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WO2010125932A1 - 融合タンパク質含有集合体、その製造方法及び該集合体を用いたアッセイ法 - Google Patents

融合タンパク質含有集合体、その製造方法及び該集合体を用いたアッセイ法 Download PDF

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WO2010125932A1
WO2010125932A1 PCT/JP2010/056843 JP2010056843W WO2010125932A1 WO 2010125932 A1 WO2010125932 A1 WO 2010125932A1 JP 2010056843 W JP2010056843 W JP 2010056843W WO 2010125932 A1 WO2010125932 A1 WO 2010125932A1
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WO
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protein
fluorescent dye
enzyme
fusion protein
target
Prior art date
Application number
PCT/JP2010/056843
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English (en)
French (fr)
Inventor
法明 山本
Original Assignee
コニカミノルタホールディングス株式会社
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Publication date
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Priority to JP2011511368A priority Critical patent/JP5660035B2/ja
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    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to an aggregate mainly composed of proteins, a production method thereof, and an assay method using the aggregate. More specifically, the present invention relates to a fusion protein-containing assembly comprising two types of proteins specifically associated with an analyte and a fluorescent dye or enzyme, a method for producing the same, and surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS; Surface). The present invention relates to an assay method using the aggregate based on the principle of Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy).
  • SPFS surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy
  • irradiation is performed by generating a dense wave (surface plasmon) on the surface of the metal thin film under the condition that the irradiated laser light is attenuated by total reflection (ATR) on the gold thin film surface.
  • ATR total reflection
  • the amount of photons in the laser beam is increased to several tens to several hundreds times (the electric field enhancement effect of surface plasmons), and by this, the fluorescent dye in the vicinity of the gold thin film is efficiently excited. It is a method that can detect an analyte.
  • Patent Document 1 discloses that a ligand (primary antibody) immobilization film using carboxymethyldextran is arranged on the surface of a metal substrate, and surface plasmon is used. A method of detecting a fluorescent dye associated with an antigen with an enhanced electric field is shown.
  • Patent Document 1 since the method described in Patent Document 1 is a so-called heterogeneous reaction system that uses an antibody immobilized on a substrate, the amount and degree of freedom of immobilization of the antibody are limited, and the efficiency of the antigen-antibody reaction There was a problem of low.
  • Patent Document 2 discloses a method in which an antibody against an antigen held by blood cells or the like is used to agglutinate the blood cells, trap them with a filter, and detect them.
  • Patent Document 2 is a method of aggregating relatively large cells such as blood cells in which the target substance holds the same epitope, and has no versatility for molecules such as proteins and nucleic acids. Furthermore, after trapping the aggregate with a filter, it is necessary to further react the fluorescent substance and the chemiluminescent substance, and the operation is complicated although the sensitivity is low.
  • the present invention has been made in view of the above problems and situations, and the problem to be solved is an assay method that is highly sensitive, highly accurate, and dramatically improved in rapidity, and a fusion protein-containing assembly used in the assay method. It is to provide a body and a method for producing the assembly.
  • the present inventors have found that a protein (A) specific to the site ⁇ of the analyte and a protein (B) specific to the site ⁇ of the analyte having the site ⁇ . ) And a fluorescent protein or enzyme-containing assembly comprising a fluorescent dye or enzyme was used in a sandwich immunoassay method using SPFS, and the rapidity and sensitivity were dramatically improved, and the present invention was completed.
  • at least a fusion protein comprising two or more proteins (B) and a fluorescent dye or enzyme or A fusion protein comprising a total of two or more proteins (A) that specifically associate with one or more site ⁇ possessed by a target substance, target virus or target cell, and a fluorescent dye or enzyme, and a target material having the site ⁇
  • a fusion protein-containing assembly comprising at least a total of two or more proteins (B) that specifically associate with one or more sites ⁇ of a target virus or target cell and a fusion protein containing a fluorescent dye or an enzyme body.
  • Biotin is immobilized on each of the proteins (A) and (B), and a fluorescent dye or enzyme is immobilized on at least one of the protein (A), protein (B), biotin, and avidin, and the fusion protein
  • each of the proteins (A) and (B) is an antibody, a Fab fragment, a Fab ′ fragment or a F (ab ′) 2 fragment. body.
  • the proteins (A) and (B) are both antibodies, and the fluorescent dye or enzyme is immobilized only on the antibody, protein A, protein G or protein A / G alone, Alternatively, the antibody is immobilized on protein A, protein G, or protein A / G, and the fusion protein comprises a total of 2 to 5 of the proteins (A) and (B) and protein A, protein G, or protein A.
  • the fusion protein-containing assembly according to any one of items 1 to 3, wherein / G is included.
  • fusion protein-containing assembly according to any one of items 1 to 5, wherein the enzyme is alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, or glucose oxidase.
  • a method for producing a fusion protein-containing assembly comprising the following steps (a), (b) and (c): Step (a): a protein (A) that specifically associates with one or more sites ⁇ of the target substance, target virus, or target cell, and one or more sites ⁇ of the target substance, target virus, or target cell having the site ⁇ Immobilizing a fluorescent dye or enzyme on at least one of a protein consisting of a protein (B) that specifically associates with biotin, biotin and avidin; Step (b): Biotin by immobilizing biotin to which the fluorescent dye or enzyme may be immobilized on each of the proteins (A) and (B) to which the fluorescent dye or enzyme may be immobilized.
  • each of the proteins (A) and (B) is an antibody, a Fab fragment, a Fab ′ fragment, or a F (ab ′) 2 fragment.
  • Item 9 The method for producing a fusion protein-containing assembly according to Item 7 or 8, comprising at least one of steps (d) and (e) below and (f).
  • Item 10 The method for producing a fusion protein-containing assembly according to any one of Items 7 to 10 above, wherein the enzyme is alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, or glucose oxidase. .
  • An assay method comprising the following steps (g) to (l); Step (g): A target substance, target virus or target cell contained in the specimen by bringing the fusion protein-containing assembly according to any one of paragraphs 1 to 6 and the specimen into contact with each other.
  • Forming an aggregate via Step (h): a step of isolating only the aggregate by passing the reaction product obtained through the step (g) through a filter, Step (i): a step of reacting the aggregate obtained through the step (h) with a fluorescent substrate or a quencher substrate to produce a fluorescent dye (E) or a quencher, respectively (however, the above step (g) , Only when a fusion protein-containing assembly comprising the enzyme according to any one of claims 1 to 6 is used).
  • the metal thin film is formed of at least one metal selected from the group consisting of gold, silver, aluminum, copper, and platinum.
  • Item 16 The assay method according to any one of Items 12 to 15, wherein the dielectric includes silicon dioxide (SiO 4 ) or titanium dioxide (TiO 2 ).
  • the assembly of the present invention When the assembly of the present invention is used in an assay method, (1) since it is not necessary to immobilize an antibody or the like on the sensor base for SPFS measurement, there is a problem related to the amount of immobilized antibody and the nonspecificity to the sensor base. (2) The reaction efficiency is improved because the immune reaction field is a liquid-liquid system, and (3) the immune reaction field and the SPFS detection field can be completely separated. Immune reaction conditions and detection conditions can be optimized, and it is difficult to be influenced by scattering noise. (4) A homogeneous and extremely efficient antibody-antigen reaction can be realized.
  • FIG. 1 Schematic diagram of an embodiment of a fusion protein (I) containing a fluorescent dye
  • FIG. 1 Schematic diagram of one embodiment of fusion protein (I) containing an enzyme
  • FIG. 1 Schematic diagram of one embodiment of a fusion protein (II) containing a fluorescent dye
  • FIG. 1 Schematic diagram of an embodiment of a fusion protein (I) containing an enzyme
  • FIG. 1 Schematic diagram of an embodiment of a fusion protein (I) containing an enzyme
  • the fluorescent substrate 13 is hydrolyzed by the enzyme 3b fix
  • the fusion protein-containing assembly of the present invention comprises a protein (A) that specifically associates with one or more sites ⁇ possessed by a target substance, target virus, or target cell, and a target substance, target virus, or target cell having the site ⁇ .
  • a fusion protein comprising a total of two or more proteins (B) that specifically associate with one or more sites ⁇ and a fluorescent dye or enzyme, or
  • a fusion protein comprising a total of two or more proteins (A) that specifically associate with one or more site ⁇ possessed by a target substance, target virus or target cell, and a fluorescent dye or enzyme, and a target material having the site ⁇ , It is characterized by containing at least a total of two or more proteins (B) that specifically associate with one or more sites ⁇ of the target virus or target cell and a fusion protein containing a fluorescent dye or an enzyme.
  • the fusion protein-containing assembly of the present invention comprises a protein (A) that specifically associates with a target substance, a target virus, or a target cell that has at least one site ⁇ , and a target substance, target virus, or An assembly comprising a fusion protein comprising a total of at least one of at least one protein (B) that specifically associates with one or more sites ⁇ of a target cell and a fluorescent dye or enzyme, wherein the protein (A) And (B) each having one or more.
  • the “enzyme” according to the present invention is an enzyme that catalyzes a reaction for converting a “fluorescent substrate” into a “fluorescent dye”, or a “quencher substrate” is a “quenching agent”. It is characterized by using an enzyme that catalyzes a reaction for conversion to.
  • biotin is immobilized on the protein, and a fluorescent dye or enzyme is immobilized on at least one of the protein, biotin and avidin, and the fusion
  • the protein preferably contains a total of four of the proteins (A) and (B) and one avidin, and in particular, each of the proteins (A) and (B) is an antibody, Fab fragment, Fab ′ fragment or F Preferably it is an (ab ′) 2 fragment.
  • the proteins (A) and (B) are both antibodies, and the fluorescent dye or enzyme is immobilized only on the antibody, or only on protein A, protein G, or protein A / G.
  • the antibody and protein A, protein G, or protein A / G are immobilized, and the fusion protein comprises a total of 2 to 5 of the proteins (A) and (B) and protein A, protein G or protein It is also preferable that A / G is included.
  • the parts ⁇ and ⁇ may be the same.
  • the enzyme is preferably alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase or glucose oxidase.
  • the method for producing a fusion protein-containing assembly of the present invention includes the steps (a), (b) and (c).
  • each of the proteins (A) and (B) is preferably an antibody, a Fab fragment, a Fab ′ fragment or a F (ab ′) 2 fragment.
  • the method for producing a fusion protein-containing assembly of the present invention is characterized by including at least one of steps (d) and (e) and (f).
  • the sites ⁇ and ⁇ may be the same.
  • the enzyme is preferably alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase or glucose oxidase.
  • the assay method of the present invention is characterized by including the following steps (g) to (l).
  • the immune reaction field in steps (g) and (h) and the SPFS detection field in steps (j) and (k) are independent of each other.
  • the metal thin film is preferably formed of at least one metal selected from the group consisting of gold, silver, aluminum, copper and platinum, and the metal is more preferably made of gold.
  • the dielectric preferably includes silicon dioxide (SiO 4 ) or titanium dioxide (TiO 2 ).
  • the fusion protein-containing assembly of the present invention comprises a protein (A) that specifically associates with one or more sites ⁇ possessed by a target substance, target virus, or target cell, and a target substance, target virus, or target cell having the site ⁇ .
  • At least a fusion protein comprising a total of two or more proteins (B) that specifically associate with one or more sites ⁇ and a fluorescent dye or enzyme, or A fusion protein comprising a total of two or more proteins (A) that specifically associate with one or more site ⁇ possessed by a target substance, target virus or target cell, and a fluorescent dye or enzyme, and a target material having the site ⁇ , It is characterized by containing at least a total of two or more proteins (B) that specifically associate with one or more sites ⁇ of the target virus or target cell and a fusion protein containing a fluorescent dye or an enzyme.
  • the aggregate of the present invention includes “a protein (A) that specifically associates with one or more sites ⁇ of target substance, target virus or target cell” and “target substance, target virus or “Assembly” containing “fusion protein” containing at least one of a total of at least one of proteins (B) specifically associated with one or more sites ⁇ of target cells and “fluorescent dye” or “enzyme” And having one or more of each of the proteins (A) and (B).
  • the aggregate of the present invention includes a plurality of such fusion proteins, and a plurality of fusion proteins are formed through a target substance, a target virus, or a target cell. .) Is different.
  • the aggregate of the present invention contains any useful substance that does not inhibit the specific association between the site of the target substance, the target virus or the target cell, and the protein. You may let them.
  • the concentration of the fusion protein contained in the aggregate of the present invention is desirably higher, preferably at least 10 nM, more preferably 100 nM or more, particularly preferably 1 ⁇ M or more.
  • the protein (A) and the protein (B) contained in the aggregate of the present invention are each at least one, preferably 9: 1 to 1: 9, more preferably 8: 2 to 2: 8, still more preferably It is expressed in a ratio of 7: 3 to 3: 7, particularly preferably 6: 4 to 4: 6, and most preferably 5: 5.
  • the total number contained in the aggregate of the protein (A) and the protein (B) is constant.
  • each of “target substance”, “target virus” and “target cell” represents a site where the protein can specifically associate (bind). If there are two or more independently, it may be a non-living substance that is a substance (a chemical substance that is a single substance or a compound) or a virus, or may be a single-celled or multi-cellular organism, and is not particularly limited Absent.
  • target substance examples include nucleic acids (DNA that may be single-stranded or double-stranded, RNA, polynucleotides, oligonucleotides, PNA (peptide nucleic acids), etc., or nucleosides, nucleotides, and their Modified molecules), proteins (polypeptides, oligopeptides, etc.), amino acids (including modified amino acids), carbohydrates (oligosaccharides, polysaccharides, sugar chains, etc.), lipids, or their modified molecules, complexes, etc. These molecules may be molecular fragments. More specifically, it may be a carcinoembryonic antigen such as AFP ( ⁇ -fetoprotein), a tumor marker, a signaling substance, a hormone, or the like, and is not particularly limited.
  • AFP ⁇ -fetoprotein
  • target virus examples include viruses that infect animals such as influenza virus, hepatitis virus, human immunodeficiency virus (HIV), viruses that infect plants, or bacteriophages that infect bacteria. There is no particular limitation.
  • viruses that infect animals such as influenza virus, hepatitis virus, human immunodeficiency virus (HIV), viruses that infect plants, or bacteriophages that infect bacteria.
  • HIV human immunodeficiency virus
  • Target cell refers to a cell derived from, for example, vertebrates and invertebrates including mammals such as humans, plants, algae, fungi, bacteria, and the like. Examples include Mycobacterium tuberculosis containing mycolic acid.
  • the target substance, target virus, or target cell can specifically associate with (combine with) the protein (that is, one or more sites ⁇ and the sites). is one or more sites ⁇ that are completely different from ⁇ .) or the sites ⁇ and ⁇ are the same. Note that “same” includes not only completely identical but also partially identical (partially overlapping).
  • protein (A) specifically associated with one or more sites ⁇ possessed by the target substance, target virus or target cell (hereinafter also simply referred to as “protein (A)”) is as described above.
  • the target substance, target virus, or target cell is not particularly limited as long as it is a protein that specifically associates (bonds) with one or more sites ⁇ , for example, various monoclonal antibodies ( Fab fragment, Fab ′ fragment and F (ab ′) 2 fragment are also included.), MDP1 (Mycobacterial DNA-binding protein 1) and the like.
  • protein includes polypeptides and oligopeptides.
  • a protein (B) that specifically associates with one or more sites ⁇ of the target substance, target virus, or target cell having the site ⁇ (hereinafter also simply referred to as “protein (B)”). ) Is particularly a protein in which the target substance, target virus or target cell as described above has one or more sites ⁇ and one or more sites ⁇ and specifically associates (bonds) via the sites ⁇ . It is not limited, and specific examples include the same kind as the protein (A).
  • the “fluorescent dye” is a general term for substances that emit fluorescence by irradiating with predetermined excitation light or using the electric field effect, and the “fluorescence” refers to various substances such as phosphorescence. Luminescence is also included.
  • the type of the fluorescent dye used in the present invention is not particularly limited as long as it is not quenched due to light absorption by a metal thin film, which will be described later, and may be any known fluorescent dye.
  • fluorescent dyes with large Stokes shifts that allow the use of a fluorometer with a filter rather than a monochromator and also increase the efficiency of detection are preferred.
  • fluorescent dyes examples include fluorescein family fluorescent dyes (Integrated DNA Technologies), polyhalofluorescein family fluorescent dyes (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.), and hexachlorofluorescein family fluorescent dyes. (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.), Coumarin family fluorescent dye (Invitrogen Corp.), Rhodamine family fluorescent dye (GE Healthcare Bioscience Co., Ltd.), Cyanine family fluorescent dye, Indocarbocyanine family fluorescent dyes, oxazine family fluorescent dyes, thiazine family fluorescent dyes, squaraine family fluorescent dyes, chelated lanthanide dyes Millie's fluorescent dye, BODIPY (registered trademark) family fluorescent dye (manufactured by Invitrogen), naphthalenesulfonic acid family fluorescent dye, pyrene family fluorescent dye, triphenylmethane family fluorescent dye, Alexa Fluor (Registered trademark) dye series (manufactured by Invitrogen Corp.) and the
  • Patent Nos. 6,406,297, 6,221,604, 5,994,063 The fluorescent dyes described in US Pat. Nos. 5,808,044, 5,880,287, 5,556,959, and 5,135,717 can also be used in the present invention.
  • Table 1 shows the absorption wavelength (nm) and emission wavelength (nm) of typical fluorescent dyes included in these families.
  • the fluorescent dye is not limited to the organic fluorescent dye.
  • rare earth complex fluorescent dyes such as Eu and Tb can also be used as fluorescent dyes in the present invention.
  • rare earth complexes have a large wavelength difference between an excitation wavelength (about 310 to 340 nm) and an emission wavelength (about 615 nm for an Eu complex and 545 nm for a Tb complex), and a long fluorescence lifetime of several hundred microseconds or more. is there.
  • a commercially available rare earth complex fluorescent dye is ATBTA-Eu 3+ .
  • BFP blue fluorescent protein
  • CFP cyan fluorescent protein
  • GFP green fluorescent protein
  • YFP yellow fluorescent protein
  • DsRed red fluorescent protein
  • APC allophycocyanin
  • Fluorescent fine particles such as latex protein and latex that can be used as the fluorescent dye in the present invention.
