DE10154579A1

DE10154579A1 - Topikale Verwendung von Cytokinen und Chemokinen zur Behandlung von viralen oder mykotischen Hauterkrankungen oder Tumorerkrankungen

Info

Publication number: DE10154579A1
Application number: DE10154579A
Authority: DE
Inventors: John Nieland; Christoph Rehfues
Original assignee: Medigene AG
Current assignee: Medigene AG
Priority date: 2001-11-07
Filing date: 2001-11-07
Publication date: 2003-05-28
Also published as: WO2003039444A2; WO2003039444A3; WO2003039444B1; CA2474196A1; JP2005512989A; US20050008614A1; EP1441755A2

Abstract

Ein Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung mindestens eines Cytokines und/oder Chemokines zur Herstellung eines topikal wirkenden Arzneimittels zur Behandlung von viralen und/oder mykotischen Hauterkrankungen und/oder Tumorerkrankungen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die topikale Verwendung mindestens eines Cytokins und/oder Chemokins zur Behandlung von viralen und/oder mykotischen Hauterkrankungen und/oder Tumorerkrankungen sowie eine topikal wirkende Arzneimittelformulierung und ihre Herstellung.
Das Cytokin Granulozyten-Makrophagen-stimulierender Faktor (GM-CSF) wurde ursprünglich als Faktor isoliert, der das Wachstum von Makrophagen bzw. Granulozyten-enthaltenden Kolonien stimulierte. GM-CSF ist notwendig für das Wachstum und die Entwicklung von der Vorläuferzellen von Granulozyten und Makrophagen. Es stimuliert Myeloblasten und Monoblasten und initiiert die irreversible Differenzierung dieser Zellen. Es unterstützt Erythropoietin (EPO) bei der Proliferation von Vorläuferzellen der Erythozyten und Megakaryozyten. Ferner ist GM-CSF in der Lage, Neutrophile anzulocken. Es verstärkt antimikrobielle Aktivitäten, oxidativen Metabolismus und phagozytotische Aktivität von Neutrophilen und Makrophagen. Es verstärkt ebenso die Zytotoxizität dieser Zellen. Da GM-CSF durch Zellen (T-Lymphozyten, Makrophagen im Gewebe, endotheliale Zellen, Mastzellen) produziert wird, die an Orten von entzündlichen Reaktionen präsent sind, ist davon auszugehen, dass GM-CSF ein wichtiger Mediator von entzündlichen Reaktionen ist.
Ebenso ist die Funktion der Langerhans-Zellen der Haut durch GM-CSF beeinflusst. Diese Zellen sind nicht in der Lage, eine primäre Immunreaktion auszulösen. Gemeinsam mit IL4 werden sie jedoch durch GM-CSF in hochwirksame immunstimulatorische dendritische Zellen umgewandelt.
GM-CSF wirkt synergistisch mit anderen Cytokinen, einschließlich den Interleukinen IL1, IL3, IL4 und Granulozyten-stimulierender Faktor (G-CSF).
Klinisch wird GM-CSF eingesetzt zur physiologischen Rekonstituion der Hämatopoese für alle Krankheiten die einhergehen mit einer unzureichenden Reifung von Blutzellen oder mit einer verringerten Produktion von Leukozyten. Die wohl bedeutendste klinische Anwendung findet GM-CSF bei der Behandlung der lebensbedrohlichen Neutropenie nach Chemo- und/oder Strahlentherapie. GM-CSF kann ebenfalls eingesetzt werden, um Chemotherapie-induzierte Cytopenien und Cytopenie-abhängige Prädispositionen für Infektionserkrankungen und Hämorrhagien zu behandeln. In solchen Fällen wird GM-CSF gewöhnlich in einer Dosierung von 5 bis 10 µg/kg/Tag entweder durch 4 bis 6-stündige intravenöse Infusion oder durch subkutane Injektion verabreicht.
Ferner wird GM-CSF bei zur Rekonstituierung des hämatopoetischen Systems nach autologen oder allogene Knochenmarkstransplantationen eingesetzt. Der therapeutische Effekt beruht hier nicht nur auf einer Verkürzung des Zeitraums einer absoluten Neutropenie, sondern ebenfalls auf signifikant weniger Infektionen, geringer intravenöser Antibiotika-Gabe und einer kürzen Hospitalisierung der Patienten.
Cytokine wie GM-CSF oder IL2, IL12, IL18, sowie die Interferone IFNγ und IFNα werden derzeit in verschiedenen Indikationen auf den Gebieten von Tumorerkrankungen eingesetzt bzw. getestet. So wird GM-CSF verschiedentlich zur Stimulation des Immunsystems in Kombination mit Antigenen verwendet, beispielsweise in Form einer GM-CSF-exprimierenden Tumorzelle oder in Form einer vorherigen oder gleichzeitigen Gabe von peptidischen Antigenen, z. B. von Tumorantigenen abgeleitet. Diesen Therapieformen liegt zugrunde, dass GM-CSF als eine Art Adjuvans für ein parallel verabreichtes Antigen fungiert (Lawson D, Kirkwood JM (2000) Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: another cytokine with adjuvant therapeutic benefit in melanoma? J Clin Oncol 18(8): 1603-5).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es folglich, weitere Anwendungen für Cytokine zu finden.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass die topikale Anwendung von Cytokinen und/oder Chemokinen, wie beispielsweise GM-CSF, dazu geeignet ist, virale und/oder mykotische Hauterkrankungen sowie Tumorerkrankungen zu behandeln.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit die Verwendung von mindestens einem Cytokin und/oder Chemokin zur Herstellung eines topikalen Arzneimittels zur Behandlung von viralen und/oder mykotischen Hauterkrankungen und/oder Tumorerkrankungen.
