JP7109423B2 - ライトシート顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、ライトシート顕微鏡に関し、このライトシート顕微鏡は、照明軸線に沿って伝播する照明ビームを試料上に配向するように構成されている、ビーム源を備える照明ユニットと、照明ビームから、試料を部分領域において照明する、ライトシート様式の照明光分布を生成するように構成されているライトシート生成手段と、照明光分布で照明された、試料の部分領域から生じる検出光を検出するように構成されている、検出器を備える検出ユニットを含んでいる。

特に蛍光顕微鏡では近年、試料が面状または線状に拡げられた光分布によって照明される顕微鏡方法が用いられている。これに対する例は、ＳＰＩＭ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｐｌａｎｅ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、ＯＰＭ（Ｏｂｌｉｑｕｅ Ｐｌａｎｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）およびＳＣＡＰＥ（Ｓｗｅｐｔ Ｃｏｎｆｏｃａｌｌｙ－Ａｌｉｇｎｅｄ Ｐｌａｎａｒ Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）の名称で知られている顕微鏡方法である。たとえばＳＰＩＭ顕微鏡では、照明光束が、たとえば円柱レンズを用いて、１方向においてのみ焦点合わせされ、ひいては拡張される。これによって、試料は、試料内で、１つの試料面だけを照明するライトシートまたはライトディスクによって照明される。ＳＰＩＭ顕微鏡は、照明と検出のために、試料側に２つの別個の対物レンズを有している。これら対物レンズの光軸は相互に垂直に延在している。結像されるべき試料面は、検出対物レンズの光軸に対して垂直に位置している。このような試料面の照明は、照明対物レンズを、検出対物レンズの光軸に対して垂直に、試料へと入射するライトシートによって行われる。

これに対して、ＳＣＡＰＥ方法では、唯一の、試料側の対物レンズが、照明のためにも、検出のためにも使用される。照明は、対物レンズの光軸に対して傾斜して位置するライトシートによって行われる。ライトシートがこのように傾斜しているために、ＳＣＡＰＥ顕微鏡は通常、対物レンズと共に作用する、相互に傾斜している部分光学系を備えた正立光学系（Ａｕｆｒｉｃｈｔｕｎｇｓｏｐｔｉｋ）を有している。これらの部分光学系は、中間結像を介して、傾斜しているライトシートによって照明された試料領域が、正しい姿勢で、かつほぼ光学的に修正されて検出器上へ結像されるように、作用する。

上述したＳＰＩＭ方法、ＯＰＭ方法およびＳＣＡＰＥ方法をより詳細に説明するために、たとえば、刊行物である、Ｋｕｍａｒ，Ｓ．等著「Ｈｉｇｈ－ｓｐｅｅｄ ２Ｄ ａｎｄ ３Ｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ｍｙｏｃｙｔｅｓ（Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ １９， １３８３９ （２０１１））」、Ｄｕｎｓｂｙ，Ｃ．著「Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ ｓｅｃｔｉｏｎｅｄ ｉｍａｇｉｎｇ ｂｙ ｏｂｌｉｑｕｅ ｐｌａｎｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ １６， ２０３０６－２０３１６ （２００８））」およびＢｏｕｃｈａｒｄ，Ｍ．Ｂ．等著「Ｓｗｅｐｔ ｃｏｎｆｏｃａｌｌｙ－ａｌｉｇｎｅｄ ｐｌａｎａｒ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ （ＳＣＡＰＥ） ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｓｐｅｅｄ ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｂｅｈａｖｉｎｇ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ（Ｎａｔ．Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ ９， １１３－１１９ （２０１５））」ならびに特許文献である、米国特許第８５８２２０３号明細書（ＵＳ ８５８２２０３ Ｂ２）および米国特許第８６１９２３７号明細書（ＵＳ ８６１９２３７ Ｂ２）を参照されたい。

正立光学系がなくてもよい、類似の顕微鏡方法は、いわゆるＨＩＬＯ（Ｈｉｇｌｙ Ｉｎｃｌｉｎｅｄ Ａｎｄ Ｌａｍｉｎａｔｅｄ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｈｅｅｔ）方法である。これに関しては、Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｍ．、Ｉｍａｍｏｔｏ，Ｎ．およびＳａｋａｔａ－Ｓｏｇａｗａ，Ｋ．著「Ｈｉｇｈｌｙ ｉｎｃｌｉｎｅｄ ｔｈｉｎ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｅｎａｂｌｅｓ ｃｌｅａｒ ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｉｎ ｃｅｌｌｓ（Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ５， １５９－１６１ （２００８））」を参照されたい。

独国特許発明第１０２０１１０００８３５号明細書（ＤＥ １０２０１１０００８３５ Ｂ４）では、試料の傾斜照明のためのライトシートが、スキャンユニットによって生成される。このスキャンユニットは、照明対物レンズの後方の焦点面に対して共役関係にある面に存在している。検出されるべき蛍光光は、対物レンズとスキャンユニットとの間で取り出される。

従来技術に関して、さらに、国際公開第２０１５／１０９３２３号（ＷＯ ２０１５／１０９３２３ Ａ２）を参照されたい。これはとりわけ、検出されるべき蛍光光の分離のためにダイクロックミラーが、光方向において、スキャンミラーの後ろに配置されており、これによって蛍光光がスキャンミラーによって直接的にデスキャン（ｅｎｔｓｃａｎｎｔ）される顕微鏡構造を示している。このような構造は、実質的に、点走査方式共焦点顕微鏡の構造に相当する。しかしこれは、点走査方式共焦点顕微鏡の構造と、一方では、照明ビームが弱く焦点合わせされ、傾斜して、試料へ配向されているという点で異なっている。他方では、傾斜した、対物レンズの焦点面に対して延在するラインフォーカスから集められた蛍光光が、正立光学系によって起こされる。これによって、画像情報が、照明された線に沿って、ラインセンサによって得られる。スキャンミラーは、照明ビームによる試料のスキャンにも、検出された蛍光光のデスキャンにも使用されるので、位置固定された検出器が使用可能である。

従来技術から公知のライトシート顕微鏡方法では、特に、検出ユニットの焦点光学系が照明された試料面と一致しない場合には、過度に強い輝度差が、記録された画像内に生じてしまう。したがって、たとえばＯＰＭ方法およびＳＣＡＰＥ方法では、照明された試料面が、照明と検出に対して共通して設けられた対物レンズの焦点面に対して傾斜して配置されている。これによって、画像を記録する際に、表面に近い試料領域も、深く位置する試料領域も結像される。ここで、照明ビームが試料に深く侵入するほど、これは、散乱および／または吸収によって強く減衰される。したがって、深く位置し、これによってより弱く照明される試料領域に割り当てられている、結果として生じる画像の領域は、試料の表面に近い層が結像されている画像領域よりも、低い輝度を有している。

上述した、Ｂｏｕｃｈａｒｄらの刊行物では、このような問題を解決するために、検出ビーム路に、フィルターを入れることが提案されている。このフィルターは特に明るい領域を、実質的に均一な輝度分布が生じるように、強く和らげる。しかしこれによって、比較的粗い減衰補償が生じ得る。

従来技術からさらに、記録された画像において、照明光の散乱および／または吸収によって生じる輝度差を回避するための多数の別の方法が知られている。たとえば、Ｄｅａｎ， Ｋ． ＆ Ｆｉｏｌｋａ， Ｒ．著「Ｕｎｉｆｏｒｍ ａｎｄ ｓｃａｌａｂｌｅ ｌｉｇｈｔ－ｓｈｅｅｔｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｆｏｃｕｓｉｎｇ（Ｏｐｔ． Ｅｘｐｒｅｓｓ ２２， ２６１４１－２６１５２ （２０１４））」、Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉ， Ａ． Ｋ．等著「Ｆａｓｔ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｌｉｖｅ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｗｉｔｈ ｓｃｕｌｐｔｅｄ ｌｉｇｈｔ ｓｈｅｅｔｓ（Ｓｃｉ． Ｒｅｐ． ５， （２０１５））」、Ｚｏｎｇ， Ｗ．等著「Ｌａｒｇｅ－ｆｉｅｌｄ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｗｏ－ｐｈｏｔｏｎ ｄｉｇｉｔａｌ ｓｃａｎｎｅｄ ｌｉｇｈｔ－ｓｈｅｅｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ２５， ２５４－２５７ （２０１５））」、Ｈｏｅｂｅ， Ｒ． Ａ．等著「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｌｉｇｈｔ－ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｒｅｄｕｃｅｓ ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ ａｎｄ ｐｈｏｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ ｉｍａｇｉｎｇ（Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２５， ２４９－２５３ （２００７））」を参照されたい。

しかし、このような方法の技術的な実現には、しばしば手間がかかる。さらに、これらは、あらゆるケースにおいて、ライトシート顕微鏡に適用できるわけではない。

本発明の課題は、画像内の、照明ビームの減衰によって生じる輝度差を回避することを可能にするライトシート顕微鏡および試料を顕微鏡で結像する方法を提供することである。

本発明はこの課題を、請求項１記載のライトシート顕微鏡によって、および請求項１５記載の方法によって解決する。有利な発展形態は、従属請求項ならびに後続の明細書に記載されている。

本発明のライトシート顕微鏡の照明ユニットは、ビーム変調手段を有している。ここでこのビーム変調手段は、照明ビームを照明軸線に沿って、すなわちビーム伝播方向を規定している軸線に沿って、次のように変調するように構成されている。すなわち、照明光分布によって照明された、試料の部分領域の露光が、照明軸線に沿って変えられるように変調するように構成されている。試料の各部分領域の露光は、照明強度ひいては照明ビームの強度の変更によって、かつ／または試料の部分領域が照明ビームにさらされる露光持続時間の変更によって変えられる。照明軸線に沿ったこのような露光の変更は、計画的に選択され、検出された画像領域を介して、できるだけ一定の輝度が生じる。