  • a fluorescent dye having a maximum fluorescence wavelength in a wavelength region where light absorption by the metal species forming the metal thin film is small when performing fluorescence measurement described later For example, when gold is used as the metal thin film, it is desirable to use a fluorescent dye having a maximum fluorescence wavelength of 600 nm or more in order to minimize the influence of light absorption by gold. Therefore, in this case, it is particularly desirable to use a fluorescent dye having a maximum fluorescence wavelength in the near infrared region, such as Cy5, Alexa Fluor (registered trademark) 647.
  • a fluorescent dye having the maximum fluorescence wavelength in the near-infrared region can minimize the influence of light absorption by iron derived from blood cell components in the blood. Is also useful.
  • a fluorescent dye having a maximum fluorescence wavelength of 400 nm or more it is desirable to use.
  • These fluorescent dyes may be used alone or in combination of two or more.
  • An enzyme (D) that catalyzes a reaction to be converted is used.
  • C examples include alkaline phosphatase (ALP), peroxidase (POD), galactosidase (GAL) and the like.
  • ALP alkaline phosphatase
  • POD peroxidase
  • GAL galactosidase
  • the enzyme (D) can be used as an enzyme reaction (D-1) by activating a “quencher substrate” blocked by a protecting group, activating the quencher by an enzyme reaction, or as an enzyme reaction (D-2).
  • the pH is lowered by a quencher activated by an enzymatic reaction using a specific “quencher substrate”.
  • those used for the enzyme reaction (D-1) include, for example, ⁇ -galactosidase ( ⁇ GAL), ⁇ -glucosidase ( ⁇ Glu), alkaline phosphatase (ALP), and the like.
  • examples of those used in D-2) include glucose oxidase (GOD).
  • fluorescent substrate “fluorescent dye (E)”, “quenching agent substrate” and “quenching agent” will be described later.
  • the fusion protein constituting the aggregate of the present invention contains at least one of protein (A) and protein (B) in total of 2 or more and a fluorescent dye or enzyme, and includes the following fusion proteins (I) and (II) is mentioned as a preferred embodiment.
  • the protein (A) 1 and the protein (B) 2 may be both antibodies, and the fluorescent dye 3a or the enzyme 3b, And biotin 4 are immobilized (not shown, but the fluorescent dye or enzyme can be immobilized on biotin and / or avidin in addition to the antibody.
  • the fluorescent dye or enzyme can be immobilized on the antibody, biotin and avidin. 4), a total of four such proteins (A) 1 and (B) 2 and one avidin 5 are included.
  • the antibody which fusion protein (I) 10 shown in FIG.1 and FIG.2 has two proteins (A) 1 and two proteins (B) 2,
  • this invention is limited to this aspect.
  • an embodiment having only four proteins (A) is also included.
  • avidin includes streptavidin and neutravidin.
  • the protein (A) 1 and the protein (B) 2 are both antibodies, and the fluorescent dye 3a or the enzyme 3b is an Fc fragment of the antibody.
  • the fluorescent dye or enzyme can be immobilized on protein A, protein G or protein A / G in addition to the Fc fragment of the antibody.
  • the fluorescent dye or enzyme Fc fragments of (2) and protein A, protein G or protein A / G may be immobilized simultaneously.
  • Protein (A) 1 and protein (B) 2 in total and protein A6 not shown
  • protein G or protein A / G may be used in addition to protein A.
  • an association which may be a protein (A) and protein (B) is a total of 2 to a 5.
  • And is intended to include.
  • the antibody which fusion protein (II) 11 shown in FIG.3 and FIG.4 has is one protein (A) 1 and protein (B) 2, respectively, this invention is not limited to this aspect, An embodiment comprising only protein (A) 1 is also included.
  • protein A and protein G may be natural or recombinant.
  • the fusion protein having a larger total number of proteins (A) and proteins (B) (that is, a higher concentration) is preferable.
  • the method for producing an aggregate of the present invention has any one of the following production methods (i) to (iv), and the production method (i) comprises the following steps (a), (b) and (c): Manufacturing method (ii) includes the following steps (d), (e) and (f); manufacturing method (iii) includes the following steps (d) and (f); manufacturing method (iv) Includes the following steps (e) and (f).
  • the production method (i) includes the above steps (a), (b) and (c), wherein at least one of protein ((A), (B)), biotin and avidin is a fluorescent dye or This is a method for producing a fusion protein (I) -containing assembly on which an enzyme is immobilized.
  • Each of the proteins (A) and (B) is preferably an antibody (immunoglobulin), Fab fragment, Fab ′ fragment or F (ab ′) fragment.
  • Step (a) includes “a protein (A) that specifically associates with one or more sites ⁇ of target substance, target virus or target cell” (protein (A)), and “target substance having the site ⁇ .
  • a “fluorescent dye” or “enzyme” for at least one of a protein consisting of a protein (B) ”(protein (B)) that specifically associates with one or more sites ⁇ of a target virus or target cell, protein (B) Is a step of immobilizing.
  • Proteins (A) and (B), and “fluorescent dye” and “enzyme” are the same as those described in the item ⁇ Aggregate> above. The same applies to these terms described in the steps (b), (d) and (e).
  • Examples of the method for immobilizing an enzyme on protein ((A) and (B)), biotin and / or avidin include an amine coupling method, a thiol coupling method, an aldehyde coupling method, and the like. The present invention is not limited to these methods.
  • the fluorescent dye or enzyme is immobilized on the protein (A) or (B), when the protein (A) or (B) is an antibody, the fluorescent dye or enzyme is preferably a constant region (C H 1 and C H L ), more preferably immobilized on an Fc fragment, and when the protein (A), (B) is a Fab fragment, Fab ′ fragment or F (ab ′) 2 fragment, the fluorescent dye or enzyme is a constant region (C H 1 and C L ) are preferably immobilized.
  • protein (A), protein (B), biotin and avidin to which a fluorescent dye or enzyme is immobilized are referred to as “fluorescent dye or enzyme-labeled protein (A)”, “fluorescent dye or enzyme-labeled protein ( B) ",” fluorescent dye or enzyme-labeled biotin "and” fluorescent dye or enzyme-labeled avidin ".
  • the step (b) is a “protein (A) that specifically associates with one or more sites ⁇ of the target substance, target virus, or target cell” to which the “fluorescent dye” or “enzyme” may be immobilized. And “fluorescent dye” or “enzyme” is immobilized on each of the “protein (B) specifically associated with one or more sites ⁇ of the target substance, target virus or target cell having the site ⁇ ”
  • This is a step of obtaining “biotinylated protein (A)” and “biotinylated protein (B)” by immobilizing good biotin.
  • the “fluorescent dye” or enzyme may be simultaneously immobilized on the proteins (A), (B) and biotin.
  • the step (b) means (1) a step of immobilizing biotin on a fluorescent dye or enzyme-labeled protein (A), (B); (2) a fluorescent dye or enzyme label on the protein (A), (B) A step of immobilizing biotin; (3) a step of immobilizing biotin on the proteins (A) and (B); (4) a fluorescent dye or enzyme-labeled antibody (A), and (B) with a fluorescent dye or enzyme-labeled biotin.
  • One of the steps of immobilization is a step of immobilizing biotin on a fluorescent dye or enzyme-labeled protein (A), (B); (2) a fluorescent dye or enzyme label on the protein (A), (B) A step of immobilizing biotin; (3) a step of immobilizing biotin on the proteins (A) and (B); (4) a fluorescent dye or enzyme-labeled antibody (A), and (B) with a fluorescent dye or enzyme-labeled biotin.
  • Examples of a method for immobilizing biotin on a protein include an amine coupling method, a thiol coupling method, and an aldehyde coupling method.
  • an enzyme is immobilized on either a protein or biotin.
  • the present invention is not limited to these methods.
  • proteins (A) and (B) are antibodies
  • biotin is preferably immobilized on constant regions (C H 1 and C L ), more preferably Fc fragments
  • proteins (A) and (B) are In the case of a Fab fragment, F (ab ′) fragment or F (ab ′) 2 fragment, biotin is preferably immobilized on the constant regions (C H 1 and C L ).
  • biotinylated protein (A) and the protein (B) immobilized with biotin are also referred to as “biotinylated protein (A)” and “biotinylated protein (B)”, respectively.
  • step (c) the biotinylated proteins (A) and (B) are mixed so as to contain one or more biotinylated proteins (A) and (B) to which fluorescent dyes or enzymes may be immobilized.
  • This is a step of obtaining an aggregate by further mixing avidin in which a fluorescent dye or an enzyme may be immobilized with respect to the sum of B) so that the molar ratio thereof is 4: 1 or more.
  • step (c) at least one biotinylated protein (A) and (B) to which the fluorescent dye or enzyme obtained by the above step (b) may be immobilized, preferably 9: 1 to 1: 9, more preferably 8: 2 to 2: 8, even more preferably 7: 3 to 3: 7, particularly preferably 6: 4 to 4: 6, most preferably 5: 5 Avidin to which a fluorescent dye or an enzyme may be immobilized is added to the total of the biotinylated proteins (A) and (B) in a molar ratio of 4: 1 or more, preferably 4 1 is a step of obtaining a fusion protein (I) -containing assembly as shown in FIG. 1 and FIG.
  • the aggregate can be stably stabilized. It is preferable because it can be formed.
  • the production method (ii) includes the steps (d), (e) and (f) described above, and comprises an antibody (preferably an antibody constant region (C H 1 and C L ), more preferably an antibody Fc). Fragment) and protein A, protein G, or protein A / G is a method for producing a fusion protein (II) -containing assembly in which a fluorescent dye or an enzyme is immobilized.
  • an antibody preferably an antibody constant region (C H 1 and C L ), more preferably an antibody Fc.
  • Fragment and protein A, protein G, or protein A / G is a method for producing a fusion protein (II) -containing assembly in which a fluorescent dye or an enzyme is immobilized.
  • Step (d) includes “an antibody (A) that specifically associates with one or more sites ⁇ possessed by the target substance, target virus or target cell” and “target substance, target virus or target cell having the site ⁇ ”.
  • a “fluorescent dye” or an “enzyme” is immobilized on each of the “antibody (B) specifically associated with one or more sites ⁇ ”.
  • the method for immobilizing the fluorescent dye or enzyme to each of the antibodies (A) and (B) is the same as the method for immobilizing a protein described in the above step (a).
  • the antibodies (A) and (B) immobilized with a fluorescent dye or enzyme are also referred to as “) fluorescent dye or enzyme-labeled antibody (A)” and “fluorescent dye or enzyme-labeled antibody (B)”, respectively.
  • the step (e) is a step of immobilizing “fluorescent dye” or “enzyme” on “protein A, protein G or protein A / G”.
  • Protein A Protein G or Protein A / G is as described above.
  • Examples of the method for immobilizing a fluorescent dye or enzyme on protein A, protein G, or protein A / G include an amine coupling method, a thiol coupling method, an aldehyde coupling method, and the like. It is not limited to these methods.
  • Protein A, protein G, and protein A / G each having a fluorescent dye or enzyme immobilized thereon are referred to as “fluorescent dye or enzyme-labeled protein A”, “fluorescent dye or enzyme-labeled protein G” and “fluorescent dye or Also referred to as “enzyme-labeled protein A / G”.
  • step (f) the antibodies (A) and (B) to which fluorescent dyes or enzymes may be immobilized are mixed so as to contain at least one antibody, and the total of the antibodies (A) and (B)
  • protein A, protein G, or protein A / G, to which a fluorescent dye or enzyme may be immobilized is further mixed so that the molar ratio thereof is 2: 1 or more to obtain an aggregate. It is a process.
  • the step (f) includes at least one antibody (A) and (B), preferably 9: 1 to 1: 9, more preferably 8: 2 to 2: 8, and still more preferably 7 : 3 to 3: 7, particularly preferably 6: 4 to 4: 6, most preferably 5: 5, and the fluorescent dye is mixed with respect to the sum of the antibodies (A) and (B).
  • Protein A, Protein G, or Protein A / G, to which the enzyme is immobilized may be further mixed so that the molar ratio thereof is 2: 1 or more, preferably 2: 1.
  • Ratio of the number of antibodies (A) and (B) to which fluorescent dyes or enzymes may be immobilized, and proteins to which the antibodies (A) and (B) and fluorescent dyes or enzymes may be immobilized It is preferable that the molar ratio of A, protein G, or protein A / G is within the above range because aggregates can be formed efficiently and stably.
  • the production method (iii) includes the steps (d) and (f) described above, and is applied only to an antibody (preferably an antibody constant region (C H 1 and C L ), more preferably an antibody Fc fragment).
  • an antibody preferably an antibody constant region (C H 1 and C L ), more preferably an antibody Fc fragment.
  • This is a method for producing a fusion protein (II) -containing assembly on which a fluorescent dye or an enzyme is immobilized.
  • Production method (iv) includes the above steps (e) and (f), and a fusion protein (II) in which a fluorescent dye or an enzyme is immobilized only on protein A, protein G or protein A / G It is a method of manufacturing a containing aggregate.
  • the assay method of the present invention comprises the following steps (g) to (l).
  • the immune reaction field in the above steps (g) and (h) and the SPFS detection field in the above steps (j) and (k) can be independent of each other. It is preferable because it can be optimized.
  • Step (g) In the step (g), the “aggregate” of the present invention and the “sample” are “contacted” to form an “aggregate” via the target substance, target virus or target cell contained in the sample. It is a process to do.
  • the “aggregate” of the present invention is as described above, and refers to, for example, a plurality of fusion proteins (I) 10 such as the aggregate 20 shown in FIGS.
  • samples of the “specimen” include blood (serum / plasma), urine, nasal fluid, saliva, feces, body cavity fluid (spinal fluid, ascites, pleural effusion, etc.), etc., and appropriately diluted in a desired solvent, buffer solution, etc. May be used. Of these samples, blood, serum, plasma, urine, nasal fluid and saliva are preferred.
  • the temperature is usually 4 to 50 ° C., preferably 10 to 40 ° C.
  • the time is usually 0.5 to 180 minutes, preferably 5 to 60 minutes.
  • the “aggregate” is formed by, for example, associating (binding) the fusion protein (II) 12 with the target substance, target virus or target cell 7 as shown in FIGS. As shown in FIGS. 7 and 8, the aggregate 21 can be produced by bringing the fusion protein (I) 10-containing assembly 20 and a specimen into contact with each other in an immune reaction field.
  • Step (h) is a step of isolating only the aggregate by passing the “reactant” obtained through the step (g) through a “filter”.
  • the “reactant” is obtained through the above step (g).
  • the specimen is the target cell.
  • the “reactant” refers to the aggregate 21, the unreacted fusion protein (II) 12, and the specimen from which the target cells have been removed (this is because the target cells contained in the specimen are (II) was associated with 12 to form an aggregate 21, so that only the target cells were specifically removed from the specimen.
  • the filter used in the present invention does not trap the fusion protein, target substance, target virus, or target cell of the present invention alone, but is not particularly limited as long as it can trap aggregates. Thus, those that trap aggregates of two or more fusion proteins are preferred.
  • a commercially available product for example, “Anopore, pore size: 0.02 ( ⁇ m)” manufactured by Whatman Corporation is suitable.
  • Step (i) In the step (i), when a fusion protein-containing assembly containing an enzyme is used in the step (g), the aggregate obtained through the step (h) is added to a “fluorescent substrate” or a “quenching agent substrate”. Are reacted to produce “fluorescent dye (E)” or “quenching agent”, respectively.
  • the fluorescent dye (E) alone or the quencher is mixed with the filter from the mixture of the aggregate and the fluorescent dye (E) or the quencher. It is preferred to isolate only
  • fluorescent substrate used in the present invention does not emit fluorescence per se, but is hydrolyzed and converted into a fluorescent dye (E) by the enzyme (C) immobilized on the fusion protein. If there is, the present invention is not particularly limited. 1 to 8 can be used.
  • the metal thin film included in the following “plasmon excitation sensor” is formed of a metal including gold, No. 2 in Table 2 from the viewpoint of gold transmittance and excitation wavelength. 7, 1,3-diculoro-9,9-dimethyl-acid-2-one-7-yl phosphate (DDAO phosphate) (manufactured by Molecular Probes) is preferred.
  • the autofluorescence wavelength of the fluorescent substrate is such that the greater the difference between the autofluorescence wavelength and the fluorescence wavelength of the fluorescent dye (E), the easier it is to avoid the influence of the background signal, and high-accuracy measurement is possible. is not.
  • fluorescent dye (E) is a general term for substances that emit fluorescence by irradiating with predetermined excitation light or using the electric field effect, and the “fluorescence” is phosphorescence or the like. Various types of light emission are also included.
  • the fluorescent dye (E) used in the present invention is obtained by hydrolyzing the aforementioned fluorescent substrate with the enzyme (C) immobilized on the fusion protein, and quenching caused by light absorption by the metal thin film described later. As long as it does not receive, there is no restriction
  • Table 2 shows examples of fluorescent substrates used in the present invention.
  • ⁇ GAL ⁇ -galactosidase
  • ⁇ -glucosidase catalyzes the reaction of desorbing ⁇ Glu from TG- ⁇ Glu, which is a “quenching substrate”, and generating TG, which is a “quenching agent”.
  • free TG is a fluorescent dye (F) because it causes an excitation wavelength of 490 nm and a fluorescence dye (F) having a fluorescence wavelength of 475 to 495 nm and Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET).
  • Fluorescence such as fluorescence of terbium (Tb) chelate (fluorescence wavelength: 495 nm) or enhanced cyan fluorescent protein (Enhanced Cyan Fluorescence Protein; ECFP) (fluorescence wavelength: 475 nm) can be quenched.
  • TG is 2-Me TG represented by the following formula
  • Alkaline phosphatase catalyzes a reaction that hydrolyzes the “Quencher Substrate” AttoPhos® substrate, and BBT (2 ′-[2-benzthiazoyl] -6′-hydroxyl ”“ Quencher ”. -Benzthiazole).
  • BBT excitation wavelength: 482 nm
  • F fluorescent dye
  • Tb terbium
  • Glucose oxidase which can be used in the “enzyme reaction (D-2)”, generates gluconolactone and hydrogen peroxide, which are “quenching agents”, by an enzyme reaction using glucose as a “quenching agent substrate”. To do.
  • the generated hydrogen peroxide lowers the pH of the aqueous solution in which hydrogen peroxide is dissolved, and 2-Me-4-OMe TG, 2-OMe-5-Me TG, or 2- Fluorescence intensity of OMe TG or the like can be reduced (that is, quenched).
