JP2015135463A - 顕微鏡装置、及び、顕微鏡システム - Google Patents

Abstract

【課題】高いＺ分解能を有する３次元情報を高速に生成可能な技術を提供する。【解決手段】顕微鏡装置１０は、標本Ｓをシート状に照明する照明光学系２とステレオ撮像手段を備える。ステレオ撮像手段は、三角測量法に基づくＺ方向の分解能がシート状の照明ＬＬの全体のＺ方向の厚さＴよりも小さくなるような異なる複数の方向から、標本Ｓを撮像する。【選択図】図７

Description

本発明は、顕微鏡装置及び顕微鏡システムに関し、特に、側方からシート状に照明した標本を撮像する顕微鏡装置及び顕微鏡システムに関する。

蛍光顕微鏡の分野では、標本の３次元情報を生成するための手段として共焦点顕微鏡が良く知られているが、近年では、標本を側方からシート状に照明するシート照明を採用した顕微鏡（以降、光シート顕微鏡と記す）も知られている。

光シート顕微鏡には、例えば、ＳＰＩＭ（Selective Plane Illumination Microscope）やＤＳＬＭ（Digital Scanned Light-sheet Microscope）などがある。特許文献１には、上述した光シート顕微鏡のうち、シリンドリカルレンズによってシート状の照明光を形成するＳＰＩＭが開示されている。

光シート顕微鏡は、共焦点蛍光顕微鏡に比べて、褪色や光毒性が少ないという特徴がある。また、共焦点蛍光顕微鏡は、図１及び図２に示すように、観察のＮＡ（Numerical Aperture）が小さくなると、横分解能（ＸＹ分解能）に比べて縦分解能（Ｚ分解能）が著しく劣化する。このため、特にマクロ観察では、十分に高い縦分解能が得られないことがある。これに対して、光シート顕微鏡では、シート状の照明の厚さ（つまり、Ｚ方向の幅）によって縦分解能が決定されるため、マクロ観察でも、十分に高い縦分解能を得ることができる。

特表２００６−５０９２４６号公報

光シート顕微鏡は、シート状の照明の厚さを薄くすることで、Ｚ分解能を向上させることができる。しかしながら、シート状の照明の厚さを薄くするほど、Ｚスタック画像の枚数が増加することになるため、３次元情報の生成に時間がかかってしまう。

以上のような実情を踏まえ、本発明は、高いＺ分解能を有する３次元情報を高速に生成可能な技術を提供することを課題とする。

本発明の一態様は、標本をシート状に照明する照明光学系と、三角測量法に基づく分解能であって前記照明光学系によって前記標本に形成される一又は複数のシート状の照明の方向と直交するＺ方向の分解能が前記一又は複数のシート状の照明全体の前記Ｚ方向の厚さよりも小さくなるような異なる複数の方向から、前記標本を撮像するステレオ撮像手段と、を備える顕微鏡装置を提供する。

本発明の別の態様は、上述した態様の顕微鏡装置と、前記顕微鏡装置のステレオ撮像手段により生成された前記標本の複数の画像に基づいて、前記標本の三次元情報を生成する演算装置と、を備える顕微鏡システムを提供する。

本発明によれば、高いＺ分解能を有する３次元情報を高速に生成可能な技術を提供することができる。

共焦点顕微鏡のＮＡに対する横分解能と縦分解能の変化を示した図である。 共焦点顕微鏡のＮＡに対する縦分解能／横分解能の変化を示した図である。 検出光学系の焦点深度と単一のシート照明のＺ方向の厚さと三角測量法に基づくＺ方向の分解能との関係を説明するための図である。 検出光学系の焦点深度、複数のシート照明全体のＺ方向の厚さ、複数のシート照明の各々のＺ方向の厚さ、複数のシート状の照明間の距離、三角測量法に基づくＺ方向の分解能の関係を説明するための図である。 三角測量法に基づくＺ方向の分解能の算出方法について説明するための図である。 所定の条件における顕微鏡装置のＸ方向の分解能と三角測量法に基づくＺ方向の分解能との関係を示した図である。 実施例１に係る顕微鏡システムの構成を例示した図である。 実施例１に係る照明光学系の構成を例示した図である。 実施例１に係る照明光学系の構成の変形例を示した図である。 実施例１に係る遮蔽手段の構成を例示した図である。 実施例１に係る遮蔽手段の構成の変形例を示した図である。 実施例２に係る顕微鏡システムの構成を例示した図である。 実施例３に係る顕微鏡システムの構成を例示した図である。 実施例４に係る照明手段の構成を例示した図である。 実施例４に係る照明手段の構成の第１の変形例を例示した図である。 実施例４に係る照明手段の構成の第２の変形例を例示した図である。 実施例４に係る照明手段の構成の第３の変形例を例示した図である。 実施例４に係る照明手段の構成の第４の変形例を例示した図である。 実施例４に係る照明位置移動手段による照明の移動の一例を示した図である。 ２色の光で複数のシート状の照明を形成した例を示す図である。 ２色の光で複数のシート状の照明を形成した例を示す図であり、ステレオ撮像手段の位置を図２０Ａに対して変更した例を示す図である。

各実施例について説明する前に、各実施例に係る発明に共通する本願発明の特徴について概説する。各実施例に係る発明は、標本を側方からシート状に照明するシート照明の技術と、視差のある複数の画像から高さ情報を計測するステレオ計測の技術を組み合わせることにより、高いＺ分解能を有する３次元情報を高速に生成可能な顕微鏡システム、及び、それに供する顕微鏡装置に関する発明である。なお、各実施例に係る発明は、主に蛍光観察に適用される。

各実施例では、照明光学系が標本をシート状に照明する。このとき、実施例１から実施例３では、単一のシート状の照明のＺ方向（照明の方向と直交する方向）の厚さＴは、図３に示すように、検出光学系の焦点深度ｆＤ以下に設定される。また、実施例４から実施例６では、複数のシート状の照明全体のＺ方向の厚さＴは、図４に示すように、検出光学系の焦点深度ｆＤ以下に設定される。これにより、焦点深度ｆＤの範囲内からのみ蛍光が生じることになるため、焦点深度ｆＤを超えた範囲からの不要な光が検出されることを回避することができる。このため、各実施例に係る発明によれば、Ｓ／Ｎ比の高い蛍光画像を取得することができる。なお、複数のシート状の照明全体のＺ方向の厚さとは、図４に示されるように、Ｚ方向に整列した複数のシート状の照明のうち最も上部に位置するシート状の照明と最も下部に位置するシート状の照明の間の距離のことである。

