JPH10218755A

JPH10218755A - メラニン産生抑制剤

Info

Publication number: JPH10218755A
Application number: JP9039782A
Authority: JP
Inventors: Hiroki Hayasawa; 宏紀早澤; Yasuo Fukuwatari; 康夫福渡; Kazumi Shinoda; 一三篠田; Mitsunari Nakajima; 光業中島
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 1997-02-07
Filing date: 1997-02-07
Publication date: 1998-08-18

Abstract

(57)【要約】【課題】安全で副作用のないメラニン産生抑制剤を提
供する。【解決手段】 β−ラクトグロブリンを有効成分として
含有するメラニン産生抑制剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、メラニン産生抑制
剤に関するものである。更に詳しくは、本発明は、β−
ラクトグロブリンを有効成分として含有するメラニン産
生抑制剤に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】皮膚のメラニン沈着は、メラニン産生細
胞であるメラノサイト内にメラニンが沈着すること及び
メラノサイトの樹状突起からメラニンが表皮角化細胞に
移行することによることが知られている［アメリカン・
サイエンティスツ(American Scientists) 、第７０巻、
第１３６ページ、１９８２年］。一般にシミ、ソバカ
ス、日焼け等における皮膚の色素沈着は、皮膚内に存在
するメラニン色素産生細胞がメラニン色素を過剰に産生
することに起因するとされている。従来から、メラニン
色素の沈着を予防又は治療する美白剤の開発を目的とし
たメラニン色素の産生を抑制する物質の検索が広く実施
されている。

【０００３】チロシナーゼは、チロシン、その他の１価
フェノール類及び相当するオルソ−２価フェノール類の
分子状酸素による酸化を触媒する酵素であり、キノコ、
ジャガイモ、リンゴ等多くの植物及び動物組織に広く存
在し、植物においては切傷部分の黒変現象に関与し、動
物においては組織、特に皮膚のメラニン色素の生成に関
与していることが知られている（化学大辞典編集委員会
編、化学大辞典、第５巻、第９７６ページ、共立出版、
昭和３５年）。

【０００４】チロシナーゼがメラニン色素の生成に関与
する酵素であることから、美白剤開発のため、特にマッ
シュルーム由来のチロシナーゼを用い、その酵素活性を
阻害する物質が検索されている。また、メラニン産生細
胞のメラニンの産生に対する効果を評価することによ
り、メラニン産生抑制物質を検索する方法も美白剤の開
発研究に一般的に採用されている。

【０００５】これらの評価方法で検索された物質は極め
て多数存在する。チロシナーゼ活性阻害剤としては、例
えば、システイン、グルタチオン、ビタミンＣ（三島豊
等、基礎皮膚化学、第２５８ページ、朝倉書店、昭和４
８年）、コウジ酸（日経産業新聞、昭和６３年５月２４
日）、アルブチン（富田健一、第２０回ＦＪセミナー予
稿集、第２１ページ、フレグランスジャーナル社、平成
２年３月１４日）、トリコデルマ属に属する微生物の産
生物（特開平２−１４５１８９号公報）、シルク蛋白質
のアルカリ分解物（特公昭５８−１７７６３号公報）、
乳蛋白質の加水分解物（特開平４−６９３１５号公
報）、乳から得られる蛋白質であるラクトフェリン（特
開平４−５９７１４号公報）及びその加水分解物（特開
平５−３２００６８号公報）、コウジ酸のアミノ酸誘導
体とペプチド誘導体（特開平４−１８７６１８号公報）
等が知られている。

【０００６】また、メラニン産生細胞のメラニンの産生
を抑制する物質としては、コウジ酸、アルブチン［フレ
グランス・ジャーナル(Fragrance Journal) 、臨時増
刊、第１４号、第１２７ページ、１９９５年］、不飽和
脂肪酸［フレグランス・ジャーナル(Fragrance Journa
l) 、臨時増刊、第１４号、第１４５ページ、１９９５
年］、リン酸Ｌ−アスコルビンマグネシウム［フレグラ
ンス・ジャーナル(Fragrance Journal) 、臨時増刊、第
１４号、第１５１ページ、１９９５年］、乳清（特開平
４−１８７６１９号公報）、乳清ミネラル（特開平７−
２５２１２６号公報）、アミノ安息香酸（特公平７−１
２１８５５号公報）、ナフタレンカルボキサミド及びイ
ソキノリンカルボキサミド（特開平７−６１９１９号公
報）、イソフラボン誘導体（特開昭５８−２２５００４
号公報）、桂皮酸誘導体（特開昭５９−１９６８１３号
公報）等が知られている。

