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JP6309450B2 - セロトニン関連の医学的状態、アドレナリン関連の医学的状態、ノルアドレナリン関連の医学的状態、グルタミン酸関連の医学的状態および副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン関連の医学的状態の処置および診断のためのミクロｒｎａおよび該ミクロｒｎａを含む組成物 - Google Patents

セロトニン関連の医学的状態、アドレナリン関連の医学的状態、ノルアドレナリン関連の医学的状態、グルタミン酸関連の医学的状態および副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン関連の医学的状態の処置および診断のためのミクロｒｎａおよび該ミクロｒｎａを含む組成物 Download PDF

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Description

本発明はそのいくつかの実施形態において、ミクロＲＮＡに関連し、より具体的には、しかし、限定ではなく、疾患を診断し、処置し、また、処置をモニターするための該ミクロＲＮＡの使用に関連する。
気分障害（例えば、大うつ病など）は、人口の約１０％が世界中で襲われる最も一般的かつ急増している健康問題の一部を占める。何十年の研究にもかかわらず、うつ病発症の背後に潜む機構、罹病性および利用可能な治療法は一部が理解されているにすぎない。現在、約１／３の患者だけが、利用可能な処置に応答しており、したがって、その病理学をより良く理解することが非常に求められている。うつ病の病因に関する現在の定説は、環境的要因と遺伝学的素因との間における複雑な相互作用からなり、これにより、エピジェネティックプロセスについての機構的役割が示唆されている。
セロトニン（５ＨＴ）は、様々な認知機能、情動機能および生理学的機能を調整するために脳全体に広範囲に突き出る縫線核（ＲＮ）によって脳内で産生されるモノアミン型神経伝達物質である。調節不全のセロトニン作動性活性と、うつ病とのつながりが十分に立証されている［Ｍｉｃｈｅｌｓｅｎ ＫＡ他、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｒｅｖ、（２００７）５５（２）：３２９〜４２］。５ＨＴのレベル、同様にまた、その産生、分泌、再取り込みおよび不活性化に関わる遺伝的回路網がうつ病では調節不全となっている。さらに、ほとんどの現在利用可能な抗うつ剤は、５ＨＴ系に関連づけられるタンパク質の機能を標的としており、これにより、増大した５ＴＨレベルをシナプスにおいてもたらしている［Ｋｒｉｓｈｎａｎ ＶおよびＮｅｓｔｌｅｒ ＥＪ、Ｎａｔｕｒｅ、（２００８）４５５：８９４〜９０２］。利用可能な治療剤は、症状の緩和が認められるまでに長期間の投与を必要とする。
ミクロＲＮＡ（ｍｉＲ）は、遺伝子発現を転写後に抑制する内因性の小さい（およそ２２ヌクレオチドの）ＲＮＡ分子のサブセットである。ｍｉＲは、ステムループ構造を有する前駆体ｍｉＲに細胞の核においてプロセッシングされる一次ｍｉＲ分子として転写され、その後、この前駆体ｍｉＲが、活性な成熟型ｍｉＲにさらにプロセッシングされる細胞質に排出される。成熟型ｍｉＲは続いて、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体に取り込まれ、主に、特定のｍＲＮＡ分子の３’未翻訳領域（３’ＵＴＲ）に結合することによって機能する。結合が、標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲにおける相補的なシード一致配列に対して対形成するシード配列（ｍｉＲの５’末端における６〜８ヌクレオチド配列）を介して生じる。ｍｉＲの結合は、直接的なｍＲＮＡ脱安定化または翻訳抑制を引き起こし、最終的には、標的遺伝子の低下したタンパク質レベルをもたらす。
ｍｉＲは神経系に多量に存在しており、初期の研究は主に、発達、癌および神経変性障害、ならびに、正常なプロセス（例えば、可塑性など）との関連においてニューロンに集中している［Ｋｏｓｉｋ ＫＳ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、（２００６）７：９１１〜２０］。加えて、ｍｉＲは、ヒトおよびマウスモデルの両方で、精神医学的障害、例えば、統合失調症、自閉症、また同様に、うつ病および不安においてある一定の役割を果たすことが示唆されている［Ｍｉｌｌｅｒ ＢＨおよびＷａｈｌｅｓｔｅｄｔ Ｃ、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ、（２０１０）１３３８：８９〜９９］。いくつかの研究では近年、５ＨＴ系の調節におけるｍｉＲの新たに明らかになりつつある役割、ならびに、うつ病関連障害とのそれらの潜在的連関を明らかにする、５ＨＴ関連遺伝子を調節することにおけるｍｉＲの関与が明らかにされている［Ｍｉｌｌａｎ ＭＪ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、（２０１１）１１（１）：１１〜２２］。
米国特許出願公開第２０１００２２２４１３号（Ｓｔｏｆｆｅｌ Ｍ．他）は、ミクロＲＮＡの発現を調整するための化学修飾されたオリゴヌクレオチドを開示する。米国特許出願公開第２０１００２２２４１３号はさらに、ミクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９２およびｍｉＲ−１９４）のサイレンシングを、中枢神経系の疾患を処置するために行うための方法を開示する。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、セロトニンレベルの上昇が治療上有益である医学的状態を処置の必要性のある対象において処置する方法であって、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−２６およびｍｉＲ−１８２からなる群から選択される少なくとも１つのミクロＲＮＡまたはその前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドを上記対象の細胞に投与し、または、上記対象の細胞において発現させ、それにより、上記医学的状態を処置することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−２６およびｍｉＲ−１８２からなる群から選択される少なくとも１つのミクロＲＮＡまたはその前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドの使用であって、セロトニンレベルの上昇が治療上有益である医学的状態を処置するために特定される医薬を製造するための使用が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、セロトニンレベルをその必要性のある対象のシナプス間隙において増大させる方法であって、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−２６およびｍｉＲ−１８２からなる群から選択される少なくとも１つのミクロＲＮＡまたはその前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドを上記対象のセロトニン作動性ニューロンに投与し、または、上記対象のセロトニン作動性ニューロンにおいて発現させ、それにより、セロトニンレベルを上記シナプス間隙において増大させることを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−２６およびｍｉＲ−１８２からなる群から選択される少なくとも１つのミクロＲＮＡまたはその前駆体をシス作用調節要素の転写制御下において発現する核酸構築物を含む単離された神経膠細胞が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、セロトニンレベルの上昇が治療上有益である医学的状態を処置するための、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−２６およびｍｉＲ−１８２からなる群から選択される少なくとも１つのミクロＲＮＡまたはその前駆体をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、アドレナリンまたはノルアドレナリンの低いレベルが治療上有益である医学的状態を処置の必要性のある対象において処置する方法であって、ｍｉＲ−１９またはその前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドを上記対象の細胞に投与し、または、上記対象の細胞において発現させ、それにより、上記医学的状態を処置することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ｍｉＲ−１９またはその前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドの使用であって、アドレナリンまたはノルアドレナリンの低いレベルが治療上有益である医学的状態を処置するために特定される医薬を製造するための使用が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ｍｉＲ−１９またはその前駆体をシス作用調節要素の転写制御下において発現する核酸構築物を含む単離された細胞が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、アドレナリンまたはノルアドレナリンの低いレベルが治療上有益である医学的状態を処置するための、ｍｉＲ−１９またはその前駆体をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）の低いレベルが治療上有益である医学的状態を処置の必要性のある対象において処置する方法であって、ｍｉＲ−１５またはその前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドを上記対象の細胞に投与し、または、上記対象の細胞において発現させ、それにより、上記医学的状態を処置することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ｍｉＲ−１５またはその前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドの使用であって、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）の低いレベルが治療上有益である医学的状態を処置するために特定される医薬を製造するための使用が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ｍｉＲ−１５またはその前駆体をシス作用調節要素の転写制御下において発現する核酸構築物を含む単離された細胞が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）の低いレベルが治療上有益である医学的状態を処置するための、ｍｉＲ−１５またはその前駆体をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、グルタミン酸受容体の低いレベルが治療上有益である医学的状態を処置の必要性のある対象において処置する方法であって、ｍｉＲ−１８１またはその前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドを上記対象の細胞に投与し、または、上記対象の細胞において発現させ、それにより、上記医学的状態を処置することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ｍｉＲ−１８１またはその前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドの使用であって、グルタミン酸受容体の低いレベルが治療上有益である医学的状態を処置するために特定される医薬を製造するための使用が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ｍｉＲ−１８１またはその前駆体をシス作用調節要素の転写制御下において発現する核酸構築物を含む単離された細胞が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、グルタミン酸受容体の低いレベルが治療上有益である医学的状態を処置するための、ｍｉＲ−１８１またはその前駆体をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−２７、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１９およびｍｉＲ−１５からなる群から選択されるミクロＲＮＡまたはその前駆体をコードする核酸配列を含み、上記核酸配列がシス作用調節要素の転写制御下にある核酸構築物が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、本発明の核酸構築物と、医薬的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、トリプトファンヒドロキシラーゼ２（Ｔｐｈ２）遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、ｍｉＲ−１８１およびｍｉＲ−２７からなる群から選択されるミクロＲＮＡまたはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整し、それにより、上記Ｔｐｈ２遺伝子の発現を調節することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、グルタミン酸受容体遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、ｍｉＲ−１８１またはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整し、それにより、上記グルタミン酸受容体遺伝子の発現を調節することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−２７またはその前駆体の発現をダウンレギュレーションするための核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ｍｉＲ−１８１およびｍｉＲ−２７からなる群から選択されるミクロＲＮＡまたはその前駆体の発現をダウンレギュレーションするための核酸配列を含み、上記核酸配列がシス作用調節要素の転写制御下にある核酸構築物が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、セロトニン輸送体（Ｓｌｃ６ａ４）遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、ｍｉＲ−１３５およびｍｉＲ−３３５からなる群から選択されるミクロＲＮＡまたはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整し、それにより、上記Ｓｌｃ６ａ４遺伝子の上記発現を調節することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、セロトニン阻害受容体１ａ（Ｈｔｒ１ａ）遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−２６からなる群から選択されるミクロＲＮＡまたはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整し、それにより、上記Ｈｔｒ１ａ遺伝子の上記発現を調節することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ダウン症候群細胞接着分子（Ｄｓｃａｍ）遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、ｍｉＲ−１８２またはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整し、それにより、上記Ｄｓｃａｍ遺伝子の上記発現を調節することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、細胞接着分子Ｌ１（Ｌ１ｃａｍ）遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、ｍｉＲ−１８２またはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整し、それにより、上記Ｌ１ｃａｍ遺伝子の上記発現を調節することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、トランスリン会合タンパク質Ｘ（Ｔｓｎａｘ）遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、ｍｉＲ−１８２またはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整し、それにより、上記Ｔｓｎａｘ遺伝子の上記発現を調節することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、モノアミンヒドロキシラーゼ（ＭａｏＡ）遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、ｍｉＲ−２７の活性または発現を調整し、それにより、上記ＭａｏＡ遺伝子の上記発現を調節することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ベータアドレナリン作動性受容体１（Ａｄｒｂ１）遺伝子の発現を神経膠細胞または心臓細胞において調節する方法であって、ｍｉＲ−１９の活性または発現を調整し、それにより、上記Ａｄｒｂ１遺伝子の上記発現を調節することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、カナビノイド受容体１（ＣＢ１）遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、ｍｉＲ−１９またはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整し、それにより、上記ＣＢ１