JPH0533208B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は、蛋白性生理活性物質を含有する水溶
性乾燥物に関するものであり、更に詳細には、蛋
白性生理活性物質とマルトトリオース残基を主な
繰り返し単位とした多糖類とを含有する蛋白性生
理活性物質の安定化された水溶性乾燥物に関する
ものである。 従来技術 リンホカイン、蛋白性ホルモンなどの蛋白性生
理活性物質は、検査用試薬、医薬などの用途を有
し、近年の生化学、医学の著しい進歩につれて研
究開発が進み、大量に工業生産され又はされよう
としている。 しかしながら、これら蛋白性生理活性物質は一
般に不安定であり、安定剤とともに製品化されて
いるのが現状である。 安定剤として、最も広く使用されているのが、
ヒト血清アルブミンである。 ところが、ヒト血清アルブミンの使用は、次の
ような欠点を有している。 (1) 蛋白性生理活性物質の安定剤として、その効
果が不充分である。 (2) ヒト血清アルブミンを加えることにより、蛋
白性生理活性物質の精製程度の判断基準とされ
る比活性（蛋白質mg当りの活性）が不明とな
る。 (3) ヒト血清由来の蛋白質であることから、ヒト
伝染病の感染媒体になる危険性がある。 (4) 乾燥することにより、水不溶性乾燥物になり
易い。 これらの欠点を避けるため、多くの安定剤が提
案されている。 例えば、インターフエロンの場合には、特開昭
58−92691号公報にシクロデキストリンが記載さ
れ、特開昭59−25333号公報に多糖類を除く単糖
類、オリゴ糖類などの糖類やグリセリン、エチレ
ングリコールなどのポリオールが記載され、ツモ
ア ネクロシス フアクターの場合には、特開昭
59−39829号公報に非イオン性界面活性剤が記載
され、特開昭59−59625号公報にＤ−グリコース、
Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルク
ロン酸、トレハロース、デキストラン、ヒドロキ
シエチル澱粉、とりわけ、トレハロースが最も望
ましいことが記載されている。 しかしながら、これらの安定剤を使用しても、
その効果が不充分であり、また、トレハロースな
どは高価であり、未だ使用されるに至つていな
い。 問題を解決するための手段 本発明者等は、安定性の高い蛋白性生理活性物
質を含有する水溶性乾燥物を目ざし、その安定剤
として各種安定剤とりわけ多糖類に着目して鋭意
研究してきた。 その結果、マルトトリオース残基を主な繰り返
し単位とした多糖類が本目的に合致することを見
いだし本発明を完成した。 即ち、本発明は、蛋白性生理活性物質とマルト
トリオース残基を主な繰り返し単位とした多糖類
とを含有する水溶液を蒸発乾固させて得られる乾
燥物が、水溶性を有しているとともに、その中に
含まれる蛋白性生理活性物質の活性をきわめて安
定に保持していることを見いだしたことに基づい
ている。 本発明でいう蛋白性生理活性物質とは、生体内
で生理活性を示す単純蛋白質、複合蛋白質などの
蛋白性物質を意味し、より具体的には、分子量１
万乃至20万程度の例えば、インターフエロン、リ
ンホトキシン、ツモア ネクロシス フアクタ
ー、マクロフアージ遊走阻子因子、トランスフア
ー フアクター、Ｔ細胞増殖因子、コロニー刺激
因子などのリンホカインや、例えば、インシユリ
ン、成長ホルモン、プロラクチン、絨毛性性腺刺
激ホルモン、エリトロポエチン、卵胞刺激ホルモ
ン、横体形成ホルモン、上皮細胞成長因子、副腎
皮質刺激ホルモン、胎盤性ラクトゲン、甲状腺刺
激ホルモン、副甲状腺ホルモンなどの蛋白性ホル
モンなどを意味する。 これら蛋白性生理活性物質の調製方法は問わ
ず、それが元来存在している、例えば、体液、細
胞、組織、臓器などからのものであつても、ま
