JPH04504111A - ヒトマクロファージ遊走阻止因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトマクロファージ遊走阻止因子 本発明は、概して、多様な炎症反応の制御に重要な新規蛋白質因子に関するもの である。さらに具体的には、本発明は、新規ヒトマクロファージ遊走阻止因子に 関するものである。また、本発明は、この因子を均一形態で得、それを組換え遺 伝子工学技術により生産する方法を提供する。

発明の背景 抗原性または細胞分裂促進性刺激に反応すると、リンパ球は、細胞免疫の免疫調 節、炎症およびエフェクター機構において重要な役割を演じるリンホカインと呼 ばれる蛋白質仲介物質を分泌する［Ｓ。

コーエン等、「バイオロジー・オブ・ザ・リンホカイン類」、ニューヨーク、ア カデミツク・プレス、５１１−５７６頁（１９Ｖ９）およびＡ、害鳥等、ｒＦＡ ＳＥＢジャーナル」、３８：２４６２−２４７３（１９８８）］。最初に報告さ れたリンホカイン活性は、抗原で感作し、活性化したモルモット・リンパ球の培 養上清で観察された。

この活性は、インビトロで毛細管からのモルモット・マクロファージの遊走を阻 止し得ることから遊走阻止因子（ＭＩＦ）と命名された［Ｂ、Ｒ，ブルーム等、 「サイエンス」、１５３：８Ｏ−８２（１９６６）およびＪ、Ｒ，デビット、「 プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシー ズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーブ・オブ・アメリカ」、１５３ニア２−７ ７（１９６６）コ。

このＭＩＦ活性が最初に観察されて以来、多数の刊行物が推定的ＭＩＦ分子の単 離および同定を報告している。例えば、ｐ、　ｓ、ババゲオルジョウ等、「ジャ ーナル・オブ・イムノロジー」、１０８：４９４−５０４（１９７２）、Ｒ，Ｅ 、ロックリン等、「セルラー・イムノロジー」、５：４３５（１９７２）、Ｔ、 吉日等、「ジャーナル・オブ・イムノロジー」、１１７：５４８−５５４（１９ ７６）、Ｈ，Ｇ。

リモールド等、「ジャーナル・オブ・イムノロジーＪ、１１８：２０１５−２０ １９（１９７７）、Ｌ、Ｈ，ブロック等、「ジャーナル・オブ・エクスペリメン タル・メディシンＪ、１４７：５４１−５５３（１９７８）、Ｇ、ボッツァンツ ァ等、「サイエンス」、２０５＋３００−３００１９７９）、Ｐ、Ｎ、ディン等 、「ジャーナル・オブ・インターフェロン・リサーチ」、１：２３（１９８１） 、ｗ、ｙ、ワイザー等、「ジャーナル・オブ・イムノロジー」、１２６：１９５ ８−１９６２（１９８１）、Ｓ、Ｚ、サラツブイン等、「サイエンス」、２２３ ニア０３−７０７（１９８４）、ｗ、ｙ、ワイザー等、「セルラー・イムノロジ ー」、８８：１０９−１２２（１９８４）、Ｗ、Ｙ、ワイザー等、「セルラー・ イムノロジー」、９３：５３２−５４０（１９８５）、Ｄ、　Ｔ。

ラメラ等、「ジャーナル・オブ・イムノロジーＪ、１４０：４２１１−４２１６ （１９８８）およびＧ、ツバドロ等、「クリニカル・アンド・エクスペリメンタ ル・イムノロジーＪ、７２：５１０−５１５（１９８８）参照。

しかしながら、ＭＩＦ活性を呈する他のリンホカイン類、特に、例えばインター フェロン・ガンマおよびＩＬ−４は、最近同定されたばかりである［Ｇ、Ｂ、ツ ルマン等、「ジャーナル・オブ・イムノロジー」、１３４：３０５−３０９（１ ９８５）およびＡ、マッキンス等、「ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・ メディシン」、１６７：５９８−６１１（１９８８）コ。他の既知リンホカイン 類もｒＭＩＦ」活性を有するというこれらの観察結果から、ＭＩＦ活性を伴う別 個の新規物質が存在するのではないかという考慮すべき疑いが生じた。

ＭＩＦ活性の検出は、遅延過敏症および細胞免疫［Ｒ，Ｅ、ロックリン等、「ニ ューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン」、２８２：１３４０−１３ ４３（１９７０）およびＪ、Ｒ，デビット等、Ｐｒｏｇｒ、　ｉｎ　Ａｌｌｅｒ ｇ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１６：３００−４４９（１９７２）コ、異型移植拒絶 ［Ｓ、アルーアスカリ等、「ネイチャー」、２０５：９１６−９１７（１９６５ ）およびＪ、Ｔ、バリントン、「セルラー・イムノロジー」、３０：２６１−２ ７１（１９７７）コおよびリューマチ様多発関節炎滑液症（ｓｙｎｏｖｉａｌｉ ｓ）　［オディンク等、「ネイチャー」、３３０：８Ｏ−８２（１９８７）］を 含む様々な炎症反応と相関する。

当業界では、依然として宿主防御の刺激に有用な医薬組成物の製造に関してマク ロファージ機能に影響を与える生物活性蛋白質、例えばＭＩＦが要望されている 。

発明の要旨 本発明は、−態様において、実質的に他のは乳類蛋白質の随伴がない新規ヒトマ クロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）を提供する。この蛋白質は、組換え遺伝子 工学技術により製造される。この発明の生物活性ＭＩＦ蛋白質は、約１１５個の アミノ酸配列により構成される。そのアミノ酸配列は後に示す。

活性ＭＩＦは、ＭＩＦｃＤＮＡ）ランスフエクシａンＣＯ８１細胞から誘導され た上清液のドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥ）を用いた測定によると約１２ｋｄの見かけ上の分子量を有する。

この発明のＭＩＦ蛋白質は様々な検定において生物活性を示しており、これは幾 つかの異なるマクロファージ機能の一般的活性化物質としてのその役割を示して いる。この発明のＭＩＦは、ヒト末梢血細胞を用いた検定においてヒトマクロフ ァージの遊走を阻止する。

ＭＩＦは、この検定において２０％阻止を越える生物活性を示す。

また、ＭＩＦは、幾つかの異なる基準により測定された培養でのマクロファージ 活性の刺激に役立つ。ＭＩＦ処理マクロファージは、正常より高いレベルのＩＬ −１βＨＬＡ−ＤＲｍＲＮＡを発現する。

またＭＩＦは単独でマクロファージを刺激することにより、細胞内病原体、レイ シュマニア・ドノバー二を殺し、また、このシステムにおいてインターフェロン −ガンマの効果を高める。

本発明の別の態様は、ヒトＭＩＦ蛋白質の発現をコードするＤＮＡ配列である。

活性ＭＩＦをコードするＤＮＡ配列は、表１のヌクレオチド配列と同じかまたは 実質的に同じ配列またはそのフラグメントを含むことを特徴とする。本発明のＭ ＩＦＤＮＡ配列は、同じＭＩＦ−ｃＤＮＡ　トランスフェクションＣＯ５−１細 胞から誘導された上清液の５ＤＳ−ＰＡＧＥにより示された新規蛋白質帯の分子 量にほぼ相当する１１５アミノ酸のポリペプチドをコードする。

この蛋白質帯をゲルから取り出し、電気溶離すると、それは強いＭＩＦ活性を示 した。ＣｏｎＡ刺激および非刺激ヒト末梢血リンパ球から抽出されたＲＮＡの分 析結果は、このｃＤＮＡが、刺激リンパ球由来の単−ｍＲＮＡ類とはハイブリダ イゼーションするが、非刺激リンパ球とはしないことを示した。

また、本発明は、発現制御配列を機能し得る形で随伴したＭＩＦをコードするＤ ＮＡ配列を含むベクターを提供する。本発明はまた、組換えＭＩＦの製造で使用 するための前記ベクターにより形質転換された宿主細胞を提供する。