さらに、各実施例では、検出光学系を備えたステレオ撮像手段が異なる複数の方向から標本を撮像する。このとき、複数の方向は、図３及び図４に示すように、三角測量法に基づくＺ方向の分解能ΔＺがシート状の照明全体のＺ方向の厚さＴよりも小さくなる（つまり、分解能が高くなる）ような方向に設定される。これにより、各実施例に係る発明によれば、複数の方向から撮像した標本の画像からパターンマッチングによりシート照明全体の厚さＴよりも高いＺ方向の分解能ΔＺを有する標本の三次元情報を生成することができる。

実施例１から実施例３は、ステレオ計測技術を用いることで高いＺ分解能を得ることができることから、高いＺ分解能を得るためにシート照明の厚さを過度に薄くする必要がないことに着目したものである。これを踏まえ、実施例１から実施例３では、従来のシート照明に比べてその厚さを厚くした単一のシート状の照明を標本に形成する例が示されている。これらの実施例では、シート照明の厚さは、焦点深度以下であれば焦点深度程度の厚さにまで厚くすることができる。このため、従来に比べてシート照明の回数（つまり、Ｚスタック回数）を大幅に減らすことが可能となる。これにより、実施例１から実施例３に係る発明によれば、撮像回数を減らすことができるため、３次元情報を高速に生成することができる。

従来のシート照明は、その主要な目的が高いＺ分解能を得ることにあるため、高いＺ分解能を得るために可能な限り薄く形成されるのが通常である。一方、実施例１から実施例３に係る発明のシート照明の主要な目的は、一般に蛍光顕微鏡でステレオ計測を行うと焦点深度外からの光が背景光となってＳ／Ｎ比を劣化させてしまうことを鑑みて、焦点深度を超えた範囲からの不要な蛍光の発生を防止することにある。従って、実施例１から実施例３に係る発明のシート照明では、シートの厚さは検出光学系の焦点深度以下であれば任意の厚さにすることができる。このため、Ｚスタック回数を減らすために、検出光学系の焦点深度以下の範囲において敢えてシート照明の厚さを厚くして焦点深度程度にする。なお、シート照明の厚さは、より具体的には、焦点深度の１／２以上の厚さにすることが望ましい。このように、実施例１から実施例３に係る発明のシート照明は、その目的が従来のシート照明とは大きく異なることに起因して、その照明の厚さも従来のシート照明の厚さとは大きく異なっている。

次に、図５を参照しながら、シート照明全体の厚さＴよりも高いＺ方向の分解能ΔＺを得るための条件について説明する。図５は、三角測量法に基づくＺ方向の分解能ΔＺの算出方法について説明するための図である。面ＴＰは標本中の観察対象ｐが存在する面を示し、面ＦＰは撮像面（受光面）と共役な検出光学系の焦点面を示している。点ａ_１と点ａ_２は、それぞれ異なる方向から標本を撮像する際の検出光学系の位置を示している。検出光学系が点ａ_１に位置するとき観察対象ｐは位置ｂ_１に位置するように撮像され、検出光学系が点ａ_２に位置するとき観察対象ｐは位置ｂ_２に位置するように撮像される。

図５では、三角形ｐｂ_２ｂ_３と三角形ｂ_２ａ_２ｃは相似であり、三角形ｐｂ_１ｂ_３と三角形ｂ_１ａ_１ｏは相似であるので、三角形ｐｂ_２ｂ_１と斜線部分を組み合わせた三角形（三角形ｂ_２ａ_２ｃと三角形ｂ_１ａ_１ｏの組み合わせ）も相似である。従って、三角測量法に基づくＺ方向の分解能ΔＺと顕微鏡装置のＸ方向の分解能ΔＸの間には、基線長Ｄ、検出光学系の焦点距離ｆを用いて以下の関係が成り立つ。なお、顕微鏡装置のＸ方向の分解能ΔＸは、検出光学系のＸ方向の分解能と撮像装置の画素ピッチによって定まる分解能である。
ΔＺ：ΔＸ＝ｆ：（Ｄ−ΔＸ）

このため、Ｚ方向の分解能ΔＺは、下式（１）で示される。
ΔＺ＝ΔＸ×ｆ／（Ｄ−ΔＸ） ・・・（１）

従って、シート照明全体の厚さＴよりも高いＺ方向の分解能ΔＺ（＜Ｔ）を得るためには、下式を満たすように設定すればよい。
Ｔ＞ΔＸ×ｆ／（Ｄ−ΔＸ） ・・・（２）

実施例１から実施例３に係る発明のＺ方向の分解能と共焦点蛍光顕微鏡でＺ方向の分解能を比較する。図６は、所定の条件における顕微鏡装置のＸ方向の分解能と三角測量法に基づくＺ方向の分解能との関係を示した図であり、ここで、所定の条件は、検出光学系の焦点距離ｆ＝１００ｍｍ、基線長Ｄ＝２５ｍｍである。

この条件では、図６に示すように、Ｘ方向の分解能が５μｍの顕微鏡装置であれば、三角測量法により２０μｍ程度のＺ方向の分解能を得ることができる。これに対して、共焦点蛍光顕微鏡は、一般的な励起波長及び蛍光波長において（励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ）、Ｘ方向の分解能が３．７μｍ程度であれば、２７１μｍ程度のＺ方向の分解能を有する。このことから、実施例１から実施例３に係る発明によれば、Ｘ方向の分解能が同程度の共焦点顕微鏡装置に比べて、１桁以上高いＺ方向の分解能を得ることができることがわかる。