有利には、照明軸線に沿った照明ビームは、照明光分布によって照明された、試料の部分領域の露光が、照明軸線に沿って増大するように変調される。

有利には、ビーム変調手段は、照明ビームの被写体深度領域または焦点を、照明軸線に沿って移動させるように構成されている。照明ビームの被写体深度領域が照明軸線に沿って移動可能であるので、照明軸線上の各位置に対する強度および／または露光持続時間が、このような位置において、試料が所望の光量によって照明されるように調整される。

有利には、ビーム変調手段は、照明軸線に沿って移動可能な照明対物レンズを有している。すなわちこのような実施形態では、照明ビームの被写体深度領域の移動は、ビーム源の外側に配置されている光学コンポーネントを介して実現される。

択一的な実施形態では、ビーム変調手段は、ビーム源に含まれている調整可能なレンズを含んでいる。この調整可能なレンズは、照明ビームの被写体深度領域を移動させる。その光学的な作用が可変に制御可能なこのような調整可能なレンズによって、特に容易に、照明ビームは次のように影響される。すなわち、その被写体深度領域が、照明軸線に沿って動かされるように影響される。

別の択一的な構成では、ビーム変調手段は、ビーム源に含まれている、照明ビームの光路長に影響を与える光学要素を有している。このような光学要素は、たとえば複数の、選択的に、照明ビームのビーム路内に入れられる透過性を有するブロックを含んでいる。これらのブロックは、照明軸線に沿って、異なる厚さを有している。この光学要素は、たとえば、相応する駆動部によって、照明軸線に対して垂直に移動可能なディスクとして構成されており、ここには、透過性を有するブロックが次のように配置されている。すなわち、このディスクが照明軸線に対して垂直に移動されると、選択的に、これらのブロックのうちの１つが、照明ビームのビーム路に入れられるように配置されている。別の構成では、照明ビームの経路長を変える、透過性を有するブロックが、照明軸線に対して平行な回転軸を中心に回転可能なディスク上に配置されていてもよい。

特に有利な構成では、ビーム変調手段は、照明ビームの強度を、被写体深度領域の位置に関連して、照明軸線に沿って変調するように構成されている。ここでは、特に、照明ビームの軸線に近い強度が意図されており、これは、照明軸線もしくは光伝播軸線を中心とした、空間的に制限された半径方向領域にわたった、ビーム強度の統合時に生じる出力に相当する。ここではたとえば、照明ビームを生成するレーザー光源が、被写体深度領域の移動と同期して相応に制御される。

照明ビームがますます深く試料に入射することに付随して被写体深度領域の移動が現れる実施形態では、ビーム変調手段は、次のように構成されている。すなわち、照明ビームの強度が、試料への被写体深度領域の増大する侵入深度に伴って増大するように構成されている。

特に、ビーム変調手段は次のように構成されている。すなわち、照明ビームの強度が、試料への被写体深度領域の増大する侵入深度に伴って増大するように構成されている。これによって特に容易に、散乱および／または吸収による照明ビームの減衰が補償される。

付加的にまたは択一的に、ビーム変調手段は次のように構成されていてもよい。すなわち、照明ビームの被写体深度領域の移動速度を、その位置に関連して、照明軸線に沿って変えるように構成されていてもよい。移動速度のこのような変化は、まさに結像されるべき試料領域の箇所での露光時間の変化に一致する。

特に、ビーム変調手段は、有利には、照明ビームの被写体深度領域の移動速度を、試料への侵入深度が増すとともに低減させるように構成されており、これによって、露光時間が相応に長くなる。

ビーム変調手段は、照明軸線に沿った照明ビームの変調のために、その半径方向の強度プロファイルに、照明軸線に対して垂直な少なくとも１つの方向において影響を与えるビーム成形光学系として形成されていてもよい。

ビーム成形光学系は、たとえば、照明ビームの透過度を、照明軸線からの半径方向の間隔に関連して、照明ビームの強度が照明軸線に沿って増大するように調整するように構成されている。

ビーム成形光学系は、たとえば、２つの位相変調要素を含んでおり、このうちの第１の要素は、照明ビームの位相を次のように調整する。すなわち、照明ビームが第２の要素で、所定の、有利には半径方向に上昇するプロファイルを備えた振幅を有するように調整する。このような実施形態では、たとえば、所望の強度プロファイルの生成に伴って現れる光損失が少なく保たれる。

これらの位相変調要素は、一体成形された構成要素に形成されていてもよく、ここでは、第１の位相変調要素で反射された照明ビームが、ミラーを介して、第２の位相変調要素に戻される。このような実施形態は特にコンパクトな構造を可能にする。

ある実施形態では、照明ビームに、照明軸線からの半径方向の間隔に線形に比例して上昇する、または下降する位相を特徴付けるようにビーム成形光学系が形成されている。特に、ビーム成形光学系は有利には、照明ビームから、少なくとも１つのベッセルビームまたは少なくとも１つのマシュービームを成形するように構成されている。

たとえばアキシコンによって生成可能なベッセルビームは、非回折性かつ自己再構築性の特徴を有している。後者は、ベッセルビームが、照明軸線に沿った点で、たとえば散乱中心によって部分的に妨害またはブロックされる場合に、自身のさらなる推移において、自身の形状を再び得ることを意味している。したがって、ベッセルビームを有する照明は、特に、散乱性、かつ／または吸収性の試料において大変有利である。これは特に、ＯＰＭ用途およびＳＣＡＰＥ用途に当てはまり、ここでは照明される試料面が、検出される焦点面に対して傾斜させられており、これによって、結果として生じる画像に寄与する検出光が、試料の表面に近い領域からも、深くに位置する領域からも生じる。

ベッセルビームの使用は、得られる、比較的高い解像度および改善された侵入深度の他に、別の利点を有している。このような利点はたとえば、ベッセルビームが自身の幅の狭い角度スペクトルに基づいて、球面収差の影響を受けない、ということである。

マシュービームの使用も有利である。これはベッセルビームと同様に、非回折性であり、類似の特性、ひいては類似の利点を有している。しかしマシュービームが、ベッセルビームのプロファイルとは異なる横断プロファイルを有していることが知られている。マシュービームはたとえば、アキシコンが横断面において楕円のガウスビームによって照明されることによって生成され得る。

ベッセルビームおよびマシュービームは、容易に、自身の軸線方向のプロファイルにおいて、すなわち光軸に沿って幅の狭いストリップにおける強度において変調される。これは、このような半径方向からのビーム区間に、すなわち、このようなストリップの外側から、光が供給されることによって行われる。このようなビームは、自身の被写体深度において測定されて、幅の広い角度スペクトルを有しているので、すなわち、比較的大きい半径方向のコンポーネントにおいて寄与を有しているので、これは可能である。

当然、ここで挙げられたビームによって常に、線形の蛍光励起と非線形の蛍光励起が可能である。

別の有利な実施形態では、ビーム成形光学系は、絞り装置を有しており、この絞り装置は、照明ビームのビーム横断面をカッティングするように構成されている。特にベッセルビームは、このようにして、ライトシート顕微鏡に対して特に有利なビーム形状にされる。したがって特に、ＯＰＭ用途においては、以降でカッティングされたベッセルビームと称されるこのようなビームは、マシュービームと同様に特に有利に利用可能である。したがってカッティングされたベッセルビームまたはマシュービームは対物レンズ瞳の縁部のより近くに配置され、検出領域との重畳が相応に僅かになる。この結果、より大きい、効果的な検出開口またはより大きい、効果的な照明開口が利用可能になる。カッティングされたベッセルビームはたとえば、アキシコンおよび後置のスリット絞りを用いて作成可能である。

有利にはビーム成形光学系は、少なくとも１つの空間光変調器、略してＳＬＭを含んでおり、これは、照明ビームの半径方向の強度プロファイルを生成するように構成されている。このような光変調器は、所望のビームプロファイルを生成するために、照明ビームの強度を変調するように構成されていてよい。しかし、光変調器が、位相または同時に位相と強度を変調することも可能である。光変調器はたとえば、凸状のアキシコンまたは凹状のアキシコン、格子、ホログラム、または変形可能なミラーの形態で実現可能である。これは強磁性のＳＬＭまたはＬＣｏＳ－ＳＬＭとして構成されていてよい。複数のこのような要素の組み合わせも、光変調器として使用可能である。

特別な実施形態では、ビーム源は、ライトシート生成手段として、アナモルフィック光学系を有している。たとえば円柱レンズの形状で構成され得るこのようなアナモルフィック光学系は、照明ビームを、２つの、照明軸線に対して垂直に位置する方向のうちの一方向においてのみ拡げる。このような実施形態では、ライトシートは、これに従って、静的に生成される。

択一的な構成では、ビーム源は第１の走査要素を、ライトシート生成手段として有しており、ここでこのような第１の走査要素は、照明ビームを、第１の走査軸線に沿って動かすように構成されている。照明ビームをこのように動かすことによって、ライトシートは動的に形成される。

別の有利な構成は、照明ユニットと検出ユニットに対して共通に設けられた第２の走査要素を有しており、この第２の走査要素は、照明ビームを、上述した第１の走査軸線に対して垂直な第２の走査軸線に沿って動かすように構成されている。したがってこのような第２の走査要素は、照明ビームにも検出光にも作用する。後者はこれによって、第２の走査軸線に沿ってデスキャンされる。これは、検出光を第２の走査要素に戻すことによって、照明ビームに、走査要素によって伝えられたスキャン運動が、検出光に関して、対向作用において相殺され、この結果、検出光が、位置固定された検出器を用いて検出可能であることを意味する。

検出光が第１の走査軸線に沿ってデスキャンされない、説明された実施形態では、検出器は有利には、面状検出器として構成されている。

特に有利な構成では、面状センサは多数のセンサ要素を有している。これらのセンサ要素は次のように駆動制御可能である。すなわち、所定の時点で、それぞれ、これらのセンサ要素の一部だけが、可動の、有利にはストリップ状のシャッターの様式に従ってアクティブにされているように駆動制御可能である。すなわち、このような構成では、面状センサに、ローリングシャッター機能が設けられている。したがってこれは、走査軸線に沿って動かされるラインセンサのように利用される。

