JP6484337B2 - インスリン受容体部分アゴニスト - Google Patents

Description

本発明は、インスリン受容体で部分アゴニストとして作用するインスリン二量体およびインスリンアナログ二量体に関する。

インスリンは、１型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）患者および多くの２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）に必須の療法であり、過去１０年間の全抗糖尿病薬使用者の中の米国患者の３分の１近くに処方されている。インスリンの世界市場は２０１３年に２０４億米ドルであり、他の全抗糖尿病薬を合わせたよりも速い速度で成長している。

しかしながら、狭いＴＩから低血糖および体重増加までを含む現在のインスリン療法の課題が、その広範囲での採用と、患者が理想的な血糖管理を達成する可能性とを制限している。

食事に応答した食事のインスリン分泌に加え、膵臓は血漿グルコースレベルによって大いに支配される「基礎」速度でインスリンを放出して適切な空腹時グルコース調節を維持している。これは主に、内因性インスリンの肝臓選択作用により肝臓グルコース放出を制御することによって達成される。現代のインスリンアナログは、速効型インスリンおよび基礎インスリン、ならびにこれら２種の混合物を含む。速効型インスリンアナログ（ＲＡＡ）は食後高血糖を制御するために開発されており、一方、長時間作用を有するインスリンは基礎グルコースレベルを調節する。長時間作用性インスリンは、全てのＴ１ＤＭによって（食事の注射と組み合わせて）使用されており、Ｔ２ＤＭ患者の大部分がそのインスリン療法を基礎製品から始めている。世界的な糖尿病人口（特にＴ２ＤＭ）が跳ね上がっているために、基礎インスリン消費は急速に増加している。

過去数十年にわたる連続的な開発努力にもかかわらず、利用可能な長時間作用性インスリンは生理学的基礎インスリンに比べて未だ最適化されていない。これは一部は、これらのアナログのＰＫ平坦性を改善することに焦点が当てられており、低血糖リスクの増加に寄与する末梢組織の相対的過剰インスリン処置（ｏｖｅｒ−ｉｎｓｕｌｉｎｉｚａｔｉｏｎ）を修復することが焦点ではなかったためである。結果として、低血糖は、患者への大きな負担を伴う重要な医的リスクのままであり、これが有意な罹患率および死亡率の原因となっている。

本発明は、インスリン分子二量体を形成するよう共有結合した２個のインスリン分子を含む化合物であって、通常のインスリン様効力を有するが、最大活性が減少したインスリン受容体を活性化し得る化合物を提供する。これらの化合物はインスリン受容体部分アゴニスト（ＩＰＲＡ）であり：これらは他のインスリンアナログ様の挙動を示し、グルコースを有効に低下させるものの、低血糖のリスクは低い。

現在の標準治療（ＳＯＣ）基礎インスリンに対して改善した治療指数（ＴＩ）を示す新規かつ変革的な基礎インスリン（１日１回投与）として製剤化されるインスリン受容体部分アゴニスト共有結合インスリン二量体が提供される。一実施形態では、本発明のＩＰＲＡが、糖尿病ミニブタにおいて、低血糖のリスクを低下させつつ、グルコースを有効に低下させることができ、１日１回（ＱＤ）基礎インスリン特性を有する。改善したＴＩは、開業医が本発明のＩＲＰＡをより積極的に投与して空腹時グルコース管理の最終目標の達成を可能にし得る。ＩＲＰＡによる空腹時グルコースとＨｂＡｌｃとの厳格な管理によって、これが１）Ｔ２ＤＭにおける有効性および安全性プロファイルが増強した独立型の長時間作用性インスリン、および２）さらなる食事の速効型インスリンアナログ（ＲＡＡ）用量と共に使用するためのＴ１ＤＭ（および一部のＴ２ＤＭ）における改善した基本的な基礎インスリンとして働くことが可能になり得る。よって、本発明は以下の実施形態を提供する。

本発明は、インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体を提供し、これらは第１のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体と第２のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体とを含み、各ヘテロ二量体はＡ鎖ポリペプチドとＢ鎖ポリペプチドとを含み、Ａ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドは鎖間ジスルフィド結合によって連結しており；第１および第２のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体は、２個のそれぞれのＢ鎖ポリペプチドのカルボキシ末端またはその近くのアミノ酸側鎖を連結する連結部分を介して一緒に共有結合しており；Ａ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドの少なくとも１つのアミノ末端は置換基と共有結合しており、但し、連結部分はジスルフィド結合を含まない。特定の態様では、第１のインスリンまたはインスリンアナログの少なくともＡ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドのアミノ末端が置換基と共有結合している。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体の特定の態様では、各Ａ鎖ポリペプチドおよび各Ｂ鎖ポリペプチドのアミノ末端が置換基と共有結合している。特定の態様では、第１のインスリンまたはインスリンアナログのＡ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドのアミノ末端ならびに第２のインスリンまたはインスリンアナログのＡ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドのアミノ末端はそれぞれ、置換基と共有結合している。第１および第２のインスリンまたはインスリンアナログのアミノ末端が置換基と共有結合している実施形態では、第１のインスリンまたはインスリンアナログのＡ鎖およびＢ鎖ポリペプチドのアミノ末端上の置換基が、第２のインスリンまたはインスリンアナログのＡ鎖およびＢ鎖ポリペプチドのアミノ末端上の置換基と同じであってもよい。第１および第２のインスリンまたはインスリンアナログのアミノ末端が置換基と共有結合している実施形態では、第１のインスリンまたはインスリンアナログのＡ鎖およびＢ鎖ポリペプチドのアミノ末端上の置換基が、第２のインスリンまたはインスリンアナログのＡ鎖およびＢ鎖ポリペプチドのアミノ末端上の置換基とが異なっていてもよい。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体のさらなる態様では、第１および第２のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体が同じであるか、または第１および第２のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体が異なる。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体のなおさらなる態様では、連結部分が、それぞれのＢ鎖ポリペプチドのカルボキシ末端またはその近くのリジン残基のεアミノ基を介して第１のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体と第２のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体を共有結合している。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体のなおさらなる態様では、置換基が一般式ＲＣ（Ｏ）−（ＲはＲ’ＣＨ２、Ｒ’ＮＨ、Ｒ’Ｏであり得、Ｒ’はＨ、直鎖アルキル鎖、アミノ酸、ペプチド、ＰＥＧ、糖類であり得る）を有し、特定の態様では、ＲＣ（Ｏ）−がアセチル、フェニルアセチル、カルバモイル、Ｎ−アルキルカルバモイルまたはアルコキシカルボニルであり得る。特定の態様では、置換基がアセチル、フェニルアセチル、カルバモイル、Ｎ−アルキルカルバモイル、イソブチル、メトキシアセチル、グリシン、アミノエチルグルコース（ＡＥＧ）、ＡＥＧ−Ｃ６、ＰＥＧ１、ＰＥＧ２、Ｎ−ジメチルおよびアルコキシカルボニルからなる群から選択される。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体の特定の態様では、各Ａ鎖ポリペプチドが独立に、アミノ酸配列
ＧＸ_２Ｘ_３ＥＱＣＣＸ_８ＳＩＣＳＬＹＱＬＸ_１７ＮＸ_１９ＣＸ_２３（配列番号３）を含み、各Ｂ鎖ポリペプチドが独立に、アミノ酸配列
Ｘ_２５ＬＣＧＸ_２９Ｘ_３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＸ２７ＹＴＸ_３１Ｘ_３２（配列番号４）または
Ｘ_２２ＶＮＱＸ_２５Ｘ_２６ＣＧＸ_２９Ｘ_３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＸ_２７ＹＴＸ_３１Ｘ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４Ｘ_３５（配列番号５）を含み、Ｘ_２がイソロイシンまたはスレオニンであり；Ｘ_３がバリン、グリシンまたはロイシンであり；Ｘ_８がスレオニンまたはヒスチジンであり；Ｘ_１７がグルタミン酸またはグルタミンであり；Ｘ_１９がチロシン、４−メトキシ−フェニルアラニン、アラニンまたは４−アミノフェニルアラニンであり；Ｘ_２３がアスパラギンまたはグリシンであり；Ｘ_２２がフェニルアラニンまたはデスアミノ−フェニルアラニンであり；Ｘ_２５がヒスチジンまたはスレオニンであり；Ｘ_２６がロイシンまたはグリシンであり；Ｘ_２７がフェニルアラニンまたはアスパラギン酸であり；Ｘ_２９がアラニン、グリシンまたはセリンであり；Ｘ_３０がヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸またはシステイン酸であり；Ｘ_３１がアスパラギン酸、プロリンまたはリジンであり；Ｘ_３２がリジンまたはプロリンであり；Ｘ_３３がスレオニン、アラニンまたは非存在であり；Ｘ_３４がアルギニンまたは非存在であり；Ｘ_３５がアルギニンまたは非存在であり；但し、Ｘ_３１またはＸ_３２の少なくとも１つがリジンである。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体の特定の態様では、第１および第２のインスリンまたはインスリンアナログが独立に、天然ヒトインスリン、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、デスＢ３０インスリンまたはインスリングラルギンである。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体の特定の態様では、連結部分がアシル、脂肪族、複素脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環からなる群から選択される置換されていてもよい基であり得る。連結部分は、１個または複数のメチレン単位が独立に、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ_２−、ＳＯ_２Ｎ（Ｒ）−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基によって置き換えられていてもよく、Ｒの各出現が独立に、水素、適切な保護基、アシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分または複素脂肪族部分である、二価の、直鎖または分岐の、飽和または不飽和の、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２０炭化水素鎖であり得る。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体のなおさらなる態様では、連結部分がアシル部分、−Ｃ（Ｏ）ＲＣ（Ｏ）−（Ｒはアルキル鎖、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）鎖、アミド含有鎖、（１又は複数の）トリアゾール含有鎖、シクロオクチン含有部分、置換アシル鎖またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖である）である。

さらなる態様では、連結部分がアルキルジオイル、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎＣ（Ｏ）−（式中、ｎ＝０〜４５であり、それだけに限らないが、オキサリル（Ｃ２）部分、スクシニル（Ｃ４）部分、アジポイル（Ｃ６）部分、スベリオル（ｓｕｂｅｒｙｏｌ）（Ｃ８）部分、デカンジオイル（Ｃ１０）部分、ドデカンジオイル（Ｃ１２）部分、テトラデカンジオイル（Ｃ１４）部分またはヘキサデカンジオイル（Ｃ１６）部分を含む）である。

本発明はさらに、式
Ｄ^１−Ｌ−Ｄ^２
（式中、Ｄ^１およびＤ^２はそれぞれ独立に、インスリンまたはインスリンアナログポリペプチドであり、各インスリンポリペプチドは鎖間ジスルフィド結合を通して連結しているＡ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドを含むヘテロ二量体であり；Ｌはリンカー部分の一端がＤ^１のカルボキシル基またはその近くのアミノ酸残基と結合しており、リンカー部分の他端がＤ^２のカルボキシル末端またはその近くのアミノ酸残基と結合している連結部分であり、但し、Ｌはジスルフィド結合を含まず；第１および第２のインスリンまたはインスリンアナログポリペプチドはＡ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドのアミノ末端と結合した置換基を含む）
を含むインスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体を提供する。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体のさらなる態様では、Ｄ^１およびＤ^２が同じであるか、またはＤ^１およびＤ^２が異なる。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体のさらなる態様では、連結部分がＤ^１およびＤ^２のカルボキシ末端またはその近くのリジン残基のεアミノ基を介してＤ^１とＤ^２を共有結合している。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体のなおさらなる態様では、置換基が一般式ＲＣ（Ｏ）−（ＲはＲ’ＣＨ２、Ｒ’ＮＨ、Ｒ’Ｏであり得、Ｒ’はＨ、直鎖アルキル鎖、アミノ酸、ペプチド、ＰＥＧ、糖類であり得る）を有し、特定の態様では、ＲＣ（Ｏ）−がアセチル、フェニルアセチル、カルバモイル、Ｎ−アルキルカルバモイルまたはアルコキシカルボニルであり得る。特定の態様では、置換基がアセチル、フェニルアセチル、カルバモイル、Ｎ−アルキルカルバモイル、イソブチル、メトキシアセチル、グリシン、アミノエチルグルコース（ＡＥＧ）、ＡＥＧ−Ｃ６、ＰＥＧ１、ＰＥＧ２、Ｎ−ジメチルおよびアルコキシカルボニルからなる群から選択される。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体の特定の態様では、各Ａ鎖ポリペプチドが独立に、アミノ酸配列
ＧＸ_２Ｘ_３ＥＱＣＣＸ_８ＳＩＣＳＬＹＱＬＸ_１７ＮＸ_１９ＣＸ_２３（配列番号３）を含み、各Ｂ鎖ポリペプチドが独立に、アミノ酸配列
Ｘ_２５ＬＣＧＸ_２９Ｘ_３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＸ２７ＹＴＸ_３１Ｘ_３２（配列番号４）または
Ｘ_２２ＶＮＱＸ_２５Ｘ_２６ＣＧＸ_２９Ｘ_３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＸ_２７ＹＴＸ_３１Ｘ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４Ｘ_３５（配列番号５）を含み、Ｘ_２がイソロイシンまたはスレオニンであり；Ｘ_３がバリン、グリシンまたはロイシンであり；Ｘ_８がスレオニンまたはヒスチジンであり；Ｘ_１７がグルタミン酸またはグルタミンであり；Ｘ_１９がチロシン、４−メトキシ−フェニルアラニン、アラニンまたは４−アミノフェニルアラニンであり；Ｘ_２３がアスパラギンまたはグリシンであり；Ｘ_２２がフェニルアラニンまたはデスアミノ−フェニルアラニンであり；Ｘ_２５がヒスチジンまたはスレオニンであり；Ｘ_２６がロイシンまたはグリシンであり；Ｘ_２７がフェニルアラニンまたはアスパラギン酸であり；Ｘ_２９がアラニン、グリシンまたはセリンであり；Ｘ_３０がヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸またはシステイン酸であり；Ｘ_３１がアスパラギン酸、プロリンまたはリジンであり；Ｘ_３２がリジンまたはプロリンであり；Ｘ_３３がスレオニン、アラニンまたは非存在であり；Ｘ_３４がアルギニンまたは非存在であり；Ｘ_３５がアルギニンまたは非存在であり；但し、Ｘ_３１またはＸ_３２の少なくとも１つがリジンである。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体のさらなる態様では、Ｄ^１およびＤ^２が独立に、天然ヒトインスリン、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、デスＢ３０インスリンまたはインスリングラルギンである。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体の特定の態様では、連結部分がアシル、脂肪族、複素脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環からなる群から選択される置換されていてもよい基であり得る。連結部分は、１個または複数のメチレン単位が独立に、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ_２−、ＳＯ_２Ｎ（Ｒ）−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基によって置き換えられていてもよく、Ｒの各出現が独立に、水素、適切な保護基、アシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分または複素脂肪族部分である、二価の、直鎖または分岐の、飽和または不飽和の、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２０炭化水素鎖であり得る。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体のなおさらなる態様では、連結部分がアシル部分、−Ｃ（Ｏ）ＲＣ（Ｏ）−（Ｒはアルキル鎖、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）鎖、アミド含有鎖、（１又は複数の）トリアゾール含有鎖、シクロオクチン含有部分、置換アシル鎖またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖である）である。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体のさらなる態様では、連結部分がアルキルジオイル、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎＣ（Ｏ）−（式中、ｎ＝０〜４５であり、それだけに限らないが、オキサリル（Ｃ２）部分、スクシニル（Ｃ４）部分、アジポイル（Ｃ６）部分、スベリオル（ｓｕｂｅｒｙｏｌ）（Ｃ８）部分、デカンジオイル（Ｃ１０）部分、ドデカンジオイル（Ｃ１２）部分、テトラデカンジオイル（Ｃ１４）部分またはヘキサデカンジオイル（Ｃ１６）部分を含む）である。

上記インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体のいずれか１つと、薬学的に許容される担体とを含む組成物がさらに提供される。

本発明はさらに、第１のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体と第２のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体とを含むインスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体であって、各ヘテロ二量体はＡ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドを含み、Ａ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドは鎖間ジスルフィド結合を通して連結しており；第１および第２のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体は２個のそれぞれのＢ鎖ポリペプチドのカルボキシ末端またはその近くのアミノ酸の側鎖を連結する連結部分を通して一緒に共有結合しており；第１のインスリンポリペプチドまたは第２のインスリンポリペプチドのＡ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドの少なくとも１つのアミノ末端は置換基と共有結合していてもよく、但し、（１）連結部分はジスルフィド結合を含まず、（２）インスリンまたはインスリンアナログがヒトインスリンまたはインスリンアナログでなく、Ａ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドのアミノ末端が置換基を含まない場合、連結部分がオキサリル（Ｃ２）部分でも、スベリオル（Ｃ８）部分でも、ドデカンジオイル（Ｃ１２）部分でもない、インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体を提供する。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体のさらなる態様では、第１および第２のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体が同じであるか、または第１および第２のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体が異なる。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体のさらなる態様では、連結部分が、それぞれのＢ鎖ポリペプチドのカルボキシ末端またはその近くのリジン残基のεアミノ基を介して第１のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体と第２のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体を共有結合している。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体のなおさらなる態様では、置換基が一般式ＲＣ（Ｏ）−（ＲはＲ’ＣＨ２、Ｒ’ＮＨ、Ｒ’Ｏであり得、Ｒ’はＨ、直鎖アルキル鎖、アミノ酸、ペプチド、ＰＥＧ、糖類であり得る）を有し、特定の態様では、ＲＣ（Ｏ）−がアセチル、フェニルアセチル、カルバモイル、Ｎ−アルキルカルバモイルまたはアルコキシカルボニルであり得る。特定の態様では、置換基がアセチル、フェニルアセチル、カルバモイル、Ｎ−アルキルカルバモイル、イソブチル、メトキシアセチル、グリシン、アミノエチルグルコース（ＡＥＧ）、ＡＥＧ−Ｃ６、ＰＥＧ１、ＰＥＧ２、Ｎ−ジメチルおよびアルコキシカルボニルからなる群から選択される。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体のさらなる態様では、第１および第２のインスリンまたはインスリンアナログが独立に、天然ヒトインスリン、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、デスＢ３０インスリンまたはインスリングラルギンである。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体の特定の態様では、各Ａ鎖ポリペプチドが独立に、アミノ酸配列
ＧＸ_２Ｘ_３ＥＱＣＣＸ_８ＳＩＣＳＬＹＱＬＸ_１７ＮＸ_１９ＣＸ_２３（配列番号３）を含み、各Ｂ鎖ポリペプチドが独立に、アミノ酸配列
Ｘ_２５ＬＣＧＸ_２９Ｘ_３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＸ２７ＹＴＸ_３１Ｘ_３２（配列番号４）または
Ｘ_２２ＶＮＱＸ_２５Ｘ_２６ＣＧＸ_２９Ｘ_３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＸ_２７ＹＴＸ_３１Ｘ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４Ｘ_３５（配列番号５）を含み、Ｘ_２がイソロイシンまたはスレオニンであり；Ｘ_３がバリン、グリシンまたはロイシンであり；Ｘ_８がスレオニンまたはヒスチジンであり；Ｘ_１７がグルタミン酸またはグルタミンであり；Ｘ_１９がチロシン、４−メトキシ−フェニルアラニン、アラニンまたは４−アミノフェニルアラニンであり；Ｘ_２３がアスパラギンまたはグリシンであり；Ｘ_２２がフェニルアラニンまたはデスアミノ−フェニルアラニンであり；Ｘ_２５がヒスチジンまたはスレオニンであり；Ｘ_２６がロイシンまたはグリシンであり；Ｘ_２７がフェニルアラニンまたはアスパラギン酸であり；Ｘ_２９がアラニン、グリシンまたはセリンであり；Ｘ_３０がヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸またはシステイン酸であり；Ｘ_３１がアスパラギン酸、プロリンまたはリジンであり；Ｘ_３２がリジンまたはプロリンであり；Ｘ_３３がスレオニン、アラニンまたは非存在であり；Ｘ_３４がアルギニンまたは非存在であり；Ｘ_３５がアルギニンまたは非存在であり；但し、Ｘ_３１またはＸ_３２の少なくとも１つがリジンである。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体の特定の態様では、連結部分がアシル、脂肪族、複素脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環からなる群から選択される置換されていてもよい基であり得る。連結部分は、１個または複数のメチレン単位が独立に、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ_２−、ＳＯ_２Ｎ（Ｒ）−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基によって置き換えられていてもよく、Ｒの各出現が独立に、水素、適切な保護基、アシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分または複素脂肪族部分である、二価の、直鎖または分岐の、飽和または不飽和の、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２０炭化水素鎖であり得る。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体のなおさらなる態様では、連結部分がアシル部分、−Ｃ（Ｏ）ＲＣ（Ｏ）−（Ｒはアルキル鎖、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）鎖、アミド含有鎖、（１又は複数の）トリアゾール含有鎖、シクロオクチン含有部分、置換アシル鎖またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖である）である。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体のさらなる態様では、連結部分がＣ２〜Ｃ２０アシル部分である。

特定の態様では、連結部分がアルキルジオイル、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎＣ（Ｏ）−（式中、ｎ＝０〜４５であり、それだけに限らないが、オキサリル（Ｃ２）部分、スクシニル（Ｃ４）部分、アジポイル（Ｃ６）部分、スベリオル（Ｃ８）部分、デカンジオイル（Ｃ１０）部分、ドデカンジオイル（Ｃ１２）部分、テトラデカンジオイル（Ｃ１４）部分またはヘキサデカンジオイル（Ｃ１６）部分を含む）である。

上記インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体のいずれか１つと、薬学的に許容される担体とを含む組成物がさらに提供される。

本発明はさらに、式
Ｄ^１−Ｌ−Ｄ^２
（式中、Ｄ^１およびＤ^２はそれぞれ独立に、インスリンまたはインスリンアナログポリペプチドであり、各インスリンポリペプチドは鎖間ジスルフィド結合を通して連結しているＡ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドを含むヘテロ二量体であり；Ｌはリンカー部分の一端がＤ^１のカルボキシル基またはその近くのアミノ酸残基と結合しており、リンカー部分の他端がＤ^２のカルボキシル末端またはその近くのアミノ酸残基と結合している連結部分であり、但し、Ｌはジスルフィド結合を含まず、Ｄ^１またはＤ^２の少なくとも１つはＤ^１またはＤ^２のＡ鎖ポリペプチドまたはＢ鎖ポリペプチドのアミノ末端と結合した置換基を含んでいてもよく、但し、（１）連結部分はジスルフィド結合を含まず、（２）Ａ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドのアミノ末端が置換基を含まない場合、連結部分はオキサリル（Ｃ２）部分でも、スベリオル（Ｃ８）部分でも、ドデカンジオイル（Ｃ１２）部分でもない）
を含むインスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体を提供する。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体のさらなる態様では、Ｄ^１およびＤ^２が同じであるか、またはＤ^１およびＤ^２が異なる。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体のさらなる態様では、連結部分がＤ^１およびＤ^２のカルボキシ末端またはその近くのリジン残基のεアミノ基を介してＤ^１とＤ^２を共有結合している。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体のなおさらなる態様では、置換基が一般式ＲＣ（Ｏ）−（ＲはＲ’ＣＨ２、Ｒ’ＮＨ、Ｒ’Ｏであり得、Ｒ’はＨ、直鎖アルキル鎖、アミノ酸、ペプチド、ＰＥＧ、糖類であり得る）を有し、特定の態様では、ＲＣ（Ｏ）−がアセチル、フェニルアセチル、カルバモイル、Ｎ−アルキルカルバモイルまたはアルコキシカルボニルであり得る。特定の態様では、置換基がアセチル、フェニルアセチル、カルバモイル、Ｎ−アルキルカルバモイル、イソブチル、メトキシアセチル、グリシン、アミノエチルグルコース（ＡＥＧ）、ＡＥＧ−Ｃ６、ＰＥＧ１、ＰＥＧ２、Ｎ−ジメチルおよびアルコキシカルボニルからなる群から選択される。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体のさらなる態様では、Ｄ^１およびＤ^２が独立に、天然ヒトインスリン、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、デスＢ３０インスリンまたはインスリングラルギンである。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体の特定の態様では、各Ａ鎖ポリペプチドが独立に、アミノ酸配列
ＧＸ_２Ｘ_３ＥＱＣＣＸ_８ＳＩＣＳＬＹＱＬＸ_１７ＮＸ_１９ＣＸ_２３（配列番号３）を含み、各Ｂ鎖ポリペプチドが独立に、アミノ酸配列
Ｘ_２５ＬＣＧＸ_２９Ｘ_３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＸ２７ＹＴＸ_３１Ｘ_３２（配列番号４）または
Ｘ_２２ＶＮＱＸ_２５Ｘ_２６ＣＧＸ_２９Ｘ_３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＸ_２７ＹＴＸ_３１Ｘ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４Ｘ_３５（配列番号５）を含み、Ｘ_２がイソロイシンまたはスレオニンであり；Ｘ_３がバリン、グリシンまたはロイシンであり；Ｘ_８がスレオニンまたはヒスチジンであり；Ｘ_１７がグルタミン酸またはグルタミンであり；Ｘ_１９がチロシン、４−メトキシ−フェニルアラニン、アラニンまたは４−アミノフェニルアラニンであり；Ｘ_２３がアスパラギンまたはグリシンであり；Ｘ_２２がフェニルアラニンまたはデスアミノ−フェニルアラニンであり；Ｘ_２５がヒスチジンまたはスレオニンであり；Ｘ_２６がロイシンまたはグリシンであり；Ｘ_２７がフェニルアラニンまたはアスパラギン酸であり；Ｘ_２９がアラニン、グリシンまたはセリンであり；Ｘ_３０がヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸またはシステイン酸であり；Ｘ_３１がアスパラギン酸、プロリンまたはリジンであり；Ｘ_３２がリジンまたはプロリンであり；Ｘ_３３がスレオニン、アラニンまたは非存在であり；Ｘ_３４がアルギニンまたは非存在であり；Ｘ_３５がアルギニンまたは非存在であり；但し、Ｘ_３１またはＸ_３２の少なくとも１つがリジンである。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体の特定の態様では、連結部分がアシル、脂肪族、複素脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環からなる群から選択される置換されていてもよい基であり得る。連結部分は、１個または複数のメチレン単位が独立に、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ_２−、ＳＯ_２Ｎ（Ｒ）−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基によって置き換えられていてもよく、Ｒの各出現が独立に、水素、適切な保護基、アシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分または複素脂肪族部分である、二価の、直鎖または分岐の、飽和または不飽和の、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２０炭化水素鎖であり得る。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体のなおさらなる態様では、連結部分がアシル部分、−Ｃ（Ｏ）ＲＣ（Ｏ）−（Ｒはアルキル鎖、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）鎖、アミド含有鎖、（１又は複数の）トリアゾール含有鎖、シクロオクチン含有部分、置換アシル鎖またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖である）である。

インスリン受容体部分アゴニストまたはインスリン二量体のさらなる態様では、連結部分がＣ２〜Ｃ２０アシル部分である。

特定の態様では、連結部分がアルキルジオイル、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎＣ（Ｏ）−（式中、ｎ＝０〜４５であり、それだけに限らないが、オキサリル（Ｃ２）部分、スクシニル（Ｃ４）部分、アジポイル（Ｃ６）部分、スベリオル（Ｃ８）部分、デカンジオイル（Ｃ１０）部分、ドデカンジオイル（Ｃ１２）部分、テトラデカンジオイル（Ｃ１４）部分またはヘキサデカンジオイル（Ｃ１６）部分を含む）である。

本発明はさらに、第１のインスリンアナログヘテロ二量体と第２のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体とを含むインスリンアナログ二量体であって、各ヘテロ二量体はＡ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドを含み、Ａ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドは鎖間ジスルフィド結合を通して連結しており；第１および第２のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体は２個のそれぞれのＢ鎖ポリペプチドのカルボキシ末端またはその近くのアミノ酸の側鎖を連結する連結部分を通して一緒に共有結合しており；インスリンアナログはインスリンリスプロ、インスリンアスパルトおよびインスリングラルギンから選択され；第１のインスリンポリペプチドまたは第２のインスリンポリペプチドのＡ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドの少なくとも１つのアミノ末端は置換基と共有結合していてもよく、但し、連結部分はジスルフィド結合を含まない、インスリンアナログ二量体を提供する。

インスリン受容体部分アゴニストのさらなる態様では、第１および第２のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体が同じであるか、または第１および第２のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体が異なる。

インスリン受容体部分アゴニストのさらなる態様では、連結部分が、それぞれのＢ鎖ポリペプチドのカルボキシ末端またはその近くのリジン残基のεアミノ基を介して第１のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体と第２のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体を共有結合している。

インスリン受容体部分アゴニストのなおさらなる態様では、置換基が一般式ＲＣ（Ｏ）−（ＲはＲ’ＣＨ２、Ｒ’ＮＨ、Ｒ’Ｏであり得、Ｒ’はＨ、直鎖アルキル鎖、アミノ酸、ペプチド、ＰＥＧ、糖類であり得る）を有し、特定の態様では、ＲＣ（Ｏ）−がアセチル、フェニルアセチル、カルバモイル、Ｎ−アルキルカルバモイルまたはアルコキシカルボニルであり得る。特定の態様では、置換基がアセチル、フェニルアセチル、カルバモイル、Ｎ−アルキルカルバモイル、イソブチル、メトキシアセチル、グリシン、アミノエチルグルコース（ＡＥＧ）、ＡＥＧ−Ｃ６、ＰＥＧ１、ＰＥＧ２、Ｎ−ジメチルおよびアルコキシカルボニルからなる群から選択される。