【０００７】一方、食品蛋白質及びその加水分解物が化
粧品の分野において利用されていることはよく知られて
いる。獣乳に酸を作用させ沈殿させて得られるカゼイン
は、化粧品原料として用いられ（日本公定書協会編、
「化粧品原料基準」、第２版追補注解、第４６ページ、
薬事日報社、１９８７年）、また、カゼインの一成分で
あるκ−カゼインを酵素で加水分解して得られるミルク
グリコペプチド（グリコマクロペプチド又はＧＭＰとも
表記されている）も化粧品原料として用いられている
（厚生省薬務局審査第二課監修、「化粧品種別許可基
準」、第５巻、第２４ページ、薬事日報社、１９９０
年）。

【０００８】乳清蛋白質（ホエー蛋白質）は、乳汁から
カゼインを除去して得られる蛋白質の混合物であるが、
化粧品原料として用いられていることは知られている
（厚生省薬務局審査課監修、「化粧品原料基準外成分規
格１９９３追補」、第２６２ページ、平成６年３月２５
日）。

【０００９】蛋白質の加水分解物を化粧品原料に用いた
例は、例えば、加水分解エラスチン（厚生省薬務局審査
課監修、「化粧品原料基準外成分規格１９９３」、第１
８２ページ、平成５年１０月１４日）、加水分解カゼイ
ン（厚生省薬務局審査課監修、「化粧品原料基準外成分
規格１９９３」、第２６２ページ、平成５年１０月１４
日）、加水分解コラーゲン（厚生省薬務局審査課監修、
「化粧品原料基準外成分規格１９９３」、第３７３ペー
ジ、平成５年１０月１４日）、大豆蛋白加水分解物（厚
生省薬務局審査課監修、「化粧品原料基準外成分規格１
９９３」、第５９９ページ、平成５年１０月１４日）等
が知られている。

【００１０】乳汁には種々の蛋白質が含まれるが、蛋白
質の分離精製技術が進歩してきたことから、乳汁から分
離精製した蛋白質についてその生理作用が検討されてき
ている。カゼインは、電気泳動的にα−、β−、及びγ
−の３成分に分離される。このうち量的に最大であるα
−カゼインは、カルシウムイオンにより沈殿するα_S−
カゼインとカルシウムイオンにより沈殿しないκ−カゼ
インとに分離される。本発明者らは、これらの成分のう
ち、κ−カゼインにメラニン産生細胞のメラニン産生を
抑制する作用があることを見い出し、既に特許出願を行
った（特願平８−９６４５６号）。

【００１１】また、乳汁から得られる蛋白質であるラク
トフェリンについては、抗腫瘍作用（特公平５−８６９
３２号公報）、抗リウマチ剤（特開平５−１８６３６８
号公報）、チロシナーゼ活性阻害作用（特開平４−５９
７１４号公報）等が知られており、ラクトフェリンの加
水分解物では、抗菌性及びチロシナーゼ活性阻害（ヨー
ロッパ特許公開第４３８７５０号）、細胞への病原菌付
着防止（特開平３−２２０１３０号公報）、抗ウィルス
作用（特開平１−２３３２２６号公報）等が知られてい
る。

【００１２】更に、β−ラクトグロブリンの加水分解物
については、チロシナーゼ活性阻害作用のあることが知
られている（特開平４−６９３１５号公報）。

【００１３】以上のとおり、従来、乳汁から分離精製さ
れた一部の蛋白質及びその加水分解物についてはその生
理作用が明らかにされていたが、乳汁に含まれるβ−ラ
クトグロブリンそのものの生理作用は知られていなかっ
た。