遺伝子の上記発現を調節することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ＣＲＨ１型受容体遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、ｍｉＲ−１５の活性または発現を調整し、それにより、上記ＣＲＨ１型受容体遺伝子の上記発現を調節することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ＦＫ５０６結合タンパク質５（ＦＫＢＰ５）遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、ｍｉＲ−１５またはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整し、それにより、上記ＦＫＢＰ５遺伝子の上記発現を調節することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、シンタキシン１ａ（Ｓｔｘ１ａ）遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、ｍｉＲ−１５またはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整し、それにより、上記Ｓｔｘ１ａ遺伝子の上記発現を調節することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、血清／グルココルチコイド調節キナーゼ（Ｓｇｋ１）遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、ｍｉＲ−１５またはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整し、それにより、上記Ｓｇｋ１遺伝子の上記発現を調節することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ベータ２型アドレナリン作動性受容体（Ａｄｒｂ２）遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、ｍｉＲ−１５またはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整し、それにより、上記Ａｄｒｂ２遺伝子の上記発現を調節することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、抗うつ剤の処置をモニターする方法であって、（ａ）処置の必要性のある対象を抗うつ剤により処置すること、および、（ｂ）上記対象の血液におけるｍｉＲ−１３５の発現レベルを上記処置の前後で測定することを含み、上記抗うつ剤による上記処置の前における上記ｍｉＲ−１３５の発現レベルと比較して、上記抗うつ剤による上記処置の後における上記ｍｉＲ−１３５のより低い発現レベルにより、上記処置が効率的であることが示される、方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、セロトニン関連の医学的状態を診断の必要性のある対象において診断する方法であって、ｍｉＲ−１３５の発現レベルを上記対象の血液において測定することを含み、健康な対象の血液試料の場合上記と比較して上記ｍｉＲ−１３５の高い発現レベルが、上記セロトニン関連の医学的状態を示すものである、方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞は神経膠細胞である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記神経膠細胞はセロトニン作動性ニューロンである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ｍｉＲ−１３５は、配列番号５８〜６２に示される通りである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ｍｉＲ−３３５は、配列番号６３〜６４に示される通りである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ｍｉＲ−２６は、配列番号６５〜６９に示される通りである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ｍｉＲ−１８２は、配列番号７０〜７１に示される通りである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記医学的状態は、うつ病、不安、ストレス、疲労、損なわれた認知機能、パニック発作、脅迫行動、嗜癖、社会恐怖、睡眠障害、食品関連障害、成長障害および生殖障害からなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ミクロＲＮＡがｍｉＲ−１３５であるとき、上記医学的状態はうつ病または不安である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞は神経膠細胞または心臓細胞である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ｍｉＲ−１９は、配列番号７２〜７６に示される通りである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記医学的状態は、ストレス、不安、記憶障害および心臓の病気からなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ｍｉＲ−１５は、配列番号７７〜８０に示される通りである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記医学的状態は、うつ病、不安、ストレス、疲労、損なわれた認知機能、パニック発作、脅迫行動、嗜癖、社会恐怖、睡眠障害、食品関連障害、成長障害および生殖障害からなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ポリヌクレオチドは、神経膠細胞において活性であるシス作用調節要素の転写制御下にある。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ポリヌクレオチドは、心臓細胞において活性であるシス作用調節要素の転写制御下にある。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ｍｉＲ−１８１は、配列番号８５〜９４に示される通りである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記医学的状態は、てんかん発作、ハンチントン病、統合失調症、脆弱Ｘ症候群、全般性不安障害および癌からなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記シス作用調節要素は神経膠細胞または心臓細胞において活性である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記対象はヒト対象である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記調節することが、上記Ｔｐｈ２遺伝子の発現をアップレギュレーションすることを含むとき、上記調整することは、上記ｍｉＲ−１８１および／または上記ｍｉＲ−２７を上記神経膠細胞においてダウンレギュレーションすることを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記Ｔｐｈ２遺伝子の発現を上記ｍｉＲ−１８１および／または上記ｍｉＲ−２７の上記神経膠細胞における上記ダウンレギュレーションの後で測定することを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記グルタミン酸受容体遺伝子は、グルタミン酸受容体代謝型１（Ｇｒｍ１）、グルタミン酸受容体イオンチャネル型カイニン酸３（Ｇｒｉｋ３）、グルタミン酸受容体代謝型５（Ｇｒｍ５）、グルタミン酸受容体イオンチャネル型カイニン酸２（Ｇｒｉｋ２）およびグルタミン酸受容体代謝型７（Ｇｒｍ７）からなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記調節することが、上記Ｓｌｃ６ａ４遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることを含むとき、上記調整することは、上記ｍｉＲ−１３５および／またはｍｉＲ−３３５を上記神経膠細胞においてアップレギュレーションすることを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記Ｓｌｃ６ａ４遺伝子の発現を上記ｍｉＲ−１３５および／またはｍｉＲ−３３５の上記神経膠細胞における上記アップレギュレーションの後で測定することを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記調節することが、上記Ｈｔｒ１ａ遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることを含むとき、上記調整することは、上記ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−２６を上記神経膠細胞においてアップレギュレーションすることを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記Ｈｔｒ１ａ遺伝子の発現を、上記ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−２６の上記神経膠細胞における上記アップレギュレーションの後で測定することを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記調節することが、上記ＭａｏＡ遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることを含むとき、上記調整することは、上記ｍｉＲ−２７を上記神経膠細胞においてアップレギュレーションすることを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記ＭａｏＡ遺伝子の発現を上記ｍｉＲ−２７の上記神経膠細胞における上記アップレギュレーションの上記アップレギュレーションの後で測定することを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記調節することが、上記Ａｄｒｂ１遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることを含むとき、上記調整することは、上記ｍｉＲ−１９を上記神経膠細胞または上記心臓細胞においてアップレギュレーションすることを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記Ａｄｒｂ１遺伝子の発現を上記ｍｉＲ−１９の上記神経膠細胞または上記心臓細胞における上記アップレギュレーションの後で測定することを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記調節することが、上記ＣＢ１遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることを含むとき、上記調整することは、上記ｍｉＲ−１９を上記神経膠細胞においてアップレギュレーションすることを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記ＣＢ１遺伝子の発現を上記ＣＢ１の上記神経膠細胞における上記アップレギュレーションの後で測定することを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記調節することが、上記ＣＲＨ１型受容体遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることを含むとき、上記調整することは、上記ｍｉＲ−１５を上記神経膠細胞においてアップレギュレーションすることを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記ＣＲＨ１型受容体遺伝子の発現を上記ｍｉＲ−１５の上記神経膠細胞における上記アップレギュレーションの後で測定することを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記調節することが、上記ＦＫＢＰ５遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることを含むとき、上記調整することは、上記ｍｉＲ−１５を上記神経膠細胞においてアップレギュレーションすることを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記ＦＫＢＰ５遺伝子の発現を上記ｍｉＲ−１５の上記神経膠細胞における上記アップレギュレーションの後で測定することを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、血液試料を上記処置に先立って上記対象から得ることを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記抗うつ剤は、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、三環系抗うつ剤およびノルアドレナリン再取り込み阻害剤（ＮＲＩ）からなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記セロトニン関連の医学的状態は精神医学的状態である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記精神医学的状態は、うつ病、不安、ストレス、疲労、損なわれた認知機能、パニック発作、脅迫行動、嗜癖、社会恐怖、睡眠障害および食品関連障害からなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ｍｉＲ−１３５はｍｉＲ−１３５ａまたはｍｉＲ−１３５ｂを含む。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
図１Ａ−１Ｅは、セロトニン（５ＨＴ）ニューロンにおけるミクロＲＮＡの発現を示す。図１Ａは、５ＨＴニューロンにおける示差的に発現したｍｉＲＮＡのグラフ例示である。Ｌｏｗｅｓｓ正規化値が、平均対数強度に対してプロットされるスポット強度のｌｎ２倍率変化として示される（ＭＡプロット）；図１Ｂは、対照と比較して、５ＨＴニューロンにおけるｍｉＲ−３７５の増大したレベルを示す、ｍｉＲのリアルタイムＰＣＲにおけるアレイ結果の検証である。ｎ＝５個の５ＨＴ細胞、ｎ＝４個の非５ＨＴ。バーは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表す。＊＊Ｐ＝０．００７１；図１Ｃは、対照と比較して、５ＨＴニューロンにおけるｍｉＲ−１３５ａの低下したレベルを示す、ｍｉＲのリアルタイムＰＣＲにおけるアレイ結果の検証である。Ｎ＝５個の５ＨＴ細胞、ｎ＝４個の非５ＨＴ。＊＊Ｐ＝０．００７５；図１Ｄは、Ｓｌｃ６ａ４についての生物情報学予測を５ＨＴマイクロアレイ結果と組み合わせることを表し、かつ、インビトロ試験のために選ばれるｍｉＲを列挙するバンダイアグラムである；図１Ｅは、Ｈｔｒ１ａについての生物情報学予測を５ＨＴマイクロアレイ結果と組み合わせることを表し、かつ、インビトロ試験のために選ばれるｍｉＲを列挙するバンダイアグラムである。 図１Ｆ−１Ｉは、セロトニン（５ＨＴ）ニューロンにおけるミクロＲＮＡの発現を示す。図１Ｆは、Ｔｐｈ２についての生物情報学予測を５ＨＴマイクロアレイ結果と組み合わせることを表し、かつ、インビトロ試験のために選ばれるｍｉＲを列挙するバンダイアグラムである；図１Ｇは、ＭａｏＡについての生物情報学予測を５ＨＴマイクロアレイ結果と組み合わせることを表し、かつ、インビトロ試験のために選ばれるｍｉＲを列挙するバンダイアグラムである；図１Ｈは、ｍｉＲ−１８１ｃおよびｍｉＲ−２７ｂがＴｐｈ２の３’ＵＴＲを標的とし得ることを示すルシフェラーゼレポーターアッセイ結果を例示するグラフである；図１Ｉは、ｍｉＲ−２７ｂがＨｔｒ１ａ ＭａｏＡを標的とし得ることを示すルシフェラーゼレポーターアッセイ結果を例示するグラフである。
図２Ａ−２Ｄは、ミクロＲＮＡがＳｌｃ６ａ４の３’ＵＴＲ（配列番号２５）およびＨｔｒ１ａの３’ＵＴＲ（配列番号２７）を標的とすることを示す。図２Ａは、ｍｉＲ−１３５ａおよびｍｉＲ−１３５ｂ（それぞれ、配列番号２４および２６）がＳｌｃ６ａ４の３’ＵＴＲを標的とすることの例示である；図２Ｂは、ｍｉＲ−１３５ａおよびｍｉＲ−１３５ｂ（それぞれ、配列番号２４および２６）がＨｔｒ１ａの３’ＵＴＲを標的とすることの例示である；図２Ｃは、ｍｉＲ−１３５ａおよびｍｉＲ−１３５ｂがＳｌｃ６ａ４の３’ＵＴＲを標的とし得ることを示すルシフェラーゼレポーターアッセイ結果を例示するグラフである。ルシフェラーゼアッセイのデータは、記載された遺伝子の３’ＵＴＲおよび空ベクター、または、特定のｍｉＲを過剰発現するベクターによりトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞における共トランスフェクションされたホタルルシフェラーゼレポーターの活性に対して正規化されるウミシイタケルシフェラーゼ活性を示す。バーは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表す。＊Ｐ＝０．０１４、＊＊＊Ｐ＝０．０００２、ｍｉＲ−１６については＃ｐ＜０．０５３５、ｍｉＲ−２７については＃Ｐ＝０．０９６７；図２Ｄは、ｍｉＲ−１３５ａ、ｍｉＲ−１３５ｂ、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−１８１ＣおよびｍｉＲ−２６ａがＨｔｒ１ａの３’ＵＴＲを標的とし得ることを示すルシフェラーゼレポーターアッセイ結果を例示するグラフである。＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＝０．００２９ 図２Ｅ−２Ｈは、ミクロＲＮＡがＳｌｃ６ａ４の３’ＵＴＲ（配列番号２５）およびＨｔｒ１ａの３’ＵＴＲ（配列番号２７）を標的とすることを示す。図２Ｅは、ｍｉＲ−１３５についてのシード一致部（配列番号２７〜４１）の、ｓｌｃ６ａ４の３’ＵＴＲでの保存を例示するものである；図２Ｆは、ｍｉＲ−１３５についてのＨｔｒ１ａの３’ＵＴＲシード一致部（配列番号４２〜５４）を例示するものであり、シード１がマウスの３’ＵＴＲにおいてのみ現れ、シード２が高度に保存されていることを示している。図２Ｇは、ｓｌｃ６ａ４の３’ＵＴＲにおけるｍｉＲ−１３５のシード一致部での変異がｍｉＲ−１３５ａおよびｍｉＲ−１３５ｂの抑制因子効果を阻止したことを例示するグラフである。＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＝０．００３２；図２Ｈは、Ｈｔｒ１ａの３’ＵＴＲにおけるｍｉＲ−１３５のシード一致部での変異を個々に行った場合および両方を一緒に行った場合を例示するグラフであり、ｍｉＲ−１３５ｂが両方のシード一致部を介してＨｔｒ１ａを標的とし、ｍｉＲ−１３５ａはシード２によってのみ標的とすることを示している。＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
