JP3392868B2

JP3392868B2 - マルチクローナル抗体フォーマットで結合タンパク質を用いた競合イムノアッセイ

Info

Publication number: JP3392868B2
Application number: JP51930594A
Authority: JP
Inventors: ベツグス，マイケル・ジエイ; ソーン，リンダ・ジエイ; ハーマン，ロバート・ジエイ; シユウ，ステイーブン・シー; ホークスワース，デイビツド・ジエイ; ピンカス，メアリー・エス
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1993-02-24
Filing date: 1994-02-24
Publication date: 2003-03-31
Anticipated expiration: 2018-03-31
Also published as: EP0686263B1; DE69427122T2; EP0686263A1; ES2157979T3; CA2156736C; DE69427122D1; AU6176594A; JPH08507603A; WO1994019695A1; US5434087A; CA2156736A1; EP0686263A4

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景 1.発明の分野本発明は、試料分析物に特異的な結合タンパク質が抗
体によって結合される特異的結合アッセイに関する。抗
体は結合タンパク質の異なるエピトープに対して特異的
であり、可溶性又は不溶性物質に結合し得、それによっ
て分離手順が容易になる。

2.従来技術の説明本発明は、特異的結合パートナーに対するリガンドの
親和性に基づいて液状媒体中のリガンドの存在を測定す
る方法及び手段に関する。特に本発明は、放射性物質を
使用しない特異的結合アッセイに用いるための方法及び
手段に関する。

人体における葉酸（folate）の欠乏は、巨赤芽球性貧
血の一般的な原因である。ヒトでは、葉酸はテトラヒド
ロ葉酸、次いで５−メチルテトラヒドロ葉酸（５′−mT
HF）に代謝される。５′−mTHFの濃度は、競合結合アッ
セイを用いて測定されることが多い。標準試薬中に較正
剤（calibrator）として用いられる５′−mTHFを含むの
が有用である。残念ながら５′−mTHFは非常に不安定で
あり、その使用には凍結乾燥形態で該物質を封入するこ
とを必要とし得る。

Corning Glass WorksのRicebergに付与された米国特
許第4,350,659号は、５′−mTHFと葉酸結合タンパク質
（FBP）のような結合タンパク質との複合体を形成する
ことにより５′−mTHFを安定化させる方法を開示してい
る。さらに複合体を凍結乾燥すると乾燥粉末が得られ
る。粉末の貯蔵に推奨されるものには気密及び耐光性容
器が含まれる。５′−mTHFは凍結乾燥によりその使用時
まで安定な形態で貯蔵し得る。そのような方法は、アッ
セイキットの製造には実用的ではなく、臨床実験用のセ
ッティングに用いることは難しい。さらに、凍結乾燥し
た物質を再構成した後でも不安定性問題が再発する可能
性がある。

ビタミンB₁₂の欠乏は神経損傷の原因となり得る。さ
らに、このビタミンは適切な葉酸代謝に必要なものであ
るために、その欠乏は巨赤芽球性貧血の原因ともなる。
巨大赤芽球症（megalobutastosis）は、他の原因による
葉酸の欠乏によっても発生し得るので、巨大赤芽球症が
これらのビタミンのいずれか一方又は両方の欠乏による
ものかどうかを決定する必要がある。

Corning Glass WorksのRicebergに付与された米国特
許第4,399,228号は、葉酸及びビタミンB₁₂の競合タンパ
ク質結合アッセイを開示している。放射性⁵⁷Co又は¹²⁵I
トレーサーを患者の試料に加えてガンマ計数管で計測す
る。該アッセイでは、結合タンパク質は多孔質ガラスに
共有結合される。患者試料中の内在性結合タンパク質は
反応管を沸騰させると破壊される。放射性物質の取り扱
いが危険且つ困難であることから、ラジオイムノアッセ
イと同様な感度及び迅速性を有し且つ結合反応を監視す
る手段として放射能以外の特性を利用する便利な特異的
結合アッセイシステムを開発しようとする多くの試みが
なされてきた。

Bio−Rad LaboratoriesのLewinらに付与された米国特
許第4,028,465号は、試料の血清葉酸を測定する放射性
競合アッセイ法を開示している。血清葉酸結合タンパク
質は加熱により不活化される。該発明は、加熱段階の前
の葉酸の安定化に用い得る緩衝液中のジチオトレイトー
ルのようなスルフヒドリルの使用を開示している。この
安定剤の使用は、該安定剤が臭気がひどくなく計量が容
易な固体であるという点でメルカプトエタノールを用い
る方法より有利である。

葉酸及びビタミンB₁₂アッセイは、内在性結合タンパ
ク質から試料中へ葉酸を遊離させるために試験の前に加
熱又は沸騰段階を用いるのが一般的であった。加熱又は
沸騰段階は正確な調節が困難であり且つ時間のかかるも
のである。より最近のアッセイでは、沸騰させずに化学
的手段により試料を変性させる。強塩基を用い、他の化
学物質を加えるか又は加えずに変性を行い得る。

