JPH0587234B2 - - Google Patents
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- JPH0587234B2 JPH0587234B2 JP3187166A JP18716691A JPH0587234B2 JP H0587234 B2 JPH0587234 B2 JP H0587234B2 JP 3187166 A JP3187166 A JP 3187166A JP 18716691 A JP18716691 A JP 18716691A JP H0587234 B2 JPH0587234 B2 JP H0587234B2
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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Description
【0001】
【産業上の利用分野】 本発明は、グルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼ、DNA、微生物、
DNAの取得法、グルコース−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼの取得法、試料溶液中のグルコース−
６−リン酸含量を酵素測定する方法及び試薬に関
する。
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【0002】
【従来の技術】 グルコース−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼ（G6P−DH）は酸化的なグルコース
代謝の第一工程を触媒作用する。その際にグルコ
ース−６−リン酸はグルコース酸−６−リン酸に
酸化され、NAD+及び／又はNAD+は補基質とし
て還元される。最後に、グルコース酸化により核
酸物質代謝のためのベントース糖が生成される。
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ース−６−リン酸はグルコース酸−６−リン酸に
酸化され、NAD+及び／又はNAD+は補基質とし
て還元される。最後に、グルコース酸化により核
酸物質代謝のためのベントース糖が生成される。
【0003】 例えば、グルコース−６−リン酸デヒ
ドロゲナーゼはロイコノストツク・メセンテロイ
デス（Leuconostoc mesenteroides）から得られ
る。この酵素は、NADP+に特異的である酵母か
らの酵素とは反対に、NAD+もNADP+もコフア
クターとして使用することができる。この酵素
は、分子量55000Dを有する２つの同じモノマー
下部単位から成る二量体として存在する。25℃で
比活性550U／mgを有する。
ドロゲナーゼはロイコノストツク・メセンテロイ
デス（Leuconostoc mesenteroides）から得られ
る。この酵素は、NADP+に特異的である酵母か
らの酵素とは反対に、NAD+もNADP+もコフア
クターとして使用することができる。この酵素
は、分子量55000Dを有する２つの同じモノマー
下部単位から成る二量体として存在する。25℃で
比活性550U／mgを有する。
【0004】 とりわけ、ロイコノストツク属細菌か
らG6P−DHを取得する方法の欠点は、乳酸菌が
複雑な栄養素要求を有しており、それ故大規模に
使われる培地ではゆつくりと成長するに過ぎずか
つ極く低い細胞密度が達成されるに過ぎないとい
う点である。更に、ロイコノストツクでG6P−
DHのバイオマス含量は極めて低い（全細胞蛋白
質の約１％）。それ故、十分量のG6P−DHを調
製するには大きな醗酵容積が必要である。更に、
異種蛋白質が多量であるために低い比活性の酵素
調製物が得られるに過ぎない。
らG6P−DHを取得する方法の欠点は、乳酸菌が
複雑な栄養素要求を有しており、それ故大規模に
使われる培地ではゆつくりと成長するに過ぎずか
つ極く低い細胞密度が達成されるに過ぎないとい
う点である。更に、ロイコノストツクでG6P−
DHのバイオマス含量は極めて低い（全細胞蛋白
質の約１％）。それ故、十分量のG6P−DHを調
製するには大きな醗酵容積が必要である。更に、
異種蛋白質が多量であるために低い比活性の酵素
調製物が得られるに過ぎない。
【0005】 公知のロイコストツク細菌からのG6P
−DHの最も顕著な欠点は低い温度安定性であ
る。
−DHの最も顕著な欠点は低い温度安定性であ
る。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】 従つて、本発
明の課題は、技術水準の欠点をもはや持つていな
いグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを調
製することであつた。
明の課題は、技術水準の欠点をもはや持つていな
いグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを調
製することであつた。
【0007】
【課題を解決するための手段】 本発明の課題
は、請求項１に記載のSEQ ID NO：１で表わさ
れるアミノ酸配列を含有しかつロイコノストツ
ク・メセンテロイデス、亜種デキストラニクス
（dextranicus：DSM20187；以下ロイコノストツ
ク・デキストラニクスと記載）から得られるグル
コース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの調製によ
り解決される。
は、請求項１に記載のSEQ ID NO：１で表わさ
れるアミノ酸配列を含有しかつロイコノストツ
ク・メセンテロイデス、亜種デキストラニクス
（dextranicus：DSM20187；以下ロイコノストツ
ク・デキストラニクスと記載）から得られるグル
コース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの調製によ
り解決される。
【0008】 更に、本発明の目的はSEQ ID NO：
１で表わされるか又は遺伝コードの退行変性範囲
で、本発明による酵素をコードする配列を含有す
るDNAである。
１で表わされるか又は遺伝コードの退行変性範囲
で、本発明による酵素をコードする配列を含有す
るDNAである。
【0009】 本発明による組換えDNAは後で詳説
するようにL.デキストラニクス（DSM20187）遺
伝子バンクを好適なオリゴヌクレオチドプローブ
で検査することにより単離した。
するようにL.デキストラニクス（DSM20187）遺
伝子バンクを好適なオリゴヌクレオチドプローブ
で検査することにより単離した。
【0010】 E.コリ細胞中で本発明による組換え
DNAを発現させる際に、僅少の醗酵容量で所望
の酵素量を調製するのに十分であることが明らか
となり驚異的であつた。ロイコノストツクからの
G6P−DHの取得に比べて醗酵容量は１：500〜
１：1000に低下する。更に、低い精製経費で高純
度の、即ち比活性約900U／mgのG6P−DH調製物
が得られる。特に、本発明による組換え酵素はE.