図３Ａ−３Ｄは、ｍｉＲ−１３５ａおよびｍｉＲ−１３５ｂのレベルを種々の条件のもとで示す。図３Ａは、急性ストレスの後でのＲＮにおけるｍｉＲ−１３５ａレベルのダウンレギュレーションを例示するグラフである。バーは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表す。（ｎ＝８、群０において；ｎ＝１０、群９０において；ｎ＝９、群２４において）。＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊Ｐ＝０．０３５７；図３Ｂは、急性ストレスの後でのＲＮにおけるｍｉＲ−１３５ｂレベルのダウンレギュレーションを例示するグラフである。＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＝０．００５５；図３Ｃは、マウスが社会的敗北にさらされたかどうかに関係なく、イミプラミンの急性投与および長期投与の後でのＲＮにおけるｍｉＲ−１３５ａレベルのアップレギュレーションを例示するグラフである。（ｎ＝８、対照の長期生理的食塩水および対照の長期イミプラミン；ｎ＝７、急性イミプラミン；ｎ＝１１、社会的敗北での長期生理的食塩水；ｎ＝９、社会的敗北での長期イミプラミン）。＊＊Ｐ＝０．００３；図３Ｄは、マウスが社会的敗北にさらされたかどうかに関係なく、イミプラミンの急性投与および長期投与の後でのＲＮにおけるｍｉＲ−１３５ｂレベルのアップレギュレーションを例示するグラフである。＊＊Ｐ＝０．００９３。 図３Ｅ−３Ｊは、ｍｉＲ−１３５ａおよびｍｉＲ−１３５ｂのレベルを種々の条件のもとで示す。図３Ｅは、ＮＲＩまたは生理的食塩水ではなく、ＳＳＲＩの急性投与または長期投与の後のＲＮでのｍｉＲ−１３５ａレベルにおける増大を例示するグラフである；（ｎ＝８、急性生理的食塩水（ｎ＝７）を除く各群）。＊＊＊Ｐ＜０．０００１；図３Ｆは、ＳＳＲＩまたはＮＲＩの急性投与または長期投与の後でのＲＮにおける変化しないｍｉＲ−１３５ｂレベルを例示するグラフである；図３Ｇは、対照と比較して、長期ＳＳＲＩまたは急性ＳＳＲＩを受けるマウスの血漿中でのｍｉＲ−１３５ａレベルにおける低下を例示するグラフである。（ｎ＝８、長期ＳＳＲＩおよび長期ＮＲＩ（ｎ＝７）を除く各群）。急性生理的食塩水と比較して急性ＳＳＲＩについては＊＊Ｐ＝０．０００４、長期生理的食塩水と比較して長期ＳＳＲＩについては＊＊Ｐ＝０．０００６；図３Ｈは、対照と比較して、長期ＳＳＲＩまたは急性ＳＳＲＩを受けるマウスの血漿における変化しないｍｉＲ−１３５ｂレベルを例示するグラフである；図３Ｉは、血漿と比較して、ＲＮにおける個々のマウスのｍｉＲ−１３５ａレベルを明らかにする散乱プロットグラフであり、ＳＳＲＩまたは生理的食塩水の処置を受けるマウスでは逆の相関を示している。図３Ｊは、対照と比較して、ＳＳＲＩ処置を受けるマウスでは、血漿に対するＲＮにおけるｍｉＲ−１３５ｂレベルの間には相関がないことを明らかにする散乱プロットグラフである。
図４Ａ−４Ｂは、ｍｉＲ−１３５ｂのインビボ過剰発現を示す。図４Ａは、ｍｉＲ−１３５ｂの過剰発現のためのレンチウイルスの概略的例示である；図４Ｂは、成体マウスの背側縫線核（ＤＲＮ）におけるインビボでのｍｉＲ−１３５ｂの過剰発現を示すリアルタイムＰＣＲ結果を例示するグラフである。バーは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表す。（ｎ＝５、ＧＦＰ注入；ｎ＝３、ｍｉＲ−１３５ ＯＥ）。Ｐ＝０．００３２。 図４Ｃ−４Ｄは、ｍｉＲ−１３５ｂのインビボ過剰発現を示す。図４Ｃ〜図４Ｄは、注入部位におけるＧＦＰ染色を明らかにすることによるＤＲＮ注入部位の例示である。（Ｐａｘｉｎｏｓから借用される区分マップ）。 図４Ｅ−４Ｈは、ｍｉＲ−１３５ｂのインビボ過剰発現を示す。図４Ｅは、対照マウスと比較して、ＲＮにおいてｍｉＲ−１３５ｂを過剰発現するマウスにおけるフォレスト水泳試験での低下した不動時間を例示するグラフである。（ｎ＝９、対照；ｎ＝９、ｍｉＲ−１３５）。Ｐ＝０．００８８（３分の時点で）およびＰ＝０．００３３０（４分の時点について）；図４Ｆは、対照マウスと比較して、ＲＮにおいてｍｉＲ−１３５ｂを過剰発現するマウスにおける尾懸垂試験での低下した不動時間を例示するグラフである。Ｐ＜０．０７３５１；図４Ｇ〜図４Ｈは、対照と比較して、ＲＮにおいてｍｉＲ−１３５ｂを過剰発現するマウスのホームケージでの自発運動における差がないことを例示するグラフである。
図５は、ルシフェラーゼ遺伝子の後にクローン化されるＡＤＲｂ１の３’ＵＴＲを示す。Ｐｓｉｃｈｅｃｋ２プラスミドにおいてルシフェラーゼ遺伝子の下流側にクローン化される、４つのｍｉＲ−１９結合部位を有する無傷（上段）のＡＤＲｂ１ ３’ＵＴＲ、および、４つすべてのｍｉＲ−１９結合部位を欠いている変異型（下段）形態のＡＤＲｂ１ ３’ＵＴＲの例示。
図６Ａ−６Ｅは、ｍｉＲ−１９ｂが、ＡＤＲｂ１の３’ＵＴＲを、その３’ＵＴＲにおけるシード一致部を介して標的とすることを示す；図６Ａ〜図６Ｂは、低い内因性ｍｉＲ−１９レベルを発現するＨＴ２２細胞において測定される正規化されたルシフェラーゼレベルを、（図６Ａ）ＧＦＰプラスミドまたは（図６Ｂ）プレ−ｍｉＲ−１９ｂ過剰発現（ＯＥ）プラスミドによるトランスフェクションの後において例示するグラフである；図６Ｃ〜図６Ｅは、高い内因性ｍｉＲ−１９レベルを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞において測定される正規化されたルシフェラーゼレベルを例示するグラフである。（図６Ｃ）対照プラスミドによるトランスフェクション、（図６Ｄ）対照としてｍｉＲ−１９ｂノックダウン（ＫＤ）プローブまたはスクランブル化プローブによるトランスフェクション、および、（図６Ｅ）ｍｉＲ−１９ｂのｍｉＡｒｒｅｓｔプラスミドまたは対照のｍｉＡｒｒｅｓｔプラスミドによるトランスフェクション。＊＊＊Ｐ＜０．００５。ウミシイタケルシフェラーゼ活性をホタルルシフェラーゼの発現レベルによって正規化し、対照処置の存在時における変異型形態のＡｄｒｂ１−３’ＵＴＲ（Ａｄｒｂ１−ｍｕｔ）によって達成される活性の比率として示した。
図７Ａ−７Ｂは、扁桃体におけるｍｉＲＮＡの示差的発現を示す。図７Ａ〜図７Ｂは、急性ストレス後９０分での扁桃体におけるｍｉＲＮＡの示差的発現を例示するグラフである。図７Ａはａｇｉｌｅｎｔアレイの結果を例示する。図７Ｂはａｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイの結果を例示する。正規化された値が、条件の全体にわたる平均強度に対してプロットされるスポット強度のｌｏｇ２比率（ストレス対対照）として示される（Ｎ＝２，２）。それぞれのｍｉＲＮＡの強度を生物学的反復の全体にわたる平均正規化強度として計算した。ｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ−１５ｂが赤色で示される。ｍｉＲ−１２４、すなわち、ストレスプロトコルによって影響されない十分に確立されたニューロンマーカーが、白色で示される。 図７Ｃ−７Ｄは、扁桃体におけるｍｉＲＮＡの示差的発現を示す。図７Ｃは、ｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ−１５ｂが半保存的なシード一致部を副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン１型受容体の３’ＵＴＲに有することを例示する［ＣＲＨＲ１、ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ（ｄｏｔ）ｏｒｇからの改編］；図７Ｄは、ｍｉＲ−１５ｂ−ＥＧＦＰ過剰発現プラスミドまたはＧＦＰ発現プラスミドと、ＣＲＦＲ１−３’ＵＴＲによって制御されるルシフェラーゼレポータープラスミドとにより共トランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において測定されるルシフェラーゼ活性を例示するグラフである。ウミシイタケルシフェラーゼ活性をホタルルシフェラーゼの発現レベルによって正規化した。
図８は、ｍｉＲ−１８２がおそらくはＨｔｒ１ａの３’ＵＴＲを標的とすることを示すルシフェラーゼレポーターアッセイ結果を例示するグラフである。ルシフェラーゼアッセイのデータは、記載された遺伝子の３’ＵＴＲおよび空ベクター、または、特定のｍｉＲを過剰発現するベクターによりトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞における共トランスフェクションされたホタルルシフェラーゼレポーターの活性に対して正規化されるウミシイタケルシフェラーゼ活性を示す。
図９は、長期の社会的敗北の後における低下した発現についての傾向を示す、成体マウスのＤＲＮにおけるｍｉＲ−１８２発現レベルのリアルタイムＰＣＲ結果を例示するグラフである。データは平均±ＳＥＭを表す。ｎ＝７（対照）および１８（社会的敗北群におけるマウス）、＃＝ｐ＝０．１。
図１０は、２つのアルゴリズムにおけるｍｉＲ−１８２の標的についてのインシリコ生物情報学予測を表すバンダイアグラム、ならびに、この予測において現れる正常なニューロン機能および病理学的ニューロン機能について大きな関連性がある潜在的な標的遺伝子のリストである。
図１１Ａ−１１Ｃは、ｍｉＲ−１８２の過剰発現またはノックダウンを示す。図１１Ａは、ｍｉＲ−１８２の過剰発現のためのレンチウイルスの概略的例示である；図１１Ｂは、Ｎ２Ａ細胞株におけるインビトロでのｍｉＲ−１８２の過剰発現を示すリアルタイムＰＣＲ結果を例示するグラフである；図１１Ｃは、ｍｉＲ−１８２のノックダウンのためのレンチウイルスの概略的例示である。
図１２Ａ−１２Ｄは、ＮＲＩ投与後のＰＦＣにおけるｍｉＲ−１９レベルを示す。ＮＲＩのレボキセチンを急性（１回）または長期（１８日間）のどちらかで投与した。注目すべきことに、ｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂのレベルがＮＲＩの急性投与の後ではＰＦＣにおいて低下し（それぞれ、図１２Ａおよび図１２Ｂ）、しかし、ＮＲＩの長期投与の後では増大した（それぞれ、図１２Ｃおよび図１２Ｄ）。
図１３Ａ−１３Ｄは、社会的敗北に供されたマウスのＰＦＣおよび扁桃体におけるｍｉＲ−１９レベルを示す。ｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂのレベルを、社会的敗北パラダイムに供されたマウスから採取される扁桃体からの試料において測定した。注目すべきことに、ＰＦＣにおけるｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂのレベルが、対照マウスに対して、社会的敗北に対する「感受性あり」として分類されるマウスにおいて上昇した（それぞれ、図１３Ａおよび図１３Ｂ）。ｍｉＲ−１９のレベルはまた、対照マウスに対して、社会的敗北に対する「感受性あり」として分類されるマウスの扁桃体において上昇した（それぞれ、図１３Ｃおよび図１３Ｄ）。
図１４は、ｍｉＲＮＡ−１９ｂがＣＢ１の３’ＵＴＲを標的とすることを示す。ＣＢ１の３’ＵＴＲ、および、ｍｉＲ−１９ｂまたはＧＦＰ対照のどちらかを過剰発現するプラスミドによるＨＴ−２２細胞のトランスフェクションは、正規化されたルシフェラーゼレベルにおける５０％の低下を引き起こした。
図１５Ａは、マウス脳の冠状切片の概略的例示である。図１５Ａは、ＢＬＡを含む脳におけるいくつかの核を示す（ＰａｘｉｎｏｓおよびＦｒａｎｋｌｉｎによるマウス脳からの改編）。 図１５Ｂは、マウス脳の冠状切片の概略的例示である。図１５Ｂは脳におけるＣＢ１分布を示す（Ａｌｌｅｎ Ｂｒａｉｎ Ａｔｌａｓからの改編、ｗｗｗ．ｍｏｕｓｅ．ｂｒａｉｎ−ｍａｐ．ｏｒｇ／）。注目すべきことに、ＣＢ１がＢＬＡに多く存在することがこの分布によって明らかである。
図１６は、扁桃体の基底外側核（ＢＬＡ）における記憶固定についての提案された機構の概略的例示である。コルチコステロン（ＣＯＲＴ）が、内在性カンナビノイド（ｅＣＢ）の合成を誘導するためにＧｓ−ｃＡＭＰ／ＰＫＡ経路を活性化する未だ特徴確認されていない膜結合型グルココルチコイド受容体（ｍｂＧＲ）に結合する。内在性カンナビノイドが、ＧＡＢＡ作動性終末部におけるＣＢ１受容体に結合し、これにより、ＧＡＢＡ放出を阻害するシナプスの中に放出される。ＧＡＢＡ放出のこの阻害がノルエピネフリン（ＮＥ）放出を脱抑制し、シナプス後のβ−アドレナリン受容体のＮＥ活性化を増大させ、これにより、情動的嫌悪記憶の固定を増大させる。
図１７Ａ−１７Ｂは、ＲＩＳＣ複合体におけるＡｇｏ２を例示する。図１７Ａは、ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの相互作用を伝達するＲＩＳＣ複合体におけるＡｇｏ２の概略例示である；図１７Ｂは、抗Ａｇｏ２抗体を用いて行われたウエスタンブロット分析を例示する。このＩＰは、Ａｇｏ２抗体により１回、ＩｇＧ１対照により１回沈殿させられた全脳試料を比較したときに認められ得るように、Ａｇｏ２タンパク質に対して特異的であった。注目すべきことに、Ａｇｏ２タンパク質は、ＩｇＧ１対照により沈殿させられた試料においては検出されなかった。
図１８Ａ−１８Ｄは、社会的回避試験を示す。マウスを、慣らすために単独で３分間迷路に置き（図１８Ａおよび図１８Ｂ）、マウスの動きを記録し、プロットした。３分後、ノーバル（ｎｏｖａｌ）ＩＣＲマウスを、被験マウスの隣のチャンバーに置き（図１８Ｃおよび図１８Ｄ）、被験マウスの動きを再び記録し、プロットした。
図１９Ａは、アレイでアップレギュレーションされる選択されたｍｉＲＮＡのヒートマップ例示を示す。
図１９Ｂは、アレイでダウンレギュレーションされる選択されたｍｉＲＮＡのヒートマップ例示を示す。
図２０Ａは、マイクロアレイ結果からのｍｉＲ−１５ａのｌｏｇ２発現を示す。それぞれの赤色ドットがアレイの１回の反復を示す。対照群（ＣＮＴ）は４回の反復を有し、「感受性あり」群（ＳＵＳＣ）は３回の反復を有し、「立ち直りが速い」群（ＲＥＳＩＬ）は３回の反復を有した。黒色線により、それぞれの群における反復の平均を示した。 図２０Ｂは、マイクロアレイ結果からのＦＫＢＰ５のｌｏｇ２発現を示す。それぞれの赤色ドットがアレイの１回の反復を示す。対照群（ＣＮＴ）は４回の反復を有し、「感受性あり」群（ＳＵＳＣ）は３回の反復を有し、「立ち直りが速い」群（ＲＥＳＩＬ）は３回の反復を有した。黒色線により、それぞれの群における反復の平均を示した。
図２０ＣはマウスＦＫＢＰ５の３’ＵＴＲ配列を示す（ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇから採用）。
図２１Ａ−２１Ｂは、社会的敗北後の対照に対して、「感受性あり」マウスにおける扁桃体のｍｉＲ−１５ａのレベル（図２１Ａ）およびＦＫＢＰ５のレベル（図２１Ｂ）を示す。注目すべきことに、ｍｉＲ−１５ａのレベルが、社会的敗北に供され、かつ、「感受性あり」として特徴づけられるマウスの扁桃体において上昇した（図２１Ａ）。ＦＫＢＰ５のレベルが、社会的敗北に供され、かつ、「感受性あり」として特徴づけられるマウスの扁桃体において低下した（図２１Ｂ）。
図２２は、Ｓｔｘ１ａ、Ｓｇｋ１およびＡｄｒｂ２の３’ＵＴＲの概略的例示である（これらはそれぞれが単一のｍｉＲＮＡ−１５結合部位を有する）。
図２３は、対照マウスに対して、社会的敗北に供されたマウスにおける扁桃体のｍｉＲ−１８１のレベルを示す。注目すべきことに、ｍｉＲ−１８１のレベルが、社会的敗北に供されたマウスの扁桃体において上昇した。
図２４は、ｍｉＲ−１８１およびグルタミン酸受容体についての生物情報学予測を組み合わせることを表すバンダイアグラムを示す。
図２５は、ｍｉＲ−１８１の６個の潜在的標的の完全な３’ＵＴＲの概略的例示である。
図２６は、ストレス後の縫線核におけるｍｉＲ１８２の発現レベルを示す。注目すべきことに、急性３０分不動ストレスは、リアルタイムＰＣＲによって測定されるように、ストレス後２４時間で試験されたとき、ＲＮにおけるｍｉＲ１８２の低下した発現レベルを引き起こした。＊＊＝Ｐ＜０．０１；ｎ＝８（各群）。
図２７Ａ−２７Ｃは、ｍｉＲ１８２が、ＤＳＣＡＭ、Ｌ１ＣＡＭおよびＴＳＮＡＸの３’ＵＴＲを標的とすることを示す、ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示す。図２７Ａは、記載された遺伝子の３’ＵＴＲおよび空ベクター、または、特定のｍｉＲを過剰発現するベクターによりトランスフェクションされたＮ２ａ細胞における共トランスフェクションされたホタルルシフェラーゼレポーターの活性に対して正規化されるウミシイタケルシフェラーゼ活性を示す、ルシフェラーゼアッセイのデータを例示する。Ｌ１ｃａｍ（図２７Ｂ）およびＴｓｎａｘ（図２７Ｃ）の３’ＵＴＲにおけるｍｉＲ１８２シード一致部での変異はｍｉＲ１８２の抑制効果を阻止した。バーは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
図２８Ａ−２８Ｄは、扁桃体（ＡＭＹ）および前頭前皮質（ＰＦＣ）におけるｍｉＲ１３５の発現を示す。図２８Ａは、急性ＳＳＲＩおよびＮＲＩがｍｉＲ１３５ａレベルをＡＭＹにおいて増大させたことを例示する；図２８Ｂは、ＡＭＹにおけるｍｉＲ１３５ｂレベルが、生理的食塩水と比較して、ＳＳＲＩまたはＮＲＩの急性投与によってアップレギュレーションされたことを例示する；図２８Ｃは、長期ＳＳＲＩがｍｉＲ１３５ａレベルをＰＦＣにおいて低下させたことを例示する；図２８Ｄは、ＰＦＣにおけるｍｉＲ１３５ｂレベルが急性ＳＳＲＩまたはＮＲＩによってアップレギュレーションされ、長期ＳＳＲＩ処置によって低下したことを例示する。ｎ＝７〜８（各群）。＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＝Ｐ＜０．０１；＊＊＊＝Ｐ＜０．０００１。
