JPH04325095A - 抗ヒトｉｌ−６モノクロ−ナル抗体及び該抗体を使用するｉｌ−６の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトインタ−ロイキン
−６（以下、特別に断らない限りヒトインタ−ロイキン
−６をＩＬ−６と記載する）に対して親和性を有するモ
ノクロ−ナル抗体、このモノクロ−ナル抗体を産生する
ハイブリド−マ、このモノクロ−ナル抗体を使用するＩ
Ｌ−６のサンドイッチ免疫測定方法及びこのサンドイッ
チ免疫測定方法用の試薬キットに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ＩＬ−６は、種々の重要な生理活性を有
し、広く細胞の増殖・分化に関与する蛋白質であるが、
一方ではその異常産生が自己免疫疾患の病因因子である
可能性も報告されている（岸本、平野ら、Ａｎｎ．Ｒｅ
ｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，ｐ４８５，１９８８年）。

【０００３】従って、生体内で多用な生理活性を発揮す
るＩＬ−６の生理的濃度を知ることができれば、ＩＬ−
６と生体内細胞の増殖・分化の具体的な相関やＩＬ−６
と自己免疫疾患等のＩＬ−６の関与が示唆されている疾
患の相関を具体的に知り、又はこの結果、ＩＬ−６が関
与する疾患の早期発見が可能となる。

【０００４】血液等の生体試料中の蛋白質等の測定方法
については、免疫測定法と総称される測定方法が知られ
ている。例えばサンドイッチ免疫測定法とよばれる方法
では、測定しようとする物質（アナライト）に対して親
和性を有する２種の抗体（異なる部位でアナライトと結
合する）を使用する。即ち、その一方を不溶性の単体に
固定化し、他方に放射性同位元素、蛍光物質、発光物質
又は酵素等の標識物質を結合させ、これら２種の抗体で
アナライトをサンドイッチするのである。

【０００５】一方ＩＬ−６に親和性を有する（ＩＬ−６
を認識する）モノクロ−ナル抗体としては、特開平２−
４８８号に記載されたＭＨ−１６６抗体等がある。

【０００６】

【従来技術の課題】ＩＬ−６の濃度と疾患の具体的な相
関関係は確立されたわけではないが、これら疾患のマ−
カ−としてＩＬ−６が注目されていることは事実であり
、その測定方法の確立が急務である。

【０００７】ＩＬ−６は、正常人血液１ｍｌ中に７から
１０ピコグラムしか含有されていないが、例えばリュウ
マチ関節腔液には１ｍｌ中には２０ナノグラム程度が（
Ｔ．Ｈｉｒａｎｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
８巻、ｐ１７９７　、１９８８年）、ＡＩＤＳ無症状患
者（いわゆるキャリア）の血液１ｍｌ中には５０ピコグ
ラム程度が、ＡＩＤＳ患者の血液中には４００から５０
０ピコグラム程度が含有されていると言われている（　
Ｍ．Ｈｏｎｄａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１４５巻、
ｐ４０５９　、１９９０年）。

【０００８】従って、ＩＬ−６の測定においては、少な
くとも数ピコグラムの精度でそれを測定し得ることが必
要となるから、サンドイッチ免疫測定法によりＩＬ−６
の生体内濃度を測定する場合には、使用する２種の抗体
のＩＬ−６との結合部位が同一であってはならないこと
は言うに及ばず、それぞれの抗体のＩＬ−６への親和性
が高く、かつ、相性の良い２種の抗体を組み合わせるこ
とがこの目的の達成には不可欠である。

【０００９】特開平２−４８８号に記載されたＭＨ−１
６６抗体等は、リコンビナントＩＬ−６をマウスに免疫
して調製されたものであり、ＩＬ−６に対して高い親和
性を有することやＩＬ−６の中和活性（共存によりＩＬ
−６の生理活性を失なわせる活性）を有することが記載
されている。しかし、具体的に免疫測定法に供し得るの
かどうかは不明であり、特にサンドイッチ免疫測定法に
有用か否かは不明であり、またどの程度の低濃度ＩＬ−
６を測定し得るのかも不明である。

【００１０】更に、サンドイッチ免疫測定法を実施して
低濃度ＩＬ−６を測定するのに相性の良い２種の抗体の
組み合わせ及びその測定限界については、従来何も知ら
れていない。

【００１１】ＩＬ−６は生体内でアルファ２−マクログ
ロブリンと結合して存在している可能性が高い（Ｔ．Ｍ
ａｔｓｕｄａ　ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２，ｐ
１４８，１９８９年）が、ＩＬ−６はインタ−ロイキン
−６レセプタ−（特開平２−２８８８９８号参照、以下
、ＩＬ−６Ｒと記載する）と結合することによりその生
理活性を発揮する（Ｔ．Ｔａｇａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．１６６，ｐ９６７，１９８７　年、Ｋ．Ｙａｍａｓ
ａｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１，ｐ８２５，１９８
８　年）ものであるため、例えばアルファ２−マクログ
ロブリンと結合した結果、本来の生理活性は発揮し得る
ものの抗体と結合し得ないために免疫測定法では測定し
得ない場合が考えられる。前記のＭＨ−１６６抗体等が
、ＩＬ−６とアルファ２−マクログロブリンの複合体に
対しても親和性を有するか否かは不明である。

【００１２】本発明者らは、従来技術に鑑みて、ＩＬ−
６をサンドイッチ免疫測定法をより高精度に実施し得、
かつ、完全に遊離した状態で血液等の中に存在するＩＬ
−６以外にも、少なくともＩＬ−６Ｒと結合し得る状態
で存在するＩＬ−６をも測定可能なＩＬ−６のサンドイ
ッチ免疫測定方法を提供すべく鋭意検討を行った。

【００１３】その結果、この目的を達成し得る、従来知
られていない性質等を有する抗ＩＬ−６モノクロ−ナル
抗体を創造し、これら抗体を産生するハイブリド−マ、
これらハイブリド−マを培養することからなる抗ＩＬ−
６モノクロ−ナル抗体の製造方法を完成し、更には新た
に創造されたモノクロ−ナル抗体の中からサンドイッチ
免疫測定により生理活性を発現し得るＩＬ−６の濃度（
生理活性濃度）を知るのに適した相性の２種のモノクロ
−ナル抗体の組み合わせを見い出し、相性の良い２種の
モノクロ−ナル抗体を使用するＩＬ−６のサンドイッチ
免疫測定法及びこれに用いる試薬キットを完成するに至
った。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明は、従来知られて
いない性質等を有する抗ＩＬ−６モノクロ−ナル抗体（
以下、抗体と記載する）であって、ＩＬ−６中のＩＬ−
６Ｒとの結合部分と結合する抗体を使用すればその生理
的濃度を知ることが出来る、との思想に基づいてなされ
たものであり、詳しくは、ＩＬ−６に対して４．３１×
１０５　　Ｍ−１以上の親和定数を示し、免疫グロブリ
ンＧ１ラムダクラスに属し、その結合によりＩＬ−６と
ＩＬ−６Ｒの結合を阻害し、ハイブリド−マＰＡＢ１０
１（微工研菌寄第１１７２１号）により産生される抗体
ＰＡＢ１０１、ＩＬ−６に対して３．７６×１０５　　
Ｍ−１の親和定数を示し、免疫グロブリンＧ１ラムダク
ラスに属し、その結合によりＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの結
合を阻害し、ハイブリド−マＰＡＢ１０２（微工研菌寄
第１１７２２号）により産生される抗体ＰＡＢ１０２、
ＩＬ−６に対して１．５５×１０６　　Ｍ−１の親和定
数を示し、免疫グロブリンＧ２ｂカッパ−クラスに属し
、その結合によりＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの結合を阻害し
、ハイブリド−マＰＡＢ１０８（微工研菌寄第１１７２
３号）により産生される抗体ＰＡＢ１０８、ＩＬ−６に
対して２．１９×１０６　　Ｍ−１以上の親和定数を示
し、免疫グロブリンＧ２ａカッパ−クラスに属し、その
結合によりＩＬ−６とＩＬ−６Ｒ結合を阻害し、ハイブ
リド−マＰＡＢ１０９（微工研菌寄第１１７２４号）に
より産生される抗体ＰＡＢ１０９又はＩＬ−６に対して
３．３６×１０６　　Ｍ−１以上の親和定数を示し、免
疫グロブリンＧ１ラムダクラスに属し、その結合により
ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの結合を阻害し、ハイブリド−マ
ＰＡＢ１１８（微工研菌寄第１１９７７号）により産生
される抗体ＰＡＢ１１８である。