本発明のベクターおよび形質転換細胞は、別の態様、すなわち組換えヒトＭＩＦ 蛋白質またはそのペプチド・フラグメントの新規製造方法において使用される。

この方法では、蛋白質の発現を制御し得る適当な発現制御配列を機能し得る形で 随伴した、ＭＩＦ蛋白質またはそのペプチド・フラグメントの発現をコードする ＤＮＡ配列により形質転換されたセルラインを特徴する請求の範囲で請求されて いるこの方法は、蛋白質発現用宿主細胞として若干の既知細胞を使用し得る。現 時点でＭＩＦの製造に好ましいセルラインは、は乳類セルラインおよび細菌細胞 である。

この発明の別の態様は、組換えＭＩＦまたはその１つもしくはそれ以上のペプチ ド・フラグメントの治療有効量を含む医薬組成物を提供する。これらの医薬組成 物は、マクロファージの活性化が重要な役割を演じる疾患状態または創傷の処置 方法において使用され得る。例えば、ＭＩＦ蛋白質またはその活性フラグメント は、癌治療、感染症の処置、創傷治癒の加速および免疫系の刺激において一般に 使用され得る。またＭＩＦは、ある種の抗原、特にワクチンに対する免疫応答の 強化に使用され得る。

従って、本発明のさらに別の態様は、適当な医薬用担体と共にＭＩＦまたはその ペプチド・フラグメントの治療有効量を患者に投与することによる、これらおよ び／または他の病的状態の処置方法である。これらの治療方法は、少な（とも１ 種の他のサイトカイン、ヘマトポエチン、インターロイキン、成長因子または腫 よう特異抗体の有効量をＭＩＦまたはそのペプチド・フラグメントと同時または 後続的に投与することを含み得る。

以下、本発明の他の態様および利点については、本発明の好ましい態様の詳細な 記載でさらに詳述されている。

発明の詳細な記載 本発明は、生物活性ヒトマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）を、実質的に他 のは乳類蛋白質の随伴がない形態で提供する。この蛋白質は、治療適用に有用な 純粋活性ＭＩＦの大量生産を可能にする組換え技術により製造され得る。

この発明の活性ヒトＭＩＦは、下記表１に示された約１１５個のアミノ酸蛋白質 配列を特徴とする。ＭＩＦは、還元条件下での５ＤＳ−ＰＡＧＥを用いた測定に よると約１２ｋｄの見かけ上の分子量をヒトＭＩＦのＤＮＡ配列は、最初、例え ばＧ、　Ｇ、ウォング等、「サイエンス」、２２８：８１０−８１５（１９８５ ）、Ｙ、Ｃ，ヤング等、「セル」、４７：３−１０（１９８６）およびＡ、　Ｅ 、ナーメン等、「ネイチャー」、３３３：５７１−５７３（１９８８）で先に報 告された発現クローニング方法に従い、フィトヘマグルチニンおよびＰＭＡ−刺 激ヒトＴ細胞ハイブリドーマライン、Ｔ−ＣＥＭＢ［Ｗ、ワイザー、ブライハム およびウィミンズ・ホスピタルからの要求時に利用可能コから誘導されたｍＲＮ Ａから製造されたｃＤＮＡライブラリーからクローン化された。このライブラリ ーは、は乳類細胞、例えばＣＯ３−１細胞でのｃＤＮＡ挿人体の発現を可能にす る発現ベクターにおいて構築された。ライブラリーのスクリーニングは、ＣＤＮ ＡクローンのプールでＣＯ３−１細胞をトランスフェクションすることにより行 なわれた。ＭＩＦ活性について上清液を検定することにより、ＭＩＦ活性を発現 するＣＤＮＡクローンが同定された。

幾つかの細胞供給源由来のｍＲＮＡを、選択されたＭＩＦｃＤＮＡクローンとの ハイブリダイゼーション能力について試験した。ノーザン・プロット分析は、Ｔ 細胞ライン、ＣＥＭおよびＴ細胞）＼イブリドーマライン、Ｔ−ＣＥＭＢ並びに レクチン刺激ヒト末梢血リンパ球（Ｐ　Ｂ　Ｌ）が、ＭＩＦクローンとハイブリ ダイゼーシヨンするｍＲＮＡを容易に検出可能なレベルで合成することを示した 。しかしながら、このメツセージは、長（暴露したにも拘わらず非刺激ＰＢＬ由 来のＲＮＡ試料からは検出され得なかった。活性化ヒトＰＢＬにおけるＲＮＡ転 写物の存在は、ヒトＭＩＦ遺伝子が活性化リンパ球の産物として発現されること を示唆している。

下記表１に示された、このクローンからのＭＩＦｃＤＮＡ配列は、１１５アミノ 酸配列（１文字コード）をコードする。

７０　９０　１：Ｌ。

１：３０　１５０　１７０ ＱＱＬＡＱＡＴＧＫ’ＰＰＱＹＩＡＶＨＶＶＰＤＱＬＭＡＦＧＧＳＳＥＰＣＡＬ ＣＳＬＨ５工　ＧＫ　工　ＧＧＡＱＮＲ５ＹＳＫＬＬＣＧＬＬＡＥＲＬＲＩＳＰ ＤＲＶＹ　工　ＮＹＹＤＭＮＡ３７０　：１９０　４１０ 表１のｃＤＮＡ配列は、ヌクレオチド５１−５３のＡＴＧコドンから始まる、３ ４５ヌクレオチドを有する長い転写解読枠を含む。

ＡＴＧの後に１１４個のコドンおよびヌクレオチド３９６−３９８のＴＡＡ終結 トリプレットが続く。３４５個のヌクレオチドは、パルス標識実験により観察さ れたＭＩＦ特異蛋白質帯の質量と一致する１２５４０の理論分子量を有する１１ ５個のアミノ酸ポリペプチドをコードする。

ＭＩＦは、分泌性蛋白質であると考えられてきたが、ＤＮＡ配列は、Ｎ末端また は内部的に、慣用的分泌リーダー配列［Ｄ、ペールマン等、「ジャーナル・オブ ・モレキュラー・バイオロジー」、１６７：３９１−４０９（１９８３）］と類 似した疎水性アミノ酸伸張を含まない。また、蛋白質シグナル・ペプチドの特徴 である高疎水性配列の欠如は、ＭＩＦ関連蛋白質からも観察されるＥＫ、オデイ ンク等、前出コ。リーダー配列が見かけ上存在しないということは、ＭＩＦ分泌 の機構が典型的分泌性蛋白質の場合とは異なることを示唆している。このＭＩＦ は活動的または効果的には分泌され得ない可脆性がある。別法として、細胞は、 ＩＬ−１の機構と類似した機構によりＭＩＦを運び出す。

また、ＭＩＦのｃＤＮＡ配列は、アミノ酸７３−７５（７３−７５（Ａｓｎ−Ａ ｒおよび１１０−１１２　（Ａｓｎ−Ａｓｎ　−５ｅｔ）において２つの潜在的 アスパラギン結合グリコジル化部位をコードする［例、Ｒ，Ｊ。

ウィンツラー、「ザ・ケミストリー・オブ・グリコプロテインズ・イン・ホーモ ナル・プロテインズ・アンド・ペブタイズ」、第１巻、Ｃ，Ｈ，り一編、アカデ ミツク・プレス、ニューヨーク、１頁（１９７３）参照コ。ベーターインターフ ェロンおよびＩＬ−２と同様、ＭＩＦＤＮＡ配列は、アミノ酸５６．５９および ８０位に位置する３つのシスティン残基をコードする。これらの３つのシスティ ン残基は、少なくとも一部分、貯蔵時におけるＭＩＦ生物活性の喪失の原因とな り得る。

本発明のこのＭＩＦｃＤＮＡのヌクレオチド配列を、ジエンバンクで記録された ヌクレオチド配列と比較した。ヌクレオチド配列における顕著な類似性は全く見 出されなかった。注目すべきことに、ヒトＭＩＦは、ガンマ・インターフェロン またはＩ　Ｌ−４、ＭＩ　Ｆ活性を有する他のサイトカインと配列類似性を一切 共有していない。