コリから単離する際に、驚くべきことに公知酵素
に比べて温度安定性が著しく改良されているので
優れている。組換え酵素の付加的な利点は、予想
外にもロイコノストツクからの公知の酵素とは異
なりグルコースと反応しないことである。従来、
ロイコノストツク酵素とグルコースとの公知の非
特異的反応は酵素試験を実施する場合の顕著な欠
点であつた。それというのもその反応により血
中、血清又は血しよう中のグルコースの存在に基
いて測定の際に間違つた結果がもたらされ得たか
らである。最後に、組換え酵素は公知のG6P−
DHとはNADP+に対する異なるKm値によりかつ
活性化剤及び阻害剤（例えばホスフエート、グリ
セリン、マグネシウムイオン、ハイドロゲンカー
ボネート）の異なる作用によつても異なつてい
る。
DNAを発現させる際に、僅少の醗酵容量で所望
の酵素量を調製するのに十分であることが明らか
となり驚異的であつた。ロイコノストツクからの
G6P−DHの取得に比べて醗酵容量は１：500〜
１：1000に低下する。更に、低い精製経費で高純
度の、即ち比活性約900U／mgのG6P−DH調製物
が得られる。特に、本発明による組換え酵素はE.
コリから単離する際に、驚くべきことに公知酵素
に比べて温度安定性が著しく改良されているので
優れている。組換え酵素の付加的な利点は、予想
外にもロイコノストツクからの公知の酵素とは異
なりグルコースと反応しないことである。従来、
ロイコノストツク酵素とグルコースとの公知の非
特異的反応は酵素試験を実施する場合の顕著な欠
点であつた。それというのもその反応により血
中、血清又は血しよう中のグルコースの存在に基
いて測定の際に間違つた結果がもたらされ得たか
らである。最後に、組換え酵素は公知のG6P−
DHとはNADP+に対する異なるKm値によりかつ
活性化剤及び阻害剤（例えばホスフエート、グリ
セリン、マグネシウムイオン、ハイドロゲンカー
ボネート）の異なる作用によつても異なつてい
る。
【0011】 更に、本発明の目的は本発明による組
換えDNAのコピー１個以上を含有する組換えベ
クターである。この種のベクターは本発明による
組換えDNAを外来宿主生物中で発現させるのを
可能にする。本発明によるベクターは宿主細胞の
染色体DNA中に統合されるベクターであつてよ
く（例えばバクテリオフアージλ）、しかし宿主
細胞中で染色体外に存在していてもよい（プラス
ミド）。殊に、本発明によるベクターはプラスミ
ドである。
換えDNAのコピー１個以上を含有する組換えベ
クターである。この種のベクターは本発明による
組換えDNAを外来宿主生物中で発現させるのを
可能にする。本発明によるベクターは宿主細胞の
染色体DNA中に統合されるベクターであつてよ
く（例えばバクテリオフアージλ）、しかし宿主
細胞中で染色体外に存在していてもよい（プラス
ミド）。殊に、本発明によるベクターはプラスミ
ドである。
【0012】 本発明によるベクターは真核生物のベ
クターでもまた原核生物のベクターでもよいが、
原核生物のベクターであると有利であり、つまり
原核宿主生物中での増殖に好適である。組換えベ
クターがE.コリ中で活性な複製開始点を有すると
特に優れており、つまりベクターはE.コリ中で増
殖可能である。
クターでもまた原核生物のベクターでもよいが、
原核生物のベクターであると有利であり、つまり
原核宿主生物中での増殖に好適である。組換えベ
クターがE.コリ中で活性な複製開始点を有すると
特に優れており、つまりベクターはE.コリ中で増
殖可能である。
【0013】 特に優れた実施例では本発明による組
換えベクターはグルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼをコードする核酸配列を、SEQ ID
NO：１で表わされる核酸配列の最初の122個ヌ
クレオチド（G6P−DH遺伝子の上流側）に含ま
れている、E.コリ中で機能し得るプロモータ配列
の調節下に含有する。
換えベクターはグルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼをコードする核酸配列を、SEQ ID
NO：１で表わされる核酸配列の最初の122個ヌ
クレオチド（G6P−DH遺伝子の上流側）に含ま
れている、E.コリ中で機能し得るプロモータ配列
の調節下に含有する。
【0014】 プロモータ特性を有するには、DNA
領域がこの122個のヌクレオチド配列を正確に有
する必要はない。プロモータ特性を有するこの配
列の誘導配列又はフラグメントも好適である。本
発明において生物活性誘導配列とは、個々のヌク
レオチド又は短いヌクレオチド配列がプロモータ
配列から欠失、置換又は挿入されていてよく、し
かも配列のプロモータ活性が保持されるようにと
いうことである。１つのプロモータで全配列では
なく、特定の部分領域が保持されるべきことは当
業者に知られている。原核生物のプロモータ配列
では特に転写開始点に対して−35〜−10の範囲で
ある。
領域がこの122個のヌクレオチド配列を正確に有
する必要はない。プロモータ特性を有するこの配
列の誘導配列又はフラグメントも好適である。本
発明において生物活性誘導配列とは、個々のヌク
レオチド又は短いヌクレオチド配列がプロモータ
配列から欠失、置換又は挿入されていてよく、し
かも配列のプロモータ活性が保持されるようにと
いうことである。１つのプロモータで全配列では
なく、特定の部分領域が保持されるべきことは当
業者に知られている。原核生物のプロモータ配列
では特に転写開始点に対して−35〜−10の範囲で
ある。
【0015】 従つて、本発明はSEQ ID NO：１に
記載の核酸配列の初めの122個のヌクレオチドは
プロモータ特性を有するその誘導配列を有する組
換えDNAを包含する。このロイコノストツクプ
ロモータがE.コリ中でも良好な蛋白質発現を惹起
し、驚異的である。それ故、このプロモータを異
種遺伝子、即ちG6P−DH遺伝子とは異なる遺伝
子をグラム陰性菌、殊にE.コリ細菌中で発現させ
るのに使用することもできる。
記載の核酸配列の初めの122個のヌクレオチドは
プロモータ特性を有するその誘導配列を有する組
換えDNAを包含する。このロイコノストツクプ
ロモータがE.コリ中でも良好な蛋白質発現を惹起
し、驚異的である。それ故、このプロモータを異
種遺伝子、即ちG6P−DH遺伝子とは異なる遺伝
子をグラム陰性菌、殊にE.コリ細菌中で発現させ
るのに使用することもできる。
【0016】 更に、本発明の目的は本発明による組