  • preferred combinations of the quencher substrate, the enzyme, the quencher and the fluorescent dye (F) include those shown in Table 3 below.
  • the concentration of such a quencher substrate during feeding is preferably 0.001 to 10,000 ⁇ g / mL, more preferably 1 to 1,000 ⁇ g / mL.
  • the temperature, time, and flow rate at which the solution is circulated are the same as those in the above step (g).
  • the step (j) includes a “transparent flat substrate”, a “metal thin film” formed on one surface of the substrate, and another surface of the metal thin film that is not in contact with the substrate.
  • the spacer layer surface or the fluorescence of a plasmon excitation sensor having at least a “spacer layer made of a dielectric” or a “fluorescent dye (F) layer” formed on the other surface not in contact with the metal thin film
  • the surface of the dye (F) layer is brought into contact with the aggregate obtained through the step (h) or the fluorescent dye (E) or the quencher obtained through the step (i).
  • the step (j) includes a “transparent flat substrate”, a “metal thin film” formed on one surface of the substrate, and the other of the metal thin film that is not in contact with the substrate.
  • a plasmon excitation sensor having at least a “spacer layer made of a dielectric” formed on the surface thereof, obtained on the surface of the spacer layer by an aggregate obtained through the step (h) or obtained through the step (i).
  • the step of “contacting” the fluorescent dye (E), or the step (j) includes “transparent flat substrate”, “metal thin film” formed on one surface of the substrate, and the metal thin film.
  • the quencher obtained through the above step (i) is applied to the surface of the fluorescent dye (F) layer of the plasmon excitation sensor having at least a “fluorescent dye (F) layer” formed on the other surface that is not This is the process of “contacting”.
  • the plasmon excitation sensor includes a “spacer layer made of a dielectric” included in the former step (j) between the “metal thin film” and the “fluorescent dye (F) layer”. You may have.
  • the “transparent planar substrate” used in the present invention may be made of quartz or glass, or may be made of plastic such as polycarbonate (PC) or cycloolefin polymer (COP), and has a refractive index [nd].
  • the size (length ⁇ width) is not particularly limited as long as the thickness is preferably 1.40 to 2.20 and the thickness is preferably 0.01 to 10 mm, more preferably 0.5 to 5 mm.
  • Glass transparent flat substrates are commercially available products such as “BK7” (refractive index [nd] 1.52) and “LaSFN9” (refractive index [nd] 1.85) manufactured by Shot Japan Co., Ltd. “K-PSFn3” (refractive index [nd] 1.84), “K-LaSFn17” (refractive index [nd] 1.88) and “K-LaSFn22” (refractive index [nd]) manufactured by Sumita Optical Glass Co., Ltd. 1.90) and “S-LAL10” (refractive index [nd] 1.72) manufactured by OHARA INC. Are preferable from the viewpoint of optical properties and detergency.
  • the transparent flat substrate is preferably cleaned with acid and / or plasma before forming metal protrusions on the surface.
  • the cleaning treatment with acid it is preferable to immerse in 0.001 to 1N hydrochloric acid for 1 to 3 hours.
  • Examples of the plasma cleaning treatment include a method of immersing in a plasma dry cleaner (“PDC200” manufactured by Yamato Scientific Co., Ltd.) for 0.1 to 30 minutes.
  • a plasma dry cleaner (“PDC200” manufactured by Yamato Scientific Co., Ltd.) for 0.1 to 30 minutes.
  • the “metal thin film” formed on one surface of the transparent flat substrate is preferably made of at least one metal selected from the group consisting of gold, silver, aluminum, copper, and platinum, more preferably gold. It is desirable to consist of these, and the alloy of these metals may be sufficient. Such metal species are preferable because they are stable against oxidation and increase in electric field due to surface plasmons increases.
  • Examples of methods for forming a metal thin film on a transparent flat substrate include sputtering, vapor deposition (resistance heating vapor deposition, electron beam vapor deposition, etc.), electrolytic plating, electroless plating, and the like. Since it is easy to adjust the thin film formation conditions, it is preferable to form a chromium thin film and / or a metal thin film by sputtering or vapor deposition.
  • the thickness of the metal thin film is preferably gold: 5 to 500 nm, silver: 5 to 500 nm, aluminum: 5 to 500 nm, copper: 5 to 500 nm, platinum: 5 to 500 nm, and alloys thereof: 5 to 500 nm.
  • the thickness of the thin film is preferably 1 to 20 nm.
  • gold 20-70 nm
  • silver 20-70 nm
  • aluminum 10-50 nm
  • copper 20-70 nm
  • platinum 20-70 nm
  • alloys thereof 10-70 nm
  • chromium The thickness of the thin film is more preferably 1 to 3 nm.
  • the thickness of the metal thin film is within the above range because surface plasmons are easily generated. Moreover, if it is a metal thin film which has such thickness, a magnitude
  • Spacer layer made of dielectric As the dielectric used for forming the “spacer layer made of a dielectric”, various optically transparent inorganic substances, natural or synthetic polymers can be used. Among them, it is preferable to contain silicon dioxide (SiO 2 ) or titanium dioxide (TiO 2 ) because it is excellent in chemical stability, production stability and optical transparency.
  • the thickness of the spacer layer made of a dielectric is usually 10 nm to 1 mm, and is preferably 30 nm or less, more preferably 10 to 20 nm from the viewpoint of resonance angle stability. On the other hand, it is preferably 200 nm to 1 mm from the viewpoint of electric field enhancement, and more preferably 400 nm to 1,600 nm from the stability of the effect of electric field enhancement.
  • Examples of the formation method of the spacer layer made of a dielectric material include a sputtering method, an electron beam evaporation method, a thermal evaporation method, a formation method by a chemical reaction using a material such as polysilazane, or an application by a spin coater.
  • the “fluorescent dye (F) layer” is a layer in which the fluorescent dye (F) is immobilized on the other surface of the metal thin film that is not in contact with the transparent flat substrate. It can also be formed by coating a composition containing (F) and a polymer on the metal thin film.
  • SAM Self-Assembled Monolayer
  • the fluorescent dye (F) and the polymer may or may not be chemically bonded, and a SAM made of alkanethiol having a polymerizable group is bonded to the metal thin film.
  • the composition containing the fluorescent dye (F) and the polymer can also be formed by adding and copolymerizing another polymerizable monomer, the fluorescent dye (F) and a polymerization initiator.
  • the fluorescent dye (F) is converted into a metal thin film by binding an alkanethiol having an amino group or a carboxyl group and a fluorescent dye (F) having a group that reacts with these groups and is covalently bonded. Can be immobilized.
  • a spacer layer made of a dielectric is provided between the fluorescent dye (F) layer and the metal thin film, the spacer layer and the fluorescent dye (F) can be bonded via a conventionally known silane coupling agent. it can.
  • the amount of the fluorescent dye (F) that can be immobilized is large, and the strength of the obtained layer is preferable. .
  • the “fluorescent dye (F)” is a general term for substances that emit fluorescence by irradiating predetermined excitation light or exciting using a field effect in the present invention
  • the “fluorescence” includes various light emission such as phosphorescence.
  • Tb terbium
  • ECFP enhanced cyan fluorescent protein
  • fluorescent dyes (F) have high water solubility.
  • fluorescent dyes (F) By reacting the carboxyl group of F) with the amino group or alcohol of the hydrophobic aromatic ring to form a water-insoluble structure, or by reacting the hydrophobic polymer with the active ester of the fluorescent dye (F) Must be chemically bonded.
  • the polymer and the fluorescent dye (F) do not have a chemical bond, it is preferable to modify the fluorescent dye (F) so as to have a structure close to a solubility parameter (SP) of the polymer.
  • SP solubility parameter
  • These fluorescent dyes (F) may be used alone or in combination of two or more.
  • a “flow channel” is a rectangular tube or cylinder (tube) that can efficiently deliver a small amount of a chemical solution and can change or circulate the solution feeding speed in order to promote the reaction. It is preferable that the vicinity of the place where the plasmon excitation sensor is installed has a rectangular tube structure, and the vicinity of the place where the drug solution is delivered preferably has a cylindrical (tube) shape.
  • the material is a homopolymer or copolymer containing methyl methacrylate, styrene or the like as a raw material in the plasmon excitation sensor part; polyethylene, polyolefin, etc., and silicon rubber, Teflon (registered trademark), polyethylene, polypropylene in the chemical solution delivery part. Etc. are used.
  • the cross section of the flow path of the plasmon excitation sensor part is preferably independently about 100 nm to 1 mm in length and width.
  • the channel height is set to 0. 0 on the surface on which the spacer layer made of the dielectric of the plasmon excitation sensor is formed.
  • a polydimethylsiloxane (PDMS) sheet having a thickness of 5 mm is pressure-bonded so as to surround the portion where the metal thin film of the plasmon excitation sensor is formed, and then the polydimethylsiloxane (PDMS) sheet and the plasmon excitation sensor are bonded together.
  • a method of fixing with a closing tool such as a screw is preferred.
  • a gold substrate is formed on an integrally molded plastic product or a separately manufactured gold substrate is fixed to the gold surface.
  • the dielectric layer or fluorescent dye (F) layer is formed and the ligand is immobilized, it can be produced by covering with a plastic integrally molded product corresponding to the top plate of the flow path. If necessary, the prism can be integrated into the flow path.
  • the “liquid feeding” is preferably the same as the solvent or buffer in which the specimen is diluted, and examples thereof include phosphate buffered saline (PBS) and Tris buffered saline (TBS), but are not particularly limited. It is not something.
  • PBS phosphate buffered saline
  • TBS Tris buffered saline
  • the temperature and time for circulating the liquid supply vary depending on the type of specimen and are not particularly limited, but are usually 20 to 40 ° C. ⁇ 1 to 60 minutes, preferably 37 ° C. ⁇ 5 to 15 minutes.
  • the initial concentration of aggregates during the feeding may be 100 ⁇ g / mL to 0.001 pg / mL.
  • the total amount of the liquid delivery that is, the volume of the flow path is usually 0.001 to 20 mL, preferably 0.1 to 1 mL.
  • the liquid flow rate is usually 1 to 2,000 ⁇ L / min, preferably 5 to 500 ⁇ L / min.
  • step (k) the plasmon excitation sensor obtained in step (j) is irradiated with laser light from the other surface of the substrate on which the thin film is not formed via a prism. In this step, the amount of fluorescence emitted from the fluorescent dye is measured.
  • the light source used in the assay method of the present invention is not particularly limited as long as it can cause plasmon excitation in a metal thin film. However, in terms of unity of wavelength distribution and intensity of light energy, laser light is used. Is preferably used as the light source. It is desirable to adjust the energy and photon amount immediately before the laser light enters the prism through the optical filter.
  • the surface plasmon is generated on the surface of the metal thin film by the laser light irradiation under the total reflection attenuation condition (ATR). Due to the electric field enhancement effect of surface plasmons, the fluorescent dye is excited by photons that are increased by several tens to several hundred times the amount of photons irradiated. Note that the amount of photon increase due to the electric field enhancement effect depends on the refractive index of the transparent flat substrate, the metal species of the metal thin film, and the film thickness thereof, but is usually about 10 to 20 times that of gold.
  • the fluorescent dye In the fluorescent dye, electrons in the molecule are excited by light absorption, move to the first electron excited state in a short time, and when returning from this state (level) to the ground state, the wavelength of the wavelength corresponding to the energy difference Fluoresce.
  • the resonance wavelength is determined by the metal species used in the metal thin film
  • a semiconductor having a wavelength of 0.01 to 100 mW. A laser etc. are mentioned.
  • the “prism” is intended to allow laser light through various filters to efficiently enter the plasmon excitation sensor, and preferably has the same refractive index as that of the transparent flat substrate 1.
  • various prisms for which total reflection conditions can be set can be selected as appropriate, and therefore, there is no particular limitation on the angle and shape.
  • a 60-degree dispersion prism may be used.
  • Examples of such commercially available prisms include those similar to the above-mentioned commercially available “glass-made transparent flat substrate”.
  • optical filter examples include a neutral density (ND) filter and a diaphragm lens.
  • ND neutral density
  • the “darkening (ND) filter” (or neutral density filter) is intended to adjust the amount of incident laser light. In particular, when a detector with a narrow dynamic range is used, it is preferable to use it for carrying out a highly accurate measurement.
  • the “polarizing filter” is used to convert the laser light into P-polarized light that efficiently generates surface plasmons.
  • Cut filters are external light (illumination light outside the device), excitation light (excitation light transmission component), stray light (excitation light scattering component in various places), plasmon scattering light (excitation light originated from plasmon A filter that removes optical noise such as scattered light generated by the influence of structures or deposits on the surface of the excitation sensor, and autofluorescence of the fluorescent dye (E) or (F), for example, an interference filter, Examples include color filters.
  • the “condensing lens” is intended to efficiently collect the fluorescent signal on the detector, and may be an arbitrary condensing system.
  • a simple condensing system a commercially available objective lens (for example, manufactured by Nikon Corporation or Olympus Corporation) used in a microscope or the like may be used.
  • the magnification of the objective lens is preferably 10 to 100 times.
  • the “SPFS detector” is preferably a photomultiplier (a photomultiplier manufactured by Hamamatsu Photonics) from the viewpoint of ultra-high sensitivity. Also, although the sensitivity is lower than these, a CCD image sensor capable of multipoint measurement is also suitable because it can be viewed as an image and noise light can be easily removed.
  • the step (l) is a step of calculating the target substance amount, the target virus amount or the target cell amount from the measurement result obtained in the step (k).
  • step (l) a calibration curve is created by performing measurement with an analyte having a known concentration, and the amount of analyte in the sample to be measured is measured based on the created calibration curve. It is the process of calculating from.
  • Example 1 In the case of a fusion protein-containing assembly containing a fluorescent dye [Example 1] (Execution of production method (i) of fusion protein (I) -containing assembly containing fluorescent dye)
  • a step (a) anti-alpha fetoprotein (AFP) monoclonal antibody 1D5 and anti-AFP monoclonal antibody 6D2 (2.5 mg / mL, manufactured by Japan Medical Laboratory) were added to “Monoclonal Antibody Labeling Kit” (Molecular Probe). Alexa Fluor (registered trademark) 647 was immobilized respectively.
  • AFP anti-alpha fetoprotein
  • the fluorescently labeled antibodies 1D5 and 6D2 obtained in the above step (a) were biotinylated using “EZ-Link Maleimide-PEO Solid Phase Biotinylation Kit” (manufactured by PIERCE).
  • step (c) the fluorescently labeled biotinylated antibodies 1D5 and 6D2 obtained in step (b) above and avidin are mixed so that the molar ratio of 1D5: 6D2: avidin is 2: 2: 1.
  • a fusion protein (I) -containing assembly was produced.
  • Alexa Fluor (registered trademark) 647 was immobilized on each of anti-AFP monoclonal antibody 1D5 and anti-AFP monoclonal antibody 6D2 using “Monoclonal Antibody Labeling Kit” (Molecular Probe).
  • the fluorescence-labeled antibody 1D5, the fluorescence-labeled antibody 6D2, and the protein A / G obtained in the step (d) are mixed at a molar ratio of 1D5: 6D2: protein A / G of 1: 1: By mixing so as to be 1, a fusion protein (I) -containing assembly was produced.
  • Example 3 (Production of plasmon excitation sensor) A glass transparent flat substrate (“S-LAL 10” manufactured by OHARA INC.) Having a refractive index [nd] of 1.72 and a thickness of 1 mm is plasma-cleaned, and a chromium thin film is formed on one surface of the substrate by sputtering. After that, a gold thin film was further formed on the surface by a sputtering method.
  • the chromium thin film had a thickness of 1 to 3 nm, and the gold thin film had a thickness of 44 to 52 nm.
  • a spacer layer made of silicon dioxide (SiO 2 ) as a dielectric was formed by sputtering on one side of the gold thin film that was not in contact with the chromium thin film.
  • the spacer layer had a thickness of 15 nm.
  • a sample containing 100 ⁇ L of the fusion protein (I) -containing assembly (1 mg / mL) produced in Example 1 and 800 ⁇ L of AFP (prepared as a 1 ng / mL TBS solution) as a target antigen For 25 minutes.
  • step (h) the reaction product obtained through the above step (g) is added as a filter to “Vector Spin Micro (pore size: 0.02 ⁇ m)” manufactured by Whatman Co., Ltd. until the solution on the filter disappears. Aggregates were isolated by centrifugation. Thereafter, as a washing step, 1,000 ⁇ L of TBS containing 0.05% by mass of Tween 20 was added to the filter, and the aggregate was washed again by centrifuging until there was no solution on the filter.
  • Vector Spin Micro pore size: 0.02 ⁇ m
  • the aggregate trapped on the filter through the above step (h) is resuspended in 50 ⁇ L of PBS, and the resulting solution is the plasma obtained in the above (production of plasma excitation sensor). It contacted by sending liquid to the surface of the excitation sensor.
  • the prism SIGMA KOKI Co., Ltd. product
  • the plasmon excitation sensor obtained in the step (i) from the other surface of the glass transparent flat substrate on which the gold thin film is not formed.
  • the signal value when the amount of fluorescence emitted from the excited fluorescent dye was observed from the CCD was measured and used as an “assay measurement signal”.
  • the SPFS measurement signal when AFP was 0 ng / mL was designated as “blank signal”.
  • the assay signal was evaluated by the following formula from the measurement result obtained in the step (j).
  • Assay signal
  • Table 4 shows the obtained results.
  • Example 4 (Production of plasmon excitation sensor) A plasmon excitation sensor was produced in the same manner as in Example 3.
  • Examplementation of assay method The assay method was performed in the same manner as in Example 3 except that 100 ⁇ L of the fusion protein (II) -containing assembly solution (1 mg / mL) obtained in Example 2 was used. Table 4 shows the obtained results.
  • the substrate thus obtained is immersed in an ethanol solution containing 1 mM 10-carboxy-1-decanethiol for 24 hours or more to form a SAM (Self Assembled Monolayer) on one side of the gold thin film. did.
  • the substrate was removed from the solution, washed with ethanol and isopropanol, and then dried with an air gun.
  • a polydimethylsiloxane (PDMS) sheet having a flow path height of 0.5 mm is provided on the surface of the SAM, and the substrate is arranged so that the SAM surface is inside the flow path (however, the silicon rubber spacer is used for liquid feeding).