実施例４から実施例６は、ステレオ計測技術を用いることで、複数のシート状の照明を標本に形成した場合に、検出光がどのシート状の照明に起因するものかを識別することができることに着目したものである。これを踏まえて、実施例４から実施例６では、各々の厚さが従来のシート状の照明の厚さと同程度またはより薄い複数のシート状の照明を標本に形成する例が示されている。これらの実施例では、三角測量法に基づくＺ分解能がシート状の照明間の距離よりも小さい（つまり、分解能が高い）限り、各シート状の照明に起因する検出光を識別することができる。このため、複数のシート状の照明を標本に同時に形成することが可能となる。これにより、実施例４から実施例６に係る発明によれば、シート状の照明の各々の厚さが薄いにもかかわらず、少ない照明の回数で３次元情報を高速に生成することができる。

さらに、実施例４から実施例６では、シート状の照明の各々の厚さを薄くすることができるため、照明により高いＺ分解能を確保することができる。従って、ステレオ計測技術に基づくＺ分解能はシート状の照明間の距離よりも小さければよく、過度に高い分解能は要求されない。このため、実施例４から実施例６に係る発明は、基線長を大きくとれない場合に特に有効である。
以下、各実施例について具体的に説明する。

図７は、本実施例に係る顕微鏡システム１００の構成を例示した図である。図７に示す顕微鏡システム１００は、シート照明を採用した蛍光顕微鏡である顕微鏡装置１０と、制御解析装置２０と、を備える。

顕微鏡装置１０は、光源１と、標本Ｓをシート状に照明する照明光学系２と、標本Ｓを保持する標本ホルダ３と、標本ホルダ３をＺ方向に移動させるＺ駆動機構４と、異なる複数の方向から標本Ｓを撮像するステレオ撮像手段と、を備えている。なお、異なる方向とは、シート状の照明ＬＬの光の進行方向（つまり、照明方向）をＸ方向、シート状の照明ＬＬが形成する平面に平行で且つＸ方向と直交する方向をＹ方向、シート状の照明ＬＬの厚さ方向をＺ方向とするとき、方向を示す３次元ベクトル（ｘ、ｙ、ｚ）が異なる方向のことをいう。

光源１は、標本Ｓを励起する励起波長の光を出射する光源である。光源１は、例えば、レーザ光源であり、光ファイバーによって顕微鏡本体と接続されるファイバー光源であってもよい。

照明光学系２は、図８に示すように、光源１からの光をコリメートとするコリメータレンズ２ａと、シリンドリカルレンズ２ｂを備えている。照明光学系２は、シリンドリカルレンズ２ｂで平行光をシート状に変換して、標本Ｓに照射する。照明光学系２は、後述する検出光学系９の焦点深度以下であって且つ焦点深度程度、具体的には、焦点深度の１／２以上の厚さのシート状の照明ＬＬを標本Ｓに形成する。

Ｚ駆動機構４は、制御解析装置２０に接続されていて、制御解析装置２０からの制御信号に従って標本ホルダ３をＺ方向に移動させる。具体的には、Ｚ駆動機構４は、Ｚスタック間隔がシート状の照明ＬＬの厚さと同程度となるように、標本ホルダ３をＺ方向に移動させる。

顕微鏡装置１０は、標本Ｓをシート状に照明する照明光学系を備えていれば良く、シリンドリカルレンズ２ｂを備える照明光学系２の代わりに、図９に示す照明光学系１２を備えてもよい。照明光学系１２は、ガルバノミラー１２ａと、ｆθレンズ１２ｂを備えている。ガルバノミラー１２ａは、標本Ｓに照射する光の方向をＺ方向と直交する方向（例えば、Ｙ方向）に変化させることにより、標本Ｓにシート状の照明ＬＬを形成するスキャナ装置である。なお、顕微鏡装置１０は、ガルバノミラー１２ａの代わりにポリゴンミラーなどのその他のスキャナ装置を備えても良く、また、ｆθレンズ１２ｂの代わりにその他のスキャナレンズを備えても良い。照明光学系１２も後述する検出光学系９の焦点深度以下であって且つ焦点深度程度、具体的には、焦点深度の１／２以上の厚さのシート状の照明ＬＬを標本Ｓに形成する点は、照明光学系２と同様である。

ステレオ撮像手段は、図７に示すように、標本Ｓを撮像する撮像装置であるＣＣＤカメラ８と、標本Ｓの光学像をＣＣＤカメラ８上に形成する検出光学系９と、検出光学系９の瞳に入射する標本Ｓからの蛍光を部分的に遮蔽する遮蔽手段である絞り６と、絞り６を駆動する駆動装置６ｂと、を備えている。

ＣＣＤカメラ８は、検出光学系９の焦点面と共役な位置に受光面を有する、二次元イメージセンサ（ＣＣＤイメージセンサ）を備える撮像装置である。ＣＣＤカメラ８は、制御解析装置２０に接続されていて、制御解析装置２０へ標本Ｓの画像を出力する。また、ＣＣＤカメラ８は、二次元イメージセンサの受光面が照明光学系２によって標本Ｓに形成されるシート状の照明の平面（ＸＹ平面）と平行になるように、配置されている。
検出光学系９は、無限遠補正型の対物レンズ５と、結像レンズ７を備えている。

絞り６は、図１０に示すように、開口６ａの位置を検出光学系９の光軸と直交する方向に移動可能な絞りであり、検出光学系９の瞳位置に配置されている。なお、絞り６は、開口径が可変する可変絞りであっても、開口径が所定の大きさに固定された絞りであってもよい。駆動装置６ｂは、制御解析装置２０に接続されていて、制御解析装置２０からの制御信号に従って、開口６ａの位置を光軸と直交する方向に移動させる。

制御解析装置２０が絞り６の開口６ａを所定位置に順番に移動させると、ステレオ撮像手段は、所定位置毎に標本Ｓを撮像する。このようにして、ステレオ撮像手段は、標本Ｓを異なる複数の方向から撮像する。換言すると、ステレオ撮像手段は、標本Ｓからの蛍光が絞り６によって遮蔽される検出光学系９の瞳の範囲が異なる複数の状態で標本Ｓを撮像する。ここで、異なる複数の状態は、異なる複数の状態で絞り６を通過する複数の光束（例えば、図７の光束Ｌ１と光束Ｌ２）が検出光学系９の主平面を通過する際の光束中心間の距離が、シート状の照明ＬＬのＺ方向の厚さＴを三角測量法に基づくＺ方向の分解能ΔＺとしたときに、検出光学系９の焦点距離ｆと、Ｚ方向の分解能ΔＺと、顕微鏡装置１０のＺ方向と直交する方向の分解能ΔＸと、により算出される三角測量法の基線長Ｄよりも長くなるような状態である。