換えベクターで形質転換されている微生物であ
る。殊にそれはグラム陰性菌、殊に、E.コリ菌で
ある。
換えベクターで形質転換されている微生物であ
る。殊にそれはグラム陰性菌、殊に、E.コリ菌で
ある。
【0017】 本発明による組換えDNAは、
(1)染色体のロイコノストツク・デキストラニクス
DNAを単離し、かつ好適な制限酵素で切断し、 (2)切断したL.デキストラニクスDNAをベクター
中に導入し、このベクターで好適な生物を形質転
換しかつこのようにして遺伝子バンクを製造し、 (3)工程(2)からの遺伝子バンクを、グルコース−６
−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子に特異的な配列
を有する核酸プローブで検出し、その際にこのプ
ローブを乳酸菌のコドン評価に関して構成し、か
つ (4)工程(3)からのプローブとポジテイブに反応する
遺伝子バンクのクローンを分析する ことにより得られる。
DNAを単離し、かつ好適な制限酵素で切断し、 (2)切断したL.デキストラニクスDNAをベクター
中に導入し、このベクターで好適な生物を形質転
換しかつこのようにして遺伝子バンクを製造し、 (3)工程(2)からの遺伝子バンクを、グルコース−６
−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子に特異的な配列
を有する核酸プローブで検出し、その際にこのプ
ローブを乳酸菌のコドン評価に関して構成し、か
つ (4)工程(3)からのプローブとポジテイブに反応する
遺伝子バンクのクローンを分析する ことにより得られる。
【0018】 染色体L.デキストラニクス
（DSM20187）DNAの単離は組合せたポリエチレ
ングリコール／リゾチーム処理及び引続くプロテ
イナーゼＫとの恒温保持により可能である。
（DSM20187）DNAの単離は組合せたポリエチレ
ングリコール／リゾチーム処理及び引続くプロテ
イナーゼＫとの恒温保持により可能である。
【0019】 単離したL.デキストラニクスDNAを
好適な制限酵素により切断し、切断したDNAを
クローニングベクター中に連結し、好適な生物を
組換えクローニングベクターにより形質転換して
遺伝子バンクを製造することについては分子生物
学の分野で当業者に公知の方法で行なうことがで
きる。次の工程は、このようにして製造した遺伝
子バンクを、グルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ遺伝子に特異的な配列を有する核酸プロー
ブで検査することである。
好適な制限酵素により切断し、切断したDNAを
クローニングベクター中に連結し、好適な生物を
組換えクローニングベクターにより形質転換して
遺伝子バンクを製造することについては分子生物
学の分野で当業者に公知の方法で行なうことがで
きる。次の工程は、このようにして製造した遺伝
子バンクを、グルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ遺伝子に特異的な配列を有する核酸プロー
ブで検査することである。
【0020】 ピリドキシル化可能なリジン残基（*）
を有するL.セメンテロイデスからのG6P−DHの
ペプチド配列は公知である［Haghighi及びその
他共著、Biochemistry21（1982）、6415−6420］。
この配列はPhe−Leu−Leu−Lys*−Ser−Pro−
Ser−Tyr−（Asp／Val）−Lysである。しかしな
がらこの配列から、L.デキストラニクス遺伝子バ
ンク中にバイブリツド形成シグナルを見出すこと
のできるオリゴヌクレオチドプローブを誘導する
ことはできなかつた。
を有するL.セメンテロイデスからのG6P−DHの
ペプチド配列は公知である［Haghighi及びその
他共著、Biochemistry21（1982）、6415−6420］。
この配列はPhe−Leu−Leu−Lys*−Ser−Pro−
Ser−Tyr−（Asp／Val）−Lysである。しかしな
がらこの配列から、L.デキストラニクス遺伝子バ
ンク中にバイブリツド形成シグナルを見出すこと
のできるオリゴヌクレオチドプローブを誘導する
ことはできなかつた。
【0021】 ヒトG6P−DHに対する高い相同性を
有するL.セメンテロイデスからのG6P−DHの活
性中心からのペプチド配列が公知である
［Bhadbhade及びその他共著、FEBS Letters211
（1987）、243〜246］。そのペプチド配列から構成
可能な多数のオリゴヌクレオチドプローブから列
２に挙げられている72塩基の長さのオリゴヌクレ
オチドプローブ SEQ ID NO：２ 配列の種類：ヌクレオチド配列 配列の長さ：72塩基対 鎖の形：一本鎖
有するL.セメンテロイデスからのG6P−DHの活
性中心からのペプチド配列が公知である
［Bhadbhade及びその他共著、FEBS Letters211
（1987）、243〜246］。そのペプチド配列から構成
可能な多数のオリゴヌクレオチドプローブから列
２に挙げられている72塩基の長さのオリゴヌクレ
オチドプローブ SEQ ID NO：２ 配列の種類：ヌクレオチド配列 配列の長さ：72塩基対 鎖の形：一本鎖
【0022】
【化４】
■■■ 亀の甲 ［0029］ ■■■
【0023】を製造した。
【0024】 最後に、L.デキストラニクスDNA遺
伝子バンクを５′−末端標識形でこのオリゴヌク
レオチドにより検出することにより、L.デキスト
ラニクスG6P−DH遺伝子の配列を決定すること
のできるポジテイブローンが得られた。
伝子バンクを５′−末端標識形でこのオリゴヌク
レオチドにより検出することにより、L.デキスト
ラニクスG6P−DH遺伝子の配列を決定すること
のできるポジテイブローンが得られた。
【0025】 L.デキストラニクスからのG6P−DH
遺伝子のDNA配列はサンガー法により決定した。
これはSEQ ID NO：１に記載されている。
遺伝子のDNA配列はサンガー法により決定した。
これはSEQ ID NO：１に記載されている。
【0026】 SEQ ID NO：１はまた決定したL.デ
キストラニクスからのG6P−DHのアミノ酸配列
を示す。これにより、本発明による酵素のアミノ
酸配列は６〜42の部位でFEBS Letters211
（1987）、243〜246に記載のL.メセンテロイデス酵
素の配列と一致しないことが明らかである。
キストラニクスからのG6P−DHのアミノ酸配列