た、これらのin vitro又はin vivoでの培養物か
らのものであつてもよく、更には、高地の細胞融
合、遺伝子組換えなどの方法により蛋白性生理活
性物質の産生能を導入したヒト細胞、動物細胞、
微生物などの培養物からのものであつてもよい。 本発明でいうマルトトリオース残基を主な繰り
返し単位とする多糖類とは、主にマルトトリオー
ス残基がα−結合で繰り返し重合した多糖類であ
つて、例えばプルラン、エルシナン又はそれらの
部分加水分解物などを意味し、その平均分子量と
しては、１万乃至1000万程度、望ましくは２万乃
至200万程度が好適である。 また、蛋白性生理活性物質に対するマルトトリ
オース残基を主な繰り返し単位とした多糖類の使
用割合は、固形物重量当り0.5倍以上、望ましく
は、10倍以上10000倍程度までが好適である。 また、本発明の蛋白性生理活性物質とマルトト
リオース残基を主な繰り返し単位とした多糖類と
を含有する水溶液を蒸発乾固させる条件として
は、蛋白性生理活性物質が実質的に失活せずに水
溶性乾燥物が得られればよく、通常30℃以下での
減圧乾燥、望ましくは、凍結乾燥処理が好適であ
る。また、必要ならば、マルトトリオース残基を
主な繰り返し単位とした多糖類以外に、例えば、
塩類、緩衝剤、アミノ酸類、他の糖類など他の物
質を併用して凍結乾燥することも自由である。 このようにして得られる蛋白性生理活性物質を
含有する水溶性乾燥物は、蛋白性生理活性物質の
活性をきわめて安定に保持し、しかも、水に易溶
性であることより、蛋白性生理活性物質を含有し
た、例えば、検査用試薬、注射薬、外用薬、内服
薬、点鼻薬、舌下薬などとして、ヒトの疾患の予
防、治療などに有利に利用できる。また、本発明
の蛋白性生理活性物質を含有する水溶性乾燥物
を、そのままで、または、必要に応じて、塩類、
アミノ酸、他の糖類など適宜の他の物質と併用し
て顆粒、錠剤などに成形し、その取扱い、使用を
簡便にし、更には、蛋白性生理活性物質の徐放性
を調節することも随意である。 実験１ インターフエロンの安定化試験 1A インターフエロンの調製 新生児のハムスターに、ウサギから公知の方法
で調製した抗血清を注射して、ハムスターの免疫
反応を弱めた後、その皮下にBALL−１細胞を移
植し、その後通常の方法で３週間飼育した。皮下
に生じた腫瘤を摘出して細切し、生理食塩水中で
分散させてほぐした。得られた細胞を血清無添加
のRPMI 1640培地（PH7.2）で洗浄し、同培地に
約２×10⁶／mlになるよう懸濁し、35℃に保つた。
これに部分精製したヒトインターフエロンを
200u／mlの割合で加えて約２時間保つた後、更
に、センダイウイルスを約300赤血球凝集価／ml
の割合で添加し、20時間保つてヒトインターフエ
ロンを誘導させた。これを、約４℃、約1000gで
遠心分離して沈澱物を除去し、得られた上清を、
更に精密過し、その液を、公知の方法に従つ
て、抗インターフエロン抗体を固定化している抗
体カラムにかけ、非吸着画分を除去した後、その
吸着画分を溶出し、膜濃縮して濃度約0.01w／ｖ
％、比活性約1.5×10⁸Ｕの濃縮液をハムスター一
匹当り約４mlの収率で得た。 なお、ヒトインターフエロンの活性は、FL細
胞を使用する公知のプラーク半減法で測定した。
赤血球凝集価は、J.E.Salk著「Journal of
Immunology Vol.49」87頁（1944）の方法に準
じて測定した。 1B インターフエロンの安定化に及ぼす各種
安定剤の比較 実験1Aの方法で得たインターフエロン濃縮液
0.5mlと各種安定剤を含有する水溶液1.0mlとをバ
イアルビンにより、よく混合した後、凍結乾燥
し、４℃又は30℃で２ケ月間放置した。次いで、
これらの凍結乾燥品に、30℃の生理食塩水を加え
インターフエロンを溶解又は溶出して活性を測定
