ES2946247T3

ES2946247T3 - Agonistas parciales del receptor de insulina

Info

Publication number: ES2946247T3
Application number: ES19211799T
Authority: ES
Inventors: Songnian Lin; Lin Yan; Pei Huo; Dmitri Pissarnitski; Danqing Feng; Ravi Nargund; Yuping Zhu; Ahmet Kekec; Christina Madsen-Duggan; Zhi-Cai Shi; Zhicai Wu; Yingjun Mu
Original assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 2014-11-21
Filing date: 2015-11-19
Publication date: 2023-07-14
Anticipated expiration: 2035-11-19
Also published as: AU2018211207A1; US20170107268A1; US10183981B2; BR112017010481A2; EP3660041A1; CA3014641C; PE20170957A1; CL2019001144A1; SG10201809427SA; SG11201704064TA; EP3660040A2; JP6931033B2; CN112494656A; US20170355743A1; CL2017001288A1; JP2019014734A; ZA201703238B; EP3660041B1; JP2020097572A; JP6703068B2

Abstract

Se describen dímeros de insulina y dímeros de análogos de insulina que actúan como agonistas parciales en el receptor de insulina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Agonistas parciales del receptor de insulina

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Antecedentes de la invención

(1) Campo de la invención

La presente invención se refiere a dímeros de insulina y a dímeros de análogos de insulina que actúan como agonistas parciales en el receptor de insulina.

(2) Descripción de la técnica relacionada

La insulina es una terapia esencial para los pacientes con diabetes de mellitus tipo 1 (DMT1) y muchos pacientes con diabetes mellitus de tipo 2 (DMT2), prescrita a cerca de un tercio de los pacientes estadounidenses entre todos los usuarios de fármacos antidiabéticos en la última década. El mercado mundial de insulinas fue de 20.400 millones de dólares estadounidenses en 2013 y está creciendo a un ritmo más rápido que todos los demás agentes antidiabéticos combinados. Sin embargo, los desafíos de las terapias con insulina actuales, que incluyen el IT estrecho con respecto a la hipoglucemia y el aumento de peso corporal, limitan su adopción más amplia y la posibilidad de que los pacientes consigan un control glucémico ideal.

Además de la secreción prandial de insulina en respuesta a las comidas, el páncreas libera insulina a una tasa "basal", que se rige en gran medida por los niveles de glucosa en plasma para mantener una regulación adecuada de la glucosa en ayunas. Esto se consigue principalmente mediante el control de la liberación de glucosa hepática, a través de la acción hepatopreferente de la insulina endógena. Los análogos de insulina modernos incluyen insulinas basales y de acción rápida, así como mezclas de estas dos. Los análogos de insulina de acción rápida (AAR) se desarrollan para controlar la hiperglucemia posprandial, mientras que las insulinas con duración de acción prolongada regulan los niveles basales de glucosa. Todos los pacientes con DM1 usan insulinas de acción prolongada (en combinación con inyecciones prandiales) y la mayoría de los pacientes con DM2 comienzan su tratamiento con insulina a partir de un producto basal. El consumo de insulina basal está creciendo rápidamente a medida que se dispara la población mundial de diabéticos (particularmente DMT2).

A pesar de los continuos esfuerzos de desarrollo durante las últimas décadas, las insulinas de acción prolongada disponibles aún no están optimizadas en comparación con la insulina basal fisiológica. Esto se debe en parte a que el enfoque principal se centró en mejorar la planitud de la FC de estos análogos, pero no en corregir la sobreinsulinización relativa de los tejidos periféricos, lo que contribuye a un mayor riesgo de hipoglucemia. Como resultado, la hipoglucemia sigue siendo un riesgo médico clave con una enorme carga para los pacientes y provoca una morbilidad y mortalidad significativas.

El documento WO2014052451 describe dímeros de análogos de insulina. El documento WO0050456 describe dímeros de insulina unidos con puentes covalentes. Deppe et al. (1994) Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology, 350:213-217, describe la relación estructura-actividad de los derivados de insulina dimerizados covalentemente y una correlación de la eficacia agonista parcial con el entrecruzamiento en la lisina B29. Schettler et al. (1982) SEYLER'S ZEITSCHRIFTFUER PHYSIOLOGISCHE CHEMIE, WALTER DE GRUYTER, BERLIN, Alemania, 363:317-330, describe la preparación y las propiedades de los dímeros de insulina unidos covalentemente. Mayer et al. (2007) Biopolymers, 88:687-713 describe la estructura y la función de la insulina. Brandenburg (1977) Protein Crosslinking, pág. 261-282, describe la preparación, las propiedades y las aplicaciones de las insulinas reticuladas.

Breve sumario de la invención

La presente invención proporciona compuestos que comprenden dos moléculas de insulina unidas covalentemente para formar un dímero de moléculas de insulina que puede activar el receptor de insulina con una potencia similar a la insulina normal, pero con una actividad máxima reducida. Estos compuestos son agonistas parciales del receptor de insulina (APRI): se comportan como otros análogos de insulina para disminuir la glucosa eficazmente, pero con menor riesgo de hipoglucemia.

Se proporcionan dímeros de insulina covalentes agonistas parciales del receptor de insulina formulados como insulinas basales novedosas y transformadoras (administración una vez al día) que manifiestan un índice terapéutico (IT) mejorado sobre las insulinas basales de tratamiento de referencia (TDR) actuales. En una realización, los APRI de la presente invención pueden disminuir la glucosa eficazmente con un riesgo reducido de hipoglucemia en minicerdos diabéticos y tienen la propiedad de una insulina basal de una vez al día (UVD). El IT mejorado puede facultar a los médicos para dosificar de forma más agresiva los APRI de la presente invención para alcanzar los objetivos de control de la glucosa en ayunas. El control estricto de la glucosa en ayunas y la HbA1c por un APRI puede permitir que sirva como 1) una insulina de acción prolongada independiente con un perfil potenciado de eficacia y seguridad en la DMT2 y 2) una insulina basal básica mejorada en la DMT1 (y algunas DM2) para su uso con dosis prandiales adicionales de análogos de insulina de acción rápida (AAR). Por lo tanto, la presente invención proporciona las siguientes realizaciones.

En un primer aspecto, la invención proporciona un compuesto seleccionado entre el grupo que consiste en:

en donde las uniones disulfuro entre los restos Cys6 y Cys-n del polipéptido de cadena A y las uniones disulfuro entre el Cys7 y Cys20 de la cadena A al Cys7 y Cys-ig del polipéptido de cadena B, respectivamente, están representados por la línea continua que los separa; en donde los restos de unión están unidos covalentemente al aminoácido épsilon del resto lisina que se muestra, en donde el polipéptido de cadena A para los Dímeros 71,72, 77 y 78 tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEQ ID NO: 1; y el polipéptido de cadena B para los Dímeros 71, 72, 77 y 78 tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEQ ID NO: 2, respectivamente.

En un segundo aspecto, la invención proporciona una composición que comprende uno o más compuestos de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En un tercer aspecto, la invención se refiere a un compuesto o composición de la invención para su uso en el tratamiento de la diabetes.

La siguiente divulgación también describe una serie de compuestos y composiciones a continuación. Sin embargo, la invención es como se define en las reivindicaciones.

En aspectos particulares del agonista parcial del receptor de insulina o dímero de insulina, el extremo amino de cada polipéptido de cadena A y cada polipéptido de cadena B está unido covalentemente a un sustituyente. En aspectos particulares, el extremo amino del polipéptido de cadena A y el polipéptido de cadena B de la primera insulina o análogo de insulina y el extremo amino del polipéptido de cadena A y el polipéptido de cadena B de la segunda insulina o análogo de insulina están cada uno unido covalentemente a un sustituyente. En realizaciones en las que los extremos amino de la primera y segunda insulina o análogos de insulina están unidos covalentemente a un sustituyente, el sustituyente en los extremos amino de los polipéptidos de cadena A y cadena B de la primera insulina o análogo de insulina es el mismo que el sustituyente en los extremos amino de los polipéptidos de cadena A y cadena B de la segunda insulina o análogo de insulina.

En un aspecto adicional del agonista parcial del receptor de insulina o dímero de insulina, los heterodímeros de la primera o segunda insulina o análogo de insulina son iguales.

En un aspecto adicional más del agonista parcial del receptor de insulina o dímero de insulina, el resto de unión une covalentemente el primer heterodímero de insulina o análogo de insulina y el segundo heterodímero de insulina o análogo de insulina a través del grupo amino épsilon de un resto lisina en el extremo carboxi, o cerca del mismo, de sus respectivos polipéptidos de cadena B.

En un aspecto adicional más del agonista parcial del receptor de insulina o dímero de insulina, el sustituyente es un grupo carbamαlo.

En el agonista parcial del receptor de insulina o dímero de insulina, cada polipéptido de cadena A tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEQ ID NO: 1 y cada polipéptido de cadena B tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEQ ID NO: 2.

En el agonista parcial del receptor de insulina o dímero de insulina, las primera y segunda insulinas o análogos de insulina son independientemente insulina humana nativa.

Además se proporcionan composiciones que comprenden uno cualquiera de los agonistas parciales del receptor de insulina o dímero de insulina mencionados anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona además un dímero de insulina que comprende una primera Lys B29 o B28 de una primera molécula de heterodímero de insulina que tiene un primer polipéptido de cadena A y un primer polipéptido de cadena B y una segunda Lys B29 o B28 de un segundo heterodímero de insulina que tiene un segundo polipéptido de cadena A y un segundo polipéptido de cadena B que tiene una conjugación que es un enlazador bifuncional que es el Enlazador 30.

En realizaciones particulares, el sustituyente es un grupo carbamoílo.

La presente invención proporciona además composiciones que comprenden uno cualquiera de los agonistas parciales del receptor de insulina de la invención y una sal farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona un compuesto o composición de la invención para su uso en un método para tratar la diabetes que comprende administrar a un individuo con diabetes una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o composición de la invención. En aspectos particulares la diabetes es diabetes de tipo 1, diabetes de tipo 2 o diabetes gestacional.

En el presente documento también se describe el uso de una composición para el tratamiento de la diabetes que comprende uno cualquiera de los agonistas parciales del receptor de insulina mencionados anteriormente. En aspectos particulares la diabetes es diabetes de tipo 1, diabetes de tipo 2 o diabetes gestacional.

En el presente documento también se describe el uso de uno cualquiera de los agonistas parciales del receptor de insulina desvelados en el presente documento para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes. En aspectos particulares la diabetes es diabetes de tipo 1, diabetes de tipo 2 o diabetes gestacional.

Definiciones

Insulina: como se usa en el presente documento, el término significa el principio activo del páncreas que afecta al metabolismo de los hidratos de carbono en el cuerpo animal y que es valioso en el tratamiento de la diabetes mellitus. El término incluye productos sintéticos y derivados biotecnológicamente que son iguales, o similares a, insulinas de origen natural en estructura, uso y efecto previsto y son valiosos en el tratamiento de la diabetes mellitus. El término es un término genérico que designa el heterodímero de 51 aminoácidos que comprende el péptido de cadena A que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEQ ID NO: 1 y el péptido de cadena B que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEQ ID NO: 2, en donde los restos cisteína en las posiciones 6 y 11 de la cadena A están unidos en un enlace disulfuro, los restos cisteína en la posición 7 de la cadena A y la posición 7 de la cadena B están unidos en un enlace disulfuro, y los restos cisteína en la posición 20 de la cadena A y 19 de la cadena B están unidos en un enlace disulfuro.

La expresión análogo o análogo de insulina, como se usa en el presente documento, incluye cualquier análogo de heterodímero o análogo de una sola cadena que comprenda una o más modificaciones del péptido de cadena A y/o péptido de cadena B nativo. Las modificaciones incluyen, pero sin limitación, sustituir un aminoácido por el aminoácido nativo en una posición seleccionada entre A4, A5, A8, A9, A10, A12, A13, A14, A15, A16, A17, ^a18, A19, A21, B1, B2, B3, B4, B5, B9, B10, B13, B14, B15, B16, B17, B18, B20, B21, B22, B23, B26, B27, B28, B29 y B30; suprimiendo cualquiera o todas las posiciones B1-4 y B26-30; o conjugando directamente o mediante un enlazador polimérico o no polimérico uno o más acilo, polietilglicina (PEG) o resto sacárido (restos); o cualquier combinación de los mismos. Como se ejemplifica por los análogos de insulina glucosilados N-unidos desvelados en el presente documento, el término incluye además cualquier heterodímero de insulina y análogo de una sola cadena que se haya modificado para tener al menos un sitio de glucosilación N-unido y, en particular, realizaciones en las que el sitio de glucosilación N-unido está unido u ocupado por un N-glucano. Los ejemplos de análogos de insulina incluyen, pero sin limitación, los heterodímeros y análogos de una sola cadena desvelados en la solicitud internacional publicada WO20100080606, WO2009/099763 e W02010080609. Los ejemplos de análogos de insulina de una sola cadena también incluyen, pero sin limitación, los desvelados en las solicitudes internacionales publicadas WO9634882, WO95516708, W02005054291, W02006097521, W02007104734, W02007104736, W02007104737, W02007104738, W02007096332, WO2009132129; las patentes de los EE.UU. N.° 5.304.473 y 6.630.348; y Kristensen et al., Biochem. J. 305: 981-986 (1995).

El término incluye además moléculas polipeptídicas de una sola cadena y heterodiméricas que tienen poca o ninguna actividad detectable en el receptor de insulina pero que se han modificado para incluir una o más modificaciones o sustituciones de aminoácidos para tener una actividad en el receptor de insulina que tiene al menos un 1 %, un 10 %, un 50 %, un 75 % o un 90 % de la actividad en el receptor de insulina en comparación con la insulina nativa y que incluye además al menos un sitio de glucosilación N-unido. En aspectos particulares, el análogo de insulina es un agonista parcial que tiene menos del 80 % (o el 70 %) de actividad en el receptor de insulina que la insulina nativa. Estos análogos de insulina, que tienen una actividad reducida en el receptor de hormona de crecimiento insulínica y una actividad mejorada en el receptor de insulina, incluyen tanto heterodímeros como análogos de una sola cadena.

Insulina de una sola cadena o análogo de insulina de una sola cadena: como se usa en el presente documento, la expresión abarca un grupo de proteínas estructuralmente relacionadas en donde el péptido de cadena A o análogo funcional y el péptido de cadena B o análogo funcional están unidos covalentemente por un péptido o polipéptido de 2 a 35 aminoácidos o enlazador polimérico no peptídico o no polimérico y que tiene al menos un 1 %, un 10 %, un 50 %, un 75 % o un 90 % de la actividad de la insulina en el receptor de insulina en comparación con la insulina nativa. La insulina de una sola cadena o análogo de insulina incluye además tres enlaces disulfuro: el primer enlace disulfuro está entre los restos cisteína en las posiciones 6 y 11 de la cadena A o análogo funcional de la misma, el segundo enlace disulfuro está entre los restos cisteína en la posición 7 de la cadena A o análogo funcional de la misma y la posición 7 de la cadena B o análogo funcional de la misma, y el tercer enlace disulfuro está entre los restos cisteína en la posición 20 de la cadena A o análogo funcional de la misma y la posición 19 de la cadena B o análogo funcional de la misma.

Péptido de conexión o péptido C: como se usa en el presente documento, la expresión se refiere al resto de conexión "C" de la secuencia polipeptídica B-C-A de una molécula similar a preproinsulina de una sola cadena. Específicamente, en la cadena de insulina natural, el péptido C conecta el aminoácido en la posición 30 de la cadena B y el aminoácido en la posición 1 de la cadena A. La expresión puede referirse tanto al péptido C de insulina nativa, al péptido C de mono y a cualquier otro péptido de 3 a 35 aminoácidos que conecte la cadena B con la cadena A, por lo tanto, pretende abarcar cualquier péptido que una el péptido de cadena B con el péptido de cadena A en un análogo de insulina de una sola cadena (véanse, por ejemplo, las solicitudes publicadas de los EE.UU. N.° 20090170750 y 20080057004 y WO9634882) y en moléculas precursoras de insulina tales como las desveladas en el documento WO9516708 y la patente de los EE.UU. N.° 7.105.314.

Modificación de aminoácidos: como se usa en el presente documento, la expresión se refiere a la sustitución de un aminoácido, o a la derivación de un aminoácido mediante la adición y/o retirada de grupos químicos al/del aminoácido, e incluye la sustitución con cualquiera de los 20 aminoácidos que se encuentran habitualmente en las proteínas humanas, así como aminoácidos atípicos o de origen no natural. Las fuentes comerciales de aminoácidos atípicos incluyen Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), ChemPep Inc. (Miami, FL) y Genzyme Pharmaceuticals (Cambridge, MA). Los aminoácidos atípicos pueden adquirirse de proveedores comerciales, sintetizarse de novo o derivatizarse o modificarse químicamente a partir de aminoácidos de origen natural.

Sustitución de aminoácidos: como se usa en el presente documento, se refiere al reemplazo de un resto de aminoácido por un resto de aminoácido diferente.

Sustitución de aminoácidos conservadora: como se usa en el presente documento, la expresión se define en el presente como intercambios dentro de uno de los siguientes cinco grupos:

I. Restos pequeños alifáticos, no polares o ligeramente polares:

Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;

II. Restos polares, con carga negativa y sus amidas:

Asp, Asn, Glu, Gln, ácido cisteico y ácido homocisteico;

III. Restos polares, con carga positiva:

His, Arg, Lys; Ornitina (Orn)

IV. Restos grandes, alifáticos, no polares:

Met, Leu, Ile, Val, Cys, Norleucina (Nle), homocisteína

V. Restos grandes, aromáticos:

Phe, Tyr, Trp, acetil fenilalanina

Tratar: como se usa en el presente documento, el término "tratar" (o "que trata", "tratado", "tratamiento", etc.) se refiere a la administración de un APRI de la presente divulgación a un sujeto que lo necesite con el objetivo de aliviar, mitigar, alterar, mejorar, restablecer o alterar una afección (por ejemplo, diabetes), un síntoma o síntomas de una afección (por ejemplo, hiperglucemia), o la predisposición a una afección. Por ejemplo, como se usa en el presente documento, la expresión "tratar la diabetes" se referirá en general a mantener los niveles de glucosa en sangre cerca de los niveles normales y puede incluir aumentar o disminuir los niveles de glucosa en sangre dependiendo de una situación dada.

Vehículo farmacéuticamente aceptable, como se usa en el presente documento, la expresión incluye cualquiera de los vehículos farmacéuticos convencionales, tales como suero salino tamponado con fosfato, agua, emulsiones tales como una emulsión de aceite/agua o agua/aceite, y diversos tipos de agentes humectantes adecuados para la administración a o por un individuo que lo necesite. La expresión también abarca cualquiera de los agentes aprobados por una agencia reguladora del gobierno federal de los EE.UU. o enumerados en la Farmacopea de los EE.UU. para su uso en animales, incluyendo seres humanos.

Sal farmacéuticamente aceptable: como se usa en el presente documento, la expresión se refiere a sales de compuestos que conservan la actividad biológica del compuesto progenitor y que no son no deseables biológicamente o de otro modo. Muchos de los compuestos desvelados en el presente documento son capaces de formar sales de ácidos y/o bases en virtud de la presencia de grupos amino y/o carboxilo o grupos similares a los mismos.

Además se pueden preparar sales de adición de base farmacéuticamente aceptables a partir de bases inorgánicas y orgánicas. Las sales derivadas de bases inorgánicas incluyen, a modo de ejemplo solamente, sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio, cinc y magnesio. Las sales derivadas de bases orgánicas incluyen, pero sin limitación, sales de aminas primarias, secundarias y terciarias.

Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables pueden prepararse a partir de ácidos inorgánicos y orgánicos. Las sales derivadas de ácidos inorgánicos incluyen ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares. Las sales derivadas de ácidos orgánicos incluyen ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-tolueno-sulfónico, ácido salicílico y similares.

Cantidad eficaz o terapéuticamente eficaz: como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad no tóxica pero suficiente de un análogo de insulina para proporcionar el efecto deseado. Por ejemplo, un efecto deseado sería la prevención o el tratamiento de la hiperglucemia. La cantidad que es "eficaz" variará de un sujeto a otro, dependiendo de la edad y el estado general del individuo, el modo de administración, y similares. Por lo tanto, no siempre es posible especificar una "cantidad eficaz" exacta. No siempre es posible determinar la cantidad eficaz óptima antes de la administración a o por un individuo que lo necesite. Sin embargo, un experto habitual en la materia puede determinar una cantidad "eficaz" adecuada en cualquier caso individual usando experimentación de rutina.

Parenteral: como se usa en el presente documento, el término significa que la administración no se realiza a través del canal alimentario sino por alguna otra vía, tal como intranasal, inhalación, subcutánea, intramuscular, intraespinal o intravenosa.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra el efecto hipoglucemiante de los Dímeros 24, 18 y 40 en comparación con IHR cuando se administró a minicerdos diabéticos a 0,69 nmol/kg.

La Figura 2A muestra los resultados de un Ensayo de tolerancia a la insulina (ETI) en ratones comparando el compuesto A con IHR (Humulina). El Compuesto A se administró a una dosis de 72 U/kg y una dosis de 300 U/kg y la Humulina se administró a una dosis de 18 U/kg y una dosis de 72 U/kg.

La Figura 2B muestra los resultados de un Ensayo de tolerancia a la insulina (ETI) en ratones comparando el compuesto B con IHR (Humulina). El Compuesto B se administró a una dosis de 72 U/kg y una dosis de 300 U/kg y la Humulina se administró a una dosis de 18 U/kg y una dosis de 72 U/kg.

La Figura 2C muestra los resultados de un Ensayo de tolerancia a la insulina (ETI) en ratones comparando el Dímero 24 con IHR (Humulina). El Dímero 24 se administró a una dosis de 72 U/kg y una dosis de 300 U/kg y la Humulina se administró a una dosis de 18 U/kg y una dosis de 72 U/kg.

La Figura 2D muestra los resultados del Dímero 55 en un Ensayo de tolerancia a la insulina (ETI) en ratones. El Dímero 55 se administró a una dosis de 120 nmol/kg y una dosis de 300 nmol/kg.

La Figura 2E muestra los resultados del Dímero 58 en un Ensayo de tolerancia a la insulina (ETI) en ratones. El Dímero 58 se administró a una dosis de 60 nmol/kg y una dosis de 300 nmol/kg.

La Figura 2F muestra los resultados del Dímero 60 en un Ensayo de tolerancia a la insulina (ETI) en ratones. El Dímero 60 se administró a una dosis de 72 nmol/kg y una dosis de 300 nmol/kg.