別の択一的な実施形態は、照明ユニットと検出ユニットに対して共通に設けられた走査ユニットを有しており、この走査ユニットは、照明ビームを、第１の走査軸線に沿って、かつ第１の走査軸線に対して垂直な第２の走査軸線に沿って動かすように構成されている。このような実施形態では、検出光は２つの走査軸線に沿ってデスキャンされる。ここで走査ユニットは、２つの別個の走査要素から形成されていてよく、これらの走査要素のうちの第１の走査要素は、第１の走査軸線に沿った走査のために用いられ、第２の走査要素は、第２の走査軸線に沿った走査のために用いられる。しかし同様に、２つの走査運動を実施する走査要素が１つだけ設けられていてもよい。

上述した走査要素は、それぞれ、ガルバノメーターミラーまたは微小電気機械ミラー（ＭＥＭＳ）として形成されていてよい。音響光学偏向器（ＡＯＤ）を使用することも可能である。用途に応じて、上述した走査要素が、１次元スキャナーとして、または２次元スキャナーとして利用される。

有利にはビーム源は、光源を含んでいる。この光源は、用途に応じて、適切なレーザー光、たとえばパルス状のレーザー光、幅の広いレーザー光または特に、非線形の蛍光励起に適している光を放射する。

本発明を以降で、図面を参照して実施例に基づいて説明する。

ｙ－ｚ断面における、本発明が適用可能な顕微鏡の第１の実施形態 ｘ－ｚ断面における、第１の実施形態に即した顕微鏡 ｙ－ｚ断面における、本発明が適用可能な顕微鏡の第２の実施形態 ｘ－ｚ断面における、第２の実施形態に即した顕微鏡 ｙ－ｚ断面における、本発明が適用可能な顕微鏡の第３の実施形態 ｘ－ｚ断面における、第３の実施形態に即した顕微鏡 ｙ－ｚ断面における、本発明が適用可能な顕微鏡の第４の実施形態 ｘ－ｚ断面における、顕微鏡の第４の実施形態 ライトシートを生成するための本発明のビーム源 ライトシートを生成するためのビーム源の択一的な実施形態 ベッセルビームを生成するための本発明のビーム源 図１１のビーム源において使用される凸状アキシコンの作用を示す概略図 択一的に使用可能な凸状アキシコンの作用を示す概略図 カッティングされたベッセルビームを生成するために、ビーム源において使用可能な絞り装置の概略図 カッティングされたベッセルビームを生成するための択一的な絞り装置を示す概略図 カッティングされたベッセルビームを生成するための別の択一的な絞り装置を示す概略図 マシュービームを生成するための本発明のビーム源 軸線方向に移動可能な被写体深度領域を備える照明ビームを生成するための本発明のビーム源 軸線方向に移動可能な被写体深度領域を備える照明ビームを生成するための択一的なビーム源 ベッセルビームの使用時の対物レンズ瞳と検出瞳を示す瞳の図 マシュービームおよびカッティングされたベッセルビームの使用時の対物レンズ瞳と検出瞳を示す瞳の図 ガウスビームの使用時の照明ビームと検出円錐との間の重畳を示す概略的な断面図 ガウスビームの使用時の照明ビームと検出円錐との間の重畳の別の断面図 カッティングされたベッセルビームまたはマシュービームの使用時の照明ビームと検出円錐との間の重畳を示す概略的な断面図 カッティングされたベッセルビームまたはマシュービームの使用時の照明ビームと検出円錐との間の重畳を示す別の断面図 照明ビームの軸線方向の被写体深度領域を示す概略図 照明ビームの被写体深度領域の、本発明に相応する移動を示す概略図 被写体深度領域の位置に関連した照明光ビームの強度の本発明の変化を示す概略図 自身の位置に関連する、照明光ビームの被写体深度領域の移動速度の本発明の変化を示す概略図 照明ビームの半径方向のプロファイルに本発明に相応に影響を与えることによってどのように減衰補償に対する軸線方向の強度を制御することができるのかを示す概略図 吸収補償をするビームプロファイルを有する照明ビームを生成するための本発明のビーム源 吸収補償をするビームプロファイルを有する照明ビームを生成するための本発明の別のビーム源 吸収補償をするビームプロファイルを有する照明ビームを生成するための本発明の別のビーム源 ｘ－ｙ断面における、ローリングシャッター機能を有する面状検出器を有する本発明の実施形態 ｙ－ｚ断面における、図３４に示された実施形態 ｘ－ｙ断面における、ローリングシャッター機能を有する面状検出器を有する別の実施形態 ｙ－ｚ断面における、図３６に示された実施形態

以降では、図１から図８を参照して、まずは、本発明のビーム変調が適用可能なライトシート顕微鏡の種々の実施形態を説明する。これらの種々の実施形態は共通して、照明および検出に対してそれぞれ共通の対物レンズ、すなわちそれを通して蛍光励起照明光も、引き起こされた蛍光ビームによって表される検出光も案内される対物レンズを有している。したがって、これらの実施形態は、ＳＣＡＰＥ顕微鏡またはＯＰＭ顕微鏡の様式に従って動作する。しかしここで、明確に、本発明が、たとえばＳＰＩＭ顕微鏡の場合のように、照明と検出に対して別個の対物レンズを設けているライトシート顕微鏡にも適用可能であるということを指摘しておく。

図１および図２では、ライトシート顕微鏡１０ａが第１の実施形態として示されている。図１および図２は、軸線ｘ、ｙおよびｚを有する直交座標系を参照する。ここで図１は、ｙ－ｚ面における断面を示し、図２はｘ－ｚ面における断面を示している。

ライトシート顕微鏡１０ａは、照明ビーム１６を送出するように構成されているビーム源１４ａを備える照明ユニット１２を有している。本実施形態では、ビーム源１４ａは、図１および図２に明示されていないアナモルフィック光学系を有している。これはたとえば円柱レンズであり、これは、照明光ビーム１６を、ライトシート状の照明光分布のために形成する。これは以降で単にライトシートと称される。ビーム源１４ａからの出射時には、ライトシートはｙ－ｚ面に対して平行に配向されている面状の光分布を形成する。図１および図２に示されているビーム源１４ａ（ならびに、図３から図８に示されている別のビーム源）の本発明の技術的な実現を、以降で、多数の実施例に基づいて、図９から図３７を参照して詳細に説明する。

ビーム源１４ａは、照明ビーム１６を偏向ミラー１８に放出する。この偏向ミラーは、照明ビーム１６を１次元スキャンミラー２０ａの方向へ反射する。１次元スキャンミラー２０ａは、たとえばガルバノメーターミラーとして、またはＭＥＭＳミラーとして構成されており、図１において、図平面に対して垂直に延在するｘ軸線を中心に、図面に明示的に示されていない駆動部によって傾斜可能である。このような傾斜によって、１次元スキャンミラー２０ａは、照明ビーム１６を、ｙ軸線に対して平行な方向にずらす。したがって１次元スキャンミラー２０ａは、実質的にｙスキャンミラーと称される。

ｙスキャンミラー２０ａは、照明ビーム１６を光学系２２の方向において反射する。ここでこの光学系は、スキャンレンズ２４と、チューブレンズ２６から成り、テレスコープを形成する。光学系２２は、照明ビーム１６を対物レンズ２８へ配向する。ここでこの対物レンズは、試料３０を、照明ビーム１６によって照明する。図面を簡略化するために、試料３０は図１においてのみ示されている。

ｙスキャンミラー２０ａは、照明ビーム路において、次のように配置されている。すなわち、これが、対物レンズ２８の後方の焦点面に対して共役の面に存在するように配置されている。このようにしてｙスキャンミラー２０ａ、光学系２２および対物レンズ２８は、テレセントリック系を形成する。対物レンズ２８が構造的に、スキャンミラー２０ａが直接的にその瞳内に配置されることが可能であるように構成されている場合には、レンズ２４および２６から成るテレスコープは、必ずしも必要ではない。

図１に示されているように、照明ビーム１６は次のようにｙスキャンミラー２０ａに入射する。すなわち、これがｙ軸線に沿ってずれて対物レンズ２８内に入るように入射する。したがって、照明ビーム１６は、対物レンズ２８の入射瞳の中心から外れた部分領域だけを照明する。これによって、照明ビームは、試料３０内で、対物レンズ２８の光軸に対して傾斜して伝播する。ライトシートを形成する照明ビーム１６、ひいては面状の照明ビーム１６は、試料体積体において、照明面Ａに沿って伝播し、ここで蛍光を励起する。試料内で照明する面を規定する照明面Ａは、照明軸線、すなわち照明ビーム１６の伝播方向と、ｘ軸線によって形成されている（図２を参照）。図１および図２において、参照番号３２は、対物レンズ２８の試料側の焦点面を表す。

ｙスキャンミラー２０ａが、ｘ軸線を中心に傾斜させられることによって、光軸に対して傾斜している照明面Ａは、試料３０内の画像スタックを記録するために、ｙ軸線に対して平行に移動される。

照明ビーム１６によって引き起こされた蛍光ビームは、以降で、検出光３４と称され、これは同様に、対物レンズ２８に達する。この対物レンズはこれに従って、照明対物レンズとしても、検出対物レンズとしても機能する。検出光３４は、光学系２２を通過した後、ｙスキャンミラー２０ａに入射する。ｙスキャンミラーは、検出光３４を次のように反射する。すなわち、これが偏向ミラー１８を通過し、正立光学系３６に達するように反射する。正立光学系３６は、２つの別の対物レンズ３８および４０ならびにチューブレンズ４２を含んでいる。このチューブレンズの後には、面状検出器４４ａが配置されている。ｙスキャンミラー２０ａに戻すことによって、検出光３４はｙ軸線の方向においてデスキャンされる。これは、照明ビーム１６に、ｙスキャンミラー２０ａによって伝達されたスキャン運動（このスキャン運動によって、いわば試料３０を通って照明面Ａが動かされる）が、検出光３４をｙスキャンミラー２０ａに戻すことによって、対向作用において相殺されることを意味する。この結果、照明面Ａは常に位置固定されて、面状検出器４４ａ上に結像される。これによって、画像の記録が面状に行われ、すなわち、面状検出器４４ａの全てのピクセルが同時に照明される。上述したコンポーネント２０ａ、２２、２８、３６および４４ａは、一般的に、参照番号３９が付けられた検出ユニットを形成する。