Aufgrund der beobachteten synergistischen Effekte zwischen unterschiedlichen Cytokinen und/oder Chemokinen ist es besonders vorteilhaft, wenn zwei, drei oder auch mehr als drei Cytokine und/oder Chemokine gleichzeitig oder zeitlich gestaffelt verarbeitet werden, wobei insbesondere drei, vor allem zwei Cytokine und/oder Chemokine verwendet werden. Besonders bevorzugte Kombinationen sind GM-CSF, RANTES oder MIP1α mit IL4, IL2, IL12; IFNγ oder TNFα.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält das Arzneimittel keine im wesentlichen antigen-wirkenden Bestandteile, wie zum Beispiel Tumorantigene oder virale Antigene. Als antigen-wirkende Bestandteile werden Antigene oder Teile davon verstanden, die im Patienten eine Immunantwort auslösen können. Unter dem Begriff "im wesentlichen keine antigen-wirkenden Bestandteile" versteht man im Sinne der vorliegenden Erfindung so wenig antigenwirkende Bestandteile, dass eine die Behandlung gefährdende Immunreaktion des Patienten im allgemeinen ausgeschlossen werden kann.
Unter den Begriff Cytokine fällt beispielsweise GM-CSF, G-CSF, IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL21, IL22, IFNα, IFNβ, IFNγ, Flt3 L, Flt3 sowie TNFα. Ein besonders bevorzugtes Cytokin ist GM-CSF. Unter den Begriff Chemokine fällt beispielsweise RANTES, MIP1α, MIP1β, MIP1γ, MIP1δ, MIP2, MIP2α, MIP2β, MIP3α, MIP3β, MIP4, MIP5, MCP1, MCP1β, MCP2, MCP3, MCP4, MCP5, MCP6, 6cykine, Dcck1 sowie DCDF. Besonders bevorzugte Chemokine sind GM-CSF, RANTES sowie MIP1α. (Zu den Cytokinen und Chemokinen: Cytokines Online Patrifinder Encyclopedia, Horst Ibelgaufis' Hypertext Information Universe of Cytokines, Version 4.0, August 1999; Website: http:/ / www.copewithcytokines.de/cope.cgi). Ferner werden im Rahmen dieser Erfindung mutierte Varianten dieser Cytokine und Chemokine sowie Fusionsproteine dieser Cytokine und Chemokine verstanden. Diese umfassen beispielsweise Punktmutationen, Insertionen, Deletionen sowie Fusionen mit anderen Polypeptiden, beispielsweise mit sogenannten Tags, beispielsweise His-Tag, GST-Tag, Myc-Tag, GFP-Tag, oder Fusionen mit funktionellen Domänen anderer Polypeptide, beispielsweise mit Domänen von Immunglobulinen, anderen Cytokinen oder Chemokinen.
Unter topischer Anwendung wird das äußerliche Auftragen des Wirkstoffes auf die Haut verstanden. Vorzugsweise liegt der Wirkstoff in Form einer Salbe, eines Gels, eines Pflasters oder einer anderen hautverträglichen Formulierung vor. Vorzugsweise wird der Wirkstoff lokal in dem Bereich appliziert, in dem eine Hautveränderung und/oder -erkrankung vorliegt.
Unter viralen Hauterkrankungen werden Hauterkrankungen verstanden, die von Viren ausgelöst bzw. verursacht und/oder mit Virusinfektionen assoziiert sind. Hierzu zählen beispielsweise Hauterkrankungen wie zum Beispiel Hautwarzen, genitale Warzen, anogenitale Warzen oder Schleimhautwarzen (siehe Tabelle 1), die von mindestens einem Papilloma Virus, insbesondere humanen Papilloma Virus, wie zum Beispiel HPV1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 31, 32, 34, 36, 37, 38, 46, 47, 48, 49, 50, 56 und 58 ausgelöst werden. Des weiteren zählen hierzu Erkrankungen, die durch mindestens ein Herpes Virus, insbesondere durch Herpes Simplex Virus 1, Herpes Simplex Virus 2, Humanes Herpes Virus (HHV) 1, HHV2, HHV3, HHV4, HHV7, HHV8 sowie Varicella Zoster, also Lippenherpes, Kaposi-Sarcom, Windpocken und/oder Gürtelrose, ausgelöst werden. Tabelle 1
Tumorerkrankungen, die mittels topikaler Application von beispielsweie GM-CSF behandelt werden können, sind Tumoren der Haut, beispielsweise Melanom oder akute Keratinosis, Neoplasien des Genital- und Analtraktes, wie zum Beispiel Cervical Intraepithelial Neoplasien, Anal Intraepithelial Neoplasien oder Penile Intraepithelial Neoplasien (siehe auch Tabelle 2). Tabelle 2
Unter mykotischen Hauterkrankungen werden Hauterkrankungen verstanden, die durch Pilzinfektionen hervorgerufen werden. Diese umfassen Erkrankungen der Haut, der Hautanhangsgebilde wie auch der Schleimhäute einschließlich der äußeren und inneren Genitale. Hierunter werden vor allem Dermatomykosen (siehe Tabelle 3) sowie andere Mykosen, die mykotische Hauterkrankungen verursachen können, verstanden (siehe Tabelle 4 und Tabelle 5). Tabelle 3