【００１５】また本発明は、前記ＰＡＢ１０１抗体を産
生するハイブリド−マＰＡＢ１０１（微工研菌寄第１１
７２１号）、前記ＰＡＢ１０２抗体を産生するハイブリ
ド−マＰＡＢ１０２（微工研菌寄第１１７２２号）、前
記ＰＡＢ１０８抗体を産生するハイブリド−マＰＡＢ１
０８（微工研菌寄第１１７２３号）、前記ＰＡＢ１０９
抗体を産生するハイブリド−マＰＡＢ１０９（微工研菌
寄第１１７２４号）又は前記ＰＡＢ１１８抗体を産生す
るハイブリド−マＰＡＢ１１８（微工研菌寄第１１９７
７号）である。

【００１６】また本発明は、前記したＰＡＢ１０１、Ｐ
ＡＢ１０２、ＰＡＢ１０８、ＰＡＢ１０９又はＰＡＢ１
１８のいずれかのハイブリド−マを培養することを特徴
とするＰＡＢ１０１、ＰＡＢ１０２、ＰＡＢ１０８、Ｐ
ＡＢ１０９又はＰＡＢ１１８のいずれかの抗体の製造方
法である。

【００１７】また本発明は、Ａ群（ＰＡＢ１０１又はＰ
ＡＢ１０２）の中から選ばれたいずれかの抗体とＢ群（
ＰＡＢ１０８、ＰＡＢ１０９又はＰＡＢ１１８）の中か
ら選ばれたいずれかの抗体を使用することを特徴とする
ヒトインタ−ロイキン−６のサンドイッチ免疫測定方法
である。

【００１８】更に本発明は、前記のサンドイッチ測定方
法に使用するための、前記Ａ群及びＢ群からそれぞれ１
種ずつ選択された抗体を含むことを特徴とするヒトイン
タ−ロイキン−６のサンドイッチ免疫測定方法用試薬キ
ットである。以下、本発明を詳細に説明する。

【００１９】１．抗ＩＬ−６抗体を産生するハイブリド
−マ。本発明のハイブリド−マＰＡＢ１０１、ＰＡＢ１
０２、ＰＡＢ１０８、ＰＡＢ１０９又はＰＡＢ１１８は
、リコンビナントＩＬ−６（Ａｓａｇｏｅら、Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　６，ｐ８０６，１９８８年）を
マウスに免疫して得た脾細胞に、マウスミエロ−マ細胞
ＳＰ２／Ｏをポリエチレングリコ−ルを用いて融合せし
めて調製されたものである。

【００２０】これら操作は従来公知の方法、例えば免疫
実験操作法（日本免疫学会編、免疫実験操作法、１９７
５年）等を参照して行われた。なお、以上の全てのハイ
ブリド−マは通商産業省告示第　１７８号に従い、工業
技術院微生物工業技術研究所に菌寄第１１７２１　号（
ＰＡＢ１０１）、１１７２２　号（ＰＡＢ１０２）、１
１７２３　号（ＰＡＢ１０８）、１１７２４　号（ＰＡ
Ｂ１０９）又は１１９７７　号（ＰＡＢ１１８）として
寄託されている。

【００２１】２．抗ＩＬ−６抗体。本発明の抗体ＰＡＢ
１０１、ＰＡＢ１０２、ＰＡＢ１０８、ＰＡＢ１０９及
びＰＡＢ１１８は、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの結合を阻害
する性質を有するものである。言い換えれば、ＩＬ−６
中のＩＬ−６Ｒとの結合部分又はこの部分に非常に近い
部分と結合する性質を有するのである。

【００２２】これら抗体は、実施例に示すように、固定
化されたＩＬ−６Ｒに対し、標識したＩＬ−６と共に抗
体を含むハイブリド−マの培養上清を添加し、標識から
のシグナルを測定することによりスクリ−ニングされた
ものである。

【００２３】以下に本発明の抗体の特徴を列記する。

【００２４】ＰＡＢ１０１；ＩＬ−６に対して４．３１
×１０５　　Ｍ−１の親和定数を示す。　　　　　　　
　　　　　　　　　　　免疫グロブリンＧ１ラムダクラ
スに属する。ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの結合を阻害する。 ＩＬ−６の活性をわずかに中和する。ハイブリド−マＰ
ＡＢ１０１により産生される。

【００２５】ＰＡＢ１０２；ＩＬ−６に対して３．７６
×１０５　　Ｍ−１の親和性を有する。　　　　　　　
　　　　　　　　　　　免疫グロブリンＧ１ラムダクラ
スに属する。ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの結合を阻害する。 ＩＬ−６の活性をわずかに中和する。ハイブリド−マＰ
ＡＢ１０２により産生される。

【００２６】ＰＡＢ１０８；ＩＬ−６に対して１．５５
×１０６　　Ｍ−１の親和性を有する。　　　　　　　
　　　　　　　　　　　免疫グロブリンＧ２ｂカッパ−
クラスに属する。ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの結合を阻害す
る。ＩＬ−６の活性を中和する。ハイブリド−マＰＡＢ
１０８により産生される。

【００２７】ＰＡＢ１０９；ＩＬ−６に対して２．１９
×１０６　　Ｍ−１の親和性を有する。　　　　　　　
　　　　　　　　　　　免疫グロブリンＧ２ａカッパ−
クラスに属する。ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの結合を阻害す
る。

【００２８】ＩＬ−６の活性を中和する。ハイブリド−
マＰＡＢ１０９により産生される。

【００２９】ＰＡＢ１１８；ＩＬ−６に対して３．３６
×１０６　　Ｍ−１の親和性を有する。　　　　　　　
　　　　　　　　　　　免疫グロブリンＧ１ラムダクラ
スに属する。ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの結合を阻害する。