  • the pressure-sensitive adhesive sheet was pressed from the outside of the flow path, and the flow path sheet and the plasmon excitation sensor were fixed with screws.
  • the obtained plasmon excitation sensor is fixed to the flow path, and ultrapure water is supplied as a liquid for 10 minutes, and then MES (25 ° C., pH 5.0) is supplied for 20 minutes by a peristaltic pump at room temperature (25 ° C.), a flow rate of 500 ⁇ L / min. And equilibrated the surface.
  • MES 25 ° C., pH 5.0
  • the solution was replaced with PBS, 0.8 mL of a PBS solution containing 1 ng / mL of AFP was added and circulated for 25 minutes.
  • Washing was performed by circulating TBS containing 0.05% by mass of Tween 20 for 5 minutes as a solution.
  • the signal value observed from the CCD was measured and used as an assay measurement signal.
  • the SPFS measurement signal when AFP was 0 ng / mL was used as a blank signal.
  • the assay was evaluated by calculating the same assay signal as in Example 1.
  • Table 4 shows the measurement results of the assay method of the present invention.
  • the assay method of the present invention is extremely high in comparison with the conventional heterogeneous SPFS measurement of Comparative Example 1 by applying the homogeneous assay system using the assembly of the present invention to SPFS measurement. It was found that sensitive measurement is possible.
  • step (a) In the case of a fusion protein-containing assembly containing an enzyme [Example 1] (Execution of production method (i) of assembly containing enzyme-containing fusion protein (I))
  • AFP anti-alpha fetoprotein
  • 6D2 2.5 mg / mL, manufactured by Japan Medical Laboratory
  • “Alkaline Phosphatase Labeling Kit” (stock) Enzyme-labeled antibodies 1D5 and 6D2 were produced by immobilizing alkaline phosphatase using Dojindo Laboratories).
  • the enzyme-labeled antibodies 1D5 and 6D2 obtained in the above step (a) are biotinylated using “EZ-Link Maleimide-PEO Solid Phase Biotinylation Kit” (manufactured by PIERCE). Labeled biotinylated antibodies 1D5 and 6D2 were produced.
  • step (c) the enzyme-labeled biotinylated antibodies 1D5 and 6D2 obtained in step (b) above and avidin are mixed so that the molar ratio of 1D5: 6D2: avidin is 2: 2: 1.
  • a fusion protein (I) -containing assembly was produced.
  • Example 2 Method for producing fusion protein (II) -containing assembly (iv)
  • step (d) by immobilizing alkaline phosphatase to each of anti-AFP monoclonal antibody 1D5 and anti-AFP monoclonal antibody 6D2 using “Alkaline Phosphatase Labeling Kit” (manufactured by Dojindo Laboratories) Labeled antibodies 1D5 and 6D2 were produced.
  • the enzyme-labeled antibody 1D5, the enzyme-labeled antibody 6D2, and the protein A / G obtained in the step (d) are mixed at a molar ratio of 1D5: 6D2: protein A / G of 1: 1: By mixing so as to be 1, a fusion protein (II) -containing assembly was produced.
  • Example 3 (Production of plasmon excitation sensor) A glass transparent flat substrate (“S-LAL 10” manufactured by OHARA INC.) Having a refractive index [nd] of 1.72 and a thickness of 1 mm is plasma-cleaned, and a chromium thin film is formed on one surface of the substrate by sputtering. After that, a gold thin film was further formed on the surface by a sputtering method.
  • the chromium thin film had a thickness of 1 to 3 nm, and the gold thin film had a thickness of 44 to 52 nm.
  • a spacer layer made of silicon dioxide (SiO 2 ) as a dielectric was formed by sputtering on one side of the gold thin film that was not in contact with the chromium thin film.
  • the spacer layer had a thickness of 15 nm.
  • a sample containing 100 ⁇ L of the fusion protein (I) -containing assembly (1 mg / mL) produced in Example 1 and 800 ⁇ L of AFP (prepared as a 1 ng / mL TBS solution) as a target antigen For 25 minutes.
  • step (h) the reaction product obtained through the above step (g) is added as a filter to “Vector Spin Micro (pore size: 0.02 ⁇ m)” manufactured by Whatman Co., Ltd. until the solution on the filter disappears. Aggregates were isolated by centrifugation. afterwards, As a washing step, 1,000 ⁇ L of TBS containing 0.05% by mass of Tween 20 was added to the filter, and the aggregate was washed by centrifuging again until there was no solution on the filter.
  • Vector Spin Micro pore size: 0.02 ⁇ m
  • step (i) the aggregate trapped on the filter through (h) is used as a fluorescent substrate (1,3-dicilo-9,9-dimethyl-acidine-2-one-7-yl phosphate (DDAO).
  • Phosphorate solution (Molecular Probes) (50 ⁇ L) was reacted to produce DDAO as the fluorescent dye (E) on the filter.
  • step (j) the solution obtained on the filter through the step (i) was brought into contact with the surface of the plasma excitation sensor obtained in the above (production of the plasma excitation sensor).
  • the prism SIGMA KOKI Co., Ltd. product
  • the plasmon excitation sensor obtained in the step (j) from the other surface of the glass transparent flat substrate on which the gold thin film is not formed.
  • ) was irradiated with laser light (633 nm, 10 ⁇ W), and the signal value when the amount of fluorescence emitted from the excited fluorescent dye (E) was observed from the CCD was measured and used as an “assay measurement signal”.
  • the SPFS measurement signal when AFP was 0 ng / mL was designated as “blank signal”.
  • step (l) the assay signal was evaluated by the following formula from the measurement result obtained in step (k).
  • Assay signal
  • the results obtained are shown in Table 5.
  • Example 4 (Production of plasmon excitation sensor) A plasmon excitation sensor was produced in the same manner as in Example 3.
  • Examplementation of assay method The assay method was performed in the same manner as in Example 3 except that 100 ⁇ L of the fusion protein (II) -containing assembly solution (1 mg / mL) obtained in Example 2 was used. The results obtained are shown in Table 5.
  • the substrate thus obtained is immersed in an ethanol solution containing 1 mM 10-carboxy-1-decanethiol for 24 hours or more to form a SAM (Self Assembled Monolayer) on one side of the gold thin film. did.
  • the substrate was removed from the solution, washed with ethanol and isopropanol, and then dried with an air gun.
  • a polydimethylsiloxane (PDMS) sheet having a flow path height of 0.5 mm is provided on the surface of the SAM, and the substrate is arranged so that the SAM surface is inside the flow path (however, the silicon rubber spacer is used for liquid feeding).
  • the pressure-sensitive adhesive sheet was pressed from the outside of the flow path, and the flow path sheet and the plasmon excitation sensor were fixed with screws.
  • the obtained plasmon excitation sensor is fixed to the flow path, and ultrapure water is supplied as a liquid for 10 minutes, and then MES (25 ° C., pH 5.0) is supplied for 20 minutes by a peristaltic pump at room temperature (25 ° C.), a flow rate of 500 ⁇ L / min. And equilibrated the surface.
  • MES 25 ° C., pH 5.0
  • the solution was replaced with PBS, 0.8 mL of a PBS solution containing 1 ng / mL of AFP was added and circulated for 25 minutes.
  • Washing was performed by circulating TBS containing 0.05% by mass of Tween 20 for 5 minutes as a solution.
  • the signal value observed from the CCD was measured and used as an assay measurement signal.
  • the SPFS measurement signal when AFP was 0 ng / mL was used as a blank signal.
  • the assay was evaluated by calculating the same assay signal as in Example 1.
  • Table 5 shows the measurement results of the assay method of the present invention.
  • the assay method of the present invention is an extremely high number of orders of magnitude compared with the conventional heterogeneous SPFS measurement of Comparative Example 1 by applying the homogeneous assay system using the assembly of the present invention to the SPFS measurement. It was found that sensitive measurement is possible.
  • the fusion protein-containing assembly of the present invention When used in the assay method of the present invention, it is a highly sensitive and highly accurate method with dramatically improved rapidity. Thus, the presence of a preclinical non-invasive cancer (carcinoma in situ) that cannot be detected by palpation or the like can be predicted with high accuracy.

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Abstract

　高感度かつ高精度であり、迅速性が飛躍的に向上したアッセイ法、該アッセイ法に用いる融合タンパク質含有集合体体及び該集合体の製造方法を提供する。本発明の融合タンパク質含有集合体は、標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質(Ａ)及び該部位αを有する標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質(Ｂ)を合計２個以上と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質を少なくとも含有すること等を特徴とする。

Description

融合タンパク質含有集合体、その製造方法及び該集合体を用いたアッセイ法
　本発明は、主にタンパク質から構成される集合体、その製造方法及び該集合体を用いたアッセイ法に関する。さらに詳しくは、本発明は、アナライトと特異的に会合する２種類のタンパク質と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質含有集合体、その製造方法、及び表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｐｌａｓｍｏｎ－ｆｉｅｌｄ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）の原理に基づき該集合体を用いたアッセイ法に関する。
　表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）とは、照射したレーザ光が金薄膜表面で全反射減衰（ＡＴＲ）する条件において、金属薄膜表面に粗密波（表面プラズモン）を発生させることによって、照射したレーザ光が有するフォトン量を数十倍～数百倍に増やし（表面プラズモンの電場増強効果）、これにより金薄膜近傍の蛍光色素を効率良く励起させることによって、極微量及び／又は極低濃度のアナライトを検出することができる方法である。
　このようなＳＰＦＳの原理に基づいたバイオセンサ又はバイオチップに関する例として、特許文献１には、金属基板表面にカルボキシメチルデキストランを用いたリガンド（１次抗体）固定化膜を配し、表面プラズモンにより増強された電場で、抗原に関係付けられた蛍光色素を検出する方法が示されている。
　しかしながら、特許文献１に記載の方法は、基板に固定化された抗体を利用する、いわゆるヘテロジニアスな反応系であるため、抗体の固定化量と自由度に制限があり、抗原抗体反応の効率が低いという問題があった。
　なお、反応効率を向上させる方法として、遊離の抗体を使用する、いわゆるホモジニアスな反応系が考えられるが、ＳＰＦＳバイオセンサと組み合わせたとき、いかに検出部分へ抗原抗体反応物を回収するかが問題となっていた。
　他方、特許文献２には、血球などが保持する抗原に対する抗体を用いて、該血球を凝集し、フィルタでトラップさせ、検出する方法が示されている。
　しかしながら、特許文献２に記載の方法は、標的物質が同一エピトープを複数保持している血球など比較的大きな細胞などを凝集する方法であって、タンパク質や核酸などの分子に対する汎用性はなかった。さらに、凝集物をフィルタでトラップした後、蛍光物質、化学発光物質をさらに反応させる必要があり、感度が低い割に、操作も煩雑であった。
特許第３２９４６０５号 特開２００８－２５６４５７号公報
　本発明は、上記問題・状況にかんがみてなされたものであり、その解決課題は、高感度かつ高精度であり、迅速性が飛躍的に向上したアッセイ法、該アッセイ法に用いる融合タンパク質含有集合体及び該集合体の製造方法を提供することである。
　本発明者らは、上記の問題を解決すべく鋭意検討した結果、アナライトが有する部位αに特異的なタンパク質（Ａ）及び該部位αを有するアナライトの部位βに特異的なタンパク質（Ｂ）と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質含有集合体を、ＳＰＦＳを利用したサンドイッチイムノアッセイ法に用いると、迅速性と感度が飛躍的に向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明に係る上記課題は、下記の手段により解決される。
　１．標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）及び該部位αを有する標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）を合計２個以上と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質を少なくとも含有するか、又は、
　標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）を合計２個以上と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質と、該部位αを有する標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）を合計２個以上と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質とを少なくとも含有することを特徴とする融合タンパク質含有集合体。
　２．上記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）それぞれにビオチンが固定化され、蛍光色素又は酵素が、該タンパク質（Ａ）、タンパク質（Ｂ）、ビオチン及びアビジンのうち少なくとも１つに固定化され、上記融合タンパク質が、該タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）の合計４個とアビジン１個とを含むことを特徴とする前記第１項に記載の融合タンパク質含有集合体。
　３．上記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）それぞれが、抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント又はＦ（ａｂ’）２フラグメントであることを特徴とする前記第１項又は第２項に記載の融合タンパク質含有集合体。
　４．上記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）が、ともに抗体であり、蛍光色素又は酵素が、該抗体のみに固定化されるか、プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇのみに固定化されるか、あるいは該抗体とプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇとに固定化され、上記融合タンパク質が、該タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）の合計２～５個と、プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇとを含むことを特徴とする前記第１項から第３項までのいずれか一項に記載の融合タンパク質含有集合体。
　５．上記部位α及びβが、同一であることを特徴とする前記第１項から第４項までのいずれか一項に記載の融合タンパク質含有集合体。
