JPH0286779A - 改良型組換えｄｎａ、それを含む形質転換体及びそれを用いた耐熱性グルコースデヒドロゲナーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、バチルス・メガテリウム由来のグルコースデ
ヒドロゲナーゼ（以下ｒＧＤＨＪという。）をコードす
るＤＮＡのアミノ酸配列で示される特定の位置のアミノ
酸を他のアミノ酸で置換することによって得られる改良
型ＤＮＡを大腸菌用ＤＮＡ導入ベクターに組み込んだ大
腸菌内で複製可能な改良型組換えＤＮＡ、それを含む形
質転換体及びそれを用いる耐熱性ＣＤＨの製造法に関す
る。

〔従来技術〕

ＧＤＨ（ＥＣ１，１，１，４７〕は、グルコース定量用
酵素として臨床検査及び食品工業の分野において重要な
酵素として使用されている。

従来、ＧＤＨを生産する微生物としては、バチルス・メ
ガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ
）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅ
ｕｓ）等のバチルス属菌が知られている　（特開昭５３
−１３７１９９号）。

〔解決すべき問題点〕

しかしながらグルコース測定用酵素としてＧＤＨを使用
するためには、より安定性に優れたＣＤｌ−１をより安
価に製造することが望まれていた。

最近になってバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のＧＤＨｉｌＩ伝子を大
腸菌に組み入れた組換え体を用いたＣＤＨの生産方法が
開示された〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオ
ケミストリー（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　１７
４巻、４８５〜４９０．　　（１９８Ｂ）　）。

しかし、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍ
ｅｇａ　ｔｅｒｉｕｍ）由来のＧＤＨ遺伝子は複数個存
在することが示され、それらを用いて形質転換体を得、
ＧＤＨを生産しているが、使用しているベクターはＧＤ
Ｈの大量生産には向かないものであり、かつＧＤＨをよ
り安定化するための改良は何らなされていないのであっ
た。

〔問題点を解決すべき手段・作用〕

本発明者らは、まずＧＤＨをより安価に製造するため、
バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔ
ｅｒｉｕｍ）由来のＧＤＨ遺伝子を高発現ベクタ−ｐＫ
Ｋ２２３−３に組み入れて形質転換体を得、該形質転換
体を栄養培地で培養することによってＧＤＨを高生産す
ることに成功した。

その後、さらに検討を続けた結果、バチルス・メガテリ
ウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来
のＣＤＨをコードするＤＮＡのアミノ酸配列で示される
特定の位置のアミノ酸を他のアミノ酸で置換して得られ
る改良型ＤＮＡを大腸菌に組み入れた形質転換体を栄養
培地で培養したところ、培養物中に従来のＧＤＨより熱
安定性に優れたＧＤＨを大量に製造せしめることに成功
し、本発明を完成したものである。

本発明のバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍ
ｅｇａ　ｔｅｒ　ｉｕｍ）由来のＧＤＨ改良型組換えＤ
ＮＡを調製するためには、まずＧＤＨをコードする組換
えＤＮＡを調製する必要がある。

そのために使用する菌株としては、ＧＤＨ生産能を有す
るバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍ６ｇａ
ｔｅｒｉｕｍ）であればいずれのものも使用できるが、
好ましくはバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）　ＩＡＭ１０３０及び土壌から
分離されたバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ｒＷＧ３を用いるのがよい。

このうち土壌から得られた菌株のバチルス・メガテリウ
ム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）　ＩＷ
Ｇ３は以下のようにして同定されたものである。

旦定曳猪ス 菌学的諸性質の試験は、ルーズ・イー・ゴートン著、ザ
・ジーナス・バチルス（Ｒｕｔｈ　Ｅ、Ｇｏｒｄｏｎ：
Ｔｈｅ　Ｇｅｎｕｓ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　（１９７３）
）に準拠し、分類方法はバージエイス・マニュアル・オ
ブ・ディタミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇ
ｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉ
ｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）　（第８版）及び前
記Ｔｈｅ　Ｇｅｎｕｓ　Ｂａｃｉｌｌｕｓによった。

Ａ６形態 ■細胞の大きさは１．１〜１．６μ×３．０〜５．０μ
で桿菌である。またグルコース栄養培地（ｇｌｕｃｏｓ
ｅ　ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ａｇａｒ）で生育した細胞をツ
クシンで染めると細胞内は粒状である。