【００３０】ＩＬ−６の活性を中和する。ハイブリド−
マＰＡＢ１１８により産生される。

【００３１】本発明の抗体については、上記したような
特徴以外の特徴をも有している。例えば、ＰＡＢ１０１
抗体とＰＡＢ１０２抗体は、ＩＬ−６に対して互いに競
争的に結合する性質を有している。一方、ＰＡＢ１０８
抗体、ＰＡＢ１０９抗体及びＰＡＢ１１８抗体は、ＩＬ
−６に対して互いに競争的に結合する性質を有している
が、ＰＡＢ１０１抗体又はＰＡＢ１０２抗体とは競争的
でない等である。

【００３２】本発明の抗体は、例えばペプシン等の適当
な酵素を用いてフラッグメント化されたものも包括する
。

【００３３】３．抗体の製造方法。本発明の抗体ＰＡＢ
１０１、ＰＡＢ１０２、ＰＡＢ１０８、ＰＡＢ１０９又
はＰＡＢ１１８は、それを産生するハイブリド−マＰＡ
Ｂ１０１、ＰＡＢ１０２、ＰＡＢ１０８、ＰＡＢ１０９
又はＰＡＢ１１８を培養することで製造することが出来
る。

【００３４】例えばこれらのハイブリド−マを１０％Ｆ
ＣＳを添加したＤＭＥＭ等の適当な培地で培養し又はＢ
ＡＬＢ／ｃマウス等の適当な動物の腹腔へ接種して得た
培養上清や腹水について、必要に応じて硫酸アンモニウ
ム塩析等の常法に従った濃縮やＩＬ−６を固定化したゲ
ルを用いたアフィニティ−クロマトグラフィ−を実施し
て製造することができる。

【００３５】４．ＩＬ−６のサンドイッチ免疫測定方法
。本発明で提供されるＩＬ−６のサンドイッチ免疫測定
方法は、Ａ群（ＰＡＢ１０１又はＰＡＢ１０２）の中か
ら選ばれたいずれかの抗体とＢ群（ＰＡＢ１０８、ＰＡ
Ｂ１０９又はＰＡＢ１１８）から選ばれたいずれかの抗
体を組み合わせて使用することを特徴とするものである
。

【００３６】それぞれの群に属する抗体は、ＩＬ−６に
対して競争的に結合する性質を有しているため、同じ群
に属する抗体を使用してサンドイッチ免疫測定方法を実
施することは出来ない。

【００３７】サンドイッチ免疫測定方法では、一方の抗
体を不溶性の固相に直接又は間接的に固定化（以下、固
定化抗体という）し、他方を酵素等に代表される標識物
質と直接又は間接的に結合させる（以下、コンジュゲ−
トという）が、本発明においては比較的高い親和性を有
する等の理由から、Ｂ群から選ばれた抗体を固定化抗体
とすることが好ましく、中でもＰＡＢ１１８が特に好ま
しい。

【００３８】これに対してＡ群から選ばれた抗体はコン
ジュゲ−トとすることが好ましく、中でもＰＡＢ１０１
が特に好ましい。

【００３９】上記のように固定化抗体（Ｂ群に属する抗
体）と標識化抗体（Ａ群に属する抗体）の組み合わせに
より良好な結果が得られ、中でもＰＡＢ１１８を固定化
抗体として使用するか又はＰＡＢ１０１を標識化抗体と
して使用した場合にはより良好なＩＬ−６のサンドイッ
チ免疫測定方法が提供される。更に、本発明で提供され
るＩＬ−６のサンドイッチ免疫測定方法の中でも、固定
化抗体としてＰＡＢ１１８を、標識化抗体としてＰＡＢ
１０１を使用する測定方法は、後の実施例で詳細に説明
するように最良の測定結果を導くことが可能である。

【００４０】このような抗体の組み合わせ、特にＰＡＢ
１０１抗体とＰＡＢ１１８抗体の組み合わせによれば、
他の組み合わせと比較して明確に高い測定精度を達成し
得るという事実は、Ａ群に属する抗体間には親和定数等
の免疫測定に影響を与えうる特徴にさほど大きな違いは
無く、またＢ群に属する抗体間の親和定数等にも大きな
違いが無いということから考えて、親和定数等以外の、
ＰＡＢ１０１又はＰＡＢ１１８抗体自体に由来する特徴
によるものと考えられる。

【００４１】ＰＡＢ１１８抗体を固定化抗体として使用
することは、前記のように、いかなる理由かは不明なが
ら、より測定精度の高い免疫測定を実施するうえで好ま
しいが、このことは、同時に他の面においても好ましい
効果を達成し得る。

【００４２】即ち、免疫測定において、Ｆ（ａｂ）´化
された抗体を使用すれば、血清や尿等に含まれる成分の
非特異的吸着を防止でき、結果としてバックグラウンド
のシグナル量（測定されるべき抗原等の量に相関しない
シグナル量）を低減することが可能であるが、本発明の
ＰＡＢ１０８、１０９、１１８抗体の中では、ＰＡＢ１
１８抗体が唯一、Ｆ（ａｂ）化し得るＩｇＧ１に属する
抗体だからである。

【００４３】本発明のＩＬ−６のサンドイッチ免疫測定
方法を実施するうえで、抗体の固相への固定化や抗体と
標識物質の固定化の方法は何等制限がないが、例えばＫ
ａｔｏｈら（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７８、２３５、１９
７５年）の方法に従うことが例示出来る。

【００４４】固相としては、例えば特開昭６２−１９７
４２５号等に記載されたようなものの他、例えばポリス
チレン製のカップやプレ−ト等、それ自体が反応空間を
提供する容器の内壁等、従来公知のものが制限なく使用
出来る。

【００４５】標識物質としては、例えば蛍光物質、発光
物質、放射性同位元素、吸光物質等を使用することが出
来るが、被爆の危険性がなく、更には比較的大きなシグ
ナルが得られる酵素を使用すると良く、中でもアルカリ
性フォスファタ−ゼやパ−オキシダ−ゼ等に代表される
タ−ンオ−バ−数の大きなものが好ましい。

【００４６】サンドイッチ免疫測定方法自体は、例えば
石川ら（酵素免疫測定法、第３版、１９８７年）、特開
昭５７−１６３５５号、特開昭４７−１８５９７号に記
載されたように、固定化抗体とＩＬ−６を結合させた後
、遊離のＩＬ−６を分離して標識化抗体を混合し、更に
遊離の標識化抗体を分離するいわゆる２ステップサンド
イッチ免疫測定方法であっても、固定化抗体、ＩＬ−６
及び標識化抗体を結合させた後、遊離の標識化抗体を分
離するいわゆる１ステップサンドイッチ免疫測定方法で
あっても良いが、後の実施例で示されるように２ステッ
プサンドイッチ法がより正確な測定を実施し得、好まし
い。

【００４７】また、本発明では、Ｆ（ａｂ）´化した抗
体を使用することに制限はない。このように、Ｆ（ａｂ
）´化した抗体を使用することで達成される効果は、先
に記載した通りである。また例えば、抗ＩＬ−６モノク
ロ−ナル抗体抗体を作製し、これを用いて間接的に固定
化するようないわゆる第２抗体を使用するサンドイッチ
免疫測定を行っても良い。