Rohm and Haas CompanyのForandらに付与された米国
特許第4,418,151号も血清葉酸についてのラジオアッセ
イに関する。測定量の血清を一定量の放射線で標識した
ビタミンB₁₂及び／又は葉酸トレーサーと混合する。高
アルカリ性環境中、シアン化カリウムのような変換剤の
存在下に溶液をメルカプタン変性剤に暴露する。メルカ
プタン溶液の使用により、保護緩衝液中での安定化が可
能になり、且つ高pHのために内在性結合タンパク質が不
活化される。

University PatentsのAllenに付与された米国特許第
4,451,571号は、強塩基と共に、β−メルカプトエタノ
ール（BME）、チオグリコレート、チオグリセロール又
はジチオトレイトール（DTT）のようなスルフヒドラル
化合物の使用を開示している。スルフヒドラル化合物
は、内在性結合タンパク質を破壊し、それによって測定
試料のビタミンB₁₂又は葉酸が遊離する。強塩基は分析
物をその結合タンパク質から放出させはするが、全ての
内在性結合タンパク質を実質的に変性させはしない。従
って、結合タンパク質からの分析物の遊離を支援し且つ
アッセイに干渉し得る阻止（blocking）抗体を排除する
ために、スルフヒドラルのような別の化合物を有してい
るのが有利である。阻止抗体は、結合因子と反応するこ
とからアッセイにとって面倒な存在となり得る。

Cambridge Patent DevelopmentsのSelfに付与された
米国特許第4,828,985号は、非免疫原性物質と該非免疫
原性物質に対する一次抗体との複合体に対して二次抗体
を産生させる方法を教示している。二次抗体は、非免疫
原性物質に対する抗体でも一次抗体に対する抗体でもな
い。検出は、二次抗体を酵素標識又は何か他の検出可能
な手段で標識して行う。

本発明は、特異的結合タンパク質をより多く結合し得
る方法を開示している点で現存の技術より改良されてい
る。本発明は、結合タンパク質の異なるエピトープに対
して２種のモノクローナル若しくはポリクローナル抗体
の混合物又はモノクローナル抗体とポリクローナル抗体
との混合物により結合を増加させる方法を開示する。こ
の方法は、分析物を検出する数種の異なるアッセイに利
用し得る。本発明の他の利点は、このマルチクローナル
フォーマットにより、葉酸アッセイにおける較正剤とし
て、不安定な５′−mTHFの代わりにプテロイルグルタミ
ン酸（PGA）の使用が可能になるという点にある。

発明の要旨本発明は、特異的結合タンパク質結合能がマルチクロ
ーナル抗体フォーマットを用いることにより増強される
不均一系アッセイに関する。マルチクローナルフォーマ
ットは結合タンパク質を単一抗体フォーマットの効率の
最高10倍も結合させる。この改良法は概して、抗体混合
物を用いて特異的結合ペアメンバーを捕獲可能な物質に
直接又は間接に結合することを含む。特異的結合ペアメ
ンバーは結合部位を含んでおり、該部位は目標試料分析
物又は標識した分析物アナローグによって占拠される。
次いで、抗体、特異的結合ペアメンバー及び試料分析物
又は分析物アナローグが結合したものである捕獲可能物
質を、検出が行われ得るマトリックス物質とのイオン相
互反応により単離し得る。

本発明は、特異的リガンドを結合し得る結合タンパク
質を用いるいずれのアッセイにも利用可能である。本発
明の他の利点は、葉酸アッセイにおける較正剤として、
５′−mTHFの代わりにPGAを使用する点にある。葉酸ア
ッセイにおける５′−mTHFの慣用的な使用から、５′−
mTHFが不安定な化合物であることが立証された。本発明
を用いることにより、較正剤としてPGAの使用が可能に
なるが、モノクローナル又はポリクローナルフォーマッ
ト単独では、PGAと５′−mTHFとの間には性能に差があ
ることが示された。

発明の詳細な説明マルチクローナルフォーマット本発明は、特異的結合タンパク質に対するリガンドの
親和性に基づいて液状媒体中のリガンドの存在を測定す
る方法及び手段に関する。

本発明は、患者の試料中の分析物を測定するための不
均一アッセイ法を開示する。この方法には二つの分離し
た段階がある。第１段階は、ポリアニオン性物質と、特
定の結合タンパク質に対して異なる結合特異性を有する
抗体との結合である。次いで、結合タンパク質を抗体に
加えて、ポリアニオン／抗結合タンパク質抗体／結合タ
ンパク質複合体を形成する。この複合体を捕獲試薬と称
する。第２段階は、特定の試薬と患者の試料との反応で
ある。複合体中の結合タンパク質は、その特定の分析物
を患者の試料中で捕獲する。ポリアニオンを捕獲するポ
リカチオンマトリックスに反応混合物を移入する。酵素
に結合した分析物アナローグを含む試薬を加えて、占拠
されていない結合タンパク質に結合させる。結合してい
ない物質をマトリックスから洗いだし、酵素用の標準蛍
光基質を添加した後、蛍光強度から分析物の濃度を決定
することが可能である。