■運動性はない。

■胞子を形成し、大きさは１．０〜１．３　μ×２゜０
〜２．５μで、卵形ないしは円柱形である。胞子のうは
膨らまない。中立ないしは準端立である。

■ダラム染色性は陽性である。

Ｂ、生理学的性質 ■硝酸塩の還元：陰性 ■脱窒反応　　：陰性 ■ＶＰテスト　：陰性。プロスのρ１１は７日間の培養
で４．６〜５．０である。

■インドールの生成：陰性 ■デンプンの加水分解：陰性 ■クエン酸塩の利用：陽性 ■無機窒素源の利用：アンモニウム塩と硝酸塩を共に利
用する。

■色素の生成：チロシン培地で茶褐色の水溶性色素を生
成する。

■ウレアーゼ二弱陽性 ［相］カタラーゼ：陽性 ■酸素に対する態度：好気性 ■糖類からの酸及びガスの生成： アラビノース、キシロース、グルコース。

フラクトース、ガラクトース、マルトース、シュクロー
ス、ラクトース、トレハロース、マンニット、イノジッ
ト、グリセリン、デンプンから酸を生成するが、ガスは
生成しない。マンノース、ソルビットからは酸もガスも
生成しない。

＠７χＮａＣ１培地での生育：生育しないｏ４５°Ｃに
おける生育：生育する ０６５°Ｃにおける生育：生育しない ■フヱニルアラニンのデアミネーション：陽性■ゼラチ
ンの液化性：陽性 ■カゼインの分解性：陽性 ［相］チロシンの分解性；陽性 ■卵黄反応：陰性 以上の諸性質をバージェイス・マニュアル・オブ・ディ
タミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ
　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）（第８版）の分類方法にし
たがって検索すると、本菌株はダラム陽性の好気性桿菌
で胞子を形成するのでＢａｃｉｌｌｕｓ属に分類される
。種については■栄養細胞の大きさが１．０〜１．６μ
×３．０〜５．０μであり、グルコース培地で細胞内が
粒状であること、■胞子のうが膨らまないこと、胞子形
成部位は中央部ないしはやや末端よりであること、■グ
ルコースから酸を生成すること、ＶＰテストが陰性であ
ること、■嫌気条件下では生育しないこと、■サブロー
、デキストローズ（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ　ｄｅｘｔｒｏ
ｓｅ）培地で生育すること、■アラビノース、キシロー
ス３マンニツトから酸を生成すること、■卵黄反応が陰
性であること等の性質からバチルス・メガテリウム（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）と同定された
。

本発明者らは、本菌株をバチルス・メガテリウム　（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）　ＩＷＧ３と
命名した。

形質転換体（１）の調製 １）ＣＤＨの精製 バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａ
ｔｅｒｉｕｍ）ＩＷＧ３を２ＸＴＹブロスに植菌し、培
養後集菌し、菌体破砕後、遠心分離して得られる上清液
を脱塩濃縮後、凍結乾燥して得られたＧＤＨ粗酵累粉末
１０５μｇをグリセロール１０％含有イミダゾール緩衝
液（２０ｍＭ、　ｐＨ６，５）　１５ｍに溶解し、ＤＥ
ＡＥ−セファデックスＡ−５０に吸着させた後、食塩濃
度勾配（０，１Ｍ−０，５Ｍ）により溶出させ、活性画
分を集め脱塩濃縮する。次にＴＳＫ−ｇｅｌ　ＤＥＡＥ
　３　ＳＷを担体とする高速液体クロマトグラフィーに
より分子量分画を行い、さらにＴＳＫ−ｇｅｌ　Ｇ３０
００　ＳＷを担体とする高速液体クロマトグラフィーに
より吸着溶離して電気泳動的に均一な活性画分（蛋白質
量として約５■）を得た。

２）ＣＤＨのアミノ基末端アミノ酸配列の決定前記１に
より得た精製酵素蛋白質のアミノ基末端アミノ酸配列を
ＡＢＩ（アプライド　バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ
　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）　３社製ペプチドシーケンサー
Ｇａｓ　Ｐｈａｓｅ　４７０Ａにより分析し、Ｎ末端よ
り２９アミノ酸残基の配列を決定した。得られたアミノ
基末端アミノ酸配列を以下に示す。

Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−ＶａｌＶａｌ−１１ｅ−Ｔｈｒ
−Ｇｌｙ−３ｅｒ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−
ＧｌｙＬｙｓ−５ｅｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−１１ｅ−へｒ
ｇ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ注：下線部はプローブ合成
に用いられた配列を示す。

３）ＤＮＡプローブの合成 前記アミノ酸配列から下線で示した１個所の配列を選択
し、これらのアミノ酸配列から推定される遺伝子上の可
能なりＮＡ塩基配列のうち、枯草菌のコドン利用頻度を
参考にしてＤＮＡ塩基配列を推定し、３８ｍｅｒの１種
のＤＮＡプローブの塩基配列を下記の如く決定した。

ＴＡＣＡＴＡ　　ＴＴＴ　　ＣＴＡ　　ＧＡＣＣＴＴ　
　ＣＣＴ　　ＴＴＴ　　ＣＡＡ　　ＣＡＡＣＡＡ　　Ｔ
ＡＡ　　ＴＧ ＤＮＡの合成はＡＢ１社製でシンセサイザー（Ｓｙｎ　
ｔｈｅｓ　１ｚｅｒ）モデル３８１Ａを用いて行った。