し、凍結前の活性に対する活性残存率（％）を次
式により求めた。 活性残存率（％）＝貯蔵後の活性／凍結乾燥前の活性
×100 結果は、第１表にまとめた。

【表】 第１表の結果から明らかなように、マルトトリ
オース残基を主な繰り返し単位としたプルラン、
エルシナンを安定剤に使用したものは、インター
フエロンの安定性に優れているだけでなく、乾燥
物の水溶性も易溶で、きわめて取り扱い易い乾燥
物であることが判明した。 実験２ ツモア ネクロシス フアクターの安定
化試験 2A ツモア ネクロシス フアクターの調製 新生児のハムスターに、ウサギから公知の方法
で調製した抗血清を注射してハムスターの免疫反
応を弱めた後、その皮下に、SV−40ウイルスで
処理して培養株化されたヒト由来の単核細胞を移
植し、通常の方法で１週間飼育した後、BCGの
生細胞を腹腔内に10⁷個注入し、更に２週間飼育
した。皮下に生じた約15gの腫瘍を摘出し細切し
た後、トリプシン含有の生理食塩水に懸濁して細
胞を分散分取した。この細胞をヒト血清5v／ｖ
％含有するPH7.2のEagleの最小基本培地で洗浄し
37℃に保つた同じ組成の培地に細胞濃度が約５×
10⁶／mlになるよう希釈し、これにE.coli由来の
エンドトキシンを約10μg／mlの割合で加えて16
時間保つてツモア ネクロシス フアクター誘導
生成させた。 これを４℃、約1000gで遠心分離し、沈澱物を
除去し、得られた上清をPH7.2，0.01Mリン酸塩
緩衝液を含有する生理食塩水で21時間透析し、更
に精密濾過して得た濾液を濃縮し、凍結乾燥して
ツモア ネクロシス フアクター活性を含有する
粉末を得た。得られた粉末をG.Bodoの報告
（Symposium on preparation，standarization
and clinical use of interferon，11th
International Immunobiological Symposium
８＆9June 1977，Zagreb.Yugoslavia）に準じて
イオン交換体への吸脱着、ゲル濾過による分子量
分画、濃縮および精密濾過の手段によりインター
フエロンを除去し、更に硫安塩析、ConA−セフ
アロース アフイニテイクロマトグラフイーによ
り精製濃縮し、MethA肉腫出血生壊死能を有し、
かつ正常細胞に何らの悪影響も及ぼさないことを
特徴とする高純度ツモア ネクロシス フアクタ
ーを含有する濃度約0.01w／ｖ％の濃縮液をハム
スター一匹当り約30mlを得た。このようにして得
られたツモア ネクロシス フアクターは、用い
た誘導剤の混入もなく、比活性約3.5×10⁵を有す
る糖蛋白質であつた。 なお、ツモア ネクロシス フアクターの活性
は、E.Pick編 Tumor Necrosis Factor in
“Lymphokines”Vol.II，pp235−272，
Academic press（1981年）に報告されているツ
モア ネクロシス フアクター感受性Ｌ−929細
胞を使用して、一定時間培養後の生残細胞数を測
定する公知の方法を用いた。 2B ツモア ネクロシス フアクターの安定
化に及ぼす各種安定剤の比較 実験2Aの方法で得たツモア ネクロシス フ
アクター濃縮液0.5mlと各種安定剤を含有する水
溶液1.0mlとをバイアルビンにとり、以後、実験
1Bと同様に、凍結乾燥し、貯蔵した後、ツモア
ネクロシス フアクターの活性残存率（％）を
求めた。 結果は、第２表にまとめた。

【表】 第２表の結果から明らかなように、マルトトリ
オース残基を主な繰り返し単位としたプルラン、
エルシナンを安定剤に使用したものは、ツモア
ネクロシス フアクターの安定性に優れているだ
けでなく、乾燥物の水溶性も易溶で、きわめて取
り扱い易い乾燥物であることが判明した。 実験３ マルトトリオース残基を主な繰り返し単
