JP6411472B2 - レーザスキャニング顕微鏡、および特に高解像度のスキャニング顕微鏡法で結像収差を修正する方法 - Google Patents

Description

本発明は、レーザスキャニング顕微鏡、および好ましくは高解像度のスキャニング顕微鏡法で、特に共焦点スキャニング顕微鏡法で、結像収差を修正する方法に関する。

従来技術より、このようなスキャニング顕微鏡の横方向と軸方向の解像度を照明光の回折限界を超えて向上させ、その際に結像収差を修正するさまざまな取組みが知られている。

まず最初に、共焦点スキャニング顕微鏡法によって、明らかなコントラスト改善と解像度改善が実現される。その場合には、焦点平面で物体を照明し、そこで蛍光分子を各点で励起するレーザが照明のために利用される。この蛍光が画像平面の絞り（ピンホール）に結像され、焦点平面から直接来る光だけが検出される。共焦点の結像により、（依然として回折限界を受ける）横方向の解像度を、従来型の顕微鏡法に比べて係数１．４だけ高くできる場合がある。このことはピンホールのサイズに依存して決まる。したがって、この場合にはピンホールのサイズを、結像されるべきスポットのサイズに合わせて最適化しなければならない。小さすぎるピンホールは有用な光の量を少なくし、大きすぎる絞りは多すぎる光を焦点平面の外部で許容し、多すぎる散乱光を許容してしまう。

Ｉ^ｎＭ顕微鏡法や４Ｐｉ顕微鏡法のような方法は、開口数の大きい２つの対物レンズを使用し、広視野または共焦点のレーザ蛍光コンフィギュレーションによって、あるいは干渉パターンの試料への投影による複数の励起光源の使用によって、検出平面の画像を重ね合わせることで軸方向の解像度を改善する。この場合、横方向の解像度は変わらないままである。

さらに別のスキャン式の高解像度方式は、特別に鮮明な画像が得られるＲＥＳＯＬＦＴ顕微鏡法（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｓａｔｕｒａｂｌｅ ｏｐｔｉｃａｌ （ｆｌｕｒｏｒｅｓｃｅｎｃｅ） ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ）である。従来式の対物レンズと回折ビームが使用されるにもかかわらず、分子スケールにまで回折限界を大幅に超える解像度が得られる。ＲＥＳＯＬＦＴ顕微鏡法は、色素を、照明後に（蛍光）信号で応答することができない状態に一時的に切り換えることによって、このような回折限界を克服する。

ＰＡＬＭ（Ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）法やＳＴＯＲＭ（Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）法により、スキャンをするのではない光学顕微鏡法の、厳密には蛍光顕微鏡法の、特別な手法が知られている。これらは個々の分子における蛍光の光制御式のオン・オフに基づいている。このときオン・オフは、個々の複数の画像を記録することができる、ある程度の時間帯にわたって行われる。引き続いてコンピュータ計算により、エルンスト・アッベにより記述された光学的な解像限界を超える解像度で、個々の分子の位置を決定することができる。

特許文献１より、照明あるいは照明パターンが、実現可能な光学的分解能を上回る精度で検出物に対して変位し、変位中に複数の画像が記録されて評価される、向上した解像度を有する顕微鏡法が公知である。

さらに、アダプティブ光学系すなわち光学的に有効なモジュールを、波面変調のために利用することが以前から知られている。アダプティブ光学系は光の位相および／または振幅を的確に変化させ、それにより、物体空間における焦点の変位とフォーミングだけでなく、場合により生じる収差の修正も惹起することができる。焦点の軸方向の変位は、波面における変化によって実現される。このとき焦点の軸方向の変位は波面の球面変化に相当しており、横方向の変位は波面の傾動に相当する。光路中での収差も同じく波面の変化によって補正される。このような操作は、変形可能なミラーを用いて、光路のひとみ平面で行われる。

このようなアダプティブ光学系はたとえば特許文献２、特許文献３、または特許文献４に記載されている。

たとえば試料誘起される波面収差（試料担体や浸漬媒体によって生じる波面収差を含む）を修正するためのアダプティブ光学系の利用は、多数の刊行物から知られている。

アダプティブ光学系を利用するときの問題は、常に、アダプティブ光学系のために制御信号が必要となることにある。すなわち波面収差を除去できるようになる前に、まず波面収差を決定しなければならない。一般に波面収差は既知ではない。

従来技術では２通りの解決の取組みがある：第１の解決法では、追加の測定システムを顕微鏡に組み込んで、たとえば通常の周知のシャックハルトマンセンサにより波面収差を直接的に測定する。たとえば特許文献５は、ハルトマンシャック波面センサを備える顕微鏡を示している。波面の形状をもとにして、試料に当たる光の散乱によって引き起こされる収差を決定可能である。このようにして性能（修正部材の修正自由度）に応じて、さまざまな現象を修正することができる。このことは、たとえばＳＬＭ（ｓｐａｔｉａｌ ｌｉｇｈｔ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）のように非常に多くの自由度を有する部材の場合、制御可能なピクセルの個数に相当する。このような部材を用いて、システムおよび試料の収差（ゆっくりと変化する波面）だけでなく高周波成分（散乱光）も、それが波面センサによってまだ測定できる限りにおいて修正することができる。スキャン位置に応じて特定の画像断片で、状況によっては非常に高周波であるこのような波面がこの部材で修正される。それにより、回折限界を受けるシステムのパフォーマンスを、媒体中や散乱する試料中でも、および特に顕微鏡の非消滅のシステム収差についても、実現することができる。