これにより、ステレオ撮像手段は、三角測量法に基づくＺ方向の分解能ΔＺがシート状の照明ＬＬのＺ方向の厚さＴよりも小さくなるような異なる複数の方向から標本Ｓを撮像する手段として機能する。

顕微鏡装置１０は、遮蔽手段を備えていれば良く、絞り６の代わりに、図１１に示す液晶装置１６を備えても良く、その場合、駆動装置６ｂは、液晶装置１６を駆動する駆動装置である。液晶装置１６は、検出光学系９の光軸と直交する方向（ＸＹ方向）に整列した複数の画素要素（画素要素１６ａ、画素要素１６ｂ）を備える液晶装置である。各画素要素は、駆動装置６ｂへ出力される制御解析装置２０からの制御信号に従って、入射光を透過させる状態と入射光を遮蔽する状態のいずれかに個別に制御される。なお、図１１は、入射光を透過させる状態の画素要素を画素要素１６ｂで示し、入射光を遮蔽する状態の画素要素を画素要素１６ａで示している。

なお、絞り６の代わりに液晶装置１６が用いられる場合には、制御解析装置２０が液晶装置１６を制御して液晶装置１６の開口（つまり、入射光を透過させる状態の画素要素）を所定位置に順番に形成し、ステレオ撮像手段が所定位置毎に標本Ｓを撮像する。これにより、ステレオ撮像手段は、異なる複数の方向から、つまり、標本Ｓからの蛍光が液晶装置１６によって遮蔽される検出光学系９の瞳の範囲が異なる複数の状態で、標本Ｓを撮像する。

制御解析装置２０は、メモリに記憶されたプログラムを実行するプロセッサを備えたコンピュータであり、顕微鏡装置１０を制御する制御装置である。また、制御解析装置２０は、制御装置であるとともに、ステレオ撮像手段により生成された標本Ｓの複数の画像に基づいて、シート状の照明のＺ方向の厚さＴよりも小さなＺ分解能（つまり、高いＺ分解能）を有する標本Ｓの三次元情報を生成する演算装置でもある。

より詳細には、制御解析装置２０は、ＣＣＤカメラ８から出力される標本Ｓの複数の画像に対してパターンマッチング処理を行う。さらに、マッチングした画像の領域の高さ情報を三角測量法により生成する。このようにして、制御解析装置２０は、標本Ｓの複数の画像から三角測量法により標本Ｓの三次元情報を、より詳細には、照明ＬＬの範囲内の標本Ｓの三次元情報を、生成する。さらに、これらの処理をＺ駆動機構４で標本ホルダ３をＺスタック間隔だけＺ方向に移動させる毎に行うことで、制御解析装置２０は、標本Ｓ全体の三次元情報を生成することができる。

制御解析装置２０は、さらに、生成した標本Ｓの三次元情報から標本Ｓを立体視するための画像（右目画像と左目画像）を生成してもよく、生成した右目画像と左目画像を表示装置に出力してもよい。

以上のように構成された顕微鏡システム１００によれば、高いＺ分解能を有する３次元情報を高速に生成することができる。また、顕微鏡装置１０によれば、高いＺ分解能を有する３次元情報を生成可能な複数の画像を短時間で制御解析装置２０に提供することができる。

図１２は、本実施例に係る顕微鏡システム２００の構成を例示した図である。図１２に示す顕微鏡システム２００は、顕微鏡装置１０の代わりに顕微鏡装置３０を備える点が、実施例１に係る顕微鏡システム１００と異なっている。

顕微鏡装置３０は、光源１と、標本Ｓをシート状に照明する照明光学系２と、標本Ｓを保持する標本ホルダ３と、標本ホルダ３をＺ方向に移動させるＺ駆動機構４と、を備えている点は、実施例１に係る顕微鏡装置１０と同様である。

顕微鏡装置３０は、標本ホルダ３をＺ軸周りに回転させる標本回転機構１３と、標本ＳをＸ軸周りに回転させる標本回転機構１４を備えている点が、顕微鏡装置１０と異なっている。標本回転機構１３及び標本回転機構１４で標本ホルダ３を回転させて標本Ｓの向きを変えることで、影ができにくい方向からシート照明を入射させることができる。

また、顕微鏡装置３０は、異なる複数の方向から標本Ｓを撮像するステレオ撮像手段を備えている点は実施例１に係る顕微鏡装置１０と同様であるが、ステレオ撮像手段の構造が顕微鏡装置１０のステレオ撮像手段とは異なっている。

顕微鏡装置３０のステレオ撮像手段は、図１２に示すように、標本Ｓを撮像する複数のＣＣＤカメラ（ＣＣＤカメラ８ａ及びＣＣＤカメラ８ｂ）と、光軸方向が異なる複数の検出光学系（検出光学系９ａ及び検出光学系９ｂ）とを備えている。検出光学系９ａ及び検出光学系９ｂの各々は、対物レンズと結像レンズからなり、標本Ｓの光学像を複数のＣＣＤカメラのうちの異なるＣＣＤカメラ上に形成する。具体的には、検出光学系９ａは、ＣＣＤカメラ８ａ上に標本Ｓの光学像を形成し、検出光学系９ｂは、ＣＣＤカメラ８ｂ上に標本Ｓの光学像を形成する。

ＣＣＤカメラ８ａ、ＣＣＤカメラ８ｂは、それぞれ、検出光学系９ａ、検出光学系９ｂの焦点面と共役な位置に受光面を有する二次元イメージセンサ（ＣＣＤイメージセンサ）を備える撮像装置である。ＣＣＤカメラ８ａ及びＣＣＤカメラ８ｂは、制御解析装置２０に接続されていて制御解析装置２０へ標本Ｓの画像を出力する点、それぞれの二次元イメージセンサの受光面が照明光学系２によって標本Ｓに形成されるシート状の照明の平面（ＸＹ平面）と平行になるように配置されている点は、実施例１に係るＣＣＤカメラ８と同様である。

