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JP7323102B2 - 抗ｐｓｍａ抗体およびその使用 - Google Patents

抗ｐｓｍａ抗体およびその使用 Download PDF

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Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年４月１３日に出願された米国仮出願第６２／３２１９７５号に対する優先権を主張する。本出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
男性のうち１４％が、一生の間に前立腺癌と診断されていることが示されている。２０１２年には、２８０万人もの人が前立腺癌であると診断されており、死亡率は、１０万人当たり２１．４人である。しかしながら、手術、放射線療法、化学療法およびアンドロゲン除去療法などの現在の手法は、それらの末期癌に対する効果は限定的である。これまでのところ、根治手術が、依然として前立腺癌の主要な治療法である。したがって、出現しているプレシジョン・メディシン、特に腫瘍ターゲティング抗体に基づく薬は、前立腺治療の転帰を改善することが期待されている。
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）は、前立腺上皮細胞に特異的なマーカーとして確認されており（Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｃｚ，Ｊ．Ｓ．ら、（１９８７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、７（５Ｂ）：９２７－３５；Ｉｓｒａｅｌｉ，Ｒ．Ｓ．ら、（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、５３（２）：２２７－３０；Ｉｓｒａｅｌｉ，Ｒ．Ｓ．ら、（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、５４（７）：１８０７－１１；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｇ．Ｌ．，Ｊｒ．ら、（１９９５）Ｕｒｏｌ Ｏｎｃｏｌ、１（１）：１８－２８；Ｔｒｏｙｅｒ，Ｊ．Ｋ．ら、（１９９５）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、６２（５）：５５２－８；Ｓｏｋｏｌｏｆｆ，Ｒ．Ｌ．ら、（２０００）Ｐｒｏｓｔａｔｅ、４３（２）：１５０－７）、前立腺癌を標的とするプレシジョン・メディシンを開発するための基礎を担っている。組織学的研究により、ほとんど全ての前立腺癌がＰＳＭＡを発現することが示され（Ｂｏｓｔｗｉｃｋ，Ｄ．Ｇ．ら、（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ、８２（１１）：２２５６－６１；Ｋｕｓｕｍｉ，Ｔ．ら、（２００８）Ｐａｔｈｏｌ Ｉｎｔ、５８（１１）：６８７－９４；Ｍａｎｎｗｅｉｌｅｒ，Ｓ．ら、（２００９）Ｐａｔｈｏｌ Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｓ、１５（２）：１６７－７２；Ａｎａｎｉａｓ，Ｈ．Ｊ．ら、（２００９）Ｐｒｏｓｔａｔｅ、６９（１０）：１１０１－８）、悪性度が高い癌、または転移、またはアンドロゲン除去療法に耐性のある癌は、通常、さらに多くのＰＳＭＡを発現する（Ａｎａｎｉａｓ，Ｈ．Ｊ．ら、（２００９）Ｐｒｏｓｔａｔｅ，６９（１０）：１１０１－８；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｇ．Ｌ．，Ｊｒ．ら、（１９９５）Ｕｒｏｌ Ｏｎｃｏｌ、１（１）：１８－２８；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｇ．Ｌ．，Ｊｒ．ら、（１９９６）Ｕｒｏｌｏｇｙ、４８（２）：３２６－３４；Ｓｗｅａｔ，Ｓ．Ｄ．ら、（１９９８）Ｕｒｏｌｏｇｙ，５２（４）：６３７－４０）。ＰＳＭＡは、前立腺特異的マーカーであると考えられていたが、後の研究では、腸細胞、腎近位尿細管および唾液腺も低レベルのＰＳＭＡを発現することが示された（Ｔｒｏｙｅｒ，Ｊ．Ｋ．ら、（１９９５）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，６２（５）：５５２－８）。なお、正常組織でのＰＳＭＡ発現レベルは、腫瘍における発現レベルよりも１００～１０００倍低く（Ｓｏｋｏｌｏｆｆ，Ｒ．Ｌ．ら、（２０００）Ｐｒｏｓｔａｔｅ、４３（２）：１５０－７）、これらの正常組織は、通常、血中の抗体に容易に接近することはできず（Ｔｒｏｙｅｒ，Ｊ．Ｋ．ら、（１９９５）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、６２（５）：５５２－８）、これは、ＰＳＭＡを標的とするイメージングおよび治療の安全性をさらに保証するものであった。
ＰＳＭＡは、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼであり（Ｐｉｎｔｏ，Ｊ．Ｔ．ら、（１９９６）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２（９）：１４４５－５１）、前立腺癌におけるその機能は、明らかになっていない。しかし、高いＰＳＭＡ発現は、癌の高浸潤に関係があることが明らかにされている。したがって、ＰＳＭＡを標的としたイメージングおよび治療は、前立腺癌の診断および処置の転帰をかなり改善するであろう。前立腺に加え、ＰＳＭＡは、多くの固形腫瘍における新生血管でも高度に発現する一方、正常な血管には存在しない（Ｓｏｋｏｌｏｆｆ，Ｒ．Ｌ．ら、（２０００）Ｐｒｏｓｔａｔｅ、４３（２）：１５０－７）。したがって、ＰＳＭＡは、前立腺癌のためだけではなく、他の固形腫瘍の新血管形成を標的とする治療のための理想的なマーカーでもある。
抗体は、腫瘍細胞上で発現される腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原を特異的に認識することができるという点で、腫瘍標的化のための最も効率的なツールであり、早期腫瘍検出、抗体薬物コンジュゲートおよび放射線療法、癌治療のためのキメラ抗原受容体Ｔ細胞またはＮＫ細胞療法のための光学イメージング、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴまたはＭＲＩイメージングへの道筋をつけるものである。残念ながら、現在市販されているＰＳＭＡ抗体はない。
したがって、癌の治療のためのＰＳＭＡを標的とする組成物および方法の必要性が当該分野において存在する。本発明は、この満たされていない必要性を満たすものである。
本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読めばより良く理解されるであろう。本発明を例示する目的のために、図面には現在好ましい実施形態が示されている。しかしながら、本発明は、図面に示された実施形態の正確な配置および手段に限定されないことを理解されたい。
図１は、ｇｙ１ ｓｃＦｖがＰＳＭＡ＋細胞に特異的に結合することを示すグラフである。ＰＳＭＡ上のＳｃＦｖ ｇｙ１結合を、フローサイトメトリーを用い、ＬＮＣａｐ ＦＧＣ細胞で試験した。簡潔には、ＬＮＣａｐ ＦＧＣ細胞をベルセン溶液で剥離し、ＰＢＳで洗浄し、氷上で１時間、ＦＡＣＳ緩衝液で３倍に希釈したｇｙ１含有酵母上清とともにインキュベートした。細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、暗室で、ＦＡＣＳ緩衝液中の１：２００希釈抗Ｖ５－Ａｌｅｘａ６４７と共に氷上で１時間インキュベートした。冷ＰＢＳで３回洗浄することにより、結合していない抗Ｖ５－Ａｌｅｘａ６４７を除去し、次いで細胞を８μｌのビアプローブ（ｖｉａ－ｐｒｏｂｅ）（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する３００μｌのＦＡＣＳに再懸濁した。ＬＮＣａｐ ＦＧＣ細胞上のＧｙ１結合は、フローサイトメトリーを用いて検出され、ここでは、生きた細胞のみがゲートされ、分析された。フローサイトメトリーコントロールには、（１）染色されていない細胞と、（２）抗Ｖ５－Ａｌｅｘａ６４７で染色した細胞が含まれる。実線の灰色の線は染色されていない細胞を表す。点線の黒い線は、抗Ｖ５－Ａｌｅｘａ６４７で染色した細胞を表す。実線の黒い線は、ｇｙ１ ｓｃＦｖで染色し、次いで抗Ｖ５－Ａｌｅｘａ６４７で染色した細胞を示す。 図２は、ｇｙ１ ｓｃＦｖがＬｎＣａｐ細胞上の抗原結合に有意に内在化されたことを実証する実験の結果を示す。ＬｎＣａｐ ＦＧＣ細胞を２枚の４８ウェルプレートに播種した。翌日、１００μｌのｇｙ１ ｓｃＦｖ含有酵母上清を、室温で１時間、２００μｌの容量（１００μｌの上清＋１００μｌの細胞培地）中の４μｌの抗Ｖ５－Ａｌｅｘａ４６７と共にプレインキュベートした。次いで、細胞を培地で１回洗浄し、２００μｌのｇｙ１含有培地（１００μｌの新鮮な培地＋１００μｌのプレインキュベーションしたｇｙ１－色素培地）と共に３７℃および４℃でそれぞれ１時間、暗室でインキュベートした。コントロールとして、細胞を両方の温度について同じ濃縮抗Ｖ５－Ａｌｅｘａ４６７とともにインキュベートした。冷ＰＢＳで２回洗浄した後、２００μｌのトリプシンをウェルに加えて細胞表面タンパク質をＲＴで３０分間消化した。次いで、５００μｌの培地を各ウェルに添加してトリプシン処理を停止させ、細胞を２回洗浄し、次いでフローサイトメトリー分析のためにＦＡＣＳ緩衝液を含むビアプローブに懸濁させた。左のパネルは、４℃のインキュベートされた細胞を表し、右のパネルは、３７℃のインキュベートされた細胞を表す。灰色の実線は、単純培地のみを用いてインキュベートした細胞を表す。黒色の点線は、抗Ｖ５－Ａｌｅｘａ６４７と共にインキュベートした細胞を表す。一方、黒色の実線は、予め作成しておいたｇｙ１－抗Ｖ５－Ａｌｅｘａ６４７と共にインキュベートした細胞を表す。 図３は、ｇｙ１ ｓｃＦｖに対する親和性を測定する実験の結果を示す。Ｇｙ１ ｓｃＦｖ親和性を捕捉ＥＬＩＳＡを用いて測定した。簡単に説明すると、抗Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ）を、ＥＬＩＳＡプレートに、４℃で一晩、ＰＢＳ中でコーティングした。プレートを洗浄し、ＰＢＳＴＭでブロッキングし、３個ずつ、３倍に順次希釈したｇｙ１ ｓｃＦｖと共にインキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、ビオチン化ＰＳＭＡと共にインキュベートし、結合をストレプトアビジン－ＨＲＰで検出し、ＴＭＢ、次いで停止バッファーを用いて比色展開により分析した。ＯＤ４５０での吸光度を測定し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて親和性を計算した。 図４は、図４Ａ～図４Ｃを含み、大腸菌におけるｇｙ１ ｓｃＦｖ発現の実験結果を示す。ｇｙ１ ｓｃＦｖを、０．０５ｍＭ ＩＰＴＧで誘発させたベクターｐＥＴ３０２を用い、３０℃で４時間、大腸菌ＢＬ２１中で発現させた。ソニケーターを用いて大腸菌細胞を溶解し、ＨｉｓＴｒｐ ＨＰカラムを用いてｇｙ１タンパク質を精製した。図４Ａ：ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、誘発された大腸菌における可溶性ｇｙ１発現を示す。レーン１：マーカー；レーン２：誘発されていない全細胞溶解物；レーン３～５：誘発された細胞溶解物、全細胞（３）、上清（４）および沈殿（５）。図４Ｂ：ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、精製されたｇｙ１タンパク質を示す。レーン１：マーカー；レーン２：誘発されていない細胞溶解物の上清；レーン３：細胞溶解物の誘発された上清、レーン４：精製されたｇｙ１ ｓｃＦｖ。図４Ｃ：ウェスタンブロット分析は、抗Ｈｉｓ６ Ａｂによる精製ｇｙ１組換えタンパク質を確認する。レーン１：誘発されていない細胞溶解物の上清；レーン２：細胞溶解物の誘発された上清、レーン３：精製されたｇｙ１ ｓｃＦｖ。 図４は、図４Ａ～図４Ｃを含み、大腸菌におけるｇｙ１ ｓｃＦｖ発現の実験結果を示す。ｇｙ１ ｓｃＦｖを、０．０５ｍＭ ＩＰＴＧで誘発させたベクターｐＥＴ３０２を用い、３０℃で４時間、大腸菌ＢＬ２１中で発現させた。ソニケーターを用いて大腸菌細胞を溶解し、ＨｉｓＴｒｐ ＨＰカラムを用いてｇｙ１タンパク質を精製した。図４Ａ：ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、誘発された大腸菌における可溶性ｇｙ１発現を示す。レーン１：マーカー；レーン２：誘発されていない全細胞溶解物；レーン３～５：誘発された細胞溶解物、全細胞（３）、上清（４）および沈殿（５）。図４Ｂ：ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、精製されたｇｙ１タンパク質を示す。レーン１：マーカー；レーン２：誘発されていない細胞溶解物の上清；レーン３：細胞溶解物の誘発された上清、レーン４：精製されたｇｙ１ ｓｃＦｖ。図４Ｃ：ウェスタンブロット分析は、抗Ｈｉｓ６ Ａｂによる精製ｇｙ１組換えタンパク質を確認する。レーン１：誘発されていない細胞溶解物の上清；レーン２：細胞溶解物の誘発された上清、レーン３：精製されたｇｙ１ ｓｃＦｖ。 図４は、図４Ａ～図４Ｃを含み、大腸菌におけるｇｙ１ ｓｃＦｖ発現の実験結果を示す。ｇｙ１ ｓｃＦｖを、０．０５ｍＭ ＩＰＴＧで誘発させたベクターｐＥＴ３０２を用い、３０℃で４時間、大腸菌ＢＬ２１中で発現させた。ソニケーターを用いて大腸菌細胞を溶解し、ＨｉｓＴｒｐ ＨＰカラムを用いてｇｙ１タンパク質を精製した。図４Ａ：ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、誘発された大腸菌における可溶性ｇｙ１発現を示す。レーン１：マーカー；レーン２：誘発されていない全細胞溶解物；レーン３～５：誘発された細胞溶解物、全細胞（３）、上清（４）および沈殿（５）。図４Ｂ：ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、精製されたｇｙ１タンパク質を示す。レーン１：マーカー；レーン２：誘発されていない細胞溶解物の上清；レーン３：細胞溶解物の誘発された上清、レーン４：精製されたｇｙ１ ｓｃＦｖ。図４Ｃ：ウェスタンブロット分析は、抗Ｈｉｓ６ Ａｂによる精製ｇｙ１組換えタンパク質を確認する。レーン１：誘発されていない細胞溶解物の上清；レーン２：細胞溶解物の誘発された上清、レーン３：精製されたｇｙ１ ｓｃＦｖ。 図５は、大腸菌発現ｇｙ１ ｓｃＦｖがＰＳＭＡ＋細胞に特異的に結合することを示す実験結果を示す。フローサイトメトリーを用いて、大腸菌発現ｇｙ１ ｓｃＦｖのＰＭＳＡ陽性および陰性細胞への結合を調べた。前立腺癌細胞、ＬＮＣａＰ、Ｃ４－２、ＰＣ３－ＰＳＭＡ＋およびＰＣ３－ＰＳＭＡ－細胞をＶｅｒｓｅｎｅ溶液で剥離させ、１００ｎＭのｇｙ１またはコントロールｓｃＦｖ ＮＣＰ１を用い、４℃で３０分間インキュベートし、その後、洗浄し、ＦＩＴＣコンジュゲート化マウス抗６Ｈｉｓ ＩｇＧ（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ；Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と共に、暗室で、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。並行して、ＰＳＭＡタンパク質発現は、ＰＥコンジュゲート抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体によって検出された。 図６は、細胞ＥＬＩＳＡによる大腸菌が発現したｇｙ１ ｓｃＦｖの親和性を再確認する実験結果を示す。ＰＳＭＡ陽性細胞株Ｃ４－２について大腸菌発現ｇｙ１ ｓｃＦｖの親和性を測定した。簡単に説明すると、９６ウェルプレートで培養したＣ４－２を４％パラホルムアルデヒドで固定し、３％Ｈ２Ｏ２および６％ウシ血清アルブミンで順次ブロックした。次に、細胞を連続希釈した３倍のｇｙ１およびコントロールｓｃＦｖ ＮＣＰ１とともに８１００ｎＭから０．００５ｎＭまで３７℃で１時間インキュベートした。細胞結合は、ＨＲＰコンジュゲートマウス抗６Ｈｉｓで検出され、比色シグナルは、ＴＭＢによって発色させ、停止バッファーによって停止した。４５０ｎｍの吸光度を用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０ソフトウェアを用いてｇｙ１親和性を計算した。 図７は、ｇｙ１ ｓｃＦｖが抗原結合に内在化され得ることを実証する実験の結果を示す。前立腺癌細胞、すなわちＬｎＣａｐ、Ｃ４－２、ＰＣ３－ＰＳＭＡ＋、およびＰＣ３－ＰＳＭＡ－について、抗原結合時のＧｙ１内在化を調べた。５０％コンフルエンスでカバースリップ上で増殖させた細胞を、２００ｎＭ ｇｙ１またはＮＣＰ１と３７℃で２時間インキュベートした。細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、内在化ｇｙ１をＦＩＴＣ結合マウス抗６Ｈｉｓ ＩｇＧによって検出した。核をＤＡＰＩで染色した。内在化は、共焦点イメージングシステムの下で観察された。 図８は、図８Ａおよび図８Ｂを含み、ｇｙ１の細胞内トラフィッキングを視覚化する実験の結果を示す。図８Ａ：Ｃ４－２細胞をｇｙ１ ｓｃＦｖと共に４時間インキュベートし、次いで抗６Ｈｉｓ ＩｇＧおよびＦＩＴＣ結合二次抗体で検出した。エンドソーム、リソソーム、ＥＲおよびゴルジ体およびＤＡＰＩ（青色）の異なる細胞オルガネラマーカー（ＲＦＰ標識、赤色）を用いて、オルガネラおよび核を同時染色した。図８Ｂ：ｇｙ１とゴルジ体およびＥＲのマーカーの共局在化を、１時間、２時間、４時間および６時間の異なるインキュベーション時間についてさらに研究した。 図８は、図８Ａおよび図８Ｂを含み、ｇｙ１の細胞内トラフィッキングを視覚化する実験の結果を示す。図８Ａ：Ｃ４－２細胞をｇｙ１ ｓｃＦｖと共に４時間インキュベートし、次いで抗６Ｈｉｓ ＩｇＧおよびＦＩＴＣ結合二次抗体で検出した。エンドソーム、リソソーム、ＥＲおよびゴルジ体およびＤＡＰＩ（青色）の異なる細胞オルガネラマーカー（ＲＦＰ標識、赤色）を用いて、オルガネラおよび核を同時染色した。図８Ｂ：ｇｙ１とゴルジ体およびＥＲのマーカーの共局在化を、１時間、２時間、４時間および６時間の異なるインキュベーション時間についてさらに研究した。 図９は、ＰＣ３－ＰＳＭＡ＋／ＰＣ３－ＰＳＭＡ－マウスモデルを用いた検証実験の結果を示す。ＰＳＭＡ陽性および陰性の異種移植ヌードマウスモデルを、ルシフェラーゼ発現ＰＣ３－ＰＳＭＡ＋およびＰＣ３－ＰＳＭＡ－細胞を用いて確立した。異種移植腫瘍モデルは、各マウスの右股関節に０．１ｍＬ ＰＢＳ中の５ｘ１０６個のホタルルシフェラーゼ発現ＰＣ３－ＰＳＭＡ＋またはＰＣ３－ＰＳＭＡ－細胞を注射することによって発色させた。接種の２週間後、腫瘍組織を単離し、Ｈ＆Ｅおよび免疫組織化学染色を行い、組織形態およびＰＳＭＡ発現レベルを確認した。 図１０は、ＩＲＤｙｅ８００ｃｗ標識がｇｙ１のＰＳＭＡ結合を妨害しないことを実証する実験の結果を示す。赤色色素ＩＲＤｙｅ８００ｃｗ標識ｇｙ１ ｓｃＦｖの結合親和性を、非標識ｇｙ１を陽性コントロールとして用いてＰＣ３－ＰＳＭＡ＋細胞について評価した。この結果は、色素標識がｇｙ１のＰＳＭＡ結合を妨害しないことを示した。 図１１は、前立腺腫瘍モデルにおけるｇｙ１ ｓｃＦｖの動的生体内分布を評価する実験の結果を示す。ＰＣ３－ＰＳＭＡ＋／ＰＣ３－ＰＳＭＡ－異種移植ヌードマウスにおけるｇｙ１ ｓｃＦｖの動的分布を、０．２μｍｏｌ／ｋｇのＩＲＤｙｅ８００ｃｗ標識ｇｙ１ ｓｃＦｖを尾の静脈に注射した後、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ Ｋｉｎｅｔｉｃ撮像システムを用い、励起波長７４５ｎｍで試験した。前立腺腫瘍組織を同定するために、生物発光イメージング（ＢＬＩ）を取得した（左）。ＩＲＤｙｅ８００ｃｗ標識ｇｙ１の分布を、各群の同じマウスの示された時点でモニターした。代表的な結果を示した。 図１２は、ｇｙ１ ｓｃＦｖのｉｎ ｖｉｖｏ ＰＳＭＡターゲティングを示す。注射６時間後、ｇｙ１ ｓｃＦｖは最良の腫瘍局在シグナルを示す。ＰＳＭＡ陽性腫瘍または陰性腫瘍を有する２群のマウスがここに示されている。 図１３は、図１３Ａおよび図１３Ｂを含み、静脈注射の１２時間後のマウス器官におけるｇｙ１ ｓｃＦｖ生体内分布を評価した実験の結果を示す。図１３Ａ：注射１２時間後、マウスを屠殺し、組織および器官を採取した。種々のマウス器官におけるＩＲＤｙｅ８００ｃｗ標識ｇｙ１の生体内分布を、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳキネティックイメージングシステムを用いて分析した。１、脳；２、肺；３、心臓；４、肝臓；５、脾臓；６、腎臓；７、小腸；８、骨；９、ＰＣ３－ＰＳＭＡ＋またはＰＣ３－ＰＳＭＡ－腫瘍組織、１０、筋肉。図１３Ｂ：ＩＶＩＳソフトウェアによって測定された腫瘍および異なる器官におけるＩＲＤｙｅ８００ｃｗシグナル強度を用いて、異なる器官の蛍光定量化を研究した。バー、平均値；エラーバー、ＳＤ；ｎ＝５；＊＊Ｐ＜０．０１。 図１３は、図１３Ａおよび図１３Ｂを含み、静脈注射の１２時間後のマウス器官におけるｇｙ１ ｓｃＦｖ生体内分布を評価した実験の結果を示す。図１３Ａ：注射１２時間後、マウスを屠殺し、組織および器官を採取した。種々のマウス器官におけるＩＲＤｙｅ８００ｃｗ標識ｇｙ１の生体内分布を、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳキネティックイメージングシステムを用いて分析した。１、脳；２、肺；３、心臓；４、肝臓；５、脾臓；６、腎臓；７、小腸；８、骨；９、ＰＣ３－ＰＳＭＡ＋またはＰＣ３－ＰＳＭＡ－腫瘍組織、１０、筋肉。図１３Ｂ：ＩＶＩＳソフトウェアによって測定された腫瘍および異なる器官におけるＩＲＤｙｅ８００ｃｗシグナル強度を用いて、異なる器官の蛍光定量化を研究した。バー、平均値；エラーバー、ＳＤ；ｎ＝５；＊＊Ｐ＜０．０１。 図１４は、図１４Ａおよび図１４Ｂを含み、ＰＳＭＡｂ発現および親和性を測定する実験結果を示す。図１４Ａ：精製ＰＳＭＡｂのＳＤＳ－ＧＡＧＥ。レーン１：抗体精製前のＣＨＯ細胞上清；レーン２：変性された精製ＰＳＭＡｂ；レーン３：非変性精製ＰＳＭＡｂ。図１４Ｂ：ＰＳＭＡｂの親和性測定。ＰＳＭＡ陽性細胞株Ｃ４－２でＰＳＭＡｂ親和性を測定した。簡単に説明すると、９６ウェルプレートで培養したＣ４－２を４％パラホルムアルデヒドで固定し、３％Ｈ２Ｏ２および６％ウシ血清アルブミンで順次ブロックした。次いで、細胞を、連続して３倍に希釈したＰＳＭＡｂと共に、１００ｎＭから０．１９ｐＭまで、３７℃で１時間インキュベートした。細胞結合をＨＲＰ結合マウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ Ａｂで検出し、比色シグナルをＴＭＢにより発色させ、ＳＴＯＰ緩衝液で停止させた。４５０ｎｍでの吸光度を用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０ソフトウェアを用いて親和性を計算した。 図１４は、図１４Ａおよび図１４Ｂを含み、ＰＳＭＡｂ発現および親和性を測定する実験結果を示す。図１４Ａ：精製ＰＳＭＡｂのＳＤＳ－ＧＡＧＥ。レーン１：抗体精製前のＣＨＯ細胞上清；レーン２：変性された精製ＰＳＭＡｂ；レーン３：非変性精製ＰＳＭＡｂ。図１４Ｂ：ＰＳＭＡｂの親和性測定。ＰＳＭＡ陽性細胞株Ｃ４－２でＰＳＭＡｂ親和性を測定した。簡単に説明すると、９６ウェルプレートで培養したＣ４－２を４％パラホルムアルデヒドで固定し、３％Ｈ２Ｏ２および６％ウシ血清アルブミンで順次ブロックした。次いで、細胞を、連続して３倍に希釈したＰＳＭＡｂと共に、１００ｎＭから０．１９ｐＭまで、３７℃で１時間インキュベートした。細胞結合をＨＲＰ結合マウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ Ａｂで検出し、比色シグナルをＴＭＢにより発色させ、ＳＴＯＰ緩衝液で停止させた。４５０ｎｍでの吸光度を用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０ソフトウェアを用いて親和性を計算した。 図１５は、ＰＳＭＡｂがＰＳＭＡ＋細胞株に特異的に結合することを示す実験結果を示す。ＰＳＭＡ陽性および陰性細胞に対するＰＳＭＡｂの結合を、フローサイトメトリーを用いて調べた。上段：陰性コントロールＩｇＧ（灰色）。ＰＳＭＡｂ（黒色）；下段：陰性コントロールＩｇＧ（灰色）。陽性コントロール抗体ＬＮＩ－１７（黒色）。 図１６は、ＰＣ３－ＰＳＭＡ＋細胞上のＰＳＭＡｂ結合が組換えＰＳＭＡタンパク質によってブロックされることを示す実験結果を示す。２ｎＭの濃度のＰＳＭＡｂを、それぞれ０、２、６および１０ｎＭの組換えＰＳＭＡ、または１０ｎＭのコントロールタンパク質ＢＳＡと共にＲＴで２時間プレインキュベートし、次いでＰＣ３－ＰＳＭＡ＋細胞と共にインキュベートした。ＰＣ３－ＰＳＭＡ＋細胞上のＰＳＭＡｂ結合に対するブロッキング効果をフローサイトメトリーにより研究した。陰性コントロール：灰色実線；ＰＳＭＡｂ ２ｎＭ：黒色実線；１０ｎＭ ＢＳＡによってブロックされたＰＳＭＡｂ ２ｎＭ：灰色の破線；２ｎＭのＰＳＭＡによってブロックされたＰＳＭＡｂ ２ｎＭ：黒い点線；６ｎＭのＰＳＭＡによってブロックされたＰＳＭＡｂ ２ｎＭ：黒い破線；１０ｎＭのＰＳＭＡによってブロックされたＰＳＭＡｂ ２ｎＭ：灰色の点線。 図１７は図１７Ａ～図１７Ｄを含み、ＰＳＭＡｂのＰＳＭＡ特異的内在化を試験する実験の結果を示す。前立腺癌細胞、すなわちＣ４－２（図１７Ａ）、ＰＣ－３（図１７Ｂ）、ＬｎＣａｐ（図１７Ｃ）およびＤＵ－１４５（図１７Ｄ）細胞についてＰＳＭＡｂ内部移行を調べた。５０％コンフルエンスでカバースリップ上で増殖させた細胞を、２００ｎＭのＰＳＭＡｂまたはコントロールヒトＩｇＧ１と３７℃で２時間インキュベートした。細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、内在化ＰＳＭＡｂをＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体によって検出した。核をＤＡＰＩで染色した。内在化は、共焦点イメージングシステムの下で観察された。 図１７は図１７Ａ～図１７Ｄを含み、ＰＳＭＡｂのＰＳＭＡ特異的内在化を試験する実験の結果を示す。前立腺癌細胞、すなわちＣ４－２（図１７Ａ）、ＰＣ－３（図１７Ｂ）、ＬｎＣａｐ（図１７Ｃ）およびＤＵ－１４５（図１７Ｄ）細胞についてＰＳＭＡｂ内部移行を調べた。５０％コンフルエンスでカバースリップ上で増殖させた細胞を、２００ｎＭのＰＳＭＡｂまたはコントロールヒトＩｇＧ１と３７℃で２時間インキュベートした。細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、内在化ＰＳＭＡｂをＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体によって検出した。核をＤＡＰＩで染色した。内在化は、共焦点イメージングシステムの下で観察された。 図１７は図１７Ａ～図１７Ｄを含み、ＰＳＭＡｂのＰＳＭＡ特異的内在化を試験する実験の結果を示す。前立腺癌細胞、すなわちＣ４－２（図１７Ａ）、ＰＣ－３（図１７Ｂ）、ＬｎＣａｐ（図１７Ｃ）およびＤＵ－１４５（図１７Ｄ）細胞についてＰＳＭＡｂ内部移行を調べた。５０％コンフルエンスでカバースリップ上で増殖させた細胞を、２００ｎＭのＰＳＭＡｂまたはコントロールヒトＩｇＧ１と３７℃で２時間インキュベートした。細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、内在化ＰＳＭＡｂをＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体によって検出した。核をＤＡＰＩで染色した。内在化は、共焦点イメージングシステムの下で観察された。 図１７は図１７Ａ～図１７Ｄを含み、ＰＳＭＡｂのＰＳＭＡ特異的内在化を試験する実験の結果を示す。前立腺癌細胞、すなわちＣ４－２（図１７Ａ）、ＰＣ－３（図１７Ｂ）、ＬｎＣａｐ（図１７Ｃ）およびＤＵ－１４５（図１７Ｄ）細胞についてＰＳＭＡｂ内部移行を調べた。５０％コンフルエンスでカバースリップ上で増殖させた細胞を、２００ｎＭのＰＳＭＡｂまたはコントロールヒトＩｇＧ１と３７℃で２時間インキュベートした。細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、内在化ＰＳＭＡｂをＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体によって検出した。核をＤＡＰＩで染色した。内在化は、共焦点イメージングシステムの下で観察された。 図１８は、図１８Ａ～図１８Ｃを含み、ＰＳＭＡｂによって標的とされるｉｎ ｖｉｖｏ ＰＳＭＡを観察する実験結果を示す。腫瘍標的化の効率およびＰＳＭＡｂの術中光学イメージングの可能性を、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ標識ＰＳＭＡｂを用いて研究した。５０μｇの標識ＰＳＭＡｂ／マウスを、ＰＣ３－ＰＳＭＡ＋（図１８Ａ）またはＰＣ３－ＰＳＭＡ－（図１８Ｂ）異種モデルに、尾の静脈に注射し、ＰＳＭＡｂの生体内分布を、４時間目、２４時間目、３０時間目、４８時間目、５４時間目、１０２時間目、１２６時間目、１７４時間目に、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ Ｋｉｎｅｔｉｃ撮像システムを用いてモニタリングした。注射４８時間後の各群の４匹のマウスの画像を図１８Ｃに示した。ｉｎ ｖｉｖｏ光学イメージングは、ＰＳＭＡｂが全身に急速に拡散したことを示しており、注射後２４時間から腫瘍組織において検出することができ、次いで、体内から徐々に排泄されたが、ＰＳＭＡ＋腫瘍では特異的に保持されているが、ＰＳＭＡ－腫瘍では特異的に保持されていなかった。 図１８は、図１８Ａ～図１８Ｃを含み、ＰＳＭＡｂによって標的とされるｉｎ ｖｉｖｏ ＰＳＭＡを観察する実験結果を示す。腫瘍標的化の効率およびＰＳＭＡｂの術中光学イメージングの可能性を、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ標識ＰＳＭＡｂを用いて研究した。５０μｇの標識ＰＳＭＡｂ／マウスを、ＰＣ３－ＰＳＭＡ＋（図１８Ａ）またはＰＣ３－ＰＳＭＡ－（図１８Ｂ）異種モデルに、尾の静脈に注射し、ＰＳＭＡｂの生体内分布を、４時間目、２４時間目、３０時間目、４８時間目、５４時間目、１０２時間目、１２６時間目、１７４時間目に、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ Ｋｉｎｅｔｉｃ撮像システムを用いてモニタリングした。注射４８時間後の各群の４匹のマウスの画像を図１８Ｃに示した。ｉｎ ｖｉｖｏ光学イメージングは、ＰＳＭＡｂが全身に急速に拡散したことを示しており、注射後２４時間から腫瘍組織において検出することができ、次いで、体内から徐々に排泄されたが、ＰＳＭＡ＋腫瘍では特異的に保持されているが、ＰＳＭＡ－腫瘍では特異的に保持されていなかった。 図１８は、図１８Ａ～図１８Ｃを含み、ＰＳＭＡｂによって標的とされるｉｎ ｖｉｖｏ ＰＳＭＡを観察する実験結果を示す。腫瘍標的化の効率およびＰＳＭＡｂの術中光学イメージングの可能性を、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ標識ＰＳＭＡｂを用いて研究した。５０μｇの標識ＰＳＭＡｂ／マウスを、ＰＣ３－ＰＳＭＡ＋（図１８Ａ）またはＰＣ３－ＰＳＭＡ－（図１８Ｂ）異種モデルに、尾の静脈に注射し、ＰＳＭＡｂの生体内分布を、４時間目、２４時間目、３０時間目、４８時間目、５４時間目、１０２時間目、１２６時間目、１７４時間目に、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ Ｋｉｎｅｔｉｃ撮像システムを用いてモニタリングした。注射４８時間後の各群の４匹のマウスの画像を図１８Ｃに示した。ｉｎ ｖｉｖｏ光学イメージングは、ＰＳＭＡｂが全身に急速に拡散したことを示しており、注射後２４時間から腫瘍組織において検出することができ、次いで、体内から徐々に排泄されたが、ＰＳＭＡ＋腫瘍では特異的に保持されているが、ＰＳＭＡ－腫瘍では特異的に保持されていなかった。 図１９は、ＳＭＣＣ－ＤＭ１を示す概略図である。 図２０は、ＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥおよびＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥを示す一組の模式図である。 図２１は、ＰＳＭＡｂ－ＡＤＣがＰＳＭＡ＋細胞に効率的に結合したままであることを示す実験結果を示す。フローサイトメトリーを用いて、ＰＳＭＡｂ複合体のＤＭ１、ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦとのＰＳＭＡ特異的結合を、ＰＣ－３（上）およびＣ４－２細胞（下）について調べた。 図２２は、図２２Ａおよび図２２Ｂを含み、ＰＳＭＡｂ－ＡＤＣがＰＳＭＡ＋細胞によって効率的に取り込まれることを実証する実験結果を示す。ＤＭ１とのＰＳＭＡｂコンジュゲートのＰＳＭＡ特異的内在化を、ＰＣ－３細胞（図２２Ａ）およびＣ４－２細胞（図２２Ｂ）について研究した。５０％コンフルエンスでカバースリップ上で増殖させた細胞を、２００ｎＭのＰＳＭＡｂ－ＡＤＣまたはコントロールヒトＩｇＧ１－ＡＤＣと３７℃で２時間インキュベートした。細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、内在化ＰＳＭＡｂをＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体によって検出した。核をＤＡＰＩで染色した。内在化は、共焦点イメージングシステムの下で観察された。 図２２は、図２２Ａおよび図２２Ｂを含み、ＰＳＭＡｂ－ＡＤＣがＰＳＭＡ＋細胞によって効率的に取り込まれることを実証する実験結果を示す。ＤＭ１とのＰＳＭＡｂコンジュゲートのＰＳＭＡ特異的内在化を、ＰＣ－３細胞（図２２Ａ）およびＣ４－２細胞（図２２Ｂ）について研究した。５０％コンフルエンスでカバースリップ上で増殖させた細胞を、２００ｎＭのＰＳＭＡｂ－ＡＤＣまたはコントロールヒトＩｇＧ１－ＡＤＣと３７℃で２時間インキュベートした。細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、内在化ＰＳＭＡｂをＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体によって検出した。核をＤＡＰＩで染色した。内在化は、共焦点イメージングシステムの下で観察された。 図２３は、図２３Ａ～図２３Ｃを含み、ＰＳＭＡｂ ＡＤＣのＰＳＭＡ特異的細胞傷害性を評価する実験の結果を示す。ＰＳＭＡｂに基づくＡＤＣの細胞傷害性を、ＰＳＭＡ－細胞株ＰＣ－３およびＰＳＭＡ＋細胞株Ｃ４－２で評価した。簡潔には、Ｃ４－２およびＰＣ－３細胞を、１０％ＦＢＳ、２０００細胞／２００ｍＬ／ウェルを有するＤＭＥＭ培地中９６ウェルプレートに播種した。次の日に、細胞密度は約２０～３０％であり、培地を、それぞれの濃度で３個ずつ、３３３．３３ｎＭ、１３３．３３ｎＭ、６６．６７ｎＭ、３３．３３ｎＭ、６．６７ｎＭ、３．３３ｎＭ、０．６７ｎＭ、０．３３ｎＭ、０．０６７ｎＭ、０．００６７ｎＭ、０．０００６７ｎＭおよび０．００００６７ｎＭの濃度でＰＳＭＡｂ－ＤＭ１、ＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＥまたはＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＦを含む新しい培地と交換した。各ウェルについて同じ薬物濃度で培地を毎日交換した。４日間のインキュベーション後、製造元のプロトコルに従ってａｌａｍａｒＢｌｕｅキットを用いて細胞生存率を評価した。Ｃ４－２細胞上のＰＳＭＡｂ－ＤＭ１（図２３Ａ）、ＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＥ（図２３Ｂ）およびＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＦ（図２３Ｃ）について計算したＩＣ５０は、それぞれ０．１２ｎＭ、０．５９ｎＭおよび０．９２ｎＭであった。 図２３は、図２３Ａ～図２３Ｃを含み、ＰＳＭＡｂ ＡＤＣのＰＳＭＡ特異的細胞傷害性を評価する実験の結果を示す。ＰＳＭＡｂに基づくＡＤＣの細胞傷害性を、ＰＳＭＡ－細胞株ＰＣ－３およびＰＳＭＡ＋細胞株Ｃ４－２で評価した。簡潔には、Ｃ４－２およびＰＣ－３細胞を、１０％ＦＢＳ、２０００細胞／２００ｍＬ／ウェルを有するＤＭＥＭ培地中９６ウェルプレートに播種した。次の日に、細胞密度は約２０～３０％であり、培地を、それぞれの濃度で３個ずつ、３３３．３３ｎＭ、１３３．３３ｎＭ、６６．６７ｎＭ、３３．３３ｎＭ、６．６７ｎＭ、３．３３ｎＭ、０．６７ｎＭ、０．３３ｎＭ、０．０６７ｎＭ、０．００６７ｎＭ、０．０００６７ｎＭおよび０．００００６７ｎＭの濃度でＰＳＭＡｂ－ＤＭ１、ＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＥまたはＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＦを含む新しい培地と交換した。各ウェルについて同じ薬物濃度で培地を毎日交換した。４日間のインキュベーション後、製造元のプロトコルに従ってａｌａｍａｒＢｌｕｅキットを用いて細胞生存率を評価した。Ｃ４－２細胞上のＰＳＭＡｂ－ＤＭ１（図２３Ａ）、ＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＥ（図２３Ｂ）およびＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＦ（図２３Ｃ）について計算したＩＣ５０は、それぞれ０．１２ｎＭ、０．５９ｎＭおよび０．９２ｎＭであった。 図２３は、図２３Ａ～図２３Ｃを含み、ＰＳＭＡｂ ＡＤＣのＰＳＭＡ特異的細胞傷害性を評価する実験の結果を示す。ＰＳＭＡｂに基づくＡＤＣの細胞傷害性を、ＰＳＭＡ－細胞株ＰＣ－３およびＰＳＭＡ＋細胞株Ｃ４－２で評価した。簡潔には、Ｃ４－２およびＰＣ－３細胞を、１０％ＦＢＳ、２０００細胞／２００ｍＬ／ウェルを有するＤＭＥＭ培地中９６ウェルプレートに播種した。次の日に、細胞密度は約２０～３０％であり、培地を、それぞれの濃度で３個ずつ、３３３．３３ｎＭ、１３３．３３ｎＭ、６６．６７ｎＭ、３３．３３ｎＭ、６．６７ｎＭ、３．３３ｎＭ、０．６７ｎＭ、０．３３ｎＭ、０．０６７ｎＭ、０．００６７ｎＭ、０．０００６７ｎＭおよび０．００００６７ｎＭの濃度でＰＳＭＡｂ－ＤＭ１、ＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＥまたはＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＦを含む新しい培地と交換した。各ウェルについて同じ薬物濃度で培地を毎日交換した。４日間のインキュベーション後、製造元のプロトコルに従ってａｌａｍａｒＢｌｕｅキットを用いて細胞生存率を評価した。Ｃ４－２細胞上のＰＳＭＡｂ－ＤＭ１（図２３Ａ）、ＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＥ（図２３Ｂ）およびＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＦ（図２３Ｃ）について計算したＩＣ５０は、それぞれ０．１２ｎＭ、０．５９ｎＭおよび０．９２ｎＭであった。 図２４は、図２４Ａ～図２４Ｒを含み、ＰＳＭＡｂ ＡＤＣがＰＳＭＡ陽性細胞に特異的にアポトーシスを誘導することを実証する実験結果を示す。ＰＣ－３およびＣ４－２細胞を６ウェルプレートに２×１０５／２ｍｌ培地／ウェルの密度で播種し、一晩培養した。翌日、培地を交換し、２ｍｌ培地中、細胞をＰＳＭＡｂ－ＡＤＣと共に、５０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌおよび０．００１μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした。５０ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトＩｇＧおよびＰＳＭＡｂをコントロールとして使用した。４８時間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、アネキシン－Ｖ／ＰＩで染色し、フローサイトメトリーを用いてアポトーシスを検出した。アネキシンＶ（＋）／ＰＩ（－）を有するシグナルは、初期アポトーシスを示し、二重陽性染色、すなわちアネキシンＶ（＋）／ＰＩ（＋）は、後期アポトーシスを示す。総アポトーシスは、初期アポトーシスおよび後期アポトーシスの合計である。Ｃ４－２（図２４Ａ～図２４Ｃ、図２４Ｇ～図２４Ｉ、図２４Ｍ～図２４Ｏ）およびＰＣ－３（図２４Ｄ～図２４Ｆ、図２４Ｊ～図２４Ｌ、図２４Ｐ～図２４Ｒ）細胞に対するＰＳＭＡｂ－ＤＭ１（図２４Ａ～図２４Ｆ）、ＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＥ（図２４Ｇ、図２４Ｌ）、およびＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＦ（図２４Ｍ～図２４Ｒ）の結果は、フローサイトメトリーデータで示され（図２４Ａ、図２４Ｄ、図２４Ｇ、図２４Ｊ、図２４Ｍおよび図２４Ｐ）、計算された全体の割合で示され（図２４Ｂ、図２４Ｅ、図２４Ｈ、図２４Ｋ、図２４Ｎおよび図２４Ｑ）、初期アポトーシスで示された（図２４Ｃ、図２４Ｆ、図２４Ｉ、図２４Ｌ、図２４Ｏおよび図２４Ｒ）。 図２４は、図２４Ａ～図２４Ｒを含み、ＰＳＭＡｂ ＡＤＣがＰＳＭＡ陽性細胞に特異的にアポトーシスを誘導することを実証する実験結果を示す。ＰＣ－３およびＣ４－２細胞を６ウェルプレートに２×１０５／２ｍｌ培地／ウェルの密度で播種し、一晩培養した。翌日、培地を交換し、２ｍｌ培地中、細胞をＰＳＭＡｂ－ＡＤＣと共に、５０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌおよび０．００１μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした。５０ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトＩｇＧおよびＰＳＭＡｂをコントロールとして使用した。４８時間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、アネキシン－Ｖ／ＰＩで染色し、フローサイトメトリーを用いてアポトーシスを検出した。アネキシンＶ（＋）／ＰＩ（－）を有するシグナルは、初期アポトーシスを示し、二重陽性染色、すなわちアネキシンＶ（＋）／ＰＩ（＋）は、後期アポトーシスを示す。総アポトーシスは、初期アポトーシスおよび後期アポトーシスの合計である。Ｃ４－２（図２４Ａ～図２４Ｃ、図２４Ｇ～図２４Ｉ、図２４Ｍ～図２４Ｏ）およびＰＣ－３（図２４Ｄ～図２４Ｆ、図２４Ｊ～図２４Ｌ、図２４Ｐ～図２４Ｒ）細胞に対するＰＳＭＡｂ－ＤＭ１（図２４Ａ～図２４Ｆ）、ＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＥ（図２４Ｇ、図２４Ｌ）、およびＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＦ（図２４Ｍ～図２４Ｒ）の結果は、フローサイトメトリーデータで示され（図２４Ａ、図２４Ｄ、図２４Ｇ、図２４Ｊ、図２４Ｍおよび図２４Ｐ）、計算された全体の割合で示され（図２４Ｂ、図２４Ｅ、図２４Ｈ、図２４Ｋ、図２４Ｎおよび図２４Ｑ）、初期アポトーシスで示された（図２４Ｃ、図２４Ｆ、図２４Ｉ、図２４Ｌ、図２４Ｏおよび図２４Ｒ）。 図２４は、図２４Ａ～図２４Ｒを含み、ＰＳＭＡｂ ＡＤＣがＰＳＭＡ陽性細胞に特異的にアポトーシスを誘導することを実証する実験結果を示す。ＰＣ－３およびＣ４－２細胞を６ウェルプレートに２×１０５／２ｍｌ培地／ウェルの密度で播種し、一晩培養した。翌日、培地を交換し、２ｍｌ培地中、細胞をＰＳＭＡｂ－ＡＤＣと共に、５０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌおよび０．００１μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした。５０ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトＩｇＧおよびＰＳＭＡｂをコントロールとして使用した。４８時間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、アネキシン－Ｖ／ＰＩで染色し、フローサイトメトリーを用いてアポトーシスを検出した。アネキシンＶ（＋）／ＰＩ（－）を有するシグナルは、初期アポトーシスを示し、二重陽性染色、すなわちアネキシンＶ（＋）／ＰＩ（＋）は、後期アポトーシスを示す。総アポトーシスは、初期アポトーシスおよび後期アポトーシスの合計である。Ｃ４－２（図２４Ａ～図２４Ｃ、図２４Ｇ～図２４Ｉ、図２４Ｍ～図２４Ｏ）およびＰＣ－３（図２４Ｄ～図２４Ｆ、図２４Ｊ～図２４Ｌ、図２４Ｐ～図２４Ｒ）細胞に対するＰＳＭＡｂ－ＤＭ１（図２４Ａ～図２４Ｆ）、ＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＥ（図２４Ｇ、図２４Ｌ）、およびＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＦ（図２４Ｍ～図２４Ｒ）の結果は、フローサイトメトリーデータで示され（図２４Ａ、図２４Ｄ、図２４Ｇ、図２４Ｊ、図２４Ｍおよび図２４Ｐ）、計算された全体の割合で示され（図２４Ｂ、図２４Ｅ、図２４Ｈ、図２４Ｋ、図２４Ｎおよび図２４Ｑ）、初期アポトーシスで示された（図２４Ｃ、図２４Ｆ、図２４Ｉ、図２４Ｌ、図２４Ｏおよび図２４Ｒ）。 図２４は、図２４Ａ～図２４Ｒを含み、ＰＳＭＡｂ ＡＤＣがＰＳＭＡ陽性細胞に特異的にアポトーシスを誘導することを実証する実験結果を示す。ＰＣ－３およびＣ４－２細胞を６ウェルプレートに２×１０５／２ｍｌ培地／ウェルの密度で播種し、一晩培養した。翌日、培地を交換し、２ｍｌ培地中、細胞をＰＳＭＡｂ－ＡＤＣと共に、５０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌおよび０．００１μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした。５０ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトＩｇＧおよびＰＳＭＡｂをコントロールとして使用した。４８時間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、アネキシン－Ｖ／ＰＩで染色し、フローサイトメトリーを用いてアポトーシスを検出した。アネキシンＶ（＋）／ＰＩ（－）を有するシグナルは、初期アポトーシスを示し、二重陽性染色、すなわちアネキシンＶ（＋）／ＰＩ（＋）は、後期アポトーシスを示す。総アポトーシスは、初期アポトーシスおよび後期アポトーシスの合計である。Ｃ４－２（図２４Ａ～図２４Ｃ、図２４Ｇ～図２４Ｉ、図２４Ｍ～図２４Ｏ）およびＰＣ－３（図２４Ｄ～図２４Ｆ、図２４Ｊ～図２４Ｌ、図２４Ｐ～図２４Ｒ）細胞に対するＰＳＭＡｂ－ＤＭ１（図２４Ａ～図２４Ｆ）、ＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＥ（図２４Ｇ、図２４Ｌ）、およびＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＦ（図２４Ｍ～図２４Ｒ）の結果は、フローサイトメトリーデータで示され（図２４Ａ、図２４Ｄ、図２４Ｇ、図２４Ｊ、図２４Ｍおよび図２４Ｐ）、計算された全体の割合で示され（図２４Ｂ、図２４Ｅ、図２４Ｈ、図２４Ｋ、図２４Ｎおよび図２４Ｑ）、初期アポトーシスで示された（図２４Ｃ、図２４Ｆ、図２４Ｉ、図２４Ｌ、図２４Ｏおよび図２４Ｒ）。 図２４は、図２４Ａ～図２４Ｒを含み、ＰＳＭＡｂ ＡＤＣがＰＳＭＡ陽性細胞に特異的にアポトーシスを誘導することを実証する実験結果を示す。ＰＣ－３およびＣ４－２細胞を６ウェルプレートに２×１０５／２ｍｌ培地／ウェルの密度で播種し、一晩培養した。翌日、培地を交換し、２ｍｌ培地中、細胞をＰＳＭＡｂ－ＡＤＣと共に、５０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌおよび０．００１μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした。５０ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトＩｇＧおよびＰＳＭＡｂをコントロールとして使用した。４８時間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、アネキシン－Ｖ／ＰＩで染色し、フローサイトメトリーを用いてアポトーシスを検出した。アネキシンＶ（＋）／ＰＩ（－）を有するシグナルは、初期アポトーシスを示し、二重陽性染色、すなわちアネキシンＶ（＋）／ＰＩ（＋）は、後期アポトーシスを示す。総アポトーシスは、初期アポトーシスおよび後期アポトーシスの合計である。Ｃ４－２（図２４Ａ～図２４Ｃ、図２４Ｇ～図２４Ｉ、図２４Ｍ～図２４Ｏ）およびＰＣ－３（図２４Ｄ～図２４Ｆ、図２４Ｊ～図２４Ｌ、図２４Ｐ～図２４Ｒ）細胞に対するＰＳＭＡｂ－ＤＭ１（図２４Ａ～図２４Ｆ）、ＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＥ（図２４Ｇ、図２４Ｌ）、およびＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＦ（図２４Ｍ～図２４Ｒ）の結果は、フローサイトメトリーデータで示され（図２４Ａ、図２４Ｄ、図２４Ｇ、図２４Ｊ、図２４Ｍおよび図２４Ｐ）、計算された全体の割合で示され（図２４Ｂ、図２４Ｅ、図２４Ｈ、図２４Ｋ、図２４Ｎおよび図２４Ｑ）、初期アポトーシスで示された（図２４Ｃ、図２４Ｆ、図２４Ｉ、図２４Ｌ、図２４Ｏおよび図２４Ｒ）。 図２４は、図２４Ａ～図２４Ｒを含み、ＰＳＭＡｂ ＡＤＣがＰＳＭＡ陽性細胞に特異的にアポトーシスを誘導することを実証する実験結果を示す。ＰＣ－３およびＣ４－２細胞を６ウェルプレートに２×１０５／２ｍｌ培地／ウェルの密度で播種し、一晩培養した。翌日、培地を交換し、２ｍｌ培地中、細胞をＰＳＭＡｂ－ＡＤＣと共に、５０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌおよび０．００１μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした。５０ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトＩｇＧおよびＰＳＭＡｂをコントロールとして使用した。４８時間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、アネキシン－Ｖ／ＰＩで染色し、フローサイトメトリーを用いてアポトーシスを検出した。アネキシンＶ（＋）／ＰＩ（－）を有するシグナルは、初期アポトーシスを示し、二重陽性染色、すなわちアネキシンＶ（＋）／ＰＩ（＋）は、後期アポトーシスを示す。総アポトーシスは、初期アポトーシスおよび後期アポトーシスの合計である。Ｃ４－２（図２４Ａ～図２４Ｃ、図２４Ｇ～図２４Ｉ、図２４Ｍ～図２４Ｏ）およびＰＣ－３（図２４Ｄ～図２４Ｆ、図２４Ｊ～図２４Ｌ、図２４Ｐ～図２４Ｒ）細胞に対するＰＳＭＡｂ－ＤＭ１（図２４Ａ～図２４Ｆ）、ＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＥ（図２４Ｇ、図２４Ｌ）、およびＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＦ（図２４Ｍ～図２４Ｒ）の結果は、フローサイトメトリーデータで示され（図２４Ａ、図２４Ｄ、図２４Ｇ、図２４Ｊ、図２４Ｍおよび図２４Ｐ）、計算された全体の割合で示され（図２４Ｂ、図２４Ｅ、図２４Ｈ、図２４Ｋ、図２４Ｎおよび図２４Ｑ）、初期アポトーシスで示された（図２４Ｃ、図２４Ｆ、図２４Ｉ、図２４Ｌ、図２４Ｏおよび図２４Ｒ）。 図２４は、図２４Ａ～図２４Ｒを含み、ＰＳＭＡｂ ＡＤＣがＰＳＭＡ陽性細胞に特異的にアポトーシスを誘導することを実証する実験結果を示す。ＰＣ－３およびＣ４－２細胞を６ウェルプレートに２×１０５／２ｍｌ培地／ウェルの密度で播種し、一晩培養した。翌日、培地を交換し、２ｍｌ培地中、細胞をＰＳＭＡｂ－ＡＤＣと共に、５０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌおよび０．００１μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした。５０ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトＩｇＧおよびＰＳＭＡｂをコントロールとして使用した。４８時間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、アネキシン－Ｖ／ＰＩで染色し、フローサイトメトリーを用いてアポトーシスを検出した。アネキシンＶ（＋）／ＰＩ（－）を有するシグナルは、初期アポトーシスを示し、二重陽性染色、すなわちアネキシンＶ（＋）／ＰＩ（＋）は、後期アポトーシスを示す。総アポトーシスは、初期アポトーシスおよび後期アポトーシスの合計である。Ｃ４－２（図２４Ａ～図２４Ｃ、図２４Ｇ～図２４Ｉ、図２４Ｍ～図２４Ｏ）およびＰＣ－３（図２４Ｄ～図２４Ｆ、図２４Ｊ～図２４Ｌ、図２４Ｐ～図２４Ｒ）細胞に対するＰＳＭＡｂ－ＤＭ１（図２４Ａ～図２４Ｆ）、ＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＥ（図２４Ｇ、図２４Ｌ）、およびＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＦ（図２４Ｍ～図２４Ｒ）の結果は、フローサイトメトリーデータで示され（図２４Ａ、図２４Ｄ、図２４Ｇ、図２４Ｊ、図２４Ｍおよび図２４Ｐ）、計算された全体の割合で示され（図２４Ｂ、図２４Ｅ、図２４Ｈ、図２４Ｋ、図２４Ｎおよび図２４Ｑ）、初期アポトーシスで示された（図２４Ｃ、図２４Ｆ、図２４Ｉ、図２４Ｌ、図２４Ｏおよび図２４Ｒ）。 図２４は、図２４Ａ～図２４Ｒを含み、ＰＳＭＡｂ ＡＤＣがＰＳＭＡ陽性細胞に特異的にアポトーシスを誘導することを実証する実験結果を示す。ＰＣ－３およびＣ４－２細胞を６ウェルプレートに２×１０５／２ｍｌ培地／ウェルの密度で播種し、一晩培養した。翌日、培地を交換し、２ｍｌ培地中、細胞をＰＳＭＡｂ－ＡＤＣと共に、５０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌおよび０．００１μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした。５０ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトＩｇＧおよびＰＳＭＡｂをコントロールとして使用した。４８時間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、アネキシン－Ｖ／ＰＩで染色し、フローサイトメトリーを用いてアポトーシスを検出した。アネキシンＶ（＋）／ＰＩ（－）を有するシグナルは、初期アポトーシスを示し、二重陽性染色、すなわちアネキシンＶ（＋）／ＰＩ（＋）は、後期アポトーシスを示す。総アポトーシスは、初期アポトーシスおよび後期アポトーシスの合計である。Ｃ４－２（図２４Ａ～図２４Ｃ、図２４Ｇ～図２４Ｉ、図２４Ｍ～図２４Ｏ）およびＰＣ－３（図２４Ｄ～図２４Ｆ、図２４Ｊ～図２４Ｌ、図２４Ｐ～図２４Ｒ）細胞に対するＰＳＭＡｂ－ＤＭ１（図２４Ａ～図２４Ｆ）、ＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＥ（図２４Ｇ、図２４Ｌ）、およびＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＦ（図２４Ｍ～図２４Ｒ）の結果は、フローサイトメトリーデータで示され（図２４Ａ、図２４Ｄ、図２４Ｇ、図２４Ｊ、図２４Ｍおよび図２４Ｐ）、計算された全体の割合で示され（図２４Ｂ、図２４Ｅ、図２４Ｈ、図２４Ｋ、図２４Ｎおよび図２４Ｑ）、初期アポトーシスで示された（図２４Ｃ、図２４Ｆ、図２４Ｉ、図２４Ｌ、図２４Ｏおよび図２４Ｒ）。 図２４は、図２４Ａ～図２４Ｒを含み、ＰＳＭＡｂ ＡＤＣがＰＳＭＡ陽性細胞に特異的にアポトーシスを誘導することを実証する実験結果を示す。ＰＣ－３およびＣ４－２細胞を６ウェルプレートに２×１０５／２ｍｌ培地／ウェルの密度で播種し、一晩培養した。翌日、培地を交換し、２ｍｌ培地中、細胞をＰＳＭＡｂ－ＡＤＣと共に、５０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌおよび０．００１μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした。５０ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトＩｇＧおよびＰＳＭＡｂをコントロールとして使用した。４８時間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、アネキシン－Ｖ／ＰＩで染色し、フローサイトメトリーを用いてアポトーシスを検出した。アネキシンＶ（＋）／ＰＩ（－）を有するシグナルは、初期アポトーシスを示し、二重陽性染色、すなわちアネキシンＶ（＋）／ＰＩ（＋）は、後期アポトーシスを示す。総アポトーシスは、初期アポトーシスおよび後期アポトーシスの合計である。Ｃ４－２（図２４Ａ～図２４Ｃ、図２４Ｇ～図２４Ｉ、図２４Ｍ～図２４Ｏ）およびＰＣ－３（図２４Ｄ～図２４Ｆ、図２４Ｊ～図２４Ｌ、図２４Ｐ～図２４Ｒ）細胞に対するＰＳＭＡｂ－ＤＭ１（図２４Ａ～図２４Ｆ）、ＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＥ（図２４Ｇ、図２４Ｌ）、およびＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＦ（図２４Ｍ～図２４Ｒ）の結果は、フローサイトメトリーデータで示され（図２４Ａ、図２４Ｄ、図２４Ｇ、図２４Ｊ、図２４Ｍおよび図２４Ｐ）、計算された全体の割合で示され（図２４Ｂ、図２４Ｅ、図２４Ｈ、図２４Ｋ、図２４Ｎおよび図２４Ｑ）、初期アポトーシスで示された（図２４Ｃ、図２４Ｆ、図２４Ｉ、図２４Ｌ、図２４Ｏおよび図２４Ｒ）。 図２４は、図２４Ａ～図２４Ｒを含み、ＰＳＭＡｂ ＡＤＣがＰＳＭＡ陽性細胞に特異的にアポトーシスを誘導することを実証する実験結果を示す。ＰＣ－３およびＣ４－２細胞を６ウェルプレートに２×１０５／２ｍｌ培地／ウェルの密度で播種し、一晩培養した。翌日、培地を交換し、２ｍｌ培地中、細胞をＰＳＭＡｂ－ＡＤＣと共に、５０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌおよび０．００１μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした。５０ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトＩｇＧおよびＰＳＭＡｂをコントロールとして使用した。４８時間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、アネキシン－Ｖ／ＰＩで染色し、フローサイトメトリーを用いてアポトーシスを検出した。アネキシンＶ（＋）／ＰＩ（－）を有するシグナルは、初期アポトーシスを示し、二重陽性染色、すなわちアネキシンＶ（＋）／ＰＩ（＋）は、後期アポトーシスを示す。総アポトーシスは、初期アポトーシスおよび後期アポトーシスの合計である。Ｃ４－２（図２４Ａ～図２４Ｃ、図２４Ｇ～図２４Ｉ、図２４Ｍ～図２４Ｏ）およびＰＣ－３（図２４Ｄ～図２４Ｆ、図２４Ｊ～図２４Ｌ、図２４Ｐ～図２４Ｒ）細胞に対するＰＳＭＡｂ－ＤＭ１（図２４Ａ～図２４Ｆ）、ＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＥ（図２４Ｇ、図２４Ｌ）、およびＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＦ（図２４Ｍ～図２４Ｒ）の結果は、フローサイトメトリーデータで示され（図２４Ａ、図２４Ｄ、図２４Ｇ、図２４Ｊ、図２４Ｍおよび図２４Ｐ）、計算された全体の割合で示され（図２４Ｂ、図２４Ｅ、図２４Ｈ、図２４Ｋ、図２４Ｎおよび図２４Ｑ）、初期アポトーシスで示された（図２４Ｃ、図２４Ｆ、図２４Ｉ、図２４Ｌ、図２４Ｏおよび図２４Ｒ）。 図２４は、図２４Ａ～図２４Ｒを含み、ＰＳＭＡｂ ＡＤＣがＰＳＭＡ陽性細胞に特異的にアポトーシスを誘導することを実証する実験結果を示す。ＰＣ－３およびＣ４－２細胞を６ウェルプレートに２×１０５／２ｍｌ培地／ウェルの密度で播種し、一晩培養した。翌日、培地を交換し、２ｍｌ培地中、細胞をＰＳＭＡｂ－ＡＤＣと共に、５０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌおよび０．００１μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした。５０ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトＩｇＧおよびＰＳＭＡｂをコントロールとして使用した。４８時間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、アネキシン－Ｖ／ＰＩで染色し、フローサイトメトリーを用いてアポトーシスを検出した。アネキシンＶ（＋）／ＰＩ（－）を有するシグナルは、初期アポトーシスを示し、二重陽性染色、すなわちアネキシンＶ（＋）／ＰＩ（＋）は、後期アポトーシスを示す。総アポトーシスは、初期アポトーシスおよび後期アポトーシスの合計である。Ｃ４－２（図２４Ａ～図２４Ｃ、図２４Ｇ～図２４Ｉ、図２４Ｍ～図２４Ｏ）およびＰＣ－３（図２４Ｄ～図２４Ｆ、図２４Ｊ～図２４Ｌ、図２４Ｐ～図２４Ｒ）細胞に対するＰＳＭＡｂ－ＤＭ１（図２４Ａ～図２４Ｆ）、ＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＥ（図２４Ｇ、図２４Ｌ）、およびＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＦ（図２４Ｍ～図２４Ｒ）の結果は、フローサイトメトリーデータで示され（図２４Ａ、図２４Ｄ、図２４Ｇ、図２４Ｊ、図２４Ｍおよび図２４Ｐ）、計算された全体の割合で示され（図２４Ｂ、図２４Ｅ、図２４Ｈ、図２４Ｋ、図２４Ｎおよび図２４Ｑ）、初期アポトーシスで示された（図２４Ｃ、図２４Ｆ、図２４Ｉ、図２４Ｌ、図２４Ｏおよび図２４Ｒ）。 図２４は、図２４Ａ～図２４Ｒを含み、ＰＳＭＡｂ ＡＤＣがＰＳＭＡ陽性細胞に特異的にアポトーシスを誘導することを実証する実験結果を示す。ＰＣ－３およびＣ４－２細胞を６ウェルプレートに２×１０５／２ｍｌ培地／ウェルの密度で播種し、一晩培養した。翌日、培地を交換し、２ｍｌ培地中、細胞をＰＳＭＡｂ－ＡＤＣと共に、５０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌおよび０．００１μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした。５０ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトＩｇＧおよびＰＳＭＡｂをコントロールとして使用した。４８時間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、アネキシン－Ｖ／ＰＩで染色し、フローサイトメトリーを用いてアポトーシスを検出した。アネキシンＶ（＋）／ＰＩ（－）を有するシグナルは、初期アポトーシスを示し、二重陽性染色、すなわちアネキシンＶ（＋）／ＰＩ（＋）は、後期アポトーシスを示す。総アポトーシスは、初期アポトーシスおよび後期アポトーシスの合計である。Ｃ４－２（図２４Ａ～図２４Ｃ、図２４Ｇ～図２４Ｉ、図２４Ｍ～図２４Ｏ）およびＰＣ－３（図２４Ｄ～図２４Ｆ、図２４Ｊ～図２４Ｌ、図２４Ｐ～図２４Ｒ）細胞に対するＰＳＭＡｂ－ＤＭ１（図２４Ａ～図２４Ｆ）、ＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＥ（図２４Ｇ、図２４Ｌ）、およびＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＦ（図２４Ｍ～図２４Ｒ）の結果は、フローサイトメトリーデータで示され（図２４Ａ、図２４Ｄ、図２４Ｇ、図２４Ｊ、図２４Ｍおよび図２４Ｐ）、計算された全体の割合で示され（図２４Ｂ、図２４Ｅ、図２４Ｈ、図２４Ｋ、図２４Ｎおよび図２４Ｑ）、初期アポトーシスで示された（図２４Ｃ、図２４Ｆ、図２４Ｉ、図２４Ｌ、図２４Ｏおよび図２４Ｒ）。 図２４は、図２４Ａ～図２４Ｒを含み、ＰＳＭＡｂ ＡＤＣがＰＳＭＡ陽性細胞に特異的にアポトーシスを誘導することを実証する実験結果を示す。ＰＣ－３およびＣ４－２細胞を６ウェルプレートに２×１０５／２ｍｌ培地／ウェルの密度で播種し、一晩培養した。翌日、培地を交換し、２ｍｌ培地中、細胞をＰＳＭＡｂ－ＡＤＣと共に、５０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌおよび０．００１μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした。５０ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトＩｇＧおよびＰＳＭＡｂをコントロールとして使用した。４８時間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、アネキシン－Ｖ／ＰＩで染色し、フローサイトメトリーを用いてアポトーシスを検出した。アネキシンＶ（＋）／ＰＩ（－）を有するシグナルは、初期アポトーシスを示し、二重陽性染色、すなわちアネキシンＶ（＋）／ＰＩ（＋）は、後期アポトーシスを示す。総アポトーシスは、初期アポトーシスおよび後期アポトーシスの合計である。Ｃ４－２（図２４Ａ～図２４Ｃ、図２４Ｇ～図２４Ｉ、図２４Ｍ～図２４Ｏ）およびＰＣ－３（図２４Ｄ～図２４Ｆ、図２４Ｊ～図２４Ｌ、図２４Ｐ～図２４Ｒ）細胞に対するＰＳＭＡｂ－ＤＭ１（図２４Ａ～図２４Ｆ）、ＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＥ（図２４Ｇ、図２４Ｌ）、およびＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＦ（図２４Ｍ～図２４Ｒ）の結果は、フローサイトメトリーデータで示され（図２４Ａ、図２４Ｄ、図２４Ｇ、図２４Ｊ、図２４Ｍおよび図２４Ｐ）、計算された全体の割合で示され（図２４Ｂ、図２４Ｅ、図２４Ｈ、図２４Ｋ、図２４Ｎおよび図２４Ｑ）、初期アポトーシスで示された（図２４Ｃ、図２４Ｆ、図２４Ｉ、図２４Ｌ、図２４Ｏおよび図２４Ｒ）。 図２４は、図２４Ａ～図２４Ｒを含み、ＰＳＭＡｂ ＡＤＣがＰＳＭＡ陽性細胞に特異的にアポトーシスを誘導することを実証する実験結果を示す。ＰＣ－３およびＣ４－２細胞を６ウェルプレートに２×１０５／２ｍｌ培地／ウェルの密度で播種し、一晩培養した。翌日、培地を交換し、２ｍｌ培地中、細胞をＰＳＭＡｂ－ＡＤＣと共に、５０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌおよび０．００１μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした。５０ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトＩｇＧおよびＰＳＭＡｂをコントロールとして使用した。４８時間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、アネキシン－Ｖ／ＰＩで染色し、フローサイトメトリーを用いてアポトーシスを検出した。アネキシンＶ（＋）／ＰＩ（－）を有するシグナルは、初期アポトーシスを示し、二重陽性染色、すなわちアネキシンＶ（＋）／ＰＩ（＋）は、後期アポトーシスを示す。総アポトーシスは、初期アポトーシスおよび後期アポトーシスの合計である。Ｃ４－２（図２４Ａ～図２４Ｃ、図２４Ｇ～図２４Ｉ、図２４Ｍ～図２４Ｏ）およびＰＣ－３（図２４Ｄ～図２４Ｆ、図２４Ｊ～図２４Ｌ、図２４Ｐ～図２４Ｒ）細胞に対するＰＳＭＡｂ－ＤＭ１（図２４Ａ～図２４Ｆ）、ＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＥ（図２４Ｇ、図２４Ｌ）、およびＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＦ（図２４Ｍ～図２４Ｒ）の結果は、フローサイトメトリーデータで示され（図２４Ａ、図２４Ｄ、図２４Ｇ、図２４Ｊ、図２４Ｍおよび図２４Ｐ）、計算された全体の割合で示され（図２４Ｂ、図２４Ｅ、図２４Ｈ、図２４Ｋ、図２４Ｎおよび図２４Ｑ）、初期アポトーシスで示された（図２４Ｃ、図２４Ｆ、図２４Ｉ、図２４Ｌ、図２４Ｏおよび図２４Ｒ）。 図２４は、図２４Ａ～図２４Ｒを含み、ＰＳＭＡｂ ＡＤＣがＰＳＭＡ陽性細胞に特異的にアポトーシスを誘導することを実証する実験結果を示す。ＰＣ－３およびＣ４－２細胞を６ウェルプレートに２×１０５／２ｍｌ培地／ウェルの密度で播種し、一晩培養した。翌日、培地を交換し、２ｍｌ培地中、細胞をＰＳＭＡｂ－ＡＤＣと共に、５０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌおよび０．００１μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした。５０ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトＩｇＧおよびＰＳＭＡｂをコントロールとして使用した。４８時間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、アネキシン－Ｖ／ＰＩで染色し、フローサイトメトリーを用いてアポトーシスを検出した。アネキシンＶ（＋）／ＰＩ（－）を有するシグナルは、初期アポトーシスを示し、二重陽性染色、すなわちアネキシンＶ（＋）／ＰＩ（＋）は、後期アポトーシスを示す。総アポトーシスは、初期アポトーシスおよび後期アポトーシスの合計である。Ｃ４－２（図２４Ａ～図２４Ｃ、図２４Ｇ～図２４Ｉ、図２４Ｍ～図２４Ｏ）およびＰＣ－３（図２４Ｄ～図２４Ｆ、図２４Ｊ～図２４Ｌ、図２４Ｐ～図２４Ｒ）細胞に対するＰＳＭＡｂ－ＤＭ１（図２４Ａ～図２４Ｆ）、ＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＥ（図２４Ｇ、図２４Ｌ）、およびＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＦ（図２４Ｍ～図２４Ｒ）の結果は、フローサイトメトリーデータで示され（図２４Ａ、図２４Ｄ、図２４Ｇ、図２４Ｊ、図２４Ｍおよび図２４Ｐ）、計算された全体の割合で示され（図２４Ｂ、図２４Ｅ、図２４Ｈ、図２４Ｋ、図２４Ｎおよび図２４Ｑ）、初期アポトーシスで示された（図２４Ｃ、図２４Ｆ、図２４Ｉ、図２４Ｌ、図２４Ｏおよび図２４Ｒ）。 図２４は、図２４Ａ～図２４Ｒを含み、ＰＳＭＡｂ ＡＤＣがＰＳＭＡ陽性細胞に特異的にアポトーシスを誘導することを実証する実験結果を示す。ＰＣ－３およびＣ４－２細胞を６ウェルプレートに２×１０５／２ｍｌ培地／ウェルの密度で播種し、一晩培養した。翌日、培地を交換し、２ｍｌ培地中、細胞をＰＳＭＡｂ－ＡＤＣと共に、５０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌおよび０．００１μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした。５０ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトＩｇＧおよびＰＳＭＡｂをコントロールとして使用した。４８時間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、アネキシン－Ｖ／ＰＩで染色し、フローサイトメトリーを用いてアポトーシスを検出した。アネキシンＶ（＋）／ＰＩ（－）を有するシグナルは、初期アポトーシスを示し、二重陽性染色、すなわちアネキシンＶ（＋）／ＰＩ（＋）は、後期アポトーシスを示す。総アポトーシスは、初期アポトーシスおよび後期アポトーシスの合計である。Ｃ４－２（図２４Ａ～図２４Ｃ、図２４Ｇ～図２４Ｉ、図２４Ｍ～図２４Ｏ）およびＰＣ－３（図２４Ｄ～図２４Ｆ、図２４Ｊ～図２４Ｌ、図２４Ｐ～図２４Ｒ）細胞に対するＰＳＭＡｂ－ＤＭ１（図２４Ａ～図２４Ｆ）、ＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＥ（図２４Ｇ、図２４Ｌ）、およびＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＦ（図２４Ｍ～図２４Ｒ）の結果は、フローサイトメトリーデータで示され（図２４Ａ、図２４Ｄ、図２４Ｇ、図２４Ｊ、図２４Ｍおよび図２４Ｐ）、計算された全体の割合で示され（図２４Ｂ、図２４Ｅ、図２４Ｈ、図２４Ｋ、図２４Ｎおよび図２４Ｑ）、初期アポトーシスで示された（図２４Ｃ、図２４Ｆ、図２４Ｉ、図２４Ｌ、図２４Ｏおよび図２４Ｒ）。 図２４は、図２４Ａ～図２４Ｒを含み、ＰＳＭＡｂ ＡＤＣがＰＳＭＡ陽性細胞に特異的にアポトーシスを誘導することを実証する実験結果を示す。ＰＣ－３およびＣ４－２細胞を６ウェルプレートに２×１０５／２ｍｌ培地／ウェルの密度で播種し、一晩培養した。翌日、培地を交換し、２ｍｌ培地中、細胞をＰＳＭＡｂ－ＡＤＣと共に、５０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌおよび０．００１μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした。５０ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトＩｇＧおよびＰＳＭＡｂをコントロールとして使用した。４８時間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、アネキシン－Ｖ／ＰＩで染色し、フローサイトメトリーを用いてアポトーシスを検出した。アネキシンＶ（＋）／ＰＩ（－）を有するシグナルは、初期アポトーシスを示し、二重陽性染色、すなわちアネキシンＶ（＋）／ＰＩ（＋）は、後期アポトーシスを示す。総アポトーシスは、初期アポトーシスおよび後期アポトーシスの合計である。Ｃ４－２（図２４Ａ～図２４Ｃ、図２４Ｇ～図２４Ｉ、図２４Ｍ～図２４Ｏ）およびＰＣ－３（図２４Ｄ～図２４Ｆ、図２４Ｊ～図２４Ｌ、図２４Ｐ～図２４Ｒ）細胞に対するＰＳＭＡｂ－ＤＭ１（図２４Ａ～図２４Ｆ）、ＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＥ（図２４Ｇ、図２４Ｌ）、およびＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＦ（図２４Ｍ～図２４Ｒ）の結果は、フローサイトメトリーデータで示され（図２４Ａ、図２４Ｄ、図２４Ｇ、図２４Ｊ、図２４Ｍおよび図２４Ｐ）、計算された全体の割合で示され（図２４Ｂ、図２４Ｅ、図２４Ｈ、図２４Ｋ、図２４Ｎおよび図２４Ｑ）、初期アポトーシスで示された（図２４Ｃ、図２４Ｆ、図２４Ｉ、図２４Ｌ、図２４Ｏおよび図２４Ｒ）。 図２４は、図２４Ａ～図２４Ｒを含み、ＰＳＭＡｂ ＡＤＣがＰＳＭＡ陽性細胞に特異的にアポトーシスを誘導することを実証する実験結果を示す。ＰＣ－３およびＣ４－２細胞を６ウェルプレートに２×１０５／２ｍｌ培地／ウェルの密度で播種し、一晩培養した。翌日、培地を交換し、２ｍｌ培地中、細胞をＰＳＭＡｂ－ＡＤＣと共に、５０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌおよび０．００１μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした。５０ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトＩｇＧおよびＰＳＭＡｂをコントロールとして使用した。４８時間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、アネキシン－Ｖ／ＰＩで染色し、フローサイトメトリーを用いてアポトーシスを検出した。アネキシンＶ（＋）／ＰＩ（－）を有するシグナルは、初期アポトーシスを示し、二重陽性染色、すなわちアネキシンＶ（＋）／ＰＩ（＋）は、後期アポトーシスを示す。総アポトーシスは、初期アポトーシスおよび後期アポトーシスの合計である。Ｃ４－２（図２４Ａ～図２４Ｃ、図２４Ｇ～図２４Ｉ、図２４Ｍ～図２４Ｏ）およびＰＣ－３（図２４Ｄ～図２４Ｆ、図２４Ｊ～図２４Ｌ、図２４Ｐ～図２４Ｒ）細胞に対するＰＳＭＡｂ－ＤＭ１（図２４Ａ～図２４Ｆ）、ＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＥ（図２４Ｇ、図２４Ｌ）、およびＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＦ（図２４Ｍ～図２４Ｒ）の結果は、フローサイトメトリーデータで示され（図２４Ａ、図２４Ｄ、図２４Ｇ、図２４Ｊ、図２４Ｍおよび図２４Ｐ）、計算された全体の割合で示され（図２４Ｂ、図２４Ｅ、図２４Ｈ、図２４Ｋ、図２４Ｎおよび図２４Ｑ）、初期アポトーシスで示された（図２４Ｃ、図２４Ｆ、図２４Ｉ、図２４Ｌ、図２４Ｏおよび図２４Ｒ）。 図２５は、図２５Ａ～図２５Ｄを含み、二重特異性抗体の様々な構成を示す。 図２５は、図２５Ａ～図２５Ｄを含み、二重特異性抗体の様々な構成を示す。 図２５は、図２５Ａ～図２５Ｄを含み、二重特異性抗体の様々な構成を示す。 図２５は、図２５Ａ～図２５Ｄを含み、二重特異性抗体の様々な構成を示す。
本発明は、癌を処置するための組成物および方法に関する。本発明は、一部には、ＰＳＭＡの細胞外ドメインに特異的に結合する抗体フラグメントの発見に基づく。したがって、本発明は、ＰＳＭＡに結合する抗体または抗体フラグメントを含む組成物を提供する。本発明の例示的な組成物には、抗体、抗体フラグメント、二重特異性抗体、抗体－薬物コンジュゲート、ＰＳＭＡターゲティング造影剤、キメラ抗原レセプター、キメラ抗原レセプターを発現する細胞などが含まれる。
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または等価な任意の方法および材料を、本発明の実施または試験で使用することができるが、好ましい方法および材料が記載される。
本明細書で使用される場合、以下の用語はそれぞれ、この章においてそれに関連する意味を有する。
冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、本明細書では、冠詞の文法的な目的語の１つまたは１つより多いもの（すなわち、少なくとも１つ）を指すために用いられる。例として、「ある要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または１つより多い要素を意味する。
量、時間的な持続時間などのような測定可能な値を指すときに本明細書で使用する「約」という用語は、このような変化は、開示された方法を実施するのに適切であるため、特定の値から±２０％、±１０％、±５％、±１％、または±０．１％の変動を包含することを意味する。
範囲：本開示全体で、本発明の様々な態様を、ある範囲の形式で示すことができる。範囲の形式の記載は、便宜上のものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、その範囲内の全ての可能な部分範囲および個々の数値を具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、１～６のような範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲と、その範囲内の個々の数字、例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３、６を含むと考えるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
説明
本発明は、癌を処置および予防するための組成物および方法を提供する。特定の実施形態では、組成物は、ＰＳＭＡの細胞外ドメインに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを含む。本発明は、ＰＳＭＡに結合する抗体フラグメントの発見に基づく。フラグメントは、抗体ライブラリーを発現する酵母ディスプレイ系において同定された。本明細書に記載される場合、本発明で提供される抗体フラグメントは、前立腺癌および他の固形腫瘍の新生血管系において見出されるＰＳＭＡを標的とする治療用および診断用の組成物を配合するために使用される。一実施形態では、組成物は抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であり、抗体または抗体フラグメントは、薬物を腫瘍位置に向かわせる。一実施形態では、組成物は二重特異性抗体であり、二重特異性抗体は、ＰＳＭＡに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントと、Ｔ細胞抗原（例えばＣＤ３）に結合する第二の抗体または抗体フラグメントを含む。一実施形態では、組成物は、ＰＳＭＡに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを含むキメラ抗原受容体である。一実施形態では、本発明は、抗体または抗体フラグメント、二重特異性抗体またはキメラ抗原受容体をコードする、単離された核酸を含む。一実施形態では、本発明は、抗体または抗体フラグメント、二重特異性抗体またはキメラ抗原受容体を発現するように改変された細胞を含む。
本発明は、癌（前立腺癌を含むがこれに限定されない）を処置または予防するための方法を提供する。特定の実施形態では、この方法は、ＰＳＭＡに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを含む有効量の組成物を被験体に投与することを含む。例えば、一実施形態では、この方法は、抗体または抗体フラグメント、二重特異性抗体またはキメラ抗原受容体を被験体に投与することを含む。一実施形態では、この方法は、抗体または抗体フラグメント、二重特異性抗体またはキメラ抗原受容体をコードする単離された核酸を含む有効量の組成物を被験体に投与することを含む。一実施形態では、この方法は、抗体または抗体フラグメント、二重特異性抗体またはキメラ抗原受容体を発現するように改変された細胞を被験体に投与することを含む。
本発明は、ＰＳＭＡに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを含む標的造影剤を被験体に投与することを含む被験体において癌を検出するための方法を提供する。抗体または抗体フラグメントは、限定されるものではないが、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、ＭＲＩまたは光学イメージングを含む様々な撮像様式において使用される標的造影剤を提供するために、任意の造影剤にコンジュゲートすることができる。
組成物
本明細書に記載される場合、本発明は、ＰＳＭＡに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを含む組成物を提供する。本発明は、大きな酵母ディスプレイヒトｓｃＦｖライブラリーの構築および高親和性抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖの単離に基づく。単離されたｓｃＦｖのＰＳＭＡに対する親和性は、９×１０－１０ｎＭと測定された。さらに、その機能性を増加させるｓｃＦｖのいくつかの突然変異が生成された。ｓｃＦｖの全長抗体への変換は、その親和性を１×１０－１０ｎＭまで増加させた。
ハイブリドーマ技術は、モノクローナル抗体調製のための従来のよく開発された方法である。しかしながら、マウス由来の抗体は、ヒトにおけるその適用を大きく妨げる。ヒト化はネズミ抗体の免疫原性を部分的に低下させる可能性があり、ヒト化抗体は現在臨床で広く使用されているが、抗体の抗原結合活性を維持するために一定のレベルのネズミアミノ酸が必要であるためヒト化が決して１００％に達することができないことから、免疫原性に関連する副作用は、依然として患者の約５０％に上る。Ｊ５９１は、ほぼ３ｎＭの親和性を有し、研究およびいくつかの臨床試験に広く使用されてきたヒト化ＰＳＭＡである（ＭｃＤｅｖｉｔｔ，Ｍ．Ｒ．ら、（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６０（２１）：６０９５－１００）。したがって、完全ヒト抗体は、臨床用途にとって最も望ましいものである。
ヒトマウスおよび異種マウストランスジェニックマウスは、従来のハイブリドーマ法による完全ヒト抗体の開発のために、Ｍｅｄａｒｅｘ／ＧｅｎＰｈａｒｍ ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌおよびＡｂｇｅｎｉｘによって開発された。ＰＳＭＡ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＬＬＣ（Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）は、異種マウスを使用し、親和性がそれぞれ１×１０－９ｎＭ、７．９×１０－１０ｎＭ、５．１×１０－１０ｎＭおよび２．１×１０－１０ｎＭの４種類の完全ヒト抗－ＰＳＭＡ抗体を開発した（米国特許８４７０３３０号）。
トランスジェニックマウスと比較して、抗体ライブラリーは、完全ヒト抗体調製のために、より簡便かつ同等に効率的である。その根拠は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を健常または特定のドナーから単離し、ｍＲＮＡを抽出し、抗体の可変領域を増幅し、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）またはＦａｂフォーマットに組み立て、分子生物学的戦略によってファージまたは酵母表面に提示することである。抗体ライブラリーの利点は、ライブラリーのサイズが十分に大きい限り、高親和性抗体を容易に単離できることである。ライブラリーがヒトＢ細胞から構築される場合、誘導される抗体は１００％ヒト起源であり、臨床適用のための免疫原性の問題を有さない。
複雑な構造および４つの鎖間ジスルフィド結合を有する構造のために、全長抗体は、大腸菌または酵母によって発現されにくい。したがって、最も頻繁に表示される抗体フォーマットは、ｓｃＦｖおよびＦａｂである。ｓｃＦｖは、重鎖および軽鎖の可変領域のみを含み、Ｆａｂは軽鎖定常領域および重鎖の第一定常領域も含む。場合によっては、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ＦａｂまたはｓｃＦｖ－Ｆｃのような小さな抗体フラグメントと比較して、完全長抗体は最も安定な構造、最長循環時間、最高親和性、標識または修飾に対する最良耐性を有し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介しうる。したがって、全長抗体は、臨床では最も一般的なフォーマットである。
抗体ライブラリーを使用するための戦略は、最初にｓｃＦｖまたはＦａｂなどの抗体フラグメントを発見し、次いでそれを全長抗体に変換することである。多くのｓｃＦｖまたはＦａｂは、機能を損なうことなく完全長抗体に首尾よく変換することができるが、いくつかのフラグメント抗体は、一旦完全長抗体に変換されると親和性を失う（Ｓｃｈｉｒｒｍａｎｎ，Ｔ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，（２０１１）１６（１）：４１２－２６；Ｂａｋｅｒ，Ｋ．Ｐ．ら、（２００３）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ，４８（１１）：３２５３－６５；Ｔｈｉｅ，Ｈ．ら、（２０１１）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，６（１）：ｅ１５９２１）、これは定常領域の添加の結果として、結合部位の立体配座変化に起因する可能性がある。ｓｃＦｖに関して、鎖間リンカーは、全長抗体に変換されるときに除去され、したがって抗原結合親和性を損なういくつかのｓｃＦｖにおける抗原結合配座に寄与し得る。したがって、高親和性ｓｃＦｖまたはＦａｂは、高親和性完全抗体誘導体を保証し得ない。それぞれの変換は、固有のケースと考えられ、実験によって確認される必要がある。
一実施形態では、本発明は、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を含む組成物を提供する。ＡＤＣは、抗原特異的毒性送達のために抗体をアーム化するためのプラットフォーム戦略である。原理的には、抗体を標的とする抗体（通常は腫瘍ターゲティング抗体）を超毒性薬物と結合させて、腫瘍細胞を標的様式で選択的に殺し、正常組織を守ることである。ＡＤＣで使用される薬物は主に２つの種類に分類され、１つは、マイクロチューブリン阻害剤、例えば、オーリスタチン（ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ）（Ｓｔｅｐｈａｎ，Ｊ．Ｐ．ら、（２００８）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，１９（８）：１６７３－８３；Ｙｏｕｎｅｓ，Ａ．ら、（２０１０）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３６３（１９）：１８１２－２１；Ｏｋｅｌｅｙ，Ｎ．Ｍ．ら、（２０１０）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１６（３）：８８８－９７０）およびメイタンシノイド（ＤＭ１およびＤＭ４）（Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｊ．Ｍ．ら、（２０１４）．Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，５７（１６）：６９４９－６４；Ｂｅｎｄｅｒ，Ｂ．ら、（２０１４）ＡＡＰＳ Ｊ，１６（５）：９９４－１００８；Ｒａｕｆｉ，Ａ．，Ａ．Ｓ．Ｅｂｒａｈｉｍら、（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ Ｍａｎａｇ Ｒｅｓ，５：２２５－３３）であり、他の種類は、二本鎖ＤＮＡ開裂剤、例えば、カリケアマイシンである。このような超毒性のために、化学療法剤として単独で使用することはできないが、副作用を軽減し治療効果を高めるために抗体と結合させる必要がある。
一実施形態では、本発明は、二重特異性抗体を含む組成物を提供する。二重特異性モノクローナル抗体（ＢｓＭＡｂ、ＢｓＡｂ）は、新規抗体を用いて強力な抗腫瘍の武器を作製するための別の戦略である。ＢｓＡｂは、２つの異なるモノクローナル抗体のフラグメントから構成され、結果的に２つの異なるタイプの抗原に結合する人工タンパク質である。この手法の最も広く使用されている用途は、癌免疫療法であり、ＢｓＭＡｂｓは、（ＣＤ３などの受容体を用いて）細胞毒性細胞に同時に結合し、腫瘍細胞などを標的として破壊するように操作されている（Ｍｕｌｌｅｒ Ｄら、（２０１０）ＢｉｏＤｒｕｇｓ，２４（２）：８９－９８；Ｃｈａｍｅｓ Ｐ１ら、（２００９）ＭＡｂｓ，１（６）：５３９－４７）。二重特異的Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）およびＤｕａｌ－Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅ－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ＤＡＲＴ）は、小さなフラグメントＢｓＡｂの例であり、種々のこれより大きなＢｓＡｂ、例えば、ノブ・イン・ホールＩｇＧ、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＴｒｉｏＭａｂ、ＤＶＤ Ｉｇも開発されている（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＲＥら、（２０１５）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ，２０（７）：８３８－４７）。ＢｓＡｂにおいて、一方のアームはＴ細胞またはＮＫ細胞の活性化抗体、例えば抗ＣＤ３または抗ＣＤ１６抗体であってもよく、他方のアームは腫瘍標的抗体であってもよく、または両方のアームが、腫瘍成長の相乗的阻害のための異なる腫瘍マーカーを標的とする。
一実施形態では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む組成物を提供する。例えば、特定の実施形態では、組成物は、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変された細胞である。例えば、特定の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞が腫瘍細胞上の特定のタンパク質（抗原）を認識することを可能にする、その表面にＣＡＲを産生するように遺伝子操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞を提供する。ｓｃＦｖは、そのような工学のために最も頻繁に使用される受容体であり、癌治療のための臨床でうまく使用されている（Ｇｒｕｐｐ ＳＡら、（２０１３）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３６８（１６）：１５０９－１８；Ｐｏｒｔｅｒ ＤＬら、（２０１１）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３６５（８）：７２５－３３）。ｓｃＦｖは、ヒンジおよび膜貫通ドメインを介してシグナル伝達細胞内ドメインに融合される。そのような分子は、その標的のｓｃＦｖによる認識に応答してＴ細胞またはＮＫ細胞の活性化を引き起こす。このようなＣＡＲを発現するＴ細胞またはＮＫ細胞は、標的抗原を発現する標的細胞を認識して殺す。いくつかのＣＡＲが腫瘍関連抗原に対して開発されており、このようなＣＡＲを発現するＴ細胞を用いる養子移入手法は、現在、様々な癌の治療のための臨床試験中である。
抗体
一実施形態では、本発明は、ＰＳＭＡの細胞外部分に特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを含む組成物を提供する。例えば、一実施形態では、抗体または抗体フラグメントが結合するＰＳＭＡの細胞外部分は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、「エピトープ」という用語は、抗体に結合する抗原の領域を指す。エピトープは、領域への第１抗体の結合が、第２抗体または他の二価分子がこの領域に結合するのを妨げる、第１抗体によって認識される抗原の領域である。この領域は、抗体の種類によって選択的に認識される１つ以上の特定のコア配列を包含する。一般に、エピトープは、連続または非連続のアミノ酸配列によって形成され得る局所的表面構造によって構成される。
別の実施形態では、「選択的に認識する」、「選択的に結合する」または「選択的に認識される」という用語は、エピトープに対する抗体または他の二価分子の結合が、例えば、ＥＬＩＳＡおよび低温置換アッセイなどの当該技術分野で知られ、本明細書に記載される技術によって決定される場合、無関係のエピトープに対する二価分子の結合よりも、またはエピトープに対する無関係の二価分子の結合よりも、少なくとも２倍を超え、好ましくは、２～５倍を超え、最も好ましくは５倍を超えることを意味する。
いくつかの実施形態では、用語「抗体」は、抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を指す。ヒトおよびマウスを含むほとんどの哺乳類では、この形態はテトラマーであり、２つの免疫グロブリン鎖の２つの同一の対からなり、それぞれの対が、１つの軽鎖と１つの重鎖を有しており、各軽鎖が、免疫グロブリンドメインＶＬおよびＣＬを含み、各重鎖が、免疫グロブリンドメインＶＨ、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３およびＣγ４を有している。各対において、軽鎖および重鎖の可変領域（ＶＬおよびＶＨ）は共に抗原への結合を担っており、定常領域（ＣＬ、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３およびＣγ４、特にＣγ１、Ｃγ２およびＣγ３）は、抗体エフェクター機能を担っている。いくつかの哺乳動物、例えばラクダおよびラマでは、全長抗体は、免疫グロブリンドメインＶＨ、Ｃγ２およびＣγ３を含む２つの重鎖のみからなることができる。本明細書において「免疫グロブリン（Ｉｇ）」とは、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。免疫グロブリンとしては、限定されないが、抗体が挙げられる。免疫グロブリンは、全長抗体、抗体フラグメント、およびＶＨ、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、ＶＬおよびＣＬを含むがこれらに限定されない個々の免疫グロブリンドメインを含むが、これらに限定されない多数の構造形態を有し得る。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、インタクトな抗体を異なる「クラス」に割り当てることができる。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの５つの主要な種類のインタクトな抗体があり、これらのいくつかはさらに、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２などの「サブクラス」（アイソタイプ）に分けられてもよい。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元立体配置は、周知である。
いくつかの実施形態では、「抗体」または「抗原結合フラグメント」という用語はそれぞれ、インタクトな分子、所望の標的と特異的に相互作用することができるＦａｂ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ二価分子、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどのその機能性フラグメントを指す。いくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントは、以下のものを含む。
（１）完全な抗体を酵素パパインで消化してインタクトな軽鎖および１つの重鎖の一部を生じることによって産生することができる、抗体分子の一価抗原結合フラグメントを含むフラグメントであるＦａｂ；
（２）抗体全体をペプシンで処理し、次いで還元して完全な軽鎖および重鎖の一部を得ることによって得ることができる抗体分子のフラグメントであるＦａｂ’；抗体分子当たり２つのＦａｂ’フラグメントが得られる；
（３）その後の還元を行わず、抗体全体を酵素ペプシンで処理することにより得ることができる抗体のフラグメント；Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって一緒に保持された２つのＦａｂ’フラグメントのダイマーである（Ｆａｂ’）２；
（４）Ｆｖ、軽鎖の可変領域および２本鎖として発現される重鎖の可変領域を含む遺伝子操作されたフラグメント；および
（５）軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含み、遺伝的に融合した単鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結された遺伝子操作分子である、単鎖抗体（ＳＣＡまたはｓｃＦｖ）。
（６）ｓｃＦｖ－Ｆｃは、ＩｇＧなどの免疫グロブリン（Ｉｇ）およびＦｃ領域からのヒンジ領域と一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を融合することによって作製される。
一実施形態では、本明細書で提供される抗体は、モノクローナル抗体である。別の実施形態では、本明細書で提供される抗原結合フラグメントは、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、タンデムｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ二価分子、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ＦｖまたはＦ（ａｂ’）２である。
一実施形態では、用語「二価分子」または「ＢＶ」は、同時に２つの別個の標的に結合することができる分子を指す。二価分子は、２つの結合ドメインを有するもの、結合ドメインを２つだけ有するものに限定されず、多価分子であってもよく、または結合した一価分子からなる分子であってもよい。二価分子の結合ドメインは、同じ標的上に位置するか、または異なる種に由来する標的上に位置する同じエピトープまたは異なるエピトープを選択的に認識することができる。結合ドメインは、ジスルフィド結合、ペプチド架橋、アミド結合、および当技術分野で公知の他の天然または合成結合で接続していてもよい（Ｓｐａｔｏｌａら、「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｂ． Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ． ２６７ （１９８３）（一般的な総説）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｊ． Ｓ．，「Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ」（１９８０） ｐｐ． ４６３－４６８（一般的な総説）；Ｈｕｄｓｏｎら、Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔ Ｒｅｓ （１９７９） １４，１７７－１８５；Ｓｐａｔｏｌａら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ （１９８６） ３８，１２４３－１２４９；Ｈａｎｎ，Ｍ．Ｍ．，Ｊ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ Ｉ （１９８２） ３０７－３１４；Ａｌｍｑｕｉｓｔら、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ （１９８０） ２３，１３９２－１３９８；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ－Ｗｈｉｔｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ （１９８２） ２３，２５３３；Ｓｚｅｌｋｅら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＥＰ ４５６６５；Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ９７，３９４０５ （１９８２）；Ｈｏｌｌａｄａｙ，ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ （１９８３） ２４，４４０１－４４０４；ａｎｄ Ｈｒｕｂｙ，Ｖ． Ｊ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ （１９８２） ３１，１８９－１９９）。
本発明は、大きな酵母ディスプレイヒトｓｃＦｖライブラリーから単離された抗ＰＳＭＡ抗体または抗体フラグメントを提供する。一実施形態では、その抗原結合フラグメントは高親和性抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ ｇｙ１であり、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ１を含む。一実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１を含む。一実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ２を含む。一実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２を含む。一実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ３を含む。一実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む。一実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ４を含む。
一実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ１を含む。一実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１を含む。一実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ２を含む。一実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２を含む。一実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ３を含む。一実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３を含む。一実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ４を含む。一実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、配列番号３７のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖリンカーを含む。
例えば、一実施形態では、組成物は、本明細書中でｇｙ１と示されるｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。一実施形態では、ｇｙ１は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ｇｙ１は、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖とを含む。一実施形態では、ｇｙ１は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ１；配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１；配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ２；配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ３；配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３；配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ４；配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ１；配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ２；配列番号２９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２；配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ３；配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３；配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ４；および配列番号３７のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖリンカーを含む。
一実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、１つ以上の突然変異を含む。例えば、一実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ２を含み、ここで、配列番号３９は、配列番号１１に関してＶ→Ａ点変異を含む。一実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２を含み、ここで、配列番号４１は、配列番号１３に関してＧ→Ｅ点変異を含む。一実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ４を含み、ここで、配列番号４３は、配列番号１９に関してＶ→Ａ点変異を含む。一実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１を含み、ここで、配列番号４５は、配列番号２５に関してＳ→Ｆ点変異を含む。一実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ３を含み、ここで、配列番号４７は、配列番号３１に関してＩ→Ｖ点変異を含む。一実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３を含み、ここで、配列番号４９は、配列番号３３に関してＤ→Ｇ点変異を含む。一実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ４を含み、ここで、配列番号５１は、配列番号３５に関してＧ→Ｅ点変異を含む。
例えば、一実施形態では、組成物は、本明細書中でｇｙ１－ｓｔと示されるｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。一実施形態では、ｇｙ１－ｓｔは、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ２と、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１と、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ４とを含む。一実施形態では、ｇｙ１－ｓｔは、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ１；配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１；配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ２；配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ３；配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３；配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ４；配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ１；配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ２；配列番号２９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２；配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ３；配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３；配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ４；および配列番号３７のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖリンカーを含む。
例えば、一実施形態では、組成物は、本明細書中でｇｙ１－２と示されるｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。一実施形態では、ｇｙ１－２は、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２と、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ４と、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１と、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ３とを含む。一実施形態では、ｇｙ１－２は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ１；配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１；配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ２；配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ３；配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３；配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ４；配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ１；配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ２；配列番号２９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２；配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ３；配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３；配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ４；および配列番号３７のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖリンカーを含む。
例えば、一実施形態では、組成物は、本明細書中でｇｙ１－３と示されるｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。一実施形態では、ｇｙ１－３は、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１と、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３とを含む。一実施形態では、ｇｙ１は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ１；配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１；配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ２；配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ３；配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３；配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ４；配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ１；配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ２；配列番号２９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２；配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ３；配列番号４９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３；配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ４；および配列番号３７のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖリンカーを含む。
一実施形態では、本明細書に記載のｓｃＦｖは、別のフラグメント抗体または全長抗体へと操作され、フラグメント抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ－ＣＨ２、ｓｃＦｖ－ＣＨ３、または完全抗体を指す。
一実施形態では、組成物は、本明細書に記載のｓｃＦｖを含む抗体を含む。例えば、一実施形態では、組成物は、ｇｙ１－２ ｓｃＦｖを含む抗体を含む。一実施形態では、ｇｙ１－２ ｓｃＦｖを含む抗体は、本明細書ではＰＳＭＡｂとして示される。一実施形態では、抗体は、配列番号６８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一実施形態では、抗体は、シグナルペプチドを有する重鎖を含み、シグナルペプチドを有する重鎖は、配列番号５３のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、重鎖シグナルペプチドは、配列番号５５のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、抗体は、配列番号５７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗体は、配列番号５９の重鎖定常領域を含む。一実施形態では、抗体は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一実施形態では、抗体は、シグナルペプチドを有する軽鎖を含み、シグナルペプチドを有する軽鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、軽鎖シグナルペプチドは、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、抗体は、配列番号６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗体は、配列番号６７の軽鎖定常領域を含む。
所望の配列アラインメントを達成するために使用され得る配列アラインメント方法は、いくつかの実施形態では、当業者に理解されるように、ペアワイズアラインメント方法またはマルチシーケンスアラインメント方法にのみ限定されない。配列アラインメントは、様々なテキストベースのファイル形式で保存することができる。一実施形態では、これは、特定の実施形態では、ＲＥＡＤＳＥＱ、ＥＭＢＯＳＳおよびＢｉｏＰｅｒｌ、ＢｉｏＲｕｂｙなどの変換プログラムおよびプログラミングパッケージを使用して、任意のフォーマット、例えばＦＡＳＴＡまたはＧｅｎＢａｎｋ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＥｎｔｒｅｚおよびＥＭＢＬフォーマットを変換することによって達成される。当業者には理解されるように、当業者は、任意のプログラムまたは記憶媒体を使用して必要に応じて配列を変換、修正、スコア付け、更新および／または格納できることを理解されたい。
いくつかの実施形態では、用語「配列アラインメント」は、核酸またはアミノ酸配列のアラインメントを実施して容易にプローブし、評価し、数学的および統計的計算を行い、その結果を得るために使用される、当業者に理解される任意のプログラムまたは方法の使用を含む。一実施形態では、配列または構造のアラインメントのための方法は当業者に周知であり、当業者に理解されるように、配列および構造相同性に基づくアラインメントを含む。
一実施形態では、用語「相同性」、「相同体」または「相同」は、配列同一性、または構造同一性、または機能同一性をいう。用語「相同性」および他の類似の形態を用いることにより、核酸またはペプチドのいずれかの分子が類似して機能し、かつ／または配列同一性を含み、かつ／または構造的に保存され、参照配列は、本発明の一部とみなされるべきである。別の実施形態では、用語「相同性」、「相同体」または「相同な」は、いずれの場合であっても、言及されている配列が、アミノ酸配列または核酸配列のいずれであっても、示された配列と少なくとも８６％の対応性を示すことを示す。別の実施形態では、アミノ酸配列または核酸配列は、示された配列と少なくとも９０％の対応性を示す。別の実施形態では、アミノ酸配列または核酸配列は、示された配列と少なくとも９２％の対応性を示す。別の実施形態では、アミノ酸配列または核酸配列は、示された配列と少なくとも９５％の対応性を示す。別の実施形態では、アミノ酸配列または核酸配列は、示された配列と少なくとも９５％またはさらに大きな対応性を示す。別の実施形態では、アミノ酸配列または核酸配列は、示された配列と少なくとも９７％またはさらに大きな対応性を示す。別の実施形態では、アミノ酸配列または核酸配列は、示された配列と９７％～１００％の対応性を示す。別の実施形態では、アミノ酸配列または核酸配列は、示された配列と１００％の対応性を示す。同様に、一実施形態では、特定の配列への対応性に関する言及は、本明細書に定義されるようなその配列に対する直接的な対応性および相同性の両方を含む。したがって、一実施形態では、用語「非相同性」は、アミノ酸配列または核酸配列が、示された配列と８５％以下の対応性を示すことを意味する。別の実施形態では、アミノ酸配列または核酸配列は、示された配列と７５％以下の対応性を示す。別の実施形態では、アミノ酸配列または核酸配列は、示された配列と６５～７４％の対応性を示す。別の実施形態では、アミノ酸配列または核酸配列は、示された配列と５５～６４％の対応性を示す。別の実施形態では、アミノ酸配列または核酸配列は、示された配列と４５～５４％の対応性を示す。別の実施形態では、アミノ酸配列または核酸配列は、示された配列と３５～４４％の対応性を示す。別の実施形態では、アミノ酸配列または核酸配列は、示された配列と３５～４４％の対応性を示す。別の実施形態では、アミノ酸配列または核酸配列は、示された配列と１５～３４％の対応性を示す。別の実施形態では、アミノ酸配列または核酸配列は、示された配列と５～１４％の対応性を示す。別の実施形態では、アミノ酸配列または核酸配列は、示された配列と０．１～４％の対応性を示す。別の実施形態では、用語「非相同性」は、用語「低配列類似性」と相互に置き換え可能に用いることができる。
一実施形態では、軽鎖は、上に列挙されているか、または例えば、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個のアミノ酸の変異、欠失または挿入により、相同性が７０％を超え、例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超えるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む。
一実施形態では、軽鎖は、上に列挙されているか、または例えば、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個のアミノ酸の変異、欠失または挿入により、相同性が７０％を超え、例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超えるＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３配列を含む。
一実施形態では、重鎖は、上に列挙されているか、または例えば、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個のアミノ酸の変異、欠失または挿入により、相同性が７０％を超え、例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超えるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む。
一実施形態では、重鎖は、上に列挙されているか、または例えば、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個のアミノ酸の変異、欠失または挿入により、相同性が７０％を超え、例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超えるＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３配列を含む。
一実施形態では、完全抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の種類のうちの１つである。別の実施形態では、ｇｙ１ ｓｃＦｖを、ＩｇＧ１完全抗体になるように操作した。
一実施形態では、完全抗体は、ラムダ、カッパの定常領域またはこれらから変異したものを有する。別の実施形態では、ｇｙ１ ｓｃＦｖは、ＣＬ２定常領域を用い、完全抗体になるように操作された。
一実施形態では、重鎖は、配列番号５９の定常領域を含むか、または例えば、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個のアミノ酸の変異、欠失または挿入により、相同性が７０％を超え、例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超える配列を含む。
一実施形態では、軽鎖は、配列番号６７の定常領域を含むか、または例えば、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個のアミノ酸の変異、欠失または挿入により、相同性が７０％を超え、例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超える配列を含む。
一実施形態では、シグナルペプチドと可変領域との間、重鎖および／または軽鎖の可変領域と定常領域との間にリンカーペプチドが存在してもよく、または存在していなくてもよい。このようなリンカーペプチドの一例は、制限酵素部位によってコードされる。
一実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、酵母細胞表面に提示される。別の実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、ナノ粒子表面にコーティングされる。別の実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、哺乳動物細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞または他のヒト細胞または他の哺乳動物細胞）の表面に提示される。別の実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、酵母、大腸菌または哺乳動物細胞によって、分泌タンパク質として産生される。
一実施形態では、用語「結合する」または「～に結合している」または文法上の同等語は、互いに親和性を有する構成を指す。「特異的結合」は、結合が２つの分子間で選択的である場合である。特異的結合の特定の例は、抗体と抗原との間に生じるものである。典型的には、解離定数（ＫＤ）が約１×１０－５Ｍ未満または約１×１０－６Ｍ未満または１×１０－７Ｍ未満である場合、特異的結合を、非特異的結合と区別することができる。特異的結合は、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、共沈、化学的架橋の有無にかかわらず、ツーハイブリッドアッセイなどによって検出することができる。適切なコントロールを用いて、「特異的」結合と「非特異的」結合を区別することができる。
一実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、１ｎＭ範囲内のＫｄで、その標的に結合する。別の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、０．１ｎＭ範囲内のＫｄで、その標的に結合する。別の実施形態では、ｇｙ１ ｓｃＦｖはＫｄ＝１．１６５ｎＭの親和性を有し、ＩｇＧ１完全抗体ＰＳＭＡｂは、Ｋｄ＝０．１ｎＭの親和性を有する。
いくつかの実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、修飾を有する。修飾は、本明細書において以下にさらに定義されるものである。いくつかの実施形態では、修飾は、Ｎ末端修飾である。別の実施形態では、修飾は、Ｃ末端修飾である。別の実施形態では、修飾は、タンパク質の中央部にある。一実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントの分泌可能な形態は、免疫グロブリン（Ｉｇ）ヒンジ領域への結合を可能にするＮ末端修飾を含む。別の実施形態では、Ｉｇヒンジ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域由来であるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、修飾は、抗体または抗体フラグメントに対する直接的な修飾である。他の実施形態では、修飾は、１つ以上の他のペプチド、タンパク質、化学物質、炭水化物、またはさらには二次抗体によって架橋された間接的な修飾である。
本発明に包含されるさらなる翻訳後修飾には、例えば、Ｎ結合またはＯ結合炭水化物鎖、Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング、アミノ酸骨格への化学的部分の結合、Ｎ－結合型またはＯ－結合型の炭水化物鎖の化学的修飾、および原核生物の宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加または欠失を含む。
一実施形態では、用語「ポリペプチド」は、一般に、本発明の抗体、抗原結合フラグメントまたはバリアントをいう。
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、アミノ酸置換を含む。一実施形態では、アミノ酸置換は、保存的である。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、電荷をもたない極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖を有するアミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。別の実施形態では、アミノ酸置換は、天然のポリペプチドと比較して、突然変異したポリペプチドの活性を高め、保存的なものではない。
本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、当該分野で周知のような任意の合成または組換えプロセスによって製造することができる。本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、当該分野で公知の技術によって生物物理学的特性または生物学的特性を変化させるために、さらに修飾されてもよい。例えば、ポリペプチドは、プロテアーゼに対するその安定性を増加させるために、またはその天然の受容体に対するその親油性、溶解性または結合親和性を改変するために修飾されてもよい。
いくつかの実施形態では、抗体フラグメントは、抗体のタンパク質加水分解によって、またはフラグメントをコードするＤＮＡの大腸菌または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物または他のタンパク質発現システム）での発現によって調製され得る。抗体フラグメントは、いくつかの実施形態では、従来の方法による全抗体のペプシン消化またはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体フラグメントは、ペプシンによる抗体の酵素的切断によって産生され、Ｆ（ａｂ’）２と表される５Ｓフラグメントを提供し得る。このフラグメントは、ジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基のためのチオール還元剤および場合によりブロッキング基を用いて３．５Ｓ Ｆａｂ’一価フラグメントを生成するためにさらに切断することができる。あるいは、ペプシンを用いる酵素的切断は、２つの一価Ｆａｂ’フラグメントおよびＦｃフラグメントを直接産生する。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、米国特許第４，０３６，９４５号および同第４，３３１，６４７号およびそこに含まれる参考文献に記載されており、これらの特許はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，７３：１１９－１２６，１９５９も参照のこと。フラグメントが、インタクトな抗体によって認識される抗原に結合する限り、一価の軽鎖－重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素的、化学的、または遺伝子技術など、抗体を切断する他の方法も使用され得る。
一実施形態では、本発明のポリペプチド、抗体またはタンパク質の「バリアント」は、１つまたは複数のアミノ酸によって、参照ポリペプチド、抗体またはタンパク質に対して変更されるアミノ酸配列をいう。本発明において、ポリペプチドのバリアントは、参照されるタンパク質の抗体結合特性を保持している。別の実施形態では、「バリアント」は、本発明の抗原結合フラグメントを指す。さらに別の実施形態では、バリアントは、標的またはマーカーに対する特異性を保持する抗原結合フラグメントのバリアントである。バリアントは、置換アミノ酸が、類似の構造的特性または化学的特性（例えば、ロイシンとイソロイシンとの置換）を有する、「保存的」変化を有していてもよい。別の実施形態では、バリアントは、１つ以上の予測された非必須アミノ酸残基での保存的アミノ酸置換を有する。別の実施形態では、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものであり、他の実施形態では、その反対の場合は「非保存的置換」と呼ばれる。類似の変化を有する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、電荷をもたない極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖を有するアミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。あるいは、飽和突然変異誘発などのコード配列の全部または一部に突然変異をランダムに導入し、得られた突然変異体を生物活性についてスクリーニングして、活性を保持する突然変異体を同定することができる。突然変異誘発の後、コードされたタンパク質は日常的に発現され、コードされたタンパク質の機能的および／または生物学的活性は、本明細書に記載の技術を用いて、または当技術分野で公知の技術を日常的に改変することによって、決定することができる。類似の軽微な変化はまた、アミノ酸の欠失または挿入、またはその両方を含み得る。どのアミノ酸残基が免疫学的反応性を消失させることなく置換、挿入または欠失され得るかを決定するための指針は、当該分野で周知のコンピュータープログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを用いて見出すことができる。
一実施形態では、用語「フレームワーク領域」または「ＦＲ」は、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。フレームワーク領域は正確に定義されている。例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、ＵＳＡ（第５版、１９９１）を参照。各可変ドメインは、典型的には、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４として識別される４つのＦＲを有する。いくつかの実施形態では、「ＦＲ」はまた、ＣＤＲ領域の外側つまり抗体の可変領域内の抗体分子の認識要素として作用する、抗原と直接相互作用する領域を除く、ＣＤＲ領域に隣接または隣接するアミノ酸残基を含む抗体可変領域を指す。一実施形態では、用語「フレームワーク領域」は、ＣＤＲによって分割されているフレームワークの各ドメインを意味することを意図している。いくつかの実施形態では、異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。抗体の結合された重鎖および軽鎖のフレームワーク領域は、抗原への適切な結合のためにＣＤＲを配置および整列させる働きをする。
一実施形態では、用語「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」は、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見られる非連続抗原結合部位を含むアミノ酸残基をいう。他の実施形態では、用語「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，６６０９－６６１６（１９７７）およびＫａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（１９９１）、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）、ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６）に記載されているような領域を含むだろう。可変ドメインのＣＤＲのアミノ酸は、配列可変性に基づいて、Ｋａｂａｔによって最初に定義され、抗体のアミノ酸残基についてＫａｂａｔの番号付システムを用いて、ヒト重鎖可変ドメイン（ＶＨ）におけるアミノ酸残基３１－３５Ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）および９５－１０２（Ｈ３）、およびヒト軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）におけるアミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）および８９－９７（Ｌ３）からなる。Ｋａｂａｔら、ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，ＵＳＡ（第５版、１９９１）を参照。ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）は、可変ドメイン領域の三次元構造ループ内に含まれる残基に基づき、ＣＤＲの別の定義を示し、抗原結合活性にとって重要であることを発見した。Ｃｈｏｔｈｉａらは、ヒト重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のアミノ酸残基２６－３２（Ｈ１）、５２－５６（Ｈ２）および９５－１０２（Ｈ３）と、ヒト軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のアミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）および８９－９７（Ｌ３）とからなるものとしてＣＤＲを定義した。ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲの定義を合わせると、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの番号付システムに基づき、ヒトＶＨのアミノ酸残基２６－３５Ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）および９５－１０２（Ｈ３）と、ヒトＶＬのアミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）および８９－９７（Ｌ３）とからなる。
いくつかの実施形態では、抗体またはその重鎖または軽鎖に関して使用される場合の「可変領域」は、抗原結合を分子に与え、定常領域ではない抗体のアミノ末端部分を意味することを意図する。この用語は、可変領域全体の結合機能の全ての一部を維持するその機能性フラグメントを含むことが意図されている。したがって、用語「ヘテロマー可変領域結合フラグメント」は、少なくとも１つの重鎖可変領域および少なくとも１つの軽鎖可変領域またはその機能性フラグメントを組み立ててヘテロマー複合体を形成することを意味する。異種可変領域結合フラグメントには、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃｆｖ）などの機能性フラグメントが含まれる。このような機能性フラグメントは、当業者に周知である。したがって、ヘテロマー可変領域の機能性フラグメントを記載する際にこれらの用語を使用することは、当業者に周知の定義に対応することを意図している。このような用語は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．Ａ．（編集），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，Ｉｎｃ．）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，２２：１８９－２２４（１９９３）；ＰｌｕｃｋｔｈｕｎおよびＳｋｅｒｒａ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１７８：４９７－５１５（１９８９）、Ｄａｙ，Ｅ．Ｄ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）に記載されている。
１つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、単離されたポリペプチドのアイソフォームである。一実施形態では、「アイソフォーム」は、同じタンパク質またはポリペプチドの別のアイソフォームとわずかな相違しかない、本発明のタンパク質またはポリペプチドなどの分子の態様を指す。一実施形態では、アイソフォームは、異なるが関連する遺伝子から産生され、または別の実施形態では、選択的スプライシングによって同じ遺伝子から生じる。別の実施形態では、アイソフォームは、単一の核酸多型によって引き起こされる。
一実施形態では、本発明の単離されたポリペプチドは、天然タンパク質のフラグメントである。一実施形態では、「フラグメント」は、全長タンパク質またはポリペプチドよりも短いか、またはより少ないアミノ酸を含むタンパク質またはポリペプチドを指す。別の実施形態では、フラグメントとは、全長核酸よりも短いか、またはより少ない核酸を含む核酸を指す。別の実施形態では、フラグメントは、Ｎ末端フラグメントである。別の実施形態では、フラグメントは、Ｃ末端フラグメントである。１つの実施形態では、本発明のフラグメントは、タンパク質、ペプチド、または核酸の内在する部分である。別の実施形態では、フラグメントは、タンパク質、ペプチド、または核酸の機能的に内在する部分である。別の実施形態では、フラグメントは、タンパク質、ペプチド、または核酸の中の機能的に内在する部分である。別の実施形態では、フラグメントは、Ｎ末端の機能性フラグメントである。一実施形態では、フラグメントは、Ｃ末端の機能性フラグメントである。
一実施形態では、「機能性フラグメント」という用語は、天然または野生型抗体またはポリペプチドの改変版であるにもかかわらず、野生型と比較してある程度の生物学的活性を維持するフラグメントを指す。この活性度は、「活性」がその天然の生物物理学的特性または生化学的特性、例えば結合能力、親和性、半減期などを指す野生型と比較して中程度から高い範囲に及ぶ可能性がある。
一実施形態では、本発明の単離されたポリペプチドは、本発明のポリペプチドの誘導体を含む。「誘導体」は、いくつかの実施形態では、問題となるタンパク質の天然配列の全長部分より短いものを指すと理解されるべきである。いくつかの実施形態では、「誘導体」は、非天然配列、すなわち問題の天然タンパク質の一部を形成しない配列を（その末端におよび／または前記配列自体内に）さらに含むことができる。「誘導体」という用語はまた、天然のタンパク質またはそのフラグメントのアミノ残基側鎖に化学基を結合させることによって産生される分子種をその範囲内に含み、前記化学基は、天然のタンパク質中の天然に存在するアミノ酸残基の一部を形成しない。
抗体および抗体フラグメントを作製する方法は、当技術分野で公知である。（例えば、本明細書に参考として組み込まれるＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８を参照。）
抗体は、本発明の抗ＰＳＭＡエピトープを含むＰＳＭＡまたはＰＳＭＡのペプチドフラグメントのような標的抗原によるマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、霊長類、ヒトおよびニワトリを含む様々な動物の免疫化によって産生され得る。一実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、動物の免疫化の前に精製される。一実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、当技術分野で公知の方法、例えばゲル濾過、イオン交換、アフィニティークロマトグラフィーなどによって精製することができる。アフィニティークロマトグラフィーまたは既知の多くの他の技術当技術分野では、血清、腹水、またはハイブリドーマ上清からポリクローナルまたはモノクローナル抗体を単離するために使用することができる。
「精製された」とは、モノクローナル抗体が、モノクローナル抗体に通常付随する少なくともいくつかのタンパク質から分離され、好ましくはタンパク質以外の全ての細胞物質から分離されることを意味する。
さらに、本発明の抗体の化学的に修飾された誘導体は、ポリペプチドの溶解性、安定性およびｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ循環時間の増加、または免疫原性の低下などのさらなる利点を提供することができる（米国特許第４，１７９，３３７号）。誘導体化のための化学的部分は、水溶性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどから選択することができる。抗体は、分子内のランダムな位置で、または分子内の所定の位置で修飾されてもよく、１つ、２つ、３つまたはそれ以上の結合した化学的部分を含み得る。
ポリマーは、任意の分子量を有していてもよく、分岐していてもよく、または分岐していなくてもよい。ポリエチレングリコールの場合、取り扱いおよび製造の容易さのために、好ましい分子量は約１ｋＤａ～約１００ｋＤａである（「約」という用語は、ポリエチレングリコールの調製において、いくつかの分子が、記載された分子量よりも大きいか、ある場合は小さいことを示す）。所望の治療プロファイル（例えば、所望の持続放出の持続時間、生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度または不足およびポリエチレングリコールの他の既知の効果）に依存して、他の大きさを使用してもよい。例えば、ポリエチレングリコールは、平均分子量が約２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５６０、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００または１００，０００ｋＤａであってもよい。
上述のように、ポリエチレングリコールは、分岐構造を有していてもよい。分枝ポリエチレングリコールは、例えば、米国特許第５，６４３，５７５号；Ｍｏｒｐｕｒｇｏら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５６：５９－７２（１９９６）；Ｖｏｒｏｂｊｅｖら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ １８：２７４５－２７５０（１９９９）；およびＣａｌｉｃｅｔｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：６３８－６４６（１９９９）に記載され、それぞれの開示は、本明細書に参考として組み込まれる。
ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、抗体の機能性ドメインまたは抗原性ドメインへの影響を考慮して抗体に結合されるべきである。当業者には利用可能な多くの付着方法が存在する。例えば、本明細書に参考として組み込まれるＥＰ ０ ４０１ ３８４号（ＰＥＧをＧ－ＣＳＦにカップリングすること）。Ｍａｌｉｋら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８－１０３５（１９９２）も参照（トレシルクロリドを用いたＧＭ－ＣＳＦのペグ化を報告している）。例えば、ポリエチレングリコールは、遊離アミノまたはカルボキシル基のような反応性基を介してアミノ酸残基を介して共有結合されていてもよい。反応性基は、活性化されたポリエチレングリコール分子が結合し得る基である。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基は、例えば、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基を含み得る。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基は、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基およびＣ末端アミノ酸残基を含んでいてもよい。スルフヒドリル基はまた、ポリエチレングリコール分子を結合させるための反応性基として使用され得る。治療目的のためには、Ｎ末端またはリジン基での結合などのアミノ基での結合が好ましい。
上に示唆したように、ポリエチレングリコールは、いくつかのアミノ酸残基のいずれかへの結合を介して、タンパク質、例えば抗体に結合することができる。例えば、ポリエチレングリコールは、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはシステイン残基への共有結合を介してタンパク質に連結され得る。１つ以上の反応化学を使用し、ポリエチレングリコールを、タンパク質の特定のアミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン）またはタンパク質の１種類より多いアミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、およびこれらの組合せ）と接続してもよい。
核酸
一実施形態では、本発明は、本発明の抗体をコードする核酸配列（抗体フラグメントまたはそのバリアントを含むか、またはそれらからなる分子を含む）を含むか、またはそれからなるポリ核酸を提供する。本発明は、高ストリンジェンシー下でハイブリダイズするか、またはその代わりに、中程度または低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件（例えば、上に定義した通り）で、本発明の抗体、またはそのフラグメントまたはバリアントをコードするポリ核酸配列を有する核酸に相補的なポリ核酸にハイブリダイズするポリ核酸も包含する。
別の実施形態では、当該分野で公知の任意の方法によって、ポリ核酸が得られ、ポリ核酸の核酸配列が決定される。あるいは、抗体をコードするポリ核酸（抗体フラグメントまたはそのバリアントを含むか、またはそれらからなる分子を含む）は、適切な供給源由来の核酸から生成される。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンが利用可能ではないが、抗体分子の配列が既知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、特定の種の天然のまたは最適化されたコドンにおいて化学的に合成され得るか、本発明の抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞などの、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞から単離された核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリー）配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いたＰＣＲ増幅、または特定の遺伝子配列に特異的なオリゴ核酸プローブ（例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローン）を用いたクローニングによって行うことができる。次いで、ＰＣＲによって生成された増幅された核酸を、当技術分野で周知の任意の方法を用いて複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。
いくつかの実施形態では、「核酸」という用語は、ポリ核酸、またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）などのオリゴ核酸、ならびに必要に応じてリボ核酸（ＲＮＡ）またはその模倣物を指す。この用語はまた、等価物として、核酸類似体から作製されたＲＮＡまたはＤＮＡの類似体を含み、記載される実施形態に適用可能であるように、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリ核酸を含むと理解されるべきである。この用語は、天然に存在する核酸塩基、糖および共有ヌクレオシド間（骨格）結合からなるオリゴ核酸、ならびに同様に機能する非天然部分を有するオリゴ核酸を含む。このような修飾または置換されたオリゴ核酸は、例えば、細胞取り込みの増強、核酸標的に対する増強された親和性およびヌクレアーゼの存在下での安定性の増加などの望ましい特性のために、しばしば天然型よりも好ましい。
当業者には理解されるように、タンパク質またはペプチドをコードする核酸配列または遺伝子のフラグメントまたは誘導体は、野生型遺伝子または配列全体と同じ様式で依然として機能し得る。同様に、核酸配列の形態は、これらの変化にもかかわらず、同じ生物学的効果を示す野生型機能を保持する、タンパク質またはペプチドまたはそのフラグメントをコードする野生型配列と比較して変動を有することができる。これらはそれぞれ、本発明の別個の実施形態を表す。
本発明の核酸は、当該分野で周知のような任意の合成または組換えプロセスによって産生され得る。本発明による核酸は、当該分野で公知の技術によって生物物理学的または生物学的特性を変化させるためにさらに修飾され得る。例えば、核酸は、ヌクレアーゼに対するその安定性を増加させるために（例えば、「エンドキャッピング」）、またはコドン最適化によって発現レベルを増加させるため、またはその親油性、溶解性、または相補的配列に対する結合親和性を改変するために改変することができる。
特定の目的を達成するために核酸を改変する方法は、例えば、当該技術分野では、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に開示されている。さらに、本発明の核酸配列は、目的のタンパク質をコードしない核酸配列の１つ以上の部分を含んでいてもよい。本発明はさらに、本明細書に記載の配列によってコードされるものと同様のタンパク質をコードするが、遺伝コードまたは対立遺伝子変異の縮重のためにそれらのコドン配列が異なり（アミノ酸変化を生じる場合も生じない場合もある本明細書中に記載される天然の塩基変化）、同様に本発明のタンパク質をコードしうるＤＮＡ配列をさらに提供する。点変異またはそれによってコードされるポリペプチドの活性、半減期または産生を増強するための誘導された修飾（挿入、欠失および置換を含む）によって引き起こされるＤＮＡ配列の変化も本発明に包含される。
本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴ核酸プローブを使用することによって）容易に単離され、配列決定される。一旦単離されると、ＤＮＡは発現ベクターに入れられ、免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、酵母細胞または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクションされる組換え宿主細胞における抗体の合成を得ることができる。抗体の組換え産生を以下にさらに詳細に記載する。
一実施形態では、組成物は、配列番号３のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ ｇｙ１をコードする核酸分子を含む。一実施形態では、組成物は、配列番号２を含む核酸分子を含む。