４）バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇ
ａ　ｔｅｒ　ｉｕｍ）からの全ＤＮＡの抽出と切断斉藤
、三浦らの方法〔バイオキミカ・バイオフィジカ・アク
タ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）
、　７２巻。

６１９　（１９６３））に従ってバチルス・メガテリウ
ム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）Ｉ１４
Ｇ３から全ＤＮＡを抽出精製した。このＤＮＡ２４０μ
ｇをとり、制限酵素ＥｃｏＲＩ　、Ｂｇｌ　Ｕそれぞれ
１５ｅ単位と３７°Ｃ，３時間反応させた。反応液の全
量を１％アガロースゲル電気泳動に供し、３〜４Ｋｂの
大きさに相当するＤＮＡを含む部分を切出して、電気抽
出法によりゲルからＤＮＡ断片を溶出させた。次いで溶
出液を当量のフェノール及びフェノール・クロロホルム
で順次抽出し、得られた水層にエタノールを添加してＤ
ＮＡを沈澱させた後、ＴＥ緩衝液１００μｌに溶かした
。

５）ベクターへのＤＮＡ断片の挿入 ベクターとしてはｐＢＲ３２２を用いたが、ＤＮＡ断片
挿入のためには、ｐＢＲ３２２２０ｕ　ｇをＥｃｏＲＩ
ＢａｍＨＩで完全分解して得られた直鎖状ベクターＤＮ
ＡをＴＥ緩衝液２００μ２に溶解して使用した。

上記工程４で得られたＤＮＡ断片との結合は、工程４で
得られた溶液と直鎖状ベクターＤＮＡ溶液を１０：１の
割合に混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを１４°Ｃで一夜反
応させることにより行った。

６）バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇ
ａ　ｔｅｒ　ｉｕｍ）のＤＮＡライブラリーの作成上記
工程５で得られた組換えＤＮＡを形質転換により宿主大
腸菌エシェリヒア・コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｃ６００に導
入し、アンピシリン５０μｇ／ｍｆｌを含むし一プロス
寒天培地上で生育してきたコロニーを集めてバチルス・
メガテリウム　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉ
ｕｍ）ＩＷＧ３のＤＮＡライブラリーと称した。

７）ＤＮＡライブラリーからＧＤＨクローンの選択・分
離 上記工程３で得られたＤＮＡプローブを各々イングリア
（Ｉｎｇｌｉａ）らの方法〔ヌクレイツク・アシッド・
リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）＋
　　９巻。

１６２７〜１６４２　（１９８２）　）に従ってＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼとＴ−”Ｐ−ＡＴＰを用いてラ
ベルした。次に前記工程６で得られた大腸菌をアンピシ
リン５０μｇ／ｄを含むし一ブロス寒天培地上でコロニ
ーとして生育させ、これをレプリカ法によって、アマ−
ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）ナイロンメンプランへ移し
、リゾチーム溶菌し、アルカリでＤＮＡ変性させ、塩酸
による中和処理を行った後、前記プローブとハイブリダ
イゼーションさせた。ハイブリダイゼーションは６倍濃
度のＳ　Ｓ　Ｃ（０，１５ＭＮａＣ１，０，０１５Ｍク
エン酸ナトリウム、　ｐＨ７，０）、　　５倍濃度のデ
ンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄ　ｔ）液（０，０２％フィコ
ール、　０．０２％ポリビニルピロリドン、　０．０２
％生血清アルブミン）＋　　０．５％ＳＤＳ、牛胸腺Ｄ
ＮＡ２０μｇ／ｍｆｌｃ終濃度）及びラベルしたＤＮＡ
プローブ約５　ＸＩＯ’　ｃｐｍ／ｍを用いてプレハイ
ブリダイゼーションを４５°Ｃ，３時間行った後、４５
℃、−夜のハイブリダイゼーションを行った。この後、
５倍濃度のＳＳＣを用いて４５°Ｃで２回、つづいて５
倍濃度（７）ＳＳＣ（０，１％ＳＤＳを含む）を用イテ
４５°Ｃで２回、４倍濃度のＳＳＣで２回ナイロンメン
ブランを洗浄した。この後ナイロンメンプランを乾燥さ
せ、オートラジオグラフィー（条件ニー８０°Ｃ９−夜
）に供した。その結果、ハイブリダイゼーション陽性の
コロニーが３つ見出された。そこで陽性ノコロニーにつ
いて液体培養をした後、バーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉ
ｍ）らの方法〔ヌクレイツク・アシッド・リサーチ（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）＋　　７巻。