正立光学系３６は、照明面Ａを、中間結像の過程において、位置固定された面Ａ’上に結像する機能を有している。面Ａ’は、焦点面３２に対して光学的に共役である面４６に対して傾斜させられている。

図１および図２に示されているように、正立光学系３６の２つの対物レンズ３８および４０は、相互に傾斜して配置されている。対物レンズ３８および４０のこのような傾斜によって、面Ａ’は、位置が正しく、面状検出器４４上に結像される。上述したように、デスキャンされた、ｙスキャンミラー２０ａの作用によって、さらに、照明面Ａが、位置固定された中間像Ａ’を介して位置固定されて、面状検出器４４上に結像されることが保証される。

ここで、ｘ－ｚ断面を示している図２において、検出ビーム路が著しく簡略化されているということを示唆しておく。実際には、ｙスキャンミラー２０ａと対物レンズ３８との間に位置している、検出ビーム路の部分は、図２の図平面に対して垂直に延在している。また、面状検出器４４の方向においてこれに続いている、検出ビーム路の部分は、図２の図平面から傾斜して延在している。

図３および図４には、ｙ－ｚ切断面もしくはｘ－ｚ切断面において、ライトシート顕微鏡１０ｂが示されている。これは、本発明に相応に、図１および図２に示された実施形態の変更を表している。

ライトシート顕微鏡１０ｂは、図１および図２に示された顕微鏡１０ａに対して、次のように変更されている。すなわち、対物レンズ２８への入射前に、ｘ－ｚ面に対して平行な、面状の光分布を表しているライトシート状の照明光分布が、ビーム源に配置されたアナモルフィック光学系によってではなく、スキャンミラーによって生成されるように変更されている。このスキャンミラーは、照明ビーム１６をｘ軸線に対して平行な方向において動かし、このようにして同様に、仮想のライトシートを生成する。図１および図２に示された実施形態と比べて、上述した変更は、図３および図４に示されたライトシート顕微鏡１０ｂにおいて、次のことによって実現される。すなわち、ビーム源１４ａが、修正されたビーム源１４ｂによって置換され、ｙスキャンミラー２０ａが２Ｄスキャンミラー２０ｂによって置換され、面状検出器４４ａがライン検出器４４ｂによって置換されていることによって実現される。その他の点では、ライトシート顕微鏡１０ｂの機能コンポーネントは、上述した顕微鏡１０ａの機能コンポーネントと一致する。これらの機能コンポーネントには、図１および図２において使用されている参照番号が付けられており、以降で再度、説明されることはない。これに相応することが、それぞれ上述した図を参照する全ての別の図に当てはまる。

修正されたビーム源１４ｂは、ライトシート生成のためのアナモルフィック光学系を含んでいない。ライトシートの生成は、ライトシート顕微鏡１０ｂでは、むしろ２Ｄスキャンミラー２０ｂによって引き起こされる。これは、ｘ軸線を中心としても、ｙ軸線を中心としても傾斜可能であり、以降で、ｘｙスキャンミラーと称される。ここで、ｙ軸線を中心としたｘｙスキャンミラー２０ｂの傾斜は、ライトシートをｘ－ｚ面において生成するのに用いられる。その限りでは、図３および図４に示されたｘｙスキャンミラー２０ｂは、図１および図２に示されたライトシート顕微鏡１０ａにおいて、ビーム源１４ａに含まれているアナモルフィック光学系が満たす機能を担っている。これに対して、ｘ軸線を中心にしたｘｙスキャンミラー２０ｂの傾斜によって、同様に、ｙ軸線に沿った、照明ビーム１６のずれが生じる。このようなずれは、図１および図２に示された実施形態の場合のように、ライトシート顕微鏡１０ｂでも、試料３０を通って照明面Ａを動かし、このようにして、画像スタックの記録を可能にするために利用される。

試料から生じる検出光を、ｘｙスキャンミラー２０ｂに戻すことによって、ライトシート顕微鏡１０ｂでも、検出光３４のデスキャンが行われる。検出光３４がｙ軸線の方向においてのみデスキャンされるライトシート顕微鏡１０ａとは異なり、図３および図４に示された実施形態では、デスキャンは、ｙ軸線の方向においても、ｘ軸線の方向においても行われる。これに相応して、ライトシート顕微鏡１０ｂでは、図１および図２に示された面状検出器４４ａは、ライン検出器４４ｂによって置換されている。したがって、ライトシート顕微鏡１０ｂでは、画像の記録は、共焦点のライン検出の過程において行われる。

ライン検出器４４ｂは、ここでは、複数のラインを有していてよく、これは特に、Ｔｉｍｅ ｄｅｌａｙ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ（ＴＤＩ）機能を有している場合であり、ここでは、ピクセル－ラインの信号は、センサに対して相対的に動かされる画像に同期して移動され、積分され、これによって、スミアーアーチファクトが回避される。

図５および図６は、別の実施形態としてのライトシート顕微鏡１０ｃを、ｙ－ｚ断面もしくはｘ－ｚ断面において示している。図１および図２に示されているライトシート顕微鏡１０ａと比べて、図５および図６に示された変更は、次のことによって実現される。すなわち、ビーム源１４ａが、修正されたビーム源１４ｃによって置換され、面状検出器４４ａが修正された面状検出器４４ｃによって置換されていることによって実現される。

ライトシート顕微鏡１０ａでは、ビーム源１４ａは、ｘ－ｚ面に対して平行に位置するライトシートを生成するアナモルフィック光学系を有しており、ライトシート顕微鏡１０ｃの修正されたビーム源１４ｃは、このような目的のために、図５および図６に詳細に示されていないｘスキャンミラーを有しており、このｘスキャンミラーは、ｙ軸を中心に傾斜可能である。図３および図４に示されている実施形態のように、図５および図６に示されたライトシート顕微鏡１０ｃでも、照明ビーム１６は、ｘ－ｚ面において動かされ、これによって同様に、仮想のライトシートが生成される。

しかし、図５および図６のライトシート顕微鏡１０ｃでは、ｘスキャンミラーはビーム源１４ｃ内に配置されているので、これは検出光３４には作用しない。すなわち後者は、ｙスキャンミラー２０ａにのみ戻される。これは、検出光３４をｙ軸線の方向においてデスキャンする。すなわち、ｘ軸線の方向における検出光３４のデスキャンは、ライトシート顕微鏡１０ｂでは行われない。これに相応して、図１および図２に示されているライトシート顕微鏡１０ａの場合のように、かつ図３および図４に示されているライトシート顕微鏡１０ｂとは異なり、面状検出器４４ｃが設けられている。しかし、同様に面状検出器４４ａを有するライトシート顕微鏡１０ａとは異なり、ライトシート顕微鏡１０ｃでは、面状検出器４４ｃによるライン毎の画像の記録が可能である。このようなライン毎の画像の記録は、たとえば次のことによって実現される。すなわち、面状検出器４４ｃが、ビーム源１４ｃ内に含まれているｘスキャンミラーの駆動制御と同期されているローリングシャッター機能を有していることによって実現される。

図７および図８は、別の実施形態としてのライトシート顕微鏡１０ｄを、ｙ－ｚ断面もしくはｘ－ｚ断面において示している。ライトシート顕微鏡１０ｄは、図５および図６において示されている顕微鏡１０ｃに対する変更を示している。このような変更は、ライトシート顕微鏡１０ｃの場合のように、仮想の、ｘ－ｚ面に対して平行に配向されているライトシートを生成するｘスキャンミラーを有するビーム源１４ｄが、照明ビーム１６を、付加的な照明対物レンズ５０へ送出することにある。これはたとえば、図７において、双方向矢印によって示されているように、ピエゾ圧電式駆動部によって、照明ビーム路の光軸に沿って移動可能である。照明対物レンズ５０は、照明ビーム１６を、面４６の領域において、照明ビーム路内へ結合する。上述されているように、面４６は光学的に焦点面３２に対して共役に位置している。照明対物レンズ５０が軸線方向に動かされることによって、試料３０内に位置するライトシートの被写体深度領域は、照明面Ａに沿って移動する。照明対物レンズ５０とビーム源１４ｄとの間に、チューブレンズ５１が位置している。

その他の点では、ライトシート顕微鏡１０ｄは、実質的に、上述した実施形態に一致する。

以降では、本発明のビーム源の種々の実施形態が説明されており、これは図１から図８に示された光顕微鏡装置および相応の装置において使用可能である。

図９は、単なる概略図において、ビーム源６８を示しており、これはたとえば、図１および図２に示された、ライトシート顕微鏡１０ａ内で、ビーム源１４ａとして使用され得る。このような実施例では、ビーム源６８は、レーザー光源５２、ファイバー結合部５４、ビーム成形光学系５６および可変の絞り開口部を有しているスリット絞り６４を含んでいる。ビーム成形光学系５６は、ビーム拡張器を形成する２つの、相互に移動可能なレンズ５８、６０と、円柱レンズ６２を含んでいる。ビーム成形光学系５６は、スリット絞り６４上に結像する。

スリット絞り６４と、照明対物レンズ２８との間に、４ｆシステムが任意の数、配置されていてよく、これは図９において、参照番号６５が付けられている２つの線によって示されている。例示的に、図１および図２に示された装置を参照すると、このような４ｆシステムは、次のことのために使用される。すなわち、スリット絞り６４をｙスキャンミラー２０ａ上に結像するために使用される。ｙスキャンミラー２０ａは次に、図１および図２において、スキャンレンズ２４およびチューブレンズ２６を含んでいる光学系２２から形成されている別の４ｆシステムを介して、照明対物レンズ２８の入射瞳内に結像される。

