JPH05506673A - 迅速な創傷の治癒を促進するためのｇｍ―ｃｓｆ及びｇ―ｃｓｆの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 迅速な創傷の治癒を促進するためのＧＭ−Ｃ８Ｆ及びＧ−Ｃ３Ｆの使用 発明の分野 本出願は１９９１年２月２２日に出願したＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ。

０７／６５９．７８０の部分継続出願である。

本発明は一般に損傷を受けた患者の迅速な創傷の治癒の促進を可能にする方法に 係る。特に、本発明は種々の創傷を負った患者の迅速な創傷の治癒を促進するた めに造（２）コロニー刺激因子Ｇ−Ｃ３Ｆ及びＧＭ−Ｃ９Ｆを使用する方法につ いて述べている。

発明の背景 Ａ、創傷及び創傷の治癒 ヒトに皮膚は２つの異なる層、表皮及び真皮からなる。これらの層の下には、皮 下組織がある。これらの組織の第一の機能は動物を保護し、感覚を与え、体温を 調整することである。第二に、これらの層は、外力や物体からの衝撃を和らげる ことにより、シコフクや外傷から生物の内臓を保護する。

皮膚の最外部の層である表皮はほぼＯ，Ｑ４ｍｍの厚さで、血管がなく、４つの 型の細胞（ケラチノサイト、メラノサイト、ランゲルハンス細胞及びメルケルｗ ｉ胞）からなり、いくつかの上皮細胞層に階層化されている［Ｌ＋＋＋ｏｎ他、 （１９８５）、ＴｅｘｔｂｏｏｋｏＩ　Ｈｉ＋ｌｏｌｏｇ７．４８５ｉａｎｌｌ ｅ＋＋　Ｃｏ、、　Ｐｈ１ｌｔｄ！１ｐｈｉｚ］　。表皮の最も内側の上皮層は 基底膜であり、真皮と直接接触し、表皮を真皮に結び付けている。皮膚の全ての 上皮細胞の分化は基底膜で行われる。細胞分化後、上皮細胞は表皮の外側表面に 向けて移動する。この移動の間に、細胞は角質化として知られる過程を経て、核 が失われ、細胞は強靭で、偏平で、抵抗力のある非生存細胞に変わる。細胞が最 外部の表皮構造である角質層に到達すると移動は終了する。この角質層は乾燥し た、耐水性の偏平細胞層であり、その下にある組織の乾燥を防ぐ助けをする。こ の死んだ上皮細胞の層は連続的に剥がれ落ち、基底膜から表面に移動してきた角 質化した細胞と入れ替わる。表皮上皮は無血管であるため、基底膜の栄養は真皮 から供給される。

真皮は非常に血管化した組織層であり、表皮に栄養を供給する。さらに、真皮は 神経末端、リンパ管、コラーゲン蛋白質及び結合組織を有している。真皮は厚さ 約０．５ｍｍで、主として繊維芽細胞及びマクロファージからなる。これらの型 の細胞は、皮膚を含む全ての動物の結合組織に見られる蛋白賀、コラーゲンの産 生と維持に大きな役割をになっている。コラーゲンは主として皮膚の回復力、柔 軟性を与える。コラーゲンの豊富な真皮の下にある皮下組織はその上の組織に対 して皮膚可動性、絶縁、カロリー貯蔵及び血液を提供する。

健康な生物では、皮膚及び／またはその下の何組織に損傷があるときにはいつも 、その結果生じた創傷を修復する過程が直ちに開始される。ヒトでは、損傷が表 皮に留まり、基底膜が無傷である場合を除き、損傷を受けた外側の外皮をこの過 程で全面的に再生すルノテハなイ［ａｋｉｌｅｋ、　Ｈ，（１９８８１、ｃｉｃ Ｃ＋１ｌｉｃ＋ｌ　Ｒｅｗｉｅｖ＋　ｉｎ　Ｂｉｏｃｏｍｐｓ＋１ｂｉｌｉｔ７ ．　ｗｅｔ、４．　３号＋　２０９−４６］。従って、創傷がより広範囲の組織 を損なっているときには、損傷を受けた、破壊された、または消失した組織は同 じ組織では再構築されず、その代わりに鍛痕組織に置き換わる。組織破壊が表皮 と真皮の両方に完全に浸透している創傷は全厚創傷（ｆｕｌｌ　ｌｈｉ＋ｋｏｃ ＋＋　ｔｏａｎｄ）として知られており、一方、表皮までは広がっているが、真 皮には完全には浸透していない創傷は部分厚創傷（ｐｘ＋ｔｉ＋ｌ　ｔｈｉｃｋ ｎｅ＋＋　ｔｏａｎｄ　）と呼ばれている。

軟組織損傷の機構は一般に２つの範躊、機械的損傷と熱損傷に分けることができ る。機械的な力には３つの型、すなわち、圧縮、切断及び伸張がある。十分圧縮 すると、接触した組織を押しつぶし、重篤な創傷、例えば鈍い力による外傷やピ ストルで撃たれて起こる創傷が生じる。切断により生じる創傷は皮膚に浸透する 損傷に最も一般的なものである。外科的な及び外科的ではない切傷が切断力によ り生じた創傷の例である。周囲の組織にはほとんどエネルギーが移動しないので 、組織の失活はほとんど起こらず、治癒は一般に複雑ではない。伸張による創傷 で、皮膚が皮下の基体から、完全にまたは少な（とも１つの縁がくっついたまま の皮膚弁を残して、引き離される。伸張による創傷の重症度は、皮膚弁への血液 供給の障害の程度並びに皮膚弁の大きさ、厚さ及び皮膚弁基底の幅と皮膚弁の長 さの比によって変わる。

創傷を生じうる熱の力には、冷却、伝導、対流、電気及び放射が含まれる。一般 に、熱創傷の重症度は熱源、温度、露出時間及び熱の移動に対する皮膚の耐容性 に依存する（：Ｔ＋ｏｔｔ、　Ａ。

ｆ１９８８］　Ａｎｎ、Ｅｍｅｒ、　Ｍｅｄ、、　ｗｏｌ、ＩＴ：　１２７９− ８３１゜創傷の治癒とは破壊された組織が修復される過程である。組織が全くま たはほとんど失われていない創傷は一次治癒で治癒し、組織が失われた深い創傷 は二次治癒で治癒するといわれている。創傷の治癒過程は炎症、肉芽組織の形成 、及びマトリックス形成及び再形成からなる［ＴＢ　Ｄｉｉｋｅ他、（１９８９ ）、Ｂｉｏｒｅｔｈｎａｌｏｇ７　、　ｙＯｌ、７：　７９３−９８］。

軟組織損傷に対する炎症反応は創傷を受けると直ちに始まり、組織の縁が分離し 、血液が創傷に流れ込み、凝固カスケードを活性化して止血させる。初めに短時 間創傷部位の周囲の組織で血管拡張し、次に血管収縮する。創傷の中の血小板は 凝集して血餅を形成すると共に、沢山の血管作動性化合物、化学誘引剤及び成長 因子を放出する［Ｇｏ＋ｌｅ３　＋、Ｂ、、（ｌＨ８］、１．　Ｄｅ＋ｍ）ｏｆ 。

Ｓｏｂ、　０ｎｔｏ、　、　ｙｏｌ　９：　９５９−７２　］　ｏ線維芽細胞及 び上皮細胞は暫定的なフィブロネクチンマトリックスを使用して創傷に侵入する ため、血餅それ自体が最終的な創傷の修復に重要である。

さらに、創傷の周囲の毛細血管透過性が高まり、また、血流が減少するために多 形核白血球（ＰＭＮ）が毛細血管壁に接着し、単球と同様に創傷の中に移動する ［：　Ｅｃｋｅ＋＋ｌｅ７他、　、（１９８８１゜Ｂｒ１ｔｉ＋ｂ　１ｌｅｄｉ ｃｚｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、ｙｏｌ、４４．　）Ｔｏ、２：　４２３−３６］。

好中球のようなＰ　Ｍ　Ｎは最初に創傷に認められる主な型の細胞である。ＰＭ Ｎ及びマクロファージが創傷の清浄化過程を開始する。この清浄化過程は、はと んど、失活した組繊及び他の破片の食ｍ胞崩壊を通して行われる。損傷を受けて から３−５日後までに、ＰＭＮの大部分がマクロファージに置き換わり、マクロ ファージが引続き死んだ勧賞や外来勧賞を除去する。

１９７２年、５ｉｉｐ＋ｏｎ及びＲｏｏｔ　ｌ：１．　Ｃｌ１ｎ、１ａｔｅｎ＋ 、、ｖａｔ、５１２００９−２３１は、創傷の部位にＰＭＮがほとんど全く存在 しなくても創傷の治癒は妨げられないことを示した。しかし、創傷の修復におけ るマクロファージの役割は重要である可能性がある［Ｄｉｅｇｅ１ｍｉａｎ他、 　（１９８２Ｊ　Ｐｉｔｓ’、　Ｒｓｅｏ＋＋ｓｔ＋、Ｓｕｅ、、　ｗｏｌ、８ ８：１０７−１１３　］。実験的な単球が減少した創傷では、肉芽組織の形成、 線維増殖、及びコラーゲンの配置が顕著に損なわれ、治癒が遅延する［Ｌ！ｉｂ ｏマｉｃｈ他、（１９７５１Ａｔ　１．　Ｐｓｊｈ、、マｏｆ、７８７１−１０ ０　；　１１ｕ＋ｔｏｅ他、（＋９８９）　Ａｍ、１．　Ｓｕｒ！、、マｏｆ、 １５Ｅ　３４５−５０　；　Ｐｉｅｒｃｅ他、（１９８９）　Ｐｔｏｃ、　Ｎｉ ｊ、　Ａｃ！ｄ、　Ｓｃｉ、［ＩＳＡ、ｒｏｔ。