La Figura 2G muestra los resultados del Dímero 67 en un Ensayo de tolerancia a la insulina (ETI) en ratones. El Dímero 67 se administró a una dosis de 120 nmol/kg y una dosis de 300 nmol/kg.

La Figura 3 muestra que el dímero de insulina Compuesto A se estaba degradando a monómeros de insulina mediante incubación de 2 horas con membranas de células de riñón de rata (MCRR) sin glutatión (GSH). El % de los valores originales son semicuantitativos únicamente debido a posibles diferencias en las eficiencias de ionización.

La Figura 4 muestra que el dímero de insulina Compuesto A se estaba degradando a monómeros de insulina mediante incubación de 2 horas con membranas de células de riñón de rata (MCRR) con glutatión (GSH). El % de los valores originales son semicuantitativos únicamente debido a posibles diferencias en las eficiencias de ionización.

La Figura 5 muestra que el Dímero 24 perdió algo de polipéptido de cadena A pero no se degradó a los monómeros mediante incubación de 2 horas con membranas de células de riñón de rata (MCRR) sin glutatión (GSH). El % de los valores originales son semicuantitativos únicamente debido a posibles diferencias en las eficiencias de ionización.

La Figura 6 muestra que el Dímero 24 perdió algo de polipéptido de cadena A pero no se degradó a los monómeros mediante incubación de 2 horas con membranas de células de riñón de rata (MCRR) con glutatión (GSH). El % de los valores originales son semicuantitativos únicamente debido a posibles diferencias en las eficiencias de ionización.

La Figura 7A muestra el efecto hipoglucemiante de los Dímeros 4 , 5 , 7 , 8 y 9 en comparación con IHR cuando se administró a minicerdos diabéticos a 0,69 nmol/kg.

La Figura 7B muestra el efecto hipoglucemiante de los Dímeros 18, 19, 20, 21 y 22 en comparación con IHR cuando se administró a minicerdos diabéticos a 0,69 nmol/kg.

La Figura 7C muestra el efecto hipoglucemiante de los Dímeros 23, 24, 26, 27 y 28 en comparación con IHR cuando se administró a minicerdos diabéticos a 0,69 nmol/kg.

La Figura 7D muestra el efecto hipoglucemiante de los Dímeros 29, 32, 37, 38 y 39 en comparación con IHR cuando se administró a minicerdos diabéticos a 0,69 nmol/kg.

La Figura 7E muestra el efecto hipoglucemiante de los Dímeros 40, 41, 43, 44 y 48 en comparación con IHR cuando se administró a minicerdos diabéticos a 0,69 nmol/kg.

La Figura 7F muestra el efecto hipoglucemiante de los Dímeros 55, 57, 58, 60 y 61 en comparación con IHR cuando se administró a minicerdos diabéticos a 0,69 nmol/kg.

La Figura 7G muestra el efecto hipoglucemiante de los Dímeros 62, 64, 67, 69 y 71 en comparación con IHR cuando se administró a minicerdos diabéticos a 0,69 nmol/kg.

La Figura 7H muestra el efecto hipoglucemiante de los Dímeros 72, 77 y 78 en comparación con IHR cuando se administró a minicerdos diabéticos a 0,69 nmol/kg.

Descripción detallada

La presente invención proporciona compuestos que comprenden dos moléculas de insulina unidas covalentemente para formar un dímero de insulina unido covalentemente que puede activar el receptor de insulina con una potencia similar a la insulina normal y una actividad máxima reducida. Estos compuestos son agonistas parciales del receptor de insulina (APRI): se comportan como otros análogos de insulina para disminuir la glucosa eficazmente, pero con menor riesgo de hipoglucemia.

La siguiente divulgación proporciona antecedentes técnicos adicionales que son útiles para comprender la invención. No se pretende definir esta información técnica como parte de la materia objeto de la invención que no entra dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Se han desvelado dímeros de insulina en Brandenburg et al. en la patente de los EE.UU. N.° 3.907.763 (1973); Tatnell et al., Biochem J. 216: 687-694 (1983); Shuttler y Brandenburg, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem, 363, 317-330, 1982; Weiland et al., Proc Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 1154-1158 (1990); Deppe et al., Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol (1994) 350:213-217; Brandenburg y Havenith en la patente de los EE.UU. N.° 6.908.897(B2) (2005); Knudsen et al., PLOS ONE 7: e51972 (2012); DiMarchi et al. en el documento WO2011/159895; DiMarchi et al. en el documento WO 2014/052451; y Herrera et al., documento WO2014141165. Más recientemente, se han descrito dímeros de insulina en Brant-Synthesis and Characterization of Insulin Receptor Partial Agonists as a Route to Improved Diabetes Therapy, Disertación de doctorado, Universidad de Indiana (abril de 2015) y Zaykov y DiMarchi, Póster P212 - Exploration of the structural and mechanistic basis for partial agonism of insulin dimers, American Peptide Symposium, Orlando FL (20 al 25 de junio (2015). Sin embargo, los inventores de la presente invención han descubierto que el nivel de actividad de insulina y la actividad agonista parcial de los dímeros es una función de la estructura dimérica, la secuencia del análogo de insulina, la longitud del enlazador de dimerización y el sitio de dimerización que conecta los dos polipéptidos de insulina. Los inventores han descubierto que los dímeros de insulina de la presente invención tienen un riesgo reducido de promover la hipoglucemia cuando se administran en dosis altas con respecto a la insulina nativa u otros análogos de insulina cuando se administran a dosis altas.

La presente invención proporciona dímeros de insulina unidos covalentemente agonistas parciales formulados como una insulina basal novedosa y transformadora (administración una vez al día) que manifiesta un índice terapéutico (IT) mejorado sobre las insulinas basales de tratamiento de referencia (TDR) actuales. Estas moléculas pueden disminuir la glucosa eficazmente con un riesgo reducido de hipoglucemia en minicerdos diabéticos y tienen la propiedad de una insulina basal de una vez al día (UVD). El IT mejorado puede permitir a los médicos dosificar de forma más agresiva el dímero APRI para alcanzar los objetivos de control de la glucosa en ayunas. El control estricto de la glucosa en ayunas y la HbA1c puede permitir que estas moléculas sirvan como 1) una insulina de acción prolongada independiente con un perfil potenciado de eficacia y seguridad en la diabetes mellitus de tipo 2 (DMT2) y 2) una insulina basal básica mejorada en la diabetes mellitus de tipo 1 (DMT1) (y algunas DM2) para su uso con dosis prandiales adicionales de análogos de insulina de acción rápida (AAR).

Una insulina de acción prolongada ideal proporciona un control continuo de la glucosa en ayunas en diabéticos con una FC/FD muy estable y reproducible. Sin embargo, las insulinas basales disponibles actualmente, incluso aquellas con una estabilidad y una reproducibilidad mejoradas de FC/FD continúan teniendo un índice terapéutico estrecho y los incidentes de hipoglucemia aumentan a medida que los niveles de glucosa se acercan al objetivo de euglucemia. Esto con frecuencia puede conducir a una infradosificación para evitar la hipoglucemia. Se espera que el tratamiento con un APRI de la presente invención altere esta relación eficacia:hipoglucemia mediante la atenuación de la tasa de cambio en la disminución de la glucosa a medida que aumenta la dosis.

Cadenas A y B de insulina

En el presente documento se describen dímeros de insulina o de análogos de insulina que tienen actividad agonista del receptor de insulina. El nivel de actividad de insulina de los dímeros es una función de la estructura dimérica, la secuencia del análogo de insulina, la longitud del enlazador de dimerización y el sitio de dimerización que conecta los dos polipéptidos de insulina. Los polipéptidos de insulina de la presente invención comprenden las secuencias de cadena B y A nativas de la insulina humana (SEQ ID NO: 2 y 1, respectivamente). En el presente documento también se describen (sin formar parte de la invención) análogos de insulina conocidos o derivados de los mismos que presentan actividad agonista de insulina cuando se unen entre sí en un heterodúplex. Dichos análogos incluyen, por ejemplo, proteínas que tienen una cadena A y una cadena B que difieren de la cadena A y la cadena B de la insulina humana por tener una o más supresiones de aminoácidos, una o más sustituciones de aminoácidos y/o una o más inserciones de aminoácidos que no destruyen la actividad de insulina del análogo de insulina.

Un tipo de análogo de insulina, "análogo de insulina monomérico", se conoce bien en la técnica. Estos son análogos de acción rápida de la insulina humana, incluyendo, por ejemplo, análogos de insulina en donde:

(a) el resto aminoacilo en la posición B28 está sustituido con Asp, Lys, Leu, Val o Ala, y el resto de aminoacilo en la posición B29 es Lys o Pro;

(b) los restos aminoacilo en cualquiera de las posiciones B27 y B30 se suprimen o se sustituyen con un aminoácido no nativo.

Un análogo de insulina puede comprender un Asp sustituido en la posición B28 (por ejemplo, insulina aspart (NOVOLOG); véase el s Eq ID NO: 9) o una Lys sustituida en la posición 28 y una prolina sustituida en la posición B29 (por ejemplo, insulina lispro (HUMALOG); véase el SEQ ID NO: 6). Se desvelan análogos de insulina monoméricos adicionales en Chance, et al., patente de los EE.UU. N.° 5.514.646; Chance, et al., solicitud de patente de los EE.UU. con N.° de serie 08/255.297; Brems, et al., Protein Engineering, 5:527-533 (1992); Brange, et al., Publicación EPO N.° 214.826 (publicada el 18 de marzo de 1987); y Brange, et al., Current Opinión in Structural Biology, 1:934-940 (1991).

Los análogos de insulina también pueden tener reemplazos de los aminoácidos amidados con formas ácidas. Por ejemplo, la Asn puede reemplazarse con Asp o Glu. Análogamente, la Gln puede reemplazarse con Asp o Glu. En particular, Asn(A18), Asn(A21) o Asp(B3), o cualquier combinación de esos restos, pueden reemplazarse por Asp o Glu. Además, Gln(A15) o Gln(B4), o ambas, pueden reemplazarse por ya sea Asp o Glu.

Como se desvela en el presente documento, los análogos de una sola cadena de insulina pueden comprender una cadena B y una cadena A de insulina humana, o análogos o derivados de las mismas, en donde el extremo carboxilo de la cadena B está unido al extremo amino de la cadena A a través de un resto de unión. La cadena A puede ser la secuencia de aminoácidos GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1) y la cadena B puede comprender la secuencia de aminoácidos FVNQHLCGSH LVEALYLVCGe R₉FFYTPKT (s EQ ID NO: 2) o una secuencia carboxilo acortada de la misma que tenga B30 suprimido, y análogos de aquellas secuencias en donde cada secuencia se modifica para comprender de una a cinco sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones de la insulina nativa seleccionadas entre A5, A8, A9, A10, A14, A15, A17, A18, A21, B1, B2, B3, B4, B5, B9, B10, B13, B14, B20, B22, B23, B26, B27, B28, B29 y B30, a condición de que al menos uno de B28 o B29 sea lisina. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser sustituciones de aminoácidos conservadoras. Los expertos en la materia conocen las sustituciones de aminoácidos adecuadas en estas posiciones que no afectan negativamente a las actividades deseadas de la insulina, como se ha demostrado, por ejemplo, en Mayer, et al., Insulin Structure and Function, Biopolymers. 2007; 88(5):687-713.

Los péptidos análogos de insulina pueden comprender una cadena A de insulina y una cadena B de insulina o análogos de las mismas, en donde la cadena A comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 70 % de identidad de secuencia (por ejemplo, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %) sobre la longitud del péptido nativo, con GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1) y la cadena B comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 60 % de identidad de secuencia (por ejemplo, un 60 %, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %) sobre la longitud del péptido nativo, con FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 2) o una secuencia acortada de carboxi de la misma que tiene B30 suprimido.

Pueden añadirse secuencias de aminoácidos adicionales al extremo amino de la cadena B o al extremo carboxilo de la cadena A. Por ejemplo, puede añadirse una serie de aminoácidos con carga negativa al extremo amino de la cadena B, incluyendo por ejemplo un péptido de 1 a 12, 1 a 10, 1 a 8 o 1 a 6 aminoácidos de longitud y que comprende uno o más aminoácidos con carga negativa incluyendo. por ejemplo, ácido glutámico y ácido aspártico. La prolongación amino terminal de la cadena B puede comprender de 1 a 6 aminoácidos con carga. Los polipéptidos de insulina pueden comprender una amida o éster C-terminal en lugar de un carboxilato C-terminal en la cadena A.

Los análogos de insulina pueden tener un punto isoeléctrico que se haya desplazado con respecto a la insulina humana. El desplazamiento en el punto isoeléctrico se consigue añadiendo uno o más restos arginina, lisina o histidina al extremo N-terminal del péptido de cadena A de insulina y/o al extremo C-terminal del péptido de cadena B de insulina. Los ejemplos de dichos polipéptidos de insulina incluyen ArgA0-insulina humana, ArgB31ArgB32-insulina humana, GlyA21ArgB31ArgB32-insulina humana, ArgA0ArgB31ArgB32-insulina humana, y ArgA0GlyA21ArgB31ArgB32-insulina humana. A modo de ejemplo adicional, la insulina glargina (LANTUS; véanse los s Eq ID NO: 7 y 8) es un análogo de insulina de acción prolongada de ejemplo en el que AsnA21 se ha reemplazado por glicina y se han unido covalentemente dos restos arginina al extremo C del péptido B. El efecto de estos cambios de aminoácidos fue desplazar el punto isoeléctrico de la molécula, produciendo de este modo una molécula que es soluble a pH ácido (por ejemplo, pH de 4 a 6,5), pero insoluble a pH fisiológico. Cuando se inyecta una solución de insulina glargina en el músculo, el pH de la solución se neutraliza y la insulina glargina forma microprecipitados que liberan lentamente la insulina glargina durante un período de 24 horas después de la inyección sin ningún pico pronunciado de insulina y, por lo tanto, con un riesgo reducido de inducir hipoglucemia. Este perfil permite una dosificación una vez al día para proporcionar la insulina basal del paciente. Por lo tanto, los análogos de insulina pueden comprender un péptido de cadena A en donde el aminoácido en la posición A21 es glicina y un péptido de cadena B en donde los aminoácidos en la posición B31 y B32 son arginina. En el presente documento se describen combinaciones únicas y múltiples de estas mutaciones y cualesquiera otras mutaciones (por ejemplo, GlyA21-insulina humana, GlyA21ArgB31-insulina humana, ArgB31ArgB32-insulina humana, ArgB31-insulina humana).

Pueden reemplazarse uno o más aminoácidos amidados del análogo de insulina con un aminoácido ácido u otro aminoácido. Por ejemplo, la asparagina puede reemplazarse con ácido aspártico o ácido glutámico, u otro resto. Análogamente, la glutamina puede reemplazarse con ácido aspártico o ácido glutámico, u otro resto. En particular, puede reemplazarse AsnA18, AsnA21 o AsnB3, o cualquier combinación de estos restos, por ácido aspártico o ácido glutámico, u otro resto. Puede reemplazarse GlnA15 o GlnB4, o ambas, por ácido aspártico o ácido glutámico, u otro resto. Los análogos de insulina pueden tener un ácido aspártico u otro resto, en la posición A21 o ácido aspártico, u otro resto, en la posición B3, o ambos.

Un experto en la materia reconocerá que es posible reemplazar otros aminoácidos en el análogo de insulina con otros aminoácidos conservando al mismo tiempo la actividad biológica de la molécula. Por ejemplo, sin limitación, las siguientes modificaciones están también ampliamente aceptadas en la técnica: el reemplazo del resto histidina de la posición B 10 con ácido aspártico (HisB10 a AspB10); el reemplazo del resto fenilalanina en la posición B 1 con ácido aspártico (PheB1 a AspB1); el reemplazo del resto treonina en la posición B30 con alanina (ThrB30 a AlaB30); el reemplazo del resto tirosina en la posición B26 con alanina (TyrB26 a AlaB26); y el reemplazo del resto serina en la posición B9 con ácido aspártico (SerB9 a AspB9).

El análogo de insulina tiene un perfil de acción prolongado. El análogo de insulina puede estar acilado con un ácido graso. Es decir, se forma un enlace amida entre un grupo amino en el análogo de insulina y el grupo de ácido carboxílico del ácido graso. El grupo amino puede ser el grupo amino alfa de un aminoácido N-terminal del análogo de insulina, o puede ser el grupo amino épsilon de un resto lisina del análogo de insulina. El análogo de insulina puede estar acilado en uno o más de los tres grupos amino que están presentes en la insulina humana de tipo silvestre o puede estar acilado en el resto lisina que se ha introducido en la secuencia de insulina humana de tipo silvestre. El análogo de insulina puede estar acilado en la posición A1, B1 o tanto A1 como B1. El ácido graso puede seleccionarse entre ácido mirístico (C14), ácido pentadecílico (C15), ácido palmítico (C16), ácido heptadecílico (C17) y ácido esteárico (C18).

Pueden encontrarse ejemplos de análogos de insulina, por ejemplo, en la solicitud internacional publicada WO9634882, WO95516708; WO20100080606, WO2009/099763 y WO2010080609, la patente de los EE.UU. N.° 6.630.348 y Brennan et al., Biochem. J. 305: 981-986 (1995)). Los análogos de insulina glucosilados in vitro o N-glucosilados in vivo pueden estar acilados y/o pegilados.

En el presente documento se describe un análogo de insulina en donde la cadena A del péptido de insulina comprende la secuencia GIVEQCCX8SICSLYQLX17NX19CX23 (SEQ ID NO: 3) y la cadena B que comprende la secuencia X25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFFYTX31X32 (SEQ ID NO: 4) en donde

X8 es treonina o histidina;

X17 es ácido glutámico o glutamina;

X19 es tirosina, 4-metoxi-fenilalanina o 4-amino fenilalanina;

X23 es asparagina o glicina;

X25 es histidina o treonina;

X29 es alanina, glicina o serina;

X30 es histidina, ácido aspártico, ácido glutámico, ácido homocisteico o ácido cisteico;

X31 es prolina o lisina; y

X32 es prolina o lisina, a condición de que al menos uno de X31 o X32 sea lisina.

La cadena B puede comprender la secuencia X22VNQX25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFFYT-X31X32X33X34X35 (SEQ ID NO: 5)

en donde

X22 es o fenilalanina y desamino-fenilalanina;

X25 es histidina o treonina;

X29 es alanina, glicina o serina;

X31 es ácido aspártico, prolina o lisina;

X32 es lisina o prolina;

X33 es treonina, alanina o está ausente;

X34 es arginina o está ausente; y

X35 es arginina o está ausente;

A condición de que al menos uno de X31 o X32 sea lisina.

Resto de unión

Los dímeros de insulina desvelados en el presente documento se forman entre un primer y un segundo polipéptido de insulina en donde cada polipéptido de insulina comprende una cadena A y una cadena B. Los polipéptidos de insulina primero y segundo pueden ser análogos de insulina de dos cadenas (es decir, en donde las cadenas A y B están unidas únicamente a través de enlaces disulfuro entre cadenas entre restos cisteína internos) en donde los polipéptidos de insulina primero y segundo están unidos entre sí para formar el dímero mediante un enlace covalente, enlazador bifuncional o usando química clic de cicloadición de alquino-azida catalizada por cobre (I) (CuAAC) o química clic sin cobre para unir restos de unión en las cadenas B respectivas. De acuerdo con una realización, los polipéptidos de insulina primero y segundo están unidos entre sí por un enlazador bifuncional que une la cadena lateral de la lisina B28 o ^b29 de la cadena B del primer polipéptido de insulina a la cadena lateral del aminoácido B28 o B29 de la cadena B del segundo polipéptido de insulina.

El resto de unión puede ser un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre el grupo que consiste en acilo, alifático, heteroalifático, arilo, heteroarilo y heterocíclico. El resto de unión puede ser una cadena de hidrocarburo C1-C20 opcionalmente sustituida, bivalente, lineal o ramificada, saturada o insaturada, en donde una o más unidades de metileno están opcional e independientemente reemplazadas por -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, C(O)O-, OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)₂-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, un grupo heterocíclico, un grupo arilo o un grupo heteroarilo, en donde cada vez que aparece R es independientemente hidrógeno, un grupo protector adecuado, un resto acilo, resto arilalquilo, resto alifático, resto arilo, resto heteroarilo o resto heteroalifático.

El resto de unión puede comprender un enlazador de PEG, un polímero lineal corto de aproximadamente 2-25 unidades de etilenglicol o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 25 unidades de etilenglicol y opcionalmente uno o más aminoácidos. El enlazador de PEG puede comprender la estructura (PEG)₂, (PEG)₃, (PEG)4, (PEG)5, (PEG)^b, (PEG)7, (PEG)a, (PEG)g, (PEG)10, (PEG)n, (PEG)12, (PEG)13, (PEG)™, (PEG)15, (PEG)1S o (PEG)₂5. El enlazador de PEG puede ser un enlazador bifuncional que puede conjugarse o unirse covalentemente o al grupo amino épsilon de los restos lisina de posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina primero y segundo. La estructura de un enlazador de PEG bifuncional conjugado con el grupo amino épsilon de los grupos lisina en la posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina primero y segundo puede representarse por la siguiente fórmula general

en donde n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 25 y la línea ondulada indica el enlace entre el enlazador y el grupo amino épsilon. Se conocen bien en la técnica métodos para conjugar PEG con el grupo amino épsilon de la lisina, véase, por ejemplo, Veronese, Biomaterials 22: 405-417 (2001).

Un resto de unión de PEG que conjuga el grupo amino épsilon de la lisina en la posición B29 o B28 del primer polipéptido de insulina con el aminoácido épsilon de la lisina en la posición B29 o B28 del segundo polipéptido de insulina puede ser

en donde las líneas onduladas indican el enlace entre el enlazador y el grupo amino épsilon de la lisina en la posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina.

El resto de unión puede comprender un resto acilo que comprende 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 carbonos. El resto acilo puede ser un resto succinilo (4), adipoílo (C6), suberoílo (C8) o hexadecanodioílo (C16). El resto acilo puede comprender un enlazador bifuncional que puede conjugarse o unirse covalentemente o al grupo amino épsilon de los restos lisina de posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina primero y segundo. La estructura de un enlazador de acilo bifuncional conjugado con el grupo amino épsilon del grupo lisina en la posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina primero y segundo puede representarse por la siguiente fórmula general

en donde n = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 y las líneas onduladas indican el enlace entre el enlazador y el grupo amino épsilon de la lisina en la posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina.