ステレオ撮像手段は、複数の検出光学系（検出光学系９ａ及び検出光学系９ｂ）によって投影される標本Ｓの光学像を複数のＣＣＤカメラ（ＣＣＤカメラ８ａ及びＣＣＤカメラ８ｂ）で撮像することで、標本Ｓを異なる複数の方向から撮像する。なお、複数の検出光学系（検出光学系９ａ及び検出光学系９ｂ）は、複数の検出光学系の主点間の距離が、シート状の照明ＬＬのＺ方向の厚さＴを三角測量法に基づくＺ方向の分解能ΔＺとしたときに、複数の検出光学系の焦点距離ｆと、Ｚ方向の分解能ΔＺと、顕微鏡装置３０のＺ方向と直交する方向の分解能ΔＸと、により算出される三角測量法の基線長Ｄよりも長くなるように、配置される。

これにより、ステレオ撮像手段は、三角測量法に基づくＺ方向の分解能ΔＺがシート状の照明ＬＬのＺ方向の厚さＴよりも小さくなるような異なる複数の方向から標本Ｓを撮像する手段として機能する。

以上のように構成された顕微鏡システム２００によっても、実施例１に係る顕微鏡システム１００と同様に、高いＺ分解能を有する３次元情報を高速に生成することができる。また、顕微鏡装置３０によっても、実施例１に係る顕微鏡装置１０と同様に、高いＺ分解能を有する３次元情報を生成可能な複数の画像を短時間で制御解析装置２０に提供することができる。

また、顕微鏡装置３０は、異なる複数の方向から同時に標本Ｓを撮像することができる。このため、顕微鏡装置３０によれば、高いＺ分解能を有する３次元情報を生成可能な複数の画像を、実施例１に係る顕微鏡装置１０よりも短時間で制御解析装置２０に提供することができる。従って、顕微鏡システム２００によれば、高いＺ分解能を有する３次元情報を、実施例１に係る顕微鏡システム１００よりも高速に生成することができる。

図１３は、本実施例に係る顕微鏡システム３００の構成を例示した図である。図１３に示す顕微鏡システム３００は、顕微鏡装置１０の代わりに顕微鏡装置４０を備える点が、実施例１に係る顕微鏡システム１００と異なっている。

顕微鏡装置４０は、光源１と、標本Ｓをシート状に照明する照明光学系２と、標本Ｓを保持する標本ホルダ３と、標本ホルダ３をＺ方向に移動させるＺ駆動機構４と、を備えている点は、実施例１に係る顕微鏡装置１０と同様である。

また、顕微鏡装置４０は、異なる複数の方向から標本Ｓを撮像するステレオ撮像手段を備えている点は実施例１に係る顕微鏡装置１０と同様であるが、ステレオ撮像手段の構造が顕微鏡装置１０のステレオ撮像手段とは異なっている。

顕微鏡装置４０のステレオ撮像手段は、標本Ｓを撮像する複数のＣＣＤカメラ８と、標本Ｓの光学像をＣＣＤカメラ８上に形成する検出光学系９を備える点は、実施例１に係る顕微鏡装置１０と同様である。顕微鏡装置４０は、絞り６及び駆動装置６ｂの代わりに、角度可変機構１１及び駆動装置１１ａを備える点が、実施例１に係る顕微鏡装置１０と異なっている。

角度可変機構１１は、検出光学系９及びＣＣＤカメラ８を機械的に移動させる機構である。角度可変機構１１は、検出光学系９の焦点位置を移動させることなく検出光学系９の光軸の方向を変更するように、検出光学系９を移動させる。また、角度可変機構１１は、検出光学系９の移動に伴って移動後の検出光学系９の光軸上にＣＣＤカメラ８が位置するように、ＣＣＤカメラ８を移動させる機構でもある。なお、角度可変機構１１は、ＣＣＤカメラ８（二次元イメージセンサ）の受光面とシート状の照明ＬＬの平面（ＸＹ平面）との平行な関係が維持されるように、ＣＣＤカメラ８をスライドさせる。

駆動装置１１ａは、角度可変機構１１を駆動する駆動装置である。駆動装置１１ａは、制御解析装置２０に接続されていて、制御解析装置２０からの制御信号に従って、検出光学系９の光軸の方向を変更するように角度可変機構１１を駆動する。

制御解析装置２０が検出光学系９の光軸の方向を所定方向に順番に移動させると、ステレオ撮像手段は、所定方向毎に標本Ｓを撮像する。このようにして、ステレオ撮像手段は、標本Ｓを異なる複数の方向から撮像する。換言すると、ステレオ撮像手段は、検出光学系９の光軸の方向が異なる複数の状態で標本Ｓを撮像する。ここで、異なる複数の状態は、異なる複数の状態にある検出光学系９の主点間の距離が、シート状の照明のＺ方向の厚さＴを三角測量法に基づくＺ方向の分解能ΔＺとしたときに、検出光学系９の焦点距離ｆと、Ｚ方向の分解能ΔＺと、顕微鏡装置４０のＺ方向と直交する方向の分解能ΔＸと、により算出される三角測量法の基線長Ｄよりも長くなるような状態である。

これにより、ステレオ撮像手段は、三角測量法に基づくＺ方向の分解能ΔＺがシート状の照明ＬＬのＺ方向の厚さＴよりも小さくなるような異なる複数の方向から標本Ｓを撮像する手段として機能する。

以上のように構成された顕微鏡システム３００によっても、実施例１及び実施例２に係る顕微鏡システムと同様に、高いＺ分解能を有する３次元情報を高速に生成することができる。また、顕微鏡装置４０によっても、実施例１及び実施例２に係る顕微鏡装置と同様に、高いＺ分解能を有する３次元情報を生成可能な複数の画像を短時間で制御解析装置２０に提供することができる。