図２９Ａ−２９Ｂは、社会的敗北後のマウスの循環系における増大したｍｉＲ１３５レベルを示す。社会的敗北後２週間でのマウスの血漿におけるｍｉＲ１３５ａレベル（図２９Ａ）およびｍｉＲ１３５ｂレベル（図２９Ｂ）が、対照マウスと比較して著しく増大した（＊＊＝Ｐ＜０．０１、ｎ＝７〜１６（各群））。
図３０Ａ−３０Ｂは、インビトロおよびインビボにおけるｍｉＲ１３５ＫＤの検証を示す。図３０Ａ〜図３０Ｂは、ｍｉＲ１３５がＨｔｒ１ａ（図３０Ａ）またはｓｌｃ６ａ４（図３０Ｂ）を標的とすることがｍｉＲ１３５ｂのＫＤ構築物によって阻止されたことを示す、ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を例示する。 図３０Ｃ−３０Ｅは、インビトロおよびインビボにおけるｍｉＲ１３５ＫＤの検証を示す。図３０Ｃは、ｍｉＲ１３５ｂＫＤウイルスベクターおよび対照ウイルスベクターの概略的例示である；図３０Ｄ〜図３０ＥはＤＲＮ注入部位の例示である（図３０ＤはＰａｘｓｉｎｏｓからの採用である）；図３０Ｅは、ｍｉＲ１３５ＫＤレンチウイルスを感染させたＤＲＮのＧＦＰ染色である。
図３１Ａ−３１Ｂは、ｍｉＲ１３５ＫＤマウスにおける増大した不安様行動およびＳＳＲＩに対する弱化した応答を示す。図３１Ａは、ｍｉＲ１３５ＫＤマウスの行動がオープンフィールド試験において対照マウスと類似していたことを例示する；図３１Ｂは、高架式十字迷路において、対照マウスと比較して、ｍｉＲ１３５ＫＤマウスにおける増大した不安様行動を例示する。不動時間が両方の群においてＳＳＲＩによって減少し、しかしながら、その減少が、試験の最後の２分において、対照と比較して、ｍｉＲ１３５ＫＤマウスでは弱まった。〜＝ｐ＜０．１ ＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１。ｎ＝１０〜１１（各群）。 図３１Ｃ−３１Ｅは、ｍｉＲ１３５ＫＤマウスにおける増大した不安様行動およびＳＳＲＩに対する弱化した応答を示す。図３１Ｃは、明暗所移動試験において、ｍｉＲ１３５ＫＤマウスが、急性ストレスの後ではなく、基礎的ストレス条件のもとでは、対照マウスと比較して、明るいチャンバーにおいてより多くの時間を過ごしたことを例示する；図３１Ｄは、ｍｉＲ１３５ＫＤマウスが、急性ストレスの後ではなく、基礎的ストレス条件のもとでは、対照マウスと比較して、明るいチャンバーをより多く訪れたことを例示する；図３１Ｅは、ｍｉＲ１３５ＫＤマウスが、急性ストレスの後ではなく、基礎的ストレス条件のもとでは、対照マウスと比較して、明るいチャンバーにおいてそれほど多くの距離を移動しなかったことを例示する。不動時間が両方の群においてＳＳＲＩによって減少し、しかしながら、その減少が、試験の最後の２分において、対照と比較して、ｍｉＲ１３５ＫＤマウスでは弱まった。〜＝ｐ＜０．１ ＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１。ｎ＝１０〜１１（各群）。 図３１Ｆ−３１Ｇは、ｍｉＲ１３５ＫＤマウスにおける増大した不安様行動およびＳＳＲＩに対する弱化した応答を示す。図３１Ｆは、基礎的条件およびＳＳＲＩ投与後の両方で尾懸垂試験において、ｍｉＲ１３５ＫＤマウスと対照マウスとの間に差がないことを例示しており、それにもかかわらず、不動時間の減少が、両方の群において、基礎的条件と比較して、ＳＳＲＩ処置の後で認められた。（図３１Ｆ〜図３１Ｇ）。不動時間が両方の群においてＳＳＲＩによって減少し、しかしながら、その減少が、試験の最後の２分において、対照と比較して、ｍｉＲ１３５ＫＤマウスでは弱まった。〜＝ｐ＜０．１ ＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１。ｎ＝１０〜１１（各群）。
図３２は、ｍｉＲ１３５マウスの誘導可能な過剰発現系の概略的例示である。ｍｉＲ１３５ａ配列の前のｌｏｘＰ化トランザクショナル停止およびＧＦＰレポーターを発現するトランスジェニックマウス。変異トランスジェニックマウスはｍｉＲ１３５ａを５−ＨＴのｅＰｅｔ陽性細胞においてのみ発現する。
図３３Ａ−３３Ｃは、ｍｉＲ１３５を５−ＨＴニューロンにおいて過剰発現するマウス系統の検証を示す。図３３Ａは、ｍｉＲ１３５が、対照マウスと比較して、ｍｉＲ１３５ＯＥマウスのＲＮにおいて過剰発現されたことを例示する。図３３Ｂ〜図３３Ｃは、ｍｉＲ１３５標的遺伝子のｍＲＮＡが、Ｓｌｃ６ａ４（図３３Ｂ）およびＨｔｒ１ａ（図３３Ｃ）の両方について、ｍｉＲ１３５ＯＥマウスのＲＮにおいてダウンレギュレーションされたことを例示する。＃＝ｐ＜０．１ ＊＝ｐ＜０．０５；ｎ＝４（各群）。
図３４Ａ−３４Ｃは、ｍｉＲ１３５ＯＥマウスにおける社会的敗北後での低下した不安およびうつ病様行動を示す。図３４Ａは、ｍｉＲ１３５ＯＥマウスが、低下した不安様行動をオープンフィールド試験において有することを示す；図３４Ｂは、明暗所移動試験におけるｍｉＲ１３５ＯＥマウスの、対照と比較してより少ない不安様行動を示す；図３４Ｃは、ｍｉＲ１３５ＯＥマウスの高架式十字迷路における、対照と比較して低下した不安様行動を示す。＃＝ｐ＜０．１ ＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１。ｎ＝７〜１１（各群）。 図３４Ｄ−３４Ｅは、ｍｉＲ１３５ＯＥマウスにおける社会的敗北後での低下した不安およびうつ病様行動を示す。図３４Ｄは、尾懸垂試験において、対照と比較して、ｍｉＲ１３５ＯＥマウスの不動時間の減少に向かう傾向を示す；図３４Ｅは、強制水泳試験において、対照と比較して、ｍｉＲ１３５ＯＥマウスにおける減少した不動時間を示す。＃＝ｐ＜０．１ ＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１。ｎ＝７〜１１（各群）。
本発明はそのいくつかの実施形態において、ミクロＲＮＡに関連し、より具体的には、しかし、限定ではなく、疾患を診断し、モニターし、また、処置するための該ミクロＲＮＡの使用に関連する。
本発明の原理および操作は、図面および付随する説明を参照してより良く理解されることができる。
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に必ずしも限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。また、本明細書中において用いられる表現法および用語法は説明のためであって、限定として見なされるべきでないことを理解しなければならない。
調節不全のセロトニン作動性活性と、精神医学的障害（例えば、不安およびうつ病など）とのつながりがこれまでに立証されており、それにもかかわらず、これらの病理の根底にある分子的機構は完全には理解されていない。ミクロＲＮＡ（ｍｉＲ）は、遺伝子発現を転写後に調節し、脳に多く存在する小さいＲＮＡ分子のサブセットである。
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、特定のミクロＲＮＡ（ｍｉＲ）が、セロトニン（５ＨＴ）神経膠関連遺伝子の調節に関与していること、したがって、異常なセロトニンレベルに伴う医学的状態（例えば、精神医学的障害など）を調整することに関与していることを発見した。
本明細書中下記および下記の実施例の節において例示されるように、本発明者らは、５ＨＴレポーターマウス（ｅＰＥＴ−ＹＦＰ）の縫線核（ＲＮ）から得られる５ＨＴニューロンにおけるｍｉＲ発現パターンを、ｍｉＲマイクロアレイを使用して明らかにした（下記の実施例の節における表２Ａ〜表２Ｂ参照）。アレイから得られるセロトニン作動性ニューロンの特異なｍｉＲ発現プロフィルを生物情報学的に分析して、重要なセロトニン作動性関連遺伝子（例えば、セロトニン輸送体（Ｓｌｃ６ａ４、図１Ｄ）、セロトニン自己受容体（Ｈｔｒ１ａ、図１Ｅ）、トリプトファンヒドロキシラーゼ２（Ｔｐｈ２、図１Ｆ）およびモノアミンヒドロキシラーゼ（ＭａｏＡ、図１Ｇ）など）を標的とすることが推定されるｍｉＲを特定した。これらの遺伝子についての３’ＵＴＲのｍｉＲＮＡ標的化をさらに、５ＨＴニューロン遺伝子を特異的に標的とし、これらを調節する特定のｍｉＲ（例えば、ｍｉＲ−１３５）を例示してインビトロで試験した（図１Ｈ〜図１Ｉおよび図２Ｃ〜図２Ｄ参照）。本発明者らはさらに、ｍｉＲ１３５の発現レベルが、急性ストレスの後で（図３Ａ〜図３Ｄ）、また、抗うつ剤による処置の後で（図３Ｅ〜図３Ｊ）、ＲＮおよび血漿において改変されることを例示している。成体マウスのＲＮにおけるインビボでのｍｉＲ−１３５の過剰発現は社会的敗北の後におけるうつ病様行動を低下させた（図４Ａ〜図４Ｈ）。そのうえ、本発明者らは、（Ｈｔｒ１ａの直接的な抑制を介した）ニューロン活性の調節因子としてのｍｉＲ−１８２の活性（図８）、および、精神病理学的行動の調節因子としてのｍｉＲ−１８２の活性（図９）、ならびに、［ＣＲＨ１Ｒ（図７Ａ〜図７Ｂ）、ＦＫ５０６結合タンパク質５（ＦＫＢＰ５）（図２１Ａ〜図２１Ｂ）、ならびに、Ｓｔｘ１ａ、Ｓｇｋ１およびＡｄｒｂ２（図２２）の直接的な抑制を介した］ストレス応答の調節因子としてのｍｉＲ−１５の活性を例示している。本発明者らはまた、ｍｉＲ−１９によるベータアドレナリン作動性受容体（Ａｄｒｂ１）およびカナビノイド受容体１（ＣＢ１）の特異的な標的化を例示している。ｍｉＲ−１９の過剰発現はＡｄｒｂ１を抑制し（図６Ａ〜図６Ｃ）、一方、ｍｉＲ−１９のノックダウンはＡｄｒｂ１の発現を高めた（図６Ｄ〜図６Ｅ）。ｍｉＲ−１９の過剰発現はまた、ＣＢ１を抑制した（図１４）。本発明者らはまた、ｍｉＲ−１８１についての標的を発見している。具体的には、本発明者らは、ｍｉＲ−１８１がグルタミン酸受容体を特異的に調節することを例示している（図２４および図２５）。まとめると、これらの結果は、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−２７、ｍｉＲ−１５およびｍｉＲ−１９などのｍｉＲＮＡまたは当該ｍｉＲＮＡを調節する配列の、治療様式としての使用を実証するものである。
従って、本発明の１つの局面によれば、セロトニンレベルの上昇が治療上有益である医学的状態を処置の必要性のある対象において処置する方法であって、少なくとも１つのミクロＲＮＡまたはその前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドを上記対象の細胞に投与し、または、上記対象の細胞において発現させることを含む方法が提供される。
特定の実施形態によれば、セロトニンレベルの上昇が治療上有益である医学的状態を処置するために、ミクロＲＮＡはｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−２６およびｍｉＲ−１８２を含む。
本発明の別の局面によれば、アドレナリンまたはノルアドレナリンの低いレベルが治療上有益である医学的状態を処置の必要性のある対象において処置する方法であって、ミクロＲＮＡまたはその前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドを上記対象の細胞に投与し、または、上記対象の細胞において発現させることを含む方法が提供される。
特定の実施形態によれば、アドレナリンまたはノルアドレナリンの低いレベルが治療上有益である医学的状態を処置するために、ミクロＲＮＡはｍｉＲ−１９を含む。
本発明の別の局面によれば、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）の低いレベルが治療上有益である医学的状態を処置の必要性のある対象において処置する方法であって、ミクロＲＮＡまたはその前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドを上記対象の細胞に投与し、または、上記対象の細胞において発現させることを含む方法が提供される。
特定の実施形態によれば、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）の低いレベルが治療上有益である医学的状態を処置するために、ミクロＲＮＡはｍｉＲ−１５を含む。
本発明の別の局面によれば、グルタミン酸受容体の低いレベルが治療上有益である医学的状態を処置の必要性のある対象において処置する方法であって、ミクロＲＮＡまたはその前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドを上記対象の細胞に投与し、または、上記対象の細胞において発現させることを含む方法が提供される。
１つの具体的な実施形態によれば、グルタミン酸受容体の低いレベルが治療上有益である医学的状態を処置するために、ミクロＲＮＡはｍｉＲ−１８１を含む。
用語「処置（治療）する」は、疾患、障害もしくは状態の発症を阻害すること、もしくは停止させること、および／または、疾患、障害もしくは状態の軽減、寛解もしくは退行を生じさせること、あるいは、疾患、障害もしくは医学的状態を、当該疾患、障害もしくは状態について危険性があるかもしれないが、当該疾患、障害もしくは状態を有すると未だ診断されていない対象において生じさせないことを示す。当業者は、様々な方法論およびアッセイが、疾患、障害もしくは状態の発症を評価するために使用され得ること、また、同様に、様々な方法論およびアッセイが、疾患、障害もしくは状態の軽減、寛解もしくは退行を評価するために使用され得ることを理解するであろう。
本明細書中で使用される場合、用語「対象」には、哺乳動物、好ましくは、どのような年齢であれ、上記病理に苦しむヒトが含まれる。好ましくは、この用語は、上記病理を発現する危険性がある個体を包含する。
本明細書中で使用される場合、表現「セロトニンレベルの上昇が治療上有益である医学的状態」は、セロトニンのレベルを増大させることにより、（本明細書中下記でさらに詳述されるように）、それに伴う疾患または医学的症状の発生が妨げられ得るか、あるいは、それに伴う疾患進行または医学的症状が停止され得る疾患または障害を示す。
本明細書中で使用される場合、用語「セロトニン」は、［５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）としても示される］モノアミン神経伝達物質を示す。セロトニンは、例えば、ＣＡＳ番号５０−６７−９で示される。
１つの実施形態によれば、セロトニンレベルをシナプス間隙において増大させる方法であって、少なくとも１つのミクロＲＮＡまたはその前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドを対象の神経膠細胞（例えば、セロトニン作動性ニューロン）に投与するか、または、対象の神経膠細胞（例えば、セロトニン作動性ニューロン）において発現させることを含む方法が提供される。
本明細書中で使用される場合、用語「シナプス間隙」は、電気的または化学的なシグナルが通過する２つのニューロンの間の領域を示す。
「神経膠細胞」は、ニューロンまたはグリア細胞（例えば、乏突起膠細胞または星状膠細胞）を示す。
本明細書中で使用される場合、用語「セロトニン作動性ニューロン」は、セロトニンを分泌するか、または、セロトニンの再取り込み（すなわち、その細胞表面に発現されるセロトニン輸送体による）が可能であるニューロンを示す。
セロトニンレベルの上昇が治療上有益である医学的状態は、例えば、うつ病、不安、ストレス、疲労、損なわれた認知機能、パニック発作、脅迫行動、嗜癖、社会恐怖を含むあらゆる気分障害、睡眠障害、食品関連障害、成長障害および生殖障害を含み得る。
１つの具体的な実施形態によれば、セロトニンレベルの上昇が治療上有益である医学的状態はうつ病を含む。
１つの実施形態によれば、医学的状態がうつ病または不安であるとき、ミクロＲＮＡはｍｉＲ−１３５である。
うつ病または不安は必ずしもセロトニンに関連づけられない可能性があるものとする。
本明細書中で使用される場合、表現「アドレナリンまたはノルアドレナリンの低いレベルが治療上有益である医学的状態」は、アドレナリンまたはノルアドレナリンの発現または活性を低下させることにより、（本明細書中下記でさらに詳述されるように）、それに伴う疾患または医学的症状の発生が妨げられ得るか、あるいは、それに伴う疾患進行または医学的症状が停止され得る疾患または障害を示す。
本明細書中で使用される場合、用語「アドレナリン」は、（エピネフリンとしても知られている）ホルモンおよび神経伝達物質を示す。アドレナリンは、例えば、ＣＡＳ番号５１−４３−４で示される。
本明細書中で使用される場合、用語「ノルアドレナリン」は、（ノルエピネフリンとしても知られている）ホルモンおよび神経伝達物質として作用するカテコールアミンを示す。ノルアドレナリンは、例えば、ＣＡＳ番号（ｌ）５１−４１−２（ｌ）および同１３８−６５−８（ｄｌ）で示される。
アドレナリンまたはノルアドレナリンの低いレベルが治療上有益である医学的状態は、例えば、ストレス関連障害、不安、記憶障害、心臓の病気（例えば、動悸、頻脈、不整脈）、頭痛、振戦、高血圧および急性肺水腫を含み得る。
本明細書中で使用される場合、表現「副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）の低いレベルが治療上有益である医学的状態」は、ＣＲＨの発現または活性を低下させることにより、（本明細書中下記でさらに詳述されるように）、それに伴う疾患または医学的症状の発生が妨げられ得るか、あるいは、それに伴う疾患進行または医学的症状が停止され得る疾患または障害を示す。
本明細書中で使用される場合、用語「副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）」は、（副腎皮質刺激ホルモン放出因子（ＣＲＦ）またはコルチコリベリンとしても知られている）ポリペプチドホルモンおよび神経伝達物質を示す。ＣＲＨは、例えば、ＮＰ＿０００７４７．１で示される。
ＣＲＨの低いレベルが治療上有益である医学的状態は、例えば、ストレス、うつ病、不安、疲労、損なわれた認知機能、パニック発作、脅迫行動、嗜癖、社会恐怖、睡眠障害、食品関連障害、成長障害、生殖障害および肥満を含み得る。
本明細書中で使用される場合、表現「グルタミン酸受容体の低いレベルが治療上有益である医学的状態」は、グルタミン酸受容体の発現または活性を低下させることにより、（本明細書中下記でさらに詳述されるように）、それに伴う疾患または医学的症状の発生が妨げられ得るか、あるいは、それに伴う疾患進行または医学的症状が停止され得る疾患または障害を示す。
