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JP6796675B2 - 植物調節エレメントおよびその使用 - Google Patents

植物調節エレメントおよびその使用 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照によって本明細書において組み込まれる、2011年3月13日に提出された米国仮特許出願第61/485,876号の利益を主張する。
配列表の組み込み
Microsoft Windows(登録商標)において測定されるように、463キロバイトであり、2012年3月9日に作成された「MONS304WO.txt」という名のファイル中に含有される配列表は、電子的な提出によって本明細書と共に提出され、参照によって本明細書において組み込まれる。
本発明は、植物分子生物学および植物遺伝子工学の分野ならびに植物における遺伝子発現を調整するのに有用なDNA分子に関する。
調節エレメントは、作動可能に連結された、転写可能なポリヌクレオチド分子の転写を調整することによって、遺伝子活性を調節する遺伝因子である。そのようなエレメントは、プロモーター、リーダー、イントロン、および3’非翻訳領域を含み、植物分子生物学および植物遺伝子工学の分野において有用である。
本発明は、植物における使用のための、一般にマスクメロンと呼ばれる植物種であるメロン(Cucumis melo)に由来する、プロモーター、リーダー、およびイントロンなどの新規な遺伝子調節エレメントを提供する。本発明はまた、調節エレメントを含むDNAコンストラクト、トランスジェニック植物細胞、植物、および種子をも提供する。本明細書において提供される調節配列に関して異種であってもよい、転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結された配列が提供されてもよい。本発明はまた、調節エレメント、調節エレメントを含むDNAコンストラクト、ならびに転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結された調節エレメントを含むトランスジェニック植物細胞、植物、および種子を作製するならびに使用するための方法をも提供する。
したがって、一態様において、本発明は、a)配列番号1〜199、211、および212のいずれかに対して少なくとも85パーセントの配列同一性を有する配列;b)配列番号1〜199、211、および212のいずれかを含む配列;ならびにc)遺伝子調節活性を示す、配列番号1〜199、211、および212のいずれかの断片からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、転写調節発現エレメント群またはプロモーターまたはリーダーまたはイントロンなどのDNA分子であって、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている、DNA分子を提供する。特定の実施形態において、転写調節発現エレメント群またはプロモーターまたはリーダーまたはイントロンが、配列番号1〜199、211、および212のいずれかと、少なくとも90パーセント、少なくとも95パーセント、少なくとも98パーセント、または少なくとも99パーセント同一である。特定の実施形態において、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子が、農学的に重要な遺伝子、植物における除草剤抵抗性を提供することができる遺伝子、または植物における植物害虫抵抗性を提供することができる遺伝子を含む。
本発明はまた、a)配列番号1〜199、211、および212のいずれかに対して少なくとも85パーセントの配列同一性を有する配列;b)配列番号1〜199、211、および212のいずれかを含む配列;ならびにc)遺伝子調節活性を示す、配列番号1〜199、211、および212のいずれかの断片からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、転写調節発現エレメント群またはプロモーターまたはリーダーまたはイントロンなどのDNA分子を含むトランスジェニック植物細胞であって、前記DNA分子が、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている、トランスジェニック植物細胞を提供する。さらに、転写調節発現エレメント群またはプロモーターまたはリーダーまたはイントロンは、遺伝子の発現を調節する。トランスジェニック植物細胞は、単子葉または双子葉植物細胞とすることができる。
a)配列番号1〜199、211、および212のいずれかに対して少なくとも85パーセントの配列同一性を有する配列;b)配列番号1〜199、211、および212のいずれかを含む配列;ならびにc)遺伝子調節活性を示す、配列番号1〜199、211、および212のいずれかの断片からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、転写調節発現エレメント群またはプロモーターまたはリーダーまたはイントロンなどのDNA分子を含むトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部であって、前記DNA分子が、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部が、本発明によってさらに提供される。特定の実施形態において、トランスジェニック植物は、転写調節発現エレメント群またはプロモーターまたはリーダーまたはイントロンを含有する任意の世代の子孫植物であってもよい。
a)配列番号1〜199、211、および212のいずれかに対して少なくとも85パーセントの配列同一性を有する配列;b)配列番号1〜199、211、および212のいずれかを含む配列;ならびにc)遺伝子調節活性を示す、配列番号1〜199、211、および212のいずれかの断片からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、転写調節発現エレメント群またはプロモーターまたはリーダーまたはイントロンなどのDNA分子を含むトランスジェニック種子であって、前記DNA分子が、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている、トランスジェニック種子が、さらに提供される。
さらに他の態様において、本発明は、a)配列番号1〜199、211、および212のいずれかに対して少なくとも85パーセントの配列同一性を有する配列;b)配列番号1〜199、211、および212のいずれかを含む配列;ならびにc)遺伝子調節活性を示す、配列番号1〜199、211、および212のいずれかの断片からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、転写調節発現エレメント群またはプロモーターまたはリーダーまたはイントロンなどのDNA分子を含有する、トランスジェニック植物、トランスジェニック植物の一部、またはトランスジェニック種子から商品を製造する方法であって、前記DNA分子が、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている、方法を提供する。一実施形態において、商品は、タンパク質濃縮物、タンパク質単離物、穀物、デンプン、種子、ミール、穀粉、バイオマス、または種子油である。
他の態様において、本発明は、a)配列番号1〜199、211、および212のいずれかに対して少なくとも85パーセントの配列同一性を有する配列;b)配列番号1〜199、211、および212のいずれかを含む配列;ならびにc)遺伝子調節活性を示す、配列番号1〜199、211、および212のいずれかの断片からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、転写調節発現エレメント群またはプロモーターまたはリーダーまたはイントロンなどのDNA分子を含む商品であって、前記DNA分子が、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている、商品を提供する。
さらに他の態様において、本発明は、配列番号1〜199、211、および212のいずれかのDNA配列に対して少なくとも85パーセント同一であるDNA配列を有する、配列番号1〜199、211、および212のいずれかを含有する、または配列番号1〜199、211、および212のいずれかの断片からなる、転写調節発現エレメント群またはプロモーターまたはリーダーまたはイントロンなどのDNA分子を使用して、トランスジェニック植物において、転写可能なポリヌクレオチド分子を発現させ、トランスジェニック植物を栽培する方法を提供する。
配列の簡単な説明
配列番号1、5、7、9、11、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、159、162、167、168、172、175、176、177、178、181、182、183、184、185、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、211、および212は、リーダーエレメントに作動可能に連結されたプロモーターエレメント;またはリーダーエレメントおよびイントロンエレメントに作動可能に連結されたプロモーターエレメント、またはリーダーエレメントに作動可能に連結され、イントロンエレメントに作動可能に連結され、リーダーエレメントに作動可能に連結されたプロモーターエレメントから構成されるウリ属(Cucumis)転写調節発現エレメント群またはEXP配列である。
配列番号2、6、8、10、12、163、および169は、プロモーターエレメントである。
配列番号3、164、166、および170は、リーダー配列である。
配列番号4、165、および171は、イントロン配列である。
配列番号157、160、173、179、および186は、プロモーターが、リーダーエレメントに作動可能に連結されている配列である。
配列番号158、161、174、180、および187は、イントロンが、リーダーエレメントに作動可能に連結されている配列である。
図1a〜1fは、メロンから単離されたプロモーターエレメントに対応するプロモーターバリアントセグメントのアライメントを示す。特に、図1a〜1fは、転写調節発現エレメント群EXP−CUCme.Ubq1:1:1(配列番号1)において見出される2068bpプロモーター配列P−CUCme.Ubq1−1:1:15(配列番号2)対プロモーター、P−CUCme.Ubq1−1:1:15の5’欠失を介して誘導されるプロモーター配列のアライメントを示す。たとえばP−CUCme.Ubq1−1:1:15の5’末端の欠失は、プロモーター、EXP−CUCme.Ubq1:1:2(配列番号5)内に見出される1459bpプロモーターであるP−CUCme.Ubq1−1:1:16(配列番号6);EXP−CUCme.Ubq1:1:3(配列番号7)内に含まれる964bp配列であるP−CUCme.Ubq1−1:1:17(配列番号8);EXP−CUCme.Ubq1:1:4(配列番号9)内に含まれる479bp配列であるP−CUCme.Ubq1−1:1:18(配列番号10);およびEXP−CUCme.Ubq1:1:5(配列番号11)内に含まれる173bp配列であるP−CUCme.Ubq1−1:1:19(配列番号12)をもたらした。 図1a〜1fは、メロンから単離されたプロモーターエレメントに対応するプロモーターバリアントセグメントのアライメントを示す。特に、図1a〜1fは、転写調節発現エレメント群EXP−CUCme.Ubq1:1:1(配列番号1)において見出される2068bpプロモーター配列P−CUCme.Ubq1−1:1:15(配列番号2)対プロモーター、P−CUCme.Ubq1−1:1:15の5’欠失を介して誘導されるプロモーター配列のアライメントを示す。たとえばP−CUCme.Ubq1−1:1:15の5’末端の欠失は、プロモーター、EXP−CUCme.Ubq1:1:2(配列番号5)内に見出される1459bpプロモーターであるP−CUCme.Ubq1−1:1:16(配列番号6);EXP−CUCme.Ubq1:1:3(配列番号7)内に含まれる964bp配列であるP−CUCme.Ubq1−1:1:17(配列番号8);EXP−CUCme.Ubq1:1:4(配列番号9)内に含まれる479bp配列であるP−CUCme.Ubq1−1:1:18(配列番号10);およびEXP−CUCme.Ubq1:1:5(配列番号11)内に含まれる173bp配列であるP−CUCme.Ubq1−1:1:19(配列番号12)をもたらした。 図1a〜1fは、メロンから単離されたプロモーターエレメントに対応するプロモーターバリアントセグメントのアライメントを示す。特に、図1a〜1fは、転写調節発現エレメント群EXP−CUCme.Ubq1:1:1(配列番号1)において見出される2068bpプロモーター配列P−CUCme.Ubq1−1:1:15(配列番号2)対プロモーター、P−CUCme.Ubq1−1:1:15の5’欠失を介して誘導されるプロモーター配列のアライメントを示す。たとえばP−CUCme.Ubq1−1:1:15の5’末端の欠失は、プロモーター、EXP−CUCme.Ubq1:1:2(配列番号5)内に見出される1459bpプロモーターであるP−CUCme.Ubq1−1:1:16(配列番号6);EXP−CUCme.Ubq1:1:3(配列番号7)内に含まれる964bp配列であるP−CUCme.Ubq1−1:1:17(配列番号8);EXP−CUCme.Ubq1:1:4(配列番号9)内に含まれる479bp配列であるP−CUCme.Ubq1−1:1:18(配列番号10);およびEXP−CUCme.Ubq1:1:5(配列番号11)内に含まれる173bp配列であるP−CUCme.Ubq1−1:1:19(配列番号12)をもたらした。 図1a〜1fは、メロンから単離されたプロモーターエレメントに対応するプロモーターバリアントセグメントのアライメントを示す。特に、図1a〜1fは、転写調節発現エレメント群EXP−CUCme.Ubq1:1:1(配列番号1)において見出される2068bpプロモーター配列P−CUCme.Ubq1−1:1:15(配列番号2)対プロモーター、P−CUCme.Ubq1−1:1:15の5’欠失を介して誘導されるプロモーター配列のアライメントを示す。たとえばP−CUCme.Ubq1−1:1:15の5’末端の欠失は、プロモーター、EXP−CUCme.Ubq1:1:2(配列番号5)内に見出される1459bpプロモーターであるP−CUCme.Ubq1−1:1:16(配列番号6);EXP−CUCme.Ubq1:1:3(配列番号7)内に含まれる964bp配列であるP−CUCme.Ubq1−1:1:17(配列番号8);EXP−CUCme.Ubq1:1:4(配列番号9)内に含まれる479bp配列であるP−CUCme.Ubq1−1:1:18(配列番号10);およびEXP−CUCme.Ubq1:1:5(配列番号11)内に含まれる173bp配列であるP−CUCme.Ubq1−1:1:19(配列番号12)をもたらした。 図1a〜1fは、メロンから単離されたプロモーターエレメントに対応するプロモーターバリアントセグメントのアライメントを示す。特に、図1a〜1fは、転写調節発現エレメント群EXP−CUCme.Ubq1:1:1(配列番号1)において見出される2068bpプロモーター配列P−CUCme.Ubq1−1:1:15(配列番号2)対プロモーター、P−CUCme.Ubq1−1:1:15の5’欠失を介して誘導されるプロモーター配列のアライメントを示す。たとえばP−CUCme.Ubq1−1:1:15の5’末端の欠失は、プロモーター、EXP−CUCme.Ubq1:1:2(配列番号5)内に見出される1459bpプロモーターであるP−CUCme.Ubq1−1:1:16(配列番号6);EXP−CUCme.Ubq1:1:3(配列番号7)内に含まれる964bp配列であるP−CUCme.Ubq1−1:1:17(配列番号8);EXP−CUCme.Ubq1:1:4(配列番号9)内に含まれる479bp配列であるP−CUCme.Ubq1−1:1:18(配列番号10);およびEXP−CUCme.Ubq1:1:5(配列番号11)内に含まれる173bp配列であるP−CUCme.Ubq1−1:1:19(配列番号12)をもたらした。 図1a〜1fは、メロンから単離されたプロモーターエレメントに対応するプロモーターバリアントセグメントのアライメントを示す。特に、図1a〜1fは、転写調節発現エレメント群EXP−CUCme.Ubq1:1:1(配列番号1)において見出される2068bpプロモーター配列P−CUCme.Ubq1−1:1:15(配列番号2)対プロモーター、P−CUCme.Ubq1−1:1:15の5’欠失を介して誘導されるプロモーター配列のアライメントを示す。たとえばP−CUCme.Ubq1−1:1:15の5’末端の欠失は、プロモーター、EXP−CUCme.Ubq1:1:2(配列番号5)内に見出される1459bpプロモーターであるP−CUCme.Ubq1−1:1:16(配列番号6);EXP−CUCme.Ubq1:1:3(配列番号7)内に含まれる964bp配列であるP−CUCme.Ubq1−1:1:17(配列番号8);EXP−CUCme.Ubq1:1:4(配列番号9)内に含まれる479bp配列であるP−CUCme.Ubq1−1:1:18(配列番号10);およびEXP−CUCme.Ubq1:1:5(配列番号11)内に含まれる173bp配列であるP−CUCme.Ubq1−1:1:19(配列番号12)をもたらした。
発明の詳細な説明
本明細書において開示される本発明は、有益な遺伝子調節活性を有するメロンから得られたポリヌクレオチド分子を提供する。これらのポリヌクレオチド分子の設計、構築、および使用が記載される。これらのポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、配列番号1〜199、211、および212の中で提供される。これらのポリヌクレオチド分子は、たとえば、植物組織における、作動可能に連結された、転写可能なポリヌクレオチド分子の発現に影響を及ぼすことができ、そのため、トランスジェニック植物において、遺伝子発現またはコード遺伝子産物の活性を選択的に調節することができる。本発明はまた、ポリヌクレオチド分子を修飾する、生成する、および使用するための方法を提供する。本発明はまた、プロモーターおよび/または他の開示されるヌクレオチド配列を含有する組成物、形質転換宿主細胞、トランスジェニック植物、および種子ならびにそれらを調製し、使用する方法をも提供する。
以下の定義および方法は、よりよく本発明を定義し、本発明の実施において当業者らをガイドするために提供される。特に断りのない限り、用語は、当業者らによって、従来の使用法に従って理解される。
DNA分子
本明細書において使用されるように、用語「DNA」または「DNA分子」は、5’(上流域)末端から3’(下流)末端に読まれる、ゲノムまたは合成起源の二本鎖DNA分子、すなわちデオキシリボヌクレオチド塩基またはポリヌクレオチド分子のポリマーを指す。本明細書において使用されるように、用語「DNA配列」は、DNA分子のヌクレオチド配列を指す。