その帰結として、有限の個数しか利用可能でない貴重な光子をセンサのために使用しなければならず、このような光子を後から本来の測定のために利用することはできなくなる。

第２の解決法では、ＬＳＭ信号から反復式に波面収差を直接決定し、すなわち、ＬＳＭ信号が最善になるまで波面収差を最適化する。この場合には大量の反復サイクルが必要となり、文献では１０から３０のサイクルが報告されている。

蛍光団は退色していき、わずか５００００個ほどの光子しか放出することができない。つまり、従来技術に基づくこれら両方の解決法では、少ない光子の多くを、アダプティブミラーに対する制御信号の判定のために「犠牲に」しなければならないという欠点がある。

従来のスキャニング顕微鏡（ＳＴＥＤを除く）では原理上、常に、回折限界を受ける（理想的には点状の）スポットの結像は、点応答または点像関数あるいは点画像（英語ｐｏｉｎｔ ｓｐｒｅａｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ＰＳＦ）によって規定される、いわゆるエアリーディスクとして行われる。ＰＳＦは、理想化された点状の物体がシステムによってどのように結像されるかを表す。問題となるのは、エアリーディスクの希望される解像度をサブミリメートル単位で結像することができる相応のセンサあるいは検出器が現時点では利用可能でなく、それ以外の技術も非常に高価または非常に低速のいずれかであり、そのために商業的な利用には適していないことである。

従来のスキャニング顕微鏡法では結像スポットがピクセルごとに評価され、すなわち、各々のスポット位置についてちょうど１つのピクセルが評価され、あるいは、各々のスポット位置から全体像の１つのピクセルが生じる。その際には、検出器によって全体として記録された放射強度が（積分で）判定されて、グレースケールに変換されるにすぎない。場合により、スキャニングステップが比較的小さいときには、相応のピクセル、あるいは情報の重ね合わせを行うことができる。このときグレースケール解像度（色深度）を高めることで、コントラスト改善を実現することができる。使用されるＰＭＴまたはＰＭＴアレイ（Ｐｈｏｔｏ Ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ Ｔｕｂｅ）は、特定の増幅率で内部雑音を有しており、そのために信号品質が低下する。

これらのいずれの解決法においても、典型的に、試料のさまざまに異なる個所で、およびさまざまに異なる焦点位置で、誤差がそれぞれ変化するという問題が発生する。このような誤差は多くの場合に既知ではなく、あるいは、高いコストをかけた測定によって判定する必要がある。

蛍光顕微鏡では光子収量が限られているため、実際のＰＳＦの追加の測定はこれまで普通は行われていない（あるいは広視野顕微鏡法でのみ行われる）。

レーザスキャニング顕微鏡では、理想状態に対するシステムのさまざまな誤差や観察されるべき試料によって、理論上のＰＳＦが乱されている場合がある。そのため信号に不具合が生じやすく（雑音、信号対雑音比・・・）、最大の解像度を低下させてしまう。

欧州特許出願公開第２３１７３６２Ａ１号明細書 欧州特許第１２５３４５７Ｂ１号明細書 米国特許第７２２４２３Ｂ２号明細書 特開２００８−０２６６４３号公報 米国特許出願公開第２００４／０２２３２１４Ａ１号明細書

そこで本発明の課題は、好ましくは高解像度のスキャニング顕微鏡で、位置依存的な誤差修正をするためのスキャニング顕微鏡および方法を提供することにある。

この課題は請求項１の特徴を有するレーザスキャニング顕微鏡によって解決され、および請求項６の特徴を有する方法によって解決される。

好ましい変形例や実施例は従属請求項に記載されている。

収差はさまざまな影響要因に左右される。スキャニング顕微鏡の光学系の収差は既知であり、相応に修正することができる。試料と環境に依存する屈折率変動、温度変動、および異なるカバーガラス厚みは試料ごとに変わるが、それぞれの試料ではほぼ一定である。典型的な生物学的試料の特性はしばしば局所的にゆっくりとのみ変化する。その例外は奥行きのある試料での画像形成であり、そこでは多様性によっていっそう強い位置依存性が生じており、いっそう高い修正コストが必要とされる。

本発明は上述した問題を解決する。ＳＲ−ＬＳＭ信号（ＳＲ−ＬＳＭ：英語Ｓｕｐｅｒ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ−Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）は、通常のＬＳＭ信号とは違って光子数だけでなく、ＰＳＦの横方向の強度分布に関する情報も含んでいる。