を示す。これにより、本発明による酵素のアミノ
酸配列は６〜42の部位でFEBS Letters211
（1987）、243〜246に記載のL.メセンテロイデス酵
素の配列と一致しないことが明らかである。
【0027】 更に、本発明はSEQ ID NO：１に記
載のアミノ酸配列を有するG6P−DHの取得法に
関し、即ち (1)好適な宿主生物を本発明によるDNAで又はこ
のDNAのコピー１個以上を有するベクターで形
質転換し、 (2)形質転換した宿主生物を好適な培地中で培養
し、かつ (3)培地又は細胞からの蛋白質を富化する。
載のアミノ酸配列を有するG6P−DHの取得法に
関し、即ち (1)好適な宿主生物を本発明によるDNAで又はこ
のDNAのコピー１個以上を有するベクターで形
質転換し、 (2)形質転換した宿主生物を好適な培地中で培養
し、かつ (3)培地又は細胞からの蛋白質を富化する。
【0028】 形質転換した宿主生物、殊に原核宿主
生物、特にE.コリ細胞中での本発明による組換え
蛋白質の発現は原理的にそれぞれの好適なプロモ
ータの調節下に可能である。E.コリ中では例えば
G6P−DHの発現は異種プロモータ、例えばtac
−プロモータ、mgl−プロモータ又はpf1−プロ
モータの調節下に可能である。しかしながら基本
的にはロイコノストツクプロモータの調節下に、
特にSEQ ID NO：１に記載されている又はその
誘導プロモータ配列（SEQ ID NO：１の初めの
122個のヌクレチオドに相当）の調節下に発現を
行なうと有利である。最も優れているのは図１に
図示されているプラスミドpUC G6P−DH1.8で
ある。
生物、特にE.コリ細胞中での本発明による組換え
蛋白質の発現は原理的にそれぞれの好適なプロモ
ータの調節下に可能である。E.コリ中では例えば
G6P−DHの発現は異種プロモータ、例えばtac
−プロモータ、mgl−プロモータ又はpf1−プロ
モータの調節下に可能である。しかしながら基本
的にはロイコノストツクプロモータの調節下に、
特にSEQ ID NO：１に記載されている又はその
誘導プロモータ配列（SEQ ID NO：１の初めの
122個のヌクレチオドに相当）の調節下に発現を
行なうと有利である。最も優れているのは図１に
図示されているプラスミドpUC G6P−DH1.8で
ある。
【0029】 好適なE.コリ宿主菌株としては市販の
E.コリ菌株HB101を選択した。E.コリHB101を
pUC G6P−DH1.8で形質転換する際に、プラス
ミドは細胞中で高い安定性を有しかつG6P−DH
の発現は選択圧がなくとも数工程で行なわれるこ
とが判明した。
E.コリ菌株HB101を選択した。E.コリHB101を
pUC G6P−DH1.8で形質転換する際に、プラス
ミドは細胞中で高い安定性を有しかつG6P−DH
の発現は選択圧がなくとも数工程で行なわれるこ
とが判明した。
【0030】
【実施例】 次に本発明をSEQ ID NO：１及び
２並びに図１と関連させて実施例により詳説す
る。
２並びに図１と関連させて実施例により詳説す
る。
【0031】SEQ ID NO：１
pUC G6P−DH1.8中のロイコノストツクDNA挿
入部のヌクレオチド配列であり、コード領域の上
流側の初めの122個の塩基は、L.デキストラニク
スG6P−DHプロモータを表わしかつ塩基123〜
1580はL.デキストラニクスG6P−DH遺伝子のヌ
クレオチド配列を表わし、この配列は同様に記載
のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする。
入部のヌクレオチド配列であり、コード領域の上
流側の初めの122個の塩基は、L.デキストラニク
スG6P−DHプロモータを表わしかつ塩基123〜
1580はL.デキストラニクスG6P−DH遺伝子のヌ
クレオチド配列を表わし、この配列は同様に記載
のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする。
【0032】SEQ ID NO：２
ロイコノストツク・メセンテロイデスのG6P−
DH遺伝子のうちの、ヒトG6P−DHと高い相同
性を有するその活性中心の領域をコードする部分
のオリゴヌクレオチドプローブ。
DH遺伝子のうちの、ヒトG6P−DHと高い相同
性を有するその活性中心の領域をコードする部分
のオリゴヌクレオチドプローブ。
【0033】 図１：プラスミドpUC−G6P−DH1.8
例 １
ロイコノストツク・デキストラニクスからの染色
体DNAの単離 ロイコノストツク・デキストラニクスのゲノム
DNAは次の方法により得られる： ロイコノストツク・デキストラニクス
（DSM20187）をAPT培地（Merck No.10454）
中30℃で培養する。細胞を培養液100mlから遠心
分離し、20mmol／１トリス／HCl PH8.0 10ml
中で洗浄し、最後にこの緩衝溶液15ml中に再懸濁
させる。24％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール
6000 ５ml及びリゾチーム20mgの添加後、４℃で
16時間恒温保持する。細胞溶解は20％（ｗ／ｖ）
SDS １mlの添加により行なう。プロテアーゼK2
mgを添加しかつ37℃で60分間恒温保持する。連続
的なフエノール−及びクロロホルム抽出、RNア
ーゼＡ（0.5mg／60分間、37℃で）による処理、再
度のフエノール及びクロロホルム抽出、最後にエ
タノール沈澱によりDNAを更に精製する。
体DNAの単離 ロイコノストツク・デキストラニクスのゲノム
DNAは次の方法により得られる： ロイコノストツク・デキストラニクス
（DSM20187）をAPT培地（Merck No.10454）
中30℃で培養する。細胞を培養液100mlから遠心
分離し、20mmol／１トリス／HCl PH8.0 10ml
中で洗浄し、最後にこの緩衝溶液15ml中に再懸濁
させる。24％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール
6000 ５ml及びリゾチーム20mgの添加後、４℃で
16時間恒温保持する。細胞溶解は20％（ｗ／ｖ）
SDS １mlの添加により行なう。プロテアーゼK2
mgを添加しかつ37℃で60分間恒温保持する。連続
的なフエノール−及びクロロホルム抽出、RNア
ーゼＡ（0.5mg／60分間、37℃で）による処理、再
度のフエノール及びクロロホルム抽出、最後にエ