Un resto de unión de acilo que conjuga el grupo amino épsilon de la lisina en la posición B29 o B28 del primer polipéptido de insulina con el aminoácido épsilon de la lisina en la posición B29 o B28 del segundo polipéptido de insulina puede ser

El enlazador de acilo bifuncional puede incluir además uno o dos aminoácidos en uno o ambos extremos del enlazador de acilo. Por ejemplo, el aminoácido en uno o ambos extremos del enlazador es ácido gamma glutámico (^yE), que pueden estar representado por la siguiente fórmula general

El resto de unión puede comprender un enlazador bifuncional de cadena de alquilo que contiene amida que puede conjugarse o unirse covalentemente al grupo amino épsilon de los restos lisina de posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina primero y segundo que puede representarse por la siguiente fórmula general

en donde n = 1 o 2, o = 1, 2, 3, 4 o 5, y las líneas onduladas indican el enlace entre el enlazador y el grupo amino épsilon de la lisina en la posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina. El resto de unión puede tener la estructura

en donde n = 1, 2, 3, 4 o 5, o = 1 o 2, p = 1, 2, 3, 4 o 5, y las líneas onduladas indican el enlace entre el enlazador y el grupo amino épsilon de la lisina en la posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina. El resto de unión puede tener la estructura

El resto de unión puede comprender un enlazador bifuncional de cadena de alquilo que contiene amida que puede conjugarse o unirse covalentemente al grupo amino épsilon de los restos lisina de posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina primero y segundo y que pueden representarse por la siguiente fórmula general

en donde n = 1 o 2, o = 1,2 o 3, p = 1 o 2, y las líneas onduladas indican el enlace entre el enlazador y el grupo amino épsilon de la lisina en la posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina. El resto de unión puede tener la estructura

El resto de unión comprende una estructura de anillo, que proporciona rigidez al resto de unión. Como se describe en el presente documento, la estructura de anillo puede comprender un grupo bencilo o un grupo alicíclico saturado o insaturado que tiene 3, 4, 5, 6, 7 u 8 carbonos. El grupo alicíclico puede comprender un ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ciclopentilo o ciclooctilo. El grupo alicíclico insaturado (cicloalcano) comprende un grupo ciclopropenilo, ciclobutenilo, ciclopentenilo, ciclohexenilo, cicloheptenilo o ciclooctenilo. La estructura de anillo puede comprender además una o más cadenas laterales alifáticas saturadas o insaturadas. La estructura de anillo puede comprender además una o más cadenas laterales alifáticas que comprenden uno o más heteroátomos. El heteroátomo puede ser O, S o N.

La estructura de anillo puede comprender un heteroátomo. El heteroátomo puede ser O, S o N. La estructura de anillo puede comprender un grupo bencilo o un grupo alicíclico saturado o insaturado que tiene 3, 4, 5, 6, 7 u 8 carbonos en el que uno o más carbonos están sustituidos con un heteroátomo seleccionado entre N, O y S. Los ejemplos de estructuras de anillo que incluyen un heteroátomo incluyen, pero sin limitación, óxido de etileno, etilenimina, óxido de trimetilo, furano, tetrahidrofurano, tifeno, pirrolidina, pirano, piperidina, imidazol, tiazol, dioxano, morfolina, pirimidina, triazol, tietano, 1,3-diazetina, 2,3-dihidroazet, 1,2-oxatiolano, isoxazol, oxazol, silol, oxepano, tiepina, 3, 4, 5, 6-tetrahidro-2H-azepina, 1,4-tiazepina, azocano y tiocano.

Un resto de unión puede comprender un enlazador bifuncional que puede conjugarse o unirse covalentemente o al grupo amino épsilon de los restos lisina de posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina primero y segundo que puede representarse por un benceno-1,1 diacilo que tiene la siguiente fórmula general

en donde R1 y R2 puede ser iguales o diferentes en donde R1 y R2 son independientemente un enlace, una cadena de alquilo C1-C20 o C1-C6 saturada o insaturada en donde una o más unidades de metileno están opcional e independientemente reemplazadas por -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, C(O)O-, OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)₂-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, un grupo heterocíclico, un grupo arilo o un grupo heteroarilo, en donde cada vez que aparece R es independientemente hidrógeno, un grupo protector adecuado, un resto acilo, resto arilalquilo, resto alifático, resto arilo, resto heteroarilo o resto heteroalifático, cadena de poli(etilenglicol) (PEG) (PEG)₂, (PEG)₃, (PEG)4, (PEG)5, (PEG)^b, (PEG)7, (PEG)8, (PEG)g, (PEG)m (PEG)n, (PEG)«, (PEG)13, (PEG)-^m, (PEG)15, (PEG) 16 o (PEG)₂y en donde las líneas onduladas indican el enlace entre el enlazador y el grupo amino épsilon de la lisina en la posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina.

en donde n y o son independientemente 0, 1, 2, 3, 4 o 5 en donde las líneas onduladas indican el enlace entre el enlazador y el grupo amino épsilon de la lisina en la posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina.

Un resto de unión puede comprender un enlazador bifuncional que puede conjugarse o unirse covalentemente o al grupo amino épsilon de los restos lisina de posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina primero y segundo que puede representarse por un benceno-1,3 diacilo que tiene la siguiente fórmula general

en donde R1 y R2 puede ser iguales o diferentes en donde R1 y R2 son independientemente un enlace, una cadena de alquilo C1-C20 o C1-C6 saturada o insaturada en donde una o más unidades de metileno están opcional e independientemente reemplazadas por -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, C(O)O-, OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)₂-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, un grupo heterocíclico, un grupo arilo o un grupo heteroarilo, en donde cada vez que aparece R es independientemente hidrógeno, un grupo protector adecuado, un resto acilo, resto arilalquilo, resto alifático, resto arilo, resto heteroarilo o resto heteroalifático, cadena de poli(etilenglicol) (PEG) (PEG)₂, (PEG)₃, (PEG)4, (PEG)5, (PEG)^b, (PEG)7, (PEG)a, (PEG)g, (PEG)10, (PEG)n,

(PEG)12, (PEG)13, (PEG)14, (PEG)15, (PEG) 16 o (PEG)2 y en donde las líneas onduladas indican el enlace entre el enlazador y el grupo amino épsilon de la lisina en la posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina.

Un resto de unión puede comprender un enlazador bifuncional que puede conjugarse o unirse covalentemente o al grupo amino épsilon de los restos lisina de posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina primero y segundo que puede representarse por un benceno-1,4 diacilo que tiene la siguiente fórmula general

en donde R1 y R2 puede ser iguales o diferentes en donde R1 y R2 son independientemente un enlace, una cadena de alquilo C1-C20 o C1-C6 saturada o insaturada en donde una o más unidades de metileno están opcional e independientemente reemplazadas por -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, C(O)O-, OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)₂-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, un grupo heterocíclico, un grupo arilo o un grupo heteroarilo, en donde cada vez que aparece R es independientemente hidrógeno, un grupo protector adecuado, un resto acilo, resto arilalquilo, resto alifático, resto arilo, resto heteroarilo o resto heteroalifático, cadena de poli(etilenglicol) (PEG) (PEG)₂, (PEG)₃, (PEG)4, (PEG)5, (PEG)6, (PEG)7, (PEG)a, (PEG)g, (PEG)m (PEG)n, (PEG)«, (PEG)«, (PEG)14, (PEG)15, (PEG) 16 o (PEG)₂y en donde las líneas onduladas indican el enlace entre el enlazador y el grupo amino épsilon de la lisina en la posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina.

En donde m, n y o son cada uno independientemente 1 o 2; R1 y R2 puede ser iguales o diferentes en donde R1 y R2 son independientemente un enlace, una cadena de alquilo C1-C20 o C1-C6 saturada o insaturada en donde una o más unidades de metileno están opcional e independientemente reemplazadas por -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, C(O)O-, OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)₂-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, un grupo heterocíclico, un grupo arilo o un grupo heteroarilo, en donde cada vez que aparece R es independientemente hidrógeno, un grupo protector adecuado, un resto acilo, resto arilalquilo, resto alifático, resto arilo, resto heteroarilo o resto heteroalifático, cadena de poli(etilenglicol) (PEG) (PEG)₂, (PEG)a, (PEG)4, (PEG)a, (PEG)a,

(PEG)7, (PEG)b, (PEG)9, (PEG)io, (PEG)h , (PEG)i2, (PEG)ia, (PEG)-m, (PEG)i5, (PEG) 1a o (PEG)2 y en donde las líneas onduladas indican el enlace entre el enlazador y el grupo amino épsilon de la lisina en la posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina.

En donde m, n y o son cada uno independientemente 1 o 2; en donde p y q son independientemente 0, 1, 2, 3, 4 o 5 en donde las líneas onduladas indican el enlace entre el enlazador y el grupo amino épsilon de la lisina en la posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina.

En donde m, n y o son cada uno independientemente 1 o 2; en donde las líneas onduladas indican el enlace entre el enlazador y el grupo amino épsilon de la lisina en la posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina.

Un resto de unión puede comprender un enlazador bifuncional que puede conjugarse o unirse covalentemente o al grupo amino épsilon de los restos lisina de posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina primero y segundo que puede representarse por un ciclohexano-1,4 diacilo que tiene la siguiente fórmula general

y en donde las líneas onduladas indican el enlace entre el enlazador y el grupo amino épsilon de la lisina en la posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina.

En donde m y n son cada uno independientemente 0, 1 o 2 a condición de que tanto m como n no sean 0; R1 y R2 puede ser iguales o diferentes en donde R1 y R2 son independientemente un enlace, una cadena de alquilo C1-C20 o C1-C6 saturada o insaturada en donde una o más unidades de metileno están opcional e independientemente reemplazadas por -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, C(O)O-, OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)₂-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, un grupo heterocíclico, un grupo arilo o un grupo heteroarilo, en donde cada vez que aparece R es independientemente hidrógeno, un grupo protector adecuado, un resto acilo, resto arilalquilo, resto alifático, resto arilo, resto heteroarilo o resto heteroalifático, cadena de poli(etilenglicol) (PEG) (PEG)₂, (PEG)₃, (PEG)4, (PEG)5, (PEG)6, (PEG)7, (PEG)^b, (PEG)g, (PEG)10, (PEG)11, (PEG)12, (PEG)13, (PEG)14, (PEG)15, (PEG)16 o (PEG)₂y en donde las líneas onduladas indican el enlace entre el enlazador y el grupo amino épsilon de la lisina en la posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina.

En donde m y n son cada uno independientemente 1 o 2; en donde p y q son independientemente 0, 1, 2, 3, 4 o 5 en donde las líneas onduladas indican el enlace entre el enlazador y el grupo amino épsilon de la lisina en la posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina.

Un resto de unión puede comprender un enlazador bifuncional que puede conjugarse o unirse covalentemente o al grupo amino épsilon de los restos lisina de posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina primero y segundo que puede representarse por un 1,1 diacilo que tiene la siguiente fórmula general

en donde n es 1, 2, 3 o 4 en donde las líneas onduladas indican el enlace entre el enlazador y el grupo amino épsilon de la lisina en la posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina. El 1,1 diacilo puede tener una estructura seleccionada entre

(1,1 -diacil-C3; 1,2-diacil-C4; 1,1 -diacil-C5; y 1,1 -diacil-C6, respectivamente) en donde las líneas onduladas indican el enlace entre el enlazador y el grupo amino épsilon de la lisina en la posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina.

Un resto de unión puede comprender un enlazador bifuncional que puede conjugarse o unirse covalentemente o al grupo amino épsilon de los restos lisina de posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina primero y segundo que puede representarse por un 1,2 diacilo que tiene la siguiente fórmula general

en donde n es 1, 2, 3 o 4 en donde las líneas onduladas indican el enlace entre el enlazador y el grupo amino épsilon de la lisina en la posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina. El 1,2 diacilo puede tener una estructura seleccionada entre

(1,2-diacil-C3; 1,2-diacil-C4; 1,2-diacil-C5; y 1,2-diacil-C6, respectivamente) en donde las lineas onduladas indican el enlace entre el enlazador y el grupo amino épsilon de la lisina en la posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina.

Un resto de unión puede comprender un enlazador bifuncional que puede conjugarse o unirse covalentemente o al grupo amino épsilon de los restos lisina de posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina primero y segundo que puede representarse por un 1,3 diacilo que tiene la siguiente fórmula general

en donde n es 1,2 o 3 en donde las líneas onduladas indican el enlace entre el enlazador y el grupo amino épsilon de la lisina en la posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina. El 1,3 diacilo puede tener una estructura seleccionada entre

(1,3-diacil-C4; 1,3-diacil-C5; y 1,3-diacil-C6, respectivamente) en donde las líneas onduladas indican el enlace entre el enlazador y el grupo amino épsilon de la lisina en la posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina.

Un resto de unión puede comprender un enlazador bifuncional que puede conjugarse o unirse covalentemente o al grupo amino épsilon de los restos lisina de posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina primero y segundo que puede representarse por un 1,4 diacilo que tiene la siguiente fórmula general

(1,4-diacil-C6) en donde las líneas onduladas indican el enlace entre el enlazador y el grupo amino épsilon de la lisina en la posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina.

Un resto de unión puede comprender un enlazador bifuncional que puede conjugarse o unirse covalentemente o al grupo amino épsilon de los restos lisina de posición B29 o B28 de los polipéptidos de insulina primero y segundo que puede representarse por un ciclobutil-1,3 diacilo que tiene la siguiente fórmula general

Los polipéptidos de insulina primero y segundo pueden conjugarse entre sí usando cicloadición de azida-alquino Huisgen catalizada por cobre (CuAAc), en particular, la química clic de CuAAC. En este aspecto, el grupo amino épsilon de la lisina B29 o B28 del primer polipéptido de insulina está conjugado con un resto enlazador que tiene un extremo proximal y un extremo distal en donde el extremo proximal del resto enlazador está conjugado con el grupo amino épsilon y el distal comprende un grupo azida. En este aspecto, el grupo amino épsilon de la lisina B29 o B28 del segundo polipéptido de insulina está conjugado con un resto enlazador que tiene un extremo proximal y un extremo distal en donde el extremo proximal del resto enlazador está conjugado con el grupo amino épsilon y el distal comprende un grupo alquino. En presencia de Cu2+ y un agente reductor, los grupos azida y alquino formarán un resto de unión contiguo que comprende un resto triazol. Véase la patente de los EE.UU. N.° 8.129.542 para consultar una descripción de la química clic de CuAAC.

Un primer polipéptido de insulina puede tener conjugado con el grupo amino épsilon de la lisina B29 o B28 un enlazador que tiene la fórmula

y el segundo polipéptido de insulina puede tener conjugado con el grupo amino épsilon de la lisina B29 o B28 un enlazador que tiene la fórmula

En presencia de Cu2+ y un agente reductor, los enlazadores se combinan para proporcionar un resto de unión que tiene la estructura

en donde n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y el segundo polipéptido de insulina puede tener conjugado con el grupo amino épsilon de la lisina B29 o B28 un enlazador que tiene la fórmula

en donde n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En presencia de Cu2+ y un agente reductor, los enlazadores se combinan para proporcionar un resto de unión que tiene la estructura

en donde cada n es independientemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.

Tanto el primer polipéptido de insulina como el segundo polipéptido de insulina pueden tener conjugado con su respectivo grupo amino épsilon de la lisina B29 o B28 un enlazador que tiene la fórmula

en donde cada n es independientemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. La conjugación de los enlazadores para formar un resto de unión puede conseguirse proporcionando una molécula (enlazador intermedio o de puente) que tiene una estructura

en donde R es un enlace covalente, un átomo de carbono, un fenilo, un heteroátomo o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre el grupo que consiste en acilo, alifático, heteroalifático, arilo, heteroarilo y heterocíclico. R puede ser un grupo acilo C2, C3, C4, C6, C7, C8, C9 o C10 o un PEG2, PEG3, PEG4, PEG5, PEG6, PEG7, PEG8, PEG9, PEG10, PEG11, PEG12, PEG13 o PEG25.

N3-R-N3

en donde R es un enlace covalente, un átomo de carbono, un fenilo, un heteroátomo o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre el grupo que consiste en acilo, alifático, heteroalifático, arilo, heteroarilo y heterocíclico. En aspectos particulares, R es un grupo acilo C2, C3, C4, C6, C7, C8, C9 o C10 o un PEG2, PEG3, PEG4, PEG5, PEG6, PEG7, PEG8, PEG9, PEG10, PEG11, PEG12, PEG 13 o PEG 25.

Un primer polímero de insulina estar conjugado en el grupo amino épsilon de la lisina B29 o B28 con un enlazador terminado en azida como anteriormente y el segundo polipéptido de insulina puede estar conjugado en el grupo amino épsilon de la lisina B29 o B28 con un enlazador terminado con un resto ciclooctino y los enlazadores están conjugados para formar un resto enlazador usando química clic de cicloadición sin cobre. Véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. N.° 7.807.619.

La siguiente tabla muestra enlazadores de ejemplo, que pueden usarse para construir los dímeros. Los dímeros que se muestran comprenden grupos 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo para conjugar con el grupo amino épsilon de la lisina B29 o B29.

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

La conjugación de un enlazador bifuncional con el grupo amino épsilon del resto lisina en la posición B29 o B28 del polipéptido de cadena B de dos moléculas de insulina o análogo de insulina para formar el dímero de insulina unido por un resto de unión puede mostrarse esquemáticamente como

en donde las moléculas de insulina 1 e insulina 2 pueden ser iguales o diferentes y el enlazador bifuncional y el resto de unión resultante después de la conjugación pueden tener la estructura de cualquier enlazador y resto de unión resultante desvelados en el presente documento.

Modificación de polipéptidos de insulina

Al menos uno de los polipéptidos de cadena A o polipéptidos de cadena B del agonista parcial del receptor de insulina puede modificarse para comprender un grupo acilo. El grupo acilo puede estar unido covalentemente directamente a un aminoácido del polipéptido de insulina o indirectamente a un aminoácido del polipéptido de insulina a través de un espaciador, en donde el espaciador está ubicado entre el aminoácido del polipéptido de insulina y el grupo acilo. El polipéptido de insulina puede estar acilado en la misma posición de aminoácido donde se une un resto hidrófilo, o en una posición de aminoácido diferente. Por ejemplo, la acilación puede ocurrir en cualquier posición, incluyendo cualquier aminoácido de los polipéptidos de cadena A o B, así como una posición dentro del resto de unión, a condición de que la actividad presentada por el polipéptido de insulina no acilado se conserve tras la acilación. Los ejemplos no limitantes incluyen la acilación en las posiciones A1 de la cadena A y las posiciones B1 de la cadena B.

Un primer y/o segundo polipéptido de insulina (o derivado o conjugado del mismo) puede modificarse para comprender un grupo acilo por acilación directa de una amina, hidroxilo o tiol de una cadena lateral de un aminoácido del polipéptido de insulina. El primer y/o segundo polipéptido de insulina puede estar acilado directamente a través de la amina, hidroxilo o tiol de cadena lateral de un aminoácido. En este sentido, puede proporcionarse un polipéptido de insulina que se ha modificado mediante una o más sustituciones de aminoácidos en la secuencia del polipéptido de cadena A o B, incluyendo, por ejemplo, en las posiciones A1, A14, A15, B1, B10 o B22 o en cualquier posición del resto de unión con un aminoácido que comprende una amina, hidroxilo o tiol de cadena lateral.

Un espaciador entre el primer y/o segundo polipéptido de insulina y el grupo acilo puede ser un aminoácido que comprende una amina, hidroxilo o tiol de cadena lateral (o un dipéptido o tripéptido que comprende un aminoácido que comprende una amina, hidroxilo o tiol de cadena lateral. El espaciador puede comprender un espaciador bifuncional hidrófilo. El espaciador puede comprender un amino poli(alquiloxi)carboxilato. En este sentido, el espaciador puede comprender, por ejemplo, NH₂(CH₂CH₂O)n(CH₂)mCOOH, en donde m es cualquier número entero de 1 a 6 y n es cualquier número entero de 2 a 12, tales como, por ejemplo, ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico, que está disponible en el mercado de Peptides International, Inc. (Louisville, KY). Un espaciador bifuncional hidrófilo comprende dos o más grupos reactivos, por ejemplo, una amina, un hidroxilo, un tiol y un grupo carboxilo o cualquier combinación de los mismos. El espaciador bifuncional hidrófilo puede comprender un grupo hidroxilo y un carboxilato. Como alternativa, un espaciador bifuncional hidrófilo comprende un grupo amina y un carboxilato. Como alternativa, un espaciador bifuncional hidrófilo comprende un grupo tiol y un carboxilato.

Un espaciador entre el primer y/o segundo polipéptido de insulina y el grupo acilo puede ser un espaciador bifuncional hidrófobo. Se conocen en la técnica espaciadores bifuncionales hidrófobos. Véase, por ejemplo, Bioconjugate Techniques, G. T. Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, 1996). El espaciador bifuncional hidrófobo puede comprender dos o más grupos reactivos, por ejemplo, una amina, un hidroxilo, un tiol y un grupo carboxilo o cualquier combinación de los mismos. En particular, el espaciador bifuncional hidrófobo comprende un grupo hidroxilo y un carboxilato. Como alternativa, el espaciador bifuncional hidrófobo comprende un grupo amina y un carboxilato. Como alternativa, el espaciador bifuncional hidrófobo comprende un grupo tiol y un carboxilato. Se conocen en la técnica espaciadores bifuncionales hidrófobos adecuados que comprenden un carboxilato y un grupo hidroxilo o un grupo tiol e incluyen, por ejemplo, acido 8-hidroxioctanoico y ácido 8-mercaptooctanoico.