さらに本発明は、２種以上の抗結合タンパク質モノク
ローナル抗体の混合物又はモノクローナル抗体とポリク
ローナル抗体との混合物が単一の抗体だけの場合より良
好に機能する方法を用いる。この方法が如何に機能し得
るかを示す一つの例は、葉酸結合タンパク質（FBP）で
ある。２種以上の抗体（２種以上のモノクローナル抗
体、又はモノクローナル抗体とポリクローナル抗体との
混合物）を共有結合を介してカルボキシメチルアミロー
ス（CMA）のようなポリアニオンに結合させる。次いでF
BPを混合物に加え、FBPを非共有結合的に抗体に結合す
る。実際には、抗体はFBPとポリアニオンとの間の結合
剤として機能する。この方法により、結合タンパク質と
ポリアニオンとの直接結合が回避される。結合タンパク
質とポリアニオンとの直接結合は、結合タンパク質の高
次構造を変化させ、それによってその試験試料分析物に
結合する能力に影響を及ぼすことが可能である。単一の
モノクローナル抗体に対して２種の抗体を用いる場合の
著しい差を示すために、２種の個別のモノクローナル抗
体を２種の抗体の1:1混合物と対比して試験した。上記
の競合アッセイにおいて、FBPはモノクローナル抗体の
一方又は両方を介してCMAに結合した。２種の抗FBPモノ
クローナル抗体の1:1混合物はモノクローナル抗体単独
のものより良好に機能する。表１は、マルチクローナル
フォーマットが如何に有効であるかを示唆している。表
１の数字は基質の回転率（turnover rate）を示す。こ
のフォーマットが同一のタンパク質に対して異なる親和
性を有する抗体を用いていることに留意する必要があ
る。

２種の抗体の1:1混合物は、劇的にシグナルを増加さ
せる。これは、1:1混合物中の抗体によって結合される
葉酸結合タンパク質がより多く存在することを示唆して
いる。これは同様に、分析物アナローグの結合、従って
シグナルがより多く存在することを意味する。

抗体とポリアニオンとの結合は、２種の方法の中のい
ずれかで達成し得る。第１の方法では、個別のモノクロ
ーナル抗体又はモノクローナル抗体とポリクローナル抗
体との混合物を別々の時点で結合させることが可能であ
る。従って、抗体はそれぞれ、1:1に混合される前に、
別々のインキュベーション段階でポリアニオンに結合す
る。第２の方法は、両抗体を（適切な抗体比率を用い
て）混合し、次いで混合物を単一のインキュベーション
段階でポリアニオンに結合させるものである。第２の方
法は、一回のインキュベーション段階で行うために大量
の抗体を用いる作業に有用である。

異なる比率のモノクローナル抗体では、マルチクロー
ナルフォーマットを用いると個別のクローンだけの場合
より良い結果が得られる。マルチクローナルフォーマッ
トを少量添加するだけでさえ、抗結合タンパク質抗体／
結合タンパク質能力が増強されることは明らかである。
モノクローナル対マルチクローナルフォーマットを用
い、マルチクローナルフォーマットの比率を変えて実験
した結果を表２に示す。この場合もまた、示されている
値は、占拠されていない結合タンパク質部位に結合する
検出可能な標識に因る基質の回転率である。

葉酸結合タンパク質抗原の特性決定 PGAアフィニティークロマトグラフィーによりウシの
乳清からFBP抗原を単離した。銀染色されたポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（PAGE）及び等電点電気泳動によ
り、タンパク質の均一性を確認した。PAGEにより見られ
る２つの可視バンドは、グリコシル化及び非グリコシル
化ウシFBPの文献記載の分子量に相当する。カチオン／
アニオン交換クロマトグラフィー、並びに逆相高性能ク
ロマトグラフィー法では、FBP調製物中に２種の成分以
外は示されなかった。トリフルオロメタンスルホン酸を
用いた化学的脱グリコシル化により、高分子量成分は、
低分子量バンドと同一の電気泳動移動度を有する単一成
分に変換された。これらのデータは、２種の成分が、異
なるグリコシル化度を有するFBPを表すという結論を支
持するものである。

さらに、タンパク質がFBPであることが以下により立
証された。（１）タンパク質が放射性葉酸の特異的高親
和性結合を示し、（２）最初の23個のアミノ酸のＮ末端
アミノ酸配列を分析することにより、ウシFBPの文献記
載のアミノ酸配列（Svendsen,I.,Hansen,S.I.,Holm,J.
及びLyngbye,J.,Carlsberg Research Communications,4
9:12−31,1984）と完全に一致した明確な配列が得ら
れ、且つ（３）ガスクロマトグラフィー質量分析によ
り、30,850及び25,968の分子量を有する２種の成分が炭
水化物側鎖含有及び非含有FBPポリペプチドの予想質量
と一致することが示された。

FBPモノクローナル抗体の産生免疫原の調製動物免疫感作のための免疫原として、また反応性スク
リーニングのための抗原として、精製された葉酸結合タ
ンパク質（FBP）を用いた。

免疫感作戦略精製された葉酸結合タンパク質（FBP）を用いて２匹
の６〜８週齢メスBALB/cマウス（Charles River,Wilmin
gton,MA.）を免疫感作した。投与量は1:1の比率の完全
フロイントアジュバント（Freund's Complete Adjuvan
t）（Difco Laboratories,Detroit,MI.）:FBP溶液100μ
ｌ中200μgFBPであった。アジュバントエマルジョン注
入経路を腹膜内と皮下とに等分して行った。動物に３週
間の休養期間を与えてから、融合３日前に100μｌ中100
μｇのFBPの静脈内前融合追加免疫注射をした。