検出器で測定された強度の積分は、スキャンミラーでの調整によって具体化される、その場所（スキャニング位置ｘ，ｙ）でのグレー値に関する情報をもたらす。

そしてＰＳＦの形状あるいは横解像度を利用して、収差のない理想的なＰＳＦに対する測定されたＰＳＦの誤差を表す収差をシステムで決定し、好ましい実施形態では、１つの部材（アダプティブ光学系）を通じて修正することができる。そのために、検出器アレイの個別検出器の信号が評価される。別案の実施形態では、顕微鏡画像のデジタル式の後処理によってソフトウェア工学的に、たとえばデコンボリューションによっても、修正を実行可能である。

すなわちこうして求められたＰＳＦは、波面収差に関する情報を追加的に含んでいる。したがって理想的には、ＰＳＦから波面収差を導出することができる。このことは純粋にコンピュータで行うことができ、すなわち、算出されるＰＳＦが測定されるＰＳＦに類似するまで、波面収差の推定を繰り返す。このようにしてコンピュータで求めたれた修正値により、好ましい実施形態ではアダプティブミラーが制御される。すると理想的な場合には、すでに２回目の測定のときに波面収差が修正されている。隣接するフィールド点は常に類似する波面収差を有しているので、２回目の測定をすでに隣接するフィールド点（スキャニング点）で行うことができる。そして測定されるＰＳＦは、わすかに位置変化のある波面収差に基づき、理想的なＰＳＦとは相違している可能性があり、この小さな誤差から、あらためてコンピュータで若干適合化された波面修正を計算することができる。

そして次のスキャニング位置では、わずかに修正された波面修正が測定される。このように本方法が反復して続行されるうちに、アダプティブ光学系を制御するための信号生成のために光子を「犠牲に」しなくてすみ、それにもかかわらず、ゆっくりと変化する残存の波面収差を修正できるという結果となる。

本発明によるレーザスキャニング顕微鏡は、さしあたり周知の形態と配置により、照明装置、スキャナ、アダプティブ光学系、および検出器の各コンポーネントを含んでいる。

すなわちこのレーザスキャニング顕微鏡は、照明スポットを提供するための照明装置と、検査されるべき試料にわたって連続するスキャニング位置で照明スポットを動かすためのスキャナと、コントロール装置を備えた、照明スポットの波面に影響を及ぼすためのアダプティブ光学系と、試料から放出される位置解像された結像スポットを検出するための検出器とを含んでいる。

本発明によると、検出器は各々のスキャニング位置で結像スポットの点像分布関数（ＰＳＦ_Ａｂｂ）を決定するための評価ユニットを含んでいる。このとき最新のスキャニング位置の点像分布関数は、１つまたは複数の先行または隣接する最新のスキャニング位置を起点として評価され、それにより、アダプティブ光学系をコントロール装置によって制御する。

そして検出器における特殊性は、結像スポットを非常に迅速に各々のスキャニング位置で実際に位置解像式に検出することにある。すなわち、結像スポットのエアリーディスクの２次元の結像から、適当な評価によって、このＰＳＦに対応する波面が決定される。理想的なＰＳＦは既知なので、そこから（従来どおり）光収量だけでなく、たとえば焦点外れ、コマ収差、非点収差のような収差も各々のスキャニング位置について抽出することができる。

このような特別な検出器を備えるＬＳＭでの解像度向上は、主として画像発生に関与する、ＬＳＭシステムの全体ＰＳＦによって説明することができる。これは励起ＰＳＦと、ピンホールの伝達関数で畳み込まれた検出器ＰＳＦとの積から算出される。

最大の解像度が得られるのは、ピンホールの伝達関数がデルタ関数に相当するときである。そのときに最大の解像度が得られる。しかしこの伝達関数では、光がほとんど検出器を通らない。したがって適用時には、相応の信号対雑音比のために十分な光子を実現する、拡張されたピンホールが常に使用される。ただし、それに伴って解像度の損失が常についてまわる。ＳＲ ＬＳＭでは、共焦点ピンホールの個所にエアリーディスクがある。検出器アレイの各々のピクセルが、非常に小さいピンホールに相当する。それにもかかわらず、全体として光が弱くなることはない。そして各々のピクセルにおける強度の評価から、検出器の最大の解像度を改善することができる。このような手順は未公開のＤＥ１０２０１２２０４１２８Ａ１に説明されており、その開示内容をここに全面的に取り入れるものとする。

修正波面を抽出するためのアルゴリズムについて重要なのは、ピクセル解像式あるいは位置解像式のＰＳＦだけである。

このようなオーダーでサブピクセル解像を実現するために、結像スポットをサブピクセルに細分する光学的な偏向部材（ファイバ光学系、マイクロミラーアレイ）によって、結像スポットが検出器アレイ（ＰＭＴアレイ）へ供給される。

検出器は個別検出器からなるアレイであるのが好ましい。特別に好適なのはＰＭＴ（Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ Ｔｕｂｅｓ）やＡＰＤ（Ａｖａｌａｎｃｈｅ Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ）である。ＰＭＴの個々の管は約０．８から２ｍｍの直径を有している。８個、１６個、３２個、６４個、およびこれ以上のチャネル（管）を有する実施形態が存在する。アレイとしての配置では、マイクロチャネルプレート（ＭＣＰ）に匹敵する間隔がそれぞれの管の間に存在する。

