. 이들 모두는 특정 포접 화합물 특성을 갖는 신규 물질을 합리적으로 고안하기 위해서, 포접 화합물의 구조적 요구 사항을 결정할 수 있게 한다.

실시예 9

말라리아 메로조이테스(Merozoites)의 검출

이 실시예는 말라리아 메로조이테스의 검출을 위한 필름 및 조건을 설명한다.

필름은 시알산을 함유하고, 실시예 1에서 설명된 것들과 동일하게 제조되었다. 필름을 말라리아 메로조이테스의 적혈구 함유 용액에 노출시켰다. 병원균에 밤새 노출시킨 후, 필름은 분홍색이 되었다. 각 경우의 비색 반응(CR)은 거의 100 % 이었다.

병원균	수용체 분자
HIV	D4"; 혈관 작용 장 펩티드, 펩티드 T, 시알산11
바시니아(Vaccinia)	상피 성장 인자1
라블레스(Rables)	아세틸콜린 수용체1
엡스테인 바아(Epstein Barr)	상보 수용체
레오(Rheo)	베타-아드레날린 수용체3
리모(Rhino)바이러스	ICAM-14,10,11;N-CAM, 미엘린-관계 글리코단백질 MAb
폴리오(Polio) 바이러스	폴리오 비루스 수용체4
임플루엔자	시알산
사이토메갈로(Cytomegalo)바이러스	글리코단백질(시알산 아님)11,11,11
코로나(Corona)바이러스	9-OAC 시알산 & 시알산
엔세팔로미엘리티스(Encephalomyelitis)	9-OAC 시알산
루벨라(Rubella) 바이러스	---------------------"
메아슬레스(Measles) 바이러스	글리코단백질(시알산 아님)11,11,11
헤르페스	올리고사카리오스 글리코단백질30.33.34,35
클라마이디아(Chlamydia)	시알산30,31,32,33
리노(Rhino)바이러스	글리코실화 단백질31,32
로타(Rota)바이러스	9-OAC 시알산
폴리마(Polyma)바이러스	시알산
레노(Reo)바이러스	시알산
스트렙토코코스 술스(Streptococos Suls)	시알산 2→3 폴리-N-아세틸락토사민
살모넬라	시알산
타이피무리움(Typhimurium)
파라마이소(Pharamyxo)바이러스
센디(Sendi) 바이러스	시알산
뭄프스(Mumps)	시알산
네우캐스틀(Newcastle)	시알산
질병 바이러스
마이소(Myxo)바이러스	시알산
에스케리치아 콜리(Escherichia Coli)	올리고만노스, 갈락토스 1→4 갈락토오스, 시알산 2→3 갈락토오스
엔세팔로마이오카르디티스 (Encephallocarditis)바이러스	시알산
콜레라 독소	G(A 시알산의 강글리오시알, 갈락토오스, 글루코오스, N-아세틸 갈락토오스
메닌기티스(Meningitis)	시알산

Claims (38)

1. a) 분석물에 대한 경쟁적 결합제로서 분석물에 대한 직접적인 친화도 또는 작용성을 갖는 검출기를 포함하는 리간드;

   b) 그의 제1 말단에서 상기 리간드에 부착된, 두 개의 말단을 갖는 선형 구조의 링커;

   c) 상기 구조의 링커가 그의 제2 말단에서 결합된 공액 중합체 주쇄;