本明細書において使用されるように、用語「単離DNA分子」は、その天然または自然状態においてそれと通常関連する他の分子から、少なくとも部分的に分離されたDNA分子を指す。一実施形態において、用語「単離」が、その天然または自然状態においてDNA分子の側面に通常位置する核酸のいくつかから、少なくとも部分的に分離されたDNA分子を指す。したがって、たとえば組換え技術の結果として、DNA分子が通常関連しない調節またはコード配列に融合されたDNA分子は、本明細書において、単離されていると考えられる。そのような分子は、それらが天然状態にないという点で、宿主細胞の染色体の中に統合されるまたは他のDNA分子と共に核酸溶液中に存在する場合、単離されていると考えられる。
本発明において開示される、DNA分子またはその断片を単離し、操作するための多くの方法が、知られている。たとえば、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)技術は、特定の出発DNA分子を増幅するおよび/またはもとの分子のバリアントを生成するために使用することができる。DNA分子またはその断片はまた、自動オリゴヌクレオチド合成装置を使用することによって一般に実施されるように、化学的な手段によって断片を直接合成することによってなど、他の技術によって得ることもできる。
本明細書において使用されるように、用語「配列同一性」は、2つの最適にアライメントされたポリヌクレオチド配列または2つの最適にアライメントされたポリペプチド配列が同一である程度を指す。最適な配列アライメントは、適切な内部ヌクレオチド挿入、欠失、またはギャップにより、配列アライメント中のヌクレオチドのマッチの数を最大限にするように、2つの配列、たとえば参照配列および他の配列を手作業でアライメントすることによって作出される。本明細書において使用されるように、用語「参照配列」は、配列番号1〜199、211、および212のポリヌクレオチド配列として提供される配列を指す。
本明細書において使用されるように、用語「パーセントの配列同一性」または「パーセントの同一性」または「%の同一性」は、同一性分率×100である。参照配列と最適にアライメントされた配列についての「同一性分率」は、参照配列におけるヌクレオチドの総数、たとえば、完全長の全参照配列におけるヌクレオチドの総数によって割った、最適なアライメントにおけるヌクレオチドのマッチの数である。したがって、本発明の一実施形態は、配列番号1〜199、211、および212としての本明細書において提供される参照配列に対して最適にアライメントされた場合に、参照配列に対して、少なくとも約85パーセントの同一性、少なくとも約90パーセントの同一性、少なくとも約95パーセントの同一性、少なくとも約96パーセントの同一性、少なくとも約97パーセントの同一性、少なくとも約98パーセントの同一性、または少なくとも約99パーセントの同一性を有する配列を含むDNA分子である。特定の実施形態において、そのような配列が、遺伝子調節活性を有するまたは細胞内に、作動可能に連結されたポリペプチドを局在化させるように機能するペプチドをコードするとして定義されてもよい。
調節エレメント
調節エレメントは、遺伝子調節活性を有するDNA分子、すなわち、作動可能に連結された、転写可能なポリヌクレオチド分子の転写および/または翻訳に影響を及ぼす能力を有するDNA分子である。用語「遺伝子調節活性」は、したがって、その作動可能に連結された、転写可能なポリヌクレオチド分子の転写および/または翻訳に影響を及ぼすことによって、作動可能に連結された、転写可能なポリヌクレオチド分子の発現パターンに影響を及ぼす能力を指す。本明細書において使用されるように、転写調節発現エレメント群(EXP)は、作動可能に連結された、エンハンサー、プロモーター、リーダー、およびイントロンなどの発現エレメントから構成されてもよい。したがって、転写調節発現エレメント群は、たとえば、リーダー配列の5’に作動可能に連結されたプロモーターから構成されてもよく、これは、順番に、イントロン配列の5’に作動可能に連結される。イントロン配列は、天然の配列の第1のイントロン/エクソンスプライスジャンクションのポイントから始まる配列から構成されてもよく、転写および結果として生じる転写物の適切なプロセシングを促進するために、適切なイントロン/エクソンプロセシングをもたらすように、第2のイントロン/エクソンスプライスジャンクションを含む小さなリーダー断片からさらに構成されてもよい。リーダーおよびイントロンは、作動可能に連結された、転写可能なポリヌクレオチド分子の転写および結果として生じる転写されたRNAの翻訳に正に影響を及ぼしてもよい。あらかじめ処理されたRNA分子は、リーダーおよびイントロンを含み、これは、転写RNAの転写後プロセシングおよび/または細胞核から細胞質の中への転写RNA分子の輸出に影響を及ぼしてもよい。転写RNA分子の転写後プロセシングの後に、リーダー配列は、最終的なメッセンジャーRNAの一部として保持されてもよく、メッセンジャーRNA分子の翻訳に正に影響を及ぼしてもよい。
プロモーター、リーダー、イントロン、および転写終結領域などの調節エレメントは、生細胞において遺伝子調節活性を有し、遺伝子の全体的な発現において欠くことのできない役割を果たすDNA分子である。用語「調節エレメント」は、遺伝子調節活性を有するDNA分子、すなわち、作動可能に連結された、転写可能なポリヌクレオチド分子の転写および/または翻訳に影響を及ぼす能力を有するDNA分子を指す。植物において機能する、プロモーターおよびリーダーなどの単離された調節エレメントは、そのため、遺伝子工学の方法を通して植物表現型を修飾するのに有用である。
調節エレメントは、それらの発現パターンの効果(定性的におよび/または定量的に)、たとえばそれらの時間的、空間的、発生的、組織、環境的、生理学的、病理学的、細胞周期、および/もしくは化学的に応答性の発現パターンならびにその任意の組み合わせによってならびに定量的または定質的指標によってなどのように、正のもしくは負の効果および/または構成的なもしくは他の効果によって特徴付けられてもよい。プロモーターは、作動可能に連結された、転写可能なポリヌクレオチド分子の発現を調整するための調節エレメントとして有用である。
本明細書において使用されるように、「遺伝子発現パターン」は、作動可能に連結されたDNA分子の、転写RNA分子への任意のパターンの転写である。転写RNA分子は、タンパク質分子を生成するように翻訳されてもよいまたはdsRNA、tRNA、rRNA、miRNA、およびその他同種のものなどのアンチセンスまたは他の調節RNA分子をもたらしてもよい。
本明細書において使用されるように、用語「タンパク質発現」は、転写RNA分子の、タンパク質分子への、任意のパターンの翻訳である。タンパク質発現は、その時間的、空間的、発生的、または形態的性質によっておよび定量的または定質的指標によって特徴付けられてもよい。
本明細書において使用されるように、用語「プロモーター」は、一般に、転写を開始するために、RNAポリメラーゼIIおよび他のタンパク質(トランス作用性転写因子)の認識および結合に関与するDNA分子を指す。プロモーターは、遺伝子のゲノムコピーの5’非翻訳領域(5’UTR)から最初に単離されてもよい。その代わりに、プロモーターは、合成的に生成されてもよいまたは操作されたDNA分子であってもよい。プロモーターはまた、キメラ、すなわち、2つ以上の異種DNA分子の融合を通して生成されたプロモーターであってもよい。本発明を実施するのに有用なプロモーターは、配列番号2、6、8、10、12、163、および169のいずれかまたは配列番号13〜199、211、および212のいずれかまたはその断片もしくはバリアント内に構成されるプロモーターエレメントを含む。本発明の特定の実施形態において、本明細書において記載されているそのような分子および任意のバリアントまたはその誘導体が、プロモーター活性を含むとしてさらに定義される、すなわち、トランスジェニック植物においてなどのように、宿主細胞においてプロモーターとして働くことができる。さらに特定の実施形態において、断片が、それが由来する出発プロモーター分子が持つプロモーター活性を示すとして定義されてもよいまたは断片が、基本レベルの転写をもたらし、転写の開始のためのRNAポリメラーゼII複合体の認識および結合のためのTATAボックスもしくは等価な配列から構成される「最小限のプロモーター」を含んでいてもよい。
一実施形態において、プロモーター分子の断片が、提供される。プロモーター断片は、上記に記載されているように、プロモーター活性をもたらし、単独でまたはキメラプロモーターを構築する際などのように、他のプロモーターおよびプロモーター断片と組み合わせて有用であってもよい。特定の実施形態において、本明細書において開示されるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド分子の少なくとも約50、95、150、250、500、750、または少なくとも約1000以上の連続ヌクレオチドを含むプロモーターの断片が提供される。
配列番号2、6、8、10、12、163、および169として示されるプロモーターまたはたとえば内部欠失もしくは5’欠失などの、配列番号13〜199、211、および212内に構成されるプロモーターエレメントのいずれかに由来する組成物は、発現に対して正の効果もしくは負の効果を有するエレメントを除去すること;発現に対して正の効果もしくは負の効果を有するエレメントを重複させること;および/または発現に対して、組織もしくは細胞特異的な効果を有するエレメントを重複させるもしくは除去することを含めて、発現を改善するまたは改変するために生成することができる。配列番号2、6、8、10、12、163、および169として示されるプロモーターまたはTATAボックスエレメントまたはその等価な配列および下流の配列が除去されている3’欠失から構成される配列番号13〜199、211、および212内に構成されるプロモーターエレメントのいずれかに由来する組成物は、たとえば、エンハンサーエレメントを作製するために使用することができる。さらなる欠失は、発現に対して正のもしくは負の;組織特異的な;細胞特異的な;またはタイミング特異的な(これに限定されないが概日リズムなど)効果を有する任意のエレメントを除去するように作製することができる。配列番号2、6、8、10、12、163、および169として示されるプロモーターまたは配列番号13〜199、211、および212内に構成されるプロモーターエレメントならびにそれに由来する断片またはエンハンサーのいずれかは、他のエンハンサーならびにプロモーターに作動可能に連結された、配列番号2、6、8、10、12、163、および169として示されるプロモーターまたは配列番号13〜199、211、および212内に構成されるプロモーターエレメントならびにそれに由来する断片またはエンハンサーのいずれかから構成されるキメラ転写調節エレメント組成物を作製するために使用することができる。特定の導入遺伝子の所望の発現の側面に対する、本明細書において記載されている修飾、重複、または欠失の有効性は、作製された変化および出発分子中の変化の目標に依存して変化し得る結果を検証するために、本明細書における効果的な実施例において記載されているものなどの、安定した一時的な植物アッセイにおいて実験的に試験されてもよい。
本明細書において使用されるように、用語「リーダー」は、遺伝子のゲノムコピーの非翻訳5’領域(5’UTR)から単離され、転写開始部位(TSS)およびタンパク質コード配列開始部位の間のヌクレオチドセグメントとして一般に定義されるDNA分子を指す。その代わりに、リーダーは、合成的に生成されたまたは操作されたDNAエレメントであってもよい。リーダーは、作動可能に連結された転写可能なポリヌクレオチド分子の発現を調整するための5’調節エレメントとして使用することができる。リーダー分子は、異種プロモーターまたはそれらの天然のプロモーターと共に使用されてもよい。本発明のプロモーター分子は、したがって、それらの天然のリーダーに作動可能に連結されてもよいまたは異種リーダーに作動可能に連結されてもよい。本発明を実施するのに有用なリーダーは、配列番号3、164、166、および170または配列番号13〜199、211、および212内に構成されるリーダーエレメントまたはその断片もしくはバリアントを含む。特定の実施形態において、そのような配列が、たとえば、トランスジェニック植物細胞を含む宿主細胞においてリーダーとして作用することができるとして提供され、定義されてもよい。一実施形態において、そのような配列が、リーダー活性を含むと解読される。
配列番号3、164、166、および170として示されるリーダー配列(5’UTR)または配列番号13〜199、211、および212のいずれかの内に構成されるリーダーエレメントは、調節エレメントから構成されてもよいまたは導入遺伝子の転写もしくは翻訳に対して効果を有する二次構造を採用してもよい。配列番号3、164、166、および170として示されるリーダー配列または配列番号13〜199、211、および212内に構成されるリーダーエレメントは、導入遺伝子の転写または翻訳に影響を及ぼすキメラ調節エレメントを作製するために、本発明に従って使用することができる。さらに、配列番号3、164、166、および170として示されるリーダー配列または配列番号13〜199、211、および212のいずれかの内に構成されるリーダーエレメントは、導入遺伝子の転写または翻訳に影響を及ぼすキメラリーダー配列を作製するために使用することができる。
新しい植物宿主の中への外来遺伝子の導入は、必ずしも、入って来る遺伝子の高度な発現をもたらすとは限らない。さらに、複雑な形質を扱う場合、空間的にまたは時間的に異なる発現パターンを有するいくつかの遺伝子を調整することが時々必要である。イントロンは、主にそのような調整をもたらすことができる。しかしながら、1つのトランスジェニック植物における同じイントロンの複数の使用は、不利益を示すことが示された。それらの場合において、適切な組換えDNAエレメントの構築のための基本的な制御エレメントの集合物を有することが必要である。発現を増強する特性を有する、当技術分野において知られているイントロンの利用可能な集合物が限られているので、他の選択肢が必要とされる。
配列番号4、165、および171として示されるイントロンまたは配列番号13〜199、211、および212内に構成されるイントロンエレメントのいずれかに由来する組成物は、シス調節エレメントの内部欠失もしくは重複の改変から構成することができるならびに/またはイントロン/エクソンスプライスジャンクションを含む5’および3’配列は、プロモーター+リーダーまたはキメラプロモーター+リーダーおよびコード配列に作動可能に連結された場合に、発現または発現の特異性を改善するために使用することができる。イントロン/エクソンスプライスジャンクションを含む5’および3’領域の改変はまた、メッセンジャーRNAのプロセシングおよびスプライシングの後に結果として生じる転写物において生成される間違った開始および終止コドンの導入の可能性を低下させるために成すことができる。イントロンは、導入遺伝子の発現に対するイントロンの効果を決定するために、効果的な実施例において記載されているように、実験的に試験することができる。
本発明に従って、プロモーターまたはプロモーターの断片は、既知のプロモーターエレメント、すなわち、TATAボックスおよび他の既知の転写因子結合部位モチーフなどのDNA配列特徴の存在について分析されてもよい。そのような知られているプロモーターエレメントの特徴は、もとのプロモーターと同様の発現パターンを有するバリアントを設計するために当業者によって使用されてもよい。
本明細書において使用されるように、用語「エンハンサー」または「エンハンサーエレメント」は、全体的な発現パターンのある側面を与えるが、通常、作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を駆動するのに単独では不十分であるシス作用性転写調節エレメント、別名、シスエレメントを指す。プロモーターと異なり、エンハンサーエレメントは、通常、転写開始部位(TSS)もしくはTATAボックスまたは等価な配列を含まない。プロモーターは、作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の転写に影響を及ぼす、1つまたは複数のエンハンサーエレメントを自然に含んでいてもよい。単離されたエンハンサーエレメントはまた、遺伝子発現の全体的な調整の側面を与えるキメラプロモーター.シスエレメントを生成するためにプロモーターに融合されてもよい。プロモーターまたはプロモーターの断片は、作動可能に連結された遺伝子の転写を達成する、1つまたは複数のエンハンサーエレメントを含んでいてもよい。多くのプロモーターエンハンサーエレメントは、DNA結合タンパク質に結合しおよび/またはDNAの形態に影響を及ぼし、DNA鋳型へのRNAポリメラーゼの接近を選択的に可能にするもしくは制限するまたは転写開始の部位での二重らせんの選択的な開口を促進する局所的な立体構造をもたらすと考えられる。エンハンサーエレメントは、転写を調節する転写因子に結合するように機能してもよい。いくつかのエンハンサーエレメントが、2つ以上の転写因子に結合し、転写因子は、2つ以上のエンハンサードメインと様々な親和性で相互作用してもよい。エンハンサーエレメントは、欠失分析、すなわちプロモーターの5’末端または内部から1つまたは複数のヌクレオチドを欠失させること;DNアーゼIフットプリント法を使用するDNA結合タンパク質分析、メチル化干渉、電気泳動移動度シフトアッセイ、ライゲーション媒介性のPCRによるインビボ(in vivo)ゲノムフットプリント法、および他の従来のアッセイを含む、多くの技術によって;またはBLASTなどの従来のDNA配列比較法と共に、標的配列もしくは標的モチーフとして、既知のシスエレメントモチーフもしくはエンハンサーエレメントを使用するDNA配列類似性分析によって同定することができる。エンハンサードメインの微細構造は、1つまたは複数のヌクレオチドの突然変異誘発(もしくは置換)によってまたは他の従来の方法によってさらに研究することができる。エンハンサーエレメントは、化学合成によってまたはそのようなエレメントを含む調節エレメントからの単離によって得ることができ、それらは、続く操作を促進するのに有用な制限酵素部位を含有する、さらなる、側面に位置するヌクレオチドと共に合成することができる。したがって、作動可能に連結された転写可能なポリヌクレオチド分子の発現を調整するための、本明細書において開示される方法によるエンハンサーエレメントの設計、構築、および使用が、本発明によって包含される。