インスリン受容体部分アゴニストのさらなる態様では、第１および第２のインスリンまたはインスリンアナログの少なくとも１つがポリエチレングリコール、糖部分または複素環とさらに結合している。

インスリン受容体部分アゴニストの特定の態様では、連結部分がアシル、脂肪族、複素脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環からなる群から選択される置換されていてもよい基であり得る。連結部分は、１個または複数のメチレン単位が独立に、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ_２−、ＳＯ_２Ｎ（Ｒ）−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基によって置き換えられていてもよく、Ｒの各出現が独立に、水素、適切な保護基、アシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分または複素脂肪族部分である、二価の、直鎖または分岐の、飽和または不飽和の、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２０炭化水素鎖であり得る。

インスリン受容体部分アゴニストのなおさらなる態様では、連結部分がアシル部分、−Ｃ（Ｏ）ＲＣ（Ｏ）−（Ｒはアルキル鎖、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）鎖、アミド含有鎖、（１又は複数の）トリアゾール含有鎖、シクロオクチン含有部分、置換アシル鎖またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖である）である。

インスリン受容体部分アゴニストのさらなる態様では、連結部分がＣ２〜Ｃ２０アシル部分である。

特定の態様では、連結部分がアルキルジオイル、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎＣ（Ｏ）−（式中、ｎ＝０〜４５であり、それだけに限らないが、オキサリル（Ｃ２）部分、スクシニル（Ｃ４）部分、アジポイル（Ｃ６）部分、スベリオル（Ｃ８）部分、デカンジオイル（Ｃ１０）部分、ドデカンジオイル（Ｃ１２）部分、テトラデカンジオイル（Ｃ１４）部分またはヘキサデカンジオイル（Ｃ１６）部分を含む）である。

本発明はさらに、式
Ｄ^１−Ｌ−Ｄ^２
（式中、Ｄ^１およびＤ^２はそれぞれ独立に、インスリンまたはインスリンアナログポリペプチドであり、各インスリンポリペプチドは鎖間ジスルフィド結合を通して連結しているＡ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドを含むヘテロ二量体であり；Ｌはリンカー部分の一端がＤ^１のカルボキシル基またはその近くのアミノ酸残基と結合しており、リンカー部分の他端がＤ^２のカルボキシル末端またはその近くのアミノ酸残基と結合している連結部分であり、但し、Ｌはジスルフィド結合を含まず；インスリンアナログはインスリンリスプロ、インスリンアスパルトおよびインスリングラルギンから選択され；Ｄ^１またはＤ^２の少なくとも１つはＤ^１またはＤ^２のＡ鎖ポリペプチドまたはＢ鎖ポリペプチドのアミノ末端と結合した置換基を含んでいてもよく；但し、連結部分はジスルフィド結合を含まない）
を含むインスリンアナログ二量体を提供する。

インスリン受容体部分アゴニストのさらなる態様では、Ｄ^１およびＤ^２が同じであるか、またはＤ^１およびＤ^２が異なる。

インスリン受容体部分アゴニストのさらなる態様では、連結部分がＤ^１およびＤ^２のカルボキシ末端またはその近くのリジン残基のεアミノ基を介してＤ^１とＤ^２を共有結合している。

インスリン受容体部分アゴニストのなおさらなる態様では、置換基が一般式ＲＣ（Ｏ）−（ＲはＲ’ＣＨ２、Ｒ’ＮＨ、Ｒ’Ｏであり得、Ｒ’はＨ、直鎖アルキル鎖、アミノ酸、ペプチド、ＰＥＧ、糖類であり得る）を有し、特定の態様では、ＲＣ（Ｏ）−がアセチル、フェニルアセチル、カルバモイル、Ｎ−アルキルカルバモイルまたはアルコキシカルボニルであり得る。特定の態様では、置換基がアセチル、フェニルアセチル、カルバモイル、Ｎ−アルキルカルバモイル、イソブチル、メトキシアセチル、グリシン、アミノエチルグルコース（ＡＥＧ）、ＡＥＧ−Ｃ６、ＰＥＧ１、ＰＥＧ２、Ｎ−ジメチルおよびアルコキシカルボニルからなる群から選択される。

インスリン受容体部分アゴニストの特定の態様では、連結部分がアシル、脂肪族、複素脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環からなる群から選択される置換されていてもよい基であり得る。連結部分は、１個または複数のメチレン単位が独立に、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ_２−、ＳＯ_２Ｎ（Ｒ）−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基によって置き換えられていてもよく、Ｒの各出現が独立に、水素、適切な保護基、アシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分または複素脂肪族部分である、二価の、直鎖または分岐の、飽和または不飽和の、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２０炭化水素鎖であり得る。

インスリン受容体部分アゴニストのなおさらなる態様では、連結部分がアシル部分、−Ｃ（Ｏ）ＲＣ（Ｏ）−（Ｒはアルキル鎖、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）鎖、アミド含有鎖、（１又は複数の）トリアゾール含有鎖、シクロオクチン含有部分、置換アシル鎖またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖である）である。

インスリン受容体部分アゴニストのさらなる態様では、連結部分がＣ２〜Ｃ２０アシル部分である。

特定の態様では、連結部分がアルキルジオイル、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎＣ（Ｏ）−（式中、ｎ＝０〜４５であり、それだけに限らないが、オキサリル（Ｃ２）部分、スクシニル（Ｃ４）部分、アジポイル（Ｃ６）部分、スベリオル（Ｃ８）部分、デカンジオイル（Ｃ１０）部分、ドデカンジオイル（Ｃ１２）部分、テトラデカンジオイル（Ｃ１４）部分またはヘキサデカンジオイル（Ｃ１６）部分を含む）である。

本発明は、
第１のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体と第２のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体とを含むインスリン受容体部分アゴニストであって、各ヘテロ二量体はＡ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドを含み、Ａ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドは鎖間ジスルフィド結合を通して連結しており；第１および第２のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体は２個のそれぞれのＢ鎖ポリペプチドのカルボキシ末端またはその近くのアミノ酸の側鎖を連結する連結部分を通して一緒に共有結合しており；第１のインスリンポリペプチドまたは第２のインスリンポリペプチドのＡ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドの少なくとも１つのアミノ末端は置換基と共有結合していてもよく；インスリン受容体部分アゴニストは、機能的リン酸化アッセイによって測定される、ヒトインスリン受容体（ＩＲ）に対する天然ヒトインスリンの最大応答の約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％または７０％のＩＲに対する最大応答を有する、インスリン受容体部分アゴニスト；または
第１のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体と第２のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体とを含むインスリン受容体部分アゴニストであって、各ヘテロ二量体はＡ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドを含み、Ａ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドは鎖間ジスルフィド結合を通して連結しており；第１および第２のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体は２個のそれぞれのＢ鎖ポリペプチドのカルボキシ末端またはその近くのアミノ酸の側鎖を連結する連結部分を通して一緒に共有結合しており；第１のインスリンポリペプチドまたは第２のインスリンポリペプチドのＡ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドの少なくとも１つのアミノ末端は置換基と共有結合していてもよく；インスリン受容体部分アゴニストは、機能的リン酸化アッセイによって測定される、ヒトインスリン受容体（ＩＲ）に対する天然ヒトインスリンの最大応答の２０％〜７０％の間、４０％〜７０％の間、５０％〜７０％の間、４０％〜６０％の間または２０％〜４０％の間のＩＲに対する最大応答を有する、インスリン受容体部分アゴニスト；または
第１のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体と第２のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体とを含むインスリン受容体部分アゴニストであって、各ヘテロ二量体はＡ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドを含み、Ａ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドは鎖間ジスルフィド結合を通して連結しており；第１および第２のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体は２個のそれぞれのＢ鎖ポリペプチドのカルボキシ末端またはその近くのアミノ酸の側鎖を連結する連結部分を通して一緒に共有結合しており；第１のインスリンポリペプチドまたは第２のインスリンポリペプチドのＡ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドの少なくとも１つのアミノ末端は置換基と共有結合していてもよく；インスリン受容体部分アゴニストは、機能的リン酸化アッセイによって測定される、ヒトインスリン受容体（ＩＲ）に対する天然ヒトインスリンの最大応答の少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％または７０％のＩＲに対する最大応答を有する、インスリン受容体部分アゴニスト；または
第１のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体と第２のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体とを含むインスリン受容体部分アゴニストであって、各ヘテロ二量体はＡ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドを含み、Ａ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドは鎖間ジスルフィド結合を通して連結しており；第１および第２のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体は２個のそれぞれのＢ鎖ポリペプチドのカルボキシ末端またはその近くのアミノ酸の側鎖を連結する連結部分を通して一緒に共有結合しており；第１のインスリンポリペプチドまたは第２のインスリンポリペプチドのＡ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドの少なくとも１つのアミノ末端は置換基と共有結合していてもよく；インスリン受容体部分アゴニストは、機能的リン酸化アッセイによって測定される、ヒトインスリン受容体（ＩＲ）に対する天然ヒトインスリンの最大応答の７０％未満のＩＲに対する最大応答を有する、インスリン受容体部分アゴニスト；または
第１のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体と第２のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体とを含むインスリン受容体部分アゴニストであって、各ヘテロ二量体はＡ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドを含み、Ａ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドは鎖間ジスルフィド結合を通して連結しており；第１および第２のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体は２個のそれぞれのＢ鎖ポリペプチドのカルボキシ末端またはその近くのアミノ酸の側鎖を連結する連結部分を通して一緒に共有結合しており；第１のインスリンポリペプチドまたは第２のインスリンポリペプチドのＡ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドの少なくとも１つのアミノ末端は置換基と共有結合していてもよく；インスリン受容体部分アゴニストは、機能的リン酸化アッセイによって測定される、ヒトインスリン受容体（ＩＲ）に対する天然ヒトインスリンの最大応答の約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％または７０％のＩＲに対する最大応答を有する、インスリン受容体部分アゴニスト
を提供する。

上記実施形態では、機能的リン酸化アッセイが、インスリン受容体（ＩＲ）ＡＫＴ−リン酸化アッセイであり得る。

インスリン受容体部分アゴニストのさらなる態様では、連結部分がジスルフィド結合を含まず、Ａ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドのアミノ末端が置換基を含まない場合、連結部分がオキサリル（Ｃ２）部分でも、スベリオル（Ｃ８）部分でも、ドデカンジオイル（Ｃ１２）部分でもない。

インスリン受容体部分アゴニストのさらなる態様では、第１および第２のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体が同じであるか、または第１および第２のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体が異なる。

インスリン受容体部分アゴニストのさらなる態様では、連結部分が、それぞれのＢ鎖ポリペプチドのカルボキシ末端またはその近くのリジン残基のεアミノ基を介して第１のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体と第２のインスリンまたはインスリンアナログヘテロ二量体を共有結合している。

インスリン受容体部分アゴニストのなおさらなる態様では、置換基が一般式ＲＣ（Ｏ）−（ＲはＲ’ＣＨ２、Ｒ’ＮＨ、Ｒ’Ｏであり得、Ｒ’はＨ、直鎖アルキル鎖、アミノ酸、ペプチド、ＰＥＧ、糖類であり得る）を有し、特定の態様では、ＲＣ（Ｏ）−がアセチル、フェニルアセチル、カルバモイル、Ｎ−アルキルカルバモイルまたはアルコキシカルボニルであり得る。特定の態様では、置換基がアセチル、フェニルアセチル、カルバモイル、Ｎ−アルキルカルバモイル、イソブチル、メトキシアセチル、グリシン、アミノエチルグルコース（ＡＥＧ）、ＡＥＧ−Ｃ６、ＰＥＧ１、ＰＥＧ２、Ｎ−ジメチルおよびアルコキシカルボニルからなる群から選択される。

インスリン受容体部分アゴニストのさらなる態様では、第１および第２のインスリンまたはインスリンアナログが独立に、天然ヒトインスリン、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、デスＢ３０インスリンまたはインスリングラルギンである。

インスリン受容体部分アゴニストの特定の態様では、各Ａ鎖ポリペプチドが独立に、アミノ酸配列
ＧＸ_２Ｘ_３ＥＱＣＣＸ_８ＳＩＣＳＬＹＱＬＸ_１７ＮＸ_１９ＣＸ_２３（配列番号３）を含み、各Ｂ鎖ポリペプチドが独立に、アミノ酸配列
Ｘ_２５ＬＣＧＸ_２９Ｘ_３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＸ２７ＹＴＸ_３１Ｘ_３２（配列番号４）または
Ｘ_２２ＶＮＱＸ_２５Ｘ_２６ＣＧＸ_２９Ｘ_３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＸ_２７ＹＴＸ_３１Ｘ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４Ｘ_３５（配列番号５）を含み、Ｘ_２がイソロイシンまたはスレオニンであり；Ｘ_３がバリン、グリシンまたはロイシンであり；Ｘ_８がスレオニンまたはヒスチジンであり；Ｘ_１７がグルタミン酸またはグルタミンであり；Ｘ_１９がチロシン、４−メトキシ−フェニルアラニン、アラニンまたは４−アミノフェニルアラニンであり；Ｘ_２３がアスパラギンまたはグリシンであり；Ｘ_２２がフェニルアラニンまたはデスアミノ−フェニルアラニンであり；Ｘ_２５がヒスチジンまたはスレオニンであり；Ｘ_２６がロイシンまたはグリシンであり；Ｘ_２７がフェニルアラニンまたはアスパラギン酸であり；Ｘ_２９がアラニン、グリシンまたはセリンであり；Ｘ_３０がヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸またはシステイン酸であり；Ｘ_３１がアスパラギン酸、プロリンまたはリジンであり；Ｘ_３２がリジンまたはプロリンであり；Ｘ_３３がスレオニン、アラニンまたは非存在であり；Ｘ_３４がアルギニンまたは非存在であり；Ｘ_３５がアルギニンまたは非存在であり；但し、Ｘ_３１またはＸ_３２の少なくとも１つがリジンである。

インスリン受容体部分アゴニストの特定の態様では、連結部分がアシル、脂肪族、複素脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環からなる群から選択される置換されていてもよい基であり得る。連結部分は、１個または複数のメチレン単位が独立に、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ_２−、ＳＯ_２Ｎ（Ｒ）−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基によって置き換えられていてもよく、Ｒの各出現が独立に、水素、適切な保護基、アシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分または複素脂肪族部分である、二価の、直鎖または分岐の、飽和または不飽和の、置換されていてもよいＣ１〜２０炭化水素鎖であり得る。

インスリン受容体部分アゴニストのなおさらなる態様では、連結部分がアシル部分、−Ｃ（Ｏ）ＲＣ（Ｏ）−（Ｒはアルキル鎖、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）鎖、アミド含有鎖、（１又は複数の）トリアゾール含有鎖、シクロオクチン含有部分、置換アシル鎖またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖である）である。

インスリン受容体部分アゴニストのさらなる態様では、連結部分がＣ２〜Ｃ２０アシル部分である。

特定の態様では、連結部分がアルキルジオイル、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎＣ（Ｏ）−（式中、ｎ＝０〜４５であり、それだけに限らないが、オキサリル（Ｃ２）部分、スクシニル（Ｃ４）部分、アジポイル（Ｃ６）部分、スベリオル（Ｃ８）部分、デカンジオイル（Ｃ１０）部分、ドデカンジオイル（Ｃ１２）部分、テトラデカンジオイル（Ｃ１４）部分またはヘキサデカンジオイル（Ｃ１６）部分を含む）である。

本発明はさらに、リンカー１、リンカー２、リンカー３、リンカー１０、リンカー１１、リンカー１２、リンカー１３、リンカー１４、リンカー１５、リンカー１６、リンカー１７、リンカー１８、リンカー１９、リンカー２０、リンカー２１、リンカー２２、リンカー２３、リンカー２４、リンカー２５、リンカー２６、リンカー２７、リンカー２８、リンカー２９、リンカー３０、リンカー３１、リンカー３２、リンカー３３、リンカー３４、リンカー３５、リンカー３６、リンカー３７、リンカー３８、リンカー３９、リンカー４０、リンカー４１、リンカー４２、リンカー４３、リンカー４４、リンカー４５、リンカー４６、リンカー４７、リンカー４８、リンカー４９およびリンカー５０からなる群から選択される二官能性リンカーによって結合された、第１のＡ鎖ポリペプチドおよび第１のＢ鎖ポリペプチドを有する第１のインスリンヘテロ二量体分子の第１のＢ２９またはＢ２８ Ｌｙｓと、第２のＡ鎖ポリペプチドおよび第２のＢ鎖ポリペプチドを有する第２のインスリンヘテロ二量体の第２のＢ２９またはＢ２８ Ｌｙｓとを含むインスリン二量体であって、但し、二官能性リンカーがリンカー１０、リンカー１１、リンカー１２、リンカー１３またはリンカー１４である場合、第１または第２のＡ鎖またはＢ鎖ポリペプチドの少なくとも１つがそのＮ末端アミノ酸で置換基と結合している、あるいは少なくとも第１のインスリンヘテロ二量体分子のＮ末端アミノ酸が置換基と結合している、あるいは第１のインスリンヘテロ二量体と第２のインスリンヘテロ二量体の両方のＮ末端アミノ酸が置換基と結合している、インスリン二量体を提供する。

特定の実施形態では、置換基が、一般式ＲＣ（Ｏ）−（ＲはＲ’ＣＨ_２、Ｒ’ＮＨ、Ｒ’Ｏであり得、Ｒ’はＨ、直鎖アルキル鎖、アミノ酸、ペプチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、糖類であり得る）を有する基と連結したＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む。特定の実施形態では、置換基がカルバモイル基、アセチル基、グリシン、メチル基、メトキシ基、ジメチル基、イソブチル基、ＰＥＧ１基、ＡＥＧ基、ＡＥＧ−Ｃ６アルキル基またはＰＥＧ２基である。

本発明はさらに、第１のリンカーおよび第２のリンカーを介して結合した、リンカー５およびリンカー７からなる群から選択される第１のリンカーと結合した第１のＡ鎖ポリペプチドおよび第１のＢ鎖ポリペプチドを有する第１のインスリンヘテロ二量体分子の第１のＢ２９またはＢ２８ Ｌｙｓと、リンカー４、リンカー６、リンカー８およびリンカー９からなる群から選択される第２のリンカーと結合した第２のＡ鎖ポリペプチドおよび第２のＢ鎖ポリペプチドを有する第２のインスリンヘテロ二量体の第２のＢ２９またはＢ２８ Ｌｙｓとを含むインスリン二量体を提供する。

さらなる実施形態では、本発明は、リンカー５およびリンカー７からなる群から選択される第１のリンカーと結合した第１のＡ鎖ポリペプチドおよび第１のＢ鎖ポリペプチドを有する第１のインスリンヘテロ二量体分子の第１のＢ２９またはＢ２８ Ｌｙｓと、リンカー５およびリンカー７からなる群から選択される第２のリンカーと結合した第２のＡ鎖ポリペプチドおよび第２のＢ鎖ポリペプチドを有する第２のインスリンヘテロ二量体の第２のＢ２９またはＢ２８ Ｌｙｓとを含むインスリンアナログ二量体であって、第１および第２のリンカーが構造

（Ｒは共有結合、炭素原子、フェニル、ヘテロ原子、またはアシル、脂肪族、複素脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環からなる群から選択される置換されていてもよい基である）
を有する架橋リンカーを介して結合しているインスリンアナログ二量体を提供する。特定の態様では、ＲがＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９もしくはＣ１０アシル基またはＰＥＧ２、ＰＥＧ３、ＰＥＧ４、ＰＥＧ５、ＰＥＧ６、ＰＥＧ７、ＰＥＧ８、ＰＥＧ９、ＰＥＧ１０、ＰＥＧ１１、ＰＥＧ１２、ＰＥＧ１３、またはＰＥＧ２５である。

特定の実施形態では、置換基が、一般式ＲＣ（Ｏ）−（ＲはＲ’ＣＨ_２、Ｒ’ＮＨ、Ｒ’Ｏであり得、Ｒ’はＨ、直鎖アルキル鎖、アミノ酸、ペプチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、糖類であり得る）を有する基と連結したＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む。特定の実施形態では、置換基がカルバモイル基、アセチル基、グリシン、メチル基、メトキシ基、ジメチル基、イソブチル基、ＰＥＧ１基、ＡＥＧ基、ＡＥＧ−Ｃ６アルキル基またはＰＥＧ２基である。

さらなる実施形態では、本発明は、リンカー４、リンカー６、リンカー８およびリンカー９からなる群から選択される第１のリンカーと結合した第１のＡ鎖ポリペプチドおよび第１のＢ鎖ポリペプチドを有する第１のインスリンヘテロ二量体分子の第１のＢ２９またはＢ２８ Ｌｙｓと、リンカー４、リンカー６、リンカー８およびリンカー９からなる群から選択される第２のリンカーと結合した第２のＡ鎖ポリペプチドおよび第２のＢ鎖ポリペプチドを有する第２のインスリンヘテロ二量体の第２のＢ２９またはＢ２８ Ｌｙｓとを含むインスリンアナログ二量体であって、第１および第２のリンカーが構造

（Ｒは共有結合、炭素原子、フェニル、ヘテロ原子、またはアシル、脂肪族、複素脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環からなる群から選択される置換されていてもよい基である）
を有する架橋リンカーを介して結合しているインスリンアナログ二量体を提供する。特定の態様では、ＲがＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９もしくはＣ１０アシル基またはＰＥＧ２、ＰＥＧ３、ＰＥＧ４、ＰＥＧ５、ＰＥＧ６、ＰＥＧ７、ＰＥＧ８、ＰＥＧ９、ＰＥＧ１０、ＰＥＧ１１、ＰＥＧ１２、ＰＥＧ１３、またはＰＥＧ２５である。

特定の実施形態では、置換基が、一般式ＲＣ（Ｏ）−（ＲはＲ’ＣＨ_２、Ｒ’ＮＨ、Ｒ’Ｏであり得、Ｒ’はＨ、直鎖アルキル鎖、アミノ酸、ペプチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、糖類であり得る）を有する基と連結したＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む。特定の実施形態では、置換基がカルバモイル基、アセチル基、グリシン、メチル基、メトキシ基、ジメチル基、イソブチル基、ＰＥＧ１基、ＡＥＧ基、ＡＥＧ−Ｃ６アルキル基またはＰＥＧ２基である。

本発明はさらに、本明細書で開示されるインスリン受容体部分アゴニストのいずれか１つと、薬学的に許容される塩とを含む組成物を提供する。

本発明は、糖尿病を治療する方法であって、治療上有効量の上記インスリン受容体部分アゴニストのいずれか１つを含む組成物を糖尿病の個体に投与するステップを含む方法を提供する。特定の態様では、糖尿病が１型糖尿病、２型糖尿病または妊娠糖尿病である。

本発明は、上記インスリン受容体部分アゴニストのいずれか１つを含む糖尿病を治療するための組成物の使用を提供する。特定の態様では、糖尿病が１型糖尿病、２型糖尿病または妊娠糖尿病である。

本発明は、糖尿病を治療するための医薬品を製造するための本明細書で開示されるインスリン受容体部分アゴニストのいずれか１つの使用を提供する。特定の態様では、糖尿病が１型糖尿病、２型糖尿病または妊娠糖尿病である。

定義
インスリン−本明細書で使用される場合、この用語は、動物の体内の炭水化物の代謝に影響を及ぼし、糖尿病の治療において価値がある膵臓の活性成分を意味する。この用語は、構造、使用および意図した効果が天然インスリンと同じまたは類似であり、糖尿病の治療において価値がある合成および生物工学由来産物を含む。この用語は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＡ鎖ペプチドおよび配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＢ鎖ペプチドを含む５１アミノ酸ヘテロ二量体であって、Ａ鎖の６位および１１位のシステイン残基がジスルフィド結合で連結しており、Ａ鎖の７位およびＢ鎖の７位のシステイン残基がジスルフィド結合で連結しており、Ａ鎖の２０位およびＢ鎖の１９位のシステイン残基がジスルフィド結合で連結している５１アミノ酸ヘテロ二量体を示す総称である。

インスリンアナログ（ａｎａｌｏｇまたはａｎａｌｏｇｕｅ）−本明細書で使用されるこの用語は、天然Ａ鎖ペプチドおよび／またはＢ鎖ペプチドの（１又は複数の）修飾を含む任意のヘテロ二量体アナログまたは単鎖アナログを含む。修飾は、それだけに限らないが、Ａ４、Ａ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１３、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１６、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２１、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１５、Ｂ１６、Ｂ１７、Ｂ１８、Ｂ２０、Ｂ２１、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０から選択される位置の天然アミノ酸をあるアミノ酸で置換すること；位置Ｂ１〜４およびＢ２６〜３０のいずれかまたは全てを欠失すること；あるいは直接またはポリマーもしくは非ポリマーリンカーによって１個または複数のアシル、ポリエチルグリシン（ＰＥＧ）または（１又は複数の）糖類部分を結合すること；あるいはこれらの任意の組み合わせを含む。本明細書で開示されるＮ結合型グリコシル化インスリンアナログによって例示されるように、この用語はさらに、少なくとも１つのＮ結合型グリコシル化部位を有するよう修飾された任意のインスリンヘテロ二量体および単鎖アナログおよび、特に、Ｎ結合型グリコシル化部位がＮ−グリカンと連結しているまたはＮ−グリカンによって占められている実施形態を含む。インスリンアナログの例としては、それだけに限らないが、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、公開国際出願である国際公開第２０１０００８０６０６号、国際公開第２００９／０９９７６３号および国際公開第２０１００８０６０９号に開示されているヘテロ二量体および単鎖アナログが挙げられる。単鎖インスリンアナログの例としては、それだけに限らないが、その開示がそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる、公開国際
出願である国際公開第９６３４８８２号、国際公開第９５５１６７０８号、国際公開２００５０５４２９１号、国際公開第２００６０９７５２１号、国際公開第２００７１０４７３４号、国際公開第２００７１０４７３６号、国際公開第２００７１０４７３７号、国際公開第２００７１０４７３８号、国際公開第２００７０９６３３２号、国際公開第２００９１３２１２９号；米国特許第５３０４４７３号および第６６３０３４８号；ならびにＫｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０５：９８１〜９８６（１９９５）に開示されているものも挙げられる。

この用語はさらに、インスリン受容体でほとんどまたは全く検出可能な活性を有さないが、天然インスリンと比べてインスリン受容体での少なくとも１％、１０％、５０％、７５％または９０％の活性を有するインスリン受容体での活性を有するように１つまたは複数のアミノ酸修飾または置換を含むよう修飾されており、少なくとも１つのＮ結合型グリコシル化部位をさらに含む単鎖およびヘテロ二量体ポリペプチド分子を含む。特定の態様では、インスリンアナログは、天然インスリンが有するインスリン受容体での８０％（または７０％）未満の活性を有する部分アゴニストである。これらのインスリンアナログは、インスリン成長ホルモン受容体での減少した活性およびインスリン受容体での増加した活性を有しており、ヘテロ二量体と単鎖アナログの両方を含む。

単鎖インスリンまたは単鎖インスリンアナログ−本明細書で使用される場合、この用語は、Ａ鎖ペプチドまたは機能的アナログおよびＢ鎖ペプチドまたは機能的アナログが、２〜３５個のアミノ酸のペプチドもしくはポリペプチドまたは非ペプチドポリマーもしくは非ポリマーリンカーによって共有結合しており、天然インスリンと比べてインスリン受容体で少なくとも１％、１０％、５０％、７５％または９０％のインスリン活性を有する構造的に関連するタンパク質の群を包含する。単鎖インスリンまたはインスリンアナログはさらに、３つのジスルフィド結合を含む：第１のジスルフィド結合はＡ鎖またはその機能的アナログの６位のシステイン残基と１１位のシステイン残基との間にあり、第２のジスルフィド結合はＡ鎖またはその機能的アナログの７位のシステイン残基とＢ鎖またはその機能的アナログの７位のシステイン残基との間にあり、第３のジスルフィド結合はＡ鎖またはその機能的アナログの２０位のシステイン残基とＢ鎖またはその機能的アナログの１９位のシステイン残基との間にある。

連結ペプチドまたはＣ−ペプチド−本明細書で使用される場合、この用語は、単鎖プレプロインスリン様分子のＢ−Ｃ−Ａポリペプチド配列の連結部分「Ｃ」を指す。具体的には、天然インスリン鎖では、Ｃ−ペプチドはＢ鎖の３０位のアミノ酸とＡ鎖の１位のアミノ酸を連結する。この用語は、天然インスリンＣ−ペプチド、サルＣ−ペプチド、およびＢ鎖とＡ鎖を連結する３〜３５個のアミノ酸の任意の他のペプチドを共に指し得るので、単鎖インスリンアナログ（例えば、米国公開出願第２００９０１７０７５０号および第２００８００５７００４号ならびに国際公開第９６３４８８２号参照）ならびに国際公開第９５１６７０８号および米国特許第７１０５３１４号に開示されているようなインスリン前駆体分子においてＢ鎖ペプチドとＡ鎖ペプチドを連結する任意のペプチドを包含することを意図している。