【００４８】５．ＩＬ−６のサンドイッチ免疫測定方法
用試薬キット。本発明の試薬キットは、少なくともＰＡ
Ｂ１０１、ＰＡＢ１０２、ＰＡＢ１０８、ＰＡＢ１０９
又はＰＡＢ１１８のいずれかの抗体を含む試薬キットで
ある。

【００４９】より具体的に、例えば２ステップサンドイ
ッチ免疫測定方法を実施するための試薬キットは、少な
くとも固定化抗体とコンジュゲ−トを含むものである。 これら抗体の他に、例えば抗体の安定化剤等を含んでい
ても良い。モノクロ−ナル抗体は、免疫反応を行う反応
容器中に封入されていても良いし、反応容器に後から添
加できるように分離した形で包括されていても良い。

【００５０】

【実施例】以下、本発明を更に詳細に説明するために実
施例を記載するが、これら実施例は本発明の一例であり
、本発明を限定するものではない。

【００５１】実施例１．抗ＩＬ−６抗体の調製（１）ハ
イブリド−マの調製 Ａｓａｇｏｅらの方法（Ａｓａｇｏｅら、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ，　６，ｐ８０６，１９８８年）に従っ
て調製したリコンビナントＩＬ−６を１週間に一度、合
計で４回、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹部に免疫した後、脾
細胞を取得し、ポリエチレングリコ−ルを用いてマウス
ミエロ−マ細胞株ＳＰ２／Ｏと融合させ、合計で２０株
のハイブリド−マを樹立した。 （２）ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの結合を阻害する抗体の選
択 ２マイクロｇ／ｍｌの抗ＩＬ−６Ｒ抗体ＭＴ１８（Ｙ．
Ｈｉｒａｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３，ｐ２
９００，１９８８　年）を含むＰＢＳ溶液（１ｌ中に、
８．０ｇ　　ＮａＣｌ、０．２ｇ　　ＫＣｌ、２．１６
ｇ　　Ｎａ２ＨＰＯ４、０．２ｇ　　ＫＨ２ＰＯ４を含
む液）を、９６穴のマイクロタイタ−プレ−ト（Ｎｕｎ
ｃ−Ｉｍｍｕｎｏ　　ＰｌａｔｅＣａｔ　　Ｎｏ．４３
９４５４、Ｎｕｎｃ社製）１穴当たり１００マイクロｌ
添加し、１晩４℃で放置した。ＰＢＳ溶液で穴を洗浄し
た後、約２マイクロｇ／ｍｌの可溶性ＩＬ−６Ｒ（ヨ−
ロッパ公開特許ＥＰ−３２５４７４号）を添加し、２時
間放置した。

【００５２】ＰＢＳ溶液で穴を洗浄後、２０株のハイブ
リド−マを培養して得られた上清の５０マイクロｌと２
００００ｃｐｍの　　１２５Ｉで標識した５０マイクロ
ｌのＩＬ−６を同時に添加し、２時間室温で放置し、Ｐ
ＢＳ溶液で洗浄した後にガンマカウンタ−を用いて各穴
に残った　　１２５Ｉ標識ＩＬ−６の量を測定した。

【００５３】対照として、ハイブリド−マの培養上清の
代わりにハイブリド−マを培養する際に使用したＤＭＥ
Ｍ（１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ、ｐＨ７．２）培地を
添加して同様の操作を行った。

【００５４】その結果、対照と比較して　　１２５Ｉ標
識ＩＬ−６が減少したハイブリド−マが５株得られた。 これらハイブリド−マを、それぞれＰＡＢ１０１、ＰＡ
Ｂ１０２、ＰＡＢ１０８、ＰＡＢ１０９、ＰＡＢ１１８
として、以下記載する。

【００５５】これら５株のハイブリド−マが産生する抗
体のいずれによってもＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの結合が阻
害された結果、測定された　　１２５Ｉのシグナルが減
少していることが分かり、中でもハイブリド−マＰＡＢ
１０８、１０９及び１１８に由来する抗体は、他と比較
して強くＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの結合を阻害することが
分かった。このことは即ち、これらハイブリド−マが産
生する抗体は、ＩＬ−６中のＩＬ−６Ｒとの結合部分又
はこの部分に非常に近い部分に結合することを示すもの
である。

【００５６】なお、ＰＡＢ１１８については１９９１年
１月２８日に、その他のハイブリド−マについては１９
９０年９月１０日に、通商産業省告示第　１７８号に従
い、工業技術院微生物工業技術研究所に菌寄第１１７２
１　号（ＰＡＢ１０１）、１１７２２　号（ＰＡＢ１０
２）、１１７２３　号（ＰＡＢ１０８）、１１７２４　
号（ＰＡＢ１０９）又は１１９７７　号（ＰＡＢ１１８
）として寄託されている。

【００５７】実施例２．ＩＬ−６の活性の中和の確認実
施例１で得られたＰＡＢ１０１、ＰＡＢ１０２、ＰＡＢ
１０８、ＰＡＢ１０９又はＰＡＢ１１８抗体の、ＩＬ−
６のヒトＢ細胞ＣＬ４に対する生理活性に及ぼす影響を
調べた。

【００５８】Ｔ．Ｈｉｒａｎｏらの方法（Ｔ．Ｈｉｒａ
ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．，８２，ｐ５４９０，　１９８５年）に従い、
ＩＬ−６の生理活性を受けて免疫グロブリンＭを産生す
るヒトＢ細胞ＣＬ４を用い、ＣＬ４に対するＩＬ−６の
免疫グロブリンＭ産生促進効果に与えるＰＡＢ１０１、
１０２、１０８、１０９又は１１８抗体の中和活性を調
査した。

【００５９】ＩＬ−６を５ｎｇ／ｍｌ濃度で使用し、０
．８マイクロｇ　／ｍｌの各抗体の共存下でＣＬ４細胞
を３時間培養し、産生されたＩｇＭ量を測定した。また
、対照として抗体の含まれていないＰＢＳ溶液、ＩＬ−
６及び抗体の含まれていないＰＢＳ溶液を使用して同様
の調査を行った。

【００６０】測定は、４０５ｎｍの吸光度を調査して行
った。

【００６１】結果を図１に示す。図１によれば、ＩＬ−
６とＩＬ−６Ｒの結合を阻害する性質を有するＰＡＢ１
０１、ＰＡＢ１０２、ＰＡＢ１０８、ＰＡＢ１０９及び
ＰＡＢ１１８抗体は、実際にＩＬ−６の生理活性を中和
することが明確に示された。

【００６２】また、生理活性の中和の度合いは、実施例
１で観察されたＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの結合を阻害する
度合いに相関しており、ＰＡＢ１１８、ＰＡＢ１０９、
ＰＡＢ１０８、ＰＡＢ１０１そしてＰＡＢ１０２の順に
弱くなることが分かった。

【００６３】実施例３．モノクロ−ナル抗体のＩＬ−６
への親和性の測定 本発明のモノクロ−ナル抗体のＩＬ−６への親和定数は
、免疫実験操作法（日本免疫学会編、ｐ２６９１から２
７０６）に記載された方法を参照して行った。