植物において、遺伝子コンストラクトにおけるいくつかのイントロンの包含は、イントロンを欠くコンストラクトに比べて、mRNAの増加およびタンパク質蓄積につながる。この効果は、遺伝子発現の「イントロン媒介性の増強」(IME)と称された[Mascarenhas et al., (1990) Plant Mol. Biol. 15:913−920]。植物における発現を刺激することが知られているイントロンは、とうもろこし遺伝子において[たとえばtubA1、Adh1、Sh1、Ubi1(Jeon et al. (2000) Plant Physiol. 123:1005−1014;Callis et al. (1987) Genes Dev. 1:1183−1200;Vasil et al. (1989) Plant Physiol. 91:1575−1579;Christiansen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675−689]およびイネ遺伝子において[たとえばsalt、tpi:McElroy et al., Plant Cell 2:163−171 (1990);Xu et al., Plant Physiol. 106:459−467 (1994)]、同定された。同様に、ツクバネアサガオ(たとえばrbcS)、ジャガイモ(たとえばst−ls1)由来のならびにシロイヌナズナ(たとえばubq3およびpat1)由来のもののような双子葉植物遺伝子由来のイントロンは、遺伝子発現率を上昇させることが分かった[Dean et al. (1989) Plant Cell 1:201−208;Leon et al. (1991) Plant Physiol. 95:968−972;Norris et al. (1993) Plant Mol Biol 21:895−906;Rose and Last (1997) Plant J.11:455−464]。イントロンのスプライス部位内の欠失または突然変異が遺伝子発現を低下させることが示され、スプライシングがIMEに必要とされるかもしれないことを示した[Mascarenhas et al. (1990) Plant Mol Biol. 15:913−920;Clancy and Hannah (2002) Plant Physiol. 130:918−929]。しかしながら、スプライシングがそれ自体、双子葉植物におけるあるIMEについて必要とされないことが、シロイヌナズナ由来のpat1遺伝子のスプライス部位内の点突然変異によって示された[Rose and Beliakoff (2000) Plant Physiol. 122:535−542]。
組換え発現カセットの中へのいくつかのイントロン挿入が、発現を増強しないので、イントロンによる遺伝子発現の増強は、一般的な現象ではない[たとえば、双子葉植物遺伝子(エンドウマメ由来のrbcS遺伝子、マメ由来のファゼオリン遺伝子、およびジャガイモ由来のstls−1遺伝子)由来のイントロンならびにとうもろこし遺伝子由来のイントロン (adh1遺伝子、第9のイントロンおよびhsp81遺伝子、第1のイントロン)][Chee et al. (1986) Gene 41:47−57;Kuhlemeier et al. (1988) Mol Gen Genet 212:405−411;Mascarenhas et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:913−920;Sinibaldi and Mettler (1992) In WE Cohn, K Moldave, eds, Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, Vol 42. Academic Press, New York, pp 229−257;Vancanneyt et al. 1990 Mol. Gen. Genet. 220:245−250]。そのため、トランスジェニック植物における非内因性遺伝子または内因性遺伝子の遺伝子発現レベルを操作するためにそれぞれのイントロンを用いることができない。所定の遺伝子の発現率を増強するためにどの特徴または特異的配列の特徴がイントロン配列中に存在しなければならないかは、先行技術において知られておらず、そのため、先行技術から所定の植物イントロンが、異種で使用された場合に、IMEを引き起こすかどうかを予測することは可能ではない。
本明細書において使用されるように、用語「キメラ」は、第1のDNA分子を第2のDNA分子に融合させることによって生成された単一のDNA分子を指し、第1のDNA分子も、第2のDNA分子も、通常、その立体配置で見出されないであろう、すなわち、他のものに融合されているであろう。キメラDNA分子は、したがって、自然界において他の場合に通常見出されない新しいDNA分子である。本明細書において使用されるように、用語「キメラプロモーター」は、DNA分子のそのような操作を通して生成されたプロモーターを指す。キメラプロモーターは、2つ以上のDNA断片を組み合わせてもよい;例として、エンハンサーエレメントに対するプロモーターの融合があるであろう。したがって、作動可能に連結された転写可能なポリヌクレオチド分子の発現を調整するための、本明細書において開示される方法によるキメラプロモーターの設計、構築、および使用が、本発明によって包含される。
本明細書において使用されるように、用語「バリアント」は、組成が同様であるが、第1のDNA分子と同一でない第2のDNA分子を指すが、第2のDNA分子はなお、第1のDNA分子の、一般的な機能性、すなわち同じまたは同様の発現パターンを維持する。バリアントは、異なる制限酵素部位ならびに/または内部欠失、置換、および/もしくは挿入を有するものなどの、第1のDNA分子のより短いもしくは切断型バージョンならびに/または第1のDNA分子の配列の改変バージョンであってもよい。「バリアント」はまた、参照配列の1つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失、および/または挿入を含むヌクレオチド配列を有する調節エレメントを包含することができ、誘導体調節エレメントが、対応する親調節分子よりも高いもしくは低いまたは等価な転写または翻訳活性を有する。調節エレメント「バリアント」はまた、細菌および植物細胞形質転換において天然に存在する突然変異から生じるバリアントを包含してもよい。本発明において、配列番号1〜199、211、および212として提供されるポリヌクレオチド配列は、なお一般的な機能性、すなわち、もとの調節エレメントと同じまたはそれと同様の発現パターンを維持しながら、組成が同様であるが、もとの調節エレメントのポリヌクレオチド配列と同一でないバリアントを作出するために使用されてもよい。本発明のそのようなバリアントの生成は、本開示に照らして当技術分野の通常の技術の範囲内に十分にあり、本発明の範囲内に包含される。キメラ調節エレメントの「バリアント」は、参照キメラ調節エレメント配列と同じ構成エレメントを含むが、キメラ調節エレメントを含む構成エレメントは、制限酵素消化およびライゲーション、ライゲーション非依存性クローニング、増幅の間のPCR産物のモジュールアセンブリー、またはキメラ調節エレメントの直接的な化学合成および当技術分野において知られている他の方法などの、当技術分野において知られている様々な方法によって適切に作用するように連結されてもよい。結果として生じる「バリアント」キメラ調節エレメントは、参照配列と同じ構成エレメントまたは同じ構成エレメントのバリアントから構成されるが、構成エレメントを作動可能に連結するために使用される配列(複数可)が異なる。本発明において、配列番号1〜199、211、および212として提供されるポリヌクレオチド配列は、それぞれ、参照配列を提供し、参照配列の構成エレメントが、当技術分野において知られている方法によってつながれてもよく、細菌および植物細胞形質転換において天然に存在する1つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失、および/もしくは挿入または突然変異からなってもよい。
コンストラクト
本明細書において使用されるように、用語「コンストラクト」は、1つまたは複数のポリヌクレオチド分子が、機能的に適切に作用する方式で連結された、すなわち、作動可能に連結されたポリヌクレオチド分子を含む、ゲノム統合または自己複製が可能な、任意の供給源に由来する、プラスミド、コスミド、ウイルス、自己複製ポリヌクレオチド分子、ファージ、または線状もしくは環状一本鎖もしくは二本鎖DNAもしくはRNAポリヌクレオチド分子などの、任意の組換えポリヌクレオチド分子を意味する。本明細書において使用されるように、用語「ベクター」は、形質転換、すなわち、宿主細胞の中への異種DNAの導入の目的で使用されてもよい、任意の組換えポリヌクレオチドコンストラクトを意味する。用語は、前述の分子のいずれかから単離された発現カセットを含む。
本明細書において使用されるように、用語「作動可能に連結された」は、第2の分子につながれた第1の分子を指し、分子は、第1の分子が、第2の分子の機能に影響を及ぼすように配置される。2つの分子は、単一の連続分子の一部であってもよくまたはなくてもよく、隣接してもよいまたは隣接しなくてもよい。たとえば、プロモーターが細胞において興味のある、転写可能なポリヌクレオチド分子の転写を調整する場合、プロモーターは、転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている。リーダーは、たとえば、それがコード配列によってコードされるポリペプチドについてのリーダーとして働くことができる場合、コード配列に作動可能に連結されている。
本発明のコンストラクトは、一実施形態において、A.tumefaciens細胞によって提供される移入分子と共に、植物細胞のゲノムの中へのT−DNAの統合を可能にするT−DNAを含む、Agrobacterium tumefaciensから単離されたTiプラスミドの右側のボーダー(RbまたはAGRtu.RB)および左側のボーダー(LBまたはAGRtu.LB)領域を有する二重TiプラスミドボーダーDNAコンストラクトとして提供されてもよい(たとえば、米国特許第6,603,061号を参照されたい)。コンストラクトはまた、細菌細胞における複製機能および抗生物質選択をもたらすプラスミド骨格DNAセグメント、たとえば、ori322などのEscherichia coli複製開始点、oriVまたはoriRiなどの広宿主域複製開始点、およびスペクチノマイシンもしくはストレプトマイシンに対する抵抗性を付与するTn7アミノグリコシドアデニルトランスフェラーゼ(aadA)をコードする、Spec/Strpなどの選択マーカーまたはゲンタミシン(Gm、Gent)選択マーカー遺伝子についてのコード領域を含有してもよい。植物形質転換のために、宿主細菌株は、多くの場合、A.tumefaciens ABI、C58、またはLBA4404であるが、しかしながら、植物形質転換について当技術分野において知られている他の株が、本発明において機能することができる。
方法は、転写可能なポリヌクレオチド分子がタンパク質産物として翻訳され、発現される機能的なmRNA分子に転写されるように、コンストラクトをアセンブルし、細胞の中に導入するのに利用可能である。本発明の実施のために、たとえば、コンストラクトおよび宿主細胞を調製し、使用するための従来の組成物および方法は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition Volumes 1, 2, and 3 (2000) J.F. Sambrook, D.W. Russell, and N. Irwin, Cold Spring Harbor Laboratory Pressにおいて見出すことができる。植物形質転換に特に適した組換えベクターを作製するための方法は、限定を伴うことなく、全体的に、米国特許第4,971,908号;第4,940,835号;第4,769,061号;および第4,757,011号において記載されているものを含む。これらのタイプのベクターはまた、科学文献においても概説されている[たとえばRodriguez, et al., Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston, (1988)およびGlick, et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton, FL. (1993)を参照されたい]。高等植物における核酸の発現に有用な典型的なベクターは、当技術分野においてよく知られており、Agrobacterium tumefaciensの腫瘍誘発(Ti)プラスミドに由来するベクターを含む[Rogers, et al., Methods in Enzymology 153: 253−277 (1987)]。pCaMVCN移入制御ベクターを含む植物形質転換に有用な他の組換えベクターもまた、科学文献において記載されている[たとえばFromm, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5824−5828 (1985)を参照されたい]。
様々な調節エレメントが、本明細書において提供されるもののいずれかを含むコンストラクトにおいて含まれていてもよい。任意のそのような調節エレメントは、他の調節エレメントと組み合わせて提供されてもよい。そのような組み合わせは、望ましい調節特徴をもたらすように、設計するまたは修飾することができる。一実施形態において、本発明のコンストラクトが、3’転写終結分子に作動可能に連結された、転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結された、少なくとも1つの調節エレメントを含む。
本発明のコンストラクトは、本明細書において提供されるまたは当技術分野において知られている任意のプロモーターまたはリーダーを含んでもよい。たとえば、本発明のプロモーターは、熱ショックタンパク質遺伝子に由来するものなどの、異種非翻訳5’リーダーに作動可能に連結されてもよい(たとえば米国特許第5,659,122号および第5,362,865号を参照されたい)。その代わりに、本発明のリーダーは、カリフラワーモザイクウイルス35S転写物プロモーターなどの異種プロモーターに作動可能に連結されてもよい(米国特許第5,352,605号を参照されたい)。異種エレメントのそのような作動可能な連結によって与えられる発現特性は、必ずしも、それぞれのプロモーターおよびリーダーの解明された特性が付加されたものではなく、むしろ、作動可能に連結された異種プロモーターおよびリーダーによって駆動される発現についての実験による分析を通して決定される。
本明細書において使用されるように、用語「イントロン」は、遺伝子のゲノムコピーから単離されてもよくまたは同定されてもよく、翻訳前のmRNAプロセシングの間にスプライスされた領域として一般に定義されてもよいDNA分子を指す。その代わりに、イントロンは、合成的に生成されてもよいまたは操作されたDNAエレメントであってもよい。イントロンは、作動可能に連結された遺伝子の転写をもたらすエンハンサーエレメントを含有してもよい。イントロンは、作動可能に連結された、転写可能なポリヌクレオチド分子の発現を調整するための調節エレメントとして使用されてもよい。DNAコンストラクトは、イントロンを含んでいてもよく、イントロンは、転写可能なポリヌクレオチド分子配列と比較して、異種ものであってもよいまたはなくてもよい。当技術分野におけるイントロンの例は、イネアクチンイントロン(米国特許第5,641,876号)およびトウモロコシHSP70イントロン(米国特許第5,859,347号)を含む。本発明を実施するのに有用なイントロンは、配列番号4、165、および171または配列番号13〜199、211、および212のいずれかの内に構成されるイントロンエレメントを含む。
本明細書において使用されるように、用語「3’転写終結分子」または「3’UTR」は、mRNA分子の3’非翻訳領域(3’UTR)を生成するために転写の間に使用されるDNA分子を指す。mRNA分子の3’非翻訳領域は、特異的な切断および3’ポリアデニル化(別名、polyAテール)によって生成されてもよい。3’UTRは、転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されてもよく、その下流に位置してもよく、ポリアデニル化シグナルおよび転写、mRNAプロセシング、または遺伝子発現に影響を及ぼすことができる他の調節シグナルを提供するポリヌクレオチドを含んでいてもよい。polyAテールは、mRNAの安定性および翻訳の開始において機能すると考えられる。3’転写終結分子の例は、ノパリンシンターゼ3’領域[Fraley, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 4803−4807 (1983)を参照されたい];コムギhsp17 3’領域;エンドウマメrubisco小サブユニット3’領域;ワタE6 3’領域(米国特許第6,096,950号);WO0011200A2において開示される3’領域;およびcoixin 3’UTR(米国特許第6,635,806号)である。
3’UTRは、典型的に、特異的な遺伝子の組換え発現に有益な使用を見出す。動物系において、3’UTRの機構は、十分に定義されている[たとえばZhao et al., Microbiol Mol Biol Rev 63:405−445 (1999);Proudfoot, Nature 322:562−565 (1986);Kim et al., Biotechnology Progress 19:1620−1622 (2003);Yonaha and Proudfoot, EMBO J. 19:3770−3777 (2000);Cramer et al., FEBS Letters 498:179−182 (2001);Kuerstem and Goodwin, Nature Reviews Genetics 4:626−637 (2003)]。RNA転写の有効な終結は、形質の性能に干渉し得る、形質に無関係な(下流)配列の望まれない転写を予防するために必要とされる。互いに局所的に近接して複数の遺伝子発現カセットを配置することは(たとえば1つのT−DNA内で)、非依存性の挿入と比較して、前記コンストラクトにおける1つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現の抑制をもたらし得る[Padidam and Cao, BioTechniques 31:328−334 (2001)。これは、たとえば、すべてのカセットからの強力な遺伝子発現が所望される場合に、適切なレベルの発現の達成に干渉し得る。
植物において、明確に定義されたポリアデニル化シグナル配列は、知られていない。Hasegawa et al., Plant J. 33:1063−1072, (2003)]は、ニコチアナ シルベストリスにおいてインビトロ(in vitro)およびインビボ系において保存ポリアデニル化シグナル配列を同定することができず、一次(非ポリアデニル化)転写物の実際の長さを決定することができなかった。弱い3’UTRは、リードスルーを生じさせる可能性を有し、これは、近隣の発現カセットに位置する遺伝子の発現に影響を及ぼし得る[Padidam and Cao, BioTechniques 31:328−334 (2001)]。転写終結の適切な制御は、下流に配置する配列(たとえば他の発現カセット)へのリードスルーを予防することができ、RNAポリメラーゼの効率的な再利用をさらに可能にし、遺伝子発現を改善することができる。転写の効率的な終結(DNAからのRNAポリメラーゼIIの放出)は、転写の再開に必須であり、それによって、全体的な転写レベルに直接影響を及ぼす。転写終結に続いて、成熟mRNAは、合成の部位および鋳型から細胞質に放出される。真核生物のmRNAは、poly(A)形態としてインビボにおいて蓄積され、その結果、従来の方法によって転写終結部位を検出するのは困難となる。しかしながら、バイオインフォマティクスの方法による機能的で効率的な3’UTRの予測は、有効な3’UTRの容易な予測を可能にする保存配列がないという点で困難である。