   d) 상기 구조의 링커에 의해 점유되지 않은 위치에서 상기 공액 중합체 주쇄의 표면에 결합된 배향기; 및

   e) 지지 구조체로 이루어지며, 표적 분석물이 리간드에 결합될 때 검출 가능한 분광 특성 변형이 일어나는, 분석물의 존재를 직접적으로 검출하기 위한 중합된 이중층 필름.
2. 제1항에 있어서, 상기 분석물이 생의학적 물질, 병원체, 약물 또는 공업 물질인 필름.
3. 제2항에 있어서, 상기 생의학적 물질이 병원체 및 이들에 의해 감염된 세포, 약물, 호르몬, 혈액 성분, 질병 지시제, 세포 성분, 항체, 렉틴, 효소, 유전 물질, 및 이들의 대사성 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 필름.
4. 제2항에 있어서, 상기 병원체가 바이러스, 박테리아, 기생충 및 기타 병원균으로부터 선택되는 것인 필름.
5. 제4항에 있어서, 상기 바이러스가 인플루엔자, 감기, 풍진, 수두, 간염 A, 간염 B, 단순 포진, 소아마비, 천연두, 페스트, HIV, 우두, 광견병, 엡스타인 바, 레오바이러스, 코감기 바이러스, 및 이들의 돌연변이, 바이러스체 및(또는) 리간드 인식성 부분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 필름.
6. 제4항에 있어서, 상기 박테리아가 대장균, 결핵, 살모넬라, 연쇄상구균, 및 이들의 돌연변이, 균주 및 분해 부분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 필름.
7. 제4항에 있어서, 상기 기생충 및 기타 병원체가 말라리아, 뇌염, 사상충증맹, 및 주혈원충병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 필름.
8. 제1항에 있어서, 상기 리간드가 병원체 분석물의 검출을 위해 제공되는 필름.
9. 제8항에 있어서, 상기 분석물이 바이러스인 필름.
10. 제8항에 있어서, 상기 리간드가 우두 분석물용 상피 성장 인자, 광견병 분석물용 아세틸콜린 수용체, 엡스타인 바 분석물용 상보성 수용체, 레오바이러스 분석물용 베타-아드레날린 수용체, 코감기 바이러스 분석물용 ICAM-1, 소아마비 바이러스 분석물용 소아마비 바이러스 수용체, 콜레라 독소 분석물용 트리사카라이드, 호중구 분석물용 테트라사카라이드, 및 분석물과 결합 가능한 그의 유도체 및 동족체로 이루어진 군으로부터 선택된 필름.
11. 제8항에 있어서, 상기 리간드가 코로나 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 뇌척수염 바이러스, 클라미디아, 센디 (sendi) 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 뉴캐슬 질병 병원체, 믹소바이러스, 뇌심근염 바이러스, 뇌막염 바이러스, 또는 말라리아 바이러스에 결합하는 시알산 및 그의 유도체 및 동족체인 필름.
12. 제8항에 있어서, 상기 리간드 및 분석물 쌍이 테트라사카라이드 및 호중구, 세포 흡착 펩티드 및 표적 세포, 트리사카라이드 및 박테리아 독소, 또는 트랜스 멤브레인을 통한 수용체 및 호르몬인 필름.
13. 제8항에 있어서, HIV 분석물을 검정하기 위해 제공된 리간드가 CD4, sCD4, CD26, 혈관작용성 장 펩티드, 펩티드 T, 시알산, 및 HIV와 결합 가능한 그의 유도체 및 동족체로 이루어진 군으로부터 선택된 필름.
14. 제1항에 있어서, 상기 중합체가 중합성 지질 단량체로 이루어지는 필름.
15. 제14항에 있어서, 상기 단량체가 아세틸렌, 디아세틸렌, 알켄, 티오펜, 이미드, 아크릴아미드, 메타크릴레이트, 비닐에테르, 말산 무수물, 우레탄, 알릴아민, 실록산, 아닐린, 피롤 및 비닐피리디늄으로 이루어진 군으로부터 선택되는 필름.
16. 제15항에 있어서, 상기 중합체 주쇄가 디아세틸렌 단량체로 구성되는 필름.
17. 제1항에 있어서, 상기 배향성 헤드 기가 수소 결합을 상호 형성할 수 있는 친수성기인 필름.
18. 제17항에 있어서, 상기 배향성 헤드 기가 -CH₂OH, -CH₂OCONHPh, -CH₂OCONHEt, -CH₂CH(Et)OCONHPh, -(CH₂)₉OH, -CH₂OCOPh, -CH₂OCONHMe, -CH₂OTs, -CH(OH)Me;

    -CH₂OCOR₂(R₂는 n-C₅H₁₁, n-C₇H₁₅, n-C₉H₁₉, n-C₁₁H₂₃, n-C₁₃H₂₇, n-C₁₅H₃₁, n-C₁₇H₃₅, Ph, PhO, 또는 o-(HO₂C)C₆H₆임);

    -OSO₂R₂(R₂는 Ph, p-MeC₆H₄, p-FC₆H₄, p-ClC₆H₄, p-BrC₆H₄, p-MeOC₆H₄, m-CF₃C₆H₄, 2-C₁₀H₇또는 Me임);