光学的な偏向部材は、個別部材（光ファイバ、マイクロミラー）の間に非常に小さい間隔だけを有しているのが好ましく、それにより、結像スポットの画像情報をより良く解像することができる。そしてこれらの個別部材の光量が、個別検出器の入力部へ直接的に供給される。

特別に好ましい偏向部材はその入力部に、（ほぼ）円形の断面で密接にパッケージングされて配置された光ファイバのバンドル（別案として、それぞれ別様に傾斜可能なマイクロミラーのアレイ、ファセットミラー、ＤＭＤ、またはアダプティブミラー）を有している。この断面は結像スポットに合わせて適合化されていなくてはならない。使用する検出器アレイに応じて個別部材の個数を選択する。９×９のＰＭＴアレイを使用できるのが好ましい。

偏向部材の出力部は、個別部材の光量を個別検出器へ供給するように構成されている。

本発明に基づいて２次元で解像されるエアリーディスクを用いて収差（高次の収差も含む）を判定し、理想的なＰＳＦ_{ｉｄｅａｌ}に合わせて画像表示を適合化（修正）することができる。

エアリーディスクの情報は直接的に、あるいは相応の制御ループへ組み込まれた後に、次のスキャン位置へアダプティブ光学系を制御するために利用できるのが好ましく、それにより、試料によって引き起こされる光学的な収差を補正する。

このとき決定的に重要なのは、各々のスキャン位置について個別画像で検出される結像スポットが、結像縮尺を考慮した上で、回折限界の個別画像の半値幅より少なくとも２倍の大きさの位置解像度で検出されることである。

本発明によると、アダプティブ光学系の適用はスキャニングシステムと同期して行われる。すなわち、各々のスキャニング位置について特定の修正関数を適用することで、局所的な誤差が補正される。それによってＰＳＦが改善され、このことは、ひいては改善された信号対雑音比をもたらす。それにより、各々のフィールド（スキャニング位置）での波面の修正によって位置依存的な収差も検出するという、広視野ではとり得ない選択肢をとることができる。

本発明の利点は、特に、新型の検出器（ＳＲ−ＬＳＭ）を通じて迅速な強度測定が可能であるという点に見ることができる。このことは、スキャン調整のためのＰＳＦの迅速な測定を実現するという他に類のない可能性を提供する。このとき波面の修正をただちに行うことができ（「オンザフライ」）、または、たとえばポストプロセス（測定されたＰＳＦによる事後的なデコンボリューション）でも行うことができる。いずれの手法についても、ＰＳＦを知ることが重要である。

検出器の信号は、理想的なＰＳＦに対する測定されたＰＳＦ_Ａｂｂの誤差を各々のスキャニング位置で決定し、修正を利用可能にするために用いられる。特に波面修正は、先行するスキャニング位置の波面測定を取り入れることができ、このことは、ゆっくりと変化する試料の場合、アルゴリズムのいっそう迅速な収束を可能にし、そのようにして、スキャニング速度を損なうことがいっそう少なくなる。そのためにアダプティブ光学系のコントロール装置は、スキャニング位置での結像スポットのＰＳＦと、理想的なＰＳＦ_{ｉｄｅａｌ}との比較によって修正関数が求められるように構成されている。

検出器アレイ（たとえば６４または８１チャネルのＰＭＴアレイ）の評価ユニットは、検出器アレイの解像度に応じて位置解像された結像スポットのＰＳＦを決定する。従来は結像スポットについて利用可能でなかったこのような情報を得ることで、最初は位置依存的な（スキャナ設定に依存する）収差を検出し、高速のアダプティブ光学系の利用によってこれを修正することが原理的に可能となる。

このような情報から、少なくともＰＳＦの重心が決定される。

重心位置から、たとえば横方向または軸方向における焦点誤差を導出することができる。

これに加えて任意選択として、非点収差、コマ収差、またはさまざまな歪み、あるいは収差に典型的なＰＳＦの対称性変化といった高次の結像収差の決定が可能である。

引き続いてＰＳＦから波面修正信号が判定され、これによってそれ自体公知のアダプティブ光学系を制御して、判定された誤差を各々のスキャニング位置で（オンザフライ）補正する。

波面修正信号はフィードフォワードループでアダプティブ光学系に伝送されて、たとえば隣接する、もしくは最新のスキャニング位置で波面信号に影響を及ぼす。

スキャン光学系がスキャンをしている間、アダプティブ光学系は、まず先行する位置のレーザのスキャン信号により制御される。このときシステムが学習をして、判定された波面修正信号が、好ましくは各々のスキャン位置についてルックアップテーブルに保存される。そしてスキャンが行われるたびに修正データが精密化されていき、ルックアップテーブルが更新される。ルックアップテーブルは、特に、考えられる後処理（デコンボリューション、英語Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）のためにも利用される。

波面修正信号は、照明（ＮＤＤ）もしくは検出ＰＳＦ（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｎｌｙ）のそのつどのスキャン位置で、または共通路（ｃｏｍｍｏｎ ｐａｔｈ）で印加されるようにトリガリングされるのが好ましく、それにより、ほぼ問題なくＰＳＦへのステップごとの接近が実現される。
第１のスキャニング位置（ｎ＝１，ｍ＝１）では、位置解像されたＰＳＦから第１の波面収差Ｗ_{（１，１）}が決定される。この波面収差は、たとえばゼルニケの波面収差