Tabelle 4

Tabelle 5
Das Arzneimittel wird gemäß der vorliegenden Erfindung im allgemeinen dadurch hergestellt, dass mindestens ein Cytokin und/oder Chemokin mit mindestens einem geeigneten Zusatz- und/oder Hilfsstoff in Kontakt gebracht wird, beispielsweise durch vermischen oder auflösen. Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch ein Verfahren zur Herstellung eines topikal wirkenden Arzneimittels bei dem mindestens ein Cytokin und/oder Chemokin mit mindestens einem Hilfsstoff, insbesondere mit humanem Serumalbumin, CpG oder oxidiertem Glutathion, in Kontakt gebracht wird. Das Cytokin und/oder Chemokin wird vorzugsweise gentechnisch, nach dem Fachmann bekannten Verfahren, hergestellt.
So kann beispielsweise ein entsprechendes Expressionskonstrukt für die gentechnische Herstellung des Cytokins und/oder Chemokins verwendet werden, enthaltend eine für das Cytokin und/oder Chemokin kodierende Nukleinsäure sowie einen geeigneten Promotor für die Expression in vorzugsweise Bakterien, z. B. E. coli, oder in eukaryotischen Zellen, wie zum Beispiel in Hefen, z. B. S. cerevisiae oder S. pombe oder Pichia pastoris, oder in höheren eukaryotischen Zellen, wie zum Beispiel in Insektenzellen oder humanen Zellen. Anschließend kann das Cytokin und/oder Chemokin unter nativen oder nicht-nativen Bedingung nach dem Fachmann bekannten Methoden gereinigt werden.
Geeignete Hilfsstoffe sind dem Fachmann bekannte Stoffe, die beispielsweise die Stabilität, das Lösungsverhalten oder die Wirkung des eigentlichen Wirkstoffs steigern. Hier sind beispielsweise ionische oder anionische Detergentien, wie z. B. Triton-X-100, Tween, Natriumdesoxycholat, aber auch Polyole, wie z. B. Polyethylenglykol oder Glycerin, Zucker, wie z. B. Saccarose oder Glukose, Lipide oder Lipopolysaccharide, zwitterionische Verbindungen, wie z. B. Aminosäuren wie Glycin oder insbesondere Taurin oder Betain und/oder ein Protein, wie z. B. bovines oder humanes Serumalbumin, Protease-Inhibitoren/Konservierungsmittel wie z. B. Aprotinin, ε-Aminocapronsäure, Pepstation A, EDTA oder EGTA zu nennen. Weitere geeignete Hilfsstoffe sind bekannte Adjuvantien, kurze DNA- ähnliche Sequenzen, enthaltend Cytosin-Guanin-Dinukleotide (CpG) oder oxidiertes Glutathion. Besonders bevorzugt sind humanes Serumalbumin, CpG und oxidiertes Glutathion.
Bevorzugt als Hilfsstoffe sind ferner Substanzen, die eine lokale Hautreizung bewirken, da dadurch die Wirkung von Cytokinen und/oder Chemokinen gesteigert wird. Hierzu zählt zum Beispiel DMSO.
Das Arzneimittel kann gemäß der vorliegenden Erfindung auch als Formulierung, enthaltend mindestens ein Cytokin und/oder Chemokin und eine Puffer- oder Salzlösung und/oder eine Salbengrundlage sowie gegebenenfalls mindestens einen geeigneten Zusatz- und/oder Hilfsstoff vorliegen.
Unter dem Begriff Formulierung versteht man eine Zusammensetzung in Form einer Lösung oder einer Suspension der genannten Cytokine und/oder Chemokine, wobei es sich dabei um eine im wesentlichen homogene Formulierung handelt, bei der auch bei längerer Lagerung bei ca. 4°C keine Sedimentation von Inhaltsstoffen beobachtet werden kann.