アミノ酸修飾−本明細書で使用される場合、この用語は、アミノ酸の置換、または化学基の付加および／もしくは除去によるアミノ酸への／からのアミノ酸の誘導を指し、ヒトタンパク質に一般的に見られる２０個のアミノ酸、ならびに非定型または非天然アミノ酸のいずれかによる置換を含む。

非定型アミノ酸の商業的な供給源には、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、ＣｈｅｍＰｅｐ Ｉｎｃ．（Ｍｉａｍｉ、ＦＬ）およびＧｅｎｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）が含まれる。非定型アミノ酸は、商業的な供給業者から購入しても、新規に合成しても、または天然アミノ酸から化学修飾もしくは誘導体化してもよい。

アミノ酸置換−本明細書で使用される場合は、１個のアミノ酸残基の異なるアミノ酸残基による置き換えを指す。

保存的アミノ酸置換−本明細書で使用される場合、この用語は、本明細書において、以下の５つのグループの１つの中の交換と定義される：
Ｉ．小型の脂肪族の非極性またはわずかに極性の残基：
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．極性の、負に帯電した残基およびそのアミド：
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、システイン酸およびホモシステイン酸；
ＩＩＩ．極性の正に帯電した残基：
Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；オルニチン（Ｏｒｎ）
ＩＶ．大型の脂肪族の非極性残基：
Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモシステイン
Ｖ．大型の芳香族残基：
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、アセチルフェニルアラニン
治療する−本明細書で使用される場合、「治療する」（または「治療すること」、「治療される」、「治療」等）という用語は、状態（例えば、糖尿病）、状態の（１又は複数の）症状（例えば、高血糖）または状態への素因を緩和する、軽減する、変化させる、寛解させる、改善するまたは影響を及ぼす目的で、本開示のＩＲＰＡをそれを必要とする対象に投与することを指す。例えば、本明細書で使用される場合、「糖尿病を治療する」という用語は、一般的に、グルコース血中レベルを正常レベル近くに維持することを指し、所与の状況に応じて血中グルコースレベルを上昇または低下させることを含み得る。

薬学的に許容される担体−本明細書で使用される場合、この用語は、標準的な医薬担体（リン酸緩衝食塩水溶液、水など）、エマルジョン（油／水型または水／油型エマルジョンなど）、および必要とする個体へのまたは必要とする個体による投与に適した種々の型の湿潤剤のいずれかを含む。この用語はまた、ヒトを含む動物での使用について、米国連邦政府の規制当局によって承認されたまたは米国薬局方に列挙された薬剤のいずれかも包含する。

薬学的に許容される塩−本明細書で使用される場合、この用語は、親化合物の生物学的活性を保持し、生物学的にもその他の点でも好ましくなくない化合物の塩を指す。本明細書で開示される化合物の多くが、アミノおよび／またはカルボキシル基またはこれらに類似の基の存在によって、酸および／または塩基塩を形成することができる。

薬学的に許容される塩基付加塩は、無機および有機塩基から調製することができる。無機塩基に由来する塩には、単なる例として、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、亜鉛およびマグネシウム塩が含まれる。有機塩基に由来する塩には、それだけに限らないが、一級、二級および三級アミンの塩が含まれる。

薬学的に許容される酸付加塩は、無機および有機酸から調製することができる。無機酸に由来する塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などが含まれる。有機酸に由来する塩には、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などが含まれる。

有効量または治療上有効量−本明細書で使用される場合は、非毒性であるが、所望の効果を提供するのに十分な量のインスリンアナログを指す。例えば、１つの所望の効果は高血糖の予防または治療であるだろう。「有効」である量は、個体の年齢および全身状態、投与様式などに応じて、対象によって異なる。よって、正確な「有効量」を指定することがいつも可能であるとは限らない。それを必要とする個体へのまたは必要とする個体による投与の前に最適な有効量を決定することがいつも可能であるとは限らない。しかしながら、任意の個々のケースでの適切な「有効」量は、日常的な実験を用いて当業者によって決定され得る。

非経口−本明細書で使用される場合、この用語は、消化管を通さず、鼻腔内、吸入、皮下、筋肉内、髄腔内または静脈内などのある他の経路によることを意味する。

０．６９ｎｍｏｌ／ｋｇで糖尿病ミニブタに投与した場合の、ＲＨＩと比べた二量体２４、１８および４０のグルコース低下効果を示す図である。 化合物ＡをＲＨＩ（Ｈｕｍｕｌｉｎ）と比較する、マウスにおけるインスリン負荷試験（ＩＴＴ）の結果を示す図である。化合物Ａを７２Ｕ／ｋｇの用量および３００Ｕ／ｋｇの用量で投与し、Ｈｕｍｕｌｉｎを１８Ｕ／ｋｇの用量および７２Ｕ／ｋｇの用量で投与した。 化合物ＢをＲＨＩ（Ｈｕｍｕｌｉｎ）と比較する、マウスにおけるインスリン負荷試験（ＩＴＴ）の結果を示す図である。化合物Ｂを７２Ｕ／ｋｇの用量および３００Ｕ／ｋｇの用量で投与し、Ｈｕｍｕｌｉｎを１８Ｕ／ｋｇの用量および７２Ｕ／ｋｇの用量で投与した。 二量体２４をＲＨＩ（Ｈｕｍｕｌｉｎ）と比較する、マウスにおけるインスリン負荷試験（ＩＴＴ）の結果を示す図である。二量体２４を７２Ｕ／ｋｇの用量および３００Ｕ／ｋｇの用量で投与し、Ｈｕｍｕｌｉｎを１８Ｕ／ｋｇの用量および７２Ｕ／ｋｇの用量で投与した。 マウスにおけるインスリン負荷試験（ＩＴＴ）の二量体５５の結果を示す図である。二量体５５を１２０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量および３００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で投与した。 マウスにおけるインスリン負荷試験（ＩＴＴ）の二量体５８の結果を示す図である。二量体５８を６０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量および３００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で投与した。 マウスにおけるインスリン負荷試験（ＩＴＴ）の二量体６０の結果を示す図である。二量体６０を７２ｎｍｏｌ／ｋｇの用量および３００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で投与した。 マウスにおけるインスリン負荷試験（ＩＴＴ）の二量体６７の結果を示す図である。二量体６７を１２０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量および３００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で投与した。 化合物Ａインスリン二量体が、グルタチオン（ＧＳＨ）を用いないラット腎細胞膜（ＲＫＣＭ）との２時間のインキュベーションによってインスリン単量体に分解していたことを示す図である。％値の％はイオン化効率の潜在的な差のために半定量的なものに過ぎない。 化合物Ａインスリン二量体が、グルタチオン（ＧＳＨ）を用いるラット腎細胞膜（ＲＫＣＭ）との２時間のインキュベーションによってインスリン単量体に分解していたことを示す図である。％値の％はイオン化効率の潜在的な差のために半定量的なものに過ぎない。 二量体２４が、グルタチオン（ＧＳＨ）を用いないラット腎細胞膜（ＲＫＣＭ）との２時間のインキュベーションによって一部のＡ鎖ポリペプチドを失ったが、モノマーには分解しなかったことを示す図である。％値の％はイオン化効率の潜在的な差のために半定量的なものに過ぎない。 二量体２４が、グルタチオン（ＧＳＨ）を用いるラット腎細胞膜（ＲＫＣＭ）との２時間のインキュベーションによって一部のＡ鎖ポリペプチドを失ったが、モノマーには分解しなかったことを示す図である。％値の％はイオン化効率の潜在的な差のために半定量的なものに過ぎない。 ０．６９ｎｍｏｌ／ｋｇで糖尿病ミニブタに投与した場合の、ＲＨＩと比べた二量体４、５、７、８および９のグルコース低下効果を示す図である。 ０．６９ｎｍｏｌ／ｋｇで糖尿病ミニブタに投与した場合の、ＲＨＩと比べた二量体１８、１９、２０、２１および２２のグルコース低下効果を示す図である。 ０．６９ｎｍｏｌ／ｋｇで糖尿病ミニブタに投与した場合の、ＲＨＩと比べた二量体２３、２４、２６、２７および２８のグルコース低下効果を示す図である。 ０．６９ｎｍｏｌ／ｋｇで糖尿病ミニブタに投与した場合の、ＲＨＩと比べた二量体２９、３２、３７、３８および３９のグルコース低下効果を示す図である。 ０．６９ｎｍｏｌ／ｋｇで糖尿病ミニブタに投与した場合の、ＲＨＩと比べた二量体４０、４１、４３、４４および４８のグルコース低下効果を示す図である。 ０．６９ｎｍｏｌ／ｋｇで糖尿病ミニブタに投与した場合の、ＲＨＩと比べた二量体５５、５７、５８、６０および６１のグルコース低下効果を示す図である。 ０．６９ｎｍｏｌ／ｋｇで糖尿病ミニブタに投与した場合の、ＲＨＩと比べた二量体６２、６４、６７、６９および７１のグルコース低下効果を示す図である。 ０．６９ｎｍｏｌ／ｋｇで糖尿病ミニブタに投与した場合の、ＲＨＩと比べた二量体７２、７７および７８のグルコース低下効果を示す図である。

本発明は、通常のインスリン様効力を有し、最大活性が減少したインスリン受容体を活性化し得る共有結合インスリン二量体を形成するよう共有結合した２個のインスリン分子を含む化合物を提供する。これらの化合物はインスリン受容体部分アゴニスト（ＩＲＰＡ）であり：これらは他のインスリンアナログのようにふるまって、グルコースを有効に低下させるが、低血糖のリスクが低い。

インスリン二量体は、Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇら、米国特許第３９０７７６３号（１９７３）；Ｔａｔｎｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２１６：６８７〜６９４（１９８３）；ＳｈｕｔｔｌｅｒおよびＢｒａｎｄｅｎｂｕｒｇ、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、３６３、３１７〜３３０、１９８２；Ｗｅｉｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（米国）８７：１１５４〜１１５８（１９９０）；Ｄｅｐｐｅら、Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇ’ｓ Ａｒｃｈ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（１９９４）３５０：２１３〜２１７；ＢｒａｎｄｅｎｂｕｒｇおよびＨａｖｅｎｉｔｈ、米国特許第６９０８８９７号（Ｂ２）（２００５）；Ｋｎｕｄｓｅｎら、ＰＬＯＳ ＯＮＥ ７：ｅ５１９７２（２０１２）；ＤｉＭａｒｃｈｉら、国際公開第２０１１／１５９８９５号；ＤｉＭａｒｃｈｉら、国際公開第２０１４／０５２４５１号；ならびにＨｅｒｒｅｒａら、国際公開第２０１４１４１１６５号に開示されている。より最近では、インスリン二量体が、Ｂｒａｎｔ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐａｒｔｉａｌ Ａｇｏｎｉｓｔｓ ａｓ ａ Ｒｏｕｔｅ ｔｏ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｐｈ．Ｄ．Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ、Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（２０１５年４月）ならびにＺａｙｋｏｖおよびＤｉＭａｒｃｈｉ、Ｐｏｓｔｅｒ Ｐ２１２−Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｐａｒｔｉａｌ ａｇｏｎｉｓｍ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ ｄｉｍｅｒｓ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、Ｏｒｌａｎｄｏ ＦＬ（６月２０〜２５日（２０１５））に記載されている。しかしながら、本発明の発明者らは、二量体のインスリン活性および部分アゴニスト活性のレベルが二量体構造、インスリンアナログの配列、二量体形成リンカーの長さおよび２個のインスリンポリペプチドを連結する二量体形成の部位の関数であることを発見した。本発明者らは、本発明のインスリン二量体が、高用量で投与した場合の天然インスリンまたは他のインスリンアナログよりも、高用量で投与した場合に低血糖を促進するリスクが低いことを発見した。

本発明は、現在の標準治療（ＳＯＣ）基礎インスリンに対して改善した治療指数（ＴＩ）を示す新規で変化をもたらす基礎インスリン（１日１回投与）として製剤化される部分アゴニスト共有結合インスリン二量体を提供する。これらの分子は、糖尿病ミニブタにおいて低下した低血糖のリスクでグルコースを有効に低下させることができ、１日１回（ＱＤ）基礎インスリン特性を有し得る。改善したＴＩは、開業医がＩＲＰＡ二量体をより積極的に投与して空腹時グルコースの管理の最終目標を達成することを可能にし得る。空腹時グルコースおよびＨｂＡｌｃの厳格な管理によって、これらの分子が１）２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）における有効性および安全性プロファイルが増強した独立型の長時間作用性インスリン、および２）さらなる食事の速効型インスリンアナログ（ＲＡＡ）用量と使用するための１型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）（および一部のＴ２ＤＭ）における改善した基礎的な基礎インスリンとして働くことが可能になり得る。

理想的な長時間作用性インスリンは、高度に安定で再現性のあるＰＫ／ＰＤで糖尿病における空腹時グルコースの連続的な管理を提供する。しかしながら、現在利用可能な基礎インスリンは、改善した安定性およびＰＫ／ＰＤの再現性を有するものでさえ、狭い治療指数を有し続け、グルコースレベルが正常血糖標的に近づくにつれて低血糖事象が増加する。これはしばしば、低血糖を回避するための過少量投与につながり得る。本発明のＩＲＰＡによる治療は、投与が増加するにつれてグルコース低下の変化率を減衰させることによって、この有効性：低血糖の関係を変化させると予想される。

インスリンＡ鎖およびＢ鎖
インスリン受容体アゴニスト活性を有するインスリンまたはインスリンアナログ二量体が本明細書で開示される。二量体のインスリン活性のレベルは、二量体構造、インスリンアナログの配列、二量体形成リンカーの長さおよび２個のインスリンポリペプチドを連結する二量体形成の部位の関数である。本発明のインスリンポリペプチドは、ヘテロ二本鎖で互いに連結するとインスリンアゴニスト活性を示すヒトインスリンの天然ＢおよびＡ鎖配列（それぞれ、配列番号１および２）またはその既知のアナログもしくは誘導体のいずれかを含み得る。このようなアナログは、例えば、インスリンアナログのインスリン活性を破壊しない１つもしくは複数のアミノ酸欠失、１つもしくは複数のアミノ酸置換、および／または１つもしくは複数のアミノ酸挿入を有することによって、ヒトインスリンのＡ鎖およびＢ鎖とは異なるＡ鎖およびＢ鎖を有するタンパク質を含む。

インスリンアナログの１つの型、「単量体インスリンアナログ」が当技術分野で周知である。これらは、例えば、
（ａ）Ｂ２８位のアミノアシル残基がＡｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＡｌａで置換されており、Ｂ２９位のアミノアシル残基がＬｙｓまたはＰｒｏであり；
（ｂ）Ｂ２７位およびＢ３０位のいずれかのアミノアシル残基が欠失しているまたは非天然アミノ酸で置換されている、
インスリンアナログを含むヒトインスリンの速効型アナログである。

一実施形態では、Ｂ２８位の置換されたＡｓｐ（例えば、インスリンアスパルト（ＮＯＶＯＬＯＧ）；配列番号９参照）または２８位の置換されたＬｙｓおよびＢ２９位の置換されたプロリン（例えば、インスリンリスプロ（ＨＵＭＡＬＯＧ）；配列番号６参照）を含むインスリンアナログが提供される。さらなる単量体インスリンアナログは、Ｃｈａｎｃｅら、米国特許第５５１４６４６号；Ｃｈａｎｃｅら、米国特許出願第０８／２５５２９７号；Ｂｒｅｍｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、５：５２７〜５３３（１９９２）；Ｂｒａｎｇｅら、ＥＰＯ公開第２１４８２６号（１９８７年３月１８日公開）；およびＢｒａｎｇｅら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１：９３４〜９４０（１９９１）に開示されている。これらの開示は、単量体インスリンアナログを説明するために参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

インスリンアナログはまた、アミド化アミノ酸の酸性型による置き換えを有してもよい。例えば、ＡｓｎはＡｓｐまたはＧｌｕで置き換えられていてもよい。同様に、ＧｌｎはＡｓｐまたはＧｌｕで置き換えられていてもよい。特に、Ａｓｎ（Ａ１８）、Ａｓｎ（Ａ２１）もしくはＡｓｐ（Ｂ３）、またはこれらの残基の任意の組み合わせがＡｓｐまたはＧｌｕによって置き換えられていてもよい。また、Ｇｌｎ（Ａ１５）もしくはＧｌｎ（Ｂ４）または両方がＡｓｐまたはＧｌｕのいずれかによって置き換えられていてもよい。

本明細書で開示されるように、ヒトインスリンのＢ鎖およびＡ鎖、またはそのアナログもしくは誘導体を含むインスリン単鎖アナログであって、Ｂ鎖のカルボキシ末端が連結部分を介してＡ鎖のアミノ末端と連結しているインスリン単鎖アナログが提供される。一実施形態では、Ａ鎖がアミノ酸配列ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号１）であり、Ｂ鎖がアミノ酸配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号２）またはＢ３０欠失を有するそのカルボキシ短縮配列を含み、各配列がＡ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ２０、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０から選択される天然インスリン位置に相当する位置に１〜５個のアミノ酸置換を含むよう修飾されたこれらの配列のアナログ、但し、Ｂ２８またはＢ２９の少なくとも１つはリジンである。一実施形態では、アミノ酸置換が保存的アミノ酸置換である。インスリンの所望の活性に悪影響を及ぼさないこれらの位置における適切なアミノ酸置換は、例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｙｅｒら、Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．２００７；８８（５）：６８７〜７１３に示されるように、当業者に知られている。

一実施形態によると、インスリンアナログペプチドが、インスリンＡ鎖およびインスリンＢ鎖またはこれらのアナログを含んでよく、Ａ鎖がＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号１）と、天然ペプチドの長さにわたって少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％）を共有するアミノ酸配列を含み、Ｂ鎖がＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号２）またはＢ３０欠失を有するそのカルボキシ短縮配列と、天然ペプチドの長さにわたって少なくとも６０％の配列同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％）を共有するアミノ酸配列を含む。

さらなるアミノ酸配列を本発明のインスリンポリペプチドのＢ鎖のアミノ末端またはＡ鎖のカルボキシ末端に付加することができる。例えば、一連の負に帯電したアミノ酸（例えば、長さが１〜１２、１〜１０、１〜８または１〜６個のアミノ酸であり、例えば、グルタミン酸およびアスパラギン酸を含む１個または複数の負に帯電したアミノ酸を含むペプチドを含む）をＢ鎖のアミノ末端に付加することができる。一実施形態では、Ｂ鎖アミノ末端伸長が１〜６個の帯電したアミノ酸を含む。一実施形態によると、開示されるインスリンポリペプチドは、Ａ鎖上のＣ末端カルボキシレートの代わりにＣ末端アミドまたはエステルを含む。

種々の実施形態では、インスリンアナログが、ヒトインスリンに対してずれた等電点を有する。いくつかの実施形態では、等電点のずれが、１個または複数のアルギニン、リジンまたはヒスチジン残基をインスリンＡ鎖ペプチドのＮ末端および／またはインスリンＢ鎖ペプチドのＣ末端に付加することによって達成される。このようなインスリンポリペプチドの例としては、Ａｒｇ^Ａ０−ヒトインスリン、Ａｒｇ^Ｂ３１Ａｒｇ^Ｂ３２−ヒトインスリン、Ｇｌｙ^Ａ２１Ａｒｇ^Ｂ３１Ａｒｇ^Ｂ３２−ヒトインスリン、Ａｒｇ^Ａ０Ａｒｇ^Ｂ３１Ａｒｇ^Ｂ３２−ヒトインスリンおよびＡｒｇ^Ａ０Ｇｌｙ^Ａ２１Ａｒｇ^Ｂ３１Ａｒｇ^Ｂ３２−ヒトインスリンが挙げられる。さらなる例として、インスリングラルギン（ＬＡＮＴＵＳ；配列番号７および８参照）は、Ａｓｎ^Ａ２１がグリシンによって置き換えられ、２個のアルギニン残基がＢペプチドのＣ末端と共有結合している代表的な長時間作用性インスリンアナログである。これらのアミノ酸変化の効果は、分子の等電点をずらし、それによって、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ４〜６．５）で可溶性であるが、生理的ｐＨで不溶性の分子を生成するというものであった。インスリングラルギンの溶液を筋肉に注射すると、溶液のｐＨが中和され、インスリングラルギンが微小沈殿（ｍｉｃｒｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）を形成し、これが著しいインスリンのピークなしに、よって、低血糖を誘発する低下したリスクで注射後２４時間の期間にわたってインスリングラルギンをゆっくり放出する。このプロファイルは、１日１回投与が患者の基礎インスリンを提供することを可能にする。よって、いくつかの実施形態では、インスリンアナログが、Ａ２１位のアミノ酸がグリシンであるＡ鎖ペプチドと、Ｂ３１位およびＢ３２位のアミノ酸がアルギニンであるＢ鎖ペプチドとを含む。本開示は、本明細書に記載されるこれらの突然変異および任意の他の突然変異の全ての単一のおよび複数の組み合わせを包含する（例えば、Ｇｌｙ^Ａ２１−ヒトインスリン、Ｇｌｙ^Ａ２１Ａｒｇ^Ｂ３１−ヒトインスリン、Ａｒｇ^Ｂ３１Ａｒｇ^Ｂ３２−ヒトインスリン、Ａｒｇ^Ｂ３１−ヒトインスリン）。

インスリン受容体部分アゴニストの特定の態様では、インスリンアナログの１個または複数のアミド化アミノ酸が、酸性アミノ酸または別のアミノ酸で置き換えられている。例えば、アスパラギンがアスパラギン酸もしくはグルタミン酸、または別の残基で置き換えられていてもよい。同様に、グルタミンがアスパラギン酸もしくはグルタミン酸、または別の残基で置き換えられていてもよい。特に、Ａｓｎ^Ａ１８、Ａｓｎ^Ａ２１もしくはＡｓｎ^Ｂ３、またはこれらの残基の任意の組み合わせが、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸、または別の残基によって置き換えられていてもよい。Ｇｌｎ^Ａ１５もしくはＧｌｎ^Ｂ４、または両方がアスパラギン酸もしくはグルタミン酸、または別の残基によって置き換えられていてもよい。インスリン受容体部分アゴニストの特定の態様では、インスリンアナログが、Ａ２１位のアスパラギン酸もしくは別の残基、またはＢ３位のアスパラギン酸もしくは別の残基、または両方を有する。

当業者であれば、分子の生物学的活性を保持しながら、インスリンアナログのさらに他のアミノ酸を他のアミノ酸で置き換えることが可能であることを認識するだろう。例えば、限定されないが、以下の修飾も当技術分野で広く受け入れられている：Ｂ１０位のヒスチジン残基のアスパラギン酸による置換（Ｈｉｓ^Ｂ１０からＡｓｐ^Ｂ１０）；Ｂ１位のフェニルアラニン残基のアスパラギン酸による置換（ＰｈｅＢ１からＡｓｐＢ１）；Ｂ３０位のスレオニン残基のアラニンによる置換（ＴｈｒＢ３０からＡｌａＢ３０）；Ｂ２６位のチロシン残基のアラニンによる置換（ＴｙｒＢ２６からＡｌａＢ２６）；およびＢ９位のセリン残基のアスパラギン酸による置換（ＳｅｒＢ９からＡｓｐＢ９）。

種々の実施形態では、インスリンアナログが遅延性の作用プロファイルを有する。よって、一定の実施形態では、インスリンアナログが脂肪酸でアシル化され得る。すなわち、インスリンアナログのアミノ基と脂肪酸のカルボン酸基との間にアミド結合が形成される。アミノ基はインスリンアナログのＮ末端アミノ酸のα−アミノ基であってもよいし、またはインスリンアナログのリジン残基のεアミノ基であってもよい。インスリンアナログは、野生型ヒトインスリン中に存在する３個のアミノ基の１個または複数でアシル化されても、野生型ヒトインスリン配列に導入されたリジン残基上でアシル化されてもよい。インスリン受容体部分アゴニストの特定の態様では、インスリンアナログがＡ１位、Ｂ１位またはＡ１位とＢ１位の両方でアシル化され得る。一定の実施形態では、脂肪酸がミリスチン酸（Ｃ_１４）、ペンタデシル酸（Ｃ_１５）、パルミチン酸（Ｃ_１６）、ヘプタデシル酸（Ｃ_１７）およびステアリン酸（Ｃ_１８）から選択される。

インスリンアナログの例は、例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、公開国際出願の国際公開第９６３４８８２号、国際公開第９５５１６７０８号；国際公開第２０１０００８０６０６号、国際公開第２００９／０９９７６３号および国際公開第２０１００８０６０９号、米国特許第６６３０３４８号およびＫｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０５：９８１〜９８６（１９９５）に見出すことができる。さらなる実施形態では、インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリンアナログがアセチル化および／またはペグ化され得る。

一実施形態によると、インスリンペプチドのＡ鎖が配列ＧＩＶＥＱＣＣＸ_８ＳＩＣＳＬＹＱＬＸＴ_１７ＮＸ_１９ＣＸ_２３（配列番号３）を含み、Ｂ鎖が配列
Ｘ_２５ＬＣＧＸ_２９Ｘ_３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＸ_３１Ｘ_３２（配列番号４）を含み、
Ｘ_８がスレオニンまたはヒスチジンであり；
Ｘ_１７がグルタミン酸またはグルタミンであり；
Ｘ_１９がチロシン、４−メトキシ−フェニルアラニンまたは４−アミノフェニルアラニンであり；
Ｘ_２３がアスパラギンまたはグリシンであり；
Ｘ_２５がヒスチジンまたはスレオニンであり；
Ｘ_２９がアラニン、グリシンまたはセリンであり；
Ｘ_３０がヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸またはシステイン酸であり；
Ｘ_３１がプロリンまたはリジンであり；
Ｘ_３２がプロリンまたはリジンであり、但し、Ｘ_３１またはＸ_３２の少なくとも１つがリジンである、
インスリンアナログが提供される。

さらなる実施形態では、Ｂ鎖が配列
Ｘ_２２ＶＮＱＸ_２５ＬＣＧＸ_２９Ｘ_３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴ−Ｘ_３１Ｘ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４Ｘ_３５（配列番号５）
（Ｘ_２２はフェニルアラニンまたはデスアミノ−フェニルアラニンであり；
Ｘ_２５はヒスチジンまたはスレオニンであり；
Ｘ_２９はアラニン、グリシンまたはセリンであり；
Ｘ_３０はヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸またはシステイン酸であり；
Ｘ_３１はアスパラギン酸、プロリンまたはリジンであり；
Ｘ_３２はリジンまたはプロリンであり；
Ｘ_３３はスレオニン、アラニンまたは非存在であり；
Ｘ_３４はアルギニンまたは非存在であり；
Ｘ_３５はアルギニンまたは非存在であり；
但し、Ｘ_３１またはＸ_３２の少なくとも１つはリジンである）
を含む。

連結部分
本明細書で開示されるインスリン二量体は、各インスリンポリペプチドがＡ鎖およびＢ鎖を含む第１のインスリンポリペプチドと第２のインスリンポリペプチドとの間で形成される。第１および第２のインスリンポリペプチドは二本鎖インスリンアナログ（すなわち、Ａ鎖およびＢ鎖が内部システイン残基間の鎖内ジスルフィド結合を介してのみ連結している）であり得、第１および第２のインスリンポリペプチドは、共有結合、二官能性リンカーによってまたは銅（Ｉ）触媒アルキン−アジド環化付加（ＣｕＡＡＣ）クリックケミストリーもしくは銅フリークリックケミストリーを用いてそれぞれのＢ鎖上の連結部分を連結することによって互いに連結して二量体を形成する。一実施形態によると、第１および第２のインスリンポリペプチドが、第１のインスリンポリペプチドのＢ鎖のＢ２８またはＢ２９リジンの側鎖を第２のインスリンポリペプチドのＢ鎖のＢ２８またはＢ２９アミノ酸の側鎖と連結する二官能性リンカーによって互いに連結される。

インスリン受容体部分アゴニストの特定の態様では、連結部分がアシル、脂肪族、複素脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環からなる群から選択される置換されていてもよい基であり得る。連結部分は、１個または複数のメチレン単位が独立に、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ_２−、ＳＯ_２Ｎ（Ｒ）−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基によって置き換えられていてもよく、Ｒの各出現が独立に、水素、適切な保護基、アシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分または複素脂肪族部分である、二価の、直鎖または分岐の、飽和または不飽和の、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２０炭化水素鎖であり得る。

一実施形態では、連結部分が、ＰＥＧリンカー、約２〜２５個のエチレングリコール単位または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６もしくは２５個のエチレングリコール単位、および場合により１個または複数のアミノ酸の短い直鎖ポリマーを含む。インスリン受容体部分アゴニストの特定の態様では、ＰＥＧリンカーが構造（ＰＥＧ）_２、（ＰＥＧ）_３、（ＰＥＧ）_４、（ＰＥＧ）_５、（ＰＥＧ）_６、（ＰＥＧ）_７、（ＰＥＧ）_８、（ＰＥＧ）_９、（ＰＥＧ）_１０、（ＰＥＧ）_１１、（ＰＥＧ）_１２、（ＰＥＧ）_１３、（ＰＥＧ）_１４、（ＰＥＧ）_１５、（ＰＥＧ）_１６または（ＰＥＧ）_２５を含む。ＰＥＧリンカーは、第１および第２のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位リジン残基のεアミノ基と共有結合または連結し得る二官能性リンカーであり得る。第１および第２のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジン基のεアミノ基と結合した二官能性ＰＥＧリンカーの構造は、以下の一般式