の合計として表され、ここで、
ｉ＝（たとえば２５のゼルニケ多項式について）４．．．２５
Ｚ_４＝焦点外れ
Ｚ_５／６ 非点収差
Ｚ_７／８ コマ収差
Ｚ_９ 球面収差
Ｚ_{１０／１１} ３波
Ｚ_{１２／１３} 高次非点収差
Ｚ_{１４／１５} 高次コマ収差
Ｚ_１６ 高次球面収差．．．

であり、Ａ（ｉ；ｎ，ｍ）はスキャニング位置（ｎ，ｍ）におけるｉ番目のゼルニケ波面収差の振幅である。第１のスキャニング位置での信号は大半の用途において修正しなくてよく、この画像情報はいわば「放棄」される。

第２のスキャニング位置ｎ＝２；ｍ＝１では、波面収差_{（１，１）}を用いて修正が行われる。現実の波面収差Ｗ_{（２，１）}は、調整された修正値とは若干相違している。スキャニング位置（２，１）で測定されたＰＳＦの差異を利用して、より良い波面修正値を決定する。振幅Ａ_{ｉ；ｎ，ｍ}は、スキャニング位置（ｎ，ｍ）にわたってゆっくりと変化する関数である。振幅のフィールド推移は通常は低次の多項式によって表すことができ、たとえば

であり、ここには振幅Ｂ_１，ｋおよびフィールド推移の基本多項式Ｆ_ｋが含まれており、たとえばｘにおける線形の推移と一定のｙについてはＦｋ＝２（ｘ−１）である。このように、波面収差は二重級数展開で表すことができる：

これにより、次のフィールド点（ｎ＋１；ｍ）または（ｎ，ｍ＋１）における確からしい波面収差を既知の測定から事前に算出しておき、この事前計算された修正値によってアダプティブミラーを制御することができる。

もっとも単純なケースでは、２つの隣接する測定点で算定された波面収差の勾配を決定して、次のフィールド点での波面収差を線形外挿によって推定する。

複数のフィールド点の後では、高次のフィールド推移多項式を取り入れることもできる。

当然のことながら、検出器によって公知のどのような評価でも行うことができる。
次に、図面を参照しながら本発明について詳しく説明する。図面は次のものを示している：

本発明による超解像レーザスキャニング顕微鏡（ＳＲ−ＬＳＭ）を示す模式図である。 本発明によるＳＲ−ＬＳＭの好ましい実施形態を示す模式図である。 アダプティブ光学系と接続可能なリレーを有する、図２に示すＳＲ−ＬＳＭの改変された実施形態である。 さまざまな収差について位置解像されたＰＳＦである。 個別検出器のさまざまな測定強度を有する検出器アレイを示す模式図である。

図１は、試料支持体２に配置された試料Ｐを顕微鏡観察するために構成された超解像レーザスキャニング顕微鏡１（以下、ＳＲ−ＬＳＭと略称する）を模式的に示している。ＳＲ−ＬＳＭ１は図示しない制御装置によって制御され、照明光路Ｂと結像光路Ｄとを含んでいる。照明光路Ｂは試料Ｐのスポットを照明する。結像光路Ｄは、試料で放出／反射された放射を、回折限界で結像スポットに結像する。

ＬＳＭ１はそれ自体として公知の仕方で構成されている：レーザ３が光学系４を介してミラー５に入力結合される。ミラー５を介して、レーザビームＢは反射角のもとでエミッションフィルタ６へと誘導され、そこで反射されてスキャナ７へと誘導される。スキャナ７は、試料ＰにわたってのレーザビームＢのスキャン運動を確実に行わせる。スキャナ７は、波面変調のためのアダプティブ光学系１７を装備しているのが好ましい。あるいは、アダプティブ光学系１７がこれ以外の個所でＬＳＭ１の照明光路Ｂに組み込まれ、周知の仕方で構成されていてもよい。

レーザビームＢは、スキャン対物レンズ８およびチューブレンズ９により、対物レンズ１０を通って試料Ｐのスポット１１へと集束される。

スポット１１で励起された蛍光放射（結像光路Ｄ）が、対物レンズ１０および光学系９，８を介して再びスキャナ７に到達する。結像方向で見てスキャナ７に後続するように、静止ビームＤがある。エミッションフィルタ６および１２が周知の仕方により結像光路Ｄに配置されており、スポット１１からの蛍光放射をその波長に関して選別する。光学系１３は、スポット１１が検出平面１５で結像スポット１４（二次元のエアリーディスク）として特定のサイズで確実に結像させる。検出平面１５は、スポット１１の平面に対して共役の平面あるいはひとみ平面である。検出器１６が結像スポット１４を位置解像および強度解像されるように検出する。