Besonders bevorzugt ist eine Formulierung, bei der das bzw. die enthaltene(n) Cytokin(e) und/oder Chemokin(e) nativ bzw. aktiv bleibt. Die Aktivität der Proteine ist für jedes einzelne Protein in einem entsprechenden Aktivitätstest nachweisbar.
Das Salz als beispielhafter Bestandteil einer Formulierung ist im allgemeinen ein Alkali- oder Erdalkalisalz, vorzugsweise ein Halogenid oder Phosphat, insbesondere ein Alkalihalogenid, vor allem NaCl und/oder KCl. Die Verwendung von NaCl ist besonders bevorzugt.
Der pH-Wert der Formulierung wird im allgemeinen mit einem geeigneten organischen oder anorganischen Puffer eingestellt, wie z. B. vorzugsweise mit einem Phosphat-Puffer, Tris-Puffer (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan), HEPES-Puffer ([4-(2-Hydroxyethyl)-piperazino]-ethansulfonsäure) oder MOPS-Puffer (3- Morpholino-1-propansulfonsäure). Die Auswahl des jeweiligen Puffers richtet sich im allgemeinen nach der gewünschten Puffermolarität.
Geeignete Salbengrundlagen sind zum Beispiel Wasser-in-Öl-Salben, beispielsweise eine Wollwachsalkoholsalbe, bestehend aus Cetylstearylalkohol, Wollwachsalkohol und Vaseline oder Öl-in-Wasser-Salben (hydrophile Salben), beispielsweise bestehend aus emulgierendem Cetylstearylalkohol, Paraffinöl subliquidum und Vaseline.
Besonders bevorzugt ist die Anwendung einer zuvor beschriebenen Formulierung in Verbindung mit einem Mittel für eine Occlusion, d. h. dass die nach Auftragen der Formulierung auf die Haut, Schleimhaut und Hautanhangsorgane die behandelte Stelle abgedeckt wird. Dies kann beispielsweise durch eine Wundabdeckung in Form eines Pflasters oder Sprühverbands erfolgen.
Somit ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Behandlungskit enthaltend mindestens ein Cytokin und/oder Chemokin sowie ein Occlusionsmittel.
Die Figuren und die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt die graphische Auswertung eines Hautpenetrationsexperiments von 3 GM-CSF-Formulierungen in einer Durchfluß-Diffusionszelle. Die Verteilung des aufgetragenen [¹²¹I]-GM-CSF (in % der Gesamtaktivität) in der Rezeptorfüssigkeit (Permeation), in der Haut und in den Salbenrückständen nach 36 h ist aufgetragen gegen die Formulierung.
Fig. 2 zeigt die graphische Auswertung eines Stabilitätsexperiments von den Formulierungen 43600 und 43400 im Vergleich zu GM-CSF zum Zeitpunkt 0 und nach Inkubation für 7 Tage bei 40°C, bei dem eine konstante Menge DMSO- Salbenextrakt mit ansteigenden Mengen an GM-CSF versetzt wurde (X-Achse, logarithmisch in % für Salbenextrakte enthaltend GM-CSF sowie in Units/ml für zugesetztes GM-CSF) und die Aktivierung von Monozyten an deren CD1a- Expression gemessen wurde (Y-Achse).
Fig. 3 zeigt die graphische Auswertung eines Stabilitätsexperiments der Formulierung 10101 zum Zeitpunkt 0 und nach Inkubation für 7 Tage bei 40°C, bei dem eine konstante Menge DMSO-Salbenextrakt mit ansteigenden Mengen an GM- CSF versetzt wurde (X-Achse, logarithmisch in %) und die Aktivierung von Monozyten an deren CD1α-Expression gemessen wurde (Y-Achse).