１５１３〜１５２３　（１９７９）　）によりプラスミ
ドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限
酵素ＥｃｏＲＩ、　Ｓａｌ　Ｉで切断し、アガロースゲ
ル電気泳動を行った後、ラベルしたＤＮＡプローブとサ
ザン（Ｓｏｎ　ｔｈｅｒｎ）ハイブリダイゼーション〔
ジャーナル・オプ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、
Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、）、９８巻、　　５０３〜５１７　（１，９
７５））を行った。その結果、ＥｃｏＲＩ、　Ｓａｌ　
１切断で生成する約３．６ＫｂのＤＮＡ断片にＤＮＡプ
ローブが弾くハイブリダイズすることが見出された。な
お分離された３株は同一のプラスミドを有することが示
され、ＧＤＨクローンの候補としてこのプラスミドをｐ
ＧＤＡｌと命名した。

８）ＧＤＨクローンの同定とＤＮＡ塩基配列の決定 プラスミドｐＧＤ＾１よりＥｃｏＲＩ　、　５ａｕ３Ａ
ｒ切断により生成する９３０ｂｐのＤＮＡ断片について
サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らの方法〔プロシーデインゲ
ス・オブ・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ニー
ニスニー　（Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、
　　Ｓｃｉ、　　Ｕ、Ｓ、八、）、　　７４巻、′５４
６３〜５４６７、　（１９７７））に従ってＤＮＡ塩基
配列を決定した。その結果、上記工程２で得られたＧＤ
Ｈのアミノ基末端アミノ酸配列に完全に一致するアミノ
酸配列をコードする塩基配列が見出され、この断片がＧ
ＤＨ遺伝子の一部を含むことが明らかになった。プラス
ミドｐＧＤＡ１については、制限酵素切断の結果にもと
づいて第１図に表される制限酵素地図を作成した。すで
に決定された塩基配列から遺伝子読取り方向の下流部位
のＤＮＡ塩基配列を決定したところ、第２図に示される
２６１個のアミノ酸よりなる蛋白質をコードする塩基配
列が存在することが示された。以上の結果によりプラス
ミドｐＧＤ＾１中のバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＷＧ３由来のＤＮ
Ａ断片中にはＧＤＨの構造遺伝子が完全に含まれている
ものと推定される。

９）ＧＤＨ遺伝子の発現 クローニングされたＧＤＨ遺伝子を大腸菌で発現させる
ためにプラスミドｐＧＤＡｌ中のバチルス・メガテリウ
ム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＷＧ
３由来のＤＮＡ断片から、以下に示す工程に従い遺伝子
の発現を試みた。

プラスミドｐＧＤＡ１１０Ｊ！７　ｇをＥｃｏＲＩ及び
Ｐｖｕ　ＩＩで切断し、１％アガロース電気泳動に供し
、約１．５Ｋｂの大きさの断片を回収した。得られた断
片１μｇにｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴ
ＴＰを終濃度各１ｍＭ。

ＤＮＡポリメラーゼクレノウフラグメント（にｌｅｎｏ
ｗ　ｆｒａｇｍｅｎｔ）　　４単位を加え、１０１１１
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、　７ｍＭ　Ｍｇ
Ｃ１ｚ、　　１ｍＭジチオスレイトールの反応液２０μ
ｌ中で、３０°Ｃ，２０分間反応させた。これにより両
端が平滑末端にされたＤＮＡ断片を精製し、その約０．
５μｇにＰｓｔｌリンカ−とＴ４ＤＮＡリガーゼ１０単
位を加え、６６ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５
）、　　５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．　５ｍＭジチオスレイト
ール、１ｍＭＡＴＰの反応液２０μｐ中で、１４°Ｃ９
−夜反応させた。反応後ＤＮＡ断片を精製し、ＢａｎＩ
［で切断後、この断片にマングビーンヌクレアーゼ（Ｍ
ｕｎｇ　ｂｅａｎ　ｎｕｃｌｅａｓｅ）　　Ｉ　Ｕを加
え、４０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５）、１００ｍ
Ｍ　ＮａＣ１゜２　ｍＭ　ＺｎＣＩｚ、　１０％グリセ
ロールの反応液５０ｕｌ中で、３０°Ｃ３３０分間反応
させた。この操作によりＢａｎ　Ｕの突出末端を平滑末
端にし、さらに上述したのと同様の方法でＥｃｏＲＩリ
ンカ−を連結した。

反応後ＤＮＡ断片を精製し、ＥｃｏＲＩとＰｓｔｌで両
端を切断し、ＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片として回収
した。

本実施例に用いられる発現用ベクターｐＫＫ２２３−３
は、ブロシウス（Ｂｒｏｓｉｕｓ、　Ｊ、）　　ら〔プ
ロシーデインゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・サ
イエンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、）、　８１巻、　６９２９〜６９３３．　
（１９８４）３により報告されたものであり、プロモー
ターとしてｔａｃプロモーターを有している。