【００１４】β−ラクトグロブリンは、ウシ、ヒツジ、
ヤギ、ウマ、シカ、ブタ、イヌ等の獣乳及びイルカの乳
汁に含まれている［ネイチャー(Nature)、第３２４巻、
第３８３ページ、１９８６年］。牛乳の場合は、全蛋白
質の７〜１２％（重量。以下特に断りのない限り同
じ。）を占める蛋白質であり、牛乳からカゼインを除去
した乳清（ホエー）に含まれ、乳清蛋白質の約半分を占
める［社団法人全国農協乳業プラント協会編集兼発行、
「ミルクのサイエンス（ミルクの新しい働き）」、第１
５８ページ、（株）日本出版制作センター、平成６年３
月］。

【００１５】β−ラクトグロブリンの生理作用として
は、ビタミンＡ等の疎水性物質の輸送機能が注目されて
いたが［ネイチャー(Nature)、第３２４巻、第３８３ペ
ージ、１９８６年、及び社団法人全国農協乳業プラント
協会編集兼発行、「ミルクのサイエンス（ミルクの新し
い働き）」、第１５８ページ、（株）日本出版制作セン
ター、平成６年３月］、β−ラクトグロブリンそのもの
がメラニン産生細胞のメラニン産生を抑制することは、
従来知られておらず、文献も皆無であった。

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】最近、すべての分野に
おいて化学合成品に頼らない安全な製品が望まれ、その
ため、安全性に問題のない食品蛋白質の生理作用が注目
されている。即ち、食品蛋白質について新たな生理作用
を見い出し、それを有効利用することが人類にとって極
めて重要であると考えられている。

【００１７】前記のとおり、乳蛋白質は食品蛋白質であ
り、化粧品原料として用いられており、安全性に問題が
ない乳蛋白質に含まれる種々の蛋白質の生理作用を鋭意
研究した。その結果、β−ラクトグロブリンそのものが
極めて強いメラニン産生抑制作用を示すことを見い出
し、本発明を完成した。

【００１８】本発明は、以上の事情を鑑みてなされたも
のであり、食品蛋白質であり安全性に問題のないβ−ラ
クトグロブリンを有効成分として含有するメラニン産生
抑制剤を提供することを目的としている。

【００１９】

【課題を解決するための手段】前記課題を解決する本発
明は、β−ラクトグロブリンを有効成分として含有する
メラニン産生抑制剤であり、β−ラクトグロブリンが、
少なくとも１０μｇ／ｇの割合で含有されていることを
望ましい態様としてもいる。

【００２０】次に本発明について詳細に説明する。

【００２１】

【発明の実施の形態】本発明のメラニン産生抑制剤は、
β−ラクトグロブリンを有効成分として含有する以外
は、通常の外用剤、化粧料等と同様に各種の形態で、公
知の方法により調製することができるが、具体的には、
軟膏、クリーム、ファンデーション、化粧水等である。

【００２２】また、本発明のメラニン産生抑制剤の有効
成分であるβ−ラクトグロブリンは哺乳類の乳汁から得
られるものであれば、市販品、常法による調製品等いず
れのものでもよいが、牛乳由来のものが産業的には有利
であり、バイオテクノロジーの技術により調製されたも
のであってもよい。

【００２３】常法によるβ−ラクトグロブリンの調製を
例示すれば、次のとおりである。

【００２４】牛乳に塩酸を添加してカゼインを沈殿さ
せ、濾液し、乳清を得る。乳清のｐＨを６．０に調製
し、半飽和の量で硫酸アンモニウムを添加し、塩析によ
り析出した蛋白質を除去し、濾液を回収する。この濾液
を硫酸アンモニウムで飽和させ、析出した蛋白質を回収
する。これを再び水に溶解し、ｐＨ５．２で透析して結
晶を分離し、乳清１ｌから約１．８ｇの割合でβ−ラク
トグロブリンを調製する。

【００２５】前記の塩析法（津郷友吉著、「乳の化
学」、第２１ページ、地球出版株式会社、昭和３２年）
以外の方法としては、前記塩析法を改良した方法［ビオ
キミカ・エト・ビオフィジカ・アクタ(Biochimica et B
iophysica Acta) 、第１４７巻、第６０ページ、１９６
７年］、低温でアルコールを作用させ調製する方法［ア
ーカイブス・オブ・バイオケミストリー(Archives of B
iochemistry)、第１６巻、第２２１ページ、１９４８
年］、ゲル濾過で調製する方法［ジャーナル・オブ・デ
イリー・サイエンス(Journal of Dairy Science)、第７
３巻、第２２９２ページ、１９９０年］などが知られて
いる。