位とした多糖類の使用割合 蛋白性生理活性物質の安定化に及ぼすマルトト
リオース残基を主な繰り返し単位とした多糖類の
使用割合を比較した。それぞれのバイアルに、実
験1Aの方法で調製したインターフエロン濃縮液
0.5ml、又は、実験2Aの方法で調製したツモア
ネクロシス フアクター濃縮液0.5mlをとり、こ
れに適当な濃度のプロラン又はエルシナン水溶液
を、蛋白性生理活性物質に対する多糖類の重量を
固形物当り０，0.01，0.1，0.5，1.0，5.0，10.0，
100.0倍となるように加えて混合した後、実験1B
と同様に凍結乾燥し、37℃で２ケ月間放置した。 次いで、それぞれの活性残存率（％）を測定し
た。 結果は、第３表にまとめた。 なお、いずれの乾燥物も生理食塩水に易溶であ
つた。

【表】 第３表の結果から明らかなように、蛋白性生理
活性物質に対するマルトトリオース残基を主な繰
り返し単位とした多糖類の使用割合は固形物重量
当り0.5倍以上、望ましくは、1.0倍以上が望まし
い。 以下、本発明の実施例及び優れた効果について
述べる。 実施例１ ヒトインターフエロン 実験1Aの方法で得た精製インターフエロンの
濃縮液と、これに固形物重量で100倍量の精製プ
ルランを含有する水溶液を加え無菌過した後、
２ml容バイアルビンにインターフエロン300万Ｕ
ずつ分注し凍結乾燥した。本品は、室温下におい
ても長期に安定であり、水に対して易溶であるこ
とから、検査用試薬、筋肉、静脈などへの注射薬
などとして有利に利用できる。 実施例２ ツモア ネクロシス フアクター 実験2Aの方法で得た精製ツモア ネクロシス
フアクターの濃縮液と、これに固形物重量で
200倍量の精製プルランを含有する水溶液を加え、
無菌過した後、２ml容バイアルビンにツモア
ネクロシス フアクター2000Uずつ分注して凍結
乾燥した。本品は、室温下においても長期に安定
であり、水に対して易溶であることから検査用試
薬、注射薬などとして有利に利用できる。 実施例３ リンホトキシン 実験1Aの方法で得られた抗インターフエロン
抗体カラムの非吸着画分を採取し、これを、フイ
トヘマグルチニン−セフアロースアフイニテイク
ロマトグラフイーにより精製し、膜濃縮して得ら
れる高純度リンホトキシンを含有する濃縮液に、
固形物重量で50倍量のエルシナンを含有する水溶
液を加えてよく混合した後、５ml容バイアルビン
にリンホトキシンを1000Uずつ分注し凍結乾燥し
た。 本品は、室温下においても長期に安定であり、
水に易溶性であり、検査用試薬、注射薬などとし
て、また、顆粒、錠剤、軟膏用原末などとして有
利に利用できる。 なお、リンホトキシンの活性は、Bloom，B.
R.＆Glade，P.R.共編「In vitro methods in
cell−mediated immunity」Academic Press
（1971年）に報告されているマウスＬ細胞を使用
して、一定時間培養後の生残細胞数を測定する公
知の方法を用いた。 実施例４ 成長ホルモン 成長したヌードマウスの皮下に、下垂体前葉好
酸性細胞腺腫の患者から摘出、細切、分散させて
得た腫瘍性好酸性細胞を移植した後、通常の方法
で３週間飼育した。 皮下に生じた腫瘤約10gを摘出して細切した
後、トリプシン含有生理食塩水に懸濁して細胞を
分散させた。 この細胞を、牛胎児血清10v／ｖ％を補足し、
グルコース無含有にしたEarle培地199（PH7.2）で
洗浄した後、成長ホルモン誘導剤としてＬ−アル
ギニンを30mM存在せしめた同培地に細胞濃度約
10⁵／mlになるように浮遊させ、37℃で６時間保
つてヒト成長ホルモンを誘導生成させた。その
後、細胞を超音波処理し、得られる上清を用いて
ヒト成長ホルモンの量を測定したところ、浮遊液
ml当り約500ngの産生量であつた。 本上清を、常法に従つて精製濃縮して、得られ