実際的見地から、導入遺伝子カセットにおいて使用される3’UTRが、以下の特徴を有することが典型的に有益である。3’UTRは、導入遺伝子の転写を効率的にかつ有効に終結することができ、かつ1つのT−DNA中に存在する複数のカセットの場合のように他の導入遺伝子カセットから構成され得る任意の近隣DNA配列またはT−DNAが挿入された近隣染色体DNAへの転写のリードスルーを予防するべきである。3’UTRは、導入遺伝子の発現を駆動するために使用されるプロモーター、リーダー、およびイントロンによって与えられる転写活性における低下を引き起こすべきでない。植物バイオテクノロジーにおいて、3’UTRは、多くの場合、形質転換植物から抽出された逆転写RNAの増幅反応の始動に使用され、また、(1)植物染色体の中に一度統合された導入遺伝子カセットの転写活性または発現を評価する;(2)植物DNA内の挿入のコピー数を評価する;および(3)育種の後に結果として生じる種子の接合性を評価するのに使用される。3’UTRはまた、挿入されたカセットが完全であることを特徴付けるために形質転換植物から抽出されたDNAの増幅反応において使用される。
植物における導入遺伝子の発現を提供するのに有用な3’UTRは、アワ[セタリア イタリカ(L.) Beauv]に由来する種子、花、および他の組織から単離されたメッセンジャーRNAから作製されたcDNAライブラリーにおいて発現配列タグ(EST)の発現に基づいて同定されてもよい。cDNAのライブラリーは、花組織、種子、葉、および根を使用して、選択された植物種から単離された組織から作製される。結果として生じるcDNAは、様々な配列決定方法を使用して配列決定される。結果として生じるESTは、clc_ref_assemble_complete version 2.01.37139(CLC bio USA、Cambridge、Massachusetts 02142)などのバイオインフォマティクスソフトウェアを使用して、クラスターにアセンブルされる。それぞれのクラスターの転写物存在量は、それぞれのクラスターについてcDNA読み取りの数を数えることによって決定される。同定された3’UTRは、cDNA配列に由来する配列およびゲノムDNAに由来する配列から構成されてもよい。cDNA配列は、プライマーを設計するために使用され、これらは、その後、より長い終結配列をもたらすために、対応するゲノムDNA配列の3’領域をクローニングするためにメーカーのプロトコールに従って構築されたGenomeWalker(商標)(Clontech Laboratories, Inc、Mountain View、CA)ライブラリーと共に使用される。それぞれの組織ライブラリーについての観察された配列読み取りの直接的なカウントまたは標準化されたカウントによる相対的な転写物存在量の分析は、発現のパターンについて特性を推測するために使用することができる。たとえば、いくつかの3’UTRは、葉に対立するものとして根組織においてより高度な存在量で見られた転写物において見出されてもよい。これは、転写物が、根において高度に発現され、根発現の特性が、プロモーター、リード、イントロン、または3’UTRの転写調節に起因し得ることを示唆する。特異的な器官、組織、または細胞型内の発現の特性によって同定される3’UTRの実験による試験は、それらの特異的な器官、組織、または細胞型における発現を増強する3’UTRの特徴をもたらすことができる。
コンストラクトおよびベクターはまた、タンパク質産物を、特に葉緑体、白色体、もしくは他の色素体細胞小器官;ミトコンドリア;ペルオキシソーム;液胞;または細胞外の位置に向けるのに有用である、連結ペプチドを発現する輸送ペプチドコード配列を含んでいてもよい。葉緑体輸送ペプチドの使用の記載については、米国特許第5,188,642号および米国特許第5,728,925号を参照されたい。多くの葉緑体局在化タンパク質は、前駆体として、核内遺伝子から発現され、葉緑体輸送ペプチド(CTP)によって葉緑体に向けられる。そのような単離緑葉タンパクの例は、リブロース−1,5,−ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニット(SSU)、フェレドキシン、フェレドキシンオキシドレダクターゼ、集光性複合体(light harvesting complex)タンパク質Iおよびタンパク質II、チオレドキシンF、エノールピルビルシキミ酸リン酸シンターゼ(EPSP)、ならびに米国特許第7,193,133号において記載されている輸送ペプチドと関連するものを含むが、これらに限定されない。非緑葉タンパク質が、異種CTPとのタンパク質融合物の使用によって葉緑体に向けられるかもしれないことおよびCTPが、葉緑体にタンパク質を向けるのに十分であることがインビボおよびインビトロにおいて実証された。シロイヌナズナEPSP CTP(CTP2)[Klee et al., Mol. Gen. Genet. 210:437−442 (1987)を参照されたい]またはペチュニアEPSP CTP(CTP4)[della−Cioppa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6873−6877 (1986)を参照されたい]などの適した葉緑体輸送ペプチドの組み込みは、トランスジェニック植物において葉緑体に異種EPSPタンパク質配列を向けることが示された(米国特許第5,627,061号;第5,633,435号;および第5,312,910号ならびにEP 0218571;EP 189707;EP 508909;およびEP 924299を参照されたい)。
転写可能なポリヌクレオチド分子
本明細書において使用されるように、用語「転写可能なポリヌクレオチド分子」は、タンパク質コード配列を有するものおよび遺伝子抑制に有用な配列を有するRNA分子を生成するものを含むが、これらに限定されない、RNA分子に転写可能な任意のDNA分子を指す。「導入遺伝子」は、少なくともゲノムにおけるその位置に関して宿主細胞に対して異種の転写可能なポリヌクレオチド分子および/または細胞の現世代もしくは任意の前の世代の宿主細胞のゲノムの中に人工的に組み込まれた転写可能なポリヌクレオチド分子を指す。
本発明のプロモーターは、プロモーター分子に関して異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されてもよい。本明細書において使用されるように、そのような組み合わせが通常自然界において見出されない場合、用語「異種の」は、2つ以上のポリヌクレオチド分子の組み合わせを指す。たとえば、2つの分子は、異なる種に由来してもよいおよび/または2つの分子は、異なる遺伝子、たとえば、同じ種由来の異なる遺伝子もしくは異なる種由来の同じ遺伝子に由来してもよい。プロモーターは、したがって、そのような組み合わせが通常自然界において見出されない場合、作動可能に連結された転写可能なポリヌクレオチド分子に関して、異種である、すなわち、その転写可能なポリヌクレオチド分子は、そのプロモーター分子と組み合わせて作動可能に連結されて天然に存在していない。
転写可能なポリヌクレオチド分子は、一般に、RNA転写物の発現が所望される任意のDNA分子であってもよい。RNA転写物のそのような発現は、結果として生じるmRNAの分子、したがってタンパク質発現の翻訳をもたらしてもよい。その代わりに、たとえば、転写可能なポリヌクレオチド分子は、特異的な遺伝子またはタンパク質の発現の減少を最終的に引き起こすように設計されてもよい。一実施形態において、これは、アンチセンス方向に方向づけられた、転写可能なポリヌクレオチド分子を使用することによって達成されてもよい。手短に言えば、アンチセンスの転写可能なポリヌクレオチド分子が転写されると、RNA産物は、細胞の内部で相補的RNA分子にハイブリダイズし、捕捉する。この二重鎖RNA分子は、細胞の翻訳機構によってタンパク質に翻訳することができず、細胞において分解される。任意の遺伝子が、このように負に調節されてもよい。
したがって、本発明の一実施形態は、コンストラクトが植物細胞のゲノムに統合された場合に、所望のレベルでまたは所望のパターンで、転写可能なポリヌクレオチド分子の転写を調整するように、転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結された、配列番号1〜199、211、および212として提供されるものなどの、本発明の調節エレメントである。一実施形態において、転写可能なポリヌクレオチド分子が、遺伝子のタンパク質コード領域を含み、プロモーターが、タンパク質産物として翻訳され、発現されるRNA分子の転写に影響を及ぼす。他の実施形態において、転写可能なポリヌクレオチド分子が、遺伝子のアンチセンス領域を含み、プロモーターが、標的宿主細胞において興味のある特異的なRNA分子の発現を阻害するように、アンチセンスRNA分子、二本鎖RNA、または他の類似する阻害性のRNA分子の転写に影響を及ぼす。
農学的に重要な遺伝子
転写可能なポリヌクレオチド分子は、農学的に重要な遺伝子であってもよい。本明細書において使用されるように、用語「農学的に重要な遺伝子」は、特定の植物組織、細胞、または細胞型において発現された場合に、植物形態、生理機能、成長、発生、収量、産物、栄養プロファイル、病気もしくは病虫害抵抗性、および/または環境的なもしくは化学的な耐性と関連するなどの望ましい特徴を与える、転写可能なポリヌクレオチド分子を指す。農学的に重要な遺伝子は、収量タンパク質、ストレス抵抗性タンパク質、発生制御タンパク質、組織分化タンパク質、分裂組織タンパク質、環境応答性タンパク質、老化タンパク質、ホルモン応答性タンパク質、脱離タンパク質、ソースタンパク質、シンクタンパク質、花制御タンパク質、種子タンパク質、除草剤抵抗性タンパク質、耐病性タンパク質、脂肪酸生合成酵素、トコフェロール生合成酵素、アミノ酸生合成酵素、殺虫性タンパク質、または抑制のための特定の遺伝子を標的にするアンチセンスもしくはRNAi分子などの任意の他の作用物質をコードするものを含むが、これらに限定されない。農学的に重要な遺伝子の産物は、植物生理機能または代謝に対する効果を引き起こすように植物内で作用してもよいまたは植物をえさとする有害生物の食餌において殺虫剤として作用してもよい。
本発明の一実施形態において、本発明のプロモーターが、プロモーターが農学的に重要な遺伝子である転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されるように、コンストラクトの中に組み込まれる。農学的に重要な遺伝子の発現は、農業経済学的に有益な形質を与えるのに望ましい。有益な農業形質は、たとえば、除草剤耐性、昆虫防除、改良された収量、菌類病抵抗性、ウイルス抵抗性、線虫抵抗性、細菌病抵抗性、植物成長および発生、デンプン産生、改良された油産生、高度な油産生、改良された脂肪酸含有量、高タンパク質産生、果実成熟、動物およびヒトに対する栄養の増強、生体高分子、環境ストレス抵抗性、医薬ペプチドおよび分泌性ペプチド、改善されたプロセシング形質、改善された消化率、酵素産生、風味、窒素固定、ハイブリッド種子産生、繊維産生、ならびにバイオ燃料産生であってもよいが、これらに限定されない。農学的に重要な遺伝子の例は、除草剤抵抗性(米国特許第第6,803,501号;第6,448,476号;第6,248,876号;第6,225,114号;第6,107,549号;第5,866,775号;第5,804,425号;第5,633,435号;および第5,463,175号)、収量の増加(米国特許第USRE38,446号;第6,716,474号;第6,663,906号;第6,476,295号;第6,441,277号;第6,423,828号;第6,399,330号;第6,372,211号;第6,235,971号;第6,222,098号;および第5,716,837号)、昆虫防除(米国特許第6,809,078号;第6,713,063号;第6,686,452号;第6,657,046号;第6,645,497号;第6,642,030号;第6,639,054号;第6,620,988号;第6,593,293号;第6,555,655号;第6,538,109号;第6,537,756号;第6,521,442号;第6,501,009号;第6,468,523号;第6,326,351号;第6,313,378号;第6,284,949号;第6,281,016号;第6,248,536号;第6,242,241号;第6,221,649号;第6,177,615号;第6,156,573号;第6,153,814号;第6,110,464号;第6,093,695号;第6,063,756号;第6,063,597号;第6,023,013号;第5,959,091号;第5,942,664号;第5,942,658号、第5,880,275号;第5,763,245号;および5,763,241号)、菌類病抵抗性(米国特許第6,653,280号;第6,573,361号;第6,506,962号;第6,316,407号;第6,215,048号;第5,516,671号;第5,773,696号;第6,121,436号;第6,316,407号;および第6,506,962号)、ウイルス抵抗性(米国特許第6,617,496号;第6,608,241号;第6,015,940号;第6,013,864号;第5,850,023号;および第5,304,730号)、線虫抵抗性(米国特許第6,228,992号)、細菌病抵抗性(米国特許第5,516,671号)、植物成長および発生(米国特許第6,723,897号および第6,518,488号)、デンプン産生(米国特許第6,538,181号;第6,538,179号;第6,538,178号;第5,750,876号;第6,476,295号)、改良された油産生(米国特許第6,444,876号;第6,426,447号;第6,380,462号)、高度な油産生(米国特許第6,495,739号;第5,608,149号;第6,483,008号;第6,476,295号)、改良された脂肪酸含有量(米国特許第6,828,475号;第6,822,141号;第6,770,465号;第6,706,950号;第6,660,849号;第6,596,538号;第6,589,767号;第6,537,750号;第6,489,461号;第6,459,018号)、高タンパク質産生(米国特許第6,380,466号)、果実成熟(米国特許第5,512,466号)、動物およびヒトに対する栄養の増強、(米国特許第6,723,837号;第6,653,530号;第6,5412,59号;第5,985,605号;第6,171,640号)、生体高分子(米国特許第USRE37,543号;第6,228,623号;第5,958,745号、および第6,946,588号)、環境ストレス抵抗性(米国特許第6,072,103号)、医薬ペプチドおよび分泌性ペプチド(米国特許第6,812,379号;第6,774,283号;第6,140,075号;第6,080,560号)、改善されたプロセシング形質(米国特許第6,476,295号)、改善された消化率(米国特許第6,531,648号)、低度のラフィノース(米国特許第6,166,292号)、工業用酵素産生(米国特許第5,543,576号)、改善された風味(米国特許第6,011,199号)、窒素固定(米国特許第5,229,114号)、ハイブリッド種子産生(米国特許第5,689,041号)、繊維産生(米国特許第6,576,818号;第6,271,443号;第5,981,834号;第5,869,720号)、ならびにバイオ燃料産生(米国特許第5,998,700号)についてのものを含む。
その代わりに、農学的に重要な遺伝子は、たとえばアンチセンスを介して、内因性遺伝子の遺伝子発現の調整の標的を引き起こすRNA分子(たとえば米国特許第5,107,065号を参照されたい);阻害性のRNA[たとえば、米国特許出願公開第2006/0200878号および第2008/0066206号ならびに米国特許出願第11/974,469号において記載されているような、miRNA、siRNA、トランス作用性siRNA、およびフェーズドsRNA(phased sRNA)媒介性のメカニズムを介しての遺伝子発現の調整を含む「RNAi」];または同時抑制媒介性のメカニズムをコードすることによって、上記に挙げられる植物の特徴または表現型に影響を及ぼすことができる。RNAはまた、所望の内因性mRNA産物を切断するように遺伝子操作された触媒RNA分子(たとえばリボザイムまたはリボスイッチ;たとえばUS 2006/0200878を参照されたい)とすることもできる。したがって、農業経済学的に重要な表現型または興味のある形態変化に影響を及ぼす転写RNA分子をコードする、任意の転写可能なポリヌクレオチド分子は、本発明の実施に有用であってもよい。転写可能なポリヌクレオチド分子が遺伝子抑制を引き起こすことができる分子に転写されるように、細胞の中にコンストラクトを構築し、導入するための方法が、当技術分野において知られている。たとえば、植物細胞における遺伝子発現を調節するためにアンチセンス方向の転写可能なポリヌクレオチド分子を有するコンストラクトを使用する転写後遺伝子抑制は、米国特許第5,107,065号および第5,759,829号において開示され、植物において遺伝子発現を調節するためにセンス方向の転写可能なポリヌクレオチド分子を有するコンストラクトを使用する転写後遺伝子抑制は、米国特許第5,283,184号および第5,231,020号において開示される。植物細胞における転写可能なポリヌクレオチドの発現はまた、植物細胞をえさとする植物有害生物を抑制するために使用することができ、たとえば、鞘翅目の有害生物から単離された組成物(米国特許出願公開US20070124836)および線虫有害生物から単離された組成物(米国特許出願公開US20070250947)がある。有害生物は、節足動物有害生物、線虫有害生物、および真菌または微生物有害生物を含むが、これらに限定されない。本発明のコンストラクトの中への組み込みのための例示的な転写可能なポリヌクレオチド分子は、たとえば、標的種以外の種由来のDNA分子もしくは遺伝子または同じ種に由来するもしくは存在するが、古典的な生殖もしくは育種技術ではなく、遺伝子工学方法によってレシピエント細胞の中に組み込まれる遺伝子を含む。ポリヌクレオチド分子のタイプは、植物細胞中に既に存在するポリヌクレオチド分子、他の植物由来のポリヌクレオチド分子、異なる生物由来のポリヌクレオチド分子、または遺伝子のアンチセンスメッセージを含有するポリヌクレオチド分子などの、外部的に生成されたポリヌクレオチド分子、または導入遺伝子の人工、合成、もしくは他の場合には修飾バージョンをコードするポリヌクレオチド分子を含むが、これらに限定されない。
選択マーカー