さらに、この発明のＭＩＦｃＤＮＡおよび、上述のオディンク等により報告され た２種の蛋白質、ＭＲＰ−８およびＭＲＰ−１４をコードするｃＤＮＡ間に配列 類似性は全（存在しない。すなわち、この発明のＭＩＦは、これらの既知因子お よび蛋白質とは免疫学的に異なる。

本発明のｃＤＮＡ配列は、は乳類細胞により製造された機能的ポリペプチドの検 出により生物活性ヒトＭＩＦをコードする。プラスミドｐ７−１におけるークロ ーン化配列は、１９８９年３月１７日付でメリーランド、ロックビル、パークロ ーン・ドライブ１２３０１のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに ナンバー４０５８２で寄託された。この寄託物は、特許手続きを目的とする微生 物寄託に関するブダペスト条約およびその下の規定（ブダペスト条約）の必要条 件を満たす。

また、本発明は、他の霊長類蛋白質をコードするＤＮＡ配列の随伴が無（、ＭＩ Ｆポリペプチドに関する発現をコードするこれらの新規ＤＮＡ配列を包含する。

これらのＤＮＡ配列は、上述のＤＮＡおよびペプチド配列と同一または実質的に 同じ配列を含む配列並びに厳密な（ストリンジェント）ハイブリダイゼーション 条件［Ｔ、マニアチス等、「モレキュラー・クローニング（ア・ラボラトリ−・ マニュアル）」、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（１９８２） 、３８７〜３８９頁コ下、上記で報告されたＭＩＦのＤＮＡ配列とハイブリダイ ゼーションする配列を含む。上記の厳密なハイブリダイゼーション条件の一例は 、６５℃、４×ＳＳＣでのハイブリダイゼーション、次いで６５℃で１時間０． ｌＸ５ＳＣ中での洗浄である。別法として、典型的な厳密なハイブリダイゼーシ ョン条件は、４２℃で５０％ホルムアミド、４ＸＳＳＣである。

緩和なハイブリダイゼーション条件下でＭＩＦの配列またはその活性フラグメン トとハイブリダイゼーションし、ＭＩＦ生物特性を有するＭＩＦペプチドに関す る発現をコードするＤＮＡ配列はまた、新規ＭＴＦポリペプチドをコードする。

それらの非厳密ハイブリダイゼーション条件の例は、５０℃で４ＸＳＳＣまたは ４２℃で３０−４０％ホルムアミドによるハイブリダイゼーションである。例え ば、ＭＩＦの配列と顕著な相同性を有する領域、例えばグリコジル化部位または ジスルフィド結合を共有し、１つまたはそれ以上のＭＩＦ生物特性を有する蛋白 質をコードするＤＮＡ配列は、かかるＤＮＡ配列がＭＩＦ配列と厳密にハイブリ ダイゼーションしない場合でも、明らかにＭＩＦポリペプチドをコードする。

同様に、ＭＩＦの配列によりコードされるＭＩＦポリペプチドをコードするが、 遺伝子コードの縮重故にコドン配列が異なるＤＮＡ配列もまたこの発明に包含さ れる。対立遺伝子変形（結果的にアミノ酸変化を生じ得る場合も生じ得ない場合 もある種集団における天然塩基改変）、ＭＩＦ生物活性を証明するＭＩＦ蛋白質 配列およびそのペプチド・フラグメントをコードするＤＮＡ配列もまた、その類 縁体または誘導体と共に本発明に包含される。点突然変異またはそれによりコー ドされるポリペプチドの活性、半減期または生産性を高めるべく誘導された修飾 により誘発されるＭＩＦのＤＮＡ配列における他の変形もまた、本発明に包含さ れる。

また、ＭＩＦポリペプチドは、公知の慣用的化学合成により製造され得る。合成 手段による本発明のポリペプチドの構築方法は、当業界の熟練者には公知である 。合成的に構築されたＭＩＦポリペプチド配列は、１次、２次または３次構造的 および立体配座的特徴をＭＩＦポリペプチドと共有していることにより、それら に共通したＭＩＦ生物特性を有し得る。すなわち、それらは、治療および免疫学 的プロセスにおいて天然の精製ＭＩＦポリペプチドに対する生物活性または免疫 学的代用物として使用され得る。

ペプチドまたはＤＮＡ配列に加えられる修飾は、公知方法を用いて当業界の一熟 練者により行なわれ得る。ＭＩＦ配列における興味深い修飾には、暗号化配列に おける選択されたアミノ酸残基の置換、挿入または欠失が含まれ得る。前記の置 換、挿入または欠失に関する突然変異誘発技術は、当業界の熟練者にはよく知ら れている。［例、アメリカ合衆国特許４５１８５８４参照コ。

ここに記載されたＭＩＦポリペプチドの配列の他の特異的突然変異は、１つまた はそれ以上のグリコジル化部位の修飾を伴い得る。

グリコジル化の非存在または部分的のみのグリコジル化は、アスパラギン結合グ リコジル化認識部位または〇−結合炭水化物の付加により修飾される分子の部位 におけるアミノ酸置換または欠失により生じる。アスパラギン結合グリコジル化 認識部位は、適当な細胞グリコジル化酵素により特異的に認識されるトリペプチ ド配列を含む。

これらのトリペプチド配列は、アスパラギン−Ｘ−トレオニンまたはアスパラギ ン−Ｘ−セリン（ただし、Ｘは普通任意のアミノ酸である）である。

グリコジル化認識部位の第１または第３アミノ酸位の一方または両方における様 々なアミノ酸置換または欠失（および／または第２位におけるアミノ酸欠失）の 結果、修飾トリペプチド配列は非グリコジル化状態となる。それらの改変された ヌクレオチド配列の発現により、その部位がグリコジル化されていない変異体が 生産される。

全体的または部分的にＭＩＦ活性を保持していることが予想されるＭＩＦ配列の 他の類縁体および誘導体もまた、当業界の一熟練者によりこの明細書で開示され た方法に従い容易に製造され得る。上記修飾の一つは、結合を可能にする慣用的 技術による、ＭＩＦ配列における既存のりジン残基へのポリエチレングリコール の結合または配列へのりジン残基の挿入であり得る。上記修飾は、この発明に包 含されると考えられる。

また本発明は、ＭＩＦポリペプチドの製造方法を提供する。本発明の方法は、既 知調節配列の制御下、ＭＩＦポリペプチドまたはその活性フラグメントに関する 発現をコードするＤＮＡ配列により形質転換された、適当な細胞またはセルライ ンの培養を含む。適当な細胞またはセルラインは、は乳類細胞、例えばチャイニ ーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）または３Ｔ３細胞であり得る。適当なは乳 類宿主細胞並びに形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび生成物製造およ び精製方法の選択は当業界では公知である。例えば、ゲシングおよびサンプルツ ク、「ネイチャーＪ、２９３：６２０−６２５（１９８１）、または別法として 、カウフマン等、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ。

Ｂ　ｉｏｌ、、５（７）：１７５０−１７５９（１９８５）またはハウリー等、 アメリカ合衆国特許４４１９４４６参照。他の適当なは乳類セルラインは、サル ＣＯ５−１セルラインおよびＣＶ−１セルラインである。

同じく本発明に適した宿主細胞として有用なのは細菌細胞である。

例えば、エシェリヒア・コリの様々な株（例、ＨＢＩＯＩ、ＭＣｌ０６１および 後記実施例で使用されている株）は、バイオテクノロジー分野において宿主細胞 としてよく知られている。また、バチラス・サチリス、シュードモナス、他の細 菌などの様々な株もこの方法で使用され得る。

また、当業界の熟練者に知られている酵母細胞の多くの株も、本発明のポリペプ チドの発現における宿主細胞として利用可能である。

さらに、所望ならば、昆虫細胞も本発明方法における宿主細胞として利用され得 る。例えば、ミラー等、「ジエネテイック・エンジニアリング」、８：２７７− ２９８（プレナム・プレス１９８６）およびそこに引用された参考文献参照。