Un espaciador bifuncional puede ser un aminoácido sintético o de origen natural que comprende una cadena principal de aminoácidos que tiene de 3 a 10 átomos de longitud (por ejemplo, ácido 6-amino hexanoico, ácido 5-aminovalérico, ácido 7-aminoheptanoico y ácido 8-aminooctanoico). Como alternativa, el espaciador puede ser un espaciador dipeptídico o tripeptídico que tiene una cadena principal peptídica que tiene de 3 a 10 átomos (por ejemplo, 6 a 10 átomos) de longitud. Cada aminoácido del espaciador dipeptídico o tripeptídico unido al polipéptido de insulina puede seleccionarse independientemente entre el grupo que consiste en: aminoácidos de origen natural y/o de origen no natural, incluyendo, por ejemplo, cualesquiera de los isómeros D o L de los aminoácidos de origen natural (Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr) o cualesquiera isómeros D o L de los aminoácidos de origen no natural seleccionados entre el grupo que consiste en: p-alanina (p-Ala), N-a-metil-alanina (Me-Ala), ácido aminobutírico (Abu), ácido a-aminobutírico (Y-Abu), ácido aminohexanoico (£-Ahx), ácido aminoisobutírico (Aib), ácido aminometilpirrol carboxílico, ácido aminopiperidinacarboxílico, aminoserina (Ams), ácido aminotetrahidropiran-4-carboxílico, arginina N-metoxi-N-metil amida, ácido p-aspártico (p-Asp), ácido azetidina carboxílico, 3-(2-benzotiazolil)alanina, a-terc-butilglicina, ácido 2-amino-5-ureido-n-valérico (citrulina, Cit), p-Ciclohexilalanina (Cha), acetamidometil-cisteína, ácido diaminobutanoico (Dab), ácido diaminopropiónico (Dpr), dihidroxifenilalanina (DOPA), dimetiltiazolidina (DMTA), ácido Y-glutámico (Y-Glu), homoserina (HSe), hidroxiprolina (Hyp), isoleucina N-metoxi-N-metil amida, metil-isoleucina (Melle), ácido isonipecótico (Isn), metil-leucina (MeLeu), metil-lisina, dimetil-lisina, trimetil-lisina, metanoprolina, metionina-sulfóxido (Met(O)), metionina-sulfona (Met(O2 )), norleucina (Nle), metil-norleucina (Me-Nle), norvalina (Nva), ornitina (Orn), ácido para-aminobenzoico (PABA), penicilamina (Pen), metilfenilalanina (MePhe), 4-Clorofenilalanina (Phe(4-Cl)), 4-fluorofenilalanina (Phe(4-F)), 4-nitrofenilalanina (Phe(4- O₂₂)), 4-cianofenilalanina ((Phe(4-CN)), fenilglicina (Phg), piperidinilalanina, piperidinilglicina, 3,4-deshidroprolina, pirrolidinilalanina, sarcosina (Sar), selenocisteína (Sec), U-Bencil-fosfoserina, ácido 4-amino-3-hidroxi-6-metilheptanoico (Sta), ácido 4-amino-5-ciclohexil-3-hidroxipentanoico (ACHPA), ácido 4-amino-3-hidroxi-5-fenilpentanoico (AHPPA), ácido 1,2,3,4,-tetrahidro-isoquinolina-3-carboxílico (Tic), tetrahidropiranglicina, tienilalanina (Thi), U-Bencil-fosfotirosina, O-fosfotirosina, metoxitirosina, etoxitirosina, O-(bis-dimetilamino-fosfono)-tirosina, sulfato de tirosina tetrabutilamina, metil-valina (MeVal), ácido 1-amino-1-ciclohexano carboxílico (Acx), ácido aminovalérico, beta-ciclopropil-alanina (Cpa), propargilglicina (Prg), alilglicina (Alg), ácido 2-amino-2-ciclohexil-propanoico (2-Cha), tercbutilglicina (Tbg), vinilglicina (Vg), ácido 1-amino-1-ciclopropano carboxílico (Acp), ácido 1-amino-1-ciclopentano carboxílico (Acpe), ácido 3-mercaptopropiónico alquilado, ácido 1-amino-1-ciclobutano carboxílico (Acb). Un espaciador dipeptídico puede seleccionarse entre el grupo que consiste en: Ala-Ala, p-Ala-p-Ala, Leu-Leu, Pro-Pro, ácido Y-aminobutírico-ácido Y-aminobutírico y y-GIu-y-GIu.

El primer y/o segundo polipéptido de insulina puede modificarse para comprender un grupo acilo por acilación de un alcano de cadena larga. El alcano de cadena larga puede comprender un grupo amina, hidroxilo o tiol (por ejemplo, octadecilamina, tetradecanol y hexadecanotiol) que reacciona con un grupo carboxilo, o una forma activada del mismo, del polipéptido de insulina. El grupo carboxilo, o forma activada del mismo, del polipéptido de insulina puede ser parte de una cadena lateral de un aminoácido (por ejemplo, ácido glutámico, ácido aspártico) del polipéptido de insulina o puede ser parte de la cadena principal del péptido.

Un primer y/o segundo polipéptido de insulina puede modificarse para comprender un grupo acilo por acilación del alcano de cadena larga mediante un espaciador que se une al polipéptido de insulina. El alcano de cadena larga puede comprender un grupo amina, hidroxilo o tiol que reacciona con un grupo carboxilo, o una forma activada del mismo, del espaciador. En el presente documento se describen espaciadores adecuados que comprenden un grupo carboxilo, o forma activada del mismo, e incluyen, por ejemplo, espaciadores bifuncionales, por ejemplo, aminoácidos, dipéptidos, tripéptidos, espaciadores bifuncionales hidrófilos y espaciadores bifuncionales hidrófobos. Como se usa en el presente documento, la expresión "forma activada de un grupo carboxilo" se refiere a un grupo carboxilo con la fórmula general R(C=O)X, en donde X es un grupo saliente y R es el polipéptido de insulina o el espaciador. Por ejemplo, las formas activadas de un grupo carboxilo pueden incluir, pero sin limitación, cloruros, anhídridos y ésteres de acilo. El grupo carboxilo activado puede ser un éster con un grupo saliente de N-hidroxisuccinimida (NHS).

Cuando un alcano de cadena larga es acilado por el péptido, el polipéptido de insulina o el espaciador, el alcano de cadena larga puede ser de cualquier tamaño y puede comprender cualquier longitud de cadena de carbono. El alcano de cadena larga puede ser lineal o ramificado. El alcano de cadena larga puede ser un alcano C4 a C30. Por ejemplo, el alcano de cadena larga puede ser cualquiera de un alcano C4, alcano Ce, alcano C8, alcano C10, alcano C12, alcano C14, alcano Cíe, alcano cis, alcano C20, alcano C22, alcano C24, alcano C26, alcano C28 o un alcano C30. El alcano de cadena larga puede comprender un alcano C8 a C20, por ejemplo, un alcano C14, alcano Cíe o un alcano Cis.

Un grupo amina, hidroxilo o tiol del primer y/o segundo polipéptido de insulina puede estar acilado con un ácido de colesterol. El péptido puede unirse al ácido del colesterol a través de un espaciador de Cis des-amino alquilado, es decir, un espaciador de ácido 3-mercaptopropiónico alquilado. Se conocen en la técnica métodos adecuados de acilación de péptidos a través de aminas, hidroxilos y tioles. Véase, por ejemplo, Miller, Biochem Biophys Res Commun 218: 377-382 (1996); Shimohigashi y Stammer, Int J Pept Protein Res 19: 54-62 (1982); y Previero et al., Biochim Biophys Acta 263: 7-13 (1972) (para consultar métodos de acilación a través de un hidroxilo); y San y Silvio, J Pept Res 66: 169-180 (2005) (para consultar métodos de acilación a través de un tiol); Bioconjugate Chem. "Chemical Modifications of Proteins: History and Applications" páginas 1, 2-12 (1990); Hashimoto et al., Pharmacuetical Res. "Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity Vol. 6, N.°: 2 págs. 171-176 (1989).

El grupo acilo del péptido acilado del primer y/o segundo polipéptido de insulina puede ser de cualquier tamaño, por ejemplo, cadena de carbono de cualquier longitud, y puede ser lineal o ramificada. El grupo acilo puede ser un ácido graso C4 a C30. Por ejemplo, el grupo acilo puede ser cualquiera de un ácido graso C4, ácido graso C6, ácido graso C8, ácido graso C10, ácido graso C12, ácido graso C14, ácido graso C16, ácido graso C18, ácido graso C20, ácido graso C22, ácido graso C24, ácido graso C26, ácido graso C28 o un ácido graso C30. El grupo acilo puede ser un ácido graso C8 a C20, por ejemplo, un ácido graso C14 o un ácido graso C16. El grupo acilo puede ser urea.

Como alternativa, un grupo acilo es un ácido biliar. El ácido biliar puede ser cualquier ácido biliar adecuado, incluyendo, pero sin limitación, ácido cólico, ácido quenodesoxicólico, ácido desoxicólico, ácido litocólico, ácido taurocólico, ácido glucocólico y ácido de colesterol.

El primer y/o segundo polipéptido de insulina acilado descrito en el presente documento puede modificarse adicionalmente para comprender un resto hidrófilo. El resto hidrófilo puede comprender una cadena de polietilenglicol (PEG). La incorporación de un resto hidrófilo puede conseguirse a través de cualquier medio adecuado, tal como cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. El análogo de una sola cadena acilado puede comprender un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en una Cys, Lys, Orn, homo-Cys o Ac-Phe, y la cadena lateral del aminoácido está unida covalentemente a un resto hidrófilo (por ejemplo, PEG). El grupo acilo puede estar unido a la posición A1, A14, A15, B1, B2, B10 o B22 (de acuerdo con la numeración de aminoácidos de las cadenas A y B de la insulina nativa), opcionalmente a través de un espaciador que comprende Cys, Lys, Orn, homo-Cys o Ac-Phe.

Como alternativa, el primer y/o segundo polipéptido de insulina acilado comprende un espaciador, en donde el espaciador está tanto acilado como modificado para comprender el resto hidrófilo. Los ejemplos no limitantes de espaciadores adecuados incluyen un espaciador que comprende uno o más aminoácidos seleccionados entre el grupo que consiste en Cys, Lys, Orn, homo-Cys y Ac-Phe.

El extremo amino de al menos un aminoácido N terminal de al menos uno de los polipéptidos de cadena A y los polipéptidos de cadena B del agonista parcial del receptor de insulina puede modificarse para comprender un sustituyente. El sustituyente puede estar unido covalentemente directamente al grupo amino del aminoácido N-terminal o indirectamente al grupo amino a través de un espaciador, en donde el espaciador está ubicado entre el grupo amino del aminoácido N-terminal del polipéptido de insulina y el sustituyente. El sustituyente puede ser un resto acilo como se ha analizado anteriormente. El sustituyente puede tener la fórmula general RC(O)-, donde R puede ser R'CH₂, R'NH, R'O y R' pueden ser H, cadena de alquilo lineal, aminoácido, péptido, polietilenglicol (PEG), sacáridos, que en aspectos particulares RC(O)- puede ser acetilo, fenilacetilo, carbamαlo, N-alquil carbamαlo o alcoxicarbonilo. Un sustituyente puede ser un grupo carbamoílo, grupo acetilo, glicina, grupo metilo, grupo metoxi, grupo dimetilo, grupo isobutilo, grupo PEG1 o grupo PEG2 (véanse los Ejemplos en el presente documento para consultar estructuras de los sustituyentes). Oimoni et al., Nephron 46: 63-66 (1987) han desvelado la carbamolización de la insulina y se han desvelado dímeros de insulina que comprenden grupos carbamoílo en el extremo N en la solicitud PCT publicada N.° WO2014052451 (por ejemplo, MIU-90).

Al menos un aminoácido N-terminal puede estar conjugado a través del nitrógeno N2 con un sustituyente que comprende un éster de N-hidroxisuccinimida unido a un grupo que tiene la fórmula general RC(O)-, donde R puede ser R'CH₂, R'NH, R'O y R' pueden ser H, cadena de alquilo lineal, aminoácido, péptido, polietilenglicol (PEG), sacáridos, que en aspectos particulares RC(O)- puede ser acetilo, fenilacetilo, carbamαlo, N-alquil carbamαlo o alcoxicarbonilo. El sustituyente puede ser un grupo carbamαlo, grupo acetilo, glicina, grupo metilo, grupo metoxi, grupo dimetilo, grupo isobutilo, grupo PEG1 o grupo PEG2.

Un sacárido unido covalentemente a uno o más extremos amino de los polipéptidos de insulina primero y segundo puede ser un monosacárido, véase, por ejemplo, el Dímero 51. El sacárido puede comprender uno o más grupos amina. El sacárido y el grupo amina pueden estar separados por un grupo alquilo C1-C6, por ejemplo, un grupo alquilo C1-C3. El sacárido puede ser aminoetilglucosa (AEG). Un ligando de sacárido puede tener la configuración "D". Como alternativa, un ligando de sacárido tiene la configuración "L". A continuación se muestran las estructuras de estos sacáridos de ejemplo. Los expertos en la materia reconocerán otros sacáridos de ejemplo.

En general, los sacáridos pueden estar conjugados directa o indirectamente a través de un enlazador con el extremo amino de uno o más de los polipéptidos de insulina primero y segundo. En aspectos particulares, el enlazador es un alquildioílo, -C(O)(CH₂)nC(O)-, en donde n = 0-45, 0-20, 0-10 o 0-5.

Los sustituyentes de ejemplo conjugados con el grupo amino N-terminal pueden ser

en donde la línea ondulada indica el enlace entre el sustituyente y el grupo amino N-term¡nal. El sustituyente también puede ser

en donde la línea ondulada indica el enlace entre Me2 y el carbono alfa del aminoácido N-terminal.

Dímeros de insulina de ejemplo

En el presente documento se describen dímeros de insulina en donde una primera Lys B29 o B28 de una primera molécula de heterodímero de insulina que tiene un primer polipéptido de cadena A y un primer polipéptido de cadena B y una segunda Lys B29 o B28 de un segundo heterodímero de insulina que tiene un segundo polipéptido de cadena A y un segundo polipéptido de cadena B están conjugados entre sí mediante un enlazador bifuncional seleccionado entre el grupo que consiste en Enlazador 1, Enlazador 2, Enlazador 3 , Enlazador 10, Enlazador 11, Enlazador 12, Enlazador 13, Enlazador 14, Enlazador 15, Enlazador 16, Enlazador 17, Enlazador 18, Enlazador 19, Enlazador 20, Enlazador 21, Enlazador 22, Enlazador 23, Enlazador 24, Enlazador 25, Enlazador 26, Enlazador 27, Enlazador 28, Enlazador 29, Enlazador 30, Enlazador 31, Enlazador 32, Enlazador 33, Enlazador 34, Enlazador 35, Enlazador 36, Enlazador 37, Enlazador 38, Enlazador 39, Enlazador 40, Enlazador 41, Enlazador 42, Enlazador 43, Enlazador 44, Enlazador 45, Enlazador 46, Enlazador 47, Enlazador 48, Enlazador 49 y Enlazador 50 a condición de que cuando el enlazador bifuncional es Enlazador 10, Enlazador 11, Enlazador 12, Enlazador 13 o Enlazador 14, al menos uno de los polipéptidos de cadena A o cadena B primero o segundo esté conjugado en su aminoácido N-terminal con un sustituyente como se desvela en el presente documento o al menos los aminoácidos N-terminales de la primera molécula de heterodímero de insulina estén conjugados con un sustituyente como se desvela en el presente documento o los aminoácidos N-terminales tanto del primer heterodímero de insulina como del segundo heterodímero de insulina estén conjugados con un sustituyente. El sustituyente puede comprender un éster de N-hidroxisuccinimida unido a un grupo que tiene la fórmula general RC(O)-, donde R puede ser R'CH₂, R'NH, R'O y R' pueden ser H, cadena de alquilo lineal, aminoácido, péptido, polietilenglicol (PEG), sacáridos, que en aspectos particulares RC(O)- puede ser acetilo, fenilacetilo, carbamoílo, N-alquil carbamoílo o alcoxicarbonilo. El sustituyente puede ser un grupo carbamoílo, grupo acetilo, glicina, grupo metilo, grupo metoxi, grupo dimetilo, grupo isobutilo, grupo PEG1, grupo AEG, grupo alquilo AEG-C6 o grupo PEG2.

En el presente documento se describen dímeros de insulina en donde una primera Lys B29 o B28 de una primera molécula de heterodímero de insulina que tiene un primer polipéptido de cadena A y un primer polipéptido de cadena B está conjugada con un primer enlazador seleccionado entre el grupo que consiste en Enlazador 5 y Enlazador 7 y una segunda Lys B29 o B28 de un segundo heterodímero de insulina que tiene un segundo polipéptido de cadena A y un segundo polipéptido de cadena B está conjugada con un segundo enlazador seleccionado entre el grupo que consiste en Enlazador 4, Enlazador 6, Enlazador 8 y Enlazador 9 , están conjugados entre sí a través del primer enlazador y el segundo enlazador. Al menos uno de los polipéptidos de cadena A o cadena B primero o segundo puede estar conjugado en su aminoácido N-terminal con un sustituyente como se desvela en el presente documento o al menos los aminoácidos N-terminales de la primera molécula de heterodímero de insulina están conjugados con un sustituyente como se desvela en el presente documento o los aminoácidos N-terminales tanto del primer heterodímero de insulina como del segundo heterodímero de insulina están conjugados con un sustituyente. El sustituyente puede comprender un éster de N-hidroxisuccinimida unido a un grupo que tiene la fórmula general RC(O)-, donde R puede ser R'CH₂, R'NH, R'O y R' pueden ser H, cadena de alquilo lineal, aminoácido, péptido, polietilenglicol (PEG), sacáridos, que en aspectos particulares RC(O)- puede ser acetilo, fenilacetilo, carbamαlo, N-alquil carbamαlo o alcoxicarbonilo. El sustituyente puede ser un grupo carbamαlo, grupo acetilo, glicina, grupo metilo, grupo metoxi, grupo dimetilo, grupo isobutilo, grupo PEG1, grupo AEG, grupo alquilo AEG-C6 o grupo PEG2.

En el presente documento se describen dímeros de insulina en donde una primera Lys B29 o B28 de una primera molécula de heterodímero de insulina que tiene un primer polipéptido de cadena A y un primer polipéptido de cadena B está conjugada con un primer enlazador seleccionado entre el grupo que consiste en Enlazador 5 y Enlazador 7 y una segunda Lys B29 o B28 de un segundo heterodímero de insulina que tiene un segundo polipéptido de cadena A y un segundo polipéptido de cadena B está conjugada con un segundo enlazador seleccionado entre el grupo que consiste en Enlazador 5 y Enlazador 7, en donde los enlazadores primero y segundo están conjugados entre sí a través de un enlazador de puente que tiene una estructura

en donde R es un enlace covalente, un átomo de carbono, un fenilo, un heteroátomo o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre el grupo que consiste en acilo, alifático, heteroalifático, arilo, heteroarilo y heterocíclico. R puede ser un grupo acilo C2, C3, C4, C6, C7, C8, C9 o C10 o un PEG2, PEG3, PEG4, PEG5, PEG6, PEG7, PEG8, ^pE^g9, PEG10, PEG11, PEG12, PEG13 o PEG25. Al menos uno de los polipéptidos de cadena A o cadena B primero o segundo puede estar conjugado en su aminoácido N-terminal con un sustituyente como se desvela en el presente documento o al menos los aminoácidos N-terminales de la primera molécula de heterodímero de insulina están conjugados con un sustituyente como se desvela en el presente documento o los aminoácidos N-terminales tanto del primer heterodímero de insulina como del segundo heterodímero de insulina están conjugados con un sustituyente. El sustituyente puede comprender un éster de N-hidroxisuccinimida unido a un grupo que tiene la fórmula general RC(O)-, donde R puede ser R'CH₂, R'NH, R'O y R' pueden ser H, cadena de alquilo lineal, aminoácido, péptido, polietilenglicol (PEG), sacáridos, que en aspectos particulares RC(O)- puede ser acetilo, fenilacetilo, carbamαlo, N-alquil carbamαlo o alcoxicarbonilo. El sustituyente puede ser un grupo carbamαlo, grupo acetilo, glicina, grupo metilo, grupo metoxi, grupo dimetilo, grupo isobutilo, grupo PEG1, grupo AEG, grupo alquilo AEG-C6 o grupo PEG2.

En el presente documento se describen dímeros de insulina en donde una primera Lys B29 o B28 de una primera molécula de heterodímero de insulina que tiene un primer polipéptido de cadena A y un primer polipéptido de cadena B está conjugada con un primer enlazador seleccionado entre el grupo que consiste en Enlazador 4, Enlazador 6, Enlazador 8, y Enlazador 9 y una segunda Lys B29 o B28 de un segundo heterodímero de insulina que tiene un segundo polipéptido de cadena A y un segundo polipéptido de cadena B está conjugada con un segundo enlazador seleccionado entre el grupo que consiste en Enlazador 4, Enlazador 6, Enlazador 8, y Enlazador 9, en donde los enlazadores primero y segundo están conjugados entre sí a través de un enlazador de puente que tiene una estructura

N3-R-N3

en donde R es un enlace covalente, un átomo de carbono, un fenilo, un heteroátomo o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre el grupo que consiste en acilo, alifático, heteroalifático, arilo, heteroarilo y heterocíclico. R puede ser un grupo acilo C2, C3, C4, C6, C7, C8, C9 o C10 o un PEG2, PEG3, PEG4, PEG5, PEG6, PEG7, PEG8, ^pEg 9, PEG10, PEG11, PEG12, PEG 13 o PEG 25. Al menos uno de los polipéptidos de cadena A o cadena B primero o segundo puede estar conjugado en su aminoácido N-terminal con un sustituyente como se desvela en el presente documento o al menos los aminoácidos N-terminales de la primera molécula de heterodímero de insulina están conjugados con un sustituyente como se desvela en el presente documento o los aminoácidos N-terminales tanto del primer heterodímero de insulina como del segundo heterodímero de insulina están conjugados con un sustituyente. El sustituyente puede comprender un éster de N-hidroxisuccinimida unido a un grupo que tiene la fórmula general RC(O)-, donde R puede ser R'CH₂, R'NH, R'O y R' pueden ser H, cadena de alquilo lineal, aminoácido, péptido, polietilenglicol (PEG), sacáridos, que en aspectos particulares RC(O)- puede ser acetilo, fenilacetilo, carbamαlo, N-alquil carbamαlo o alcoxicarbonilo. En aspectos particulares, el sustituyente es un grupo carbamαlo, grupo acetilo, glicina, grupo metilo, grupo metoxi, grupo dimetilo, grupo isobutilo, grupo PEG1, grupo a Eg , grupo alquilo AEG-C6 o grupo PEG2.

Un primer y segundo heterodímero de insulina pueden comprender cualquiera de las moléculas de insulina o análogo de insulina desveladas en el presente documento.