Beispiel

1 GM-CSF enthaltende Formulierungen

1. Beschreibung der Formulierungen

Es wurden folgende Formulierungsansätze mit je 100 µg/g humanem rekombinantem GM-CSF (Leucomax 400 von Sandoz AG, Basel, Schweiz) hergestellt: Tabelle 6

Herstellung der Salben

Alle Salben wurden unter aseptischen Bedingungen (Laminar flow, sterile Handschuhe, Mundschutz etc.) hergestellt.
20 g der Salbe mit der Bezeichnung 43400 wurden wie folgt hergestellt:
Zunächst wurde zur Herstellung der Wollwachsalkoholsalbe 1 g Cetylstearylalkohol, 12 g Wollwachsalkohol sowie 187 g Vaseline weiß in ein Becherglas eingewogen und bei 70°C aufgeschmolzen und unter ständigem Rühren auf Raumtemperatur abgekühlt. Es wurde Leucomax 400 in 1 g Glycerinlösung 70% gelöst (5 Gefäße a 400 µg/g = 2000 µg/5 g). 15 g Wollwachsalkoholsalbe wurden in Reibschale vorgelegt, 5 g Leucomax/Glycerin-Lösung 400 µg/g zugegeben und homogen eingerührt. Die Salbe wurde jeweils zu 1 g in Gefäße abgefüllt.
20 g der Salbe mit der Bezeichnung 43500 wurden wie folgt hergestellt:
Zunächst wurde zur Herstellung der Wollwachsalkoholsalbe 1 g Cetylstearylalkohol, 12 g Wollwachsalkohol sowie 187 g Vaseline weiß in ein Becherglas eingewogen und bei 70°C aufgeschmolzen und unter ständigem Rühren auf Raumtemperatur abgekühlt. Es wurde Leucomax 400 in 1 g Dimethylsulfoxid reinst (DMSO) gelöst (5 Gefäße a 400 µg/g = 2000 µg/5 g). 15 g Wollwachsalkoholsalbe wurde in Reibschale vorgelegt, 5 g Leucomax/DMSO-Lösung 400 µg/g zugegeben und homogen eingerührt. Die Salbe wurde jeweils zu 1 g in Gefäße abgefüllt.
20 g der Salbe mit der Bezeichnung 34600 wurden wie folgt hergestellt:
Zunächst wurden 70 g Vaseline weiß, 70 g Paraffinöl subl. und 60 g Emulgierder Cetylstearylalkohol in einem Becherglas eingewogen, bei 70°C aufgeschmolzen und anschließend bei ständigem Rühren auf Raumterperatur abgekühlt. Es wurde Leucomax 400 in 1 g Glycerinlösung 70% gelöst (5 Gefäße a 400 µg/g = 2000 µg/5 g). Von der hydrophilen Salbe wurden 15 g in eine Reibschale vorgelegt, die Leucomax/Glycerin Lösung 400 µg/g zugegeben und homogen eingerührt. Die Salbe wurde jeweils zu 1 g in Gefäße abgefüllt.
20 g der Salbe mit der Bezeichnung 10101 wurden wie folgt hergestellt:
Zunächst wurden 100 g Polyethylenglykol 300 und 100 g Polyenthylenglykol 1500 bei 60 bis 70°C unter Rühren geschmolzen und bis zum Erkalten gerührt. Es wurde Leucomax 400 in 1 g Glycerinlösung 70% gelöst (5 Gefäße a 400 µg/g = 2000 µg/5 g). Von dem Polyethylenglykolgemisch wurden 15 g in eine Reibschale vorgelegt, die Leucomax/Glycerin Lösung 400 µg/g zugegeben und homogen eingerührt. Die Salbe wurde jeweils zu 1 g in Gefäße abgefüllt.