タノール沈澱によりDNAを更に精製する。
【0034】
例２ G6P−DHをコードするゲノムDNAフラ
グメントの大きさの測定 ハイブリツド形成にはSEQ ID NO：２に記載の
オリゴヌクレオチドを使用した。
グメントの大きさの測定 ハイブリツド形成にはSEQ ID NO：２に記載の
オリゴヌクレオチドを使用した。
【0035】 L.デキストラニクスからのゲノム
DNA各5μｇを種々の制限エンドヌクレアーゼ
（Bcl、Cla、Hind、Pst、Xba）で切
断し、0.8％アガロースゲル上で電気泳動で分離
し、かつその後ニトロセルロースフイルターに移
す。このようなフイルターを６×SSC緩衝液、
0.7％脱脂粉乳からの溶液で前ハイブリツド成形
後、付加的に32Ｐで放射性末端標識した前記のオ
リゴヌクレオチドを含有する同じ溶液中で一晩40
℃で恒温保持する。洗浄、乾燥及びオートラジオ
グラフイにより、制限酵素Bclにより生成した
大きさ約3.4kbのDNAフラグメントがオリゴヌク
レオチドとハイブリツド形成することを確認する
ことができる。
DNA各5μｇを種々の制限エンドヌクレアーゼ
（Bcl、Cla、Hind、Pst、Xba）で切
断し、0.8％アガロースゲル上で電気泳動で分離
し、かつその後ニトロセルロースフイルターに移
す。このようなフイルターを６×SSC緩衝液、
0.7％脱脂粉乳からの溶液で前ハイブリツド成形
後、付加的に32Ｐで放射性末端標識した前記のオ
リゴヌクレオチドを含有する同じ溶液中で一晩40
℃で恒温保持する。洗浄、乾燥及びオートラジオ
グラフイにより、制限酵素Bclにより生成した
大きさ約3.4kbのDNAフラグメントがオリゴヌク
レオチドとハイブリツド形成することを確認する
ことができる。
【0036】
例３ G6P−DHをコードするDNAフラグメン
トのクローニング L.デキストラニクスからのゲノムDNA20μｇを
BClで切断しかつ低温溶融アガロースからのゲ
ル中で分離する。大きさ約3.4kb＋／−0.2kbの
DNAフラグメントをゲルから切断する。このゲ
ル片をリガーゼ緩衝液［Maniatis及びその他共
著（1982）、Molecular Cloning、474頁］で平衡
化し、かつ65℃で液化する。その後、BamH
切断したpUC18DNA0.1μｇ及びT4−リガーゼ5U
を添加し、37℃で10分間、次に15℃で16時間恒温
保持する。制限エンドヌクレアーゼBamHは、
Bclにより生成された末端に相溶である突出し
ているDNA末端を生成する。
トのクローニング L.デキストラニクスからのゲノムDNA20μｇを
BClで切断しかつ低温溶融アガロースからのゲ
ル中で分離する。大きさ約3.4kb＋／−0.2kbの
DNAフラグメントをゲルから切断する。このゲ
ル片をリガーゼ緩衝液［Maniatis及びその他共
著（1982）、Molecular Cloning、474頁］で平衡
化し、かつ65℃で液化する。その後、BamH
切断したpUC18DNA0.1μｇ及びT4−リガーゼ5U
を添加し、37℃で10分間、次に15℃で16時間恒温
保持する。制限エンドヌクレアーゼBamHは、
Bclにより生成された末端に相溶である突出し
ているDNA末端を生成する。
【0037】 F.コリHB101（DSM1607）の細胞を培
地20ml中で培養しかつ塩化カルシウム処理により
コンピテントな状態にする［Maniatis及びその
他共著（1982）、Molecular Cloning、250〜
252］。前記の連結バツチを50mmol／１トリス／
HCl PH7.5の添加後再度65℃で５分間液化しか
つ形質転換に使用した。このように処理した細胞
を50μｇ／mlアンピシリンを含有するLB寒天プレ
ート上に塗り広げかつ37℃で１日恒温保持する。
地20ml中で培養しかつ塩化カルシウム処理により
コンピテントな状態にする［Maniatis及びその
他共著（1982）、Molecular Cloning、250〜
252］。前記の連結バツチを50mmol／１トリス／
HCl PH7.5の添加後再度65℃で５分間液化しか
つ形質転換に使用した。このように処理した細胞
を50μｇ／mlアンピシリンを含有するLB寒天プレ
ート上に塗り広げかつ37℃で１日恒温保持する。
【0038】 高度に成長したコロニーをアンピシリ
50μlを含有する新しいLB寒天プレート上に押し
付け、この上にニトロセルロースフイルターを置
く。コロニーが再度著しく成長した後でフイルタ
ーを取り除き、コロニーを溶解し［例えば
Grunstein及びHogness共著、Proc、Natl、
Acad、Sci.USA、72（1975）3961］かつ２に記載
した放射性標識したオリゴヌクレオチドプローブ
とハイブリツド形成する。オートラジオグラフイ
によりG6P−DHをコードする組換えプラスミド
を固定しかつ出発プレートから単離することがで
きる。そのようなクローンのプラスミドDNAの
単離及び特性の解明により、それが約6kbの大き
さを有することが明らかである。つまり、約
3.4kbの大きさのDNAフラグメントが
pUC18DNA中に挿入されている。このような組
換えプラスミドをそれ以後の処理に選択する。
50μlを含有する新しいLB寒天プレート上に押し
付け、この上にニトロセルロースフイルターを置
く。コロニーが再度著しく成長した後でフイルタ
ーを取り除き、コロニーを溶解し［例えば
Grunstein及びHogness共著、Proc、Natl、
Acad、Sci.USA、72（1975）3961］かつ２に記載
した放射性標識したオリゴヌクレオチドプローブ
とハイブリツド形成する。オートラジオグラフイ
によりG6P−DHをコードする組換えプラスミド
を固定しかつ出発プレートから単離することがで
きる。そのようなクローンのプラスミドDNAの
単離及び特性の解明により、それが約6kbの大き
さを有することが明らかである。つまり、約
3.4kbの大きさのDNAフラグメントが
pUC18DNA中に挿入されている。このような組
換えプラスミドをそれ以後の処理に選択する。
【0039】
例４ 遺伝子の制限及び発現
制限酵素Xba及びSpeで切断することにより
前記の得られた組換えプラスミドを大きさ約
2.2kbのフラグメント及び大きさ約3.8kbのフラグ
メントに切断することができる。この3.8kbフラ
グメントはpUC18からのDNA配列とSEQ ID
NO：１のヌクレオチド配列だけを含有する。
3.8kbフラグメントの単離及び再連結及び次のE.