　６．上記酵素が、アルカリフォスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ又はグルコースオキシダーゼであることを特徴とする前記第１項から第５項までのいずれか一項に記載の融合タンパク質含有集合体。
　７．下記工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むことを特徴とする融合タンパク質含有集合体の製造方法；
　工程（ａ）：標的物質、標的ウイルス又は標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）及び該部位αを有する標的物質、標的ウイルス又は標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）からなるタンパク質、ビオチンならびにアビジンのうち少なくとも１つに蛍光色素又は酵素を固定化する工程、
　工程（ｂ）：蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよい該タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）それぞれに、蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいビオチンを固定化することによって、ビオチン化タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）を得る工程及び
　工程（ｃ）：蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいビオチン化タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）を、それぞれ１個以上含むように混合し、
　該ビオチン化タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）の合計に対して、蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいアビジンを、そのモル比で４：１以上となるようにさらに混合することによって、融合タンパク質含有集合体を得る工程。
　８．上記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）それぞれが、抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント又はＦ（ａｂ’）２フラグメントであることを特徴とする前記第７項に記載の融合タンパク質含有集合体の製造方法。
　９．下記工程（ｄ）及び（ｅ）のうち少なくとも一方と（ｆ）とを含むことを特徴とする前記第７項又は第８項に記載の融合タンパク質含有集合体の製造方法。
　工程（ｄ）：標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合する抗体（Ａ）及び該部位αを有する標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合する抗体（Ｂ）それぞれに蛍光色素又は酵素を固定化する工程、
　工程（ｅ）：プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇに蛍光色素又は酵素を固定化する工程、及び
　工程（ｆ）：蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよい抗体（Ａ）及び（Ｂ）を、それぞれ１個以上含むように混合し、該抗体（Ａ）及び（Ｂ）の合計に対して、蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇ（ただし、抗体（Ａ）及び（Ｂ）に蛍光色素又は酵素が固定化されていない場合、用いるプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇには蛍光色素又は酵素が固定化されている。）を、そのモル比で２：１以上となるようにさらに混合することによって、集合体を得る工程。
　１０．上記部位α及びβが、同一であることを特徴とする前記第７項から第９項までのいずれか一項に記載の融合タンパク質含有集合体の製造方法。
　１１．上記酵素が、アルカリフォスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ又はグルコースオキシダーゼであることを特徴とする前記第７項から第１項０までのいずれか一項に記載の融合タンパク質含有集合体の製造方法。
　１２．下記工程（ｇ）～（ｌ）を含むことを特徴とするアッセイ法；
　工程（ｇ）：前記第１項から第６項までのいずれか一項に記載の融合タンパク質含有集合体と検体とを接触させることによって、該検体に含有される標的物質、標的ウイルス又は標的細胞を介して凝集体を形成する工程、
　工程（ｈ）：該工程（ｇ）を経て得られた反応物をフィルタに通すことによって、該凝集体のみを単離する工程、
　工程（ｉ）：該工程（ｈ）を経て得られた凝集体に、蛍光基質又は消光剤基質を反応させ、それぞれ蛍光色素（Ｅ）又は消光剤を生成する工程（ただし、上記工程（ｇ）において、請求項１から請求項６までのいずれか一項に記載の酵素を含む融合タンパク質含有集合体を用いた場合のみ。）、
　工程（ｊ）：透明平面基板と、該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と、該金属薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された誘電体からなるスペーサ層、又は該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された蛍光色素（Ｆ）層とを少なくとも有するプラズモン励起センサの、該スペーサ層表面又は該蛍光色素（Ｆ）層表面に、上記工程（ｈ）を経て得られた凝集体又は上記工程（ｉ）を経て得られた蛍光色素（Ｅ）又は消光剤を接触させる工程、
　工程（ｋ）：該工程（ｊ）で得られたプラズモン励起センサに、該基板の、該薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程、及び
　工程（ｌ）：該工程（ｋ）で得られた測定結果から、該標的物質量、該標的ウイルス量又は該標的細胞量を算出する工程。
　１３．上記工程（ｇ）及び（ｈ）の免疫反応場、及び上記工程（ｊ）及び（ｋ）のＳＰＦＳ検出場が、それぞれ独立していることを特徴とする前記第１２項に記載のアッセイ法。
　１４．上記金属薄膜が、金、銀、アルミニウム、銅及び白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属から形成されることを特徴とする前記第１２項又は第１３項に記載のアッセイ法。
　１５．上記金属が、金からなることを特徴とする前記１４項に記載のアッセイ法。
　１６．上記誘電体が、二酸化ケイ素（ＳｉＯ４）又は二酸化チタン（ＴｉＯ２）を含むことを特徴とする前記第１２項から第１５項までのいずれか一項に記載のアッセイ法。
　本発明の集合体をアッセイ法に用いると、（１）ＳＰＦＳ測定用センサ基盤に抗体等を固定化する必要がないことから、抗体等の固定化量に係る問題及び該センサ基盤への非特異的吸着を考慮する必要もなく、（２）免疫反応場が液液系であることから反応効率が向上し、（３）免疫反応場とＳＰＦＳ検出場との完全分離が可能であることから、免疫反応条件及び検出条件を最適化することができ、さらに散乱ノイズの影響を受けづらく、（４）ホモジニアスかつ極めて高効率な抗体抗原反応を実現することができ、さらに、蛍光シグナルが凝集体として濃縮されるので、通常のＳＰＦＳよりも迅速性と感度が飛躍的に向上し、又は（５）融合タンパク質に固定化されている酵素（この酵素は、蛍光基質を蛍光色素（Ｅ）に変換する反応を触媒するか、又は消光剤基質を消光剤に変換する反応を触媒する。）によって、シグナルを増幅することができる。
蛍光色素を含む融合タンパク質（Ｉ）の一態様の模式図 酵素を含む融合タンパク質（Ｉ）の一態様の模式図 蛍光色素を含む融合タンパク質（II）の一態様の模式図 酵素を含む融合タンパク質（II）の一態様の模式図であって、該融合タンパク質（II）１１に固定化されている酵素３ｂによって蛍光基質１３が加水分解され、蛍光色素（Ｅ）１４に変換される反応を模式的に示す 蛍光色素を含む融合タンパク質（Ｉ）含有集合体の一態様の模式図 酵素を含む融合タンパク質（Ｉ）含有集合体の一態様の模式図 標的物質、標的ウイルス又は標的細胞７を介して蛍光色素を含む融合タンパク質（II）１２が互いに会合して形成された凝集体２１の模式図 標的物質、標的ウイルス又は標的細胞７を介して酵素を含む融合タンパク質（II）１２が互いに会合して形成された凝集体２１の模式図 本発明の蛍光色素を含む融合タンパク質含有集合体に係るアッセイ法を模式的に示した図 本発明の酵素を含む融合タンパク質含有集合体に係るアッセイ法を模式的に示した図
　本発明の融合タンパク質含有集合体は、標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）及び該部位αを有する標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）を合計２個以上と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質を少なくとも含有するか、又は、
　標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）を合計２個以上と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質と、該部位αを有する標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）を合計２個以上と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質とを少なくとも含有することを特徴とする。換言すると、本発明の融合タンパク質含有集合体は、標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）及び該部位αを有する標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）のうち少なくとも一方を合計２個以上と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質からなる集合体であって、該タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）を、それぞれ１個以上有することを特徴とする。
　この特徴は、請求項１から請求項１６までの請求項に係る発明に共通する技術的特徴である。なお、本発明においては、本発明に係る「酵素」として、後述するように、「蛍光基質」を「蛍光色素」に変換する反応を触媒する酵素、又は「消光剤基質」を「消光剤」に変換する反応を触媒する酵素を用いることを特徴とする。
　本発明の実施態様としては、本発明の効果発現の観点から、上記タンパク質にビオチンが固定化され、蛍光色素又は酵素が、該タンパク質、ビオチン及びアビジンのうち少なくとも１つに固定化され、上記融合タンパク質は、該タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）の合計４個とアビジン１個とを含むことが好ましく、特に上記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）それぞれは、抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント又はＦ（ａｂ’）２フラグメントであることが好ましい。
　また、上記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）は、ともに抗体であり、蛍光色素又は酵素は、該抗体のみに固定化されるか、プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇのみに固定化されるか、あるいは該抗体とプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇに固定化され、上記融合タンパク質は、該タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）の合計２～５個と、プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇとを含むことも好ましい。
　上記部位α及びβは、同一であってもよい。
　上記酵素は、アルカリフォスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ又はグルコースオキシダーゼであることが好ましい。
　本発明の融合タンパク質含有集合体の製造方法は、前記工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むことを特徴とする。
　該製造方法において、上記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）それぞれは、抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント又はＦ（ａｂ’）２フラグメントであることが好ましい。
　また、本発明の融合タンパク質含有集合体の製造方法は、前記工程（ｄ）及び（ｅ）のうち少なくとも一方と（ｆ）とを含むことを特徴とする。
　該製造方法において、上記部位α及びβは、同一であってもよい。
　上記酵素は、アルカリフォスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ又はグルコースオキシダーゼであることが好ましい。
　本発明のアッセイ法は、下記工程（ｇ）～（ｌ）を含むことを特徴とする。
　上記工程（ｇ）、（ｈ）の免疫反応場、及び上記工程（ｊ）、（ｋ）のＳＰＦＳ検出場は、それぞれ独立していることが好ましい。
　上記金属薄膜は、金、銀、アルミニウム、銅及び白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属から形成されることが好ましく、該金属は、金からなることがより好ましい。
　上記誘電体は、二酸化ケイ素（ＳｉＯ４）又は二酸化チタン（ＴｉＯ２）を含むことが好ましい。
　以下、本発明とその構成要素、及び本発明を実施するための形態・態様について詳細な説明をする。
　＜集合体＞
　本発明の融合タンパク質含有集合体は、標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）及び該部位αを有する標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）を合計２個以上と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質を少なくとも含有するか、又は、
　標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）を合計２個以上と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質と、該部位αを有する標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）を合計２個以上と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質とを少なくとも含有することを特徴とする。
　換言すると、本発明の集合体は、「標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）」及び「該部位αを有する標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）」のうち少なくとも一方を合計２個以上と「蛍光色素」又は「酵素」とを含む「融合タンパク質」を含有する「集合体」であって、該タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）を、それぞれ１個以上有することを特徴とするものである。
　すなわち、本発明の集合体は、このような融合タンパク質を複数個含むものであって、複数個の融合タンパク質が標的物質、標的ウイルス又は標的細胞を介して形成される「凝集体」（後述する。）とは異なる。
　なお、本発明の効果発現を阻害しない限りにおいて、本発明の集合体には、上記の標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する部位とタンパク質との特異的会合を阻害しない何らかの有用物質等を含有させても良い。
　本発明の集合体に含まれる上記融合タンパク質の濃度は、高い方が望ましく、少なくとも１０ｎＭ以上が好ましく、１００ｎＭ以上がより好ましく、１μＭ以上が特に好ましい。
　本発明の集合体に含まれる上記タンパク質（Ａ）及び上記タンパク質（Ｂ）は、それぞれ少なくとも１個、好ましくは９：１～１：９、より好ましくは８：２～２：８、さらに好ましくは７：３～３：７、特に好ましくは６：４～４：６、もっとも好ましくは５：５の比で表される。上記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）の集合体に含まれる個数が５：５の比に近いほど（同数に近いほど）、凝集体を効率良く安定に形成できることから好ましい。なお、このような態様において、上記タンパク質（Ａ）及び上記タンパク質（Ｂ）の集合体に含まれる合計個数は一定とする。
　（標的物質，標的ウイルス，標的細胞）
　本発明において、「標的物質」、「標的ウイルス」及び「標的細胞」（以下、これらをまとめて単に「アナライト」ともいう。）それぞれは、タンパク質が特異的に会合（結合）し得る部位を独立して２以上有すれば、物質（単体又は化合物である化学物質）もしくはウイルスである非生物であっても、又は単細胞もしくは多細胞からなる生物であってもよく、特に限定されるものではない。
　「標的物質」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、又はヌクレオシド、ヌクレオチド及びそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、又はこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、これらの分子は分子断片であってもよい。さらに具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されるものではない。
　「標的ウイルス」としては、例えば、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）など動物に感染するウイルスであっても、植物に感染するウイルスであっても、又は細菌に感染するバクテリオファージであってもよく、特に限定されるものではない。
　「標的細胞」としては、例えば、ヒトなどの哺乳動物を含む脊椎動物及び無脊椎動物、植物、藻類、菌類、バクテリアなどに由来する細胞をいい、バクテリアとしては、具体的に、細胞壁に多量のミコール酸を含有する結核菌などが挙げられる。
　標的物質、標的ウイルス又は標的細胞が有する、タンパク質が特異的に会合（結合）し得る最小の部位は、２以上あり、かつ完全に独立している（すなわち、１以上の部位α、及び該部位αとはまったく異なる１以上の部位βである。）か、又は該部位αと該部位βとが同一である。なお、「同一である」とは、完全同一以外にも、部分同一（一部重複）も包含する。
　ただし、上記部位α及びβが同一である場合、下記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）は同一のものを用いることはできない。
　（タンパク質（Ａ）及び（Ｂ））
　本発明において、「標的物質、標的ウイルス又は標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）」（以下、単に「タンパク質（Ａ）」ともいう。）は、上述したような標的物質、標的ウイルス又は標的細胞に、それが有する１以上の部位αを介して、特異的に会合（結合）するタンパク質であれば特に限定されるものではなく、例えば、種々のモノクローナル抗体（Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント及びＦ（ａｂ’）２フラグメントも含む。）、ＭＤＰ１（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ　ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１）などが挙げられる。なお、「タンパク質」は、本発明において、ポリペプチドやオリゴペプチドも包含するものとする。
　また、本発明において、「上記部位αを有する標的物質、標的ウイルス又は標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）」（以下、単に「タンパク質（Ｂ）」ともいう。）は、上述したような標的物質、標的ウイルス又は標的細胞が１以上の部位α及び１以上の部位βを有し、該部位βを介して特異的に会合（結合）するタンパク質であれば特に限定されるものではなく、具体例として、タンパク質（Ａ）と同様の種類のものが挙げられる。
　（蛍光色素）
　本発明において、「蛍光色素」は、所定の励起光を照射して、又は電界効果を利用して、励起することによって蛍光を発光する物質の総称であり、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も包含する。
　本発明で用いられる蛍光色素は、後述する金属薄膜による吸光に起因する消光を受けない限りにおいて、その種類に特に制限はなく、公知の蛍光色素のいずれであってもよい。一般に、単色比色計（ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ）よりむしろフィルタを備えた蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークス・シフトを有する蛍光色素が好ましい。
　このような蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア　バイオサイエンス（株）製）、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン（株）製）などが挙げられ、さらに米国特許番号第６，４０６，２９７号、同第６，２２１，６０４号、同第５，９９４，０６３号、同第５，８０８，０４４号、同第５，８８０，２８７号、同第５，５５６，９５９号及び同第５，１３５，７１７号に記載の蛍光色素も本発明で用いることができる。
　これらファミリーに含まれる代表的な蛍光色素の吸収波長（ｎｍ）及び発光波長（ｎｍ）を表１に示す。
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　また、蛍光色素は、上記有機蛍光色素に限られない。例えば、Ｅｕ、Ｔｂ等の希土類錯体系の蛍光色素も、本発明に用いられる蛍光色素となりうる。希土類錯体は、一般的に励起波長（３１０～３４０ｎｍ程度）と発光波長（Ｅｕ錯体で６１５ｎｍ付近、Ｔｂ錯体で５４５ｎｍ付近）との波長差が大きく、蛍光寿命が数百マイクロ秒以上と長い特徴がある。市販されている希土類錯体系の蛍光色素の一例としては、ＡＴＢＴＡ－Ｅｕ３＋が挙げられる。さらに、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）又はＡｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ；ＬｙｏＦｌｏｇｅｎ（登録商標））などに代表される蛍光タンパク質、ラテックスやシリカなどの蛍光微粒子なども、本発明に用いられる蛍光色素となりうる。
　本発明においては、後述する蛍光測定を行う際に、金属薄膜を形成する金属種による吸光の少ない波長領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。例えば、金属薄膜として金を用いる場合には、金による吸光による影響を最小限に抑えるため、最大蛍光波長が６００ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。したがって、この場合には、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７等近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが特に望ましい。このような近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることは、血液中の血球成分由来の鉄による吸光の影響を最小限に抑えることができる点で、検体として血液を用いる場合においても有用である。一方、金属薄膜として銀を用いる場合には、最大蛍光波長が４００ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。
　これら蛍光色素は１種単独でも、２種以上併用してもよい。
　（酵素）
　本発明においては、本発明に係る「酵素」として、「蛍光基質」を「蛍光色素（Ｅ）」に変換する反応を触媒する酵素（Ｃ）、又は「消光剤基質」を「消光剤」に変換する反応を触媒する酵素（Ｄ）を用いることを特徴とする。
　このような酵素（Ｃ）としては、例えば、アルカリフォスファダーゼ（ＡＬＰ）、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）などが挙げられる。
　また、酵素（Ｄ）は、酵素反応（Ｄ－１）として、保護基によってブロックされている「消光剤基質」を、酵素反応によって消光剤を活性化したり、酵素反応（Ｄ－２）として、特定の「消光剤基質」を用いた酵素反応によって活性化した消光剤によりｐＨを低下させたりする。