2. Herstellung ¹²⁵I-markiertes humanes GM-CSF-enthaltender Formulierungen

¹²⁵I-markiertes humanes GM-CSF (NEN Life Sciences, Köln, Deutschland, ¹²⁵I- PACAP27, NEX294, Lot-Nummer GCB1500) wurde kalibriert. Die spezifische Aktivität betrug bei Beginn des Experiments 5,2 µCi (192,4 kBq). Das Protein wurde in lyophilisierter Form bezogen und in 70 µl aqua dest. Aufgenommen (die Aufnahme in 35 µl führte nicht zu einer homogene Lösung). Die resultierende spezifische Aktivität der Lösung betrug 0,074 µCi/µl (2,75 kBq/µl).
Ca. 260 mg der drei verschiedenen GM-CSF-Forumulierungen wurden in eine 48- Well Zellkulturschale transferriert. 15 µl ¹²⁵I-markiertes GM-CSF wurden zugegeben und bei Raumtemperatur mittels eines Spatels mit der Formulierung vermischt. Zwischen 3 und 5 mg des Gemisches wurden in ein Szintilationsgefäß transferriert und 2 ml Packard Microscint-20 wurden hinzugegeben. Die Proben wurden für mehrere Minuten auf 60°C erhitzt und erneut gemischt. Anschließend wurden sie in einem Szintillationszähler gemessen (siehe Tabelle 7). Die vermischten Formulierungen wurden in Eppendorf Reaktionsgefäße transferriert und bei 4°C gelagert.
Als Kontrolle wurden 2 µl der ¹²⁵I-GM-CSF Lösung (0,074 µCi/µl, 2,75 kBq/µl) unmittelbar in 2 ml Packard Microscint-20 gemessen. Tabelle 7
Anhand der Kontrolle ist erkennbar, dass mittels dieser Methode lediglich 23% der theoretisch zu erwartenden Aktivität messbar sind.
Diese Versuchsreihe macht deutlich, dass wässrig gelöstes GM-CSF (hier vorliegend als ¹²⁵I-markiertes GM-CSF) in alle drei Formulierungen eingebracht werden konnte. Es gelingt, ¹²⁵I-OM-CSF homogen in die beschriebenen Formulierungen einzubringen, was daran erkennbar ist, dass die Paralleanalysen der einzelnen Formulierungen lediglich geringe Abweichungen aufweisen. In den unterschiedlichen Formulierungen konnten zwischen 11,8 und 17,6% der ursprünglich theoretisch zugegebenen Menge an GM-CSF nachgewiesen werden, wobei die systembedingt maximal nachweisbare Menge bei 23% liegt.

Beispiel 2

Hautpenetration verschiedener GM-CSF Formulierungen

Die Hautpenetration verschiedener GM-CSF Formulierungen wurde anhand eines in vitro Hautpenetrationsassays gemessen (siehe zum Beispiel: Bronaugh RL et al., (1982) Toxicol Appl Pharmacol 15; 62(3): 481-488; Bronaugh RL, (2000) Ann N Y Acad Sci 919: 188-191).
Hautproben von weiblicher abdominaler Herkunft aus kosmetischen Operationen wurden verwendet. Hautscheiben (450 µm) wurde mittels eines Dermatoms präpariert, die das Stratum corneum, die Epidermis und Teil der Dermis enthielt. Es wurden Hautscheiben mit einem Durchmesser von 10 mm ausgestanzt und in einer Diffusionszelle eingesetzt. Die Hautstücke wurden zwischen Mikroskop- Objektträgern bei unter ≤ -15°C eingefroren. Die Dicke der Hautscheiben wurde zwischen den Objektträgern-Aufhängungen gemessen. Da die Membranherstellung mit einer Beschädigung der Haut einhergehen könnte, wurde die Integrität der Hautmembran mikroskopisch überprüft, bevor diese in die Diffusionszellen eingepasst wurden.
Als Diffusionszelle wurde die Diffusionszelle von BSL BIOSERVICE, Planegg, Deutschland, verwendet. Diese ist mit einem PTFE-Donor und -Akzeptor für die Durchflussdiffusion für horizontale Exposition der Hautoberfläche ausgelegt. Die Fläche der Hautexposition beträgt 19,63 mm². Die Temperatur der Diffusionszellen wurden konstant gehalten. Eine Multikanal-Peristaltikpumpe wurde mit dem Rezeptorteil der Diffusionszelle verbunden und ein programierbarer Fraktionssammler wurde für die Sammlung der Proben eingesetzt.
Die gefrorene Haut wurde mit PBS gewaschen und auf den Akzeptorteil plaziert. Die Diffusionszelle wurde mit dem Rezeptorteil geschlossen und mit entgaster Akzeptorflüssigkeit (Physiologischer Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (RT, pH 7,5 ± 0,3), ergänzt mit 0,1% BSA und 50 µg/ml Gentamycin; entgast) in horizontaler Position für mindestens 1 h equilibriert (Einstellung von Flussrate und Temperatur auf 0,6 ml/h und 32 ± 1°C). Anschließend wurde eine definierte Menge der unter Beispiel 1.2 genannten ¹²⁵I-markierten GM-CSF-Formulierungen mittels Spatels auf die Hautoberfläche aufgebracht. Die Sammlung der Akzeptorflüssigkeit wurde für 36 gestartet, wobei alle 6 h das Auffanggefäß gewechselt wurde. Am Ende der Messreihe wurde die verbliebene Salbe von der Donorseite mit einem Wattestäbchen abgewischt. Nach dem Abbau der Diffusionszelle wurde die Hautmembran erneut mit einem Wattestäbchen abgewischt und die gesamten verbliebenen, nicht penetrierten Salbenreste wurde in einem Szintillationsgefäß gesammelt.
200 µl jeder gesammelten Fraktion wurden mit 2 ml Szintillationsflüssigkeit (Microscint™20, Canberra Packard, Dreieich, Deutschland) vermischt. Die gesammelte, nicht penetrierten Salbenreste wurden mit 4 ml Szintillationsflüssigkeit vermischt und in einem Ultraschall-Wasserbad bei 60°C für mindestens 30 min inkubiert. Die exponierten Hautscheiben wurden mit 500 µl Gewebeauflöser (Solvable™, Packerd) für mindestens 3 h bei 50°C inkubiert. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurden 50 µl der aufgelösten Haut zu 4 ml Szintillationsflüssigkeit gegeben. Die Radioaktivität all dieser Proben wurde in einem Szintillationszähler gemessen (in cpm) und die Verteilung des [¹²⁵I]-GM-CSF in der Haut, ausgedrückt als Aktivität (nCi), in den nicht penetrierten Salbenresten wie auch in der Akzeptorflüssigkeit nach der Formel