また本発明は、新規ＭＩＦポリペプチドの発現方法で使用されるベクターを提供 する。これらのベクターは、本発明のＭＩＦポリペプチドをコードする新規ＭＩ ＦＤＮＡ配列を含む。別法として、上記修飾配列が組み込まれたベクターもまた 、本発明の実施態様であり、ＭＩＦポリペプチドの製造に有用である。また、こ の方法で使用されるベクターは、本発明のＤＮＡ暗号化配列を機能し得る形で随 伴し、選択された宿主細胞においてその複製および発現を指令し得る選択された 調節配列を含む。

すなわち、組換え技術または合成方法により製造されたＭＩＦは、マクロファー ジ活性化に関与し得る疾患を処置するための医薬製剤で使用され得る。また、上 記医薬製剤においてＭＩＦの活性ペプチド・フラグメントを使用することも可能 である。ＭＩＦまたはそのフラグメントを含む医薬組成物に関する一治療用途は 、癌治療である。例えば、活性化されたマクロファージは、単独または特異的抗 腫ようモノクローナル抗体と組み合わされると、重要な殺腫よう能力を示す。Ｍ ＩＦのマクロファージ活性化能力は、癌患者処置用の強力な抗腫よう剤としての その単独用途または他の治療剤と組み合わせた形での用途を示している。

同様に、ＭＩＦがマクロファージ介在によるある種の病原体を殺す作用を高める 能力は、例えばレイシュマニア・ドノバニを含む若干の病原体による様々な感染 症の処置におけるこの分子の用途を示している。

さらに、ＭＩＦがマクロファージの遊走を阻止し得る能力は、創傷処置用の治療 剤で利用され得る。創傷部位にＭＩＦ蛋白質を局所適用すると、創傷内で濃縮さ れた活性化マクロファージの数が増加することにより、創傷治癒速度も高められ 得る。

さらに、ＭＩＦは、一般的免疫刺激物質として使用され得、特に特定ワクチンに 対して発生する免疫を高めるのに使用され得る。ＭＩＦがマクロファージＩＬ− １βおよびＨＬＡ−ＤＲ発現を高め得るということは、この分子が、マクロファ ージが有するＴ細胞への抗原提示能力を高めることを示している。従って、ＭＩ Ｆは、種々の抗原に対する免疫応答の強化に有用である。ＭＩＦのこの特性は、 一般的免疫刺激物質としてのその有用性を示している。さらに詳しくは、ＭＩＦ は特定ワクチンに対する免疫応答の強化に有用である。

これは、ワクチン開発が特に疑問視されている例えばヒト免疫不全ウィルスの場 合に非常に重要である。

また、この発明のＭＩＦ蛋白質またはそのフラグメントは、単独または他のサイ トカイニン類、ヘマトポエチン、インターロイキン、成長因子、インターフェロ ンまたは抗体と組み合わせて使用されることにより、上記の様々な感染症、癌お よび恐らくは組織損傷を処置し得る。特に、ＭＩＦをＩＦＮガンマ、Ｍ−Ｃ８Ｆ またはＧＭ−ＣＳＦと共に投与すると、上記状態に対する治療上の利益を高める ことが期待される。

これらの新規ポリペプチドに関する他の用途は、診断または治療用途に関する標 準的方法により生成されるモノクローナルおよびポリクローナル抗体の開発に存 する。

従って、本発明のさらに別の態様は、上述の状態を処置するための方法および治 療組成物である。上記組成物は、治療有効量の本発明によるＭＩＦ蛋白質または その治療有効フラグメントを医薬的に許容し得る担体と混合した形で含む。この 組成物は、非経口的に全身投与され得る。別法として、組成物は静脈内投与され 得る。所望ならば、組成物は皮下投与され得る。損傷治癒用途の場合、この発明 のＭＩＦは、局部または局所投与に適した医薬製剤に製剤化される。

全身投与の場合、この発明で使用される治療組成物は、発熱物質不含有で非経口 的に許容し得る水溶液形態をとる。ｐＨ１等張性、安定性などを熟慮した、上述 の医薬的に許容し得る蛋白質溶液の製造は、当業界の技術範囲内に含まれる。

上記状態の処置方法に伴う服用体制は、薬剤の作用を修飾する様々な因子、例え ば患者の状態、体重、性別および食餌療法、損傷または感染の重症度、投与時間 および他の臨床因子を考慮した上で担当医により決定される。一般に、−日用量 は、体重１キログラム当たり１−１０００マイクログラムのＭＩＦ蛋白質または ５０〜５０００単位（すなわち、ｌ＋１当たりの１単位は、ＭＩＦ検定において 半最大阻止を導（蛋白質濃度である）の蛋白質の範囲とすべきである。

また、本発明の治療方法および組成物は、他のヒト因子との共投与を含み得る。

上記用途における典型的サイトカイニンまたはへマトポエチンには、既知因子Ｉ Ｌ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、Ｇ−Ｃ３Ｆ、Ｃ３Ｆ−１、 ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−Ｃ８Ｆ１インターロイキンまたはエリトロポエチンがある。

さらに特定すれば、ＭＩＦをＩＦＮガンマまたはＭ−ＣＳＦもしくはＧＭ−ＣＳ Ｆと組み合わせると、上記状態の処置に関する治療活性が高められると予想され る。上述の用量は、治療組成物中の上記追加成分について補正すべく調節される 。処置された患者の経過は、慣用的方法によりモニターされ得る。

以下、実施例により、ヒトＭＩＦのクローニング、発現および製造並びに本発明 の他の方法および生成物について詳述する。これらの実施例は説明を目的として いるのであって、本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１ ｍＲＮＡの単離およびｃＤＮＡライブラリーの構築。

顕著なＭＩＦ活性ではあるがほとんど検出できない量のＩＦＮ−ガンマ・メツセ ージを合成することが見出された、ヒトＴ細胞ハイブリドーマライン、Ｔ−ＣＥ ＭＢを、ＲＮＡ抽出の供給源として選択した。このセルラインは、Ｗ、Ｙ、ワイ ザー等、「セルラー・イムノロジー」、９０：１６７−１７８（１９８５）に従 い、ＨＡＴ−感受性Ｔリンパ芽球様ラインＣＥＭＷＨ４をＣｏｎＡ−刺激ヒト末 梢血Ｔ細胞と融合することにより生成された。細胞は、ＲＰＭ１１６４０．１０ ％加熱不活化胎児牛血清（Ｆｅ２）、２ミリモルのし一グルタミンおよび５０μ ｇ／ｉｌのゲンタマイシンから成る培地で維持される。

総ＲＮＡは、１８時間ＰＨＡ（１％）およびＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）により刺 激されたＴ−ＣＥＭＢ細胞からチャーブウィン等、「バイオケミストリー」、１ ８：５２９４−５２９９（１９７９）の方法に従い抽出された。

ｍＲＮＡは、オリゴ（ｄＴ）−セルロース・クロマトグラフィー［Ｈ。

アビブ等、「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・ サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーブ・オブ・アメリカ」、６９ ：１４０８−１４１２（１９７２）］により製造された。５マイクログラムのｍ ＲＮＡを用いて、第２鎖反応においてＤＮＡポリメラーゼＩにより、前出のウォ ング等により報告された２本鎖ｃＤＮＡを合成し、Ｓ！ヌクレアーゼ消化により ヘアピン・ループを除去した［Ｔ、マニアチス等、前出〕。２本鎖ＤＮＡをプラ ント化し、５倍過剰の合成セミ−Ｘｈｏアダプター［ヤング等、「セル」、４７ ：３−１０（１９８６）］にライゲーションした。セミーｘｈＯ適合ｃＤＮＡを アガロース・ゲル電気泳動によりサイズ分画した。

５００塩基対より大きいｃＤＮＡを含むゲルの領域を取り出した。

これらのセミーＸｈｏ適合ｃＤＮＡフラグメントを、ガラス粉末への付着［Ｂ、 　フォーゲルスタイン等、「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカ デミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーブ・オブ・ア メリカ」、７６：６１５−６１９（１９７９）］および後続の低塩緩衝液［５ミ リモルのトリス、０．５ミリモルのエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）］ を用いた溶離により分離した。