（式中、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または２５であり、波線はリンカーとεアミノ基との間の結合を示す）
によって表され得る。ＰＥＧをリジンのεアミノ基と結合する方法は当技術分野で周知であり、例えば、Ｖｅｒｏｎｅｓｅ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２２：４０５〜４１７（２００１）を参照されたい。

インスリン受容体部分アゴニストの特定の態様では、第１のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基と第２のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ酸を結合するＰＥＧ連結部分が、

（式中、波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
である。

別の実施形態では、連結部分が、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個の炭素を含むアシル部分を含む。インスリン受容体部分アゴニストの特定の態様では、アシル部分がスクシニル（４）、アジポイル（Ｃ６）、スベリオル（Ｃ８）またはヘキサデカンジオイル（Ｃ１６）部分である、アシル部分は、第１および第２のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位リジン残基のεアミノ基と共有結合または連結し得る二官能性リンカーを含み得る。第１および第２のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジン基のεアミノ基と結合した二官能性アシルリンカーの構造は、以下の一般式

（式中、ｎ＝０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２であり、波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
によって表され得る。

インスリン受容体部分アゴニストの特定の態様では、第１のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基と第２のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ酸を結合するアシル連結部分が、

（式中、波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
である。

インスリン受容体部分アゴニストの特定の態様では、二官能性アシルリンカーが、アシルリンカーの一末端または両末端に１個または２個のアミノ酸をさらに含み得る。例えば、インスリン受容体部分アゴニストの特定の態様では、リンカーの一末端または両末端のアミノ酸が、以下の一般式

（式中、ｎ＝０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２であり、波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
によって表され得るγグルタミン酸（γＥ）である。

別の実施形態では、連結部分が、以下の一般式

（式中、ｎ＝１または２であり、ｏ＝１、２、３、４または５であり、波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
によって表され得る、第１および第２のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位リジン残基のεアミノ基と共有結合または連結し得るアミド含有アルキル鎖二官能性リンカーを含む。特定の実施形態では、連結部分が、構造

（式中、波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
を有し得る。

別の実施形態では、連結部分が、以下の一般式

（式中、ｎ＝１、２、３、４または５であり、ｏ＝１または２であり、ｐ＝１、２、３、４または５であり、波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
によって表され得る、第１および第２のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位リジン残基のεアミノ基と共有結合し得るアミド含有アルキル鎖二官能性リンカーを含む。特定の実施形態では、連結部分が、構造

（式中、波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
である。

別の実施形態では、連結部分が、以下の一般式

（式中、ｎ＝１または２であり、ｏ＝１、２または３であり、ｐ＝１または２であり、波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
によって表され得る、第１および第２のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位リジン残基のεアミノ基と共有結合または連結し得るアミド含有アルキル鎖二官能性リンカーを含む。特定の実施形態では、連結部分が、構造

（式中、波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
である。

特定の実施形態では、連結部分が、連結部分に剛性を与える環構造を含む。特定の実施形態では、環構造がベンジル基または３、４、５、６、７もしくは８個の炭素を有する飽和もしくは不飽和脂環式基を含む。特定の実施形態では、脂環式基がシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロペンチルまたはシクロオクチルを含む。特定の実施形態では、不飽和脂環式基（シクロアルカン）がシクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニルまたはシクロオクテニル基を含む。特定の実施形態では、環構造が、１個または複数の飽和または不飽和脂肪族側鎖をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、環構造が、１個または複数のヘテロ原子を含む１個または複数の脂肪族側鎖をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、ヘテロ原子がＯ、ＳまたはＮである。

特定の実施形態では、環構造がヘテロ原子を含む。特定の実施形態では、ヘテロ原子がＯ、ＳまたはＮであり得る。特定の実施形態では、環構造が、１個または複数の炭素がＮ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子で置換されている、ベンジル基または３、４、５、６、７もしくは８個の炭素を有する飽和もしくは不飽和脂環式基を含む。ヘテロ原子を含む環構造の例としては、それだけに限らないが、エチレンオキシド、エチレンイミン、トリメチルオキシド、フラン、テトラヒドロフラン（ｔｅｔｒｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）、チオフェン（ｔｈｉｐｈｅｎｅ）、ピロリジン、ピラン、ピペリジン、イミダゾール、チアゾール、ジオキサン、モルホリン、ピリミジン、トリアゾール、チエタン、１，３−ジアゼチン、２，３−ジヒドロアゼト（２，３−ｄｉｈｙｄｒｏａｚｅｔｅ）、１，２−オキサチオラン、イソオキサゾール、オキサゾール、シロール、オキセパン、チエピン、３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−アゼピン、１，４−チアゼピン、アゾカンおよびチオカンが挙げられる。

別の実施形態では、連結部分が、以下の一般式

（式中、Ｒ_１およびＲ_２は同じであっても異なっていてもよく、Ｒ_１およびＲ_２は独立に、結合、飽和もしくは不飽和Ｃ１〜Ｃ２０またはＣ１〜Ｃ６アルキル鎖であり、１個または複数のメチレン単位は独立に、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ_２−、ＳＯ_２Ｎ（Ｒ）−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基によって置き換えられていてもよく、Ｒの各出現は独立に、水素、適切な保護基、アシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分または複素脂肪族部分、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）鎖（ＰＥＧ）_２、（ＰＥＧ）_３、（ＰＥＧ）_４、（ＰＥＧ）_５、（ＰＥＧ）_６、（ＰＥＧ）_７、（ＰＥＧ）_８、（ＰＥＧ）_９、（ＰＥＧ）_１０、（ＰＥＧ）_１１、（ＰＥＧ）_１２、（ＰＥＧ）_１３、（ＰＥＧ）_１４、（ＰＥＧ）_１５、（ＰＥＧ）_１６または（ＰＥＧ）_２であり、波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
を有するベンゼン−１，１ジアシルによって表され得る第１および第２のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位リジン残基のεアミノ基と共有結合または連結し得る二官能性リンカーを含む。

別の実施形態では、連結部分が、以下の一般式

（式中、ｎおよびｏは独立に、０、１、２、３、４または５であり、波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
を有するベンゼン−１，１ジアシルによって表され得る第１および第２のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位リジン残基のεアミノ基と共有結合または連結し得る二官能性リンカーを含む。

別の実施形態では、連結部分が、以下の一般式

（式中、Ｒ_１およびＲ_２は同じであっても異なっていてもよく、Ｒ_１およびＲ_２は独立に、結合、飽和もしくは不飽和Ｃ１〜Ｃ２０またはＣ１〜Ｃ６アルキル鎖であり、１個または複数のメチレン単位は独立に、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ_２−、ＳＯ_２Ｎ（Ｒ）−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基によって置き換えられていてもよく、Ｒの各出現は独立に、水素、適切な保護基、アシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分または複素脂肪族部分、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）鎖（ＰＥＧ）_２、（ＰＥＧ）_３、（ＰＥＧ）_４、（ＰＥＧ）_５、（ＰＥＧ）_６、（ＰＥＧ）_７、（ＰＥＧ）_８、（ＰＥＧ）_９、（ＰＥＧ）_１０、（ＰＥＧ）_１１、（ＰＥＧ）_１２、（ＰＥＧ）_１３、（ＰＥＧ）_１４、（ＰＥＧ）_１５、（ＰＥＧ）_１６または（ＰＥＧ）_２であり、波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
を有するベンゼン−１，３ジアシルによって表され得る第１および第２のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位リジン残基のεアミノ基と共有結合または連結し得る二官能性リンカーを含む。

別の実施形態では、連結部分が、以下の一般式

（式中、ｎおよびｏは独立に、０、１、２、３、４または５であり、波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
を有するベンゼン−１，３ジアシルによって表され得る第１および第２のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位リジン残基のεアミノ基と共有結合または連結し得る二官能性リンカーを含む。

別の実施形態では、連結部分が、以下の一般式

（式中、Ｒ_１およびＲ_２は同じであっても異なっていてもよく、Ｒ_１およびＲ_２は独立に、結合、飽和もしくは不飽和Ｃ１〜Ｃ２０またはＣ１〜Ｃ６アルキル鎖であり、１個または複数のメチレン単位は独立に、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ_２−、ＳＯ_２Ｎ（Ｒ）−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基によって置き換えられていてもよく、Ｒの各出現は独立に、水素、適切な保護基、アシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分または複素脂肪族部分、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）鎖（ＰＥＧ）_２、（ＰＥＧ）_３、（ＰＥＧ）_４、（ＰＥＧ）_５、（ＰＥＧ）_６、（ＰＥＧ）_７、（ＰＥＧ）_８、（ＰＥＧ）_９、（ＰＥＧ）_１０、（ＰＥＧ）_１１、（ＰＥＧ）_１２、（ＰＥＧ）_１３、（ＰＥＧ）_１４、（ＰＥＧ）_１５、（ＰＥＧ）_１６または（ＰＥＧ）_２であり、波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
を有するベンゼン−１，４ジアシルによって表され得る第１および第２のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位リジン残基のεアミノ基と共有結合または連結し得る二官能性リンカーを含む。

別の実施形態では、連結部分が、以下の一般式

（式中、ｎおよびｏは独立に、０、１、２、３、４または５であり、波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
を有するベンゼン−１，４ジアシルによって表され得る第１および第２のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位リジン残基のεアミノ基と共有結合または連結し得る二官能性リンカーを含む。

別の実施形態では、連結部分が、以下の一般式

（式中、ｍ、ｎおよびｏはそれぞれ独立に、１または２であり；Ｒ_１およびＲ_２は同じであっても異なっていてもよく、Ｒ_１およびＲ_２は独立に、結合、飽和もしくは不飽和Ｃ１〜Ｃ２０またはＣ１〜Ｃ６アルキル鎖であり、１個または複数のメチレン単位は独立に、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ_２−、ＳＯ_２Ｎ（Ｒ）−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基によって置き換えられていてもよく、Ｒの各出現は独立に、水素、適切な保護基、アシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分または複素脂肪族部分、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）鎖（ＰＥＧ）_２、（ＰＥＧ）_３、（ＰＥＧ）_４、（ＰＥＧ）_５、（ＰＥＧ）_６、（ＰＥＧ）_７、（ＰＥＧ）_８、（ＰＥＧ）_９、（ＰＥＧ）_１０、（ＰＥＧ）_１１、（ＰＥＧ）_１２、（ＰＥＧ）_１３、（ＰＥＧ）_１４、（ＰＥＧ）_１５、（ＰＥＧ）_１６または（ＰＥＧ）_２であり、波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
を有するベンゼン−１，３ジアシルによって表され得る第１および第２のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位リジン残基のεアミノ基と共有結合または連結し得る二官能性リンカーを含む。

別の実施形態では、連結部分が、以下の一般式

（式中、ｍ、ｎおよびｏはそれぞれ独立に、１または２であり；ｐおよびｑは独立に、０、１、２、３、４または５であり、波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
を有するベンゼン−１，３ジアシルによって表され得る第１および第２のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位リジン残基のεアミノ基と共有結合または連結し得る二官能性リンカーを含む。

別の実施形態では、連結部分が、以下の一般式

（式中、ｍ、ｎおよびｏはそれぞれ独立に、１または２であり；波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
を有するベンゼン−１，３ジアシルによって表され得る第１および第２のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位リジン残基のεアミノ基と共有結合または連結し得る二官能性リンカーを含む。

別の実施形態では、連結部分が、以下の一般式

（式中、波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
を有するシクロヘキサン−１，４ジアシルによって表され得る第１および第２のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位リジン残基のεアミノ基と共有結合または連結し得る二官能性リンカーを含む。

別の実施形態では、連結部分が、以下の一般式

（式中、波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
を有するシクロヘキサン−１，４ジアシルによって表され得る第１および第２のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位リジン残基のεアミノ基と共有結合または連結し得る二官能性リンカーを含む。

別の実施形態では、連結部分が、以下の一般式

（式中、ｍおよびｎはそれぞれ独立に、０、１または２であり、但し、ｍとｎの両方が０ではなく；Ｒ_１およびＲ_２は同じであっても異なっていてもよく、Ｒ_１およびＲ_２は独立に、結合、飽和もしくは不飽和Ｃ１〜Ｃ２０またはＣ１〜Ｃ６アルキル鎖であり、１個または複数のメチレン単位は独立に、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ_２−、ＳＯ_２Ｎ（Ｒ）−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基によって置き換えられていてもよく、Ｒの各出現は独立に、水素、適切な保護基、アシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分または複素脂肪族部分、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）鎖（ＰＥＧ）_２、（ＰＥＧ）_３、（ＰＥＧ）_４、（ＰＥＧ）_５、（ＰＥＧ）_６、（ＰＥＧ）_７、（ＰＥＧ）_８、（ＰＥＧ）_９、（ＰＥＧ）_１０、（ＰＥＧ）_１１、（ＰＥＧ）_１２、（ＰＥＧ）_１３、（ＰＥＧ）_１４、（ＰＥＧ）_１５、（ＰＥＧ）_１６または（ＰＥＧ）_２であり、波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
を有するベンゼン−１，３ジアシルによって表され得る第１および第２のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位リジン残基のεアミノ基と共有結合または連結し得る二官能性リンカーを含む。

別の実施形態では、連結部分が、以下の一般式

（式中、ｍおよびｎはそれぞれ独立に、１または２であり；ｐおよびｑは独立に、０、１、２、３、４または５であり、波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
を有するベンゼン−１，３ジアシルによって表され得る第１および第２のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位リジン残基のεアミノ基と共有結合または連結し得る二官能性リンカーを含む。

別の実施形態では、連結部分が、以下の一般式

（式中、ｎは１、２、３または４であり、波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
を有する１，１ジアシルによって表され得る第１および第２のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位リジン残基のεアミノ基と共有結合または連結し得る二官能性リンカーを含む。具体的な実施形態では、１，１ジアシルが

（それぞれ、１，１−ジアシル−Ｃ３；１，２−ジアシル−Ｃ４；１，１−ジアシル−Ｃ５；および１，１−ジアシル−Ｃ６）（式中、波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
から選択される構造を有し得る。

別の実施形態では、連結部分が、以下の一般式

（式中、ｎは１、２、３または４であり、波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
を有する１，２ジアシルによって表され得る第１および第２のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位リジン残基のεアミノ基と共有結合または連結し得る二官能性リンカーを含む。具体的な実施形態では、１，２ジアシルが

（それぞれ、１，２−ジアシル−Ｃ３；１，２−ジアシル−Ｃ４；１，２−ジアシル−Ｃ５；および１，２−ジアシル−Ｃ６）（式中、波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
から選択される構造を有し得る。

別の実施形態では、連結部分が、以下の一般式

（式中、ｎは１、２または３であり、波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
を有する１，３ジアシルによって表され得る第１および第２のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位リジン残基のεアミノ基と共有結合または連結し得る二官能性リンカーを含む。具体的な実施形態では、１，３ジアシルが

（それぞれ、１，３−ジアシル−Ｃ４；１，３−ジアシル−Ｃ５；および１，３−ジアシル−Ｃ６）（式中、波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
から選択される構造を有し得る。

別の実施形態では、連結部分が、以下の一般式

（１，４−ジアシル−Ｃ６）（式中、波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
を有する１，４ジアシルによって表され得る第１および第２のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位リジン残基のεアミノ基と共有結合または連結し得る二官能性リンカーを含む。

別の実施形態では、連結部分が、以下の一般式

（式中、波線はリンカーとインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジンのεアミノ基との間の結合を示す）
を有するシクロブチル−１，３ジアシルによって表され得る第１および第２のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位リジン残基のεアミノ基と共有結合または連結し得る二官能性リンカーを含む。

本発明のさらなる態様では、第１および第２のインスリンポリペプチドが、銅触媒アジド−アルキンＨｕｉｓｇｅｎ環化付加（ＣｕＡＡｃ）、特にＣｕＡＡＣクリックケミストリーを用いて結合され得る。この態様では、第１のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のεアミノ基を近位端および遠位端を有するリンカー部分と結合し、リンカー部分の近位端はεアミノ基と結合しており、遠位端はアジド基を含む。この態様では、第２のインスリンポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のεアミノ基を近位端および遠位端を有するリンカー部分と結合し、リンカー部分の近位端はεアミノ基と結合しており、遠位端はアルキン基を含む。Ｃｕ２＋および還元剤の存在下では、アジドおよびアルキン基が、トリアゾール部分を含む隣接連結部分を形成する。ＣｕＡＡＣクリックケミストリーの説明については、全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８１２９５４２号を参照されたい。

インスリン受容体部分アゴニストの特定の態様では、第１のインスリンポリペプチドが、式

を有するリンカーを介して、Ｂ２９またはＢ２８リジンのεアミノ基と結合していてもよく、
第２のインスリンポリペプチドが、式

を有するリンカーを介して、Ｂ２９またはＢ２８リジンのεアミノ基と結合していてもよい。

Ｃｕ２＋および還元剤の存在下では、リンカーが組み合わさって構造

を有する連結部分を提供する。

インスリン受容体部分アゴニストの特定の態様では、第１のインスリンポリペプチドが、式

（式中、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である）
を有するリンカーを介して、Ｂ２９またはＢ２８リジンのεアミノ基と結合していてもよく、
第２のインスリンポリペプチドが、式

（式中、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である）
を有するリンカーを介して、Ｂ２９またはＢ２８リジンのεアミノ基と結合していてもよい。Ｃｕ２＋および還元剤の存在下では、リンカーが組み合わさって構造

（式中、各ｎは独立に、１、２、３、４、５，６、７、８、９または１０である）
を有する連結部分を提供する。

さらなる態様では、第１のインスリンポリペプチドと第２のインスリンポリペプチドの両方が、式

（式中、各ｎは独立に、１、２、３、４、５，６、７、８、９または１０である）
を有するリンカーを介してＢ２９またはＢ２８リジンのそれぞれのεアミノ基と結合していてもよい。リンカーが結合して連結部分を形成することは、構造

（式中、Ｒは共有結合、炭素原子、フェニル、ヘテロ原子、またはアシル、脂肪族、複素脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環からなる群から選択される置換されていてもよい基である）
を有する分子（中間体または架橋リンカー）を提供することによって達成され得る。特定の態様では、ＲがＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９もしくはＣ１０アシル基またはＰＥＧ２、ＰＥＧ３、ＰＥＧ４、ＰＥＧ５、ＰＥＧ６、ＰＥＧ７、ＰＥＧ８、ＰＥＧ９、ＰＥＧ１０、ＰＥＧ１１、ＰＥＧ１２、ＰＥＧ１３、またはＰＥＧ２５である。

さらなる態様では、第１のインスリンポリペプチドと第２のインスリンポリペプチドの両方が、式

（式中、各ｎは独立に、１、２、３、４、５，６、７、８、９または１０である）
を有するリンカーを介してＢ２９またはＢ２８リジンのそれぞれのεアミノ基と結合していてもよい。リンカーが結合して連結部分を形成することは、構造

（Ｒは共有結合、炭素原子、フェニル、ヘテロ原子、またはアシル、脂肪族、複素脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環からなる群から選択される置換されていてもよい基である）
を有する分子（中間体または架橋リンカー）を提供することによって達成され得る。特定の態様では、ＲがＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９もしくはＣ１０アシル基またはＰＥＧ２、ＰＥＧ３、ＰＥＧ４、ＰＥＧ５、ＰＥＧ６、ＰＥＧ７、ＰＥＧ８、ＰＥＧ９、ＰＥＧ１０、ＰＥＧ１１、ＰＥＧ１２、ＰＥＧ１３、またはＰＥＧ２５である。

特定の態様では、第１のインスリンポリマーがＢ２９またはＢ２８リジンのεアミノ基で上記のアジド末端リンカーと結合しており、第２のインスリンポリペプチドがＢ２９またはＢ２８リジンのεアミノ基でシクロオクチン部分で終結したリンカーと結合しており、リンカーが銅フリー環化付加クリックケミストリーを用いて結合してリンカー部分を形成する。例えば、全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７８０７６１９号を参照されたい。

以下の表は、本発明の二量体を構築するために使用され得る代表的なリンカーを示す。示される二量体は、Ｂ２９またはＢ２９リジンのεアミノ基と結合するための２，５−ジオキソピロリジン−イル基を含む。

ニ官能性リンカーと２個のインスリンまたはインスリンアナログ分子のＢ鎖ポリペプチドのＢ２９位またはＢ２８位のリジン残基のεアミノ基が結合して連結部分によって連結されたインスリン二量体を形成することは、

（式中、インスリン１およびインスリン２分子は同じであっても異なっていてもよく、二官能性リンカーおよび結合後に得られる連結部分は本明細書で開示される任意のリンカーおよび得られる連結部分の構造を有し得る）
として模式的に示され得る。

インスリンポリペプチドの修飾
いくつかの実施形態では、インスリン受容体部分アゴニストのＡ鎖ポリペプチドまたはＢ鎖ポリペプチドの少なくとも１つが、アシル基を含むよう修飾される。アシル基をインスリンポリペプチドのアミノ酸に直接またはスペーサー（スペーサーはインスリンポリペプチドのアミノ酸とアシル基との間に位置する）を介してインスリンポリペプチドのアミノ酸に間接的に共有結合することができる。インスリンポリペプチドは、親水性部分が連結している同じアミノ酸位置でアシル化されても、または異なるアミノ酸位置でアシル化されてもよい。例えば、非アシル化インスリンポリペプチドによって示される活性がアシル化で保持される限り、アシル化は、ＡまたはＢ鎖ポリペプチドの任意のアミノ酸を含む任意の位置ならびに連結部分中の位置で生じることができる。限定的でない例としては、Ａ鎖のＡ１位およびＢ鎖のＢ１位でのアシル化が挙げられる。

本発明の１つの具体的な態様では、第１および／または第２のインスリンポリペプチド（またはその誘導体もしくは複合体）が、インスリンポリペプチドのアミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシルまたはチオールの直接アシル化によってアシル基を含むよう修飾される。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のインスリンポリペプチドが、アミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシルまたはチオールを通して直接アシル化される。この点については、側鎖アミン、ヒドロキシルまたはチオールを含むアミノ酸による、例えば、Ａ１位、Ａ１４位、Ａ１５位、Ｂ１位、Ｂ１０位もしくはＢ２２位または連結部分の任意の位置を含む、ＡまたはＢ鎖ポリペプチド配列中の１個または複数のアミノ酸置換によって修飾されたインスリンポリペプチドが提供され得る。

いくつかの実施形態では、第１および／または第２のインスリンポリペプチドとアシル基との間のスペーサーが側鎖アミン、ヒドロキシルまたはチオールを含むアミノ酸（あるいは側鎖アミン、ヒドロキシルもしくはチオールを含むアミノ酸を含むジペプチドまたはトリペプチド）である。いくつかの実施形態では、スペーサーが親水性二官能性スペーサーを含む。具体的な実施形態では、スペーサーがアミノポリ（アルキルオキシ）カルボキシレートを含む。この点については、スペーサーが、例えば、ＮＨ_２（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ（ＣＨ_２）_ｍＣＯＯＨ（式中、ｍは１〜６の任意の整数であり、ｎは２〜１２の任意の整数である）、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ＫＹ）から商業的に入手可能な８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸を含むことができる。一実施形態では、親水性二官能性スペーサーが２個以上の反応性基、例えば、アミン、ヒドロキシル、チオールおよびカルボキシル基、またはこれらの任意の組み合わせを含む。一定の実施形態では、親水性二官能性スペーサーが水酸基およびカルボキシレートを含む。他の実施形態では、親水性二官能性スペーサーがアミン基およびカルボキシレートを含む。他の実施形態では、親水性二官能性スペーサーがチオール基およびカルボキシレートを含む。

いくつかの実施形態では、第１および／または第２のインスリンポリペプチドとアシル基との間のスペーサーが疎水性二官能性スペーサーである。疎水性二官能性スペーサーは当技術分野で既知である。例えば、全体が参照により組み込まれる、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、１９９６）を参照されたい。一定の実施形態では、疎水性二官能性スペーサーが２個以上の反応性基、例えば、アミン、ヒドロキシル、チオールおよびカルボキシル基、またはこれらの任意の組み合わせを含む。一定の実施形態では、疎水性二官能性スペーサーが水酸基およびカルボキシレートを含む。他の実施形態では、疎水性二官能性スペーサーがアミン基およびカルボキシレートを含む。他の実施形態では、疎水性二官能性スペーサーがチオール基およびカルボキシレートを含む。カルボキシレートおよび水酸基またはチオール基を含む適切な疎水性二官能性スペーサーは当技術分野で既知であり、これには、例えば、８−ヒドロキシオクタン酸および８−メルカプトオクタン酸が含まれる。

一定の実施形態によると、二官能性スペーサーは、長さが３〜１０個の原子であるアミノ酸骨格を含む合成または天然アミノ酸（例えば、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸および８−アミノオクタン酸）であり得る。あるいは、スペーサーは、長さが３〜１０個の原子（例えば、６〜１０個の原子）であるペプチド骨格を有するジペプチドまたはトリペプチドスペーサーであり得る。インスリンポリペプチドに結合しているジペプチドまたはトリペプチドスペーサーの各アミノ酸は独立に、例えば、天然アミノ酸（Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）のＤもしくはＬ異性体のいずれか、またはβ−アラニン（β−Ａｌａ）、Ｎ−α−メチル−アラニン（Ｍｅ−Ａｌａ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、α−アミノ酪酸（γ−Ａｂｕ）、アミノヘキサン酸（ε−Ａｈｘ）、アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、アミノメチルピロールカルボン酸、アミノピペリジンカルボン酸、アミノセリン（Ａｍｓ）、
アミノテトラヒドロピラン−４−カルボン酸、アルギニンＮ−メトキシ−Ｎ−メチルアミド、β−アスパラギン酸（β−Ａｓｐ）、アゼチジンカルボン酸、３−（２−ベンゾチアゾリル）アラニン、α−ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、２−アミノ−５−ウレイド−ｎ−吉草酸（シトルリン、Ｃｉｔ）、β−シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、アセトアミドメチル−システイン、ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）、ジメチルチアゾリジン（ＤＭＴＡ）、γ−グルタミン酸（γ−Ｇｌｕ）、ホモセリン（Ｈｓｅ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、イソロイシンＮ−メトキシ−Ｎ−メチルアミド、メチル−イソロイシン（ＭｅＩｌｅ）、イソニペコチン酸（Ｉｓｎ）、メチル−ロイシン（ＭｅＬｅｕ）、メチル−リジン、ジメチル−リジン、トリメチル−リジン、メタノプロリン、メチオニン−スルホキシド（Ｍｅｔ（Ｏ））、メチオニン−スルホン（Ｍｅｔ（Ｏ２））、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、メチル−ノルロイシン（Ｍｅ−Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、パラ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、ペニシラミン（Ｐｅｎ）、メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、４−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｃｌ））、４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｆ））、
４−ニトロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−ＮＯ２））、４−シアノフェニルアラニン（（Ｐｈｅ（４−ＣＮ））、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、ピペリジニルアラニン、ピペリジニルグリシン、３，４−デヒドロプロリン、ピロリジニルアラニン、サルコシン（Ｓａｒ）、セレノシステイン（Ｓｅｃ）、Ｕ−ベンジル−ホスホセリン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸（Ｓｔａ）、４−アミノ−５−シクロヘキシル−３−ヒドロキシペンタン酸（ＡＣＨＰＡ）、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸（ＡＨＰＰＡ）、１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）、テトラヒドロピラングリシン、チエニルアラニン（Ｔｈｉ）、Ｕ−ベンジル−ホスホチロシン、Ｏ−ホスホチロシン、メトキシチロシン、エトキシチロシン、Ｏ−（ビス−ジメチルアミノ−ホスホノ）−チロシン、硫酸化チロシンテトラブチルアミン、
メチル−バリン（ＭｅＶａｌ）、１−アミノ−１−シクロヘキサンカルボン酸（Ａｃｘ）、アミノ吉草酸、β−シクロプロピル−アラニン（Ｃｐａ）、プロパルギルグリシン（Ｐｒｇ）、アリルグリシン（Ａｌｇ）、２−アミノ−２−シクロヘキシル−プロパン酸（２−Ｃｈａ）、ｔｅｒｔブチルグリシン（Ｔｂｇ）、ビニルグリシン（Ｖｇ）、１−アミノ−１−シクロプロパンカルボン酸（Ａｃｐ）、１−アミノ−１−シクロペンタンカルボン酸（Ａｃｐｅ）、アルキル化３−メルカプトプロピオン酸、１−アミノ−１−シクロブタンカルボン酸（Ａｃｂ）からなる群から選択される非天然アミノ酸の任意のＤもしくはＬ異性体を含む天然および／または非天然アミノ酸からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、ジペプチドスペーサーが、Ａｌａ−Ａｌａ、β−Ａｌａ−β−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、γ−アミノ酪酸−γ−アミノ酪酸およびγ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕからなる群から選択される。