この発現ベクターｐＫＫ２２３−３を制限酵素ＥｃｏＲ
ＩとＰｓｔｌで切断した後、回収したＥｃ６ＲＩ　−Ｐ
ｓｔ　Ｉ断片と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合反応
を行わせた。その反応液を用いてエシェリヒア・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＪＭ１０５を形
質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍ１．　　イソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を
含むし一プロス寒天培地上で生育してくるコロニーを選
択した。

得られたコロニーについてＣＤＨの発現をｆｌｌｌ　Ｅ
’２するために、色素共役法を用いたコロニーアッセイ
を行った。コロニーをろ紙上にレプリカし、５０ｍＭト
リス−塩酸（ｐＨ７，５）、　１０ｍＭ　ＥＤＴＡ緩衝
液にリゾチームを１■／戚の濃度に調整したりゾチーム
溶液をろ紙上のコロニーに加え、３０″Ｃｌ２Ｏ分間保
温後、１％トリトン溶液を加え室温で５分間放置した。

さらに熱処理用の緩衝液（５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
６，５）、　２Ｍ　ＮａＣ１，５０ｍＭ　ＥＤＴＡ）を
加え、６０°Ｃ２０分間熱処理を行った。

次に基質混合液（２０ｍＭ　）リス−塩酸（ｐＨ８，０
）。

ＩＭ　ＮａＣ１，１００ｍＭグルコース、　　０．５ｍ
Ｍフェナジンエトサルフェート（ＰＥＳ）、　０．５ｍ
Ｍ　３−（４’、５’−ジメチルチアゾール−２−イー
ルー２．５−ジフェニルテトラゾリウム　ブロマイド（
ＭＴＴ）、　　’５０μＭ　ＮＡＤ）を加え、３７°Ｃ
，５分間暗所にて放置する。対照実験として上記基質混
合液中のグルコースを除いたものを用いた。反応の停止
は、１０％酢酸溶液を加えることにより行った。コロニ
ーの選択は、コロニーが青紫色に変化したものを選んだ
。コロニーアッセイの結果、多数の陽性コロニーを得、
この中の１株からプラスミドＤＮＡを抽出し、これをｐ
ＧＤＡ２と命名し、制限酵素による切断で予想される構
造（第２図）を確認した。

なお、本プラスミドをエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＪＭ１０５へ形質転換によ
り導入してＧＤＨ高発現株エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＪＭ１０５／ｐＧＤＡ
２を得た。

本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄
第１０２４７号として寄託されている。

形質転換体（２）の調製 バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａ
ｔｅｒｉｕｍ）ＩＷＧ３にかえてバチルス・メガテリウ
ム（Ｂａ（ｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）　１４Ｍ
１０３０を用い、形質転換体（１）の調製の１）〜９）
と同様に操作し、高ＧＤＨ発現プラスミドＤＮＡを抽出
し、ｐＧＤＡ３と命名した。次いで本プラスミドを形質
転換してＧＤＨ高発現株エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＪＭ１０５／ｐＧＤＡ３
を得た。

なお、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅ
ｇａｔｅｒｉｕｍ）　１４Ｍ１０３０より得られたＣＤ
Ｈのアミノ酸配列は、第２図で示されたバチルス・メガ
テリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）
ＩＷＧ３由来ＧＤＨのＤＮＡアミノ酸配列と比較してそ
のＮ末端より２２位のセリンがアラニンに、４３位のア
スパラギン酸がグルタミン酸に、７９位のアラニンがセ
リンにそして９５位のロイシンがメチオニンにそれぞれ
置き換わったにすぎないことがわかった。

即ちバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇ
ａ　ｔｅｒ　ｉｕｍ）由来ＧＤＨをコードするＤＮＡの
アミノ酸配列は以下に要約される。

Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａ１Ｖａｌ−１１ｅ−Ｔｈｒ
−Ｇｌｙ−５ｅｒ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａ　　−Ｍｅｔ−Ａｌａ−１１ｅ−Ａ
ｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−ＧｌｕＬｙｓ−Ａｌａ
−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−
Ａｒｇ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｘ　　−Ｇｌｕ−八
Ｉａ−Ａｓｎ−３ｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌ
ｕ−ｒｌｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｕ−Ａｌａ−ｌｉｅＡｌａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−５ｅ
ｒＡｓｐ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−
Ｇｉｎ−３ｅｒ−Ｙ　　−１ｉｅＬｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈ
ｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ
−１１ｅ１１ｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ａ
ｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−（但しＡはＳ
ｅｒ又は八ｌａ、　Ｘは八ｓｐ又はＧｌｕ、　ＹはＡｌ
ａ又はＳｅｒ、　ＢはＬｅｕ又はＭｅｔである。）改良
型組換えＤＮＡ（１）の調製 １）−木鎖ＤＮＡの調製 前記プラスミドｐＧＤＡ２又はｐＧＤＡ３を制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉによって切断し、Ｃ，ＤＨ遺伝
子断片約０．９Ｋｂを得、Ｍ１３ファージｍｐ１８又は
ｍｐ１９を用いてクローニングを行い得られた組換え体
より常法に従って一本ｔｊｊ　Ｄ　Ｎ　Ａを調製した。