コリHB101中への形質転換により、G6P−DH遺
伝子を発現するクローンが得られる。G6P−DH
遺伝子はこのポジテイブクローン中で、ポリリン
カー領域中でXba及びKpnで切断された市販
のpUC18ベクター中の1.8kbフラグメント（Spe
／Kpn）としてサブクローン化されており、
その際にポジテイブなクローンのベクター成分か
らのKpn切断部位は遺伝子バンクから由来す
る。それ故、ロイコノストツク・デキストラニク
スゲノムからのSpe／Bcl−フラグメントは
存在する。全サブクローン化1.8kbSpe／Bcl
のDNA配列はSEQ ID NO：１に記載されてい
る。
前記の得られた組換えプラスミドを大きさ約
2.2kbのフラグメント及び大きさ約3.8kbのフラグ
メントに切断することができる。この3.8kbフラ
グメントはpUC18からのDNA配列とSEQ ID
NO：１のヌクレオチド配列だけを含有する。
3.8kbフラグメントの単離及び再連結及び次のE.
コリHB101中への形質転換により、G6P−DH遺
伝子を発現するクローンが得られる。G6P−DH
遺伝子はこのポジテイブクローン中で、ポリリン
カー領域中でXba及びKpnで切断された市販
のpUC18ベクター中の1.8kbフラグメント（Spe
／Kpn）としてサブクローン化されており、
その際にポジテイブなクローンのベクター成分か
らのKpn切断部位は遺伝子バンクから由来す
る。それ故、ロイコノストツク・デキストラニク
スゲノムからのSpe／Bcl−フラグメントは
存在する。全サブクローン化1.8kbSpe／Bcl
のDNA配列はSEQ ID NO：１に記載されてい
る。
【0040】 生成した組換えプラスミドはG6P−
DHを固有のロイコノストツクプロモータの調節
下に含有する。それはpUC−G6P−DH1.8と表わ
され、図１に示されている。その際にG6P−DH
遺伝子の発現方向はpUC18上の1ac−プロモータ
（pLAC）と反対方向である。
DHを固有のロイコノストツクプロモータの調節
下に含有する。それはpUC−G6P−DH1.8と表わ
され、図１に示されている。その際にG6P−DH
遺伝子の発現方向はpUC18上の1ac−プロモータ
（pLAC）と反対方向である。
【0041】 G6P−DHの酵素活性の測定及び精製
に当りそのようなクローンを50μｇ／mlアンピシ
リンを含有するLB培地５mlを包含する試験管中
に接種しかつ37℃で一晩培養する。この培養物を
50μm／mlのアンピシリンを含有するLB培地11を
含む三角フラスコに接種しかつ再度37℃で一晩振
盪下に培養する。細胞を遠心分離により収穫す
る。
に当りそのようなクローンを50μｇ／mlアンピシ
リンを含有するLB培地５mlを包含する試験管中
に接種しかつ37℃で一晩培養する。この培養物を
50μm／mlのアンピシリンを含有するLB培地11を
含む三角フラスコに接種しかつ再度37℃で一晩振
盪下に培養する。細胞を遠心分離により収穫す
る。
【0042】
例５ E.コリからの組換えG6P−DHの富化及び
特性解明 ５ １富化法 １ 砕解 バイオマス（E.コリHB101 pUC−G6P−DH1.8）
５Kgを、10-3mol／1MgCl2を含有するリン酸カ
リウム緩衝液10mmol／１、PH7.5 251で懸濁しか
つ細胞をAPV−ガウリン高圧ホモゲナイザーを
使つて均質化圧800バールで砕解する。生成懸濁
液を14℃に冷却しかつ遠心分離する。
特性解明 ５ １富化法 １ 砕解 バイオマス（E.コリHB101 pUC−G6P−DH1.8）
５Kgを、10-3mol／1MgCl2を含有するリン酸カ
リウム緩衝液10mmol／１、PH7.5 251で懸濁しか
つ細胞をAPV−ガウリン高圧ホモゲナイザーを
使つて均質化圧800バールで砕解する。生成懸濁
液を14℃に冷却しかつ遠心分離する。
【0043】２ 硫酸アンモニウム分画
粗製エキスに固体硫酸アンモニウムを濃度1.9モ
ル／１まで加えかつ沈澱を遠心分離する。上澄み
を更に濃度3.0mol／１までの硫酸アンモニウム
で析出させかつ沈澱を遠心分離する。
ル／１まで加えかつ沈澱を遠心分離する。上澄み
を更に濃度3.0mol／１までの硫酸アンモニウム
で析出させかつ沈澱を遠心分離する。
【0044】３ 加熱
第２の硫酸アンモニウム沈澱を、1mmol／１
EDTAを含有する20mmol／１リン酸カリウム緩
衝液PH6.0で溶解しかつ52℃に20分間加熱する。
析出した沈澱を遠心分離する。
EDTAを含有する20mmol／１リン酸カリウム緩
衝液PH6.0で溶解しかつ52℃に20分間加熱する。
析出した沈澱を遠心分離する。
【0045】４ 第１結晶化
前記３からの上澄みに固体硫酸アンモニウムをゆ
つくりと2.1mmol／１まで加え、PH値をNaOHで
6.0に補正する。一晩G6P−DHを結晶させる。結
晶化は室温でかつ軽く攪拌しながら実施する。酵
素結晶を遠心分離する。
つくりと2.1mmol／１まで加え、PH値をNaOHで
6.0に補正する。一晩G6P−DHを結晶させる。結
晶化は室温でかつ軽く攪拌しながら実施する。酵
素結晶を遠心分離する。
【0046】５ 第２結晶化
1mmol／1EDTAを含有する20mmol／１リン酸
カリウム緩衝液PH6.0で沈澱を溶解し、かつ固体
硫酸アンモニウムを1.9mol／１まで加える。PH
を6.0に調節しかつ一晩室温でかつ軽く攪拌しな
がら酵素を晶出させる。
カリウム緩衝液PH6.0で沈澱を溶解し、かつ固体
硫酸アンモニウムを1.9mol／１まで加える。PH
を6.0に調節しかつ一晩室温でかつ軽く攪拌しな
がら酵素を晶出させる。
【0047】６ 遮断
酵素結晶を遠心分離しかつ濃縮した沈澱を、
1mmol／1EDTAを含有する10mmol／１リン酸
カリウム緩衝液PH6.0で溶解し、かつ同じ緩衝液
に対して24時間遮断する。
1mmol／1EDTAを含有する10mmol／１リン酸
カリウム緩衝液PH6.0で溶解し、かつ同じ緩衝液
に対して24時間遮断する。
【0048】７ 凍結乾燥
添加物を含有しない酵素溶液を凍結乾燥する。活
性約900U／mgの凍結乾燥物約210ｇが生成する。
性約900U／mgの凍結乾燥物約210ｇが生成する。
【0049】５ ２組換えG6P−DHの特性解明
遺伝子工学により製造したG6P−DHは公知のロ
イコノストツクからの酵素の性質とは異なつてい
る。
イコノストツクからの酵素の性質とは異なつてい
る。
【0050】 公知のロイコノストツク酵素の欠点は
次の通りである： 長期安定性が低い。更に、この酵素はグルコース
を変換し、このことは血液、血清又は血しよう中
で測定する際にこのような試料中には常にグルコ
ースが存在するので誤つた結果をもたらし得る。
G6P−DHの不十分な特異性は“アーカイブズ・
オブ・バイオケミストリー・エンド・バイオフイ
ズイツクス（Archives of Biochemistry and
Biophysics）”、149（1972）、102〜109に記載され
ている。
次の通りである： 長期安定性が低い。更に、この酵素はグルコース
を変換し、このことは血液、血清又は血しよう中
で測定する際にこのような試料中には常にグルコ
ースが存在するので誤つた結果をもたらし得る。
G6P−DHの不十分な特異性は“アーカイブズ・
オブ・バイオケミストリー・エンド・バイオフイ
ズイツクス（Archives of Biochemistry and
Biophysics）”、149（1972）、102〜109に記載され
ている。
【0051】 特性の差異は次の通りである。：
１ Km NADP（0.1mol／１トリスPH7.8中；25