【００２６】本発明のメラニン産生抑制剤の有効成分で
あるβ−ラクトグロブリンの配合量は、特に制限されず
広範囲から適宜選択できるが、後記試験例から明らかな
とおり、少なくとも１０μｇ／ｇ、望ましくは１０μｇ
／ｇ〜１０ｍｇの範囲である。また、本発明のメラニン
産生抑制剤は、前記のβ−ラクトグロブリンと公知のメ
ラニン産生抑制剤とを併用することもできる。

【００２７】次に試験例を示して本発明を具体的に説明
する。試験例１この試験は、β−ラクトグロブリンのメラニン産生抑制
効果を調べるために行なった。

【００２８】（１）試料市販の乳清蛋白質（ＷＰＩ。ミライ社製）、牛乳から分
離精製された蛋白質であるβ−ラクトグロブリン、α−
ラクトアルブミン、ウシ血清アルブミン及びイムノグロ
ブリンＧ（いずれもシグマ社製）を、表１に示す各濃度
で、添加剤（クラボウ社製。ヒト表皮メラニン細胞増殖
添加剤：０．２％ウシ脳下垂体抽出液、０．５％ウシ胎
児血清、３ｎｇ／ｍｌヒト組み換え塩基性線維芽細胞増
殖因子、５００ｎＭハイドロコーチゾン、５μｇ／ｍｌ
インスリン、５μｇ／ｍｌトランスフェリン、１０ｎｇ
／ｍｌＰＭＡ、及び３μｇ／ｍｌヘパリンを含有す
る。）を１％含むＭｅｄｉｕｍ１５４培地（クラボウ社
製。以下、メラノサイト用培養液と記載する。）に溶解
した。

【００２９】（２）試験方法メラニン産生抑制効果を、本発明者らの方法（特願平８
−９６４５６号）により次のとおり試験した。即ち、１
２穴培養プレート（ファルコン社製）にヒト包皮由来メ
ラノサイト（クラボウ社製）を３×１０⁴個ずつ蒔き、
１ｍｌのメラノサイト用培養液で培養した。２４時間
後、各種濃度の試料を含む同培養液（１ｍｌ）で培地を
交換し、更に３日間培養した。培養液を除去し、リン酸
緩衝液（ＰＢＳ）で細胞を洗浄し、０．２５％トリプシ
ン溶液を０．１ｍｌ添加して細胞を浮遊させ、１０％牛
胎児血清を０．５％含有するダルベッコ変法イーグル培
養液（日水製薬社製）を添加し、細胞浮遊液を調製し
た。バイオドットＳＦ（バイオラッド社製）を用い、細
胞をニトロセルロース膜（ザルトリウス社製。ポアサイ
ズ１．２μｍ）にスロットブロットし、室温で乾燥し、
ブロットされた膜の画像を、エプソンＧＴ−６０００ス
キャナー（ＥｐＳｃａｎ・Ｍａｃソフトを使用。エプソ
ン社製）によりマッキントッシュ・コンピューターに取
り込んだ。ブロット細胞のメラニン産生量は、ＮＩＨ・
Ｉｍａｇｅソフト［ウエイン・ラズバンド氏作製］によ
り、画像として取り込んだ色調の濃さを２次元化し、個
々のバンドの色調の濃さの相対強度をピーク面積から求
めて定量した。

【００３０】尚、表に示した数値は、試験検体を添加し
ない試料の色の濃さを１００として他の試料のそれを、
相対的に表示した。

【００３１】（３）試験結果この試験の結果は、表１に示すとおりである。表１から
明らかなとおり、乳清蛋白質（ＷＰＩ）では１０００及
び１００００μｇ／ｍｌの濃度で色の濃さの減少、即
ち、メラニン産生抑制効果が認められた。これに対し
て、β−ラクトグロブリンでは、乳清蛋白質より更に低
濃度、即ち、１０及び１００μｇ／ｍｌの濃度でメラニ
ン産生抑制効果が認められ、β−ラクトグロブリンのメ
ラニン産生抑制効果は、乳清蛋白のそれよりも格段に高
いことが判明した。