融合融合当日に、２匹のマウスを頚管切除して殺し、脾臓
を取り出した。脾細胞をIscove's Modified Dulbecco's
Medium（IMDM）（GIBCO、Grand Island,NY.）で一度洗
浄し、1000RPMで10分間遠心した。ペレット化脾細胞をS
P2/O骨髄腫細胞（Dr.Milstein,Cambridge,U.K.の研究室
から得た）と1:1の比率で合わせ、IMDMで洗浄し、遠心
した。上清を取り除き、1mlの50％ポリエチレングリコ
ール（PEG）（American Type Culture Collection,Rock
ville,MD.）を１分間でペレットに加えたが、その間、
軽くたたいたりかき回したりしてペレットがゆっくり分
散するようにした。混合物に30mlのIMDMを加え、上記の
ように遠心した。上清をデカントし、ペレットをHAT
（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン）（Gi
bco,Gaithersburg,MD.）、10％ウシ胎児血清（FBS）（H
yclone Laboratories,Logan,UT.）及びSalmonella typh
imurium mitogen（STM）（１％v/v）（RIBI Immunochem
Research,Inc.,Hamilton,MT.）と共にIMDMに再懸濁し
た。STMはＢ細胞特異的マイトジェンであり、融合頻度
を高めるために用いられる。融合細胞懸濁液を96ウエル
の組織培養プレートに入れた。

一次融合スクリーニング 10日目に一次融合スクリーニングを実施し、その時点
では培養は集密化していた。エンザイムイムノアッセイ
（EIA）を用いて上清試料の抗FBP反応性を検出した。マ
イクロタイターウエルをリン酸緩衝塩水（PBS）中５μg
/mlのFBP100μｌでコートし、室温で一晩インキュベー
トした。翌日、プレートを１ウエル当たり200μｌのPBS
中３％ウシ血清アルブミン（BSA）で30分間ブロックし
た。プレートを蒸留水で３回洗浄した後、１ウエル当た
り50μｌの培養上清を加え、１時間インキュベートし
た。プレートを３回洗浄し、１ウエル当たり50μｌの希
釈ヤギ抗マウスIgG＋IgM−HRPO（西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ）結合体（Kirkegaard Perry Laboratories,Gait
hersburg,MD.）をプレートに加え、30分間インキュベー
トした。最後のプレート洗浄をし、Ｏ−フェニレンジア
ミン2HCl（OPD）（Abbott Laboratories、Abbott Park,
IL）を用いて発色させた。光学密度の相対強度の読み取
りをしてハイブリッド＃１−279及び＃１−641を陰性対
照、即ち正常なマウス血清（NMS）（Organon Teknika−
Cappel,Malvern,PA）の３倍として同定し、該ハイブリ
ッドをクローニング及びその後の評価の候補として選択
した。

ハイブリッドのクローニングハイブリッド＃１−279及び＃１−641を限界希釈によ
りクローン化した。１×10²〜１×10⁶で出発して１〜10
倍希釈を行った。用いられたクローニング培地は10％v/
vFBS及び１％v/vHT（ヒポキサンチン及びチミジン）Sup
plement（Gibco,Gaithersburg,MD.）を含むIMDMであっ
た。100μｌの細胞懸濁液をTCプレートの96ウエルのそ
れぞれに加えた。７日目にプレートに１ウエル当たり20
0μｌのクローニング培地をフィードした。

クローンの選択追加のEIAスクリーニングに基づいて集密化培養のク
ローン上清についてさらに評価を行うために、１×10⁶
希釈ウエルからクローン＃１−279−176及び＃１−641
−101を選択した。用いられたEIAスクリーニング法は先
に記載のものである。

サブクローンの選択試薬の再現性のためには、１−279−176という単一の
細胞系を確実に得ることが必要であった。そのために、
細胞系を上記のように再度クローン化した。＃−１−27
9−866のサブクローン選択には上記のEIAスクリーニン
グを用いた。

ウェスターン法による評価２−メルカプトエタノール（Bio−Rad,Richmond,C
A.）を用いて還元及び非還元FBP抗原10μｇを、製造者
の指示により、ミニ電気泳動及びトランスファーシステ
ム（Profile^TMSystem,Schleicher ＆ Schuell,Keene,N.
H.）により、８〜16％、1.0mmのミニ−ポリアクリルア
ミドゲル（Novex,San Diego,CA）上で泳動させた。次い
でタンパク質をゲルからニトロセルロースに移動した。
ニトロセルロースをストリップに切断し、抗体をストリ
ップ上で数時間インキュベートした。還元及び非還元抗
原に対する抗体の結合能を、４−クロロ−ナプトール
（４−chloro−napthol）（Sigma,St.Louis,MO.）によ
り発色する上記のヤギ抗マウスIgG＋Ｍ−HRPO結合体を
用いて検出した。１−279−866由来の抗体は、還元及び
非還元条件下で32kD MW FBPに対して反応性であること
が判明した。１−641−101由来の抗体は、ウェスターン
法試験においてFBP抗原に対して反応性でないことが判
明した。これらのデータに基づき、ハイブリッド細胞系
が産生したモノクローナル抗体は、２種の異なるエピト
ープ結合部位に対するものであることが判明した。