　酵素（Ｄ）のうち、酵素反応（Ｄ－１）に用いられるものとしては、例えば、β－ガラクトシダーゼ（βＧＡＬ）、β－グルコシダーゼ（βＧｌｕ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）などが挙げられ、酵素反応（Ｄ－２）に用いられるものとしては、例えば、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）などが挙げられる。
　これら酵素は、１種単独でも、また２種以上併用することもできる。
　なお、「蛍光基質」、「蛍光色素（Ｅ）」、「消光剤基質」及び「消光剤」についは後述する。
　〔融合タンパク質〕
　本発明の集合体を構成する融合タンパク質は、タンパク質（Ａ）及びタンパク質（Ｂ）のうち少なくとも一方を合計２個以上と蛍光色素又は酵素とを含むものであり、以下の融合タンパク質（Ｉ）及び（II）が好ましい態様として挙げられる。
　（融合タンパク質（Ｉ））
　図１及び図２に例示するように、融合タンパク質（Ｉ）１０は、タンパク質（Ａ）１及びタンパク質（Ｂ）２が、ともに抗体であってもよく、該抗体に蛍光色素３ａ又は酵素３ｂ、及びビオチン４が固定化され（図示していないが、蛍光色素又は酵素は、抗体以外にもビオチン及び／又はアビジンに固定化することができ、例えば、蛍光色素又は酵素は、抗体、ビオチン及びアビジンに同時に固定化されていてもよい。）、このようなタンパク質（Ａ）１及びタンパク質（Ｂ）２の合計４個とアビジン５の１個とを含むものである。
　なお、図１及び図２に示す融合タンパク質（Ｉ）１０が有する抗体は、タンパク質（Ａ）１が２個及びタンパク質（Ｂ）２が２個であるが、本発明は、この態様に限定されず、タンパク質（Ａ）のみを４個有する態様なども包含される。
　本発明において、アビジンは、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンも包含するものとする。
　（融合タンパク質（II））
　図３及び図４に例示するように、融合タンパク質（II）１１は、タンパク質（Ａ）１及びタンパク質（Ｂ）２が、ともに抗体であり、蛍光色素３ａ又は酵素３ｂが、該抗体のＦｃフラグメントに固定化され（図示していないが、蛍光色素又は酵素は、抗体のＦｃフラグメント以外にプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇに固定化することができ、例えば、蛍光色素又は酵素は、抗体のＦｃフラグメントと、プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇとに同時に固定化されていてもよい。）、タンパク質（Ａ）１及びタンパク質（Ｂ）２の合計２個とプロテインＡ６（図示していないが、プロテインＡ以外にプロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇであってもよい。プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇを用いる場合、会合（結合）し得るタンパク質（Ａ）及びタンパク質（Ｂ）は、合計２～５個である。）とを含むものである。
　なお、図３及び図４に示す融合タンパク質（II）１１が有する抗体は、それぞれ１個のタンパク質（Ａ）１及びタンパク質（Ｂ）２であるが、本発明は、この態様に限定されず、タンパク質（Ａ）１のみからなる態様なども包含される。
　本発明において、プロテインＡ及びプロテインＧは天然型であっても組換え型であってもよい。
　これら融合タンパク質のうち、後述する凝集体を効率良く安定に形成できることから、融合タンパク質が有するタンパク質（Ａ）及びタンパク質（Ｂ）の合計個数が多い（すなわち、濃度が高い）ものほど好ましい。
　＜集合体の製造方法＞
　本発明の集合体の製造方法は、以下の製造方法（ｉ）～（iv）のいずれかの態様を有し、製造方法（ｉ）は、下記工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含み；製造方法（ii）は、下記工程（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）を含み；製造方法（iii）は、下記工程（ｄ）及び（ｆ）を含み；製造方法（iv）は、下記工程（ｅ）及び（ｆ）を含むことを特徴とするものである。
　工程（ａ）：標的物質、標的ウイルス又は標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）及び該部位αを有する標的物質、標的ウイルス又は標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）からなるタンパク質、ビオチンならびにアビジンのうち少なくとも１つに蛍光色素又は酵素を固定化する工程。
　工程（ｂ）：蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよい上記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）それぞれに、蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいビオチンを固定化することによって、ビオチン化タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）を得る工程。
　工程（ｃ）：蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいビオチン化タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）を、それぞれ１個以上含むように混合し、該ビオチン化タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）の合計に対して、蛍光色素又は酵素に固定化されていてもよいアビジンを、そのモル比で４：１以上となるようにさらに混合することによって、集合体を得る工程。
　工程（ｄ）：標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合する抗体（Ａ）及び該部位αを有する標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合する抗体（Ｂ）それぞれに蛍光色素又は酵素を固定化する工程。
　工程（ｅ）：プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇに蛍光色素又は酵素を固定化する工程。
　工程（ｆ）：蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよい抗体（Ａ）及び（Ｂ）を、それぞれ１個以上含むように混合し、該抗体（Ａ）及び（Ｂ）の合計に対して、蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇを、そのモル比で２：１以上となるようにさらに混合することによって、融合タンパク質含有集合体を得る工程。
　〔製造方法（ｉ）〕
　製造方法（ｉ）は、上記工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むものであって、タンパク質（（Ａ），（Ｂ））、ビオチン及びアビジンのうち少なくとも１つに蛍光色素又は酵素が固定化されている融合タンパク質（Ｉ）含有集合体を製造する方法である。
　該タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）それぞれは、抗体（免疫グロブリン）、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント及びＦ（ａｂ’）フラグメントのいずれかであることが好ましい。
　（工程（ａ））
　工程（ａ）とは、「標的物質、標的ウイルス又は標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）」（タンパク質（Ａ））、及び「該部位αを有する標的物質、標的ウイルス又は標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）」（タンパク質（Ｂ））からなるタンパク質、ビオチンならびにアビジンのうち少なくとも１つに「蛍光色素」又は「酵素」を固定化する工程である。
　タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）、ならびに「蛍光色素」及び「酵素」は、上記＜集合体＞の項目内で記載したものと同様である。なお、上記工程（ｂ）、（ｄ）及び（ｅ）に記載のこれらの用語についても同様である。
　タンパク質（（Ａ）及び（Ｂ））、ビオチン及び／又はアビジンに酵素を固定化する方法として、例えば、アミンカップリングする方法、チオールカップリングする方法、アルデヒドカップリングする方法などが挙げられるが、本発明はこれらの方法に限定されない。
　タンパク質（Ａ），（Ｂ）に蛍光色素又は酵素を固定化する際、タンパク質（Ａ），（Ｂ）が、抗体である場合、蛍光色素又は酵素は、好ましくは定常領域（ＣＨ１及びＣＬ）、より好ましくはＦｃフラグメントに固定化し、タンパク質（Ａ），（Ｂ）が、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント又はＦ（ａｂ’）２フラグメントである場合、蛍光色素又は酵素は、定常領域（ＣＨ１及びＣＬ）に固定化することが好ましい。
　このようにしてタンパク質（Ａ）、タンパク質（Ｂ）、ビオチン及びアビジンに蛍光色素又は酵素を固定化したものを、それぞれ「蛍光色素又は酵素標識タンパク質（Ａ）」、「蛍光色素又は酵素標識タンパク質（Ｂ）」、「蛍光色素又は酵素標識ビオチン」及び「蛍光色素又は酵素標識アビジン」ともいう。
　（工程（ｂ））
　工程（ｂ）とは、「蛍光色素」又は「酵素」が固定化されていてもよい「標的物質、標的ウイルス又は標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）」及び「該部位αを有する標的物質、標的ウイルス又は標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）」それぞれに、「蛍光色素」又は「酵素」が固定化されていてもよいビオチンを固定化することによって、「ビオチン化タンパク質（Ａ）」及び「ビオチン化タンパク質（Ｂ）」を得る工程である。なお、「蛍光色素」又は酵素は、タンパク質（Ａ），（Ｂ）及びビオチンに同時に固定化されていてもよい。
　すなわち、工程（ｂ）とは、（１）蛍光色素又は酵素標識タンパク質（Ａ），（Ｂ）にビオチンを固定化する工程；（２）タンパク質（Ａ），（Ｂ）に蛍光色素又は酵素標識ビオチンを固定化する工程；（３）タンパク質（Ａ），（Ｂ）にビオチンを固定化する工程；（４）蛍光色素又は酵素標識抗体（Ａ），（Ｂ）に蛍光色素又は酵素標識ビオチンを固定化する工程のいずれかである。
　タンパク質にビオチンを固定化する方法として、例えば、アミンカップリングする方法、チオールカップリングする方法、アルデヒドカップリングする方法などが挙げられるが、タンパク質及びビオチンのいずれかに酵素が固定化されている場合であっても、本発明はこれらの方法に限定するものではない。
　タンパク質（Ａ），（Ｂ）が、抗体である場合、ビオチンは、好ましくは定常領域（ＣＨ１及びＣＬ）、より好ましくはＦｃフラグメントに固定化し、タンパク質（Ａ），（Ｂ）が、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント又はＦ（ａｂ’）２フラグメントである場合、ビオチンは、定常領域（ＣＨ１及びＣＬ）に固定化することが好ましい。
　このようにしてタンパク質（Ａ）及びタンパク質（Ｂ）それぞれにビオチンを固定化したものを、それぞれ「ビオチン化タンパク質（Ａ）」及び「ビオチン化タンパク質（Ｂ）」ともいう。
　（工程（ｃ））
　工程（ｃ）とは、蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいビオチン化タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）を、それぞれ１個以上含むように混合し、該ビオチン化タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）の合計に対して、蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいアビジンを、そのモル比で４：１以上となるようにさらに混合することによって、集合体を得る工程である。
　すなわち、工程（ｃ）は、上記工程（ｂ）を経て得られた、蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいビオチン化タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）を、それぞれ少なくとも１個、好ましくは９：１～１：９、より好ましくは８：２～２：８、さらに好ましくは７：３～３：７、特に好ましくは６：４～４：６、もっとも好ましくは５：５の比で含むように混合し、該ビオチン化タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）の合計に対して、蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいアビジンを、そのモル比で４：１以上、好ましくは４：１となるようにさらに混合することによって、図１及び図２に示すような融合タンパク質（Ｉ）含有集合体を得る工程である。
　該ビオチン化タンパク質（Ａ）と（Ｂ）との個数の比、及び該ビオチン化タンパク質（Ａ），（Ｂ）と該アビジンとのモル比が上記範囲内であると、凝集体を効率良く安定に形成できることから好ましい。
　〔製造方法（ii）〕
　製造方法（ii）は、上記工程（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）を含むものであって、抗体（好ましくは抗体の定常領域（ＣＨ１及びＣＬ）、より好ましくは抗体のＦｃフラグメント）と、プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇとに蛍光色素又は酵素が固定化されている融合タンパク質（II）含有集合体を製造する方法である。
　（工程（ｄ））
　工程（ｄ）とは、「標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合する抗体（Ａ）」及び「該部位αを有する標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合する抗体（Ｂ）」それぞれに「蛍光色素」又は「酵素」を固定化する工程である。
　該抗体（Ａ）及び（Ｂ）のそれぞれに蛍光色素又は酵素を固定化する方法は、上記工程（ａ）に記載のタンパク質への固定化方法と同様である。
　該抗体（Ａ）及び（Ｂ）に蛍光色素又は酵素を固定化したものを、それぞれ「）蛍光色素又は酵素標識抗体（Ａ）」及び「蛍光色素又は酵素標識抗体（Ｂ）」ともいう。
　（工程（ｅ））
　工程（ｅ）とは、「プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇ」に「蛍光色素」又は「酵素」を固定化する工程である。
　「プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇ」は上述した通りである。
　プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇに蛍光色素又は酵素を固定化する方法として、例えば、アミンカップリングする方法、チオールカップリングする方法、アルデヒドカップリングする方法などが挙げられるが、本発明はこれらの方法に限定するものではない。
　このようにプロテインＡ、プロテインＧ及びプロテインＡ／Ｇそれぞれに蛍光色素又は酵素を固定化したものを、「蛍光色素又は酵素標識プロテインＡ」、「蛍光色素又は酵素標識プロテインＧ」及び「蛍光色素又は酵素標識プロテインＡ／Ｇ」ともいう。
　（工程（ｆ））
　工程（ｆ）とは、蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよい抗体（Ａ）及び（Ｂ）を、それぞれ１個以上含むように混合し、該抗体（Ａ）及び（Ｂ）の合計に対して、蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇを、そのモル比で２：１以上となるようにさらに混合することによって、集合体を得る工程である。
　すなわち、工程（ｆ）とは、該抗体（Ａ）及び（Ｂ）を、それぞれ少なくとも１個、好ましくは９：１～１：９、より好ましくは８：２～２：８、さらに好ましくは７：３～３：７、特に好ましくは６：４～４：６、もっとも好ましくは５：５の比で含むように混合し、該抗体（Ａ）及び（Ｂ）の合計に対して、蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇを、そのモル比で２：１以上、好ましくは２：１となるようにさらに混合することによって、図３及び図４に示すような融合タンパク質（II）含有集合体を得る工程である。
　蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよい抗体（Ａ）と（Ｂ）との個数の比、及び該抗体（Ａ），（Ｂ）と蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇとのモル比が上記範囲内であると、凝集体を効率良く安定に形成できることから好ましい。
　〔製造方法（iii）〕
　製造方法（iii）は、上記工程（ｄ）及び（ｆ）を含むものであって、抗体（好ましくは抗体の定常領域（ＣＨ１及びＣＬ）、より好ましくは抗体のＦｃフラグメント）のみに蛍光色素又は酵素が固定化されている融合タンパク質（II）含有集合体を製造する方法である。
　〔製造方法（iv）〕
　製造方法（iv）は、上記工程（ｅ）及び（ｆ）を含むものであって、プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇのみに蛍光色素又は酵素が固定化されている融合タンパク質（II）含有集合体を製造する方法である。
　＜アッセイ法＞
　本発明のアッセイ法は、下記工程（ｇ）～（ｌ）を含むことを特徴とするものである。
　工程（ｇ）：本発明の集合体と検体とを接触させることによって、該検体に含有される標的物質、標的ウイルス又は標的細胞を介して凝集体を形成する工程。
　工程（ｈ）：上記工程（ｇ）を経て得られた反応物をフィルタに通すことによって、該凝集体のみを単離する工程。
　工程（ｉ）：上記工程（ｈ）を経て得られた凝集体に、蛍光基質又は消光剤基質を反応させ、それぞれ蛍光色素（Ｅ）又は消光剤を生成する工程（ただし、上記工程（ｇ）において酵素を含む融合タンパク質含有集合体を用いた場合のみ。）。
　工程（ｊ）：透明平面基板と、該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と、該金属薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された誘電体からなるスペーサ層、又は該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された蛍光色素（Ｆ）層とを少なくとも有するプラズモン励起センサの、該スペーサ層表面又は該蛍光色素（Ｆ）層表面に、上記工程（ｈ）を経て得られた凝集体又は上記工程（ｉ）を経て得られた蛍光色素（Ｅ）又は消光剤を接触させる工程。
　工程（ｋ）：上記工程（ｊ）で得られたプラズモン励起センサに、該基板の、該薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程。及び、
　工程（ｌ）：上記工程（ｋ）で得られた測定結果から、上記標的物質量、上記標的ウイルス量又は上記標的細胞量を算出する工程。
　本発明のアッセイ法は、上記工程（ｇ），（ｈ）の免疫反応場、及び上記工程（ｊ），（ｋ）のＳＰＦＳ検出場をそれぞれ独立することができ、免疫反応条件及び検出条件の最適化をすることができることから好適である。
　〔工程（ｇ）〕
　工程（ｇ）とは、本発明の「集合体」と「検体」とを「接触」させることによって、該検体に含有される標的物質、標的ウイルス又は標的細胞を介して「凝集体」を形成する工程である。
　本発明の「集合体」は上述した通りであって、例えば、図５及び図６に示す集合体２０のように、融合タンパク質（Ｉ）１０が複数個存在するものを言う。
　（検体）
　「検体」としては、例えば、血液（血清・血漿）、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが挙げられ、所望の溶媒、緩衝液等に適宜希釈して用いてもよい。これら検体のうち、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液及び唾液が好ましい。
　（接触）
　集合体と検体とを接触させる条件として、温度は、通常４～５０℃、好ましくは１０～４０℃、時間としては、通常０．５～１８０分間、好ましくは５～６０分間である。
　（凝集体）
　本発明において、「凝集体」とは、例えば、図７及び図８に示すように、融合タンパク質（II）１２同士が、標的物質、標的ウイルス又は標的細胞７に会合（結合）して形成された高分子量体であり、図７及び図８に示すように、融合タンパク質（Ｉ）１０含有集合体２０と検体とを免疫反応場において接触させることによって凝集体２１を製造することができる。
　〔工程（ｈ）〕
　工程（ｈ）とは、上記工程（ｇ）を経て得られた「反応物」を「フィルタ」に通すことによって、上記凝集体のみを単離する工程である。
　（反応物）
　「反応物」とは、上記工程（ｇ）を経て得られたものであり、図９及び図１０に示すように、標的物質、標的ウイルス又は標的細胞７のうち、例えば、検体が標的細胞を含む血液である場合、「反応物」とは、凝集体２１と、未反応の融合タンパク質（II）１２と、標的細胞が除かれた検体（これは、検体に含まれる標的細胞が、融合タンパク質（II）１２と会合し、凝集体２１を形成したため、検体から標的細胞のみが特異的に除かれた。）とを含む。
　（フィルタ）
　本発明で用いるフィルタは、本発明の融合タンパク質、標的物質、標的ウイルス又は標的細胞それぞれ単体ではトラップしないが、凝集体をトラップするものであれば特に限定するものではなく、標的物質１個を介して融合タンパク質が２個以上連なった凝集体をトラップするものが好ましい。市販品としては、例えば、ワットマン（株）製の「アノポア、孔径：０．０２（μｍ）」などが好適である。
　〔工程（ｉ）〕
　工程（ｉ）とは、上記工程（ｇ）において酵素を含む融合タンパク質含有集合体を用いた場合、上記工程（ｈ）を経て得られた凝集体に、「蛍光基質」又は「消光剤基質」を反応させ、それぞれ「蛍光色素（Ｅ）」又は「消光剤」を生成する工程である。
　さらに該工程（ｉ）は、蛍光色素（Ｅ）又は消光剤が生成した後に、該凝集体と蛍光色素（Ｅ）又は消光剤との混合物から、上記フィルタによって蛍光色素（Ｅ）のみ又は消光剤のみを単離することが好ましい。
　（蛍光基質）
　本発明で用いられる「蛍光基質」とは、それ自体は蛍光を発することはなく、上記融合タンパク質に固定化されている酵素（Ｃ）によって加水分解され蛍光色素（Ｅ）に変換されるものであれば、本発明は特に限定するものではなく、例えば、表２に記載のＮｏ．１～８などを用いることができる。
　これら蛍光基質のうち、下記「プラズモン励起センサ」が含む金属薄膜が、金を含む金属から形成されている場合、金の透過率や励起波長の観点から、表２中Ｎｏ．７の１，３－ｄｉｃｌｏｒｏ－９，９－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－ａｃｒｉｄｉｎｅ－２－ｏｎｅ－７－ｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＤＤＡＯ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社製）が好ましい。
　蛍光基質の自家蛍光波長は、自家蛍光波長と蛍光色素（Ｅ）の蛍光波長との差が大きいほどバックグラウンドシグナルの影響を回避しやすく高精度な測定が可能となるが、特に制限されるものではない。
　（蛍光色素（Ｅ））
　本発明において、「蛍光色素（Ｅ）」は、所定の励起光を照射する、又は電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する物質の総称であり、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も包含する。
　本発明で用いられる蛍光色素（Ｅ）は、上記融合タンパク質に固定化されている酵素（Ｃ）によって前述の蛍光基質が加水分解されたものであり、後述する金属薄膜による吸光に起因する消光を受けない限りにおいて、その種類に特に制限はなく、公知の蛍光色素のいずれであってもよい。一般に、単色比色計（ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ）よりむしろフィルタを備えた蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークス・シフトを有する蛍光色素が好ましい。
　表２に、本発明に用いられる蛍光基質の例を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（消光剤基質／消光剤）
　上記「酵素反応（Ｄ－１）」に用いられ得るβ－ガラクトシダーゼ（βＧＡＬ）は、「消光剤基質」であるＴＧ－βＧａｌからβＧａｌを脱離させ、「消光剤」であるＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ（ＴＧ）を生成する反応を触媒する。
　また、β－グルコシダーゼ（βＧｌｕ）は、「消光剤基質」であるＴＧ－βＧｌｕからβＧｌｕを脱離させ、「消光剤」であるＴＧを生成する反応を触媒する。