本明細書において使用されたように、用語「マーカー」は、その発現またはその欠乏をいくつかの方法においてスクリーニングするまたはスコア化することができる任意の転写可能なポリヌクレオチド分子を指す。本発明の実施における使用のためのマーカー遺伝子は、β−グルクロニダーゼをコードする転写可能なポリヌクレオチド分子(米国特許第5,599,670号において記載されているGUS)、緑色蛍光タンパク質およびそのバリアント(米国特許第5,491,084号および第6,146,826号において記載されているGFP)、抗生物質抵抗性を与えるタンパク質、または除草剤耐性を与えるタンパク質を含むが、これらに限定されない。有用な抗生物質抵抗性マーカーは、カナマイシン(nptII)、ヒグロマイシンB(aph IV)、ストレプトマイシンまたはスペクチノマイシン(aad、spec/strep)、ならびにゲンタマイシン(aac3およびaacC4)に対する抵抗性を与えるタンパク質をコードするものを含む。トランスジェニック植物耐性が実証されており、本発明の方法を適用することができる除草剤は、アミノ−メチル−ホスホン酸、グリフォセート、グルホシネート、スルホニル尿素、イミダゾリノン、ブロモキシニル、デラポン(delapon)、ジカンバ、シクロヘキサンジオン、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害剤、およびイソキサスフルトール(isoxasflutole)除草剤を含むが、これらに限定されない。除草剤耐性に関与するタンパク質をコードする転写可能なポリヌクレオチド分子は、5−エノイルピルビニルシキミ酸−3−リン酸シンターゼをコードする転写可能なポリヌクレオチド分子(米国特許第5,627,061号;第5,633,435号;第6,040,497号;および第5,094,945号において記載されているグリフォセート耐性についてのEPSP);グリフォセートオキシドレダクターゼおよびグリフォセート−N−アセチルトランスフェラーゼをコードする転写可能なポリヌクレオチド分子(米国特許第5,463,175号において記載されているGOX;米国特許出願公開第20030083480号において記載されているGAT、およびジカンバモノオキシゲナーゼ、米国特許出願公開第20030135879号);ブロモキシニルニトリラーゼをコードする転写可能なポリヌクレオチド分子(米国特許第4,810,648号において記載されているブロモキシニル耐性についてのBxn);ノルフルラゾン耐性についてMisawa, et al., Plant Journal 4:833−840 (1993)およびMisawa, et al., Plant Journal 6:481−489 (1994)において記載されているフィトエンデサチュラーゼ(crtI)をコードする転写可能なポリヌクレオチド分子;スルホニル尿素除草剤に対する耐性についてSathasiivan, et al., Nucl. Acids Res. 18:2188−2193 (1990)において記載されているアセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS、別名ALS)をコードする転写可能なポリヌクレオチド分子;ならびにグルホシネートおよびビアラホス耐性についてDeBlock, et al., EMBO Journal 6:2513−2519 (1987)において記載されているbar遺伝子を含むが、これらに限定されない。本発明のプロモーター分子は、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ、グリフォセート抵抗性EPSP、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ヒドロキシフェニルピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ダラポンデハロゲナーゼ、ブロモキシニル抵抗性ニトリラーゼ、アントラニル酸シンターゼ、アリルオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、グリフォセートオキシドレダクターゼ、およびグリフォセート−N−アセチルトランスフェラーゼをコードする、連結された転写可能なポリヌクレオチド分子を発現することができる。
分泌を、形質転換細胞を同定するまたは選択する手段として検出することができる分泌性マーカーをコードする遺伝子もまた、用語「選択マーカー」内に含まれる。例として、抗体相互作用によって同定することができる分泌性抗原またはさらに触媒作用的に検出することができる分泌性酵素をコードするマーカーを含む。選択可能な分泌マーカータンパク質は、多くのクラスに分類され、検出可能な(たとえばELISAによって)小さな拡散性のタンパク質、細胞外溶液において検出可能な、小さな活性酵素(たとえばアルファ−アミラーゼ、ベータ−ラクタマーゼ、ホスフィノトリシントランスフェラーゼ)、または細胞壁中に挿入されるもしくは閉じ込められるタンパク質(伸長の発現単位において見出されるものなどのリーダー配列を含むタンパク質もしくはタバコPR−Sとしても知られているタバコ病原性関連タンパク質など)を含む。他の可能な選択マーカー遺伝子は、当業者らに明らかであり、本発明によって包含される。
細胞形質転換
本発明はまた、転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む形質転換細胞および植物を生成する方法にも関する。
用語「形質転換」は、レシピエント宿主の中への核酸の導入を指す。本明細書において使用されるように、用語「宿主」は、細菌、菌類、または植物を指し、細菌、菌類、または植物の任意の細胞、組織、器官、または子孫を含む。特定の興味のある植物の組織および細胞は、プロトプラスト、カルス、根、塊茎、種子、茎、葉、実生、胚、および花粉を含む。
本明細書において使用されるように、用語「形質転換」は、コンストラクトなどの外来ポリヌクレオチド分子が導入された細胞、組織、器官、または生物を指す。導入されたポリヌクレオチド分子は、導入されたポリヌクレオチド分子が次の子孫に遺伝するように、レシピエント細胞、組織、器官、または生物のゲノムDNAの中に統合されてもよい。「トランスジェニック」または「形質転換」細胞または生物はまた、細胞または生物の子孫および交雑において親としてそのようなトランスジェニック生物を用いる育種プログラムから生成され、外来ポリヌクレオチド分子の存在から結果として生じる、改変された表現型を示す子孫をも含む。用語「トランスジェニック」は、1つまたは複数の異種ポリ核酸分子を含有する細菌、菌類、または植物を指す。
植物細胞の中にポリ核酸分子を導入するための多くの方法がある。方法は、一般に、適した宿主細胞を選択し、組換えベクターにより宿主細胞を形質転換し、形質転換宿主細胞を得る工程を含む。適した方法は、細菌感染(たとえばアグロバクテリウム)、バイナリーバクテリア人工染色体ベクター、DNAの直接的なデリバリー(たとえばPEG媒介性の形質転換、乾燥/阻害媒介性のDNA取込み、エレクトロポレーション、炭化ケイ素繊維による撹拌、およびDNAコーティング粒子の加速などを介して[Potrykus, et al., Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 205 (1991)において概説される]を含む。
任意の形質転換方法は、本発明の1つまたは複数のプロモーターおよび/またはコンストラクトにより宿主細胞を形質転換するために利用されてもよい。宿主細胞は、植物細胞、藻類細胞、藻類、真菌細胞、菌類、細菌細胞、または昆虫細胞などの、任意の細胞または生物であってもよい。好ましい宿主および形質転換細胞は、植物、アスペルギルス、酵母、昆虫、細菌、および藻類由来の細胞を含む。
再生されたトランスジェニック植物は、ホモ接合性のトランスジェニック植物をもたらすために自家受粉することができる。その代わりに、再生されたトランスジェニック植物から得られた花粉は、非トランスジェニック植物、好ましくは農業経済学的に重要な種の自殖系と交雑させてもよい。異なる形質および作物について一般に使用される育種方法の説明は、いくつかの参考図書のうちの1つにおいて見出すことができ、たとえばAllard, Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons, NY, U. of CA, Davis, CA, 50−98 (1960);Simmonds, Principles of crop improvement, Longman, Inc., NY, 369−399 (1979);Sneep and Hendriksen, Plant breeding perspectives, Wageningen (ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation (1979);Fehr, Soybeans: Improvement, Production and Uses, 2nd Edition, Monograph, 16:249 (1987);Fehr, Principles of variety development, Theory and Technique, (Vol. 1) and Crop Species Soybean (Vol 2), Iowa State Univ., Macmillan Pub. Co., NY, 360−376 (1987)を参照されたい。逆に、非トランスジェニック植物由来の花粉は、再生されたトランスジェニック植物を受粉するために使用されてもよい。
形質転換植物は、興味のある遺伝子の存在ならびに本発明の調節エレメントによって与えられた発現レベルおよび/またはプロファイルについて分析されてもよい。当業者らは、形質転換植物の分析に利用可能な多くの方法を知っている。たとえば、植物分析のための方法は、サザンブロットまたはノーザンブロット、PCRベースのアプローチ、生化学的分析、表現型スクリーニング法、フィールド評価、および免疫診断アッセイを含むが、これらに限定されない。転写可能なポリヌクレオチド分子の発現は、TaqMan(登録商標)(Applied Biosystems、Foster City、CA)試薬およびメーカーによって説明される方法およびTaqMan(登録商標) Testing Matrixを使用して決定されるPCRサイクルタイムを使用して測定することができる。その代わりに、Invader(登録商標)(Third Wave Technologies、Madison、WI)試薬およびメーカーによって説明される方法を、導入遺伝子発現に使用することができる。
本発明の植物の種子は、稔性トランスジェニック植物から収集することができ、本発明のコンストラクトを含み、農学的に重要な遺伝子を発現するハイブリッド植物系を含む、本発明の形質転換植物の子孫世代を成長させるために使用することができる。
本発明はまた、本発明の植物の一部分を提供する。植物の一部分は、限定を伴うことなく、葉、茎、根、塊茎、種子、胚乳、胚珠、および花粉を含む。本発明はまた、本発明の核酸分子を含む形質転換植物細胞をも含み、提供する。
トランスジェニック植物は、その子孫にトランスジェニックポリヌクレオチド分子を伝えてもよい。子孫は、祖先の植物に由来する導入遺伝子を含む、任意の再生可能な植物の一部分または種子を含む。トランスジェニック植物は、好ましくは、形質転換されたポリヌクレオチド分子についてホモ接合性であり、有性生殖の結果としてすべての子孫にその配列を伝える。子孫は、トランスジェニック植物によって産生された種子から成長させてもよい。その後、これらのさらなる植物は、植物の何世代にもわたって同じ特徴を示す系を生成するために自家受粉してもよい。これらの植物由来の子孫は、遺伝子発現について、とりわけ評価される。遺伝子発現は、ウエスタンブロッティング、ノーザンブロッティング、免疫沈降、およびELISAなどのいくつかの一般的な方法によって検出されてもよい。
これまでに本発明を全般的に記載したが、同じことが、例証を介して提供され、また、特に指定のない限り、本発明を限定するようには意図されない以下の実施例への参照を通してより容易に理解されるであろう。以下の実施例において開示される技術は、本発明の実施において十分に機能するように、発明者らによって発見された技術を示すことが、当業者らによって十分に理解されたい。しかしながら、当業者らは、本開示を考慮して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの変形が、開示される特定の実施形態において成され、同様のまたは類似する結果をなお得ることができ、そのため、添付の図面において記載され、示される内容はすべて、例証となるものとして解釈され、限定する意味で解釈されないことを十分に理解されたい。
実施例
調節エレメントの同定およびクローニング
新規な転写調節エレメントまたは転写調節発現エレメント群(EXP)配列を同定し、双子葉植物種メロン(Cucumis melo)WSH−39−1070ANのゲノムDNAから単離した。
転写調節エレメントは、大豆(ダイズ(Glycine max))およびシロイヌナズナ(Alabidopsis)において行われた転写プロファイリング実験に由来する私有のおよび公的なマイクロアレイデータ、ならびに、私有のメロン配列に対して、クエリーとして既知の双子葉植物配列を使用する、相同性ベースの検索に基づいて、選択した。
同定した配列を使用して、生物情報学分析を、増幅したDNA内の調節エレメントを同定するために行い、続いて、配列中に存在する転写開始部位(TSS)および任意の双方向性、イントロン、または上流コード配列の同定を行った。この分析の結果を使用して、調節エレメントをDNA配列内で決定し、調節エレメントを増幅するためにプライマーを設計した。それぞれの調節エレメントについて対応するDNA分子は、特有の制限酵素部位とメロンから単離したゲノムDNAを含有するプライマーを用いて、標準的なポリメラーゼ連鎖反応条件を使用して増幅した。結果として生じるDNA断片は、適合する制限部位の標準的な制限酵素消化およびDNAライゲーション方法を使用して、基本植物発現ベクターの中にライゲーションした。
調節エレメントTSSおよびイントロン/エクソンスプライスジャンクションの分析は、形質転換植物プロトプラストを使用して実行することができる。手短に言えば、プロトプラストを、異種転写可能ポリヌクレオチド分子に作動可能に連結された、クローニングDNA断片を含む植物発現ベクターを用いて形質転換し、5’ RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version 2.0(Invtrogen、Carlsbad、California 92008)を、それによって産生されるmRNA転写物の配列を分析することによって、調節エレメントTSSおよびイントロン/エクソンスプライスジャンクションを確認するために使用する。
ユビキチン1転写調節発現エレメント群(EXP)をコードする配列は、上記に記載されているように分析し、それぞれの転写調節発現エレメント群(「EXP」)はまた、それぞれの転写調節発現エレメント群を含む対応するプロモーター、リーダー、およびイントロンに分解した。同定されたユビキチン1転写調節発現エレメント群(「EXP」)の配列は、配列番号1、5、7、9、および11として本明細書において提供され、また、表1において下記に列挙される。対応するユビキチン1プロモーターは、配列番号2、6、8、10、および12として本明細書において提供される。ユビキチン1リーダーおよびイントロンは、それぞれ、配列番号3および4として本明細書において提供される。
リーダーエレメントに作動可能に連結されたプロモーターエレメント;またはリーダーエレメントおよびイントロンエレメントに作動可能に連結されたプロモーターエレメント、またはリーダーエレメントに作動可能に連結され、イントロンエレメントに作動可能に連結され、リーダーエレメントに作動可能に連結されたプロモーターエレメントから構成される他のウリ属転写調節発現エレメント群またはEXP配列をコードする配列は、配列番号13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、159、162、167、168、172、175、176、177、178、181、182、183、184、185、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、211、および212として提供され、また、下記の表1においても列挙される。さらなるプロモーターエレメントは、配列番号163および169として提供される。さらなるリーダーエレメントは、配列番号164、166、および170として提供される。さらなるイントロンエレメントは、配列番号165および171として提供される。プロモーターがリーダーエレメントに作動可能に連結されるエレメントは、配列番号157、160、173、179、および186として提供される。イントロンがリーダーエレメントに作動可能に連結されるエレメントは、配列番号158、161、174、180、および187として提供される。配列番号13〜199、211、および212として提供される配列のサブセットに関して、これらの配列は、構成的発現、根発現、地上(above ground)発現、または種子発現などの望ましいパターンの発現を示す、異なる種の相同遺伝子由来のプロモーターによって駆動された転写プロファイリングまたは発現などの、実験の結果に基づいて選択し、クローニングした。ウリ属(Cucumis)配列によって与えられる実際の活性は、実験的に決定され、形質転換植物宿主細胞および完全なトランスジェニック植物において使用される場合、メロン以外の種由来の相同遺伝子に由来する調節エレメントと必ずしも同じではない。
表1において示されるように、たとえば、EXP−CUCme.Ubq1:1:1(配列番号1)と呼ばれる転写調節発現エレメント群(EXP)は、メロンから単離された成分と共に、リーダーエレメント、L−CUCme.Ubq1−1:1:1(配列番号3)の5’に作動可能に連結され、イントロンエレメント、I−CUCme.Ubq1−1:1:1(配列番号4)の5’に作動可能に連結された、2068塩基対サイズ(bp)のプロモーターエレメント、P−CUCme.Ubq1−1:1:15(配列番号2)を含む。EXP−CUCme.Ubq1:1:2(配列番号5)と呼ばれる転写調節発現エレメント群(EXP)は、メロンから単離された成分と共に、リーダーエレメント、L−CUCme.Ubq1−1:1:1(配列番号3)の5’に作動可能に連結され、イントロンエレメント、I−CUCme.Ubq1−1:1:1(配列番号4)の5’に作動可能に連結された、1459bpプロモーターエレメント、P−CUCme.Ubq1−1:1:16(配列番号6)を含む。EXP−CUCme.Ubq1:1:3(配列番号7)と呼ばれる転写調節発現エレメント群(EXP)は、メロンから単離された成分と共に、リーダーエレメント、L−CUCme.Ubq1−1:1:1(配列番号3)の5’に作動可能に連結され、イントロンエレメント、I−CUCme.Ubq1−1:1:1(配列番号4)の5’に作動可能に連結された、964bpプロモーターエレメント、P−CUCme.Ubq1−1:1:17(配列番号8)を含む。EXP−CUCme.Ubq1:1:4(配列番号9)と呼ばれる転写調節発現エレメント群(EXP)は、メロンから単離された成分と共に、リーダーエレメント、L−CUCme.Ubq1−1:1:1(配列番号3)の5’に作動可能に連結され、イントロンエレメント、I−CUCme.Ubq1−1:1:1(配列番号4)の5’に作動可能に連結された、479bpプロモーターエレメント、P−CUCme.Ubq1−1:1:18(配列番号10)を含む。EXP−CUCme.Ubq1:1:5(配列番号11)と呼ばれる転写調節発現エレメント群(EXP)は、メロンから単離された成分と共に、リーダーエレメント、L−CUCme.Ubq1−1:1:1(配列番号3)の5’に作動可能に連結され、イントロンエレメント、I−CUCme.Ubq1−1:1:1(配列番号4)の5’に作動可能に連結された、173bpプロモーターエレメント、P−CUCme.Ubq1−1:1:19(配列番号12)を含む。