Los dímeros de insulina pueden seleccionarse de

Dímero 1;

Dímero 2;

Dímero 3;

Dímero 4;

Dímero 5;

Dímero 6;

Dímero 9;

Dímero 12;

10

Dímero 24;

5

5

Dímero 46;

Dímero 85;

Dímero 88;

Dímero 91;

En donde las uniones disulfuro entre los restos Cys6 y Cys11 del polipéptido de cadena A y las uniones disulfuro entre el Cys7 y Cys2o de la cadena A al Cys7 y Cys19 del polipéptido de cadena B, respectivamente, están representadas por la línea continua entre ellas; en donde los restos de unión están unidos covalentemente al aminoácido épsilon del resto lisina que se muestra, en donde el polipéptido de cadena A para los Dímeros 1-40, 42-52, 54-86 y 88-94 tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEQ ID NO: 1; el polipéptido de cadena A para el Dímero 56 tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra para el SEQ ID NO: 11; el polipéptido de cadena B para los Dímeros 1 17, 21-27, 36, 37, 39-40 y 42-52, 54-82, 84-86 y 88-94 tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEQ ID NO: 2; el polipéptido de cadena B para los Dímeros 18 y 32-35 tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEQ ID NO: 6; el polipéptido de cadena B para los Dímeros 19 y 83 tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEQ ID NO: 9; el polipéptido de cadena B para los Dímeros 20, 28-31 y 38 tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEQ ID NO: 10; y el polipéptido de cadena A y el polipéptido de cadena B para los Dímeros 53 y 87 son el SEQ ID NO: 7 y el SEQ ID NO: 8, respectivamente.

Composiciones farmacéuticas

De acuerdo con una realización, se proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los dímeros de insulina novedosos desvelados en el presente documento, preferentemente con un nivel de pureza de al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 %, y un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones pueden contener un dímero de insulina como se describe en el presente documento a una concentración de al menos 0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 11 mg/ml, 12 mg/ml, 13 mg/ml, 14 mg/ml, 15 mg/ml, 16 mg/ml, 17 mg/ml, 18 mg/ml, 19 mg/ml, 20 mg/ml, 21 mg/ml, 22 mg/ml, 23 mg/ml, 24 mg/ml, 25 mg/ml o superior. En una realización, las composiciones farmacéuticas comprenden soluciones acuosas que se esterilizan y, opcionalmente, se almacenan contenidas dentro de diversos recipientes. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden un polvo liofilizado. Las composiciones farmacéuticas pueden envasarse además como parte de un kit que incluye un dispositivo desechable para administrar la composición a un paciente. Los recipientes o kits pueden etiquetarse para su almacenamiento a temperatura ambiente o a temperatura refrigerada.

Se cree que los dímeros de insulina desvelados son adecuados para cualquier uso que se haya descrito anteriormente para los péptidos de insulina. En consecuencia, los dímeros de insulina desvelados en el presente documento pueden usarse para tratar la hiperglucemia o tratar otras enfermedades metabólicas que son resultado de niveles altos de glucosa en sangre. En consecuencia, la presente invención abarca composiciones farmacéuticas que comprenden dímeros de insulina como se desvelan en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable para su uso en el tratamiento de un paciente que padece niveles altos de glucosa en sangre. De acuerdo con una realización, el paciente que ha de tratarse usando un dímero de insulina desvelado en el presente documento es un animal doméstico y, en otra realización, el paciente que ha de tratarse es un ser humano.

Un método de tratamiento de la hiperglucemia de acuerdo con la presente divulgación comprende las etapas de administrar los dímeros de insulina desvelados en el presente documento a un paciente usando cualquier vía convencional de administración, incluyendo por vía parenteral, tal como por vía intravenosa, por vía intraperitoneal, por vía subcutánea o por vía intramuscular, por vía intratecal, por vía transdérmica, por vía rectal, por vía oral, por vía nasal o por inhalación. En una realización, la composición se administra por vía subcutánea o por vía intramuscular. En una realización, la composición se administra por vía parenteral y el polipéptido de insulina, o un derivado profármaco del mismo, se preenvasa en una jeringuilla.

Los dímeros de insulina desvelados en el presente documento pueden administrarse solos o en combinación con otros agentes antidiabéticos. Los agentes antidiabéticos conocidos en la técnica o en investigación incluyen insulina nativa, glucagón nativo y análogos funcionales de los mismos, sulfonilureas, tales como tolbutamida (Orinase), acetohexamida (Dymelor), tolazamida (Tolinase), clorpropamida (Diabinese), glipizida (Glucotrol), gliburida (Diabeta, Micronasa, Glynasa), glimepirida (Amaryl) o gliclazida (Dimicron); meglitinidas, tales como repaglinida (Prandin) o nateglinida (Starlix); bisguanidas tales como metformina (Glucophage) o fenformina; tiazolidinadionas tales como rosiglitazona (Avandia), pioglitazona (Actos) o troglitazona (Rezulin), u otros inhibidores de PPARy; inhibidores de la alfa glucosidasa que inhiben la digestión de hidratos de carbono, tales como miglitol (Glyset), acarbosa (Precose/Glucobay); exenatida (Byetta) o pramlintida; inhibidores de la dipeptidil peptidasa-4 (DPP-4) tales como vildagliptina o sitagliptina; inhibidores de s GlT (transportador de glucosa dependiente de sodio 1); o inhibidores de FBPasa (fructosa 1,6-bisfosfatasa).

Las composiciones farmacéuticas que comprenden los dímeros de insulina desvelados en el presente documento pueden formularse y administrarse a pacientes usando vehículos farmacéuticamente aceptables convencionales y vías de administración conocidas por los expertos en la materia. En consecuencia, la presente divulgación también abarca composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los dímeros de insulina desvelados en el presente documento, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas que comprenden los dímeros de insulina desvelados en el presente documento pueden contener opcionalmente iones de cinc, conservantes (por ejemplo, fenol, cresol, parabenos), agentes isotónicos (por ejemplo, manitol, sorbitol, lactosa, dextrosa, trehalosa, cloruro de sodio, glicerol), sustancias tamponantes, sales, ácidos y álcalis y también excipientes adicionales. Estas sustancias pueden estar presentes en cada caso individualmente o alternativamente como mezclas. Hay presente habitualmente glicerol, dextrosa, lactosa, sorbitol y manitol en la preparación farmacéutica en una concentración de 100-250 mM, NaCl en una concentración de hasta 150 mM. Hay presentes sustancias tamponantes, tales como, por ejemplo, tampón de fosfato, acetato, citrato, arginina, glicilglicina o TRIS (es decir, 2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol) y las sales correspondientes, a una concentración de 5-250 mM, habitualmente de aproximadamente 10-100 mM. Pueden ser excipientes adicionales, entre otros, sales o arginina.

En una realización, la composición farmacéutica comprende una concentración de 1 mg/ml del dímero de insulina a un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 7,0 en un sistema tampón de fosfato. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender el dímero de insulina como único componente farmacéuticamente activo, o el dímero de insulina puede combinarse con uno o más agentes activos adicionales.

Todos los métodos terapéuticos, las composiciones farmacéuticas, los kits y otras realizaciones similares descritos en el presente documento contemplan que los dímeros de insulina incluyen todas las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

En una realización, el kit se proporciona con un dispositivo para administrar la composición de dímeros de insulina a un paciente. El kit puede incluir además diversos recipientes, por ejemplo, viales, tubos, frascos y similares. Preferentemente, el kit también incluirá instrucciones de uso. De acuerdo con una realización, el dispositivo del kit es un dispositivo dispensador de aerosol, en donde la formulación se preenvasa dentro del dispositivo de aerosol. En otra realización, el kit comprende una jeringuilla y una aguja, y en una realización, la composición de dímero de insulina se preenvasa dentro de la jeringuilla.

Los compuestos de la presente invención pueden prepararse mediante métodos de síntesis convencionales, técnicas de ADN recombinante o cualquier otro método de preparación de péptidos y proteínas de fusión. Aunque determinados aminoácidos no naturales no pueden expresarse mediante técnicas de ADN recombinante convencionales, en la técnica se conocen técnicas para su preparación. Los compuestos de la presente invención que abarcan porciones no peptídicas pueden sintetizarse mediante reacciones de química orgánica convencionales, además de las reacciones químicas de péptidos convencionales cuando corresponda.

Los siguientes ejemplos pretenden promover una mayor comprensión de la presente invención.

Ejemplos

Procedimientos generales

Todos los productos químicos se adquirieron de fuentes comerciales, a menos que se indique otra cosa. Las reacciones se realizaron por lo general a temperatura ambiental o a temperatura ambiente a menos que se indique otra cosa. Las reacciones sensibles a la humedad o al aire se realizaron en una atmósfera de nitrógeno o argón usando disolventes y reactivos anhidros. El progreso de las reacciones se controló mediante cromatografía de capa fina analítica (CCF) y cromatografía de líquidos de ultra rendimiento-espectrometría de masas (UPLC-EM). La CCF se realizó en placas de CCF de E. Merck prerrecubiertas con gel de sílice 60F-254, espesor de capa 0,25 mm. Las placas se visualizaron usando UV de 254 nm y/o por exposición a soluciones de tinción de molibdato de amonio y cerio (CAM) o p-anisaldehído seguidas de carbonización. La cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) se realizó en un sistema Waters Acquity™ UPLC®.

Método A de UPLC-EM: Columna Waters Acquity™ UPLC® BEH C18 1,7 μm 1,0x50 mm con gradiente 10:90-95:5 v/v CH₃CN/H₂O v TFA al 0,05 % durante 2,0 min; caudal 0,3 ml/min, longitud de onda UV 215 nm; UPLC-EM;

Método B: Columna Waters Acquity™ UPLC® BEH C18 1,7 μm 2,1x100 mm con gradiente 60:40-100:0 v/v CH₃CN/H₂O v TFA al 0,05 % durante 4,0 min y 100:0-95:5 v/v CH₃CN/H₂O v TFA al 0,05 % durante 40 s; caudal 0,3 ml/min, longitud de onda UV 200-300 nm; u PlC-EM;

Método C: Columna Waters Acquity™ UPLC® BEH C18 1,7 μm 2,1x100 mm con gradiente 20:80-90:10 v/v CH₃CN/H₂O v TFA al 0,05 % durante 4,0 min y 90:10-95:5 v/v CH₃CN/H₂O v TFA al 0,05 % durante 0,5 min; caudal 0,3 ml/min, longitud de onda UV 200-300 nm; UPLC-EM;

Método D: Columna Waters Acquity™ UPLC® BEH C81,7 μm 2,1x100 mm con gradiente 10:90-55:45 v/v CH₃CN/H₂O v TFA al 0,05 % durante 4,0 min y 55:45-95:5 v/v CH₃CN/H₂O v TFA al 0,05 % durante 40 s; caudal 0,3 ml/min, longitud de onda UV 200-300 nm; UPLC-EM;

Método E: Columna Waters Acquity™ UPLC® BEH300 C4 1,7 μm 2,1x100 mm con gradiente 10:90-50:50 v/v CH₃CN/H₂O v TFA al 0,05 % durante 4,3 min y 50:50-70:30 v/v CH₃CN/H₂O v TFA al 0,05 % durante 0,5 min; caudal 0,3 ml/min, longitud de onda UV 200-300 nm; UPLC-EM;

Método F: Columna Waters Acquity™ UPLC® BEH C8 1,7 μm 2,1x100 mm con gradiente 20:80-72,5:27,5 v/v CH₃CN/H₂O v TFA al 0,05 % durante 4,3 min y 72,5:27,5-95:5 v/v CH₃CN/H₂O v TFA al 0,05 % durante 0,5 min; caudal 0,3 ml/min, longitud de onda UV 200-300 nm y UPLC-EM;

Método G: Columna Waters Acquity™ UPLC® BEH C81,7 μm 2,1x100 mm con gradiente 20:80-90:10 v/v CH₃CN/H₂O v TFA al 0,1 % durante 4,0 min y 90:10-95:5 v/v CH₃CN/H₂O v TFA al 0,1 % durante 0,4 min; caudal 0,3 ml/min, longitud de onda UV 200-300 nm.

El análisis de masas se realizó en un detector Waters SQ con ionización por electronebulización en modo de detección de iones positivos y el intervalo de barrido de la relación masa-carga fue de 170-900 o un Waters Micromass® LCT Premier™ XE con ionización por electronebulización en modo de detección de iones positivos y el intervalo de exploración de la relación masa-carga fue de 300-2000. La identificación de los conjugados de insulina producidos o APRI se confirmó comparando el peso molecular teórico con el valor experimental que se midió usando UPLC-EM. Para la determinación de las posiciones de unión, específicamente, los dímeros de insulina se sometieron a tratamiento con DTT (para la cadena a/b) o digestión con Glu-C (con o sin reducción y alquilación), y después los péptidos resultantes se analizaron mediante CL-EM. Basándose en las masas medidas, se dedujeron las posiciones de unión.

La cromatografía ultrarrápida se realizó usando un aparato de cromatografía ultrarrápida Biotage (Dyax Corp.) o un instrumento de Rf CombiFlash®(Teledyne Isco). La cromatografía en fase normal se realizó en gel de sílice (20-70 μm, tamaño de poro 60 A) en cartuchos precargados del tamaño indicado. La cromatografía de intercambio iónico se realizó en un material a base de sílice con un recubrimiento adherido de una poli(2-sulfoetil aspartamida) hidrófila y aniónica (columna PolySULFOETHYL A, PolyLC Inc., 250x21 mm, 5 μm, tamaño de poro de 1000 A). La cromatografía de fase inversa se realizó en gel de sílice unido a C18 (20-60 μm, tamaño de poro 60-100 A) en cartuchos precargados del tamaño indicado. La HPLC a escala preparativa se realizó en un sistema binario Gilson 333-334 usando una columna Waters DELTA PAK C4 15 |jm, 300 A, 50x250 mm o una columna KROMASIL® C8 10 |jm, 100 A, 50x250 mm, caudal 85 ml/min, con el gradiente indicado. La concentración de las soluciones se realizó en un evaporador rotatorio a presión reducida o se liofilizó en un secador por congelación VirTis Freezemobile (SP Scientific).

Abreviaturas: acetonitrilo (AcCN), acuoso (ac.), N,N-diisopropiletilamina o base de Hunig (DIPEA), N,N-dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO), acetato de etilo (EtOAc), clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etil-carbodiimida (EDC), gramo o gramos (g), hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt, hora u horas (h), espectro de masas (em o EM), microgramo o microgramos (jg), microlitro o microlitros (jl), micromol (jmol), miligramo o miligramos (mg), mililitro o mililitros (ml), milimol (mmol), minuto o minutos (min), tiempo de retención (tR), temperatura ambiente (ta), saturado (sat.), solución ac. satuada de cloruro de sodio (salmuera), trietilamina (TEA), ácido trifluoroacético (TFA) y tetrafluoroborato de N,N,N',N'-tetrametil-0-(N-succinimidil)uronio (TSTU).

El término "IHR" se refiere a la insulina humana recombinante y se usa para indicar que la insulina tiene la secuencia de aminoácidos característica de la insulina humana nativa y de tipo silvestre. Como se usa en el presente documento en las tablas, el término indica que la secuencia de aminoácidos de la insulina que comprende el dímero es la de la insulina humana nativa y de tipo silvestre.

EJEMPLO 1

Se describe la síntesis de 6-((6-((2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi)-6-oxohexil)amino)-6-oxohexanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (Enlazador 1; C6+NC6).

Etapa 16-((6-(Benciloxi)-6-oxohexil)amino)-6-oxohexanoato de bencilo

A una mezcla de éster monobencílico del ácido adípico (600 mg, 2,54 mmol) y 4-metilbencenosulfonato de 6-(benciloxi)-6-oxohexan-1-aminio (1,0 g, 2,54 mmol) en D^mF (12,71 ml) se le añadió HOBt (584 mg, 3,81 mmol), base de Hunig (888 jl, 5,08 mmol) y EDC (731 mg, 3,81 mmol). Después de agitar durante la noche, la mezcla de reacción se repartió entre NaHCO₃sat. y EtOAc. La fase orgánica se separó, se lavó con HCl 1,0 M y salmuera, se secó sobre Na2SO₄y se concentró para proporcionar el compuesto del título en forma de un semisólido y se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. Método A de UPLC-EM: tR = 1,26 min, m/z = 440,3 [M+1]

Etapa 2 Ácido 6-((5-carboxipentil)amino)-6-oxohexanoico

Una suspensión del producto de la Etapa 1 (1,08 g, 2,457 mmol) y catalizador de Pearlman (al 20 % en peso sobre carbono, 173 mg, 0,246 mmol) en MeOH (50 ml) se agitó en atmósfera de H₂a 344,74 kPa (50 psi) durante la noche. El catalizador se filtró y el filtrado se sometió a cromatografía de fase inversa en fase C8 (Kromasil, C8 10 jm 100 A, 250 x 50 mm; disolvente A = agua/TFA al 0,05 %, disolvente B = AcCN/TFA al 0,05 %), caudal = 85 ml/min, gradiente de B en A 5-30 % en 30 min. Método A de UPLC-EM: tR = 0,40 min, m/z = 260,15 [M+1].

Etapa 36-((6-((2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi)-6-oxohexil)amino)-6-oxohexanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo

A una solución del producto de la Etapa 2 (50 mg, 0,193 mmol) en DMF (964 j l ) se le añadió TSTU (116 mg, 0,386 mmol). Después de enfriar a 0 °C, a la mezcla se le añadió trietilamina (53,8 jl, 0,386 mmol). Después de agitar durante 45 minutos, se observó la formación del compuesto deseado: Método A de UPLC-EM: tR = 0,71 min, m/z = 453,4 [M+1]. El 6-((6-((2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi)-6-oxohexil)amino)-6-oxohexanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo resultante se usó como solución 0,2 M en DMF sin purificación.

EJEMPLO 2

Se describe la síntesis de 6,6'-(adipoilbis(azanodiil))dihexanoato de bis(2,5-dioxopirrolidin-1-ilo) (Enlazador 2 ; C6N+C6+NC6).

Etapa 16,6'-(adipoilbis(azanodiil))dihexanoato de dibencilo

A una solución de 4-metilbencenosulfonato de 6-(benciloxi)-6-oxohexan-1-aminio (2,693 g, 6,84 mmol) y ácido adípico (500 mg, 3,42 mmol) en DMF (17,1 ml) se le añadió base de Hunig (1,793 ml, 10,26 mmol), HOBt (1,572 g, 10,26 mmol) y EDC (1,968 g, 10,26 mmol). Después de agitar durante la noche, la mezcla de reacción se vertió en agua (500 ml) y se agitó durante 30 minutos. El compuesto del título se recogió mediante filtración en forma de un sólido y se secó mediante succión de aire. Método A de UPLC-EM: tR = 1,23 min, m/z = 553,5 [M+1].

Etapa 26,6-(Adipoilbis(azanodiil))dihexanoato de bis(2,5-dioxopirrolidin-1-ilo)

El compuesto del título se preparó usando un procedimiento análogo al descrito en el EJEMPLO 1, sustituyendo el 6-((6-(benciloxi)-6-oxohexil)amino)-6-oxohexanoato de bencilo por el 6,6'-(adipoilbis(azanodiil))dihexanoato de bencilo en el Etapa 2. Método A de UPLC-EM: tR = 0,74 min, m/z = 567,4 [M+1].

EJEMPLO 3

Se describe la síntesis de ácido (2S,2'S)-2,2'-(octanodioilbis(azanodiil))bis(5-((2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi)-5-oxopentanoico) (Enlazador 3; gamma-Glu-subérico-gamma-Glu).

Etapa 1 Ácido (S)-5-(benciloxi)-4-(8-(((S)-1-(bendloxi)-4-carboxi-1-oxobutan-2-il)amino)-8-oxooctanamido)-5-oxopentanoico

A una solución de H-GLU-OBZL (1,00 g, 4,21 mmol) en DMF (10,5 ml) se le añadió trietilamina (5,875 ml, 42,1 mmol) seguida de suberato de disuccinimidilo (776 mg, 2,107 mmol). Después de agitar durante 1 hora, la mezcla de reacción se concentró y el residuo resultante se purificó en columna C18 (ISCO 44 g), flujo = 37 ml/min; gradiente de AcCN en agua con TFA al 0,05 %: 2 %-20 % en 20 min seguido de retención. Después de la liofilización, se obtuvo el ácido biscarboxílico intermedio. Método B de UPLC-EM: tR = 2,66 min, m/z = 613,3 [M+1].

Etapa 2 Éster bis-N-hidroxisuccinimídico del ácido (S)-5-(benciloxi)-4-(8-(((S)-1-(benciloxi)-4-carboxi-1-oxobutan-2-il)amino)-8-oxooctanamido)-5-oxopentanoico

A una suspensión del producto de la Etapa 1 (455 mg, 0,743 mmol) en acetonitrilo (7,4 ml) se le añadió TSTU (492 mg, 1,634 mmol) en forma de un sólido seguido de trietilamina (228 μl, 1,634 mmol), momento en el que la suspensión se disolvió. La mezcla de reacción se agitó durante 1,5 h y se concentró en el rotovap a temperatura ambiente. El producto se purificó mediante cromatografía de fase inversa en fase C-8 (Columna Kromasil, C8 10 μm 100A, tamaño 250 x 50 mm; disolvente A = agua/TFA al 0.05 %, disolvente B = AcCN/TFA al 0.05 %), Flujo = 85 ml/min, gradiente de B en A 10-80 % en 30 min. Después de la liofilización de las fracciones, se obtuvo el bis-éster de NHS. Método B de UPLC-EM: tR = 2,77 min, m/z = 807 [M+1].

Etapa 3. Ácido (2S,2'S)-2,2'-(octanodioilbis(azanodiil))bis(5-((2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi)-5-oxopentanoico)

El producto de la Etapa 2 (250 mg, 0,310 mmol) se hidrogenó usando paladio sobre carbono (66,0 mg, 0,031 mmol) como catalizador y acetona que contenía TFA al 0,1 % como disolvente (6,2 ml) a 101,32 kPa (1 atm) de hidrógeno, durante la noche. El catalizador se retiró por filtración y el filtrado se concentró para proporcionar el compuesto del título. Se bombeó a alto vacío durante la noche. Método C de UPLC-EM: tR = 3,61 min, m/z = 627,3 [M+1].