℃） 組換えG6P−DH ロイコノストツクからのG6P
−DH 3.7×10-5 7.4・10-6mol／11) 5.7・10-6mol／13) 9.9・10-6mol／12) ２ 活性化剤／阻害剤の作用 ■■■ 亀の甲 ［0030］ ■■■ ３ 特異性 ■■■ 亀の甲 ［0031］ ■■■ ４ 温度安定性 ■■■ 亀の甲 ［0032］ ■■■ 温度安定性の測定は3.2mol／１硫酸アンモニア
PH6.0中で10分間行なつた（酵素の開始活性
2500U／ml）。
℃） 組換えG6P−DH ロイコノストツクからのG6P
−DH 3.7×10-5 7.4・10-6mol／11) 5.7・10-6mol／13) 9.9・10-6mol／12) ２ 活性化剤／阻害剤の作用 ■■■ 亀の甲 ［0030］ ■■■ ３ 特異性 ■■■ 亀の甲 ［0031］ ■■■ ４ 温度安定性 ■■■ 亀の甲 ［0032］ ■■■ 温度安定性の測定は3.2mol／１硫酸アンモニア
PH6.0中で10分間行なつた（酵素の開始活性
2500U／ml）。
【0052】 活性測定及び特異性測定は例６に記載
されているように行なつた。
されているように行なつた。
【0053】1Olive及びLevy共著、Biochem.6
（1967）、730頁 2DeMoss著、Methods in Enzymology、Vol.1、
328頁、Acad、Press出版、New York在、1955 3Levy著、626th Meeting Sheffield、13頁
（1988） ４濃度0.15mol／１ 5Arch.Biochem、and Biophys.149（1972）、102
〜109頁 例 ６ グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性の
測定 G6P−DHはグルコース−６−リン酸及びNAD+
をグルコン酸−６−リン酸及びNADHに変換す
る。形成されたNADHを340nmで測光法により
測定する。
（1967）、730頁 2DeMoss著、Methods in Enzymology、Vol.1、
328頁、Acad、Press出版、New York在、1955 3Levy著、626th Meeting Sheffield、13頁
（1988） ４濃度0.15mol／１ 5Arch.Biochem、and Biophys.149（1972）、102
〜109頁 例 ６ グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性の
測定 G6P−DHはグルコース−６−リン酸及びNAD+
をグルコン酸−６−リン酸及びNADHに変換す
る。形成されたNADHを340nmで測光法により
測定する。
【0054】 トリス緩衝液（0.1mol／１ PH7.8、
3mmol／１ HgCl2）、0.1mmol／１ NAD+、
遊離酸及び0.15mol／１グルコース−６−リン酸
により成る試薬３mlに試料（G6P−DH、容量活
性可能な限り0.3〜0.5U／ml）0.05mlを25℃で添
加しかつ吸光度（ΔE／分）の増加を追跡する。
容量活性は次のように計算する： ■■■ 亀の甲 ［0018］ ■■■
3mmol／１ HgCl2）、0.1mmol／１ NAD+、
遊離酸及び0.15mol／１グルコース−６−リン酸
により成る試薬３mlに試料（G6P−DH、容量活
性可能な限り0.3〜0.5U／ml）0.05mlを25℃で添
加しかつ吸光度（ΔE／分）の増加を追跡する。
容量活性は次のように計算する： ■■■ 亀の甲 ［0018］ ■■■
【図１】プラスミドpUC−G6P−DH1.8の地図で
ある。
ある。
Claims (7)
- 【請求項１】 SEQ ID NO：１ 配列の種類：相応する蛋白質を含有するヌクレオ
チド 配列の長さ：1696塩基対 鎖の形：一本鎖 【化１】 ■■■ 亀の甲 ［0026］ ■■■ 【化２】 ■■■ 亀の甲 ［0027］ ■■■ 【化３】 ■■■ 亀の甲 ［0028］ ■■■ で表わされるアミノ酸配列を含有することを特徴
とするグルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼ。 - 【請求項２】 SEQ ID NO：１で表わされる核
酸配列の請求項１によるグルコース−６−リン酸
デヒドロゲナーゼをコードする領域又は遺伝コー
ドの退行変性範囲で前記領域に相当する配列を含
有することを特徴とするDNA。 - 【請求項３】 請求項２によるDNAで形質転換
されていることを特徴とする微生物。 - 【請求項４】 (1)染色体のロイコノストツク・デ
キストラニクス（DSM20187）DNAを単離し、
かつ好適な制限酵素で切断し、 (2)切断したＬ、デキストラニクスDNAをベクタ
ー中に導入し、このベクターで好適な宿主生物を
形質転換しかつこのようにして遺伝子バンクを製
造し、 (3)(2)からの遺伝子バンクを、グルコース−６−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子に特異的な配列を有
する核酸プローブで検出し、かつ (4)(3)からのプローブとポジテイブに反応する遺伝
子バンクのクローンを分析する ことを特徴とする請求項２によるDNAの取得法。 - 【請求項５】 (1)好適な宿主生物を請求項２によ
るDNAで形質転換し、 (2)形質転換した宿主生物を好適な培地中で培養
し、かつ (3)培地又は細胞からの蛋白質を富化することを特
徴とする請求項１による蛋白質の取得法。 - 【請求項６】 測定酵素としてグルコース−６−
リン酸デヒドロゲナーゼを使用して、試料溶液中
のグルコース−６−リン酸の含量を酵素測定する
方法において、請求項１による組換えグルコース
−６−リン酸デヒドロゲナーゼを使用することを
特徴とする試料溶液中のグルコース−６−リン酸
含量の酵素測定法。 - 【請求項７】 測定酵素としてグルコース−６−
リン酸デヒドロゲナーゼを使用して、試料溶液中
のグルコース−６−リン酸の含量を酵素測定する
試薬において、請求項１による組換えグルコース
−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含有することを
特徴とする試料溶液中のグルコース−６−リン酸
含量の酵素測定試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4024158.0 | 1990-07-30 | ||
| DE4024158A DE4024158A1 (de) | 1990-07-30 | 1990-07-30 | Klonierung und ueberexpression von glucose-6-phosphat-dehydrogenase aus leuconostoc dextranicus |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04252180A JPH04252180A (ja) | 1992-09-08 |
| JPH0587234B2 true JPH0587234B2 (ja) | 1993-12-15 |
Family
ID=6411302