図示しない制御装置がＬＳＭ１のすべてのコンポーネントを制御し、特にスキャナ７、検出器１６、およびアダプティブ光学系１７を制御する。

検出器１６は、図示した実施形態では、結像をしない光学的な再分配部材としてのファイバオプティクス、特に光ファイバ１８からなるバンドルを含んでいる。それぞれの個々の光ファイバ１８が、ここでは結像スポット１４の１つのピクセルを表す。バンドルの入力部１９は検出平面１５に配置されている。このとき光ファイバ１８は互いに密接に押し合わされて配置されており、あるいはパッケージングされており、それにより、結像スポット１４を全面的に検出することができる円形に類似する構造またはほぼ円形の構造が生じている。

光ファイバ１８の出力側の端部は、出力部として、検出器アレイ２０の入力部と結合されている。この結合は固定的に、またはたとえばコネクタによって取外し可能なように、実現されていてよい。検出器アレイ２０は、本実施形態では、光電子増倍管（ＰＭＴ）またはアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）を、検出平面１５でピクセルが必要とされる個数だけ含んでいる。ＰＭＴは、検出されるデータを同一のスキャンステップで処理できるようにするために十分に高速で作動する。

このような構造の１つの特別な利点は、再分配部材あるいはファイバオプティクスの入力部１９の断面よりも設計スペース技術的に大きい検出器アレイ２０が検出平面１５の外部に配置されていてよく、また、利用可能な設計スペースに応じて、個々の管あるいは部材の任意の形状／配置を有することができることにある。検出器アレイ２０を結像平面で直接使用しようとすれば、結像スポットを検出器アレイのサイズまで相応に拡大しなければならないことになり、このことは技術的にしばしば問題となる。

検出器アレイ２０の後段には評価ユニット２１があり、ここで位置解像および強度解像された検出器アレイ２０のデータが評価、処理される。その際に、焦点位置についてのＰＳＦを表す、２次元で位置解像されたエアリーディスクが検出される。このとき検出器の各々のピクセルで、エアリーディスクの一部の光量が検出される。つまり検出器アレイ２０によって放射強度を位置解像式に検出することができ、その様子は詳細図Ａ（出典ウィキペディア：ｐｏｉｎｔ ｓｐｒｅａｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）に示唆されている。

さまざまな１次および高次の収差についてＰＳＦがわかることで、多項式決定により、存在している収差の種類と程度を計算し、これらを制御ループによって算出することが可能である。当業者はそのために必要な計算を知っており、相応の制御ルーチンと評価ルーチンを具体化することができる。顕微鏡画像の最終的な画像ピクセルについて、検出された総光量からグレー値が決定されるときに、このような収差を考慮に入れることができる。場合により、エアリーディスクはサブピクセル領域のさらに別の情報も供給し、このような情報は顕微鏡画像で隣接するピクセルにとって有意義な場合があり、そこで相応に考慮される。

すなわち評価ユニット２１は、図示しない画像処理ユニットへピクセルデータを供給する。これに加えて、評価ユニット２１のデータが理想的なＰＳＦ（詳細図Ａ）と比較され、その結果として生じる修正波面がアダプティブ光学系１７の制御部に供給されて、次のスキャン位置でオンザフライ画像修正のために利用される。

図２には、別個のアダプティブ光学系が存在するＳＲ−ＬＳＭの好ましい実施形態が模式的に示されている。顕微鏡１は、上で説明した仕方により、試料ホルダ２に配置された試料Ｐを共焦点の検出器１６へ結像するように機能する。検出器１６は、先ほどの図面で説明したように構成されており、図示しない光学的な再分配部材を装備している。

試料の照明は、同じく周知の仕方により、アダプティブミラー２２により焦点位置および横方向位置に関して、ならびに収差の修正のために影響を及ぼすことが可能な、スキャナ７により試料の上で可動であるレーザ光源３を通じて行われる。結像は周知の仕方により、対物レンズ１０とチューブレンズ９を通じて中間画像Ｓへと行われる。そこから光はさらにスキャン対物レンズ８を介して、スキャナ７が配置されている共役のひとみ平面Ｔに入る。第１のリレー光学系２３を介して、アダプティブミラー２２が配置されている第２のひとみ平面Ｕが生成される。

共役のひとみ平面Ｕと第１のリレー光学系２３との間では、別の共役のひとみ平面あるいは中間画像Ｖが生じる。第２のリレーレンズ２４，２５を介して、中間画像は図１で説明した仕方により検出器１６へ結像される。検出器は評価ユニット２１へ信号を供給する。ここで判定される位置解像されたＰＳＦから修正信号が求められ、これがアダプティブミラー２２の制御のためにコントロール装置２６へ供給され、それによって照明光路の波面に影響が及ぼされる。

アダプティブ光学系と任意選択で接続可能なリレー光学系２７が設けられていてよい。

図３は、第２の（追加の）アダプティブ光学系を有する、本発明によるＳＲ−ＬＳＭ１のさらに別の実施形態を模式的な図面で示している。このＳＲ−ＬＳＭ１は、上で説明したのと同じ原理的構造を有している。同じ符号は同じコンポーネントを意味している。したがって、これらの部品の再度の説明はここでは省略する。ここではＳＲ−ＬＳＭ１はひとみ平面Ｕに、（任意選択として）同じくアダプティブミラーとして用いられる第２のスキャンミラー２８を含んでいる。第２のリレー光学系２７は、第２のアダプティブミラー２９と接続可能なリレーとして、第３の共役ひとみＷに配置されている。この第２のリレー光学系２７は、共同で利用される光学系３０と、分離された光学系３１とを含んでいる。当業者はこのような光学系の構造を知っているので、ここでは詳細な説明は省略する。