ａｓ＋　２２２９−３３］。

マクロファージが創傷の中で見いだされた場合、これは単球及び繊維芽細胞の化 学誘引勧賞として作用する覆々の生物学的に活性な勧賞、例えばトランスフォー ミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）及び血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を放出 することが知られている［Ｒ１ｐｐｏｌｌｅｅ他、（１９８８１５ｃｉｅ＋＋ｃ ｅ、マｏｆ。

２４１　：　７０Ｂ−１２；　Ｐｉｅｒｃｅ他、上記；　Ｐｉｅｒｃｅ他、（１ ９８９１１，Ｃｅ１ｌＲｉａｌ　、マｏ１．　１Ｇ９：　４２９−２０　］　。

　０ｂｂｅ！ｌｈｅｏ−５ｈｅｉｌｌｉｎｇ　他。

（１９８８）　１．　Ｒｉｏｔ、Ｃｈｅａ、、マｏｆ、２６３：　７７４１−４ ６、Ｐｉａｌ＋＋ｏｎ他。

（１９８７＋ ＮＮａ＋ｅ、ｙｏｌ、３２１：　７１５−１７：及びＣｏ１ｆｅｌ他、（＋９８ ７］　Ｎ！ｌａ：ｅ。

マｏｆ、３２８：　Ｈ７−２０も参照のこと。活性化されたマクロファージは失 活したコラーゲン及びフィブリンの塊を消化する。血餅が溶解して、創傷の部位 に肉芽組織が形成される。これが創傷の治癒の第２の相である。

肉芽組織の形成は、創傷が生じて３−４日後から始まり、再上皮形成が起こるま で開放創傷中で続く。この段階では、線維芽細胞の増殖及び創傷の部位への移動 が顕著である。線維芽細胞は創傷の部位で、職質物質として知られている、コラ ーゲン、フィブロネクチン、及びヒアルロン酸からなる細胞外マトリックスを生 成して、消化した血餅と置き換える。この細胞外マトリックスは足場として作用 し、その上に内皮細胞、線維芽細胞及びマクロファージが移動できる。また、胚 線維芽細胞もこの細胞外マトリックスを使用して、二次治癒で治癒する全厚創傷 の創傷の収縮過程により創傷の閉鎖を促進する。

筋繊維芽細胞は、全厚創傷が生じた直後に、内在する線維芽細胞の分化によって 得られる。これらの胚線維芽細胞は新しく置かれた細胞外マトリックを使用し、 フィブロネクチンと呼番ｆれるマトリックスと共に放射状に並び、収縮し、より 迅速な創傷の閉鎖を促進する［Ｓｉｎｇ＋＋他、（１９８４）　１．　Ｃｅ１１ ．　Ｂｉｏｌ、、マｏｆ。

９８１２０９＋−２１１１６］。

創傷の閉鎖の他に、創傷治癒のこの段階では上皮形成も起こる。上皮細胞が創傷 の端で増殖し、職質物質を超えて移動する。上皮細胞は生きた血管組織の上のみ を移動できる。上皮細胞間の接触阻害により移動が停止され、この時点で、上皮 細胞は分裂し、分化して表皮を再構築する［Ｌｎｔ他、（１９７９）Ｆａａｄｔ ｍｅｎｔｔｌ＋　ｏｒ　ｔｏｕｎｄ　１ｎｓ（＋ｍｅｎ１．　Ａｐｐｌｅ＋ｏｎ −ＣｅｎｔｕＢ−Ｃｔｏｔ口］。

肉芽組織形成が進むと、創傷の中が低酸素状態になる結果、内皮細胞の分裂と移 動による新しい血管の形成である脈管形成も起こる。Ｋｎｉｇｔｈｏ口ら　［（ １９８３）　Ｓ＜１ｒａｔｅ、マｏｆ、２２１：　１２８３−８５１は、低酸素 条件下でマクロファージが脈管形成を刺激することを示している。その結果、血 管新生が増加して、創傷の中の血流及び酸素供給を増加させる。最終的に、創傷 の治癒過程がマトリックス形成及び再構築相に進むと、この新しく形成された脈 管構造の多くが退化し、比較的無血管の条痕が残る。

コラーゲン及びマトリックスの再構成は、肉芽組織形成が始まると始まり、創傷 が新しい上皮で覆われた後も長く続き、１年以上継続することがある。この創傷 の治癒の最終段階の特徴は脈管遮断及び主としてＩ型コラーゲンからなるマトリ ックスによる肉芽組織及び細胞の置換である。この比較的無細胞で無血管の組織 が条痕となる。最痕形成は主として創傷の付いた組織に引っ張り強さを回復する 働きがある。しかし、最痕は、組織が損傷を受ける前に有していた引っ張り強さ の約８０％以上の引っ張り強さは持つことはない。

多くの要素が創傷治癒過程に悪影響を及ぼすことがある。これらの要素には、壊 死した破片、外来物質、感染、医薬品、及び損傷を受けたヒトの年齢、健康及び 栄養状態が含まれる。さらに、末梢血液循環を妨げる過程、例えば動脈硬化、長 期の圧力、静脈瘤疾患及び静脈うつ血が、損傷を受けた患者での酸素、栄養素、 化学磐号の分配及び治癒を媒介するのに適切な型の細胞に悪影響を与えることが あり、創傷の治癒を損なうことがある。

壊死破片及び外来物質は一般的に、治癒過程の初期に、先ず創傷を洗って目で見 える汚染物質を除去し、次に内因性ＰＭＮ及びマクロファージにより残った顕微 鏡レベルの破片を除去することにより、取り除く。細胞の壊死切除を阻止する要 素は創傷の治癒を遅らせる。このような要素には、創傷の乾燥、医薬品例えば化 学療法またはステロイド、及び患者の健康及び／または栄養状態の悪さが含まれ る。

患者の物理的条件も創傷の治癒に重要である。年齢が増すにつれ、皮膚は薄くな り、線維芽細胞の数及び全皮膚コラーゲン量が減少するために、損傷した皮膚の 修復能が衰える［：５ｃｈａｓｔｅ＋他、（１９７５］、Ｂ＋、１．　Ｄｅｒｍ ＊ｔｏ１．、マｏｆ、９３：　６２９−４３１゜疾患状態例えばアルコール中毒 、貧血、糖尿病、栄養不良、シ這ツク及び尿毒症は酸素及び栄養の創傷の部位へ の分配を損ない、それにより治癒過程を阻害する。また、単球減少症を招く疾患 は創傷の治癒を顕著に妨げる。

疾患を治療するために使用する医薬品も創傷の治癒を妨げることがある。癌患者 から分裂細胞を除去するために使用する化学療法も、このような患者の新しい細 胞の成長に依存する創傷の治癒能を抑制する。ステロイドは３つの傷修復相の全 てにマイナスの影響を与える。すなわち、最初の炎症反応を阻害し、析しい上皮 及び血管組織の生成を遅延させ、鍛痕組織のコラーゲンマトリックスを弱める［ ＢｒＨｎｌ、Ｒ，ｆ１９８７）　ＩＥｕ＋＋ｏ＋ｔｏＩｎ＋ｌ　Ｔｈｅ＋ｘｐ） 、ｔｏｌ、１４．　Ｎｏ、６：　２６２−６６　］。

創傷の細菌感染が創傷の治癒を長引かせる最も一般的な局所的原因である。ヒト の皮膚には一般に、Ｃｘｎｄｉｄｘ　ａｌｂｉｃｘｎ＋。

５Ｎｐｈ７１ｏｃｏｃｃｕ＋　＋ｐｉｄｅ＋ｍ１ｄｉｔ、１Ｄｐｂ４１ｏ＋ｏｃ ｃａ＋　ｘ＋ｕ＋ｕ＋　、及びＳｌ＋＋ｐｌｏｃｏｃｃｏｔ株の一部を含む多数 の微生物がコロニーを形成している。従って、その下にある組織が環境に露出さ れる創傷はすべて少なくとも１つの常在微生物相に感染する。よく手入れされた 、非常に血管化した組織の創傷は感染に耐性であり、一方、１血組織の創傷はは るかに感染し易い。

血流及び酸素供給は、白血球が媒介して細菌１１ＩＩ胞を殺すための必要要件で ある。細菌を食べた白血球で酸素消賛量が１０−２０倍増加する。大気の０２を 使用して酸化的代謝を行い、スーパーオキシドイオン及び過酸化水素（Ｈ２０２ ）を産生じ、これを使用して内部の細菌を殺す［Ｈｕｎｔ、　Ｔ、　、（１９８ ８）＾ｎｎａｌ＋ｏｆ　ＥＩＢ＋＋Ｂｎ＋７　Ｍ＋ｄｉ＋１ｆｉ３　ｖｏｌ、１ ７：　１２６５−７３　］　ｏ次善の酸素還流を有する損傷は汚染微生物を処理 できる可能性が低く、従って感染を起こす危険性が高くなる。

細菌感染、医薬品及び患者の物理的条件以外の要素により創傷が治癒しないこと もある。ある種の部分厚及び全厚損傷、例えば火傷、皮膚移植、及び種々の型の 潰瘍は修復され難（、損傷を受けたヒトに顕著な痛みや不快感を与える。