アイソタイプ１−279−866及び１−641−101と同定された細胞系か
ら分泌されたモノクローナル抗体のアイソタイプをEIA
クロノタイピング（clonotyping）キット（Southern Bi
otech,Birmingham,AL.）で測定した。該アッセイは、製
造者の推薦する手法により行われ、その結果は、どちら
もIgG1、κ（カッパ）であったことを示している。

等電点電気泳動１−279−866及び１−641−101抗体の電気泳動をPhas
tSystem（Pharmacia−LKB,Piscataway,N.J.）で評価し
た。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電
気泳動（SDS−PAGE）プロフィールをクーマシー染色し
て、各抗体について、25kDの単一の軽鎖バンド及び55kD
の単一の重鎖バンドという典型的な抗体バンドパターン
を同定した。銀染色されたIEFプロフィールから、１−2
79−866については6.8±0.2のpIを、１−641−101につ
いては6.6±0.2のpIを同定した。

寄託細胞系１−279−866及び１−641−101をAmerican Tis
sue Culture Collection（A.T.T.C.）（Rockville,Mary
land）に寄託した。細胞系１−279−866はA.T.C.C.番号
HB11249、また１−641−101はA.T.C.C.番号HB11250の受
託番号を得た。

方法及び試薬本発明は、２種以上の抗結合タンパク質モノクローナ
ル抗体の混合物、又はモノクローナル抗体とポリクロー
ナル抗体との混合物により、モノクローナル若しくはポ
リクローナル単独のものよりもよい反応率を得る方法を
教示する。このアッセイ法は多くのタンパク質並びに、
葉酸及びビタミンB₁₂等の該タンパク質の結合剤に適用
可能であるが、これらには限定されない。

分析物の存在について試験すべき試料には、アッセイ
に干渉し得る内在性タンパク質を変性させる種々の段階
を課してよい。本発明は、酢酸、塩化ナトリウム及びエ
チレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）と混合したDTTを用
いて試料を前処理することが好ましい。DTTはタンパク
質を変性させるのみならず、５′−mTHFの還元形態を保
持させる。分析物によっては、他の一般的な変性剤をDT
Tの代わりとしてよい。

第２の変性段階では、試料に0.75M水酸化カリウムを
添加するのが好ましい。この添加は、試料中の内在性葉
酸結合物質をさらに変性させ、それによって測定対象で
ある葉酸を放出する高塩基性環境が造り出される。NaO
H、LiOH及びNH₄OHのような他の強塩基を用いてもよい。

用いられた捕獲法はCMAのようなポリアニオンを利用
する。ポリアニオンに結合するのは、葉酸結合タンパク
質と複合体を形成する抗葉酸結合タンパク質抗体の混合
物である。該抗体は、ポリアニオンと葉酸結合タンパク
質との間の結合剤として機能する。葉酸結合タンパク質
は、ポリアニオン関連抗体に非共有結合的に結合する。
変性した試料がFBPの添加前又は添加時に中和されるこ
とが重要である。本発明においては、中和はFBP添加時
に行われるのが好ましい。捕獲試薬は、50mMホウ酸緩衝
液（pH8.1）、0.2％ヒト血清アルブミン（HSA）、0.1％
Tween−20、0.1％アジ化ナトリウム、0.003％硫酸デキ
ストラン及び1mM EDTAからなる溶液に希釈してよい。HS
A構成成分は内在性葉酸結合タンパク質を含んでいな
い。アジ化ナトリウムは、ある程度の抗菌作用を提供し
得る一般に実験室用試薬に用いられている保存料であ
る。捕獲試薬中の硫酸デキストランは、アッセイの精度
に干渉し得る予期せぬ（stray）カチオン種（即ち、マ
トリックス由来のカチオンダスト）に結合する。

ホウ酸緩衝液を含む捕獲試薬を反応ウエルに添加し
て、変性剤を中和し、試薬中の葉酸を葉酸結合タンパク
質に結合させる。インキュベーション後、ポリアニオン
をポリカチオン物質に結合させるマトリックスに反応混
合物を移入する。

ポリカチオンの添加を可能にする種々の方法がある。
ポリカチオン物質は、該物質をポリアニオンに結合させ
る捕獲試薬に直接添加することが可能である。別の方法
は、反応混合物をマトリックスに添加する前の或る段階
でポリカチオンを反応混合物に添加するものである。好
ましい方法は、マトリックスをポリカチオンでプレコー
トし、次いで反応混合物を添加するものである。

結合体試薬（conjugate reagent）は、プテロイン酸
に結合し且つ50mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン（TRIS）（pH7.4）、0.5％HSA、0.1M塩化ナトリウ
ム、1mM塩化マグネシウム、0.1mM塩化亜鉛、0.1％硫酸
デキストラン及び0.1％アジ化ナトリウムに希釈したア
ルカリ性ホスファターゼ酵素を含んでいる。結合体は占
拠されていない葉酸結合タンパク質部位に結合する。結
合体試薬はプテロイン酸の使用には限定されない。PGA
を含む他の葉酸アナローグを結合体試薬に用いてもよ
い。