アダプティブミラー２２，２８，２９は変形可能なミラーであるのが好ましく、その変形は、存在している波面収差が補正されるように調整することができる。このシステムは、たとえば第１のアダプティブミラー２２，２８が、焦点位置と球面収差を変更するために高速で変形可能なミラーであり、それに対して第２の変形可能なミラー２９はコマ収差や非点収差のような回転対称でない波面収差を修正するように設計されていてもよい。それにより、実施態様に応じてモジュール形式のシステム拡張を実現できる。

評価ユニット２１では第１のスキャン位置の検出器信号が分析され、たとえば比率によって第１の波面変形が判定される。理想的な波面信号がわかっているので、修正信号が判定されてコントロール装置２６へ供給される。１つまたは場合により複数のアダプティブミラー２２，２８，２９が、第２のスキャニング位置について修正信号により制御される。そして検出器１６では、第２のスキャニング位置についての信号あるいはＰＳＦの結像が受信され、第１の検出器信号または理想的なＰＦＳと比較される。第２のスキャニング位置の信号に基づいて、新たな波面変形およびこれに対応する修正信号を判定し、それによってアダプティブミラーを以後のスキャニング位置について制御することができる。このような反復式のプロセスは、通常、非常に迅速に収束していく。３回から８回のサイクルの後に、検出器信号が理想的なＰＳＦにほぼ一致することが予想される。

スキャナ７が次のスキャニング位置のために制御されている間に、反復的なプロセスを行うことができる。試料の隣接するスキャニング位置は、通常、非常に類似する波面収差を有している。１つ／複数のアダプティブミラー２２，２８，２９のためのコントロール装置２６は、スキャンミラー７のための信号発生器と結合することができる。

第１のスキャニング位置における第１の波面修正が決定された後、スキャンミラー７が隣接する第２のスキャニング位置へ移動する。修正をするために、第１のスキャニング位置の波面変形が設定される。第２の最新のスキャニング位置での測定をベースとして、信号発生器が新たな第２の波面修正を判定し、これが隣接する第３のスキャニング位置に適用される。したがって測定が迅速であれば、波面修正は理想的な修正に、わずかしか「遅れをとる」ことがない。

それぞれのスキャニング位置に対応する波面修正を修正係数として表に保存しておくことができ、それにより、同一あるいは類似する試料での以後の測定では波面変形をあらためて判定しなくてもよくなり、あるいは、最適化のための明瞭なスタート点が得られる。

図４は、ＰＳＦの位置解像された記録（図ＡおよびＢ）についての２通りの例と、これに対応するさまざまな収差についての強度分布（図ＣおよびＤ）とを示している。これらの図面から、異なる収差をそれぞれの対称性に基づいてＰＳＦの包絡線の形状からどのように認識できるかが明らかである。図Ａではコマ収差の結像収差を有するＰＳＦ、図Ｂでは焦点外れの結像収差を有するＰＳＦが示されている。

図ＢおよびＣはセンサ信号の強度推移を、Ｘ軸の断面について実線の曲線４０として示すとともに、ｙ軸を通る断面について点線の表示４１として示している。

図Ｃでは、軸断面４０，４１の間の対称性の違いを明らかに認識することができる。図Ｄでは、高い強度は非対称で、ただし中心から離れて存在することを認識することができる。

詳細な評価のために、考えられるすべての（当然ながら分散した）ステップをＰＳＦの結像によって実施、評価して、高次の収差を検出して相応に補正することもできるはずである。

図５は、結像スポット１４がＰＳＦとして位置解像されて、たとえば９×９の個別検出器４２から構成される検出器アレイ２０によってどのように検出されるかを一例として示している。ここでは異なるグレー値は、個別センサの異なる測定強度を表している。図ａ）では、回転対称でない収差を明らかに認識することができ、それに対して、図ｂはほぼ理想的なＰＳＦを示している。

１ ＳＲ−ＬＳＭ：超解像レーザスキャニング顕微鏡
２ 試料ホルダ
３ レーザ
４ 光学系
５ ミラー
６ エミッションフィルタ
７ スキャナ
８ スキャン対物レンズ
９ チューブレンズ
１０ 対物レンズ
１１ スポット
１２ エミッションフィルタ
１３ 光学系
１４ 結像スポット
１５ 検出平面
１６ 検出器
１７ アダプティブ光学系
１８ 光ファイバ
１９ 入力部
２０ 検出器アレイ
２１ 評価ユニット
２２ アダプティブミラーリレー光学系
２４ リレーレンズ
２５ リレーレンズ
２６ コントロール装置
２７ リレー光学系
２８ スキャンミラー
２９ アダプティブミラー
３０ 光学系
３１ 光学系
４０ 軸断面
４１ 軸断面
４２ 個別検出器
Ｐ 試料
Ｂ 照明光路
Ｄ 結像光路
Ｓ 中間画像
Ｔ，Ｕ，Ｖ ひとみ平面