    -CO₂M (M은 K, HNA 또는 Ba/2임); 또는

    -CH₂OCONHR₂또는 -CH₂CONHR₂(R₂는 Et, n-Bu, n-C₆H₁₃, n-C₈H₁₇, n-C₁₂H₂₅, 시클로-C₆H₁₁, Ph, p-MeC₆H₄, m-MeC₆H₄, o-ClC₆H₄, m-ClC₆H₄, p-ClC₆H₄, o-MeOC₆H₄, 3-티에닐, Me, Et, Ph, 1-C₁₀H₇, Et, Ph, EtOCOCH₂, BuOCOCH₂, Me, Et, i-Pr, n-C₆H₁₃, EtOCOCH₂, BuOCOCH₂, Ph, 2,4(NO₂)₂C₆H₃OCH₂, CH₂CH₂OH임)로 이루어진 군으로부터 선택된 필름.
19. 제17항에 있어서, 상기 배향성 헤드 기가 카르복실산인 필름.
20. 제1항에 있어서, 단량체의 배향기가 CH₃-, CH₃O-, 네오-C₅H₁₁O-, 시클로-C₆H₁₁O-, PhCH₂O-, p-AcC₆H₄O-, p-BzC₆H₄O-, o-BrC₆H₄COCH₂O-, p-(PhCH-CHCO)C₆H₄O-, p(PhCOCH=CH)C₆H₄O-, o-BzC₆H₄NH-, p-BzC₆H₄NH-, MeOCH₂CH₂NH-, n-C₆H₁₄NH- 또는 EtO-의 군으로부터 선택된 필름.
21. 제20항에 있어서, 말단이 메틸기인 필름.
22. 제1항에 있어서, 상기 필름이 지지체를 추가로 포함하는 것인 필름.
23. 제22항에 있어서, 상기 지지체가 플라스틱, 운모, 금속, 세라믹, 유리 및 기타 중합체 표면 및 이의 소수성 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 필름.
24. 제23항에 있어서, 상기 지지체가 소수성화된 유리 슬라이드인 필름.
25. 제1항의 필름을 포함하는 용기로 이루어진 테스트 키트.
26. 제25항에 있어서, 오리피스가 구비된 고상 구조체가 분석물 유체를 투과시키지 않는 웰 구조를 제공하기 위하여 필름의 표면 상에 배치된 테스트 키트.
27. 제25항에 있어서, 상기 키트 용기가 테스트 과정의 수행에 관한 지시사항을 포함하는 테스트 키트.
28. 제1항의 필름을 포함하는 분석 장치.
29. 제28항에 있어서, 상기 장치가 자동식 크로마토그래피 판독 성분을 구비한 것인 분석 장치.
30. 제29항에 있어서, 상기 장치가 유동 스트림 또는 일련의 샘플을 연속적으로 판독하도록 자동식 샘플 처리 성분을 구비한 것인 분석 장치.
31. a) 수용체 결합 리간드를 선형 구조체 단위의 제1 말단에 결합시키는 단계;

    b) 단량체를 선형 구조체 단위의 제2 말단에 결합시켜 단량체-선형 구조체 단위 리간드 잔기를 형성하는 단계;

    c) 배향성 헤드 기를 단량체에 결합시켜 배향성 헤드 기-단량체 잔기를 형성하는 단계;

    d) 상기 단량체-선형 구조체 단위-리간드 잔기를 다수의 배향성 헤드 기-단량체 잔기와 혼합하는 단계;

    e) 단계 (d)의 혼합물을 표면 상에 분포시키는 단계; 및

    f) 상기 분포된 혼합물을 중합하는 단계를 포함하는, 제1항의 중합된 이중층 분석 필름의 제조 방법.
32. 제31항에 있어서, 중합된 혼합물을 지지체로 이동시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
33. 제31항에 있어서, 단계 (e) 후에, 상기 분포된 혼합물을 압착하는 방법.
34. 제31항에 있어서, 단계 (d) 후에, 상기 혼합물을 수면 상에 분포시키는 방법.
35. a) 제1항의 중합된 이중층 분석 필름을 분석물을 함유하는 샘플과 접촉시키는 단계; 및

    b) 필름을 그의 광학 특성 변화에 대해 평가하는 단계를 포함하는, 분석물의 직접 검출 방법.
36. 제35항에 있어서, 관찰된 광학 특성이 색변화인 방법.
37. 제36항에 있어서, 상기 색변화가 청색에서 적색으로 변화하는 것인 방법.
38. 제37항에 있어서, 상기 색변화가 620 ㎚ 내지 550 ㎚의 파장에서 검출되는 방법.