る生長ホルモンを含有する濃縮液に、固形物重量
で10000倍のプルランを含有する水溶液を加えて
よく混合した後、２ml容バイアルビンに成長ホル
モン10ngずつ分注して凍結乾燥した。 本品は、室温下においても長期に安定であり、
水に易溶性であり、検査用試薬、注射薬などとし
て有利に利用できる。 なお、ヒト成長ホルモンの量は、S.M.Glick，
et al.，Nature（London），Vol.199，784（1963）
に記載されているラジオイムノアツセイ法に準じ
て測定した。 実施例５ 上皮細胞成長因子 顎下腺腫瘍患者から摘出、細切、分散させて得
られた細胞を仔牛血清10v／ｖ％を補足した
Earle培地199（PH7.2）に細胞濃度１×10⁵／mlに
なるように接種した。その後、密閉系中、定期的
に新鮮な培地と取り替えながら37℃で一週間培養
した。細胞の単層が得られた時点で、増殖細胞を
トリプシンとリン酸塩を含む生理食塩水で洗浄し
た。 次いで細胞を同じ培地にml当り濃度約１×10⁵
になるように浮遊させ、PH7.2，37℃で一週間浮
遊培養した。その後、細胞を超音波処理し、得ら
れる上清中に含まれるヒト上皮細胞成長因子量を
測定したところ、浮遊液ml当り約1.3μgの産生量
であつた。 本上清を、常法に従つて精製濃縮して、得られ
る上皮細胞成長因子を含有する濃縮液に、固形物
重量で200倍量のエルシナンを含有する水溶液を
加えてよく混合した後、５ml容バイアルビンに上
皮細胞成長因子0.5μgずつ分注して凍結乾燥した。 本品は、室温下においても長期に安定であり、
水に易溶性であつて、検査用試薬、注射薬などと
して、また、顆粒、錠剤、坐薬用原末などとして
有利に利用できる。 なお、ヒト上皮細胞成長因子の量は、Roger l.
Ladda et al：Anslytical Chemistry，第93巻、
第286〜294頁（1979年）に記載されている公知の
ラジオレセプターアツセイ法に準じて行なつた。 実施例６ エリトロポエチン 腎腫瘍患者から摘出、細切、分散させて得たヒ
ト腎腫瘍細胞とリンパ芽球ナマルバ細胞
（Namalva cell）とを140mM NaCl，54mM
KCL，1mM NaH₂PO₄，2mM CaCl₂を含有す
る塩類溶液にそれぞれ約10³／mlになるようにフ
ラスコ中で浮遊させ、これに予め紫外線で不活化
したセンダイウイルスを含有する前記塩類溶液を
氷冷下で混合し、約５分後に37℃恒温水槽に移し
て、約30分間攪拌しつつ細胞融合を起させ、リン
パ芽球ナマルバ細胞にヒトエリトロポエチン産生
能を導入した。 このリンパ芽球ナマルバ細胞を成長したヌード
マウスの腹腔内に移植した後、通常の方法で５週
間飼育した。 皮下に生じた腫瘤約15gを摘出し分散させた
後、トリプシン含有生理食塩水に懸濁して細胞を
分散させた。 この細胞を、牛胎児血清10v／ｖ％を補足した
Earle培地199（PH7.2）で洗浄した後、同培地に細
胞濃度が約10⁶／mlになるように浮遊させ、700mm
Hgの減圧雰囲気下で、温度37℃に20時間保つて
ヒトエリトロポエチンを産生させた。その後、細
胞を超音波処理し、得られる上清を用いてヒトエ
リトロポエチンの産生量を測定したところ、浮遊
液１ml当り約170Uであつた。 本上清を、常法に従つて精製濃縮して得られる
エリトロポエチンを含有する濃縮液に、固形物重
量で500倍量のプルランを含有する水溶液を加え
てよく混合した後、５ml容バイアルビンにエリト
ロポエチン10Uずつ分注して凍結乾燥した。 本品は、室温下においても長期に安定であり、
水に易溶性であり、検査用試薬、注射薬などとし
て有利に利用できる。 なお、ヒトエリトロポエチンの量は、P.Mary
Cotes等がNatureNo.4793，Sep.9，1961，1065〜