【００３２】一方、α−ラクトアルブミン、ウシ血清ア
ルブミン及びイムノグロブリンＧでは、メラニン産生抑
制効果は、ほとんど認められなかった。

【００３３】

【表１】

【００３４】参考例牛乳を２０００×ｇで２０分間遠心して脂肪を分離し、
得られた脱脂乳に２規定の塩酸を添加し、ｐＨを４．６
に調整した。沈殿したカゼインを濾紙（東洋濾紙、Ｎ
ｏ．２）で除去し、濾液（乳清）を回収した。得られた
乳清に２規定の水酸化ナトリウムを添加して中和し、４
℃、２００００×ｇの条件で３０分間遠心した。上清を
回収し、その２００ｍｌを０．２Ｍ食塩を含む０．０５
Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）で緩衝化したセフ
ァクリル・Ｓ−２００（８．５×１１０ｃｍ。Sephacry
l S-200 。ファルマシア社製）により４℃でゲル濾過し
た。尚、溶出液には０．２Ｍ食塩を含む０．０５Ｍトリ
ス・塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）を用いた。β−ラクトグ
ロブリンは第４番目に溶出されるピークに含まれている
ので、そのピーク（約３４０ｍｌ）を回収し、水で透析
し、凍結乾燥し、約４００ｍｇのβ−ラクトグロブリン
を得た。

【００３５】次に実施例を示して本発明を更に具体的に
説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるもので
ない。

【００３６】

【実施例】

実施例１ β−ラクトグロブリン（シグマ社製）１（ｇ）白色ワセリン２５ステアリルアルコール２２プロピレングリコール１２ウラリル硫酸ナトリウム１．５パラオキシ安息香酸メチル０．０２５パラオキシ安息香酸プロピル０．０１５精製水３８．４６常法により前記成分を配合し、１００ｇの親水性軟膏を
製造した。尚、原料はいずれも市販品を用いた。

【００３７】実施例２ β−ラクトグロブリン１０（ｇ）（参考例と同一の方法により調製）ポリオキシエチレンステアリルエーテル２ポリオキシエチレンセチルエーテル３ミツロウ４セタノール３ラノリン１イソプロピルパルミテート２流動パラフィン１９ポリエチレングリコールモノステアレート０．５パラオキシ安息香酸メチル０．１精製水６４．４常法により前記成分を配合し、１００ｇのクリームを製
造した。尚、β−ラクトグロブリン以外の原料はいずれ
も市販品を用いた。

【００３８】実施例３ β−ラクトグロブリン０．１（ｇ）（参考例と同一の方法により調製）ステアリン酸２．４モノステアリン酸プロピレングリコール２．０セトステアリルアルコール０．２液状ラノリン２．０流動パラフィン３．０ミリスチン酸イソプロピル８．５防腐剤適量カルボキシメチルセルロースナトリウム０．２ベントナイト０．５プロピレングリコール４．０トリエタノールアミン１．０酸化チタン８．０タルク４．０着色料適量精製水６４．１常法により前記成分を配合し、約１００ｇのファンデー
ションを製造した。尚、β−ラクトグロブリン以外の原
料はいずれも市販品を用いた。

【００３９】実施例４ β−ラクトグロブリン（シグマ社製）０．０１（ｇ）エタノール３．０パラオキシ安息香酸メチル０．１カルボキシビニルポリマー１．０炭酸カルシウム０．３精製水９５．５９常法により前記成分を配合し、約１００ｇのパックを製
造した。尚、原料はいずれも市販品を用いた。

【００４０】

【発明の効果】以上、詳細に説明したとおり、本発明
は、β−ラクトグロブリンを有効成分として含有するメ
ラニン産生抑制剤であり、本発明のメラニン産生抑制剤
は、食用されている乳汁由来の蛋白質であるβ−ラクト
グロブリンを有効成分としているので安全であり、副作
用等の問題がない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者中島光業神奈川県座間市東原５−１−83 森永乳業株式会社栄養科学研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 β−ラクトグロブリンを有効成分として
含有するメラニン産生抑制剤。
【請求項２】 β−ラクトグロブリンが、少なくとも１
０μｇ／ｇの割合で含有されている請求項１に記載のメ
ラニン産生抑制剤。