図９に示されている装置では、全ての光学要素５８、６０、６２および２８がテレセントリックに配置されている。すなわち、自身の焦点距離の総計の間隔で配置されている。

スリット絞り６４は、円柱レンズ６２の焦点に、ひいては対物レンズ２８の瞳に共役な面に配置されている。これは、照明ビーム１６の効果的な開口数を整合するために用いられる。これによって、スリット絞り６４を介して、ライトシートの厚さおよび被写体深度が調整される。

図９に示された実施形態は、単に例示的なものであると理解されるべきであり、多用に変更可能である。したがってたとえば、ビーム源５２内に、別のスリット絞りを、照明対物レンズ２８の焦点面に対して共役な面に配置することが可能である。このようなさらなるスリット絞りは、次に同様に、ライトシートの横方向のカッティングに用いられ、ひいては、ライトシートによって照明される試料領域の幅の、面状検出器４４ａによって記録された画像領域の幅への整合に用いられる。図２を参照して、これによって、ｘ軸線の方向におけるライトシートのカッティングが意図される。

図１０は、同様に、単なる概略図において、ビーム源７０を示している。これはたとえば、図５および６に示されたライトシート顕微鏡１０ｃにおいて、ビーム源１４ｃとして、または、図７および８に示されたライトシート顕微鏡１０ｄにおいて、ビーム源１０ｄとして使用可能である。

図９に示されたビーム源６８が、ライトシートを生成するための円柱レンズ６２を有しているのに対して、図１０に示されたビーム源７０は、ライトシート生成の目的で、円柱レンズ６２の代わりに、（図５から図８を参照して）、ｙ軸線を中心に傾斜可能であるｘスキャンミラー７２と、このｘスキャンミラー７２の後に配置されているスキャンレンズ７４を含んでいる。ｙ軸線を中心としたｘスキャンミラーの傾斜によって、照明ビーム１６はｘ－ｚ面において動かされ、これによって、仮想のライトシートが生成される。ｘスキャンミラー７２のレンズ５８、６０およびスキャンレンズ７４は、ビーム成形光学系７５を形成する。

図１１は、図１０に示されたビーム源７０に対する変更を表す、ビーム源７６を示している。このビーム源７６は、ビーム成形光学系７８を有している。このビーム成形光学系は、ベッセルビームの形態の照明ビーム１６を生成するように構成されている。このために、ビーム成形光学系７８は、２つのレンズ５８、６０から形成されたビーム拡張器の他に、凸状のアキシコン８０ならびに別の、このアキシコン８０の後方に配置されているレンズ８２を有している。このアキシコン８０は、屈折性または回折性の構成要素またはホログラムとして、空間光変調器上に構成されていてよく、または変形可能なミラーとして構成されていてよい。アキシコン８０は、照明ビーム１６の位相を、この光軸からの間隔に関連して変更するために用いられる。アキシコン８０の作用は、図１２に示された概略図において、より詳細に示されている。

図１２に示された図では、双方向矢印８１は、ひし形の領域を示しており、このひし形の領域内では、アキシコン８０によって生成されたベッセルビームの強度極大値が局地化されている。別の双方向矢印８４は、レンズ８２の後方の焦点距離を示している。これに相応に、レンズ８２の後方の焦点面８３は、ひし形の領域８１の中央に位置している。これは、レンズ８４によって結像されており、これによって、ベッセルビームの強度極大値が、照明対物レンズの焦点面に移される。図１２に示されているひし形の領域８１は、これによって、ベッセルビームの被写体深度を表している。ベッセルビームの軸線方向のプロファイルが、対称にさせるために、すなわちビームプロファイルを均一化するために、図１２においてＢの参照符号が付けられている面に、リング絞りが配置されていてよい。

図１３は、凸状のアキシコン８０の代わりに、凹状のアキシコン８６が使用されている択一的な実施形態を示している。凹状のアキシコン８６によって、仮想のベッセルビームが形成され、その強度極大値は、図１３において参照番号８８が付けられている領域内に位置する。ここには同様に、レンズ８６の後方の焦点面８３が位置する。アキシコン８６の凹状の構成は、特に省スペースの装置を可能にする。

図１４から図１６には、種々の絞り装置が示されている。これらの絞り装置は、図１１に示されているビーム源７６において、凸状のアキシコン８２（図１２を参照）とともに、または凹状のアキシコン８６（図１３を参照）とともに作用して、カッティングされたベッセルビームの生成のために使用可能である。

図１４は、光軸Ｏの平面図で、絞り９４を示している。ここでこの絞り９４は、図１２または１３に示された図において、面Ａまたは面Ｂに配置されている。絞り９４は、２つの絞り部分９６および９８から形成されている。これらはそれぞれ、三角形の幾何学形状を有している。絞り部分９６および９８は、相互に次のように向かい合っている。すなわち、その三角形の形状の頂点が、図１４の平面図において、光軸Ｏ上に位置しているように向かい合っている。図１４に示された角度βは、アキシコン８０もしくは８６によって使用されている開口に対する尺度である。

図１５は、択一的な実施形態において、間隙絞り１００を示している。このような間隙絞りは、２つの長方形の絞り部分１０２と１０４から形成されている。２つの絞り部分１０２および１０４は、所定の間隔で、相互に対称に、光軸Ｏに対して配置されている。これによって、中空空間が形成され、この中空空間内でベッセルビームが伝播する。角度βは同様に、アキシコン８０もしくは８６によって使用される開口を表している。間隙絞り１００は、図１２および図１３に示されている装置において、それぞれ面Ｂに配置されている。間隙絞り１００によって、カッティングされたベッセルビームは、リング状の光分布によって生成される。

図１６は、別の択一的な実施形態において、絞り１０６を示している。これは、ワンピースの、長方形の絞り部分から形成されており、この絞り部分は、光軸Ｏ上に配置されている。これによって、絞り１０６は、ベッセルビームによって形成された光分布の軸線に近い部分を遮断する。これに相応に、カッティングされたベッセルビームは、光分布の軸線に遠い部分によって生成され、これは図１６において、絞り１０６の上方および下方を通過する。これによって、カッティングされたベッセルビームが、再び、リング状の光分布の周辺に生じる。

絞り１０６は、図１２および１３に示された装置において、それぞれ、面Ｂ内に配置されている。角度βは同様に、アキシコン８０もしくは８６によって使用される開口を示している。

図１７は、ビーム源１０８を示している。これはたとえば、図５および図６に示されているライトシート顕微鏡１０ｃにおいて、ビーム源１４ｃとして、または図７および図８に示されているライトシート顕微鏡１０ｄにおいて、ビーム源１４ｄとして使用され得る。

図１７に示されているビーム源１０８は、照明ビーム１６を、マシュービームの形態で生成するように構成されている。このために、ビーム源１０８は、ビーム成形光学系１１０を有しており、これは、たとえば、図１１に示されているビーム源７６において使用されているビーム成形光学系７８と、次の点によって異なっている。すなわち、２つのレンズ１１０および１１２から形成されているビーム拡張器が、アナモルフィックに形成されている、すなわち、光軸に対して垂直に位置する２つの軸線に沿って異なる拡大を有しているという点によって異なっている。これに従って、アナモルフィックビーム拡張器から生じる照明ビーム１６は、楕円形のガウスビームの形態で、アキシコン８０に入射する。このような楕円形のガウスビームは、アキシコン８０によって、マシュービームに形成される。これは次に、既に説明されたように、ライトシート生成のために使用される。

図１８は、別のビーム源１１４を示しており、これは、照明ビーム１６の被写体深度領域を試料内で移動させるように構成されている。その限りでは、図１８に示された実施形態は、図７に示された解決策に対する選択肢を示す。ここでは、照明ビーム１６の被写体深度領域の移動が、照明対物レンズ５０を用いて行われる。すなわちここでは、被写体深度領域の移動が、ビーム源の外側に設けられているコンポーネントを介して行われ、図１８に示された実施形態では、このような技術的な機能は、ビーム源１１４自体によって実現される。

ビーム源１１４は、既に説明されたコンポーネント、たとえば、レーザー光源５２、ファイバー結合部５４、ｙスキャンミラー７２およびスキャンレンズ７４の他に、ビーム成形光学系１１６ならびに、３つのレンズ１１８、１２０および１２２から形成されたレンズ装置を含んでいる。このレンズ装置は、ビーム成形光学系１１６の後方に配置されている。ビーム成形光学系１１６として、選択的に、図９から図１７に例示的に示されている光学系が使用されてよい。すなわち、特に、ビーム成形光学系１１６は次のように構成されていてよい。すなわち、これが照明ビーム１６をベッセルビーム、カッティングされたベッセルビームまたはマシュービームに形成するように構成されていてよい。しかしビーム成形光学系１１６は、上述したビームの種類の生成に制限されない。特に、ビーム成形光学系１１６は、これが、従来のガウスビームを生成するように構成されていてもよい。

ビーム成形光学系１１４の後ろに配置されているレンズ装置は、次のように選択されている。すなわち、２つの外側のレンズ１１８および１２２が、光軸に沿って、自身の焦点距離の総計の間隔において位置付けされているように選択されている。これは次のことを意味している。すなわち、２つのレンズ１１８および１２２の間に、レンズ１１８からも、レンズ１２２からも、各レンズ１１８もしくは１２２の焦点距離と一致する間隔を有している面が位置することを意味している。これに従って共通の焦点面を形成するこのような面には、中央のレンズ１２０が配置されている。このレンズ１２０は、調整可能なレンズとして構成されており、すなわち、その光学的な作用が可変に制御可能な光学要素として構成されている。たとえば、調整可能なレンズ１２０は、エラストマーレンズとして実現され、その表面曲率は、外部の作動によって変更可能であり、したがって、レンズの焦点距離が制御可能である。調整可能なレンズ１２０の相応する駆動制御によって、このようにして、照明ビーム１６は、要望に応じて、収束または発散され、これは、被写体深度領域の相応する変化を生じさせる。