Ｂ、コロニー刺激因子 人の造血（血液形成）系は、白血球細胞（好中球、マクロファージ、及び好塩基 球／マスト細胞）、赤血球細胞及び血餅形成細胞（巨核細胞／血小板）を置換す る。平均的なヒトの男性の造血系では、毎年４．５Ｘ１０”個の顆粒球及び赤血 球を産生ずると算定されており、これは年間での全体重の置換に相当する　ｒＤ ｅｘｔｅ＋他　（１９Ｈ］　ＢｉｏＥ＋＋ｓ７＋、ｒｏｔ、２：　１５４−５８ コ。

Ｃ３Ｆは造血を調整し、骨髄で見られる正常の造血前駆細胞のクローン成長及び 成熟に必要なホルモン様の糖蛋白質である。

これらの因子は多数の組織で産生される。ヒトから単離した４つのＣ３Ｆが同定 されている二顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳ　Ｆ　）　［Ｗｅｌｔｅ＋他、 （１９８５１ＰＩＯＣ，Ｎ！Ｉ１．Ａｃｚｄ、Ｓｃｉ　ＵＳＡ。

ｗｏｌ、８２：　１５２６−３０コ　：顆粒球−マクロファージコロニー刺激因 子（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）　ＪＣａｎｌ＋＋ｌｌ　他、（ｉ９８５）　ＰＩＯＣ，！Ｉ ａ＋ｉ−〇＋ｄ、Ｓｋｉ、ＵＳＡ、マ０１．　８２：　６２５０−５４コ　、マ クロファージコロニー刺激因子（Ｍ−Ｃ３Ｆ）ｌ及びマルチ−コロニー刺激因子 （マルチ−Ｃ３Ｆ、インターロイキン３とも呼ばれる）Ｊｉ＜ｂｌｒ　＠、　ｆ ｌＨ４）　Ｐ！Ｏ（〜＋！！、　Ａｃ＋ｄ、　ＳＣｉ、　ＵＳＡ、　ｖｏｌ、　 ８１　：３７６に−５９］。これらは各々特定の未成熟前駆細胞を成熟細胞に分 化させる働きがある。さらに、これらの因子は成熟した型の細胞の維持にも必要 である。ｉａ　ｖｉＨｏで、培養物から適切なＣ３Ｆを除くと、そのＣ３Ｆに応 じて、最終的に分化した造血細胞を迅速に変性させることになる。

Ｇ−Ｃ３Ｆは、１０マｉｔ＋ｏでコロニー形成単位−顆粒球細胞／マクロファー ジ（ＣＦＵ−ＧＭ）アッセイに使用すると、主として好中球顆粒球コロニーの産 生を刺激する。他のＧ−Ｃ３Ｆ活性についても述べられている。現在、（、−Ｃ ３Ｆは、化学療法剤として及び他の化学療法の毒性を低下しつる化合物として癌 治寮への使用が研究されている。

その他の治療用に重要なコロニー刺激因子はＧＭ−Ｃ３Ｆである。このポリペプ チドはマクロファージ及び顆粒球の前駆細胞を１０マ１１「Ｏで増殖させるため に連続的に必要とされる。ＧＭ−Ｃ３Ｆはこれらの前駆細胞が顆粒球及びマクロ ファージの形成に非可逆的に関わることを調整する。他の生物活性には、成熟型 細胞の機能性活性の調整二Ｇｏａｇｈ他、！１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ 。

３０９：　７３７−６７　］及び認識した化学誘引物質への走化性の増加がある ［ｔｌ＋ｌｌｌｉｔｏｌｏｇ！、　第４版、１９９Ｇ、　Ｗｉｌｌｉａｎ＋他纏 コ。ＧＭ−Ｃ３ＦはＧ−Ｃ３Ｆと同じ前駆細胞配列に作用するが、単球の産生も 刺激するため卓球の障害例えば単球減少度の治療に有用である。

組換えＧ−Ｃ３Ｆ　（ｒＧ−Ｃ９Ｆ）の製造手順については、米国特許第４．８ １０．６４３号明細書を参照のこと。この明細書は参考として本明細書に含むも のとする。組換えヒトＧＭ−Ｃ３Ｆの製造法はＢａｔｇｅＩ＋他が述べているＣ 　（１９ｇ？）　Ｂｆｏｏｄ。

ｖｏｌ、　５９．　Ｎｏ、　ｌ：　４３−５１　コ　。

治療すべき疾患状態が全身性であることまたは露出されない内部組織もしくは器 官の一部に影響を与えることから、現在、これらの組換え蛋白質の治療用の使用 には非経口経路による投与が含まれている。ＧＭ−ＣＳ　Ｆを末梢静脈から患者 に投与すると静脈炎を起こす。従って、好ましい分配機構は中心静脈カテーテル である。このサイトキンを毎日皮下注射すると静脈投与と同じ位有効に所望の反 応が得られらることが判った）ＨｅｍＪｌｏＩｏｇ７　第４版、上記］。任意の 経路で投与した３２μｇ／体賃ｋｇ／ヨ以上の用量のＧＭ−Ｃ５Ｆは、炎度反応 及び肺毒性があるため、耐容性が良好ではない。より少量を使用するとＧＭ−Ｃ ３Ｆは一般に耐容性が良好であるが、緩和な副作用には背痛、筋痛症、悪寒、吐 き気、顔面紅潮及び発熱が含まれる。　一方、Ｇ−Ｃ３Ｆでは、用量限定性副作 用の骨癌以外には感知できる副作用はないが顕著な好中球減少が生じる。

この骨癌は骨髄の顆粒球細胞が拡張するために生じると考えられている。この副 作用を引き起こすことなく注射または静脈カテーテルで投与できる最大用量は６ ０μｇ／体重ｋｇ／日までである。

治療薬として使用し、非経口経路で投与するためには、Ｇ−Ｃ３Ｆ及びＧＭ−Ｃ ３Ｆのような組換え蛋白質を一般に、患者に投与する前に、許容される医薬品製 剤に処方する。このような処方には一般に、生理的ｐＨに調整した等張バッファ 水溶液に生物学的に活性な物質が懸濁した懸濁液を含む。本明細書で述べたポリ ペプチドをこのように非経口的に投与すると、創傷の治癒に関与する型の細胞を 刺激し、増殖させることができ、従ってこのような状況での適当な治療を構成で きる。

Ｃ１現在の創傷治癒の促進法 感染症または他の合併症のない、正常の創傷の治癒過程では完全に組織機能が回 復されることが多い。従来から、医師が創傷の治癒を促進するためにできること には限度があった。過去には、このような活動は最初の創傷の洗浄と創縁切除、 適当な場合には創傷の縫合または皮膚の移植、乾燥や感染を防ぐための創傷の手 当て、感染の危険性を減らすための局所的または全身的な抗生物質投与に限られ ていた。このような処置は自然の治癒過程に最適条件を提供するように考えられ たものである。

動物モデルで、急性及び慢性の両方の創傷で、多くの組換え成長因子が創傷の治 癒過程を促進できることが判っている。

これらの組換えにより得た因子には血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ）　、繊維 芽細胞成長因子（ＦＧＦ）　、表皮成長因子（ＥＧＦ）　、及びトランスフォー ミング成長因子α及びβ（ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β）が含まれる。また、イン シュリン、インシュリン様成長因子■及びＩ　Ｉ　（ＩＧＦ−Ｉ及びＴＧＦ−Ｔ 　Ｉ）　、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターロイキン（Ｉ　Ｌ）　、ＫＧ Ｆ　（ケラチン細胞成長因子）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−Ｃ３Ｆ ）、血小板由来の内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）及び幹細胞因子（Ｓ　Ｃ Ｆ）を含む他の組換え成長因子が創傷治癒過程に関与する型の細胞の活性化、増 殖及び／または刺激を促進できる。

ＥＧＦはポリペプチドの成長因子（成熟した、処理型は５３アミノ酸長である） である［Ｇｒ！！他、［１９８３）　Ｎ１Ｉｎ＋＋、　ｖｏ１３０３：　７２２ −２５１゜ヒトでは、この蛋白質は胃酸の分泌を阻害するが、不ズミのＥＧＦは 内皮、上皮及び線維芽細胞を含む多数の型の細胞にとってマイトジェンであるこ とが知られている［！ＬＩｋ１ｇＩＷ！他、（１９８５）　Ｄｉｌｌ＋＋ｅｎｔ ｉｚ＋ｉｏｎ、マｏｆ、２９：　２８４−８８　］。

ＦＧＦは、強力な抗凝固剤ヘパリンにしっかりと結合した１４−１８ｋＤの大き さの単鎖蛋白質の族である。２つの型のＦＧＦ、すなわち酸性及び塩基性のＦＧ Ｆが報告されている。１４６アミノ酸の塩基性型（ｂＦＧＦ）は酸性のＦＧＦ（ ａＦＧＦ）に比べ、より安定であり、中胚葉細胞、例えば線維芽佃胞、内皮細胞 、ケラ千ノサイトを１０倍強く刺激する。

Ｅｔｃｈ他、　（１９８５）　Ｐ＋ｏｃ、　！（ｉｔ、　Ａ＋ｚｄ、　Ｓｅｉ、 　σＳＡ、　ｖｏｌ、　８５−６５０７−１１をＩＩ唄のこと。

インシュリンは膵臓の島の細胞が分泌する蛋白質ホルモンである。インシュリン は、グルコース、アミノ酸、脂肪酸及びケトン体の血中濃度が高くなると分泌さ れ、細胞膜を通過する代謝物質及びイオンの輸送を変化させ、種々の細胞内生合 成経路を調整することにより、それらの効率的な貯蔵と細胞燃料としての使用を 促進する。インシュリンはグルコース、脂肪酸及びアミノ酸の細胞内への侵入を 促進する。さらに、インシュリンはグリコーゲン、蛋白質及び脂肪の合成を促進 し、グルコース分解、グルカゴンの分解、蛋白質の異化、及び脂肪分解を阻害す る。インシュリンは２つのジスルフィド結合で結合したα及びβサブユニットか らなる。