EJEMPLO 4

Método general A: Síntesis de Conjugados de N6829 Insulina (Análogos)

En un recipiente de tamaño adecuado, se disolvió insulina o análogo de insulina, con agitación suave, a temperatura ambiente en una mezcla de disolventes: Na2CO₃0,1 M:AcCN 2:3 v/v. Una vez que la mezcla se aclaró, el pH se ajustó al valor de 10,5-10,8 usando una solución alcalina, por ejemplo, NaOH 0.1 N. En un vial separado, un intermedio de éster activado (resto de unión) se disolvió en un disolvente orgánico, por ejemplo, DMSO, a temperatura ambiente. Se añadieron alícuotas de la solución del éster activado (Enlazador) durante un período de tiempo a la solución que contenía insulina hasta que el cromatograma de UPLC mostró que la mayor parte de la insulina sin modificar había reaccionado y que una porción sustancial de la mezcla de reacción se había convertido en insulina conjugada con B29. La reacción se interrumpió mediante la adición de un nucleófilo de amina, por ejemplo, 2-aminoetanol. La solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La solución resultante se diluyó cuidadosamente con H₂O fría (20x) a 0 °C y su pH se ajustó a un pH final de 2,5 usando HCl 1 N (y NaOH 0,1 N si fuera necesario). La solución se concentró en primer lugar mediante ultrafiltración, ya sea a través de un sistema de filtración de flujo tangencial (FFT) o usando unidades centrífugas Amicon Ultra-15, con membrana de CPM de 1K, 3K o 10K. La solución concentrada por lo general se sometió en primer lugar a cromatografía de intercambio iónico (columna PolySULFOETHYL A, PolyLC Inc., 250x21 mm, 5 μm, 1000 A; Tampón A: HaPO4al 0,1 %(v/v)/AcCN al 25%; Tampón B: H3PO₄al 0,1 %(v/v)/AcCN al 25 %/NaCl 0,5 M). Las fracciones que contenían el conjugado con B29 con la pureza deseada se combinaron y se concentraron usando el sistema de FFT o Amicon Ultra-15. Después, la solución resultante se purificó adicionalmente mediante HPLC de fase inversa (columna Waters C4 de 250 x 50 mm, 10 μm, columna de 1000 A o Kromasil C8 250x50 mm, 10 μm, columna de 100A; Tampón A: TFA al 0,05-0,1 % en agua; Tampón B: TFA al 0,05-0,1 % en AcCN). Las fracciones que contenían el conjugado del título se combinaron y se liofilizaron o se intercambiaron tampones usando el sistema de FFT y/o Amicon Ultra-15 para proporcionar el producto del título.

EJEMPLO 5

Se describe la síntesis de W®29B-5-azido-pentanoil Insulina desB30 (A:Y19A) (Análogo 1).

En un vial de centelleo de 20 ml, se disolvió insulina desB30 A:Y19A (112 mg, 0,020 mmol), con agitación suave, a temperatura ambiente en una mezcla de disolventes (2 ml, Na₂CO₃0,1 M:AcCN 2:3 v/v). Una vez que la mezcla se aclaró, el pH se ajustó al valor de 10,5-10,8 usando una solución alcalina, por ejemplo, NaOH 0.1 N. En un vial separado de centelleo de 8 ml, se disolvió 5-azidopentanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (Enlazador 5 ; véase el EJEMPLO 6) (4,79 mg, 0,020 mmol) en DMSO (500 μl) a temperatura ambiente. Se añadieron alícuotas de la solución del éster activado durante un período de tiempo a la solución que contenía insulina hasta que el cromatograma de UPLC mostró que la mayor parte de la insulina sin modificar había reaccionado y que una porción sustancial de la mezcla de reacción se había convertido en insulina conjugada con B29. La reacción se interrumpió mediante la adición de un nucleófilo de amina, por ejemplo, 2-aminoetanol. La solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La solución resultante se diluyó cuidadosamente con H₂O fría (20x) a 0 °C y su pH se ajustó a un pH final de 2,5 usando HCl 1,0 N (y NaOH 0,1 N si fuera necesario). La solución se concentró en primer lugar mediante ultrafiltración usando unidades centrífugas Amicon Ultra-15 con membrana de CPM de 3K o 10K. La solución concentrada se sometió a HPLC de fase inversa (KROMASIL C8250x50 mm, 10 μm, columna de 100A, Tampón B al 25-35 % en Tampón A durante 20 min; Tampón A: TFA al 0,05 % en agua; Tampón B: TFA al 0,05 % en A^cCⁿ). Las fracciones que contenían Análogo 1 se combinaron y después se liofilizaron. Método D de UPLC-EM: tR = 3,91 min, m/z = 1435,86 [(M+4)/4].

EJEMPLO 6

La IHR N6, B29-acilada Análogo 2, Análogo 3, y Análogo 4 se prepararon para su uso en la construcción de dímeros usando química "clic" y se prepararon usando el Método general A o el procedimiento análogo a los descritos para el EJEMPLO 4 pero sustituyendo la insulina humana recombinante y

(pent-4-inoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo; Enlazador 4);

(2,5-dioxopirrolidin-1-il-azidopentanoato; Enlazador 5); o

(1-(biciclo[6.1.0]non-4-in-9-il)-3-oxo-2,7,10,13,16-pentaoxa-4-azanonadecan-19-oato de perfluorofenilo)(Enlazador 6) para preparar Análogo 2, Análogo 3 o Análogo 4 , respectivamente. Los análogos se caracterizaron usando el Método D de UPLC-EM excepto por el Análogo 5, que se caracterizó usando el Método F de UPLC-EM.

EJEMPLO 7

Se describe la síntesis de W2’1A,W2’1B-bis(carbamoil) Insulina Humana (Análogo 5).

A una suspensión de IHR (1 g, 0,172 mmol) en agua (50 ml) se le añadió una solución de fosfato de potasio, dibásico (0,249 g, 1,429 mmol) en agua (5,0 ml). Después de agitar a temperatura ambiente durante 30 minutos, a la mezcla resultante se le añadió cianato de potasio (0,279 g, 3,44 mmol). La mezcla de reacción se dejó agitar durante 16 horas. Para detener la reacción, el cianato de potasio sin reaccionar se retiró mediante FFT usando un dispositivo de diafiltración de CPM de 3K y el producto se aisló en forma de un sólido mediante liofilización. El producto contenía aproximadamente el 10-35 % de A1/B1/B29-tris-urea-IHR, que opcionalmente podía retirarse mediante cromatografía de fase inversa en fase C8 (Columna KROMASIL, C810 μm 100 A, 250 x 50 mm; disolvente A = agua/TFA al 0,05 %, disolvente B = AcCN/TFA al 0.05 %), caudal = 85 ml/min, gradiente de B en A al 26-34 % durante 30 min). Método D de UPLC-EM: tR = 4,29 min, m/z = 1474,6 (z = 4). El sustituyente N-terminal tiene la estructura

en donde la línea ondulada indica el enlace entre el sustituyente y el nitrógeno N2 del aminoácido N-terminal.

EJEMPLO 8

Se describe la síntesis de N21A,N21B-bis(carbamoil) Insulina Humana desB30 (Análogo 6).

El compuesto del título se preparó usando un procedimiento análogo al descrito para el EJEMPLO 7, sustituyendo IHR por insulina desB30. Método D de UPLC-EM: tR = 4,10 min, m/z = 1448,9 (z = 4). El sustituyente N-terminal tiene la estructura

EJEMPLO 9

Se describe la síntesis de N21A,N21B-bis(carbamoil) Insulina lispro (Análogo 7).

El compuesto del título se preparó usando un procedimiento análogo al descrito para el EJEMPLO 7, sustituyendo IHR por insulina lispro. Método D de UPLC-EM: tR = 4,07 min, m/z = 1473,6 (z = 4). El sustituyente N-terminal tiene la estructura

EJEMPLO 10

Se describe la síntesis de N21A-acetil insulina humana (Análogo 8).

A una solución de IHR (400 mg, 0,069 mmol) en DMSO (4,6 ml) se le añadió gota a gota una solución de acetato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo

(10,82 mg, 0,069 mmol) en 100 μl de DMSO. Después de agitar durante 3 horas, la mezcla de reacción se diluyó con agua (95 ml), se acidificó hasta un pH de aproximadamente 3 y después se diafiltró a través de unidades centrífugas Amicon Ultra-15 con membrana de CPM de 3 o 10K para retirar la mayor parte del DMSO. La solución resultante se sometió en primer lugar a cromatografía de intercambio iónico (columna PolySULFOETHYL A, PolyLC Inc., 250x21 mm, 5 μm, 1000 A, caudal 15 ml/min; Tampón A: H3PO₄al 0,1 %(v/v)/AcCN al 25 %; Tampón B: H3PO₄al 0,1 %(v/v)/AcCN al 25 %/NaCl 0,5 M) usando un gradiente del 10-40% de Tampón B en Tampón A durante 24 minutos. Las fracciones que contenían la N21A-acetil-IHR deseada se combinaron y se concentraron, y después se sometieron a cromatografía de fase inversa en (KROMASIL, C8 10 μm 100 A, 250 x 50 mm; disolvente A = agua/TFA al 0,05 %, disolvente B = AcCN/TFA al 0,05 %, gradiente del 26-30 % de B en A). La posición de modificación se confirmó usando análisis de DTT. Método D de UPLC-EM: tR = 3,5 min y m/z = 1463,5 (z = 4). El sustituyente N-terminal tiene la estructura

EJEMPLO 11

Se describe la síntesis de IHR N21A,N21B-bis(carbamoíl) N629B-acilada.

Se prepararon Análogo 5 conjugado con 2,5-dioxopirrolidin-1-il-azidopentanoato (Enlazador 5) para construir Análogo 9 o pent-4-inoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (Enlazador 4) para construir Análogo 10 usando el Método General A o el procedimiento análogo a los descritos para el EJEMPLO 4.

EJEMPLO 12

Se prepararon los siguientes análogos de IHR N629B-acilada (Análogo 11, Análogo 12, y Análogo 13) para su uso en la construcción de dímeros usando química "clic". Los análogos se prepararon usando el Método general A o el procedimiento análogo a los descritos para el EJEMPLO 4 pero sustituyendo la insulina humana recombinante (IHR) y el resto de unión adecuado seleccionado de

para preparar Análogo 11, Análogo 12 o Análogo 13, respectivamente. Los análogos se caracterizaron usando el Método D de UPLC-EM excepto por el Análogo 12, que se caracterizó usando el Método F de UPLC-EM.

EJEMPLO 13

Método general B: Síntesis de Dímeros de W629B,W629B'-Insulina usando condiciones de base orgánica

En un recipiente de tamaño adecuado, se suspende insulina o análogo de insulina a temperatura ambiente en un disolvente orgánico o disolventes mixtos acuosos (ac.)/orgánicos, por ejemplo, DMSO, en presencia de una base, por ejemplo, TEA. Se permite que la mezcla se agite suavemente hasta que la insulina se disuelva por completo. A la solución resultante se le añade un intermedio de éster activado (enlazador) en solución de disolventes orgánicos, tales como DMSO o DMF. Después el cromatograma de UPLC muestra que una porción sustancial de la mezcla de reacción se ha convertido en dímero de N629B,N6, B29B'-insulina (o dímero de W628B,W628B'-insulina lispro). La mezcla de reacción puede someterse directamente a una purificación por HPLC de fase inversa (columna Waters C4 de 250 x 50 mm, 10 |jm, columna de 1000 A o KROMASIL C8250x50 mm, 10 jm , columna de 100Á; Tampón A: TFA al 0,05-0.1 % en agua desionizada; Tampón B: TFA al 0,05-0,1 % en AcCN) o la reacción puede interrumpirse por dilución cuidadosa con H₂O ácida fría (20x, pH aproximadamente 3,0) a 0 °C y su pH se ajusta a un pH final de 2,5 usando HCl 1 N (y NaOH 0,1 N si es necesario). La solución puede concentrarse en primer lugar mediante ultrafiltración, ya sea a través de un sistema de filtración de flujo tangencial (FFT) o usando unidades centrífugas Amicon Ultra-15, con membrana de CPM de 1K, 3K o 10K. La solución concentrada por lo general se somete en primer lugar a cromatografía de intercambio iónico (columna PolySULFOETHYL A, PolyLC Inc., 250x21 mm, 5 jm , 1000 A; Tampón A: H3PO₄al 0,1 %(v/v)/AcCN al 25 %; Tampón B: H3PO₄al 0,1 %(v/v)/AcCN al 25 %/NaCl 0,5 M). Las fracciones que contienen el conjugado con B29 con la pureza deseada se combinan y se concentran usando el sistema de FFT o Amicon Ultra-15. Después, la solución concentrada se somete a una purificación por HPLC de fase inversa (columna Waters C4 de 250 x 50 mm, 10 jm , columna de 1000 A o KROMASIL C8250x50 mm, 10 jm , columna de 100Á; Tampón A: TFA al 0,05-0.1 % en agua desionizada; Tampón B: TFA al 0,05-0,1 % en AcCN). Las fracciones que contienen el dímero de insulina deseado se combinan y se liofilizan o se intercambian tampones usando el sistema de FFT y/o Amicon Ultra-15 para proporcionar los dímeros de W629B,W629B'-insulina.

EJEMPLO 14

Método general C: Síntesis de Dímeros de W6’29B,W6’29B'-Insulina usando condiciones de base acuosa.

En un recipiente de tamaño adecuado, se disuelve insulina o análogo de insulina, con agitación suave, a temperatura ambiente en una mezcla de disolventes: Na2CO₃0,1 M:AcCN 2:3 v/v. Una vez que la mezcla se aclaró, el pH se ajusta al valor de 10,5-10,8 usando una solución alcalina, por ejemplo, NaOH 0.1 N. En un vial separado, un intermedio de éster activado (enlazador) se disuelve en un disolvente orgánico, por ejemplo, DMSO, a temperatura ambiente. Se añaden alícuotas de la solución del éster activado durante un período de tiempo a la solución que contiene insulina hasta que el cromatograma de UPLC muestra que la mayor parte de la insulina sin modificar ha reaccionado y que una porción sustancial de la mezcla de reacción se ha convertido en dímero de N6, B29, N6, B29'-insulina (o dímero de W6,28B,W628B -insulina lispro). La reacción se interrumpe mediante la adición de un nucleófilo de amina, por ejemplo, 2-aminoetanol. La solución de reacción se agitó a ta durante 30 minutos. La solución resultante se diluye cuidadosamente con H₂O fría (20x) a 0 °C y su pH se ajusta a un pH final de 2,5 usando HCl 1 N (y NaOH 0,1 N si es necesario). La solución se concentra en primer lugar mediante ultrafiltración, ya sea a través de un sistema de filtración de flujo tangencial (FFT) o usando unidades centrífugas Amicon Ultra-15, con membrana de CPM de 1K, 3K o 10K. La solución concentrada por lo general se somete en primer lugar a cromatografía de intercambio iónico (columna PolySULFOETHYL A, PolyLC Inc., 250x21 mm, 5 μm, 1000 A; Tampón A: H3PO₄al 0,1 %(v/v)/AcCN al 25%; Tampón B: H3PO₄al 0,1 %(v/v)/AcCN al 25 %/NaCl 0,5 M). Las fracciones que contienen el conjugado con B29 con la pureza deseada se combinan y se concentran usando el sistema de FFT o Amicon Ultra-15. Después, la solución resultante se purifica adicionalmente mediante HPLC de fase inversa (columna Waters C4 de 250 x 50 mm, 10 μm, columna de 1000 A o KROMASIL C8250x50 mm, 10 μm, columna de 100A; Tampón A: TFA al 0,05-0,1 % en agua; Tampón B: TFA al 0,05-0,1 % en AcCN). Las fracciones que contienen el dímero del título deseado se combinan y se liofilizan o se intercambian tampones usando el sistema de FFT y/o Amicon Ultra-15 para proporcionar los dímeros de N629B,N629B-insulina.

EJEMPLO 15

Este ejemplo ilustra la síntesis de N6^ 29, N6B29'-(2,2'-(etano-1,2-diilbis(oxi))diacetil)bis[insulina humana] (Dímero 1).

Se disolvió IHR (2,6 g, 0,448 mmol) en una mezcla de Na2CO₃(0,1 M) (15,8 ml) y AcCN (10,5 ml) y se añadieron 0,895 ml (0,179 mmol) de solución en DMF 0,2 M de 2,2'-(etano-1,2-diilbis(oxi))diacetato de bis(2,5-dioxopirrolidin-1-ilo) (Enlazador 8). La mezcla de reacción se agitó durante 30 min y se añadió una porción adicional de 0,895 ml (0,179 mmol) de solución en DMF 0,2 M de 2,2'-(etano-1,2-diilbis(oxi))diacetato de bis(2,5-dioxopirrolidin-1-ilo) y la mezcla de reacción se agitó durante 30 min más. La mezcla de reacción se vertió en 60 ml de AcCN al 20 %/TFA al 0,1 %/agua, el pH se ajustó a 2,5 y se diafiltró usando Amicon Ultra-15 con membrana de CPM de 10K para concentrar hasta que el volumen resultante fue de aproximadamente 10 ml. La solución resultante se sometió a cromatografía de intercambio iónico (columna PolySULFOETHYL A, 250x21 mm, 5 μm, 1000 A, gradiente del 10-80% de Tampón B en Tampón A durante 30 min; Tampón A: H3PO₄al 0,1 %(v/v)/AccN al 25 %; Tampón B: H3PO₄al 0,1 %(v/v)/AcCN al 25 %/NaCl 0,5 M). Las fracciones que contenían el compuesto del título se combinaron y se concentraron. Después, la solución resultante se sometió a cromatografía de fase inversa (KROMASIL C8 250x50 mm, 10 μm, columna de 100 A; gradiente del 27-35 % de AcCN con TFA al 0,05 % en agua con TFA al 0,05 %). Método E de UPLC-EM: tR = 2,75 min, m/z = 1960,4 (z = 6), 1680,4 (z = 7).

EJEMPLO 16

Este ejemplo ilustra la síntesis de N21A,N₂,1A',N₂,1B,N₂,1B'-Tetraquis(carbamoil)-N6B29, N6B29'-(hexanodioil)bis[insulina humana] (Dímero 2).

Se disolvió Ai2’1A,W2’1B-b¡s(carbamoil) IHR (150 mg, 0,025 mmol) en DMSO (1 ml) y se añadió trietilamina (0,106 ml, 0,764 mmol) seguido de la adición gota a gota de adipato de d^N-succinimidilo) (Enlazador 12) (4,33 mg, 0,013 mmol) disuelto en 100 μl de DMSO. Se agitó durante 1 hora y se vertió la mezcla de reacción en 20 ml de agua. Se acidificó a pH=2 y se diafiltró usando 10K Amicon Ultra 15. El producto se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico usando un gradiente del 10-40 % de Disolvente B en Disolvente A en 24 minutos y se volvió a purificar mediante cromatografía de fase inversa en C-8 gradiente de fase B en A 26-36 % en 30 minutos. Método E de UPLC-EM: tR = 3,75 min, m/z = 1983,9, (z = 6).

EJEMPLOS 17

La Tabla 3 muestra los dímeros que se prepararon usando los intermedios adecuados (enlazadores) siguiendo el Método general B o el Método general C como se indica usando la IHR, IHR DesB30, insulina lispro, insulina aspart, insulina glargina o el análogo adecuado. Por ejemplo, para los dímeros con extremos N carbamoilados, se usó Análogo 5 o Análogo 6 (DesB30); para los dímeros con extremos N A1 acetilados, se usó Análogo 8. Los dímeros se caracterizaron usando el Método D de UPLC-EM o el Método E de UPLC-EM, presentando ya sea seis especies cargadas, es decir, [(M+6)/6], (o siete especies cargadas, es decir, [(M+7)/7]) del compuesto original a determinado tiempo de retención (tR). La insulina y las moléculas de insulina unidas entre sí por el resto de unión son las mismas para cada uno de los dímeros que se muestran en Tabla 3.

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

EJEMPLO 18

Método general D: Síntesis de dímeros de W6’29B,W6’29B'-insulina usando química clic catalizada por Cu2+.

En un recipiente de tamaño adecuado, se disolvió el intermedio de insulina que contenía acetileno (Análogo) adecuado, con agitación suave, a temperatura ambiente en una mezcla de disolventes de DMSO y tampón de acetato de trietilamonio ac. (pH 7,0, concentración final 0,2 mM). En otro recipiente de tamaño adecuado, se disolvió el intermedio de insulina que contenía azido (Análogo) adecuado, con agitación suave, a temperatura ambiente en una mezcla de disolventes de DMSO y agua. Ambas soluciones se combinaron, se mezclaron minuciosamente, se desgasificaron por burbujeo suave de N₂. A la solución resultante se le añadió ascorbato de sodio recién preparado o solución de ácido ascórbico (la concentración final es de 0,5 mM) y, después de mezclar minuciosamente, una solución de CuSO₄10 mM y tris[(1-bencil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina (es decir, ligando de TBTA) en DMSO al 55 %. Después de desgasificar burbujeando suavemente N₂y mezclar minuciosamente, la mezcla se almacenó a ta, mezclando ocasionalmente, durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó cuidadosamente con una mezcla de disolventes (AcCN/agua v/v 7:3 con TFA al 0,05 %) a 0 °C y el pH se ajustó a 2,50 usando HCl 0,1, 1,0 N (y NaOH 0,1 N si era necesario). La solución se concentró en primer lugar mediante ultrafiltración, ya sea a través de un sistema de filtración de flujo tangencial (FFT) o usando unidades centrífugas Amicon Ultra-15, con membrana de CPM de 1K, 3K o 10K. La solución concentrada por lo general se sometió en primer lugar a cromatografía de intercambio iónico (columna PolySULFOETHYL A, PolyLC Inc., 250x21 mm, 5 μm, 1000 A; Tampón A: HaPO4al 0,1 %(v/v)/AcCN al 25%; Tampón B: H3PO₄al 0,1 %(v/v)/AcCN al 25 %/NaCl 0,5 M). Las fracciones que contenían el producto deseado con la pureza deseada se combinaron y se concentraron usando el sistema de FFT o Amicon Ultra-15. Después, la solución resultante se purificó adicionalmente mediante HPLC de fase inversa (columna Waters C4 de 250 x 50 mm, 10 μm, columna de 1000 A o KROMASIL C8250x50 mm, 10 μm, columna de 100A; Tampón A: TFA al 0,05-0,1 % en agua; Tampón B: TFA al 0,05-0,1 % en AcCN). Las fracciones que contenían el producto deseado con la pureza deseada se combinaron y se liofilizaron o se intercambiaron tampones usando el sistema de FFT y/o Amicon Ultra-15 para proporcionar los dímeros de insulina.

La Tabla 4 enumera los Dímeros 40, 41,45, 46, 47, 59, 57, 79, 80, 82 y 84, que se prepararon usando los intermedios adecuados siguiendo el Método general D. Estos dímeros se caracterizaron usando el Método D de UPLC-EM o el Método E de UPLC-EM o el Método G de UPLC-EM, presentando ya sea seis especies cargadas, es decir, [(M+6)/6], (o siete especies cargadas, es decir, [(M+7)/7]) del compuesto original a determinado tiempo de retención (tR).

(continuación)

EJEMPLO 19

Método general E: Síntesis de dímeros de W6’29B,W6’29B'-insulina usando química clic doble catalizada por Cu2+.