ビーム源１１４を用いて、照明ビーム１６の被写体深度領域は次のように制御される。すなわち、試料内で生成されたライトシートが、形状、延在および位置に関して変更されるように制御される。このようにして、照明ビームの被写体深度領域は、従来の装置において、通常、全体的な画像領域が照明されるように調整される。これは次のことを意味する。すなわち、被写体深度領域が、通常は、光軸に沿った画像の延在に相応することを意味する。これに対して、図１８に示されたビーム源１１４は次のように制御される。すなわち、照明ビーム１６がより強く焦点合わせされ、すなわち、より小さい被写体深度領域が選択され、これによって、結果として生じるライトシートが、自身のくびれ部分の領域においてより細くなり、他方で、くびれ部分から離れて、より強く発散され、すなわち、より太くなるように制御される。有利にはこの場合には、検出器側で、検出光だけが検出され、この検出光は、ライトシートのくびれ部分によって照明される試料ストリップから生じる。

図１９は、ビーム源１２４を示している。このビーム源は、照明ビーム１６の被写体深度領域の移動のための、図１８に示されている装置に対して変更された実施形態を示している。ビーム源１２４は、図１８において設けられた、調整可能なレンズ１２０の代わりに、光軸に対して垂直に移動可能なディスク１２８を含んでいる。これは、複数の、透過性を有するブロック１３０、１３２、１３４および１３６を含んでいる。透過性を有するブロック１３０から１３６は、光軸に沿って異なる厚さを有している。ディスク１２８は、相応する駆動部によって、光軸に対して垂直に移動可能であり、したがって選択的に、透過性を有するブロック１３０から１３６のうちの１つが、照明ビーム１６のビーム路内に入れられる。自身の異なる軸線方向の厚さの結果、透過性を有するブロック１３０から１３６は、照明ビーム１６の光路長に異なって影響を与える。光路長の変化する影響は、照明ビームの被写体深度領域、ひいては被写体深度領域に相当する、結果として生じるライトシートのくびれ部分を、試料内で移動させるために使用される。

図１９に示されたビーム源１２４では、２つのレンズ１１８と１２２は次のように相互に間隔が空けられている。すなわち、これらが近似的に、テレセントリック系を形成するように、相互に間隔が空けられている。正確にするために、２つのレンズ１１８、１２２の間隔は、レンズ１１８、１２２の焦点距離の総計よりも若干大きくなるように選択される。この間隔は、まさに、中間の厚さの、透過性を有するブロック、たとえばブロック１３４が、照明ビーム１６のビーム路内に位置し、コリメートされた形態で、レンズ１１８へ入射する照明ビーム６０が、同様にコリメートされてレンズ１２２から出射するように定められている。これに対して、２つの比較的厚いブロック１３０、１３２のうちの１つがビーム路内に存在している場合、照明ビーム１６は、レンズ１２２から出射する際に発散する。これに対して、比較的薄いブロック１３６が、ビーム路内に入れられる場合、照明ビームは、収束された光束として、レンズ１２２から出射する。

透過性を有するブロック１３０から１３６が設けられているディスク１２８は、照明ビーム１６が発散して、または収束しているがコリメートされていないビーム路の領域内に存在する。

図１９に示されている、照明ビーム１６の光路長に影響を与える実現形態は、単に例示的なものであると理解されたい。したがって、たとえば透過性を有するブロック１３０および１３６は、相応に修正された実現形態において、たとえば、光軸を中心に回転可能であるディスク上に配置されてもよく、このようにして、選択的に、ブロックの１つが、ビーム路内に入れられる。

図２０および図２１は、瞳の図を示している。これらは、ガウスビームの使用に対するベッセルビーム、カッティングされたベッセルビームおよびマシュービームの使用の利点を、明らかにしている。図２０および図２１に示されている例においては、各照明ビームが、ｘ軸線に沿ってずらされて、対物レンズ瞳３０２内に入射し、その後、対物レンズ瞳３０２の中央から外れた部分領域だけが、照明されることが想定されている。

ｘ方向におけるこのようなずれは、光軸に対する、結果として生じるライトシートの傾斜を特定する。

図２０および図２１には、種々のビームタイプに対して、それぞれ、対物レンズ瞳３０２の、照明開口３０４および検出開口３０６に割り当てられている領域が示されている。照明開口３０４によって規定された瞳領域は、別の照明瞳において、および検出開口３０６によって規定された瞳領域において、検出瞳として表されている。

図２０では、ベッセルビーム３００ａに対して、これが対物レンズ瞳３０２の縁部においてどのように、照明瞳および検出瞳が、ｘ方向における対物レンズ瞳３０２の延在を完全に利用するように位置付けされているかが示されている。矢印の長さは、最大の照明開口を示している。図２１には、カッティングされたベッセルビームもしくはマシュービーム３００ｂに対する同じ状況が示されている。ここで、図２１において、付加的に、ガウスビームに対する最大の照明開口３１０が、比較のために示されている。図２１に示された図から明らかであるように、カッティングされたベッセルビームまたはマシュービーム３００ｂは、比較的大きい照明開口の場合に、対物レンズ瞳３０２の縁部のより近くに位置付けされる。換言すれば、比較的大きい照明開口の場合に、照明瞳と検出瞳との重畳を回避することができる。このようにして、結果において、比較的大きい検出開口または比較的大きい照明開口が利用され得る。

ベッセルビームを用いた照明から、特にカッティングされたベッセルビームとマシュービームを用いた照明から、ガウスビームを用いた照明に対して生じる利点が、再度、図２２から図２５に示されている。ここで図２２および図２３は、相互に垂直に位置する２つの断面において、ガウスビームを用いた照明を示しており、図２４および図２５は相応する断面において、カッティングされたベッセルビームまたはマシュービームを用いた照明を示している。

図２２から図２５ではそれぞれ、対物レンズ１３８ならびに照明ビーム１４０の各横断面ならびに検出円錐１４２が示されている。照明ビーム１４０は図２２および図２３においてはガウスビームであり、図２４および図２５においては、カッティングされたベッセルビームまたはマシュービームである。

照明は有利には次のように選択される。すなわち、各照明ビーム１４０と検出円錐１４２との重畳が、図２２おいて、参照番号１４４が付けられた破線によって示されている、結像されるべき面を中心にしたできるだけ狭い領域に制限されているように選択される。特に図２２および図２５においては、照明ビーム１４０と検出円錐１４２との間の重畳が回避されるべき領域に、参照番号１４６が付けられている。

図２２から図２５をまとめて見ると分かるように、照明ビーム１４０と検出円錐１４２との間の上述した重畳は、カッティングされたベッセルビームまたはマシュービームの使用時には、ガウスビームの使用時に比べて格段に少ない。これによって、カッティングされたベッセルビームまたはマシュービームに対して、格段に多くの遊びが生じ、検出開口が高くなる。ここでは、検出開口ＮＡ_ｄｅｔ＝ｎα_ｄｅｔが特定され、この際に、検出円錐１４２の開口角度２α_ｄｅｔが、図を容易にするために、図２２においてのみ示されている。図２２ではさらに、角度２α_ｉｌｌが示されており、これは、照明開口に対する尺度を表している。照明および検出の開口は、対物レンズの開放角度αによって制限されている。これは、ＮＡ＝ｎｓｉｎαを、２α＝２α_ｉｌｌ＋２α_ｄｅｔにわたって有している。

以降では、実施形態が説明されており、この実施形態は次のことを目指している。すなわち、試料への照明ビームの侵入深度が増すとともに、散乱および吸収によって生じる、検出光の損失を補償することを目指している。照明された面が、検出対物レンズの焦点面に一致する従来の顕微鏡では、照明光のこのような損失が、画像領域にわたって、比較的僅かである。これに対して、ＯＰＭまたはＳＣＡＰＥ等の、ライトシート顕微鏡方法では、個々の画像に対して、検出光が、試料内の極めて異なる深さから検出される。このような場合には、光侵入深度が増すとともに強くなる、散乱および吸収の結果として生じる、照明光の損失を補償することが必要である。

図２６から図２９において、例示的に、図４、図１８および図１９に示された装置を用いて可能であるように、照明ビーム１６の被写体深度領域の移動によって、散乱および／または吸収が原因で生じる、光侵入深度に関連する照明ビーム１６の減衰が、どのように補償されるのかが示されている。図２６は、対物レンズ１４８を示しており、これを通じて、試料が、照明ビーム１６によって照明される。照明ビーム１６は、被写体深度領域１５０を有しており、照明軸線ｚに沿った、この被写体深度領域の延在は、図２６において、双方向矢印によって示されている。被写体深度領域１５０内には、図２６において参照番号１５２が付けられている、対物レンズ１４８の焦点面が存在している。

図２７では、一方では、どのようにして、照明ビーム１６のより強い焦点合わせによって、その被写体深度領域１５０が、照明軸線ｚに沿って短くされるのかを示している。これに相応して、半径方向ｒにおいて、すなわち照明軸線ｚに対して垂直な方向において測定された、照明ビーム１６の幅も低減する。この結果、より短い被写体深度を伴う、格段に薄いライトシートが生じる。

図２７は、他方で、ライトシートが試料を照明する侵入深度を変えるために、被写体深度領域１５０が、照明軸線ｚに沿って、どのように移動されるのかが示されている。その内部で、被写体深度領域１５０が、照明軸線ｚに沿って移動される領域は、図２７において、参照番号１５１が付けられた双方向矢印１５１によって示されている。

図２８には、被写体深度領域１５０の軸線方向の移動がどのように減衰補償に使用されるのかの例が示されている。ここでは、図２８において、曲線１５４は、時間ｔに関連する照明ビームの強度を示している。その下に位置する、参照番号１５６が付けられている曲線は、これに対して、照明軸線ｚに沿った被写体深度領域１５０の位置を、時間ｔに関連して示している。ここで、曲線１５６の上昇は、被写体深度領域１５０の移動と、図２７において、左から右へ、一致している。