本明細書中で使用される場合、用語「グルタミン酸受容体」は、典型的にはニューロン細胞の膜に位置するシナプス受容体を示す（例えば、Ｇｒｍ１、Ｇｒｉｋ３、Ｇｒｍ５、Ｇｒｉａ２、Ｇｒｉｋ２およびＧｒｍ７）。グルタミン酸受容体は、例えば、ＮＰ＿０００８２２．２［グルタミン酸受容体イオンチャネル型カイニン酸３（Ｇｒｉｋ３）］；ＮＰ＿０００８１７．２、ＮＰ＿００１０７７０８８．１、ＮＰ＿００１０７７０８９．１［グルタミン酸受容体イオンチャネル型ＡＭＰＡ２（Ｇｒｉａ２）］；ＮＰ＿００１１５９７１９．１、ＮＰ＿０６８７７５．１、ＮＰ＿７８６９４４．１［グルタミン酸受容体イオンチャネル型カイニン酸２（Ｇｒｉｋ２）］；ＮＰ＿０００８３３．１、ＮＰ＿００１１３７３０３．１［グルタミン酸受容体代謝型５（Ｇｒｍ５）］；ＮＰ＿０００８３５．１、ＮＰ＿８７０９８９．１［グルタミン酸受容体代謝型７（Ｇｒｍ７）］；ＮＰ＿０００８２９．２、ＮＰ＿００１１０７８０１．１［グルタミン酸受容体代謝型１（Ｇｒｍ１）］で示される。
グルタミン酸受容体の低いレベルが治療上有益である医学的状態は、例えば、てんかん発作（例えば、てんかん）、ハンチントン病、統合失調症、脆弱Ｘ症候群、全般性不安障害および癌（例えば、メラノーマ）を含み得る。
本明細書中で使用される場合、用語「ミクロＲＮＡまたはその前駆体」は、転写後の調節因子として作用するミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子を示す。ミクロＲＮＡは典型的には、プレ−ｍｉＲ（プレ−ミクロＲＮＡ前駆体）からプロセッシングされる。プレ−ｍｉＲは、例えば、培養細胞にトランスフェクションされたとき、機能的なｍｉＲＮＡに効率よくプロセッシングされる、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって転写される一組の前駆体ｍｉＲＮＡ分子である。プレ−ｍｉＲを使用して、特異的なｍｉＲＮＡ活性を、このｍｉＲＮＡを通常は発現しない細胞型において誘発することができ、したがって、その標的の機能を、その発現を「（ｍｉＲＮＡ）機能獲得」実験においてダウンレギュレーションすることによって検討することができる。様々なプレ−ｍｉＲ設計が、ｍｉＲＮＡ Ｒｅｇｉｓｔｒｙにおいて列挙されている公知ｍｉＲＮＡのすべてに対して存在しており、また、どのような研究のためにでも容易に設計され得る。ミクロＲＮＡは、本明細書中下記でさらに記載するように、細胞自体に投与されるか、または、核酸構築物中に連結される前駆体分子からコードされる場合がある。
本教示のミクロＲＮＡは、どのようなミクロＲＮＡ標的であれ、標的との結合、標的への結合、標的の調節、標的のプロセッシング、標的の妨害、標的の増強、標的の安定化および／または標的の脱安定化をもたらし得るものとする。そのような標的は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子およびポリペプチド（これらに限定されない）を含む、いかなる分子でもあり得、例えば、セロトニン関連遺伝子、例えば、セロトニン輸送体（すなわち、ＳＥＲＴまたはＳｌｃ６ａ４）、セロトニン阻害受容体１ａ（Ｈｔｒ１ａ）、トリプトファンヒドロキシラーゼ２（Ｔｐｈ２）およびモノアミンヒドロキシラーゼ（ＭａｏＡ）など；アドレナリンまたはノルアドレナリン受容体（アドレナリン作動性受容体、例えば、Ａｄｒ１など）；アデニル酸シクラーゼ１型（ＡＤＣＹ１）；ＣＲＨ受容体、例えば、Ｃｒｈ１Ｒなど；または、任意の他の分子、例えば、ＦＫ５０６結合タンパク質５（ＦＫＢＰ５）、カナビノイド受容体１（ＣＢ１）、ダウン症候群細胞接着分子（Ｄｓｃａｍ）、トランスリン会合タンパク質Ｘ（Ｔｓｎａｘ）および細胞接着分子Ｌ１（Ｌ１ｃａｍ）など（これらに限定されない）が可能である（すべてが本明細書中下記でさらに詳しく記載される）。
本発明のミクロＲＮＡが、例えば、ミクロＲＮＡ登録（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗｄｏｔｓｓａｎｇｅｒｄｏｔａｃｄｏｔｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｒｆａｍ／ｍｉｒｎａ／ｉｎｄｅｘｄｏｔｓｈｔｍｌ）を含めて、様々なデータベースを介して同定され得るものとする。
本発明の方法は、ミクロＲＮＡをコードする外因性ポリヌクレオチドを対象に投与することによって、または、対象の細胞において発現させることによって達成され得る。
用語「ポリヌクレオチド」は、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはそれらの模倣体の一本鎖または二本鎖のオリゴマーまたはポリマーを示す。この用語には、自然界に存在する核酸分子（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）に由来するポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチド、自然界に存在する塩基、糖および共有結合性のヌクレオシド間連結（例えば、骨格）から構成される合成ポリヌクレオチド分子および／またはオリゴヌクレオチド分子、同様にまた、自然界に存在するそれぞれの部分と同様に機能する自然界に存在しない部分を有する合成ポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドが含まれる。
本発明のポリヌクレオチドの長さは、必要に応じて１００ヌクレオチド以下、必要に応じて９０ヌクレオチド以下、必要に応じて８０ヌクレオチド以下、必要に応じて７０ヌクレオチド以下、必要に応じて６０ヌクレオチド以下、必要に応じて５０ヌクレオチド以下、必要に応じて４０ヌクレオチド以下、必要に応じて３０ヌクレオチド以下（例えば、２９ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１５ヌクレオチド）、必要に応じて１２ヌクレオチド〜２４ヌクレオチドの間、必要に応じて５ヌクレオチド〜１５ヌクレオチドの間、必要に応じて５ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドの間、最も好ましくは約２０〜２５ヌクレオチドである。
本発明の教示に従って設計されるポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチドを含む）は、酵素的合成または固相合成の両方を含めて、当技術分野で知られている任意のオリゴヌクレオチド合成法に従って作製することができる。固相合成を実行するための様々な設備および試薬が、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている。そのような合成のための他の手段があれば、それらもまた用いることができる；オリゴヌクレオチドの実際の合成は十分に当業者の能力の範囲内であり、固相化学（例えば、シアノエチルホスホルアミダイト）、その後、脱保護、脱塩および精製（例えば、自動化されたトリチル−オン法またはＨＰＬＣによる）を利用して、例えば、下記において詳しく記載されるような確立された方法論により達成することができる：Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（２００１）、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．他編（１９９４、１９８９）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ、ボルチモア、メリーランド；Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８８）、“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ニューヨーク；およびＧａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”。
ＲＮＡ分子を含むポリヌクレオチドは、本明細書中下記でさらに記載されるような発現ベクターを使用して作製され得るものとする。
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは修飾ポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドは、当技術分野で知られている様々な方法を使用して修飾することができる。
例えば、本発明のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、３’から５’へのホスホジエステル連結で結合する、プリン塩基およびピリミジン塩基からなる複素環式ヌクレオシドを含み得る。
好ましく使用されるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、本明細書中下記で幅広く記載されるように、骨格、ヌクレオシド間連結または塩基のいずれかにおいて改変されるものである。
本発明のこの局面に従って有用である好ましいオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの具体的な例には、修飾された骨格または非天然型ヌクレオシド間連結を含有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが含まれる。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドには、下記において開示されるように、リン原子を骨格に保持するものが含まれる：米国特許第４４６９８６３号、同第４４７６３０１号、同第５０２３２４３号、同第５１７７１９６号、同第５１８８８９７号、同第５２６４４２３号、同第５２７６０１９号、同第５２７８３０２号、同第５２８６７１７号、同第５３２１１３１号、同第５３９９６７６号、同第５４０５９３９号、同第５４５３４９６号、同第５４５５２３３号、同第５４６６６７７号、同第５４７６９２５号、同第５５１９１２６号、同第５５３６８２１号、同第５５４１３０６号、同第５５５０１１１号、同第５５６３２５３号、同第５５７１７９９号、同第５５８７３６１号および同第５６２５０５０号。
好ましい修飾オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド骨格には、例えば、ホスホロチオアート；キラルなホスホロチオアート；ホスホロジチオアート；ホスホトリエステル；アミノアルキルホスホトリエステル；メチルホスホナートおよび他のアルキルホスホナート（３’−アルキレンホスホナートおよびキラルなホスホナートを含む）；ホスフィナート；ホスホルアミダート（３’−アミノホスホルアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートを含む）；チオノホスホルアミダート；チオノアルキルホスホナート；チオノアルキルホスホトリエステル；ならびに、通常の３’−５’連結を有するボラノホスホナート、これらの２’−５’連結類似体、および、逆の極性を有するもの（この場合、ヌクレオシド単位の隣接対が、３’−５’から５’−３’に、または、２’−５’から５’−２’に連結される）が含まれる。上記修飾体の様々な塩、混合塩および遊離酸形態もまた使用することができる。
別法として、リン原子を骨格に含まない修飾オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルのヌクレオシド間連結、ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルの混合型ヌクレオシド間連結、あるいは、１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子ヌクレオシド間連結または複素環ヌクレオシド間連結によって形成される骨格を有する。これらには、下記の米国特許において開示されるように、（部分的にはヌクレオシドの糖部分から形成される）モルホリノ連結；シロキサン骨格；スルフィド骨格、スルホキシド骨格およびスルホン骨格；ホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル骨格およびメチレンチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファマート骨格；メチレンイミノ骨格およびメチレンヒドラジノ骨格；スルホナート骨格およびスルホンアミド骨格；アミド骨格を有するもの；ならびに、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２の混合成分部分を有する他のものが含まれる：米国特許第５０３４５０６号、同第５１６６３１５号、同第５１８５４４４号、同第５２１４１３４号、同第５２１６１４１号、同第５２３５０３３号、同第５２６４５６２号、同第５２６４５６４号、同第５４０５９３８号、同第５４３４２５７号、同第５４６６６７７号、同第５４７０９６７号、同第５４８９６７７号、同第５５４１３０７号、同第５５６１２２５号、同第５５９６０８６号、同第５６０２２４０号、同第５６１０２８９号、同第５６０２２４０号、同第５６０８０４６号、同第５６１０２８９号、同第５６１８７０４号、同第５６２３０７０号、同第５６６３３１２号、同第５６３３３６０号、同第５６７７４３７号および同第５６７７４３９号。
本発明に従って使用される場合がある他のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、糖およびヌクレオシド間連結の両方において修飾されるものであり、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格が新規な基により置き換えられる。塩基単位は、適切なポリヌクレオチド標的との相補のために維持される。そのようなオリゴヌクレオチド模倣体の一例には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる。ＰＮＡオリゴヌクレオチドは、糖−骨格がアミド含有骨格（特に、アミノエチルグリシン骨格）により置き換えられるオリゴヌクレオチドを示す。塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する米国特許には、米国特許第５５３９０８２号、同第５７１４３３１号および同第５７１９２６２号が含まれるが、これらに限定されない（これらのそれぞれが参照によって本明細書中に組み込まれる）。本発明において使用される場合がある他の骨格修飾が米国特許第６３０３３７４号に開示されている。
本発明のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドはまた、塩基修飾または塩基置換を含む場合がある。本明細書中で使用される場合、「非修飾」塩基または「天然型」塩基には、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびに、ピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。「修飾（された）」塩基には、他の合成塩基および天然型塩基（これらに限定されない）が含まれ、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）；５−ヒドロキシメチルシトシン；キサンチン；ヒポキサンチン；２−アミノアデニン；アデニンおよびグアニンの６−メチル誘導体および他のアルキル誘導体；アデニンおよびグアニンの２−プロピル誘導体および他のアルキル誘導体；２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン；５−ハロウラシルおよびシトシン；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン；５−ウラシル（プセウドウラシル）；４−チオウラシル；８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシおよび他の８−置換されたアデニンおよびグアニン；５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換されたウラシルおよびシトシン；７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン；８−アザグアニンおよび８−アザアデニン；７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン；ならびに、３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどが含まれる。さらなる修飾塩基には、米国特許第３６８７８０８号；Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．編（１９９０）、“Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”、８５８頁〜８５９頁、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；Ｅｎｇｌｉｓｃｈ他（１９９１）、“Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ”、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、３０、６１３；および、Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．、“Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、第１５章、２８９頁〜３０２頁、Ｓ．Ｔ．ＣｒｏｏｋｅおよびＢ．Ｌｅｂｌｅｕ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９３に開示されているものが含まれる。そのような修飾塩基は、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるために特に有用である。これらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに、Ｎ−２−置換プリン、Ｎ−６−置換プリンおよびＯ−６−置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む）が含まれる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃増大させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．他（１９９３）、“Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、２７６頁〜２７８頁、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、ボカラトン）、現時点では好ましい塩基置換であり、より一層具体的には、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合である。