【００６４】０．５％のＢＳＡ及びそれぞれ０．２６、
０．９６、４．８、２４又は１２０マイクロｇ／ｍｌの
ＩＬ−６を含むＰＢＳ溶液を１００マイクロｌずつエッ
ペンドルフチュ−ブに加え、　　１２５Ｉでラベルした
ＩＬ−６を１６５５０ｃｐｍ／チュ−ブとなるように加
え、更にＰＡＢ１０１、ＰＡＢ１０２、ＰＡＢ１０８、
ＰＡＢ１０９又はＰＡＢ１１８抗体溶液（各々０．３２
ｍｌ／ｍｌに調製したもの）の１００マイクロｌを加え
て４℃で２時間反応させた後、０．６ｍｇ／ｍｌに調製
したウサギ抗マウスＩｇＧの５０マイクロｌ及び１２．
５マイクロｇ　／ｍｌに調製したマウスガンマグロブリ
ンの５０マイクロｌを添加し、４℃で１８時間反応させ
た。　　０．５％のＢＳＡを含むＰＢＳ溶液で洗浄した
１ｍｌのプロテインＧ−セファロ−ス（ファルマシア社
製）を２ｍｌの同溶液で懸濁し、その５０マイクロｌを
反応終了後のチュ−ブに加え、４℃で１時間放置した後
、５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して上清を除去し
、沈殿を０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄した後、そ
の中に含まれる　　１２５Ｉの放射能をガンマカウンタ
−でカウントし、スキャッチャ−ド解析により親和定数
を求めた。

【００６５】その結果、ＰＡＢ１０１では４．３１×１
０５　　Ｍ−１であり、ＰＡＢ１０２では３．７６×１
０５　　Ｍ−１であり、ＰＡＢ１０８では１．５５×１
０６　　Ｍ−１であり、ＰＡＢ１０９では２．１９×１
０６　　Ｍ−１であり、ＰＡＢ１１８では３．３６×１
０６　　Ｍ−１であった。

【００６６】実施例４．ＩＬ−６のサンドイッチ免疫測
定方法 ＰＡＢ１０１、ＰＡＢ１０２、ＰＡＢ１０８及びＰＡＢ
１０９抗体を用いて、ＩＬ−６のサンドイッチ免疫測定
方法を実施した。

【００６７】固定化抗体とコンジュゲ−トの組み合わせ
は、固定化抗体（ＰＡＢ１０１）に対してコンジュゲ−
ト（ＰＡＢ１０８又はＰＡＢ１０９）、固定化抗体（Ｐ
ＡＢ１０２）に対してコンジュゲ−ト（ＰＡＢ１０８又
はＰＡＢ１０９）、固定化抗体（ＰＡＢ１０８）に対し
てコンジュゲ−ト（ＰＡＢ１０１又はＰＡＢ１０２）及
び固定化抗体（ＰＡＢ１０９）に対して標識抗体（ＰＡ
Ｂ１０１又はＰＡＢ１０２）である。

【００６８】なお、固相としては前記したのと同様のプ
レ−ト（Ｎｕｎｃ社製）を、標識物質としてはアルカリ
性フォスファタ−ゼ（ＡＬＰ）を使用し、固相と抗体の
結合及び標識物質と抗体の結合はＫａｔｏｈらの方法（
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７８、２３５、１９７５年）に従
った。

【００６９】測定は、それぞれ０、１、２又は３ナノｇ
／ｍｌ濃度のリコンビナントＩＬ−６を含む測定溶液（
５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．１）、１ｍＭ　　Ｍｇ
Ｃｌ２、０．１５Ｍ　　ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０、０．０２％ＮａＮ３、１％ＢＳＡ）を試料溶液
として、試料溶液、固相（固定化抗体を含む）及び標識
抗体を混合して室温で１２０分間反応させ、ＰＢＳ溶液
で各穴を洗浄して未反応の標識抗体を除去し、ＡＬＰの
基質であるｐ−ｎｉｔｏｒｏｐｈｅｎｙｌ　　ｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅを１ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、ＡＬＰ
の酵素反応を停止させるために３Ｎ　　ＮａＯＨを含む
反応停止液を添加し、基質が分解されて生じるｐ−ｎｉ
ｔｏｒｏｐｈｅｎｏｌを４０５ｎｍの吸光度をモニタ−
して行った。

【００７０】結果を図２に示す。またそれぞれの抗体の
組み合わせの相性に関して、ＩＬ−６当たりの吸光度の
変化は、固定化抗体（ＰＡＢ１０１）に対してコンジュ
ゲ−ト（ＰＡＢ１０８又はＰＡＢ１０９）を使用するか
又は固定化抗体（ＰＡＢ１０２）に対してコンジュゲ−
ト（ＰＡＢ１０８又はＰＡＢ１０９）を使用した場合に
比較して、固定化抗体（ＰＡＢ１０８）に対してコンジ
ュゲ−ト（ＰＡＢ１０１又はＰＡＢ１０２）を使用する
か又は固定化抗体（ＰＡＢ１０９）に対して標識抗体（
ＰＡＢ１０１又はＰＡＢ１０２）を使用した場合の方が
はるかに大きいことが分かる。

【００７１】これらのことは、例えばＰＡＢ１０１とＰ
ＡＢ１０８の組み合わせであってもどちらを固定化抗体
として使用するかにより期待される測定精度が大きく変
わることを示し、ＰＡＢ１０１又はＰＡＢ１０２抗体を
固定化抗体として使用した場合に比較してＰＡＢ１０８
又はＰＡＢ１０９抗体を固定化抗体として使用した場合
、言い換えればＰＡＢ１０１又は１０２をコンジュゲ−
トとして使用した場合にはより好ましい結果が得られる
ことが分かる。

【００７２】また、ＰＡＢ１０１又はＰＡＢ１０２抗体
をコンジュゲ−トとして使用した場合を見ると、ＰＡＢ
１０２と比較してＰＡＢ１０１を使用する方が好ましい
結果が得られることも分かる。

【００７３】実施例５．ＩＬ−６のサンドイッチ免疫測
定方法（２） 実施例３で得られた結果を基に、標識抗体としてＰＡＢ
１０１を、固定化抗体としてＰＡＢ１０１抗体との組み
合わせで最良の相性を示したＰＡＢ１０８又はＰＡＢ１
１８抗体を使用し、ＩＬ−６サンドイッチ免疫測定を行
った。

【００７４】なお、固相、標識物質、固相と抗体の結合
、標識物質と抗体の結合、更には測定の手順等は実施例
３と同様であり、試料溶液としては１００から３００ピ
コｇ／ｍｌのＩＬ−６を含む溶液を使用した。

【００７５】結果を図３に示す。またそれぞれの抗体の
組み合わせの相性に関して、ＩＬ−６当たりの吸光度の
変化は、ＰＡＢ１０１とＰＡＢ１１８の組み合わせの方
がＰＡＢ１０１とＰＡＢ１０８の組み合わせに比較して
大きいことが分かった。

【００７６】これらの結果によれば、実施例４の結果最
良の相性を示したＰＡＢ１０１とＰＡＢ１０８の組み合
わせ以上にＰＡＢ１０１とＰＡＢ１１８の組み合わせの
相性が良いことが分かり、図３に従う限り、１０ｐｇ／
ｍｌ程度の低濃度ＩＬ−６を測定可能であると推定され
る。