Ｉ　ＧＦ−１及びＩＧＦ−ＩＩは成長ホルモンの作用を仲介する成長ホルモン依 存性の族の一員である。これらの蛋白質は骨格成長の調整に重要であることが知 られている。両方の分子ともインシュリンと構造が非常に近く、同様な生物活性 を有している。ＩＧＦ−１はプロインシュリンとアミノ酸配列が４３％相同であ り、ＩＧＦ−ＩＩはｒＧＦ−１と６０％相同である。

ＩＧＦは本明細書に記載の他の蛋白質と比べ、哺乳類の血漿中に検出可能な遊離 ＩＧＦｇが本質的に全く存在しない点で、幾分独特である。その代わりに、ｒＧ Ｆはより高分子の特異的な担体血漿蛋白質に結合している［Ｏｏｉ他、（１９８ ８］　１．　Ｅｎｄｏｃｔ、。

マｏｆ、１１８：　７−＋８コ。両方の種類のｒＧＦはＤＮＡ、ＲＮＡ及び蛋白 質合成を促進し、一部の型の細胞の増殖、分化及び走化性に関与する。Ｉ　ＧＦ −１を局所投与すると、末梢神経の再生を刺激することが知られている。さらに 、ＩＧＦ−１とＰＤＧＦとをブタの創傷に局所投与すると相乗作用を示し、どち らかの因子を単独で投与したときと比べより効果的に治癒を促進する［５ｋｏｔ ｆｏｅｔ他、（１９８８）　ＡＣｔ！　Ｐｚｅｄｉｉｌ＋、５ｅａｎｄ。

（Ｓｏｐｐｌ）、　ｖｏｌ、　３４７：　１１０−１２コ　。

インターフェロンは始め、広範囲のウィルス感染に対する耐性を細胞に付与する 蛋白質として同定された。３つの型のインターフェロン、α−ｒＦＮ、β−ＴＦ Ｎ及びγ−ＩＦＮが同定されており、これらは活性化されたＴ及びＮＫ（天然の キラー）細胞が産生ずる。α−ＩＦＮは非常に関連性のある１５個位の蛋白質群 からなり、β−ＩＦＮ及びγ−ＩＦＮは単独の種類として存在する。さらに、全 ての公知のα−ｒＦＮサブタイプに共通な領域を取り込むように設計した合成の 調和したα−ＩＦＮが米国特許策４．８９７．４７１号明細嘗に記載されており 、これは７考として本明細書に含むものとする。全てのＴＦＮはリンフ才力イン カスケードで重要な役割を果たす成長阻害分子である。その各々は正常細胞、癌 細胞、及び宿主免疫防御細胞で広範囲な調整作用を行フている。γ−ＩＦＮ活性 には、食作用及び腫瘍を殺す能力を高めるマクロファージの活性化を含んでいる 。現在のところ、これらの蛋白質は癌の治療に主として使用されている）ｌｌｇ ｌｋｈｉｌｌ、ｆｌＨ７）　Ｌｚａｃｅ（、：　３１７−１８コ　。

インターロイキン（ＩＬ）は体の免疫反応に重要な働きを持つポリペプチド族で ある。インターロイキンは、抗原性またはマイトジニン刺激に反応して、多数の 型の細胞、特にＴ細胞で産生される。ｒ　Ｌ−４は外来抗原を認識した後に産生 される。

免疫応答を伝える他、ｒＬ−１は急性感染症の炎症反応に関与する。ＩＬ−１は Ｂ細胞及びＴ細胞を活性化し、Ｉ　Ｌ−２合成を誘導する。ｒＬ−４はＢ細胞の 増殖と分化のコファクターとして働く。ＩＬ−４はＴ細胞及びＮＫ細胞の毒性を 高める。

ＩＬ−１は種々のコロニー刺激因子（ＣＳ　Ｆ）に対する骨髄前駆細胞の反応を 高める。炎症では、ｒＬ−１は骨髄顆粒球を放出し、多単核細胞化学誘引剤とし て働き、線維芽細胞の増殖を促進し、コラーゲンの放出に寄与する［Ｇｅｎｅｔ ｉｅ＊ｌ１７Ｅｎｇｉｎ＋＋ｌｃｄ　ｌｌｕｍｉｎ　Ｔｂ＋＋ａｐｅｕ＋ｉ、　 Ｄｏｕｇｈ、Ｃｏｐ＋ｓｒ及びＤ＋１ａｘｔ＋ｓ。

５ｔｏＣＨｏ口Ｐｌ！ＩＬ１９８８コ。

ＩＬ−２のＴ細胞合成はＩＬ−１が誘導する。ＩＬ−２はＢＨ抱及びＴｓ抱成長 因子である。Ｉ　Ｌ−２はＮＫＮ抱成長及び活性化信号でもあり、これらを刺激 して非常に細胞毒性の強いリンフ才力イン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞になる。

ＩＬ−２はまたマクロファージ活性を翼整し、細胞毒性を高めるＪＧ＋ｏ＋ｌ＋ Ｃｘ１ｌｙＥＢｉｎ＋＋＋＋ａ　Ｈｕｍｚｎ　Ｔｈ＋＋＋ｐ＋１ｔｉｃ　Ｄ＋ｕ ｇ５上記コ。

マルチ−Ｃ３Ｆとも呼ばれるＩＬ−３はＴリンパ球により誘導された抗原または マイトジエンにより合成され、造血前駆細胞の成長及び分化に関与している［０ ’Ｇｘ＋＋ｓ、（１９９０１Ｌ！ＩＩｃＩＬ。

ｙｏｌ、ｌ：　１００３−１００５コ。ｉｎ　ｙｉ！ｔｏでは、Ｉ　Ｌ−４は粘 膜及び結合組織の成長に必須である。Ｔ　Ｌ−４はマクロファージの殺腫瘍活性 及び抗原提示能も高める。Ｉ　Ｌ−４は多くの非最終的に分化した造血細胞配列 に対してＣ３Ｆと相乗的に相互作用する。

さらに、ＩＬ−４は休止Ｂ細胞を活性化する［０’Ｇｚ＋＋ｘ　、上記；Ｔｈｅ ＾ｌｌｔ＋　ｏｉ　Ｓｅｉ＋１Ｉｃｅ、Ｋｉ＋ｂｉｍｏｔｏ、Ｉｓｌ、１９８ｇ ］　ｏ　Ｉ　Ｌ−４は単球免疫機能を下方調整し、単球及びマクロファージの活 性を阻害し、刺激された単球内でのｒ　Ｌ−８の産生を抑制する口Ｓ＋ｚｎｄｉ ｔｏ＋ｄ他、（１９９０）　１．　１ｍｍａｎｏ１．、ｗｏｌ、１４５．　Ｎｏ 、５：　１４３５−３９　］　。

抗原的に刺激した後、ＩＬ−５はＢ細胞の成長及び免疫グロブリン分泌細胞への 分化を誘導する：Ｏ”ＧＪｔｘ　、上ｆｆＥ］。ＪＬ−５は好酸球の増殖、分化 及び活性化も刺激する（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｌ１７Ｅｏｇｉｎ＋ｅｒｅｄ　Ｈａｍ ａｎ　Ｔｂｅ＋ｘｐｅｕｌｉｃ　Ｄｏｕｇｈ　ｓ上２１．７細胞の他に線維芽細 胞、内皮細胞及び単球が産生ずるＩＬ−６は活性化したＢ細胞の最終分化を誘導 して抗体産生細胞とする。さらに、Ｉ　Ｌ−６は造血前駆細胞を活性化して、Ｉ Ｌ−３に応答する口Ｇｅｎｅｔｉｃｉｌ１７　Ｅｎ（ｉｎｅｅ＋ｅｄ　［Ｈｕｍ ｚｎ　Ｔｂｓ＋ｉｐ＋ａｌｉｃ　Ｄｏｕｇｈ、上記コ　。

Ｉ　Ｌ−７はｉｎマｉｌ＋ｏでＢ細胞及び胸腺細胞の増殖を誘導する［０′Ｇ！ ｒｒ！、上記］。ＩＬ−８は免疫及び非免疫型の両方の細胞で発現される。刺激 された単球のＴＬ−８の発現は■・Ｌ−４で抑制されが、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ ）またはＩＬ−１で予め活性化した線維芽細胞及び内皮細胞での発現はＩＬ−４ で抑制されない。ｉｎ　ｙｉｙｏで、好中球の移動を仲介する因子が知られてい ないが、強力な好中球活性化及び走化性活性を有するｆＬ−８はｉｎ　ｆｉｖｏ の好中球蓄積を仲介しうるＣ５１ｉｎｄｉ！ｏ＋ｄ他。