１つの具体的な実施形態によれば、本発明のｍｉＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号５８〜９４で示される核酸配列を有する（表１Ａ参照）。
本明細書中上記で述べられるように、また、下記の実施例の節において示されるように、ミクロＲＮＡは、特定の前駆体（すなわち、プレ−ｍｉＲＮＡ）に由来するプロセッシングされた分子であり、特異的なｍｉＲＮＡ機能のアップレギュレーションを、特定のｍｉＲＮＡ前駆体分子を使用して達成することができる。
同様に意図されるものが、ｍｉＲＮＡおよびその前駆体に対して相同的な配列である。相同性のレベルは、成熟型ｍｉＲＮＡについては比較的高いものとするべきであるが、より大きな自由度が、配列変化が、成熟型ｍｉＲに対応する核酸セグメントではなくヘアピン配列においてである限り、前駆体レベルでは許容される（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上）。
そのような前駆体ポリヌクレオチド作用物質は典型的には、発現構築物の一部として標的細胞（例えば、神経膠細胞または心臓細胞）に投与される。この場合、ポリヌクレオチド作用物質は、標的細胞（例えば、神経膠細胞または心臓細胞）におけるミクロＲＮＡの発現を構成的または誘導可能な様式で行わせることができるシス作用調節要素（例えば、プロモーター）の制御下で核酸構築物において連結される。
本発明のミクロＲＮＡポリヌクレオチド作用物質の例には、ｍｉＲ−１５（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＲ＿０２９４８５ＲＮＡ）、ｍｉＲ−１９（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＲ＿０２９４８９．１）、ｍｉＲ−２６（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＲ＿０２９５００および同ＮＲ＿０２９４９９）、ｍｉＲ−２７（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＲ＿０２９５０１ＲＮＡ）、ｍｉＲ−１３５（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＲ＿０２９６７７．１）、ｍｉＲ−３３５（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＲ＿０２９８９９．１）、ｍｉＲ−１８１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＲ＿０２９６１１．１）およびｍｉＲ−１８２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＲ＿０２９６１４）が含まれるが、これらに限定されない。
ニューロン細胞特異的プロモーターの例には、ニューロン特異的エノラーゼ遺伝子プロモーター、シナプシンプロモーター、強化シナプシンプロモーター、カルシウムカルモジュリンプロモーターおよびＴｈｙ１プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
心臓細胞特異的プロモーターの例には、心臓ＮＣＸ１プロモーターおよびα−ミオシン重鎖（αＭＨＣ）プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の発現構築物はまた、当該ベクターを真核生物における複製および組み込みについて好適にするさらなる配列を含む場合がある（例えば、シャトルベクター）。典型的なクローニング用ベクターは、転写開始配列および翻訳開始配列（例えば、プロモーター、エンハンサー）、ならびに、転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含有する。本発明の発現構築物はさらに、エンハンサーを含むことができ、これは、プロモーター配列に対して近位または遠位に位置することができ、プロモーター配列からの転写をアップレギュレーションすることにおいて機能することができる。
エンハンサー要素は、転写を連結されている同種プロモーターまたは異種プロモーターから１０００倍にまで刺激することができる。エンハンサーは、転写開始部位の下流側または上流側に置かれたときに活性である。ウイルスに由来する多くのエンハンサー要素は広範な宿主範囲を有しており、また、様々な組織において活性である。例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーが多くの細胞型について好適である。本発明のために好適である他のエンハンサー／プロモーターの組合せには、ポリオーマウイルスまたはヒトもしくはマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、および、様々なレトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルスまたはラウス肉腫ウイルス、および、ＨＩＶなど）から得られる長い縦列反復（ＬＴＲ）に由来する組合せが含まれる。Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．およびＳｈｅｎｋ，Ｔ．編（１９８３）、Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ａｎｄ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク）参照（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。
ポリアデニル化配列もまた、検出可能な部分の発現効率を増大させるために本発明の発現構築物に加えることができる。２つの異なった配列要素が、正確かつ効率的なポリアデニル化のために要求される：ポリアデニル化部位の下流側に位置するＧＵリッチ配列またはＵリッチ配列、および、この部位の１１〜３０ヌクレオチド上流側に位置する６ヌクレオチドの高度保存配列、すなわち、ＡＡＵＡＡＡ。本発明のために好適である終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルには、ＳＶ４０に由来するシグナルが含まれる。
既に記載された実施形態に加えて、本発明の発現構築物は典型的には、クローン化された核酸の発現レベルを増大させるために、または、組換えＤＮＡを有する細胞の特定を容易にするために意図される他の特化された要素を含有し得る。例えば、いくつかの動物ウイルスは、許容細胞型におけるウイルスゲノムの染色体外複製を促進するＤＮＡ配列を含有する。これらのウイルスレプリコンを有するプラスミドは、適切な因子が、プラスミドで運ばれる遺伝子、または、宿主細胞のゲノムとともに運ばれる遺伝子のどちらかによって提供される限り、エピソームとして複製される。
本発明の発現構築物は真核生物レプリコンを含む場合も、または含まない場合もがあり得る。真核生物レプリコンが存在するならば、ベクターは、真核生物細胞における増幅を、適切な選択マーカーを使用して行うことができる。構築物が真核生物レプリコンを含まないならば、エピソーム増殖を行うことができない。代わりに、組換えＤＮＡが、操作された細胞のゲノムに一体化し、この場合、その細胞において、プロモーターにより、所望される核酸の発現が導かれる。
核酸構築物は、適切な遺伝子送達ビヒクル／方法（トランスフェクション、形質導入など）および適切な発現系を使用して本発明の標的細胞（例えば、神経膠細胞または心臓細胞）に導入され得る。
哺乳動物発現ベクターの例には、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１およびｐＮＭＴ８１（これらはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である）、ｐＣＩ（これはＰｒｏｍｅｇａから入手可能である）、ｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ（これらはＳｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能である）、ｐＴＲＥＳ（これはＣｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である）、ならびに、それらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
真核生物ウイルス（例えば、レトロウイルスなど）から得られる調節要素を含有する発現ベクターもまた使用することができる。ＳＶ４０系ベクターには、例えば、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２が含まれる。ウシパピローマウイルスに由来するベクターには、ｐＢＶ−１ＭＴＨＡが含まれ、エプスタイン・バールウイルスに由来するベクターには、ｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５が含まれる。他の例示的なベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５およびバキュロウイルスｐＤＳＶＥが含まれる。
脂質に基づく系が、これらの構築物を本発明の標的細胞（例えば、神経膠細胞または心臓細胞）に送達するために使用される場合がある。
リポソームには、一定量を包む脂質二重層から構成されるあらゆる合成（すなわち、自然界に存在しない）構造が含まれる。リポソームは、エマルション、フォーム、ミセル、不溶性単層物、液晶、リン脂質分散物およびラメラ層などを含む。リポソームは、当技術分野における公知方法のいずれかによって調製され得る［Ｍｏｎｋｋｏｎｅｎ，Ｊ．他、１９９４、Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ、２：２９９〜３０８；Ｍｏｎｋｋｏｎｅｎ，Ｊ．他、１９９３、Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ．、５３：１３９〜１４５；Ｌａｓｉｃ ＤＤ．、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９９３、６３〜１０５（第３章）；Ｗｉｎｔｅｒｈａｌｔｅｒ Ｍ、Ｌａｓｉｃ ＤＤ、Ｃｈｅｍ Ｐｈｙｓ Ｌｉｐｉｄｓ、１９９３（９月）、６４（１−３）：３５〜４３］。リポソームは、正荷電、中性または負荷電であり得る。単核食細胞系（ＭＰＳ）取り込みのために、リポソームは疎水性とすることができ、これは、リポソーム膜の（例えば、ポリエチレングリコール結合脂質および親水性粒子の使用による）親水性での遮蔽がＭＰＳ取り込みを受けにくくする場合があるからである。リポソームが、立体的に遮蔽された脂質（例えば、ガングリオシド−ＧＭ１およびホスファチジルイノシトールなど）を含まないことまたも好ましく、これは、これらの脂質がＭＰＳ取り込みを妨げるからである。
リポソームは単一脂質層であり得、または、多層状であり得る。治療剤が親水性であるならば、その送達が、大きい単層小胞を使用してさらに改善される場合があり、これは、それらの内部体積がより大きいからである。逆に、治療剤が疎水性であるならば、その送達が、多層小胞を使用してさらに改善される場合がある。別法として、治療剤（例えば、オリゴヌクレオチド）は脂質二重層を透過することができないことがあり得、結果として、リポソーム表面に吸着されたままとなる。この場合には、リポソームの表面積を増大することにより、治療剤の送達がさらに改善される場合がある。本発明による好適なリポソームは非毒性のリポソームであり、例えば、ホスファチジルコリンホスホグリセロールおよびコレステロールから調製されるリポソームなどである。使用されるリポソームの直径は０．１〜１．０ミクロンの範囲であり得る。しかしながら、食作用細胞による食作用に好適である他のサイズ範囲もまた使用される場合がある。リポソームのサイズ調整を行うために、均質化が使用される場合があり、これは、大きいリポソームをより小さいリポソームに細分化するための剪断エネルギーに依拠する。都合よく使用され得るホモジナイザーには、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（ボストン、マサチューセッツ）によって製造されるミクロフルイダイザーが含まれる。典型的な均質化手順において、リポソームは、選択されたリポソームサイズが観測されるまで、標準的な乳化ホモジナイザーに通して再循環される。粒子サイズ分布を慣用的レーザービーム粒子サイズ識別によってモニターすることができる。小細孔のポリカルボナート膜または非対称セラミック膜に通したリポソームの押出しが、リポソームサイズを比較的十分に規定されたサイズ分布にまで小さくするための効果的な方法である。典型的には、懸濁物が、所望されるリポソームサイズ分布が達成されるまで１回または複数回、そのような膜に通して循環される。リポソームが、リポソームサイズを徐々に減少させるために、細孔が順次小さくなる膜に通して押し出される場合がある。
当技術分野で知られている方法はどれも、ミクロＲＮＡポリヌクレオチド作用物質をリポソームに取り込ませるために使用することができる。例えば、ミクロＲＮＡポリヌクレオチド作用物質がリポソーム内にカプセル化される場合がある。別法として、ミクロＲＮＡポリヌクレオチド作用物質がリポソームの表面に吸着される場合がある。薬剤を本発明のリポソームに取り込ませるために使用される場合がある他の方法には、Ａｌｆｏｎｓｏ他［Ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、イーストン、ペンシルベニア、第１９版（１９９５）］によって記載された方法、および、Ｋｕｌｋａｒｎｉ他［Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１９９５、１２（３）：２２９〜４６］によって記載された方法がある。
本発明の方法において使用されるリポソームは好ましくは、血液関門を越える。したがって、本発明のリポソームは好ましくは、血液関門を標的とする多糖（例えば、マンノース）をその膜部分に含まない。好ましくは、本発明のリポソームは、リポソームを血液関門上の受容体に対して標的化するペプチドをその膜部分に含まない。そのようなペプチドの例には、トランスフェリン、インスリン、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、抗トランスフェリン受容体抗体、抗インスリン受容体抗体、抗ＩＧＦ−１受容体抗体および抗ＩＧＦ−２受容体抗体が含まれるが、これらに限定されない。
本発明に従ってとりわけ好適であるリポソームを決定するために、例えば、米国特許出願公開第２００４０２６６７３４号および米国特許出願公開第２００４０２６６７３４号、ならびに、Ｄａｎｅｎｂｅｒｇ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２００３、４２：６７１〜９；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００２、１０６：５９９〜６０５；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００３、１０８：２７９８〜８０４に記載されたアッセイなどのスクリーニングアッセイを行うことができる。
本発明のこの局面に従って使用することができる他の非脂質型ベクターには、ポリリシンおよびデンドリマーが含まれるが、これらに限定されない。
発現構築物はまた、ウイルスであり得る。ウイルス構築物の例には、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ポリオーマウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよびヘルペスウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。
レトロウイルスベクターは、本発明との使用のために特に好適である一群のベクターを表す。欠陥レトロウイルスベクターが、遺伝子を哺乳動物細胞に移入することにおいて常用されている（総説については、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）、Ｂｌｏｏｄ、７６、２７１参照）。本発明のポリヌクレオチドを含む組換えレトロウイルスを、よく知られている分子技術を使用して構築することができる。レトロウイルスのゲノムの一部を、レトロウイルス複製装置を欠陥にするために除くことができ、その後、この複製欠陥レトロウイルスをビリオンにパッケージングすることができ、このビリオンを、標準的な技術を用いながら、ヘルパーウイルスの使用により標的細胞に感染させるために使用することができる。組換えレトロウイルスを作製するため、および、細胞にウイルスをインビトロまたはインビボで感染させるためのプロトコルを、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ他（１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）において見出すことができる。レトロウイルスは、様々な遺伝子を多くの異なる細胞型（ニューロン細胞、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞および骨髄細胞を含む）に導入するために使用されている。
１実施形態によれば、レンチウイルスベクター（レトロウイルスベクターの１つのタイプ）が本教示に従って使用される。レンチウイルスベクターは、分裂中の細胞と同様に、非分裂細胞のゲノムに組み込むそれらの能力のためにベクターとして広範囲に使用されている。ウイルスのゲノム（これはＲＮＡの形態である）が、ウイルスが細胞に進入したときに逆転写されて、ＤＮＡを産生し、このＤＮＡがその後、ウイルスインテグラーゼ酵素によってランダムな位置においてゲノムに挿入される。ベクター（プロウイルス）はゲノムに留まり、細胞が分裂するとき、細胞の子孫に伝えられる。安全性の理由から、レンチウイルスベクターは、その複製に要求される遺伝子を決して有しない。レンチウイルスを作製するために、いくつかのプラスミドが、いわゆるパッケージング細胞株（一般にはＨＥＫ２９３）にトランスフェクションされる。１つまたは複数のプラスミド（これらは一般にパッケージングプラスミドとして示される）により、ビリオンタンパク質（例えば、カプシドおよび逆転写酵素など）がコードされる。別のプラスミドが、ベクターによって送達されるための遺伝物質を含有する。遺伝物質は、一本鎖のＲＮＡウイルスゲノムを産生するために転写され、また、Ψ（プサイ）配列の存在によって印が付けられる。この配列が、ゲノムをビリオンにパッケージングするために使用される。