２）−重鎖ＤＮＡの化学試薬による変異処理上記により
得られた一本鎖ＤＮＡ４０μｇを０．５Ｍ酢酸緩衝液（
ｐＨ４，３）　５０μｌに溶解し、２Ｍ亜硝酸ナトリウ
ム溶液５０μ！を加えて２０°Ｃ，１〜３時間の処理を
行った。

また同様に亜硝酸ナトリウムの代わりに１２Ｍのギ酸を
１００μＰ添加して２０°Ｃ，５〜２０分間処理したり
、他にも６０％ヒドラジン１００μｌを°加えて同様に
２０°Ｃ，５〜２０分間処理した。反応の停止は上記処
理液にそれぞれ２０ｅｇのｔＲ？ＪＡを含む２゜５Ｍ酢
酸緩衝液（ｐＨ７，０）　１００μｌを添加することに
より行い、続いて各反応液に蒸留水２００μＰを加えた
後、水冷エタノール１ｄを加えて変異処理ＤＮＡを沈澱
させ、さらに水冷７０％エタノールで３回洗浄した。

３）変異二本鎖遺伝子断片の調製 前工程により得られた変異処理ＤＮＡｌ０μｇに１０倍
濃度の逆転写酵素用緩衝液〔７０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐ）１７．５）、　　７０ｍＭ塩化マグネシウム、　
０．５Ｍ塩化ナトリウム、　２０ｍＭジチオスレイトー
ル）１０μｌと２０ｅｍｏｌのプライマーを含む溶液２
μｌと蒸留水７４μ！を加えて８５°Ｃ，５分間、４０
°Ｃ９１５分間保温した後、１抛台のｄＮＴＰ　　１３
μ！と逆転写酵素１μ１（２０ｕ）を加えて３７°Ｃで
反応を行った。１時間後フェノール抽出を行った後エタ
ノール沈澱を行い、沈澱物を溶解後、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ、　ＰｓｔＩで分解し、アガロースゲル電気泳動を行
い、ゲルより変異二本鎖遺伝子断片を常法に従い回収し
た。

４）耐熱化ＧＤＨ遺伝遺伝子株持株択 前工程により得られた変異二本鎖遺伝子断片を発現ベク
ターｐＫＫ２２３のＥｃｏＲＩ、　Ｐｓｔｌ切断部位へ
組み込み、大腸菌エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａｃｏ目）　ＪＭ１０３を形質転換した。シャー
レ培地上に生育したコロニーについて、ろ紙を用いるレ
プリカプリント法により酵素活性を調べた。尚、ろ紙は
あらかじめ６０°Ｃｌ２Ｏ分間の加熱処理を行った。

ろ紙上に強い発色が認められたクローンについては、変
異によりＣＤＨの遺伝子が変化して耐熱化したことが考
えられるため、菌株をマスタープレートから釣菌する。

次に上記方法により選択された菌株を各々２ＸＴＹ培地
５ｄに接種して３７°Ｃ１１８時間振盪培養を行い、集
菌洗浄後、菌体懸濁液を超音波処理し、遠心分離を行っ
て上清液を得た。この上清液について６０°Ｃ９２０分
間の加熱処理を行い、残存活性を測定して耐熱化変異酵
素遺伝子株持株を選択した。

５）耐熱化変異酵素遺伝子の塩基配列決定と変異の同定 耐熱化変異酵素遺伝子株持株よりプラスミドＤＮＡ−ｔ
−調製し、常法に従って遺伝子断片の塩基配列の決定を
行い、変異点を明らかにし、酵素蛋白質のアミノ酸配列
上の変化を確認した。