本発明においては、標準IMx（登録商標）（Abbott La
boratories,North Chicago,IL.,60064）メチルウンベリ
フェリルホスフェート基質を用いる。

先に述べたように、標準又は較正剤として５′−mTHF
を使用することには問題があった。５′−mTHFは、いっ
たん光、温度及び大気に暴露されると不安定になる。
５′−mTHFは、その不安定性により較正剤としての有用
性が無効になる。さらに、５′−mTHFは較正マトリック
ス中にヒト血清の使用を必要とし得る。また５′−mTHF
を用いる場合にはアスコルビン酸塩（ascorbate）及び
クエン酸塩（citrate）の添加も必要となる。これらを
添加すると、使用時の５′−mTHFの安定性は増大する
が、アスコルビン酸塩はアッセイを妨害することが判明
した。

本発明は、その較正試薬としてPGAを用いる。PGAを用
いることの利点はいくつかある。先ず、PGAは５′−mTH
Fより安定である。第２に、アッセイの較正にPGAを用い
ると５′−mTHFを用いる場合より結果の再現性がよい。
第３には、PGAの安定化にアスコルビン酸塩を必要とし
ない。さらに、較正剤としてPGAを用いると、較正剤用
希釈剤としてヒト血清の代りにウシ血清アルブミン（BS
A）を用いることが可能になる。これによって、ヒト血
清に係わる危険、コスト及び入手可能性などの問題がな
くなる。

５′−mTHFは患者試料中で実際に測定される葉酸の代
謝形態である。従って、５′−mTHF以外の較正剤は、適
切な結合タンパク質によって結合され、試料の５′−mT
HFレベルとの良好な相関関係を与えるに十分なものでな
ければならない。マルチクローナルフォーマットは、そ
の作用機序は不明であるが、５′−mTHFと同じようにFB
PとPGAとを結合させる。従って、マルチクローナルフォ
ーマットを用いることにより、PGAによる較正（又は検
量）が可能になり且つ試験試料５′−mTHFの良好な指示
が得られる。比較の例を図１に示す。

本発明の他の改良点は、クエン酸塩を添加すると、ゼ
ロ日値のPGA安定性が数カ月まで改善されたという発見
にある。PGAゼロ日値安定性をクエン酸塩（100mM）添加
及び非添加BSA希釈剤中で評価した。クエン酸を加える
と、PGAゼロ日値安定性は−20℃、４℃、45℃及び室温
で経時的に改善される。図２は、クエン酸塩のPGAゼロ
日値安定性増強効果を示している。試験ポイントは、IM
x（登録商標）装置で測定し、MUP回転率は示されている
日に測定した。得られた率をゼロ日の基準値（baseline
runs）と比較した。

同様な方法をビタミンB₁₂のアッセイに用いることが
できる。ビタミンB₁₂は、α−メチルチオグリセロール
を用い、それに続く高アルカリ性環境下に内在性の固有
因子から分離するのが好ましい。これは、放出されたビ
タミンB₁₂の捕獲試薬複合体との結合を可能にし、それ
によって検出過程が容易になる。

２種の慣用アッセイを用いて、患者試料を分析し、個
々の葉酸濃度を測定した。患者試料は、マルチクローナ
ル及びポリクローナルフォーマットの両方を用いて、Bi
o−Rad（登録商標）（Bio−Rad Chemical Div.Richmon
d,CA.,94804）及びCorning（登録商標）（Corning In
c.,Science Products Division,Corning,N.Y.,14831）
アッセイに対してIMx（登録商標）によって分析した。
表３からわかるように、２種の方法の間には良好な一致
が見られた。表示「Ｎ」は試験した患者試料の数を指
す。

マルチクローナル試薬が45℃で３日後にも良好な安定
性を示したという事実も重要である。２種の別個のモノ
クローナル、２種のモノクローナルの1:1混合物及びポ
リクローナル試料を異なる温度で試験した。マルチクロ
ーナル試薬（1:1混合物）は45℃で３日後にその４℃で
の活性の10％を失ったに過ぎない。表４に示されている
ように、マルチクローナルフォーマットは、高温での貯
蔵後の高基質回転率で示されているように、より多くの
結合タンパク質に結合する良好な能力を示している。

本発明の方法は、いくつかの分析物に適合するように
用いることが可能である。用いた抗体は、試薬性能の可
変性を排除するべく開発されたものである。初期には捕
獲試薬中で２種のCMA−抗体結合体を混ぜ合わせてマル
チクローナルフォーマットを製造した。これは後に、２
種の抗体を混ぜ合わせ、次いで混合物をCMAと結合させ
てマルチクローナル抗体を製造することにより簡易化さ
れた。抗体混合物は２種の別個のモノクローナル抗体で
あるか、又はモノクローナル抗体とポリクローナル抗体
との組み合わせであってよい。