（１９９０１ｆｌｉｏｃｈｅｇ、５ｌＩｄ　Ｂ：ｏｇｈＨ，Ｒｅｔ、Ｃｏｍｅ、 ｙｏｌ、１７１．　Ｎｏ、２５３１−３６　］　。

ｒ　Ｌ−９はある種のＴｗｉ胞セルラインで、マイトジェン刺激した末梢血リン パ球により発現される［ＴｘＢ他、（１９ｇ９１　Ｂｆｏｏｄ。

Ｔｅ１．　７４．　Ｎｏ、６：　１８８０−８４］　。Ｔ　Ｌ　−９はマスト細 胞の増殖を高め、また、骨髄由来のマスト細胞でのｒＬ−６の産生も刺激する［ Ｈｎｌｌ＋＋他、　（１９９０）　Ｅｘｐ、　ｆｌｅｓｚｔｏｌ、　ｙｏｌ、　 １８：　８７３−７７］　ｏ最近マウスで発見された、マウスサイトカイン合成 阻害因子（ＣＳ　Ｉ　Ｆ）とも呼ばれる［Ｌ−１０は、刺激された非ホルモンＴ 細胞でのサイトカイン産生を阻害する［Ｌｏ＋ｅ他、（１９９０ＧＳｃｉｅｎｃ ｅ、　ｔｏｌ、２４ｇ：　１２３０−３４１゜ＫＧＦは正常な基質線維芽細胞が 分泌する上皮細胞特異性マイトジェンである。ｉｎ　ｖｉｓａで、ＫＧＦはヒト のケラ千ノサイトの増殖刺激においてＥＦＧと同様に強力であることが示されて いる口１１ｔ＋ｃｂｅ＋ｅ他、（１９９０１］、Ｃｅ１ｌ　Ｐｂｒ＋ｉｏｌ、、 ｗｏｌ、１４４゜Ｎｏ、　２：　３２６−３２］。

Ｃ３Ｆ−１としても知られているＭ−Ｃ３Ｆはマクロファージ前駆細胞にのみ作 用するホモノメリブクコロニー刺激因子である。このマクロファージ配列に特異 的な蛋白質は本質的に、ｉｎｖ白ＴＯで、繊維芽細胞及び基質セルラインで産生 される。

ｉｎ　ｔｉｗｏでは、Ｍ−Ｃ３Ｈは他のＣ３Ｆとは異なり、胚発生の初期に出現 し、このポリペプチドが発生に強力な役割を担っていることを示唆している［Ｄ ｅＬ１＋＋ｘ＋１＋＋、１．、（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ＊ｌ　Ｐｂ！＋ ｍｘｃｏｌｏｇ７．ｔｏｌ、　３７．　Ｎｏ、１６：　３０５７−６２１゜ＰＤ −ＥＣＧＦは血小板由来の内皮細胞マイトジェンで、分子量は約４５ｋＤである 。内皮細胞マイトジェンのＦＧＦ族とは対照的に、ＰＤ−ＥＣＧＦはヘパリンと 結合せず、繊維芽細胞の増殖を誘導することもない。しかし、ＰＤ−ＥＣＧＦは 、ｉｎ！ｉｔ＋ａでは内皮細胞の成長及び走化性を刺激し、ｉｎマ１マＯでは血 管形成を刺激する［Ｉｔｈｉｋ＊ｖｔ他、（１９８９）　１ｌｉｔａｒｅ、ｗｏ ｌ。

３３８：　５５７−６１　］。

ＰＤＧＦは繊維芽細胞及び平滑菌細胞のような中胚葉型の細胞を強力に刺激する が、上皮または内皮細胞の成長は刺激しない［Ｒｏ＋＋他、［１９８６）　Ｃｅ １１．　ｒｏｌ、　４５：　１５５−６９］　、　Ｐ　Ｄ　Ｅ　Ｆは低濃度で繊 維芽細胞の化学誘引剤として、また単球及び好中球の化学誘引剤及び活性化信号 として作用する［Ｄ＋ａ＋ｌ他、（１９８２）１、　Ｃ１ｉ、　Ｉｎｖｅｕ、、 　ｔｏｌ、　６９：　ＩＱ４６−４９コ　。

組換えＳＣＦは初期の造血性前駆細胞、神経幹細胞及び胚芽幹細胞の成長を刺激 する新規の細胞成長因子である［　ＰＣＴ／ＵＳ９Ｇ１０５５４８．１９９０年 ９月２８日出願コ。ＳＣＦはコロニー刺激因子と強力な相乗活性を示し、コロニ ー数を増加させ、コロニーを大きくする　口ＭｚＮｉｎ他、（１９９０）　Ｃｅ １ｌ、ｙｏｌ、６３：　２０３−ｉｌｌ　。

従って、ＳＣＦを、単独でまたは他のコロニー刺激因子または他の造血成長因子 と合わせて、薬理的な用量で哺乳類に投与すると、多様な器官系で損傷した細胞 を改善することができる。

ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βは相乗作用しである種の癌のセルラインで固定原に無 関係な成長を誘導する。ＴＧＦ−βはジスルフィド結合したホモジメリック蛋白 質からなり、この各蛋白質層は１１２個のアミノ酸からなる［Ｓｐｏ＋ｎ他、（ １９８７＋　ｌＣｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　ｒａｔ、１０５：　１０３９−４５ １　。この二量体蛋白質は、多くの生物学的作用、使用したアッセイに応じて、 例えばマイトジェンス、成長阻害、及び分化誘導を行う。ＴＧＦ−β１は創傷の 治癒と関係して最も研究されているＴＧＦ−βである口Ｔｅｎ　Ｄｉｉｋ＋　、 上記コ。種類としては、ＴＧＦ−βは強力は単球及び繊維芽細胞の化学誘引剤で ある。

これら上記の組換え成長因子は、創傷治癒過程に非常に関与する型の細胞、すな わち単球／マクロファージ、好中球、繊維芽細胞並びに内皮及び上皮細胞のマイ トジェン、阻害剤または化学誘引剤として作用しうるため、創傷治癒の動物モデ ルでよく研究されている。創傷治癒と関連して最も研究されて（する成長因子で あるＥＧＦは、創傷の部位に繰り返し付けると、表面の創傷や火傷の治癒を促進 することが知られて０る。ＰＤＥＦ及びＴＧＦ−βは創傷が生じた直後に切傷の 部位に１回投与することにより切傷の治癒速度を高める。しかし、他の因子例え ば造血性コロニー刺激因子の使用について述べた研究は文献（こ見あたらない。

従って、本発明の目的は、創傷治癒過程を促進する方法を提供することである。

通常治癒する創傷に関して述べられて−）る方法は本発明方法を促進しよう。一 般に直り難０創傷（こ関しても、本発明方法は同じようにこれらの創傷の治癒を 可能にする。

本発明方法は損傷修復に必要な時間を短縮し、そのため、損傷に苦しむ患者が創 傷の治癒に耐えなければならな−）時間を短縮する。

発明の概要 本発明は、治療上有効量の組換えＧ−Ｃ３Ｆまた！よ組換えＧＭ−Ｃ３Ｆを患者 の創傷の部分に投与することにより、損傷を受けた患者の迅速な創傷の治癒を促 進する方法を提供する。

これは、治療薬を、コラーゲンをベースとするクリーム、フィルム、マイクロカ プセルまたは粉末；ヒアルロン駿または他のグリコースアミノグリカン由来の製 剤：クリーム、フオーム、縫合材料、及び創傷の包帯を含む種々の物質に入れる ことにより実現できる。あるいは、治療薬を局所投与用に考えられた医薬品とし て許容される溶液に含むこともできる。また、治療薬を非経口投与用に処方する こともできる。

本発明方法は、切傷、圧迫傷、熱傷、急性損傷、慢性損傷、感染性損傷及び無菌 損傷の創傷治癒の促進に有効である。

また、組換えＧ−Ｃ３Ｆは少なくとも１つの次の蛋白質を含む混合物に入れるこ ともできる：　ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、ｒＧＦ−ｒ、ＩＧＦ−［Ｔ、イ ンシュリン、インターフェロン、インターロイキン、ＫＧＦ、Ｍ−Ｃ３Ｆ、ＰＤ −ＥＣＧＦ、ＰＤＧＦＳＳＣＦｌＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β。同様に、ＧＭ−Ｃ ５Ｆは少なくとも１つの次の組換え蛋白質を含む混合物に入れることもできる： 　ＥＧＦｌＦＧＦＳＧ−Ｃ５Ｆ。

ＩＧＦ−１，ＩＧＦ−１１，インシュリン、インターフェロン、インターロイキ ン、ＫＧＦＸＭ−Ｃ３Ｆ、ＦＤ−ＥＣＧＦｌＰＤＧＦ、ＳＣＦ、ＴＧＦ−α及び ＴＧＦ−β。これらの混合物も損傷を受けた患者での迅速な創傷治癒を促進する のに有効である。

図面の簡単な説明 第１図は、組換えＧＭ−Ｃ３Ｆ２０μｇで治療した切傷の破壊強さくｂ＋＋ｔｋ ｉａｇ　＋ｔ＋ｅｎｇｔｈ　）と自然治癒に任せた同様の創傷の破壊強さを示し ている。

第２図は、ＧＭ−Ｃ３Ｆ３０μｇで局所治療した切傷の受傷後７日及び１４日目 の破壊強さを示している。

第３図は、未治療及び組換えＧＭ−ＣＳ　Ｆ治療した、慢性的に肉芽化している 感染した創傷での創傷の閉鎖速度を示している。

本発明の多くの面及び利点は、好適実施態様での本発明の詳細な説明している以 下の詳細説明から、当業者には明かであろう。

発明の詳細な説明 典型的な創傷は局在しているため、創傷の修復に必要とされる型の細胞は損傷領 域内及びその周囲に集まっていなければならない。従って、これらの型の細胞の 創傷治癒活性を促進するために必要な因子は創傷を負った部分に存在するのが好 ましい。