Aktivität [nCi] = cpm × Verdünnungsfaktor × Quenchfaktor/60/37

bestimmt. P-Werte wurden nach dem unpaired t-test berechnet.
In dem beschriebenen Experiment konnte nachgewiesen werden, dass innerhalb von 36 h zwischen 1,4 und 3,7% des aufgetragenen [¹²⁵I]-GM-CSF durch die exponierten Hautschichten in die Akzeptorflüssigkeit durchdrangen. Dabei zeigte die Formulierung 43600 die niedrigste, 43400 hingegen die höchste Permeation. Nach Versuchsabschluß wurden in der Haut 2,6% (43400), 2,2% (43500) und 3,5% (45600) der aufgetragenen [¹²⁵I]-GM-CSF-Menge nachgewiesen. Geht man davon aus, dass sowohl das in der Haut als auch das durch die Haut hindurchgewanderte GM-CSF therapeutisch wirksam ist, so sind für die Formulierung 43400 > 6%, für 43500 < 5% und für 43600 < 4% des aufgetragenen GM-CSF wirksam.

Beispiel 3

Stabilität verschiedener GM-CSF Formulierungen

Um die Stabilität verschiedener GM-CSF Formulierungen zu testen, wurden ca. 10 mg der unter Beispiel 1.1 genannten Formulierungen steril eingewogen und für 7 Tage bei 40°C inkubiert. Anschließend wurden die Proben mit 5 µl DMSO/mg Creme versetzt, um das in der Creme enthaltene GM-CSF zu extrahieren. Die Proben wurden gründlich vermischt (Vortex) und ca. 2 h bei RT inkubiert, wobei ca. alle 30 min nochmals per Vortex gemischt wurde. Die Proben wurden kurz abzentrifugiert und bis zur weiteren Bearbeitung bei 4°C gelagert.
Es wurden Monozyten nach bekannten Methoden isoliert (siehe z. B. Current Protocols in Immunology, Editors Coligan JE et al. 1999, Seiten 7.32.1-4). Diese wurden in Medium (RPMI - Gibco, Paisley, Schottland - mit 5% FCS) aufgenommen, so dass eine Konzentration von 175000-220000 Zellen pro 500 µl vorlag.
Humanes rekombinantes IL4 doppeltkonzentriert (Pharmingen, Heidelberg, Deutschland) hinzugeben (Endkonz. 500 Units/ml).
Die extrahierten Salbenproben wurden auf RT equilibriet, nach 30 min gründlich per Vortex gemischt und kurz abzentrifugiert.
In je ein Well einer 48-well Platte wurden zunächst jeweils 1 ml Medium (RPMI mit 5% FCS) vorgelegt und anschließend 2,5 µl der Cremeextrakte oder - als Kontrolle - 0,5 µl humanes rekombinantes GM-CSF (entspricht 0,25% Extrakt bzw. 500 Units GM-CSF) zugegeben. Von jedem dieser Ausgangsansätze wurden Verdünnungsreihen angesetzt, indem in Wells mit je 500 µl vorgelegtem Medium jeweils 500 µl des jeweils höher konzentrierten Ansatzes zupipettiert wurden. Diese Verdünnungsreihe sah somit wie in Tabelle 8 dargestellt aus. Tabelle 8
Anschließend wurden in jedes Well 500 µl der Monozyten-Suspension zugegeben. Die Platten wurde für 7 Tage bei 37°C inkubiert, die Zellen geerntet und mit Maus-anti-Human CD1a (1:50, Pharmingen, Heidelberg, Deutschland) und anti- Maus IgG FITC (3/50, Sigma, Deisenhofen, Deutschland) gefärbt. Abschließend wurden die Zellen in einem FACS (FACS Calibur, Fa. Beckton Dickenson, Hamburg, Deutschland) hinsichtlich ihrer CD1a-Immunfärbung analysiert.
Als Positivkontrolle diente ein Ansatz aus 500 µl Medium mit 2,5 µl humanem rekombinanten GM-CSF, als Negativkontrolle ohne GM-CSF.
In den Stabilitätsexperimenten konnte gezeigt werden, dass die Formulierung 43600 nach 7 Tagen bei 40°C deutlich mehr GM-CSF Aktivität besitzt als die Formulierung 43400 (siehe Fig. 2). Auch die Formulierung 10101 besitzt nach der Inkubationszeit kaum noch GM-CSF Aktivität (siehe Fig. 3).