図２８における曲線１５６の推移が示しているように、被写体深度領域１５０はこの例では、まずは、所期位置から、一定の速度で、照明軸線ｚに沿って、対物レンズ１４８から離れて、最終位置へ動き、次にこの最終位置から、所期位置へ戻り、次に再び、所期位置から、同じ一定の速度で、最終位置へと動く。ここで図２７において、被写体深度領域１５０が、所期位置において、実線で示されており、最終位置において、破線で示されている。

曲線１５４に従って、照明ビーム１６の強度が上昇し、被写体深度領域１５０は、自身の初期位置から、照明軸線ｚに沿って、自身の最終位置へ動かされる。図２８に示された例では、強度は指数関数的に上昇する。このような指数関数的な強度上昇は、いわゆるランベルト・ベールの法則を反映している。この法則は、吸収する物質および／または散乱する物質を有する媒体を通る際の電磁ビームの強度の減衰を、このような物質の濃度と侵入深度に関連して表している。しかし、簡易的な実現形態では、照明ビームの線形の強度上昇も設定されていてよい。

ｚに沿った上昇もしくは一般的に変調は、特に繰り返し、適応するように、次のように対物レンズに合わせられる。すなわち、信号強度が、画像において、ｚに沿って均一であるように合わせられる。ここで、たとえば少なくとも１つの（生）画像が評価され、これによって、ビームプロファイルは、適切な方法で整合され、最終的な、最適化された画像が生成され、ユーザーに対して格納される。

図２８および図２９において示されている強度推移を調整するために、照明ビーム１６を放射するレーザー光源が相応に時間に関連して制御される。

図２９は、減衰補償のための、変更された実施例を示している。図２９における曲線１５４が示しているように、この実施例では、照明ビーム１６の強度が、被写体深度領域１５０の全体的な移動運動を介して、一定に保持される。これに対して、照明ビーム１６が、照明軸線ｚに沿って動かされる速度が変化する。具体的にはここで、移動速度は、侵入深度が増すとともに低減する。これは、照明ビーム１６の滞在時間が、侵入深度とともに増すことを意味している。これによって、より深く位置する試料領域が、より強く照明される。

図３０では、照明ビーム１６の半径方向プロファイルの影響によって、どのように、その強度が、照明軸線ｚに沿って、吸収補償のために制御されるのかが明らかにされている。ここでは照明ビーム１６として、有利には、ベッセルビーム、カッティングされたベッセルビームまたはマシュービームが使用される。所望のビーム形状を生成するために、たとえば、凸状のアキシコンが、面１５８に位置付けされ得る。図３０が示しているように、このような面１５８の後方には、レンズ１６０ならびに対物レンズ１６２が配置されている。レンズ１６０と対物レンズ１６２との間に、任意の数のテレセントリック光学系と、ビーム偏向手段が配置されている。

照明ビーム１６の半径方向プロファイルに影響を与えるために、適切な手段、たとえば異なる透過度のリングセグメントが設けられているマスクによって、照明ビーム１６の透過度が、照明軸線ｚからの半径方向の間隔ｒに関連して、次のように変更される。すなわち、照明ビーム１６の強度が、照明軸線ｚに沿って、所望のように調整されるように変更される。たとえば、照明軸線ｚにおいて位置ｚ２が割り当てられている半径方向の間隔ρ１の場合に、照明軸線において位置ｚ１が割り当てられているより大きい半径方向の間隔ρ２の場合よりも大きいように、透過度が選択される場合には、軸線位置ｚ２における照明ビーム１６の強度は、位置ｚ１における強度よりも高くされ得る。ここで、屈折作用が考慮されるべきであり、ならびにリング幅ｄρを有するリングが、面Ａ＝２πρｄρを有しているという事実が考慮されるべきである。すなわちこれは、ρとともに増大する。すなわち、光軸上での照明ビームの均一な強度のために、リングセグメントの透過度は、外側へ向かって、低減しなければならない。散乱および／または吸収によって発生する光損失を考慮して、このようにして、適切な透過度制御マスクを用いて、照明ビームの半径方向プロファイルが次のように調整される。すなわち、照明ビーム１６の軸線方向の強度が、照明軸線ｚに沿って、ちょうど、侵入深度とともに増大する光損失が補償されるように強く増大するように調整される。

図３０に示された、ベッセルビーム、カッティングされたベッセルビームまたはマシュービームを用いた照明は、特に、共焦点ライン検出との関係において、実利的に適用可能である。

図３１は、ビーム源１６８を示しており、これによって、図３０に示されている照明原理が例示的に実現されている。図３１に示されたビーム源１６８は、レーザー光源５２、ファイバー結合部５４および２つのレンズ５８、６０から形成されているビーム拡張器の他に、図３０にも示されているレンズ１６０ならびに空間光変調器１７０を有しており、これによって、図３０を参照して上述したアキシコンは、半径方向ビームプロファイルを制御するマスクとともに実現されている。空間光変調器１７０の代わりに、フリーフォームレンズも使用可能であり、その曲率半径は、半径方向の間隔ｒとともに変化し、これによって照明ビーム１６の軸線方向の強度が、所望のように制御される。

図３２は、ビーム源１７２を示しており、これは、図３１に示された装置に対して変更された、図３０に示された照明原理を実現するための実施形態を表している。ビーム源１７２は、２つの空間光変調器１７４と１７６を有しており、このうちの第１の光変調器１７４は、第２の光変調器１７６上に、軸線方向で上昇するビームプロファイルに対する適切な照明を生成するために用いられる。ここで、第１の光変調器１７４は、照明ビームの位相を次のように変調する。すなわち、照明ビーム１６の振幅が、第２の空間光変調器上で、所望のように、照明軸線からの半径方向の間隔に関連して変化するように変調する。図３０を参照して、レンズ１６０と対物レンズ１６２との間に位置している第２の空間光変調器１７６は、同様に、たとえばアキシコンによって形成されている。第２の光変調器１７６から始まり、照明ビーム１６はたとえば、スキャンミラーを介して、照明対物レンズへと伝播する。

図３３は、ビーム源１７８を示しており、これは、図３２に示された実施形態に対して、次のことによって変更されている。すなわち、２つの別個の光変調器１７４、１７６の代わりに、唯一の空間光変調器１７８が設けられているということによって変更されている。この空間光変調器は、２つの変調器領域１８０および１８２を有しており、このうちの第１の変調器区間１８０が第１の光変調器１７４の機能を担い、第２の変調器区間１８２が第２の光変調器１７６の機能を担っている。

照明ビーム１６はまずは、第１の変調器区間１８０に入射し、レンズ１６０を通り、ミラー１８４で第２の変調器区間の方向に反射される。第２の変調器区間１８２から始まり、照明ビーム１６は、別のミラー１８６へと伝搬する。これは、照明ビーム１６を、たとえばスキャンミラーを介して、照明対物レンズの方向に反射する。

図３４および図３５は、ローリングシャッター機能を有する面状検出器１８８が使用される実施形態を示している。ここで図３４は、ｘ－ｙ断面における装置を示しており、図３５は、ｙ－ｚ断面における装置を示している。図３４および図３５に示された実施形態では、照明と検出のために、別個の対物レンズが設けられている。すなわち、照明ビーム１６を試料へ焦点合わせする照明対物レンズ１９０と、自身の光軸によって、照明対物レンズ１９０の光軸に対して垂直に配置されている検出対物レンズ１９２である。図３４および図３５に示されている装置はさらに、検出対物レンズ１９２の後ろに配置されている正立ユニット１９４ならびに面状検出器１８８の前に配置されているチューブレンズ１９６を有している。

図３４および図３５に示されている実施形態では、照明ビーム１６は、照明軸線ｚに対して横向きに、ｘ軸線に沿って動かされる。これに相応して、試料は、ｚ軸線の方向に延在するストリップに沿って照明される。このストリップは、逆向きに、ｘ軸線に沿って動かされる。この結果、検出光３４は面状検出器１８８上で、相応するストリップを生成する。これは、ｚ軸線の方向において延在し、ｘ軸線に沿って、面状検出器１８８上で動かされる。

面状検出器１８８は、ローリングシャッター機能を有している。すなわち、面状検出器は、次のように構成されている。すなわち、所定の時点でそれぞれ、ｚ軸線の方向において延在している、面状検出器１８８のストリップ状の領域１９８だけがアクティブにされ、これによって検出作用を有するように構成されている。面状検出器１８８は次のように駆動制御される。すなわち、アクティブにされた自身のストリップ状の領域１９８が、面状検出器１８８上に入射する検出光ストリップと同期して、ｘ軸線に沿って動かされるように駆動制御される。

面状検出器１８８は次のように駆動制御されてよい。すなわち、自身の、ローリングシャッター機能を実現するストリップ状の領域１９８が、ｘ軸線の方向において、１つのピクセルの幅だけを有するように駆動制御されてよい。このような場合には、面状検出器１８８は、（ｘ軸線の方向に動かされる）ライン検出器と同様に作用する。しかし、検出光のより良好な収量を可能にするために、面状検出器１８８のストリップ状の領域１９８が、ｘ軸線の方向において、複数のピクセルの幅を有していてもよい。いずれにせよ、面状検出器１８８のストリップ状の領域１９８は、有利には、スリット絞りの様式で利用され、これによって、ライン毎の検出が実現される。幅、すなわち同時にアクティブにされるラインの数は、理想的には自由に調整可能である。

特に有利な構成では、図３４および図３５に示されている装置で使用されている照明ビームは、ベッセルビーム、カッティングされたベッセルビームまたはマシュービームである。上述したビーム源によって生成可能なこのようなビームによって、照明軸線ｚの隣に位置する領域はいわば、照明軸線ｚに、たとえば、図３０から図３３に示されている解決方法に従って光を供給するために利用され得る。これはガウスビームによっては不可能である。後者は、高い被写体深度に対して必要な幅の狭い角度スペクトルを有している。これに対して、たとえば、ベッセルビームは、比較的高い半径方向のコンポーネントでは、角度スペクトルにおいて寄与する。面状検出器１８８のストリップ状の領域は、このような場合には、たとえば、図３０に示されている線１６４と一致する。すなわちこれは、センサに対して共役の面において、ｘ軸線に沿った位置に位置する。これは、領域１９８上に結像される。