本発明のポリヌクレオチド配列を神経膠細胞または心臓細胞に導入し、当該細胞において発現させるための好適なレンチウイルスベクターの具体的な一例が、レンチウイルスｐＬＫＯ．１ベクターである。
本発明のこの局面に従って使用される場合がある別の好適な発現ベクターがアデノウイルスベクターである。アデノウイルスは、広範囲に研究され、かつ、常用されている遺伝子移入ベクターである。アデノウイルスベクターの重要な利点には、分裂細胞および休止細胞の比較的大きい形質導入効率、広範囲の上皮組織に対する天然の指向性、ならびに、高力価物の容易な製造が含まれる（Ｒｕｓｓｅｌ，Ｗ．Ｃ．（２０００）、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ、８１、５７〜６３）。アデノウイルスＤＮＡは核に輸送されるが、そこに組み込まれることはない。したがって、アデノウイルスベクターによる変異誘発の危険性が最小限に抑えられ、一方で、短期間の発現が、癌細胞を処置するために特に適している。実験的な癌処置において使用されるアデノウイルスベクターが、Ｓｅｔｈ他（１９９９）、“Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ”（１０３〜１２０頁）；Ｐ．Ｓｅｔｈ編、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ：Ｂａｓｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｔｏ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（ランデス、オースチン、テキサス）によって記載されている。
好適なウイルス発現ベクターはまた、レトロウイルス成分およびアデノウイルス成分を組み合わせるキメラアデノウイルス／レトロウイルスベクターであり得る。そのようなベクターは、腫瘍細胞を形質導入するための従来型の発現ベクターよりも効率的であり得る（Ｐａｎ他（２００２）、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｓ、１８４、１７９〜１８８）。
本発明の発現構築物をウイルス感染によって標的細胞（例えば、神経膠細胞または心臓細胞）に導入するとき、感染のためのウイルス用量は、少なくとも１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５またはそれ以上のｐｆｕまたはウイルス粒子である。
用いられる方法または構築物にかかわらず、上記で詳述されたように、ミクロＲＮＡをコードする核酸構築物を含む単離された細胞が提供される。
本明細書中で使用される場合、用語「単離（された）」は、天然の環境から、例えば、人体から少なくとも部分的に分離されたことを示す。
１つの実施形態によれば、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−２７、ｍｉＲ−１８１およびｍｉＲ−１８２からなる群から選択される少なくとも１つのミクロＲＮＡまたはその前駆体を発現する核酸構築物を含み、上記核酸構築物がシス作用調節要素の転写制御下にある単離された細胞が提供される。
特定の実施形態によれば、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−２６およびｍｉＲ−１８２からなる群から選択される少なくとも１つのミクロＲＮＡまたはその前駆体を発現する核酸構築物を含み、上記核酸構築物がシス作用調節要素の転写制御下にある単離された神経膠細胞が提供される。
特定の実施形態によれば、ｍｉＲ−１９またはその前駆体を発現する核酸構築物を含み、上記核酸構築物がシス作用調節要素の転写制御下にある単離された細胞が提供される。
特定の実施形態によれば、ｍｉＲ−１５またはその前駆体を発現する核酸構築物を含み、上記核酸構築物がシス作用調節要素の転写制御下にある単離された細胞が提供される。
特定の実施形態によれば、上記細胞は神経膠細胞または心臓細胞である。
特定の実施形態によれば、上記神経膠細胞はセロトニン作動性ニューロンなどのニューロンである。
ミクロＲＮＡまたはその前駆体は、細胞、すなわち、本発明の標的細胞（例えば、神経膠細胞または心臓細胞にインビボで（すなわち、生物または対象の体内に）、または、エクスビボで（例えば、組織培養において）与えられるためのものである。細胞がエクスビボで処理される場合、方法は好ましくは、そのような細胞を個体に投与して戻す段階を含む（エクスビボ細胞治療）。
エクスビボ治療のために、細胞が好ましくは、本発明の作用物質（例えば、ミクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチド）により処理され、その後、その細胞が、その必要性のある対象に投与される。
本発明のエクスビボ処理細胞の投与を、任意の好適な導入経路（例えば、静脈内、腹腔内、腎臓内、胃腸管内、皮下、経皮、筋肉内、皮内、クモ膜下腔内、硬膜外および直腸など）を使用して達成することができる。現在好ましい実施形態によれば、本発明のエクスビボ処理細胞は、静脈内、腎臓内、胃腸管内および／または腹腔内投与を使用して個体に導入される場合がある。
本発明の細胞（例えば、神経膠細胞または心臓細胞）は、自己供給源または同種供給源（例えば、ヒト死体またはヒトドナー）のどちらからでも得ることができる。非自己細胞は、身体に投与されたときには免疫反応を誘導する可能性があるので、いくつかの取り組みが、非自己細胞を拒絶する可能性を軽減するために開発されている。これらには、レシピエントの免疫系を抑制すること、または、非自己細胞を移植前に、免疫隔離する半透過性膜でカプセル化することのどちらかが含まれる。
カプセル化技術は一般には、小さい球状ビヒクルを伴うマイクロカプセル化として、また、より大きい平坦シートおよび中空繊維膜を伴うマクロカプセル化として分類される（Ｕｌｕｄａｇ，Ｈ．他（２０００）、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ、４２、２９〜６４）。
マイクロカプセルの調製方法は、当技術分野では知られており、例えば、下記の文献において開示されている方法が含まれる：Ｌｕ，Ｍ．Ｚ．他（２０００）、Ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｌｇｉｎａｔｅ ａｎｄ ａｌｐｈａ−ｐｈｅｎｏｘｙｃｉｎｎａｍｙｌｉｄｅｎｅ−ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ｐｏｌｙ（ａｌｌｙｌａｍｉｎｅ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ、７０、４７９〜４８３；Ｃｈａｎｇ，Ｔ．Ｍ．およびＰｒａｋａｓｈ，Ｓ．（２００１）Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ，ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１７、２４９〜２６０；およびＬｕ，Ｍ．Ｚ．他（２０００）、Ａ ｎｏｖｅｌ ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｏｌｙ（ａｌｌｙｌａｍｉｎｅ ａｌｐｈａ−ｃｙａｎｏｃｉｎｎａｍｙｌｉｄｅｎｅａｃｅｔａｔｅ）、Ｊ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ、１７、２４５〜５２１。
例えば、マイクロカプセルは、修飾コラーゲンを、メチルアクリル酸２−ヒドロキシエチル（ＨＥＭＡ）、メタクリル酸（ＭＡＡ）およびメタクリル酸メチル（ＭＭＡ）のターポリマー殻との複合体（これは２〜５μｍのカプセル厚さをもたらす）で使用して調製される。そのようなマイクロカプセルはさらに、負荷電の滑らかな表面を与えるために、かつ、血漿タンパク質の吸収を最小限に抑えるために、さらに２〜５μｍのターポリマー殻によりカプセル化することができる（Ｃｈｉａ，Ｓ．Ｍ．他（２００２）、Ｍｕｌｔｉ−ｌａｙｅｒｅｄ ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２３、８４９〜８５６）。
他のマイクロカプセルは、海洋多糖であるアルギン酸塩（Ｓａｍｂａｎｉｓ，Ａ．（２００３）、Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｉｓｌｅｔｓ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｔｈｅｃｈｎｏｌ Ｔｈｅｒ、５、６６５〜６６８）またはその誘導体に基づく。例えば、マイクロカプセルを、ポリアニオンのアルギン酸ナトリウムおよびセルロース硫酸ナトリウムと、ポリカチオンのポリ（メチレン−コ−グアニジン）塩酸塩との間における塩化カルシウム存在下での高分子電解質複合体化によって調製することができる。
細胞のカプセル化は、より小さいカプセルが使用されるときには改善されるものとする。したがって、例えば、カプセル化された細胞の品質管理、機械的安定性、拡散特性およびインビトロ活性が、カプセルサイズが１ｍｍから４００μｍに縮小されたときに改善した（Ｃａｎａｐｌｅ，Ｌ．他（２００２）、Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｉｚｅ ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｊ Ｂｉｏｍａｔｅｒ Ｓｃｉ Ｐｏｌｙｍ Ｅｄ１３、７８３〜９６）。そのうえ、７ｎｍもの小さい十分制御された細孔サイズ、調整された表面化学、および、精密な微細構造様式を有するナノ多孔性バイオカプセルは、細胞のための微小環境を首尾良く免疫隔離することが見出された（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．（１９９９）、Ｓｍａｌｌ ｉｓ ｂｅａｕｔｉｆｕｌ：ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ ａｎｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ ｍｅｄｉｃａｌ ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｍｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ、１０、６〜９；およびＤｅｓａｉ，Ｔ．Ａ．（２００２）、Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ、２、６３３〜６４６参照）。
エクスビボ処置と併せて使用され得る免疫抑制剤の例には、メトトレキサート、シクロホスファミド、シクロスポリン、シクロスポリンＡ、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン（スルファサラゾピリン）、金塩、Ｄ−ペニシラミン、レフルノミド、アザチオプリン、アナキンラ、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、エタネルセプト、ＴＮＦアルファ遮断剤、炎症性サイトカインを標的とする生物製剤、および、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が含まれるが、これらに限定されない。ＮＳＡＩＤの例には、アセチルサリチル酸、サリチル酸コリンマグネシウム、ジフルニサル、サリチル酸マグネシウム、サルサラート、サリチル酸ナトリウム、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロフェナマート、ナプロキセン、ナブメトン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、Ｃｏｘ−２阻害剤およびトラマドールが含まれるが、これらに限定されない。
インビボ治療のために、作用物質（例えば、ミクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチド）が、それ自体で、または、医薬組成物の一部として対象に投与される。好ましくは、そのような組成物は、血液脳関門（ＢＢＢ）の通過を可能にするように配合される。
中枢神経系（ＣＮＳ）への薬物送達のための従来の取り組みには、下記のことが含まれる：神経外科的戦略（例えば、脳内注射または脳室内注入）；ＢＢＢの内在性輸送経路の１つを利用するための試みでの、作用物質の分子的操作（例えば、内皮細胞表面分子に対する親和性を有する輸送ペプチドを、自身でＢＢＢを越えることができない作用物質との組合せで含むキメラな融合タンパク質の製造）；作用物質の脂質溶解性を増大させるために設計される薬理学的戦略（例えば、水溶性作用物質を脂質担体またはコレステロール担体にコンジュゲート化すること）；および、ＢＢＢの一体性の、（頸動脈内へのマンニトール溶液の注入または生物学的活性剤（例えば、アンギオテンシンペプチドなど）の使用から生じる）高浸透圧破壊による一時的な破壊。
ＢＢＢの背後への薬物送達のための方法には、脳内埋め込み（例えば、針によるものなど）および対流強化分布が含まれる。マンニトールを、ＢＢＢを迂回することにおいて使用することができる。同様に、粘膜投与（例えば、鼻腔投与）を、ＢＢＢを迂回するために使用することができる。
本発明のミクロＲＮＡポリヌクレオチド作用物質はまた、当該作用物質が好適な担体または賦形剤と混合される医薬組成物において生物に投与することができる。
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分の１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適な担体および賦形剤など）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。
本明細書中において、用語「有効成分」は、生物学的効果を説明することができるペプチドを示す。
本明細書中以降、表現「生理学的に許容される担体」および表現「医薬的に許容される担体」は、交換可能に使用され得るが、生物に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された化合物の生物学的な活性および性質を妨げない担体または希釈剤を示す。アジュバントはこれらの表現に包含される。
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。
薬物の配合および投与のための技術が「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出されることができ、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、特に経鼻送達、腸管送達、または非経口送達（これには、筋肉内注射、皮下注射および髄内注射、ならびに、クモ膜下注射、直接的な脳室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射または眼内注射が含まれる）が含まれることができる。
あるいは、例えば、患者の組織領域に直接的に医薬組成物の注射をすることによって、全身的な方法よりも局所的に医薬組成物を投与することができる。
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られているプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥のプロセスによって製造されることができる。
従って、本発明に従って使用される医薬組成物は、医薬品として使用されることができる調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容され得る担体を使用して従来の様式で配合されることできる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合しうる緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な食塩緩衝液など）において配合されることができる。経粘膜投与の場合、浸透されるバリヤーに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
経口投与の場合、医薬組成物は、活性化合物をこの分野でよく知られている医薬的に許容され得る担体と組み合わせることによって容易に配合されることができる。そのような担体は、医薬組成物が、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤および懸濁物などとして配合されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物は、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、錠剤または糖衣錠コアを得るために、望ましい好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製されることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容され得るポリマーである。もし望むなら、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤が加えられることができる。
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有しうる。色素または顔料は、活性化合物の量を明らかにするために、または活性化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えられることができる。