【００７７】実施例６．天然のＩＬ−６のサンドイッチ
免疫測定方法 実施例５で使用した抗体の組み合わせ（ＰＡＢ１０１と
ＰＡＢ１０８の組み合わせ及びＰＡＢ１０１とＰＡＢ１
１８の組み合わせ）を用いて、天然のＩＬ−６のサンド
イッチ免疫測定を実施した。

【００７８】天然のＩＬ−６（ｎＩＬ−６）は、特開平
１−１３２３９８号に従ってｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ
から調製した。その他の固相、標識物質、固相と抗体の
結合や標識物質と抗体の結合、更には測定の手順等は実
施例４と同様である。

【００７９】結果を図４に示す。また、それぞれの抗体
の組み合わせの相関に関して、ＩＬ−６当たりの吸光度
の変化は、ＰＡＢ１０１とＰＡＢ１１８の組み合わせの
方がＰＡＢ１０１とＰＡＢ１０８の組み合わせより大き
いことが分かった。

【００８０】これらの結果によれば、ｎＩＬ−６を生物
学的検定により濃度検定すれば、ｎＩＬ−６のサンドイ
ッチ免疫測定により得られるシグナルはリコビナントＩ
Ｌ−６の測定により得られるシグナルに比較してやや微
量ではあるものの、リコビナントＩＬ−６を測定する場
合の抗体の組み合わせの相性は同様であり、ＰＡＢ１０
１とＰＡＢ１０８の組み合わせに比較してＰＡＢ１０１
とＰＡＢ１１８の組み合わせが優れていることが分かり
、図４からは２０ｐｇ／ｍｌ程度の低濃度まで測定可能
であると推定される。

【００８１】実施例７．低濃度ＩＬ−６のサンドイッチ
免疫測定方法 ＰＡＢ１０１とＰＡＢ１０８の組み合わせ及びＰＡＢ１
０１とＰＡＢ１１８の組み合わせを使用して、低濃度Ｉ
Ｌ−６のサンドイッチ免疫測定を行った。

【００８２】測定の手順等は実施例４と同様であり、試
料溶液としては０、１０、１００、２００又は３００ピ
コｇ／ｍｌの天然のＩＬ−６（ｎＩＬ−６）又はリコン
ビナントＩＬ−６（ｒＩＬ−６）を含む溶液を使用した
。

【００８３】結果を図５に示す。それぞれの抗体の組み
合わせの相関に関して、ＩＬ−６当たりの吸光度の変化
は、ＰＡＢ１０１とＰＡＢ１１８の組み合わせの方がＰ
ＡＢ１０１とＰＡＢ１０８の組み合わせより大きいこと
が分かった。

【００８４】これらの結果からは、ｎＩＬ−６のサンド
イッチ免疫測定により得られるシグナルは、生物学的検
定により求めたＩＬ−６の換算値（１Ｕが０．２ｎｇに
相当）と仮定して比較するならば、ｒＩＬ−６の測定に
より得られるシグナルに比較して微量であった。また、
ｎＩＬ−６又はｒＩＬ−６のサンドイッチ免疫測定のい
ずれの場合であっても、ＰＡＢ１０１とＰＡＢ１０８の
組み合わせに比較してＰＡＢ１０１とＰＡＢ１１８の組
み合わせが優れていることが確認され、図５に従えば、
１０ｐｇ／ｍｌ程度の低濃度ＩＬ−６を測定可能である
と推定される。

【００８５】実施例８．微量の天然ＩＬ−６のサンドイ
ッチ免疫測定方法 ＰＡＢ１０１とＰＡＢ１１８の組み合わせを使用して、
超微量の天然のＩＬ−６（ｎＩＬ−６）のサンドイッチ
免疫測定を行った。

【００８６】測定の手順等は実施例４と同様であり、試
料溶液としては０から２５０ピコｇ／ｍｌの天然のＩＬ
−６（ｎＩＬ−６）を含む溶液を使用した。

【００８７】結果を図６に示す。この結果によれば、Ｐ
ＡＢ１０１とＰＡＢ１１８を組み合わせて使用すること
で４ピコｇｎＩＬ−６程度のｎＩＬ−６の測定が可能な
ことが分かる。この値は正常人の血液中のｎＩＬ−６濃
度（７−１０ピコｇ／ｍｌ）の増減を十分に測定可能で
ある。

【００８８】実施例９．１ステップ又は２ステップサン
ドイッチ免疫測定方法 標識抗体にＰＡＢ１０１を使用し、固定化抗体にＰＡＢ
１０８抗体を使用して１ステップ及び２ステップのサン
ドイッチ免疫測定を行った。

【００８９】１ステップによる測定の手順等は実施例４
と同様である。２ステップによる測定の手順等は、固定
化抗体とリコンビナントＩＬ−６を含む試料溶液を混合
して免疫反応を行わせ、更に標識抗体を添加して反応さ
せ、未反応の標識抗体を洗浄して除去した以外は実施例
４と同様である。

【００９０】試料溶液としては０から２０００ピコｇ／
ｍｌのリコンビナントＩＬ−６を含む溶液を使用した。

【００９１】結果を図７に示す。ＩＬ−６当たりの吸光
度の変化は、１ステップより２ステップの方が大きいこ
とが分かる。

【００９２】これらの結果によれば、ＩＬ−６のサンド
イッチ免疫測定方法は２ステップで行うことにより、更
に高い精度で実施し得ることが分かる。

【００９３】実施例１０．ＩＬ−６の酵素増幅測定Ｃ．
Ｊ．Ｓｔａｎｌｅｙら（Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　８３
巻、ｐ８９から９５、１９８５年）を参照して、標識抗
体としてＡＬＰと結合させたＰＡＢ１０１を、固定化抗
体としてＰＡＢ１１８を使用してＩＬ−６の酵素増幅測
定を行った。

【００９４】それぞれ０、１、３、６、１２．５、２５
．０又は５０．０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−６を含むＰＢＳに
ＰＡＢ１０１抗体を加えて反応させ、ＰＡＢ１１８抗体
を固定化した９６穴プレ−トに添加し、各穴をＰＢＳで
洗浄して未反応のＰＡＢ１０１抗体を除去した。

【００９５】各穴に、０．４ｍｇ／ｍｌのＮＡＤＰを含
む０．１Ｍエタノ−ルアミン緩衝液（シグマ社製）の１
００マイクロｌを加え、室温で３０分間反応させ、更に
１００マイクロｌの酵素反応増幅液（１ｍｌ当たり、５
０マイクロｇのウマ肝臓由来のアルコ−ルデヒドロゲナ
−ゼ（ベ−リンガ−社製）、５０マイクロｇのジアホラ
−ゼ（ベ−リンガ−社製）、５０マイクロｌのエタノ−
ル、０．５ｍｇのＩＮＴ−ｖｉｏｌｅｔ（シグマ社製）
を含むｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸緩衝液）を加えて１
０分間反応させた。