En un recipiente de tamaño adecuado, se disolvió el intermedio de insulina que contenía azido (Análogo) adecuado, con agitación suave, a temperatura ambiente en una mezcla de disolventes de DMSO y tampón de acetato de trietilamonio ac. (pH 7,0, concentración final 0,2 mM). En otro recipiente de tamaño adecuado, se disolvió el enlazador intermedio o de puente que contenía bis-acetileno adecuado, con agitación suave, a temperatura ambiente en un disolvente mixto de DMSO y agua. Ambas soluciones se combinaron, se mezclaron minuciosamente, se desgasificaron por burbujeo suave de N₂. A la solución resultante se le añadió ascorbato de sodio recién preparado o solución de ácido ascórbico (la concentración final es de 0,5 mM) y, después de mezclar minuciosamente, una solución de CuSO₄10 mM y tris[(1-bencil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina (es decir, ligando de TBTA) en DMSO al 55%. Después de desgasificar burbujeando suavemente N₂y mezclar minuciosamente, el tampón se almacenó a temperatura ambiente, mezclando ocasionalmente, durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó cuidadosamente con una mezcla de disolventes (AcCN/agua v/v 7:3 con TFA al 0,05 %) a 0 °C y el pH se ajustó a 2,50 usando HCl 0,1, 1,0 N (y NaOH 0,1 N si era necesario). La solución se concentró en primer lugar mediante ultrafiltración, ya sea a través de un sistema de filtración de flujo tangencial (FFT) o usando unidades centrífugas Amicon Ultra-15, con membrana de CPM de 1K, 3K o 10K. La solución concentrada por lo general se sometió en primer lugar a cromatografía de intercambio iónico (columna PolySULFOETHYL A, PolyLC Inc., 250x21 mm, 5 μm, 1000 A; Tampón A: H3PO₄al 0,1 %(v/v)/AcCN al 25 %; Tampón B: H3PO₄al 0,1 %(v/v)/AcCN al 25 %/NaCl 0,5 M). Las fracciones que contenían el producto deseado con la pureza deseada se combinaron y se concentraron usando el sistema de FFT o Amicon Ultra-15. Después, la solución resultante se purificó adicionalmente mediante HPLC de fase inversa (columna Waters C4 de 250 x 50 mm, 10 μm, columna de 1000 A o KROMASIL C8 250x50 mm, 10 μm, columna de 100A; Tampón A: TFA al 0,05-0,1 % en agua; Tampón B: TFA al 0,05-0,1 % en AcCN). Las fracciones que contenían el producto deseado con la pureza deseada se combinaron y se liofilizaron o se intercambiaron tampones usando el sistema de FFT y/o Amicon Ultra-15 para proporcionar los dímeros de insulina.

La Tabla 5 enumera los Dímeros 42-44 y 54 que se prepararon usando los intermedios adecuados siguiendo el Método general E. Los enlazadores intermedios o de puente de bis-acetileno fueron

Estos dímeros se caracterizaron usando el Método D de UPLC-EM o el Método E de UPLC-EM, presentando ya sea seis especies cargadas, es decir, [(M+6)/6], (o siete especies cargadas, es decir, [(M+7)/7]) del compuesto original a determinado tiempo de retención (tR).

Este ejemplo ilustra la síntesis de Dímeros de W2’1A,W2’1A',W2’1B,W2’1B'-Tetraqu¡s(acet¡lo o PEG1 o metoxiacetilo) (Dímero 48, 55, 56, 69 y 70).

A una solución de Dímero 40, 19 o 4 (21 mg, 1,777 jm ol) en DMSO (2 ml) a temperatura ambiente se le añadió TEA (3,96 |jl, 0,028 mmol) y después una solución de acetato de 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo (2,23 mg, 0,014 mmol) en DMSO (100 j l) u otro éster de N-hidroxisuccinimida activado adecuado (metoxi acetato de 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo o PEG1 acetato de 2,5-dioxopirrolidin-1 -ilo) en DMSO (100 jl). Después de 3 horas, la mezcla de reacción se diluyó con 12 ml de una mezcla de agua/AcCN = H3 con TFA al 0,1 % y el pH se ajustó hasta 2,5. La solución transparente resultante se concentró mediante filtros de centrífuga Amicon Ultra 15 con membrana de CPM de 10K. La solución resultante se sometió en primer lugar a cromatografía de intercambio iónico (PolySULFOETHYL A, 250x21 mm, 5jm , 1000 A, 15 ml/min, gradiente del 5 % al 45 % en 30 min; Tampón A: H3PO₄al 0,1 % (v/v)/Acetonitrilo al 25 % en agua; Tampón B: H3PO₄al 0,1 %(v/v)/Acetonitrilo al 25 %/NaCl 0,5 M en agua). Las fracciones que contenían el producto deseado con la pureza deseada se combinaron y se concentraron usando Amicon Ultra-15 con membrana de CPM de 10K. Después, la solución resultante se sometió a HPLC de fase inversa (KROMASIL C8250x50 mm, 10 jm , columna de 100 A; Tampón A: TFA al 0,05% en AcCN/H₂O; Tampón B: AcCN al 0,05%; caudal 85 ml/min). Las fracciones deseadas se combinaron y liofilizaron para proporcionar el Dímero 48, 55, 56, 69 o 70 como se muestra en la Tabla 6. Se usó el método F o G de UPLC-EM.

Los sustituyentes N-terminales tienen la estructura

EJEMPLO 21

La Tabla 7 muestra los Dímeros 49, 50 y 51 y muestra los grupos acilo unidos a los grupos amino de N₂*1, N281, N₂*1' y N281'. Estos dímeros se prepararon a partir del Dímero 40 usando los procedimientos análogos a los descritos para preparar el Dímero 48 pero sustituyendo el acetato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo por ésteres activados de N-hidroxisuccinimida adecuados para producir los Dímeros 49, 50 y 51. Los ésteres activados fueron Fmoc-glicina acetato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo

PEG2 acetato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo

y AEG-C6 acetato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo, en donde AEG es aminoetilglucosa

. Estos dímeros se caracterizaron usando el Método F de UPLC-EM (Dímeros 50 y 51) o el Método G de UPLC-EM (Dímero 49), presentando seis especies cargadas, es decir, [(M+6)/6], (o siete especies cargadas, es decir, [(M+7)/7]) del compuesto original a determinado tiempo de retención (tR). Los dímeros se muestran en la Tabla 7.

Los sustituyentes N-terminales tienen la estructura

o

EJEMPLO 22

Este ejemplo ilustra la síntesis del Dímero 52 usando química clic sin cobre.

A una solución de Análogo 3 (10 mg, 1,686 |jmol) en 1,0 ml de H₂O/AcCN 3:2 v/v a temperatura ambiente se le añadió una solución de Análogo 4 (10,5 mg, 1,686 jmol) en 1,0 ml de H₂O/AcCN 3:2 v/v. Después de agitar a temperatura ambiente durante 2 horas, la mezcla de reacción se sometió en primer lugar a cromatografía de intercambio iónico (PolySULFOETHYL A, 250x21 mm, 5jm, 1000 A, 15 ml/min, gradiente del 5 % al 45 % en 30 min; Tampón A: H3PO₄al 0,1 % (v/v)/Acetonitrilo al 25 % en agua; Tampón B: H3PO₄al 0,1 %(v/v)/Acetonitrilo al 25 %/NaCl 0,5 M en agua). Las fracciones que contenían el producto deseado con la pureza deseada se combinaron y se concentraron usando Amicon Ultra-15 con membrana de CPM de 3K o 10K. Después, la solución resultante se sometió a HPLC de fase inversa (KROMASIL C8250x50 mm, 10 jm, columna de 100 A; Tampón A: TFA al 0,05 % en AcCN/H₂O; Tampón B: AcCN al 0,05 %; caudal 85 ml/min). Las fracciones deseadas se combinaron y se liofilizaron para proporcionar el Dímero 52. Método F de UPLC-^eM: tR = 3,73 min, m/z = 1738,59 [(M+7)/7 1]. Los resultados se muestran en la Tabla 8.

EJEMPLO 23

Este ejemplo ilustra la síntesis de Dímeros de W2’1A,W2’1A',W2’1B,W2’1B,-Tetraqu¡s(d¡met¡lo o isobutilo) (Dímeros 60, 58, 65 y 67).

Se disolvió Dímero 40, 19 o 4 (100 mg, 8,46 jmol) (suspensión) en agua (10 ml) y se ajustó a pH=4,0 con solución de ácido acético, después se añadió formaldehído (0,013 ml, 0,169 mmol) o isobutiraldehído (0,025 ml, 0,272 mmol), seguido de la adición de una solución recién preparada de cianoborohidruro de sodio (10,63 mg, 0,169 mmol) en agua (500 jl). Se formó el precipitado. La mezcla se agita suavemente. Después de la finalización de la reacción aproximadamente 1 hora, la mezcla se acidifica cuidadosamente mediante la adición gota a gota de HCl 1 N a pH 2,9. La suspensión se convirtió en una solución transparente. La mezcla se purificó mediante HPLC preparatoria de fase inversa (columna C-8, 50X250cm, 85ml/min, gradiente del 29 % al 36 % en 25 min). (Agua con TFA al 0,1 % y MeCN con TFA al 0,05%). Las fracciones deseadas se liofilizaron para proporcionar los dímeros (19,9 mg, 1,506 jmol, rendimiento del 17,80 %). Método D de UPLC-EM: tR = 3,31 min, m/z = 1989,44 [(M+6)/6 1].

Los sustituyentes N-terminales tienen la estructura

(isobutilo), en donde la línea ondulada indica el enlace entre el sustituyente y el nitrógeno N2 del aminoácido N- terminal,

(N-dimetilo; Me2), en donde la línea ondulada indica el enlace entre el nitrógeno N2 y el carbono C2 del aminoácido N-terminal.

Los dímeros se muestran en la Tabla 9.

EJEMPLO 24

La síntesis de los Dímeros 61,62, 63, 64 y 66 fue de la siguiente manera.

Se describe la síntesis de 6-((2-((2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi)-2-oxoetil)amino)-6-oxohexanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (enlazador de C6-glicina; Enlazador 24).

Etapa 1 (2,5-Dioxopirrolidin-1-il)adipato de bencilo

^{A una solución de ácido}6^{-(benciloxi)-}6^{-oxohexanoico (5 g, 21,16 mmol) en DMF (10 ml) a 0 °C se le añadió N-etil-N-}isopropilpropan-2-amina (4,44 ml, 25,4 mmol) seguida de TSTU (7,01 g, 23,28 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 0 °C durante 1 hora y a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla se vertió en una mezcla de hielo-agua/etil éter (1/1, 100 ml). La mezcla se extrajo con etil éter (3 x 50 ml), se lavó con agua (2 x 10 ml) y salmuera (10 ml). La ^{capa orgánica se secó sobre MgSO}4^{, se filtró a través de un lecho de celite y se concentró para proporcionar el}compuesto del título en forma de un jarabe incoloro (5,2 g, 15,6 mmol, 74 %). CL-EM 2 min: tR = 1,05 min, m/z = 334,1 [M+1].

Etapa 2 - Ácido ((carboximetil)amino)-6-oxohexanoico

A una solución de glicina (225 mg, 3,0 mmol) en DMF (2,5 ml) se le añadió gota a gota el producto de la Etapa 1 (1,0 g, 3,0 mmol) en DMF (2,5 ml) seguido de TEA (418 μl, 3,0 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 h. La DMF se retiró a presión reducida. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía de fase inversa C18 (eluida con AcCN al 0-40 %/agua en 16 volúmenes de columna (VC)). Las fracciones que contenían el producto ^{deseado se combinaron, se concentraron y se liofilizaron para proporcionar el intermedio (}6^{-(benciloxi)-}6^{-oxohexanoil)glicina. Al intermedio anterior en agua (3 ml), se le añadió Pd/C}(10 ^{%, 160 mg, 0,15 mmol). La reacción}se agitó a temperatura ambiente en globo de hidrógeno durante 18 h. La mezcla se filtró a través de un lecho de celite, se lavó con MeOH/agua (1/1, 10 ml). El filtrado se concentró y se liofilizó para proporcionar el compuesto del título ^{(400 mg, 2,2 mmol,}66 ^{%). CL-EM 2 min: tR = 0,28 min, m/z = 204,03 [M+1].}

Etapa 3. 6-((2-((2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi)-2-oxoetil)amino)-6-oxohexanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo

Al producto de la Etapa 2 (10 mg, 0,049 mmol) en DMF (0,5 ml) a 0 °C se le añadió TEA (0,015 ml, 0,108 mmol) seguido de TSTU (31,1 mg, 0,103 mmol). La mezcla se calentó a temperatura ambiente y se agitó a esa temperatura durante 1 h. La CCF (EtOAc/MeOH/Agua/AcCN: 2:1:1:1 (v:v:v:v)) mostró la formación del producto deseado (fR: 0,25) y no quedaba material de partida. El material en bruto se usó para construir dímeros sin purificación.

^{El Enlazador 25 (C}6^{-alanina), el Enlazador 26 (C}6^{-isoleucina), el Enlazador 27 (C}6^{-leucina) y el Enlazador 28 (valina C}6^{) en donde el aminoácido que comprende el enlazador de C}6^{-aminoácido es alanina, isoleucina, leucina y valina,}respectivamente, se sintetizaron de manera similar al proceso mostrado anteriormente. Los dímeros se construyeron usando los enlazadores anteriores usando el Método de prep. D. Los resultados se muestran en la Tabla 10.

continuación

EJEMPLO 25

La síntesis de los Dímeros 73, 89, 90, 91,92 y 93 fue de la siguiente manera.

Se describe la síntesis de 3,3'-(1,3-fenilen)dipropionato de bis 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (dipropilfenilo; Enlazador 29).

Etapa 1. 3,3'-(1,3-Fenilen)dipropionato de bis 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo

A una solución de ácido 3,3'-(1,3-fenilen)dipropionoico (21,8 mg, 0,098 mmol) en DMF (0,6 ml) a 0 °C, se le añadió TEA (29 ml, 0,206 mmol) seguido de TSTU (62,0 mg, 0,206 milimoles). La mezcla se calentó a temperatura ambiente y se agitó a esa temperatura durante 1 hora. La CCF (EtOAc/MeOH/Agua/AcCN: 2/1/1/1) mostró la formación del producto deseado (fR: 0,25) y no quedaba material de partida. Método B de UPLC-EM: tR = 3,47 min, m/z = 417,19 [M+1]. El producto se usó sin purificación adicional para construir el Dímero 73 usando Análogo 5 usando el Método D.

Se describe la síntesis de benceno-1,3-dicarboxilato de bis(2,5-dioxopirrolidin-1-ilo) (tereftalato; Enlazador 34).

Etapa 1. Benceno-1,3-dicarboxilato de bis(2,5-dioxopirrolidin-1-ilo)

A 0 °C, a una solución de ácido tereftálico (100 mg, 0,602 mmol) en THF (2 ml) se le añadió tetrafluoroborato de 2-(2,5-dioxopirrolidin-1-il)-1,1,3,3-tetrametilisouronio (371 mg, 1,234 mmol) seguido de N-etil-N-isopropilpropan-2-amina (0,222 ml, 1,234 mmol)). Después de 30 minutos, el baño de hielo se retiró. La solución se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadieron 25 ml de THF adicionales y la reacción se dejó durante la noche a temperatura ambiente. El producto se concentró a aproximadamente 5 ml y se usó una porción tal cual sin purificación adicional para construir el Dímero 89 usando IHR usando el Método D. El material restante se diluyó con acetato de etilo (200 ml) y se lavó con salmuera (10 ml), la capa orgánica se secó con Na₂SO₄, se filtró y se concentró.

Se describe la síntesis de isoftalato de bis (2,5-dioxopirrolidin-1-ilo) (isoftalato; Enlazador 35).

Etapa 1. Isoftalato de bis (2,5-dioxopirrolidin-1-ilo)

Al ácido isoftálico (54 mg, 0,325 mmol) en DMSO (1 ml) se le añadió TSTU (215 mg, 0,715 mmol) seguido de TEA (0,137 ml, 0,975 mmol). CL-EM 2 min: tR = 0,79 min, m/z = 721,28 [2M+1]. El producto se usó sin purificación para construir el Dímero 90 usando Análogo 5 y el Dímero 91 usando IHR en el Método E.

Se describe la síntesis de 4-((terc-butoxicarbonil)amino) heptanodioato de bis (2,5-dioxopirrolidin-1-ilo) (heptanodioato; Enlazador 36).

Etapa 1. 4-((terc-Butoxicarbonil)amino)heptanodioato de bis(2,5-dioxopirrolidin-1-ilo)

Al ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)heptanodioico (16,5 mg, 0,06 mmol) en DMSO (0,5 ml) se le añadió TSTU ^{(39,7 mg, 0,132 mmol) seguido de TeA (0,025 ml,}0,180 ^{mmol). CL-EM 2 min: tR = 0,90 min, m/z = 470,34 [M+1]. El}producto se usó sin purificación para construir el Dímero 92 usando Análogo 5 y el Dímero 93 usando IHR en el Método E.

Los resultados se muestran en la Tabla 11.

EJEMPLO 26

La síntesis de los Dímeros 71, 72, 77, 78, 81 y 87 fue de la siguiente manera. Se describe la síntesis de (1S,4S)-ciclohexano-1,4-dicarboxilato de bis(2,5-dioxopirrolidin-1-ilo) (Enlazador 30; trans-ciclohexano 1,4-diácido).

A una solución de ácido (1S,4S)-ciclohexano-1,4-dicarboxílico (200 mg, 1,162 mmol) en DCM (11 ml) a 0 °C se le añadieron TSTU (734 mg, 2,439 mmol) y DIPEA (0,5 ml, 2,86 mmol). La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El producto se trituró en la solución de reacción en forma de un sólido de color blanco; se filtró y se lavó con DCM (2x5 ml); y se secó al vacío para obtener el compuesto del título. UPLC-EM ^{calculada para C}16^H18 ^N2^O8^{: 366,11, m\e observado: 367,16 (M+h )+, (tR: 3,20 / 5,00 minutos). Método A de UPLC-}EM. RMN 1H (500 MHz, DMSO): 62,81-2,89 (m; 2 H); 2,80 (s; 8 H); 2,02-2,10 (m; 4 H); 1,57-1,63 (m; 4 H).

Se describe la síntesis de (1R,4R)-ciclohexano-1,4-dicarboxilato de bis(2,5-dioxopirrolidin-1-ilo) (Enlazador 31; cisciclohexano 1,4-diácido).

A una solución de ácido (1R,4R)-ciclohexano-1,4-dicarboxílico (200 mg, 1,162 mmol) en DCM (11 ml) a 0 °C se le añadieron TSTU (734 mg, 2,439 mmol) y DIPEA (0,5 ml, 2,86 mmol). La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El residuo se purificó mediante cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 0 ^{100 %/Hexanos) para proporcionar el compuesto del título. UPLC-EM calculada para C}16^H18 ^N2^O8^{: 366,11, m/z}observado: 367,17 (M+H)+, (tR: 3,17 / 5,00 minutos). Método A de UPLC-EM. RMN 1H (500 MHz, DMSO): 63,02-3,08 (m; 2 H); 2,80 (s; 8 H); 1,80-1,90 (m; 8 H).

Se describe la síntesis de 3,5-bis(2,5-dioxopirrolidin-1-il) (3R,5S)-piperidina-1,3,5-tricarboxilato de 1-(terc-butilo) (Enlazador 32).

A una solución de ácido (3R,SS)-1-(terc-butoxicarbonil)piperidina-3,5-dicarboxílico (200 mg, 0,734 mmol) en DMF (7 ml) a 0 °C se le añadieron TSTU (485 mg, 1,611 mmol) y DIPEA (0,3 ml, 1,718 mmol). La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. El residuo se purificó mediante cromatografía sobre sílice ^{(EtOAc al 0-100 %/Hexanos) para proporcionar el compuesto del título. UPLC-EM calculada para C}20^H25 ^N3^O10^:467,15, m\e observado: 468,30 (M+H)+, (tR: 0,98 / 2,00 minutos). Método A de UPLC-EM.

Método general F: Síntesis de Dímeros de N6-29B,N629B'-insulina usando condiciones de base orgánica

En un recipiente de tamaño adecuado, se suspende insulina o análogo de insulina a temperatura ambiente en un disolvente orgánico o disolventes mixtos ac./orgánicos, por ejemplo, DMSO, en presencia de una base, por ejemplo, TEA o 1,1,3,3-tetrametilguanidina (TMG). Se permite que la mezcla se agite suavemente hasta que la insulina se disuelva por completo. A la solución resultante se le añade un intermedio de éster activado en solución de disolventes orgánicos, tales como DMSO o DMF. Después de la UPLC, el cromatograma muestra que una porción sustancial de ^{la mezcla de reacción se ha convertido en dímero de N}629^{B,N6, B29B-insulina (o dímero de N6,28B,N628B-insulina lispro),}la solución de reacción se transfirió, a través de autopipetas, a un tubo de centrífuga de 50 ml que contenía IPAc/MTBE (v/v 4:1) (45 ml). La adición se realizó gota a gota. La suspensión de color blanco resultante se centrifugó (3000 rpm, 15 minutos, a 4C) para generar un sobrenadante transparente y un sedimento de color blanco. El sobrenadante se extrajo y el sedimento de color blanco se secó al vacío. Después, el sedimento de color blanco que contenía el producto intermedio en bruto se disolvió en 2 ml de TFA a 0 °C y se agitó durante 10 minutos a la misma temperatura. Tras la finalización de la reacción des-boc, la solución de reacción se transfirió, a través de autopipetas, a un tubo de centrífuga de 50 ml que contenía MTBE (45 ml). La adición se realizó gota a gota. La suspensión de color blanco resultante se centrifugó (3000 rpm, 15 minutos, a 4 °C) para generar un sobrenadante transparente y un sedimento de color blanco. ^{El sobrenadante se extrajo y el sedimento de color blanco se secó al vacío y se redisolvió en solución de CH}3^CN/H2^O(v/v 1:4). La mezcla de reacción puede someterse directamente a una purificación por HPLC de fase inversa (columna Waters C4 de 250 x 50 mm, 10 μm, columna de 1000 A o KROMASlL C8 250x50 mm, 10 μm, columna de 100Á; Tampón A: TFA al 0,05-0.1 % en agua desionizada; Tampón B: TFA al 0,05-0,1 % en AcCN) o la reacción puede ^{interrumpirse por dilución cuidadosa con H}2^{O ácida fría (20x, pH ~ 3,0) a 0 °C y su pH se ajusta a un pH final de 2,5}usando HCl 1 N (y NaOH 0,1 N si es necesario). La solución puede concentrarse en primer lugar mediante ultrafiltración, ya sea a través de un sistema de filtración de flujo tangencial (FFT) o usando unidades centrífugas Amicon Ultra-15, con membrana de CPM de 1K, 3K o 10K. La solución concentrada por lo general se somete en primer lugar a cromatografía de intercambio iónico (columna Poly SULFOETHYL A, PolyLC Inc., 250x21 mm, 5 μm, 1000 A; ^{Tampón A: H}3^PO4 ^{al 0,1 %(v/v)/AcCN al 25%; Tampón B: H}3^PO4 ^{al 0,1 %(v/v)/AcCN al 25 %/NaCl 0,5 M). Las}fracciones que contienen el conjugado con B29 con la pureza deseada se combinan y se concentran usando el sistema de FFT o Amicon Ultra-15. Después, la solución concentrada se somete a una purificación por HPLC de fase inversa (columna Waters C4 de 250 x 5o mm, 10 |jm, columna de 1000 A o KROMASIL C8250x50 mm, 10 |jm, columna de 100A; Tampón A: TFA al 0,05-0.1 % en agua desionizada; Tampón B: TFA al 0,05-0,1 % en AcCN). Las fracciones que contienen el dímero de insulina deseado se combinan y se liofilizan o se intercambian tampones usando el sistema de FFT y/o Amicon Ultra-15 para proporcionar los dímeros de W629B,W629B'-insulina.