　なお、遊離のＴＧは励起波長が４９０ｎｍであり、蛍光波長が４７５～４９５ｎｍである蛍光色素（Ｆ）とＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　Ｅｎｅｒｇｙ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＦＲＥＴ；蛍光共鳴エネルギー移動）を起すので、蛍光色素（Ｆ）であるテルビウム（Ｔｂ）キレートの蛍光（蛍光波長：４９５ｎｍ）又は強化シアン蛍光タンパク質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｃｙａｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＣＦＰ）（蛍光波長：４７５ｎｍ）などの蛍光を消光することができる。
　また、ＴＧは、本発明において、下記式で表される２－Ｍｅ　ＴＧや、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
下記式で表される２－Ｍｅ－４－ＯＭｅ　ＴＧなども包含する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）は、「消光剤基質」であるＡｔｔｏＰｈｏｓ（登録商標）基質を加水分解する反応を触媒し、「消光剤」であるＢＢＴ（２′－［２－ｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｙｌ］－６′－ｈｙｄｒｏｘｙｌ－ｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｅ）を生成させる。ここで、蛍光色素（Ｆ）でもあるＢＢＴ（励起波長４８２ｎｍ）は、上述のＴＧと同様、テルビウム（Ｔｂ）キレート又はＥＣＦＰとＦＲＥＴを起し、それぞれ消光することができる。
　上記「酵素反応（Ｄ－２）」に用いられ得るグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）は、グルコースを「消光剤基質」とする酵素反応により、「消光剤」であるグルコノラクトンと過酸化水素とを生成する。生成した過酸化水素は、過酸化水素が溶解した水系溶液のｐＨを低下させ、蛍光色素（Ｆ）として用いている２－Ｍｅ－４－ＯＭｅ　ＴＧ、２－ＯＭｅ－５－Ｍｅ　ＴＧ又は２－ＯＭｅ　ＴＧなどの蛍光強度が小さくする（すなわち消光する。）ことができる。
　本発明において、消光剤基質、酵素、消光剤及び蛍光色素（Ｆ）の好ましい組み合わせとして、下表３に示すものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　このような消光剤基質の送液中の濃度は、０．００１～１０，０００μｇ／ｍＬが好ましく、１～１，０００μｇ／ｍＬがより好ましい。
　送液を循環させる温度、時間及び流速は、それぞれ上記工程（ｇ）の場合と同様である。
　〔工程（ｊ）〕
　工程（ｊ）とは、「透明平面基板」と、該基板の一方の表面に形成された「金属薄膜」と、該金属薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された「誘電体からなるスペーサ層」、又は該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された「蛍光色素（Ｆ）層」とを少なくとも有するプラズモン励起センサの、該スペーサ層表面又は該蛍光色素（Ｆ）層表面に、上記工程（ｈ）を経て得られた凝集体又は上記工程（ｉ）を経て得られた蛍光色素（Ｅ）又は消光剤を「接触」させる工程である。
　より詳細には、工程（ｊ）とは、「透明平面基板」と、該基板の一方の表面に形成された「金属薄膜」と、該金属薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された「誘電体からなるスペーサ層」とを少なくとも有するプラズモン励起センサの、該スペーサ層表面に、上記工程（ｈ）を経て得られた凝集体又は上記工程（ｉ）を経て得られた蛍光色素（Ｅ）を「接触」させる工程、又は
　工程（ｊ）とは、「透明平面基板」と、該基板の一方の表面に形成された「金属薄膜」と、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された「蛍光色素（Ｆ）層」とを少なくとも有するプラズモン励起センサの、該蛍光色素（Ｆ）層表面に、上記工程（ｉ）を経て得られた消光剤を「接触」させる工程である。
　なお、後者の工程（ｊ）において、プラズモン励起センサは、「金属薄膜」と「蛍光色素（Ｆ）層」との間に、前者の工程（ｊ）に含まれる「誘電体からなるスペーサ層」を有していてもよい。
　（透明平面基板）
　本発明で用いられる「透明平面基板」としては、石英製やガラス製であっても、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などのプラスチック製であってもよく、屈折率〔ｎｄ〕が好ましくは１．４０～２．２０であり、厚さが好ましくは０．０１～１０ｍｍ、より好ましくは０．５～５ｍｍであれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。
　なお、ガラス製の透明平面基板は、市販品として、ショット日本（株）製の「ＢＫ７」（屈折率〔ｎｄ〕１．５２）及び「ＬａＳＦＮ９」（屈折率〔ｎｄ〕１．８５）、（株）住田光学ガラス製の「Ｋ－ＰＳＦｎ３」（屈折率〔ｎｄ〕１．８４）、「Ｋ－ＬａＳＦｎ１７」（屈折率〔ｎｄ〕１．８８）及び「Ｋ－ＬａＳＦｎ２２」（屈折率〔ｎｄ〕１．９０）、（株）オハラ製の「Ｓ－ＬＡＬ１０」（屈折率〔ｎｄ〕１．７２）などが光学的特性と洗浄性との観点から好ましい。
　透明平面基板は、その表面に金属突起を形成する前に、その表面を酸及び／又はプラズマにより洗浄することが好ましい。
　酸による洗浄処理としては、０．００１～１Ｎの塩酸中に、１～３時間浸漬することが好ましい。
　プラズマによる洗浄処理としては、例えば、プラズマドライクリーナー（ヤマト科学（株）製の「ＰＤＣ２００」）中に、０．１～３０分間浸漬させる方法が挙げられる。
　（金属薄膜）
　上記透明平面基板の一方の表面に形成された「金属薄膜」としては、好ましくは、金、銀、アルミニウム、銅、及び白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは金からなることが望ましく、これら金属の合金であってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強が大きくなることから好適である。
　なお、透明平面基板としてガラス製平面基板を用いる場合に限り、ガラスと金属薄膜とをより強固に接着することができることから、あらかじめクロム、ニッケルクロム合金又はチタンの薄膜を形成することが好ましい。
　透明平面基板上に金属薄膜を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法等）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。薄膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法又は蒸着法によりクロムの薄膜及び／又は金属薄膜を形成することが好ましい。
　金属薄膜の厚さとしては、金：５～５００ｎｍ、銀：５～５００ｎｍ、アルミニウム：５～５００ｎｍ、銅：５～５００ｎｍ、白金：５～５００ｎｍ、及びそれらの合金：５～５００ｎｍが好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１～２０ｎｍが好ましい。
　電場増強効果の観点から、金：２０～７０ｎｍ、銀：２０～７０ｎｍ、アルミニウム：１０～５０ｎｍ、銅：２０～７０ｎｍ、白金：２０～７０ｎｍ、及びそれらの合金：１０～７０ｎｍがより好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１～３ｎｍがより好ましい。
　金属薄膜の厚さが上記範囲内であると、表面プラズモンが発生し易いので好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜であれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。
　（誘電体からなるスペーサ層）
　「誘電体からなるスペーサ層」の形成に用いられる誘電体としては、光学的に透明な各種無機物、天然又は合成ポリマーを用いることもできる。その中で、化学的安定性、製造安定性及び光学的透明性に優れていることから、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）又は二酸化チタン（ＴｉＯ２）を含むことが好ましい。
　誘電体からなるスペーサ層の厚さは、通常１０ｎｍ～１ｍｍであり、共鳴角安定性の観点からは、好ましくは３０ｎｍ以下、より好ましくは１０～２０ｎｍである。一方、電場増強の観点から、好ましくは２００ｎｍ～１ｍｍであり、さらに電場増強の効果の安定性から、４００ｎｍ～１，６００ｎｍがより好ましい。
　誘電体からなるスペーサ層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法、電子線蒸着法、熱蒸着法、ポリシラザン等の材料を用いた化学反応による形成方法、又はスピンコータによる塗布などが挙げられる。
　（蛍光色素（Ｆ）層）
　「蛍光色素（Ｆ）層」とは、上記金属薄膜の、上記透明平面基板とは接していないもう一方の表面に、蛍光色素（Ｆ）を固定化した層であって、（１）蛍光色素（Ｆ）とポリマーとを含有する組成物を該金属薄膜上に塗工することによって形成することもでき、（２）アルカンチオールなどからなるＳＡＭ（自己組織化単分子膜；Ｓｅｌｆ－Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ　Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）を介して、蛍光色素（Ｆ）を該金属薄膜上に結合することによって形成することもできる。
　（１）の場合、蛍光色素（Ｆ）とポリマーとは化学的結合をしていても、していなくてもよく、また重合性基を有するアルカンチオールなどからなるＳＡＭを金属薄膜に結合させて、他の重合性モノマー、蛍光色素（Ｆ）及び重合開始剤を加えて共重合させることにより蛍光色素（Ｆ）とポリマーとを含有する組成物を形成することもできる。
　（２）の場合、アミノ基又はカルボキシル基を有するアルカンチオールと、それらの基と反応して共有結合する基を有する蛍光色素（Ｆ）とを結合することによって、蛍光色素（Ｆ）を金属薄膜に固定化することができる。なお、蛍光色素（Ｆ）層と金属薄膜との間に誘電体からなるスペーサ層を設ける場合、従来公知のシランカップリング剤を介して該スペーサ層と蛍光色素（Ｆ）とを結合することができる。
　このように、蛍光色素（Ｆ）とポリマーとを含有してなる層を形成する（１）の場合は、固定化できる蛍光色素（Ｆ）量が多く、得られる層の強度が高いことから好ましい。
　「蛍光色素（Ｆ）」も蛍光色素（Ｅ）と同様に、本発明において、所定の励起光を照射する、又は電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する物質の総称であり、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も含む。
　本発明で用いられる「蛍光色素（Ｆ）」としては、例えば、テルビウム（Ｔｂ）キレート（蛍光波長：４９０ｎｍ）、強化シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）（蛍光波長：４７５ｎｍ）、２－Ｍｅ－４－ＯＭｅ　ＴＧ、２－ＯＭｅ－５－Ｍｅ　ＴＧ、２－ＯＭｅ　ＴＧなどが挙げられる。
　このような蛍光色素（Ｆ）は、水溶性が高いものが多く、これら蛍光色素（Ｆ）を蛍光色素（Ｆ）層としてポリマー中に分子間相互作用で固定化するためには、蛍光色素（Ｆ）が有するカルボキシル基に、疎水性の芳香族環が有するアミノ基やアルコールを反応させて水に不溶性の構造にするか、又は疎水性ポリマーと蛍光色素（Ｆ）の活性エステルとの反応によって化学的に結合する必要がある。ポリマーと蛍光色素（Ｆ）とが化学的な結合を有しない場合、ポリマーの溶解パラメータ（Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ　Ｐａｒａｍｅｔｅｒ；ＳＰ）に近い構造となるように蛍光色素（Ｆ）を修飾することが好ましい。
　これら蛍光色素（Ｆ）は１種単独でも、２種以上併用してもよい。
　（接触）
　プラズモン励起センサの、誘電体からなるスペーサ層表面又は蛍光色素（Ｆ）層表面に、上記工程（ｈ）を経て得られた凝集体又は上記工程（ｉ）を経て得られた蛍光色素（Ｅ）又は消光剤を「接触」させる方法としては、例えば、単離した蛍光色素（Ｅ）又は消光剤を含有した溶液の滴下、吹付、塗布などの方法が挙げられる。また、プラズモン励起センサに後述する流路を形成し、蛍光色素（Ｅ）又は消光剤を含有した溶液をプラズモン励起センサ表面に接触させるような方法も挙げられる。
　「流路」とは、微量な薬液の送達を効率的に行うことができ、反応促進を行うために送液速度を変化させたり、循環させたりすることができる角筒状又は円筒（管）状のものであって、プラズモン励起センサを設置する個所近傍は角筒状構造を有することが好ましく、薬液を送達する個所近傍は円筒（管）状を有することが好ましい。
　その材料としては、プラズモン励起センサ部ではメチルメタクリレート、スチレン等を原料として含有するホモポリマー又は共重合体；ポリエチレン、ポリオレフィン等からなり、薬液送達部ではシリコンゴム、テフロン（登録商標）、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリマーを用いる。
　プラズモン励起センサ部においては、凝集体との接触効率を高め、拡散距離を短くする観点から、プラズモン励起センサ部の流路の断面として、縦×横がそれぞれ独立に１００ｎｍ～１ｍｍ程度が好ましい。
　流路にプラズモン励起センサを固定する方法としては、小規模ロット（実験室レベル）では、まず、該プラズモン励起センサの誘電体からなるスペーサ層が形成されている表面に、流路高さ０．５ｍｍを有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを該プラズモン励起センサの金属薄膜が形成されている部位を囲むようにして圧着し、次に、該ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートと該プラズモン励起センサとをビス等の閉め具により固定する方法が好ましい。
　工業的に製造される大ロット（工場レベル）では、流路にプラズモン励起センサを固定する方法として、プラスチックの一体成形品に金基板を形成、又は別途作製した金基板を固定し、金表面に誘電体層又は蛍光色素（Ｆ）層形成と、リガンド固定化とを行った後、流路の天板に相当するプラスチックの一体成形品により蓋をすることで製造できる。必要に応じてプリズムを流路に一体化することもできる。
　「送液」としては、検体を希釈した溶媒又は緩衝液と同じものが好ましく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
　送液を循環させる温度及び時間としては、検体の種類などにより異なり、特に限定されるものではないが、通常２０～４０℃×１～６０分間、好ましくは３７℃×５～１５分間である。
　送液中の凝集体の初期濃度は、１００μｇ／ｍＬ～０．００１ｐｇ／ｍＬであってもよい。
　送液の総量、すなわち流路の容積としては、通常０．００１～２０ｍＬ、好ましくは０．１～１ｍＬである。
　送液の流速は、通常１～２，０００μＬ／ｍｉｎ、好ましくは５～５００μＬ／ｍｉｎである。
　〔工程（ｋ）〕
　工程（ｋ）とは、上記工程（ｊ）で得られたプラズモン励起センサに、該基板の、該薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程である。
　（光学系）
　本発明のアッセイ法で用いる光源は、金属薄膜にプラズモン励起を生じさせることができるものであれば、特に制限がないものの、波長分布の単一性及び光エネルギーの強さの点で、レーザ光を光源として用いることが好ましい。レーザ光は、光学フィルタを通して、プリズムに入射する直前のエネルギー及びフォトン量を調節することが望ましい。
　レーザ光の照射により、全反射減衰条件（ＡＴＲ）において、金属薄膜の表面に表面プラズモンが発生する。表面プラズモンの電場増強効果により、照射したフォトン量の数十～数百倍に増えたフォトンにより蛍光色素を励起する。なお、該電場増強効果によるフォトン増加量は、透明平面基板の屈折率、金属薄膜の金属種及びその膜厚に依存するが、通常、金では約１０～２０倍の増加量となる。
　蛍光色素は、光吸収により分子内の電子が励起され、短時間のうちに第一電子励起状態に移動し、この状態（準位）から基底状態に戻る際、そのエネルギー差に相当する波長の蛍光を発する。
　「レーザ光」としては、例えば、波長２００～９００ｎｍ、０．００１～１，０００ｍＷのＬＤ、波長２３０～８００ｎｍ（金属薄膜に用いる金属種によって共鳴波長が決まる。）、０．０１～１００ｍＷの半導体レーザなどが挙げられる。
　「プリズム」は、各種フィルタを介したレーザ光が、プラズモン励起センサに効率よく入射することを目的としており、屈折率が透明平面基板１と同じであることが好ましい。本発明は、全反射条件を設定できる各種プリズムを適宜選択することができることから、角度、形状に特に制限はなく、例えば、６０度分散プリズムなどであってもよい。このようなプリズムの市販品としては、上述した「ガラス製の透明平面基板」の市販品と同様のものが挙げられる。
　「光学フィルタ」としては、例えば、減光（ＮＤ）フィルタ、ダイアフラムレンズなどが挙げられる。「減光（ＮＤ）フィルタ」（又は、中性濃度フィルタ）は、入射レーザ光量を調節することを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器を使用するときには精度の高い測定を実施する上で用いることが好ましい。
　「偏光フィルタ」は、レーザ光を、表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするために用いられるものである。
　「カットフィルタ」は、外光（装置外の照明光）、励起光（励起光の透過成分）、迷光（各所での励起光の散乱成分）、プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、プラズモン励起センサ表面上の構造体又は付着物などの影響で発生する散乱光）などの光学ノイズ、及び蛍光色素（Ｅ）又は（Ｆ）の自家蛍光を除去するフィルタであって、例えば、干渉フィルタ、色フィルタなどが挙げられる。
　「集光レンズ」は、検出器に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであり、任意の集光系でよい。簡易な集光系として、顕微鏡などで使用されている、市販の対物レンズ（例えば、（株）ニコン製又はオリンパス（株）製等）を転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０～１００倍が好ましい。
　「ＳＰＦＳ検出部」としては、超高感度の観点からは光電子増倍管（浜松ホトニクス（株）製のフォトマルチプライヤー）が好ましい。また、これらに比べると感度は下がるが、画像として見ることができ、かつノイズ光の除去が容易なことから、多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサも好適である。
　〔工程（ｌ）〕
　工程（ｌ）とは、上記工程（ｋ）で得られた測定結果から、上記標的物質量、上記標的ウイルス量又は上記標的細胞量を算出する工程である。
　より具体的には、工程（ｌ）は、既知濃度のアナライトでの測定を実施することで検量線を作成し、作成された検量線に基づいて被測定検体中のアナライト量を測定シグナルから算出する工程である。
　（アッセイシグナル）
　アッセイシグナルは、上記工程（ｋ）の前に測定したシグナルを“ブランクシグナル”、としたとき、下記式で算出することができる。
アッセイシグナル＝｜（アッセイ測定シグナル）－（ブランクシグナル）｜
　次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
（Ｉ）蛍光色素を含む融合タンパク質含有集合体の場合
　［実施例１］
　（蛍光色素を含む融合タンパク質（Ｉ）含有集合体の製造方法（ｉ）の実施）
　工程（ａ）として、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体１Ｄ５及び抗ＡＦＰモノクローナル抗体６Ｄ２（２．５ｍｇ／ｍＬ、（株）日本医学臨床検査研究所製）に、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ社製）を用いて、それぞれＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７を固定化した。
　工程（ｂ）として、上記工程（ａ）で得られた蛍光標識抗体１Ｄ５及び６Ｄ２に、「ＥＺ－Ｌｉｎｋ　Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ－ＰＥＯ　Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ」（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いてビオチン化した。
　工程（ｃ）として、上記工程（ｂ）で得られた蛍光標識ビオチン化抗体１Ｄ５及び６Ｄ２とアビジンとを、該１Ｄ５：該６Ｄ２：アビジンのモル比が、２：２：１になるように混合することによって、融合タンパク質（Ｉ）含有集合体を製造した。
　［実施例２］
　（融合タンパク質（II）含有集合体の製造方法（iv））
　工程（ｄ）として、抗ＡＦＰモノクローナル抗体１Ｄ５及び抗ＡＦＰモノクローナル抗体６Ｄ２それぞれに、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ社）を用いて、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７を固定化した。
　工程（ｆ）として、上記工程（ｄ）で得られた蛍光標識抗体１Ｄ５と蛍光標識抗体６Ｄ２とプロテインＡ／Ｇとを、該１Ｄ５：該６Ｄ２：プロテインＡ／Ｇのモル比が１：１：１になるように混合することで、融合タンパク質（Ｉ）含有集合体を製造した。
　［作製例１］
　（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識２次抗体の作製）
　抗ＡＦＰモノクローナル抗体６Ｄ２に、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ社製）を用いて、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７を固定化した。
　［実施例３］
　（プラズモン励起センサの作製）
　屈折率〔ｎｄ〕１．７２、厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板（（株）オハラ製の「Ｓ－ＬＡＬ　１０」）をプラズマ洗浄し、該基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさらに金薄膜をスパッタリング法により形成した。クロム薄膜の厚さは１～３ｎｍ、金薄膜の厚さは４４～５２ｎｍであった。
　金薄膜の、クロム薄膜とは接していない片面に対して、誘電体として二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）からなるスペーサ層をスパッタリング法により形成した。該スペーサ層の厚さは、１５ｎｍであった。
　（アッセイ法の実施）
　工程（ｇ）として、まず実施例１で製造した融合タンパク質（Ｉ）含有集合体の溶液（１ｍｇ／ｍＬ）１００μＬに、標的抗原としてＡＦＰ（１ｎｇ／ｍＬのＴＢＳ溶液に調製）８００μＬを含有する検体を２５分間接触させた。
　工程（ｈ）として、上記工程（ｇ）を経て得られた反応物を、フィルタとしてワットマン（株）製の「ベクタスピン　ミクロ（孔径：０．０２μｍ）」に添加し、フィルタ上の溶液がなくなるまで遠心分離することによって、凝集体を単離した。その後、洗浄工程として、該フィルタに、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むＴＢＳ　１，０００μＬを添加し、再度、フィルタ上の溶液がなくなるまで遠心分離することによって、凝集体を洗浄した。
　工程（ｉ）として、上記工程（ｈ）を経てフィルタ上にトラップされた凝集体を、５０μＬのＰＢＳで再懸濁し、得られた溶液を、上記（プラズマ励起センサの作製）で得られたプラズマ励起センサの表面に送液することで接触させた。
　工程（ｊ）として、上記工程（ｉ）で得られたプラズモン励起センサに、ガラス製の透明平面基板の、金薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズム（シグマ光機（株）製）を経由してレーザ光（６３３ｎｍ、１０μＷ）を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量をＣＣＤから観察したときのシグナル値を計測し「アッセイ測定シグナル」とした。
　なお、ＡＦＰが０ｎｇ／ｍＬ時のＳＰＦＳ測定シグナルを「ブランクシグナル」とした。
　工程（ｋ）として、上記工程（ｊ）で得られた測定結果から、アッセイシグナルを以下の式で評価した。
アッセイシグナル＝｜（アッセイ測定シグナル）－（ブランクシグナル）｜
　得られた結果を表４に示す。
　［実施例４］
　（プラズモン励起センサの作製）
　実施例３と同様にしてプラズモン励起センサを作製した。
　（アッセイ法の実施）
　実施例２で得られた融合タンパク質（II）含有集合体の溶液（１ｍｇ／ｍＬ）１００μＬを用いた以外は、実施例３と同様にしてアッセイ法を実施した。得られた結果を表４に示す。
　［比較例１］
　（プラズモン励起センサの作製）
　屈折率〔ｎｄ〕１．７２、厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板（（株）オハラ製のＳ－ＬＡＬ　１０）をプラズマ洗浄し、該基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさらに金薄膜をスパッタリング法により形成した。クロム薄膜の厚さは１～３ｎｍ、金薄膜の厚さは４４～５２ｎｍであった。