一実施形態では、核酸分子は、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖をコードする核酸配列を含む。例えば、一実施形態では、軽鎖をコードする核酸配列は、配列番号４のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ１をコードする核酸配列を含む。例えば、一実施形態では、ＶＬ ＦＲ１をコードする核酸配列は、配列番号６のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１をコードする核酸配列を含む。例えば、一実施形態では、ＶＬ ＣＤＲ１をコードする核酸配列は、配列番号８のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ２をコードする核酸配列を含む。例えば、一実施形態では、ＶＬ ＦＲ２をコードする核酸配列は、配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２をコードする核酸配列を含む。例えば、一実施形態では、ＶＬ ＣＤＲ２をコードする核酸配列は、配列番号１２のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ３をコードする核酸配列を含む。例えば、一実施形態では、ＶＬ ＦＲ３をコードする核酸配列は、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３をコードする核酸配列を含む。例えば、一実施形態では、ＶＬ ＣＤＲ３をコードする核酸配列は、配列番号１６のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ４をコードする核酸配列を含む。例えば、一実施形態では、ＶＬ ＦＲ４をコードする核酸配列は、配列番号１８のヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、核酸分子は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖をコードする核酸配列を含む。例えば、一実施形態では、重鎖をコードする核酸配列は、配列番号２０のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ１をコードする核酸配列を含む。例えば、一実施形態では、ＶＨ ＦＲ１をコードする核酸配列は、配列番号２２のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１をコードする核酸配列を含む。例えば、一実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１をコードする核酸配列は、配列番号２４のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ２をコードする核酸配列を含む。例えば、一実施形態では、ＶＨ ＦＲ２をコードする核酸配列は、配列番号２６のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２をコードする核酸配列を含む。例えば、一実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ２をコードする核酸配列は、配列番号２８のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ３をコードする核酸配列を含む。例えば、一実施形態では、ＶＨ ＦＲ３をコードする核酸配列は、配列番号３０のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３をコードする核酸配列を含む。例えば、一実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ３をコードする核酸配列は、配列番号３２のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ４をコードする核酸配列を含む。例えば、一実施形態では、ＶＨ ＦＲ４をコードする核酸配列は、配列番号３４のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号３７のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖリンカーをコードする核酸配列を含む。例えば、一実施形態では、ｓｃＦｖリンカーをコードする核酸配列は、配列番号３６のヌクレオチド配列を含む。
例えば、一実施形態では、核酸分子は、ｇｙ１をコードする。一実施形態では、核酸分子は、配列番号３のアミノ酸配列を含むｇｙ１をコードする。例えば、一実施形態では、ｇｙ１をコードする核酸配列は、配列番号２のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ｇｙ１をコードする核酸は、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列と、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列とを含む。例えば、一実施形態では、軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４のヌクレオチド配列を含み、重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２０のヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、ｇｙ１をコードする核酸分子は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ１をコードするヌクレオチド配列；配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列；配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ２をコードするヌクレオチド配列；配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ３をコードするヌクレオチド配列；配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列；配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ４をコードするヌクレオチド配列；配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ１をコードするヌクレオチド配列；配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列；配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ２をコードするヌクレオチド配列；配列番号２９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列；配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ３をコードするヌクレオチド配列；配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列；配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ４をコードするヌクレオチド配列；および配列番号３７のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖリンカーをコードするヌクレオチド配列を含む。
例えば、一実施形態では、ＶＬ ＦＲ１をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６のヌクレオチド配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は、配列番号８のヌクレオチド配列を含み；ＶＬ ＦＲ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０のヌクレオチド配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２のヌクレオチド配列を含み；ＶＬ ＦＲ３をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１４のヌクレオチド配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１６のヌクレオチド配列を含み；ＶＬ ＦＲ４をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１８のヌクレオチド配列を含み；ＶＨ ＦＲ１をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２２のヌクレオチド配列を含み；ＶＨ ＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２４のヌクレオチド配列を含み；ＶＨ ＦＲ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２６のヌクレオチド配列を含み；ＶＨ ＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２８のヌクレオチド配列を含み；ＶＨ ＦＲ３をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３０のヌクレオチド配列を含み；ＶＨ ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３２のヌクレオチド配列を含み；ＶＨ ＦＲ４をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３４のヌクレオチド配列を含み；ｓｃＦｖリンカーをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３６のヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、核酸分子は、１つ以上の突然変異を含む抗体または抗体フラグメントをコードする。例えば、一実施形態では、核酸分子は、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ２をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、配列番号３９は、配列番号１１に関してＶ→Ａ点変異を含む。例えば、一実施形態では、変異体ＶＬ ＦＲ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３８のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、配列番号４１は、配列番号１３に関してＧ→Ｅ点変異を含む。例えば、一実施形態では、変異体ＶＬ ＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４０のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ４をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、配列番号４３は、配列番号１９に関してＶ→Ａ点変異を含む。例えば、一実施形態では、変異体ＶＬ ＦＲ４をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４２のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、配列番号４５は、配列番号２５に関してＳ→Ｆ点変異を含む。例えば、一実施形態では、変異体ＶＨ ＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４４のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ３をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、配列番号４７は、配列番号３１に関してＩ→Ｖ点変異を含む。例えば、一実施形態では、変異体ＶＨ ＦＲ３をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４６のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、配列番号４９は、配列番号３３に関してＤ→Ｇ点変異を含む。例えば、一実施形態では、変異体ＶＨ ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４８のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ４をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、配列番号５１は、配列番号３５に関してＧ→Ｅ点変異を含む。例えば、一実施形態では、変異体ＶＨ ＦＲ４をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５０のヌクレオチド配列を含む。
例えば、一実施形態では、組成物は、本明細書中でｇｙ１－ｓｔと示されるｓｃＦｖを含む抗体フラグメントをコードする核酸分子を含む。一実施形態では、ｇｙ１－ｓｔをコードする核酸分子は、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ２をコードするヌクレオチド配列と、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列と、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ４をコードするヌクレオチド配列とを含む。一実施形態では、ｇｙ１－ｓｔをコードする核酸分子は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ１をコードするヌクレオチド配列；配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列；配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ２をコードするヌクレオチド配列；配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ３をコードするヌクレオチド配列；配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列；配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ４をコードするヌクレオチド配列；配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ１をコードするヌクレオチド配列；配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列；配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ２をコードするヌクレオチド配列；配列番号２９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列；配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ３をコードするヌクレオチド配列；配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列；配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ４をコードするヌクレオチド配列；および配列番号３７のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖリンカーをコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ＶＬ ＦＲ１をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６のヌクレオチド配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は、配列番号８のヌクレオチド配列を含み；ＶＬ ＦＲ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３８のヌクレオチド配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２のヌクレオチド配列を含み；ＶＬ ＦＲ３をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１４のヌクレオチド配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１６のヌクレオチド配列を含み；ＶＬ ＦＲ４をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１８のヌクレオチド配列を含み；ＶＨ ＦＲ１をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２２のヌクレオチド配列を含み；ＶＨ ＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４４のヌクレオチド配列を含み；ＶＨ ＦＲ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２６のヌクレオチド配列を含み；ＶＨ ＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２８のヌクレオチド配列を含み；ＶＨ ＦＲ３をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３０のヌクレオチド配列を含み；ＶＨ ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３２のヌクレオチド配列を含み；ＶＨ ＦＲ４をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５０のヌクレオチド配列を含み；ｓｃＦｖリンカーをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３６のヌクレオチド配列を含む。
例えば、一実施形態では、組成物は、本明細書中でｇｙ１－２と示されるｓｃＦｖを含む抗体フラグメントをコードする核酸分子を含む。例えば、一実施形態では、ｇｙ１－２をコードする核酸分子は、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列；配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ４をコードするヌクレオチド配列；配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列；および配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ３をコードするヌクレオチド配列；例えば、一実施形態では、ｇｙ１－２をコードする核酸分子は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ１をコードするヌクレオチド配列；配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列；配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ２をコードするヌクレオチド配列；配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ３をコードするヌクレオチド配列；配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列；配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ４をコードするヌクレオチド配列；配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ１をコードするヌクレオチド配列； 配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列；配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ２をコードするヌクレオチド配列；配列番号２９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列；配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ３をコードするヌクレオチド配列；配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列；配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ４をコードするヌクレオチド配列；および 配列番号３７のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖリンカーをコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ＶＬ ＦＲ１をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６のヌクレオチド配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は、配列番号８のヌクレオチド配列を含み；ＶＬ ＦＲ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０のヌクレオチド配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４０のヌクレオチド配列を含み；ＶＬ ＦＲ３をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１４のヌクレオチド配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１６のヌクレオチド配列を含み；ＶＬ ＦＲ４をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４２のヌクレオチド配列を含み；ＶＨ ＦＲ１をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２２のヌクレオチド配列を含み；ＶＨ ＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４４のヌクレオチド配列を含み；ＶＨ ＦＲ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２６のヌクレオチド配列を含み；ＶＨ ＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２８のヌクレオチド配列を含み；ＶＨ ＦＲ３をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４６のヌクレオチド配列を含み；ＶＨ ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３２のヌクレオチド配列を含み；ＶＨ ＦＲ４をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３４のヌクレオチド配列を含み；ｓｃＦｖリンカーをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３６のヌクレオチド配列を含む。
例えば、一実施形態では、組成物は、本明細書中でｇｙ１－３と示されるｓｃＦｖを含む抗体フラグメントをコードする核酸分子を含む。一実施形態では、ｇｙ１－３をコードする核酸分子は、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列と、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列とを含む。一実施形態では、ｇｙ１は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ１をコードするヌクレオチド配列；配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列；配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ２をコードするヌクレオチド配列；配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ３をコードするヌクレオチド配列；配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列；配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＦＲ４をコードするヌクレオチド配列；配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ１をコードするヌクレオチド配列；配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列；配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ２をコードするヌクレオチド配列；配列番号２９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列；配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ３をコードするヌクレオチド配列；配列番号４９のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列；配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨ ＦＲ４をコードするヌクレオチド配列；および配列番号３７のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖリンカーをコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ＶＬ ＦＲ１をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６のヌクレオチド配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は、配列番号８のヌクレオチド配列を含み；ＶＬ ＦＲ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０のヌクレオチド配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２のヌクレオチド配列を含み；ＶＬ ＦＲ３をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１４のヌクレオチド配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１６のヌクレオチド配列を含み；ＶＬ ＦＲ４をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１８のヌクレオチド配列を含み；ＶＨ ＦＲ１をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２２のヌクレオチド配列を含み；ＶＨ ＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４４のヌクレオチド配列を含み；ＶＨ ＦＲ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２６のヌクレオチド配列を含み；ＶＨ ＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２８のヌクレオチド配列を含み；ＶＨ ＦＲ３をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３０のヌクレオチド配列を含み；ＶＨ ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４８のヌクレオチド配列を含み；ＶＨ ＦＲ４をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３４のヌクレオチド配列を含み；ｓｃＦｖリンカーをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３６のヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、組成物は、ＰＳＭＡｂをコードする核酸分子を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号６８のアミノ酸配列を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、シグナルペプチドを有する重鎖をコードするヌクレオチド配列を含み、シグナルペプチドを有する重鎖は、配列番号５３のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号５７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号５９の重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、シグナルペプチドを有する軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含み、シグナルペプチドを有する軽鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号６７の軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、シグナルペプチドを有する重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５２のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、重鎖シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５４のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５６のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５８のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、シグナルペプチドを有する軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６０のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、軽鎖シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号６２のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６４のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６６のヌクレオチド配列を含む。
本発明は、本明細書に記載の１つ以上のヌクレオチド配列と相同性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子を包含する。例えば、特定の実施形態では、核酸分子は、本飯愛書に記載するヌクレオチド配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８２％以上、８５％以上、８７％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または９９．５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含む。
本発明はさらに、様々なタンパク質発現系を用いて抗ＰＳＭＡ抗体または抗体フラグメントの組換えタンパク質を発現または産生する方法を提供する。
一実施形態では、本発明はまた、抗体または抗原結合フラグメントをコードする核酸分子がｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで組換えＤＮＡ技術によって導入された形質転換細胞およびその子孫を提供する。真核生物または原核生物の形質転換細胞は、精製または腫瘍の診断または治療のような様々な目的のためのｉｎ ｓｉｔｕで、または分泌発現のために組換え抗体または抗体フラグメントを産生するために使用され得る。形質転換された細胞は増殖され、導入された核酸は転写されるか、またはコードされたタンパク質が発現される。子孫細胞は、複製中に生じる突然変異が存在する可能性があるため、親細胞と同一ではない可能性があることが理解される。形質転換された細胞には、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物（例えば、ヒトを含む哺乳類）細胞などの原核細胞および真核細胞が含まれるが、これらに限定されない。細胞は、培養物中、細胞内、組織内または器官内に存在するか、または被験体に存在し得る。
典型的には、細胞形質転換はベクターを用いる。「ベクター」という用語は、遺伝子操作のために、例えば、核酸の挿入または組み込みによって操作可能なプラスミド、ウイルス、例えば、ウイルスベクター、または当該技術分野で知られる他のベクター（すなわち、「クローニングベクター」）を指すか、または挿入されたポリ核酸を転写または翻訳するために使用可能な、プラスミド、ウイルス、例えば、ウイルスベクター、または当該技術分野で知られる他のベクター（すなわち、「発現ベクター」）を指す。このようなベクターは、発現制御エレメントと作動可能に連結された抗体をコードする核酸を含む核酸を導入し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、溶液または固相）、細胞またはｉｎ ｖｉｖｏで発現させるのに有用である。
一実施形態では、発現ベクターは、従来の技術によって宿主細胞に移され、その後、トランスフェクションされた細胞は、従来の技術によって培養されて、本発明の抗体または抗原結合フラグメントを産生する。したがって、本発明は、本発明の抗体（例えば、抗体全体、その重鎖または軽鎖、またはその一部、または一本鎖抗体、またはそのフラグメントもしくはバリアント）をコードするポリ核酸を含む宿主細胞を含み、異種プロモーターに作動可能に連結されている。他の実施形態では、抗体分子全体の発現のために、免疫グロブリン分子全体の発現のために、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターが宿主細胞において共発現される。
種々の宿主－発現ベクター系を利用して、本発明の抗体分子を発現させることができる。そのような宿主発現系は、目的のコード配列を産生し、続いて精製することができる媒体を表すが、適切な核酸コード配列で形質転換またはトランスフェクトされたときに本発明の抗体分子をｉｎ ｓｉｔｕで発現し得る細胞も表す。これらには、抗体フラグメントまたはそのバリアント（一本鎖抗体）を発現するように操作されたバクテリオファージ粒子、抗体コード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌、枯草菌）などの微生物；抗体コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母（例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ））；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染させたか、または抗体コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系；哺乳動物細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター）を含む組換え発現構築物を含む哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３，３Ｔ３、ＮＳ０細胞）；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＣＭＶプロモーターまたはＥＦ１プロモーター）が挙げられる。好ましくは、組換え抗体分子の発現のために、大腸菌などの細菌細胞、より好ましくは真核細胞が、特に組換え抗体分子全体の発現のために使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要な中間初期遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターと共に、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞は、抗体の有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２（１１９９０）；Ｂ ｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １０：１６９（１９９２）；ＫｅｅｎおよびＨａｌｅ，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：２０７（１９９６））。これらの参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
細胞または宿主発現ベクターを形質転換するために使用されるベクターは、一般に、細胞内での増殖のために少なくとも複製起点を含む。転写および翻訳を容易にするために、ベクター内に存在する本明細書に記載の発現制御エレメントを含む制御エレメントが含まれる。「発現制御エレメント」という用語は、少なくともその存在が発現に影響を及ぼすことができる１つ以上の成分を含むことが意図され、プロモーターまたはエンハンサー以外の成分、またはプロモーターまたはエンハンサーに追加する成分、例えばリーダー配列および融合パートナー配列を含むことができ、多重遺伝子の作製のための配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素、または多シストロン性、メッセージ、イントロンのためのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡのインフレーム翻訳を可能にする遺伝子の正確なリーディングフレームの維持、目的の遺伝子の転写物の適切なポリアデニル化を提供するためのポリアデニル化シグナル、終止コドンなどが含まれる。
ベクターは、選択マーカーを含んでいてもよい。当技術分野で知られているように、「選択マーカー」は、遺伝子を含む細胞の選択を可能にする遺伝子を意味する。「陽性選択」とは、選択マーカーを含む細胞のみが陽性選択に曝されると生存するプロセスをいう。薬物耐性は、陽性選択マーカーの一例である。マーカーを含む細胞は、選択薬剤を含有する培地中で生存し、マーカーを含まない細胞は死滅する。そのようなマーカーには、Ｇ４１８に対する抵抗性を付与するｎｅｏ、ハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒ、またはプロマイシンに対する耐性を付与するｐｕｒｏなどの薬剤耐性遺伝子が含まれる。他の陽性選択マーカー遺伝子には、マーカーを含む細胞の同定またはスクリーニングを可能にする遺伝子が含まれる。これらの遺伝子には、蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｌａｃＺ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、およびＣＤ８などの表面マーカーが含まれる。
ベクターには陰性選択マーカーを含めることができる。「陰性選択」とは、陰性選択マーカーを含む細胞を、適切な陰性選択剤に曝露すると死滅させるプロセスをいう。例えば、単純ヘルペスウイルス－チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））を含む細胞は、薬物ガンシクロビル（ＧＡＮＣ）に感受性である。同様に、ｇｐｔ遺伝子は、細胞を６－チオキサンチンに感受性にする。
哺乳動物発現系はさらに、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏ発現のために特異的に設計されたベクターを含む。このような系としては、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる（米国特許第５，６０４，０９０号）。ＡＡＶベクターは、ヒトおよびマウスにおいて、治療上の利益のために十分なレベルで第ＩＸ因子の発現を提供することが以前に示されている（Ｋａｙら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２４：２５７（２０００）；Ｎａｋａｉら、Ｂｌｏｏｄ ９１：４６００（１９９８））。アデノウイルスベクター（米国特許第５，７００，４７０号、第５，７３１，１７２号および第５，９２８，９４４号）、ヘルペス単純ウイルスベクター（米国特許第５，５０１，９７９号）およびレトロウイルス（例えば、レンチウイルスベクターは、分割する細胞および分割しない細胞、泡末ウイルスを感染させるのに有用である）ベクター（米国特許第５，６２４，８２０号、同第５，６９３，５０８号、同第５，６６５，５７７号、同第６，０１３，５１６号および同第５，６７４，７０３号およびＷＩＰＯ公開ＷＯ９２／０５２６６号およびＷＯ９２／１４８２９号）およびパピローマウイルスベクター（例えば、ヒトおよびウシパピローマウイルス）は、全て遺伝子治療に使用されてきた（米国特許第５，７１９，０５４号）。ベクターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）系ベクターも含まれる（米国特許第５，５６１，０６３号）。腸管の細胞に遺伝子を効率的に送達するベクターが開発されており、また使用されてもよい（例えば、米国特許第５，８２１，２３５号、同第５，７８６，３４０号および同第６，１１０，４５６号）。酵母では、相同組換えを介して染色体への外来核酸配列の組み込みを容易にするベクターが当該分野で公知であり、使用することができる。挿入された核酸がより通常のベクター（例えば、約１２ｋｂより大きい）には大きすぎる場合、酵母人工染色体（ＹＡＣ）が典型的に使用される。
一実施形態では、本発明における使用のためのファージミドベクターには、本発明の抗体／抗体鋳型／ＦＲライブラリーの製造に適した当技術分野で利用可能な任意のものが含まれ、ファージミドベクターｐＣＢ０４、ｐＩＴ１、ｐＩＴ２、ＣＡＮＴＡＢ ６、ｐＣｏｍｂ ３ ＨＳが挙げられる。フィラメント状ベクターおよびファージミド構築の方法は、例えば、それぞれ本明細書に参考として組み込まれる米国特許第６，０５４，３１２号、米国特許第６，８０３，２３０号を参照されたい。細胞質バクテリオファージまたは溶解ファージとして知られている非糸状バクテリオファージベクターを含むバクテリオファージディスプレイシステムもまた、例えば、米国特許第５，７６６，９０５号に記載されている。
本発明で使用するのに適した細菌発現構築物には、ｐＣＡＬ、ｐＵＣ、ｐＥＴ、ｐＥＴＢｌｕｅ（登録商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＢＡＤ、ｐＬＥＸ、ｐＴｒｃＨｉｓ２、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ３８０、ｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＫＫ２２３－２ ）、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＭＣ１８７１、ｐＥＺＺ１８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＡＬＴＥＲ－Ｅｘ１、ｐＡＬＴＥＲ－Ｅｘ２、ｐＧＥＭＥＸ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＦｉｖＥ（ＭＢＩ）、ｐＱＥ（Ｑｉａｇｅｎ）構築物、およびそれらの誘導体、ならびに当該分野で公知の他のものが挙げられる。本発明のいくつかの実施形態では、構築物はまた、ウイルス、プラスミド、バクミド、ファージミド、コスミド、またはバクテリオファージを含み得る。
核酸を含む様々な組成物を細胞に導入するためのリポソームの使用は、当業者に知られている。（例えば、米国特許第４，８４４，９０４号、同第５，０００，９５９号、同第４，８６３，７４０号および同第４，９７５，２８２号を参照）。国際公開第９４／２００７８号パンフレットおよび米国特許第６，０９６，２９１号明細書に記載されている天然ポリマー、または天然ポリマーの誘導体もしくは加水分解物を含む担体は、ポリペプチドおよびポリ核酸などの分子の粘膜送達に適しており、ピペラジンをベースとする両親媒性カチオン性脂質も知られている（例えば、米国特許第５，８６１，３９７号を参照）。カチオン性脂質系も知られている。（例えば、米国特許第５，４５９，１２７号を参照。）したがって、細胞または組織へのｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏでの送達のウイルスおよび非ウイルスベクター手段が含まれる。
一実施形態では、核酸配列は、発現制御配列の機能を確実にするために「作動可能に連結される」、すなわち配置され得る。これらの発現構築物は、典型的には、エピソームとして、または細胞の染色体ＤＮＡの不可欠な部分として細胞内で複製可能であり、発現に使用されるそれぞれの原核生物株についての適切な複製起点を含み得る。一般に、発現構築物は、所望の核酸配列で形質転換された細菌細胞の検出および／または選択を容易にする、例えばテトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性またはクロラフェニコール耐性などの選択マーカーを含む（例えば、米国特許第４，７０４，３６２号を参照）。しかしながら、これらのマーカーは、排他的ではなく、当業者に知られているように、多数の他のマーカーを使用することができる。本発明の別の実施形態では、発現構築物は、陽性選択マーカーおよび陰性選択マーカーの両方を含む。
同様に、転写産物の同定を容易にするために、発現構築物内にレポーター遺伝子を組み込むことができる。したがって、本発明の一実施形態では、利用されるレポーター遺伝子は、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼおよび蛍光タンパク質からなる群から選択される。
原核生物プロモーター配列は、コードされたポリ核酸配列の発現を調節し、本発明のいくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドをコードするポリ核酸に作動可能に連結される。本発明のさらなる実施形態では、これらのプロモーターは構成性または誘導性のいずれかであり、本発明のポリペプチドの高レベルおよび低レベルの発現の手段を与え、いくつかの実施形態では、本発明の複数のポリペプチドの制御された発現のために、いくつかの実施形態では、融合タンパク質として発現される。
Ｔ７プロモーター系、ラクトースプロモーター系、チロプシン（Ｔｒｐ）プロモーター系、Ｔｒｃ／Ｔａｃプロモーター系、β－ラクタマーゼプロモーター系、ｔｅｔＡプロモーター系、アラビノース制御プロモーター系、ファージＴ５プロモーター、またはファージラムダ由来のプロモーター系を使用することができ、本発明の実施形態を含む。プロモーターは、典型的には発現を任意にオペレーター配列で制御し、例えば転写および翻訳を開始および完了させるためのリボソーム結合部位配列を含み得る。さらなる実施形態によれば、ベクターはまた、発現制御配列、プロモーターの転写活性を調節し得るエンハンサー、プロモーターに隣接するインサートのクローニングを容易にするための適切な制限部位、およびＲＮＡスプライス部位のような他の必要なプロセシング部位、ポリアデニル化部位および転写終結配列、ならびに挿入された核酸の発現を促進し得る任意の他の配列を含む。
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のポリ核酸、ベクター、抗体および／またはそのフラグメントの使用方法、および／またはそれを含む組成物の治療、阻害または予防を含む。
ＰＳＭＡの検出
本明細書で提供される抗体、抗原結合フラグメント、または組成物は、診断または治療の手順で使用され得ることが当業者に理解される。
一実施形態では、被験体における腫瘍の存在または癌の増殖を診断する方法が本明細書で提供される。別の実施形態では、本方法は、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントを含む組成物で被験体から単離された組織試料をサンプリングすることを含み、それにより、前記抗体または抗原結合フラグメントの組織試料への特異的結合が、被験体における腫瘍または癌の成長を含む。別の実施形態では、この方法は、抗体または抗原結合フラグメントに特異的に結合するが、抗体または抗原結合フラグメントのその標的への結合に拮抗しない二次試薬を検出することをさらに含む。別の実施形態では、「二次試薬」は、光活性化可能な試薬、フルオロフォア、放射性同位元素、生物発光タンパク質、生物発光ペプチド、蛍光タグ、蛍光タンパク質、または蛍光ペプチドである。
一実施形態では、用語「癌」および「癌性」は、一実施形態では、典型的には調節されていない細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理的状態を指すか、または記載する。癌の例としては、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫（リポ肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍、中皮腫、シュワン細胞腫、髄膜腫、腺癌、メラノーマ、および白血病またはリンパ性悪性腫瘍が挙げられる。
一実施形態では、「癌」という用語は、卵巣癌、乳癌、グリア芽細胞腫、胃腸癌を含むが、これらに限定されない。別の実施形態では、癌は、前立腺癌である。
別の実施形態では、「サンプリング」は、抗体または抗原結合フラグメントと複合体化またはコンジュゲートし、抗体が標的に特異的に結合するとき検出可能な「シグナル」を放出する、二次試薬の検出を可能にする検出アッセイを用いて試料を試験または分析する工程を指す。別の実施形態では、検出は、免疫学的アッセイ（例えば、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡなど）または顕微鏡画像化などの当技術分野で通常使用されるアッセイを使用して行われるが、これらに限定されない。
一実施形態では、「標識された」という用語は、スクリーン中での検出を可能にするために付着された１つ以上の元素、同位体、または化学化合物を有する本発明の抗体を指す。一般に、標識は、以下の３つのクラスに分けられる。（ａ）免疫標識、抗体によって認識される融合パートナーとして組み込まれるエピトープであってもよい。（ｂ）同位体標識、放射性同位体または重同位体であってもよい。（ｃ）低分子標識、蛍光染料および比色染料、または他の標識方法が可能なビオチンなどの分子を含んでいてもよい。一実施形態では、本発明の抗体は、ビオチンで標識される。他の関連する実施形態では、本発明のビオチン化抗体は、例えば造影剤として、または１つ以上のリガンド分子を同定する手段として使用することができる。別の実施形態では、標識は、一旦抗体または抗原結合フラグメントに結合すると、検出または可視化され得るナノ粒子であり得る。標識は、任意の位置で化合物に取り込まれてもよく、タンパク質発現中にｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで取り込まれてもよい。
一実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントおよび二次試薬によって形成されるコンジュゲートは、種々の用途、例えば、限定されないが、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学、膜アッセイ、および本明細書で記載されるか、または当該技術分野で一般的に適用される診断方法および治療方法で使用される。
異常なＰＳＭＡ発現を伴う腫瘍の画像化
一実施形態では、本発明の組成物は、標的抗原、タンパク質または他の分子の不適切な発現を伴う疾患を有する被験体に投与される。例えば、一実施形態では、ＰＳＭＡに結合する抗体または抗体フラグメントを含む組成物を投与して、被験体におけるＰＳＭＡの存在、存在量、位置またはそれらの組合せを検出する。本発明の範囲内では、これは、例えば、存在するタンパク質の量の変化、タンパク質の局在化、翻訳後修飾、コンフォメーション状態、変異体または病原体タンパク質の存在などに起因して、異常なタンパク質によって特徴付けられる疾患および障害同様に、疾患または障害は、多糖類およびガングリオシドを含むがこれらに限定されない変化分子によって特徴付けられ得る。過剰レベルは、分子レベルでの過剰発現、作用部位での長期または蓄積された出現、または正常と比較したタンパク質の活性の増加を含むが、これに限定されない原因に起因し得る。この定義には、タンパク質の減少を特徴とする疾患および障害が含まれる。この減少は、分子レベルでの発現の減少、作用部位での発現の短縮または減少、タンパク質の突然変異形態、または正常と比較したタンパク質の活性の低下を含むが、これに限定されない任意の原因に起因し得る。このようなタンパク質の過剰量または減少は、タンパク質の正常な発現、出現または活性と比較して測定することができ、前記測定は、本発明の抗体の開発および／または臨床試験において重要な役割を果たす可能性がある。
一実施形態では、本発明の抗体または抗体フラグメントは、被験体に投与された場合、前立腺癌細胞などの腫瘍細胞上に発現された抗原と結合する。別の実施形態では、被験体に投与される本発明の抗体または抗体フラグメントは、固形腫瘍（例えば、ＰＳＭＡ陽性の新生血管を有する腫瘍）の新生血管で発現する抗原に結合し、限定されないが、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、結腸癌、胃癌、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌、膀胱癌、メラノーマ、神経膠腫などを含む。
一実施形態では、ＰＳＭＡ含有腫瘍を撮像する方法が本明細書で提供される。別の実施形態では、本方法は、二次試薬に作動可能に連結された本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントを適用する工程を含む。別の実施形態では、前立腺または他のタイプの固形腫瘍は、抗体または抗原結合フラグメントがその標的に結合した後に可視化され得る。さらに別の実施形態では、二次試薬は、光活性化可能な試薬、フルオロフォア、放射性同位元素、生物発光タンパク質、生物発光ペプチド、蛍光タグ、蛍光タンパク質、または蛍光ペプチドである。二次試薬の非限定的な例を以下に示す。
一実施形態では、検出可能な標識またはこれに付着した二次試薬としては、限定されないが、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、シアニン色素など）、アフィニティー標識（例えば、ビオチン、アビジン、プロテインＡなど）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）、または同位体標識（例えば、１２４Ｉ）または抗体の検出および単離を可能にする任意の他のそのような検出可能な部分が挙げられる。
変化した可変領域の集団内の結合種の同定のための検出方法は、直接的または間接的であり得、例えば、発光、放射性同位元素、比色色素および蛍光色素の測定を含み得る。直接検出には、結合した抗原またはリガンドの量を評価するための中間体または二次測定手順なしで操作する方法が含まれる。そのような方法は、一般に、例えば、放射性、発光性または蛍光性部分によって標識されたリガンドを使用する。これとは対照的に、間接的な検出には、中間または二次測定手順によって操作する方法が含まれる。これらの方法は、一般に、抗原またはリガンドと特異的に反応する分子を使用し、それ自体、直接的に標識され得るか、または二次試薬によって検出され得る。例えば、リガンドに特異的な抗体は、リガンドに特異的な第１抗体と相互作用することができる二次抗体を用いて、直接検出するための上記の検出方法を用いて再び検出することができる。間接的方法は、酵素標識による検出をさらに用いることができる。さらに、触媒抗体のスクリーニングの特定の例については、基質の消失または生成物の出現を、結合親和性または触媒活性の間接的測定として用いることができる。
特定の実施形態では、本発明の抗体は、近赤外染料で標識される。例えば、本発明の抗体は、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷまたはインドシアニングリーン（ＩＣＧ）で標識することができる。
特定の実施形態では、本発明の抗体は、放射性金属イオン（１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、１６６Ｈｏ、１５３Ｓｍ、２１５Ｂｉおよび２２５Ａｃを含むがこれらに限定されない）をポリペプチドに結合させるのに有用な大環状キレート剤に結合する。好ましい実施形態では、本発明の抗体に結合した大環状キレート化剤に関連する放射性金属イオンは１１１Ｉｎである。別の好ましい実施形態では、本発明の抗体ポリペプチドに結合した大環状キレート化剤に関連する放射性金属イオンは９０Ｙである。特定の実施形態では、大環状キレート化剤は、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’－四酢酸（ＤＯＴＡ）である。特定の実施形態では、大環状キレート化剤は、ｑｕａｄｒａｔｕｒｅ－（５－イソチオシアナト－２－メトキシフェニル）－１，４，７，１０－テトラアザ－シクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸である。他の特定の実施形態では、ＤＯＴＡは、リンカー分子を介して本発明の抗体に結合される。ＤＯＴＡのような大環状キレート化剤をポリペプチドに結合させるために有用なリンカー分子の例は、当該分野で一般的に知られている。例えば、その全体が本明細書に参考として組み込まれる、ＤｅＮａｒｄｏら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４（１０）：２４８３－９０，１９９８；Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０（４）：５５３－７，１９９９；およびＺｉｍｍｅｒｍａｎら、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２６（８）：９４３－５０，１９９９を参照。加えて、米国特許第５，６５２，３６１号および第５，７５６，０６５号は、抗体とコンジュゲートし得るキレート化剤、およびそれらを作製および使用する方法を開示しており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
治療の方法
本発明はまた、前記抗体または抗原結合フラグメントで前記腫瘍細胞を標的化する工程を含む被験体におけるＰＳＭＡ発現癌を治療する方法を提供する。
特定の実施形態では、この方法は、抗体または抗体フラグメントを含む組成物を被験体に投与することを含む。一実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、毒素、放射性同位体、ナノ粒子または生物活性ペプチドである、生物学的に活性な薬剤またはそのような薬剤の組合せに作動可能に連結される。
一実施形態では、本発明は、ＰＳＭＡ高発現細胞を、抗体または抗原結合フラグメントで標的化する工程を含む被験体において、異常なＰＳＭＡ発現を伴う固形腫瘍、例えば、新生血管に高いＰＳＭＡ発現を伴う前立腺癌または固形腫瘍を治療する方法を提供する。特定の実施形態では、この方法は、高ＰＳＭＡ発現に関連する腫瘍を有する被験体に、抗体または抗体フラグメントを含む組成物を投与することを含む。一実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、毒素、放射性同位体、ナノ粒子または生物活性ペプチドである、生物学的に活性な薬剤またはそのような薬剤の組合せに作動可能に連結される。これらの腫瘍には、限定されないが、前立腺癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、結腸癌、胃癌、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌、膀胱癌、メラノーマ、神経膠腫などが含まれる。
一実施形態では、被験体の腫瘍を阻害または抑制する方法が本明細書で提供される。別の実施形態では、本方法は、有効量の本発明の抗体または抗原結合フラグメントを投与する工程を含む。
別の実施形態では、被験体における固形腫瘍の進行を遅らせる方法が本明細書において提供される。さらに別の実施形態では、本方法は、有効量の本発明で提供される抗体または抗原結合フラグメントを被験体に投与することを含む。別の実施形態では、被験体は、固形腫瘍の脈管構造に対する免疫応答をもたらし、それにより、被験体における固形腫瘍の進行を遅延させる。
一実施形態では、「作動可能に連結された」という用語は、分子および配列の適切な機能または発現を確実にするように、２つ以上の分子または配列の配置／連結を指す。
一実施形態では、用語「治療的有効量」は、所与の状態および投与レジメンに対して治療効果を提供する量を指す。本発明において、治療効果は、腫瘍増殖、浸潤、拡がり、転移または再発の予防または抑制、好ましくは腫瘍負荷の軽減または患者転帰の改善である。
一実施形態では、「予防するまたは治療する」という用語は、症状の発症の遅延、症状の重症度の軽減、急性発作の重症度の軽減、症状の数の減少、症状の潜伏期間の短縮、症状の改善、二次症状の軽減、二次感染の減少、患者の生存の延長、疾患への再発の予防、再発エピソードの数または頻度の減少、症候性エピソード間の待ち時間の増加、寛解を誘発し、寛解を促し、回復を加速し、または代替治療への有効性を増強するか、または抵抗性を減少させるために使用される。一実施形態では、「治療する」とは、治療処置および予備的または予防的手段の両方を指し、目的は、上記の標的病理学的状態または障害を予防または軽減することである。
別の実施形態では、「症状」は、上記の疾患または病的状態の症状である。
別の実施形態では、本明細書で提供される方法は、タンパク質分解阻害剤、医薬担体、希釈剤、およびアジュバントをさらに含む。
一実施形態では、本発明の組成物は、本発明のポリペプチド、抗体または抗原結合フラグメントを、単独でまたはいくつかの実施形態では、第２の薬学的に活性な薬剤と組み合わせて含む。一実施形態では、「薬学的に活性な薬剤」という用語は、示された目的を満たす任意の薬剤を指す。いくつかの実施形態では、本発明の薬学的に活性な薬剤には、化学療法薬、放射線療法薬、血管新生阻害薬、腫瘍イメージングプローブ、免疫モジュレーターまたは任意の他の腫瘍療法および／またはイメージング薬剤／薬剤などが含まれる。
別の実施形態では、被験体の腫瘍の治療のための本発明の生物学的に活性な薬剤および抗体または抗原結合性フラグメントを送達する方法が本明細書に提供される。別の実施形態では、本方法は、生物学的に活性な薬剤と抗体または抗原結合フラグメントとを同時に投与する工程を含む。別の実施形態では、この方法は、生物学的に活性な薬剤と抗体または抗原結合フラグメントを別々に投与する工程を含む。
一実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメント自体は、「生物学的に活性」であり、修飾後、特に標的抗原への結合において、対応する親抗体の生物学的作用または増強作用を発揮することができる調節、特に抗原媒介シグナル伝達の阻害、および抗原媒介疾患の予防または治療の観点から、リガンドの受容体への結合を阻害することができる。用語「生物学的に活性な」は、当業者であれば理解されるように、本明細書中に記載される生物学的に活性な薬剤のいずれかに関して使用される場合、予防的、診断的または治療的効果をもたらすことができる様式で免疫応答を調節する薬剤の能力を指す。いくつかの実施形態では、当業者なら理解されるだろうが、この生体活性を達成するために使用される薬剤としては、限定されないが、サイトカイン、酵素、ケモカイン、放射性同位体、酵素的に活性な毒素、治療ナノ粒子または化学療法剤が挙げられる。
代替の実施形態では、抗体のポリペプチドは、抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）を使用するために、それらの意図された目的で酵素に機能するように接合されるか、または機能的に連結される。ＡＤＥＰＴは、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤）を活性抗癌剤に変換するプロドラッグ活性化酵素に抗体またはＦｃ融合体をコンジュゲートまたは作動可能に連結することによって使用され得る。ＡＤＥＰＴに有用なイムノコンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞傷害性形態に変換するようにプロドラッグに作用することができる任意の酵素が含まれる。本明細書で提供される改変された分子の他のさらなる改変も本明細書中に企図される。例えば、ポリペプチド／抗体は、種々の非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーの１つと結合していてもよい。
別の実施形態では、本明細書で提供される抗体／ポリペプチドは、１つ以上の免疫調節剤とともに投与される。そのような薬剤は、１種以上のサイトカインの産生を増加または減少させ、自己抗原提示をアップレギュレートまたはダウンレギュレートし、ＭＨＣ抗原をマスクし、または１種以上のタイプの免疫細胞の増殖、分化、移動または活性化状態を促進し得る。免疫調節剤としては、限定されないが、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えば、アスピリン、イブプロフェン、セレコキシブ、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、インドメタシン、ケトララク、オキサプロジン、ナブメントン、スリンダク、トルメチン、ロフェコキシブ、ナプロキセン、ケトプロフェンおよびナブメトン；ステロイド（例えば、グルココルチコイド、デキサメタゾン、コルチゾン、ヒドロキシコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニゾロン、トリムシノロン、アズルフィジンエイコサノイド、例えば、プロスタグランジン、トロンボキサンおよびロイコトリエン；および局所ステロイド、例えば、アントラリン、カルシポトリエン、クロベタゾールおよびタザロテン）；サイトカイン、例えば、ＴＧＦｂ、ＩＦＮａ、ＩＦＮｂ、ＩＦＮｇ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１０；サイトカイン、ケモカインまたは受容体アンタゴニスト、例えば抗体、可溶性受容体およびＢＡＴＦに対する受容体－Ｆｃ融合物、Ｂ７、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ２Ｏ、ＣＤ２３、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５２、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１４７、ＣＤ１５２、補因子（Ｃ５、Ｄ）ＣＴＬＡ４、エオタキシン、Ｆａｓ、ＩＣＡＭ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮＡＲ、ＩｇＥ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－４、ＩＬ－５Ｒ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１３Ｒ１、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８Ｒ、ＩＬ－２３、インテグリン、ＬＦＡ－１、ＬＦＡ－３、ＭＨＣ、セレクチン、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＴＮＦ－Ｒ１、Ｔ細胞受容体、例えば、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト）、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）（アダリムマブ）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）（インフリキシマブ）、ＰＤ１抗体（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）（ニボルマブ）、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）またはＰＤ－Ｌ１抗体（デュルバルマブ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ）；異種抗－リンパ球グロブリン；他の免疫調節分子、例えば、２－アミノ－６－アリール－５置換ピリミジン、ＭＨＣ結合ペプチドおよびＭＨＣフラグメントの抗イディオタイプ抗体、アザチオプリン、ブレキナール、ブロモクリプチン、シクロホスファミド、シクロスポリンＡ、Ｄ－ペニシラミン、デオキシスペルグアリン、ＦＫ５０６、グルタルアルデヒド、金、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、マロノニトリロアミド（例えば、レフルノミド）、メトトレキサート、ミノサイクリン、ミゾリビン、マイコフェノレートモフェチル、ラパマイシンおよびスルファササジンが挙げられる。
代替の実施形態では、本発明の抗体は、サイトカインとともに投与される。本明細書で使用する「サイトカイン」は、細胞間仲介物質として別の細胞に作用する１つの細胞集団によって放出されるタンパク質の総称を意味する。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインの中には、線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子－αおよびβ；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ－ベータなどの神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ－αおよびＴＧＦ－βなどのトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）インスリン様増殖因子－Ｉおよび－ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導性因子；インターフェロンアルファ、ベータ、およびガンマのようなインターフェロン；マクロファージ－ＣＳＦ（Ｍ－ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球－マクロファージ－ＣＳＦ（ＧＭ－ＣＳＦ）；顆粒球－ＣＳＦ（Ｇ－ＣＳＦ）インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－１ａｌｐｈａ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２；ＩＬ－１５、腫瘍壊死因子、例えば、ＴＮＦ－αまたはＴＮＦ－β；およびＬＩＦおよびキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が含まれる。本明細書中で使用される場合、サイトカインという用語には、天然供給源または組換え細胞培養由来のタンパク質、および天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。
化学療法剤または他の細胞毒性剤をプロドラッグとして投与することができる。「プロドラッグ」という用語は、親薬物と比較して腫瘍細胞に対して細胞傷害性が低く、酵素的に活性化され得るか、またはより活性な親形態に変換され得る、薬学的に活性な物質の前駆体または誘導体の形態を指す。例えば、Ｗｉｌｍａｎ，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，６１５ｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｂｅｌｆａｓｔ，１４：３７５－３８２；およびＳｔｅｌｌａら、「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｂｏｒｃｈａｒｄｔら（編集）：２４７－２６７，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９８５を参照。本明細書で提供される組成物および方法で使用することができるプロドラッグには、限定されないが、リン酸塩含有プロドラッグ、チオリン酸塩含有プロドラッグ、硫酸塩含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ－アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、βラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは場合により置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５－フルオロシトシンおよびより活性な細胞傷害性遊離薬物に変換され得る他の５－フルオロウリジンプロドラッグを含む。本明細書で提供される組成物および方法の抗体／ポリペプチドとともに使用するためにプロドラッグ形態に誘導体化され得る細胞傷害性薬物の例には、前述の化学療法剤のいずれかが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、抗体／ポリペプチドと上記で特定した生物学的活性剤、すなわちサイトカイン、酵素、ケモカイン、放射性同位体、酵素的に活性な毒素または化学療法剤との任意の組合せを適用することができる。別の実施形態では、抗体／ポリペプチドは、生物学的に活性な薬剤と作動可能に連結され、本明細書に記載の方法で使用されるか、またはここに提供される抗体／ポリペプチドは、生物学的に活性な薬剤と組み合わせて、所望の予防効果、診断効果または治療効果を達成するために別々に投与される（すなわち、コンジュゲートしない）。
ＰＳＭＡ標的化抗体薬物コンジュゲート
一実施形態では、本発明は、細胞毒性剤、例えば、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物由来の酵素的に活性な毒素、またはこれらのフラグメント）または放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）にコンジュゲートした抗体を含む抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。１つの特定の実施形態では、薬物には、メイタンシノイド、オーリスタチン、ドラスタチンおよびカリケアミシンなどのチューブリン阻害剤およびＤＮＡ切断試薬が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態では、本発明は、ＡＤＣを使用する方法をさらに提供する。一態様では、ＡＤＣは、上記のＰＳＭＡ抗体または細胞傷害性薬剤または検出可能な薬剤に共有結合した抗体フラグメントのいずれかを含む。
細胞毒性剤または細胞増殖抑制剤、すなわち癌の治療において腫瘍細胞を死滅または抑制するための薬物の局所送達のための抗体コンジュゲートの使用（ＳｙｒｉｇｏｓおよびＥｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９：６０５－６１４；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ－ＤｕｖａｚおよびＳｐｒｉｎｇｅｒ（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．２６：１５１－１７２；米国特許第４，９７５，２７８号）によって、薬物部分を腫瘍に標的送達し、細胞内に蓄積させることができ、これらのコンジュゲートしていない薬剤の全身投与によって、正常細胞と、除外されることを求めている腫瘍細胞に受け入れられないレベルの毒性が生じる場合がある（Ｂａｌｄｗｉｎら、（１９８６）Ｌａｎｃｅｔ ｐｐ．（１９８６年３月１５日）：６０３－０５；Ｔｈｏｒｐｅ，（１９８５）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａ．Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編集），ｐｐ．４７５－５０６）。最小の毒性で最大限の有効性が求められる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方が、これらの戦略において有用であると報告されている（Ｒｏｗｌａｎｄら、（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２１：１８３－８７）。これらの方法で使用される薬物は、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキセートおよびビンデシンを含む（Ｒｏｗｌａｎｄら、（１９８６）、前出）。抗体－毒素コンジュゲートに使用される毒素としては、細菌毒素、例えば、ジフテリア毒素、植物毒素、例えば、リシン、低分子毒素、例えば、ゲルダナマイシン（Ｍａｎｄｌｅｒら（２０００）Ｊｏｕｒ．ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３－１５８１；Ｍａｎｄｌｅｒら、（２０００）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １０：１０２５－１０２８；Ｍａｎｄｌｅｒら、（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１３：７８６－７９１）、マイタンシノイド（ＥＰ １３９１２１３号；Ｌｉｕら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：８６１８－８６２３）およびカリケアマイシン（Ｌｏｄｅら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２９２８；Ｈｉｎｍａｎら（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３３３６－３３４２）が挙げられる。毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、またはトポイソメラーゼ阻害を含む機構によって、細胞傷害性および細胞増殖抑制効果に影響を及ぼし得る。いくつかの細胞傷害性薬物は、大きな抗体またはタンパク質受容体リガンドにコンジュゲートした場合、不活性または低活性である傾向がある。