また、実施例１に係る顕微鏡装置１０では、瞳位置に入射する蛍光の一部が遮蔽されるのに対して、顕微鏡装置４０では、検出光学系９の瞳に入射する蛍光の光束全体がＣＣＤカメラ８に入射する。また、実施例２に係る顕微鏡装置３０では、十分なＺ方向の分解能が得られる基線長を確保しつつ複数の検出光学系を配置するために、各検出光学系のレンズ径が制限されるのに対して、顕微鏡装置４０では、より大きなレンズを用いることができる。このため、顕微鏡装置４０及び顕微鏡システム３００によれば、より明るい蛍光画像を得ることができる。

また、顕微鏡装置４０では、単一の検出光学系９の光軸の方向を変化させる構成を採用しているため、実施例２に係る顕微鏡装置３０に比べて基線長の制約が少ない。従って、顕微鏡装置４０及び顕微鏡システム３００によれば、より大きな基線長を採用してより高いＺ分解を実現することができる。

図１４は、本実施例に係る照明手段の構成を例示した図である。なお、本実施例に係る顕微鏡システムは、光源１及び照明光学系２の代わりに、図１４に示す照明手段２２を備えている点が、実施例１に係る顕微鏡システム１００とは異なっている。

照明手段２２は、光源１と照明光学系を備えている。本実施例に係る照明光学系は、コリメータレンズ２ａを備える点は顕微鏡システム１００の照明光学系２と同様である。ただし、シリンドリカルレンズ２ｂの代わりにシリンドリカルレンズ群２２ｂとリレー系２２ｃを備える点が顕微鏡システム１００の照明光学系２とは異なっている。

本実施例に係る顕微鏡システムでは、光源１からの光は、コリメータレンズ２ａで平行光に変換されて、シリンドリカルレンズアレイ２２ｂを構成する複数のシリンドリカルレンズに入射する。そして、各シリンドリカルレンズでシート状に変換されて、リレー系２２ｃを介して、標本に照射される。つまり、照明光学系は、複数のシート状の照明（ＬＬ１、ＬＬ２、ＬＬ３、ＬＬ４）を標本Ｓに形成するように構成されている。さらに、照明光学系は、複数のシート状の照明全体の厚さＴが検出光学系９の焦点深度以下になるように構成されている。

なお、照明手段は、標本Ｓに複数のシート状の照明を形成する照明光学系を備えていれば良い。従って、本実施例に係る顕微鏡システムは、図１４に示す照明手段２２の代わりに、図１５から図１８に示す照明手段（照明手段３２、照明手段４２、照明手段５０、照明手段５１）のいずれかを備えてもよい。

図１５に示す照明手段３２は、シリンドリカルレンズアレイ２２ｂの代わりに空間位相変調器３２ｂを備える点が、図１４に示す照明手段２２とは異なっている。空間位相変調器３２ｂは、二次元に配列された画素要素を有する装置であり、例えば、ＬＣＯＳなどの液晶デバイスである。各画素要素は独立に制御されて、入射光の位相を変調する。照明手段３２は、空間位相変調器３２ｂで入射光の位相を変調することで、複数のシート状の照明を形成することができる。なお、空間位相変調器３２ｂの代わりにホログラム光学素子により同様の機能を実現してもよい。

図１６に示す照明手段４２は、シリンドリカルレンズアレイ２２ｂ及びリレー系２２ｃの代わりにプリズム４２ｂを備える点が、図１４に示す照明手段２２とは異なっている。また、光源１にはレーザを用いる。照明手段４２は、プリズム４２ｂから出射した光を干渉させることで、複数のシート状の照明を形成する。

図１７に示す照明手段５０は、コリメータレンズ２ａの代わりに光ファイバー５２及びコリメータレンズアレイ５２ａを備える点、及び、リレー系２２ｃを有しない点が、図１４に示す照明手段２２とは異なっている。照明手段５０は、光ファイバー５２で光源１からの光を分岐させて、分岐した光の各々をコリメータレンズアレイ５２ａの各コリメートレンズでコリメートする。さらに、シリンドリカルレンズアレイ２２ｂを構成する各シリンドリカルレンズで各平行光がシート状に変換されることで、照明手段５０は、複数のシート状の照明を標本に形成する。

図１８に示す照明手段５１は、光源１及び光ファイバー５２の代わりに複数の光源（光源１ａ、光源１ｂ、光源１ｃ、光源１ｄ）を備える点が、図１７に示す照明手段５０とは異なっている。照明手段５１によっても、図１７に示す照明手段５０と同様に、複数のシート状の照明を標本に形成することができる。

以上のように構成された本実施例に係る顕微鏡システムでは、ステレオ撮像手段は、図４に示すように、三角測量法に基づくＺ方向の分解能が複数のシート状の照明間の距離Ｇよりも小さくなる（分解能が高くなる）ような異なる複数の方向から標本Ｓを撮像する。

なお、三角測量法に基づくＺ方向の分解能は、上記の条件を満たす限り、複数のシート状の照明の各々の厚さＴｓよりも厚くてもよい。これは、上記の条件を満たす限り、本実施例に係る顕微鏡システムのＺ方向の分解能として、少なくとも複数のシート状の照明の各々の厚さＴｓが保証されるからである。

さらに、本実施例に係る顕微鏡システムでは、Ｚ駆動機構４は、移動前に複数のシート状の照明間に位置する標本Ｓの領域に移動後に複数のシート状の照明が形成されるように、複数のシート状の照明の位置を移動させる。即ち、Ｚ駆動機構４は、複数のシート状の照明が形成される標本Ｓ上の位置をＺ方向に移動させる照明位置移動手段である。より具体的には、Ｚ駆動機構４は、図１９に示すように、複数のシート状の照明の各々の厚さＴｓずつ、標本ホルダ３をＺ方向に移動させることが望ましい。このように動作させることで、シート照明間の隙間を漏れなく撮像することができるからである。

本実施例に係る顕微鏡システムでも、制御解析装置２０が、ＣＣＤカメラ８から出力される標本Ｓの複数の画像に対してパターンマッチング処理を行うことで、標本Ｓの三次元情報が生成される。