Claims (12)

1. 照明スポットを提供する照明装置と、
   検査されるべき試料にわたって連続するスキャニング位置で照明スポットを動かすスキャナと、
   照明スポットの波面に影響を及ぼすコントロール装置を備えたアダプティブ光学系と、
   試料から放出される位置解像された結像スポットを検出する検出器とを含むレーザスキャニング顕微鏡において、
   前記検出器の接続された評価ユニットは、
   （ｉ）前記試料にわたって前記照明スポットを連続的にスキャンするステップと、
   （ｉｉ）各々のスキャニング位置で結像スポットの点像分布関数（ＰＳＦ_Ａｂｂ）を決定するステップと、
   （ｉｉｉ）スキャニング位置における前記ＰＳＦ_Ａｂｂと理想的な点像分布関数（ＰＳＦ_{ｉｄｅａｌ}）との間の差異を判定するステップと、
   （ｉｖ）前記スキャニング位置におけるＰＳＦ_ＡｂｂとＰＳＦ_{ｉｄｅａｌ}との間の差異から波面修正信号を判定するステップと、
   （ｖ）前記アダプティブ光学系を調整するために前記コントロール装置へ前記波面修正信号を供給するステップと、
   を含む、レーザ走査顕微鏡。
2. 前記検出器は少なくとも４つの個別検出器からなる検出器アレイと非結像式の再分配部材とを含んでおり、前記再分配部材の入力部は検出平面に配置されており、前記再分配部材は検出平面からの放射を個別検出器へ分配することを特徴とする、請求項１に記載のレーザ走査顕微鏡。
3. 前記再分配部材は光ファイバからなるバンドルを含んでおり、前記光ファイバは入力部では円形に束ねられており、前記個別検出器側の出力部では前記入力部とは異なる幾何学的配置を有していることを特徴とする、請求項２に記載のレーザ走査顕微鏡。
4. 前記再分配部材はそれぞれ別様に傾斜可能なマイクロミラーを有する少なくとも１つのマイクロミラーアレイを含んでいることを特徴とする、請求項２に記載のレーザ走査顕微鏡。
5. 前記検出器はアバランシェフォトダイオードまたは光電子増倍管からなるアレイであることを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載のレーザ走査顕微鏡。
6. 走査顕微鏡法において結像収差を修正する方法において、
   （ｉ）走査顕微鏡を用いてスキャニング位置で位置解像された結像スポットを検出するステップと、
   （ｉｉ）各々のスキャニング位置で前記結像スポットの点像分布関数（ＰＳＦ_Ａｂｂ）を決定するステップと、
   （ｉｉｉ）スキャニング位置における理想的な点像分布関数（ＰＳＦ_{ｉｄｅａｌ}）と前記ＰＳＦ_Ａｂｂとの間の差異を判定するステップと、
   （ｉｖ）前記スキャニング位置における前記ＰＳＦ_{ｉｄｅａｌ}と前記ＰＳＦ_Ａｂｂとの間の差異から波面修正信号を算出するステップと、
   （ｖ）前記波面修正信号でアダプティブ光学系を調整するために前記波面修正信号をコントロール装置へ供給するステップと、
   を有している方法。
7. 前記方法はさらに、（ｖｉ）試料にわたって前記結像スポットを走査する間に、前記ステップ（ｉ）乃至（ｖ）を繰り返すステップを有することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
8. 前記各々のスキャニング位置での前記波面修正信号を合算しながら前記ステップが反復され、反復のたびごとに修正係数がルックアップテーブルに保存されることを特徴とする、請求項６または７に記載の方法。
9. 前記走査顕微鏡は、前記アダプティブ光学系として第１のアダプティブ光学系と第２のアダプティブ光学系とを有し、
   前記波面修正信号が第１の波面修正信号と第２の波面修正信号とに分割され、前記第１の波面修正信号は回転対称の修正に関する情報を含むとともに、第１のアダプティブ光学系を制御するように機能し、前記第２の波面修正信号は回転対称でない修正に関する情報を含むとともに、第２のアダプティブ光学系を制御するように機能することを特徴とする、請求項６から８のいずれかに記載の方法。
10. 前記各々のスキャニング位置について個別画像で検出される前記結像スポットは結像縮尺を考慮した上で回折限界個別画像の半値幅の少なくとも２倍の大きさの位置解像度で検出されることを特徴とする、請求項６から９のいずれかに記載の方法。
11. 前記結像スポットのＰＳＦ_Ａｂｂの判定は検出器アレイの個別検出器の測定強度の評価によって行われ、前記検出器アレイにおける個別検出器の位置がピクセルに割り当てられ、測定強度は、位置解像された前記結像スポットにおけるグレー値に割り当てられることを特徴とする、請求項６から１０のいずれかに記載の方法。
12. 前記各々のスキャニング位置についての前記波面修正信号が顕微鏡画像のデコンボリューションのために用いられることを特徴とする、請求項６に記載の方法。

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