第１および／または第２のインスリンポリペプチドは、長鎖アルカンのアシル化によりアシル基を含むよう修飾され得る。具体的な態様では、長鎖アルカンが、インスリンポリペプチドのカルボキシル基またはその活性化型と反応するアミン、ヒドロキシルまたはチオール基を含む（例えば、オクタデシルアミン、テトラデカノールおよびヘキサデカンチオール）。インスリンポリペプチドのカルボキシル基またはその活性化型は、インスリンポリペプチドのアミノ酸（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）の側鎖の一部であっても、またはペプチド骨格の一部であってもよい。

一定の実施形態では、第１および／または第２のインスリンポリペプチドが、インスリンポリペプチドと結合しているスペーサーによる長鎖アルカンのアシル化によってアシル基を含むよう修飾される。具体的な態様では、長鎖アルカンが、スペーサーのカルボキシル基またはその活性化型と反応するアミン、ヒドロキシルまたはチオール基を含む。カルボキシル基またはその活性化型を含む適切なスペーサーは本明細書に記載されており、これには、例えば、二官能性スペーサー、例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能性スペーサーおよび疎水性二官能性スペーサーが含まれる。本明細書で使用される場合、「カルボキシル基の活性化型」という用語は、一般式Ｒ（Ｃ＝Ｏ）Ｘ（式中、Ｘは脱離基であり、Ｒはインスリンポリペプチドまたはスペーサーである）を有するカルボキシル基を指す。例えば、カルボキシル基の活性化型には、それだけに限らないが、塩化アシル、無水物およびエステルが含まれ得る。いくつかの実施形態では、活性化カルボキシル基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）脱離基を有するエステルである。

長鎖アルカンがペプチド、インスリンポリペプチドまたはスペーサーによってアシル化された本発明のこれらの態様に関して、長鎖アルカンは任意のサイズであってよく、任意の長さの炭素鎖を含むことができる。長鎖アルカンは直鎖であっても分岐であってもよい。一定の態様では、長鎖アルカンがＣ_４〜Ｃ_３０アルカンである。例えば、長鎖アルカンは、Ｃ_４アルカン、Ｃ_６アルカン、Ｃ_８アルカン、Ｃ_１０アルカン、Ｃ_１２アルカン、Ｃ_１４アルカン、Ｃ_１６アルカン、Ｃ_１８アルカン、Ｃ_２０アルカン、Ｃ_２２アルカン、Ｃ_２４アルカン、Ｃ_２６アルカン、Ｃ_２８アルカンまたはＣ_３０アルカンのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、長鎖アルカンがＣ_８〜Ｃ_２０アルカン、例えば、Ｃ_１４アルカン、Ｃ_１６アルカンまたはＣ_１８アルカンを含む。

いくつかの実施形態では、第１および／または第２のインスリンポリペプチドのアミン、ヒドロキシルまたはチオール基がコレステロール酸によってアシル化される。具体的な実施形態では、ペプチドが、アルキル化デス−アミノＣｙｓスペーサー、すなわち、アルキル化３−メルカプトプロピオン酸スペーサーを通してコレステロール酸と結合する。アミン、ヒドロキシルおよびチオールを介したペプチドアシル化の適切な方法は当技術分野で既知である。例えば、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２１８：３７７〜３８２（１９９６）；ＳｈｉｍｏｈｉｇａｓｈｉおよびＳｔａｍｍｅｒ、Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ １９：５４〜６２（１９８２）；ならびにＰｒｅｖｉｅｒｏら、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２６３：７〜１３（１９７２）（ヒドロキシルを通したアシル化の方法について）；ならびにＳａｎおよびＳｉｌｖｉｕｓ、Ｊ Ｐｅｐｔ Ｒｅｓ ６６：１６９〜１８０（２００５）（チオールを通したアシル化の方法について）；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．「Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｈｉｓｔｏｒｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」１、２〜１２頁（１９９０）；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、Ｐｈａｒｍａｃｕｅｔｉｃａｌ Ｒｅｓ．「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ Ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」第６巻、第２号、１７１〜１７６頁（１９８９）を参照されたい。

アシル化ペプチド、第１および／または第２のインスリンポリペプチドのアシル基は、任意のサイズ、例えば、任意の長さの炭素鎖であってよく、直鎖であっても分岐であってもよい。本発明のいくつかの具体的な実施形態では、アシル基がＣ_４〜Ｃ_３０脂肪酸である。例えば、アシル基は、Ｃ_４脂肪酸、Ｃ_６脂肪酸、Ｃ_８脂肪酸、Ｃ_１０脂肪酸、Ｃ_１２脂肪酸、Ｃ_１４脂肪酸、Ｃ_１６脂肪酸、Ｃ_１８脂肪酸、Ｃ_２０脂肪酸、Ｃ_２２脂肪酸、Ｃ_２４脂肪酸、Ｃ_２６脂肪酸、Ｃ_２８脂肪酸またはＣ_３０脂肪酸のいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、アシル基がＣ_８〜Ｃ_２０脂肪酸、例えば、Ｃ_１４脂肪酸またはＣ_１６脂肪酸である。いくつかの実施形態では、アシル基が尿素である。

代替実施形態では、アシル基が胆汁酸である。胆汁酸は、それだけに限らないが、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸およびコレステロール酸を含む任意の適切な胆汁酸であり得る。

本明細書に記載されるアシル化第１および／または第２のインスリンポリペプチドを、親水性部分を含むようさらに修飾することができる。いくつかの具体的な実施形態では、親水性部分がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含むことができる。親水性部分の組み込みは、本明細書に記載される方法のいずれかなどの任意の適切な手段を通して達成することができる。いくつかの実施形態では、アシル化単鎖アナログが、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−ＣｙｓまたはＡｃ−Ｐｈｅからなる群から選択されるアミノ酸を含み、アミノ酸の側鎖が親水性部分（例えば、ＰＥＧ）と共有結合している。一実施形態では、アシル基が、場合によりＣｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−ＣｙｓまたはＡｃ−Ｐｈｅを含むスペーサーを介して、Ａ１、Ａ１４、Ａ１５、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ１０またはＢ２２位（天然インスリンのＡ鎖およびＢ鎖のアミノ酸ナンバリングによる）と結合している。

あるいは、アシル化第１および／または第２のインスリンポリペプチドが、アシル化されており、かつ親水性部分を含むよう修飾もされているスペーサーを含む。適切なスペーサーの限定的でない例としては、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−ＣｙｓおよびＡｃ−Ｐｈｅからなる群から選択される１個または複数のアミノ酸を含むスペーサーが挙げられる。

いくつかの実施形態では、インスリン受容体部分アゴニストのＡ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドの少なくとも１つの少なくとも１個のＮ末端アミノ酸のアミノ末端が、置換基を含むよう修飾される。置換基をＮ末端アミノ酸のアミノ基に直接またはスペーサー（スペーサーはインスリンポリペプチドのＮ末端アミノ酸のアミノ基と置換基との間に位置する）を介してアミノ基に間接的に共有結合することができる。置換基は上に論じられるアシル部分であり得る。置換基は一般式ＲＣ（Ｏ）−（ＲはＲ’ＣＨ_２、Ｒ’ＮＨ、Ｒ’Ｏであり得、Ｒ’はＨ、直鎖アルキル鎖、アミノ酸、ペプチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、糖類であり得る）を有し、特定の態様では、ＲＣ（Ｏ）−がアセチル、フェニルアセチル、カルバモイル、Ｎ−アルキルカルバモイルまたはアルコキシカルボニルであり得る。特定の態様では、置換基がカルバモイル基、アセチル基、グリシン、メチル基、メトキシ基、ジメチル基、イソブチル基、ＰＥＧ１基またはＰＥＧ２基である（置換基の構造については本明細書の実施例を参照）。インスリンのカルバモイル化はＯｉｍｏｎｉら、Ｎｅｐｈｒｏｎ ４６：６３〜６６（１９８７）によって開示されており、Ｎ末端のカルバモイル基を含むインスリン二量体はＰＣＴ出願番号国際公開第２０１４０５２４５１号（例えば、ＭＩＵ−９０）に開示されている。

特定の実施形態では、少なくとも１個のＮ末端アミノ酸が、一般式ＲＣ（Ｏ）−（ＲはＲ’ＣＨ_２、Ｒ’ＮＨ、Ｒ’Ｏであり得、Ｒ’はＨ、直鎖アルキル鎖、アミノ酸、ペプチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、糖類であり得る）を有し、特定の態様では、ＲＣ（Ｏ）−がアセチル、フェニルアセチル、カルバモイル、Ｎ−アルキルカルバモイルまたはアルコキシカルボニルであり得る基と連結したＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む置換基とＮ２窒素を介して結合している。特定の態様では、置換基がカルバモイル基、アセチル基、グリシン、メチル基、メトキシ基、ジメチル基、イソブチル基、ＰＥＧ１基またはＰＥＧ２基である。

特定の実施形態では、第１および第２のインスリンポリペプチドの１個または複数のアミノ末端と共有結合した糖類が単糖であり得る（例えば、二量体５１参照）。いくつかの実施形態では、糖類が１個または複数のアミン基を含む。一定の実施形態では、糖類およびアミン基がＣ_１〜Ｃ_６アルキル基、例えば、Ｃ_１〜Ｃ_３アルキル基によって分離されている。いくつかの実施形態では、糖類がアミノエチルグルコース（ＡＥＧ）である。一定の実施形態では、糖類リガンドが「Ｄ」配置である。他の実施形態では、糖類リガンドが「Ｌ」配置である。以下で、本発明者らは、これらの代表的な糖類の構造を示す。他の代表的な糖類は当業者によって認識されるだろう。

一般的に、糖類は直接またはリンカーを介して間接的に第１および第２のインスリンポリペプチドの１つまたは複数のアミノ末端と結合し得る。特定の態様では、リンカーがアルキルジオイル、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎＣ（Ｏ）−（式中、ｎ＝０〜４５、０〜２０、０〜１０または０〜５である）である。

Ｎ末端アミノ基と結合した代表的な置換基は、

であり得、波線は置換基とＮ末端アミノ基との間の結合を示す。置換基が

（Ｍｅ２；Ｎ−ジメチル）（式中、波線はＭｅ２とＮ末端アミノ酸のα炭素との間の結合を示す）であってもよい。

代表的なインスリン二量体
特定の実施形態では、本発明は、第１のＡ鎖ポリペプチドおよび第１のＢ鎖ポリペプチドを有する第１のインスリンヘテロ二量体分子の第１のＢ２９またはＢ２８ Ｌｙｓと第２のＡ鎖ポリペプチドおよび第２のＢ鎖ポリペプチドを有する第２のインスリンヘテロ二量体の第２のＢ２９またはＢ２８ Ｌｙｓが、リンカー１、リンカー２、リンカー３、リンカー１０、リンカー１１、リンカー１２、リンカー１３、リンカー１４、リンカー１５、リンカー１６、リンカー１７、リンカー１８、リンカー１９、リンカー２０、リンカー２１、リンカー２２、リンカー２３、リンカー２４、リンカー２５、リンカー２６、リンカー２７、リンカー２８、リンカー２９、リンカー３０、リンカー３１、リンカー３２、リンカー３３、リンカー３４、リンカー３５、リンカー３６、リンカー３７、リンカー３８、リンカー３９、リンカー４０、リンカー４１、リンカー４２、リンカー４３、リンカー４４、リンカー４５、リンカー４６、リンカー４７、リンカー４８、リンカー４９およびリンカー５０からなる群から選択される二官能性リンカーによって結合されており、但し、二官能性リンカーがリンカー１０、リンカー１１、リンカー１２、リンカー１３またはリンカー１４である場合、第１または第２のＡ鎖またはＢ鎖ポリペプチドの少なくとも１つがそのＮ末端アミノ酸で本明細書で開示される置換基と結合している、あるいは少なくとも第１のインスリンヘテロ二量体分子のＮ末端アミノ酸が本明細書で開示される置換基と結合している、あるいは第１のインスリンヘテロ二量体と第２のインスリンヘテロ二量体の両方のＮ末端アミノ酸が置換基と結合している、インスリン二量体を提供する。特定の実施形態では、置換基が一般式ＲＣ（Ｏ）−（ＲはＲ’ＣＨ_２、Ｒ’ＮＨ、Ｒ’Ｏであり得、Ｒ’はＨ、直鎖アルキル鎖、アミノ酸、ペプチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、糖類であり得る）を有する基と連結したＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含み、特定の態様では、ＲＣ（Ｏ）−がアセチル、フェニルアセチル、カルバモイル、Ｎ−アルキルカルバモイルまたはアルコキシカルボニルであり得る。特定の態様では、置換基がカルバモイル基、アセチル基、グリシン、メチル基、メトキシ基、ジメチル基、イソブチル基、ＰＥＧ１基、ＡＥＧ基、ＡＥＧ−Ｃ６アルキル基またはＰＥＧ２基である。

特定の実施形態では、本発明は、第１のリンカーおよび第２のリンカーを介して結合している、第１のＡ鎖ポリペプチドおよび第１のＢ鎖ポリペプチドを有する第１のインスリンヘテロ二量体分子の第１のＢ２９またはＢ２８ Ｌｙｓがリンカー５およびリンカー７からなる群から選択される第１のリンカーと結合しており、第２のＡ鎖ポリペプチドおよび第２のＢ鎖ポリペプチドを有する第２のインスリンヘテロ二量体の第２のＢ２９またはＢ２８ Ｌｙｓがリンカー４、リンカー６、リンカー８およびリンカー９からなる群から選択される第２のリンカーと結合しているインスリン二量体を提供する。特定の実施形態では、第１または第２のＡ鎖またはＢ鎖ポリペプチドの少なくとも１つがそのＮ末端アミノ酸で本明細書で開示される置換基と結合している、あるいは少なくとも第１のインスリンヘテロ二量体分子のＮ末端アミノ酸が本明細書で開示される置換基と結合している、あるいは第１のインスリンヘテロ二量体と第２のインスリンヘテロ二量体の両方のＮ末端アミノ酸が置換基と結合している。特定の実施形態では、置換基が一般式ＲＣ（Ｏ）−（ＲはＲ’ＣＨ_２、Ｒ’ＮＨ、Ｒ’Ｏであり得、Ｒ’はＨ、直鎖アルキル鎖、アミノ酸、ペプチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、糖類であり得る）を有する基と連結したＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含み、特定の態様では、ＲＣ（Ｏ）−がアセチル、フェニルアセチル、カルバモイル、Ｎ−アルキルカルバモイルまたはアルコキシカルボニルであり得る。特定の態様では、置換基がカルバモイル基、アセチル基、グリシン、メチル基、メトキシ基、ジメチル基、イソブチル基、ＰＥＧ１基、ＡＥＧ基、ＡＥＧ−Ｃ６アルキル基またはＰＥＧ２基である。

特定の実施形態では、本発明は、第１のＡ鎖ポリペプチドおよび第１のＢ鎖ポリペプチドを有する第１のインスリンヘテロ二量体分子の第１のＢ２９またはＢ２８ Ｌｙｓがリンカー５およびリンカー７からなる群から選択される第１のリンカーと結合しており、第２のＡ鎖ポリペプチドおよび第２のＢ鎖ポリペプチドを有する第２のインスリンヘテロ二量体の第２のＢ２９またはＢ２８ Ｌｙｓがリンカー５およびリンカー７からなる群から選択される第２のリンカーと結合しているインスリン二量体であって、第１および第２のリンカーが構造

（Ｒは共有結合、炭素原子、フェニル、ヘテロ原子、またはアシル、脂肪族、複素脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環からなる群から選択される置換されていてもよい基である）
を有する架橋リンカーを介して結合しているインスリン二量体を提供する。特定の態様では、ＲがＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９もしくはＣ１０アシル基またはＰＥＧ２、ＰＥＧ３、ＰＥＧ４、ＰＥＧ５、ＰＥＧ６、ＰＥＧ７、ＰＥＧ８、ＰＥＧ９、ＰＥＧ１０、ＰＥＧ１１、ＰＥＧ１２、ＰＥＧ１３、またはＰＥＧ２５である。特定の実施形態では、第１または第２のＡ鎖またはＢ鎖ポリペプチドの少なくとも１つがそのＮ末端アミノ酸で本明細書で開示される置換基と結合している、あるいは少なくとも第１のインスリンヘテロ二量体分子のＮ末端アミノ酸が本明細書で開示される置換基と結合している、あるいは第１のインスリンヘテロ二量体と第２のインスリンヘテロ二量体の両方のＮ末端アミノ酸が置換基と結合している。特定の実施形態では、置換基が一般式ＲＣ（Ｏ）−（ＲはＲ’ＣＨ_２、Ｒ’ＮＨ、Ｒ’Ｏであり得、Ｒ’はＨ、直鎖アルキル鎖、アミノ酸、ペプチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、糖類であり得る）を有する基と連結したＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含み、特定の態様では、ＲＣ（Ｏ）−がアセチル、フェニルアセチル、カルバモイル、Ｎ−アルキルカルバモイルまたはアルコキシカルボニルであり得る。特定の態様では、置換基がカルバモイル基、アセチル基、グリシン、メチル基、メトキシ基、ジメチル基、イソブチル基、ＰＥＧ１基、ＡＥＧ基、ＡＥＧ−Ｃ６アルキル基またはＰＥＧ２基である。

特定の実施形態では、本発明は、第１のＡ鎖ポリペプチドおよび第１のＢ鎖ポリペプチドを有する第１のインスリンヘテロ二量体分子の第１のＢ２９またはＢ２８ Ｌｙｓがリンカー４、リンカー６、リンカー８およびリンカー９からなる群から選択される第１のリンカーと結合しており、第２のＡ鎖ポリペプチドおよび第２のＢ鎖ポリペプチドを有する第２のインスリンヘテロ二量体の第２のＢ２９またはＢ２８ Ｌｙｓがリンカー４、リンカー６、リンカー８およびリンカー９からなる群から選択される第２のリンカーと結合しているインスリン二量体であって、第１および第２のリンカーが構造

（Ｒは共有結合、炭素原子、フェニル、ヘテロ原子、またはアシル、脂肪族、複素脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環からなる群から選択される置換されていてもよい基である）
を有する架橋リンカーを介して結合しているインスリンアナログ二量体を提供する。特定の態様では、ＲがＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９もしくはＣ１０アシル基またはＰＥＧ２、ＰＥＧ３、ＰＥＧ４、ＰＥＧ５、ＰＥＧ６、ＰＥＧ７、ＰＥＧ８、ＰＥＧ９、ＰＥＧ１０、ＰＥＧ１１、ＰＥＧ１２、ＰＥＧ１３、またはＰＥＧ２５である。特定の実施形態では、第１または第２のＡ鎖またはＢ鎖ポリペプチドの少なくとも１つがそのＮ末端アミノ酸で本明細書で開示される置換基と結合している、あるいは少なくとも第１のインスリンヘテロ二量体分子のＮ末端アミノ酸が本明細書で開示される置換基と結合している、あるいは第１のインスリンヘテロ二量体と第２のインスリンヘテロ二量体の両方のＮ末端アミノ酸が置換基と結合している。特定の実施形態では、置換基が一般式ＲＣ（Ｏ）−（ＲはＲ’ＣＨ_２、Ｒ’ＮＨ、Ｒ’Ｏであり得、Ｒ’はＨ、直鎖アルキル鎖、アミノ酸、ペプチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、糖類であり得る）を有する基と連結したＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含み、特定の態様では、ＲＣ（Ｏ）−がアセチル、フェニルアセチル、カルバモイル、Ｎ−アルキルカルバモイルまたはアルコキシカルボニルであり得る。特定の態様では、置換基がカルバモイル基、アセチル基、グリシン、メチル基、メトキシ基、ジメチル基、イソブチル基、ＰＥＧ１基、ＡＥＧ基、ＡＥＧ−Ｃ６アルキル基またはＰＥＧ２基である。

さらなる実施形態では、第１および第２のインスリンヘテロ二量体が本明細書で開示されるインスリンまたはインスリンアナログのいずれかを含み得る。

本発明はまた、

から選択されるインスリン二量体を提供する。

Ａ鎖ポリペプチドのＣｙｓ_６残基とＣｙｓ_１１残基との間のジスルフィド結合ならびにそれぞれＡ鎖のＣｙｓ_７およびＣｙｓ_２０とＢ鎖ポリペプチドのＣｙｓ_７およびＣｙｓ_１９との間のジスルフィド結合はその間の実線によって表され；連結部分は示されるリジン残基のεアミノ酸と共有結合しており、二量体１〜４０、４２〜５２、５４〜８６および８８〜９４についてのＡ鎖ポリペプチドは配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し；二量体５６についてのＡ鎖ポリペプチドは配列番号１１について示されるアミノ酸配列を有し；二量体１〜１７、２１〜２７、３６、３７、３９〜４０および４２〜５２、５４〜８２、８４〜８６および８８〜９４についてのＢ鎖ポリペプチドは配列番号２に示されるアミノ酸配列を有し；二量体１８および３２〜３５についてのＢ鎖ポリペプチドは配列番号６に示されるアミノ酸配列を有し；二量体１９および８３についてのＢ鎖ポリペプチドは配列番号９に示されるアミノ酸配列を有し；二量体２０、２８〜３１および３８についてのＢ鎖ポリペプチドは配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有し；二量体５３および８７についてのＡ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドはそれぞれ、配列番号７および配列番号８である。

医薬組成物
一実施形態によると、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の純度レベルの本明細書で開示される新規なインスリン二量体のいずれかと、薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。このような組成物は、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１１ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１３ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１７ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、１９ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２１ｍｇ／ｍｌ、２２ｍｇ／ｍｌ、２３ｍｇ／ｍｌ、２４ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、またはそれ以上の濃度で本明細書で開示されるインスリン二量体を含有し得る。一実施形態では、医薬組成物が、滅菌され、種々の包装容器に含まれて保管されてもよい水溶液を含む。他の実施形態では、医薬組成物が凍結乾燥粉末を含む。医薬組成物を、組成物を患者に投与するための使い捨て装置を含むキットの一部としてさらに包装することができる。容器またはキットは、周囲温度または冷蔵温度で保管するためにラベル付けされ得る。

開示されるインスリン二量体は、インスリンペプチドについて前に記載されてきたいずれの使用にも適していると考えられる。したがって、本明細書で開示されるインスリン二量体を使用して高血糖を治療する、または高血中グルコースレベルから生じる他の代謝疾患を治療することができる。したがって、本発明は、高血中グルコースレベルを患っている患者の治療に使用するための、本明細書で開示されるインスリン二量体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を包含する。一実施形態によると、本明細書で開示されるインスリン二量体を用いて治療される患者が家畜化動物であり、別の実施形態では、治療される患者がヒトである。

本開示による高血糖を治療する１つの方法は、非経口、例えば、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内、くも膜下腔内、経皮的、直腸、経口、経鼻または吸入を含む任意の標準的な投与経路を用いて、本開示インスリン二量体を患者に投与するステップを含む。一実施形態では、組成物が皮下または筋肉内投与される。一実施形態では、組成物が非経口投与され、インスリンポリペプチドまたはそのプロドラッグ誘導体が注射器に事前包装される。

本明細書で開示されるインスリン二量体は、単独で投与されても、または他の抗糖尿病薬と組み合わせて投与されてもよい。当技術分野で既知のまたは調査中の抗糖尿病薬には、天然インスリン、天然グルカゴンおよびその機能的アナログ、スルホニル尿素、例えば、トルブタミド（Ｏｒｉｎａｓｅ）、アセトヘキサンアミド（Ｄｙｍｅｌｏｒ）、トラザミド（Ｔｏｌｉｎａｓｅ）、クロルプロパミド（Ｄｉａｂｉｎｅｓｅ）、グリピジド（Ｇｌｕｃｏｔｒｏｌ）、グリブリド（Ｄｉａｂｅｔａ、Ｍｉｃｒｏｎａｓｅ、Ｇｌｙｎａｓｅ）、グリメピリド（Ａｍａｒｙｌ）またはグリクラジド（Ｄｉａｍｉｃｒｏｎ）；メグリチニド、例えば、レパグリニド（Ｐｒａｎｄｉｎ）またはナテグリニド（Ｓｔａｒｌｉｘ）；ビグアナイド、例えば、メトホルミン（Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ）またはフェンホルミン；チアゾリジンジオン、例えば、ロシグリタゾン（Ａｖａｎｄｉａ）、ピオグリタゾン（Ａｃｔｏｓ）またはトログリタゾン（Ｒｅｚｕｌｉｎ）または他のＰＰＡＲγ阻害薬；炭水化物消化を阻害するαグルコシダーゼ阻害薬、例えば、ミグリトール（Ｇｌｙｓｅｔ）、アカルボース（Ｐｒｅｃｏｓｅ／Ｇｌｕｃｏｂａｙ）；エキセナチド（Ｂｙｅｔｔａ）またはプラムリンチド；ジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）阻害薬、例えば、ビルダグリプチンまたはシタグリプチン；ＳＧＬＴ（ナトリウム依存性グルコース輸送体１）阻害薬；あるいはＦＢＰａｓｅ（フルクトース１，６−ビスホスファターゼ）阻害薬が含まれる。

本明細書で開示されるインスリン二量体を含む医薬組成物は、標準的な薬学的に許容される担体および当業者に既知の投与経路を用いて製剤化し、患者に投与することができる。したがって、本開示はまた、本明細書で開示されるインスリン二量体またはその薬学的に許容される塩の１つまたは複数を、薬学的に許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物を包含する。例えば、本明細書で開示されるインスリン二量体を含む医薬組成物は、亜鉛イオン、保存剤（例えば、フェノール、クレゾール、パラベン）、等張化剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（例えば、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、デキストロース、トレハロース、塩化ナトリウム、グリセロール）、緩衝物質、塩、酸およびアルカリならびにさらなる賦形剤を含有してもよい。これらの物質は、各場合で、個別に、あるいは混合物として存在することができる。グリセロール、デキストロース、ラクトース、ソルビトールおよびマンニトールは慣用的に１００〜２５０ｍＭの濃度で医薬製剤中に存在し、ＮａＣｌは最大１５０ｍＭの濃度で存在する。例えば、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、アルギニン、グリシルグリシンまたはＴＲＩＳ（すなわち、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール）緩衝液および対応する塩などの緩衝物質は、５〜２５０ｍＭ、一般的に約１０〜１００ｍＭの濃度で存在する。さらなる賦形剤は、特に、塩またはアルギニンであり得る。

一実施形態では、医薬組成物が、リン酸緩衝系中約４．０〜約７．０のｐＨで１ｍｇ／ｍＬ濃度のインスリン二量体を含む。医薬組成物が唯一の医薬品有効成分としてインスリン二量体を含んでもよいし、またはインスリン二量体を１種または複数のさらなる活性剤と組み合わせてもよい。

本明細書で開示される全ての治療方法、医薬組成物、キットおよび他の同様の実施形態は、インスリン二量体がその全ての薬学的に許容される塩を含むことを考慮している。

一実施形態では、キットがインスリン二量体組成物を患者に投与するための装置を備える。キットは、種々の容器、例えば、バイアル、チューブ、瓶などをさらに含んでもよい。好ましくは、キットは取扱説明書も含む。一実施形態によると、キットの装置がエアロゾル分配装置であり、組成物がエアロゾル装置内に事前包装されている。別の実施形態では、キットが注射器および針を含み、一実施形態では、インスリン二量体組成物が注射器内に事前包装されている。

本発明の化合物は、標準的な合成方法、組換えＤＮＡ技術、またはペプチドおよび融合タンパク質を調製する任意の他の方法によって調製され得る。一定の非天然アミノ酸は標準的な組換えＤＮＡ技術によって発現することができないが、その調製技術は当技術分野で既知である。非ペプチド部分を包含する本発明の化合物は、該当する場合、標準的なペプチド化学反応に加えて、標準的な有機化学反応によって合成され得る。

以下の実施例は、本発明のさらなる理解を促進することを意図している。

［実施例］
一般的手順
全ての化学物質は特に注記しない限り、商業的供給業者から購入した。反応は特に注記しない限り、通常は周囲温度または室温で行った。湿気または空気に敏感な反応は、無水溶媒および試薬を用いて、窒素またはアルゴン下で行った。反応の進行は、分析薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および超高性能液体クロマトグラフィー−質量分析（ＵＰＬＣ−ＭＳ）によって監視した。ＴＬＣはシリカゲル６０Ｆ−２５４、層厚０．２５ｍｍでプレコーティングしたＥ．Ｍｅｒｃｋ ＴＬＣプレートで行った。プレートは、２５４ｎｍ ＵＶを用いておよび／またはモリブデン酸アンモニウムセリウム溶液（ＣＡＭ）もしくはｐ−アニスアルデヒド染色液への暴露、引き続く炭化によって可視化した。超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）はＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ（商標）ＵＰＬＣ（登録商標）システムで行った。

ＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ａ：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ（商標）ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍ １．０×５０ｍｍカラム ２．０分にわたって１０：９０〜９５：５ｖ／ｖのＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ＋ｖ０．０５％ＴＦＡの勾配を用いる；流量０．３ｍＬ／分、ＵＶ波長２１５ｎｍ；ＵＰＬＣ−ＭＳ；
方法Ｂ：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ（商標）ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍ ２．１×１００ｍｍカラム ４．０分にわたって６０：４０〜１００：０ｖ／ｖのＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ＋ｖ０．０５％ＴＦＡおよび４０秒にわたって１００：０〜９５：５ｖ／ｖのＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ＋ｖ０．０５％ＴＦＡの勾配を用いる；流量０．３ｍＬ／分、ＵＶ波長２００〜３００ｎｍ；ＵＰＬＣ−ＭＳ；
方法Ｃ：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ（商標）ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍ ２．１×１００ｍｍカラム４．０分にわたって２０：８０〜９０：１０ｖ／ｖのＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ＋ｖ０．０５％ＴＦＡおよび０．５分にわたって９０：１０〜９５：５ｖ／ｖのＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ＋ｖ０．０５％ＴＦＡの勾配を用いる；流量０．３ｍＬ／分、ＵＶ波長２００〜３００ｎｍ；ＵＰＬＣ−ＭＳ；
方法Ｄ：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ（商標）ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ Ｃ８ １．７μｍ ２．１×１００ｍｍカラム ４．０分にわたって１０：９０〜５５：４５ｖ／ｖのＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ＋ｖ０．０５％ＴＦＡおよび４０秒にわたって５５：４５〜９５：５ｖ／ｖのＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ＋ｖ０．０５％ＴＦＡの勾配を用いる；流量０．３ｍＬ／分、ＵＶ波長２００〜３００ｎｍ；ＵＰＬＣ−ＭＳ；
方法Ｅ：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ（商標）ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ３００ Ｃ４ １．７μｍ ２．１×１００ｍｍカラム ４．３分にわたって１０：９０〜５０：５０ｖ／ｖのＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ＋ｖ０．０５％ＴＦＡおよび０．５分にわたって５０：５０〜７０：３０ｖ／ｖのＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ＋ｖ０．０５％ＴＦＡの勾配を用いる；流量０．３ｍＬ／分、ＵＶ波長２００〜３００ｎｍ；ＵＰＬＣ−ＭＳ；
方法Ｆ：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ（商標）ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ Ｃ８ １．７μｍ ２．１×１００ｍｍカラム ４．３分にわたって２０：８０〜７２．５：２７．５ｖ／ｖのＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ＋ｖ０．０５％ＴＦＡおよび０．５分にわたって７２．５：２７．５〜９５：５ｖ／ｖのＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ＋ｖ０．０５％ＴＦＡの勾配を用いる；流量０．３ｍＬ／分、ＵＶ波長２００〜３００ｎｍおよびＵＰＬＣ−ＭＳ；
方法Ｇ：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ（商標）ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ Ｃ８ １．７μｍ ２．１×１００ｍｍカラム４．０分にわたって２０：８０〜９０：１０ｖ／ｖのＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ＋ｖ０．１％ＴＦＡおよび０．４分にわたって９０：１０〜９５：５ｖ／ｖのＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ＋ｖ０．１％ＴＦＡの勾配を用いる；流量０．３ｍＬ／分、ＵＶ波長２００〜３００ｎｍ。

質量分析を、正イオン検出モードのエレクトロスプレーイオン化によりＷａｔｅｒｓ ＳＱ検出器で行い、質量対電荷比のスキャン範囲を１７０〜９００とした、または正イオン検出モードのエレクトロスプレーイオン化によりＷａｔｅｒｓ Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ（登録商標）ＬＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒ（商標）ＸＥで行い、質量対電荷比のスキャン範囲を３００〜２０００とした。生成インスリン複合体またはＩＲＰＡの同定は、理論分子量とＵＰＬＣ−ＭＳを用いて測定した実験値を比較することによって確認した。結合位置を決定するために、具体的には、インスリン二量体をＤＴＴ処置（ａ／ｂ鎖について）またはＧｌｕ−Ｃ消化（還元およびアルキル化を用いるもしくは用いない）に供し、次いで、得られたペプチドをＬＣ−ＭＳによって分析した。測定した質量に基づいて、結合位置を推定した。

Ｂｉｏｔａｇｅ Ｆｌａｓｈ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ装置（Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐ．）またはＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）Ｒｆ機器（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ Ｉｓｃｏ）のいずれかを用いてフラッシュクロマトグラフィーを行った。順相クロマトグラフィーは注記されるサイズの充填済カートリッジ中シリカゲル（２０〜７０μｍ、６０Å孔径）で行った。イオン交換クロマトグラフィーは親水性陰アニオン性ポリ（２−スルホエチルアスパルトアミド）の結合コーティングを含むシリカ系材料で行った（ＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ Ａカラム、ＰｏｌｙＬＣ Ｉｎｃ．、２５０×２１ｍｍ、５μｍ、１０００Å孔径）。逆相クロマトグラフィーは注記されるサイズの充填済カートリッジ中Ｃ１８結合シリカゲル（２０〜６０μｍ、６０〜１００Å孔径）で行った。分取スケールＨＰＬＣは、Ｗａｔｅｒｓ ＤＥＬＴＡ ＰＡＫ Ｃ４ １５μｍ、３００Å、５０×２５０ｍｍカラムまたはＫＲＯＭＡＳＩＬ（登録商標）Ｃ８ １０μｍ、１００Å、５０×２５０ｍｍカラム、流量８５ｍＬ／分、注記される勾配を用いてＧｉｌｓｏｎ ３３３〜３３４バイナリーシステムで行った。溶液の濃縮は減圧下ロータリーエバポレーターで行った、またはＶｉｒＴｉｓ Ｆｒｅｅｚｅｍｏｂｉｌｅ Ｆｒｅｅｚｅ Ｄｒｙｅｒ（ＳＰ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で凍結乾燥した。

略語：アセトニトリル（ＡｃＣＮ）、水性（ａｑ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンまたはヒューニッヒ塩基（ＤＩＰＥＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、（１又は複数の）グラム（ｇ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ）、（１又は複数の）時間（ｈまたはｈｒ）、質量スペクトル（ｍｓまたはＭＳ）、（１又は複数の）マイクログラム（μｇ）、（１又は複数の）マイクロリットル（μＬ）、マイクロモル（μｍｏｌ）、（１又は複数の）ミリグラム（ｍｇ）、（１又は複数の）ミリリットル（ｍＬ）、ミリモル（ｍｍｏｌ）、（１又は複数の）分（分）、保持時間（Ｒ_ｔ）、室温（ｒｔ）、飽和（ｓａｔ．またはｓａｔ’ｄ）、飽和塩化ナトリウム水溶液（食塩水）、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＳＴＵ）。

「ＲＨＩ」という用語は組換えヒトインスリンを指し、インスリンが天然の野生型ヒトインスリン特有のアミノ酸配列を有することを示すために使用される。表において本明細書で使用される場合、この用語は、二量体を構成するインスリンのアミノ酸配列が天然の野生型ヒトインスリンのものであることを示す。

［実施例１］
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル６−（（６−（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）−６−オキソヘキシル）アミノ）−６−オキソヘキサノエート（リンカー１；Ｃ６＋ＮＣ６）の合成を説明する。

ステップ１ ベンジル６−（（６−（ベンジルオキシ）−６−オキソヘキシル）アミノ）−６−オキソヘキサノエート
アジピン酸モノベンジルエステル（６００ｍｇ、２．５４ｍｍｏｌ）および６−（ベンジルオキシ）−６−オキソヘキサン−１−アミニウム４−メチルベンゼンスルホネート（１．０ｇ、２．５４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１２．７１ｍＬ）中混合物に、ＨＯＢｔ（５８４ｍｇ、３．８１ｍｍｏｌ）、ヒューニッヒ塩基（８８８μＬ、５．０８ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（７３１ｍｇ、３．８１ｍｍｏｌ）を添加した。一晩攪拌した後、反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３とＥｔＯＡｃに分配した。有機相を分離し、１．０Ｍ ＨＣｌおよび食塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮すると、標記化合物が半固体として得られ、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。ＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ａ：Ｒｔ＝１．２６分、ｍ／ｚ＝４４０．３［Ｍ＋１］
ステップ２ ６−（（５−カルボキシペンチル）アミノ）−６−オキソヘキサン酸
ステップ１の生成物（１．０８ｇ、２．４５７ｍｍｏｌ）およびパールマン触媒（炭素上２０％ｗｔ、１７３ｍｇ、０．２４６ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（５０ｍＬ）中懸濁液を５０ｐｓｉ Ｈ_２下で一晩攪拌した。触媒を濾別し、濾液をＣ８相での逆相クロマトグラフィーに供した（Ｋｒｏｍａｓｉｌ、Ｃ８ １０μｍ １００Å、２５０×５０ｍｍ；溶媒Ａ＝水／０．０５％ＴＦＡ、溶媒Ｂ＝ＡｃＣＮ／０．０５％ＴＦＡ）、流量＝８５ｍＬ／分、勾配３０分でＡ中Ｂ５〜３０％、ＵＰＬＣ−ＭＳ 方法Ａ：Ｒｔ＝０．４０分、ｍ／ｚ＝２６０．１５［Ｍ＋１］
ステップ３ ２，５−ジオキソピロリジン−１−イル６−（（６−（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）−６−オキソヘキシル）アミノ）−６−オキソヘキサノエート
ステップ２の生成物（５０ｍｇ、０．１９３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（９６４μＬ）中溶液に、ＴＳＴＵ（１１６ｍｇ、０．３８６ｍｍｏｌ）を添加した。０℃に冷却した後、混合物にトリエチルアミン（５３．８μＬ、０．３８６ｍｍｏｌ）を添加した。４５分間攪拌した後、所望の化合物の形成が観察された：ＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ａ：Ｒｔ＝０．７１分、ｍ／ｚ＝４５３．４［Ｍ＋１］得られた２，５−ジオキソピロリジン−１−イル６−（（６−（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）−６−オキソヘキシル）アミノ）−６−オキソヘキサノエートを、精製することなくＤＭＦ中０．２Ｍ溶液として使用した。

［実施例２］
ビス（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）６，６’−（アジポイルビス（アザンジイル））ジヘキサノエート（リンカー２；Ｃ６Ｎ＋Ｃ６＋ＮＣ６）の合成を説明する。

ステップ１ ジベンジル６，６’−（アジポイルビス（アザンジイル））ジヘキサノエート
６−（ベンジルオキシ）−６−オキソヘキサン−１−アミニウム４−メチルベンゼンスルホネート（２．６９３ｇ、６．８４ｍｍｏｌ）およびアジピン酸（５００ｍｇ、３．４２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１７．１ｍＬ）中溶液に、ヒューニッヒ塩基（１．７９３ｍＬ、１０．２６ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１．５７２ｇ、１０．２６ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（１．９６８ｇ、１０．２６ｍｍｏｌ）を添加した。一晩攪拌した後、反応混合物を水（５００ｍＬ）に注ぎ入れ、３０分間攪拌した。標記化合物を、濾過を通して固体として回収し、空気吸込によって乾燥させた。ＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ａ：Ｒｔ＝１．２３分、ｍ／ｚ＝５５３．５［Ｍ＋１］
ステップ２ ビス（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）６，６’−（アジポイルビス（アザンジイル））ジヘキサノエート
ステップ２でベンジル６−（（６−（ベンジルオキシ）−６−オキソヘキシル）アミノ）−６−オキソヘキサノエートをジベンジル６，６’−（アジポイルビス（アザンジイル））ジヘキサノエートに代えて、実施例１について記載されるのと同様の手順を用いて標記化合物を調製した。ＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ａ：Ｒｔ＝０．７４分、ｍ／ｚ＝５６７．４［Ｍ＋１］
［実施例３］
（２Ｓ’，２’Ｓ）−２，２’−（オクタンジオイルビス（アザンジイル））ビス（５−（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）−５−オキソペンタン酸）（リンカー３；γ−Ｇｌｕ−スベリン−γ−Ｇｌｕ）の合成を説明する。

ステップ１ （Ｓ）−５−（ベンジルオキシ）−４−（８−（（（Ｓ）−１−（ベンジルオキシ）−４−カルボキシ−１−オキソブタン−２−イル）アミノ−８−オキソオクタンアミド）−５−オキソペンタン酸
Ｈ−ＧＬＵ−ＯＢＺＬ（１．００ｇ、４．２１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０．５ｍＬ）中溶液に、トリエチルアミン（５．８７５ｍＬ、４２．１ｍｍｏｌ）、引き続いてスベリン酸ジスクシンイミジル（７７６ｍｇ、２．１０７ｍｍｏｌ）を添加した。１時間攪拌した後、反応混合物を濃縮し、得られた残渣をＣ１８カラム（ＩＳＣＯ４４ｇ）、流量＝３７ｍＬ／分；勾配２０分で０．０５％ＴＦＡを含む水中ＡｃＣＮ：２％〜２０％、引き続いて保持で精製した。凍結乾燥後、中間体ビス−カルボン酸が得られた。ＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ｂ：Ｒｔ＝２．６６分、ｍ／ｚ＝６１３．３［Ｍ＋１］
ステップ２ （Ｓ）−５−（ベンジルオキシ）−４−（８−（（（Ｓ）−１−（ベンジルオキシ）−４−カルボキシ−１−オキソブタン−２−イル）アミノ−８−オキソオクタンアミド）−５−オキソペンタン酸のビス−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
ステップ１の生成物（４５５ｍｇ、０．７４３ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（７．４ｍＬ）中懸濁液に、固体としてのＴＳＴＵ（４９２ｍｇ、１．６３４ｍｍｏｌ）、引き続いてトリエチルアミン（２２８μＬ、１．６３４ｍｍｏｌ）を添加し、この時点で懸濁液が溶解した。反応混合物を１．５時間攪拌し、室温においてロータリーエバポレーターで濃縮した。生成物をＣ８相での逆相クロマトグラフィーによって精製した（カラムＫｒｏｍａｓｉｌ、Ｃ８ １０μｍ １００Ａ、サイズ２５０×５０ｍｍ；溶媒Ａ＝水／０．０５％ＴＦＡ、溶媒Ｂ＝ＡｃＣＮ／０．０５％ＴＦＡ）、流量＝８５ｍＬ／分、勾配３０分でＡ中Ｂ１０〜８０％。分画を凍結乾燥した後、ビスＮＨＳエステルが得られた。ＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ｂ：Ｒｔ＝２．７７分、ｍ／ｚ＝８０７［Ｍ＋１］
ステップ３．（２Ｓ，２’Ｓ）−２，２’−（オクタンジオイルビス（アザンジイル））ビス（５−（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）−５−オキソペンタン酸）
ステップ２の生成物（２５０ｍｇ、０．３１０ｍｍｏｌ）を、触媒としてパラジウム炭素（６６．０ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）および溶媒として０．１％ＴＦＡを含有するアセトン（６．２ｍＬ）を用いて１ａｔｍの水素で一晩水素化した。触媒を濾別し、濾液を濃縮すると標記化合物が得られた。高真空で一晩ポンピングした。ＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ｃ：Ｒｔ＝３．６１分、ｍ／ｚ＝６２７．３［Ｍ＋１］
［実施例４］
一般的方法Ａ：Ｎ^{６，Ｂ２９}インスリン複合体（アナログ）の合成
適切な大きさの容器で、インスリンまたはインスリンアナログを室温で穏やかに攪拌しながら、混合溶媒：２：３ｖ／ｖ０．１Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３：ＡｃＣＮに溶解した。混合物が透明になった後、アルカリ性溶液、例えば、０．１Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨを１０．５〜１０．８の値に調整した。別のバイアルで、活性化エステル中間体（連結部分）を室温で有機溶媒、例えば、ＤＭＳＯに溶解した。活性化エステル（リンカー）の溶液の分割量を、ＵＰＬＣクロマトグラムが未修飾インスリンのほとんどが反応したことおよび反応混合物の相当部分がＢ２９−結合インスリンに変換されたことを示すまで、インスリンを含有する溶液に一定期間にわたって添加した。アミン求核試薬、例えば、２−アミノエタノールを添加することによって反応物をクエンチした。反応溶液を室温で３０分間攪拌した。得られた溶液を０℃で冷Ｈ_２Ｏ（２０×）により慎重に希釈し、１Ｎ ＨＣｌ（および必要な場合には０．１Ｎ ＮａＯＨ）を用いてそのｐＨを２．５の最終ｐＨに調整した。溶液を最初に、接線流濾過（ＴＦＦ）システムを通してまたは１Ｋ、３Ｋもしくは１０Ｋ ＭＷＣＯ膜を用いるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｕｎｉｔｓを用いて、限界濾過によって濃縮した。濃縮溶液を通常は最初に、イオン交換クロマトグラフィー（ＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ Ａカラム、ＰｏｌｙＬＣ Ｉｎｃ．、２５０×２１ｍｍ、５μｍ、１０００Å；緩衝液Ａ：０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ_３ＰＯ_４／２５％ＡｃＣＮ；緩衝液Ｂ：０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ_３ＰＯ_４／２５％ＡｃＣＮ／０．５Ｍ ＮａＣｌ）に供した。所望の純度のＢ２９−複合体を含有する分画を合わせ、ＴＦＦシステムまたはＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５を用いて濃縮した。次いで、得られた溶液を逆相ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃ４ ２５０×５０ｍｍカラム、１０μｍ、１０００ÅカラムまたはＫｒｏｍａｓｉｌ Ｃ８ ２５０×５０ｍｍ、１０μｍ、１００Åカラム；緩衝液Ａ：水中０．０５〜０．１％ＴＦＡ；緩衝液Ｂ：ＡｃＣＮ中０．０５〜０．１％ＴＦＡ）によってさらに精製した。標記複合体を含有する分画を合わせ、凍結乾燥あるいはＴＦＦシステムおよび／またはＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５を用いて緩衝液交換すると標記生成物が得られた。

［実施例５］
Ｎ^{６，２９Ｂ}−５−アジド−ペンタノイルデスＢ３０インスリン（Ａ：Ｙ１９Ａ）（アナログ１）の合成を説明する。

２０ｍＬシンチレーションバイアルで、デスＢ３０ Ａ：Ｙ１９Ａインスリン（１１２ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）を、室温で穏やかに攪拌しながら、混合溶媒（２ｍＬ、２：３ｖ／ｖ ０．１Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３：ＡｃＣＮ）に溶解した。混合物が透明になった後、アルカリ性溶液、例えば、０．１Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨを１０．５〜１０．８の値に調整した。別の８ｍＬシンチレーションバイアルで、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル５−アジドペンタノエート（リンカー５；実施例６参照）（４．７９ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）を室温でＤＭＳＯ（５００μＬ）に溶解した。活性化エステルの溶液の分割量を、ＵＰＬＣクロマトグラムが未修飾インスリンのほとんどが反応したことおよび反応混合物の相当部分がＢ２９−結合インスリンに変換されたことを示すまで、インスリンを含有する溶液に一定期間にわたって添加した。アミン求核試薬、例えば、２−アミノエタノールを添加することによって反応物をクエンチした。反応溶液を室温で３０分間攪拌した。得られた溶液を０℃で冷Ｈ２Ｏ（２０×）により慎重に希釈し、１．０Ｎ ＨＣｌ（および必要な場合には０．１Ｎ ＮａＯＨ）を用いてそのｐＨを２．５の最終ｐＨに調整した。溶液を最初に、３Ｋまたは１０Ｋ ＭＷＣＯ膜を用いるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｕｎｉｔｓを用いて限界濾過によって濃縮した。濃縮溶液を逆相ＨＰＬＣ（ＫＲＯＭＡＳＩＬ Ｃ８ ２５０×５０ｍｍ、１０μｍ、１００Åカラム、２０分にわたって緩衝液Ａ中２５〜３５％緩衝液Ｂ；緩衝液Ａ：水中０．０５％ＴＦＡ；緩衝液Ｂ：ＡｃＣＮ中０．０５％ＴＦＡ）に供した。

アナログ１を含有する分画を合わせ、次いで、凍結乾燥した。ＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ｄ：Ｒｔ＝３．９１分、ｍ／ｚ＝１４３５．８６［（Ｍ＋４）／４］
［実施例６］
Ｎ^{６，２９Ｂ}−アシル化ＲＨＩアナログ２、アナログ３およびアナログ４を、「クリック」ケミストリーを用いて二量体を構築するのに使用するために調製し、一般的方法Ａ、あるいは実施例４について記載されるのと同様であるが、アナログ２、アナログ３またはアナログ４をそれぞれ生成するために組換えヒトインスリンと

（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルペンタ−４−イノエート；リンカー４）；

（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル−アジドペンタノエート；リンカー５）；または

（ペルフルオロフェニル１−（ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イル）−３−オキソ−２，７，１０，１３，１６−ペンタオキサ−４−アザノナデカン−１９−オエート）（リンカー６）
を交換する手順を用いて調製した。アナログを、アナログ５（これはＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ｆを用いて特徴付けた）を除いて、ＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ｄを用いて特徴付けた。

［実施例７］
Ｎ^２，１Ａ，Ｎ^２，１Ｂ−ビス（カルバモイル）ヒトインスリン（アナログ５）の合成を説明する。

ＲＨＩ（１ｇ、０．１７２ｍｍｏｌ）の水（５０ｍＬ）中懸濁液に、リン酸二カリウム（０．２４９ｇ、１．４２９ｍｍｏｌ）の水（５．０ｍＬ）中溶液を添加した。室温で３０分間攪拌した後、得られた混合物にシアン酸カリウム（０．２７９ｇ、３．４４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１６時間攪拌させた。反応を停止するために、ＭＷＣＯ ３Ｋ透析濾過装置を用いてＴＦＦによって未反応シアン酸カリウムを除去し、生成物を凍結乾燥により固体として単離した。生成物は約１０〜３５％のＡ１／Ｂ１／Ｂ２９−トリス−尿素−ＲＨＩを含有しており、これはＣ８相での逆相クロマトグラフィーによって除去してもよかった（カラムＫＲＯＭＡＳＩＬ、Ｃ８ １０μｍ １００Å、２５０×５０ｍｍ；溶媒Ａ＝水／０．０５％ＴＦＡ、溶媒Ｂ＝ＡｃＣＮ／０．０５％ＴＦＡ）、流量＝８５ｍＬ／分、勾配３０分にわたってＡ中Ｂ２６〜３４％）。ＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ｄ：Ｒｔ＝４．２９分、ｍ／ｚ＝１４７４．６（ｚ＝４）。Ｎ末端置換基は構造

（カルバモイル）（式中、波線はＮ末端アミノ酸の置換基とＮ２窒素との間の結合を示す）を有する。

［実施例８］
Ｎ^２，１Ａ，Ｎ^２，１Ｂ−ビス（カルバモイル）デスＢ３０ヒトインスリン（アナログ６）の合成を説明する。

ＲＨＩをデスＢ３０インスリンに代えて、実施例７について記載されるのと同様の手順を用いて標記化合物を調製した。ＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ｄ：Ｒｔ＝４．１０分、ｍ／ｚ＝１４４８．９（ｚ＝４）。Ｎ末端置換基は構造

（カルバモイル）（式中、波線はＮ末端アミノ酸の置換基とＮ２窒素との間の結合を示す）を有する。

［実施例９］
Ｎ^２，１Ａ，Ｎ^２，１Ｂ−ビス（カルバモイル）インスリンリスプロ（アナログ７）の合成を説明する。

ＲＨＩをインスリンリスプロに代えて、実施例７について記載されるのと同様の手順を用いて標記化合物を調製した。ＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ｄ：Ｒｔ＝４．０７分、ｍ／ｚ＝１４７３．６（ｚ＝４）。Ｎ末端置換基は構造

（カルバモイル）（式中、波線はＮ末端アミノ酸の置換基とＮ２窒素との間の結合を示す）を有する。

［実施例１０］
Ｎ^２，１Ａ−アセチルヒトインスリン（アナログ８）の合成を説明する。

ＲＨＩ（４００ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（４．６ｍＬ）中溶液に、２，５−ジオキソピロリジン−１−イルアセテート

（１０．８２ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ１００μＬ中溶液を滴加した。３時間攪拌した後、反応混合物を水（９５ｍＬ）で希釈し、約ｐＨ３まで酸性化し、次いで、３または１０Ｋ ＭＷＣＯ膜を用いるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｕｎｉｔｓを通して透析濾過してＤＭＳＯのほとんどを除去した。得られた溶液を最初に、２４分間にわたって勾配緩衝液Ａ中１０〜４０％の緩衝液Ｂを用いるイオン交換クロマトグラフィー（ＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ Ａカラム、ＰｏｌｙＬＣ Ｉｎｃ．、２５０×２１ｍｍ、５μｍ、１０００Å、流量１５ｍＬ／分；緩衝液Ａ：０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ_３ＰＯ_４／２５％ＡｃＣＮ；緩衝液Ｂ：０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ_３ＰＯ_４／２５％ＡｃＣＮ／０．５Ｍ ＮａＣｌ）に供した。所望のＮ^２，１Ａ−アセチル−ＲＨＩを含有する分画を合わせ、濃縮し、次いで、逆相クロマトグラフィー（ＫＲＯＭＡＳＩＬ、Ｃ８ １０μｍ １００Å、２５０×５０ｍｍ；溶媒Ａ＝水／０．０５％ＴＦＡ、溶媒Ｂ＝ＡｃＣＮ／０．０５％ＴＦＡ、勾配Ａ中２６〜３０％のＢ）に供した。ＤＴＴ分析を用いて修飾位置を確認した。ＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ｄ：Ｒｔ＝３．５分およびｍ／ｚ＝１４６３．５（ｚ＝４）。Ｎ末端置換基は構造

（アセチル）（式中、波線はＮ末端アミノ酸の置換基とＮ２窒素との間の結合を示す）を有する。

［実施例１１］
Ｎ^２，１Ａ，Ｎ^２，１Ｂ−ビス（カルバモイル）Ｎ^{６，２９Ｂ}−アシル化ＲＨＩの合成を説明する。

２，５−ジオキソピロリジン−１−イル−アジドペンタノエート（リンカー５）と結合してアナログ９を構築するまたは２，５−ジオキソピロリジン−１−イルペンタ−４−イノエート（リンカー４）と結合してアナログ１０を構築するアナログ５を、一般的方法Ａまたは実施例４について記載されるのと同様の手順を用いて調製した。

［実施例１２］
以下のＮ^{６，２９Ｂ}−アシル化ＲＨＩアナログ（アナログ１１、アナログ１２およびアナログ１３）を、「クリック」ケミストリーを用いて二量体を構成するのに使用するために調製した。アナログを一般的方法Ａまたは実施例４について記載されるのと同様であるが、アナログ１１、アナログ１２またはアナログ１３をそれぞれ生成するために組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）と

から選択される適切な連結部分を交換する手順を用いて調製した。アナログを、アナログ１２（これはＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ｆを用いて特徴付けた）を除いて、ＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ｄを用いて特徴付けた。

［実施例１３］
一般的方法Ｂ：有機塩基条件を用いたＮ^{６，２９Ｂ}，Ｎ^{６，２９Ｂ’}−インスリン二量体の合成
適切な大きさの容器で、インスリンまたはインスリンアナログを室温で塩基、例えば、ＴＥＡの存在下、有機溶媒または混合水性（ａｑ）／有機溶媒、例えば、ＤＭＳＯに懸濁する。インスリンが完全に溶解するまで、混合物を穏やかに攪拌させる。得られた溶液に、有機溶媒（ＤＭＳＯまたはＤＭＦなど）の溶液中活性化エステル中間体（リンカー）を添加する。ＵＰＬＣ後、クロマトグラムは、反応混合物の相当部分がＮ^{６，２９Ｂ}，Ｎ^{６，Ｂ２９Ｂ’}−インスリン二量体（またはＮ^{６，２８Ｂ}，Ｎ^{６，２８Ｂ’ｖ}−インスリンリスプロ二量体）に変換したことを示す。反応混合物を直接逆相ＨＰＬＣ精製（Ｗａｔｅｒｓ Ｃ４ ２５０×５０ｍｍカラム、１０μｍ、１０００ÅカラムまたはＫＲＯＭＡＳＩＬ Ｃ８ ２５０×５０ｍｍ、１０μｍ、１００Åカラム；緩衝液Ａ：脱イオン水中０．０５〜０．１％ＴＦＡ；緩衝液Ｂ：ＡｃＣＮ中０．０５〜０．１％ＴＦＡ）に供してもよいし、または反応物を０℃で冷酸性Ｈ_２Ｏ（２０×、ｐＨ約３．０）で慎重に希釈することによってクエンチしてもよく、１Ｎ ＨＣｌ（および必要な場合には０．１Ｎ ＮａＯＨ）を用いてそのｐＨを２．５の最終ｐＨに調整する。溶液を最初に、接線流濾過（ＴＦＦ）システムを通してまたは１Ｋ、３Ｋもしくは１０Ｋ ＭＷＣＯ膜を用いるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｕｎｉｔｓを用いて、限界濾過によって濃縮することができる。濃縮溶液を通常は最初に、イオン交換クロマトグラフィー（ＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ Ａカラム、ＰｏｌｙＬＣ Ｉｎｃ．、２５０×２１ｍｍ、５μｍ、１０００Å；緩衝液Ａ：０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ_３ＰＯ_４／２５％ＡｃＣＮ；緩衝液Ｂ：０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ_３ＰＯ_４／２５％ＡｃＣＮ／０．５Ｍ ＮａＣｌ）に供する。所望の純度のＢ２９−複合体を含有する分画を合わせ、ＴＦＦシステムまたはＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５を用いて濃縮する。次いで、濃縮溶液を逆相ＨＰＬＣ精製（Ｗａｔｅｒｓ Ｃ４ ２５０×５０ｍｍカラム、１０μｍ、１０００ÅカラムまたはＫＲＯＭＡＳＩＬ Ｃ８ ２５０×５０ｍｍ、１０μｍ、１００Åカラム；緩衝液Ａ：脱イオン水中０．０５〜０．１％ＴＦＡ；緩衝液Ｂ：ＡｃＣＮ中０．０５〜０．１％ＴＦＡ）に供する。所望のインスリン二量体を含有する分画を合わせ、凍結乾燥あるいはＴＦＦシステムおよび／またはＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５を用いて緩衝液交換するとＮ^{６，２９Ｂ}，Ｎ^{６，２９Ｂ’}−インスリン二量体が得られる。