Claims

1. Verwendung mindestens eines Cytokines und/oder Chemokines zur Herstellung eines topikal wirkenden Arzneimittels zur Behandlung von viralen und/oder mykotischen Hauterkrankungen und/oder Tumorerkrankungen.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel mehr als drei, insbesondere drei, vorzugsweise zwei Cytokine und/oder Chemokine enthält.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel im wesentlichen keine antigen-wirkenden Bestandteile enthält.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Cytokin und/oder Chemokin GM-CSF, G-CSF, IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL21, IL22, IFNα, IFNβ, IFNγ, Flt3 L, Flt3, RANTES, MIP1α, MIP1β, MIP1γ, MIP1δ, MIP2, MIP2α, MIP2β, MIP3α, MIP3β, MIP4, MIP5, MCP1, MCP1β, MCP2, MCP3, MCP4, MCP5, MCP6, 6cykine, Dcck1 und/oder DCDF, insbesondere GM-CSF, RANTES und/oder MIP1α ist.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die viralen Hauterkrankungen und/oder Tumorerkrankungen hervorgerufen werden durch mindestens einen Papilloma Virus, insbesondere durch mindestens einen Humanen Papilloma Virus wie zum Beispiel HPV 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 31, 32, 34, 36, 37, 38, 46, 47, 48, 49, 50, 56, 58, durch mindestens einen Herpes Virus, wie zum Beispiel Herpes Simplex Virus 1, Herpes Simplex Virus 2, Varicella Zoster Virus oder Humanes Herpes Virus 1, 2, 3, 4, 7, 8.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die viralen Hauterkrankungen Warzen, Genitalwarzen, durch Papillomaviren verursachte benigne Tumore der Haut oder Schleimhaut, z. B. Verrucae plantares, Verrucae vulgares, Verrucae planae jeveniles, Epidermodysplasia verruciforis, Condylomata acuminata, Condylomata plana, bowenoide Papulose, Papillome an Larynx oder Mundschleimhaut, fokale epitheliale Hyperplasie, Lippenherpes, Kaposi-Sarcom, Windpocken und/oder Gürtelrose sind.

7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Tumorerkrankungen Bowen-Krankheit, Penis- und Vulvakarzinom, Zervixkarzinom, Larynxkarzinom und/oder Zungenkarzinom sind.

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die mykotischen Hauterkrankungen Dermatomykosen, Chromoblastomykose, Sporothrix-Mykose, Eumyzetom oder Systemmykosen sind.

9. Verfahren zur Herstellung eines topikal wirkenden Arzneimittels, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Cytokin und/oder Chemokin mit mindestens einem Hilfsstoff, insbesondere mit humanem Serumalbumin, CpG oder oxidiertem Glutathion, in Kontakt gebracht wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Cytokin und/oder Chemokin gentechnisch hergestellt wird.

11. Topikal wirkende Arzneimittelformulierung enthaltend mindestens ein Cytokin und/oder ein Chemokin sowie Cetylstearylalkohol, Vaseline und Wollwachsalkohol oder Parafinöl.

12. Behandlungskit enthaltend eine Formulierung gemäß Anspruch 11 sowie ein Occlusionsmittel.

13. Behandlungskit nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Occlusionsmittel ein Pflaster oder ein Sprühverband ist.