【００９６】１０分後、０．２Ｍの硫酸を添加して反応
を停止させ、４９２ｎｍの吸光度を測定した。

【００９７】結果を図８に示す。図８によれば、本実施
例に示した方法は、これまで説明してきた方法以上に低
濃度（１ｐｇ／ｍｌ程度）のＩＬ−６を測定し得ること
が分かる。

【００９８】

【発明の効果】本発明によれば、５種（ＰＡＢ１０１、
ＰＡＢ１０２、ＰＡＢ１０８、ＰＡＢ１０９及びＰＡＢ
１１８）の従来とは異なる抗ＩＬ−６抗体が提供される
。その使用目的がＩＬ−６の免疫測定、ＩＬ−６の分離
又は精製、ＩＬ−６の生理活性の研究又はＩＬ−６に起
因する疾患の治療と多種に渡る現在、優れた性質を有す
る抗ＩＬ−６抗体をより多種提供することは重要な意義
を有している。

【００９９】このような意義に鑑みれば、ＩＬ−６とＩ
Ｌ−６Ｒの結合を阻害するという大きな特徴を有する本
発明の抗体は、例えば生理活性を有する形態で存在する
ＩＬ−６（天然のＩＬ−６かリコンビナントＩＬ−６か
を問わない）の生理活性濃度を測定し又はＩＬ−６に起
因する疾患の治療薬として特に有効である。

【０１００】事実、本発明はＩＬ−６のサンドイッチ免
疫測定方法を提供する。本発明の免疫測定方法によれば
、例えＩＬ−６がアルファ２−マクログロブリン等と結
合していたとしても、ＩＬ−６Ｒと相互作用し得る形態
、即ち生理活性を発揮し得る状態であればその濃度を測
定することが可能である。

【０１０１】本発明の免疫測定方法においては、ＰＡＢ
１０１又はＰＡＢ１０２を標識抗体とし、ＰＡＢ１０８
、ＰＡＢ１０９又はＰＡＢ１１８を固定化抗体とするこ
とで良好な結果が得られる。サンドイッチ免疫測定方法
においては、抗体自体のＩＬ−６への親和性等は勿論、
使用する２種の抗体の相性も重要である。

【０１０２】本発明の抗体に関しては、特に標識抗体と
してＰＡＢ１０１を、特に固定化抗体としてＰＡＢ１１
８を使用することが、超微量のＩＬ−６を測定する場合
には最良の組み合わせであることが実験的に示されてい
る。

【０１０３】このように、本発明のＩＬ−６のサンドイ
ッチ免疫測定方法は、ＩＬ−６とＩＬ−６が関与してい
ると示唆されている疾患の相関をより明確に調査する研
究用手段として、更にはＩＬ−６との相関が明確である
疾患についてはその早期発見のための臨床的手段として
、本発明の測定方法は有効である。

【０１０４】以上、本発明の抗ＩＬ−６抗体は種々の効
果を有するものであるが、これら抗体はそれを産生する
５種のハイブリド−マ（ハイブリド−マＰＡＢ１０１、
ＰＡＢ１０２、ＰＡＢ１０８、ＰＡＢ１０９及びハイブ
リド−マＰＡＢ１１８）により産生される。従ってこれ
らのハイブリド−マは、本発明の抗体を調製し又は本発
明のサンドイッチ免疫測定方法を実施するうえで極めて
重要である。

【０１０５】即ち、本発明の抗体はこれらのハイブリド
−マを適当な培地で培養し又は適当な動物腹腔内で培養
することで容易に取得することが可能である。また、例
えばＩＬ−６に起因する疾患の治療薬を開発する目的で
、本発明の抗体をキメラ化しようとする場合にも、これ
らハイブリド−マからの遺伝子等が有効である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、実施例２の結果を示すものである。図
中、縦軸は４０５ｎｍにおける吸光度、即ちヒトＢ細胞
ＣＬ４がＩＬ−６の生理活性を受けて産生した免疫グロ
ブリンＭの量を示し、横軸はＣＬ４に添加した溶液の内
容を示す。横軸は詳しくは、左のカラムからＩＬ−６溶
液のみを添加した場合、ＰＢＳ溶液のみを添加した場合
及びそれぞれ示された抗体を含むＰＢＳ溶液を添加した
場合の結果を示すものである。図中、吸光度が大きいカ
ラムは、ＩＬ−６の生理活性を受けてヒトＢ細胞ＣＬ４
が免疫グロブリンＭを大量に産生していることを示し、
小さいカラムは免疫グロブリンＭを少量にしか産生して
いないことを示す。

【図２】図２は、本発明の実施例４の結果を示すもので
ある。図中、縦軸は４０５ｎｍの吸光度、即ちＡＬＰの
酵素反応により生じた分解物の量を示し、横軸は免疫反
応に使用したＩＬ−６の濃度を示すものである。図中、
白丸の直線はＰＡＢ１０１（固定化抗体）とＰＡＢ１０
８抗体（標識抗体）を使用した場合の結果を示す。黒丸
の直線はＰＡＢ１０１（固定化抗体）とＰＡＢ１０９抗
体（標識抗体）を使用した場合の結果を示す。 白三角の直線はＰＡＢ１０２（固定化抗体）とＰＡＢ１
０８抗体（標識抗体）を使用した場合を示す。 黒三角の直線はＰＡＢ１０２（固定化抗体）とＰＡＢ１
０９抗体（標識抗体）を使用した場合を示す。 白四角の直線はＰＡＢ１０８（固定化抗体）とＰＡＢ１
０１抗体（標識抗体）を使用した場合を示す。 黒四角の直線はＰＡＢ１０８（固定化抗体）とＰＡＢ１
０２抗体（標識抗体）を、使用した場合を示す。 白星の直線はＰＡＢ１０９（固定化抗体）とＰＡＢ１０
１抗体（標識抗体）を使用した場合を示す。 黒星の直線はＰＡＢ１０９（固定化抗体）とＰＡＢ１０
２抗体（標識抗体）を、使用した場合を示す。

【図３】図３は、本発明の実施例５の結果を示すもので
ある。図中、縦軸は４０５ｎｍの吸光度、即ちＡＬＰの
酵素反応により生じた分解物の量を示し、横軸は免疫反
応に使用したＩＬ−６の濃度を示すものである。図中、
白丸の直線はＰＡＢ１０１（標識化抗体）とＰＡＢ１１
８抗体を使用した場合の結果を示し、黒丸の直線はＰＡ
Ｂ１０１（標識抗体）とＰＡＢ１０８抗体を使用した場
合の結果を示す。

【図４】図４は、本発明の実施例６の結果を示すもので
ある。図中、縦軸は４０５ｎｍの吸光度、即ちＡＬＰの
酵素反応により生じた分解物の量を示し、横軸は免疫反
応に使用した天然のＩＬ−６濃度を示すものである。図
中、白丸の直線はＰＡＢ１０１（標識抗体）とＰＡＢ１
１８抗体を使用した場合の結果を示し、黒丸の直線はＰ
ＡＢ１０１（標識抗体）とＰＡＢ１０８抗体を使用した
場合の結果を示す。