1067で報告している鉄−59の取り込みによるバイ
オアツセイ法に準じてその活性を測定し、1Uは、
WHOが配布している国際標準品の１アンプル中
に含有する活性の1/10の活性とする。 実施例７ 甲状腺刺激ホルモン 下垂体前葉好塩基性細胞腺腫の患者から摘出、
細切、分散させて得たヒト腫瘍性好塩基性細胞と
リンパ芽球ナマルバ（Namalva cell）とを
140mM NaCl，54mM KCl，1mM NaH₂PO₄，
2mM CaCl₂を含有する塩類溶液にそれぞれ約
10⁴／mlになるように浮遊させ、これに予め紫外
線で不活化したセンダイウイルスを含有する前記
塩類溶液を氷冷下で混合し、約５分後に37℃恒温
水槽に移して、約30分間攪拌しつつ細胞融合を起
させ、リンパ芽球ナマルバ細胞に甲状腺刺激ホル
モン産生能を導入した。このリンパ芽球ナマルバ
細胞を成長したヌードマウスの腹腔内に移植した
後、通常の方法で５週間飼育した。生じた腫瘤約
15gを摘出し、細切した後、トリプシン含有の生
理食塩水に懸濁して細胞を分散させた。 この細胞を牛胎児血清10v／ｖ％を補足した
Earle培地199（PH7.2）で洗浄した後、Ｌ−アルギ
ニンを30mM存在せしめた同培地に細胞濃度約
10⁵／mlになるように浮遊させ、37℃で35時間保
つてヒト甲状腺刺激ホルモンを産生させた。その
後、細胞を超音波処理し、得られる上清を用いて
甲状腺刺激ホルモン量を測定したところ、浮遊液
ml当り約180mIUであつた。 本上清を、常法に従つて精製濃縮して得られる
甲状腺刺激ホルモンを含有する濃縮液に、固形物
重量で100倍量のエルシナンを含有する水溶液を
加えてよく混合した後、５ml容バイアルビンに甲
状腺刺激ホルモンを10mIUずつ分注して凍結乾
燥した。 本品は、室温下においても長期に安定であり、
検査用試薬、注射薬などとして有利に利用でき
る。 なお甲状腺刺激ホルモンの量は、S.W.Manley
et al.，J.Endoerinol.，Vol.61，419−436（1974）
に報告されているラジオレセプターアツセイ法に
準じて測定し、英国Nation Institute for
Medical Researchより入手される標準ヒト甲状
腺刺激ホルモンの国際単位（IU）で表示した。 発明の効果 上記したことから明らかなように、本発明の乾
燥物は、蛋白性生理活性物質を室温下のような苛
酷な条件下においても長期に安定保持できるとと
もに、水に易溶性である特徴を有している。ま
た、ヒト血清アルブミンなどの安定剤を用いる場
合とは違つて、ヒト伝染病の感染の懸念がなく、
蛋白性生理活性物質の精製程度の判断基準とされ
る比活性の測定も容易である。 従つて、本発明の蛋白性生理活性物質を含有す
る乾燥物は、検査用試薬、注射薬、外用薬、内服
薬などとしてヒトの疾患の予防、治療に有利に利
用できる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 蛋白性生理活性物質とマルトトリオース残基
   を主な繰り返し単位とした多糖類とを含有する水
   溶液を蒸発乾固させた蛋白性生理活性物質を含有
   する水溶性乾燥物。 ２ 蛋白性生理活性物質に対してマルトトリオー
   ス残基を主な繰り返し単位とした多糖類を固形物
   重量当り0.5倍以上含有する特許請求の範囲第１
   項記載の水溶性乾燥物。 ３ 蛋白性生理活性物質がリンホカイン又は蛋白
   性ホルモンである特許請求の範囲第１、２項記載
   の水溶性乾燥物。 ４ マルトトリオース残基を主な繰り返し単位と
   した多糖類がプルラン又はエルシナンである特許
   請求の範囲第１、２、３項記載の水溶性乾燥物。 ５ 水溶性乾燥物が、減圧乾燥又は凍結乾燥した
   ものである特許請求の範囲第１、２、３、４項記
   載の水溶性乾燥物。