アッセイの開始時に、試料にDTT試薬を加えて試料の
５′−mTHFを保存するための還元環境を維持する。DTT
は、ジスルフィド結合を還元し、他のタンパク質をより
アルカリ変性しやすくすることによって、タンパク質変
性剤としての機能も果たし得る。文献に記載されている
論文により、葉酸結合タンパク質が12以上のpHで不可逆
的に変性することが示唆されている。本発明は、好まし
くは水酸化カリウム試薬を用いて内在性葉酸結合タンパ
ク質を破壊することにより患者試料を変性させる。これ
によって、CMA/マルチクローナル/FBP複合体を、放出さ
れた患者試料葉酸に結合させる。従って、このアッセイ
では、変性のためにpHを再現可能に上昇させ、次いで捕
獲希釈剤で塩基を中和しなければならない。最近の文献
及び本出願人の経験は、約9.3のpHで較正剤中のPGAと試
料中の５′−mTHFとの最適な結合が得られることを示唆
している。

本発明において、希釈剤は、CMA/マルチクローナル/F
BP捕獲試薬を機能させ且つ安定に保つのに適切でなけれ
ばならないだけでなく、KOHの中和も行なわなければな
らない。従って、捕獲試薬は適切なPGA及び５′−mTHF
の性能を得るために反応pHを緩衝する。ホウ酸塩は9.3
に近いpKAを有し且つFBP結合能を助ける好ましい緩衝剤
である。４％スクロースを添加するとホウ酸塩の溶解度
が増大する。スクロースのこの機能の遂行能力は、ホウ
酸塩と結合するcis−ヒドロキシ基によるものである。
スクロースは、４℃で貯蔵されている捕獲希釈剤からホ
ウ酸塩が偶発的に沈殿するのを阻止する。

葉酸アッセイ 1.手順（ａ）IMx（登録商標）（Abbott Laboratories,Abbott
Park,IL.,60064）カルーセルに較正剤及び／又は対照並
びに試験試料（それぞれ最低100μｌ）をロードする。
次いで0.4mlのジチオトレイトール（DTT）をカルーセル
の第１反応セルの希釈前ウエルに入れる。

（ｂ）反応ウエルがそれぞれ第１反応セルの希釈前ウエ
ルからのDTT0.015ml及び較正剤、対照又は試料0.018ml
を受けとるとアッセイが始まる。DTTはタンパク質を変
性させ、試料中の５′−mTHFの還元形を保持する。各ウ
エルを８分間インキュベートする。

（ｃ）各反応ウエルに0.028mlの0.75M水酸化カリウム
（KOH）を加え、８分間インキュベートする。

（ｄ）反応ウエルに、0.15mlの捕獲試薬（ホウ酸緩衝液
中のFBPと複合体を形成したポリアニオン−抗FBP抗体）
を加える。捕獲試薬中のホウ酸緩衝液は、変性剤を中和
（約9.3の最終pH）し、試料中の葉酸とFBPとを結合させ
る。捕獲試薬中の硫酸デキストランは予期せぬカチオン
種（即ち、マトリックス由来のカチオンダスト）に結合
し、アッセイの可変要素を減少させる。ウエルを12.5分
間インキュベートする。

（ｅ）0.22mlの反応混合物を、ポリアニオン（抗体を介
してFBPに結合された）がイオン相互作用により反応セ
ルのマトリックス上のポリカチオンに結合するイオン捕
獲反応セルマトリックスに移入する。

（ｆ）マトリックスを希釈剤で２度洗浄して、結合して
いない物質を除去し、次いで0.06mlの結合体試薬を加え
る。用いられた結合体試薬はプテロイン酸に結合した仔
ウシ腸アルカリ性ホスファターゼである。結合体は捕獲
FBP上の葉酸が占拠していない部位に結合する。

（ｇ）次いで未結合の結合体をマトリックスの表面から
洗いだし、0.06mlのメチルウンベリフェリルホスフェー
ト（MUP）試薬を加え、遊離したMUの蛍光を読み取る。
蛍光強度は較正剤又は患者試料中の葉酸の量に反比例す
る。

ビタミンB₁₂アッセイ 1.手順（ａ）カルーセルに較正剤及び／又は対照並びに試験試
料（それぞれ最低100μｌ）をロードする。次いで0.4ml
のα−モノチオグリセロールをカルーセル中の第１反応
セルの希釈前ウエルに入れる。

（ｂ）各反応ウエルが0.01mlのα−モノチオグリセロー
ル及び0.06mlの較正剤、対照又は試料を受けとると検定
が始まる。還元剤がタンパク質を変性させる。８分間イ
ンキュベートする。

（ｃ）各反応ウエルに0.08mlのKOHを加え、８分間イン
キュベートする。

（ｄ）0.15mlの捕獲試薬（ホウ酸緩衝液中の固有因子と
複合体を形成したポリアニオン−抗固有因子抗体）を反
応ウエルに加え、次いで変性剤を中和（約9.3の最終p
H）し、試料中のビタミンB₁₂を固有因子と結合させる。
捕獲試料中の硫酸デキストランは予期せぬカチオン種
（即ち、マトリックス由来のカチオンダスト）に結合す
る。12.5分間インキュベートする。

（ｅ）0.15mlの反応混合物を、ポリアニオン（抗固有因
子抗体を介して固有因子に結合された）がイオン相互作
用によりマトリックス上にコートされたポリカチオンに
結合するイオン捕獲反応セルマトリックスに移入する。