【図５】図５は、本発明の実施例７の結果を示すもので
ある。図中、縦軸は４０５ｎｍの吸光度、即ちＡＬＰの
酵素反応により生じた分解物の量を示し、横軸は免疫反
応に使用した天然またはリコンビナントのＩＬ−６濃度
を示すものである。図中、白抜の直線は天然のＩＬ−６
に関する結果であり、黒の直線はリコンビナントＩＬ−
６に関するである。なお、天然のＩＬ−６に関する結果
は、生物学的検定によって決定された濃度により示され
ている。また、丸の直線は固定化抗体としてＰＡＢ１０
８抗体を使用した結果であり、四角の直線は固定化抗体
としてＰＡＢ１１８抗体を使用した結果である。

【図６】図６は、本発明の実施例８の結果を示すもので
ある。図中、縦軸は４０５ｎｍの吸光度、即ちＡＬＰの
酵素反応により生じた分解物の量を示し、横軸は免疫反
応に使用した天然のＩＬ−６濃度を示すものである。

【図７】図７は、本発明の実施例９の結果を示すもので
ある。図中、縦軸は４０５ｎｍの吸光度、即ちＡＬＰの
酵素反応により生じた分解物の量を示し、横軸は免疫反
応に使用した天然のＩＬ−６濃度を示すものである。図
中、黒丸の直線は２ステップによるサンドイッチ免疫測
定の結果を、白丸の直線は１ステップによるサンドイッ
チ免疫測定の結果を示すものである。

【図８】図８は、本発明の実施例１０の結果を示すもの
である。図中、縦軸は４９２ｎｍの吸光度、即ち増幅さ
れたＡＬＰの酵素反応の結果を示し、横軸は免疫反応に
使用したＩＬ−６の濃度を示すものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】　　ヒトインタ−ロイキン−６に対して４
   ．３１×１０５　　Ｍ−１以上の親和定数を示し、免疫
   グロブリンＧ１ラムダクラスに属し、その結合によりヒ
   トインタ−ロイキン−６とヒトインタ−ロイキン−６レ
   セプタ−の結合を阻害し、ハイブリド−マＰＡＢ１０１
   （微工研菌寄第１１７２１号）により産生されるモノク
   ロ−ナル抗体ＰＡＢ１０１。 【請求項２】　　ヒトインタ−ロイキン−６に対して３
   ．７６×１０５　　Ｍ−１以上の親和定数を示し、免疫
   グロブリンＧ１ラムダクラスに属し、その結合によりヒ
   トインタ−ロイキン−６とヒトインタ−ロイキン−６レ
   セプタ−の結合を阻害し、ハイブリド−マＰＡＢ１０２
   （微工研菌寄第１１７２２号）により産生されるモノク
   ロ−ナル抗体ＰＡＢ１０２。 【請求項３】　　ヒトインタ−ロイキン−６に対して１
   ．５５×１０６　　Ｍ−１以上の親和定数を示し、免疫
   グロブリンＧ２ｂカッパ−クラスに属し、その結合によ
   りヒトインタ−ロイキン−６とヒトインタ−ロイキン−
   ６レセプタ−の結合を阻害し、ハイブリド−マＰＡＢ１
   ０８（微工研菌寄第１１７２３号）により産生されるモ
   ノクロ−ナル抗体ＰＡＢ１０８。 【請求項４】　　ヒトインタ−ロイキン−６に対して２
   ．１９×１０６　　Ｍ−１以上の親和定数を示し、免疫
   グロブリンＧ２ａカッパ−クラスに属し、その結合によ
   りヒトインタ−ロイキン−６とヒトインタ−ロイキン−
   ６レセプタ−の結合を阻害し、ハイブリド−マＰＡＢ１
   ０９（微工研菌寄第１１７２４号）により産生されるモ
   ノクロ−ナル抗体ＰＡＢ１０９。 【請求項５】　　ヒトインタ−ロイキン−６に対して３
   ．３６×１０６　　Ｍ−１以上の親和定数を示し、免疫
   グロブリンＧ１ラムダクラスに属し、その結合によりヒ
   トインタ−ロイキン−６とヒトインタ−ロイキン−６レ
   セプタ−の結合を阻害し、ハイブリド−マＰＡＢ１１８
   （微工研菌寄第１１９７７号）により産生されるモノク
   ロ−ナル抗体ＰＡＢ１１８。 【請求項６】　　請求項第１項のＰＡＢ１０１抗体を産
   生するハイブリド−マＰＡＢ１０１（微工研菌寄第１１
   ７２１号）。 【請求項７】　　請求項第２項のＰＡＢ１０２抗体を産
   生するハイブリド−マＰＡＢ１０２（微工研菌寄第１１
   ７２２号）。 【請求項８】　　請求項第３項のＰＡＢ１０８抗体を産
   生するハイブリド−マＰＡＢ１０８（微工研菌寄第１１
   ７２３号）。 【請求項９】　　請求項第４項のＰＡＢ１０９抗体を産
   生するハイブリド−マＰＡＢ１０９（微工研菌寄第１１
   ７２４号）。 【請求項１０】　　請求項第５項のＰＡＢ１１８抗体を
   産生するハイブリド−マＰＡＢ１１８（微工研菌寄第１
   １９７７号）。 【請求項１１】　　請求項６乃至１０項のいずれかのハ
   イブリド−マを培養することを特徴とするＰＡＢ１０１
   、ＰＡＢ１０２、ＰＡＢ１０８、ＰＡＢ１０９又はＰＡ
   Ｂ１１８のいずれかのモノクロ−ナル抗体の製造方法。 【請求項１２】　　次のＡ群の中から選ばれたいずれか
   のモノクロ−ナル抗体と次のＢ群の中から選ばれたいず
   れかのモノクロ−ナル抗体を使用することを特徴とする
   ヒトインタ−ロイキン−６のサンドイッチ免疫測定方法
   。 Ａ群（ＰＡＢ１０１、ＰＡＢ１０２） Ｂ群（ＰＡＢ１０８、ＰＡＢ１０９、ＰＡＢ１１８）【
   請求項１３】　　Ｂ群から選ばれるモノクロ−ナル抗体
   がＰＡＢ１１８であることを特徴とする請求項１２のサ
   ンドイッチ免疫測定方法。 【請求項１４】　　モノクロ−ナル抗体ＰＡＢ１１８を
   固相に固定化して使用することを特徴とする請求項１３
   のサンドイッチ免疫測定方法。 【請求項１５】　　Ａ群から選ばれるモノクロ−ナル抗
   体がＰＡＢ１０１であることを特徴とする請求項１２項
   のサンドイッチ免疫測定方法。 【請求項１６】　　モノクロ−ナル抗体ＰＡＢ１０１を
   検出可能な標識物質と結合させて使用することを特徴と
   する請求項１５のサンドイッチ免疫測定方法。 【請求項１７】　　請求項１２乃至１５に記載のサンド
   イッチ免疫測定法を実施するための、少なくとも下記Ａ
   群及びＢ群からそれぞれ１種ずつ選択されたモノクロ−
   ナル抗体を含むことを特徴とするヒトインタ−ロイキン
   −６のサンドイッチ免疫測定方法用試薬キット。 Ａ群（ＰＡＢ１０１、ＰＡＢ１０２） Ｂ群（ＰＡＢ１０８、ＰＡＢ１０９、ＰＡＢ１１８）