ＣＯ５−１細胞発現ベクターｐＸＭ［Ｙ、Ｃ，ヤング等、前出〕を特有のＸｈｏ Ｉ部位で線形化し、等モル量のセミーＸｈｏ適合ｃＤＮＡにライゲーションした 。ライゲーション反応を用いて、適格エシェリヒア・コリ株ＨＢ１０１［Ｙ、Ｃ ，ヤング等、前出コを形質転換し、約６００００のアンピシリン耐性コロニーの ライブラリーを作成した。

実施例２ ＤＮＡ製造およびＣ０８−１細胞トランスフエクシヨン。

前出のＧ、　Ｇ、ウォング等により先に報告された発現クローニング・システム を用いて、下記の要領でＭＩＦ活性をコードするｃＤＮＡを分離した。

上記ｃＤＮＡライブラリーからの細菌コロニーを、ニトロセルロース・フィルタ ー上へ複製した。各フィルターからのコロニーをＬ−ブロスへかき集め、プラス ミドＤＮＡを前記方法により分離した［Ｊ、Ａ、メイヤーズ等、「ジャーナル・ オブ・バクテリオロジー」、１２７：１５２９−１５３６（１９７６）］。各１ 次ＤＮＡ試料を２００−５００コロニーのプールから製造した。

５マイクログラムの各プラスミドＤＮＡを用いて、０．１ミリモルのクロロキン 処理を加え、ＤＥＡＥ−デキストラン−介在ＤＮＡトランスフエクシゴンにより Ｃ０８−１細胞をトランスフェクションした［Ｌ、Ｍ、ソンパイラック等、「プ ロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーブ・オブ・アメリカ」、７８ニア５７５−７ ５７８（１９８１）およびＨ，ルスマン等、「ヌクレイツク・アシッズ・リサー チ」、１１：１２９５−１３０８（１９８３）］。トランスフェクションされた ＣＯ３−１細胞からの培養土清液をトランスフェクションの７２時間後に採取し 、後記実施例７記載の検定法に従いＭＩＦ活性について検定した。

陽性プールからのプラスミドＤＮＡを、ＣＯ３−１細胞へ再トランスフェクショ ンし、トランスフェクションされた上清をＭＩＦ活性について再スクリーニング した。偽陽性の機会を最少限にするため、異なる血液ドナーからの細胞を用いて 各試料を少な（とも５回試験した。次いで、個々のクローンが単離されるまで、 さらに僅かのクローンしか含まなくなるように各試料を再分した。１次プールの 初回Ｃ０８−１細胞トランスフエクシヨンにおける１００の上清のうち、２つの 試料は最善の全体的ＭＩＦ活性を示した。

最高のＭＩＦ活性を有するプールを選抜し、さらに少ない数のクローンを含むよ うに再分し、それらのＤＮＡを製造し、トランスフェクションし、ＭＩＦ活性を 発現する単一クローンが得られるまでトランスフェクションされた上清をＭＩＦ 活性について調べた。

最善のＭＩＦ活性を一貫して示す１クローンを、実施例７のＭＩＦ検定で再試験 した。また、このクローンの生物活性を、モルモットおよびマウスの腹膜マクロ ファージにより試験した。トランスフェクションされたＣ０８−１細胞の粗上清 の５倍希釈物からは、各々３８％および３１％の阻止が見出された。また、この クローンからのＭＩＦ活性を、他のサイトカインＱ（ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、Ｔ ＮＦ−β、ＩＬ−３およびＩＦＮ−ガンマ）と比較した。ＭＩＦ上清は、生物検 定においてこれらのサイトカイン全部よりも大きなＭＩＦ活性を示した。しかし ながら、かなり強いＭＩＦ活性は、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−ガンマにより示さ れた。

実施例３ 蛋白質分析。

ｐ７−１のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドを、パルス標識実験を用い て同定した。ｐ７−ＩＤＮＡによりトランスフェクションされたＣ０８−１細胞 により分泌された蛋白質の５ＤＳ−ＰＡＧＥは、模擬トランスフェクション対照 には存在しない１２ｋｄポリペプチドの存在を示した。この新しい帯をポリアク リルアミド・ゲルから取り出し、５０ミリモルのＮＨ４ＨＣＯｓおよび２００　 ｎｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含む溶離緩衝液中２時間６ワツトで電気溶離 した。後者を加えることにより、非特異的付着を阻止した。対照として、同じく 模擬トランスフェクション上清からの同じ分子量を有するゲルを取り出し、電気 溶離にかけた。溶離液を培地により再構成し、ＭＩＦ活性について試験した。

強いＭＩＦ活性が溶離液から見出された。しかしながら、同じ分子量領域から取 り出された模擬ゲルからは、活性は全く検出されなかった。活性ＭＩＦポリペプ チドを含む同ゲルから３０ｋｄを有する帯を除去し、電気溶離にかけると、３０ ｋｄ帯からの溶離液は遊走を高めた。この３０ｋｄ蛋白質は、粗上清においてＭ ＩＦ活性ときっ抗および／またはこれを低減化するＭＩＦの阻害剤であり得る。

クロロキン処理の４８時間後、ＭＩＦ陽性クローンの組換えＤＮＡによりトラン スフェクションしたＣＯ５−１細胞からの粗上清を除去し、細胞を、３７℃で４ 時間０゜５ｍｌのＤＭＥＭ中０．５ｍＣ１［３５Ｓ］メチオニンによりパルス標 識した。放射性標識した上清を集め、１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけた［Ｕ、に 、レムリ等、「ネイチャー」、２２７：６８０−６８５（１９７０）］。電気泳 動後、ゲルをフルオログラフィー促進性溶液（エンハンス、二ニーイングランド ・ヌクリアー、ボストン、メリーランド）に浸し、乾燥し、Ｘ線フィルムに暴露 した。

実施例４ ＲＮＡ分析。

ＰＨＡ／ＰＭＡ−刺激または非刺激Ｔ−ＣＥＭＢ細胞、ＣｏｎＡ−刺激または非 刺激ヒトＰＢＬまたはＣＥＭ細胞からの全細胞ＲＮＡ２０マイクログラムを、２ ．２モルのホルムアルデヒドを含む１．２％アガロース・ゲルにより電気泳動さ せた［Ｈ，レーラッハ等、「バイオケミストリー」、１６：４７４３（１９７７ ）］。Ｅ、Ｍ、サザーン、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジーＪ 、９８：５０３−５１７（１９７５）の記載に従い、ホルムアルデヒド−変性Ｒ ＮＡをナイロン・フィルター（ゼータバインド、クーノ、メリダン、コネティカ ット）へ移した。

ＸｈｏＩ制限酵素によりベクターからｃＤＮＡＤＮＡ挿間体することによりｃＤ ＮＡプローブを作成し、ＤＮＡポリメラーゼＩの大きなフラグメントの存在下プ ライマーとしてランダムなオリゴヌクレオチドを用いて３１ｐにより挿入体を標 識した［Ａ、Ｐ、ファインバー、グ等、「アナリティカル・バイオケミストリー Ｊ、１３２：６−１３（１９８３）］。ナイロン・フィルターを４３℃で４時間 プレハイブリダイゼーションし、４３℃で１６時間５ｘＳＳＣ，０，５％ＳＤＳ 。

５×デンハーツ溶液および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精液ＤＮＡから成るハイブ リダイゼーション溶液中ａｚｐ−標識ｃＤＮＡプローブとハイブリダイゼーショ ンした。

ハイブリダイゼーション後、フィルターを、室温で３０分間後洗浄溶液■（１０ ミリモル燐酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１ミリモルのＥＤＴＡおよび１ｘＳ ＳＣ）により２回および６８℃で１５分間後洗浄溶液ＩＩ（１０ミリモル燐酸ナ トリウム、０．１％ＳＤＳ、１ミリモルＥＤＴＡおよび０．２　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ ）により２回洗浄し、乾燥し、Ｘ線フィルムに適用した。