ユビキチン1プロモーター配列のアライメントは、図1a〜1fにおいて提供される。プロモーターエレメント、P−CUCme.Ubq1−1:1:16(配列番号6)、P−CUCme.Ubq1−1:1:17(配列番号8)、P−CUCme.Ubq1−1:1:18(配列番号10)、およびP−CUCme.Ubq1−1:1:19(配列番号12)は、プロモーター、P−CUCme.Ubq1−1:1:15(配列番号2)の5’末端から様々な長さの欠失を導入することによって構築した。
大豆子葉プロトプラストにおいてGUSを駆動する調節エレメントの分析
大豆子葉プロトプラストを、β−グルクロニダーゼ(GUS)導入遺伝子の発現を駆動する試験転写調節発現エレメント群を含有する植物発現ベクターを用いて形質転換し、GUSの発現が既知の構成的プロモーターによって駆動される、葉プロトプラストにおけるGUS発現と比較した。
EXP−CUCme.Ubq1:1:1(配列番号1)、EXP−CUCme.Ubq1:1:2(配列番号5)、EXP−CUCme.Ubq1:1:3(配列番号7)、EXP−CUCme.Ubq1:1:4(配列番号9)、およびEXP−CUCme.Ubq1:1:5(配列番号11)によって駆動される導入遺伝子の発現を、既知の構成的プロモーターからの発現と比較した。植物発現ベクターはそれぞれ、Agrobacterium tumefaciens由来の右側のボーダー領域、ジャガイモ光誘発性組織特異的ST−LS1遺伝子(Genbank受託:X04753)に由来する、プロセシング可能なイントロンを含有するβ−グルクロニダーゼ(GUS、配列番号206)についてのコード配列の5’に作動可能に連結され、海鳥綿(Gossypium barbadense)E6遺伝子(T−Gb.E6−3b:1:1、配列番号204)由来の3’終結領域、エンドウマメRbcS2−E9遺伝子、(T−Ps.RbcS2−E9−1:1:6、配列番号203)、または海鳥綿FbLate−2遺伝子(T−Gb.FbL2−1:1:1、配列番号205)の5’に作動可能に連結された、EXP配列または既知の構成的プロモーターから構成される第1の導入遺伝子カセット;除草剤グリフォセート(シロイヌナズナアクチン7プロモーターによって駆動される)または抗生物質、カナマイシンに対する抵抗性を与える形質転換植物細胞の選択に使用される第2の導入遺伝子選択カセット、およびA.tumefaciens由来の左側のボーダー領域から構成された。プロモーターがない対照植物発現ベクター(pMON124912)は、発現についての陰性対照として働いた。前述の試験および構成的発現エレメント群は、下記の表2において示されるように、植物発現ベクターの中にクローニングした。
同時形質転換およびデータの標準化における使用のための2つのプラスミドもまた、構築した。一方の形質転換対照プラスミドは、Agrobacterium tumefaciensノパリンシンターゼ遺伝子(T−AGRtu.nos−1:1:13、配列番号209)由来の3’終結領域の5’に作動可能に連結されたホタル(Photinus pyralis)ルシフェラーゼコード配列(FLuc、配列番号207)の発現を駆動する構成的プロモーターから構成された。他方の形質転換対照プラスミドは、Agrobacterium tumefaciensノパリンシンターゼ遺伝子由来の3’終結領域の5’に作動可能に連結されたウミシイタケ(Renilla reniformis)ルシフェラーゼコード配列(RLuc、配列番号208)の発現を駆動する構成的プロモーターから構成された。
植物発現ベクター、pMON80585、pMON109584、pMON118756、pMON124912、pMON138776、pMON138777、pMON138778、pMON138779、およびpMON138780は、PEG形質転換方法を使用して、大豆子葉プロトプラスト細胞を形質転換するために使用した。プロトプラスト細胞を、2つの形質転換対照プラスミドのそれぞれおよび試験植物発現ベクターの等モル量を用いて形質転換した。GUSおよびルシフェラーゼの活性をアッセイした。GUSおよびルシフェラーゼの両方の測定は、2つの異なる小さなウェルトレーの中に、上記のように形質転換した細胞の溶解調製物の一定分量を配置することによって行った。一方のトレーは、GUS測定に使用し、第2のトレーは、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ系を使用して、デュアルルシフェラーゼアッセイを実行するために使用した(Promega Corp.、Madison、WI;たとえば、Promega Notes Magazine, No: 57, 1996, p.02を参照されたい)。サンプル測定は、形質転換当たり3回または4回の反復実験を使用して行った。平均GUSおよびルシフェラーゼ値を、下記の表3に示す。
大豆子葉プロトプラストにおけるそれぞれのプロモーターの相対的な活性を比較するために、GUS値を、ルシフェラーゼ活性に対するGUSの比として表現し、構成的発現エレメント群、EXP−At.Act7:1:11およびEXP−CaMV.35S−enh+Ph.DnaK:1:3について観察された発現レベルに関して標準化した。下記の表4は、EXP−At.Act7:1:11およびEXP−CaMV.35S−enh+Ph.DnaK:1:3に関して標準化したホタルルシフェラーゼ(FLuc)に対するGUSの比を示す。下記の表5は、EXP−At.Act7:1:11およびEXP−CaMV.35S−enh+Ph.DnaK:1:3に関して標準化したレニラ(renilla)ルシフェラーゼ(RLuc)に対するGUSの比を示す。
上記表4および5に見られるように、発現エレメント群、EXP−CUCme.Ubq1:1:1(配列番号1)、EXP−CUCme.Ubq1:1:2(配列番号5)、EXP−CUCme.Ubq1:1:3(配列番号7)、EXP−CUCme.Ubq1:1:4(配列番号9)、およびEXP−CUCme.Ubq1:1:5(配列番号11)はそれぞれ、大豆子葉プロトプラストにおいて導入遺伝子発現を駆動する能力を実証した。発現レベルは、EXP−At.Act7:1:11よりも大きく、このアッセイにおいてEXP−At.Act7:1:11よりも2.9〜5.8(FLuc)または3〜7(RLuc)倍高度であった。発現は、EXP−CaMV.35S−enh+Ph.DnaK:1:3について観察された発現と等価、またはそれよりも高度であった。発現レベルは、EXP−CaMV.35S−enh+Ph.DnaK:1:3について観察された発現よりも0.8〜1.7(FLuc)または1〜2.4(RLuc)倍高度であった。
撃ち込まれた(bombarded)大豆葉および根においてGUSを駆動する調節エレメントの分析
大豆葉および根を、β−グルクロニダーゼ(GUS)導入遺伝子の発現を駆動する試験転写調節発現エレメント群を含有する植物発現ベクターを用いて形質転換し、GUSの発現が既知の構成的プロモーターによって駆動される、葉および根におけるGUS発現と比較した。
粒子を撃ち込まれた大豆葉および根において、EXP−CUCme.Ubq1:1:1(配列番号1)、EXP−CUCme.Ubq1:1:2(配列番号5)、EXP−CUCme.Ubq1:1:3(配列番号7)、EXP−CUCme.Ubq1:1:4(配列番号9)、およびEXP−CUCme.Ubq1:1:5(配列番号11)によって駆動される導入遺伝子の発現を、既知の構成的プロモーターからの発現と比較した。葉および根の形質転換に使用した植物発現ベクターは、上記の実施例2の表2において示すものと同じものとした。
植物発現ベクター、pMON80585、pMON109584、pMON118756、pMON124912、pMON138776、pMON138777、pMON138778、pMON138779、およびpMON138780を、パーティクルガン(particle bombardment)形質転換法を使用して大豆葉および根を形質転換するために使用した。
手短に言えば、A3244大豆種子は表面殺菌され、16時間明および8時間暗の光周期によりトレーにおいて発芽させた。およそ13日後に、葉および根の組織は、実生から無菌条件下で収集し、撃ち込みに使用した。組織試料は、植物培地を含有するペトリ皿上に無作為に配置した。10マイクログラムのプラスミドDNAを、撃ち込み用の0.6ミクロンの金粒子(カタログ#165−2262 Bio−Rad、Hercules、CA)をコーティングするために使用した。マクロキャリアに、DNAコーティング金粒子(カタログ#165−2335 Bio−Rad、Hercules CA)をロードした。PDS 1000/He微粒子銃を、形質転換(カタログ#165−2257 Bio−Rad、Hercules CA)に使用した。撃ち込まれた根および葉組織は、摂氏26度で24時間、暗中でインキュベートした。この一晩のインキュベーション後に、組織を、摂氏37度でGUS発現について溶液中で一晩染色した。一晩の染色の後に、クロロフィルを除去し、かつGUS染色を明らかにするために、組織を、70%エタノール中に一晩浸漬した。その後、組織を撮影し、GUS発現のレベルを反映する「0」、「+」〜「++++++」の評定尺度を、それぞれのコンストラクトに割り当てた(それぞれ0−発現なし、+〜++++++−低度〜高度)。
それぞれの組織において実証されたGUS導入遺伝子の発現は、安定して形質転換されたトウモロコシ植物において導入遺伝子発現を駆動するそれぞれのエレメントの能力の相対的な可能性のあるレベルおよび特異性を推測するために使用した。平均GUS発現評定を、下記の表6に提供する。
上記表6において見られるように、発現エレメント群、EXP−CUCme.Ubq1:1:1(配列番号1), EXP−CUCme.Ubq1:1:2(配列番号5), EXP−CUCme.Ubq1:1:3(配列番号7), EXP−CUCme.Ubq1:1:4(配列番号9)、およびEXP−CUCme.Ubq1:1:5(配列番号11)はそれぞれ、粒子を撃ち込まれた、形質転換された葉および根組織において導入遺伝子発現を駆動する能力を実証した。
大豆子葉プロトプラストにおいてGUSを駆動する調節エレメントの分析
大豆子葉プロトプラストを、β−グルクロニダーゼ(GUS)導入遺伝子の発現を駆動する試験転写調節発現エレメント群を含有する植物発現ベクターを用いて形質転換し、GUSの発現が既知の構成的プロモーターによって駆動される、葉プロトプラストにおけるGUS発現と比較した。
P−CUCme.1−1:1:1rc(配列番号155)、P−CUCme.2−1:1:1(配列番号14)、P−CUCme.3−1:1:3(配列番号15)、EXP−CUCme.4:1:1(配列番号156)、EXP−CUCme.5:1:1(配列番号159)、P−CUCme.6−1:1:1(配列番号18)、P−CUCme.8−1:1:2(配列番号19)、P−CUCme.9−1:1:2(配列番号20)、P−CUCme.10−1:1:1(配列番号21)、EXP−CUCme.eEF1a:1:1(配列番号162)、P−CUCme.15−1:1:2(配列番号23)、P−CUCme.16a−1:1:2(配列番号24)、P−CUCme.17−1:1:2(配列番号26)、P−CUCme.18−1:1:2(配列番号27)、P−CUCme.19−1:1:3(配列番号167)、P−CUCme.20−1:3(配列番号211)、P−CUCme.21−1:1:1(配列番号30)、P−CUCme.22−1:1:3(配列番号31)、EXP−CUCme.SAMS2:1:1(配列番号168)、P−CUCme.26−1:1:2(配列番号33)、P−CUCme.28−1:1:2(配列番号34)、およびEXP−CUCme.29:1:2(配列番号212)によって駆動された導入遺伝子の発現を、既知の構成的発現エレメント群からの発現と比較した。植物発現ベクターはそれぞれ、Agrobacterium tumefaciens由来の右側のボーダー領域、ジャガイモ光誘発性組織特異的ST−LS1遺伝子(Genbank受託:X04753)に由来する、プロセシング可能なイントロンを含有するβ−グルクロニダーゼ(GUS、配列番号206)についてのコード配列の5’に作動可能に連結され、海鳥綿(Gossypium barbadense)E6遺伝子(T−Gb.E6−3b:1:1、配列番号204)由来の3’終結領域、エンドウマメRbcS2−E9遺伝子、(T−Ps.RbcS2−E91:1:6、配列番号203)、または海鳥綿FbLate−2遺伝子(T−Gb.FbL2−1:1:1、配列番号205)の5’に作動可能に連結された、試験プロモーターまたは既知の構成的プロモーターから構成される第1の導入遺伝子カセット;除草剤グリフォセート(シロイヌナズナアクチン7プロモーターによって駆動される)または抗生物質、カナマイシンに対する抵抗性を与える形質転換植物細胞の選択に使用される第2の導入遺伝子選択カセット、およびA.tumefaciens由来の左側のボーダー領域から構成された。プロモーターがない対照植物発現ベクター(pMON124912)は、発現についての陰性対照として働いた。前述の試験および構成的発現エレメント群は、下記の表7において示されるように、植物発現ベクターの中にクローニングした。
同時形質転換およびデータの標準化における使用のための2つのプラスミドもまた、構築した。一方の形質転換対照プラスミドは、Agrobacterium tumefaciensノパリンシンターゼ遺伝子(T−AGRtu.nos−1:1:13、配列番号209)由来の3’終結領域の5’に作動可能に連結されたホタル(Photinus pyralis)ルシフェラーゼコード配列(FLuc、配列番号207)の発現を駆動する構成的プロモーターから構成された。他方の形質転換対照プラスミドは、Agrobacterium tumefaciensノパリンシンターゼ遺伝子由来の3’終結領域の5’に作動可能に連結されたウミシイタケ(Renilla reniformis)ルシフェラーゼコード配列(RLuc、配列番号208)の発現を駆動する構成的プロモーターから構成された。
植物発現ベクター、pMON80585、pMON109584、pMON118756、pMON124912、pMON140818、pMON140819、pMON140820、pMON140821、pMON140822、pMON140823、pMON140824、pMON140825、pMON140826、pMON140827、pMON140828、pMON140829、pMON140830、pMON140831、pMON140832、pMON140833、pMON140834、pMON140835、pMON140836、pMON140837、pMON140838、およびpMON140839は、PEG形質転換方法を使用して大豆子葉プロトプラスト細胞を形質転換するために使用した。プロトプラスト細胞を、2つの形質転換対照プラスミドのそれぞれおよび試験植物発現ベクターの等モル量を用いて形質転換した。GUSおよびルシフェラーゼの活性をアッセイした。GUSおよびルシフェラーゼの両方の測定は、2つの異なる小さなウェルトレーの中に、上記のように形質転換した細胞の溶解調製物の一定分量を配置することによって行った。一方のトレーは、GUS測定に使用し、第2のトレーは、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ系を使用して、デュアルルシフェラーゼアッセイを実行するために使用した(Promega Corp、Madison、WI;たとえば、Promega Notes Magazine, No: 57, 1996, p.02を参照されたい)。サンプル測定は、形質転換当たり3回または4回の反復実験を使用して行った。平均GUSおよびルシフェラーゼ値を、下記の表8に示す。
大豆子葉プロトプラストにおけるそれぞれのプロモーターの相対的な活性を比較するために、GUS値を、ルシフェラーゼ活性に対するGUSの比として表現し、構成的発現エレメント群、EXP−At.Act7:1:11およびEXP−CaMV.35S−enh+Ph.DnaK:1:3について観察された発現レベルに関して標準化した。下記の表9は、EXP−At.Act7:1:11およびEXP−CaMV.35S−enh+Ph.DnaK:1:3に関して標準化したホタルルシフェラーゼ(FLuc)に対するGUSの比を示す。下記の表10は、EXP−At.Act7:1:11およびEXP−CaMV.35S−enh+Ph.DnaK:1:3に関して標準化したレニラ(renilla)ルシフェラーゼ(RLuc)に対するGUSの比を示す。
表9および10において見られるように、試験したほとんどの発現エレメント群は、大豆子葉プロトプラスト細胞において導入遺伝子発現を駆動する能力を実証した。ある発現エレメント群、EXP−CUCme.4:1:1(配列番号156)は、このアッセイにおいて、EXP−At.Act7:1:11よりも高度な導入遺伝子発現のレベルを実証した。
撃ち込まれた大豆葉および根においてGUSを駆動する調節エレメントの分析
大豆葉および根は、β−グルクロニダーゼ(GUS)導入遺伝子の発現を駆動する試験転写調節発現エレメント群を含有する植物発現ベクターを用いて形質転換し、GUSの発現が知られている構成的プロモーターによって駆動される根および葉におけるGUS発現と比較した。
粒子を撃ち込まれた大豆葉および根において、P−CUCme.1−1:1:1rc(配列番号155)、P−CUCme.2−1:1:1(配列番号14)、P−CUCme.3−1:1:3(配列番号15)、EXP−CUCme.4:1:1(配列番号156)、EXP−CUCme.5:1:1(配列番号159)、P−CUCme.6−1:1:1(配列番号18)、P−CUCme.8−1:1:2(配列番号19)、P−CUCme.9−1:1:2(配列番号20)、P−CUCme.10−1:1:1(配列番号21)、EXP−CUCme.eEF1a:1:1(配列番号162)、P−CUCme.15−1:1:2(配列番号23)、P−CUCme.16a−1:1:2(配列番号24)、P−CUCme.17−1:1:2(配列番号26)、P−CUCme.18−1:1:2(配列番号27)、P−CUCme.19−1:1:3(配列番号167)、P−CUCme.20−1:3(配列番号211)、P−CUCme.21−1:1:1(配列番号30)、P−CUCme.22−1:1:3(配列番号31)、EXP−CUCme.SAMS2:1:1(配列番号168)、P−CUCme.26−1:1:2(配列番号33)、P−CUCme.28−1:1:2(配列番号34)、およびEXP−CUCme.29:1:2(配列番号212)によって駆動された導入遺伝子の発現を、既知の構成的発現エレメント群からの発現と比較した。葉および根の形質転換に使用した植物発現ベクターは、上記の実施例4の表7において示すものと同じものとした。