即ち、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅ
ｇａｔｅｒｉｕｍ）　ＩＷＧ３由来ＧＤＨ天然型ＤＮＡ
のアミノ酸配列のＮ末端より９６位のグルタミン酸がア
ラニンに変化した改良型組換えＤＮＡであるｐＧＤへ２
Ｆ＝１８、同じくＮ末端より９６位のグルタミン酸がグ
リシンに変化したｐＧＤＡ２１１−３５　、Ｎ末端より
２５２位のグルタミンがロイシンに変化したｐＧＤＡ２
Ｆ−２０、Ｎ末端より２５３位の千ロジンがシスティン
に変化したｐＧＤＡ２Ｎ−７１、Ｎ末端より９６位のグ
ルタミン酸及びＮ末端より１８３位のバリンがそれぞれ
リジン及びイソロイシンに変化したｐＧＤＡ２Ｎ−１、
Ｎ末端より９６位、１１２位、１３３位及び２１７位の
グルタミン酸、バリン、グルタミン酸及びチロシンがそ
れぞれリジン、アラニン、リジン及びヒスチジンに変化
したｐＧＤＡ２Ｎ−１３、さらにはＮ末端より９６位、
１０８位、１９４位及び２１０位のグルタミン酸、アス
パラギン酸、プロリン及びグルタミン酸がそれぞれリジ
ン、アスパラギン、グルタミン及びリジンに変化したｐ
ＧＤ＾２Ｎ−２８の各改良型組換えＤＮＡが得られた。

次いで各プラスミドでエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＪＭ１０３を形質転換して
得られた各形質転換体について２ＸＴＹブロス培地で３
７”Ｃ，１８時間培養し、集菌後、菌体懸濁液を超音波
処理し、遠心分離後、得られた上澄液について５０”Ｃ
，２０分及び６０″Ｃ，２０分処理後の残存ＧＤＨ活性
を測定した。

尚、対照菌としてエシェリヒア・コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＪＭ１０３／
ｐＧＤＡ２菌を使用して比較した。その結果は表−１に
示される。

（以下余白） 表−１ 表−１より明らかのように、ＧＤＨをコードするアミノ
酸配列で示される特定のアミノ酸即ちＮ末端より９６位
のグルタミン酸がアラニン、グリシン又はリジンのいず
れかに置換することによって或いはＮ末端より２５２位
のグルタミンがロイシン及びＮ末端より２５３位の千ロ
ジンがシスティンに置換されることによってもＧＤＨの
耐熱性が著しく向上することがわかる。

改　　　　えＤ　Ｎ　Ａ　（２）のＲ，′プラスミドｐ
ＤＧＡ２にかえてプラスミドｐＧＤＡ３を用いる以外は
改良型組換えＤＮＡ（１）の調製の項の１）〜５）と同
様に操作してバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）　ＩＡＭ１０３０由来天然
型ＤＮＡのアミノ酸配列のＮ末端より９６位のグルタミ
ン酸がアラニンに変化した改良型組換えＤＮＡであるｐ
ＧＤＡ３Ｆ−２０及びＮ末端より２５２位のグルタミン
がロイシンに変化したｐＧＤ４３Ｆ−２０、Ｎ末端より
２５３位のチロシンがグリシンに変化したｐＧＤＡ３Ｎ
−７１がそれぞれ得られた。

次いで各プラスミドでエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＪＭ１０３を形質転換して
得られた各形質転換体について２ＸＴＹブロス培地で３
７”Ｃ，１８時間培養し、集菌洗浄後、菌体懸濁液を超
音波処理し、遠心分離後、得られた上澄液について５０
°Ｃ５２０分及び６０°Ｃｌ２Ｏ分処理後の残存ＧＤＨ
活性を測定した。

尚、対照菌としてエシェリヒア・コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）　ＪＭ１０３／
ｐＧＤＡ３菌を使用して比較した。その結果は表−２に
示される。

表−２ （以下余白） バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａ
ｔｅｒｉｕｍ）部位特異的変換手法〔シーラーら（Ｍ、
Ｚｏｌｌｅｒ、　Ｍ、Ｓｍ１ｔｈ）、　　ヌクレイツク
・アシド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅｓ、）＋　１０巻、　６４Ｂ？　（１９８２）　）を
用いてＧＤＨ遺伝子のＮ末端より９６位に対応する塩基
配列ＧＡＡ（グルタミン酸）をＧＣＡ　（アラニン）に
変換して変異遺伝子を調製し、上記と同様に生産された
酵素の耐熱性を調べた結果、高い耐熱性が確認された。

実施例１ 形質転換体エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ　ｉｃｈ
　１ａｃｏｌｉ）　ＪＭ１０５／ｐＧＤＡ２Ｆ−１８を
アンピシリン５０　ｔｔ　ｇ／　ｍｌを含む２ＸＴＹブ
ロス１００−に植菌し、３７゛Ｃで１３時間振盪培養後
、ＩＰＴＧ（終濃度０．１ｍＭ）を添加して２時間後に
遠心分離により集菌し、ＮａＣ１２Ｍを含む５０ｍＭリ
ン酸塩緩衝液（ｐＨ６，５）で洗浄後、１０　ｍｌの同
緩衝液に懸濁し、超音波破砕機により破砕後、遠心分離
して上清液を得た。一方、対照としてバチルス・メガテ
リウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）　Ｉ
ＷＧ３を２ＸＴＹブロスＩＯＭ！に植菌し、３７°Ｃ１
２４時間振盪培養した。次に上記と同様に集菌し、洗浄
後、超音波破砕処理した後、遠心分離し、その上清を酵
素液とした。