このノーザン・プロット分析は、Ｔセルライン、ＯＥＭおよびＴ細胞ハイブリド ーマライン、Ｔ−ＣＥＭＢおよびレクチン刺激ヒトＰＢＬが、ＭＩＦクローンと ハイブリダイゼーションする検出可能レベルのｍＲＮＡを容易に合成することを 示した。しかしながら、メツセンジャーは、フィルムに長く暴露したにも拘わら ず非刺激ＰＢＬから得られたＲＮＡ試料からは検出され得なかった。活性化ヒト ＰＢＬにおけるＲＮＡ転写物の存在は、ヒトＭＩＦ遺伝子が発現されること、お よびＭＩＦが活性化リンパ球の産物であることを示唆している。

実施例５ ＤＮＡ配列分析。

ｐ７−１のｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列は、Ｇ、　Ｇ、ウォングおよび ｙ、　ｃ、ヤング等（前出）の記載に従い、Ｂａ１３１ヌクレアーゼ消化により 部分的重複フラグメントの規則正しいセットを生成し、Ｍ１３ベクターへサブク ローニングすることにより決定された［Ｍ、ポンツ等、「プロシーディンゲス・ オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイ テッド・ステーブ・オブ・アメリカ」、７９：４２９８−４３０２（１９８２） 、およびＪ、メッシング等、「ジーン」、１９：２６９−２７６（１９８２）〕 。１本鎮ＤＮＡを製造し、ジデオキシヌクレオチド鎖終結方法［Ｆ、サンガー等 、「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン シーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーブ・オブ・アメリカ」、７４：５４６ ３−５４６７（１９７７）１によりヌクレオチド配列を決定した。

実施例６ 突然変異ｃＤＮＡフラグメントの生成。

暗号化領域に明確なシグナル・ペプチドが欠如しているにも拘わらず、ｐ７−１ トランスフエクシヨンＣｏＳ細胞からＭＩＦ活性を有する１２ｋｄ蛋白質が比較 的有効に分泌されることから、分子クローン化蛋白質はＭＩＦではないが、ＣＯ ８細胞による内在性ＭＩＦ発現の誘導物質であるという可能性が生じた。この可 能性を試験するため、ｐ７−１ｃＤＮＡの暗号化領域の２つの挿入性突然変異体 を次の要領で構築した。

ＭＩＦｃＤＮＡクローン、ｐ７−１は単−Ｐ　ｓｔＩ部位を含むが、挿入体に近 接するアダプターにおけるＰｓｔＩ部位によって、この部位はＭＩＦｃＤＮＡの 突然変異分析に不適当なものとなった。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによりＰｓｔＩ を伴うプラスミドの部分消化後に単離されるｐ７−１挿入体を処理し、次に生成 したフラッシュ末端へＥｃｏＲＩアダプターをライゲーションすることにより、 ２つの近接するＰｓｔ１部位を除去した。この適合したフラグメントを、Ｐｓｔ １部位をもたないｐＸＭＴ４と命名されたｐＸＭの誘導体の唯一のＥｃｏＲＩ部 位へサブクローニングした。正確な配向でｃＤＮＡを伴うクローン、ｐ７−１− ２４を、突然変異分析用に選択した。

ＭＩＦの２つの挿入性突然変異体を構築した。ｐ７−１−２４の唯一のＰｓｔ１ 部位に１４塩基オリゴデオキシヌクレオチド、５’　ＴＧＴＡＡＴＴＡＣＡＴＧ ＣＡ　３’を挿入することにより、第１突然変異体（ｐ７−１−２４Ｂ２）を生 成した。この配列は、ＭＩＦ暗号化領域が、挿入配向とは関係無く終止コドン（ ＴＡＡ）により中断されるように設計された。

９９塩基オリゴデオキシヌクレオチドをｐ７−１−２４のＰｓｔＩ部位へ挿入す ることにより、第２挿入性突然変異体（ｐ７−１−２４２３２）を構築した。こ の配列は、ｐ７−１−２４のＰｓｔＩ部位へいずれかの方向で挿入されたときに 、３３個のアミノ酸をＭＩＦ暗号化領域へ加えるように設計された。

１４塩基オリゴヌクレオチドまたは９９塩基オリゴヌクレオチドを含むクローン は、プローブとして＄２ｐ−標識１４塩基オリゴマーまたは９９塩基オリゴマー を用いたハイブリダイゼーションにより同定された。これらのプラスミドの各々 を、最初のｐ７−１プラスミドにより観察された１２ｋｄ蛋白質の分泌およびＣ Ｏ８細胞へトランスフェクションしたときのＭＩＦ活性の誘導能力について試験 した。

ＭＩＦの切頭形態（ｐ７−１−２４Ｂ２）によりトランスフェクションされたＣ Ｏ８細胞から得られた上清からは、１２ｋｄ蛋白質もＭＩＦ活性も検出されなか った。また、伸長した暗号化領域を有する突然変異体（ｐ７−１−２４２３２） によりＣＯＳ細胞をトランスフェクションしても、検出可能レベルのＭＩＦ活性 または１２ｋｄ蛋白質は得られなかった。しかしながら、ＣＯ８細胞上清は、挿 入性突然変異体ｐ７−１−２４２３２の伸長した暗号化領域の予想されたサイズ と一致する、約１５５００の見かけ上の分子量を有する新しい種類を含むことが 見出された。

これらの実験は、ｐ７−１−トランスフェクションＣＯ８細胞から誘導された１ ２ｋｄ蛋白質群がｐ７−１プラスミドのｃＤＮＡ挿入体により直接コードされる こと、およびこの蛋白質がＭＩＦ活性を有することを示した。

実施例７ ＭＩＦ生物活性。

Ａ、ＭＩＦ検定 先に記載した方法［Ｗ、Ｙ、　ワイザー等、前出、およびＪ、Ｔ、バリントン等 、「ジャーナル・オブ・イムノロジーＪ、１１０ニア５２（１９７３）］に従い 、アガロース飛沫検定システムにおけるインジケーター細胞としてヒト末梢血単 核白血球を用いてＭＩＦ検定を遂行した。

フィコルーハイバーク遠心分離により得られたヒト末梢血単核白血球を、緩衝塩 溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄し、最少必須培地（ＭＥＭ）中０．２％アガロース と混合した。アガロース混合物中１マイクロリツトルの細胞を、５０μｍ反復デ ィスペンサー（ハミルトン・カンパニー、レノ、ネバダ）を用いてマイクロタイ ター・ウェルの中心へ分配した。試験すべき試料を１ウエル当たり１００μｍの 割合でウェルに加えた。各アガロース飛沫のサイズを測定した。３７℃で一夜イ ンキュベーション後、もとのアガロース飛沫を含む全遊走領域を再び測定した。

遊走＝（全領域の直径／アガロース飛沫の直径）２−１という式により遊走領域 を計算した。各試料の阻止のパーセンテージ（１％）を次の要領で誘導した。Ｉ ％＝１００−（試験試料の平均遊走／対照試料の平均遊走）Ｘ　１００゜２０％ またはそれより大きい阻止は、有意であると考えられた［Ｗ、Ｙ、ワイザー等、 前出コ。

Ｂ、マクロファージＩＬ−１βおよびＨＬＡ−ＤＲ遺伝子発現のＭＩＦ促進性。

単離された単核白血球の７日培養により得られた単核白血球誘導マクロファージ を、６または２４時間本発明の組紐換えＭＩＦまたは模擬トランスフェクション 細胞からの上清とインキュベーションした。これらの細胞から得られた全ＲＮＡ を、チャーブウィン等、「バイオケミストリー」、１８：５２９４（１９７４） の方法に従い抽出し、２．２モルのホルムアルデヒドを含む１．２％アガロース ・ゲルによる電気泳動によりサイズ分画した。ＲＮＡをナイロン・フィルターへ 移した。ＩＬ−１−ベータおよびＨＬＡ−ＤＲのｃＤＮＡ挿入体をそれらの各ベ クターから開裂し、単離し、ランダム・ブライミング［ファインバーブ等、「ア ナリティカル・バイオケミストリー」、１３２：６（１９８３）コにより３！Ｐ で放射性標識し、フィルターとハイブリダイゼーションさせた。