本実施例に係る顕微鏡システムによれば、薄いシート状の照明により高いＺ分解能を確保しつつ、ステレオ計測技術で複数のシート状の照明を識別して高速に三次元情報を生成することができる。また、本実施例に係る顕微鏡装置によれば、高いＺ分解能を有する３次元情報を生成可能な複数の画像を短時間で制御解析装置２０に提供することができる。さらに、本実施例に係る顕微鏡システムでは、シート照明により高いＺ分解能が保証されるため、三角測量法の基線長Ｄを過度に大きく取る必要がない。このため、例えば、検出光学系９のレンズ径を小さくすることができるなど、設計上の自由度が向上する。

本実施例に係る顕微鏡システムは、光源１及び照明光学系２の代わりに、図１４に示す照明手段２２を備えている点が、実施例２に係る顕微鏡システム２００とは異なっている。

本実施例に係る顕微鏡システムでは、ステレオ撮像手段は、図４に示すように、三角測量法に基づくＺ方向の分解能が複数のシート状の照明間の距離Ｇよりも小さくなる（分解能が高くなる）ような異なる複数の方向から標本Ｓを撮像する。さらに、Ｚ駆動機構４は、移動前に複数のシート状の照明間に位置する標本Ｓの領域に移動後に複数のシート状の照明が形成されるように、複数のシート状の照明の位置を移動させる。より具体的には、より望ましくは、図１９に示すように、複数のシート状の照明の各々の厚さＴｓずつ、標本ホルダ３をＺ方向に移動させる。これらの点は、実施例４に係る顕微鏡システムと同様である。

本実施例に係る顕微鏡システム及び顕微鏡装置によっても、実施例４に係る顕微鏡システム及び顕微鏡装置と同様の効果を得ることができる。また、異なる複数の方向から同時に標本Ｓを撮像することができるため、より短時間で複数の画像を取得して、より高速に三次元情報を生成することができる。

本実施例に係る顕微鏡システムは、光源１及び照明光学系２の代わりに、図１４に示す照明手段２２を備えている点が、実施例３に係る顕微鏡システム３００とは異なっている。

本実施例に係る顕微鏡システムでは、ステレオ撮像手段は、図４に示すように、三角測量法に基づくＺ方向の分解能が複数のシート状の照明間の距離Ｇよりも小さくなる（分解能が高くなる）ような異なる複数の方向から標本Ｓを撮像する。さらに、Ｚ駆動機構４は、移動前に複数のシート状の照明間に位置する標本Ｓの領域に移動後に複数のシート状の照明が形成されるように、複数のシート状の照明の位置を移動させる。より具体的には、より望ましくは、図１９に示すように、複数のシート状の照明の各々の厚さＴｓずつ、標本ホルダ３をＺ方向に移動させる。これらの点は、実施例４に係る顕微鏡システムと同様である。

本実施例に係る顕微鏡システム及び顕微鏡装置によっても、実施例４に係る顕微鏡システム及び顕微鏡装置と同様の効果を得ることができる。

上述した各実施例は、発明の理解を容易にするために具体例を示したものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。顕微鏡装置及び顕微鏡システムは、特許請求の範囲により規定される本発明の思想を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。

例えば、実施例１に係る顕微鏡システム１００は、絞り６の代わりにカラーフィルタを備えても良い。透過波長の異なる複数のカラーフィルタを、互いに検出光学系９の瞳位置に入射する光束の異なる領域に作用するように配置して、複数の異なる色の蛍光を同時に検出してもよい。この場合、複数のカラーフィルタの位置を切り替えて撮像を繰り返すことで、色毎に異なる複数の方向から標本Ｓを撮像することができる。

また、実施例４から実施例６に係る顕微鏡システムは、２色以上のシート状の照明を含む複数のシート状の照明を形成してもよい。このような照明は、例えば、図１８に示す複数の光源が異なる波長の光を出射することによって実現される。図２０Ａ及び図２０Ｂは、標本に赤色のシート状の照明（照明ＬＬ１ｒから照明ＬＬ５ｒ）と緑色のシート状の照明（照明ＬＬ１ｇから照明ＬＬ５ｇ）をそれぞれ複数形成した例を示している。図２０Ａと図２０Ｂに示すように、照明位置を変化させずにステレオ撮像手段で異なる２方向から２色のシートを撮像することで、色毎に３次元情報を生成することができる。

なお、色の異なるシート状の照明間の距離は、三角測量法に基づくＺ方向の分解能よりも短くしてもよい。これは、色の異なるシート状の照明に起因する検出光は、異なる色（波長）を有しているため、波長で分離して検出することができるからである。
また、本発明の各実施例は、ＳＴＯＲＭ（STochastic Optical Reconstruction Microscopy）やＧＳＤ（Ground State Depletion）などのローカライゼーション法を用いた超解像画像の生成にも適用可能である。

１ 光源
２、１２ 照明光学系
２ａ コリメータレンズ
２ｂ シリンドリカルレンズ
３ 標本ホルダ
４ Ｚ駆動機構
５ 対物レンズ
６ 絞り
６ａ 開口
６ｂ、１１ａ 駆動装置
７ 結像レンズ
８、８ａ、８ｂ ＣＣＤカメラ
９、９ａ、９ｂ 検出光学系
１０、３０、４０ 顕微鏡装置
１１ 角度可変機構
１２ａ ガルバノミラー
１２ｂ ｆθレンズ
１３、１４ 標本回転機構
１６ 液晶装置
１６ａ、１６ｂ 画素要素
２０ 制御解析装置
２２、３２、４２、５０、５１ 照明手段
２２ｂ シリンドリカルレンズアレイ
２２ｃ リレー系
３２ｂ 空間位相変調器
４２ プリズム
５２ 光ファイバー
５２ａ コリメータレンズアレイ
１００、２００、３００ 顕微鏡システム
Ｓ 標本

Claims (16)