抗体薬物コンジュゲートの例は、正常および異常なＢリンパ球の表面に見出されるＣＤ２０抗原に対して指向するマウスＩｇＧ１カッパモノクローナル抗体およびチオウレアリンカーキレート化剤によって結合する１１１Ｉｎまたは９０Ｙ放射性同位体から構成される抗体－放射性同位体コンジュゲートであるＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン、Ｂｉｏｇｅｎ／Ｉｄｅｃ）である（Ｗｉｓｅｍａｎら（２０００）Ｅｕｒ．Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２７（７）：７６６－７７；Ｗｉｓｅｍａｎら、（２００２）Ｂｌｏｏｄ ９９（１２）：４３３６－４２；Ｗｉｔｚｉｇら、（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０（１０）：２４５３－６３；Ｗｉｔｚｉｇら、（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０（１５）：３２６２－６９）。
さらに、カリケアマイシンに結合したヒトＣＤ３３抗体から構成される抗体薬物コンジュゲートＭＹＬＯＴＡＲＧ（商標）（ゲムツヅマブオゾガマイシン、Ｗｙｅｔｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が、２０００年に急性骨髄性白血病の治療のために承認された（Ｄｒｕｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ（２０００）２５（７）：６８６；米国特許第４，９７０，１９８号；第５，０７９，２３３号；第５，５８５，０８９号；第５，６０６，０４０号；第５，６９３，７６２号；第５，７３９，１１６号；第５，７６７，２８５号；第５，７７３，００１号）。
最後に、ドラスタチンの合成アナログであるモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）などのオーリスタチンペプチドを、キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６（癌腫上のＬｅｗｉｓ Ｙに特異的）およびｃＡＣ１０（血液悪性腫瘍上のＣＤ３０に特異的）にコンジュゲートした（Ｄｏｒｏｎｉｎａら（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１（７）：７７８－７８４）。ｃＡＣ１０は治療薬開発中である。
さらに、ＡＤＣの生成に有用な化学療法剤が本明細書に記載されている。使用可能な酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α－サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ－Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが挙げられる。例えば、１９９３年１０月２８日公開のＷＯ９３／２１２３２を参照されたい。放射性コンジュゲート抗体の産生のために、様々な放射性核種が利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅが挙げられる。抗体と細胞毒性剤とのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス－アジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン ２，６－ジイソシアネート）およびビス－活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）を用いて作られる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８：１０９８に記載されているように調製することができる。炭素－１４標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性核酸を抗体に結合させるための例示的なキレート剤である（ＷＯ９４／１１０２６号）。
抗体と、カリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、オーリスタチン、トリコテセン、およびＣＣ１０６５などの１つ以上の低分子毒素と、毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体とのコンジュゲートも本明細書において企図される。
メイタンシノイド：
メイタンシノイド薬物部分としての使用に適したメイタンシノイド化合物は当該分野で周知であり、遺伝子工学技術を用いて製造された既知の方法で天然物から単離されてもよく（Ｙｕ ｅｔ ａｌ（２００２）ＰＮＡＳ ９９：７９６８－７９７３を参照のこと）、または、公知の方法に従って合成的に調製されたメイタンシノールおよびメイタンシノール類縁体でもよい。
例示的なメイタンシノイド薬物部分には、以下のような修飾芳香環を有するものが含まれる：Ｃ－１９－デクロロ（米国特許第４，２５６，７４６号）（アンサマイトシンＰ２のリチウムアルミニウムヒドリド還元により調製）；Ｃ－２０－ヒドロキシ（またはＣ－２０－デメチル）＋／－Ｃ－１９－デクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号および第４，３０７，０１６号）（ストレプトマイセスまたはアクチノミセスを用いる脱メチル化またはＬＡＨを用いた脱塩素化によって調製される）、Ｃ－２０－デメトキシ、Ｃ－２０－アシルオキシ（－ＯＣＯＲ）、＋／－デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号）（塩化アシルを用いたアシル化により調製）、他の位置に修飾を有するもの。
例示的なメイタンシノイド薬物部分はまた、以下のような修飾を有するものを含む：Ｃ－９－ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号）（メイタンシノールとＨ２ＳまたはＰ２Ｓ５との反応によって調製）；Ｃ－１４－アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号）、Ｃ－１４－ヒドロキシメチルまたはアシロキシメチル（ＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号）（Ｎｏｃａｒｄｉａから調製）；Ｃ－１５－ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号）（ストレプトマイセスによるメイタンシノールの変換によって調製）；Ｃ－１５－メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号および第４，３１５，９２９号）（Ｔｒｅｗｉａ ｎｕｄｌｆｌｏｒａから単離された）；Ｃ－１８－Ｎ－デメチル（米国特許第４，３６２，６６３号および第４，３２２，３４８号）（ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）によるメイタンシノールの脱メチル化によって調製）；４，５－デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号）（三塩化チタン／ＬＡＨ還元メイタンシノールにより調製）。
メイタンシノイドを含有するＡＤＣ、その製造方法、およびそれらの治療的使用は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号；第５，４１６，０６４号；第６，４４１，１６３号および欧州特許第ＥＰ ０ ４２５ ２３５ Ｂ１号に開示され、その開示は、本明細書に参考として組み込まれる。Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：８６１８－８６２３（１９９６）は、ヒト結腸直腸癌に指向するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合したＤＭ１と呼ばれるメイタンシノイドを含むＡＤＣを記載していた。コンジュゲートは、培養された結腸癌細胞に対して高い細胞傷害性であることが見出され、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍増殖アッセイにおいて抗腫瘍活性を示した。Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７－１３１（１９９２）は、メイタンシノイドがジスルフィドリンカーを介して、ヒト結腸癌細胞株上の抗原に結合するマウス抗体Ａ７に結合した、またはＨＥＲ－２／ｎｅｕ癌遺伝子に結合する別のマウスモノクローナル抗体ＴＡ．１に結合するＡＤＣを記載している。ＴＡ．１－メイタンシノイドコンジュゲートの細胞傷害性を、細胞あたり３×１０５のＨＥＲ－２表面抗原を発現するヒト乳癌細胞株ＳＫ－ＢＲ－３についてｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。薬物コンジュゲートは、遊離メイタンシノイド薬物と同様の程度の細胞傷害性を達成したが、これは抗体分子当たりメイタンシノイド分子の数を増加させることによって増加させることができた。Ａ７－メイタンシノイドコンジュゲートは、マウスにおいて全身細胞傷害性が低かった。
例示的なメイタンシノイドの実施形態は、ＤＭ１（ここで、波線は、抗体薬物コンジュゲートのリンカー（Ｌ）への共有結合を示す）である。
オーリスタチンおよびドラスタチン：
いくつかの実施形態では、ＡＤＣは、ドラスタチンまたはドロスタチンペプチド類似体および誘導体に結合した本発明の抗体、オーリスタチンを含む（米国特許第５，６３５，４８３号；第５，７８０，５８８号）。ドラスタチンおよびオーリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解、ならびに核および細胞分裂を妨害することが示されており（Ｗｏｙｋｅら、（２００１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５（１２）：３５８０－３５８４）、抗癌活性（米国特許第５，６６３，１４９号）および抗真菌活性を有する（Ｐｅｔｔｉｔら、（１９９８）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２９６１－２９６５）。ドラスタチンまたはオーリスタチン薬物部分は、ペプチド薬物部分のＮ（アミノ）末端またはＣ（カルボキシル）末端を介して抗体に結合することができる（ＷＯ ０２／０８８１７２号）。
典型的なオーリスタチンの実施形態には、Ｎ末端結合したモノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥおよびＤＦを含み、「Ｓｅｎｔｅｒら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ ４５，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｕｍｂｅｒ ６２３（２００４年３月２８日に発表）に開示され、米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９号に記載され、その開示は、その全体が参考として本明細書に明示的に組み込まれる。
様々なリンカー成分を有するＭＭＡＥおよびＭＭＡＦを使用するＡＤＣが開示されている（ＵＳ２００５／０２３８６４９号、ＵＳ０８９６８７４２号）。
例示的なオーリスタチンの実施形態は、ＭＭＡＥ（ここで、波線は、抗体薬物コンジュゲートのリンカー（Ｌ）への共有結合を示す）である。
別の例示的なオーリスタチンの実施形態は、ＭＭＡＦであり、波線は、抗体薬物コンジュゲートのリンカー（Ｌ）への共有結合を示す（ＵＳ２００５／０２３８６４９号）。
典型的には、ペプチド系の薬物部分は、２つ以上のアミノ酸および／またはペプチドフラグメント間にペプチド結合を形成することによって調製することができる。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学分野でよく知られている液相合成法に従って調製することができ（Ｅ．ＳｃｈｒｏｄｅｒおよびＫ．Ｌｕｂｋｅ，「Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐｐ ７６－１３６，１９６５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。オーリスタチン／ドラスタチン薬物部分は、以下の方法に従って調製することができる。米国特許第５，６３５，４８３号；米国特許第５，７８０，５８８号；Ｐｅｔｔｉｔら（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：５４６３－５４６５；Ｐｅｔｔｉｔら（１９９８）Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ １３：２４３－２７７；Ｐｅｔｔｉｔ，Ｇ．Ｒ．ら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９９６，７１９－７２５；Ｐｅｔｔｉｔら（１９９６）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１５：８５９－８６３；およびＤｏｒｏｎｉｎａ（２００３）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１（７）：７７８－７８４。
カリケアマイシン：
他の実施形態では、ＡＤＣは、１つ以上のカリケアマイシン分子に結合した本発明の抗体を含む。カリケアマイシンファミリーの抗生物質は、ピコモル未満の濃度で二本鎖ＤＮＡ切断を生成することができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５，７１２，３７４号、第５，７１４，５８６号、第５，７３９，１１６号、第５，７６７，２８５号、第５，７７０，７０１号、第５，７７０，７１０号、第５，７７３，００１号および第５，８７７，２９６号を参照（全てＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ Ｃｏｍｐａｎｙに対するもの）。使用することができるカリケアマイシンの構造類似体には、限定されるものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ－アセチル－γ１Ｉ、ＰＳＡＧおよびθ１Ｉが挙げられる（Ｈｉｎｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：３３３６－３３４２（１９９３），Ｌｏｄｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：２９２５－２９２８（１９９８）およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄに対する上述の米国特許）。抗体がコンジュゲートされ得る別の抗腫瘍薬は、葉酸拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシンおよびＱＦＡの両方は、細胞内作用部位を有し、形質膜を容易には通過しない。したがって、抗体媒介内在化によるこれらの薬剤の細胞取り込みは、それらの細胞傷害効果を大きく増強する。
その他の細胞傷害性薬剤：
本発明の抗体にコンジュゲートすることができる他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチンおよび５－フルオロウラシル（これらの薬剤のファミリーは、まとめて、米国特許第５，０５３，３９４号、第５，７７０，７１０号に記載されるＬＬ－Ｅ３３２８８複合体として知られる）およびエスペラマイシン（米国特許第５，８７７，２９６号）が挙げられる。
使用可能な酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α－サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ－Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが挙げられる。例えば、１９９３年１０月２８日公開のＷＯ９３／２１２３２号を参照されたい。
本発明は、抗体と、核酸分解活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼまたはデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮａｓｅなどのＤＮＡエンドヌクレアーゼ）との間に形成されるＡＤＣをさらに企図する。
腫瘍の選択的破壊のために、抗体は高度に放射性の原子を含んでいてもよい。放射性コンジュゲート抗体の産生のために、様々な放射性同位体が利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２およびＬｕの放射性同位体が挙げられる。コンジュゲートが検出に使用される場合、それはシンチグラフィー研究のための放射性原子、例えばｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、またはヨウ素のような核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ｍｒｉとしても知られている）のためのスピンラベル、例えば、ヨウ素１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄である。
放射標識または他の標識は、既知の方法でコンジュゲートに組み込むことができる。例えば、ペプチドは生合成されてもよく、または例えば水素の代わりにフッ素－１９を含む適切なアミノ酸前駆体を用いた化学的アミノ酸合成によって合成されてもよい。ｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８およびＩｎ１１１のような標識は、ペプチド中のシステイン残基を介して結合することができる。イットリウム－９０は、リジン残基を介して結合することができる。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒら（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９－５７）を使用してヨウ素－１２３を組み込むことができる。「免疫シンチグラフィーにおけるモノクローナル抗体」（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８９）には、他の方法が詳細に記載されている。
ＰＳＭＡ標的化抗体－薬物複合体化合物：
本発明は、とりわけ、薬物の標的送達のための抗体－薬物コンジュゲート化合物を提供する。本発明者らは、抗体－薬物コンジュゲート化合物がＰＳＭＡを発現する細胞に対して強力な細胞傷害性および／または細胞増殖抑制活性を有するという発見を行った。抗体－薬物コンジュゲート化合物は、少なくとも１つの薬物単位に共有結合した抗体単位を含む。薬物単位は、直接またはリンカー単位（－ＬＵ－）を介して共有結合させることができる。
いくつかの実施形態では、抗体薬物コンジュゲート化合物は、以下の式を有する：
Ａｂ－（ＬＵ－Ｄ）ｐ
またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物；ここで、
Ａｂは、抗体単位、例えば、ｇｙ１またはＰＳＭＡｂのような本発明の完全抗体またはその抗体フラグメントに由来する変異したバリアントであり、
（ＬＵ－Ｄ）は、リンカー単位－薬物単位部分であり、ここで、
ＬＵ－は、リンカー単位であり；
－Ｄは、標的細胞に対して細胞増殖抑制活性または細胞傷害活性を有する薬物ユニットであり；
ｐは、１～２０の整数である。
いくつかの実施形態では、ｐは、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３または１～２の範囲である。いくつかの実施形態では、ｐは、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４または２～３の範囲である。他の実施形態では、ｐは、１、２、３、４、５または６である。いくつかの実施形態では、ｐは、２または４である。
いくつかの実施形態では、抗体薬物コンジュゲート化合物は、以下の式を有する：
Ａｂ－（Ａａ－Ｗｗ－Ｙｙ－Ｄ）ｐ
またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物、ここで、
Ａｂは、抗体単位、例えば、ｇｙ１またはＰＳＭＡｂのような本発明の完全抗体またはその抗体フラグメントに由来する変異したバリアントであり、
－Ａａ－Ｗｗ－Ｙｙ－は、リンカー単位（ＬＵ）であり；
－Ａ－は、伸張ユニットであり、
ａは、０または１であり、
各－Ｗ－は、独立して、アミノ酸単位であり、
ｗは、０～１２の整数であり、
－Ｙ－は、自己犠牲スペーサ単位であり、
ｙは、０、１または２であり；
－Ｄは、標的細胞に対して細胞増殖抑制活性または細胞傷害活性を有する薬物ユニットであり；
ｐは、１～２０の整数である。
いくつかの実施形態では、ａは０または１であり、ｗは０または１であり、ｙは０、１または２である。いくつかの実施形態では、ａは０または１であり、ｗは０または１であり、ｙは０または１である。いくつかの実施形態では、ｐは、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３または１～２の範囲である。いくつかの実施形態では、ｐは、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４または２～３の範囲である。他の実施形態では、ｐは、１、２、３、４、５または６である。いくつかの実施形態では、ｐは、２または４である。いくつかの実施形態では、ｗがゼロでない場合、ｙは、１または２である。いくつかの実施形態では、ｗが１～１２である場合、ｙは１または２である。いくつかの実施形態では、ｗは２～１２であり、ｙは１または２である。いくつかの実施形態では、ａは１であり、ｗおよびｙは０である。
複数の抗体を含む組成物では、薬物負荷量は、抗体当たりの薬物分子の平均数ｐで表される。薬物負荷は、抗体１個当たり１～２０個の薬物（Ｄ）の範囲であり得る。コンジュゲート反応の準備における抗体あたりの薬物の平均数は、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、およびＨＰＬＣなどの従来の手段によって特徴付けられ得る。ｐの観点からの抗体－薬物複合体の定量的分布も決定することができる。いくつかの例では、他の薬物が添加された抗体－薬物コンジュゲートからのｐが特定の値である同種抗体－薬物コンジュゲートの分離、精製および特性決定は、逆相ＨＰＬＣまたは電気泳動などの手段によって達成されてもよい。例示的な実施形態では、ｐは、２～８である。
抗体－薬物コンジュゲート化合物の生成は、当業者に公知の任意の技術によって達成することができる。簡潔に述べると、抗体－薬物コンジュゲート化合物は、抗体単位としてのｇｙ１またはその突然変異型バリアント、抗体単位として本発明の完全抗体または抗体フラグメント、および場合によっては薬物と結合剤とを結合するリンカーを含む。好ましい実施形態では、抗体は、本明細書の他の箇所に記載されるように、ｇｙ１または点変異を有するそのバリアントに由来する抗体または抗体フラグメントである。結合剤への薬物および／またはリンカーの共有結合のために、多数の異なる反応が利用可能である。これは、多くは、結合剤のアミノ酸残基（例えば、抗体分子、リジンのアミン基を含む）、グルタミン酸およびアスパラギン酸の遊離カルボン酸基、システインのスルフヒドリル基および芳香族アミノ酸の種々の部分の反応によって達成される。共有結合の最も一般的に使用される非特異的な方法の１つは、化合物のカルボキシ（またはアミノ）基を抗体のアミノ（またはカルボキシ）基に結合させるカルボジイミド反応である。さらに、化合物のアミノ基を抗体分子のアミノ基に結合するために、ジアルデヒドまたはイミドエステルのような二官能性薬剤が使用されている。結合剤への薬物の付着のためにも利用可能であるのは、シッフ塩基反応である。この方法は、グリコールまたはヒドロキシ基を含有する薬物の過ヨウ素酸酸化を含み、したがってアルデヒドを形成し、その後アルデヒドを結合剤と反応させる。付着は、結合剤のアミノ基を有するシッフ塩基の形成を介して起こる。イソチオシアネートは、薬物を結合剤に共有結合させるためのカップリング剤として使用することもできる。他の技術は当業者に知られており、本発明の範囲内である。
特定の実施形態では、リンカーの前駆体である中間体を、適切な条件下で薬物と反応させる。特定の実施形態では、反応性基は、薬物および／または中間体に使用される。薬物と中間体または誘導体化薬物との間の反応の生成物は、適切な条件下で完全な抗体または抗体フラグメントに由来するｇｙ１またはそのバリアントと引き続き反応する。
ＰＳＭＡターゲットＣＡＲ－ＴまたはＣＡＲ－ＮＫ
Ｔ細胞をＢ細胞悪性腫瘍などの癌細胞上の適切な細胞表面分子に向け直すことに依存するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）修飾自己Ｔ細胞（ＣＡＲＴ）療法を使用する最近の開発は、免疫の力を利用して、Ｂ細胞性悪性腫瘍および他の癌を治療することができる有望な結果を示す（例えば、Ｓａｄｅｌａｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ３：３８８－３９８（２０１３）を参照されたい）。マウス由来のＣＡＲＴ１９（すなわち、「ＣＴＬ０１９」）の臨床結果は、ＣＬＬならびに小児ＡＬＬにおいて苦しんでいる患者において完全な寛解を確立することの有望性を示している（例えば、Ｋａｌｏｓら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ３：９５ｒａ７３ ２０１１）、Ｐｏｒｔｅｒら、ＮＥＪＭ ３６５：７２５－７３３（２０１１）、Ｇｒｕｐｐら、ＮＥＪＭ ３６８：１５０９－１５１８（２０１３））。遺伝的に改変されたＴ細胞上のキメラ抗原レセプターが標的細胞を認識して破壊する能力に加えて、成功する治療的Ｔ細胞療法は、時間の経過とともに増殖し、持続し、白血病細胞エスケープをさらにモニタリングする能力を有する必要がある。エネルギー、抑制または枯渇の結果であるかどうかにかかわらず、Ｔ細胞の可変性は、ＣＡＲ形質転換Ｔ細胞の性能に影響を及ぼすが、熟練した実務者はこの時点で制御が制限される。効果的であるためには、ＣＡＲで形質転換された患者のＴ細胞は、ＣＡＲの抗原に応答して増殖する能力を持続し、維持する必要がある。全ての患者のＴ細胞は、ネズミｓｃＦｖを含むＣＡＲＴ１９でこれを行うことができることが示されている（例えば、Ｇｒｕｐｐら、ＮＥＪＭ ３６８：１５０９－１５１８（２０１３）参照）。
本発明は、操作されたＴ細胞をＰＳＭＡ陽性腫瘍細胞に向け直して、認識させ、死滅させるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物に組み込まれたＰＭＳＡに結合する完全ヒト抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）を提供することによって、患者の免疫応答を制御することに取り組む。
したがって、一態様では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離された核酸分子に関し、ＣＡＲは、ＰＳＭＡ結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む抗体または抗体フラグメントを含む例えば共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン）を含む。一実施形態では、ＣＡＲは、本明細書に記載の完全ヒト抗ＰＳＭＡ結合ドメイン、本明細書に記載の膜貫通ドメイン、および本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、補助刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメイン）を含む。
一実施形態では、コードされたヒト抗ＰＳＭＡ結合ドメインは、本明細書に記載の完全ヒト抗ＰＳＭＡ結合ドメインの１つまたは複数の（例えば３つ全ての）軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）、および／または完全ヒト抗ＰＳＭＡ結合ドメインの１つ以上（例えば、３つ全て）の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含み、例えば１つまたは複数の、例えば３つのＬＣ ＣＤＲおよび／または１つまたは複数の、例えば３つ全てのＨＣ ＣＤＲを含む完全ヒト抗ＰＳＭＡ結合ドメインを含む。一実施形態では、コードされた軽鎖可変領域は、本明細書に記載された１つ、２つ、３つ、または４つ全てのフレームワーク領域を含む。一実施形態では、コードされた重鎖可変領域は、以下に記載された１つ、２つ、３つ、または４つ全てのフレームワーク領域を含む。一実施形態では、コードされた完全ヒト抗ＰＳＭＡ結合ドメインは、以下に記載されるヒト軽鎖可変領域および／または以下に記載されるヒト重鎖可変領域を含む。一実施形態では、コードされた抗ＰＳＭＡ結合ドメインは、以下に記載されるアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖである。一実施形態では、抗ＰＳＭＡ結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、以下に提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列、または以下に記載されるアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の少なくとも１つ、２つまたは３つの修飾（例えば、置換）を有するが３０、２０または１０個以下の修飾（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；および／または以下に提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列、または以下に記載されるアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の少なくとも１つ、２つまたは３つの修飾（例えば、置換）を有するが、３０，２０または１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、コードされたヒト抗ＰＳＭＡ結合ドメインは、以下に記載される配列、またはその９５～９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、ヒト抗ＰＳＭＡ結合ドメインをコードする核酸配列は、以下に記載される配列、またはその９５～９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、コードされたヒト抗ＰＳＭＡ結合ドメインはｓｃＦｖであり、軽鎖可変領域はリンカー、例えば本明細書に記載のリンカーを介して重鎖可変領域に結合される。一実施形態では、コードされたヒト抗ＰＳＭＡ結合ドメインは、（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）ｎリンカーを含み、ここでｎは１，２，３，４，５または６であり、好ましくは３または４である。別の実施形態では、コードされたヒト抗ＰＳＭＡ結合ドメインは、配列番号３７に記載のリンカー配列を含む。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、軽鎖可変領域－リンカー－重鎖可変領域または重鎖可変領域－リンカー－軽鎖可変領域のいずれかの方向であり得る。
特定の実施形態では、抗ＰＳＭＡ結合ドメインは、本明細書の他の場所に記載される抗体または抗体フラグメントを含む。例えば、ある実施形態では、抗ＰＳＭＡ結合ドメインは、本明細書の他の箇所に記載されるように、ｇｙ１、ｇｙ１－ｓｔ、ｇｙ１－２、ｇｙ１－３またはＰＳＭＡｂを含む。
例えば、特定の実施形態では、抗ＰＳＭＡ結合ドメインは、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６８および配列番号６９のうち１つ以上を含む。
例えば、特定の実施形態では、抗ＰＳＭＡ結合ドメインは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４および配列番号６６の１つ以上のヌクレオチド配列によってコードされる。
一実施形態では、コードされた膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインである。一実施形態では、コードされた膜貫通ドメインは、配列番号７５のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、コードされた膜貫通ドメインは、配列番号７５、または配列番号７５のアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の少なくとも１，２または３個の修飾（例えば、置換）を有するが、２０，１０または５個以下の修飾（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、膜貫通ドメインをコードする核酸配列は、配列番号７４の配列、またはその９５～９９％の同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、コードされた抗ＰＳＭＡ結合ドメインは、ヒンジ領域、例えば本明細書に記載のヒンジ領域によって膜貫通ドメインに連結される。一実施形態では、コードされるヒンジ領域は、配列番号７３のアミノ酸配列、またはその９５～９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、ヒンジ領域をコードする核酸配列は、配列番号７２の配列、またはその９５～９９％を識別する配列を含む。
一実施形態では、核酸分子は、補助刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。一実施形態では、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能性シグナル伝達ドメインである。一実施形態では、コードされた共刺激ドメインは、配列番号７７の配列を含む。一実施形態では、コードされた共刺激ドメインは、配列番号７７のアミノ酸配列または配列番号７７のアミノ酸配列に対して９５～９９％の同一性を有する配列の少なくとも１，２または３個の修飾（例えば、置換）を有するが、２０，１０または５個以下の修飾（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、共刺激ドメインをコードする核酸配列は、配列番号７６の配列、またはその９５～９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、単離された核酸分子は、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列をさらに含む。一実施形態では、コードされる細胞内シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢの機能性シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能性シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、コードされた機能的ＣＤ３ゼータ細胞内シグナルドメインは、配列番号７９の配列を含む。一実施形態では、コードされた共刺激ドメインは、配列番号７９のアミノ酸配列または配列番号７９のアミノ酸配列に対して９５～９９％の同一性を有する配列の少なくとも１、２または３個の修飾（例えば、置換）を有するが、２０、１０または５個以下の修飾（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、共刺激ドメインをコードする核酸配列は、配列番号７８の配列、またはその９５～９９％の同一性を有する配列を含む。別の実施形態では、ＣＡＲ共構造は、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群から選択される２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。
別の態様では、本発明は、リーダー配列、例えば本明細書中に記載されるリーダー配列、例えば配列番号７１のリーダー配列を含むＣＡＲ構築物をコードする核酸分子；本明細書に記載のヒト抗ＰＳＭＡ結合ドメイン、例えば、本明細書に記載のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、ＬＣ ＣＤＲ３、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を含むヒト抗ＰＳＭＡ結合ドメイン、例えば、ヒト配列番号１から配列番号６９までに列挙された配列を有する抗ＰＳＭＡ結合ドメイン、またはそれらの９５～９９％の同定を有する配列；例えば配列番号７３の本明細書に記載のヒンジ領域；本明細書に記載の膜貫通ドメイン、例えば、配列番号７５を含む膜貫通ドメイン；および細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、コードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン、例えば本明細書に記載された共刺激ドメイン、例えば配列番号７７の配列を有する４－１ＢＢ共刺激ドメイン、および／または一次シグナル伝達ドメイン、本明細書に記載の一次シグナル伝達ドメイン、例えば、配列番号７９の配列を有するＣＤ３ゼータ刺激ドメインを含む。一実施形態では、ＣＡＲ構築物をコードする単離された核酸分子は、配列番号７１の核酸配列によってコードされるリーダー配列、またはそれに対して９５～９９％の同一性を有する配列を含む。
別の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号８１のアミノ酸配列、またはそれに対して９５～９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、ＣＡＲは、配列番号８０またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。
本発明は、本明細書に記載のＣＡＲをコードする本発明の核酸配列を発現する単離された宿主細胞を提供する。一実施形態では、宿主細胞はＴ細胞である。本発明のＴ細胞は、培養Ｔ細胞、例えば、初代Ｔ細胞、または培養Ｔ細胞株由来のＴ細胞、または哺乳動物から得たＴ細胞など、任意のＴ細胞であってもよい。哺乳動物から得られた場合、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、または他の組織もしくは体液を含むがこれらに限定されない多数の供給源から得ることができる。Ｔ細胞は濃縮されていても精製されていてもよい。Ｔ細胞は、好ましくはヒトＴ細胞（例えば、ヒトから単離されたもの）である。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例えば、Ｔｈ）およびＴｈ２細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞、記憶Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞などが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。Ｔ細胞株は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）およびＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＤＳＭＺ）から入手可能であり、例えばＪｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ－１５２）、Ｓｕｐ－Ｔｌ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１９４２）、ＲＰＭＩ ８４０２細胞（ＤＳＭＺ ＡＣＣ－２９０）、カルパス（Ｋａｒｐａｓ）４５細胞（ＤＳＭＺ ＡＣＣ－５４５）およびそれらの誘導体を含むが、これらに限定されない。
別の実施形態では、宿主細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。ＮＫ細胞は、自然免疫系において役割を果たす細胞傷害性リンパ球の一種である。ＮＫ細胞は、大きな顆粒リンパ球として定義され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球をも生じる共通のリンパ球前駆細胞から分化した第３の種類の細胞を構成する（例えば、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、５ｔｈ ｅｄ、Ｊａｎｅｗａｙら、編、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ（２００１））。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃腺、および胸腺において分化および成熟する。成熟後、ＮＫ細胞は、特有の細胞傷害性顆粒を有する大きなリンパ球として循環に入る。ＮＫ細胞は、例えば、いくつかの腫瘍細胞およびウイルス感染細胞などのいくつかの異常な細胞を認識して死滅させることができ、細胞内病原体に対する本来の免疫防御に重要であると考えられている。Ｔ細胞に関して上述したように、ＮＫ細胞は、培養されたＮＫ細胞、例えば、初代ＮＫ細胞、または培養されたＮＫ細胞株由来のＮＫ細胞、または哺乳動物から得られるＮＫ細胞など、任意のＮＫ細胞であってもよい。哺乳動物から得られた場合、ＮＫ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、または他の組織もしくは体液を含むがこれらに限定されない多数の供給源から得ることができる。ＮＫ細胞は濃縮されていても精製されていてもよい。ＮＫ細胞は、好ましくはヒトＮＫ細胞（例えば、ヒトから単離されたもの）である。ＮＫ細胞株は、例えば、ＮＫ－９２細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２４０７）、ＮＫ９２ＭＩ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２４０８）およびそれらの誘導体を含むＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手可能である。
別の態様では、本発明は、ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞の集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ発現細胞の集団は、異なるＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む。例えば、一実施形態では、ＣＡＲＴ細胞の集団は、本明細書に記載の抗ＰＳＭＡ結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第１の細胞と、異なる抗ＰＳＭＡ結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第２の細胞、例えば、第１の細胞によって発現されるＣＡＲにおける抗ＰＳＭＡ結合ドメインとは異なる、本明細書に記載のＰＳＭＡ結合ドメインとを含んでいてもよい。別の例として、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば本明細書に記載のような抗ＰＳＭＡ結合ドメインを含むＣＡＲを発現する第１の細胞、およびＰＳＭＡ以外の標的（例えば、ＰＳＣＡ）に対する抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現する第２の細胞を含むことができる。一実施形態では、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第１細胞と、二次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第２細胞を含む。
別の態様では、本発明は、集団中の少なくとも１つの細胞が、本明細書に記載の抗ＰＳＭＡドメインを有するＣＡＲおよび別の薬剤を発現する第２細胞、例えば、ＣＡＲ発現細胞を含む。例えば、一実施形態では、薬剤は、阻害性分子を阻害する薬剤であり得る。阻害性分子は、例えば、いくつかの実施形態では、免疫エフェクター応答を賦与するＣＡＲ発現細胞の能力を低下させることができる。阻害性分子の例には、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲβが含まれる。一実施形態では、阻害分子を阻害する薬剤は、細胞に陽性シグナルを提供する第２のポリペプチド（例えば、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメイン）に関連する第１のポリペプチド、例えば阻害分子を含む。一実施形態では、薬剤は、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０，２Ｂ４およびＴＧＦＲベータなどの阻害性分子、またはこれらのいずれかのフラグメント（例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの１つ）である第１のポリペプチド、および本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載の４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８）および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載のＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）である第２のポリペプチドを含む。一実施形態では、薬剤は、ＰＤ１の第１のポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部）および本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインの第２のポリペプチド（例えば、記載のＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／または本明細書に記載のＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）を含む。
本発明はまた、本明細書に記載の１つ以上のＣＡＲ構築物をコードする核酸分子を提供する。一態様では、核酸分子はメッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。一態様では、核酸分子はＤＮＡ構築物として提供される。
所望の分子をコードする核酸配列は、例えば遺伝子を発現する細胞からライブラリーをスクリーニングすること、それを含むことが知られているベクターから遺伝子を誘導すること、標準的な技術を使用して、それを含有する細胞および組織から直接単離することによって、得ることができる。あるいは、目的の遺伝子をクローン化するのではなく、合成的に作製することができる。
また、本発明は、本発明のＤＮＡが挿入されたベクターを提供する。レンチウイルスなどのレトロウイルス由来のベクターは、導入遺伝子の長期間の安定した組み込みおよび娘細胞へのその伝播を可能にするので、長期間の遺伝子導入を達成するのに適したツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞を形質導入することができるという点で、マウス白血病ウイルスのようなオンコレトロウイルス由来のベクターよりも付加的な利点を有する。それらはまた、低い免疫原性の付加的利点を有する。
別の実施形態では、本発明の所望のＣＡＲをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター（Ａ５／３５）である。別の実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸の発現は、睡眠の美容、クリスピー、ＣＡＳ９およびジンクフィンガーヌクレアーゼなどのトランスポゾンを使用して達成することができる。以下、本明細書に参考として組み込まれる、Ｊｕｎｅら、２００９ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９．１０：７０４－７１６を参照のこと。
要約すると、ＣＡＲをコードする天然または合成の核酸の発現は、典型的には、ＣＡＲポリペプチドまたはその一部をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結し、その構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。このベクターは、真核生物の複製および組込みに適している可能性がある。典型的なクローニングベクターは、転写および翻訳ターミネーター、開始配列、および所望の核酸配列の発現の調節に有用なプロモーターを含む。
本発明の発現構築物はまた、標準的な遺伝子送達プロトコルを用いて、核酸免疫化および遺伝子治療のために使用され得る。遺伝子送達のための方法は当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、第５，５８０，８５９号、第５，５８９，４６６号に記載されており、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。別の実施形態では、本発明は、遺伝子治療ベクターを提供する。
核酸は、多くの種類のベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルスおよびコスミドを含むが、これらに限定されないベクターにクローニングすることができる。特に関心のあるベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクターおよび配列決定ベクターが含まれる。
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供されてもよい。ウイルスベクター技術は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２０１２、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、１－４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）および他のウイルス学および分子生物学マニュアルに記載される。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。一般に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物体において機能する複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つ以上の選択可能なマーカーを含む（例えば、ＷＯ ０１／９６５８４号；ＷＯ ０１／２９０５８号；および米国特許第６，３２６，１９３号）。
哺乳動物細胞への遺伝子導入のための多くのウイルス系システムが開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムのための便利なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、ベクターに挿入され、当該分野で公知の技術を用いてレトロウイルス粒子中にパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスを単離し、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏのいずれかで被験体の細胞に送達することができる。多くのレトロウイルス系が当該分野で公知である。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。多くのアデノウイルスベクターが当該分野で公知である。一実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。
さらなるプロモーターエレメント、例えばエンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは、開始部位の下流に機能的エレメントを含むように数多くのプロモーターが示されているが、開始部位の上流３０～１１０ｂｐの領域に位置する。プロモーター要素間の間隔はしばしば柔軟であり、その結果、要素が互いに逆転したり動いたりすると、プロモーター機能が維持される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターにおいて、プロモーターエレメント間の間隔は、活性が低下し始める前に５０ｂｐ離れて増加することができる。プロモーターに依存して、個々の要素は、転写を活性化するために協同的にまたは独立して機能することができるようである。
哺乳動物Ｔ細胞においてＣＡＲトランス遺伝子を発現することができるプロモーターの例は、ＥＦ１ａプロモーターである。天然のＥＦ１ａプロモーターは、リボソームへのアミノアシルｔＲＮＡの酵素送達の原因となる伸長因子－１複合体のアルファサブユニットの発現を促進する。ＥＦ１ａプロモーターは、哺乳動物発現プラスミドに広く用いられており、レンチウイルスベクターにクローニングされたトランス遺伝子からのＣＡＲ発現を促進するのに有効であることが示されている。例えば、Ｍｉｌｏｎｅら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３－１４６４（２００９）を参照。一態様では、ＥＦ１ａプロモーターは、配列番号１００として提供される配列を含む。
プロモーターの別の例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強力な構成的プロモーター配列である。しかし、他の構成的プロモーター配列、例えば、限定されないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶエプスタイン－バーウイルス即時型早期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子－１ａプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターが挙げられるが、これに限定されるものではないヒト遺伝子プロモーターも使用されうる。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターもまた、本発明の一部として企図される。誘導性プロモーターの使用は、そのような発現が所望される場合に作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列の発現をオンにすることができる分子スイッチ、または発現が望ましくない場合に発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例には、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
ＣＡＲポリペプチドまたはそのタンパク質の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは、ウイルスベクターを介してトランスフェクションまたは感染しようとした細胞集団からの発現細胞の同定および選択を容易にするための選択マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかまたは両方を含むこともできる。他の態様では、選択マーカーを別個のＤＮＡフラグメント上に保持し、共トランスフェクション手順に用いることができる。選択可能なマーカーおよびレポーター遺伝子の両方は、宿主細胞における発現を可能にするために、適切な調節配列に隣接していてもよい。有用な選択マーカーとしては、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクトされた細胞を同定するため、および調節配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織に存在しないか、またはレシピエント生物または組織によって発現されない遺伝子であり、その発現が、いくつかの容易に検出可能な性質、例えば酵素活性によって明らかになるポリペプチドをコードする。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の適切な時点でアッセイされる。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼまたは緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含むことができる（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉら、２０００ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９－８２）。適切な発現系は周知であり、公知の技術を用いて調製するか、または商業的に入手することができる。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小５’フランキング領域を有する構築物がプロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結され、プロモーター駆動転写を調節する能力について薬剤を評価するために使用され得る。
遺伝子を細胞に導入し発現させる方法は、当技術分野で公知である。発現ベクターとの関連で、ベクターは宿主細胞、例えば哺乳動物、細菌、酵母または昆虫細胞に当該分野の任意の方法によって容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的または生物学的手段によって宿主細胞に移入することができる。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を産生するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２０１２，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，ｖｏｌｕｍｅｓ １－４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）を参照のこと。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法には、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えばヒト細胞に遺伝子を挿入するための最も広く使用されている方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号および第５，５８５，３６２号を参照のこと。
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段には、巨大分子複合体、ナノカプセル、微小球、ビーズ、および水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質系システムなどのコロイド分散系が含まれる。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの送達媒体として使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。標的ナノ粒子または他の適切なサブミクロンサイズの送達系を用いたポリヌクレオチドの送達のような、核酸の最先端の標的送達の他の方法が利用可能である。
非ウイルス送達システムが利用される場合、送達ビヒクルの例はリポソームである。核酸の宿主細胞への導入（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ）のために、脂質製剤の使用が企図されている。別の態様では、核酸は脂質と会合していてもよい。脂質と会合した核酸は、リポソームの脂質二重層内に点在するリポソームの水性内部にカプセル化され、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方に会合した連結分子を介してリポソームに結合され、リポソームに捕捉されるリポソームと複合体化し、脂質を含む溶液に分散させ、脂質と混合し、脂質と組合せ、脂質中の懸濁液として含有し、ミセルに含有または複合化した、またはそうでなければ脂質と会合する。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクター関連組成物は、溶液中の特定の構造に限定されない。例えば、それらは、二層構造、ミセル、または「崩壊」構造で存在し得る。それらは単に溶液中に散在していてもよく、サイズまたは形状が一様でない凝集物を形成する可能性がある。脂質は、天然または合成の脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質には、細胞質に天然に存在する脂肪滴、ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体を含む化合物のクラスが含まれる。
使用に適した脂質は、商業的供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）はＳｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから得ることができる。ジセチルリン酸（「ＤＣＰ」）はＫ＆Ｋラボラトリーズ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ）から得ることができる。コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｂｅｈｒｉｎｇから得ることができる。ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ｉｎｃ． （バーミンガム、アラバマ州）から得ることができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質のストック溶液は、約－２０℃で保存することができる。クロロホルムはメタノールよりも容易に蒸発するので、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」は、密閉された脂質二重層または凝集体の生成によって形成される多様な単層および多重層脂質媒体を包含する一般用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部水性媒体を有する小胞構造を有するものとして特徴付けることができる。多重層リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。リン脂質を過剰の水溶液中に懸濁させると、それらは自然に形成される。脂質成分は、閉鎖構造の形成前に自己再構成を受け、脂質二重層の間に水および溶質を閉じ込める（Ｇｈｏｓｈら、１９９１ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：５０５－１０）。しかしながら、通常の小胞構造とは異なる構造を溶液中で有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造をとることができ、または単に脂質分子の不均一な凝集体として存在することができる。また、リポフェクタミン－核酸複合体も企図される。
外因性核酸を宿主細胞に導入するか、または本発明の阻害剤に細胞を曝露するために使用される方法にかかわらず、宿主細胞における組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイが実施され得る。このようなアッセイには、例えば、サザンおよびノザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲのような当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ；例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット）または本発明の範囲内にある薬剤を同定するための本明細書に記載のアッセイによって、特定のペプチドの存在または非存在を検出するなどの「生化学」アッセイが含まれる。
本発明は、ＣＡＲをコードする核酸分子を含むベクターをさらに提供する。一態様では、ＣＡＲベクターは、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に直接的に形質導入され得る。一態様では、ベクターは、クローニングまたは発現ベクター、例えば、限定されないが、１つまたは複数のプラスミド（例えば、発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、２分染色体）、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクター構築物を含むベクターである。一態様では、ベクターは、哺乳動物Ｔ細胞においてＣＡＲ構築物を発現することができる。一態様では、哺乳動物Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞である。
Ｔ細胞の供給源
拡大および遺伝子改変の前に、Ｔ細胞の供給源が被験体から得られる。用語「被験体」は、免疫応答が誘発され得る生物（例えば、哺乳動物）を含むことを意図する。被験体の例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が含まれる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む多くの供給源から得ることができる。本発明の特定の態様では、当技術分野で利用可能な任意の数のＴ細胞株を使用することができる。本発明の特定の態様において、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離のような、当業者に公知の任意の数の技術を使用して、被験体から採取された血液の単位から得ることができる。１つの好ましい態様では、個体の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス生成物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球および血小板を含むリンパ球を含有する。一態様では、アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、その後の処理工程のために細胞を適切な緩衝液または培地に入れることができる。本発明の一態様では、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。別の態様では、洗浄溶液はカルシウムを欠いており、マグネシウムを欠いていてもよく、または全てではないにしても多くの二価陽イオンを欠いていてもよい。カルシウムの不在下での最初の活性化工程は、活性化を拡大させる可能性がある。当業者であれば容易に理解されるように、洗浄工程は、半自動「フロースルー」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１細胞プロセッサー、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）を用いて、製造元の指示に従って行った。洗浄後、細胞は、種々の生体適合性緩衝液、例えば、Ｃａ非含有、Ｍｇ非含有ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ、または緩衝液を含むまたは含まない他の生理食塩水などに再懸濁することができる。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培地に直接再懸濁することができる。
一態様では、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、例えばＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離または向流遠心分離による単球の枯渇により末梢血リンパ球から単離される。ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞のようなＴ細胞の特定の亜集団は、陽性または陰性選択技術によってさらに単離することができる。例えば、一態様では、Ｔ細胞を単離するのに十分な時間所望のＴ細胞の陽性選択のために、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔなどの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、３×２８）共役ビーズとのインキュベーションにより単離される。一態様では、時間は約３０分である。さらなる態様では、時間は、３０分～３６時間またはそれ以上の範囲であり、その間の全ての整数値である。さらなる態様では、時間は、少なくとも１、２、３、４、５または６時間である。さらに別の好ましい態様では、時間は１０～２４時間である。一態様では、インキュベーション時間は２４時間である。腫瘍組織または免疫無防備状態の個体から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離する場合など、他の細胞タイプと比較してＴ細胞が少ない任意の状況において、より長いインキュベーション時間を用いてＴ細胞を単離することができる。さらに、より長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕捉効率を増加させる可能性がある。したがって、Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合させる時間を単純に短縮または延長することにより、および／またはＴ細胞に対するビーズの比を増加または減少させることにより（Ｔ細胞の亜集団を優先的に選択することができる）培養開始時またはプロセス中の他の時点で、またはその逆に投与することができる。さらに、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体の比率を増加または減少させることによって、Ｔ細胞の亜集団を、培養開始時または他の所望の時点で優先的に選択することができる。当業者であれば、本発明の文脈において複数回の選択を用いることもできることを認識するであろう。特定の態様では、選択手順を実行し、活性化および拡張プロセスにおいて「選択されていない」細胞を使用することが望ましい場合がある。「選択されていない」細胞は、さらなる回の選択を受けることもできる。
陰性選択によるＴ細胞集団の富化は、陰性選択細胞に特有の表面マーカーに向けられた抗体の組合せによって達成することができる。１つの方法は、負に選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルを用いる負の磁気免疫接着またはフローサイトメトリーによる細胞選別および／または選択である。例えば、陰性選択によるＣＤ４＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体を含む。特定の態様では、典型的にはＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、およびＦｏｘＰ３＋を発現する制御性Ｔ細胞を豊富にするか、または積極的に選択することが望ましい場合がある。あるいは、ある態様では、Ｔ制御細胞は、抗Ｃ２５結合ビーズまたは他の同様の選択方法によって枯渇される。
一実施形態では、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、グランザイムＢ、およびパーフォリン、または他の適切な分子、例えば他のサイトカインのうちの１つ以上を発現するＴ細胞集団を選択することができる。細胞発現をスクリーニングする方法は、例えば、ＰＣＴ公開番号：ＷＯ ２０１３／１２６７１２に記載された方法によって決定することができる。
陽性または陰性選択による所望の細胞集団の単離のために、細胞および表面（例えば、ビーズのような粒子）の濃度を変えることができる。特定の態様では、細胞およびビーズの最大限の接触を確実にするために、ビーズおよび細胞が一緒に混合される（例えば、細胞の濃度を増加させる）体積を有意に減少させることが望ましい場合がある。例えば、一態様では、２０億個の細胞／ｍｌの濃度が使用される。一態様では、１０億個の細胞／ｍｌの濃度が使用される。さらなる態様では、１億個の細胞／ｍｌを超える細胞が使用される。さらなる態様では、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万または５０００万個の細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。さらに一態様では、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万または１億個の細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。さらなる態様において、１億２５００万個または１億５０００万個の細胞／ｍｌの濃度が使用され得る。高濃度を使用すると、細胞収量、細胞活性化、および細胞拡張が増加する可能性がある。さらに、高い細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞、または腫瘍細胞が多数存在するサンプル（例えば、白血病の血液、腫瘍組織など）をより効率的に捕捉することを可能にする。そのような細胞の集団は、治療上の価値を有する場合があり、そして得るのが望ましいであろう。例えば、高濃度の細胞を使用することにより、通常より弱いＣＤ２８発現を有するＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択が可能になる。
関連する態様では、より低い濃度の細胞を使用することが望ましい場合がある。Ｔ細胞および表面の混合物（例えば、ビーズなどの粒子）を有意に希釈することによって、粒子と細胞との間の相互作用が最小限に抑えられる。これは、粒子に結合する所望の抗原を大量に発現する細胞を選択する。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、より高いレベルのＣＤ２８を発現し、ＣＤ８＋Ｔ細胞よりも希薄濃度でより効率的に捕捉される。一態様では、使用される細胞の濃度は５×１０ｅ６／ｍｌである。他の態様において、使用される濃度は、約１×１０５／ｍｌ～１×１０６／ｍｌ、およびその間の任意の整数値であり得る。
他の態様において、細胞は、２～１０℃または室温で様々な速度で様々な時間長のローテーター上でインキュベートすることができる。
刺激のためのＴ細胞はまた、洗浄工程後に凍結され得る。理論に拘束されないことを望むが、凍結およびその後の解凍工程は、顆粒球およびある程度は細胞集団の単球を除去することにより、より均一な生成物を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄工程の後、細胞を凍結溶液中に懸濁させることができる。多くの凍結溶液およびパラメータが当該分野で公知であり、この状況において有用であるが、一方の方法は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミンを含むＰＢＳ、または１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７．５％ＤＭＳＯ、または３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ－Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン、および７．５％ＤＭＳＯまたは他の適切な細胞凍結培地、例えばＨｅｓｐａｎおよびＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含有する場合、細胞を１℃／分の速度で－８０℃まで凍結させ、液体窒素貯蔵タンクの気相中に保存する。他の凍結方法を使用してもよく、－２０℃または液体窒素中で制御されずに直ちに凍結される方法を用いてもよい。
特定の態様では、凍結保存された細胞を解凍し、本明細書に記載のように洗浄し、室温で１時間静置してから本発明の方法を用いて活性化させる。
本明細書に記載されているような拡張された細胞が必要とされる前の時間における被験体由来の血液サンプルまたはアフェレーシス産物の採集も本発明の文脈において企図される。このように、増殖させる細胞の供給源は、必要な任意の時点で収集することができ、Ｔ細胞などの所望の細胞は、例えば本明細書に記載されるものを含むＴ細胞療法から利益を得るいくつかの疾患または状態のためのＴ細胞療法での後の使用のために単離され、凍結されることができる。一態様では、血液サンプルまたはアフェレーシスは、一般に健康な被験体から採取される。特定の態様では、血液サンプルまたはアフェレーシスは、疾患を発症する危険性があるが、まだ疾患を発症していない一般に健康な被験体から採取され、その後の使用のために目的の細胞が単離され、凍結される。特定の態様では、Ｔ細胞は、後に拡大され、凍結され、使用され得る。特定の態様では、本明細書に記載される特定の疾患の診断直後であるが、いずれかの治療の前に、患者からサンプルを収集する。さらなる態様では、細胞は、任意の数の関連する治療様式の前に被験体からの血液サンプルまたはアフェレーシスから単離され、治療様式には、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法剤、放射線、免疫抑制剤などの薬剤、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノラート、およびＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体、またはＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、サイトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８および照射のような他の免疫抑制剤による治療を含むがこれらに限定されない。