［実施例１４］
一般的方法Ｃ：水性塩基条件を用いたＮ^{６，２９Ｂ}，Ｎ^{６，２９Ｂ’}−インスリン二量体の合成
適切な大きさの容器で、インスリンまたはインスリンアナログを室温で穏やかに攪拌しながら、混合溶媒：２：３ｖ／ｖ０．１Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３：ＡｃＣＮに溶解する。混合物が透明になった後、アルカリ性溶液、例えば、０．１Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨを１０．５〜１０．８の値に調整する。別のバイアルで、活性化エステル中間体（リンカー）を室温で有機溶媒、例えば、ＤＭＳＯに溶解する。活性化エステルの溶液の分割量を、ＵＰＬＣクロマトグラムが未修飾インスリンのほとんどが反応したことおよび反応混合物の相当部分がＮ^{６，Ｂ２９}，Ｎ^{６，Ｂ２９’}−インスリン二量体（またはＮ^{６，２８Ｂ}，Ｎ^{６，２８Ｂ}−インスリンリスプロ二量体）に変換されたことを示すまで、インスリンを含有する溶液に一定期間にわたって添加する。アミン求核試薬、例えば、２−アミノエタノールを添加することによって反応物をクエンチする。反応溶液を室温で３０分間攪拌する。得られた溶液を０℃で冷Ｈ_２Ｏ（２０×）により慎重に希釈し、１Ｎ ＨＣｌ（および必要な場合には０．１Ｎ ＮａＯＨ）を用いてそのｐＨを２．５の最終ｐＨに調整する。溶液を最初に、接線流濾過（ＴＦＦ）システムを通してまたは１Ｋ、３Ｋもしくは１０Ｋ ＭＷＣＯ膜を用いるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｕｎｉｔｓを用いて、限界濾過によって濃縮する。濃縮溶液を通常は最初に、イオン交換クロマトグラフィー（ＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ Ａカラム、ＰｏｌｙＬＣ Ｉｎｃ．、２５０×２１ｍｍ、５μｍ、１０００Å；緩衝液Ａ：０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ_３ＰＯ_４／２５％ＡｃＣＮ；緩衝液Ｂ：０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ_３ＰＯ_４／２５％ＡｃＣＮ／０．５Ｍ ＮａＣｌ）に供する。

所望の純度のＢ２９−複合体を含有する分画を合わせ、ＴＦＦシステムまたはＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５を用いて濃縮する。次いで、得られた溶液を逆相ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃ４ ２５０×５０ｍｍカラム、１０μｍ、１０００ÅカラムまたはＫＲＯＭＡＳＩＬ Ｃ８ ２５０×５０ｍｍ、１０μｍ、１００Åカラム；緩衝液Ａ：水中０．０５〜０．１％ＴＦＡ；緩衝液Ｂ：ＡｃＣＮ中０．０５〜０．１％ＴＦＡ）によってさらに精製する。標記インスリン二量体を含有する分画を合わせ、凍結乾燥あるいはＴＦＦシステムおよび／またはＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５を用いて緩衝液交換するとＮ^{６，２９Ｂ}，Ｎ^{６，２９Ｂ’}−インスリン二量体が得られる。

［実施例１５］
この実施例はＮ^{６，Ｂ２９}，Ｎ^{６，Ｂ２９’}−（２，２’−（エタン−１，２−ジイルビス（オキシ））ジアセチル）ビス［インスリンヒト］（二量体１）の合成を例示する。

ＲＨＩ（２．６ｇ、０．４４８ｍｍｏｌ）をＮａ_２ＣＯ_３（０．１Ｍ）（１５．８ｍＬ）とＡｃＣＮ（１０．５ｍＬ）の混合物に溶解し、ビス（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）２，２’−（エタン−１，２−ジイルビス（オキシ））ジアセテート（リンカー８）の０．２Ｍ ＤＭＦ溶液０．８９５ｍＬ（０．１７９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を３０分間攪拌し、追加分のビス（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）２，２’−（エタン−１，２−ジイルビス（オキシ））ジアセテートの０．２Ｍ ＤＭＦ溶液０．８９５ｍＬ（０．１７９ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物をさらに３０分間攪拌した。反応混合物を２０％ＡｃＣＮ／０．１％ＴＦＡ／水６０ｍＬに注ぎ入れ、ｐＨを２．５に調整し、得られた体積が約１０ｍＬになるまで、１０Ｋ ＭＷＣＯ膜を用いるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５を用いて透析濾過して濃縮した。得られた溶液をイオン交換クロマトグラフィー（ＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ Ａカラム、２５０×２１ｍｍ、５μｍ、１０００Å；勾配３０分にわたって緩衝液Ａ中１０〜８０％の緩衝液Ｂ；緩衝液Ａ：０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ_３ＰＯ_４／２５％ＡｃＣＮ；緩衝液Ｂ：０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ_３ＰＯ_４／２５％ＡｃＣＮ／０．５Ｍ ＮａＣｌ）に供した。

標記化合物を含有する分画を合わせ、濃縮した。次いで、得られた溶液を逆相クロマトグラフィー（ＫＲＯＭＡＳＩＬ Ｃ８ ２５０×５０ｍｍ、１０μｍ、１００Åカラム；勾配０．０５％ＴＦＡを含む水中２７〜３５％の０．０５％ＴＦＡを含むＡｃＣＮ）に供した。ＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ｅ：Ｒｔ＝２．７５分、ｍ／ｚ＝１９６０．４（ｚ＝６）、１６８０．４（ｚ＝７）。

［実施例１６］
この実施例はＮ^２，１Ａ，Ｎ^{２，１Ａ’}，Ｎ^２，１Ｂ，Ｎ^{２，１Ｂ’}−テトラキス（カルバモイル）−Ｎ^{６，Ｂ２９}，Ｎ^{６，Ｂ２９’}−（ヘキサンジオイル）ビス［インスリンヒト］（二量体２）の合成を例示する。

Ｎ^２，１Ａ，Ｎ^２，１Ｂ−ビス（カルバモイル）ＲＨＩ（１５０ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．１０６ｍＬ、０．７６４ｍｍｏｌ）を添加し、引き続いてＤＭＳＯ１００に溶解したジ（Ｎ−スクシンイミジル）アジペート（リンカー１２）（４．３３ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）を滴加した。

１時間攪拌し、反応混合物を水２０ｍＬに注ぎ入れた。ｐＨ＝２に酸性化し、１０Ｋ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １５を用いて透析濾過した。生成物を、勾配２４分で溶媒Ａ中１０〜４０％の溶媒Ｂを用いるイオン交換クロマトグラフィーによって精製し、Ｃ８相、勾配３０分でＡ中Ｂ２６〜３６％の逆相クロマトグラフィーによって再精製した。ＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ｅ：Ｒｔ＝３．７５分、ｍ／ｚ＝１９８３．９（ｚ＝６）。

［実施例１７］
表３は、ＲＨＩ、デスＢ３０ ＲＨＩ、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギンまたは適切なアナログを用いて注記されるように一般的方法Ｂまたは一般的方法Ｃのいずれかにしたがって、適切な中間体（リンカー）を用いて調製した二量体を示している。例えば、カルバモイル化Ｎ末端を有する二量体については、アナログ５またはアナログ６（デスＢ３０）を使用し；アセチル化Ａ１ Ｎ末端を有する二量体については、アナログ８を使用した。一定の保持時間（Ｒｔ）で親化合物の６荷電、すなわち、［（Ｍ＋６）／６］（または７荷電、すなわち、［（Ｍ＋７）／７］）種を示す、ＵＰＬＣ−ＭＳ方法ＤまたはＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ｅを用いて二量体を特徴付けた。連結部分によって連結されたインスリンおよびインスリンの分子は、表３に示される二量体の各々について同じである。

［実施例１８］
一般的方法Ｄ：Ｃｕ^２＋触媒クリックケミストリーを用いたＮ^{６，２９Ｂ}，Ｎ^{６，２９Ｂ’}−インスリン二量体の合成
適切な大きさの容器で、インスリン中間体（アナログ）を含有する適切なアセチレンを、室温で穏やかに攪拌しながら、ＤＭＳＯと水性トリエチルアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ７．０、最終濃度０．２ｍＭ）の混合溶媒に溶解した。別の適切な大きさの容器で、インスリン中間体（アナログ）を含有する適切なアジドを、室温で穏やかに攪拌しながら、ＤＭＳＯと水の混合溶媒に溶解した。両溶液を合わせ、徹底的に混合し、Ｎ_２を穏やかに通して泡立たせることによって脱気した。得られた溶液に、新たに調製したアスコルビン酸ナトリウムまたはアスコルビン酸溶液（最終濃度は０．５ｍＭである）および、徹底的に混合した後、１０ｍＭ ＣｕＳＯ_４およびトリス［（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル］アミン（すなわち、ＴＢＴＡリガンド）の５５％ＤＭＳＯ中溶液を添加した。Ｎ_２を穏やかに通して泡立たせることによって脱気し、徹底的に混合した後、混合物を一晩、時々混合しながら、室温で保管した。反応混合物を０℃において混合溶媒（ｖ／ｖ７：３ＡｃＣＮ／水＋０．０５％ＴＦＡ）で慎重に希釈し、０．１、１．０Ｎ ＨＣｌ（および必要な場合には０．１Ｎ ＮａＯＨ）を用いてｐＨを２．５０に調整した。溶液を最初に、接線流濾過（ＴＦＦ）システムを通してまたは１Ｋ、３Ｋもしくは１０Ｋ ＭＷＣＯ膜を用いるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｕｎｉｔｓを用いて、限界濾過によって濃縮した。濃縮溶液を通常は最初に、イオン交換クロマトグラフィー（ＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ Ａカラム、ＰｏｌｙＬＣ Ｉｎｃ．、２５０×２１ｍｍ、５μｍ、１０００Å；緩衝液Ａ：０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ_３ＰＯ_４／２５％ＡｃＣＮ；緩衝液Ｂ：０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ_３ＰＯ_４／２５％ＡｃＣＮ／０．５Ｍ ＮａＣｌ）に供した。所望の純度の所望の生成物を含有する分画を合わせ、ＴＦＦシステムまたはＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５を用いて濃縮した。次いで、得られた溶液を逆相ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃ４ ２５０×５０ｍｍカラム、１０μｍ、１０００ÅカラムまたはＫＲＯＭＡＳＩＬ Ｃ８ ２５０×５０ｍｍ、１０μｍ、１００Åカラム；緩衝液Ａ：水中０．０５〜０．１％ＴＦＡ；緩衝液Ｂ：ＡｃＣＮ中０．０５〜０．１％ＴＦＡ）によってさらに精製した。所望の純度の所望の生成物を含有する分画を合わせ、凍結乾燥あるいはＴＦＦシステムおよび／またはＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５を用いて緩衝液交換するとインスリン二量体が得られた。

表４は、一般的方法Ｄにしたがって適切な中間体を用いて調製した二量体４０、４１、４５、４６、４７、５９、５７、７９、８０、８２および８４を列挙している。一定の保持時間（Ｒｔ）で親化合物の６荷電、すなわち、［（Ｍ＋６）／６］（または７荷電、すなわち、［（Ｍ＋７）／７］）種を示す、ＵＰＬＣ−ＭＳ方法ＤまたはＵＰＬＣ−ＭＳ方法ＥまたはＵＰＬＣ−方法Ｇを用いてこれらの二量体を特徴付けた。

［実施例１９］
一般的方法Ｅ：Ｃｕ^２＋触媒ダブルクリックケミストリーを用いたＮ^{６，２９Ｂ}，Ｎ^{６，２９Ｂ’}−インスリン二量体の合成
適切な大きさの容器で、インスリン中間体（アナログ）を含有する適切なアジドを、室温で穏やかに攪拌しながら、ＤＭＳＯと水性トリエチルアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ７．０、最終濃度０．２ｍＭ）の混合溶媒に溶解した。別の適切な大きさの容器で、架橋または中間体リンカーを含有する適切なビス−アセチレンを、室温で穏やかに攪拌しながら、ＤＭＳＯと水の混合溶媒に溶解した。両溶液を合わせ、徹底的に混合し、Ｎ_２を穏やかに通して泡立たせることによって脱気した。得られた溶液に、新たに調製したアスコルビン酸ナトリウムまたはアスコルビン酸溶液（最終濃度は０．５ｍＭである）および、徹底的に混合した後、１０ｍＭ ＣｕＳＯ_４およびトリス［（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル］アミン（すなわち、ＴＢＴＡリガンド）の５５％ＤＭＳＯ中溶液を添加した。Ｎ_２を穏やかに通して泡立たせることによって脱気し、徹底的に混合した後、混合物を一晩、時々混合しながら、室温で保管した。反応混合物を０℃において混合溶媒（ｖ／ｖ７：３ＡｃＣＮ／水＋０．０５％ＴＦＡ）で慎重に希釈し、０．１、１．０Ｎ ＨＣｌ（および必要な場合には０．１Ｎ ＮａＯＨ）を用いてｐＨを２．５０に調整した。溶液を最初に、接線流濾過（ＴＦＦ）システムを通してまたは１Ｋ、３Ｋもしくは１０Ｋ ＭＷＣＯ膜を用いるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｕｎｉｔｓを用いて、限界濾過によって濃縮した。濃縮溶液を通常は最初に、イオン交換クロマトグラフィー（ＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ Ａカラム、ＰｏｌｙＬＣ Ｉｎｃ．、２５０×２１ｍｍ、５μｍ、１０００Å；緩衝液Ａ：０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ_３ＰＯ_４／２５％ＡｃＣＮ；緩衝液Ｂ：０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ_３ＰＯ_４／２５％ＡｃＣＮ／０．５Ｍ ＮａＣｌ）に供した。所望の純度の所望の生成物を含有する分画を合わせ、ＴＦＦシステムまたはＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５を用いて濃縮した。次いで、得られた溶液を逆相ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃ４ ２５０×５０ｍｍカラム、１０μｍ、１０００ÅカラムまたはＫＲＯＭＡＳＩＬ Ｃ８ ２５０×５０ｍｍ、１０μｍ、１００Åカラム；緩衝液Ａ：水中０．０５〜０．１％ＴＦＡ；緩衝液Ｂ：ＡｃＣＮ中０．０５〜０．１％ＴＦＡ）によってさらに精製した。所望の純度の所望の生成物を含有する分画を合わせ、凍結乾燥あるいはＴＦＦシステムおよび／またはＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５を用いて緩衝液交換するとインスリン二量体が得られた。

表５は、一般的方法Ｅにしたがって適切な中間体を用いて調製した二量体４２〜４４および５４を列挙している。ビスアセチレン架橋または中間体リンカーは、

であった。

一定の保持時間（Ｒｔ）で親化合物の６荷電、すなわち、［（Ｍ＋６）／６］（または７荷電、すなわち、［（Ｍ＋７）／７］）種を示す、ＵＰＬＣ−ＭＳ方法ＤまたはＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ｅを用いてこれらの二量体を特徴付けた。

［実施例２０］
この実施例はＮ^２，１Ａ，Ｎ^{２，１Ａ’}，Ｎ^２，１Ｂ，Ｎ^{２，１Ｂ’}−テトラキス（アセチルまたはＰＥＧ１またはメトキシアセチル）−二量体（二量体４８、５５、５６、６９および７０）の合成を例示している。

室温の二量体４０、１９または４（２１ｍｇ、１．７７７μｍｏｌ）のＤＭＳＯ（２ｍＬ）中溶液に、ＴＥＡ（３．９６μＬ、０．０２８ｍｍｏｌ）、次いで、２，５−ジオキソピロリジン−１−イルアセテート（２．２３ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（１００μＬ）中溶液または他の適切なＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化エステル（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルメトキシアセテートもしくは２，５−ジオキソピロリジン−１−イルＰＥＧ１アセテート）のＤＭＳＯ（１００μＬ）中溶液を添加した。３時間後、反応混合物を０．１％ＴＦＡを含む水／ＡｃＣＮ＝７／３の混合物１２ｍＬで希釈し、ｐＨを２．５まで調整した。得られた透明な溶液を１０Ｋ ＭＷＣＯ膜を用いるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ Ｆｉｌｔｅｒｓによって濃縮した。得られた溶液を最初にイオン交換クロマトグラフィー（ＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ Ａ、２５０×２１ｍｍ、５μｍ、１０００Å、１５ｍＬ／分、勾配３０分で５％〜４５％；緩衝液Ａ：０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ_３ＰＯ_４／水中２５％アセトニトリル；緩衝液Ｂ：０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ_３ＰＯ_４／２５％アセトニトリル／水中０．５Ｍ ＮａＣｌ）に供した。所望の純度の所望の生成物を含有する分画を合わせ、１０Ｋ ＭＷＣＯ膜を用いるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５を用いて濃縮した。次いで、得られた溶液を逆相ＨＰＬＣ（ＫＲＯＭＡＳＩＬ Ｃ８ ２５０×５０ｍｍ、１０μｍ、１００Åカラム；緩衝液Ａ：ＡｃＣＮ中０．０５％ＴＦＡ／Ｈ_２Ｏ；緩衝液Ｂ：０．０５％ＡｃＣＮ；流量８５ｍＬ／分）に供した。所望の分画を合わせ、凍結乾燥すると、表６に示される二量体４８、５５、５６、６９または７０が得られた。ＵＰＬＣ−ＭＳ方法ＦまたはＧを使用した。

Ｎ末端置換基は構造

（式中、波線はＮ末端アミノ酸の置換基とＮ２窒素との間の結合を示す）を有する。

［実施例２１］
表７は二量体４９、５０および５１を示しており、Ｎ^２，Ａ１、Ｎ^２，Ｂ１、Ｎ^{２，Ａ１’}およびＮ^{２，Ｂ１’}のアミノ基と連結したアシル基を示している。これらの二量体を、二量体４８を生成するために記載されるのと同様であるが、二量体４９、５０および５１を製造するために２，５−ジオキソピロリジン−１−イルアセテートを適切なＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化エステルに代えた手順を用いて二量体４０から調製した。活性化エステルは２，５−ジオキソピロリジン−１−イルＦｍｏｃ−グリシンアセテート、

２，５−ジオキソピロリジン−１−イルＰＥＧ２アセテート、

および２，５−ジオキソピロリジン−１−イルＡＥＧ−Ｃ６アセテート（式中、ＡＥＧはアミノエチルグルコースである）

であった。

一定の保持時間（Ｒｔ）で親化合物の６荷電、すなわち、［（Ｍ＋６）／６］（または７荷電、すなわち、［（Ｍ＋７）／７］）種を示す、ＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ｆ（二量体５０および５１）またはＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ｇ（二量体４９）のいずれかを用いてこれらの二量体を特徴付けた。二量体を表７に示す。

Ｎ末端置換基は構造

を有する。

［実施例２２］
この実施例は銅フリークリックケミストリーを用いた二量体５２の合成を例示する。

室温のアナログ３（１０ｍｇ、１．６８６μｍｏｌ）の３：２ｖ／ｖＨ_２Ｏ／ＡｃＣＮ１．０ｍＬ中溶液に、アナログ４（１０．５ｍｇ、１．６８６μｍｏｌ）の３：２ｖ／ｖＨ_２Ｏ／ＡｃＣＮ１．０ｍＬ中溶液を添加した。室温で２時間攪拌した後、反応混合物を最初にイオン交換クロマトグラフィー（ＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ Ａ、２５０×２１ｍｍ、５μｍ、１０００Å、１５ｍＬ／分、勾配３０分で５％〜４５％；緩衝液Ａ：０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ_３ＰＯ_４／水中２５％アセトニトリル；緩衝液Ｂ：０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ_３ＰＯ_４／２５％アセトニトリル／水中０．５Ｍ ＮａＣｌ）に供した。所望の純度の所望の生成物を含有する分画を合わせ、３Ｋまたは１０Ｋ ＭＷＣＯ膜を用いるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５を用いて濃縮した。次いで、得られた溶液を逆相ＨＰＬＣ（ＫＲＯＭＡＳＩＬ Ｃ８ ２５０×５０ｍｍ、１０μｍ、１００Åカラム；緩衝液Ａ：ＡｃＣＮ中０．０５％ＴＦＡ／Ｈ_２Ｏ；緩衝液Ｂ：０．０５％ＡｃＣＮ；流量８５ｍＬ／分）に供した。所望の分画を合わせ、凍結乾燥すると、二量体５２が得られた。ＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ｆ：Ｒｔ＝３．７３分、ｍ／ｚ＝１７３８．５９［（Ｍ＋７）／７＋１］結果を表８に示す。

［実施例２３］
この実施例はＮ^２，１Ａ，Ｎ^{２，１Ａ’}，Ｎ^２，１Ｂ，Ｎ^{２，１Ｂ’}−テトラキス（ジメチルまたはイソブチル）−二量体（二量体６０、５８、６５および６７）の合成を例示している。

二量体４０、１９または４（１００ｍｇ、８．４６μｍｏｌ）を水（１０ｍｌ）に溶解（懸濁）し、酢酸溶液によってｐＨ＝４．０に調整し、次いで、ホルムアルデヒド（０．０１３ｍｌ、０．１６９ｍｍｏｌ）またはイソブチルアルデヒド（０．０２５ｍｌ、０．２７２ｍｍｏｌ）を添加し、引き続いて新たに調製したシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１０．６３ｍｇ、０．１６９ｍｍｏｌ）の水（５００μＬ）中溶液を添加した。沈殿が形成した。混合物を穏やかに攪拌する。約１時間の反応の完了後、１Ｎ ＨＣｌを滴加して、混合物を慎重にｐＨ２．９に酸化する。懸濁液が透明な溶液になった。混合物を逆相分取ＨＰＬＣ（Ｃ−８カラム、５０×２５０ｃｍ、８５ｍｌ／分、勾配２５分で２９％から３６％）（０．１％ＴＦＡを含む水および０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ）によって精製した。所望の分画を凍結乾燥すると二量体（１９．９ｍｇ、１．５０６μｍｏｌ、１７．８０％収率）が得られた。ＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ｄ：Ｒｔ＝３．３１分、ｍ／ｚ＝１９８９．４４［（Ｍ＋６）／６＋１］
Ｎ末端置換基は構造

（イソブチル）（式中、波線はＮ末端アミノ酸の置換基とＮ２窒素との間の結合を示す）、または

（Ｎ−ジメチル；Ｍｅ２）（式中、波線はＮ末端アミノ酸のＮ２窒素とＣ２炭素の間の結合を示す）を有する。

二量体を表９に示す。

［実施例２４］
二量体６１、６２、６３、６４および６６の合成は以下の通りであった。

２，５−ジオキソピロリジン−１−イル６−（（２−（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）−２−オキソエチル）アミノ）−６−オキソヘキサノエート（Ｃ６−グリシンリンカー；リンカー２４）の合成を説明する。

ステップ１ ベンジル（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）アジペート
０℃の６−（ベンジルオキシ）−６−オキソヘキサン酸（５ｇ、２１．１６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍＬ）中溶液に、Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピルプロパン−２−アミン（４．４４ｍＬ、２５．４ｍｍｏｌ）、引き続いてＴＳＴＵ（７．０１ｇ、２３．２８ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を０℃で１時間および室温で１時間攪拌した。混合物を氷水／エチルエーテル混合物（１／１、１００ｍＬ）に注ぎ入れた。混合物をエチルエーテル（３×５０ｍＬ）で抽出し、水（２×１０ｍＬ）および食塩水（１０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、ｃｅｌｉｔｅパッドを通して濾過し、濃縮すると、標記化合物が無色シロップ（５．２ｇ、１５．６ｍｍｏｌ、７４％）として得られた。ＬＣ−ＭＳ ２分：Ｒｔ＝１．０５分、ｍ／ｚ＝３３４．１［Ｍ＋１］
ステップ２ ２−（（カルボキシメチル）アミノ）−６−オキソヘキサン酸
グリシン（２２５ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２．５ｍＬ）中溶液に、ＤＭＦ（２．５ｍＬ）中ステップ１の生成物（１．０ｇ、３．０ｍｍｏｌ）を滴加し、引き続いてＴＥＡ（４１８μＬ、３．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で１８時間攪拌した。ＤＭＦを減圧下で除去した。粗生成物をＣ１８逆相クロマトグラフィー（１６カラム体積（ＣＶ）の０〜４０％ＡｃＣＮ／水で溶出）によって精製した。所望の生成物を含有する分画を合わせ、濃縮し、凍結乾燥すると中間体（６−（ベンジルオキシ）−６−オキソヘキサノイル）グリシンが得られた。水（３ｍＬ）中の上記中間体に、Ｐｄ／Ｃ（１０％、１６０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を水素バルーン下室温で１８時間攪拌した。混合物をｃｅｌｉｔｅパッドを通して濾過し、ＭｅＯＨ／水（１／１、１０ｍｌ）で洗浄した。濾液を濃縮し、凍結乾燥すると標記化合物（４００ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ、６６％）が得られた。ＬＣ−ＭＳ ２分：Ｒｔ＝０．２８分、ｍ／ｚ＝２０４．０３［Ｍ＋１］
ステップ３．２，５−ジオキソピロリジン−１−イル６−（（２−（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）−２−オキソエチル）アミノ）−６−オキソヘキサノエート
０℃のＤＭＦ（０．５ｍＬ）中ステップ２の生成物（１０ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）に、ＴＥＡ（０．０１５ｍＬ、０．１０８ｍｍｏｌ）、引き続いてＴＳＴＵ（３１．１ｍｇ、０．１０３ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温に加温し、その温度で１時間攪拌した。ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ／水／ＡｃＣＮ：２：１：１：１（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ））は、所望の生成物（Ｒｆ：０．２５）の形成および出発材料が残っていないことを示した。粗物質を精製することなく二量体を構築するために使用した。

Ｃ６−アミノ酸リンカーを構成するアミノ酸がそれぞれアラニン、イソロイシン、ロイシンおよびバリンであるリンカー２５（Ｃ６−アラニン）、リンカー２６（Ｃ６−イソロイシン）、リンカー２７（Ｃ６−ロイシン）およびリンカー２８（Ｃ６−バリン）を上に示される方法と同様に合成した。調製方法Ｄを用いて上記リンカーを用いて二量体を構築した。結果を表１０に示す。

［実施例２５］
二量体７３、８９、９０、９１、９２および９３の合成は以下の通りであった。

ビス２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３，３’−（１，３−フェニレン）ジプロピオネート（ジプロピルフェニル；リンカー２９）の合成を説明する。

ステップ１．ビス２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３，３’−（１，３−フェニレン）ジプロピオネート
０℃の３，３’−（１，３−フェニレン）ジプロピオン酸（２１．８ｍｇ、０．０９８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．６ｍＬ）中溶液に、ＴＥＡ（２９ｍＬ、０．２０６ｍｍｏｌ）、引き続いてＴＳＴＵ（６２．０ｍｇ、０．２０６ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温に加温し、その温度で１時間攪拌した。ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ／水／ＡｃＣＮ：２／１／１／１）は、所望の生成物（Ｒｆ：０．２５）の形成および出発材料が残っていないことを示した。ＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ｂ：Ｒｔ＝３．４７分、ｍ／ｚ＝４１７．１９［Ｍ＋１］生成物をさらに精製することなく使用して、方法Ｄを用いてアナログ５を用いて二量体７３を構築した。

ビス（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）ベンゼン−１，３−ジカルボキシレート（テレフタレート；リンカー３４）の合成を説明する。

ステップ１．ビス（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）ベンゼン−１，３−ジカルボキシレート
０℃で、テレフタル酸（１００ｍｇ、０．６０２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２ｍｌ）中溶液に、２−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルイソウロニウムテトラフルオロボレート（３７１ｍｇ、１．２３４ｍｍｏｌ）、引き続いてＮ−エチル−Ｎ−イソプロピルプロパン−２−アミン（０．２２２ｍｌ、１．２３４ｍｍｏｌ）を添加した。３０分後、氷浴を除去した。溶液を室温で１時間攪拌した。ＴＨＦをさらに２５ｍＬ添加し、反応物を室温で一晩放置した。生成物を約５ｍＬまで濃縮し、一部をそのままさらに精製することなく使用して、方法Ｄを用いてＲＨＩを用いて二量体８９を構築した。残っている物質を酢酸エチル（２００ｍＬ）で希釈し、食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。

ビス（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）イソフタレート（イソフタレート；リンカー３５）の合成を説明する。

ステップ１．ビス（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）イソフタレート
ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中イソフタル酸（５４ｍｇ、０．３２５ｍｍｏｌ）に、ＴＳＴＵ（２１５ｍｇ、０．７１５ｍｍｏｌ）、引き続いてＴＥＡ（０．１３７ｍＬ、０．９７５ｍｍｏｌ）を添加した。ＬＣ−ＭＳ ２分：Ｒｔ＝０．７９分、ｍ／ｚ＝７２１．２８［２Ｍ＋１］生成物を精製することなく使用して、方法Ｅでアナログ５を用いて二量体９０およびＲＨＩを用いて二量体９１を構築した。

ビス（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ヘプタンジオエート（ヘプタンジオエート；リンカー３６）の合成を説明する。