模擬上清ではな（ｒＭＩＦ上清は、ＩＬ−１−ベーターＲＮＡ発現を誘導した。

この発明のｒＭＩＦはＨＬＡ−ＤＲｍＲＮＡの迅速で持続性の高い増加を誘導し たが、模擬上清とインキュベーションされたマクロファージはＨＬＡ−ＤＲ■Ｒ ＮＡのレベル上昇を全く示さなかった。

Ｃ０過酸化水素放出に対するヒトマクロファージの活性化。

過酸化水素放出能力は、反応性酸素中間体がそれらの抗菌機能において深く関与 しているため、マクロファージ活性化の密接な生化学的相関現象である［例、ネ ーサン、Ｔｒａｎｓ、　Ｒ，Ｓｏｃ、　Ｔｒｏｐ、　Ｍｅｄ、　Ｈｙｇ、、７７ ：６２０（１９８３）参照コ。過酸化水素に関するｒＭＩＦのマクロファージ活 性化能力を次の要領で測定した。

ヒト単核白血球誘導マクロファージを、この発明の２〜１０００倍希釈ｒＭＩＦ 上清または模擬上清を含む培地中で約４８時間インキュベーションした。ＰＭＡ により誘発された、これらの細胞からの過酸化水素放出を、西洋わさびペルオキ シダーゼの存在下スコポレチンの酸化により測定した。

模擬上清ではな（，２，２０および５０倍希釈ｒＭＩＦ上清とインキュベーショ ンされたマクロファージは、過酸化水素の２〜３゜６倍高い放出を示した。

Ｄ、マクロファージによるレイシュマニア・ドノバー二致死のＭＩＦ活性化。

この発明のｒＭＩＦが、酸素依存性致死機構に対して感受性を示すことが知られ ている［ムレイ等、「ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション 」、７２：３２（１９８３）］細胞内寄生物レイシュマニア・ドノバー二の致死 を誘導し得るか否かを測定するため、下記検定を行った。

単核白血球誘導マクロファージを、約４８時間ｒＭＩＦ上清とインキュベーショ ンした。１０：１の寄生物対細胞比でレイシュマニア・ドノバー二のプロマステ ィボート（ｐｒｏｍａｓｔｉｇｏｔｅ）をインキュベーションした細胞へ加えた 。感染の２．２４．４８および７２時間後における細胞内寄生物の数／１００マ クロファージを、カバーグラスの染色したプレパラートで数えた。

この発明のｒＭＩＦにより処理した細胞の抗レイシュマニア能力における約２２ ％を越える増加が観察された。ｒＭＩＦをインターフェロン・ガンマと合わせた 平行実験は、この寄生物の致死力を高めることが予想される。

実施例８ 組換えヒトＭＩＦの発現。

ＭＩＦを製造するため、それをコードするｃＤＮＡを適当な発現ベクターへ導入 した。それらの多様なタイプは、標準分子生物技術によるは乳類、昆虫、酵母、 真菌および細菌発現に関して当業界では周知である。は乳類細胞の場合の上記の 一ベクターはｐＸＭ［Ｙ。

Ｃ，ヤング等、「セル」、４７：３−１０（１９８３）］である。このベクター は、は乳類細胞において所望のｃＤＮＡの高レベルの発現を指令するのに適した 関係で、ＳＶ４０複製開始点およびエンハンサ−、アデノウィルス主後期プロモ ーター、アデノウィルス・トリパータイト（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配 列のｃＤＮＡコピー、小ハイブリッド介在配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナ ルおよびアデノウィルスＶＡ　Ｉ遺伝子を含む［例、カウフマン、「プロシーデ ィンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ ザ・ユナイテッド・ステーブ・オブ・アメリカ」、８２：６８９−６９３（１９ ８５）参照］。ｐＸＭベクターをエンドヌクレアーゼ酵素ＸｈｏＩにより線形化 し、続いて、Ｘｈｏｌ相補的末端を生成する合成オリゴヌクレオチド［コラボレ イティブ・リサーチ、レキシンシン、メリーラントコの付加により予め修飾され たＭＩＦをコードするｃＤＮＡへ等モル量で別々にライゲーションすることによ り、発現用の構築物を生成する。これらの構築物は、適当なベクターにより様々 な宿主で発現され得る。

ａ、は乳類細胞による発現。

下記検定で使用されるＭＩＦ蛋白質の発現を達成するため、ＭＩＦに関するｃＤ ＮＡを含むｐＸＭ構築物を、実施例５の記載に従い、ＣｏＳ細胞へトランスフェ クションする。トランスフェクションされたＣＯ８細胞からの条件培地は、ＭＩ Ｆ検定で測定された通りＭＩＦ生物活性を含む。

ここに記載されているは乳類細胞発現ベクターは、この業界の熟練者によく知ら れた技術により合成され得る。ベクターの成分、例えばレプリコン、選択遺伝子 、エンハンサ−、プロモーターなどは、公知技術により天然供給源または合成的 に得られる。カウフマン等、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー Ｊ、１５９：５１１−５２１（１９８２）、およびカウフマン、「プロシーディ ンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ ・ユナイテッド・ステーブ・オブ・アメリカＪ、８２：６８９−６９３（１９８ ５）参照。典型的なは乳類宿主細胞には、形質転換セルラインを含め、特に霊長 類セルラインおよびネズミ・セルラインがある。正常ディプロイド細胞、−次組 縁のインビトロ培養から誘導された細胞株および一部エクスプラントもまた適当 である。選択遺伝子が顕著に作用している場合、候補細胞は選択遺伝子において 遺伝子型的に不完全である必要はない。ともに常法によって、ベクターＤＮＡを 安定した状態で組み込み、続いて組み込まれたベクターＤＮＡを増幅させるため 、ＣＨＯ細胞が使用され得る。別法として、ベクターＤＮＡは、ウシ・パピロー マウィルス・ゲノム［ラスキー等、「セル」、３６：３９１−４０１（１９８４ ）コの全部または一部を含み、安定したエピソーム要素としてセルライン、例え ばＣ１２７マウス細胞に担われ得る。他の適当なは乳類セルラインには、ヒーラ 、ＣＯ３−１サル細胞、マウスＬ−９２９細胞、スイスＢａ１ｂ−ｃまたはＮＩ Ｈマウスから誘導された３Ｔ３ライン、ＢＨＫまたはＨａＫハムスター・セルラ インがあるが、これらに限定されるわけではない。

次に、安定した形質転換体を、標準的な免疫学的、生物学的または酵素的検定法 により生成物の発現についてスクリーニングする。

ＭＩＦポリペプチドをコードするＤＮＡおよびｍＲＮＡの存在は、標準的方法、 例えばサザーン・プロッティングおよびＲＮＡブロッティングにより検出され得 る。適当な宿主細胞、例えばＣＯ３−１サル細胞へ発現ベクターＤＮＡを導入し た後、数日間中におけるポリペプチドをコードするＤＮＡの一時的発現を、培養 培地における蛋白質の活性または免疫検定法による選択を行わずに測定する。

また、当業界の熟練者であれば、例えば適当な酵素によりプラスミドからＭＩＦ のＤＮＡ配列を挿入し、よ（知られた組換え遺伝子工学技術および他の公知ベク ター、例えばｐＪＬ３およびｐＪＬ４［ガフ等、ｒＥＭＢ○ジャーナル」、４： ６４５−６５３（１９８５）コおよびｐＭＴ２（ｐＭＴ２−ＶＷＦＩ：より出発 、ＡＴＣＣ＄６７１２２、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ８７１０００３３参照）を使 用することにより、ｐＸＭベクターに匹敵する他のは乳類発現ベクターを構築す ることができる。ＭＩＦを伴うベクターにより適当な宿主細胞を形質転換すると 、ＭＩＦポリペプチドが発現され得る。