図３６および図３７では、変更された実施形態が、ｘ－ｙ断面もしくはｙ－ｚ断面において示されており、ここでは同様に、ローリングシャッター機能を有する面状検出器２００が使用されている。図３４および図３５に示された実施形態とは異なり、ここでは、照明ビーム１６は、高い開口数で、かつ低い被写体深度で生成される。その限りでは、このような実施形態に対して、図２６から図２９に基づいて例示的に説明されたような照明の様式が使用され得る。

図３６および図３７に示された装置では、照明ビーム１６は次のように焦点合わせされる。すなわちこれが、照明軸線ｚの方向において比較的短くなるように焦点合わせされる。このような場合には、照明ビーム１６のくびれ部分は、検出軸線であるｙ軸線の方向において、比較的薄い。

照明ビーム１６によって照明された試料領域は、ｘ方向において長く延在するストリップの形態において、面状検出器２００上に結像される。照明ビーム１６がｚ軸線に沿って動かされることによって、検出光ストリップは、面状検出器２００上で、逆向きに、ｚ軸線に沿って移動する。これに相応して、面状検出器２００は次のように駆動制御される。すなわち、ｘ軸線に沿って延在し、ｚ軸線の方向において、１つまたは複数のピクセルの幅を有する、面状検出器２００のストリップ状の領域２０２だけが所定の時点でアクティブにされ、ひいては検出作用を有するように駆動制御される。面状検出器２００のこのようなストリップ状の領域２０２は、ローリングシャッター機能の実現のために、照明ビーム１６の運動と同期して、ｚ軸線に沿って移動される。

上述した全ての実施例は、単に、本発明のビーム変調手段の例示的な説明に使用されている。ビーム変調のための上述した手段が、このような手段の説明において、それぞれ具体的に参照された実施形態に制限されないということに特に留意されたい。したがって各手段は、別の実施形態と組み合わされてもよい。さらに、種々のビーム変調手段自体が、必要に応じて、相互に組み合わされてよい。したがってたとえば、照明ビームの被写体深度領域の移動によって実現されているビーム変調を、上述したビーム成形光学系による、ビーム横断面の制御によって得られるビーム変調と組み合わせることが可能である。

Claims (16)

1. ライトシート顕微鏡（１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，１０ｄ）であって、
   照明軸線（ｚ）に沿って伝播する照明ビーム（１６）を、対物レンズ（２８）を介して試料（３０）上に配向するように構成されている、ビーム源（１４ａ，１４ｂ，１４ｃ，１４ｄ）を備える照明ユニット（１２）と、
   前記照明ビーム（１６）から、前記試料（３０）を部分領域において照明する、ライトシート様式の照明光分布を生成するように構成されているライトシート生成手段（２０ｂ，６２，７２）と、
   前記照明光分布で照明された、前記試料（３０）の部分領域から生じる検出光（３４）を、前記対物レンズ（２８）を介して検出するように構成されている、検出器（４４ａ，４４ｂ，４４ｃ）を備える検出ユニット（３９）と、
   を含んでいるライトシート顕微鏡において、
   前記対物レンズ（２８）は、照明対物レンズとしても、検出対物レンズとしても機能し、
   前記照明ビーム（１６）は、前記対物レンズ（２８）の入射瞳の中心から外れた部分領域だけを照明し、
   前記照明ユニット（１２）は、ビーム変調手段（５０，５２，１２０，１２８；５６，７５，７８，１１０，１７０，１７４，１７６）を有しており、前記ビーム変調手段は、照明強度および／または露光持続時間の変更によって、前記照明ビーム（１６）を前記照明軸線（ｚ）に沿って変調するように構成され、前記照明光分布によって照明された、前記試料（３０）の部分領域の露光の前記照明軸線（ｚ）に沿った変化は、検出された画像領域にわたりできるだけ一定の輝度が生じるように選択される、
   ことを特徴とするライトシート顕微鏡（１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，１０ｄ）。
2. 前記ビーム変調手段（５０，５２，１２０，１２８）は、前記照明ビーム（１６）の被写体深度領域（１５０）を、前記照明軸線（ｚ）に沿って移動させるように構成されている、
   請求項１記載のライトシート顕微鏡（１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，１０ｄ）。
3. 前記ビーム変調手段は、前記照明軸線（ｚ）に沿って移動可能な照明対物レンズ（５０）を有している、
   請求項２記載のライトシート顕微鏡（１０ｄ）。
4. 前記ビーム変調手段は、前記ビーム源（１４ａ，１４ｂ，１４ｃ，１４ｄ）に含まれている、前記照明ビーム（１６）の被写体深度領域（１５０）を移動させる調整可能なレンズ（１２０）を有している、
   請求項２記載のライトシート顕微鏡（１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，１０ｄ）。
5. 前記ビーム変調手段は、前記ビーム源（１４ａ，１４ｂ，１４ｃ，１４ｄ）に含まれている、前記照明ビーム（１６）の光路長に影響を与える光学要素（１２８）を有している、
   請求項２記載のライトシート顕微鏡（１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，１０ｄ）。
6. 前記光学要素（１２８）は、複数の、選択的に、前記照明ビーム（１６）のビーム路内に入れられる、透過性を有するブロック（１３０，１３２，１３４，１３６）を含んでおり、前記ブロック（１３０，１３２，１３４，１３６）は、前記照明軸線（ｚ）に沿って、異なる厚さを有している、
   請求項５記載のライトシート顕微鏡（１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，１０ｄ）。
7. 前記ビーム変調手段（５０，５２，１２０，１２８）は、前記照明ビーム（１６）の強度を、前記被写体深度領域（１５０）の位置に関連して、前記照明軸線（ｚ）に沿って変調するように構成されている、
   請求項２から６までのいずれか１項記載のライトシート顕微鏡（１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，１０ｄ）。
8. 前記ビーム変調手段（５０，５２，１２０，１２８）は、前記照明ビーム（１６）の強度が、前記試料（３０）への前記被写体深度領域（１５０）の増大する侵入深度に伴って増大するように構成されている、
   請求項７記載のライトシート顕微鏡（１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，１０ｄ）。
9. 前記ビーム変調手段（５０，５２，１２０，１２８）は、前記照明ビーム（１６）の被写体深度領域（１５０）の移動速度を、その位置に関連して、前記照明軸線（ｚ）に沿って変えるように構成されている、
   請求項２から８までのいずれか１項記載のライトシート顕微鏡（１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，１０ｄ）。
10. 前記ビーム変調手段（５０，５２，１２０，１２８）は、前記照明ビーム（１６）の被写体深度領域の移動速度を、前記試料（３０）への侵入深度が増すとともに低減させるように構成されている、
    請求項９記載のライトシート顕微鏡（１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，１０ｄ）。
11. 前記ビーム変調手段は、ビーム成形光学系（５６，７５，７８，１１０，１７０，１７４，１７６）として形成されており、前記ビーム成形光学系５６，７５，７８，１１０，１７０，１７４，１７６）は、前記照明軸線（ｚ）に沿った前記照明ビーム（１６）の変調のために、前記照明ビームの半径方向の強度プロファイルに、前記照明軸線（ｚ）に対して垂直な少なくとも１つの方向において影響を与える、
    請求項１から１０までのいずれか１項記載のライトシート顕微鏡（１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，１０ｄ）。
12. 前記ビーム成形光学系（５６，７５，７８，１１０，１７０，１７４，１７６）は、前記照明ビーム（１６）の透過度を、前記照明軸線（ｚ）からの半径方向の間隔に関連して、前記照明ビーム（１６）の強度が、前記照明軸線（ｚ）に沿って増大するように調整するように構成されている、
    請求項１１記載のライトシート顕微鏡（１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，１０ｄ）。
13. 前記ビーム成形光学系は、２つの位相変調要素（１７４，１７６）を含んでおり、このうちの第１の要素（１７４）は、前記照明ビーム（１６）の位相を、前記照明ビーム（１６）が第２の要素（１７６）で、所定の、有利には半径方向に上昇するプロファイルを備えた振幅を有するように調整する、
    請求項１１または１２記載のライトシート顕微鏡（１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，１０ｄ）。
14. 前記２つの位相変調要素は、一体成形された構成要素（１７８）に形成されており、第１の位相変調要素で反射された照明ビーム（１６）が、ミラー（１８４）を介して、第２の位相変調要素に戻される、
    請求項１３記載のライトシート顕微鏡（１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，１０ｄ）。
15. 試料（３０）の顕微鏡結像方法であって、
    照明軸線（ｚ）に沿って伝播する照明ビーム（１６）を、対物レンズ（２８）を介して前記試料（３０）上に配向し、
    前記照明ビーム（１６）から、前記試料（３０）を部分領域において照明する、ライトシート様式の照明光分布を生成し、
    前記照明光分布で照明された、前記試料（３０）の部分領域から生じる検出光（３４）を、対物レンズ（２８）を介して検出する方法において、
    前記照明光分布によって照明された、前記試料（３０）の部分領域の露光が前記照明軸線（ｚ）に沿って変化し、検出された画像領域にわたりできるだけ一定の輝度が生じるように、照明強度および／または露光持続時間の変更によって、前記照明ビーム（１６）は、前記照明軸線（ｚ）に沿って変調され、
    前記対物レンズ（２８）は、照明対物レンズとしても、検出対物レンズとしても機能し、
    前記照明ビーム（１６）は、前記対物レンズ（２８）の入射瞳の中心から外れた部分領域だけを照明する、
    ことを特徴とする試料（３０）の顕微鏡結像方法。
16. 前記照明光分布は、前記試料（３０）の非線形の蛍光励起に使用される、
    請求項１５記載の方法。

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