ポリペプチドの局所への分配がこれらの目的を達成する最も有効な方法である。

本発明は、組換えＧＭＣ３Ｆを、局所的にすなわち創傷の部分の表面に投与する と、全ての型の創傷の創傷治癒過程を促進できるという発見に基づいている。組 換えＧ−Ｃ３Ｆの投与は、特に感染した創傷に局所投与したときに、創傷の治癒 過程を促進するのに有効である。ＧＭ−Ｃ３ＦまたはＧ−Ｃ９Ｆを上記ように分 配すると、全ての型の創傷、機械的または熱による、急性または慢性、感染性ま たは無菌性の創傷は、自然治癒に任せたまたは現在入手可能な方法で治療した同 様の創傷に比べてより迅速に治癒する。しかし、前記のように、創傷治癒過程に 作用するポリペプチドの非経口投与も本発明に含まれる。

創傷治癒過程には、損傷を受けた後の、その下にある結合組織の形成及び上皮再 形成が必要である。全厚の、外科的に生じたラットの切傷モデルを使用して組換 えＧＭ−Ｃ３Ｆの創傷治癒過程促進能を示した。この切傷ラットモデルはヒトの 全厚切傷と同様のものである。

また、全厚の慢性的に肉芽化した感染したラットの創傷のモデルを使用して、典 型的な慢性の治り難いヒトの創傷をシミュレートした。ラットモデルでは、顕著 な細菌汚染により、おそらく治癒過程の炎症槽が長引くため、自然の創傷治癒が 阻害される。ＧＭ−Ｃ３Ｆを毎日投与すると、顕著な細菌感染は持続したままで あるにもかかわらず、この細菌による創傷治癒の阻害が克服できた。この慢性的 肉芽化感染性創傷モデルを使用すると、ＧＭ−Ｃ９Ｆは一般的に修復に耐性の創 傷の創傷治癒を促進できることが示された。

本発明によると、「損傷」とは患者の皮膚表面からその下の組織に広がる創傷と 定義され、実際、損傷が患者を貫通して、入口の創傷と出口の創傷が残っている 場合もある。「患者」とは、上記のような損傷を受けた哺乳類である。「治療薬 」とは、迅速な創傷の治癒のような治療上望ましい結果が得られる化合物を意味 する。本発明では、治療薬はＧ−Ｃ３Ｆ及びＧＭ−Ｃ３Ｆである。また、「治療 薬」という用語は、Ｇ−Ｃ３Ｆと１つ以上の次の組換え蛋白質：　ＥＧＦ、ＦＧ Ｆ、ＧＭ−Ｃ９Ｆ。

ＩＧＦ−Ｉ％　ＩＧＦ−１１、インシュリン、インターフェロン、インターロイ キン、ＫＧＦ、Ｍ−Ｃ３Ｆ、ＰＤ−ＥＣＧＦ。

ＰＤＧＦ、ＳＣＦ、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βとの組合せ、またはＧＭ−Ｃ３Ｆ と少なくとも１つの次の化合物：ＥＧＦ。

ＦＧＦ、Ｇ　Ｃ３Ｆ、ｒＧＦ　Ｉ、ＩＧＦ−ｒ　ｒ、　インシｓ’）ン、インタ ーフェロン、インターロイキン、ＫＧＦ、Ｍ−Ｃ３Ｆ、ＰＤ−ＥＣＧＦ、ＰＤＧ ＦｌＳＣＦＳＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βとの組合せも意味している。ここで、「 迅速な創傷の治癒」とは、本発明の治療剤の投与の結果、治療剤を投与されてい ない創傷に比べてより迅速に起こる創傷治癒過程と定義される。

「局所投与」とは、創傷の表面及び隣接する上皮に治療薬を分配することと定義 する。「非経口投与」とは、患者に注射することによる治療薬の全身的な分配で ある。本発明の意味での治療薬の「治療上有効量」は、患者の主治医または獣医 が決定しよう。このような量は当業者は容易に知ることができ、本発明に従って 投与したときに迅速な創傷の治癒を可能にする。治療上有効量に影響を与える因 子には、使用する治療薬の比活性、創傷の型（機械的または熱による、全厚また は部分厚、等）、創傷の大きさ、（全厚の場合には）創傷の深さ、感染の有無、 損傷を受けてからの時間、並びに患者の年齢、物理的条件、他の疾轡状態の存在 、及び栄養状態が含まれる。また、患者が服用している他の医薬品も投与する治 療薬の治療上有効量に作用する。「医薬品として許容される」とは、処方に含ま れる治療薬以外の成分が本発明に従って治療する患者への投与に遺したものであ ることを意味する。

本発明によると、「創傷の包帯」は創傷を覆い、保護するために使用する種々の 物質全てを表す。その例には、閉鎖用包帯、粘着包帯、抗菌包帯及び保護用包帯 がある。医薬品組成物では、「クリーム」が局所使用に適した水中油型または油 中水型の半固体エマルシヨンである。本発明によると、クリーム及びフオームの 使用も本明細書に記載の治療薬と共に使用するのに適している。

組換えＧＭ−Ｃ３ＦまたはＧ−Ｃ３Ｆは、本明細書が教示するように治療上有効 量投与すると、全ての型の創傷で創傷治癒過程を顕著に促進する。ＧＭ−Ｃ３Ｆ がこの過程の加速を促進する機構は、本化合物投与によるマクロファージ活性の 上昇によるものと考えられている。自然の創傷の系では、ＧＭ−Ｃ３Ｆのような 細胞外成長因子が速度限定量で存在していることがある。従って、このような因 子を非経口及び／または局所投与すると迅速な創傷の治癒が促進できる。

ｉａマ１ｆｒｏでは、ＧＭ−Ｃ３Ｆは顆粒球及びマクロファージの増殖を増加さ せる。さらに、このポリペプチドは公知の化学誘引剤へのこれらの細胞の走化性 を増加させる。ｉｎ　ｖｉｖｏでは、外因性の組換えＧＭ−Ｃ３Ｆを投与すると 生物が損傷に対応する力を高める。ケモトキンスの増加により、創傷の創縁切除 がより早くなり、炎症相が短縮される。マクロファージは、治癒過程を開始する 血餅の分解、血餅の肉芽組繊による置換、及び上皮を再形成した創傷のそれ以上 の成熟及び再構成に非常に関与している。この型の細胞の活性が上昇するだけで なく、その数が増えると、治癒するのに必要な時間が短縮される。また、マクロ ファージ自体も、創傷の治癒に重要な働きを持つ他の型の細胞例えば線維芽細胞 を阻害または刺激する因子を放出する。

対照的に、組換えＧ−Ｃ３Ｆは主として好中球細胞の産生及び増殖を刺激する。

好中球は創傷治癒の絶対必要要件ではないが、好中球が炎症相に存在すると、失 活した組織及び他の汚染勧賞を損傷部位からより早く取り除く手助けとなる。特 に感染した慢性の創傷は直りにくいと定義されている。これらの創傷は一般に持 続した炎症相に残る。組換えＧ−Ｃ３Ｆの投与、及びその結果のＷＡ泣球の活性 上昇、侵入及び局所での増殖により、炎症相を長引かせるこれらの因子をより迅 速に、完全に除去でき、そのため治癒過程を進展させうる。

同等またはそれ以上のｉｎマｉｖｏの生物学的活性を持つＧ−Ｃ３ＦまたはＧＭ −Ｃ３Ｆのアナローブを本発明方法に従って使用することができる。このような アナローブは天然の蛋白質の一時構造のアミノ酸を欠損、挿入または置換するこ とにより、または蛋白質の化学的修飾例えばベギレーション（ｐｅｇｒｌａｌｉ ｏｎ）により生成することができる。例えば、原核宿主微生物でのこれらのポリ ペプチドの発現を可能にするために（ヨ、最初のメチオニンコドンが翻訳開始に 必要である。他のアナローブがより大きなｉｎ　ｆｉｌＴｏ及び／またはｉｎマ １マＯの生物学的活性を有する、より高いｐＨまたは温度安定性を示す、より広 範囲の環境条件にわたり生物学的活性を維持する、または１ｎマ１マＯでより長 ０半減期またはフレアランス時間を持つことがある。

市販用医薬品に使用するために十分な量のＧ−Ｃ３Ｆ及びＧＭ−Ｃ３Ｆを製造す るためには、これらの蛋白質を組換え宿主細胞発現産物として製造する。ＧＭ− Ｃ３Ｆまた番よＧ−Ｃ３Ｆの生物学的活性型は、原核細胞宿主例えば大腸菌を、 これらのポリペプチドをコードする適切な発現ベクターで形質転換し、外来遺伝 子を発現させる条件で増殖させると、大量に回収できる。従って、この方法で製 造したＧ−Ｃ３ＦまたはＧＭ−Ｃ３Ｆを使用するのが好ましい。

組換えＧ−Ｃ３ＦまたはＧＭ−Ｃ３Ｆを患者への投与に適した医薬品処方に処方 する。当業者には理解されるように、このような処方には医薬品として許容され る助剤及び希釈剤と含むことができる。全身投与の場合、治療薬の治療上有効量 を非経口経路、例えば皮下、静脈、筋肉内及び腹腔内注射で分配する。

非経口注射での創傷の治療には、種々の要因例えば損傷の型、重症度及び場所に 応じて、治療薬を単回、複数回または連続投与が含まれる。

本発明の好ましい実施態様では、組換えＧ−Ｃ３ＦまたはＧＭ−Ｃ３Ｆを創傷の 部位に局所投与して叡者の迅速な創傷治癒を促進することができる。この局所投 与は単回投与または複数の間隔での反復投与であってよい。好ましい投与療法は 治療する損傷の型及び重症度により異なることは当業者に理解されよう。例えば 、外科的な切傷では、損傷を与えた物体から組織にほとんどエネルギーが移行し ないので、周囲の組織にほとんど損傷を与えることはない。治療薬を単回局所投 与すると、創傷は未治療の同じ創傷と比べて顕著に早（治癒する。創傷が感染し ているまたは慢性的に肉芽化している場合には、治療薬を連日反復投与すると、 治療していない同様の創傷に比べ、より早く治癒することが判った。