酵素活性の測定はＤ−グルコース０．ＬＭ　　ＮＡＤ　
２０ｍＭを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）　７５
ｍＭに酵素液を加えて光度計セル内にて３０°Ｃで反応
させ、３４０ｎｍにおける吸光度の増大を調べることに
より行った。反応の１分間に１μｍｏｌｅのＮＡＤＨを
生成する酵素活性を１単位と定め、比活性は酵素液中の
蛋白質１■当匂の単位数として示した。その結果エシェ
リヒア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）
ＪＭ１０５／ｐＧＤＡ２Ｆ−１８の比活性は７，８ｕ／
ｍｇであった。

これに対し、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）　ＩＷＧ３の比活性は０．０
７ｕ／ｍｇであった。

叉履桝ｌ Ｂで得られたエシェリヒア・コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）　ＪＭ１０５／
ｐＧＤＡ２Ｆ−１８株由来の耐熱性ＧＤＨ酵素液及び対
照としてのバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＷＧ３株由来のＧＤＨ酵素
液のそれぞれについて３７°Ｃ，６ケ月間での安定性を
比較した。

その結果、本発明の耐熱性ＧＤＨは９０％以上の残存活
性を示したが、対照の方は８０％以下の残存活性を示し
た。

実施例３ 形質転換体エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌｉ）　ＪＭ１０５／ｐＧＤＡ３Ｆ−１８をアン
ピシリン５０ｕｇ／ｍｌを含む２ＸＴＹブロス１００戚
に植菌し、３７°Ｃで１３時間振盪培養後、ＩＰＴＧ（
終濃度０．１ｍＭ）を添加して、２時間後に遠心分離に
より集菌し、ＮａＣ１２Ｍを含む５０ｍＭリン酸塩緩衝
液（ｐＨ６，５）で洗浄後、１０艷の同緩衝液に懸濁し
、超音波破砕機により破砕後、遠心分離して上澄液を得
た。

本上澄液の比活性を実施例１の比活性測定法に準じて求
めたところ、６．６ｕ／■であった。

〔発明の効果〕

本発明は、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｍｅｇａ　ｔｅｒ　ｉ　ｕｍ）由来のＧＤＨをコードす
るＤＮＡのアミノ酸配列で示される特定位置のアミノ酸
を他のアミノ酸で置き換えて得られる改良型ＤＮＡをＧ
ＤＨ高発現用ベクターに組み込んだ大腸菌内で複製可能
な改良型組換えＤＮＡを含む形質転換体を培養すること
によって耐熱性ＧＤＨを安価に大量に供給することを可
能としたものである。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＧＤＡ２の制限酵素地図を示すも
のであり、第２図はバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＷＧ３由来ＧＤＨ
のＤＮＡアミノ酸配列を示すものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）次のアミノ酸配列で示されるバチルス・メガテリウ
   ム由来のグルコースデヒドロゲナーゼをコードするＤＮ
   Ａの特定の位置のアミノ酸が他のアミノ酸によって置換
   された改良型ＤＮＡを大腸菌導入ベクターに組み込んだ
   大腸菌内で複製可能な改良型組換えＤＮＡ。【遺伝子配
   列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 （但しＡはＳｅｒ又はＡｌａＮＸはＡｓｐ又はＧｌｕ、
   ＹはＡｌａ又はＳｅｒ、ＢはＬｅｕ又はＭｅｔである。 ） ２）特定の位置のアミノ酸がＮ末端から９６位のグルタ
   ミン酸であり、置換された他のアミノ酸がリジン、グリ
   シン又はアラニンのいずれかである特許請求の範囲第１
   項記載の改良型組換えＤＮＡ。 ３）特定の位置のアミノ酸がＮ末端から２５２位のグル
   タミンであり、置換された他のアミノ酸がロイシンであ
   る特許請求の範囲第１項記載の改良型組換えＤＮＡ。 ４）特定の位置のアミノ酸がＮ末端から２５３位のチロ
   シンであり、置換された他のアミノ酸がシステインであ
   る特許請求の範囲第１項記載の改良型組換えＤＮＡ。 ５）特許請求の範囲第２項、第３項又は第４項記載の改
   良型組換えＤＮＡを導入したエシエリヒア・コリ。 ６）特許請求の範囲第５項記載の形質転換体を栄養培地
   で培養し、耐熱性グルコースデヒドロゲナーゼを培養物
   中に産生せしめ、該培養物中より耐熱性グルコースデヒ
   ドロゲナーゼを採取することを特徴とする耐熱性グルコ
   ースデヒドロゲナーゼの製造法。