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3187166A Granted JPH04252180A (ja) | 1990-07-30 | 1991-07-26 | グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ｄｎａ、微生物、ｄｎａの取得法、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの取得法並びに試料溶液中のグルコース−６−リン酸含量を酵素測定する方法及び試薬 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5229286A (ja) |
| EP (1) | EP0469523B1 (ja) |
| JP (1) | JPH04252180A (ja) |
| CN (1) | CN1055314C (ja) |
| AT (1) | ATE121456T1 (ja) |
| AU (1) | AU636500B2 (ja) |
| CA (1) | CA2045838A1 (ja) |
| DE (2) | DE4024158A1 (ja) |
| DK (1) | DK0469523T3 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US6455288B1 (en) | 1993-04-08 | 2002-09-24 | Dade Behring Marburg Gmbh | Homogeneous immunoassays using mutant glucose-6-phosphate dehydrogenases |
| US6127345A (en) * | 1997-01-21 | 2000-10-03 | Smithkline Beecham Corporation | Polynucleotides encoding the glucose 6-phosphate dehydrogenase of Streptococcus pneumoniae |
| US7153666B2 (en) * | 2003-07-17 | 2006-12-26 | General Atomics | Methods and compositions for determination of glycated proteins |
| US7943385B2 (en) | 2006-07-25 | 2011-05-17 | General Atomics | Methods for assaying percentage of glycated hemoglobin |
| CN101484809B (zh) * | 2006-07-25 | 2013-12-04 | 通用原子公司 | 用于测定糖化血红蛋白百分比的方法 |
| WO2009140343A1 (en) * | 2008-05-13 | 2009-11-19 | General Atomics | Electrochemical biosensor for direct determination of percentage of glycated hemoglobin |
| US11878381B2 (en) | 2020-08-06 | 2024-01-23 | Mate Precision Technologies Inc. | Tooling base assembly |
| WO2022032178A1 (en) | 2020-08-06 | 2022-02-10 | Mate Precision Technologies Inc. | Vise assembly |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02177887A (ja) * | 1988-12-29 | 1990-07-10 | Toyo Jozo Co Ltd | グルコース―６―リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子 |
-
1990
- 1990-07-30 DE DE4024158A patent/DE4024158A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-06-27 CA CA002045838A patent/CA2045838A1/en not_active Abandoned
- 1991-07-16 AU AU80431/91A patent/AU636500B2/en not_active Ceased
- 1991-07-26 JP JP3187166A patent/JPH04252180A/ja active Granted
- 1991-07-29 AT AT91112739T patent/ATE121456T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-07-29 EP EP91112739A patent/EP0469523B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-29 DK DK91112739.7T patent/DK0469523T3/da active
- 1991-07-29 DE DE59105231T patent/DE59105231D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-30 US US07/737,071 patent/US5229286A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-30 CN CN91105212A patent/CN1055314C/zh not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-02-25 US US08/022,096 patent/US5308770A/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02177887A (ja) * | 1988-12-29 | 1990-07-10 | Toyo Jozo Co Ltd | グルコース―６―リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE59105231D1 (de) | 1995-05-24 |
| JPH04252180A (ja) | 1992-09-08 |
| CA2045838A1 (en) | 1992-01-31 |
| US5229286A (en) | 1993-07-20 |
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| EP0469523A3 (en) | 1992-11-04 |
| CN1058616A (zh) | 1992-02-12 |
| EP0469523B1 (de) | 1995-04-19 |
| ATE121456T1 (de) | 1995-05-15 |
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| CN1055314C (zh) | 2000-08-09 |
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| US5308770A (en) | 1994-05-03 |
| AU636500B2 (en) | 1993-04-29 |
| AU8043191A (en) | 1992-05-07 |
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