本発明のさらなる態様では、Ｔ細胞は、被験体に機能性Ｔ細胞を残す治療の直後の患者から得られる。これに関して、ある種の癌治療、特に患者が通常治療から回復している期間の治療の直後に、免疫系に損傷を与える薬物による治療後、得られるＴ細胞の質は最適であり得るまたはｅｘ ｖｉｖｏで増殖する能力が改善され得る。同様に、本明細書に記載の方法を用いたｅｘ ｖｉｖｏ操作後、これらの細胞は、生着の増強およびｉｎ ｖｉｖｏ拡大のための好ましい状態であり得る。したがって、本発明の文脈内では、この回復期の間に、Ｔ細胞、樹状細胞、または造血系統の他の細胞を含む血液細胞を収集することが企図される。さらに、特定の態様では、動員（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）（例えば、ＧＭ－ＣＳＦを用いた動員）およびコンディショニングレジメンを使用して、再集合、再循環、再生および／または特定の細胞型の拡大が好ましい治療後の定義された時間枠を作成することができる。例示的な細胞種には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、および免疫系の他の細胞が含まれる。
Ｔ細胞の活性化と拡大
Ｔ細胞は、一般に、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号；第６，５３４，０５５号；第６，９０５，６８０号；第６，６９２，９６４号；第５，８５８，３５８号；第６，８８７，４６６号；第６，９０５，６８１号；第７，１４４，５７５号；第７，０６７，３１８号；第７，１７２，８６９号；第７，２３２，５６６号；第７，１７５，８４３号；第５，８８３，２２３号；第６，９０５，８７４号；第６，７９７，５１４号；第６，８６７，０４１；および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載されている。
一般に、本発明のＴ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤と、Ｔ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドとを接触させることによって増殖させることができる。特に、Ｔ細胞集団は、例えば、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメント、または表面に固定化された抗ＣＤ２抗体との接触、またはプロテインキナーゼＣ活性化剤と（例えば、ブリオスタチン）をカルシウムイオノフォアと組合せとの接触によるなど、本明細書に記載されるように刺激され得る。Ｔ細胞の表面上の補助分子の共刺激のために、補助分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の増殖を刺激するために適切な条件下で、Ｔ細胞の集団を抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するための、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体。抗ＣＤ２８抗体の例としては、９．３、Ｂ－Ｔ３、ＸＲ－ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、ブザンソン、フランス）が挙げられ、これを、当該技術分野で一般的に知られている他の方法として使用することができる（Ｂｅｒｇら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５－３９７７，１９９８；Ｈａａｎｅｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８，１９９９；Ｇａｒｌａｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２２７（１－２）：５３－６３，１９９９）。
特定の態様では、一次刺激シグナルおよびＴ細胞の共刺激シグナルは、異なるプロトコルによって提供され得る。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中に存在していてもよいし、表面に結合していてもよい。表面に結合される場合、薬剤は同じ表面に（すなわち、「シス」形成において）または分離された表面で（すなわち、「トランス」形成において）結合され得る。あるいは、一方の薬剤を表面に結合させ、他方の薬剤を溶液に結合させることができる。一態様では、共刺激シグナルを提供する薬剤は細胞表面に結合し、一次活性化シグナルを提供する薬剤は溶液または表面に結合される。特定の態様では、両方の薬剤を溶液状態にすることができる。１つの態様において、薬剤は可溶性形態であり得、次いで、Ｆｃ受容体を発現する細胞または薬剤に結合する抗体または他の結合剤などの表面に架橋され得る。この観点で、例えば、本発明においてＴ細胞を活性化し、増殖させる際に使用することが企図されている人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）について、米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号および第２００６００３４８１０号を参照のこと。
一態様では、２つの薬剤は、同じビーズに、すなわち「シス」で、または別個のビーズに、すなわち「トランス」で、ビーズ上に固定化される。一例として、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントであり、共刺激シグナルを提供する薬剤は、抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合フラグメントであり、両方の薬剤が同等の分子量で同じビーズに共固定化される。一態様では、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖およびＴ細胞増殖のためにビーズに結合した各抗体の１：１の比が使用される。本発明の特定の態様において、ビーズに結合した抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は、１：１の比を用いて観察された増殖と比較してＴ細胞増殖の増加が観察されるように使用される。１つの特定の態様では、１：１の比を用いて観察された膨張と比較して、約１～約３倍の増加が観察される。一態様では、ビーズに結合したＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は、１００：１～１：１００の範囲であり、その間の全ての整数値である。本発明の一態様では、より多くの抗ＣＤ２８抗体が抗ＣＤ３抗体よりも粒子に結合しており、すなわちＣＤ３：ＣＤ２８の比が１未満である。本発明の特定の態様では、ビーズに結合した抗ＣＤ２８抗体と抗ＣＤ３抗体の比は２：１より大きい。一態様では、ビーズに結合した抗体の１：１００のＣＤ３：ＣＤ２８比が使用される。一態様では、ビーズに結合した抗体の１：７５のＣＤ３：ＣＤ２８比が使用される。さらなる態様では、ビーズに結合した抗体の１：５０のＣＤ３：ＣＤ２８比が使用される。一態様では、ビーズに結合した抗体の１：３０ＣＤ３：ＣＤ２８比が使用される。１つの好ましい態様では、ビーズに結合した抗体の１：１０のＣＤ３：ＣＤ２８比が使用される。一態様では、ビーズに結合した抗体の１：３のＣＤ３：ＣＤ２８比が使用される。さらに一つの態様では、ビーズに結合した抗体の３：１のＣＤ３：ＣＤ２８比が使用される。
細胞に対する粒子の１：５００～５００：１の比およびその間の任意の整数値を用いて、Ｔ細胞または他の標的細胞を刺激することができる。当業者であれば容易に理解できるように、細胞に対する粒子の比は、標的細胞に対する粒子の大きさに依存し得る。例えば、小さなビーズは数個の細胞にしか結合できず、大きなビーズは多くの細胞に結合することができる。特定の態様では、細胞対粒子の比は１：１００～１００：１の範囲内であり、さらなる態様では、比は１：９～９：１を含み、その間の任意の整数値を含み、Ｔ細胞を刺激するために使用することもできる。Ｔ細胞刺激を引き起こすＴ細胞に対する抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８に結合した粒子の比率は、上述のように様々であってもよいが、特定の好ましい値としては、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１および１５：１が挙げられ、１つの好ましい比率は、Ｔ細胞あたり少なくとも１：１の粒子比率である。一態様では、細胞に対する粒子の比が１：１以下である。１つの特定の態様では、好ましい粒子：細胞比は１：５である。さらなる態様において、細胞に対する粒子の比は、刺激の日に応じて変化させることができる。例えば、１つの態様において、細胞に対する粒子の比は、最初の日に１：１から１０：１であり、そして追加の粒子は、最終比で、毎日またはその後１日おきに最大１０日間、細胞に添加される１：１～１：１０（添加日の細胞数に基づく）である。１つの特定の態様では、細胞に対する粒子の比は、刺激の第１日に１：１であり、刺激の第３日および第５日に１：５に調節される。一態様では、粒子は、１日目に１：１、刺激の３日目および５日目に１：５の最終比まで毎日または１日おきに添加される。一態様では、細胞に対する粒子の比は、刺激の第１日に２：１であり、刺激の第３および第５日に１：１０に調節される。一態様では、粒子は、１日目に１：１、刺激の３日目および５日目に１：１０の最終比まで毎日または１日おきに添加される。当業者は、様々な他の比が本発明での使用に適していることを理解するであろう。特に、比は、粒径および細胞の大きさおよび種類に依存して変化する。１つの態様では、使用のための最も典型的な比は、最初の日に１：１、２：１および３：１の近傍にある。
本発明のさらなる態様において、Ｔ細胞などの細胞を薬剤被覆ビーズと組み合わせ、続いてビーズおよび細胞を分離し、次いで細胞を培養する。別の態様では、培養の前に、薬剤でコーティングされたビーズおよび細胞は分離されずに一緒に培養される。さらなる態様では、ビーズおよび細胞は、磁力のような力の適用によって最初に濃縮され、細胞表面マーカーのライゲーションが増加し、それによって細胞刺激が誘導される。
一例として、細胞表面タンパク質は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が結合した常磁性ビーズ（３×２８ビーズ）をＴ細胞と接触させることによって連結され得る。一態様では、細胞（例えば、１０４～１０９Ｔ細胞）およびビーズ（例えば、１：１の比のＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ常磁性ビーズ）を緩衝液、例えばＰＢＳカルシウムおよびマグネシウムのような二価カチオンを含まない）と合わせる。再度、当業者は、任意の細胞濃度を使用することができることを容易に理解することができる。例えば、標的細胞は、サンプル中で非常にまれであり、サンプルの０．０１％のみを含むか、または試料全体（すなわち、１００％）が目的の標的細胞を含み得る。したがって、任意の細胞数は、本発明の文脈内にある。特定の態様では、細胞と粒子の最大限の接触を確実にするために、粒子および細胞が一緒に混合される（すなわち、細胞の濃度を増加させる）体積を有意に減少させることが望ましい場合がある。例えば、一態様では、約２０億個の細胞／ｍｌの濃度が使用される。一態様では、１億個の細胞／ｍｌを超える細胞が使用される。さらなる態様では、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万または５０００万細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。さらに一態様では、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万または１億個の細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。さらなる態様において、１億２５００万個または１億５０００万個の細胞／ｍｌの濃度が使用され得る。高濃度を使用すると、細胞収量、細胞活性化、および細胞拡張が増加する可能性がある。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞のような目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞のより効率的な捕捉を可能にする。そのような細胞の集団は、治療上の価値を有し得、特定の態様において得ることが望ましいであろう。例えば、高濃度の細胞を使用することにより、通常より弱いＣＤ２８発現を有するＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択が可能になる。
本発明の１つの態様において、混合物は、数時間（約３時間）～約１４日間またはその間の任意の時間単位の整数値で培養され得る。一態様では、混合物を２１日間培養することができる。本発明の一態様では、ビーズおよびＴ細胞を約８日間一緒に培養する。一態様では、ビーズおよびＴ細胞を２～３日間一緒に培養する。Ｔ細胞の培養時間が６０日以上になるように、いくつかのサイクルの刺激もまた望まれ得る。Ｔ細胞培養に適切な条件には、血清（例えば、ウシ胎仔またはヒト血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦβおよびＴＮＦ－αまたは任意のもの（例えば、当業者に公知の細胞の成長のための他の添加剤を含みうる適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ－ｖｉｖｏ １５（Ｌｏｎｚａ））が含まれる。細胞増殖のための他の添加剤には、界面活性剤、プラスマネート、およびＮ－アセチル－システインおよび２－メルカプトエタノールなどの還元剤が含まれるが、これらに限定されない。培地には、添加アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンを含むＲＰＭＩ １６４０、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ １５およびＸ－Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを含むことができ、Ｔ細胞の成長および増殖に十分な量の血清（または血漿）または所定のホルモンセットおよび／またはサイトカインの量を補充することができる。ペニシリンおよびストレプトマイシンなどの抗生物質は、被験体に注入される細胞の培養物ではなく、実験的培養物にのみ含まれる。標的細胞は、例えば適切な温度（例えば、３７℃）および大気（例えば、空気＋５％ＣＯ２）などの増殖を支持するのに必要な条件下で維持される。
様々な刺激時間に曝露されたＴ細胞は、異なる特性を示し得る。例えば、典型的な血液またはアフェレーシス末梢血単核細胞産物は、細胞傷害性または抑制性Ｔ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）よりも大きいヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３およびＣＤ２８受容体を刺激することによるＴ細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの拡大では、約８～９日前にＴＨ細胞が主になり、約８～９日後にＴ細胞集団がますます多くの集団を含み、Ｔ細胞集団は、ＴＣ細胞の大きな集合を含む。したがって、治療の目的に応じて、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を被験体に注入することが有利であり得る。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットが単離されている場合、このサブセットをより大きく拡大することが有益であり得る。
さらに、ＣＤ４およびＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーは大きく変化するが、大部分は、細胞拡張プロセスの過程で再現可能に変化する。したがって、そのような再現性は、特定の目的のために活性化されたＴ細胞産物を調整する能力を可能にする。
ＰＳＭＡ ＣＡＲが構築されると、抗原刺激後にＴ細胞を増殖させる能力、再刺激がない場合にＴ細胞増殖を維持する能力、適切なｉｎ ｖｉｔｒｏおよび動物モデルにおける抗癌活性などの分子の活性を評価するために様々なアッセイが使用されうる。ＰＳＭＡ ＣＡＲの効果を評価するためのアッセイは、以下にさらに詳細に記載される
一次Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現のウェスタンブロット分析を用いて、モノマーおよびダイマーの存在を検出することができる。例えば、Ｍｉｌｏｎｅら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７（８）：１４５３－１４６４（２００９）を参照のこと。非常に簡単に説明すると、ＣＡＲを発現するＴ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の１：１混合物）を１０日間以上ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させ、続いて還元条件下で溶解およびＳＤＳ－ＰＡＧＥを行う。完全長ＴＣＲ－ζ細胞質ドメインおよび内因性ＴＣＲ－ζ鎖を含むＣＡＲは、ＴＣＲ－ζ鎖に対する抗体を用いたウェスタンブロッティングによって検出される。同じＴ細胞サブセットを非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に使用して、共有結合性のダイマー形成の評価を可能にする。
抗原刺激後のＣＡＲ＋Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ拡大は、フローサイトメトリーによって測定することができる。例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物をαＣＤ３／αＣＤ２８ａＡＰＣで刺激し、続いて分析すべきプロモーターの制御下でＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターで形質導入する。例示的なプロモーターには、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子、ＥＦ－１α、ユビキチンＣ、またはホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが含まれる。
再刺激がない場合の持続的なＣＡＲ＋Ｔ細胞拡大も測定することができる。例えば、Ｍｉｌｏｎｅら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７（８）：１４５３－１４６４（２００９）を参照のこと。簡単に述べると、０日目にαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズで刺激し、１日目に示されたＣＡＲで形質導入した後、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ＩＩＩ粒子計数器を用いて培養の８日目に平均Ｔ細胞量（ｆｌ）を測定する。
ＰＳＭＡ標的二重特異性抗体
天然の抗体とは異なり、二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、２つの異なる腫瘍抗原、すなわち１つは腫瘍細胞上の抗原で他方はエフェクター細胞上の抗原を標的とする二重特異性を有し、免疫細胞を腫瘍部位に効率的に補充してそれらを活性化して腫瘍細胞を特異的に殺すことができる人工抗体である。前者の例、すなわち２つの異なる腫瘍関連抗原を標的とするＢｓＡｂは、Ｈｅｒ２とＶＥＧＦに同時に結合するｂＨ１である（Ｂｏｓｔｒｏｍ Ｊ１ら、２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２３：１６１０－４）か、またはＥｒＢｂ２／ＥｒＢｂ３を二重に標的化する二重特異性ｓｃＦｖと同時に結合する（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＭＫら、２００８，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ９９：１４１５－２５）。２つの腫瘍関連抗原は、両方が腫瘍細胞で発現することができ、または１方が腫瘍細胞で、他方は腫瘍細胞関連細胞、例えば腫瘍微小環境細胞、例えば、線維芽細胞、血管細胞、内皮細胞、周皮細胞または腫瘍微小環境内の免疫細胞（マクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞など）で発現することもできる。後者の例、すなわち、１つの腫瘍関連抗原および免疫不安定抗原を標的とするＢｓＡｂは、Ｈｅｒ２、ＣＤ１９またはＣＤ１２３などの腫瘍抗原を標的とする一方のアームと、ＣＤ３またはＣＤ１６などの免疫活性化可能な抗原を標的とする他方のアームを有し、腫瘍細胞およびＴ細胞、ＮＫ細胞またはマクロファージなどの免疫細胞に関与することができるＢｓＡｂである（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＲＥら、２０１５、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ２０：８３８－８４７）。
抗ＣＤ３抗体を含むＢｓＡｂは、Ｔ細胞および腫瘍細胞と共に繋がり、腫瘍細胞（Ｍｕｌｌｅｒ ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ、ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２０１０； ２４：８９－９８、Ｂａｅｕｅｒｌｅ ａｎｄ Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ ２００９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９６：４９４１）活性化Ｔ細胞を死滅させる。Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ（Ｂａｒｇｏｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００８，３２１：９７４－９７６）は、ＣＤ１９およびＣＤ３を標的とすることによって細胞傷害性を誘導するＢｉＴＥと命名された一本鎖抗体構築物である。他の抗体フラグメントに基づくＴ細胞が関与する二重特異性物質が記載されている（Ｍｏｏｒｅら、２０１１，Ｂｌｏｏｄ １１７：４５４２－４５５１，Ｂａｅｕｅｒｌｅら、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２００９，１１：２２－３０）。ＢｉＴＥ（商標）フォーマットは、２つの異なる抗体由来の可変ドメインを連結する二重特異性一本鎖抗体構築物である。しかしながら、ブリナツモマブは、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が低く、生産および安定性の点で製造が困難である。したがって、Ｔ細胞を腫瘍細胞に標的化することができ、改善された製造可能性を有する、改善された二重特異性抗体が必要とされている。
ＢｓＡｂは、化学的架橋、ハイブリドーマ技術または遺伝的方法によって生成され得るハイブリッドタンパク質である。化学架橋法では、２種類のモノクローナル抗体およびそのフラグメントを還元体により解離させ、一価抗体およびそのフラグメントを生成させた。得られたＢｓＡｂは、異なる親抗体由来の２つの一価抗体およびそのフラグメントの化学的架橋によって構築される。この戦略は、ＢｓＡｂを大量に迅速に生産するために使用することができるが、架橋中にＢｓＡｂを不活性化することがあり、製品の均質性を保証することは困難である。ＢｓＡｂの産生のための別の戦略は、１つのモノクローナル抗体を分泌する確立されたハイブリドーマ細胞株を他の抗原で免疫化した脾臓細胞に融合させるハイブリドーマ技術または２つの異なるモノクローナル抗体を分泌する２つの確立されたハイブリドーマ細胞株を融合させてハイブリッドハイブリドーマを作製する。前者の結果のハイブリドーマは、二量体ハイブリドーマおよび四量体ハイブリドーマと呼ばれる。一般に、ハイブリドーマ技術によって産生されたＢｓＡｂは、高い生物活性を維持する。しかしながら、この手順は退屈で時間がかかり、ＢｓＡｂを同時に生成される他の非活性かつ望ましくない抗体から単離することは容易ではない。これらのＢｓＡｂフォーマットは、予測可能な別の問題に直面した。ＢｓＡｂに含まれる大きすぎるサイズおよびマウス成分は患者において免疫原性であり、臨床でこれらのＢｓＡｂの再使用を妨げるヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）の産生を誘導する。さらに、ＢｓＡｂのこれらの形式の製造および精製は高価であり、これはクリニックでのＢｓＡｂの適用を制限する。これらの伝統的な方法を遺伝子組換え手法に置き換えることは、この分野における進歩を加速させる。小分子抗体の技術に基づいて、遺伝子工学によるＢｓＡｂの生産は、プロセスの安定性、大規模生産、低コストおよび使い易さなど、上述のものよりも利点がある。遺伝子工学は、２つの異なる種類のｓｃＦｖを連結することにより様々な小分子ＢｓＡｂ形式の開発に繋がった。異なるリンクによって分類される３種類のＢｓＡｂフォーマットがある。（１）ミニ抗体は、オリゴマー化ドメイン（例えば、ＦｏｓまたはＪｕｎ転写因子由来のロイシンジッパーモチーフ）とともに２つのｓｃＦｖフラグメントを連結することによって組み立てられたヘテロダイマーである。（２）二重特異性抗体は、両方とも、同じ鎖からのＶ－ドメイン間の対形成を可能にするには短すぎる短いリンカーによって接続された２つの単鎖ＶＨ１－ＶＬ２およびＶＨ２－ＶＬ１によって構築される非共有結合性の二量体である。したがって、各鎖のみが抗原に結合することはできないが、２つの鎖（ＶＨ１－ＶＬ２およびＶＨ２－ＶＬ１）の同時発現は、２種類の抗原に結合し得るヘテロ二量体ダイアボディの集合をもたらす。（３）ＳｃＢｓＡｂ：異なる特異性を有する２つの異なるｓｃＦｖを連結するためにインターリンカーを用い、単一のポリペプチドとしてＳｃＢｓＡｂを宿主細胞で発現させた。ｓｃＦｖ内の２つのドメイン間のイントラリンカーはしばしば（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３である。２つのｓｃＦｖ間のインターリンカーに関しては、それを設計するための２つの戦略がある。異種可変領域間の誤った結合を回避する目的で、インターリンカーは、しばしば、Ｇｌｙ４Ｓｅｒのような１０未満のアミノ酸残基の短いペプチドリンカーである。もう一つの戦略は、インターリンカーのために長いリンカーを選択することである。言い換えれば、インターリンカーを設計するために最も重要なことは、可変ドメイン間の適切な対合とタンパク質の折りたたみを保証し、生物学的活性および安定性を維持するＢｓＡｂの形成をもたらすことである。精製を容易にし、血漿半減期を延長するためのいくつかの新規な特性が導入されるべきである。
ＢｓＡｂ媒介免疫療法は、腫瘍の臨床的生物療法において有望な役割を果たす。ＢｓＡｂによって媒介される腫瘍死滅効果は、免疫系を刺激することに基づいており、腫瘍に非常に特異的であり、ＭＨＣ制限がない。したがって、ＢｓＡｂ介在療法は、手術、放射線療法および化学療法などの伝統的方法の相補性である。ＢｓＡｂは、腫瘍を治癒するだけでなく、免疫系を刺激して、長期にわたり免疫保護を提供し、維持する。マウスおよび臨床の実験結果に基づき、治験用途で調製された最適なＢｓＡｂは、以下のような少なくとも５つの特徴を有する。（１）高い特異性および親和性を有する関連腫瘍抗原を標的とする。（２）ＢｓＡｂが腫瘍抗原に結合するときにのみ、エフェクター細胞－細胞毒性細胞に対する因子の引き金となるように結合し、架橋を生じることができる。（３）ＢｓＡｂは、腫瘍部位での白血球の対応する群によって選択的に産生される、効果的な細胞毒性および炎症を促進することができる。（４）ＢｓＡｂは、繰り返し使用した後のヒト抗マウス応答の誘発を最小限にするためにヒト化されなければならない。最後に、（５）ＢｓＡｂは、腫瘍に浸透するほど十分に小さいだけではなく、十分な時間、血中に保持されるのに十分なほど大きくなければならない。
上記の点に基づいて、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞、単球、巨大痛、好中球、ＬＡＫ細胞（リンホカイン活性化細胞傷害性細胞）およびＴＩＬ細胞（腫瘍浸潤リンパ球）などを含む多数の種類の免疫エフェクター細胞を誘発し、異なる腫瘍細胞を標的とする多数のＢｓＡｂが開発されてきた。Ｔ細胞は、免疫応答の主要な特異的細胞として一般に認識されている。全ての成熟Ｔ細胞の表面上に発現されるＣＤ３は、Ｔ細胞の共通の表面マーカーである。ＣＤ３はＴＣＲに非共有結合的に結合し、ＴＣＲ－ＣＤ３複合体全体を形成し、抗原刺激に対する免疫応答に関与する。現在、ＣＤ３は免疫エフェクター細胞上の表面トリガー分子であり、最も広く、効果的に使用されている。ＢｓＡｂ内の抗ＣＤ３抗体がＴ細胞表面上のＣＤ３分子に結合すると、腫瘍細胞を殺すために以下のような多くの作用が生じる。これらの作用には、（１）Ｔ細胞の増殖および分化が含まれる。まず、ＢｓＡｂは残りのＴ細胞を活性化し、早熟エフェクターＴ細胞に由来するＴｈ細胞およびＴｃ細胞をＣＤ４＋またはＣＤ８＋で得ることができる。第二に、ＢｓＡｂは、腫瘍細胞を攻撃し殺すエフェクターＴ細胞に増殖し、分化するために多数の記憶細胞を活性化することができる。エフェクター細胞の数は、腫瘍排除の速度に直接関係している。（２）サイトカインの放出：ＢｓＡｂによって活性化されたＣＤ４＋Ｔｈ細胞は、大量のＩＬ－２を分泌することができる。ＩＬ－２は、自己分泌におけるＴｈ細胞の増殖を刺激するだけでなく、傍分泌において未処理のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化してＴｃ細胞になり、Ｔｃ細胞の細胞傷害性の拡大をもたらす。さらに、ＩＬ－２は、Ｔ細胞を活性化するための共刺激シグナルである。したがって、ＩＬ－２は、ＢｓＡｂ媒介性免疫作用において重要な役割を果たす。ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γなどのいくつかの他のサイトカインは、Ｔ細胞活性化の過程で産生され、細胞間の培地を介して「スタンバイ」腫瘍細胞の増殖を阻害することによって「スタンバイ」効果を生じさせることができる。（３）細胞毒性：ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験は、ＢｓＡｂ、ＣＤ８＋Ｔｃによって媒介されることが腫瘍細胞と直接相互作用し、顆粒エキソサイトーシスによって細胞毒性物質を放出し、標的腫瘍細胞を溶解することを示すが、通常これは腫瘍細胞の標的化に続いて４－６時間以内に急速に行われる。細胞傷害性物質の主要成分は、パーフォリンおよびセリンイースターゼまたはグランザイムである。パーフォリンは原形質膜を攻撃してイオンチャネルを形成し、イオンと水が多く侵入し、細胞の溶解と壊死を引き起こし、一方でグランザイムは細胞内のＤＮａｓｅを活性化することができるリンホトキシンに類似しており、核ＤＮＡの溶解を引き起こし、標的細胞のアポトーシスをもたらす。
現在、Ｆｖフラグメントは、完全抗原結合部位を有する最小単位（抗体全体の約１／６）、Ｆｃドメインの非存在、低免疫原性、血管の壁および固形腫瘍への侵入容易性が含まれる。しかし、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間の共有結合は生成することができないため、Ｆｖは不安定であり、生体内で解離しやすい。Ｆｖフラグメントの安定性を改善するために、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドイントラリンカーを用いて、いわゆるＳｃＦｖを形成する。イントラリンカーは、一般に、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３のような長さが１５アミノ酸残基の短い柔軟なペプチドである。本発明の一実施形態では、前記イントラリンカーを抗ＣＤ３ ＳｃＦｖに使用し、異なるイントラリンカーを抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖに使用する。
標準的なＩｇＧフォーマットを有する二重特異性抗体は、４つの異なるポリペプチド鎖を含むため、産生が困難であり得る。より小さく、より容易に産生される二重特異性分子の有効性は、非ホジキンリンパ腫において臨床的に証明されている。例えば、Ｂａｒｇｏｕら、（２００８），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１（５８９１）：９７４－９７７を参照。
連続した静脈内注入による長期投与を使用して、この小さな一本鎖分子の生体内半減期が短いため、これらの結果を達成した。したがって、類似の治療効力を保持し、産生するのが容易であり、より長い半減期を含む好ましい薬物動態学的特性を有する二重特異性治療薬に対する必要性が当該分野において存在する。
本明細書に記載の二重特異性Ｆｃ（Ｂｓ－Ｆｃ）は、２つの異なるタンパク質に結合することができ、抗体のＦｃ領域またはその一部を含む。Ｂｓ－Ｆｃは、Ｆｃ領域を欠く二重特異性単鎖分子と比較して好ましい薬物動態学的特性を有することができる。Ｂｓ－Ｆｃによって結合された１つのタンパク質は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、好中球、またはマクロファージなどの免疫エフェクター細胞上で発現されてもよく、他のタンパク質は、標的細胞、例えば、癌細胞、病原体に感染した細胞、または線維症を引き起こす線維芽細胞のような疾患を媒介する細胞である。本明細書に記載のＢｓ－Ｆｃ分子は、標的細胞の存在下での免疫エフェクター細胞の活性化および／または免疫エフェクター細胞の存在下での標的細胞の死滅を誘発することができる。
一態様では、本明細書で提供されるのは、（ａ）式Ｖ１－Ｌ１－Ｖ２－Ｌ２－Ｖ３－Ｌ３－Ｖ４－Ｌ４－Ｆｃを有するポリペプチド鎖を含むことができるＢｓ－Ｆｃ（図２５Ａ～図２５Ｄ）ここで、ＦｃはＦｃポリペプチド鎖であり、ここでＶ１、Ｖ２、Ｖ３およびＶ４は異なるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン可変領域であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４はリンカーであり、Ｌ２および／またはＬ４は存在しても存在しなくてもよい（図２５Ａ）；または（ｂ）式Ｆｃ－Ｌ４－Ｖ１－Ｌ１－Ｖ２－Ｌ２－Ｖ３－Ｌ３－Ｖ４を有するポリペプチド鎖であって、ＦｃがＦｃポリペプチド鎖であり、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３およびＶ４がそれぞれ免疫グロブリン可変領域Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４がリンカーであり、Ｌ２および／またはＬ４が存在しても存在しなくてもよく、Ｆｃのジスルフィド結合がＮ末端（図２５Ｃ）またはＣ末端（図２５Ｄ）に存在し得る。Ｂｓ－Ｆｃは、免疫エフェクター細胞による標的細胞タンパク質を提示する標的細胞の細胞溶解を媒介し、免疫エフェクター細胞による標的細胞タンパク質を提示しない細胞の細胞溶解を媒介せず、および／またはＢｓ－Ｆｃは標的細胞および免疫エフェクター細胞に結合することができる。第１および第２のポリペプチド鎖中のＦｃポリペプチド鎖は、ヒトＩｇＧ Ｆｃポリペプチド鎖であってもよい。Ｖ１は、重鎖可変（ＶＨ）領域であってもよく、Ｖ２は、軽鎖可変（ＶＬ）領域であってもよい。代替の実施形態では、Ｖ１は、ＶＬ領域であってもよく、Ｖ２は、ＶＨ領域であってもよい。Ｖ３およびＶ４は、それぞれＶＨ領域およびＶＬ領域であってもよく、またはＶ３およびＶ４は、それぞれＶＬ領域およびＶＨ領域であってもよく、図２５Ｂは一例を示す。Ｌ１およびＬ３は、少なくとも１５アミノ酸長であってもよく、Ｌ２は、存在する場合、１２アミノ酸長未満であってもよい。Ｖ１およびＶ２は、それらがＩｇＧおよび／またはｓｃＦｖ抗体の一部である場合、標的細胞または免疫エフェクター細胞に結合することができ、Ｖ３およびＶ４は、それらがＩｇＧおよび／またはｓｃＦｖ抗体の一部である場合、標的細胞または免疫エフェクター細胞に結合することができる。
本発明において、Ｇｌｙ４ Ｓｅｒインターリンカーによって連結され、操作されたＩｇＧ４ Ｆｃに融合された一本鎖二重特異性抗体（ＳｃＢｓＡｂ）は循環寿命を延長するように構築された。
本発明の一実施形態では、ＳｃＢｓＡｂの２つのｓｃＦｖのうちの１つが抗ＣＤ３ ｓｃＦｖであった。本発明の一実施形態では、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、配列番号８２に示される核酸配列と、配列番号８３に示されるアミノ酸配列を有する、ＯＫＴ３抗体に由来していた。本発明の一実施形態では、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、配列番号８８に示される核酸配列と、配列番号８９に示されるアミノ酸配列を有する、ヒト化ＯＫＴ３抗体に由来していた。
一実施形態では、ＳｃＢｓＡｂの他のｓｃＦｖは、ＰＳＭＡを標的とする。一実施形態では、抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖは、本明細書の他の箇所に記載されるように、ｇｙ１、ｇｙ１－ｓｔ、ｇｙ１－２またはｇｙ１－３である。例えば、一実施形態では、ＢｓＡｂのＰＳＭＡ結合部分は、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９および配列番号５１のうち１つ以上を含む。特定の実施形態では、ＢｓＡｂのＰＳＭＡ結合部分は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８および配列番号５０のうち１つ以上のヌクレオチド配列によってコードされる。
本発明の一実施形態では、ＳｃＢｓＡｂ中の抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖは、記載されるｇｙ１またはｇｙ１バリアントと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％を超える相同性を有するアミノ酸配列を有する。
ＳｃＢｓＡｂの循環寿命を延ばすために、サイズは、糸球体濾過の分子量カットオフ、すなわち約６０ｋＤａを超えるように増加させなければならない（Ｐｉｓａｌ ＤＳら、２０１０、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．９９：２５５７－２５７５）。タグまたは融合タンパク質の中で、Ｆｃは、目的のタンパク質のサイズを拡大するだけでなく、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との相互作用によって循環時間を延長するため、完全である。したがって、本発明の一実施形態では、ＦｃドメインがＳｃＢｓＡｂに融合された。本発明の別の実施形態では、ＩｇＧ４ ＦｃをＳｃＢｓＡｂに融合させた。
ＣＤ３上のＢｓＡｂの結合は、これらの機能を介してＴ細胞の枯渇を引き起こすので、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ機能はＢｓＡｂにおいて望ましくない。ＩｇＧ４はＣ１ｑに結合しないので、ＣＤＣは存在しない。さらに、ＩｇＧ４は、ＦｃγＲＩＩｂの阻害に対して比較的高い親和性を保持しながら、ＦｃγＲを活性化する親和性が低く、したがってＩｇＧ４は非常に弱いＡＤＣＣを有する。ＡＤＣＣを完全に排除するために、Ｆｃ受容体へのＩｇＧ４の結合を阻害するために、Ｎ２９７をＡ２９７に変異させた。しかし、ＦｃＲｎへのＩｇＧ結合はＦｃグリコシル化に依存しないので、Ｎ２９７Ａ変異は、ＩｇＧ４ Ｆｃ融合タンパク質の半減期に影響しない。本発明の一実施形態では、Ｎ２９７Ａ変異ＩｇＧ４ ＦｃをＳｃＢｓＡｂに融合させて循環寿命を延長する。核酸およびアミノ酸配列を配列番号９６および９７に示した。
ヒンジ領域のＳ２２８とＩｇＧ４のＣＨ３のＲ４０９の両方が、ＩｇＧ４のＦａｂアーム交換（ＦＡＥ）に必要であり、これは治療的ＩｇＧ４抗体ナタリズマブで観察されるような生理学的条件で起こる。そこで、ＦＡＥを避けるために、ＳｃＢｓＡｂとＦｃの間にＩｇＧ１ヒンジを使用した。ＩｇＧ１ヒンジの使用のもう一つの利点は、ＩｇＧ１ヒンジがＩｇＧ４（１２ａａ）より長い（１５アミノ酸）ので、より柔軟であるということである。ジスルフィド結合のミスマッチを避けるために、ＣＬを用いたＦａｂ形成に関与するＣ２２０はＡ（Ｃ２２０Ａ）に変異させている。したがって、本発明の一実施形態では、ＳｃＢｓＡｂとＦｃとの間のリンカーはＩｇＧ１ヒンジであり；別の具体的な実施形態では、ＳｃＢｓＡｂとＦｃとの間のリンカーは、Ｃ２２０Ａが付加されたＩｇＧ１ヒンジであり、その核酸配列およびアミノ酸配列は、配列番号９４および９５に示される。
本発明の一実施形態では、ＳｃＢｓＡｂ発現のための発現ベクターは、以下の５つの選択肢から選択される発現カセットを有する：
カセット１：（Ｋｏｚａｋ）－ＳＰ－ＭＣＳ－Ｇ４Ｓ－ｓｃＦｖ２－ｍＩｇＧ１ヒンジ－ｍＩｇＧ４ Ｆｃ
カセット２：ＳＰ－ＭＣＳ－Ｇ４Ｓ－ｓｃＦｖ２－ｍＩｇＧ１ヒンジ－ｍＩｇＧ４ Ｆｃ
カセット３：（Ｋｏｚａｋ）－ＳＰ－ｓｃＦｖ１－Ｇ４Ｓ－ｓｃＦｖ２－ｍＩｇＧ１ヒンジ－ｍＩｇＧ４ Ｆｃ
カセット４：ＳＰ－ｓｃＦｖ１－Ｇ４Ｓ－ｓｃＦｖ２－ｍＩｇＧ１ヒンジ－ｍＩｇＧ４ Ｆｃ
カセット５：ｓｃＦｖ１－Ｇ４Ｓ－ｓｃＦｖ２－ｍＩｇＧ１ヒンジ－ｍＩｇＧ４ Ｆｃ
（略称：ＳＰ：シグナルペプチド；ＭＣＳ：マルチクローンサイト；ｍＩｇＧ１ヒンジ：変異ＩｇＧ１ヒンジ；ｍＩｇＧ４ Ｆｃ：変異ＩｇＧ４ Ｆｃ）
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号９９のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、組成物は、配列番号９９をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明の特定の一実施形態では、組成物は、配列番号９８をコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、組成物は、配列番号１０１をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明の特定の一実施形態では、組成物は、配列番号１００をコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号１０３のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、組成物は、配列番号１０３をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明の特定の一実施形態では、組成物は、配列番号１０２をコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、抗ＰＳＭＡおよび抗ＣＤ３ ＳｃＢｓＡｂは、配列番号１０５のアミノ酸、またはそれに対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％を超える相同性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、抗ＰＳＭＡおよび抗ＣＤ３ ＳｃＢｓＡｂは、配列番号１０６のアミノ酸、またはそれに対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％を超える相同性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、抗ＰＳＭＡおよび抗ＣＤ３ ＳｃＢｓＡｂは、配列番号１０８のアミノ酸、またはそれに対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％を超える相同性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、抗ＰＳＭＡおよび抗ＣＤ３ ＳｃＢｓＡｂは、配列番号１０９のアミノ酸、またはそれに対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％を超える相同性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ＢｓＡｂ発現ベクターは、配列番号１０４の核酸配列、または配列番号１０５のアミノ酸配列をコードする核酸配列またはそれに対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％を超える相同性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
一実施形態では、ＢｓＡｂ発現ベクターは、配列番号１０７の核酸配列、または配列番号１０８のアミノ酸配列をコードする核酸配列またはそれに対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％を超える相同性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
ネズミ抗体に由来するほとんどのネズミ抗体またはＢｓＡｂについては、ネズミ抗体によって誘発されたヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）の問題は、臨床での反復使用および用量を強く制限する。マウス抗体は、それらの異種性を最小化するためにヒト化されなければならない。これは、臨床で使用される抗体の調製のための緊急事態である。本発明で使用される抗ＰＳＭＡ ＳｃＢｓＡｂにおけるＣＤ３分子に対するｓｃＦｖはヒト化ｓｃＦｖであり、ＰＳＭＡ ｓｃＦｖはＢｓＡｂの免疫原性を有意に最小限に抑え、癌治療の全結果を改善する完全ヒト抗体である。
併用療法
本明細書に記載の抗体、抗体フラグメント、ＡＤＣ、ＣＡＲ発現細胞、または二重特異性抗体を含む組成物は、他の公知の薬剤および療法と組み合わせて使用することができる。本明細書中で使用されるように、「組合せ」とは、２つ（またはそれ以上）の異なる処置が、障害による被験体の苦痛の経過中に被験体に送達されることを意味し、例えば、２つ以上の処置は、障害が診断された後、障害が治癒または排除される前、または治療が他の理由で中止される前に投与される。いくつかの実施形態では、１つの治療の送達は、投与に関して重複するように、第２の送達が開始されたときにもなお継続している。これは、本明細書では「同時」または「同時送達」と呼ばれることがある。他の実施形態では、一方の治療の送達は、他方の治療の送達が始まる前に終了する。どちらの場合もいくつかの実施形態では、併用投与のために、治療がより効果的である。例えば、第２の治療がより効果的である、例えば、第２の治療のより少ない量で同等の効果が見られ、または第２の治療が、第１の治療の存在なしで投与された場合よりも、もしくは第１の治療で見られる類似の状況よりも、より大きい程度で症状を減少させる。いくつかの実施形態では、症状の低下または障害に関連する他のパラメータが、他の治療の不存在下で送達される１つの治療で観察されるものよりも大きくなるような送達が行われる。２つの処理の効果は、部分的に相加的、完全に相加的、または相加的よりも大きいことがある。送達は、送達される第１の治療の効果が、第２の送達が送達されたときに依然として検出可能なものであり得る。
本明細書に記載の抗体、抗体フラグメント、ＡＤＣ、ＣＡＲ発現細胞または二重特異性抗体および少なくとも１つのさらなる治療剤を含む組成物は、同時に、同じまたは別々の組成物で、または逐次投与することができる。逐次投与の場合、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞を最初に投与し、追加の薬剤を２回投与してもよいし、投与順序を逆にしてもよい。
さらなる態様では、本明細書に記載の抗体、抗体フラグメント、ＡＤＣ、ＣＡＲ発現細胞、または二重特異性抗体を含む組成物は、手術、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノラート、およびＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体、またはＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体または他の抗体療法などの免疫除去剤、サイトキン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、および照射、ペプチドワクチン、例えば、Ｉｚｕｍｏｔｏら、２００８ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ １０８：９６３－９７１などと組み合わせた処置レジメンで使用されうる。
一実施形態では、本明細書に記載の抗体、抗体フラグメント、ＡＤＣ、ＣＡＲ発現細胞、または二重特異性抗体を含む組成物は、化学療法剤と組み合わせて使用することができる。例示的な化学療法剤には、抗アンドロゲン（アンドロゲンアンタゴニスト）、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン（例えば、リポソームドキソルビシン）、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、デカルバジン、メルファラン、イフォスファミド、テモゾロミド）、免疫細胞抗体（例えば、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、トシツモマブ）、代謝拮抗物質（例えば、葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類似体、プリン類似体およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤（例えばフルダラビン））、ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦＲグルココルチコイド誘発ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）アゴニスト、プロテアソーム阻害剤（例えばアクラシノマイシンＡ、グリオトキシンまたはボルテゾミブ）、サリドマイドまたはサリドマイド誘導体（例えば、レナリドマイド）などの免疫調節薬が挙げられる。
併用療法に組み合わせて使用するために考慮される一般的な化学療法剤としては、（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））、ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ（登録商標））、硫酸ブレオマイシン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））、ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標））、ブスルファン注射剤（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標））、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、Ｎ４－ペントキシカルボニル－５－デオキシ－５－フルオロシチジン、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））、クラドリビン（Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）またはＮｅｏｓａｒ（登録商標））、シタラビン、シトシンアビニシド（Ｃｙｔｏｓａｒ－Ｕ（登録商標）、シタラビンリポソーム注射剤（ＤｅｐｏＣｙｔ（登録商標））、デカルバジン（ＤＴＩＣ－Ｄｏｍｅ（登録商標））、ダクチノマイシン（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ、Ｃｏｓｍｅｇａｎ）、塩酸ダウノルビシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））、クエン酸ダウノルビシンリポソーム注射剤（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））、デキサメタゾン、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、塩酸ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｒｕｂｅｘ（登録商標））、エトポシド（Ｖｅｐｅｓｉｄ（登録商標））、リン酸フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａ（登録商標））、５－フルオロウラシル（Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標）、Ｅｆｕｄｅｘ（登録商標））、フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標））、テキサシチン、ゲムシタビン（ジフルオロデオキシシチジン）、ヒドロキシウレア（Ｈｙｄｒｅａ（登録商標））、（イデアマイシン（登録商標））、イフォスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、Ｌ－アスパラギナーゼ（ＥＬＳＰＡＲ（登録商標））、ロイコボリンカルシウム、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））、６－メルカプトプリン（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（登録商標））、メトトレキサート（Ｆｏｌｅｘ（登録商標））、ミトキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））、ミロタルグ、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、フェニックス（Ｙｔｔｒｉｕｍ９０／ＭＸ－ＤＴＰＡ）、ペントスタチン、ポリフェプロサン２０カルムスチンインプラント（Ｇｌｉａｄｅｌ（登録商標））、クエン酸タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標））、テニポシド（Ｖｕｍｏｎ（登録商標））、６－チオグアニン、チオテパ、チラパザミン（Ｔｉｒａｚｏｎｅ（登録商標））、注射用塩酸トポテカン（ＨｙＣａｍｐｔｉｎ（登録商標））、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、およびビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））を含むが、これらに限定されるものではない。
例示的な抗アンドロゲン（アンドロゲンアンタゴニスト）剤には、ビカルタミド、ゴセレリンアセテートＳＲ Ｄｅｐｏが含まれる。
例示的なアルカリ化剤としては、限定されないが、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキル誘導体、アルキルスルフォネート、ニトロソウレアおよびトリアゼン、ウラシルマスタード（Ａｍｉｎｏｕｒａｃｉｌ Ｍｕｓｔａｒｄ（登録商標）、Ｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎａｃｉｌ（登録商標）、Ｄｅｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｄｅｓｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｈａｅｍａｎｔｈａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｎｏｒｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｕｓｔａｒｄ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌｌｏｓｔ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌｍｏｓｔａｚａ（登録商標）、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎ（登録商標）、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ（登録商標））、クロルメチン（Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標）、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｃｌａｆｅｎ（登録商標） Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（商標）、イフォスファミド（Ｍｉｔｏｘａｎａ（登録商標））、メルファラン（アルケカン（登録商標））、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、ピポブルマン（Ａｍｅｄｅｌ（登録商標）、 Ｖｅｒｃｙｔｅ（登録商標））、トリエチレンメラミン（Ｈｅｍｅｌ（登録商標）、Ｈｅｘｙｌｅｎ（登録商標）、Ｈｅｘａｓｔａｔ（登録商標））、トリエチレンチオホスホラミン、テモゾロマイド（Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標））、チオテパ（Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標））、ブスルファン（Ｂｕｓｉｌｖｅｘ（登録商標）、Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標）、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、ロムスチン（ＣｅｅＮＵ（登録商標））、ストレプトゾシン（Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標））およびダカルバジン（ＤＴＩＣ－Ｄｏｍｅ（登録商標））が挙げられる。さらなる例示的なアルキル化剤としては、限定されないが、オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標））；テモゾロマイド（Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標）およびＴｅｍｏｄａｌ（登録商標））；ダクチノマイシン（アクチノマイシン－Ｄ、Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（登録商標）としても知られている）；メルファラン（Ｌ－ＰＡＭ、Ｌ－サルコリシン、およびフェニルアラニンマスタード、Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標）としても知られている）；アルテレタミン（ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、ヘキシレン（Ｈｅｘｙｌｅｎ）（登録商標）としても知られている）；カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））；ベンダムスチン（Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標））；ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標）およびＭｙｌｅｒａｎ（登録商標））；カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））；ロムスチン（ＣＣＮＵ、ＣｅｅＮＵ（登録商標）としても知られている）；シスプラチン（ＣＤＤＰ、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）およびＰｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）－ＡＱとしても知られている）；クロラムブシル（ロイケラン（登録商標））；シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）およびＮｅｏｓａｒ（登録商標））；ダカルバジン（ＤＴＩＣ、ＤＩＣおよびイミダゾールカルボキサミド、ＤＴＩＣ－Ｄｏｍｅ（登録商標）としても知られている）；アルテレタミン（ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、ヘキシレン（Ｈｅｘｙｌｅｎ）（登録商標）としても知られている）；イフォスファミド（Ｉｆｅｘ（登録商標））；プレドニムスチン；プロカルバジン（Ｍａｔｕｌａｎｅ（登録商標））；メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード、ムチンおよび塩酸メクロレタミン）、ムスタルゲン（Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ）（登録商標）としても知られている）；ストレプトゾシン（Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標））；チオテパ（チオホスホアミド、ＴＥＳＰＡおよびＴＳＰＡ、Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標）としても知られている）；シクロホスファミド（Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、 Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（登録商標））；およびベンダムスチンＨＣｌ（Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標））が挙げられる。
例示的なｍＴＯＲ阻害剤には、例えば、テムシロリムス；（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）－４－［（２Ｒ）－２［（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｚ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）－１，１８－ジヒドロキシ－１９，３０－ジメトキシ－１５，１７，２１，２３，２９，３５－ヘキサメチル－２，３，１０，１４，２０－ペンタオキソ－１１，３６－ジオキサ－４－アザトリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコントタ－１６，２４，２６，２８－テトラエン－１２－イル］プロピル］－２－メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィン酸塩が挙げられる（ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としても知られ、ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０６４３８３号）；エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標）またはＲＡＤ００１）；ラパマイシン（ＡＹ２２９８９、シロリムス（登録商標））；シマピモド（ＣＡＳ１６４３０１－５１－３）；（５－｛２，４－ビス［（３Ｓ）－３－メチルモルホリン－４－イル］ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７－イル｝－２－メトキシフェニル）メタノール（ＡＺＤ８０５５）、２－アミノ－８－［トランス－４－（２－ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］－６－（６－メトキシ－３－ピリジニル）－４－メチル－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７（８Ｈ）－（ＰＦ０４６９１５０２、ＣＡＳ １０１３１０１－３６－４）；およびＮ２－［１，４－ジオキソ－４－［［４－（４－オキソ－８－フェニル－４Ｈ－１－ベンゾピラン－２－イル）モルホリニウム－４－イル］メトキシ］ブチル］－Ｌ－アルギニルグリシル－Ｌ－α－アスパラチルＬ－セリン内塩（ＳＦ１１２６、ＣＡＳ ９３６４８７－６７－１）、およびＸＬ７６５を含むが、これらに限定されない。
例示的な免疫調節剤には、例えば、アフツズマブ（Ｒｏｃｈｅ（登録商標）から入手可能）；ペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））；レナリドマイド（ＣＣ－５０１３、Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（登録商標））；サリドマイド（Ｔｈａｌｏｍｉｄ（登録商標））、アクチミド（ＣＣ４０４７）；およびＩＲＸ－２（インターロイキン１、インターロイキン２およびインターフェロンγを含むヒトサイトカインの混合物、ＣＡＳ ９５１２０９－７１－５、ＩＲＸ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから入手可能）が挙げられる。
例示的なアントラサイクリンとしては、例えば、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）およびＲｕｂｅｘ（登録商標））；ブレオマイシン（レノキサン（登録商標））；ダウノルビシン（塩酸ダウオリビシン、ダウノマイシン、塩酸ルビドマイシン、セラビジン（登録商標））；ダウノルビシンリポソーム（ダウノルビシンクエン酸リポソーム、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））；ミトキサントロン（ＤＨＡＤ、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））；エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ（商標））；イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｉｄａｍｙｃｉｎ ＰＦＳ（登録商標））；マイトマイシンＣ（Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（登録商標））；ゲルダナマイシン；ハービマイシン；ラビドマイシン；およびデスアセチルラビドマイシンが挙げられる。
例示的なビンカアルカロイドには、例えば、ビノレルビンタータレート（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、およびビンデシン（Ｅｌｄｉｓｉｎｅ（登録商標））、ビンブラスチン（ビンブラスチン硫酸、ビンカロイコブラスチンおよびＶＬＢ、Ａｌｋａｂａｎ－ＡＱ（登録商標）およびＶｅｌｂａｎ（登録商標）としても知られている）；およびビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））が挙げられる。
例示的なプロテオソーム阻害剤には、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））；カリフォルゾミブ（ＰＸ－１７１－００７、（Ｓ）－４－メチル－１－（（Ｒ）－２－メチルオキシラン－２－イル）アミノ）－１－オキソ－３－フェニルプロパン－２－イル）－２－（（Ｓ）－２－（２－モルホリノアセトアミド）－４－フェニルブタンアミド）－ペンタンアミド）、マリゾミブ（ＮＰＩ－００５２）；クエン酸イクザミブ（ＭＬＮ－９７０８）；デランゾミブ（ＣＥＰ－１８７７０）；およびＯ－メチル－Ｎ－［（２－メチル－５－チアゾリル）カルボニル］－Ｌ－セリル－Ｏ－メチル－Ｎ－［（１Ｓ）－２－［（２Ｒ）－２－メチル－２－オキシラニル］－２－オキソ－１－（フェニルメチル）エチル］－Ｌ－セリンアミド（ＯＮＸ－０９１２）が挙げられる。
例示的なＧＩＴＲアゴニストには、例えば、ＧＩＴＲ融合タンパク質および抗ＧＩＴＲ抗体（例えば、二価抗ＧＩＴＲ抗体）、例えば米国特許第６，１１１，０９０号、欧州特許第０９０５０５Ｂ１号、米国特許第８，５８６，０２３号、ＰＣＴ公開番号：ＷＯ２０１０／００３１１８および２０１１／０９０７５４に記載のＧＩＴＲ融合タンパク質、または例えば、米国特許第７，０２５，９６２号、欧州特許第１９４７１８３Ｂ１号、米国特許第７，８１２，１３５号、米国特許第８，３８８，９６７号、米国特許第８，５９１，８８６号、欧州特許第１８６６３３９号、ＰＣＴ公開番号：ＷＯ２０１１／０２８６８３、ＰＣＴ公開番号：２０１３／０３９９５４、ＰＣＴ公開番号：ＷＯ２００５／００７１９０、ＰＣＴ公開番号：ＷＯ２００７／１３３８２２、ＰＣＴ公開番号：ＷＯ２００５／０５５８０８、ＰＣＴ公開番号：ＷＯ９９／４０１９６、ＰＣＴ公開番号：ＷＯ２００１／０３７２０、ＰＣＴ公開番号：ＷＯ９９／２０７５８、ＰＣＴ公開番号：ＷＯ２００６／０８３２８９、ＰＣＴ公開国際公開第２００５／１１５４５１号パンフレット、米国特許第７，６１８，６３２号、およびＰＣＴ公開番号：ＷＯ２０１１／０５１７２６に記載の抗ＧＩＴＲ抗体が挙げられる。
一実施形態では、被験体に、裸の抗体または抗体フラグメント、ＡＤＣ、ＣＡＲ発現細胞または二重特異性抗体の投与に伴う副作用を軽減または改善する薬剤を投与することができる。
一実施形態では、被験体に、裸の抗体または抗体フラグメント、ＡＤＣ、ＣＡＲ発現細胞または二重特異性抗体の活性を増強する薬剤を投与することができる。例えば、一実施形態では、薬剤は、阻害性分子を阻害する薬剤であり得る。いくつかの実施形態では、抑制された分子、例えばプログラムされた死１（ＰＤ１）は、免疫エフェクター応答を賦与するＣＡＲ発現細胞の能力を低下させることができる。阻害性分子の例には、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲβが含まれる。例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの阻害による阻害分子の阻害は、裸の抗体または抗体フラグメント、ＡＤＣ、ＣＡＲ発現細胞または二重特異性抗体の性能を最適化することができる。実施形態では、阻害性核酸、例えば阻害性核酸、例えばｄｓＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを用いて、ＣＡＲ発現細胞または二重特異性Ａｂ反応細胞における阻害分子の発現を阻害することができる。一実施形態では、阻害剤はｓｈＲＮＡである。一実施形態では、阻害シグナルの阻害剤は、例えば、阻害性分子に結合する抗体または抗体フラグメントであり得る。例えば、薬剤は、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２またはＣＴＬＡ４に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、イピリムマブ（ＭＤＸ－０１０およびＭＤＸ－１０１とも呼ばれ、Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）として市販される； Ｂｒｉｓｔｏｌ （Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）；トレメリムマブ（Ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）（以前はチシリムマブとして知られているファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ）から入手可能なＩｇＧ２モノクローナル抗体、ＣＰ－６７５，２０６）であってもよい。一実施形態では、薬剤は、ＴＩＭ３に結合する抗体または抗体フラグメントである。一実施形態では、薬剤は、ＬＡＧ３に結合する抗体または抗体フラグメントである。
ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡも含むＣＤ２８受容体ファミリーの阻害性メンバーである。ＰＤ１は、活性化されたＢ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞上で発現される（Ａｇａｔａら、１９９６ Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ８：７６５－７５）。ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２の２つのリガンドは、ＰＤ１に結合するとＴ細胞活性化をダウンレギュレートすることが示されている（Ｆｒｅｅｍａｎら、２０００ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９２：１０２７－３４；Ｌａｔｃｈｍａｎら、２００１ Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２：２６１－８；Ｃａｒｔｅｒら、２００２ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：６３４－４３）。ＰＤ－Ｌ１はヒトの癌に豊富に存在する（Ｄｏｎｇら、２００３ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ８１：２８１－７；Ｂｌａｎｋら、２００５ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５４：３０７－３１４；Ｋｏｎｉｓｈｉら、２００４ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １０：５０９４）。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ－Ｌ１との局所的相互作用を阻害することによって逆転させることができる。ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２の抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤は、当技術分野において利用可能であり、本明細書に記載のＰＳＭＡ標的化裸抗体または抗体フラグメント、ＡＤＣ、ＣＡＲ発現細胞、または二重特異性抗体と組み合わせて使用してもよい。例えば、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８またはＭＤＸ１１０６；Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂとも呼ばれる）は、ＰＤ１を特異的に遮断する完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ（クローン５Ｃ４）およびＰＤ１に特異的に結合する他のヒトモノクローナル抗体は、米国特許第８，００８，４４９号およびＷＯ２００６／１２１１６８号に記載されている。ピジリズマブ（ＣＴ－０１１； Ｃｕｒｅ Ｔｅｃｈ）は、ＰＤ１Ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂに結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体であり、他のヒト化抗ＰＤ１モノクローナル抗体はＷＯ２００９／１０１６１１号に開示されている。ラムブロリズマブ（ＭＫ０３４７５；Ｍｅｒｃｋとも呼ばれる）は、ＰＤ１に結合するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。Ｌａｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂおよび他のヒト化抗ＰＤ１抗体は、米国特許第８，３５４，５０９号およびＷＯ２００９／１１４３３５号に記載されている。ＭＤＰＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）は、ＰＤ－Ｌ１に結合するヒトＦｃ最適化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ＰＤ－Ｌ１に対するＭＤＰＬ３２８０Ａおよび他のヒトモノクローナル抗体は、米国特許第７，９４３，７４３号および米国公開第２０１２００３９９０６号に記載されている。他の抗ＰＤ－Ｌ１結合剤としては、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（重鎖および軽鎖可変領域はＷＯ２０１０／０７７６３４の配列番号２０および２１に示される）およびＭＤＸ－１１０５（ＢＭＳ－９３６５５９とも呼ばれる。例えば、ＷＯ２００７／００５８７４に開示されている抗ＰＤ－Ｌ１結合剤）である。ＡＭＰ－２２４（Ｂ７－ＤＣＩｇ；Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ；例えばＷＯ２０１０／０２７８２７号およびＷＯ２０１１／０６６３４２号に開示されている）は、ＰＤ１とＢ７－Ｈ１との間の相互作用をブロックするＰＤ－Ｌ２ Ｆｃ融合可溶性受容体である。他の抗ＰＤ１抗体には、とりわけ、ＡＭＰ５１４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）、例えば、米国特許第８，６０９，０８９号、米国特許出願公開第２０１００２８３３０号、および／または米国特許出願公開第２０１２０１１４６４９号に記載されている。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、例えば、第１のドメインおよび第２のドメインを含む融合タンパク質であってもよく、第１のドメインは阻害性分子またはそのフラグメントであり、第２のドメインは陽性シグナルに関連するポリペプチド、例えば、本明細書に記載の細胞外シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、陽性シグナルに関連するポリペプチドは、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、例えばＣＤ２８、ＣＤ２７および／またはＩＣＯＳの細胞内シグナル伝達ドメイン、および／または一次シグナル伝達ドメイン、例えば、本明細書に記載のＣＤ３ゼータを含む。一実施形態では、融合タンパク質は、ＣＡＲを発現したのと同じ細胞によって発現される。別の実施形態では、融合タンパク質は、細胞、例えば、抗ＰＳＭＡ ＣＡＲを発現しないＴ細胞によって発現される。
製剤および投与経路
本発明の抗体、ＡＤＣ、ＣＡＲ発現細胞、または二重特異性抗体は、広範囲の製品に用途を見出すことができる。一実施形態では、本発明の抗体、ＡＤＣ、ＣＡＲ発現細胞、または二重特異性抗体は、治療剤、診断剤または研究試薬である。一実施形態では、本発明の抗体ＡＤＣ、ＣＡＲ発現細胞、または二重特異性抗体は、治療剤である。いくつかの実施形態では、本発明の抗体または抗体フラグメント、ＡＤＣ、ＣＡＲ発現細胞または二重特異性抗体は、産業用途に使用される。本発明の抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルである抗体組成物での使用を見出すことができる。本発明の抗体は、アゴニスト、アンタゴニスト、中和剤、阻害剤、または刺激剤であってもよい。一実施形態では、本発明の抗体または抗体フラグメント、ＡＤＣ、ＣＡＲ発現細胞、または二重特異性抗体は、標的抗原を有する標的細胞、例えば癌細胞を死滅させるために使用される。代替の実施形態では、本発明の抗体は、標的抗原を遮断、拮抗または作動させるために使用される。代替の実施形態では、本発明の抗体は、標的抗原を遮断、拮抗または作動させ、標的抗原を有する標的細胞を死滅させるために使用される。別の実施形態では、標的細胞は、腫瘍細胞またはその新生血管系である。一実施形態では、血管新生は血管新生において重要な役割を果たし、本明細書で提供される抗体または抗体フラグメント、ＡＤＣ、ＣＡＲ発現細胞または二重特異性抗体の標的であるとも考えられる。