植物発現ベクター、pMON80585、pMON109584、pMON118756、pMON124912、pMON140818、pMON140819、pMON140820、pMON140821、pMON140822、pMON140823、pMON140824、pMON140825、pMON140826、pMON140827、pMON140828、pMON140829、pMON140830、pMON140831、pMON140832、pMON140833、pMON140834、pMON140835、pMON140836、pMON140837、pMON140838、およびpMON140839を、パーティクルガン形質転換法を使用して大豆葉および根を形質転換するために使用した。
手短に言えば、A3244大豆種子は表面殺菌され、16時間明および8時間暗の光周期によりトレーにおいて発芽させた。およそ13日後に、葉および根の組織は、実生から無菌条件下で収集し、撃ち込みに使用した。組織試料は、植物培地を含有するペトリ皿上に無作為に配置した。10マイクログラムのプラスミドDNAを、撃ち込み用の0.6ミクロンの金粒子(カタログ#165−2262 Bio−Rad、Hercules、CA)をコーティングするために使用した。マクロキャリアに、DNAコーティング金粒子(カタログ#165−2335 Bio−Rad、Hercules CA)をロードした。PDS 1000/He微粒子銃を、形質転換(カタログ#165−2257 Bio−Rad、Hercules CA)に使用した。撃ち込まれた根および葉組織は、摂氏26度で24時間、暗中でインキュベートした。この一晩のインキュベーション後に、組織を、摂氏37度でGUS発現について溶液中で一晩染色した。一晩の染色の後に、クロロフィルを除去し、かつGUS染色を明らかにするために、組織を、70%エタノール中に一晩浸漬した。その後、組織を撮影し、GUS発現のレベルを反映する「0」、「+」〜「++++++」の評定尺度を、それぞれのコンストラクトに割り当てた(それぞれ0−発現なし、+〜++++++−低度〜高度)。
それぞれの組織において実証されたGUS導入遺伝子の発現は、安定して形質転換されたトウモロコシ植物において導入遺伝子発現を駆動するそれぞれのエレメントの能力の相対的な可能性のあるレベルおよび特異性を推測するために使用した。平均GUS発現評定を、下記の表11に提供する。
上記表11において見られるように、発現エレメント群のうちの1つ以外すべては、粒子を撃ち込まれた大豆葉および根組織において導入遺伝子発現を駆動する能力を実証した。2つの発現エレメント群、P−CUCme.28−1:1:2(配列番号34)およびEXP−CUCme.4:1:1(配列番号156)は、このアッセイにおいて、EXP−CaMV.35S−enh+Ph.DnaK:1:3によって駆動された発現と同様のまたはそれに比べて高度なレベルの発現を実証した。
導入遺伝子カセットアンプリコンを使用して、大豆子葉プロトプラストにおいてGUSを駆動する調節エレメントの分析
大豆子葉プロトプラストを、β−グルクロニダーゼ(GUS)導入遺伝子の発現を駆動する転写調節発現エレメント群を含有する導入遺伝子カセットアンプリコンを用いて形質転換し、GUSの発現が既知の構成的プロモーターによって駆動される、葉プロトプラストにおけるGUS発現と比較した。導入遺伝子カセットアンプリコンは、GUSコード配列(GUS、配列番号206)に作動可能に連結され、3’UTR(T−Gb.FbL2−1:1:1、配列番号205)に作動可能に連結されたEXP配列から構成された。平均GUS発現は、対照EXPエレメント、P−CaMV.35S−enh−1:1:102/L−CaMV.35S−1:1:2(配列番号210)およびEXP−At.Atntt1:1:2(配列番号200)と比較した。
同時形質転換およびデータの標準化における使用のためのプラスミドもまた、実施例2において上記に記載されているものと同様の方法で使用した。一方の形質転換対照プラスミドは、Agrobacterium tumefaciensノパリンシンターゼ遺伝子(T−AGRtu.nos−1:1:13、配列番号209)由来の3’終結領域の5’に作動可能に連結されたホタル(フォチナス・フィラリス)ルシフェラーゼコード配列(FLuc、配列番号205)の発現を駆動する構成的プロモーターから構成された。
下記の表12は、それぞれの導入遺伝子アンプリコンによって与えられた平均GUS発現値を示す。下記の表13は、EXP−At.Atntt1:1:2およびP−CaMV.35S−enh−1:1:102/L−CaMV.35S−1:1:2に関して標準化したホタルルシフェラーゼ(FLuc)に対するGUSの比を示す。
上記表12において見られるように、すべてのEXP配列が、プロモーターなしの対照と比較した場合に、導入遺伝子発現を駆動する能力を実証したわけではなかった。しかしながら、EXP配列、CumMe_WSM_SF16429.G5670(配列番号40)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF16444.G5140−1:1:1(配列番号175)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF16563.G5560−1:1:1(配列番号176)、CumMe_WSM_SF17051.G5470(配列番号48)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF17111.G5790−1:1:1(配列番号177)、P−CUCme.WSM_SF17252.G7330−1:1:1(配列番号179)、CumMe_WSM_SF17866.G6050(配列番号62)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF18488.G5340−1:1:1(配列番号181)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF18536.G6480−1:1:1(配列番号182)、CumMe_WSM_SF18575.G6410(配列番号71)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF18634.G5190−1:1:1(配列番号183)、CumMe_WSM_SF18986.G6110(配列番号79)、EXP−CUCme.WSM_SF19064.G5690:1:1(配列番号185)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF19647.G5760−1:1:1(配列番号188)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF19839.G5090−1:1:1(配列番号189)、CumMe_WSM_SF19902.G5260(配列番号87)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF20132.G5560−1:1:1(配列番号190)、CumMe_WSM_SF20359.G5870(配列番号92)、CumMe_WSM_SF206458.G5970(配列番号98)、CumMe_WSM_SF206534.G5200(配列番号99)、CumMe_WSM_SF22008.G5670(配列番号108)、CumMe_WSM_SF22355.G5310(配列番号113)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF22531.G5120−1:1:1(配列番号192)、EXP−CUCme.WSM_SF19064.G5690:1:1(配列番号193)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF23906.G6180−1:1:1(配列番号194)、CumMe_WSM_SF24045.G5400(配列番号123)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF25141.G5160−1:1:2(配列番号195)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF25936.G5450−1:1:1(配列番号197)、CumMe_WSM_SF28729.G5340(配列番号134)、CumMe_WSM_SF31264.G5380(配列番号136)、およびP−CUCme.CumMe_WSM_SF35856.G5150−1:1:1(配列番号198)は、EXP−At.Atntt1:1:2と同様のまたはそれよりも大きなレベルで、大豆子葉プロトプラストにおいて導入遺伝子発現を駆動する能力を実証した。上記の表13において示されるように、EXP配列P−CUCme.CumMe_WSM_SF19647.G5760−1:1:1(配列番号188)は、EXP−At.Atntt1:1:2よりも大きなレベルで、このアッセイにおいて導入遺伝子発現を駆動する能力を実証した。
ワタ葉プロトプラストにおいてGUSを駆動する調節エレメントの分析
ワタ子葉プロトプラストを、β−グルクロニダーゼ(GUS)導入遺伝子の発現を駆動する試験転写調節発現エレメント群を含有する植物発現ベクターを用いて形質転換し、GUSの発現が既知の構成的プロモーターによって駆動される、葉プロトプラストにおけるGUS発現と比較した。
P−CUCme.1−1:1:1rc(配列番号155)、P−CUCme.2−1:1:1(配列番号14)、P−CUCme.3−1:1:3(配列番号15)、EXP−CUCme.4:1:1(配列番号156)、P−CUCme.6−1:1:1(配列番号18)、P−CUCme.8−1:1:2(配列番号19)、P−CUCme.9−1:1:2(配列番号20)、P−CUCme.10−1:1:1(配列番号21)、EXP−CUCme.eEF1a:1:1(配列番号162)、P−CUCme.15−1:1:2(配列番号23)、P−CUCme.16a−1:1:2(配列番号24)、P−CUCme.17−1:1:2(配列番号26)、P−CUCme.18−1:1:2(配列番号27)、P−CUCme.19−1:1:3(配列番号167)、P−CUCme.20−1:3(配列番号211)、P−CUCme.21−1:1:1(配列番号30)、P−CUCme.22−1:1:3(配列番号31)、EXP−CUCme.SAMS2:1:1(配列番号168)、P−CUCme.26−1:1:2(配列番号33)、P−CUCme.28−1:1:2(配列番号34)、およびEXP−CUCme.29:1:2(配列番号212)によって駆動された導入遺伝子の発現を、既知の構成的発現エレメント群からの発現と比較した。植物発現ベクターはそれぞれ、Agrobacterium tumefaciens由来の右側のボーダー領域、ジャガイモ光誘発性組織特異的ST−LS1遺伝子(Genbank受託:X04753)に由来する、プロセシング可能なイントロンを含有するβ−グルクロニダーゼ(GUS、配列番号206)についてのコード配列の5’に作動可能に連結され、海鳥綿(Gossypium barbadense)E6遺伝子(T−Gb.E6−3b:1:1、配列番号204)由来の3’終結領域、エンドウマメRbcS2−E9遺伝子、(T−Ps.RbcS2−E91:1:6、配列番号203)、または海鳥綿FbLate−2遺伝子(T−Gb.FbL2−1:1:1、配列番号205)の5’に作動可能に連結された、試験プロモーターまたは既知の構成的プロモーターから構成される第1の導入遺伝子カセット;除草剤グリフォセート(シロイヌナズナアクチン7プロモーターによって駆動される)または抗生物質、カナマイシンに対する抵抗性を与える形質転換植物細胞の選択に使用される第2の導入遺伝子選択カセット、およびA.tumefaciens由来の左側のボーダー領域から構成された。プロモーターがない対照植物発現ベクター(pMON124912)は、発現についての陰性対照として働いた。前述の試験および構成的発現エレメント群は、下記の表14において示されるように、植物発現ベクターの中にクローニングした。
同時形質転換およびデータの標準化における使用のための2つのプラスミドもまた、構築した。一方の形質転換対照プラスミドは、Agrobacterium tumefaciensノパリンシンターゼ遺伝子(T−AGRtu.nos−1:1:13、配列番号209)由来の3’終結領域の5’に作動可能に連結されたホタル(Photinus pyralis)ルシフェラーゼコード配列(FLuc、配列番号205)の発現を駆動する構成的プロモーターから構成された。他方の形質転換対照プラスミドは、Agrobacterium tumefaciensノパリンシンターゼ遺伝子由来の3’終結領域の5’に作動可能に連結されたウミシイタケ(Renilla reniformis)ルシフェラーゼコード配列(RLuc、配列番号206)の発現を駆動する構成的プロモーターから構成された。
植物発現ベクター、pMON80585、pMON109584、pMON118756、pMON124912、pMON140818、pMON140819、pMON140820、pMON140821、pMON140823、pMON140824、pMON140825、pMON140826、pMON140827、pMON140828、pMON140829、pMON140830、pMON140831、pMON140832、pMON140833、pMON140834、pMON140835、pMON140836、pMON140837、pMON140838、およびpMON140839は、PEG形質転換方法を使用してワタ葉プロトプラスト細胞を形質転換するために使用した。プロトプラスト細胞を、2つの形質転換対照プラスミドのそれぞれおよび試験植物発現ベクターの等モル量を用いて形質転換した。GUSおよびルシフェラーゼの活性をアッセイした。GUSおよびルシフェラーゼの両方の測定は、2つの異なる小さなウェルトレーの中に、上記のように形質転換した細胞の溶解調製物の一定分量を配置することによって行った。一方のトレーは、GUS測定に使用し、第2のトレーは、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ系を使用して、デュアルルシフェラーゼアッセイを実行するために使用した(Promega Corp、Madison、WI;たとえば、Promega Notes Magazine, No: 57, 1996, p.02を参照されたい)。サンプル測定は、形質転換当たり4回の反復実験を使用して行った。平均GUSおよびルシフェラーゼ値を、下記の表15に示す。
ワタ葉プロトプラストにおけるそれぞれのプロモーターの相対的な活性を比較するために、GUS値を、ルシフェラーゼ活性に対するGUSの比として表現し、構成的発現エレメント群、EXP−At.Act7:1:11およびEXP−CaMV.35S−enh+Ph.DnaK:1:3について観察された発現レベルに関して標準化した。下記の表16は、EXP−At.Act7:1:11およびEXP−CaMV.35S−enh+Ph.DnaK:1:3に関して標準化したホタルルシフェラーゼ(FLuc)に対するGUSの比を示す。下記の表17は、EXP−At.Act7:1:11およびEXP−CaMV.35S−enh+Ph.DnaK:1:3に関して標準化したレニラ(renilla)ルシフェラーゼ(RLuc)に対するGUSの比を示す。
表16および17において見られるように、試験したほとんどの発現エレメント群は、ワタ葉プロトプラスト細胞において導入遺伝子発現を駆動する能力を実証した。ある発現エレメント群、EXP−CUCme.4:1:1(配列番号156)は、このアッセイにおいて、EXP−At.Act7:1:11よりも高度な導入遺伝子発現のレベルを実証した。
導入遺伝子カセットアンプリコンを使用して、ワタ葉プロトプラストにおいてGUSを駆動する調節エレメントの分析
ワタ葉プロトプラストを、β−グルクロニダーゼ(GUS)導入遺伝子の発現を駆動する転写調節発現エレメント群を含有する導入遺伝子カセットアンプリコンを用いて形質転換し、GUSの発現が既知の構成的プロモーターによって駆動される、葉プロトプラストにおけるGUS発現と比較した。導入遺伝子カセットアンプリコンは、GUSコード配列(GUS、配列番号206)に作動可能に連結され、3’UTR(T−Gb.FbL2−1:1:1、配列番号205)に作動可能に連結されたEXP配列から構成された。平均GUS発現は、対照EXPエレメント、P−CaMV.35S−enh−1:1:102/L−CaMV.35S−1:1:2(配列番号210)およびEXP−At.Atntt1:1:2(配列番号200)と比較した。
同時形質転換およびデータの標準化における使用のためのプラスミドもまた、実施例2において上記に記載されているものと同様の方法で使用した。形質転換対照プラスミドは、Agrobacterium tumefaciensノパリンシンターゼ遺伝子(T−AGRtu.nos−1:1:13、配列番号209)由来の3’終結領域の5’に作動可能に連結されたホタル(Photinus pyralis)ルシフェラーゼコード配列(FLuc、配列番号205)の発現を駆動する構成的プロモーターから構成された。
下記の表18は、それぞれの導入遺伝子アンプリコンによって与えられた平均GUS発現値を示す。下記の表19は、EXP−At.Atntt1:1:2およびP−CaMV.35S−enh−1:1:102/L−CaMV.35S−1:1:2に関して標準化したホタルルシフェラーゼ(FLuc)に対するGUSの比を示す。
上記表18において見られるように、すべてのEXP配列が、プロモーターなしの対照と比較した場合に、導入遺伝子発現を駆動する能力を実証したわけではなかった。しかしながらEXP配列、P−CUCme.CumMe_WSM_SF16444.G5140−1:1:1(配列番号175)およびP−CUCme.CumMe_WSM_SF19839.G5090−1:1:1(配列番号189)は、EXP−At.Atntt1:1:2と同様のまたはそれよりも大きなレベルで、大豆子葉プロトプラストにおいて導入遺伝子発現を駆動する能力を実証した。上記の表19において示されるように、EXP配列、P−CUCme.CumMe_WSM_SF19839.G5090−1:1:1(配列番号189)は、EXP−At.Atntt1:1:2よりも大きなレベルで、このアッセイにおいて導入遺伝子発現を駆動する能力を実証した。
安定して形質転換された大豆においてGUSを駆動する調節エレメントの分析
大豆植物を、β−グルクロニダーゼ(GUS)導入遺伝子の発現を駆動するEXP配列を含有する植物発現ベクターを用いて形質転換した。