ステップ１．ビス（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ヘプタンジオエート
ＤＭＳＯ（０．５ｍＬ）中４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ヘプタン二酸（１６．５ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）に、ＴＳＴＵ（３９．７ｍｇ、０．１３２ｍｍｏｌ）、引き続いてＴＥＡ（０．０２５ｍＬ、０．１８０ｍｍｏｌ）を添加した。ＬＣ−ＭＳ ２分：Ｒｔ＝０．９０分、ｍ／ｚ＝４７０．３４［Ｍ＋１］。生成物を精製することなく使用して、方法Ｅでアナログ５を用いて二量体９２およびＲＨＩを用いて二量体９３を構築した。

結果を表１１に示す。

［実施例２６］
二量体７１、７２、７７、７８、８１および８７の合成は以下の通りであった。ビス（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）（１Ｓ，４Ｓ）−シクロヘキサン−１，４−ジカルボキシレート（リンカー３０；トランス−シクロヘキサン１，４−二酸）の合成を説明する。

０℃の（１Ｓ，４Ｓ）−シクロヘキサン−１，４−ジカルボン酸（２００ｍｇ、１．１６２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１１ｍＬ）中溶液に、ＴＳＴＵ（７３４ｍｇ、２．４３９ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．５ｍＬ、２．８６ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応混合物を室温で１時間攪拌した。生成物を白色固体として反応溶液中に押しつぶし、濾過し、ＤＣＭ（２×５ｍｌ）で洗浄し、真空中で乾燥させると、標記化合物が得られた。ＵＰＬＣ−ＭＳ Ｃ_１６Ｈ_１８Ｎ_２Ｏ_８について計算値３６６．１１、実測値ｍ＼ｅ：３６７．１６（Ｍ＋Ｈ）^＋、（Ｒｔ：３．２０／５．００分）。ＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ａ。^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ２．８１−２．８９（ｍ；２Ｈ）；２．８０（ｓ；８Ｈ）；２．０２−２．１０（ｍ； ４Ｈ）；１．５７−１．６３（ｍ；４Ｈ）．
ビス（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）（１Ｒ，４Ｒ）−シクロヘキサン−１，４−ジカルボキシレート（リンカー３１；シス−シクロヘキサン１，４−二酸）の合成を説明する。

０℃の（１Ｒ，４Ｒ）−シクロヘキサン−１，４−ジカルボン酸（２００ｍｇ、１．１６２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１１ｍＬ）中溶液に、ＴＳＴＵ（７３４ｍｇ、２．４３９ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．５ｍＬ、２．８６ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応混合物を室温で１時間攪拌した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製すると標記化合物が得られた。ＵＰＬＣ−ＭＳ Ｃ_１６Ｈ_１８Ｎ_２Ｏ_８について計算値３６６．１１、実測値ｍ／ｚ：３６７．１７（Ｍ＋Ｈ）^＋、（Ｒｔ：３．１７／５．００分）。ＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ａ。^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ３．０２−３．０８（ｍ；２Ｈ）；２．８０（ｓ；８Ｈ）；１．８０−１．９０（ｍ；８Ｈ）．
１−（ｔｅｒｔ−ブチル）３，５−ビス（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）（３Ｒ，５Ｓ）−ピペリジン−１，３，５−トリカルボキシレート（リンカー３２）の合成を説明する。

０℃の（３Ｒ，５Ｓ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピペリジン−３，５−ジカルボン酸（２００ｍｇ、０．７３４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（７ｍＬ）中溶液に、ＴＳＴＵ（４８５ｍｇ、１．６１１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．３ｍＬ、１．７１８ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応混合物を室温で２時間攪拌した。残渣をシリカクロマトグラフィー（０〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製すると標記化合物が得られた。ＵＰＬＣ−ＭＳ Ｃ_２０Ｈ_２５Ｎ_３Ｏ_１０について計算値４６７．１５、実測値ｍ＼ｅ：４６８．３０（Ｍ＋Ｈ）^＋、（Ｒｔ：０．９８／２．００分）。ＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ａ。

一般的方法Ｆ：有機塩基条件を用いたＮ^{６，２９Ｂ}，Ｎ^{６，２９Ｂ’}−インスリン二量体の合成
適切な大きさの容器で、インスリンまたはインスリンアナログを室温で塩基、例えば、ＴＥＡまたは１，１，３，３−テトラメチルグアニジン（ＴＭＧ）の存在下、有機溶媒または混合水性／有機溶媒、例えば、ＤＭＳＯに懸濁する。インスリンが完全に溶解するまで、混合物を穏やかに攪拌させる。得られた溶液に、有機溶媒（ＤＭＳＯまたはＤＭＦなど）の溶液中活性化エステル中間体を添加する。ＵＰＬＣ後、クロマトグラムは、反応混合物の相当部分がＮ^{６，２９Ｂ}，Ｎ^{６，２９Ｂ’}−インスリン二量体（またはＮ^{６，２８Ｂ}，Ｎ^{６，２８Ｂ’}−インスリンリスプロ二量体）に変換したことを示す。反応溶液を、自動ピペットを介して、ＩＰＡｃ／ＭＴＢＥ（ｖ／ｖ４：１）（４５ｍＬ）を含有する５０ｍＬ遠心管に移した。滴加を行った。得られた白色懸濁液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分、４Ｃ）すると、透明な上清および白色ペレットが生成した。上清を引き抜き、白色ペレットを真空中で乾燥させた。次いで、粗中間体を含有する白色ペレットを０℃でＴＦＡ２ｍＬに溶解し、同温度で１０分間攪拌した。脱ｂｏｃ反応の完了後、反応溶液を、自動ピペットを介して、ＭＴＢＥ（４５ｍＬ）を含有する５０ｍＬ遠心管に移した。滴加を行った。得られた白色懸濁液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分、４℃）すると、透明な上清および白色ペレットが生成した。上清を引き抜き、白色ペレットを真空中で乾燥させ、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ（ｖ／ｖ１：４）溶液に再溶解した。反応混合物を直接逆相ＨＰＬＣ精製（Ｗａｔｅｒｓ Ｃ４ ２５０×５０ｍｍカラム、１０μｍ、１０００ÅカラムまたはＫＲＯＭＡＳＩＬ Ｃ８ ２５０×５０ｍｍ、１０μｍ、１００Åカラム；緩衝液Ａ：脱イオン水中０．０５〜０．１％ＴＦＡ；緩衝液Ｂ：ＡｃＣＮ中０．０５〜０．１％ＴＦＡ）に供してもよいし、または反応物を０℃で冷酸性Ｈ_２Ｏ（２０×、ｐＨ約３．０）で慎重に希釈することによってクエンチしてもよく、１Ｎ ＨＣｌ（および必要な場合には０．１Ｎ ＮａＯＨ）を用いてそのｐＨを２．５の最終ｐＨに調整する。溶液を最初に、接線流濾過（ＴＦＦ）システムを通してまたは１Ｋ、３Ｋもしくは１０Ｋ ＭＷＣＯ膜を用いるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｕｎｉｔｓを用いて、限界濾過によって濃縮することができる。濃縮溶液を通常は最初に、イオン交換クロマトグラフィー（ＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ Ａカラム、ＰｏｌｙＬＣ Ｉｎｃ．、２５０×２１ｍｍ、５μｍ、１０００Å；緩衝液Ａ：０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ_３ＰＯ_４／２５％ＡｃＣＮ；緩衝液Ｂ：０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ_３ＰＯ_４／２５％ＡｃＣＮ／０．５Ｍ ＮａＣｌ）に供する。所望の純度のＢ２９−複合体を含有する分画を合わせ、ＴＦＦシステムまたはＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５を用いて濃縮する。次いで、濃縮溶液を逆相ＨＰＬＣ精製（Ｗａｔｅｒｓ Ｃ４ ２５０×５０ｍｍカラム、１０μｍ、１０００ÅカラムまたはＫＲＯＭＡＳＩＬ Ｃ８ ２５０×５０ｍｍ、１０μｍ、１００Åカラム；緩衝液Ａ：脱イオン水中０．０５〜０．１％ＴＦＡ；緩衝液Ｂ：ＡｃＣＮ中０．０５〜０．１％ＴＦＡ）に供する。所望のインスリン二量体を含有する分画を合わせ、凍結乾燥あるいはＴＦＦシステムおよび／またはＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５を用いて緩衝液交換するとＮ^{６，２９Ｂ}，Ｎ^{６，２９Ｂ’}−インスリン二量体が得られる。

表１２は、一般的方法Ｂ（二量体７７および７８）、一般的方法Ｃ（二量体７１および７２）、または一般的方法Ｆ（二量体８１および８７）のいずれかにしたがって適切なリンカーを用いて調製した二量体７１、７２、７７、７８、８１および８７を列挙している。一定の保持時間（Ｒｔ）で親化合物の６荷電、すなわち、［（Ｍ＋６）／６］（または７荷電、すなわち、［（Ｍ＋７）／７］）種を示す、ＵＰＬＣ−ＭＳ方法ＤまたはＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ｅを用いてこれらの二量体を特徴付けた。

［実施例２６］
二量体６８および二量体７４の合成は以下の通りであった。

ビス（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）６，６’−（（６−クロロ−１，３，５−トリアジン−２，４−ジイル）ビス（アザンジイル））ジヘキサノエート（リンカー３３；Ｃ６Ｎ−クロロ−１，３，５−トリアジン−ＮＣ６）の合成を説明する。

２，４，６−トリクロロ−１，３，５−トリアジン（８０ｍｇ、０．４３４ｍｍｏｌ）およびメチル６−アミノヘキサノエート（１２９ｍｇ、０．８８９ｍｍｏｌ）ＨＣｌ塩のＣＨ_２Ｃｌ_２（１ｍＬ）中溶液を−３０℃に冷却した。ＤＩＰＥＡ（０．３７９ｍＬ、２．１６９ｍｍｏｌ）のＣＨ_２Ｃｌ_２（１ｍＬ）中溶液を滴加した。混合物を−３０℃〜室温で５時間攪拌した。次いで、ＣＨ_２Ｃｌ_２（２０ｍＬ）を添加し、ＨＣｌ水溶液（１Ｍ）（２×１０ｍＬ）、ＮａＨＣＯ_３（１０ｍｌ）および食塩水（１０ｍｌ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空によって濃縮すると、ジメチル６，６’−（（６−クロロ−１，３，５−トリアジン−２，４−ジイル）ビス（アザンジイル））ジヘキサノエート（１３５ｍｇ、０．３３６ｍｍｏｌ）が得られた。

ジメチル６，６’−（（６−クロロ−１，３，５−トリアジン−２，４−ジイル）ビス（アザンジイル））ジヘキサノエート（１３５ｍｇ、０．３３６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（０．５ｍｌ）およびメタノール（０．５ｍＬ）中溶液に、（２Ｍ）ＬｉＯＨ水溶液（５０４μｌ、１．００８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１時間攪拌し、次いで、真空中で濃縮すると所望の残渣が得られた。残渣を水に溶解し、ＨＣｌ水溶液で中和した。沈殿を濾過によって回収し、これを水で洗浄した。固体を真空中で乾燥させると、６，６’−（（６−クロロ−１，３，５−トリアジン−２，４−ジイル）ビス（アザンジイル））ジヘキサン酸が得られた。

６，６’−（（６−クロロ−１，３，５−トリアジン−２，４−ジイル）ビス（アザンジイル））ジヘキサン酸（１０８ｍｇ、０．２８９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２８８９μｌ）中溶液に、ＴＳＴＵ（１７４ｍｇ、０．５７８ｍｍｏｌ）、引き続いてトリエチルアミン（８１μｌ、０．５７８ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を１時間攪拌した。ＵＰＬＣは、所望の物質の形成を示す。ＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ｃ：Ｒｔ＝０．９９分、ｍ／ｚ＝５６８．２［Ｍ＋１］。この試薬（０．１Ｍ／ＤＭＦ）をさらに精製することなく使用した。

一般的方法Ｂ（二量体７４）または一般的方法Ｃ（二量体６８）のいずれかを用いて二量体を調製した。一定の保持時間（Ｒｔ）で親化合物の６荷電、すなわち、［（Ｍ＋６）／６］（または７荷電、すなわち、［（Ｍ＋７）／７］）種を示す、ＵＰＬＣ−ＭＳ方法ＤまたはＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ｅを用いてこれらの二量体を特徴付けた。リンカー３３およびＲＨＬを用いて二量体６８を構築し、リンカー３３およびアナログ５を用いて二量体７４を構築した。結果を表１３に示す。

［実施例２７］
二量体５４の合成は以下の通りであった。

Ａ１−ＴＦＡ−ＲＨＩ（Ｄ．Ｌｉｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉ．、２０１２、１８、３３６〜３４１）（１００ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）を、水（５ｍＬ）およびリン酸二カリウム（２４．４９ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ）を含有する予備混合物に溶解した（得られた溶液のｐＨは約４である）。シアン酸カリウム（２７．５ｍｇ、０．３３９ｍｍｏｌ）を添加し、一晩攪拌した。生成物をＣ８相での逆相クロマトグラフィーによって精製した（カラムＫＲＯＭＡＳＩＬ、Ｃ８ １０μＭ １００Ａ、サイズ２５０×５０ｍｍ；溶媒Ａ＝水／０．０５％ＴＦＡ、溶媒Ｂ＝ＡｃＣＮ／０．０５％ＴＦＡ）、流量＝８５ｍＬ／分、勾配３０分でＡ中Ｂ２６〜３４％。ＵＰＬＣ−ＭＳ方法Ｆ：Ｒｔ＝４．４８分、ｍ／ｚ＝１４８６．９［（Ｍ＋４）／４＋１］
上記生成物（６０ｍｇ、１０．０９μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５９４μｌ）に溶解し、トリエチルアミン（２８．１μｌ、０．２０２ｍｍｏｌ）、引き続いてＤＭＳＯ１００μｌに溶解したリンカースベリン酸ジスクシンイミジル（１．８５８ｍｇ、５．０４μｍｏｌ）の溶液を添加した。３時間攪拌した。ＵＰＬＣは反応が完了したことを示す。全反応混合物を水酸化アンモニウム（２１０５μｌ、１５．１３ｍｍｏｌ）に添加した（滴加、発熱が予想される）。２時間穏やかに攪拌し、ＴＦＡ基の脱保護を確認した。混合物を水２０ｍＬによって希釈し、１０Ｋ Ａｍｉｃｏｎ管を用いた透析濾過によって水酸化アンモニウムのほとんどを除去した。ｐＨを約３に調整し、透析濾過によって塩を除去した。生成物をイオン交換クロマトグラフィー（ＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ Ａカラム、ＰｏｌｙＬＣ Ｉｎｃ．、２５０×２１ｍｍ、５μｍ、１０００Å；緩衝液Ａ：０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ_３ＰＯ_４／２５％ＡｃＣＮ；緩衝液Ｂ：０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ_３ＰＯ_４／２５％ＡｃＣＮ／０．５Ｍ ＮａＣｌ）によって精製した。生成物をＣ８相での逆相クロマトグラフィーによって再精製した（カラムＫＲＯＭＡＳＩＬ、Ｃ８ １０μＭ １００Ａ、サイズ２５０×５０ｍｍ；溶媒Ａ＝水／０．０５％ＴＦＡ、溶媒Ｂ＝ＡｃＣＮ／０．０５％ＴＦＡ）。結果を以下に示す。結果を表１４に示す。

［実施例２８］
インスリン受容体結合アッセイを以下の通り行った。

ＩＲ結合アッセイを、１０％ＦＢＳおよび抗生物質（Ｇ４１８、ペニシリン／ストレプトアビジン）を含有するＦ１２培地で増殖したヒトＩＲ（Ｂ）を過剰発現しているＣＨＯ細胞から調製した細胞膜を用いて、３８４ウェルフォーマットのシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）で実行した。細胞膜を、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含有する５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．８中で調製した。アッセイ緩衝液は５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１％ＢＳＡおよびプロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ−Ｍｉｎｉ−Ｒｏｃｈｅ）を含有していた。細胞膜をＷＧＡ ＰＶＴ ＰＥＩ ＳＰＡビーズに添加し（５ｍｇ／ｍＬ最終濃度）、引き続いてインスリン二量体分子を適切な濃度で添加した。室温で５〜１５分のインキュベーション後、^１２５［Ｉ］−インスリンを５０μＬの最終総体積について０．０１５ｎＭ最終濃度で添加した。混合物を室温で１〜１２時間振盪しながらインキュベートし、引き続いてシンチレーション測定して^１２５［Ｉ］−インスリンとＩＲの結合およびこの相互作用に対するインスリン二量体分子の滴定効果を決定した。

［実施例２９］
インスリン受容体（ＩＲ）ＡＫＴ−リン酸化アッセイを以下の通り行った。ＩＲ ＡＫＴ−リン酸化アッセイ：Ａｋｔタンパク質のリン酸化、インスリン受容体シグナル伝達カスケードの重要なステップを測定することによって、インスリン受容体活性化を評価することができる。ヒトＩＲを過剰発現しているＣＨＯ細胞系を、ＨＴＲＦサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイキット（Ｃｉｓｂｉｏ「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）およびＰｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）細胞アッセイキット」）に利用した。細胞を、１０％ＦＢＳ、４００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８および１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを補足したＦ１２培地で増殖した。アッセイの前に、細胞を無血清培地で２〜４時間インキュベートした。

あるいは、細胞を凍結乾燥し、２０％ＤＭＳＯを含有する培地に前もって分割し、解凍、遠心沈殿および再懸濁してアッセイに使用することもできた。細胞を、３８４ウェルプレート中無血清Ｆ１２培地２０μＬに１００００個細胞／ウェルで蒔いた。Ｈｕｍｕｌｉｎおよびインスリングラルギン対照を試験化合物の各プレートで実行した。滴定化合物を細胞に添加し（２μＬ／ウェル、最終濃度＝１：５倍希釈で１０００ｎＭから０．５１２ｐＭまで滴定）、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を、ＣｉｓＢｉｏキットに用意した調製済溶解緩衝液８μＬで溶解し、２５℃で１時間インキュベートした。希釈した抗体試薬（抗ＡＫＴ−ｄ２および抗ｐＡＫＴ−Ｅｕ３／クリプテート）をキット説明書にしたがって調製し、次いで、１０μＬを細胞溶解物の各ウェルに添加し、引き続いて２５℃で３．５〜５時間インキュベートした。プレートをＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（励起＝３２０ｎｍ；発光＝６６５ｎｍ）で読み取って、各化合物についての効力と最大応答の両方に関するＩＲ ｐＡｋｔアゴニスト活性を決定した。あるいは、化合物を１．６ｎＭのＨｕｍｕｌｉｎの存在下で同様に試験して、どのように各化合物がインスリンの全アゴニスト活性と競合することができるかを決定した。

［実施例３０］
表１５は、インスリン受容体（ＩＲ）に対するインスリン二量体のインビトロ生物学的活性を示している。実施例２８に記載されるリガンド競合アッセイまたは実施例２９に記載される機能的Ａｋｔ−リン酸化アッセイのいずれかによって活性を測定した。

［実施例３１］
この実施例では、本発明のいくつかのインスリン受容体部分アゴニストのインビボ効果を、化合物Ａ（公開ＰＣＴ出願番号国際公開第２０１４０５２４５１号に開示されているインスリン二量体ＭＩＵ−９０）およびＤｅｐｐｅら、Ｎａｕｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇ’ｓ Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３５０：２１３〜２１７（１９９４）に開示されている化合物Ｂ（Ｂ２９，Ｂ２９’−スベロイル−（インスリン）_２）と比較したが、腹腔内インスリン負荷試験（ＩＰ−ＩＴＴ）アッセイでウシインスリンの代わりにＲＨＩを用いて、成体雄、痩せたＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウスで行った。

１群当たりＮ＝６〜８匹の動物の群を体重（平均約３０ｇ）によってランダム化した。試験の２日前に、マウスを、５ｍｌ／ｋｇの投与体積の０．９％塩化ナトリウム溶液の腹腔内注射による投与に慣らした。試験の日の朝、試験の２または４時間前に餌を除去した。血中グルコース濃度を、血糖値測定器を用いてＴ＝０分（ベースライン）で測定した。次いで、マウスに、腹腔内注射を介して５ｍＬ／ｋｇでビヒクル、二量体２４、二量体５５、二量体５８、二量体６０、二量体６７、化合物Ａ、化合物ＢまたはＨｕｍｕｌｉｎ（ＲＨＩ）を投与した（使用した用量については表１６参照）。投与３０〜３６０分後の間に採取した尾出血から血中グルコースレベルを決定した。

結果を図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ、図２Ｆおよび図２Ｇに示す。結果は、二量体２４、二量体５５、二量体５８、二量体６０および二量体６７についてのグルコースプロファイルが試験した両用量で実質的に同じであった一方で、化合物Ａおよび化合物Ｂの投与量の増加がグルコース低下効力の増加を引き起こしたことを示しており、ＲＨＩまたは化合物Ａおよび化合物Ｂと比べて二量体についての高血糖リスクの可能性が低いことを示している。

［実施例３２］
以下の通り、糖尿病ユカタン系ミニブタ（Ｄミニブタ）で、二量体２４、１８および４０のグルコース低下効果をＲＨＩと比較した。

ユカタン系ミニブタを、Ｓｉｎｃｌａｉｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（Ａｕｘｖａｓｓｅ、ＭＯ）によって開発された専売プロトコルにしたがってアロキサン注射によって１型糖尿病にした。基礎グルコースレベルが１５０ｍｇ／ｄＬを超えたら、誘発が成功したとみなす。血漿グルコースレベルが約３００ｍｇ／ｄｌのＤミニブタをこれらの実験に利用した。

２つの頚静脈血管アクセスポート（ＶＡＰ）を装着した雄ユカタン系ミニブタをこれらの試験に使用した。一晩の絶食後の試験日に、ミニブタをスリングに入れ、ＶＡＰを注入およびサンプリングのために利用可能にした。ｔ＝０分ならびに血漿グルコース測定のために２つのベースライン血液試料を回収した（ｔ＝−３０分およびｔ＝０分）後、ミニブタにＨｕｍｕｌｉｎ（組換えヒトインスリン、ＲＨＩ）またはＩＲＰＡを０．６９ｎｍｏｌ／ｋｇで単回ボーラスＩＶとして投与した。ＨｕｍｕｌｉｎおよびＩＲＰＡを、グリセリン、１６ｍｇ／ｍＬ；メタクレゾール、１．６ｍｇ／ｍＬ；フェノール、０．６５ｍｇ／ｍＬ；無水リン酸二ナトリウム、３．８ｍｇ／ｍＬを含有する緩衝液；ＨＣｌで７．４にｐＨを調整に６９ｎｍｏｌ／ｍｌで製剤化した。投与後、サンプリングを４８０分間続けた；試料回収の時点は、−３０分、０分、８分、１５分、３０分、４５分、６０分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分、２１０分、２４０分、２７０分、３００分、３３０分、３６０分、４２０分、４８０分とした。血液を、１０μｇ／ｍＬアプロチニンを補足したＫ３−ＥＤＴＡ管に回収し、回収の３０分以内に行われる処理まで、氷上に保った。３０００ｒｐｍ、４℃で８分間の遠心分離後、血漿を回収し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＡＵ４８０ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ分析装置を用いたグルコース測定および化合物レベル測定のために分割した。

図１は、０．６９ｎｍｏｌ／ｋｇ濃度で、ＲＨＩが血清グルコースレベルを５０ｍｇ／ｄＬ未満に低下させた一方で、インスリン二量体は低下させなかったことを示している。この結果は、インスリン二量体が、ＲＨＩよりも低血糖を促進するリスクが低いことを示している。

［実施例３３］
以下の通り、糖尿病ユカタン系ミニブタ（Ｄミニブタ）で、二量体４、５、７、８、９、１８〜２９、３２、３７〜４１、４３、４４、４８、５５、５７、５８、６０、６１、６２、６４、６７、６９、７１、７２、７７および７８のグルコース低下効果をＲＨＩと比較した。

ユカタン系ミニブタを、Ｓｉｎｃｌａｉｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（Ａｕｘｖａｓｓｅ、ＭＯ）によって開発された専売プロトコルにしたがってアロキサン注射によって１型糖尿病にした。基礎グルコースレベルが１５０ｍｇ／ｄｌを超えたら、誘発が成功したとみなす。血漿グルコースレベルが約３００〜４００ｍｇ／ｄｌであり、２つの頚静脈血管アクセスポート（ＶＡＰ）を装着したＤミニブタをこれらの試験に使用した。

一晩の絶食後の試験日に、ミニブタをスリングに入れ、ＶＡＰを注入およびサンプリングのために利用可能にした。ｔ＝０分ならびに血漿グルコース測定のために２つのベースライン血液試料を回収した（ｔ＝−３０分およびｔ＝０分）後、ミニブタにＨｕｍｕｌｉｎ（組換えヒトインスリン、ＲＨＩ）または他の二量体を０．６９ｎｍｏｌ／ｋｇ（化合物番号７８については０．３５ｎｍｏｌ／ｋｇ）で単回ボーラスＩＶとして投与した。Ｈｕｍｕｌｉｎおよび二量体を、グリセリン、１６ｍｇ／ｍＬ；メタクレゾール、１．６ｍｇ／ｍＬ；フェノール、０．６５ｍｇ／ｍＬ；無水リン酸二ナトリウム、３．８ｍｇ／ｍＬを含有する緩衝液；ＨＣｌで７．４にｐＨを調整に６９ｎｍｏｌ／ｍｌで製剤化した。投与後、サンプリングを４８０分間続けた；試料回収の時点は、−３０分、０分、８分、１５分、３０分、４５分、６０分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分、２１０分、２４０分、２７０分、３００分、３３０分、３６０分、４２０分および４８０分とした。血液を、１０μｇ／ｍＬアプロチニンを補足したＫ３−ＥＤＴＡ管に回収し、回収の３０分以内に行われる処理まで、氷上に保った。３０００ｒｐｍ、４℃で８分間の遠心分離後、血漿を回収し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＡＵ４８０ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ分析装置を用いたグルコース測定のために分割した。結果を図７Ａ〜図７Ｈに示す。図は、０．６９ｎｍｏｌ／ｋｇ濃度で、ＲＨＩが血清グルコースレベルを５０ｍｇ／ｄＬ未満に低下させた一方で、インスリン二量体は低下させなかったことを示している。この結果は、インスリン二量体が、ＲＨＩよりも低血糖を促進するリスクが低いことを示している。

［実施例３４］
この実験は、化合物Ａのジスルフィド連結部分と二量体２４のスベリオル（Ｃ８）連結部分の安定性を比較した。

１μＭの化合物Ａおよび二量体２４をそれぞれ別々に、５ｍＭグルタチオン（ＧＳＨ）を含むまたは含まないラット腎細胞膜（ＲＫＣＭ）でインキュベートした。時間０および時間２時間の試料を得て、反応物を１体積の０．１％ギ酸を含むＡｃＣＮ中１０％ＭｅＯＨでクエンチした。次いで、クエンチした試料を遠心分離し、分析前に凍結した。次いで、試料を解凍し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｏｒｂｉ Ｖｅｌｏｓシステムを用いて分析した。１０ｐｐｍ窓で２電荷状態から３つの同位体を用いて抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）で標的化ＭｅｔＩＤ分析を行った。

化合物Ａ代謝産物は、ＧＳＨを含むＲＫＣＭとＧＳＨを含まないＲＫＣＭの両方で検出された。図３に示されるように、単量体は２時間のインキュベーションにより親（化合物Ａのストック溶液）の約１％であった。図４に示されるように、単量体は２時間のインキュベーションにより親（化合物Ａのストック溶液）の約６．５％であった。結果は、ジスルフィド結合が徐々に壊れていったことを示している。化合物Ａについての０時間対照でもストック溶液でも代謝産物は観察されなかった。

二量体２４はＲＫＣＭ中に検出される代謝産物を産生したが、Ａ鎖ポリペプチドとＢ鎖ポリペプチドとの間のジスルフィド結合の破壊によるＡ鎖ポリペプチドの損失が観察された一方で、単量体は検出されなかった。図５は、ＧＳＨを含まない場合、Ａ鎖ポリペプチドの損失が親（二量体２４のストック溶液）の１％未満であったことを示している。図６は、ＧＳＨを含む場合、Ａ鎖ポリペプチドの損失が親（二量体２４のストック溶液）の１％未満であったことを示している。二量体２４についての０時間対照でもストック溶液でも代謝産物は観察されなかった。酸性条件での新たなクエンチ手順は、ジスルフィド交換を適切に停止した。

例示実施形態を参照して、本発明を本明細書において説明しているが、本発明はこれに限定されないことが理解されるべきである。当業者および本明細書中の教示を入手できる者であれば、その範囲内のさらなる修飾および実施形態を認識するだろう。そのため、本発明は本明細書に添付される特許請求の範囲によってのみ限定される。

Claims (6)

1. 

   
   から成る群より選択される化合物。
2. 請求項１に記載の化合物と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
3. 請求項１に記載の化合物を含む、糖尿病を治療するための組成物。
4. 前記糖尿病が１型糖尿病、２型糖尿病または妊娠糖尿病である、請求項３に記載の組成物。
5. 糖尿病を治療するための医薬品を製造するための、請求項１に記載の化合物の使用。
6. 前記糖尿病が１型糖尿病、２型糖尿病または妊娠糖尿病である、請求項５に記載の使用。

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