本発明はさらに、適切な包装材料に包装された医薬製剤を含む、本発明の１つ以上の組成物を含むキットを提供する。別の実施形態では、キットは、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント、Ｃａｒ ＴまたはＣａｒ ＮＫ細胞、またはその二重特異性抗体をコードする核酸を含む。さらなる実施形態では、キットは、発現制御エレメントをさらに含む核酸；発現ベクター；ウイルス発現ベクター；アデノ随伴ウイルス発現ベクター；アデノウイルス発現ベクター；およびレトロウイルス発現ベクターを含む。さらに別の実施形態では、キットは、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント、例えばＣａｒ ＴまたはＣａｒ ＮＫ細胞を発現する細胞を含む。
さらなる実施形態では、キットは、抗体または二重特異性抗体または抗体、その抗原結合フラグメントまたはそれらの二重特異性抗体をコードする核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで細胞内で発現させるための説明書を含むラベルまたはパッケージングインサートを含む。さらに別の実施形態では、キットは、本発明の抗体または抗体フラグメント、ＡＤＣ、ＣＡＲ発現細胞、またはその二重特異性抗体（例えば、喘息を有するかまたは喘息を有するリスクを有する被験体）をｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで治療するための説明書を含むラベルまたはパッケージングインサートを含む。
本明細書で使用される場合、用語「包装材料」は、キットの構成要素を収容する物理的構造を指す。包装材料は、成分を無菌的に維持することができ、そのような目的に一般的に使用される材料（例えば、紙、コルゲートファイバー、ガラス、プラスチック、フォイル、アンプルなど）で作ることができる。ラベルまたはパッケージングインサートは、例えば、本発明の方法を実施する（例えば、風邪を治療する）適切な書面による指示を含むことができる。したがって、本発明のキットは、本発明の方法においてキット成分を使用するための説明書をさらに含むことができる。
説明書は、本明細書に記載の本発明の方法のいずれかを実施するための説明書を含むことができる。したがって、本発明の医薬組成物は、被験体への投与のための説明書とともに容器、パック、またはディスペンサーに含めることができる。説明書には、満足のいく臨床的エンドポイントまたは起こり得る有害症状の徴候、またはヒト被験体に使用するために食品医薬品局によって要求される追加情報がさらに含まれてもよい。
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、ワクチンの一部として投与される。いくつかの実施形態では、ワクチンという用語は、任意の免疫調節組成物を包含するものと理解され、このようなワクチンは、本発明のポリペプチドに加えて、アジュバント、抗原、免疫調節化合物、またはこれらの組合せを含む。
いくつかの実施形態では、アジュバントは、（Ａ）アルミニウム化合物（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ヒドロキシリン酸アルミニウム、オキシ水酸化物、オルトリン酸塩、硫酸塩など）を含むが、これらに限定されない。［例えば、参考文献の第８章および第９章参照。９６］）、または異なるアルミニウム化合物の混合物であり、化合物は任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶質、非晶質など）をとり、吸着が好ましい；（Ｂ）ＭＦ５９（５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５、マイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に製剤化）；（Ｃ）リポソーム；（Ｄ）追加の洗剤がないかもしれないＩＳＣＯＭ；（Ｅ）サブミクロンエマルジョンにミクロ流動化されるかまたはより大きい粒径のエマルジョンを生成するためにボルテックスされた１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０，５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ－ＭＤＰを含有するＳＡＦ；（Ｆ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、およびモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）からなる群からの１つ以上の細菌細胞壁成分、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））を含有するＲｉｂｉ（商標）アジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；（Ｇ）Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）としても知られているＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１などのサポニンアジュバント；（Ｈ）キトサン；（Ｉ）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（Ｊ）インターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２など）、インターフェロン（例えば、インターフェロン－γ）マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子などのサイトカイン；（Ｋ）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３－Ｏ－脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）］；（Ｌ）３ｄＭＰＬと例えばＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンとの組合せ；（Ｍ）ＣｐＧモチーフを含む）（すなわち、少なくとも１つのＣＧ二三リン酸を含み、５－メチルシトシンが場合によりシトシンの代わりに使用される）オリゴヌクレオチド；（Ｎ）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル；（Ｏ）オクトキシノールまたはポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤と組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤と、オクトキシノールのような少なくとも１種の追加の非イオン性界面活性剤との組合せ；（Ｐ）免疫刺激性オリゴ核酸（例えば、ＣｐＧオリゴ核酸）およびサポニン；（Ｏ）免疫刺激剤および金属塩の粒子；（Ｒ）サポニンおよび水中油型エマルジョン；（Ｓ）サポニン（例えばＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ１２（場合により＋ステロール）；（Ｔ）大腸菌熱不安定性エンテロトキシン（「ＬＴ」）、またはその解毒された突然変異体、例えばＫ６３またはＲ７２突然変異体；（Ｕ）コレラ毒素（「ＣＴ」）、またはジフテリア毒素（「ＤＴ」）またはいずれかの解毒変異体；（Ｖ）二本鎖ＲＮＡ；（Ｗ）モノホスホリルリピドＡ模倣物、例えばアミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体（例えばＲＣ－５２９）；（Ｘ）ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）；（Ｙ）エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェアのような生体接着剤、またはポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖類およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体のような粘膜接着剤。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物の投与は、病的な状態の重篤度を下げることを意図している。「病的な状態の重篤度を下げる」という用語は、本明細書に開示された方法、化合物および組成物を介した任意の減少が本発明に包含されるとみなされるべきである。重症度の低下は、一実施形態では、生存の強化、または別の実施形態では疾患の進行の停止、または別の実施形態では疾患の進行の遅延を含み得る。
一実施形態では、投薬は、投与された分子／化合物またはそれを含む組成物に対する細胞応答性に依存する。一般に、上記の目的に利用される用量は変化するが、当業者であれば決定されるように、所望の効果を発揮するのに有効な量である。本明細書で使用する「薬学的に有効な量」という用語は、患者における症状または他の所望の表現型において所望の緩和を生じる、本明細書に記載の化合物の量を指す。
本発明の一実施形態では、化合物の濃度は、治療される状態の性質、患者の状態、投与経路および組成物の個々の忍容性を含む様々な要因に依存する。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物のいずれかは、本明細書に記載の任意の形態または実施形態の化合物を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物のいずれかは、本明細書に記載される任意の形態または実施形態の本質的に化合物からなる。いくつかの実施形態では、「含む」という用語は、本発明の化合物のような、示された活性薬剤の包含、ならびに他の活性薬剤、および薬学的に許容される担体、賦形剤、皮膚軟化剤、製薬業界で知られている。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載のポリペプチド／ポリ核酸／ベクターから本質的になるであろう。いくつかの実施形態では、「本質的に～からなる」という用語は、特定の種類の薬剤の有効成分のみが示された有効成分である組成物を指すが、指示された治療効果に直接関与する他の化合物が含まれてもよい。いくつかの実施形態では、「本質的に～からなる」という用語は、特定の機構を標的とする、または特定の経路を介して作用する唯一の活性成分が示された有効成分である組成物を指すが、指示された薬剤の治療効果、例えば、指示された薬剤に関連するがそれには直接関与しない作用機序を有する。いくつかの実施形態では、「本質的に～からなる」という用語は、有効成分のみが示された有効成分である組成物を指すが、製剤を安定化、保存などするためであるが、示された有効成分の治療効果に直接関与しない他の化合物が含まれてもよい。いくつかの実施形態では、「本質的に～からなる」という用語は、活性成分の放出を促進する成分を指し得る。いくつかの実施形態では、「含む」という用語は、活性成分および薬学的に許容される担体または賦形剤を含有する組成物を指す。
特定の場合における活性化合物の実際の量は、利用される特定の化合物、処方される特定の組成物、適用様式、および治療される特定の状態および生物によって変化することは理解されよう。所与の宿主の投薬量は、例えば対象化合物と公知の薬剤との差異的な活性の慣習的な比較（例えば、適切な従来の薬理学的プロトコルによる）などの従来の考慮を用いて決定することができる。
一実施形態では、本発明の化合物は、一時的な状態の急性治療のために急性投与されるか、または慢性的に、特に進行性、再発性または変性疾患の場合に慢性投与され得る。１つの実施形態では、本発明の１つ以上の化合物は、同時に投与されてもよく、または別の実施形態では、それらは、互い違いに投与されてもよい。一実施形態では、互い違いの様式は、疾患のステージまたは段階によって決定され得る。
非経口ビヒクル（皮下、静脈内、動脈内、または筋肉内注射用）には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲルおよび固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、液体および栄養補充剤、リンガーデキストロースに基づくものなどの電解質補充剤などが含まれる。例は、界面活性剤および他の薬学的に許容されるアジュバントの添加の有無にかかわらず、水および油のような滅菌液体である。一般に、水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連する糖溶液、ならびにプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールは、特に注射液のための好ましい液体担体である。油の例は、ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、オリーブ油、ヒマワリ油および魚肝油などの石油、動物、植物または合成起源のものである。
一実施形態では、投与経路は、非経口であってもよく、またはそれらの組合せであってもよい。別の実施形態では、前記経路は眼内、結膜、局所、経皮、皮内、皮下、腹腔内、静脈内、動脈内、膣、直腸、腫瘍内、肝臓、粘膜、筋肉内、血管内、エアロゾル）、鼻吸引（スプレー）、鼻腔内（滴下）、舌下、経口、エアロゾルまたは座薬またはそれらの組合せである。一実施形態では、投与レジメンは、治療される状態の正確な性質、状態の重症度、患者の年齢および一般的な身体状態、体重、および個々の患者の応答などの要因に基づいて、熟練した臨床医によって決定される。
鼻腔内投与または吸入による適用のために、適切な担体の存在下で混合およびエアロゾル化または噴霧された化合物の溶液または懸濁液による。このようなエアロゾルは、本明細書に記載の任意の薬剤を含むことができる。
非経口適用のためには、注射剤、滅菌溶液、好ましくは油性または水性溶液、ならびに坐剤および浣腸剤を含む懸濁剤、乳剤またはインプラントが特に適している。アンプルは、便利な単位用量である。このような坐剤は、本明細書に記載の任意の薬剤を含み得る。
徐放または直接放出組成物は、例えばリポソームまたは活性化合物が示差的に分解可能なコーティング、例えばマイクロカプセル化、複数のコーティングなどによって保護されているものなど、処方することができる。そのような組成物は、即時放出または徐放のために製剤化されうる。また、新しい化合物を凍結乾燥し、得られた凍結乾燥物を例えば注射用製剤の調製に使用することも可能である。
液体製剤の場合、薬学的に許容される担体は、水性または非水性の溶液、懸濁液、乳濁液または油であり得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および注入可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。
水性担体には、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液（生理食塩水および緩衝媒体を含む）が含まれる。油の例は、ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、オリーブ油、ヒマワリ油および魚肝油などの石油、動物、植物または合成起源のものである。
一実施形態では、本発明の方法の組成物または本発明の方法で使用される組成物は、単独で、または組成物中に投与することができる。別の実施形態では、活性化合物と有害に反応しない非経口、経腸（例えば、経口）または局所適用に適した薬学的に許容される有機または無機担体物質を混合する本発明の組成物を使用することができる。一実施形態では、適切な薬学的に許容される担体は、水、塩溶液、アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロースまたはデンプンなどの炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、白色パラフィン、グリセロール、アルギネート、ヒアルロン酸、コラーゲン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどを含むが、これらに限定されるものではない。別の実施形態では、薬学的調製物は滅菌されてもよく、所望であれば、活性化合物と有害に反応しない、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝剤、着色剤、香味剤および／または芳香物質などの補助剤と混合してもよい。別の実施形態では、それらを、必要に応じて他の活性剤、例えばビタミンと組み合わせることもできる。
医薬組成物には、「薬学的に許容される」および「生理学的に許容される」担体、希釈剤または賦形剤が含まれる。一実施形態では、「薬学的に許容される」および「生理学的に許容される」という用語は、安全であり、本発明で使用するための有効量の少なくとも１つの化合物の所望の投与経路の適切な送達を提供する任意の製剤を指す。この用語は、ｐＨが、化合物の安定性および投与経路に従って、ｐＨ４．０からｐＨ９．０の範囲の特定の所望の値に維持される、緩衝化された製剤の使用をも指す。この用語には、薬学的投与に適合する溶媒（水性または非水性）、溶液、エマルジョン、分散媒、コーティング、等張および吸収促進または遅延剤が含まれる。このような製剤は、液体、エマルジョン、懸濁液、シロップまたはエリキシル、または固体形態；錠剤（被覆または非被覆）、カプセル（硬または軟）、粉末、顆粒、結晶またはマイクロビーズに含有させることができる。補充活性化合物（例えば、防腐剤、抗細菌剤、抗ウイルス剤および抗真菌剤）も組成物に組み込むことができる。
本発明の薬学的組成物は、ナイトロジェンマスタード（例えば、シクロホスファミドおよびイフォスファミド）、アジリジン（例えば、チオテパ）、アルキルスルフォネート（例えば、ブスルファン）、ニトロソ尿素（例えば、カルムスチンおよびストレプトゾシン）、白金錯体（例えば、カルボプラチンおよびシスプラチン）、非古典的アルキル化剤（例えば、ダカルバジンおよびテモゾラミド）、葉酸類似体（例えば、メトトレキサート）、プリン類似体（例えば、フルダラビンおよびメルカプトプリン）、アデノシン類似体（例えば、クラドリビンおよびペントスタチン）、ピリミジン類似体 （例えば、フルオロウラシル（単独でまたはロイコボリンとの組合せで）およびゲムシタビン）、置換ウレア（例えば、ヒドロキシウレア）、抗腫瘍抗生物質（例えば、ブレオマイシンおよびドキソルビシン）、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシドおよびテニポシド）、微小管薬剤（例えば、ドセタキセルおよびパクリタキセル）、カンプトテシン類似体（例えば、イリノテカンおよびトポテカン）、酵素（例えば、アスパラギナーゼ）、サイトカイン（例えば、インターロイキン－２およびインターフェロン－α）、モノクローナル抗体（例えば、トラスツズマブおよびベバシズマブ）、組換え毒素および免疫毒素（例えば、組換えコレラ毒素－ＢおよびＴＰ－３８）、癌遺伝子療法、物理療法（例えば、温熱療法、放射線療法および外科手術）および癌ワクチン、テロメラーゼに対するワクチン）の１つ以上を含んでいてもよい。
本発明の組成物（例えば、抗体および二重特異性分子）は、補体と共に投与することもできる。したがって、本発明の範囲内には、ヒト抗体、多重特異性または二重特異性分子および血清または補体を含む組成物がある。これらの組成物は、補体がヒト抗体、多重特異性分子または二重特異性分子のすぐ近くに位置する点で有利である。あるいは、ヒト抗体、本発明の多重特異性または二重特異性分子および補体または血清を別々に投与することができる。
医薬組成物は、特定の局所または全身投与経路に適合するように製剤化することができる。したがって、医薬組成物は、特定の経路による投与に適した担体、希釈剤、または賦形剤を含む。本発明の組成物の投与経路の特定の非限定的な例は、吸入または鼻腔内送達である。追加の経路には、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口、経皮（局所）、経粘膜および直腸投与が含まれる。
非経口、皮内、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような張度調整剤が挙げられる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。
注射用医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌注射溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与のためには、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であってもよい。流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。抗菌剤および抗真菌剤には、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸およびチメロサールが含まれる。等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムなどのポリアルコールを組成物に含めることができる。吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことは、注射用組成物の吸収を延長させることができる。
滅菌注射溶液は、必要な量の活性化合物を、適切な溶媒中に上記成分の１つまたは組合せと共に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、上記のような塩基性分散媒および他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法には、例えば、真空乾燥および凍結乾燥が含まれ、有効成分と予め滅菌濾過された溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。
経粘膜または経皮投与のためには、バリアに浸透するのに適した浸透剤を製剤に使用する。そのような浸透剤は、当該分野において一般的に知られており、例えば、経粘膜投与のために、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレー、吸入装置（例えば、アスピレーター）または座薬の使用によって達成することができる。経皮投与の場合、活性化合物は、当該分野で一般的に知られている軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームに配合される。
本発明の抗体（部分配列および修飾形態ならびにそれらをコードする核酸を含む）は、制御放出製剤またはモノステアリン酸グリセリルまたはステアリン酸グリセリルなどの時間遅延物質のような身体からの迅速な排出を防ぐ担体で調製することができる。組成物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを用いて送達されて、局所的または全身的持続送達または制御放出を達成することもできる。
エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製方法は、当業者には明らかであろう。材料はまた、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．から商業的に得ることができる。リポソーム懸濁液（抗体またはウイルスコートタンパク質を用いて細胞または組織に標的化されたリポソームを含む）も、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、当業者に公知の方法に従って、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載される方法に従って調製することができる。
本発明の方法における投与のための組成物に適した追加の医薬製剤は、当技術分野で公知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）１８ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．；Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ（１９９６）１２ｔｈ ｅｄ．，Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，Ｎ．Ｊ．；およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｐａ．，（１９９３）を参照）。薬学的処方物は、投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態で包装することができる。本明細書で使用される「投薬単位形態」は、治療される被験体のための単位投薬量として適した物理的に別個の単位を指す。各単位は、医薬担体または賦形剤と関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。
本明細書で提供される医薬組成物は、主に、ヒトへの投与に適した医薬組成物に関するものであるが、当業者であれば、そのような組成物は、一般にあらゆる動物の投与に適していると理解される。組成物を種々の動物に投与するのに適したものにするためにヒトに投与するのに適した医薬組成物の改変は十分に理解されており、通常の熟練した獣医学の薬理学者は、このような改変を、あるとしてもわずかな実験で設計し、実施することができる。本発明の医薬組成物の投与が企図される被験体には、ヒトおよび他の霊長類、ならびに他の哺乳動物が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に記載のポリペプチドに対する配列、構造的または機能的相同性を示す任意の手段によって自然にまたは合成的に得られたいずれのアミノ酸配列も本発明の一部と考えられることを理解されたい。
一実施形態では、「約」という用語は、±５％、別の実施形態では±１０％、または別の実施形態では±１５％、または別の実施形態では±２０％を意味する。
「被験体」という用語は、一実施形態では、ある状態またはその後遺症またはその症状の治療を必要とする、ヒトを含む哺乳動物を意味する。被験体は、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、およびマウスおよびヒトを含むことができる。「被験体」という用語は、あらゆる面で、健常な個体を除外するものではない。
任意の刊行物、特許出願または発行された特許への言及は、その全体が参照により本明細書に完全に組み込まれているとみなされるべきであることを理解されたい。
化合物の有効性を決定する手段として、治療化合物によって調節される特定の活性を測定するための任意のアッセイを用いることができ、一実施形態では、化合物の最適負荷量、別の実施懈怠では、時間および投与量、別の実施形態では、またはそれらの組合せを用いることができる。
実験例
本発明は、以下の実験例を参照しつつ、さらに詳細に記載される。これらの実施例は、例示のみを目的として提供されており、特記しない限り、限定することを意図するものではない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されるものと決して解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになる任意のおよび全ての変形を包含すると解釈されるべきである。
さらなる説明がない限り、当業者は、前述の説明および以下の実施例を使用して、本発明を作製および利用し、特許請求の範囲に記載の方法を実施することができると考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に指摘し、決して本開示の残りの部分を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１：酵母ディスプレイのヒトｓｃＦｖライブラリーのパニング
１×１０１１酵母ディスプレイの未処理ヒトｓｃＦｖライブラリーを構築し、ヒトＰＳＭＡの細胞外ドメインをＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ライブラリーパニングの方法は以前に記載されている（Ｚｈａｏら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１１；３６３（２）：２２１－３２）。簡潔には、組換えＰＳＭＡタンパク質をビオチン化し、誘導酵母ディスプレイｓｃＦｖライブラリーとインキュベートし；ＰＳＭＡ結合酵母細胞を、ストレプトアビジン（ＳＡ）結合マイクロビーズおよびフローサイトメトリー活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて単離し；ｓｃＦｖ遺伝子を、単離された酵母細胞から増幅させ、分泌発現酵母株ＹＶＨ１０にクローニングし；個々の分泌ｓｃＦｖ発現を９６ウェルプレートで誘導し、ＰＳＭＡ結合クローンをハイスループットＥＬＩＳＡによって同定した。
ＰＳＭＡ組換えタンパク質のビオチン化
ＰＳＭＡ組換えタンパク質緩衝液を、ＰＢＳに対して４℃で透析してＰＢＳに変え、濃度を０．５ｍｇ／ｍｌに調整した。ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ビオチン試薬（１０ｍＭ；冷水に溶解）（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＰＳＭＡ組換えタンパク質と最終モル比１：２０（タンパク質：ビオチン）に混合した。ＰＳＭＡ組換えタンパク質混合物を４℃で２時間インキュベートした。未反応の遊離ビオチン試薬を透析により除去し、ビオチン化タンパク質を等分し、－８０℃で保存した。
磁気ビーズを用いた酵母ディスプレイｓｃＦｖライブラリーパニング
酵母ディスプレイｓｃＦｖライブラリーを－８０℃から解凍し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を捨て、酵母細胞を、１２Ｌ ＳＤ－ＣＡＡ培地に再び懸濁させた（１リットルのＳＤ－ＣＡＡ培地は、５ｇのカザミノ酸、１．７ｇのアンモニウムＳＯ４およびアミノ酸を含まない酵母窒素塩基、５．３ｇの硫酸アンモニウム、１０．２ｇのＮａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、８．６ｇのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏおよび２０ｇのデキストロースを含んでいる）。細胞を２００ｒｐｍでロッキングしながら３０℃で一晩培養した。翌日、酵母細胞を、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって回収し、適切な量を１２Ｌ Ｓ－ＣＡＡ－ＧＲＤ誘導培地に、最終濃度がＯＤ６００＝０．５になるように再懸濁させ（１リットルのＳ－ＣＡＡ－ＧＲＤは、５ｇのカザミノ酸、１．７ｇのアンモニウムＳＯ４およびアミノ酸を含まない酵母窒素塩基、５．３ｇの硫酸アンモニウム、１０．２ｇのＮａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、８．６ｇのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、１ｇのデキストロース、２０ｇのガラクトースおよび２０ｇのラフィノースを含んでいる）、２０℃で一晩誘導した。誘導酵母細胞を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して回収し、２ＬのＰＢＥ緩衝液（ＰＢＥ緩衝液は２ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液）で２回洗浄し、最後に２００ｍＬのＰＢＥに再懸濁した。細胞を室温（ＲＴ）で１．５時間、次いで４℃で０．５時間、４０μｇのビオチン化ＰＳＭＡタンパク質と共にインキュベートした。以下の工程は、４℃で、または氷上で行った。３０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって細胞を収穫し、２ＬのＰＢＥで２回洗浄し、２００ｍｌのＰＢＥに再懸濁した。次に、２ｍｌのストレプトアビジンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を細胞に添加し、１時間ゆっくりと揺動させながらインキュベートした。１リットルのＰＢＥを細胞に添加し、溶液をボルテックスして細胞を単一細胞に分離し、７０μｍのストレーナーを用いて濾過した。１６個のＭｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラムをＰＳＭＡ結合酵母細胞単離に使用した。簡潔には、７ｍＬの染色した細胞懸濁液をカラムに添加した。各７ｍＬの細胞がカラムに入り、流れが停止した後、カラムから磁石を取り出し、直ちに磁石に戻した。これにより、カラム内の鉄ビーズが再配列され、物理的にビーズ間に閉じ込められた細胞が通過することが可能になる。カラムを磁石に戻し、洗浄緩衝液１ｍｌを加え、洗浄液が流れた後、さらに７ｍＬの細胞をカラムに加えた。各細胞のローディングの間にカラム除去手順を繰り返した。全ての細胞をカラムに充填したら、カラムを３ｍＬの洗浄緩衝液で洗浄した。この洗浄は、カラムの空隙体積中の細胞を除去する。カラムを磁石から取り出し、直前に交換した。洗浄を２回繰り返した。カラムの滴下が止まったら、カラムを磁石から取り出し、７ｍＬの洗浄バッファーを加えた。プランジャーを使用して、残りの細胞を全て１５ｍＬコニカルチューブに押し出した。
収穫した細胞をさらに２つの新しいカラムに入れて、非特異的細胞をさらに除去した。３０００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより、最終的に溶出した細胞を回収した。細胞をＳＤ－ＣＡＡプレート上に広げ、３０℃で２日間培養した。１回目の磁気選別から合計２．５×１０７個のクローンを得た。細胞をこすり落とし、第２回の磁気選別のために誘導した。アリコートを－８０℃で１０％グリセロールを含むＳＤ－ＣＡＡに保存した。
５×１０９個の第１ラウンド磁気選別酵母細胞を２０℃で一晩誘導するために２００ｍｌのＳ－ＣＡＡ－ＧＲＤ培地に接種した。翌日、２．５×１０９個の誘導細胞を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して回収し、１５ｍｌのＰＢＥで２回洗浄した。細胞を３ｍｌのＰＢＥに再懸濁し、ＲＴで１．５時間、次いで４℃で３０分間、３μｇのビオチン化ＰＳＭＡタンパク質と共にインキュベートした。以下の工程は、全て４℃で、または氷上で行った。インキュベーション後、細胞を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによってペレット化し、次いで１５ｍｌのＰＢＥで３回洗浄した。細胞を再度ペレット化し、３ｍｌのＰＢＥに再懸濁し、４℃で１時間、５０μｌの抗ビオチン抗体結合マイクロバッドと共にインキュベートした。細胞をＰＢＥで１回洗浄し、ＰＢＥ１５ｍｌに再懸濁し、７０μｍのストレーナーで濾過し、上記のように１つのＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｍａｃｓ ＬＳカラムを用いてＰＳＭＡ結合酵母細胞を単離した。２回目の磁気選別により、５．１×１０６個のクローンが生じた。
ＰＳＭＡ特異的酵母集団をさらに濃縮するために、３回目の磁気選別を行った。簡単に説明すると、２０℃で一晩、５０ｍｌのＳ－ＣＡＡ－ＧＲＤ中に１×１０９個の細胞を誘導し、５×１０８個の細胞をさらにパニングするために採取した。細胞を１５ｍｌのＰＢＥで２回洗浄し、３ｍｌのＰＢＥに再懸濁し、続いて１μｇのビオチン化ＰＳＭＡタンパク質と室温で１．５時間、次いで４℃で３０分間インキュベートした。以下の工程は、全て４℃で、または氷上で行った。インキュベーション後、細胞を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによってペレット化し、次いで１５ｍｌのＰＢＥで３回洗浄した。細胞を再びペレット化し、３ｍｌのＰＢＥに再懸濁し、４℃で１時間、５０μｌのストレプトアビジンコンジュゲートマイクロバッドと共にインキュベートした。細胞をＰＢＥで１回洗浄し、ＰＢＥ１５ｍｌに再懸濁し、７０μｍのストレーナーで濾過し、上記のように１つのＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｍａｃｓ ＬＳカラムを用いてＰＳＭＡ結合酵母細胞を単離した。３回目の磁気選別により、１×１０７個のクローンが生じた。
フローソーティングを使用した酵母ディスプレイｓｃＦｖライブラリーパニング
３回目の磁気選別から得られた酵母細胞をさらに３回のフローソーティングに供した。全ての遠心分離は３０００ｒｐｍで５分間行い、全ての工程は４℃で行った。３回目の磁気選別から単離された２×１０９個の細胞を２０℃で１００ｍｌのＳ－ＣＡＡ－ＧＲＤ培地中で一晩誘導し、そこから１×１０８個の細胞を１回目のフローソーティングのために採取した。細胞をペレット化し、１５ｍｌのＰＢＥで２回洗浄し、次いで１ｍｌのＰＢＥに再懸濁し、ビオチン化ＰＳＭＡタンパク質０．２μｇと共に室温で１．５時間、次いで４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＥで３回洗浄した後、４℃、１ｍｌのＰＢＥ中、５０μｌの抗Ｖ５－Ａｌｅｘａ６４７（ＡｂＤ Ｓｔｅｒｅｏ）および５０μｌのストレプトアビジン－ＰＥ（ＳＡ－ＰＥ）（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と１時間暗室でインキュベートした。染色後、細胞を１５ｍｌのＰＢＥで３回洗浄し、フローサイトメトリーによるフロー選別のために１ｍｌのＰＢＥに再懸濁した。ここで、Ａｌｅｘａ６４７およびＰＥの二重陽性細胞をＰＳＭＡ結合集団として選別した。また、並行して設定した染色コントロールには、（１）染色していないコントロール、（２）抗Ｖ５－Ａｌｅｘａ６４７染色のみ、（３）ＳＡ－ＰＥ染色のみを含んでいた。１．２×１０６個の二重陽性細胞を選別し、３０℃で２日間、ＳＤ－ＣＡＡプレート上で培養した。
第１のフローソーティングから単離した細胞を、第２および第３のフローソーティングにさらに供した。サンプル調製は、第２のフローソーティングにおいて、染色の代わりに５０ｎｇのビオチン化ＰＳＭＡタンパク質および抗ビオチン－ＦＩＴＣ（Ａｂｃａｍ）を用いた以外は、第１のフローソーティングと同様であった。３回目のフローソーティングでは、ビオチン化ＰＳＭＡタンパク質はさらに２ｎｇに減少し、ＳＡ－ＰＥをＰＳＭＡ結合の検出に使用した。最後に、第２および第３のフローソーティングで１×１０６および２×１０４個の細胞（集団の上位０．１％）を選別した。
実施例２：個々の抗ＰＳＭＡクローンの同定
豊富なディスプレイｓｃＦｖライブラリーの分泌ｓｃＦｖライブラリーへの変換
ディスプレイＥＢＹ１００細胞中のｓｃＦｖ遺伝子を有するプラスミドを抽出し、分泌ｓｃＦｖ発現のためにｓｃＦｖ遺伝子フラグメントを増幅して分泌ベクターｐＹＳ１にクローニングし、酵母株ＹＶＨ１０に形質転換した。
酵母プラスミド抽出キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）のプロトコルに従い、第３のフロー選別中に選別した上位０．１％集団の拡大後に酵母プラスミドを抽出し、以下のプライマーを用いてｓｃＦｖ遺伝子フラグメントをＰＣＲによって増幅した。順方向：５’－ＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣ－３’（配列番号１１１）、および逆方向：５’－ＡＧＴＡＧＡＡＴＣＡＡＧＡＣＣＴＡＧＴＡＧＡＧＧＧ－３’（配列番号１１２）。次いで、増幅されたｓｃＦｖ遺伝子フラグメントを精製し、Ｓｆｉ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ線状化分泌ｓｃＦｖ発現ベクターｐＹＳ１と共に酵母株ＹＶＨ１０に同時形質転換した。ｓｃＦｖ遺伝子／ベクターのモル比は３：１であり、形質転換には１μｇのベクターを用いた。ＹＶＨ１０コンピテント細胞の調製および形質転換は以前に記載されている（Ｚｈａｏら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１１；３６３（２）：２２１－３２）。形質転換細胞をＳＤ－ＣＣＡ－Ｔｒｐ（ＳＤ－ＣＡＡ＋０．００８％トリプトファン）上で３０℃で２日間培養した。
ＰＳＭＡ結合ｓｃＦｖクローンの同定
３８４の分泌ｓｃＦｖクローンを選び取り、ＳＤ－ＣＡＡ－Ｔｒｐで培養し、可溶性ｓｃＦｖの発現をＳ－ＣＡＡ－ＧＲＤ－Ｔｒｐ中で、９６ウェルディープウェルプレートで２０℃で２日間誘導した。ＰＳＭＡ結合ｓｃＦｖをＥＬＩＳＡを用いて同定した。簡単に説明すると、ＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩５０μｌ／ウェルの１μｇ／ｍｌの抗Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ）でコーティングし、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で２回洗浄し、ＰＢＳＴＭ（５％乾燥ミルク（Ｂｉｏｒａｄ）を含むＰＢＳＴ）中で、室温で２時間インキュベートした。次いで、ＰＢＳＴＭで１：１希釈した希釈したの上清含有１００μｌのｓｃＦｖと共に１時間室温でインキュベートし、ＰＢＳＴで６回洗浄し、次いでＰＢＳＴＭ中の０．４μｇ／ｍｌ、５０ｍｌ／ウェルのビオチン化ＰＳＭＡタンパク質と共に室温で１時間インキュベートした。上記のように６回洗浄した後、プレートを１００μｌの１：１０００希釈したストレプトアビジン－ＨＲＰ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共にＰＢＳＴＭ中、室温で１時間インキュベートし、再び６回洗浄し、ＴＭＢ（ＫＰＬ）および停止バッファーをプレートと共に順次インキュベートし、比色アッセイを行った。吸光度をＯＤ４５０で測定した。分析した３８４のクローンのうち、２６０は陽性シグナルを示した（ＯＤ４５０値はバックグラウンド値の２倍より大きい）。９６個の無作為に選んだクローンを、ＰＳＭＡ結合についてさらに分析した。結果は、全てがＰＳＭＡに特異的に結合するが、コントロールタンパク質Ｆｃ（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ組換えタンパク質）には結合しなかったことを示し、その中で、３０クローンをプラスミド抽出のために採取し、ｓｃＦｖフラグメントをＰＣＲ増幅し、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて精製した後に配列決定した。ＰＣＲプライマーは、順方向：ＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＴＴＧＣＴＧＣ（配列番号１１３）、逆方向：ＡＴＡＧＧＧＡＣＣＴＡＧＡＣＴＴＣＡＧＧ（配列番号１１４）；配列決定プライマーは、順方向：ＣＣＴＴＣＴＡＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＡＣＣ（配列番号１１５）、逆方向：ＧＧＡＧＧＧＣＧＴＧＡＡＴＧＴＡＡＧＣ（配列番号１１６）である。配列決定は、全てのクローンが配列番号２、配列番号４および配列番号２０に示されるようなほぼ同じｓｃＦｖ配列、すなわちｇｙ１を有し、配列番号３８、４０、４２、４４、４６、４８および５０に点変異を有していた。
実施例３：抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ
酵母ディスプレイライブラリーパニングは、ＰＳＭＡの組換え細胞外ドメインを使用し、生細胞表面上に発現されたものとは異なるコンフォメーションを有し得る。したがって、ｇｙ１ ｓｃＦｖの細胞表面上に発現されたネイティブコンホーメーションＰＳＭＡへの結合能および抗原結合時の内在化を評価することが必要である。
細胞表面上に発現されたＰＳＭＡへのｇｙ１ ｓｃＦｖの結合
ＰＳＭＡ上のｓｃＦｖ ｇｙ１結合を、フローサイトメトリーを用いてＬＮＣａｐ ＦＧＣ細胞で調べた。簡潔には、ＬＮＣａｐ ＦＧＣ細胞を、５％ＣＯ２を含む３７℃の１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。細胞をＰＢＳで洗浄し、０．０２％のＶｅｒｓｅｎｅ緩衝液（１．３７ＭのＮａＣｌ、２６．８ｍＭのＫＣｌ、８０．７ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１４．７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、５．４ｍＭの二ナトリウムＥＤＴＡ、０．２％Ｄ－グルコース）を用いたインキュベーションによって剥離した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＦＡＣＳ（ＰＢＳ含有０．２％ＦＢＳ）緩衝液で３倍に希釈したｇｙ１含有酵母上清と共に１時間氷上でインキュベートした。細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、暗室で、ＦＡＣＳ緩衝液中の１：２００希釈抗Ｖ５－Ａｌｅｘａ６４７と共に氷上で１時間インキュベートした。非結合抗Ｖ５－Ａｌｅｘａ６４７を、冷ＰＢＳで３回洗浄して除去し、次いで、細胞を８μｌのビアプローブ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む３００μｌのＦＡＣＳに再懸濁した。ＬＮＣａｐ ＦＧＣ細胞上のＧｙ１結合は、フローサイトメトリーを用いて検出され、ここでは、生きた細胞のみがゲートされ、分析された。フローサイトメトリーコントロールには以下のものが含まれる：（１）ＦＡＣＳバッファーを含むビアプローブに再懸濁した死細胞。死細胞は、－８０℃および３７℃で２サイクル凍結融解することにより調製し；（２）死細胞を、ビアプローブを用いずに、ＦＡＣＳバッファーに再懸濁させ；（３）ビアプローブで細胞を染色せず、（４）ビアプローブのみを用いて抗Ｖ５－Ａｌｅｘａ６４７を染色した。結果は、ｇｙ１ ｓｃＦｖがＬｎ－Ｃａｐ ＦＧＣ細胞に有意に結合することができることを示した（図１）。
内在化
内在化は、薬剤を選択的に腫瘍細胞に送達するために使用される場合、抗体の前提条件である。ＡＤＣ、免疫毒素およびナノメディシンの発生のためのｇｙ１の可能性を評価するために、ｇｙ１内在化をフローサイトメトリーを用いて調べた。フローサイトメトリーは、内在化アッセイのための共焦点への単純な代替物である。その根拠は、内在化が３７℃では非常に効率的であるが、４℃では起こらない能動的プロセスであるということである。色素標識抗体をそれぞれ３７℃および４℃で細胞とインキュベートすると、抗体分子は細胞表面に結合し、その一部は３７℃で内在化する。抗体は内在化が起こらないため、４℃でのみ細胞表面に結合する。次いで、トリプシンを用いて、色素標識抗体を含む全ての細胞表面タンパク質を除去する。細胞内の陽性の色素シグナルは内部移行が起こったことを示し、陰性の色素シグナルは内部移行が起こらなかったことを示す。
簡潔に言うと、ＬｎＣａｐ ＦＧＣ細胞を２枚の４８ウェルプレートに播種した。翌日、１００μｌのｇｙ１ ｓｃＦｖ含有酵母上清を、室温で１時間、２００μｌの容量（１００μｌの上清＋１００μｌの細胞培地）中の４μｌの抗Ｖ５－Ａｌｅｘａ４６７と共にプレインキュベートした。次いで、細胞を培地で１回洗浄し、２００μｌのｇｙ１含有培地（１００μｌの新鮮な培地＋１００μｌのプレインキュベーションしたｇｙ１－色素培地）と共に３７℃および４℃でそれぞれ１時間、暗室でインキュベートした。コントロールとして、細胞を両方の温度について同じ濃縮抗Ｖ５－Ａｌｅｘａ４６７とともにインキュベートした。冷ＰＢＳで２回洗浄した後、２００μｌのトリプシンをウェルに加えて細胞表面タンパク質をＲＴで３０分間消化した。次いで、５００μｌの培地を各ウェルに添加してトリプシン処理を停止させ、細胞を２回洗浄し、次いでフローサイトメトリー分析のためにＦＡＣＳ緩衝液を含むビアプローブに懸濁させた。死細胞コントロールも、上述のように設定した。
フローサイトメトリーの結果は、ｇｙ１ ｓｃＦｖを４℃でＬｎ－Ｃａｐ ＦＧＣ細胞とともにインキュベートすると、抗体は細胞表面にしか結合できないことを示した。インキュベーションが３７℃であった場合、ｇｙ１ ｓｃＦｖは細胞に結合するだけでなく、顕著に内在化し（図２）、ｇｙ１抗体または抗体フラグメントを用いたＰＳＭＡの標的化した薬物送達の基礎となった。
アフィニティー測定
ＳＤ－ＣＡＡ－Ｔｒｐ培地で培養した可溶性ｇｙ１発現ＹＶＨ１０クローンを５００ｍｌまでスケールアップし、次いで細胞をペレット化し、同じ容量のＹＥＰＤ－ＧＲＤ－Ｔｒｐ誘導培地（ＹＥＰＤ培地は、ペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、デキストロース２０ｇ／Ｌを含む）に再懸濁させた。ＹＥＰＤ－ＧＲＤ－Ｔｒｐは、１ｇ／Ｌのデキストロース、２０ｇ／Ｌのガラクトースおよび２０ｇ／Ｌのラフィノースおよび０．００８％のトリプトファンを含むＹＥＰＤ培地であり、２０℃で４日間ｓｃＦｖ発現を誘導する。ｓｃＦｖはＣ末端に６ｘＨｉｓタグを有するので、ニッケルカラムを用いてｓｃＦｖを精製した。上清を０．４５μｍフィルターで濾過し、同じ容積のＥＱバッファー（０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０５Ｍリン酸バッファー、ｐＨ８．０）と混合することによってｐＨを８．０に調節し、５カラム容積のＥＱバッファーで平衡化したＨｉｓＴｒｐ ＨＰカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に入れた。カラムを１０カラム容量の洗浄バッファー（１０ｍＭイミダゾールを含むＥＱバッファー）で洗浄し、ｓｃＦｖを溶出バッファー（２５０ｍＭイミダゾールを含むＥＱバッファー）で溶出した。次いでｓｃＦｖを遠心フィルターユニット（Ａｍｉｃｏ）で濃縮し、イミダゾールを透析によりＰＢＳで除去した。等分したｓｃＦｖを－８０℃で保存した。
捕捉ＥＬＩＳＡを用い、ｇｙ１ ｓｃＦｖの親和性を測定した。ｓｃＦｖのＮ末端およびＣ末端にＦｌａｇタグおよびＶ５タグが存在するので、これらのタグに対する抗体を用いてＥＬＩＳＡアッセイのｓｃＦｖを捕捉した。簡単に説明すると、抗Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ）を、ＥＬＩＳＡプレートに、１μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェルで、４℃で一晩、ＰＢＳ中でコーティングした。プレートをＰＢＳＴで２回洗浄し、ＰＢＳＴＭで、室温で２時間かけてブロッキングし、３個ずつ、３倍に順次希釈したｇｙ１ ｓｃＦｖと共にインキュベートし、これは、１００ｎＭから開始し、ＰＢＳＴＭ中０．１３７ｎＭまで、室温で１時間かけて行った。プレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、次いでＰＢＳＴＭ中の０．５μｇ／ｍｌのビオチン化ＰＳＭＡと共に室温でさらに１時間インキュベートした。６回洗浄した後、プレートをＰＢＳＴＭ中の１：１０００希釈ストレプトアビジン－ＨＲＰ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共に室温で３０分間インキュベートした。プレートを６回再度洗浄し、ＴＭＢと共に室温で２０分間インキュベートし、比色反応を停止バッファーで停止させ、吸光度をＯＤ４５０で読み取った。親和性は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて計算し、Ｋｄ＝１．１６５ｎＭであった（図３）。
実施例４：大腸菌におけるＧｙ１発現および精製
酵母で発現される組換えタンパク質のグリコシル化は、通常、免疫原性の問題を引き起こし、その臨床的適用を制限する可能性がある。この潜在的な問題を克服するために、大腸菌におけるｇｙ１ ｓｃＦｖの原核生物発現が追求された。ｇｙ１遺伝子を増幅し、原核生物発現ベクターｐＥＴ３０２（ｐＥＴ３０２－ｇｙ１と命名）にクローニングした後、大腸菌ＢＬ２１に形質転換し、０．０５ｍＭイソプロピル－１－チオ－ｂ－ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって、３０℃で４時間発現させた。ソニケーターを用いて大腸菌細胞を溶解し、次いで、上記のようにＨｉｓＴｒｐ ＨＰカラムを用いてｇｙ１タンパク質を精製した（図４）。抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ（ＮＣＰ１と命名）を同じ方法で発現および精製し、陰性コントロールとして使用した。
フローサイトメトリーを用いて、大腸菌発現ｇｙ１ ｓｃＦｖのＰＭＳＡ陽性細胞および陰性細胞への結合を調べた。簡単に言うと、前立腺癌細胞、ＬＮＣａＰ、Ｃ４－２、ＰＣ３－ＰＳＭＡ＋およびＰＣ３－ＰＳＭＡ－細胞をＶｅｒｓｅｎｅ溶液（１．３７ＭのＮａＣｌ、２６．８ｍＭのＫＣｌ、８０．７ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１４．７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、５．４ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム、０．２％のＤ－グルコース）で剥離させ、１×１０６細胞／ｍｌの密度でＰＢＳに再懸濁し、細胞はＰＢＳで洗浄し、１００ｎＭのｇｙ１またはコントロールｓｃＦｖ ＮＣＰ１を用い、４℃で３０分間インキュベートし、その後、洗浄し、ＦＩＴＣコンジュゲート化マウス抗６Ｈｉｓ ＩｇＧ（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ；Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と共に、暗室で、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。並行して、ＰＳＭＡタンパク質発現は、ＰＥコンジュゲート化市販抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって検出された。結果は、大腸菌発現ｇｙ１がＰＳＭＡ陽性細胞のみに結合できるが、陰性細胞は結合しないことを示した（図５）。
実施例５：細胞ＥＬＩＳＡによるｇｙ１親和性測定
細胞表面ＰＳＭＡに対する大腸菌発現ｇｙ１ ｓｃＦｖの結合親和性を評価するために、ＰＳＭＡ陽性Ｃ４－２細胞を、９６ウェルプレートに５×１０４／ウェルで播種し、一晩培養した。翌日、細胞を４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定した後、３％Ｈ２Ｏ２で２０分間処理して内因性ペルオキシダーゼをブロックし、続いて６％ウシ血清アルブミンで３０分間室温でブロッキングした。３倍連続希釈したｇｙ１およびコントロールｓｃＦｖ ＮＣＰ１を８１００ｎＭから０．００５ｎＭまで添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳＴで洗浄し、ＨＲＰ結合マウス抗６Ｈｉｓ抗体（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ、オックスフォード、ＵＫ）と共に室温で１時間インキュベートした。３，３’、５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を加えて比色シグナルを発色させ、１５分間１Ｍ Ｈ２ＳＯ４でインキュベートすることにより停止させた。Ｓｕｎｒｉｓｅマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、Ｇｒｏｅｄｉｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０ソフトウェアを用いて結合曲線を分析した。ｇｙ１親和性は、１部位結合双曲線方程式の非線形回帰分析を用いて計算した。大腸菌発現ｓｃＦｖ ｇｙ１の親和性は、Ｋｄ＝４．１３４ｎＭとして計算した（図６）。
実施例６：共焦点イメージングを用いたｇｙ１内在化アッセイ
大腸菌発現ｇｙ１ ｓｃＦｖを用いて、共焦点イメージングを用いた内在化を研究した。５０％コンフルエンスでカバースリップ上で増殖させた前立腺細胞（すなわち、ＬｎＣａｐ、Ｃ４－２、ＰＣ３－ＰＳＭＡ＋およびＰＣ３－ＰＳＭＡ－）を、２００ｎＭ ｇｙ１またはＮＣＰ１と３７℃で２時間インキュベートした。細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定した。内在化ｇｙ１は、ＦＩＴＣ結合マウス抗６Ｈｉｓ ＩｇＧ（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ； Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって検出された。次いで、細胞を４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色して核を可視化した。最後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、スライド上に載せ、レーザー走査共焦点顕微鏡（ＦｌｕｏＶｉｅｗ ＦＶ１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）で観察した。結果は、強い蛍光シグナルが、ＰＳＭＡ陽性細胞株ＬＮＣａＰ、Ｃ４－２およびＰＣ３－ＰＳＭＡ＋の細胞質において観察され得ることを示した。ＰＳＭＡ陰性ＰＣ３－ＰＳＭＡ細胞では、蛍光シグナルは検出されない（図７）。これらの結果は、ｇｙ１がＰＳＭＡ陽性細胞に効果的に内在化され得ることをさらに実証した。
内在化後のｇｙ１の細胞内輸送を調べるために、Ｃ４－２細胞におけるエンドソーム、リソソーム、ゴルジ体およびＥＲ（赤色蛍光）を含む特定の細胞小器官とのｇｙ１（緑色蛍光）の共局在を調べるために免疫蛍光染色を行った。細胞オルガネラの染色は、ＣｅｌｌＬｉｇｈｔ（登録商標）Ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ－ＲＦＰ、ＣｅｌｌＬｉｇｈｔ（登録商標）Ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ－ＲＦＰ、ＣｅｌｌＬｉｇｈｔ（登録商標）Ｇｏｌｇｉ－ＲＦＰおよびＣｅｌｌＬｉｇｈｔ（登録商標）ＥＲ－ＲＦＰを含め、ＣｅｌｌＬｉｇｈｔ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用い、製造業者のプロトコルに従って行われた。細胞画像は、共焦点顕微鏡（ＦｌｕｏＶｉｅｗ ＦＶ１０００、オリンパス）を走査するレーザーによって捕捉された。結果は、４時間のインキュベーション後、ｇｙ１がエンドソームおよびリソソームに優勢に蓄積したことを示し（図８Ａの黄色蛍光）、ｇｙ１がエンドソーム－リソソーム経路を介して標的細胞に内在化することを示唆した。インキュベーション時間の異なる期間について、ｇｙ１およびＧｏｌｇｉまたはＥＲのシグナル間に重複はなかった（図８Ｂ）。
内在化タンパク質は、主に２つの輸送経路を有する。１つはエンドソームからリソソームへと直接的に入り、もう１つはゴルジ体からＥＲへと向かう。これは逆行性の移動と呼ばれ、輸送のリサイクルによく使われる。ｇｙ１がゴルジ装置またはＥＲと同時染色することにより、ｇｙ１が第２の経路を使用するかどうかをさらに調べた。結果は、異なる時点でインキュベートしても、ｇｙ１の内部移行後に第２の輸送経路の可能性を排除し、ｇｙ１とＧｏｌｇｉまたはＥＲとの間で共局在は観察されないことを示した（図８Ｂ）。
実施例７：ｇｙ１によるｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍標的化
ｉｎ ｖｉｖｏでのＰＳＭＡ標的化のためのｇｙ１の能力および効率を評価し、ｇｙ１系の手術中の光学イメージングの実行可能性を評価するために、ＰＳＭＡ陽性および陰性の異種移植ヌードマウスモデルを、ルシフェラーゼ発現ＰＣ３－ＰＳＭＡ＋およびＰＣ３－ＰＳＭＡ－細胞を用いて確立した。異種移植腫瘍モデルは、各マウスの右股関節に０．１ｍＬ ＰＢＳ中の５ｘ１０６個のホタルルシフェラーゼ発現ＰＣ３－ＰＳＭＡ＋またはＰＣ３－ＰＳＭＡ－細胞を注射することによって発達させた。接種の２週間後、腫瘍組織を単離し、Ｈ＆Ｅおよび免疫組織化学染色を行い、組織形態およびＰＳＭＡ発現レベルを確認した。結果は、ＰＳＭＡがＰＣ３－ＰＳＭＡ＋前立腺癌組織において検出され得るが、ＰＣ３－ＰＳＭＡ－前立腺癌組織において検出され得ないことを示した（図９）。ルシフェラーゼ発現はまた、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳキネティックイメージングシステム（図１１、左パネル）による両方の異種移植モデルにおいて確認された。このＰＳＭＡ陽性および陰性の前立腺癌異種移植片マウスモデルをｇｙ１標的評価に使用した。
ｉｎ ｖｉｖｏ光学イメージング研究のために、タンパク質／染料比１：２０で、１ｍｇ／ｍｌの濃度で、ｇｙ１およびＮＣＰ１タンパク質を、製造業者の指示に従い、ＩＲＤｙｅ８００ｃｗラベリングキット（Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ネブラスカ、ＵＳＡ）を用い、ＩＲＤｙｅ８００で標識した。余分な色素を透析により除去した。フローサイトメトリー分析（図１０）により、色素標識は、ＰＣ３－ＰＳＭＡ＋細胞上で確認されたｇｙ１のＰＳＭＡ結合親和性を妨害しなかった。各マウスについて、０．２μｍｏｌ／ｋｇのＩＲＤｙｅ８００標識ｇｙ１またはＮＣＰ１を静脈内に注射し、マウスを指示された時点で麻酔し、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ Ｋｉｎｅｔｉｃイメージングシステムで、励起波長７４５ｎｍで、ＩＲＤｙｅ８００蛍光をリアルタイムの様式でモニタリングした。同一照明設定（１秒露出、ｆ／ストップ＝２）を全ての画像に使用した。生体内全身近赤外蛍光イメージング（ＦＬＩ）と並行して、１２時間処理した各群の５匹のマウスを屠殺し、異なる組織を単離し、それらの蛍光強度を分析した。蛍光強度は、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェアを用いて計算し、光束（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）として示した。
結果は、ｇｙ１標識されたＩＲＤｙｅ８００が１時間後に全身に急速に拡散し、２時間から腫瘍組織で検出され得ることを示した。次に、ｇｙ１と標識されたＩＲＤｙｅ８００を体から徐々に除去したが、ＰＳＭＡ陽性腫瘍組織にはまだ特異的に保持されたが、ＰＳＭＡ陰性腫瘍組織には特異的に保持されなかった（図１１、右パネル、図１２）。注射後６時間で腫瘍における最高シグナル／バックグラウンド比が得られ、腫瘍内のシグナルは２４時間後にほとんど検出されなかった。各群の５匹のマウスを、ｇｙ１注射の１２時間後に屠殺し、さらなる生体分布評価のために異なる組織を収集した。ＦＬＩデータと一致して、ＰＣ３－ＰＳＭＡ＋群の腫瘍組織において最も強い蛍光シグナルが検出され、腎臓、肝臓および脾臓では比較的弱いシグナルが検出され、他の組織では無視できるシグナルしか検出されない。ＰＣ３－ＰＳＭＡ－群では、腫瘍組織において明らかな蛍光シグナルは検出されない（図１３Ａおよび図１３Ｂ）。これらのデータは、ｇｙ１が、術中の光学イメージング、ＰＥＴイメージング、ナノメディシンおよび抗体薬物コンジュゲートのようなｇｙ１を用いたＰＳＭＡターゲティングイメージングおよび治療戦略の開発を促進する、ｉｎ ｖｉｖｏでＰＳＭＡ陽性腫瘍組織を特異的に標的化および分布させることができることを示唆した。
実施例８：完全抗体へのｇｙ１ ｓｃＦｖの操作
配列番号４０／４１，４２／４３，４４／４５，４６／４７（ｇｙ１－２）の突然変異を有するＧｙ１ ｓｃＦｖを、それぞれ重鎖および軽鎖の両方のためのシグナルペプチドおよび定常領域を移植することによって完全抗体に操作した。抗体生殖系列データベースの配列分析により、ＩＧＨＶ３－３０－３＊０２およびＩＧＬＶ１－５０＊０１シグナルペプチド、およびＩｇＧ１およびＣＬ１定常領域がそれぞれ重鎖および軽鎖について選択された。重鎖および軽鎖の核酸およびアミノ酸配列を配列番号５２／５３および６０／６１に示し、成熟した重鎖および軽鎖（シグナルペプチド切断後）の配列を配列番号６８および６９に示す。操作された完全抗体はＰＳＭＡｂと命名された。重鎖および軽鎖の核酸配列をＣＨＯ細胞発現のためにコドン最適化し、合成し、ベクターｐｃＤＮＡ３にそれぞれクローン化した。組換えＰＳＭＡｂは、製造者のプロトコル（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ発現システム）に従って、懸濁ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－Ｓ）への１：４の比の重鎖および軽鎖発現ベクターの一時的同時トランスフェクションによって発現された。発現７日後、上清を回収し、ＨｉＴｒａｐ ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＰＳＭＡｂを精製した。簡単に説明すると、上清を同量のブイファーＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）と混合し、０．４５μｍ膜を通して濾過し、５カラム容量の緩衝液Ａで平衡化したＨｉＴｒａｐ ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦカラムに適用した。カラムを１０カラム容量の緩衝液Ａで洗浄し、抗体を緩衝液Ｂ（０．１Ｍクエン酸、ｐＨ３．５）で溶出し、緩衝液Ｃ（１．０Ｍトリス－ＨＣｌ ｐＨ９．０）で中和した。抗体を透析によりＰＢＳに緩衝液に変更し、等分し、－８０℃で保存した（図１４Ａ）。
実施例９：ＰＳＭＡｂ完全抗体の特性決定
アフィニティー測定
陰性コントロールとしてＰＳＭＡｂの代わりにコントロールヒトＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ）を用い、ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ Ａｂ（１：２００００、Ａｂｃａｍ）を二次抗体として用いた以外は、実施例５に記載したように、ＥＬＩＳＡでＰＳＭＡｂの親和性を測定した。ＰＳＭＡｂの３倍系列希釈は、１００ｎＭから開始して０．１９ｐＭに下げた。計算されたＰＳＭＡｂの親和性は０．１ｎＭである（図１４Ｂ）。
細胞結合およびブロッキングアッセイ
細胞表面上に発現されたＰＳＭＡへのＰＳＭＡｂの結合は、いくつかの前立腺細胞株、すなわちＰＳＭＡ＋細胞Ｃ４－２、ＬＮＣａＰ、ＰＣ－３－ＰＳＭＡ＋およびＰＳＭＡ－細胞ＰＣ－３およびＤＵ－１４５についてフローサイトメトリーによって研究されている。簡単に説明すると、３回洗浄した後、分離した細胞をまずＰＳＭＡｂ、陰性コントロールヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）または陽性コントロール抗体ＬＮＩ－１７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と共にインキュベートし、次いで１：２０希釈ＰＥ結合二次抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）でインキュベートした。フローサイトメトリーにより細胞結合シグナルを検出した。結果は、ＰＳＭＡｂはＰＳＭＡ陽性細胞のみに結合することができるが、ＬＮＩ－１７染色によって確認されるＰＳＭＡ発現レベルと一致する陰性細胞は結合できないことを示した（図１５）。
ＰＳＭＡ＋細胞へのＰＳＭＡｂの結合がＰＳＭＡ特異的であることをさらに確認するために、組換えＰＳＭＡタンパク質またはコントロールタンパク質ＢＳＡを用いてブロッキングアッセイを実施した。細胞とのインキュベーションの前に、２ｎＭの濃度のＰＳＭＡｂを、２，６および１０ｎＭの組換えＰＳＭＡ、またはコントロールとして１０ｎＭのＢＳＡと一緒に室温で２時間プレインキュベートしたことを除いて、上記のフローサイトメトリーを用いてＰＣ３－ＰＳＭＡ＋細胞でブロッキングアッセイを試験した。結果は、ＰＳＭＡ組換えタンパク質が、同じ濃度の抗体、すなわち２ｎＭでも、ＰＳＭＡｂのＰＣ３－ＰＳＭＡ＋細胞への結合を完全にブロックすることができることを示した（図１６）。
ＰＳＭＡｂの内在化
前立腺癌細胞Ｃ４－２、ＬＮＣａＰ、ＰＣ－３およびＤＵ－１４５について、実施例６に記載したように、ただし、コントロールヒトＩｇＧ１を陰性コントロールとして使用し、二次抗体は、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（１：５０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）にして、ＰＳＭＡｂの内在化を試験した。結果は、ＰＳＭＡｂが選択的かつ効果的にＰＳＭＡ陽性細胞に内在化できることを示した（図１７）。
実施例１０：ＰＳＭＡｂのｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍標的化
腫瘍標的の効率およびＰＳＭＡｂの術中光学イメージングの可能性を評価するために、ＰＳＭＡｂを近赤外色素ＩＲＤｙｅ８００ＣＷで標識し、５０μｇ標識ＰＳＭＡｂ／マウスをＰＣ３－ＰＳＭＡ＋またはＰＣ３－ＰＳＭＡ－異種移植片に尾静脈注射したＰＳＭＡｂのリアルタイム生体内分布を、実施例７に記載したように、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳキネティックイメージングシステムを用いてモニターした。ｉｎ ｖｉｖｏ光学撮像は、ＰＳＭＡｂが全身に急速に拡散し、注射後２４時間から腫瘍組織で検出され、その後、ＰＳＭＡ＋腫瘍では特異的に保持されているがＰＳＭＡ－腫瘍では特異的に保持されている間に徐々に体から除去されたことを示した（図１８Ａ～図１８Ｃ）。良好なシグナル／バックグラウンド比が注射後４８時間で観察された（図１８Ａ～図１８Ｃ）。ｓｃＦｖと比較して、完全抗体は、より長い循環時間を有し、したがって光学イメージングのためのより良いシグナル／バックグラウンド比を有する。
実施例１１：ＤＭ１抗体薬物結合
ＰＳＭＡ標的化ＡＤＣを開発するために、ＰＳＭＡｂを安定リンカーＳＭＣＣを介してＤＭ１と結合させた（図１９）。簡単には、ＰＳＭＡｂを５０ｍＭリン酸カリウム、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２に緩衝液交換し、濃度を４ｍｇ／ｍｌに調整した。ＳＭＣＣ－ＤＭ１（Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をＤＭＡに溶解して最終濃度１０ｍＭとした。各容量の抗体溶液に、０．４３％容量のＤＭＡを加え、混合し、次に２．６７％容量の１０ｍＭ ＳＭＣＣ－ＤＭ１を加える。ＤＭＡの最終濃度は３％（ｖ／ｖ）であり、薬物／Ａｂ比は１０：１である。溶液を混合しながら室温で３時間進行させ、次いで透析により緩衝液をＰＢＳに交換した。コンジュゲートの２５２および２８０ｎｍでの吸光度に基づいて、上記のように３．３で薬物／Ａｂコンジュゲート比を測定した（ＵＳ ２００６００８８５３９ Ａ１号）。
実施例１２：ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ抗体薬物結合
ＰＳＭＡ標的化ＡＤＣを開発するために、ＰＳＭＡｂを切断可能なリンカーＭｃ－ｖｃ－ＰＡＢを介してそれぞれＭＭＡＥおよびＭＭＡＦとコンジュゲートさせた（図２０）。抗体濃度は、０．０２５Ｍホウ酸ナトリウムｐＨ８、０．０２５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＰＡ中で８ｍｇ／ｍｌに調整し、２．７５モル当量のＴＣＥＰにより部分的に３７℃で２時間還元した。次いで、混合物を０℃に冷却し、抗体濃度を５．６２５ｍｇ／ｍｌに調整し、冷アセトニトリルに溶解した０．２５容量の７００ｍＭ ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥおよびＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦと混合し、反応を氷上で３０分間継続させた。過剰のＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥまたはＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦをシステイン（１ｍＭ最終濃度）でクエンチした。抗体薬物コンジュゲートを、ＰＤ－１０カラムを用いて記載されているように精製した（Ｋｅｖｉｎ Ｊ．Ｈａｍｂｌｅｔｔら、２００４，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１０；７０６３）。記載されているように、２５０および２８０ｎＭでの吸光度の比を測定することにより、抗体あたり３．５および３．０３のＭＭＡＥおよびＭＭＡＦについて薬物負荷を決定する（Ｋｅｖｉｎ Ｊ． Ｈａｍｂｌｅｔｔら、２００４、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、１０；７０６３）。
実施例１３：ＰＳＭＡｂは薬物結合後のＰＳＭＡ結合および内在化能力を保持する
ＤＭ１、ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦと結合させた後、ＰＳＭＡ結合およびＰＳＭＡｂ薬物コンジュゲートの内在化を、上記のフローサイトメトリーおよび共焦点イメージングによってそれぞれ評価した。結果は、ＰＳＭＡｂ薬物コンジュゲートの抗原結合および内在化が十分に保持されていることを示した（図２１および図２２）。
実施例１４：ＰＳＭＡｂ抗体薬物コンジュゲートのＰＳＭＡ特異的細胞傷害性
ＰＳＭＡｂに基づくＡＤＣの細胞傷害性を、ＰＳＭＡ－細胞系ＰＣ－３およびＰＳＭＡ＋細胞系Ｃ４－２で評価した。簡潔には、Ｃ４－２およびＰＣ－３細胞を、１０％ＦＢＳ、２０００細胞／２００ｍＬ／ウェルを有するＤＭＥＭ培地中９６ウェルプレートに播種した。次の日に、細胞密度は約２０～３０％であり、培地を、それぞれの濃度で３個ずつ、３３３．３３ｎＭ、１３３．３３ｎＭ、６６．６７ｎＭ、３３．３３ｎＭ、６．６７ｎＭ、３．３３ｎＭ、０．６７ｎＭ、０．３３ｎＭ、０．０６７ｎＭ、０．００６７ｎＭ、０．０００６７ｎＭおよび０．００００６７ｎＭの濃度でＰＳＭＡｂ－ＤＭ１、ＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＥまたはＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＦを含む新しい培地と交換した。各ウェルについて同じ薬物濃度で培地を毎日交換した。４日間のインキュベーション後、製造元のプロトコルに従ってａｌａｍａｒＢｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）キットを用いて細胞生存率を評価した。結果は、ＰＳＭＡｂ－ＤＭ１、ＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＥおよびＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＦは、ＰＣ－３細胞に対して毒性がないが、Ｃ４－２細胞に対して用量依存性の毒性を有し、ＰＳＭＡｂ－ＤＭ１、ＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＥおよびＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＦについてそれぞれ０．１２ｎＭ、０．５９ｎＭおよび０．９２ｎＭのＩＣ５０を有していた（図２３）。
実施例１５：ＰＳＭＡ－ＡＤＣはＰＳＭＡ＋細胞のアポトーシスを特異的に誘導する
ＰＳＭＡ特異的細胞死滅におけるＰＳＭＡｂ ＡＤＣの機構をさらに調べるために、ＰＳＭＡｂ ＡＤＣ誘導アポトーシスをＰＣ－３およびＣ４－２細胞で調べた。簡単に言うと、ＰＣ－３およびＣ４－２細胞を６ウェルプレートに２×１０５／２ｍｌ培地／ウェルの密度で播種し、一晩培養した。翌日、培地を交換し、２ｍｌ培地中、細胞をＰＳＭＡｂ－ＡＤＣと共に、５０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌおよび０．００１μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした。５０ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトＩｇＧおよびＰＳＭＡｂをコントロールとして使用した。４８時間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、製造者の指示に従ってＡｎｎｅｘｉｎ－Ｖ／ＰＩ（Ｒｏｃｈｅ）で染色した。アポトーシスは、早期アポトーシスを示すアネキシンＶ（＋）／ＰＩ（－）および後期アポトーシスを示すアネキシンＶ（＋）／ＰＩ（＋）の二重陽性染色を有するフローサイトメトリーを用いて検出された。総アポトーシスは、早期アポトーシスおよび後期アポトーシスの合計である。結果は、ＰＳＭＡｂ－ＤＭ１が主に後期アポトーシスおよびＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＥを誘導した一方で、３つのＰＳＭＡｂに基づくＡＤＣＳ、すなわちＰＳＭＡｂ－ＤＭ１、ＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＥ、およびＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＦの全てが早期アポトーシスおよび後期アポトーシスの効率的誘導を可能にし、ＰＳＭＡｂ－ＭＭＡＦは主に早期アポトーシスを誘導した（図２４）。
実施例１６：配列
配列番号１ ＰＳＭＡの細胞外ドメイン：