1. 標本をシート状に照明する照明光学系と、
   三角測量法に基づく分解能であって前記照明光学系によって前記標本に形成される一又は複数のシート状の照明の方向と直交するＺ方向の分解能が前記一又は複数のシート状の照明全体の前記Ｚ方向の厚さよりも小さくなるような異なる複数の方向から、前記標本を撮像するステレオ撮像手段と、を備える
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
2. 請求項１に記載の顕微鏡装置において、
   前記ステレオ撮像手段は、前記Ｚ方向の分解能が前記照明光学系によって前記標本に形成される単一のシート状の照明の前記Ｚ方向の厚さよりも小さくなるような異なる複数の方向から前記標本を撮像する
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
3. 請求項２に記載の顕微鏡装置において、
   前記ステレオ撮像手段は、
   前記標本を撮像する撮像装置と、
   前記標本の光学像を前記撮像装置上に形成する検出光学系と、を備え、
   前記単一のシート状の照明の前記Ｚ方向の厚さは、前記検出光学系の焦点深度以下であり、且つ、前記検出光学系の焦点深度程度である
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
4. 請求項３に記載の顕微鏡装置において、
   前記単一のシート状の照明の前記Ｚ方向の厚さは、前記検出光学系の焦点深度以下であり、且つ、前記検出光学系の焦点深度の１／２以上である
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
5. 請求項３または請求項４に記載の顕微鏡装置において、
   前記ステレオ撮像手段は、
   さらに、前記検出光学系の瞳位置に配置され、前記検出光学系の瞳に入射する前記標本からの光を部分的に遮蔽する遮蔽手段と、を備え、
   前記遮蔽手段により前記標本からの光が遮蔽される前記検出光学系の瞳の範囲が異なる複数の状態で前記標本を撮像する
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
6. 請求項５に記載の顕微鏡装置において、
   前記異なる複数の状態で前記遮蔽手段を通過する複数の光束が前記検出光学系の主平面を通過する際の光束中心間の距離は、前記単一のシート状の照明の前記Ｚ方向の厚さを三角測量法に基づく前記Ｚ方向の分解能としたときに、前記検出光学系の焦点距離と、前記Ｚ方向の分解能と、前記顕微鏡装置の前記Ｚ方向と直交する方向の分解能と、により算出される三角測量法の基線長よりも長い
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
7. 請求項３または請求項４に記載の顕微鏡装置において、
   前記ステレオ撮像手段は、
   さらに、前記検出光学系の光軸の方向を変更する機構を備え、
   前記検出光学系の光軸の方向が異なる複数の状態で前記標本を撮像する
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
8. 請求項７に記載の顕微鏡装置において、
   前記異なる複数の状態にある前記検出光学系の主点間の距離は、前記単一のシート状の照明の前記Ｚ方向の厚さを三角測量法に基づく前記Ｚ方向の分解能としたときに、前記検出光学系の焦点距離と、前記Ｚ方向の分解能と、前記顕微鏡装置の前記Ｚ方向と直交する方向の分解能と、により算出される三角測量法の基線長よりも長い
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
9. 請求項３または請求項４に記載の顕微鏡装置において、
   前記ステレオ撮像手段は、
   前記標本を撮像する複数の前記撮像装置と、
   各々が前記標本の光学像を前記複数の撮像装置のうちの異なる撮像装置上に形成する複数の前記検出光学系であって、各々の光軸の方向が異なる複数の前記検出光学系と、を備える
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
10. 請求項９に記載の顕微鏡装置において、
    前記複数の検出光学系の主点間の距離は、前記単一のシート状の照明の前記Ｚ方向の厚さを三角測量法に基づく前記Ｚ方向の分解能としたときに、前記複数の検出光学系の焦点距離と、前記Ｚ方向の分解能と、前記顕微鏡装置の前記Ｚ方向と直交する方向の分解能と、により算出される三角測量法の基線長よりも長い
    ことを特徴とする顕微鏡装置。
11. 請求項１に記載の顕微鏡装置において、
    前記照明光学系は、前記標本に複数のシート状の照明を形成し、
    前記ステレオ撮像手段は、前記Ｚ方向の分解能が前記複数のシート状の照明間の距離よりも小さくなるような異なる複数の方向から前記標本を撮像する
    ことを特徴とする顕微鏡装置。
12. 請求項１１に記載の顕微鏡装置において、さらに、
    前記複数のシート状の照明が形成される前記標本上の位置を前記Ｚ方向に移動させる照明位置移動手段を備え、
    前記照明位置移動手段は、移動前に前記複数のシート状の照明間に位置する前記標本の領域に移動後に前記複数のシート状の照明が形成されるように、前記複数のシート状の照明の位置を移動させる
    ことを特徴とする顕微鏡装置。
13. 請求項１１に記載の顕微鏡装置において、
    前記ステレオ撮像手段は、
    前記標本を撮像する撮像装置と、
    前記標本の光学像を前記撮像装置上に形成する検出光学系と、
    前記検出光学系の瞳位置に配置され、前記検出光学系の瞳に入射する前記標本からの光を部分的に遮蔽する遮蔽手段と、を備え、
    前記遮蔽手段により前記標本からの光が遮蔽される前記検出光学系の瞳の範囲が異なる複数の状態で前記標本を撮像する
    ことを特徴とする顕微鏡装置。
14. 請求項１１に記載の顕微鏡装置において、
    前記ステレオ撮像手段は、
    前記標本を撮像する撮像装置と、
    前記標本の光学像を前記撮像装置上に形成する検出光学系と、
    前記検出光学系の光軸の方向を変更する機構を備え、
    前記検出光学系の光軸の方向が異なる複数の状態で前記標本を撮像する
    ことを特徴とする顕微鏡装置。
15. 請求項１１に記載の顕微鏡装置において、
    前記ステレオ撮像手段は、
    前記標本を撮像する複数の撮像装置と、
    各々が前記標本の光学像を前記複数の撮像装置のうちの異なる撮像装置上に形成する複数の検出光学系であって、各々の光軸の方向が異なる複数の検出光学系と、を備える
    ことを特徴とする顕微鏡装置。
16. 請求項１乃至請求項１５に記載の顕微鏡装置と、
    前記顕微鏡装置のステレオ撮像手段により生成された前記標本の複数の画像に基づいて、前記標本の三次元情報を生成する演算装置と、を備える
    ことを特徴とする顕微鏡システム。