EXP−CUCme.Ubq1:1:1(配列番号1)、EXP−CUCme.Ubq1:1:3(配列番号7)、P−CUCme.1−1:1:1rc(配列番号155)、P−CUCme.2−1:1:1(配列番号14)、P−CUCme.3−1:1:3(配列番号15)、EXP−CUCme.4:1:1(配列番号156)、EXP−CUCme.5:1:1(配列番号159)、P−CUCme.6−1:1:1(配列番号18)、P−CUCme.8−1:1:2(配列番号19)、P−CUCme.9−1:1:2(配列番号20)、P−CUCme.10−1:1:1(配列番号21)、EXP−CUCme.eEF1a:1:1(配列番号162)、P−CUCme.15−1:1:2(配列番号23)、P−CUCme.17−1:1:2(配列番号26)、P−CUCme.18−1:1:2(配列番号27)、P−CUCme.19−1:1:3(配列番号167)、P−CUCme.20−1:3(配列番号211)、P−CUCme.21−1:1:1(配列番号30)、EXP−CUCme.SAMS2:1:1(配列番号168)、P−CUCme.26−1:1:2(配列番号33)、EXP−CUCme.29:1:2(配列番号212)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF25355.G5000−1:1:1(配列番号196)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF17111.G5790−1:1:1(配列番号177)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF22531.G5120−1:1:1(配列番号192)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF18488.G5340−1:1:1(配列番号181)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF23760.G5200−1:1:1(配列番号193)、EXP−CUCme.WSM_SF19064.G5690:1:1(配列番号185)、P−CUCme.WSM_SF17252.G7330−1:1:1(配列番号179)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF18634.G5190−1:1:1(配列番号183)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF19647.G5760−1:1:1(配列番号188)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF25936.G5450−1:1:1(配列番号197)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF19839.G5090−1:1:1(配列番号189)、CumMe_WSM_SF206458.G5970(配列番号98)、およびP−CUCme.CumMe_WSM_SF18716.G5860−1:1:1(配列番号184)によって駆動されたGUS導入遺伝子の発現は、染色組織切片の検査を通して、定性的にもおよび定量的にもアッセイした。植物発現ベクターはそれぞれ、Agrobacterium tumefaciens由来の右側のボーダー領域、海鳥綿FbLate−2遺伝子(T−Gb.FbL2−1:1:1、配列番号205)由来の3’終結領域の5’に作動可能に連結された、ジャガイモ光誘発性組織特異的ST−LS1遺伝子(Genbank受託:X04753)に由来する、プロセシング可能なイントロンを含有するβ−グルクロニダーゼ(GUS、配列番号206)についてのコード配列の5’に作動可能に連結されたEXP配列から構成される第1の導入遺伝子カセット;除草剤グリフォセート(シロイヌナズナアクチン7プロモーターによって駆動される)に対する抵抗性を与えた形質転換植物細胞の選択に使用される第2の導入遺伝子選択カセット、およびA.tumefaciens由来の左側のボーダー領域から構成された。
前述のEXP配列は、下記の表20〜23において示されるような植物発現コンストラクトの中にクローニングし、agrobacterium媒介性の形質転換方法を使用して、大豆植物を形質転換するために使用した。GUSの発現は、選択した組織の組織学的切片を使用して、定性的におよび定量的にアッセイした。
組織化学的GUS分析は、形質転換植物の定質的発現分析に使用した。全組織切片を、適切な時間、GUS染色溶液X−Gluc(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−b−グルクロニド)(1ミリグラム/ミリリッター)と共にインキュベートし、すすぎ、青色の変色について視覚的に検査した。GUS活性は、選択した植物器官および組織を使用して、直接的な目視検査または顕微鏡下での検査によって定性的に決定した。R世代植物は、Vn5根、R1根、Vn5シンク葉、Vn5ソース葉、R1ソース葉、R1葉柄、黄色鞘胚、黄色鞘子葉、R3未成熟種子、R3鞘、R5子葉、およびR1花において発現について検査した。
定量的分析については、総タンパク質を、形質転換トウモロコシ植物の選択した組織から抽出した。総タンパク質のうちの1マイクログラムを、50マイクロリットルの総反応容量で、蛍光発生基質4−メチルウンベリフェリル−β−D−グルクロニド(MUG)と共に使用した。反応生成物、4−メチルウンベリフェロン(4−MU)は、高pHで最大に蛍光性であり、ヒドロキシル基はイオン化されている。炭酸ナトリウムの塩基性溶液の追加は、同時に、アッセイを停止し、蛍光性産物を定量化するためにpHを調整する。蛍光は、Micromax Readerと共に、Fluoromax−3(Horiba;Kyoto、Japan)を使用して、365nmでの励起および445nmでの放射を用いて測定し、スリット幅は、励起2nmおよび放射3nmで設定した。
下記の表20および21は、R世代植物組織において測定した平均定量的発現レベルを示す。アッセイしなかった組織は、両方の表においてブランクのセルとして示す。
表20および21において見られるように、EXP配列、EXP−CUCme.Ubq1:1:1(配列番号1)、EXP−CUCme.Ubq1:1:3(配列番号7)、P−CUCme.1−1:1:1rc(配列番号155)、P−CUCme.2−1:1:1(配列番号14)、EXP−CUCme.4:1:1(配列番号156)、EXP−CUCme.5:1:1(配列番号159)、P−CUCme.6−1:1:1(配列番号18)、P−CUCme.8−1:1:2(配列番号19)、P−CUCme.9−1:1:2(配列番号20)、P−CUCme.10−1:1:1(配列番号21)、EXP−CUCme.eEF1a:1:1(配列番号162)、P−CUCme.15−1:1:2(配列番号23)、P−CUCme.17−1:1:2(配列番号26)、P−CUCme.18−1:1:2(配列番号27)、P−CUCme.19−1:1:3(配列番号167)、P−CUCme.20−1:3(配列番号211)、P−CUCme.21−1:1:1(配列番号30)、EXP−CUCme.SAMS2:1:1(配列番号168)、P−CUCme.26−1:1:2(配列番号33)、EXP−CUCme.29:1:2(配列番号212)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF25355.G5000−1:1:1(配列番号196)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF17111.G5790−1:1:1(配列番号177)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF22531.G5120−1:1:1(配列番号192)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF18488.G5340−1:1:1(配列番号181)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF23760.G5200−1:1:1(配列番号193)、EXP−CUCme.WSM_SF19064.G5690:1:1(配列番号185)、P−CUCme.WSM_SF17252.G7330−1:1:1(配列番号179)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF18634.G5190−1:1:1(配列番号183)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF19647.G5760−1:1:1(配列番号188)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF25936.G5450−1:1:1(配列番号197)、P−CUCme.CumMe_WSM_SF19839.G5090−1:1:1(配列番号189)、CumMe_WSM_SF206458.G5970(配列番号98)、およびP−CUCme.CumMe_WSM_SF18716.G5860−1:1:1(配列番号184)は、発現を駆動するために使用したEXP配列に依存して、アッセイしたいくつかのまたはすべての組織において導入遺伝子発現を駆動する能力を定量的に実証した。
選択した組織切片の組織学的分析は、EXP配列の多くについて発現のさらなる証拠を提供した。EXP−CUCme.Ubq1:1:1(配列番号1)およびEXP−CUCme.Ubq1:1:3(配列番号7)は、定量的分析がかなり低度のレベルの発現を示したが、すべての組織において観察された染色により構成的発現パターンを実証した。このタイプの発現パターンは、低レベルの構成的発現を必要とする導入遺伝子の発現の駆動に対して非常に偶発的な(adventitious)ものとすることができる。P−CUCme.1−1:1:1rc(配列番号155)によって駆動された発現は、シンクおよびソース葉の維管束および木部におけるならびに根外皮、師部、木部、内皮、中心柱、および先端における発現を実証した。EXP−CUCme.4:1:1(配列番号156)によって駆動された発現は、すべての組織において観察され、植物の生殖相において観察された発現が最も高度であった。P−CUCme.10−1:1:1(配列番号:21)によって駆動された発現は、V5シンク葉およびR1花葯においてのみ観察された。EXP−CUCme.eEF1a:1:1(配列番号162)によって駆動された発現は、構成的発現パターンを実証し、最も高度な発現は、黄色鞘胚および子葉において観察された。黄色鞘胚活性は、R世代よりもR世代において5倍高度であった(下記表23を参照されたい)。P−CUCme.15−1:1:2(配列番号23)、P−CUCme.17−1:1:2(配列番号26)、およびP−CUCme.18−1:1:2(配列番号27)によって駆動された発現は、構成的レベルの発現を組織学的に実証した。P−CUCme.19−1:1:3(配列番号167)によって駆動された発現は、V5根およびR1葉柄を例外として構成的パターンの発現を組織学的に実証した。R3鞘は、最も高度な発現を示した。
P−CUCme.20−1:3(配列番号211)によって駆動された発現は、V5根における発現を例外として構成的発現パターンを組織学的に実証した。発現は、R8ステージ子葉において最も高度であった。EXP−CUCme.SAMS2:1:1(配列番号168)によって駆動された発現は、すべての組織において組織学的に観察された発現により構成的パターンの発現を実証した。GUS発現は、R世代において増加することが観察された(下記表22および23を参照されたい)。R1ステージ花および葉柄は、大豆において最も高レベルの発現を実証した。P−CUCme.CumMe_WSM_SF22531.G5120−1:1:1(配列番号192)によって駆動された発現は、構成的パターンの発現を組織学的に実証し、R8ステージ子葉および胚における発現が最も高度であった。P−CUCme.CumMe_WSM_SF18488.G5340−1:1:1(配列番号181)によって駆動された発現は、構成的レベルの発現を実証したが、定量的に高度な発現は、黄色鞘胚において観察された。
EXP−CUCme.eEF1a:1:1(配列番号162)およびEXP−CUCme.SAMS2:1:1(配列番号168)を含むプラスミドコンストラクトを用いて形質転換したR世代植物の種子をまき、R世代植物をGUS発現について分析した。R世代植物は、Vn5根、Vn5シンク葉、Vn5ソース葉、R1ソース葉、R1葉柄 黄色鞘胚、黄色鞘子葉、R3未成熟種子、R3鞘、R5子葉、およびR1花において発現について検査した。表22および23は、R世代形質転換植物のそれぞれの組織において測定した平均GUS発現を示す。
上記表22および23において見られるように、EXP−CUCme.eEF1a:1:1(配列番号162)およびEXP−CUCme.SAMS2:1:1(配列番号168)によってR世代において駆動された発現は、構成的レベルの発現を示し、発現における増加は、R世代に比べてR世代で多くの組織において観察された。
本発明の原理について例証し、記載したが、そのような原理から逸脱することなく、構成および細部において本発明を変更することができることは当業者らに明らかであるはずである。請求項の精神および範囲内にある変更はすべて、本発明の範囲内に含められることが意図される。本明細書において引用される刊行物および公開特許文書は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が、参照によって組み込まれるように明確にかつ個々に示されるのと同じ程度まで、参照によってこれによって組み込まれる。

Claims (15)

  1. a)遺伝子調節活性を示す、配列番号33の全長に対して少なくとも90パーセントの配列同一性を有する配列、
    b)配列番号33を含む配列、ならびに
    c)遺伝子調節活性を示す、配列番号33のヌクレオチド1−577を含む、配列番号33の断片
    からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、遺伝子調節機能活性を示すDNA分子であって、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている、DNA分子。
  2. 前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号33において記載されているポリヌクレオチド配列に対して少なくとも90パーセントの配列同一性を有する、請求項1に記載のDNA分子。
  3. 前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号33において記載されているポリヌクレオチド配列に対して少なくとも95パーセントの配列同一性を有する、請求項1に記載のDNA分子。
  4. 異種の転写可能なポリヌクレオチド分子が、農学的に重要な遺伝子を含む、請求項1に記載のDNA分子。
  5. 農学的に重要な遺伝子が、植物において除草剤耐性を与える、請求項4に記載のDNA分子。
  6. 農学的に重要な遺伝子が、植物において病虫害抵抗性を与える、請求項4に記載のDNA分子。
  7. a)遺伝子調節活性を示す、配列番号33の全長に対して少なくとも90パーセントの配列同一性を有する配列、
    b)配列番号33を含む配列、ならびに
    c)遺伝子調節活性を示す、配列番号33のヌクレオチド1−577を含む、配列番号33の断片
    からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、遺伝子調節機能活性を示す異種のDNA分子を含むトランスジェニック植物細胞であって、前記DNA分子が、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている、トランスジェニック植物細胞。
  8. 前記トランスジェニック植物細胞が、単子葉植物細胞である、請求項7に記載のトランスジェニック植物細胞。
  9. 前記トランスジェニック植物細胞が、双子葉植物細胞である、請求項7に記載のトランスジェニック植物細胞。
  10. a)遺伝子調節活性を示す、配列番号33の全長に対して少なくとも90パーセントの配列同一性を有する配列、
    b)配列番号33を含む配列、ならびに
    c)遺伝子調節活性を示す、配列番号33のヌクレオチド1−577を含む、配列番号33の断片
    からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、遺伝子調節機能活性を示すDNA分子を含むトランスジェニック植物またはその一部分であって、前記DNA分子が、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている、トランスジェニック植物またはその一部分。
  11. 遺伝子調節機能活性を示す前記DNA分子を含む、請求項10に記載のトランスジェニック植物の子孫植物またはその一部分。
  12. a)遺伝子調節活性を示す、配列番号33の全長に対して少なくとも90パーセントの配列同一性を有する配列、
    b)配列番号33を含む配列、ならびに
    c)遺伝子調節活性を示す、配列番号33のヌクレオチド1−577を含む、配列番号33の断片
    からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、遺伝子調節機能活性を示すDNA分子を含むトランスジェニック種子であって、前記DNA分子が、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている、トランスジェニック種子。
  13. 商品を製造する方法であって、
    a)1)遺伝子調節活性を示す、配列番号33の全長に対して少なくとも90パーセントの配列同一性を有する配列、
    2)配列番号33を含む配列、ならびに
    3)遺伝子調節活性を示す、配列番号33のヌクレオチド1−577を含む、配列番号33の断片
    からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、遺伝子調節機能活性を示すDNA分子を含むトランスジェニック植物またはその一部分であって、前記DNA分子が、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている、トランスジェニック植物またはその一部分を得ること、ならびに
    b)それらから商品を製造すること
    を含む、方法。
  14. 商品が、タンパク質濃縮物、タンパク質単離物、穀物、デンプン、種子、ミール、穀粉、バイオマス、または種子油である、請求項13に記載の方法。
  15. 転写可能なポリヌクレオチド分子を発現する方法であって、
    a)1)遺伝子調節活性を示す、配列番号33の全長に対して少なくとも90パーセントの配列同一性を有する配列、
    2)配列番号33を含む配列、ならびに
    3)遺伝子調節活性を示す、配列番号33のヌクレオチド1−577を含む、配列番号33の断片
    からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、遺伝子調節機能活性を示すDNA分子を含むトランスジェニック植物であって、前記DNA分子が、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている、トランスジェニック植物を得ること、ならびに
    b)前記転写可能なポリヌクレオチドが発現される、前記トランスジェニック植物を栽培すること
    を含む、方法。
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