純粋または実買的に純粋な化合物として、すなわち任意の医薬品処方に含まれて いない治療薬を投与することができるが、医薬品処方または組成物中に治療薬を 入れるのが好ましい。このような処方は治療上有効量の治療薬と１つ以上の医薬 品として許容される担体及び／または助剤からなる。使用する担体は処方の他の 成分と相容性でなければならない。好ましくは、処方には、上記にポリペプチド と非相容性であることが知られている酸化剤または還元剤または他の物質を含ま ない。全ての処方法に、生物学的活性成分を担体及び／または助剤と合わせるス テップを含んでいる。一般に、本発明治療薬は、液体担体、微細に分割した固体 担体または両方に合わせることにより処方する。

本発明に従って局所投与するのに適した処方は治療上有効量の治療薬と１つ以上 の医薬品として許容される担体及び／または助剤とからなる。水性またはコラー ゲンをベースとする担体ベヒクルが本発明に記載の治療薬の局所投与に好ましい 。処方を１回だけ投与する場合には、コラーゲンをベースとした担体ベヒクルが 好ましい。このようなベヒクルの例は２７ｄｅ＋ｍＲ（Ｃｏｌｌ＋ｇ＋ｎ　Ｃｏ ｒｐ、、Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ　）である。治療する創傷が指示された間 隔で治療薬を数回投与することを必要とするときには、医薬品として許容される 水性ベヒクルを使用して分配するのが好ましい。しかし、治療薬を創傷の治療に 日常的に使用されている種々の物質に含ませることもできる。このような物質に は、ヒアルロン酸または他のグリコースアミノグリカン由来の製剤、縫合用品及 び創傷用包帯を含んでいる。

本発明に従って使用する治療薬が１つ以上の蛋白賀からなる場合、得られた混合 物は、治療薬として１つのポリペプチドのみ含む処方と同じ方法で投与する。

以下の実施例は本発明をより完全に説明するために提供したもので、本発明の範 囲を限定するものではない。

実施例１ 全厚の切傷モデル 体重３００−３５０ｇの若い成体雄性Ｓｐｒｚｇａｅ−０１マｌｅ７ラツト（Ｓ １＋ｃｏ：　Ｏｍｔｈ＊、Ｎε）８匹をフエノバルビタールで麻酔した。

各動物の背中を剃り、よく擦って洗った。無菌状態で、各ラットの背中に２本の ６ｃｍの全厚切開を行った。各切開は背中の中央から１．５ｃｍの所であった。

次に、各動物の２つの創傷のうち１つの長さ方向に、ツベルクリンシリンジを使 用して、コラーゲン１ｍｇ及びＧＭ−Ｃ３Ｆ２０μｇを含むウシコラーゲン懸濁 液を投与した。次に、ウシコラーゲンのみを含有する懸濁液を各動物の他方の創 傷に注射して、内部対照とした。次に、創傷を３つの均等間隔の外科クリ・ツブ で接着させた。手術後、動物を１０ＥＩ間１つのケージに入れ、この時点で採取 するために取り出した。

採取は、先ず各ラットを人道的に殺して実施した。殺した後、背中全体の皮膚を 注意深く外科的に剥した。次に、平行な外科用ブレードを持つテンプレートを使 用して、各創傷にまたがる部位から、切開軸に垂直に２−３片の皮膚片を取った 。基片の幅は８ｍｔｏであり、外科クリップの間の領域から切り取った。

切除後、実験用の創傷と対照用の創傷からのよく釣り合った、対の試料を湿らせ ておき、次に、ＧＭ−３ＣＦ処理及び未処理創傷の破壊強さの測定に使用した。

また、各切開端から１つまたは２つの試料も切取り、組織学的分析用に固定した 。

張力計（τ＋＋＋＋ｏｉ＋ｔｅ＋　１０；鷺ｏｎ＋５ｎｌｏ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、 　Ｌｏｗｉｓ、　ＭＯ）を使用して、接着した創傷の破壊強さを測定した。第１ 図は、破壊強さの測定の結果を示している。感染、過剰な出血または不十分な接 着が認められた創傷では測定しなかった。ＳＡＳデータ分析システム（ワシント ン大学生物統計学部、Ｓｌ　Ｌｏｏｉ＋。

ハ０）を使用して、破壊強さのスコアー及び実験値と対照値との間の差の対ので 一検定を実施した。これらの分析から、を−検定の値は２．１３６２９８であり 、ｐ−値は０．０３８であることが明かになり、ＧＭ−Ｃ３Ｆ治療が非治療対照 と比べて治癒した創傷の破壊強さを有意に上昇させることが示唆された。

接着した創傷の組織学的な分析は、切開２４−４８時間後に切開端から取り出し た試料を調べて実施した。試験の前に、各試料をパラフィンに埋め、３μｍの厚 さの薄い切片を作った。

細胞性及び肉芽組織形成について調べる切片を標準法でヘマトキンリンで染色し 、エオシンで後染色した。次に、これらの切片を、２人の観察者により１００倍 の光学顕微鏡で評価した。

これらの観察から、ＧＭ−Ｃ３Ｆで処理した創傷は非処理の創傷に比べ単球及び 線維芽ＩＩ抱の流入が非常に多いことが示された。

これらの張力計及び組織学的分析の結果は、ＧＭ−ＣＳ　Ｆ２０μｇの単回投与 によりｉｎマ１マＯでの創傷の治癒過程が有意に加速されることを示している。

非処理対照群と比べて、ＧＭ−Ｃ８Ｆ処理した創傷で細胞性及びコラーゲン産生 の増加が認められた。従って、ＧＭ−Ｃ３Ｆ処理した創傷で観察された破壊強さ の上昇は、局所投与したＧＭＣ３Ｆが創傷の部分へのマクロファージ及び線維芽 細胞の侵入の増加を促進するためである可能性がある。また、この急速な細胞性 の上昇により、肉芽組繊からコラーゲンをベースとするマトリックス特性を持つ 鍛痕組織への移行がより早く起こる。

上記の実験の他に、同じ全厚切傷モデルを使用てた別の実験を行い、ＧＭ−Ｃ９ Ｆの局所治療と全身治療を比較した。ここでは、２５０−３００ｇの雄性のＳｐ ＋ａｇａｅ−ＤｘｖｌＣ７ラツトを使用した。全厚切傷は上記のように作った。

局所投与用には、ツベルクリンシリンジを使用して閉鎖時に各創傷の裂は目に全 量Ｑ、１ｍｌをつけて３０ｕｇのＧＭ−Ｃ３Ｆがつくように、組換えＧＭ−Ｃ３ Ｆ　（０，５ｍｇ／ｍｌ）を乳化したウシコラーゲン懸濁液（１０ｍｇ／ｍｌ） と合わせた。各動物での対にして作った対照の創傷には１００μｌのコラーゲン ベヒクルのみを投与した。

別なグループの動物を使用）７て、単球減少動物での切傷に対するＧＭ−Ｃ３Ｆ の局所投与の効果を調べた。創傷をつける２日前に各実験動物に３０ｍｇ／ｋｇ 　（約１０ｍｇ／ラット）のメチルプレドニソロンを筋肉的注射して単球減少症 を誘導させた。創傷の部位に局所的に投与したＧＭ−Ｃ３Ｆの可能な全身作用を 調べるために、各群（正常群及び単球減少症群の両方）の代表の動物で、傷をつ けてから２日後に尾の静振の全血球算定を行った。これらの測定値、特に白血球 分画から、ＧＭ−Ｃ３Ｆは局所投与時には顕著に全身から吸収されることはない ことが明かとなった。

局所治療した動物を傷をつけてから７日または１４日目に殺した。その皮膚を引 続き採取し、前記のように３つの標準化した８ｍｍ片を各創傷の部位から得た。

次に、張力計を使用してこれらの基片の破壊強さを分析した。対にした５ｔａｄ ＋ｕの１−検定で結果を分析した（ｌｌ＋＋ｉｅｔ、ｌ口Ｃａｍｐ、　）。過剰 の引っかき傷を示すまたは近似が少ない（く全での創傷の５％）の創傷はすべて 分析から除外した。正常の、単球減少症ではない動物についての結果を第２図に 示すが、これは冨上図に示した結果、すなわち、切傷へのＧＭ−Ｃ３Ｆの局所投 与により創傷治癒速度が顕著に早くなることを確認するものである。単球減少ラ ットについては反対の結果が得られた。創傷を受ける前にグルココルチコイドで 処理すると、創傷の部位へのＧＭ−Ｃ３ＦＩｉＳ所投与の正の作用がなくなった 。