ｂ、細菌発現システム 同様に、当業界の熟練者であれば、暗号化配列に近接するは乳類調節配列を排除 し、細菌調節配列を挿入することにより、ＭＩＦをコードする配列を操作して、 細菌細胞による本発明のＭｒＦの細胞内または細胞外発現用細菌性ベクターを作 成することができる。さらに、ＭＩＦをコードするＤＮＡは、当業界で知られて いる通り、細菌発現を最適化する異なるコドンを含むように修飾され得る。好ま しくは、成熟ＭＩＦをコードする配列は、同じく当業界で周知の方法により、成 熟ＭＩＦポリペプチドの細菌発現、分泌およびプロセシングを可能にする分泌誘 導性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列へ機能し得るように枠内結合さ れる。上記分泌システムを用いたエシェリヒア・コリにおけるＭＩＦの発現の結 果、活性ポリペプチドの分泌が予想される。

次いで、細菌宿主細胞においていずれかの経路で発現された化合物は、全て既知 方法により、採取、精製および／または物理化学的、生化学的および／または臨 床的パラメーターに関して特性検定され得る。

Ｃ０昆虫または酵母細胞による発現 同様の操作を行うことにより、昆虫細胞におけるＭＩＦポリペプチド発現用の昆 虫ベクターが構築され得る［例、公開されたヨーロッパ特許出願１５５４７６で 報告された方法参照］。ＭＩＦｃＤＮＡは昆虫細胞において発現される。

酵母調節配列を用いて同様の酵母ベクターを構築することにより、酵母細胞にお いてＭＩＦをコードするｃＤＮＡが発現され、細胞外活性ＭＩＦが分泌される。

［例えば、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ３６１０Ｏ６３９およびヨーロッパ特許出 願ＥＰ１２３２８９に記載された方法参照］。

実施例９ 高レベルのＭＩＦを発現するＣＨＯセルラインの構築。

は乳類細胞から高レベルの本発明ＭＩＦ蛋白質を製造する一方法では、ＭＩＦを コードするｃＤＮＡの多数のコピーを含む細胞を構築する。

カウフマンおよびシャープ、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー Ｊ（１９８２）（前出）の方法に従い、ｃＤＮＡを、増幅可能なマーカー、例え ば増加濃度のメトトレキセート（ＭＴＸ）を含む細胞に対するＤＨＦＲ遺伝子と コ（同時）トランスフェクションする。

この方法は、若干の異なる細胞タイプにより使用され得る。

例えば、発現を可能にする他のプラスミド配列を機能し得る形で随伴したＭＩＦ 遺伝子を含むｐＸＭベクターを、燐酸カルシウム同時沈澱およびトランスフェク ションによりＤＨＦＲ発現プラスミド、例えばｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ３［カウフ マン、「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ エンシーズ」、８２：６８９−６９３（１９８５）コトー緒ニ、ＤＨＦＲ欠失Ｃ ＨＯ細胞、ＤＵＫＸ−ＢＩ　１へ導入する。ＤＨＦＲＨＦ性形質転換体は、透析 した胎児ウシ血清を含むアルファ培地での成長に関して選択される。

生物検定法、免疫検定法またはＲＮＡプロッティングにより、形質転換体をＭＩ Ｆの発現についてチェックし、続いて、カウフマン等、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂ ｉｏｌ、、５：１７５０（１９８３）の記載に従い、増加濃度のＭＴＸ（０，０ ２，０，２，１，０および５マイクロモルのＭＴＸにおける連続段階）における 成長による増幅について陽性プールを選択する。増幅されたラインをクローン化 し、ＭＩＦ蛋白質発現をＭＩＦ検定法によりモニターする。ＭＩＦ発現は、ＭＴ Ｘ耐性のレベル増加に伴い増加すると予想される。

上記発現システムのいずれかにおいて、生成されたセルラインは、適当な薬剤選 択によりさらに増幅され、生成されたセルラインを再クローン化し、この明細書 に記載されたＭＩＦ検定法を用いて発現レベルが評価され得る。

本発明の多様な修飾および変形も本願明細書に包含され、当業界の一熟練者にと って明白であることが予想される。本発明の組成物および方法に対する上記修飾 および変更は、後記請求の範囲に包含されるものと考えられる。

国際調査報告 一一向−＾−”””””　ＰＣＴ／ｌｌｓ　９０１０１３５５Ｓ＾　３５３８４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）実質的に他の蛋白質様物質の随伴がないヒトマクロファージ遊走阻止因子 蛋白質。 （２）下記アミノ酸配列： 【配列があります】 またはそのフラグメントと同一または実質的に同一のアミノ酸配列の全部または 一部分を含む、請求項１記載の蛋白質。 （３）下記ＤＮＡ配列： 【配列があります】 と同一または実質的に同一のＤＮＡ、そのフラグメントまたはそこにハイブリダ イゼーションし得るＤＮＡの全部または一部分によりコードされる、請求項１記 載の蛋白質。 （４）下記特徴： （１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける還元条件下での見かけ上の分子量が約１２ｋｄ 、 （２）２０％より高い阻止率を示すＭＩＦ生物検定法における生物活性、 （３）マクロファージにおけるＩＬ−１ベータおよびＨＬＡ−ＤＲ遺伝子発現の 増強における生物活性、 （４）レイシュマニア・ドノバーニのマクロファージ致死作用の活性化における 生物活性 の一つまたはそれ以上を有する、請求項１記載の蛋白質。 （５）発現制御配列を機能し得る形で随伴したＭＩＦの発現をコードするＤＮＡ 配列により形質転換されたセルラインを培養することにより製造される、請求項 １記載の蛋白質。 （６）発現制御配列を機能し得る形で随伴したＭＩＦの発現をコードするＤＮＡ 配列またはそのフラグメントにより形質転換されたセルラインを培養することを 含む、ＭＩＦまたはそのフラグメントの製造方法。 （７）下記配列： 【配列があります】 と同一または実質的に同一のヌクレオチド塩基の配列、そのフラグメントまたは そこにハイブリダイゼーションし得るＤＮＡ配列を含む、ＭＩＦをコードするＤ ＮＡ配列。 （８）発現制御配列を機能し得る形で随伴した請求項７記載のＤＮＡ配列により 形質転換された細胞。 （９）ほ乳類または細菌細胞を含む、請求項８記載の細胞。 （１０）２０％を越える阻止率のＭＩＦ検定法での生物活性を有する均質ＭＩＦ 。 （１１）医薬的に有効な賦形剤中にＭＩＦまたはその生物活性フラグメントの治 療有効量を含む医薬組成物。 （１２）さらに、追加的なサイトカイン、ヘマトポエチン、成長因子または腫よ う活性化抗体の治療有効量を含む、請求項１１記載の組成物。 （１３）サイトカインが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６ 、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、インターフェロン、エリトロポエチ ンから成る群から選択される、請求項１２記載の組成物。 （１４）追加的サイトカインがＩＦＮ−ガンマ、Ｍ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ である、請求項１３記載の組成物。 （１５）請求項７記載のＤＮＡ配列を含むプラスミド・ベクター。 （１６）患者に有効量のＭＩＦまたはそのフラグメントを投与することを含む、 癌の処置方法。 （１７）患者に有効量のＭＩＦまたはそのフラグメントを投与することを含む、 感染症の処置方法。 （１８）患者に有効量のＭＩＦまたはそのフラグメントを投与することを含む、 創傷治癒の促進方法。 （１９）患者に有効量のＭＩＦまたはそのフラグメントを投与することを含む、 免疫系の刺激方法。 （２０）ワクチンをＭＩＦを含む治療用組成物の後または同時に投与することを 含む、ワクチンの有効性を高める方法。 （２１）さらに、少なくとも１種のヘマトポエチン、サイトカイン、成長因子ま たは抗体の有効量をＭＩＦと同時または後続的に投与することを含む、請求項１ ９記載の方法。 （２２）サイトカインがＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＦＮ−ガンマである 、請求項２１記載の方法。