　このようにして得られた基板を、１０－カルボキシ－１－デカンチオールを１ｍＭ含むエタノール溶液に２４時間以上浸漬し、金薄膜の片面にＳＡＭ（Ｓｅｌｆ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ　Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜）を形成した。基板を該溶液から取り出し、エタノール及びイソプロパノールで洗浄した後、エアガンで乾燥させた。
　ＳＡＭの表面に、流路高さ０．５ｍｍを有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを設け、ＳＡＭ表面が流路の内側となるように基板を配置し（ただし、該シリコンゴムスペーサは送液に触れない状態とする。）、流路の外側から圧着し、ビスで流路シートと該プラズモン励起センサとを固定した。
　（アッセイ法の実施）
　得られたプラズモン励起センサを流路に固定し、送液として超純水を１０分間、その後ＭＥＳ（２５℃、ｐＨ５．０）を２０分間、ペリスタポンプにより、室温（２５℃）、流速５００μＬ／ｍｉｎで循環させ、その表面を平衡化した。
　続いて、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を２５ｍｇ／ｍＬと、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を２５ｍｇ／ｍＬとを含むＭＥＳ（２５℃、ｐＨ５．０）を５ｍＬ送液し、２０分間循環送液させた後に、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍＬ、（株）日本医学臨床検査研究所製）を含むＡｃｅｔａｔｅ溶液（２５℃、ｐＨ６．０）２．５ｍＬを３０分間循環送液することで、ＳＡＭ上に１次抗体を固相化した。次いで、５０ｍＭＴｒｉｓ（２５℃、ｐＨ７．４）５ｍＬを１５分間循環送液することで、未反応の活性化エステル基をブロッキングし、１質量％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水にて３０分間循環送液することで、非特異的吸着防止処理を行った。
　送液をＰＢＳに代え、ＡＦＰを１ｎｇ／ｍＬ含むＰＢＳ溶液を０．８ｍＬ添加し、２５分間循環させた。
　Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むＴＢＳを送液として５分間循環させることによって洗浄した。
　作製例１で得られたＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７を標識した２次抗体（１，０００ｎｇ／ｍＬとなるように調製したＰＢＳ溶液）を２．５ｍＬ添加し、２０分間循環させた。
　その後、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むＴＢＳを送液として１０分間循環させることによって洗浄した。
　ＣＣＤから観察したときのシグナル値を計測しアッセイ測定シグナルとした。なお、ＡＦＰを０ｎｇ／ｍＬ時のＳＰＦＳ測定シグナルをブランクシグナルとした。アッセイ評価としては実施例１と同様のアッセイシグナルを算出することで評価した。
　本発明のアッセイ法による測定結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表４から、本発明のアッセイ法は、本発明の集合体を用いたホモジニアスアッセイ系をＳＰＦＳ測定に応用することで、比較例１の従来のヘテロジニアスＳＰＦＳ測定と比べて、桁違いの極めて高感度な測定が可能であることがわかった。
（II）酵素を含む融合タンパク質含有集合体の場合
　［実施例１］
　（酵素を含む融合タンパク質（Ｉ）含有集合体の製造方法（ｉ）の実施）
　工程（ａ）として、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体１Ｄ５及び抗ＡＦＰモノクローナル抗体６Ｄ２（２．５ｍｇ／ｍＬ、（株）日本医学臨床検査研究所製）に、「Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ」（（株）同仁化学研究所製）を用いて、アルカリフォスファターゼを固定化することによって、酵素標識抗体１Ｄ５及び６Ｄ２を製造した。
　工程（ｂ）として、上記工程（ａ）で得られた酵素標識抗体１Ｄ５及び６Ｄ２に、「ＥＺ－Ｌｉｎｋ　Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ－ＰＥＯ　Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ」（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いてビオチン化することによって、酵素標識ビオチン化抗体１Ｄ５及び６Ｄ２を製造した。
　工程（ｃ）として、上記工程（ｂ）で得られた酵素標識ビオチン化抗体１Ｄ５及び６Ｄ２とアビジンとを、該１Ｄ５：該６Ｄ２：アビジンのモル比が、２：２：１になるように混合することによって、融合タンパク質（Ｉ）含有集合体を製造した。
　［実施例２］
　（融合タンパク質（II）含有集合体の製造方法（iv））
　工程（ｄ）として、抗ＡＦＰモノクローナル抗体１Ｄ５及び抗ＡＦＰモノクローナル抗体６Ｄ２それぞれに、「Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ」（（株）同仁化学研究所製）を用いて、アルカリフォスファターゼを固定化することによって、酵素標識抗体１Ｄ５及び６Ｄ２を製造した。
　工程（ｆ）として、上記工程（ｄ）で得られた酵素標識抗体１Ｄ５と酵素標識抗体６Ｄ２とプロテインＡ／Ｇとを、該１Ｄ５：該６Ｄ２：プロテインＡ／Ｇのモル比が１：１：１になるように混合することで、融合タンパク質（II）含有集合体を製造した。
　［作製例１］
　（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識２次抗体の作製）
　抗ＡＦＰモノクローナル抗体６Ｄ２に、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ社製）を用いて、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７を固定化した。
　［実施例３］
　（プラズモン励起センサの作製）
　屈折率〔ｎｄ〕１．７２、厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板（（株）オハラ製の「Ｓ－ＬＡＬ　１０」）をプラズマ洗浄し、該基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさらに金薄膜をスパッタリング法により形成した。クロム薄膜の厚さは１～３ｎｍ、金薄膜の厚さは４４～５２ｎｍであった。
　金薄膜の、クロム薄膜とは接していない片面に対して、誘電体として二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）からなるスペーサ層をスパッタリング法により形成した。該スペーサ層の厚さは、１５ｎｍであった。
　（アッセイ法の実施）
　工程（ｇ）として、まず実施例１で製造した融合タンパク質（Ｉ）含有集合体の溶液（１ｍｇ／ｍＬ）１００μＬに、標的抗原としてＡＦＰ（１ｎｇ／ｍＬのＴＢＳ溶液に調製）８００μＬを含有する検体を２５分間接触させた。
　工程（ｈ）として、上記工程（ｇ）を経て得られた反応物を、フィルタとしてワットマン（株）製の「ベクタスピン　ミクロ（孔径：０．０２μｍ）」に添加し、フィルタ上の溶液がなくなるまで遠心分離することによって、凝集体を単離した。その後、
　洗浄工程として、該フィルタに、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むＴＢＳ　１，０００μＬを添加し、再度、フィルタ上の溶液がなくなるまで遠心分離することによって、凝集体を洗浄した。
　工程（ｉ）として、上記（ｈ）を経てフィルタ上にトラップされた凝集体に、蛍光基質として（１，３－ｄｉｃｌｏｒｏ－９，９－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－ａｃｒｉｄｉｎｅ－２－ｏｎｅ－７－ｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＤＤＡＯ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社製））５０μＬを反応させることによって、蛍光色素（Ｅ）であるＤＤＡＯがフィルタ上に生成した。
　工程（ｊ）として、上記工程（ｉ）を経てフィルタ上に得られた溶液を、上記（プラズマ励起センサの作製）で得られたプラズマ励起センサの表面に送液することで接触させた。
　工程（ｋ）として、上記工程（ｊ）で得られたプラズモン励起センサに、ガラス製の透明平面基板の、金薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズム（シグマ光機（株）製）を経由してレーザ光（６３３ｎｍ、１０μＷ）を照射し、励起された蛍光色素（Ｅ）から発光された蛍光量をＣＣＤから観察したときのシグナル値を計測し「アッセイ測定シグナル」とした。
　なお、ＡＦＰが０ｎｇ／ｍＬ時のＳＰＦＳ測定シグナルを「ブランクシグナル」とした。
　工程（ｌ）として、上記工程（ｋ）で得られた測定結果から、アッセイシグナルを以下の式で評価した。
アッセイシグナル＝｜（アッセイ測定シグナル）－（ブランクシグナル）｜
　得られた結果を表５に示す。
　［実施例４］
　（プラズモン励起センサの作製）
　実施例３と同様にしてプラズモン励起センサを作製した。
　（アッセイ法の実施）
　実施例２で得られた融合タンパク質（II）含有集合体の溶液（１ｍｇ／ｍＬ）１００μＬを用いた以外は、実施例３と同様にしてアッセイ法を実施した。得られた結果を表５に示す。
　［比較例１］
　（プラズモン励起センサの作製）
　屈折率〔ｎｄ〕１．７２、厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板（（株）オハラ製のＳ－ＬＡＬ　１０）をプラズマ洗浄し、該基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさらに金薄膜をスパッタリング法により形成した。クロム薄膜の厚さは１～３ｎｍ、金薄膜の厚さは４４～５２ｎｍであった。
　このようにして得られた基板を、１０－カルボキシ－１－デカンチオールを１ｍＭ含むエタノール溶液に２４時間以上浸漬し、金薄膜の片面にＳＡＭ（Ｓｅｌｆ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ　Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜）を形成した。基板を該溶液から取り出し、エタノール及びイソプロパノールで洗浄した後、エアガンで乾燥させた。
　ＳＡＭの表面に、流路高さ０．５ｍｍを有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを設け、ＳＡＭ表面が流路の内側となるように基板を配置し（ただし、該シリコンゴムスペーサは送液に触れない状態とする。）、流路の外側から圧着し、ビスで流路シートと該プラズモン励起センサとを固定した。
　（アッセイ法の実施）
　得られたプラズモン励起センサを流路に固定し、送液として超純水を１０分間、その後ＭＥＳ（２５℃、ｐＨ５．０）を２０分間、ペリスタポンプにより、室温（２５℃）、流速５００μＬ／ｍｉｎで循環させ、その表面を平衡化した。
　続いて、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を２５ｍｇ／ｍＬと、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を２５ｍｇ／ｍＬとを含むＭＥＳ（２５℃、ｐＨ５．０）を５ｍＬ送液し、２０分間循環送液させた後に、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍＬ、（株）日本医学臨床検査研究所製）を含むＡｃｅｔａｔｅ溶液（２５℃、ｐＨ６．０）２．５ｍＬを３０分間循環送液することで、ＳＡＭ上に１次抗体を固相化した。次いで、５０ｍＭＴｒｉｓ（２５℃、ｐＨ７．４）５ｍＬを１５分間循環送液することで、未反応の活性化エステル基をブロッキングし、１質量％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水にて３０分間循環送液することで、非特異的吸着防止処理を行った。
　送液をＰＢＳに代え、ＡＦＰを１ｎｇ／ｍＬ含むＰＢＳ溶液を０．８ｍＬ添加し、２５分間循環させた。
　Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むＴＢＳを送液として５分間循環させることによって洗浄した。
　作製例１で得られたＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７を標識した２次抗体（１，０００ｎｇ／ｍＬとなるように調製したＰＢＳ溶液）を０．８ｍＬ添加し、２０分間循環させた。
　その後、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むＴＢＳを送液として１０分間循環させることによって洗浄した。
　ＣＣＤから観察したときのシグナル値を計測しアッセイ測定シグナルとした。なお、ＡＦＰを０ｎｇ／ｍＬ時のＳＰＦＳ測定シグナルをブランクシグナルとした。アッセイ評価としては実施例１と同様のアッセイシグナルを算出することで評価した。
　本発明のアッセイ法による測定結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表５から、本発明のアッセイ法は、本発明の集合体を用いたホモジニアスアッセイ系をＳＰＦＳ測定に応用することで、比較例１の従来のヘテロジニアスＳＰＦＳ測定と比べて、桁違いの極めて高感度な測定が可能であることがわかった。
　本発明の融合タンパク質含有集合体は、本発明のアッセイ法に用いた際、高感度かつ高精度であり、迅速性が飛躍的に向上した方法であるから、例えば、血液中に含まれる極微量の腫瘍マーカーであっても検出することができ、この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。
　１　標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）
　２　標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）
　３ａ　蛍光色素
　３ｂ　酵素
　４　ビオチン
　５　アビジン
　６　プロテインＡ／Ｇ
　７　標的物質、標的ウイルス又は標的細胞
　８　フィルタ
　９　透明平面基板と、該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と、該金属薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された誘電体からなるスペーサ層とを少なくとも有するプラズモン励起センサ
　１０　融合タンパク質（Ｉ）
　１１　融合タンパク質（II）
　１２　融合タンパク質（II）
　１３　蛍光基質
　１４　蛍光色素（Ｅ）
　２０　集合体
　２１　凝集体

Claims (16)

  1. 　標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）及び該部位αを有する標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）を合計２個以上と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質を少なくとも含有するか、又は、
    　標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）を合計２個以上と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質と、該部位αを有する標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）を合計２個以上と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質とを少なくとも含有することを特徴とする融合タンパク質含有集合体。
  2. 　上記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）それぞれにビオチンが固定化され、蛍光色素又は酵素が、該タンパク質（Ａ）、タンパク質（Ｂ）、ビオチン及びアビジンのうち少なくとも１つに固定化され、上記融合タンパク質が、該タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）のうち少なくとも一方を合計４個とアビジン１個とを含むことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質含有集合体。
  3. 　上記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）それぞれが、抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント又はＦ（ａｂ’）２フラグメントであることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の融合タンパク質含有集合体。
  4. 　上記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）が、ともに抗体であり、蛍光色素又は酵素が、該抗体のみに固定化されるか、プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇのみに固定化されるか、あるいは該抗体とプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇとに固定化され、上記融合タンパク質が、該タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）のうち少なくとも一方を合計２～５個と、プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇとを含むことを特徴とする請求項１から請求項３までのいずれか一項に記載の融合タンパク質含有集合体。
  5. 　上記部位α及びβが、同一であることを特徴とする請求項１から請求項４までのいずれか一項に記載の融合タンパク質含有集合体。
  6. 　上記酵素が、アルカリフォスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ又はグルコースオキシダーゼであることを特徴とする請求項１から請求項５までのいずれか一項に記載の融合タンパク質含有集合体。
  7. 　下記工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むことを特徴とする融合タンパク質含有集合体の製造方法；
    　工程（ａ）：標的物質、標的ウイルス又は標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）及び該部位αを有する標的物質、標的ウイルス又は標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）からなるタンパク質、ビオチンならびにアビジンのうち少なくとも１つに蛍光色素又は酵素を固定化する工程、
    　工程（ｂ）：蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよい該タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）それぞれに、蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいビオチンを固定化することによって、ビオチン化タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）を得る工程及び
    　工程（ｃ）：蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいビオチン化タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）を、それぞれ１個以上含むように混合し、
    　該ビオチン化タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）の合計に対して、蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいアビジンを、そのモル比で４：１以上となるようにさらに混合することによって、融合タンパク質含有集合体を得る工程。
  8. 　上記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）それぞれが、抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント又はＦ（ａｂ’）２フラグメントであることを特徴とする請求項７に記載の融合タンパク質含有集合体の製造方法。
  9. 　下記工程（ｄ）及び（ｅ）のうち少なくとも一方と（ｆ）とを含むことを特徴とする請求項７又は請求項８に記載の融合タンパク質含有集合体の製造方法。
    　工程（ｄ）：標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合する抗体（Ａ）及び該部位αを有する標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合する抗体（Ｂ）それぞれに蛍光色素又は酵素を固定化する工程、
    　工程（ｅ）：プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇに蛍光色素又は酵素を固定化する工程、及び
    　工程（ｆ）：蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよい抗体（Ａ）及び（Ｂ）を、それぞれ１個以上含むように混合し、該抗体（Ａ）及び（Ｂ）の合計に対して、蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇ（ただし、抗体（Ａ）及び（Ｂ）に蛍光色素又は酵素が固定化されていない場合、用いるプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇには蛍光色素又は酵素が固定化されている。）を、そのモル比で２：１以上となるようにさらに混合することによって、集合体を得る工程。
  10. 　上記部位α及びβが、同一であることを特徴とする請求項７から請求項９までのいずれか一項に記載の融合タンパク質含有集合体の製造方法。
  11. 　上記酵素が、アルカリフォスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ又はグルコースオキシダーゼであることを特徴とする請求項７から請求項１０までのいずれか一項に記載の融合タンパク質含有集合体の製造方法。
  12. 　下記工程（ｇ）～（ｌ）を含むことを特徴とするアッセイ法；
    　工程（ｇ）：請求項１から請求項６までのいずれか一項に記載の融合タンパク質含有集合体と検体とを接触させることによって、該検体に含有される標的物質、標的ウイルス又は標的細胞を介して凝集体を形成する工程、
    　工程（ｈ）：該工程（ｇ）を経て得られた反応物をフィルタに通すことによって、該凝集体のみを単離する工程、
    　工程（ｉ）：該工程（ｈ）を経て得られた凝集体に、蛍光基質又は消光剤基質を反応させ、それぞれ蛍光色素（Ｅ）又は消光剤を生成する工程（ただし、上記工程（ｇ）において、請求項１から請求項６までのいずれか一項に記載の酵素を含む融合タンパク質含有集合体を用いた場合のみ。）、
    　工程（ｊ）：透明平面基板と、該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と、該金属薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された誘電体からなるスペーサ層、又は該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された蛍光色素（Ｆ）層とを少なくとも有するプラズモン励起センサの、該スペーサ層表面又は該蛍光色素（Ｆ）層表面に、上記工程（ｈ）を経て得られた凝集体又は上記工程（ｉ）を経て得られた蛍光色素（Ｅ）又は消光剤を接触させる工程、
    　工程（ｋ）：該工程（ｊ）で得られたプラズモン励起センサに、該基板の、該薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程、及び
    　工程（ｌ）：該工程（ｋ）で得られた測定結果から、該標的物質量、該標的ウイルス量又は該標的細胞量を算出する工程。
  13. 　上記工程（ｇ）及び（ｈ）の免疫反応場、及び上記工程（ｊ）及び（ｋ）のＳＰＦＳ検出場が、それぞれ独立していることを特徴とする請求項１２に記載のアッセイ法。
  14. 　上記金属薄膜が、金、銀、アルミニウム、銅及び白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属から形成されることを特徴とする請求項１２又は請求項１３に記載のアッセイ法。
  15. 　上記金属が、金からなることを特徴とする請求項１４に記載のアッセイ法。
  16. 　上記誘電体が、二酸化ケイ素（ＳｉＯ４）又は二酸化チタン（ＴｉＯ２）を含むことを特徴とする請求項１２から請求項１５までのいずれか一項に記載のアッセイ法。
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