上記の局所投与実験と同時に、同じ切傷をつけたラットにＧＭ−Ｃ３Ｆの全身投 与も行った。これらのラットには、創傷をつける２日前から始め、創傷をつけた ５日後まで連続して、１２時間毎に、リン酸バッファ中のＧＭ−Ｃ３Ｆを１００ μｇ／ｋｇ皮下注射した。対照ラットには、同じスケジュールで等量の食塩水の みを注射した。ＧＭ−ＣＳ　Ｆ投与開始前日、投与開始後１日及び９日目に尾の 静脈血試料を採取した。これらの動物は手術７日後に人道的に殺して、上記のよ うに創傷の破壊強さを測定した。切傷をつけ、ＧＭ−Ｃ３Ｆで全身処理した動物 で得られた結果は、切傷の迅速な治癒を促進するのに有効なＧＭ−Ｃ３Ｆにはこ のような分配経路は無効であることを示した。血液細胞分析はＧＭ−Ｃ３Ｆ投与 に対して明確な反応を示したが、ＧＭ−Ｃ３Ｆを皮下投与した動物の創傷は食塩 水処理した動物の創傷に比べて破壊強さが増してはいないことが判った。上記の 局所投与の結果とこの結果を合わせて考えると、創傷自体にＧＭ−Ｃ９Ｆをつけ ることが創傷を受けた動物の治癒を加速する最も有効な方法であることが明らか に示される。

実施例２ 慢性的な肉芽化創傷モデル ２００−２５０ｇの雄性Ｓｐ＋Ｂｕｅ−［１畠ｖｌｅ７ラツト（Ｓｘ＋ｃｏ１０ ｍｓｈ＊、　１ｌＥ）７２匹を麻酔し、次に、各ラットの背中の表面を剃り、消 毒した。次に、各ラットの背中の表面に２０％の全厚火傷からなる修飾Ｂｒｏｏ ｋｅ　Ｂａｒｎ　１ｌｏｄｅｌ損傷を与えた。使用した修飾８ｒｏｏｋ＋　Ｂｏ 「ｎ　Ｍｏｄｅｌ　［Ｌｌｋｅ＋他、（１９６４）、Ａｎｎｚｌｓ　ｏｆＳａｒ ｆ＋ｒ７．　８月　２９７−３０５３では１００℃に加熱した鋳型を使用した。

次に、この鋳型を実験動物の背中に１５秒載せた。火傷を負った直後に、ラット の内４０匹の火傷した背中に１０８の大腸９Ｉ（ＡＴＣＣ株２５９２２）を均等 に接種した。

麻酔からさめた後、動物を１つのケージに入れた。

創傷を受けてから５日後に、火傷の感染にもかかわらず生存している動物に麻酔 下で焼面切除術を行い、機械的手段で創傷を覆っている焼面を取り除いた。焼面 を除去すると、組繊細菌濃度が細Ｍ１０５個／組織ｇの慢性的に肉芽化した創傷 が得られる。焼面除去後先ずイソプロポルアルコールで創傷を洗浄して定量的及 び定性的に細菌を分析した。次に、肉芽組織の２−３ｍｍのコアを取り出して生 検材料を得た。次に、生検材料を計量し、炎に当て、ホモジエナイズし、１：１ ０のチオグリコレートを含有する溶液で希釈した。次に、この溶液を順次希釈し 、血液寒天プレートで裏打ちすると細菌の数が得られた。

最初の細菌数を得た後、動物を３つの群に分けた。東１群は大腸菌に感染せず、 ＧＭ−Ｃ９Ｆ治療を受けなかった２０匹の動物からなり、非処理対照群とした。

茶２群及び第３群は実験群であった。第２群は第３群と同じスケジュールで不活 性ベヒクルのみを局所投与した２０匹の動物からなり、東３群には１回の投与で １０μｇのＧＭ−ＣＳＦを投与した。第２群及び東３群では、適切な局所用処方 をツベルクリンシリンジで１０日間毎日与えた。上皮形成及び／または創傷の収 縮の速度は実験期間中、２−３日毎に、放射面積で測定した。さらに、生検材料 を５日目及び１００日目得て、種々の群の創傷の中の細菌量を測定した。１００ 日目組織の細菌数は、感染群（第２群、平均＝ＩＩＩ１１．９Ｘ１０７個／ｇ） より１！３群（平均＝３．７８×１０５）で少なかった。しかし、実験期間中を 通して、第２群及びｊｌｌａ群の両者の細菌数は東１群（平均〈細Ｍ１０２個／ ｇ）より有意に多かった。

第２群の慢性的に肉芽化している創傷は第１群の動物の創傷より治癒が遅く、こ のモデルでは細菌汚染が創傷治癒を阻害していることが判った。しかし、第３群 のＧＭＣ３Ｆ処理動物では、茶２群より有意に（ｐ　＜　Ｏ，ＯＯ５Ｗｉｌｅｏ ｘｏｎ　）早く創傷が治癒していることから、この細菌汚染を克服できた（第２ 図）。従って、重篤な細菌汚染が持続しているにもかかわらず、ＧＭ−Ｃ５Ｆの 局所使用により創傷の閉鎖が早まる。実際、慢性的に肉芽化している創傷にＧＭ −Ｃ３Ｆを投与して得られる創傷の閉鎖速度は感染していない動物で観察される 速度時間に近づいた。これらの結果は、それまでは治癒が不可能であった創傷に ＧＭ−Ｃ３Ｆを局所投与すると、非常に汚染された創傷においてさえも、正常の 創傷治癒速度が得られることを示している。

本発明を好ましい実施態様を使用して述べてきたが、上記説明を考慮して変更や 修飾がなされることは当業者には理解される。従って、添付の請求の範囲はそこ に述べた本発明の範囲のこのような変更をすべて含むものと意図している。

ＦＩＧ、１ −ｈ外の忌夕東ルζ　（９ｍ±ＳεＭ）ＦＩＧ、　３ ＥＩ＆ 要　約 哺乳類での迅速な創傷治癒を促進するためにＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＧ−Ｃ３Ｆを使用 する方法について述べる。この方法はこれら２つのポリペプチドのいずれかの治 療上有効量を哺乳類に投与することからなる。また、Ｇ−Ｃ３ＦまたはＧＭ−Ｃ ３Ｆのいずれかと少なくとも１つの他の蛋白質を含有する混合物からなるこのよ うな方法も開示している。

国際調査報告

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．損傷を受けた患者での迅速な創傷治癒を促進する方法であって、Ｇ−ＣＳＦ 及びＧＭ−ＣＳＦからなる群から選択したコロニー刺激因子の治療上有効量を患 者に局所投与または非経口投与することからなる方法。
2. ２．コロニー刺激因子が組換え真核宿主細胞の産物である請求項１の方法。
3. ３．コロニー刺激因子が組換え原核宿主細胞の産物である請求項１の方法。
4. ４．損傷が機械的創傷、熱傷、急性創傷、慢性創傷、感染創傷及び無菌創傷から なる群から選択した型である請求項１の方法。
5. ５．損傷を受けた患者がヒトである請求項１の方法。
6. ６．組換え原核宿主細胞が大腸菌である請求項３の方法。
7. ７．コロニー刺激因子がＧ−ＣＳＦである請求項６の方法。
8. ８．コロニー刺激因子がヒトのＧ−ＣＳＦである請求項７の方法。
9. ９．コロニー刺激因子がＧＭ−ＣＳＦである請求項６の方法。
10. １０．コロニー刺激因子がヒトのＧＭ−ＣＳＦである請求項７の方法。
11. １１．ＥＧＦ、ＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ 、インシュリン、インターフェロン、インターロイキン、ＫＧＦ、Ｍ−ＣＳＦ、 ＰＤ−ＥＣＧＦ、ＰＤＧＦ、ＳＣＦ、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βからなる群から 選択した少なくとも１つの他の組換え蛋白質も含む請求項１の方法。
12. １２．インターフェロンをα−ＩＦＮ、β−ＩＦＮ及びγ−ＩＦＮから選択した 請求項１１の方法。
13. １３．インターロイキンをＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５ 、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９及びＩＬ−１０からなる群から選択 した請求項１１の方法。
14. １４．治療上有効量のコロニー刺激因子からなる医薬品として許容される処方の 局所投与を、コラーゲンをベースとするクリーム、コラーゲンをベースとするフ ィルム、コラーゲンをベースとするマイクロカプセル、コラーゲンをベースとす る粉末、ヒアルロン酸または他のグリコースアミノグリカン、クリーム、フォー ム、縫合材料及び創傷用包帯からなる群から選択したコロニー刺激因子を含有す る創傷の優いを通して実施する請求項１の方法。
15. １５．ＥＧＦ、ＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−ＩＩ 、インシュリン、インターフェロン、インターロイキン、ＫＧＦ、Ｍ−ＣＳＦ、 ＰＤ−ＥＣＧＦ、ＰＤＧＦ、ＳＣＦ、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βからなる群から 選択した少なくとも１つの他の組換え蛋白質も含む請求項１４の方法。
16. １６．インターフェロンをα−ＩＦＮ、β−ＩＦＮ及びγ−ＩＦＮから選択した 請求項１５の方法。
17. １７．インターロイキンをＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５ 、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９及びＩＬ−１０からなる群から選択 した請求項１５の方法。
18. １８．治療上有効量のコロニー刺激因子からなる医薬品として許容される処方の 局所投与を、コロニー刺激因子からなる溶液の使用を通して実施する請求項１の 方法。
19. １９．ＥＧＦ、ＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−ＩＩ 、インシュリン、インターフェロン、インターロイキン、ＫＧＦ、Ｍ−ＣＳＦ、 ＰＤ−ＥＣＧＦ、ＰＤＧＦ、ＳＣＦ、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βからなる群から 選択した少なくとも１つの他の組換え蛋白質も含む請求項１８の方法。
20. ２０．インターフェロンをα−ＩＦＮ、β−ＩＦＮ及びγ−ＩＦＮから選択した 請求項１９の方法。
21. ２１．インターロイキンをＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５ 、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９及びＩＬ−１０からなる群から選択 した請求項１９の方法。