ＫＳＳＮＥＡＴＮＩＴＰＫＨＮＭＫＡＦＬＤＥＬＫＡＥＮＩＫＫＦＬＹＮＦＴＱＩＰＨＬＡＧＴＥＱＮＦＱＬＡＫＱＩＱＳＱＷＫＥＦＧＬＤＳＶＥＬＡＨＹＤＶＬＬＳＹＰＮＫＴＨＰＮＹＩＳＩＩＮＥＤＧＮＥＩＦＮＴＳＬＦＥＰＰＰＰＧＹＥＮＶＳＤＩＶＰＰＦＳＡＦＳＰＱＧＭＰＥＧＤＬＶＹＶＮＹＡＲＴＥＤＦＦＫＬＥＲＤＭＫＩＮＣＳＧＫＩＶＩＡＲＹＧＫＶＦＲＧＮＫＶＫＮＡＱＬＡＧＡＫＧＶＩＬＹＳＤＰＡＤＹＦＡＰＧＶＫＳＹＰＤＧＷＮＬＰＧＧＧＶＱＲＧＮＩＬＮＬＮＧＡＧＤＰＬＴＰＧＹＰＡＮＥＹＡＹＲＲＧＩＡＥＡＶＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩＧＹＹＤＡＱＫＬＬＥＫＭＧＧＳＡＰＰＤＳＳＷＲＧＳＬＫＶＰＹＮＶＧＰＧＦＴＧＮＦＳＴＱＫＶＫＭＨＩＨＳＴＮＥＶＴＲＩＹＮＶＩＧＴＬＲＧＡＶＥＰＤＲＹＶＩＬＧＧＨＲＤＳＷＶＦＧＧＩＤＰＱＳＧＡＡＶＶＨＥＩＶＲＳＦＧＴＬＫＫＥＧＷＲＰＲＲＴＩＬＦＡＳＷＤＡＥＥＦＧＬＬＧＳＴＥＷＡＥＥＮＳＲＬＬＱＥＲＧＶＡＹＩＮＡＤＳＳＩＥＧＮＹＴＬＲＶＤＣＴＰＬＭＹＳＬＶＨＮＬＴＫＥＬＫＳＰＤＥＧＦＥＧＫＳＬＹＥＳＷＴＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰＲＩＳＫＬＧＳＧＮＤＦＥＶＦＦＱＲＬＧＩＡＳＧＲＡＲＹＴＫＮＷＥＴＮＫＦＳＧＹＰＬＹＨＳＶＹＥＴＹＥＬＶＥＫＦＹＤＰＭＦＫＹＨＬＴＶＡＱＶＲＧＧＭＶＦＥＬＡＮＳＩＶＬＰＦＤＣＲＤＹＡＶＶＬＲＫＹＡＤＫＩＹＳＩＳＭＫＨＰＱＥＭＫＴＹＳＶＳＦＤＳＬＦＳＡＶＫＮＦＴＥＩＡＳＫＦＳＥＲＬＱＤＦＤＫＳＮＰＩＶＬＲＭＭＮＤＱＬＭＦＬＥＲＡＦＩＤＰＬＧＬＰＤＲＰＦＹＲＨＶＩＹＡＰＳＳＨＮＫＹＡＧＥＳＦＰＧＩＹＤＡＬＦＤＩＥＳＫＶＤＰＳＫＡＷＧＥＶＫＲＱＩＹＶＡＡＦＴＶＱＡＡＡＥＴＬＳＥＶＡ
配列番号２ ｇｙ１ ｓｃＦｖ核酸配列：
ＣＡＧＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＧＴＣＡＴＴＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＧＧＣＡＧＧＴＴＣＴＣＡＴＧＴＡＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＴＴＣＣＡＧＧＡＡＣＡＧＣＣＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＴＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＣＣＴＣＡＧＧＴＴＣＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＡＣＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡＴＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＡＡＣＡＴＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧＴＣＴＧＡＡＴＧＧＴＧＴＡＡＴＡＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＡＧＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＣＣＣＴＣＡＧＴＧＧＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＡＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＣＡＡＴＡＡＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＴＡＡＡＧＧＣＣＴＴＡＣＴＴＧＧＧＧＡＣＴＣＧＧＴＧＡＣＡＡＴＧＡＴＧＣＴＣＴＣＧＡＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＣＣＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号３ ｇｙ１ ｓｃＦｖアミノ酸配列：
ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＧＡＰＧＱＳＶＩＩＳＣＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＳＨＶＨＷＹＱＱＶＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＧＮＴＮＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＧＳＬＡＩＴＧＬＱＰＥＤＥＡＤＹＹＣＡＴＷＤＤＳＬＮＧＶＩＦＧＧＧＴＫＶＴＶＬＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＥＶＱＬＶＥＳＧＧＡＬＡＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＴＬＳＧＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＦＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＬＴＷＧＬＧＤＮＤＡＬＤＩＷＧＰＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号４ ｇｙ１ ＶＬ核酸配列：
ＣＡＧＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＧＴＣＡＴＴＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＧＧＣＡＧＧＴＴＣＴＣＡＴＧＴＡＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＴＴＣＣＡＧＧＡＡＣＡＧＣＣＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＴＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＣＣＴＣＡＧＧＴＴＣＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＡＣＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡＴＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＡＡＣＡＴＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧＴＣＴＧＡＡＴＧＧＴＧＴＡＡＴＡＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＡ
配列番号５ ｇｙ１ ＶＬアミノ酸配列：
ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＧＡＰＧＱＳＶＩＩＳＣＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＳＨＶＨＷＹＱＱＶＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＧＮＴＮＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＧＳＬＡＩＴＧＬＱＰＥＤＥＡＤＹＹＣＡＴＷＤＤＳＬＮＧＶＩＦＧＧＧＴＫＶＴＶＬ
配列番号６ ｇｙ１ ＶＬフレーム領域１（ＦＲ１）核酸配列：
ＣＡＧＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＧＴＣＡＴＴＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧＧＡＧＣ
配列番号７ ｇｙ１ ＶＬフレーム領域１（ＦＲ１）アミノ酸配列：
ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＧＡＰＧＱＳＶＩＩＳＣＴＧＳ
配列番号８ ｇｙ１ ＶＬ ＣＤＲ１核酸配列：
ＡＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＧＧＣＡＧＧＴＴＣＴＣＡＴ
配列番号９ ｇｙ１ ＶＬ ＣＤＲ１アミノ酸配列：
ＳＳＮＩＧＡＧＳＨ
配列番号１０ ｇｙ１ ＶＬフレーム領域２（ＦＲ２）核酸配列：
ＧＴＡＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＴＴＣＣＡＧＧＡＡＣＡＧＣＣＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴ
配列番号１１ ｇｙ１ ＶＬフレーム領域２（ＦＲ２）アミノ酸配列：
ＶＨＷＹＱＱＶＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹ
配列番号１２ ｇｙ１ ＶＬ ＣＤＲ２核酸配列：
ＧＧＡＡＡＣＡＣＣ
配列番号１３ ｇｙ１ ＶＬ ＣＤＲ２アミノ酸配列：
ＧＮＴ
配列番号１４ ｇｙ１ ＶＬフレーム領域３（ＦＲ３）核酸配列：
ＡＡＴＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＣＣＴＣＡＧＧＴＴＣＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＡＣＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡＴＴＡＴＴＡＴＴＧＴ
配列番号１５ ｇｙ１ ＶＬフレーム領域３（ＦＲ３）アミノ酸配列：
ＮＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＧＳＬＡＩＴＧＬＱＰＥＤＥＡＤＹＹＣ
配列番号１６ ｇｙ１ ＶＬ ＣＤＲ３領域核酸配列：
ＧＣＡＡＣＡＴＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧＴＣＴＧＡＡＴＧＧＴＧＴＡＡＴＡ
配列番号１７：
ＡＴＷＤＤＳＬＮＧＶＩ
配列番号１８：
ＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＡ
配列番号１９ ｇｙ１ ＶＬフレーム領域４（ＦＲ４）アミノ酸配列：
ＦＧＧＧＴＫＶＴＶＬ
配列番号２０ ｇｙ１ ＶＨ核酸配列：
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＣＣＣＴＣＡＧＴＧＧＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＡＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＣＡＡＴＡＡＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＴＡＡＡＧＧＣＣＴＴＡＣＴＴＧＧＧＧＡＣＴＣＧＧＴＧＡＣＡＡＴＧＡＴＧＣＴＣＴＣＧＡＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＣＣＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号２１ ｇｙ１ ＶＨアミノ酸配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＡＬＡＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＴＬＳＧＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＦＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＬＴＷＧＬＧＤＮＤＡＬＤＩＷＧＰＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号２２ ｇｙ１ ＶＨフレーム領域１（ＦＲ１）核酸配列：
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴ
配列番号２３ ｇｙ１ ＶＨフレーム領域１（ＦＲ１）アミノ酸配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＡＬＡＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ
配列番号２４ ｇｙ１ ＶＨ ＣＤＲ１核酸配列：
ＧＧＡＴＣＣＡＣＣＣＴＣＡＧＴＧＧＣＴＡＴＧＣＴ
配列番号２５ ｇｙ１ ＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列：
ＧＳＴＬＳＧＹＡ
配列番号２６ ｇｙ１ ＶＨフレーム領域２（ＦＲ２）核酸配列：
ＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＴ
配列番号２７ ｇｙ１ ＶＨフレーム領域２（ＦＲ２）アミノ酸配列：
ＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶ
配列番号２８ ｇｙ１ ＶＨ ＣＤＲ２領域核酸配列：
ＡＴＡＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＣＡＡＴＡＡＡ
配列番号２９ ｇｙ１ ＶＨ ＣＤＲ２領域アミノ酸配列：
ＩＳＹＤＧＳＮＫ
配列番号３０ ｇｙ１ ＶＨフレーム領域３（ＦＲ３）核酸配列：
ＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴ
配列番号３１ ｇｙ１ ＶＨフレーム領域３（ＦＲ３）アミノ酸配列：
ＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＦＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣ
配列番号３２ ｇｙ１ ＶＨ ＣＤＲ３領域核酸配列：
ＧＣＴＡＡＡＧＧＣＣＴＴＡＣＴＴＧＧＧＧＡＣＴＣＧＧＴＧＡＣＡＡＴＧＡＴＧＣＴＣＴＣＧＡＴＡＴＣ
配列番号３３ ｇｙ１ ＶＨ ＣＤＲ３領域アミノ酸配列：
ＡＫＧＬＴＷＧＬＧＤＮＤＡＬＤＩ
配列番号３４ ｇｙ１ ＶＨフレーム領域４（ＦＲ４）核酸配列：
ＴＧＧＧＧＣＣＣＣＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号３５ ｇｙ１ ＶＨフレーム領域４（ＦＲ４）アミノ酸配列：
ＷＧＰＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号３６ ｇｙ１ ｓｃＦｖリンカー核酸配列：
ＧＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＴ
配列番号３７ ｇｙ１ ｓｃＦｖリンカーアミノ酸配列：
ＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ
配列番号３８ 点変異を有するｇｙ１ ＶＬフレーム領域２（ＦＲ２）核酸配列：
ＧＴＡＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＡＡＣＡＧＣＣＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴ
配列番号３９ 点変異を有するｇｙ１ ＶＬフレーム領域２（ＦＲ２）アミノ酸配列：
ＶＨＷＹＱＱＡＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹ （Ｖ＝＞Ａ）
配列番号４０ 点変異を有するｇｙ１ ＶＬ ＣＤＲ２核酸配列：
ＧＡＡＡＡＣＡＣＣ
配列番号４１ 点変異を有するｇｙ１ ＶＬ ＣＤＲ２アミノ酸配列：
Ｅ Ｎ Ｔ （Ｇ＝＞Ｅ）
配列番号４２ 点変異を有するｇｙ１ ＶＬフレーム領域４（ＦＲ４）核酸配列：
ＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＣＣＡＣＣＧＴＣＣＴＡ
配列番号４３ 点変異を有するｇｙ１ ＶＬフレーム領域４（ＦＲ４）アミノ酸配列：
Ｆ Ｇ Ｇ Ｇ Ｔ Ｋ Ａ Ｔ Ｖ Ｌ （Ｖ＝＞Ａ）
配列番号４４
ＧＧＡＴＴＣＡＣＣＣＴＣＡＧＴＧＧＣＴＡＴＧＣＴ
配列番号４５ 点変異を有するｇｙ１ ＶＨ ＣＤＲ１アミノ配列：
Ｇ Ｆ Ｔ Ｌ Ｓ Ｇ Ｙ Ａ （Ｓ＝＞Ｆ）
配列番号４６：
ＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴ
配列番号４７ 点変異を有するｇｙ１ ＶＨフレーム領域３（ＦＲ３）アミノ酸配列
Ｙ Ｙ Ａ Ｄ Ｓ Ｖ Ｋ Ｇ Ｒ Ｆ Ｔ Ｖ Ｓ Ｒ Ｄ Ｎ Ｓ Ｋ Ｎ Ｔ Ｌ Ｆ Ｌ Ｑ Ｍ Ｎ Ｓ Ｌ Ｒ Ｐ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ Ｖ Ｙ Ｙ Ｃ （Ｉ＝＞Ｖ）
配列番号４８ 点変異を有するｇｙ１ ＶＨ ＣＤＲ３領域核酸配列：
ＧＣＴＡＡＡＧＧＣＣＴＴＡＣＴＴＧＧＧＧＡＣＴＣＧＧＴＧＡＣＡＡＴＧＡＴＧＣＴＣＴＣＧＧＴＡＴＣ
配列番号４９ 点変異をｇｙ１ ＶＨ ＣＤＲ３領域有するアミノ酸配列：
Ａ Ｋ Ｇ Ｌ Ｔ Ｗ Ｇ Ｌ Ｇ Ｄ Ｎ Ｄ Ａ Ｌ Ｇ Ｉ （Ｄ＝＞Ｇ）
配列番号５０：
ＴＧＧＧＧＣＣＣＣＧＡＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号５１ 点変異を有するｇｙ１ ＶＨフレーム領域４（ＦＲ４）アミノ酸配列：
Ｗ Ｇ Ｐ Ｅ Ｔ Ｔ Ｖ Ｔ Ｖ Ｓ Ｓ （Ｇ＝＞Ｅ）
配列番号５２ ＰＳＭＡｂ重鎖核酸配列：
ＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＴＧＣＴＣＴＴＴＴＡＡＧＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＣＴＣＡＧＴＧＧＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＡＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＣＡＡＴＡＡＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＴＡＡＡＧＧＣＣＴＴＡＣＣＴＧＧＧＧＡＣＴＣＧＧＴＧＡＣＡＡＴＧＡＴＧＣＴＣＴＣＧＡＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＣＣＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＧＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＧＡ
配列番号５３ ＰＳＭＡｂ重鎖アミノ酸配列：
Ｍ Ｅ Ｆ Ｇ Ｌ Ｓ Ｗ Ｖ Ｆ Ｌ Ｖ Ａ Ｌ Ｌ Ｒ Ｇ Ｖ Ｑ Ｃ Ｅ Ｖ Ｑ Ｌ Ｖ Ｅ Ｓ Ｇ Ｇ Ａ Ｌ Ａ Ｋ Ｐ Ｇ Ｇ Ｓ Ｌ Ｒ Ｌ Ｓ Ｃ Ａ Ａ Ｓ Ｇ Ｆ Ｔ Ｌ Ｓ Ｇ Ｙ Ａ Ｍ Ｈ Ｗ Ｖ Ｒ Ｑ Ａ Ｐ Ｇ Ｋ Ｇ Ｌ Ｅ Ｗ Ｖ Ａ Ｖ Ｉ Ｓ Ｙ Ｄ Ｇ Ｓ Ｎ Ｋ Ｙ Ｙ Ａ Ｄ Ｓ Ｖ Ｋ Ｇ Ｒ Ｆ Ｔ Ｖ Ｓ Ｒ Ｄ Ｎ Ｓ Ｋ Ｎ Ｔ Ｌ Ｆ Ｌ Ｑ Ｍ Ｎ Ｓ Ｌ Ｒ Ｐ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ Ｖ Ｙ Ｙ Ｃ Ａ Ｋ Ｇ Ｌ Ｔ Ｗ Ｇ Ｌ Ｇ Ｄ Ｎ Ｄ Ａ Ｌ Ｄ Ｉ Ｗ Ｇ Ｐ Ｇ Ｔ Ｔ Ｖ Ｔ Ｖ Ｓ Ｓ Ａ Ｓ Ｔ Ｋ Ｇ Ｐ Ｓ Ｖ Ｆ Ｐ Ｌ Ａ Ｐ Ｓ Ｓ Ｋ Ｓ Ｔ Ｓ Ｇ Ｇ Ｔ Ａ Ａ Ｌ Ｇ Ｃ Ｌ Ｖ Ｋ Ｄ Ｙ Ｆ Ｐ Ｅ Ｐ Ｖ Ｔ Ｖ Ｓ Ｗ Ｎ Ｓ Ｇ Ａ Ｌ Ｔ Ｓ Ｇ Ｖ Ｈ Ｔ Ｆ Ｐ Ａ Ｖ Ｌ Ｑ Ｓ Ｓ Ｇ Ｌ Ｙ Ｓ Ｌ Ｓ Ｓ Ｖ Ｖ Ｔ Ｖ Ｐ Ｓ Ｓ Ｓ Ｌ Ｇ Ｔ Ｑ Ｔ Ｙ Ｉ Ｃ Ｎ Ｖ Ｎ Ｈ Ｋ Ｐ Ｓ Ｎ Ｔ Ｋ Ｖ Ｄ Ｋ Ｋ Ｖ Ｅ Ｐ Ｋ Ｓ Ｃ Ｄ Ｋ Ｔ Ｈ Ｔ Ｃ Ｐ Ｐ Ｃ Ｐ Ａ Ｐ Ｅ Ｌ Ｌ Ｇ Ｇ Ｐ Ｓ Ｖ Ｆ Ｌ Ｆ Ｐ Ｐ Ｋ Ｐ Ｋ Ｄ Ｔ Ｌ Ｍ Ｉ Ｓ Ｒ Ｔ Ｐ Ｅ Ｖ Ｔ Ｃ Ｖ Ｖ Ｖ Ｄ Ｖ Ｓ Ｈ Ｅ Ｄ Ｐ Ｅ Ｖ Ｋ Ｆ Ｎ Ｗ Ｙ Ｖ Ｄ Ｇ Ｖ Ｅ Ｖ Ｈ Ｎ Ａ Ｋ Ｔ Ｋ Ｐ Ｒ Ｅ Ｅ Ｑ Ｙ Ｎ Ｓ Ｔ Ｙ Ｒ Ｖ Ｖ Ｓ Ｖ Ｌ Ｔ Ｖ Ｌ Ｈ Ｑ Ｄ Ｗ Ｌ Ｎ Ｇ Ｋ Ｅ Ｙ Ｋ Ｃ Ｋ Ｖ Ｓ Ｎ Ｋ Ａ Ｌ Ｐ Ａ Ｐ Ｉ Ｅ Ｋ Ｔ Ｉ Ｓ Ｋ Ａ Ｋ Ｇ Ｑ Ｐ Ｒ Ｅ Ｐ Ｑ Ｖ Ｙ Ｔ Ｌ Ｐ Ｐ Ｓ Ｒ Ｄ Ｅ Ｌ Ｔ Ｋ Ｎ Ｑ Ｖ Ｓ Ｌ Ｔ Ｃ Ｌ Ｖ Ｋ Ｇ Ｆ Ｙ Ｐ Ｓ Ｄ Ｉ Ａ Ｖ Ｅ Ｗ Ｅ Ｓ Ｎ Ｇ Ｑ Ｐ Ｅ Ｎ Ｎ Ｙ Ｋ Ｔ Ｔ Ｐ Ｐ Ｖ Ｌ Ｄ Ｓ Ｄ Ｇ Ｓ Ｆ Ｆ Ｌ Ｙ Ｓ Ｋ Ｌ Ｔ Ｖ Ｄ Ｋ Ｓ Ｒ Ｗ Ｑ Ｑ Ｇ Ｎ Ｖ Ｆ Ｓ Ｃ Ｓ Ｖ Ｍ Ｈ Ｅ Ａ Ｌ Ｈ Ｎ Ｈ Ｙ Ｔ Ｑ Ｋ Ｓ Ｌ Ｓ Ｌ Ｓ Ｐ Ｇ Ｋ
配列番号５４ ＰＳＭＡｂ重鎖シグナルペプチド核酸配列：
ＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＴＧＣＴＣＴＴＴＴＡＡＧＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴ
配列番号５５ ＰＳＭＡｂ重鎖シグナルペプチドアミノ酸配列：
Ｍ Ｅ Ｆ Ｇ Ｌ Ｓ Ｗ Ｖ Ｆ Ｌ Ｖ Ａ Ｌ Ｌ Ｒ Ｇ Ｖ Ｑ Ｃ
配列番号５６ ＰＳＭＡｂ重鎖可変領域核酸配列：
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＣＴＣＡＧＴＧＧＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＡＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＣＡＡＴＡＡＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＴＡＡＡＧＧＣＣＴＴＡＣＣＴＧＧＧＧＡＣＴＣＧＧＴＧＡＣＡＡＴＧＡＴＧＣＴＣＴＣＧＡＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＣＣＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号５７ ＰＳＭＡｂ重鎖可変領域アミノ酸配列：
Ｅ Ｖ Ｑ Ｌ Ｖ Ｅ Ｓ Ｇ Ｇ Ａ Ｌ Ａ Ｋ Ｐ Ｇ Ｇ Ｓ Ｌ Ｒ Ｌ Ｓ Ｃ Ａ Ａ Ｓ Ｇ Ｆ Ｔ Ｌ Ｓ Ｇ Ｙ Ａ Ｍ Ｈ Ｗ Ｖ Ｒ Ｑ Ａ Ｐ Ｇ Ｋ Ｇ Ｌ Ｅ Ｗ Ｖ Ａ Ｖ Ｉ Ｓ Ｙ Ｄ Ｇ Ｓ Ｎ Ｋ Ｙ Ｙ Ａ Ｄ Ｓ Ｖ Ｋ Ｇ Ｒ Ｆ Ｔ Ｖ Ｓ Ｒ Ｄ Ｎ Ｓ Ｋ Ｎ Ｔ Ｌ Ｆ Ｌ Ｑ Ｍ Ｎ Ｓ Ｌ Ｒ Ｐ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ Ｖ Ｙ Ｙ Ｃ Ａ Ｋ Ｇ Ｌ Ｔ Ｗ Ｇ Ｌ Ｇ Ｄ Ｎ Ｄ Ａ Ｌ Ｄ Ｉ Ｗ Ｇ Ｐ Ｇ Ｔ Ｔ Ｖ Ｔ Ｖ Ｓ Ｓ
配列番号５８ ＰＳＭＡｂ重鎖定常領域核酸配列：
ＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＧＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡ
配列番号５９ ＰＳＭＡｂ重鎖定常領域アミノ酸配列：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号６０ ＰＳＭＡｂ軽鎖核酸配列：
ＡＴＧＧＣＣＴＧＧＴＣＴＣＣＴＣＴＣＣＴＣＣＴＣＡＣＴＣＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＡＣＡＧＧＧＴＣＣＴＧＧＧＣＣＣＡＧＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＧＴＣＡＴＴＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＧＧＣＡＧＧＴＴＣＴＣＡＴＧＴＡＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＴＴＣＣＡＧＧＡＡＣＡＧＣＣＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＡＡＴＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＣＣＴＣＡＧＧＴＴＣＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＡＣＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡＴＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＡＡＣＡＴＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧＴＣＴＧＡＡＴＧＧＴＧＴＡＡＴＡＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＣＣＡＣＣＧＴＣＣＴＡＧＧＴＣＡＧＣＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＧＴＣＡＣＴＣＴＧＴＴＣＣＣＧＣＣＣＴＣＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＴＴＣＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＣＡＴＡＡＧＴＧＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＧＧＧＡＧＣＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＧＣＡＧＡＴＡＧＣＡＧＣＣＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＧＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣＣＴＣＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＡＣＡＡＣＡＡＧＴＡＣＧＣＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴＣＣＣＡＣＡＧＡＡＧＣＴＡＣＡＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＣＡＣＧＣＡＴＧＡＡＧＧＧＡＧＣＡＣＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＣＣＴＡＣＡＧＡＡＴＧＴＴＣＡＴＧＡ
配列番号６１ ＰＳＭＡｂ軽鎖アミノ酸配列：
Ｍ Ａ Ｗ Ｓ Ｐ Ｌ Ｌ Ｌ Ｔ Ｌ Ｌ Ａ Ｈ Ｃ Ｔ Ｇ Ｓ Ｗ Ａ Ｑ Ｓ Ｖ Ｌ Ｔ Ｑ Ｐ Ｐ Ｓ Ｖ Ｓ Ｇ Ａ Ｐ Ｇ Ｑ Ｓ Ｖ Ｉ Ｉ Ｓ Ｃ Ｔ Ｇ Ｓ Ｓ Ｓ Ｎ Ｉ Ｇ Ａ Ｇ Ｓ Ｈ Ｖ Ｈ Ｗ Ｙ Ｑ Ｑ Ｖ Ｐ Ｇ Ｔ Ａ Ｐ Ｋ Ｌ Ｌ Ｉ Ｙ Ｅ Ｎ Ｔ Ｎ Ｒ Ｐ Ｓ Ｇ Ｖ Ｐ Ｄ Ｒ Ｆ Ｓ Ｇ Ｓ Ｋ Ｓ Ｇ Ｔ Ｓ Ｇ Ｓ Ｌ Ａ Ｉ Ｔ Ｇ Ｌ Ｑ Ｐ Ｅ Ｄ Ｅ Ａ Ｄ Ｙ Ｙ Ｃ Ａ Ｔ Ｗ Ｄ Ｄ Ｓ Ｌ Ｎ Ｇ Ｖ Ｉ Ｆ Ｇ Ｇ Ｇ Ｔ Ｋ Ａ Ｔ Ｖ Ｌ Ｇ Ｑ Ｐ Ｋ Ａ Ａ Ｐ Ｓ Ｖ Ｔ Ｌ Ｆ Ｐ Ｐ Ｓ Ｓ Ｅ Ｅ Ｌ Ｑ Ａ Ｎ Ｋ Ａ Ｔ Ｌ Ｖ Ｃ Ｌ Ｉ Ｓ Ｄ Ｆ Ｙ Ｐ Ｇ Ａ Ｖ Ｔ Ｖ Ａ Ｗ Ｋ Ａ Ｄ Ｓ Ｓ Ｐ Ｖ Ｋ Ａ Ｇ Ｖ Ｅ Ｔ Ｔ Ｔ Ｐ Ｓ Ｋ Ｑ Ｓ Ｎ Ｎ Ｋ Ｙ Ａ Ａ Ｓ Ｓ Ｙ Ｌ Ｓ Ｌ Ｔ Ｐ Ｅ Ｑ Ｗ Ｋ Ｓ Ｈ Ｒ Ｓ Ｙ Ｓ Ｃ Ｑ Ｖ Ｔ Ｈ Ｅ Ｇ Ｓ Ｔ Ｖ Ｅ Ｋ Ｔ Ｖ Ａ Ｐ Ｔ Ｅ Ｃ Ｓ
配列番号６２ ＰＳＭＡｂ軽鎖シグナルペプチド核酸配列：
ＡＴＧＧＣＣＴＧＧＴＣＴＣＣＴＣＴＣＣＴＣＣＴＣＡＣＴＣＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＡＣＡＧＧＧＴＣＣＴＧＧＧＣＣ
配列番号６３ ＰＳＭＡｂ軽鎖シグナルペプチドアミノ酸配列：
Ｍ Ａ Ｗ Ｓ Ｐ Ｌ Ｌ Ｌ Ｔ Ｌ Ｌ Ａ Ｈ Ｃ Ｔ Ｇ Ｓ Ｗ Ａ
配列番号６４ ＰＳＭＡｂ軽鎖可変領域核酸配列：
ＣＡＧＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＧＴＣＡＴＴＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＧＧＣＡＧＧＴＴＣＴＣＡＴＧＴＡＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＴＴＣＣＡＧＧＡＡＣＡＧＣＣＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＡＡＴＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＣＣＴＣＡＧＧＴＴＣＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＡＣＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡＴＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＡＡＣＡＴＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧＴＣＴＧＡＡＴＧＧＴＧＴＡＡＴＡＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＣＣＡＣＣＧＴＣＣＴＡ
配列番号６５ ＰＳＭＡｂ軽鎖可変領域アミノ酸配列：
Ｑ Ｓ Ｖ Ｌ Ｔ Ｑ Ｐ Ｐ Ｓ Ｖ Ｓ Ｇ Ａ Ｐ Ｇ Ｑ Ｓ Ｖ Ｉ Ｉ Ｓ Ｃ Ｔ Ｇ Ｓ Ｓ Ｓ Ｎ Ｉ Ｇ Ａ Ｇ Ｓ Ｈ Ｖ Ｈ Ｗ Ｙ Ｑ Ｑ Ｖ Ｐ Ｇ Ｔ Ａ Ｐ Ｋ Ｌ Ｌ Ｉ Ｙ Ｅ Ｎ Ｔ Ｎ Ｒ Ｐ Ｓ Ｇ Ｖ Ｐ Ｄ Ｒ Ｆ Ｓ Ｇ Ｓ Ｋ Ｓ Ｇ Ｔ Ｓ Ｇ Ｓ Ｌ Ａ Ｉ Ｔ Ｇ Ｌ Ｑ Ｐ Ｅ Ｄ Ｅ Ａ Ｄ Ｙ Ｙ Ｃ Ａ Ｔ Ｗ Ｄ Ｄ Ｓ Ｌ Ｎ Ｇ Ｖ Ｉ Ｆ Ｇ Ｇ Ｇ Ｔ Ｋ Ａ Ｔ Ｖ Ｌ
配列番号６６ ＰＳＭＡｂ軽鎖定常領域核酸配列：
ＧＧＴＣＡＧＣＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＧＴＣＡＣＴＣＴＧＴＴＣＣＣＧＣＣＣＴＣＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＴＴＣＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＣＡＴＡＡＧＴＧＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＧＧＧＡＧＣＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＧＣＡＧＡＴＡＧＣＡＧＣＣＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＧＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣＣＴＣＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＡＣＡＡＣＡＡＧＴＡＣＧＣＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴＣＣＣＡＣＡＧＡＡＧＣＴＡＣＡＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＣＡＣＧＣＡＴＧＡＡＧＧＧＡＧＣＡＣＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＣＣＴＡＣＡＧＡＡＴＧＴＴＣＡ
配列番号６７ ＰＳＭＡｂ軽鎖定常領域アミノ酸配列：
Ｇ Ｑ Ｐ Ｋ Ａ Ａ Ｐ Ｓ Ｖ Ｔ Ｌ Ｆ Ｐ Ｐ Ｓ Ｓ Ｅ Ｅ Ｌ Ｑ Ａ Ｎ Ｋ Ａ Ｔ Ｌ Ｖ Ｃ Ｌ Ｉ Ｓ Ｄ Ｆ Ｙ Ｐ Ｇ Ａ Ｖ Ｔ Ｖ Ａ Ｗ Ｋ Ａ Ｄ Ｓ Ｓ Ｐ Ｖ Ｋ Ａ Ｇ Ｖ Ｅ Ｔ Ｔ Ｔ Ｐ Ｓ Ｋ Ｑ Ｓ Ｎ Ｎ Ｋ Ｙ Ａ Ａ Ｓ Ｓ Ｙ Ｌ Ｓ Ｌ Ｔ Ｐ Ｅ Ｑ Ｗ Ｋ Ｓ Ｈ Ｒ Ｓ Ｙ Ｓ Ｃ Ｑ Ｖ Ｔ Ｈ Ｅ Ｇ Ｓ Ｔ Ｖ Ｅ Ｋ Ｔ Ｖ Ａ Ｐ Ｔ Ｅ Ｃ Ｓ
配列番号６８ シグナルペプチドを含まないＰＳＭＡｂ重鎖アミノ酸配列：
Ｅ Ｖ Ｑ Ｌ Ｖ Ｅ Ｓ Ｇ Ｇ Ａ Ｌ Ａ Ｋ Ｐ Ｇ Ｇ Ｓ Ｌ Ｒ Ｌ Ｓ Ｃ Ａ Ａ Ｓ Ｇ Ｆ Ｔ Ｌ Ｓ Ｇ Ｙ Ａ Ｍ Ｈ Ｗ Ｖ Ｒ Ｑ Ａ Ｐ Ｇ Ｋ Ｇ Ｌ Ｅ Ｗ Ｖ Ａ Ｖ Ｉ Ｓ Ｙ Ｄ Ｇ Ｓ Ｎ Ｋ Ｙ Ｙ Ａ Ｄ Ｓ Ｖ Ｋ Ｇ Ｒ Ｆ Ｔ Ｖ Ｓ Ｒ Ｄ Ｎ Ｓ Ｋ Ｎ Ｔ Ｌ Ｆ Ｌ Ｑ Ｍ Ｎ Ｓ Ｌ Ｒ Ｐ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ Ｖ Ｙ Ｙ Ｃ Ａ Ｋ Ｇ Ｌ Ｔ Ｗ Ｇ Ｌ Ｇ Ｄ Ｎ Ｄ Ａ Ｌ Ｄ Ｉ Ｗ Ｇ Ｐ Ｇ Ｔ Ｔ Ｖ Ｔ Ｖ Ｓ Ｓ Ａ Ｓ Ｔ Ｋ Ｇ Ｐ Ｓ Ｖ Ｆ Ｐ Ｌ Ａ Ｐ Ｓ Ｓ Ｋ Ｓ Ｔ Ｓ Ｇ Ｇ Ｔ Ａ Ａ Ｌ Ｇ Ｃ Ｌ Ｖ Ｋ Ｄ Ｙ Ｆ Ｐ Ｅ Ｐ Ｖ Ｔ Ｖ Ｓ Ｗ Ｎ Ｓ Ｇ Ａ Ｌ Ｔ Ｓ Ｇ Ｖ Ｈ Ｔ Ｆ Ｐ Ａ Ｖ Ｌ Ｑ Ｓ Ｓ Ｇ Ｌ Ｙ Ｓ Ｌ Ｓ Ｓ Ｖ Ｖ Ｔ Ｖ Ｐ Ｓ Ｓ Ｓ Ｌ Ｇ Ｔ Ｑ Ｔ Ｙ Ｉ Ｃ Ｎ Ｖ Ｎ Ｈ Ｋ Ｐ Ｓ Ｎ Ｔ Ｋ Ｖ Ｄ Ｋ Ｋ Ｖ Ｅ Ｐ Ｋ Ｓ Ｃ Ｄ Ｋ Ｔ Ｈ Ｔ Ｃ Ｐ Ｐ Ｃ Ｐ Ａ Ｐ Ｅ Ｌ Ｌ Ｇ Ｇ Ｐ Ｓ Ｖ Ｆ Ｌ Ｆ Ｐ Ｐ Ｋ Ｐ Ｋ Ｄ Ｔ Ｌ Ｍ Ｉ Ｓ Ｒ Ｔ Ｐ Ｅ Ｖ Ｔ Ｃ Ｖ Ｖ Ｖ Ｄ Ｖ Ｓ Ｈ Ｅ Ｄ Ｐ Ｅ Ｖ Ｋ Ｆ Ｎ Ｗ Ｙ Ｖ Ｄ Ｇ Ｖ Ｅ Ｖ Ｈ Ｎ Ａ Ｋ Ｔ Ｋ Ｐ Ｒ Ｅ Ｅ Ｑ Ｙ Ｎ Ｓ Ｔ Ｙ Ｒ Ｖ Ｖ Ｓ Ｖ Ｌ Ｔ Ｖ Ｌ Ｈ Ｑ Ｄ Ｗ Ｌ Ｎ Ｇ Ｋ Ｅ Ｙ Ｋ Ｃ Ｋ Ｖ Ｓ Ｎ Ｋ Ａ Ｌ Ｐ Ａ Ｐ Ｉ Ｅ Ｋ Ｔ Ｉ Ｓ Ｋ Ａ Ｋ Ｇ Ｑ Ｐ Ｒ Ｅ Ｐ Ｑ Ｖ Ｙ Ｔ Ｌ Ｐ Ｐ Ｓ Ｒ Ｄ Ｅ Ｌ Ｔ Ｋ Ｎ Ｑ Ｖ Ｓ Ｌ Ｔ Ｃ Ｌ Ｖ Ｋ Ｇ Ｆ Ｙ Ｐ Ｓ Ｄ Ｉ Ａ Ｖ Ｅ Ｗ Ｅ Ｓ Ｎ Ｇ Ｑ Ｐ Ｅ Ｎ Ｎ Ｙ Ｋ Ｔ Ｔ Ｐ Ｐ Ｖ Ｌ Ｄ Ｓ Ｄ Ｇ Ｓ Ｆ Ｆ Ｌ Ｙ Ｓ Ｋ Ｌ Ｔ Ｖ Ｄ Ｋ Ｓ Ｒ Ｗ Ｑ Ｑ Ｇ Ｎ Ｖ Ｆ Ｓ Ｃ Ｓ Ｖ Ｍ Ｈ Ｅ Ａ Ｌ Ｈ Ｎ Ｈ Ｙ Ｔ Ｑ Ｋ Ｓ Ｌ Ｓ Ｌ Ｓ Ｐ Ｇ Ｋ
配列番号６９ シグナルペプチドを含まないＰＳＭＡｂ軽鎖アミノ酸配列：
Ｑ Ｓ Ｖ Ｌ Ｔ Ｑ Ｐ Ｐ Ｓ Ｖ Ｓ Ｇ Ａ Ｐ Ｇ Ｑ Ｓ Ｖ Ｉ Ｉ Ｓ Ｃ Ｔ Ｇ Ｓ Ｓ Ｓ Ｎ Ｉ Ｇ Ａ Ｇ Ｓ Ｈ Ｖ Ｈ Ｗ Ｙ Ｑ Ｑ Ｖ Ｐ Ｇ Ｔ Ａ Ｐ Ｋ Ｌ Ｌ Ｉ Ｙ Ｅ Ｎ Ｔ Ｎ Ｒ Ｐ Ｓ Ｇ Ｖ Ｐ Ｄ Ｒ Ｆ Ｓ Ｇ Ｓ Ｋ Ｓ Ｇ Ｔ Ｓ Ｇ Ｓ Ｌ Ａ Ｉ Ｔ Ｇ Ｌ Ｑ Ｐ Ｅ Ｄ Ｅ Ａ Ｄ Ｙ Ｙ Ｃ Ａ Ｔ Ｗ Ｄ Ｄ Ｓ Ｌ Ｎ Ｇ Ｖ Ｉ Ｆ Ｇ Ｇ Ｇ Ｔ Ｋ Ａ Ｔ Ｖ Ｌ Ｇ Ｑ Ｐ Ｋ Ａ Ａ Ｐ Ｓ Ｖ Ｔ Ｌ Ｆ Ｐ Ｐ Ｓ Ｓ Ｅ Ｅ Ｌ Ｑ Ａ Ｎ Ｋ Ａ Ｔ Ｌ Ｖ Ｃ Ｌ Ｉ Ｓ Ｄ Ｆ Ｙ Ｐ Ｇ Ａ Ｖ Ｔ Ｖ Ａ Ｗ Ｋ Ａ Ｄ Ｓ Ｓ Ｐ Ｖ Ｋ Ａ Ｇ Ｖ Ｅ Ｔ Ｔ Ｔ Ｐ Ｓ Ｋ Ｑ Ｓ Ｎ Ｎ Ｋ Ｙ Ａ Ａ Ｓ Ｓ Ｙ Ｌ Ｓ Ｌ Ｔ Ｐ Ｅ Ｑ Ｗ Ｋ Ｓ Ｈ Ｒ Ｓ Ｙ Ｓ Ｃ Ｑ Ｖ Ｔ Ｈ Ｅ Ｇ Ｓ Ｔ Ｖ Ｅ Ｋ Ｔ Ｖ Ａ Ｐ Ｔ Ｅ Ｃ Ｓ
配列番号７０ ＣＤ８ａリーダー核酸配列：
ＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧ
配列番号７１ ＣＤ８ａリーダーアミノ酸配列：
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ
配列番号７２ ＣＤ８ａヒンジ核酸配列：
ＡＣＣＡＣＧＡＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＧＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＣＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣＧＴＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＣＧＣＡＧＴＧＣＡＣＡＣＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＴＧＡＴ
配列番号７３ ＣＤ８ａヒンジアミノ酸配列：
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ
配列番号７４ ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン核酸配列
ＡＴＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＧＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＴＴＧＴＧＧＧＧＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＴＴＡＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＣＴＧＣ
配列番号７５ ＣＤ８ａ膜貫通ドメインアミノ酸配列：
ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ
配列番号７６ ４－１ ＢＢ細胞内ドメイン（ＩＣＤ）核酸配列：
ＡＡＡＣＧＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＴＣＡＡＡＣＡＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＡＣＡＡＡＣＴＡＣＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＧＡＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＴＧ
配列番号７７ ４－１ ＢＢ細胞内ドメイン（ＩＣＤ）アミノ配列：
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ
配列番号７８ ＣＤ３ゼータ核酸配列
ＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＡＣＡＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣ
配列番号７９ ＣＤ３ゼータアミノ酸配列：
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
配列番号８０ ｇｙ１－２ ＣＡＲ構築物核酸配列：
ＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＣＡＧＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＧＴＣＡＴＴＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＧＧＣＡＧＧＴＴＣＴＣＡＴＧＴＡＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＴＴＣＣＡＧＧＡＡＣＡＧＣＣＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＡＡＴＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＣＣＴＣＡＧＧＴＴＣＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＡＣＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡＴＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＡＡＣＡＴＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧＴＣＴＧＡＡＴＧＧＴＧＴＡＡＴＡＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＣＣＡＣＣＧＴＣＣＴＡＧＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＣＴＣＡＧＴＧＧＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＡＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＣＡＡＴＡＡＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＴＡＡＡＧＧＣＣＴＴＡＣＣＴＧＧＧＧＡＣＴＣＧＧＴＧＡＣＡＡＴＧＡＴＧＣＴＣＴＣＧＡＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＣＣＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＡＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＧＡＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＧＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＣＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣＧＴＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＣＧＣＡＧＴＧＣＡＣＡＣＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＴＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＧＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＴＴＧＴＧＧＧＧＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＴＴＡＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＣＴＧＣＡＡＡＣＧＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＴＣＡＡＡＣＡＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＡＣＡＡＡＣＴＡＣＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＧＡＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣＴＡＡ
配列番号８１ ｇｙ１－２ ＣＡＲ構築物アミノ酸配列
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＳＲＱＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＧＡＰＧＱＳＶＩＩＳＣＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＳＨＶＨＷＹＱＱＶＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＥＮＴＮＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＧＳＬＡＩＴＧＬＱＰＥＤＥＡＤＹＹＣＡＴＷＤＤＳＬＮＧＶＩＦＧＧＧＴＫＡＴＶＬＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＥＶＱＬＶＥＳＧＧＡＬＡＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＳＧＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＳＫＮＴＬＦＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＬＴＷＧＬＧＤＮＤＡＬＤＩＷＧＰＧＴＴＶＴＶＳＳＲＳＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
配列番号８２ ｍＯＫＴ３マウスｓｃＦｖ核酸配列：
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＣＧＣＣＣＧＧＧＣＧＣＧＡＧＣＧＴＧＡＡＡＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＧＡＧＣＧＧＣＴＡＴＡＣＣＴＴＴＡＣＣＣＧＣＴＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＴＴＧＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＣＧＣＣＣＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＡＴＡＴＴＡＡＣＣＣＧＡＧＣＣＧＣＧＧＣＴＡＴＡＣＣＡＡＣＴＡＴＡＡＣＣＡＧＡＡＡＴＴＴＡＡＡＧＡＴＡＡＡＧＣＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＣＣＧＡＴＡＡＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＧＣＧＴＡＴＡＴＧＣＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＡＡＧＡＴＡＧＣＧＣＧＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＣＧＣＧＣＧＣＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＡＴＣＡＴＴＡＴＴＧＣＣＴＧＧＡＴＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＧＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＧＧＣＧＡＴＴＡＴＧＡＧＣＧＣＧＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＡＡＡＡＡＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＧＣＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＧＣＴＡＴＡＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＡＧＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＣＣＧＡＡＡＣＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣＡＡＡＣＴＧＧＣＧＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＣＧＣＡＴＴＴＴＣＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＴＡＴＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＴＴＡＧＣＧＧＣＡＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＡＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣＴＡＴＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＡＣＣＣＧＴＴＴＡＣＣＴＴＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＧＣ
配列番号８３ ｍＯＫＴ３マウスｓｃＦｖアミノ酸配列：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＨＦＲＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＧＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＮＲ
配列番号８４ ｍＯＫＴ３ ＶＨ核酸配列：
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＣＧＣＣＣＧＧＧＣＧＣＧＡＧＣＧＴＧＡＡＡＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＧＡＧＣＧＧＣＴＡＴＡＣＣＴＴＴＡＣＣＣＧＣＴＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＴＴＧＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＣＧＣＣＣＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＡＴＡＴＴＡＡＣＣＣＧＡＧＣＣＧＣＧＧＣＴＡＴＡＣＣＡＡＣＴＡＴＡＡＣＣＡＧＡＡＡＴＴＴＡＡＡＧＡＴＡＡＡＧＣＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＣＣＧＡＴＡＡＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＧＣＧＴＡＴＡＴＧＣＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＡＡＧＡＴＡＧＣＧＣＧＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＣＧＣＧＣＧＣＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＡＴＣＡＴＴＡＴＴＧＣＣＴＧＧＡＴＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣ
配列番号８５ ｍＯＫＴ３ ＶＨアミノ酸配列：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
配列番号８６ ｍＯＫＴ３ ＶＬ核酸配列：
ＣＡＧＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＧＧＣＧＡＴＴＡＴＧＡＧＣＧＣＧＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＡＡＡＡＡＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＧＣＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＧＣＴＡＴＡＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＡＧＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＣＣＧＡＡＡＣＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣＡＡＡＣＴＧＧＣＧＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＣＧＣＡＴＴＴＴＣＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＴＡＴＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＴＴＡＧＣＧＧＣＡＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＡＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣＴＡＴＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＡＣＣＣＧＴＴＴＡＣＣＴＴＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＧＣ
配列番号８７ ｍＯＫＴ３ ＶＬアミノ酸配列：
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配列番号８８ ｈＯＫＴ３ヒト化ｓｃＦｖ核酸配列：
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＧＧＧＣＣＧＣＡＧＣＣＴＧＣＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＧＡＧＣＧＧＣＴＡＴＡＣＣＴＴＴＡＣＣＣＧＣＴＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＴＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＡＴＡＴＴＡＡＣＣＣＧＡＧＣＣＧＣＧＧＣＴＡＴＡＣＣＡＡＣＴＡＴＡＡＣＣＡＧＡＡＡＧＴＧＡＡＡＧＡＴＣＧＣＴＴＴＡＣＣＡＴＴＡＧＣＡＣＣＧＡＴＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＣＧＴＴＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＧＡＴＡＧＣＣＴＧＣＧＣＣＣＧＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＧＣＧＴＧＴＡＴＴＴＴＴＧＣＧＣＧＣＧＣＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＡＴＣＡＴＴＡＴＴＧＣＣＴＧＧＡＴＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＡＴＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＧＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＴＣＧＣＧＴＧＡＣＣＡＴＴＡＣＣＴＧＣＡＧＣＧＣＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＧＣＴＡＴＡＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＧＣＣＧＡＡＡＣＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣＡＡＡＣＴＧＧＣＧＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＣＣＧＣＴＴＴＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＴＴＡＴＡＣＣＴＴＴＡＣＣＡＴＴＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＡＴＡＴＴＧＣＧＡＣＣＴＡＴＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＡＣＣＣＧＴＴＴＡＣＣＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＴＧＣＡＧＡＴＴＡＣＣＣＧＣ
配列番号８９ ｈＯＫＴ３ヒト化ｓｃＦｖアミノ酸配列：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＶＫＤＲＦＴＩＳＴＤＫＳＫＳＴＡＦＬＱＭＤＳＬＲＰＥＤＴＧＶＹＦＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＴＰＧＫＡＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＱＩＴＲ
配列番号９０ ｈＯＫＴ３ ＶＨ核酸配列：
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＧＧＧＣＣＧＣＡＧＣＣＴＧＣＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＧＡＧＣＧＧＣＴＡＴＡＣＣＴＴＴＡＣＣＣＧＣＴＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＴＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＡＴＡＴＴＡＡＣＣＣＧＡＧＣＣＧＣＧＧＣＴＡＴＡＣＣＡＡＣＴＡＴＡＡＣＣＡＧＡＡＡＧＴＧＡＡＡＧＡＴＣＧＣＴＴＴＡＣＣＡＴＴＡＧＣＡＣＣＧＡＴＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＣＧＴＴＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＧＡＴＡＧＣＣＴＧＣＧＣＣＣＧＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＧＣＧＴＧＴＡＴＴＴＴＴＧＣＧＣＧＣＧＣＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＡＴＣＡＴＴＡＴＴＧＣＣＴＧＧＡＴＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣ
配列番号９１ ｈＯＫＴ３ ＶＨアミノ酸配列：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＶＫＤＲＦＴＩＳＴＤＫＳＫＳＴＡＦＬＱＭＤＳＬＲＰＥＤＴＧＶＹＦＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
配列番号９２ ｈＯＫＴ３ ＶＬ核酸配列：
ＧＡＴＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＧＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＴＣＧＣＧＴＧＡＣＣＡＴＴＡＣＣＴＧＣＡＧＣＧＣＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＧＣＴＡＴＡＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＧＣＣＧＡＡＡＣＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣＡＡＡＣＴＧＧＣＧＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＣＣＧＣＴＴＴＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＴＴＡＴＡＣＣＴＴＴＡＣＣＡＴＴＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＡＴＡＴＴＧＣＧＡＣＣＴＡＴＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＡＣＣＣＧＴＴＴＡＣＣＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＴＧＣＡＧＡＴＴＡＣＣＣＧＣ
配列番号９３ ｈＯＫＴ３ ＶＬアミノ酸配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＴＰＧＫＡＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＱＩＴＲ
配列番号９４変異ＩＧＧ１ヒンジ核酸配列：
ＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡ
配列番号９５ 変異したＩｇＧ１ヒンジアミノ酸配列：
ＥＰＫＳＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ
配列番号９６ 変異したＩｇＧ４ Ｆｃ（Ｎ２９７Ａ）核酸配列：
ＧＣＡＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＧＣＴＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴＡＡＡ
配列番号９７ 変異したＩｇＧ４ Ｆｃ（Ｎ２９７Ａ）アミノ酸配列：
ＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号９８ 変異したＩｇＧ１ヒンジ－ＩｇＧ４ Ｆｃ核酸配列：
ＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＧＣＴＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴＡＡＡ
配列番号９９ 変異したＩｇＧ１ヒンジ－ＩｇＧ４ Ｆｃアミノ酸配列：
ＥＰＫＳＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号１００ ｓｃＦｖ１ ＭＣＳ－Ｇ４Ｓ－ｈＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＩｇＧ１ヒンジ－ＩｇＧ４ Ｆｃ発現カセット核酸配列：
ＡＣＴＡＧＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＴＡＴＣＴＴＧＡＡＧＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＴＣＴＡＧＡＡＧＣＧＣＴＧＣＴＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＡＧＧＧＧＧＧＧＧＡＧＴＣＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＴＣＧＧＴＣＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＴＡＡＧＧＣＡＴＣＣＧＧＴＴＡＴＡＣＴＴＴＴＡＣＣＡＧＧＴＡＣＡＣＡＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＡＴＡＴＣＡＡＣＣＣＡＴＣＣＡＧＧＧＧＣＴＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＡＡＴＣＡＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＴＡＣＡＧＡＴＡＡＧＡＧＣＡＡＧＴＣＴＡＣＡＧＣＣＴＴＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＣＴＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＧＣＧＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＧＣＴＣＧＣＴＡＣＴＡＴＧＡＣＧＡＴＣＡＴＴＡＣＴＧＴＣＴＧＧＡＣＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＡＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＡＴＣＴＴＣＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＴＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＣＡＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＴＡＡＧＡＧＡＴＧＧＡＴＣＴＡＣＧＡＴＡＣＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＴＣＣＧＧＡＧＴＧＣＣＣＴＣＴＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＡＧＡＣＴＡＴＡＣＣＴＴＴＡＣＡＡＴＣＡＧＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＴＡＴＣＧＣＴＡＣＣＴＡＣＴＡＴＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＣＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＡＣＣＡＧＧＣＴＣＧＡＧＣＣＡＡＡＧＡＧＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＣＣＣＴＴＧＴＣＣＡＧＣＴＣＣＣＧＡＧＴＴＴＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＣＡＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＴＡＣＡＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＣＧＧＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＴＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＴＧＣＴＴＣＴＡＣＡＴＡＣＣＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＴＡＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＴＡＡＧＧＧＡＣＡＧＣＣＴＣＧＣＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＡＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＣＴＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＴＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＴＧＧＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＡＴＡＧＣＡＧＡＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＴＡＡＧＴＣＴＣＧＣＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＡＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＴＣＡＧＡＡＡＴＣＡＣＴＧＴＣＡＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号１０１ ｓｃＦｖ１ ＭＣＳ－Ｇ４Ｓ－ｈＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＩｇＧ１ヒンジ－ＩｇＧ４ Ｆｃ発現カセットアミノ酸配列：
ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣ－ＭＣＳ－ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＶＫＤＲＦＴＩＳＴＤＫＳＫＳＴＡＦＬＱＭＤＳＬＲＰＥＤＴＧＶＹＦＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＴＰＧＫＡＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＱＩＴＲＬＥＰＫＳＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号１０２ ｓｃＦｖ１ ＭＣＳ－Ｇ４Ｓ－ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＩｇＧ１ヒンジ－ＩｇＧ４ Ｆｃ発現カセット核酸配列：
ＡＣＴＡＧＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＴＡＴＣＴＴＧＡＡＧＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＴＣＴＡＧＡＡＧＣＧＣＴＧＣＴＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＴＧＣＣＧＡＡＣＴＧＧＣＣＣＧＴＣＣＣＧＧＡＧＣＡＡＧＣＧＴＧＡＡＡＡＴＧＴＣＣＴＧＴＡＡＡＧＣＡＡＧＴＧＧＣＴＡＴＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＧＴＡＣＡＣＡＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＡＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＡＴＡＴＣＡＡＣＣＣＣＴＣＴＡＧＧＧＧＣＴＡＣＡＣＡＡＡＣＴＡＴＡＡＴＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＣＣＧＡＴＡＡＧＴＣＣＡＧＣＴＣＴＡＣＡＧＣＴＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＴＡＧＡＴＡＣＴＡＴＧＡＣＧＡＴＣＡＴＴＡＣＴＧＴＣＴＧＧＡＴＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＡＧＣＴＡＴＣＡＴＧＴＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＡＴＧＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＴＧＴＣＴＴＡＣＡＴＧＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＴＣＣＧＧＣＡＣＡＡＧＣＣＣＴＡＡＧＡＧＡＴＧＧＡＴＣＴＡＣＧＡＣＡＣＣＴＣＴＡＡＧＣＴＧＧＣＣＴＣＣＧＧＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＴＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＧＡＣＡＡＴＣＡＧＣＧＧＣＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＣＣＧＣＴＡＣＣＴＡＣＴＡＴＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＧＧＴＣＡＴＣＡＡＡＴＣＣＴＴＴＣＡＣＣＴＴＣＧＧＴＴＣＡＧＧＧＡＣＡＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＴＡＧＧＣＴＣＧＡＧＣＣＡＡＡＧＡＧＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＣＣＣＴＴＧＴＣＣＡＧＣＴＣＣＣＧＡＧＴＴＴＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＣＡＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＴＡＣＡＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＣＧＧＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＴＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＴＧＣＴＴＣＴＡＣＡＴＡＣＣＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＴＡＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＴＡＡＧＧＧＡＣＡＧＣＣＴＣＧＣＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＡＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＣＴＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＴＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＴＧＧＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＡＴＡＧＣＡＧＡＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＴＡＡＧＴＣＴＣＧＣＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＡＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＴＣＡＧＡＡＡＴＣＡＣＴＧＴＣＡＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号１０３ ｓｃＦｖ１ ＭＣＳ－Ｇ４Ｓ－ｍＯＫＴ３ ｓｃＦｖ－ＩｇＧ１ヒンジ－ＩｇＧ４ Ｆｃ発現カセットアミノ酸配列：
ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣ－ＭＣＳ－ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＨＦＲＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＧＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＮＲＬＥＰＫＳＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号１０４ 抗ＰＳＭＡ＆ｈＯＫＴ３二重特異性Ａｂ抗体核酸配列（ｇｙ１－２）：
ＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＴＡＴＣＴＴＧＡＡＧＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴＧＡＡＴＴＣＣＡＧＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＧＴＣＡＴＴＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＧＧＣＡＧＧＴＴＣＴＣＡＴＧＴＡＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＴＴＣＣＡＧＧＡＡＣＡＧＣＣＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＡＡＴＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＣＣＴＣＡＧＧＴＴＣＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＡＣＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡＴＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＡＡＣＡＴＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧＴＣＴＧＡＡＴＧＧＴＧＴＡＡＴＡＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＣＣＡＣＣＧＴＣＣＴＡＧＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＣＴＣＡＧＴＧＧＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＡＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＣＡＡＴＡＡＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＴＡＡＡＧＧＣＣＴＴＡＣＣＴＧＧＧＧＡＣＴＣＧＧＴＧＡＣＡＡＴＧＡＴＧＣＴＣＴＣＧＡＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＣＣＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＡＧＧＧＧＧＧＧＧＡＧＴＣＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＴＣＧＧＴＣＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＴＡＡＧＧＣＡＴＣＣＧＧＴＴＡＴＡＣＴＴＴＴＡＣＣＡＧＧＴＡＣＡＣＡＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＡＴＡＴＣＡＡＣＣＣＡＴＣＣＡＧＧＧＧＣＴＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＡＡＴＣＡＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＴＡＣＡＧＡＴＡＡＧＡＧＣＡＡＧＴＣＴＡＣＡＧＣＣＴＴＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＣＴＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＧＣＧＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＧＣＴＣＧＣＴＡＣＴＡＴＧＡＣＧＡＴＣＡＴＴＡＣＴＧＴＣＴＧＧＡＣＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＡＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＡＴＣＴＴＣＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＴＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＣＡＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＴＡＡＧＡＧＡＴＧＧＡＴＣＴＡＣＧＡＴＡＣＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＴＣＣＧＧＡＧＴＧＣＣＣＴＣＴＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＡＧＡＣＴＡＴＡＣＣＴＴＴＡＣＡＡＴＣＡＧＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＴＡＴＣＧＣＴＡＣＣＴＡＣＴＡＴＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＣＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＡＣＣＡＧＧＣＴＣＧＡＧＣＣＡＡＡＧＡＧＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＣＣＣＴＴＧＴＣＣＡＧＣＴＣＣＣＧＡＧＴＴＴＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＣＡＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＴＡＣＡＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＣＧＧＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＴＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＴＧＣＴＴＣＴＡＣＡＴＡＣＣＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＴＡＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＴＡＡＧＧＧＡＣＡＧＣＣＴＣＧＣＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＡＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＣＴＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＴＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＴＧＧＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＡＴＡＧＣＡＧＡＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＴＡＡＧＴＣＴＣＧＣＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＡＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＴＣＡＧＡＡＡＴＣＡＣＴＧＴＣＡＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡＧ
配列番号１０５ 抗ＰＳＭＡ＆ｈＯＫＴ３二重特異性Ａｂアミノ酸配列（ｇｙ１－２）：
ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣＥＦＱＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＧＡＰＧＱＳＶＩＩＳＣＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＳＨＶＨＷＹＱＱＶＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＥＮＴＮＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＧＳＬＡＩＴＧＬＱＰＥＤＥＡＤＹＹＣＡＴＷＤＤＳＬＮＧＶＩＦＧＧＧＴＫＡＴＶＬＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＥＶＱＬＶＥＳＧＧＡＬＡＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＳＧＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＳＫＮＴＬＦＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＬＴＷＧＬＧＤＮＤＡＬＤＩＷＧＰＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＶＫＤＲＦＴＩＳＴＤＫＳＫＳＴＡＦＬＱＭＤＳＬＲＰＥＤＴＧＶＹＦＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＴＰＧＫＡＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＱＩＴＲＬＥＰＫＳＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号１０６ シグナルペプチドを含まない抗ＰＳＭＡ＆ｈＯＫＴ３二重特異性Ａｂアミノ酸配列（ｇｙ１－２）
ＥＦＱＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＧＡＰＧＱＳＶＩＩＳＣＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＳＨＶＨＷＹＱＱＶＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＥＮＴＮＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＧＳＬＡＩＴＧＬＱＰＥＤＥＡＤＹＹＣＡＴＷＤＤＳＬＮＧＶＩＦＧＧＧＴＫＡＴＶＬＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＥＶＱＬＶＥＳＧＧＡＬＡＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＳＧＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＳＫＮＴＬＦＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＬＴＷＧＬＧＤＮＤＡＬＤＩＷＧＰＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＶＫＤＲＦＴＩＳＴＤＫＳＫＳＴＡＦＬＱＭＤＳＬＲＰＥＤＴＧＶＹＦＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＴＰＧＫＡＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＱＩＴＲＬＥＰＫＳＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号１０７ 抗ＰＳＭＡ＆ｍＯＫＴ３二重特異性Ａｂ抗体核酸配列（ｇｙ１－２）：
ＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＴＡＴＣＴＴＧＡＡＧＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴＧＡＡＴＴＣＣＡＧＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＧＴＣＡＴＴＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＧＧＣＡＧＧＴＴＣＴＣＡＴＧＴＡＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＴＴＣＣＡＧＧＡＡＣＡＧＣＣＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＡＡＴＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＣＣＴＣＡＧＧＴＴＣＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＡＣＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡＴＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＡＡＣＡＴＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧＴＣＴＧＡＡＴＧＧＴＧＴＡＡＴＡＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＣＣＡＣＣＧＴＣＣＴＡＧＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＣＴＣＡＧＴＧＧＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＡＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＣＡＡＴＡＡＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＴＡＡＡＧＧＣＣＴＴＡＣＣＴＧＧＧＧＡＣＴＣＧＧＴＧＡＣＡＡＴＧＡＴＧＣＴＣＴＣＧＡＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＣＣＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＴＧＣＣＧＡＡＣＴＧＧＣＣＣＧＴＣＣＣＧＧＡＧＣＡＡＧＣＧＴＧＡＡＡＡＴＧＴＣＣＴＧＴＡＡＡＧＣＡＡＧＴＧＧＣＴＡＴＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＧＴＡＣＡＣＡＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＡＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＡＴＡＴＣＡＡＣＣＣＣＴＣＴＡＧＧＧＧＣＴＡＣＡＣＡＡＡＣＴＡＴＡＡＴＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＣＣＧＡＴＡＡＧＴＣＣＡＧＣＴＣＴＡＣＡＧＣＴＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＴＡＧＡＴＡＣＴＡＴＧＡＣＧＡＴＣＡＴＴＡＣＴＧＴＣＴＧＧＡＴＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＡＧＣＴＡＴＣＡＴＧＴＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＡＴＧＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＴＧＴＣＴＴＡＣＡＴＧＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＴＣＣＧＧＣＡＣＡＡＧＣＣＣＴＡＡＧＡＧＡＴＧＧＡＴＣＴＡＣＧＡＣＡＣＣＴＣＴＡＡＧＣＴＧＧＣＣＴＣＣＧＧＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＴＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＧＡＣＡＡＴＣＡＧＣＧＧＣＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＣＣＧＣＴＡＣＣＴＡＣＴＡＴＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＧＧＴＣＡＴＣＡＡＡＴＣＣＴＴＴＣＡＣＣＴＴＣＧＧＴＴＣＡＧＧＧＡＣＡＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＴＡＧＧＣＴＣＧＡＧＣＣＡＡＡＧＡＧＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＣＣＣＴＴＧＴＣＣＡＧＣＴＣＣＣＧＡＧＴＴＴＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＣＡＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＴＡＣＡＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＣＧＧＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＴＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＴＧＣＴＴＣＴＡＣＡＴＡＣＣＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＴＡＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＴＡＡＧＧＧＡＣＡＧＣＣＴＣＧＣＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＡＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＣＴＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＴＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＴＧＧＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＡＴＡＧＣＡＧＡＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＴＡＡＧＴＣＴＣＧＣＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＡＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＴＣＡＧＡＡＡＴＣＡＣＴＧＴＣＡＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡＧ
配列番号１０８ 抗ＰＳＭＡ＆ｍＯＫＴ３二重特異性Ａｂ抗体アミノ酸配列（ｇｙ１－２）：
ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣＥＦＱＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＧＡＰＧＱＳＶＩＩＳＣＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＳＨＶＨＷＹＱＱＶＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＥＮＴＮＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＧＳＬＡＩＴＧＬＱＰＥＤＥＡＤＹＹＣＡＴＷＤＤＳＬＮＧＶＩＦＧＧＧＴＫＡＴＶＬＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＥＶＱＬＶＥＳＧＧＡＬＡＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＳＧＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＳＫＮＴＬＦＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＬＴＷＧＬＧＤＮＤＡＬＤＩＷＧＰＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＨＦＲＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＧＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＮＲＬＥＰＫＳＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号１０９ 抗ＰＳＭＡ＆ｍＯＫＴ３二重特異性Ａｂ抗体アミノ酸配列（ｇｙ１－２）：
ＥＦＱＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＧＡＰＧＱＳＶＩＩＳＣＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＳＨＶＨＷＹＱＱＶＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＥＮＴＮＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＧＳＬＡＩＴＧＬＱＰＥＤＥＡＤＹＹＣＡＴＷＤＤＳＬＮＧＶＩＦＧＧＧＴＫＡＴＶＬＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＥＶＱＬＶＥＳＧＧＡＬＡＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＳＧＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＳＫＮＴＬＦＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＬＴＷＧＬＧＤＮＤＡＬＤＩＷＧＰＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＨＦＲＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＧＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＮＲＬＥＰＫＳＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号１１０ ＥＦ１ａプロモーター配列：
ＣＧＴＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣＧＴＣＡＧＴＧＧＧＣＡＧＡＧＣＧＣＡＣＡＴＣＧＣＣＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＧＡＧＡＡＧＴＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＧＡＡＣＣＧＧＴＧＣＣＴＡＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＴＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡＧＴＧＡＴＧＴＣＧＴＧＴＡＣＴＧＧＣＴＣＣＧＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＡＣＣＧＴＡＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＧＴＡＧＴＣＧＣＣＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＴＡＡＧＴＧＣＣＧＴＧＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＧＣＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＴＴＴＡＣＧＧＧＴＴＡＴＧＧＣＣＣＴＴＧＣＧＴＧＣＣＴＴＧＡＡＴＴＡＣＴＴＣＣＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＴＡＣＧＴＧＡＴＴＣＴＴＧＡＴＣＣＣＧＡＧＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＧＡＡＧＴＧＧＧＴＧＧＧＡＧＡＧＴＴＣＧＡＧＧＣＣＴＴＧＣＧＣＴＴＡＡＧＧＡＧＣＣＣＣＴＴＣＧＣＣＴＣＧＴＧＣＴＴＧＡＧＴＴＧＡＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＧＣＴＧＧＧＧＣＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＧＣＡＣＣＴＴＣＧＣＧＣＣＴＧＴＣＴＣＧＣＴＧＣＴＴＴＣＧＡＴＡＡＧＴＣＴＣＴＡＧＣＣＡＴＴＴＡＡＡＡＴＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＣＧＡＣＧＣＴＴＴＴＴＴＴＣＴＧＧＣＡＡＧＡＴＡＧＴＣＴＴＧＴＡＡＡＴＧＣＧＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＴＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＡＴＴＴＣＧＧＴＴＴＴＴＧＧＧＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＡＣＧＧＧＧＣＣＣＧＴＧＣＧＴＣＣＣＡＧＣＧＣＡＣＡＴＧＴＴＣＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＧＧＣＣＴＧＣＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＡＣＣＧＡＧＡＡＴＣＧＧＡＣＧＧＧＧＧＴＡＧＴＣＴＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧＧＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＴＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＧＣＴＧＧＣＣＣＧＧＴＣＧＧＣＡＣＣＡＧＴＴＧＣＧＴＧＡＧＣＧＧＡＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＣＴＴＣＣＣＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＧＡＧＣＴＣＡＡＡＡＴＧＧＡＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＣＴＣＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＴＧＡＧＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＧＣＣＴＴＴＣＣＧＴＣＣＴＣＡＧＣＣＧＴＣＧＣＴＴＣＡＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＣＧＧＡＧＴＡＣＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＣＣＡＧＧＣＡＣＣＴＣＧＡＴＴＡＧＴＴＣＴＣＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＡＧＴＡＣＧＴＣＧＴＣＴＴＴＡＧＧＴＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＡＴＧＣＧＡＴＧＧＡＧＴＴＴＣＣＣＣＡＣＡＣＴＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＣＴＧＡＡＧＴＴＡＧＧＣＣＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣＴＴＧＡＴＧＴＡＡＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧＡＡＴＴＴＧＣＣＣＴＴＴＴＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＴＣＴＴＧＧＴＴＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＴＣＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＧＧＴＧＴＣＧＴＧＡ
例示的な実施形態
本開示の他の箇所に記載された実施形態に加えて、本発明の例示的な実施形態としては、限定されないが、以下のものが挙げられる。
１．抗体または抗体フラグメントを含む組成物であって、前記抗体または抗体フラグメントが、以下のうち１つ以上を含む組成物：
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列および配列番号７に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＦＲ１；
（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列および配列番号９に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
（ｃ）配列番号１１、配列番号１１に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列、配列番号３９、配列番号３９に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＦＲ２；
（ｄ）配列番号１３、配列番号１３に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列、配列番号４１、配列番号４１に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；
（ｅ）配列番号１５のアミノ酸配列および配列番号１５に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＦＲ３；
（ｆ）配列番号１７のアミノ酸配列および配列番号１７に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（ｇ）配列番号１９、配列番号１９に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列、配列番号４３、配列番号４３に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＦＲ４；
（ｈ）配列番号２３のアミノ酸配列および配列番号２３に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＦＲ１；
（ｉ）配列番号２５、配列番号２５に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列、配列番号４５、配列番号４５に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｊ）配列番号２７のアミノ酸配列および配列番号２７に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＦＲ２；
（ｋ）配列番号２９のアミノ酸配列および配列番号２９に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｌ）配列番号３１、配列番号３１に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列、配列番号４７、配列番号４７に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＦＲ３；
（ｍ）配列番号３３、配列番号３３に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列、配列番号４９、配列番号４９に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｎ）配列番号３５、配列番号３５に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列、配列番号５１、配列番号５１に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＦＲ４；
（ｏ）配列番号３７のアミノ酸配列および配列番号３７に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むリンカードメイン。
２．前記抗体または抗体フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖とを含む実施形態１に記載の組成物。
３．前記抗体または抗体フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列を含む実施形態１に記載の組成物。
４．前記抗体または抗体フラグメントが、配列番号３９、配列番号４５および配列番号５１を含む実施形態１に記載の組成物。
５．前記抗体または抗体フラグメントが、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５および配列番号４７を含む実施形態１に記載の組成物。
６．前記抗体または抗体フラグメントが、配列番号４５および配列番号４９を含む実施形態１に記載の組成物。
７．抗体または抗体フラグメントを含む組成物であって、前記抗体または抗体フラグメントが、以下のうち１つ以上を含む組成物：
（ａ）配列番号５５のアミノ酸配列および配列番号５５に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖シグナルペプチド；
（ｂ）配列番号５７のアミノ酸配列および配列番号５７に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｃ）配列番号５９のアミノ酸配列および配列番号５９に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域；
（ｄ）配列番号６３のアミノ酸配列および配列番号６３に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖シグナルペプチド；
（ｅ）配列番号６５のアミノ酸配列および配列番号６５に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｆ）配列番号６７のアミノ酸配列および配列番号６７に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域。
８．前記抗体または抗体フラグメントが、配列番号６８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む実施形態７に記載の組成物。
９．前記抗体または抗体フラグメントが、配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む実施形態７に記載の組成物。
１０．前記抗体またはその抗体フラグメントが、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡｌ、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、ＩｇＥからなる群から選択されるか、またはＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡｌ、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＡまたはＩｇＥの免疫グロブリン定常ドメインおよび／または可変ドメインを含む、実施形態１～９のいずれかに記載の組成物。
１１．前記抗体または抗原結合フラグメントが、ラムダ、カッパまたはそのバリアントの部分軽鎖定常領域または全軽鎖定常領域を含む、実施形態１～９のいずれかに記載の組成物。
１２．前記抗体または抗体フラグメントが、組換え抗体である、実施形態１～１１のいずれかに記載の組成物。
１３．前記抗体または抗体フラグメントが、モノクローナル抗体である、実施形態１～１１のいずれかに記載の組成物。
１４．前記抗体または抗体フラグメントが、ポリクローナル抗体である、実施形態１～１１のいずれかに記載の組成物。
１５．前記抗体または抗体フラグメントが、モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体の混合物である、実施形態１～１１のいずれかに記載の組成物。
１６．前記抗体または抗体フラグメントが、ヒト抗体である、実施形態１～１１のいずれかに記載の組成物。
１７．前記抗体または抗体フラグメントが、ヒト化抗体である、実施形態１～１１のいずれかに記載の組成物。
１８．前記抗体または抗体フラグメントが、キメラ抗体である、実施形態１～１１のいずれかに記載の組成物。
１９．抗体または抗体フラグメントをコードする単離された核酸分子を含む組成物であって、前記単離された核酸分子が、以下のうち１つ以上を含む組成物：
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列および配列番号７に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域ＦＲ１をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列および配列番号９に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号１１、配列番号１１に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列、配列番号３９、配列番号３９に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域ＦＲ２をコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号１３、配列番号１３に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列、配列番号４１、配列番号４１に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号１５のアミノ酸配列および配列番号１５に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域ＦＲ３をコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）配列番号１７のアミノ酸配列および配列番号１７に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列；
（ｇ）配列番号１９、配列番号１９に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列、配列番号４３、配列番号４３に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域ＦＲ４をコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）配列番号２３のアミノ酸配列および配列番号２３に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域ＦＲ１をコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）配列番号２５、配列番号２５に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列、配列番号４５、配列番号４５に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列；
（ｊ）配列番号２７のアミノ酸配列および配列番号２７に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域ＦＲ２をコードするヌクレオチド配列；
（ｋ）配列番号２９のアミノ酸配列および配列番号２９に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列；
（ｌ）配列番号３１、配列番号３１に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列、配列番号４７、配列番号４７に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域ＦＲ３をコードするヌクレオチド配列；
（ｍ）配列番号３３、配列番号３３に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列、配列番号４９、配列番号４９に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列；
（ｎ）配列番号３５、配列番号３５に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列、配列番号５１、配列番号５１に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域ＦＲ４をコードするヌクレオチド配列；
（ｏ）配列番号３７のアミノ酸配列および配列番号３７に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、リンカードメインをコードするヌクレオチド配列。
２０．前記単離された核酸分子が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列と、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列とを含む、実施形態１９に記載の組成物。
２１．前記単離された核酸分子が、配列番号３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、実施形態１９に記載の組成物。
２２．前記単離された核酸分子が、配列番号３９をコードするヌクレオチド配列と、配列番号４５をコードするヌクレオチド配列と、配列番号５１をコードするヌクレオチド配列とを含む、実施形態１９に記載の組成物。
２３．前記単離された核酸分子が、配列番号４１をコードするヌクレオチド配列と、配列番号４３をコードするヌクレオチド配列と、配列番号４５をコードするヌクレオチド配列と、配列番号４７をコードするヌクレオチド配列とを含む、実施形態１９に記載の組成物。
２４．前記単離された核酸分子が、配列番号４５をコードするヌクレオチド配列と、配列番号４９をコードするヌクレオチド配列とを含む、実施形態１９に記載の組成物。
２５．抗体または抗体フラグメントをコードする単離された核酸分子を含む組成物であって、前記単離された核酸分子が、以下のうち１つ以上を含む、組成物：
（ａ）配列番号６のヌクレオチド配列および配列番号６に対して約９０％を超える相同性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択される軽鎖可変領域ＦＲ１をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号８のヌクレオチド配列および配列番号８に対して約９０％を超える相同性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号１０、配列番号１０に対して約９０％を超える相同性を有するヌクレオチド配列、配列番号３８、配列番号３８に対して約９０％を超える相同性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択される軽鎖可変領域ＦＲ２をコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号１２、配列番号１２に対して約９０％を超える相同性を有するヌクレオチド配列、配列番号４０、配列番号４０に対して約９０％を超える相同性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号１４のヌクレオチド配列および配列番号１４に対して約９０％を超える相同性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択される軽鎖可変領域ＦＲ３をコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）配列番号１６のヌクレオチド配列および配列番号１６に対して約９０％を超える相同性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列；
（ｇ）配列番号１８、配列番号１８に対して約９０％を超える相同性を有するヌクレオチド配列、配列番号４２、配列番号４２に対して約９０％を超える相同性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択される軽鎖可変領域ＦＲ４をコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）配列番号２２のヌクレオチド配列および配列番号２２に対して約９０％を超える相同性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択される重鎖可変領域ＦＲ１をコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）配列番号２４、配列番号２４に対して約９０％を超える相同性を有するヌクレオチド配列、配列番号４４、配列番号４４に対して約９０％を超える相同性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列；
（ｊ）配列番号２６のヌクレオチド配列および配列番号２６に対して約９０％を超える相同性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択される重鎖可変領域ＦＲ２をコードするヌクレオチド配列；
（ｋ）配列番号２８のヌクレオチド配列および配列番号２８に対して約９０％を超える相同性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列；
（ｌ）配列番号３０、配列番号３０に対して約９０％を超える相同性を有するヌクレオチド配列、配列番号４６、配列番号４６に対して約９０％を超える相同性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択される重鎖可変領域ＦＲ３をコードするヌクレオチド配列；
（ｍ）配列番号３２、配列番号３２に対して約９０％を超える相同性を有するヌクレオチド配列、配列番号４８、配列番号４８に対して約９０％を超える相同性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択される重鎖ＣＤ３をコードするヌクレオチド配列；
（ｎ）配列番号３４、配列番号３４に対して約９０％を超える相同性を有するヌクレオチド配列、配列番号５０、配列番号５０に対して約９０％を超える相同性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択される重鎖可変領域ＦＲ４をコードするヌクレオチド配列；
（ｏ）配列番号３６のヌクレオチド配列および配列番号３６に対して約９０％を超える相同性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択されるリンカードメインをコードするヌクレオチド配列。
２６．前記単離された核酸分子が、配列番号４のヌクレオチド配列と、配列番号２０のヌクレオチド配列とを含む、実施形態２５に記載の組成物。
２７．前記単離された核酸分子が、配列番号２のヌクレオチド配列を含む、実施形態２５に記載の組成物。
２８．前記単離された核酸分子が、配列番号３８のヌクレオチド配列と、配列番号４４のヌクレオチド配列と、配列番号５０のヌクレオチド配列とを含む、実施形態２５に記載の組成物。
２９．前記単離された核酸分子が、配列番号４０のヌクレオチド配列と、配列番号４２のヌクレオチド配列と、配列番号４４のヌクレオチド配列と、配列番号４６のヌクレオチド配列とを含む、実施形態２５に記載の組成物。
３０．前記単離された核酸分子が、配列番号４４のヌクレオチド配列と、配列番号４８のヌクレオチド配列とを含む、実施形態２５に記載の組成物。
３１．抗体または抗体フラグメントをコードする単離された核酸分子を含む組成物であって、前記単離された核酸分子が、以下のうち１つ以上を含む組成物：
（ａ）配列番号５５のアミノ酸配列および配列番号５５に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号５７のアミノ酸配列および配列番号５７に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号５９のアミノ酸配列および配列番号５９に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号６３のアミノ酸配列および配列番号６３に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号６５のアミノ酸配列および配列番号６５に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）配列番号６７のアミノ酸配列および配列番号６７に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列。
３２．前記単離された核酸分子が、配列番号６８のアミノ酸配列を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列と、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列とを含む、実施形態３１に記載の組成物。
３３．前記単離された核酸分子が、配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列と、配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列とを含む、実施形態３１に記載の組成物。
３４．抗体または抗体フラグメントをコードする単離された核酸分子を含む組成物であって、前記単離された核酸分子が、以下のうち１つ以上を含む組成物：
（ａ）配列番号５４のヌクレオチド配列および配列番号５４に対して約９０％を超える相同性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択される重鎖シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号５６のヌクレオチド配列および配列番号５６に対して約９０％を超える相同性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択される重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号５８のヌクレオチド配列および配列番号５８に対して約９０％を超える相同性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択される重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号６２のヌクレオチド配列および配列番号６２に対して約９０％を超える相同性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択される軽鎖シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号６４のヌクレオチド配列および配列番号６４に対して約９０％を超える相同性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択される軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）配列番号６６のヌクレオチド配列および配列番号６６に対して約９０％を超える相同性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択される軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列。
３５．前記単離された核酸分子が、配列番号５２のヌクレオチド配列と、配列番号６０のヌクレオチド配列とを含む、実施形態３４に記載の組成物。
３６．前記組成物が、前記単離された核酸分子を含むベクターである、実施形態１９～３５のいずれかに記載の組成物。
３７．前記ベクターが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群から選択される、実施形態３６に記載の組成物。
３８．前記組成物が、前記抗体または抗体フラグメントを含む細胞である、実施形態１～１８のいずれかに記載の組成物。
３９．前記組成物が、前記単離された核酸分子を含む細胞である、実施形態１９～３５のいずれかに記載の組成物。
４０．前記細胞が、ファージ、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、またはＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、またはＰＥＲ．Ｃ６などの哺乳動物細胞である、実施形態３８～３９のいずれかに記載の組成物。
４１．前記細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系またはｉｎ ｖｉｖｏ発現系、例えば、タンパク質発現のための操作された動物である、実施形態３８～４０のいずれかに記載の組成物。
４２．ＰＳＭＡの発現に関連する疾患を有する被験体を治療する方法であって、有効量の実施形態１～４１のいずれかに記載の組成物を被験体に投与することを含む方法。
４３．前記組成物は、生物学的に活性な薬剤に対して、共有結合または非共有結合によって操作可能に連結した抗体または抗体フラグメントを含む抗体薬物コンジュゲートであり、前記薬物は、毒素、放射性同位体、ナノ粒子、酵素、生物活性ペプチドまたはヌクレオチドである、実施形態１～１８のいずれかに記載の組成物。
４４．前記抗体薬剤コンジュゲートが、以下の式を有する、実施形態４３の組成物：
Ａｂ－（ＬＵ－Ｄ）ｐ
またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物、ここで、
Ａｂは、抗体または抗体フラグメントであり；
（ＬＵ－Ｄ）は、リンカー単位－薬物単位部分であり、ここで、
ＬＵ－は、リンカー単位であり；
－Ｄは、毒素、放射性同位体、ナノ粒子、酵素、生物活性ペプチドまたはヌクレオチドを表す薬物単位であり；
ｐは、１～２０の整数である。
４５．前記抗体薬剤コンジュゲートが、以下の式を有する、実施形態４３の組成物：
Ａｂ－（Ａａ－Ｗｗ－Ｙｙ－Ｄ）ｐ
またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物、ここで、
Ａｂは、抗体または抗体フラグメントであり；
－Ａａ－Ｗｗ－Ｙｙ－は、リンカー単位（ＬＵ）であり；
－Ａ－は、伸張ユニットであり、
ａは、０または１であり、
各－Ｗ－は、独立して、アミノ酸単位であり、
ｗは、０～１２の整数であり、
－Ｙ－は、自己犠牲スペーサ単位であり、
ｙは、０、１または２であり；
－Ｄは、毒素、放射性同位体、ナノ粒子、酵素、生物活性ペプチドまたはヌクレオチドを表す薬物単位であり；
ｐは、１～２０の整数である。
４６．前記毒素、放射性同位体、ナノ粒子、生物活性ペプチドまたはヌクレオチドは、以下の式を有する担体を介して間接的に抗体または抗体フラグメントに標識されている、実施形態４３に記載の組成物：
Ａｂ－｛担体－（ＬＵ－Ｄ）ｐ｝ｎ
または
Ａｂ－｛担体－（Ａａ－Ｗｗ－Ｙｙ－Ｄ）ｐ｝ｎ
またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物、ここで、
Ａｂは、抗体または抗体フラグメントであり；
（ＬＵ－Ｄ）は、リンカー単位－薬物単位部分であり、ここで、
ＬＵ－は、リンカー単位であり；
－Ａａ－Ｗｗ－Ｙｙ－は、リンカー単位（ＬＵ）であり；
－Ａ－は、伸張ユニットであり、
ａは、０または１であり、
各－Ｗ－は、独立して、アミノ酸単位であり、
ｗは、０～１２の整数であり、
－Ｙ－は、自己犠牲スペーサ単位であり、
ｙは、０、１または２であり；
－Ｄは、毒素、放射性同位体、ナノ粒子、酵素、生物活性ペプチドまたはヌクレオチドを表す薬物単位であり；
ｐは、１～２０の整数であり、
担体は、ポリマー、ＰＥＧ、ペプチド、糖、化合物または薬物単位との間接抗体コンジュゲートのための薬物単位（複数可）を保持するために使用されているヌクレオチドであり、
Ｎは、１～２０の整数である組成物。
４７．前記リンカーが、開裂可能であるか、または開裂不能であり、安定であるか、または酸に不安定である、実施形態４３～４６のいずれかに記載の組成物。
４８．前記リンカーが、ペプチド、ポリマー、ＰＥＧ、糖、化合物、ヌクレオチドである、実施態様４３～４６のいずれかに記載の組成物。
４９．前記リンカーが、ＳＭＣＣ、ＭＣ、ＭＰ、ｖａｌ－ｃｉｔ（ＶＣ）、ａｌａ－ｐｈｅ、ＰＡＢ、ＳＰＰ、ＳＰＤＢ、ＳＩＡＢ、ＭＣ－ｖｃ、ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ、ヒドラゾンまたはマレイミドカプロイルである、実施形態４３～４６のいずれかに記載の組成物。
５０．前記毒素が、メイタンシノイド、オーリスタチン、カリケアマイシン、ドラスタチン、ドキソルビシンまたはこれらの組合せ、例えば、ＤＭ１、ＤＭ４、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、カリケアマイシンまたはドキソルビシンである、実施形態４３～４６のいずれかに記載の組成物。
５１．前記毒素が、サポリン、ジフテリア毒素、ジフテリア毒素Ａ、シュードモナス外毒素、シュードモナス外毒素ＰＥ３８、カスパーゼ－３、カスパーゼ－９、グランザイムＢ、リンパ毒素、パーフォリン、アポトーシス誘導因子、ＤＮＡｓｅ、ＤＮＡｓｅ Ａ、シトクロムＣ、ボツリヌス、アンギオゲニン、コリシン、リシンＡ、またはこれらの組合せの部分的な単位または全毒素である、実施態様４３～４６のいずれかに記載の組成物。
５２．前記放射性同位体は、α、β、γまたはポジトロン線を発する、実施形態４３～４６のいずれかに記載の組成物。
５３．前記放射性同位体が、モリブデン－９９、テクネチウム－９９ｍ、ビスマス－２１３、クロム－５１、コバルト－６０、銅－６４、ジスプロシウム－１６５、エルビウム－１６９、ホルミウム－１６６、ヨウ素－１２５、イリジウム－１９２、鉄－５９、ルテチウム－１７７、パラジウム－１０３、リン－３２、カリウム－４２、レニウム－１８６、レニウム－１８８、サマリウム－１５３、セレニウム－７５、ナトリウム－２４（１５ｈ）、ストロンチウム－８９、キセノン－１３３、イッテルビウム－１６９、イットリウム－９０、炭素－１１、窒素－１３、酸素－１５、コバルト－５７、ガリウム－６７、インジウム－１１１、ヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、クリプトン－８１ｍ、ルビジウム－８２、ストロンチウム－９２、タリウム－２０１、ロジウム－８６、ロジウム－１８８、銅－６７、臭素－７７、鉛－２１２、ラジウム－２２４、ラジウム－２２３Ｒａ、臭素－７６、ヨウ素－１２４、イットリウム－８６、テクネチウム－９４ｍ、ガリウム－６８、ガリウム－６６、銅－６０、ジルコニウム－８９、炭素－１１、窒素－１３、酸素－１５、フッ素－１８、ルビジウム－８２からなる群から選択される、実施形態４３～４６のいずれかに記載の組成物。
５４．前記ナノ粒子が、イメージングプローブ、イメージングコントラスト、遺伝子、薬物、プレドラッグまたはこれらの組合せを含有する、診断、治療またはセラノスティックである、実施形態４３～４６のいずれかに記載の組成物。
５５．前記生物活性ペプチドが、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、ガンマインターフェロン、インターロイキン－１、インターロイキン－２、インターロイキン－３、インターロイキン－４、インターロイキン－５、インターロイキン－６、インターロイキン－７、インターロイキン－８、インターロイキン－１０、インターロイキン－１２、インターロイキン－１５、インターロイキン－１８、インターロイキン－２１、インターロイキン－２３、ガンマＴＮＦ、ベータＴＧＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦなどのサイトカイン、またはいくつかのサイトカインの組合せである、実施形態４３～４６のいずれかに記載の組成物。
５６．前記組成物は、同じ抗原上または異なる抗原上にある２つ以上の異なるエピトープに結合する多重特異性抗体を含み、エピトープの１つがヒト前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）上にある、実施形態１～１８のいずれかに記載の組成物。
５７．前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、実施形態５６に記載の組成物。
５８．前記二重特異性抗体が、以下を含む、実施形態５７に記載の組成物：
（ａ）以下の式：Ｖｌ－Ｌｌ－Ｖ２－Ｌ２－Ｖ３－Ｌ３－Ｖ４－Ｌ４－Ｆｃを有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖；ここで、Ｆｃは、ヒトＩｇＧ Ｆｃポリペプチド鎖であり；ＶＩ、Ｖ２、Ｖ３およびＶ４のうちの２つは免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）領域であり、他の２つは免疫グロブリン軽鎖可変（ＶＬ）領域であり；ＬＩ、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、リンカーであり；Ｌ２は、存在しても存在しなくてもよく；Ｌ４は、Ｃ２２０での突然変異を有するＩｇＧ１ヒンジであり；
（ｂ）以下の式：Ｆｃ－Ｌ４－Ｖｌ－Ｌｌ－Ｖ２－Ｌ２－Ｖ３－Ｌ３－Ｖ４を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖；ここで、Ｆｃは、ヒトＩｇＧ Ｆｃポリペプチド鎖であり；Ｆｃのジスルフィド結合は、ＦｃのＮ末端またはＣ末端にあってもよく；ＶＩ、Ｖ２、Ｖ３およびＶ４のうちの２つはＶＨ領域であり、他の２つはＶＬ領域であり；ＬＩ、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、リンカーであり；Ｌ２は、存在しても存在しなくてもよく；Ｌ４は、Ｃ２２０での突然変異を有するＩｇＧ１ヒンジであり；
（ｃ）以下の式：標的部分－Ｌ４－Ｆｃを有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖；ここで、Ｆｃは、ヒトＩｇＧ Ｆｃポリペプチド鎖であり；Ｌ４は、Ｃ２２０での突然変異を有するＩｇＧ１ヒンジであり；または
（ｄ）以下の式：Ｆｃ－Ｌ４－標的部分を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖；ここで、Ｆｃは、ヒトＩｇＧ Ｆｃポリペプチド鎖であり；Ｌ４は、Ｃ２２０での突然変異を有するＩｇＧ１ヒンジであり；
二重特異性抗体が標的細胞および免疫エフェクター細胞に結合し、および／または免疫エフェクター細胞による標的細胞の細胞溶解を媒介し、
二重特異性抗体がダイマーである。
５９．（ａ）または（ｂ）のＦｃポリペプチド鎖がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド鎖である、実施形態５８に記載の組成物。
６０．（ａ）または（ｂ）のＦｃポリペプチド鎖が、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａの１つ以上の突然変異を有するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド鎖である、実施形態５８に記載の組成物。
６１．（ａ）または（ｂ）のＦｃポリペプチド鎖が、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａの１つ以上の突然変異を有するＩｇＧ４ Ｆｃである、実施形態５８に記載の組成物。
６２．前記Ｌ４が、Ｃ２２０Ａ、Ｃ２２０Ｇ、Ｃ２２０ＳのようなＣ２２０での突然変異を有するＩｇＧ１ヒンジである、実施形態５８に記載の組成物。
６３．前記二重特異性抗体が、第１の抗原結合領域および第２の抗原結合領域を含み、第２の抗原結合領域が、ヒトＣＤ３上のエピトープに結合し、第１の抗原結合領域が、抗体または抗原フラグメントを含み、ヒト前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）上のエピトープに結合する実施形態５８～６２のいずれかに記載の組成物。
６４．前記二重特異性抗体が、二価、三価または四価である、実施形態５８～６２のいずれかに記載の組成物。
６６．二重特異性抗体が、タンデムｓｃＦｖ（ｔａＦｖまたはｓｃＦｖ２）、ダイアボディ、ｄＡｂ２Ａ／ＨＨ２、ノブ・イン・ホール誘導体、ＳＥＥＤ－ｌｇＧ、ヘテロＦｃ－ｓｃＦｖ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｊｕｎ／Ｆｏｓ、Ｆａｂ’－Ｊｕｎ／Ｆｏｓ、トリボディ、ＤＮＬ－Ｆ（ａｂ）３、ｓｃＦｖ３－ＣＨ１／ＣＬ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ２、ＩｇＧ－ｓｃＦａｂ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、ｓｃＦｖ２－Ｆｃ、Ｆ（ａｂ’）２－ｓｃＦｖ２、ｓｃＤＢ－Ｆｃ、ｓｃＤｂ－ＣＨ３、Ｄｂ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ２－Ｈ／Ｌ、ＤＶＤ－ｌｇ、ｔａｎｄＡｂ、ｓｃＦｖ－ｄｈｌｘ－ｓｃＦｖ、ｄＡｂ２－ｌｇＧ、ｄＡｂ－ＩｇＧ、ｄＡｂ－Ｆｃ－ｄＡｂ、およびこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態５８～６２のいずれかに記載の組成物。
６７．二重特異性抗体が、ダイアボディまたはトリボディである、実施形態５８～６２のいずれかに記載の組成物。
６８．二重特異性抗体が、第１の抗原結合領域と第２の抗原結合領域を含み、第２の抗原結合領域がヒトＣＤ３上のエピトープに結合し、第１の抗原結合領域がヒト前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）上のエピトープに結合し、第２の抗原結合領域が、以下からなる群から選択される、実施形態５８～６７のいずれかの組成物：
（ａ）配列番号８５のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域（ＶＨ）と、配列番号８７の配列を含むＶＬ領域とを含む抗体、および
（ｂ）配列番号９１の配列を含む可変重鎖領域（ＶＨ）と、配列番号９３の配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）領域とを含む抗体。
６９．第２の抗原結合領域（ヒトＣＤ３）の抗体または抗原結合領域が、以下からなる群より選択される、実施形態６８に記載の組成物：
（ａ）配列番号８３のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合領域、および
（ｂ）配列番号８９のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合領域。
７０．二重特異性抗体が、配列番号１０１のアミノ酸配列または配列番号１０３のアミノ酸配列をコードするシグナルペプチド－ｓｃＦｖ１－ＭＣＳ－ｓｃＦｖ２－ＩｇＧ１ヒンジ－ＩｇＧ４ Ｆｃ発現カセットを含む、実施形態６８に記載の組成物。
７１．二重特異性抗体が、配列番号１００の核酸配列または配列番号１０２の核酸配列をコードするシグナルペプチド－ｓｃＦｖ１－ＭＣＳ－ｓｃＦｖ２－ＩｇＧ１ヒンジ－ＩｇＧ４ Ｆｃ発現カセットを含む、実施形態６８に記載の組成物。
７２．前記二重特異性抗体が、（ａ）配列番号１０５のアミノ酸配列；（ｂ）配列番号１０６のアミノ酸配列；（ｃ）配列番号１０８のアミノ酸配列；（ｄ）配列番号１０９のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態５６～７１のいずれかに記載の組成物。
７３．前記二重特異性抗体が、（ａ）配列番号：１０４の核酸配列；（ｂ）配列番号１０７の核酸配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態５６～７１のいずれかに記載の組成物。
７４．実施形態５６～７３のいずれかに記載の二重特異性抗体をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを含む組成物。
７５．前記ベクターが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群から選択される、実施形態７４に記載の組成物。
７６．前記組成物が、ベクターを含む細胞である、実施形態７４のいずれかに記載の組成物。
７７．前記細胞が、ファージ、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞またはＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ．Ｃ６などの哺乳類細胞、またはヒト由来の任意の細胞である、実施形態７６に記載の組成物。
７８．前記細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系またはｉｎ ｖｉｖｏ発現系、例えば、タンパク質発現のための操作された動物である、実施形態７６～７７のいずれかに記載の組成物。
７９．組成物が単離されたキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を含み、ＣＡＲが抗体または抗体フラグメント、膜貫通ドメイン、および１つ以上の刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、実施形態１～１８のいずれかに記載の組成物。
８０．ＣＡＲが、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択される膜貫通ドメインを含む、実施形態７９に記載の組成物。
８１．前記膜貫通ドメインが、配列番号７５、および配列番号７５に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施例８０に記載の組成物。
８２．抗体または抗体フラグメントが、ヒンジ領域によって膜貫通ドメインに連結されている、実施形態７９に記載の組成物。
８３．前記ヒンジ領域が、配列番号７３を含む群から選択されるアミノ酸配列と、配列番号７３と約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列とを含む、実施形態８２に記載の組成物。
８４．１以上の共刺激ドメインをさらに含む、実施形態７９に記載の組成物。
８５．１つまたは複数の共刺激ドメインが、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群から選択される１つ以上のタンパク質から得られる機能性シグナル伝達ドメインである、実施形態８４に記載の組成物。
８６．前記共刺激ドメインが、配列番号７７からなる群から選択されるアミノ酸配列と、配列番号７７と約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列とを含む、実施形態８４または８５に記載の組成物。
８７．細胞内シグナル伝達ドメインが、４－１ＢＢの機能性シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能性シグナル伝達ドメインを含む、実施形態７９に記載の組成物。
８８．前記細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号７７、配列番号７７に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列、配列番号７９、配列番号７９に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態８７に記載の組成物。
８９．リーダー配列をさらに含む、実施形態７９に記載の組成物。
９０．前記リーダー配列が、配列番号７１を含む、実施形態８９に記載の組成物。
９１．ＣＡＲが、配列番号８１、および配列番号８１に対して約９０％を超える相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施例７９に記載の組成物。
９２．前記組成物が、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子を含み、ＣＡＲが、抗体または抗体フラグメント、膜貫通ドメイン、および１つ以上の刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、実施形態１９～３５のいずれかに記載の組成物。
９３．前記組成物が、ＣＡＲをコードする核酸分子を含むベクターである、実施形態９２に記載の組成物。
９４．前記ベクターが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群から選択される、実施形態９３に記載の組成物。
９５．前記ベクターが、プロモーターをさらに含む、実施形態９３に記載の組成物。
９６．前記プロモーターが、ＥＦ－１プロモーターである、実施形態９５に記載の組成物。
９７．前記ＥＦ－１プロモーターが、配列番号１１０の配列を含む、実施形態９６に記載の組成物。
９８．前記組成物が、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子を含む細胞を含み、ＣＡＲが、抗体または抗体フラグメント、膜貫通ドメイン、および１つ以上の刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、実施形態９２に記載の組成物。
９９．前記細胞が、ヒトＴ細胞である、実施形態９８に記載の組成物。
１００．前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項９９に記載の組成物。
１０１．実施態様９３－９７のいずれかの組成物を用い、Ｔ細胞に形質導入することを含む、細胞を作製する方法。
１０２．ＰＳＭＡの発現に関連する疾患を有する被験体を治療する方法であって、有効量の実施態様７９～１００のいずれかに記載の組成物を被験体に投与することを含む方法。
１０３．前記組成物が、自己Ｔ細胞である、実施形態１０２に記載の方法。
１０４．前記組成物が、同種異系Ｔ細胞である、実施形態１０２に記載の方法。
１０５．ＰＳＭＡの発現に関連する疾患を有する被験体を治療する方法であって、有効量の実施形態４３～５５のいずれかに記載の組成物を被験体に投与することを含む方法。
１０６．ＰＳＭＡの発現に関連する疾患を有する被験体を治療する方法であって、有効量の実施形態５６～７８のいずれかに記載の組成物を被験体に投与することを含む方法。
１０７．哺乳動物においてＰＳＭＡの発現に関連する疾患の存在を診断する方法であって、この方法が、実施形態１～１８のいずれかに記載の組成物を含む組成物を用い、前記哺乳動物から単離された組織サンプルをサンプリングすることを含み、前記組織サンプルに対する抗体または抗体フラグメントの特異的な結合が、前記哺乳動物におけるＰＳＭＡの発現に関連する疾患の存在の指標となる方法。
１０８．薬学的に許容される担体、賦形剤、安定剤、希釈剤、アジュバント、サイトカイン、ケモカイン、化学療法薬、他の治療薬またはこれらの組合せをさらに含む、実施形態１～４１のいずれかに記載の組成物。
１０９．薬学的に許容される担体、賦形剤、安定剤、希釈剤、アジュバント、サイトカイン、ケモカイン、化学療法薬、他の治療薬またはこれらの組合せをさらに含む、実施形態４３～５５のいずれかに記載の組成物。
１１０．薬学的に許容される担体、賦形剤、安定剤、希釈剤、アジュバント、サイトカイン、ケモカイン、化学療法薬、他の治療薬またはこれらの組合せをさらに含む、実施形態５６～７８のいずれかに記載の組成物。
１１１．薬学的に許容される担体、賦形剤、安定剤、希釈剤、アジュバント、サイトカイン、ケモカイン、化学療法薬、他の治療薬またはこれらの組合せをさらに含む、実施形態７９～１００のいずれかに記載の組成物。
１１２．被験体におけるＰＳＭＡの発現に関連する疾患を画像化する方法であって、この方法が、実施形態１～１８のいずれかに記載の組成物を適用する工程を含み、抗体または抗体フラグメントが、試薬に作動可能に連結されている方法。
１１３．前記試薬が、光活性化可能な薬剤、フルオロフォア、放射性同位体、生物発光タンパク質、生物発光ペプチド、蛍光タグ、蛍光タンパク質、蛍光ペプチド、イメージングコントラスト、酵素、核磁気共鳴活性試薬またはナノ粒子である、実施形態１１２に記載の方法。
１１４．ＰＳＭＡ発現に関連する疾患が、癌または悪性腫瘍などの増殖性疾患または前立腺癌などの前癌状態、または腫瘍細胞または血管新生のときにＰＳＭＡの高い発現を伴う他の固形腫瘍から選択されるか、またはＰＳＭＡの発現に関連する非癌に関連する徴候であり、固形腫瘍としては、悪性上皮腫瘍、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫（脂肪肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍、中皮腫、シュワン細胞腫、髄膜腫、悪性腺腫、白血病または悪性リンパ増殖性障害、特に、例えば、肉腫、卵巣癌、乳癌、膠芽腫、胃癌、直腸癌、直腸結腸癌、肺癌、肝臓癌、甲状腺癌、リンパ腫、鼻咽頭癌、上顎洞癌、腎臓癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、胆嚢癌、胆管癌が挙げられる、実施形態４２、１０２、１０５～１０７および１１２に記載の方法。
本明細書で引用した各特許、特許出願および刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、特定の実施形態を参照しつつ開示されたが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、他の実施形態および本発明の変形形態が当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような実施形態および同等の全ての変形を含むと解釈されることが意図される。

Claims (19)

  1. 前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
    （ｉ）配列番号９（ＬＣＤＲ１）、配列番号１３または配列番号４１（ＬＣＤＲ２）および配列番号１７（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖領域；および
    （ｉｉ）配列番号２５または４５（ＨＣＤＲ１）、配列番号２９（ＨＣＤＲ２）、および配列番号３３または４９（ＨＣＤＲ３）を含む重鎖領域であって、前記ＨＣＤＲのセットが、配列番号２５、２９および３３、配列番号４５、２９および３３ならびに配列番号４５、２９および４９からなる群から選択される、重鎖領域
    を含む、抗体または抗原結合フラグメント。
  2. 前記軽鎖領域が配列番号５、７、１１、１５、１９、３９、４３、６１、６３、６５、６７および６９の配列の１以上を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  3. 前記重鎖領域が配列番号２１、２３、２７、３１、３５、４７、５１、５３、５５、５７、５９および６８の配列の１以上を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  4. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが配列番号３および３７の配列の１以上を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  5. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡｌ、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、ＩｇＥからなる群から選択されるか、またはＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡｌ、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＡまたはＩｇＥの免疫グロブリン定常ドメインおよび／または可変ドメインを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  6. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、（ｉ）組換え抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体の混合物、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、または（ｉｉ）細胞毒性剤、薬物、成長阻害剤、毒素、放射性同位体またはナノ粒子にコンジュゲートする、請求項１～５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  7. 同じ抗原上または異なる抗原上にある２つ以上の異なるエピトープに結合し、前記エピトープの１つが、ヒト前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）上にあり、請求項１～６のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメントの軽鎖領域または重鎖領域を含む、多重特異性抗体。
  8. 単離されたキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）であって、前記ＣＡＲが、請求項１～７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、膜貫通ドメイン、および１つ以上の刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、単離されたキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）。
  9. 請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、または請求項８に記載のＣＡＲをコードする、単離された核酸分子。
  10. 請求項９に記載の核酸分子を含むベクター。
  11. 請求項１０に記載のベクターを含む培養宿主細胞。
  12. 組成物であって、前記組成物は、請求項１～７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項８に記載のＣＡＲ、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載のベクター、または請求項１１に記載の宿主細胞を含み、前記組成物は、好ましくは薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物である、組成物。
  13. 被験体におけるＰＳＭＡの発現に関連する疾患の治療に用いられる、請求項１２に記載の組成物。
  14. 哺乳動物においてＰＳＭＡの発現に関連する疾患の存在を診断するための薬剤の製造における請求項１～６のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
  15. ヒトを除く被験体におけるＰＳＭＡの発現に関連する疾患を画像化する方法であって、この方法が、請求項１～６のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを適用する工程を含み、抗体または抗体フラグメントが、試薬に作動可能に連結されている方法。
  16. 前記試薬が、光活性化可能な薬剤、フルオロフォア、放射性同位体、生物発光タンパク質、生物発光ペプチド、蛍光タグ、蛍光タンパク質、蛍光ペプチド、イメージングコントラスト、酵素、核磁気共鳴活性試薬またはナノ粒子である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記ＰＳＭＡ発現に関連する疾患が、増殖性疾患、好ましくは癌、より好ましくは前立腺癌である、請求項１３に記載の組成物。
  18. 前記ＰＳＭＡ発現に関連する疾患が、増殖性疾患、好ましくは癌、より好ましくは前立腺癌である、請求項１４に記載の使用。
  19. 前記ＰＳＭＡ発現に関連する疾患が、増殖性疾患、好ましくは癌、より好ましくは前立腺癌である、請求項１５または１６に記載の方法。
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