（ｆ）マトリックスを希釈剤で２度洗浄し、次いで0.05
mlの結合体試薬を加える。用いられる結合体試薬は、ビ
タミンB₁₂又はビタミンB₁₂アナローグに結合した仔ウシ
腸アルカリ性ホスファターゼである。結合体は捕獲され
た固有因子上のビタミンB₁₂が占拠していない部位に結
合する。

（ｇ）次いで未結合の結合体をマトリックスの表面から
洗いだし、0.06mlのメチルウンベリフェリルホスフェー
ト（MUP）試薬を加え、遊離したMUの蛍光を読み取る。
蛍光強度は較正剤又は患者試料中のビタミンB₁₂の量に
反比例する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ハーマン，ロバート・ジエイアメリカ合衆国、イリノイ・60031、ガーニー、ケンウツド・アベニユー・3514 (72)発明者シユウ，ステイーブン・シーアメリカ合衆国、イリノイ・60061、バーノン・ヒルズ、アシユランド・コート・204 (72)発明者ホークスワース，デイビツド・ジエイアメリカ合衆国、イリノイ・60060、マンデレイン、ノース・グリーンビユウ・ 146 (72)発明者ピンカス，メアリー・エスアメリカ合衆国、イリノイ・60630、シカゴ、ウエスト・グレゴリー・4845 (56)参考文献特開昭58−210567（ＪＰ，Ａ) 特表昭58−501008（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/543 511

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】試験試料中の分析物の存在又は量を測定す
るための改良法であって、分析物に特異的な第１の結合ペアメンバーに特異的であ
り且つ捕獲可能な物質に結合した少なくとも２種の異な
るモノクローナル抗体の混合物又はモノクローナル抗体
とポリクローナル抗体との混合物を用いて、前記第１の
結合ペアメンバーを前記捕獲可能な物質に結合する段
階、前記試験試料中に存在する任意の分析物を前記第１
の結合ペアメンバーに捕獲させる段階、分析物又は第１
の結合ペアメンバーに指向する第２の特異的結合ペアメ
ンバーに直接又は間接的に結合した検出可能な標識を添
加する段階、前記捕獲可能な物質を捕獲して、該物質を
試験試料から分離する段階、及び遊離しているか又は捕
獲された検出可能な標識を前記分析物の存在又は量に関
して監視する段階を含む前記方法。
【請求項２】試験試料中の分析物の存在又は量を測定す
るための方法が、第１の特異的結合ペアメンバーに特異的な第２の特異的
結合ペアメンバーに直接又は間接的に結合した検出可能
な標識を含む指示試薬及び、前記第１の特異的結合ペア
メンバーに対する少なくとも２つの異なるモノクローナ
ル抗体の混合物又はモノクローナル抗体とポリクローナ
ル抗体との混合物によってポリアニオンポリマーに結合
した前記第１の特異的結合ペアメンバーを含む捕獲試薬
に、試験試料を接触させて試験混合物を形成する段階、
前記捕獲試薬との結合に関して前記試験試料を前記指示
試薬と競合させる段階、マトリックスにイオン結合させ
ることにより前記試験試料から前記ポリアニオンポリマ
ーを分離する段階、並びに遊離しているか又は捕獲され
た検出可能な標識を監視して、前記試験試料中の前記分
析物の存在又は量を測定する段階からなる、請求項１に
記載の方法。
【請求項３】前記試験試料を、前記捕獲試薬、次いで前
記指示試薬に順次接触させることにより前記試験混合物
を形成する請求項２に記載の方法。
【請求項４】それぞれ異なる抗体にカップリングされた
数種の捕獲物質を混合することにより抗体混合物を得る
請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記第１の特異的結合ペアメンバーが前記
試験試料中の特定の分析物に特異的な結合タンパク質で
ある請求項２に記載の方法。
【請求項６】前記第１の特異的結合ペアメンバーが葉酸
結合タンパク質であり、前記分析物が葉酸である請求項
５に記載の方法。
【請求項７】前記捕獲試薬と組み合わせる前に、試験試
料を還元剤で処理し、次いでアルカリ性剤で処理する請
求項２に記載の方法。
【請求項８】標準試薬としてプテロイルグルタミン酸
（PGA）を用いる請求項６に記載の方法。
【請求項９】クエン酸塩を添加することにより前記PGA
を安定化させる請求項８に記載の方法。
【請求項１０】葉酸分析物と競合する前記第２の特異的
結合ペアメンバーがプテロイン酸である請求項６に記載
の方法。
【請求項１１】第１の特異的結合ペアメンバーが固有因
子であり、分析物がビタミンB12である請求項２に記載
の方法。
【請求項１２】前記マトリックスをポリカチオン物質で
プレコートすることにより該マトリックスを製造する請
求項２に記載の方法。
【請求項１３】細胞系A.T.C.C.寄託番号HB−11249によ
って分泌される請求項１に記載の方法に有用なモノクロ
ーナル抗体。
【請求項１４】細胞系A.T.C.C.受託番号HB−11250によ
って分泌される請求項１に記載の方法に有用なモノクロ
ーナル抗体。