La Tabla 12 enumera los Dímeros 71,72, 77, 78, 81 y 87, que se prepararon usando el enlazador adecuado siguiendo el Método general B (Dímeros 77 y 78), Método general C (Dímeros 71 y 72) o Método general F (Dímeros 81 y 87). Estos dímeros se caracterizaron usando el Método D de UPLC-EM o el Método E de UPLC-EM, presentando ya sea seis especies cargadas, es decir, [(M+6)/6], (o siete especies cargadas, es decir, [(M+7)/7]) del compuesto original a determinado tiempo de retención (tR).

(continuación)

EJEMPLO 26

La síntesis de Dímero 68 y Dímero 74 fue de la siguiente manera.

Se describe la síntesis de 6,6'-((6-cloro-1,3,5-triazina-2,4-diil)bis(azanodiil))dihexanoato de bis(2,5-dioxopirrolidin-1-ilo) (Enlazador 33; C6N-cloro-1,3,5-Triazina-NC6).

La solución de 2,4,6-tricloro-1,3,5-triazina (80 mg, 0,434 mmol) y sal de HCl de 6-aminohexanoato de metilo (129 mg, ^{0,889 mmol) en CH}2^{Ch (1 ml) se enfrió a -30 °C. Se añadió gota a gota una solución de DIPEA (0,379 ml, 2,169 mmol) en CH}2^Cl2 ^{(1 ml). La mezcla se agitó a -30 °C-temperatura ambiente durante 5 horas. Después se añadió CH}2^ch(20 ml) y la mezcla se lavó con HCl acuoso (1 M) (2X10 ml), NaHCO acuosos (10 ml) y salmuera (10 ml). La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio y se filtró, se concentró al vacío para proporcionar 6,6'-((6-cloro-1,3,5-triazina-2,4-diil)bis(azanodiil))dihexanoato de dimetilo (135 mg, 0,336 mmol).

A la solución de 6,6'-((6-cloro-1,3,5-triazina-2,4-diil)bis(azanodiil))dihexanoato de dimetilo (135 mg, 0,336 mmol) en THF (0,5 ml) y metanol (0,5 ml) se le añadió LiOH acuoso (2 M) (504 μl, 1,008 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y después se concentró al vacío para producir un residuo seco. Se disolvió el residuo en agua y se neutralizó con HCl ac. Se recogió el precipitado por filtración y se lavó con agua. Se secó el sólido al vacío para proporcionar ácido 6,6'-((6-cloro-1,3,5-triazina-2,4-diil)bis(azanodiil))dihexanoico.

A una solución de ácido 6,6'-((6-cloro-1,3,5-triazina-2,4-diil)bis(azanodiil))dihexanoico (108 mg, 0,289 mmol) en DMF (2889 μl) se le añadió TSTU (174 mg, 0,578 mmol) seguido de trietilamina (81 μl, 0,578 mmol). Se agitó la reacción durante 1 hora. La UPLC indica la formación del material deseado Método C de U^pLC-EM: tR = 0,99 min, m/z = 568,2 [M+1]. Este reactivo (0,1 M/DMF) se usó sin purificación adicional.

Los dímeros se prepararon usando el Método general B (Dímero 74) o el Método general C (Dímero 68). Estos dímeros se caracterizaron usando el Método D de UPLC-EM o el Método E de UPLC-EM, presentando ya sea seis especies cargadas, es decir, [(M+6)/6], (o siete especies cargadas, es decir, [(M+7)/7]) del compuesto original a determinado tiempo de retención (tR). El Dímero 68 se construyó usando Enlazador 33 e IHR. El Dímero 74 se construyó usando Enlazador 33 y Análogo 5. Los resultados se muestran en la Tabla 13.

EJEMPLO 27

La síntesis del Dímero 54 fue de la siguiente manera.

Se disolvió A1-TFA-IHR (D. Liu et al., Journal of Peptide Sci., 2012, 18, 336-341) (100 mg, 0,017 mmol) en una premezcla que contenía agua (5 ml) y fosfato de potasio dibásico (24,49 mg, 0,141 mmol) (el pH de la solución resultante era de aproximadamente 0,4). Se añadió cianato de potasio (27,5 mg, 0,339 mmol) y se agitó durante la ^{noche. El producto se purificó mediante cromatografía de fase inversa en fase C}-8 ^{(Columna k Ro MASIL, C}8^{10 uM}100A, tamaño 250 x 50 mm; disolvente A = agua/TFA al 0.05%, disolvente B = AcCN/TFA al 0.05%), Flujo = 85 ml/min, gradiente de B en A 26-34 % en 30 min. Método F de UPLC-EM: tR = 4,48 min, m/z = 1486,9 [(M+4)/4 1].

Se disolvió el producto anterior (60 mg, 10,09 jmol) en DMSO (594 jl) y se añadió trietilamina (28,1 jl, 0,202 mmol) seguido de una solución de suberato de disuccinimidilo enlazador (1,858 mg, 5,04 jmol) disuelto en 100 jl de DMSO. Se agitó durante 3 horas. La UPLC indicó la reacción completa. Se añadió toda la mezcla de reacción a hidróxido de amonio (2105 jl, 15,13 mmol) (gota a gota, se esperaba exotermia). Se agitó suavemente durante 2 horas y se confirmó la desprotección del grupo TFA. Se diluyó la mezcla en 20 ml de agua y se retiró la mayor parte del hidróxido ^{de amonio mediante diafiltración usando tubos Amicon}10^{K. Se ajustó el pH a aproximadamente 3 y se retiraron las}sales mediante diafiltración. El producto se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico (columna ^{PolySULFOETHYL A, PolyLC Inc., 250x21 mm, 5 jm, 1000 A; Tampón A: HaPO}4^{al 0,1 %(v/v)/AcCN al 25%; Tampón B: H}3^PO4 ^{al 0,1 %(v/v)/AcCN al 25 %/NaCl 0,5 M). El producto se volvió a purificar mediante cromatografía de fase inversa en fase C}-8 ^{(Columna KROMASIL, C}8^{10 jM 100A, tamaño 250 x 50 mm; disolvente A = agua/TFA al 0.05 %,}disolvente B = AcCN/TFA al 0,05 %). El resultado se muestra a continuación. Los resultados se muestran en la Tabla 14.

EJEMPLO 28

Los Ensayos de unión al receptor de insulina se realizaron de la siguiente manera.

El ensayo de unión al RI se realizó en un ensayo de proximidad de centelleo (EPC) en formato de 384 pocillos usando membranas celulares preparadas a partir de células CHO que sobreexpresan IR(B) humano cultivadas en medios F12 que contenían FBS al 10 % y antibióticos (G418, Penicilina/Estrepavidina). Las membranas celulares se prepararon en tampón Tris 50 mM, pH 7,8 que contenía MgCh 5 mM. El tampón de ensayo contenía tampón Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, CaCh 1 mM, MgCh 5 mM, BSA al 0,1 % e inhibidores de proteasa (Complete-Mini-Roche). Se añadieron membranas celulares a perlas WGA PVT PEI SPA (concentración final de 5 mg/ml) seguido de la adición de moléculas de dímero de insulina a concentraciones adecuadas. Después de una incubación de 5-15 min a temperatura ambiente, se añadió 125[I]-insulina a una concentración final de 0,015 nM para un volumen total final de 50 |jl. La mezcla se incubó con agitación a temperatura ambiente durante 1 a 12 horas seguido de recuento de centelleo para determinar la unión de 125[I]-insulina a IR y los efectos de titulación de las moléculas de dímero de insulina en esta interacción.

EJEMPLO 29

Los ensayos de fosforilación de AKT del receptor de insulina (RI) se realizaron de la siguiente manera.

Ensayo de fosforilación de AKT del RI: La activación del receptor de insulina se puede evaluar midiendo la fosforilación de la proteína Akt, una etapa clave en la cascada de señalización del receptor de insulina. Se utilizaron estirpes celulares CHO que sobreexpresaban el IR humano en un kit de ensayo ELISA de tipo sándwich HTRF (Cisbio "Phospho-AKT(Ser473) and Phospho-AKT(Thr308) Cellular Assay Kits"). Las células se cultivaron en medio F12 suplementado con FBS al 10 %, G418 400 jg/ml y HEPES 10 mM. Antes del ensayo, las células se incubaron en medio sin suero durante 2 a 4 horas. Como alternativa, las células podían congelarse y dividirse en alícuotas con anticipación en medios que contenían DMSO al 20 % y usarse en el ensayo tras la descongelación, centrifugado y resuspensión. Las células se sembraron en placa a 10.000 células por pocillo en 20 jl del medio F12 sin suero en 3 placas de 84 pocillos. Se ejecutaron controles de humulina e insulina glargina en cada placa de compuestos de ensayo. Los compuestos titulados se añadieron a las células (2 jl por pocillo, concentraciones finales = 1000 nM tituladas a 0,512 μM en diluciones 1:5) y se incubaron a 37 °C durante 30 min. Las células se lisaron con 8 jl del tampón de lisis preparado proporcionado en el kit CisBio y se incubaron a 25 °C durante 1 h. Los reactivos de anticuerpos diluidos (anti-AKT-d2 y anti-pAKT-Eu3/criptato) se prepararon de acuerdo con las instrucciones del kit y después se añadieron 10 jl a cada pocillo de lisado celular seguido de incubación a 25 °C durante 3,5 a 5 h. La placa se leyó en un lector de placas Envision (Excitación = 320 nm; Emisión = 665 nm) para determinar la actividad agonista de pAkt de RI con respecto a la potencia y la respuesta máxima para cada compuesto. Como alternativa, los compuestos se sometieron a ensayo de la misma manera en presencia de 1,6 nM de Humulina para determinar cómo podía competir cada compuesto contra la actividad agonista total de la insulina.

EJEMPLO 30

La Tabla 15 muestra la actividad biológica in vitro de los dímeros de insulina hacia el receptor de insulina (RI). Las actividades se midieron mediante ensayos de competencia de ligandos como se describe en el EJEMPLO 28 o ensayos funcionales de fosforilación de Akt como se describe en el EJEMPLO 29.

EJEMPLO 31

En este ejemplo, se compararon los efectos en vivo de varios agonistas parciales del receptor de insulina con el Compuesto A (dímero de insulina MIU-90 desvelado en la solicitud ^pC^tpublicada N.° WO2014052451) y el Compuesto B (B29,B29'-suberoil-(insulina)₂) desvelado en Deppe et al., Nauyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 350: 213-217 (1994) pero usando IHR en lugar de insulina bovina en un Ensayo de tolerancia a la insulina intraperitoneal (ETI-IP) realizado en ratones macho adultos C57BL/6NTac delgados.

^{Se aleatorizaron por peso grupos de N=}6-8 ^{animales por grupo (promedio de aproximadamente 30 gramos). Dos días}antes del estudio, los ratones se acondicionaron a la dosificación con una inyección intraperitoneal de solución de cloruro de sodio al 0,9 % a un volumen de dosificación de 5 ml/kg. En la mañana del estudio, la comida se retiró dos o cuatro horas antes del estudio. Las concentraciones de glucosa en sangre se determinaron en T = 0 min (valor basal) usando un Glucómetro. Después, se administró a los ratones vehículo, Dímero 24, Dímero 55, Dímero 58, Dímero 60, Dímero 67, Compuesto A, Compuesto B o Humulina (IHR) a 5 ml/kg a través de inyección intraperitoneal (véase la Tabla 16 para las dosis utilizadas). Los niveles de glucosa en sangre se determinaron a partir de muestras de sangre de la cola tomadas entre 30 y 360 minutos después de la dosis.

Los resultados se muestran en la Figura 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F y 2G. Los resultados muestran que el perfil de glucosa para el Dímero 24, el Dímero 55, el Dímero 58, el Dímero 60 y el Dímero 67 fueron sustancialmente iguales en ambas dosis sometidas a ensayo, mientras que el aumento de la dosis de los compuestos A y B provocó un aumento de la potencia hipoglucemiante, lo que indica un menor potencial de riesgo de hiperglucemia para los dímeros en comparación con la IHR o los compuestos A y B.

EJEMPLO 32

El efecto hipoglucemiante de los Dímeros 24, 18 y 40 se comparó con la IHR en cerdos miniatura diabéticos de Yucatán (minipigs D) de la siguiente manera.

Se convirtieron minicerdos de Yucatán en diabéticos de tipo 1 mediante inyecciones de Alloxan siguiendo un protocolo patentado desarrollado por Sinclair Research Center (Auxvasse, MO). La inducción se considera satisfactoria si los niveles basales de glucosa superan los 150 mg/dl. En estos experimentos se utilizaron mminicerdos D con niveles de glucosa en plasma de aproximadamente 300 mg/dl.

En estos estudios se usaron minicerdos de Yucatán macho, equipados con dos puertos de acceso vascular de la vena yugular (PAV). El día del estudio después de un ayuno nocturno, los minicerdos se colocaron en cabestrillos y se accedió a los PAV para la infusión y el muestreo. A t = 0 min, y después de recoger dos muestras de sangre de referencia para la medición de glucosa en plasma (t = -30 minutos y t = 0 minutos), se administró a los minicerdos Humulina (insulina humana recombinante, ⁱH^r) o APRI como un bolo único IV, a 0,69 nmol/kg. La Humulina y el APRI se formularon a 69 nmol/ml en un tampón que contenía Glicerina, 16mg/ml; Metacresol, 1,6 mg/ml; Fenol, 0,65 mg/ml; Fosfato de sodio anhidro, Dibásico, 3,8 mg/ml; pH ajustado a 7,4 con HCl. Después de la dosificación, el muestreo ^{continuó durante 480 minutos; los puntos temporales para la recogida de muestras fueron -30 min, 0 min,}8 ^{min, 15}min, 30 min, 45 min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min, 180 min, 210 min, 240 min, 270 min, 300 min, 330 min, 360 min, 420 min, 480 minutos. La sangre se recogió en tubos K3-EDTA, suplementados con aprotinina 10|jg/ml y mantenidos en hielo hasta su procesamiento, que se produjo dentro de los 30 minutos siguientes a la recogida. ^{Después de la centrifugación a 3000 rpm, 4 °C, durante}8 ^{min, se recogió el plasma y se dividió en alícuotas para la}medición de la glucosa usando un analizador químico Beckman Coulter AU480 y para la medición de los niveles de compuestos.

La Figura 1 muestra que a una concentración de 0,69 nmol/kg, la IHR redujo los niveles de glucosa en suero por debajo de 50 mg/dl mientras que los dímeros de insulina no lo hicieron. Este resultado muestra que los dímeros de insulina presentan menos riesgo de promover hipoglucemia que la IHR.

EJEMPLO 33

El efecto hipoglucemiante de los Dímeros 4, 5, 7, 8, 9, 18-29, 32, 37-41, 43, 44, 48, 55, 57, 58, 60, 61, 62, 64, 67, 69, 71, 72, 77 y 78 se comparó con la IHR en cerdos miniatura diabéticos de Yucatán (minipigs D) de la siguiente manera.

Se convirtieron minicerdos de Yucatán en diabéticos de tipo 1 mediante inyecciones de Alloxan siguiendo un protocolo patentado desarrollado por Sinclair Research Center (Auxvasse, MO). La inducción se considera satisfactoria si los niveles basales de glucosa superan los 150 mg/dl. En estos estudios se usaron minicerdos D con niveles de glucosa en plasma de aproximadamente 300-400 mg/dl y equipados con dos puertos de acceso vascular (VAP) en la vena yugular.

El día del estudio, después de un ayuno nocturno, los minicerdos se colocaron en cabestrillos y se accedió a los PAV para la infusión y el muestreo. A t = 0 min, y después de recoger dos muestras de sangre de referencia para la medición de glucosa en plasma (t = -30 minutos y t = 0 minutos), se administró a los minicerdos Humulina (insulina humana recombinante, IHR) u otro dímero como un bolo único IV, a 0,69 nmol/kg (0,35 nmol/kg para el compuesto n.° 78). La Humulina y los dímeros se formularon a 69 nmol/ml en un tampón que contenía Glicerina, 16 mg/ml; Metacresol, 1,6 mg/ml; Fenol, 0,65 mg/ml; Fosfato de sodio anhidro, Dibásico, 3,8 mg/ml, pH ajustado a 7,4 con HCl. Después de la dosificación, el muestreo continuó durante 480 minutos; los puntos temporales para la recogida de muestras fueron -30 minutos, 0 minutos, 8 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 120 minutos, 150 minutos, 180 minutos, 210 minutos, 240 minutos, 270 minutos, 300 minutos, 330 minutos, 360 minutos, 420 minutos y 480 minutos. La sangre se recogió en tubos K3-EDTA, suplementados con aprotinina 10 μg/ml y mantenidos en hielo hasta su procesamiento, que se produjo dentro de los 30 minutos siguientes a la recogida. Después de la centrifugación a 3000 rpm, 4 °C, durante 8 minutos, el plasma se recogió y se dividió en alícuotas para la medición de la glucosa usando un analizador químico Beckman Coulter AU480. Los resultados se muestran en la Figura 7A - 7H. Las Figuras muestran que a una concentración de 0,69 nmol/kg, la IHR redujo los niveles de glucosa en suero por debajo de 50 mg/dl mientras que los dímeros de insulina no lo hicieron. Este resultado muestra que los dímeros de insulina presentan menos riesgo de promover hipoglucemia que la IHR.

EJEMPLO 34

Este experimento comparó la estabilidad del resto de unión de disulfuro del Compuesto A con el resto de unión de suberαlo (C8) del Dímero 24.

El Compuesto A y el Dímero 24 1 μM se incubaron cada uno por separado en Membranas de células de riñón de rata (MCRR) con o sin glutatión (GSH) 5 mM. Se obtuvieron muestras de Tiempo 0 y Tiempo 2 horas y la reacción se interrumpió con 1 volumen de MeOH al 10 % en AcCN con ácido fórmico al 0,1 %. Después, las muestras inactivadas se centrifugaron y se congelaron antes del análisis. Después, las muestras se descongelaron y se analizaron usando el sistema Thermo Orbi Velos. El análisis por MetID dirigido se realizó con Cromatogramas de iones extraídos (XIC, por sus siglas en inglés) usando 3 isótopos de 2 estados de carga en una ventana de 10 ppm.

Se detectaron metabolitos del Compuesto A en MCRR tanto sin GSH como con GSH. Como se muestra en la Figura 3, el monómero era aproximadamente el 1 % del original (solución madre del Compuesto A) en 2 horas de incubación. Como se muestra en la Figura 4, el monómero era aproximadamente el 6,5 % del original (solución madre del Compuesto A) en 2 horas de incubación. Los resultados muestran que el enlace disulfuro se estaba rompiendo con el tiempo. No se observaron metabolitos en los controles de 0 horas para el Compuesto A o en las soluciones madre.

El Dímero 24 produjo metabolitos que se detectaron en MCRR, sin embargo, aunque se observó pérdida del polipéptido de cadena A debido a la ruptura de los enlaces disulfuro entre el polipéptido de cadena A y el polipéptido de cadena B, no se detectaron monómeros. La Figura 5 muestra que sin GSH, la pérdida del polipéptido de cadena A fue inferior al 1 % del original (solución madre de Dímero 24). La Figura 6 muestra que con GSH, la pérdida del polipéptido de cadena A fue inferior al 1 % del original (solución madre de Dímero 24). No se observaron metabolitos en los controles de 0 horas para el Dímero 24 o en las soluciones madre. El nuevo procedimiento de inactivación con condiciones ácidas detuvo adecuadamente el intercambio de disulfuro.

(continuación)

Aunque la presente invención se describe en el presente documento con referencia a las realizaciones ilustradas, debe comprenderse que la invención no se limita a las mismas. Aquellos que tienen habilidad habitual en la técnica y acceso a las enseñanzas del presente documento reconocerán modificaciones y realizaciones adicionales dentro del alcance de las mismas. Por lo tanto, la presente invención está limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto seleccionado de entre el grupo que consiste en

en los que las uniones disulfuro entre los restos Cys6 y Cys-n del polipéptido de cadena A y las uniones disulfuro entre ^{el Cysy y el Cys}20 ^{de la cadena A al Cysy y al Cys-ig del polipéptido de cadena B, respectivamente, están representadas}por la línea continua que las separa; en donde los restos de unión están unidos covalentemente al aminoácido épsilon del resto lisina que se muestra, en donde el polipéptido de cadena A para los Dímeros 71, 72, 77 y 78 tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEQ ID NO: 1; y el polipéptido de cadena B para los Dímeros 71, 72, 77 y 78 tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEQ ID NO: 2, respectivamente.

2. Un dímero de insulina de la reivindicación 1 que comprende:

una primera Lys B29 o B28 de una primera molécula de heterodímero de insulina que tiene un primer polipéptido de cadena A y un primer polipéptido de cadena B y una segunda Lys B29 o B28 de un segundo heterodímero de insulina que tiene un segundo polipéptido de cadena A y un segundo polipéptido de cadena B que tiene una conjugación que es un enlazador bifuncional seleccionado de entre el grupo que consiste en:

3. Un compuesto de la reivindicación 1 que tiene la siguiente fórmula

Dímero 71.

4. Una composición que comprende uno o más compuestos de la reivindicación 3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

5. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o una composición de la reivindicación 4 para su uso en el tratamiento de la diabetes.

6^{. El compuesto para el uso de la reivindicación 5, en donde la enfermedad es diabetes de tipo 1, diabetes de tipo 2 o}diabetes gestacional.