経口使用されうる医薬組成物としては、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびに、ゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが挙げられる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）、および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分は、好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁されることができる。さらに、安定化剤が加えられることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
口内投与の場合、組成物は、従来の方法で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
鼻吸入による投与の場合、本発明による使用のための有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投与量は、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定されることができる。ディスペンサーにおいて使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは、化合物および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有して配合されることができる。
本明細書中に記載される医薬組成物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合されることができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供されることができる。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態の活性調製物の水溶液が含まれる。さらに、有効成分の懸濁物は、適切な油性または水性の注射用懸濁物として調製されることができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが挙げられる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために、有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
あるいは、有効成分は、好適なビヒクル（例えば、無菌の、パイロジェン不含水溶液）を使用前に用いて構成される粉末形態であることができる。
本発明の医薬組成物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合されることができる。
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物として、有効成分が、その意図された目的を達成するために有効な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、「治療有効量」は、処置されている対象の障害（例えば、糖尿病）の症状を予防、緩和あるいは改善するために効果的であるか、または、処置されている対象の生存を延ばすために効果的である、有効成分（ペプチド）の量を意味する。
本発明の１つの実施形態によれば、ｍｉＲ−１３５の過剰発現が抗うつ効果を有する。
治療有効量の決定は、特に本明細書中に与えられる詳細な開示に鑑みて、十分に当業者の能力の範囲内である。
本発明の方法において使用されるいかなる調製物についても、投与量または治療有効量は、インビトロおよび細胞培養アッセイから最初に推定されることができる。例えば、投与量は、所望の濃度または力価を達成するために動物モデルにおいて決定されることができ、そのような情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために使用されることができる。
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、インビトロ、細胞培養物、または実験動物における標準的な薬学的手法によって決定されることができる。これらのインビトロ、細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量範囲を定めるために使用されることができる。投与量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化しうる。正確な配合、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択されることができる（例えば、Ｆｉｎｇｌら、（１９７５）「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１ ｐ．１を参照のこと）。
投薬量および投薬間隔を、生物学的効果を誘導または抑制するために活性な成分の十分な血漿レベル（これは最小有効濃度（ＭＥＣ）と呼ばれる）を提供するために個々に調節することができる。ＭＥＣはそれぞれの調製物について変化するが、インビトロデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は個々の特性および投与経路に依存する。検出アッセイを使用して、血漿中濃度を求めることができる。
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は、単回または複数回投与で行われることができ、この場合、処置期間は、数日から数週間まで、または治療が達成されるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存するだろう。投与量および投与時期は、個体の変化する状態の注意深い連続した観察に応じて変わるであろう。
本発明の作用因がヒトの処置に先立って試験され得る様々な動物モデルが存在することが理解されるであろう。例えば、うつ病、ストレス、不安の動物モデル、例えば、学習性無力モデル（ＬＨ）、慢性的軽度ストレス（ＣＭＳ）モデル、社会的敗北ストレス（ＳＤＳ）モデルおよび母性略奪モデルなどが使用され得る。
本発明の組成物は、所望されるならば、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態物を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供され得る。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイルを含むことができる（例えば、ブリスターパックなど）。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随し得る。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、容器に関連した通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きであり得るか、または、承認された製品添付文書であり得る。適合し得る医薬用担体に配合された本発明の調製物を含む組成物もまた、上でさらに詳述されたように、示された状態を処置するために調製され、適切な容器に入れられ、かつ標識され得る。
本発明の治療組成物は、ミクロＲＮＡポリヌクレオチド作用物質に加えて、うつ病、ストレス、不安、断眠などの処置のための他の公知薬物を含む場合があるものとする：そのような薬物は、例えば、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、セロトニン−ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）、ノルアドレナリン作動性かつ特異的なセロトニン作動性抗うつ剤（ＮａＳＳＡ）、ノルエピネフリン（ノルアドレナリン）再取り込み阻害剤（ＮＲＩ）、ノルエピネフリン−ドパミン再取り込み阻害剤、選択的セロトニン再取り込み強化剤、ノルエピネフリン−ドパミン脱抑制剤、三環系抗うつ剤（例えば、イミプラミン）、モノアミンオキシダーゼ阻害剤（ＭＡＯＩ）であり、これらに限定されない。これらの薬物は、単一の包装物または別個の包装物で製品に含まれる場合がある。
本発明者らは、ｍｉＲ−２７の過剰発現がＭａｏＡの抑制をもたらすこと（実施例１（本明細書中下記）参照）、ｍｉＲ−１３５の過剰発現がＳｌｃ６ａ４の抑制をもたらすこと（実施例１（本明細書中下記）参照）、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−１８１またはｍｉＲ−１８２の過剰発現がＨｔｒ１ａの抑制をもたらすこと（実施例１（本明細書中下記）参照）、ｍｉＲ−１９の過剰発現がＡｄｒ１の抑制をもたらし（実施例２（本明細書中下記）参照）、また、ＣＢ１の抑制をもたらすこと（実施例３Ｂ（本明細書中下記）参照）、および、ｍｉＲ−１５の過剰発現がＣｒｈ１Ｒの抑制をもたらし（実施例４（本明細書中下記）参照）、また、ＦＫＢＰ５の抑制をもたらすこと（実施例４Ｂ（本明細書中下記）参照）を示している。
従って、本発明の１つの実施形態によれば、セロトニン輸送体（Ｓｌｃ６ａ４）遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、ｍｉＲ−１３５およびｍｉＲ−３３５からなる群から選択されるミクロＲＮＡまたはその前駆体の活性または発現を調整することを含む方法が提供される。
本明細書中で使用される場合、用語「セロトニン輸送体（Ｓｌｃ６ａ４）」は、シナプス間隙からのセロトニンの再取り込みに関与する（ＳＥＲＴとも呼ばれる）モノアミン輸送体タンパク質を示す。例示的なＳｌｃ６ａ４がＮＰ＿００１０３６．１で示される。
別の実施形態によれば、セロトニン阻害受容体１ａ（Ｈｔｒ１ａ）遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−２６からなる群から選択されるミクロＲＮＡまたはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整することを含む方法が提供される。
本明細書中で使用される場合、用語「セロトニン阻害受容体１ａ（Ｈｔｒ１ａ）」は、シナプス前ニューロンにおいて自己受容体として機能し、セロトニン放出の阻害を伝達するＧタンパク質共役受容体を示す。例示的なＨｔｒ１ａがＮＰ＿０００５１５．２で示される。
別の実施形態によれば、モノアミンヒドロキシラーゼ（ＭａｏＡ）遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、ｍｉＲ−２７またはその前駆体の活性または発現を調整することを含む方法が提供される。
本明細書中で使用される場合、用語「モノアミンヒドロキシラーゼ（ＭａｏＡ）」は、アミン系神経伝達物質（例えば、ドパミン、ノルエピネフリンおよびセロトニンなど）を分解する酵素を示す。例示的なＭａｏＡがＮＰ＿０００２３１．１で示される。
本発明の１つの実施形態によれば、トリプトファンヒドロキシラーゼ２（Ｔｐｈ２）遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、ｍｉＲ−１８１およびｍｉＲ２７からなる群から選択されるミクロＲＮＡまたはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整することを含む方法が提供される。
本明細書中で使用される場合、用語「トリプトファンヒドロキシラーゼ２（Ｔｐｈ２）」は、セロトニンの生合成における最初の律速段階を触媒する酵素を示す。例示的なＴｐｈ２がＮＰ＿ＮＰ＿７７５４８９．２で示される。
別の実施形態によれば、ベータアドレナリン作動性受容体１（Ａｄｒｂ１）遺伝子の発現を神経膠細胞または心臓細胞において調節する方法であって、ｍｉＲ−１９またはその前駆体の活性または発現を調整することを含む方法が提供される。
本明細書中で使用される場合、用語「ベータアドレナリン作動性受容体１（Ａｄｒｂ１）」は、アドレナリンおよびノルアドレナリンの生理学的影響を伝達する受容体を示す。例示的なＡｄｒｂ１がＮＰ＿０００６７５．１で示される。
別の実施形態によれば、ベータ２型アドレナリン作動性受容体（Ａｄｒｂ２）遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、ｍｉＲ−１５またはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整することを含む方法が提供される。
本明細書中で使用される場合、用語「ベータ２型アドレナリン作動性受容体（Ａｄｒｂ２）」は、クラスＣのＬ型カルシウムチャネルＣａ（Ｖ）１．２と直接会合する受容体を示す。Ａｄｒｂ２が、例えば、ＮＰ＿００００１５．１で示される。
別の実施形態によれば、ＣＲＨ１型受容体遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、ｍｉＲ−１５またはその前駆体の活性または発現を調整することを含む方法が提供される。
本明細書中で使用される場合、用語「ＣＲＨ１型」は、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）と結合する受容体を示す。ＣＲＨ１型が、例えば、ＮＰ＿００１１３８６１８．１、ＮＰ＿００１１３８６１９．１、ＮＰ＿００１１３８６２０．１およびＮＰ＿００４３７３．２で示される。
別の実施形態によれば、グルタミン酸受容体遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、ｍｉＲ−１８１またはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整することを含む方法が提供される。
別の実施形態によれば、上記グルタミン酸受容体遺伝子は、さらに上述されるように、グルタミン酸受容体代謝型１（Ｇｒｍ１）、グルタミン酸受容体イオンチャネル型カイニン酸３（Ｇｒｉｋ３）、グルタミン酸受容体代謝型５（Ｇｒｍ５）、グルタミン酸受容体イオンチャネル型カイニン酸２（Ｇｒｉｋ２）およびグルタミン酸受容体代謝型７（Ｇｒｍ７）を含む。
別の実施形態によれば、ダウン症候群細胞接着分子（Ｄｓｃａｍ）遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、ｍｉＲ−１８２またはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整することを含む方法が提供される。
本明細書中で使用される場合、用語「ダウン症候群細胞接着分子（Ｄｓｃａｍ）」は、ニューロンの自己回避においてある一定の役割を果たす細胞接着分子を示す。Ｄｓｃａｍが、例えば、ＮＰ＿００１３８０．２で示される。
別の実施形態によれば、細胞接着分子Ｌ１（Ｌ１ｃａｍ）遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、ｍｉＲ−１８２またはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整することを含む方法が提供される。
本明細書中で使用される場合、用語「細胞接着分子Ｌ１（Ｌ１ｃａｍ）」は、ニューロンの細胞接着分子を示す。Ｌ１ｃａｍが、例えば、ＮＰ＿０００４１６．１、ＮＰ＿００１１３７４３５．１、ＮＰ＿０７６４９３．１．で示される。
別の実施形態によれば、トランスリン会合タンパク質Ｘ（Ｔｓｎａｘ）遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、ｍｉＲ−１８２またはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整することを含む方法が提供される。
本明細書中で使用される場合、用語「トランスリン会合タンパク質Ｘ（Ｔｓｎａｘ）」は、トランスリンと特異的に相互作用するタンパク質を示す。Ｔｓｎａｘが、例えば、ＮＰ＿００５９９０．１で示される。
別の実施形態によれば、カナビノイド受容体１（ＣＢ１）遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、ｍｉＲ−１９またはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整することを含む方法が提供される。
本明細書中で使用される場合、用語「カナビノイド受容体１（ＣＢ１）」は、（ＣＮＲ１としても知られている）細胞膜受容体を示す。ＣＢ１が、例えば、ＮＰ＿００１１５３６９８．１、ＮＰ＿００１１５３７３０．１、ＮＰ＿００１１５３７３１．１、ＮＰ＿０５７１６７．２、ＮＰ＿１４９４２１．２で示される。
別の実施形態によれば、ＦＫ５０６結合タンパク質５（ＦＫＢＰ５）遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、ｍｉＲ−１５またはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整することを含む方法が提供される。
本明細書中で使用される場合、用語「ＦＫ５０６結合タンパク質５（ＦＫＢＰ５）」は、免疫抑制剤ＦＫ５０６およびラパマイシンに特異的に結合するタンパク質を示す。ＦＫＢＰ５が、例えば、ＮＰ＿００１１３９２４７．１、ＮＰ＿００１１３９２４８．１、ＮＰ＿００１１３９２４９．１、ＮＰ＿００４１０８．１で示される。
別の実施形態によれば、シンタキシン１ａ（Ｓｔｘ１ａ）遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、ｍｉＲ−１５またはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整することを含む方法が提供される。
本明細書中で使用される場合、用語「シンタキシン１ａ（Ｓｔｘ１ａ）」は、神経系特異的タンパク質を示す。Ｓｔｘ１ａが、例えば、ＮＰ＿００１１５９３７５．１、ＮＰ＿００４５９４．１で示される。
別の実施形態によれば、血清／グルココルチコイド調節キナーゼ（Ｓｇｋ１）遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、ｍｉＲ−１５またはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整することを含む方法が提供される。
本明細書中で使用される場合、用語「血清／グルココルチコイド調節キナーゼ（Ｓｇｋ１）」は、セリン／トレオニンプロテインキナーゼを示す。Ｓｇｋ１が、例えば、ＮＰ＿００１１３７１４８．１、ＮＰ＿００１１３７１４９．１、ＮＰ＿００１１３７１５０．１、ＮＰ＿００５６１８．２で示される。
本教示は、上記遺伝子の発現レベルをアップレギュレーションすること（すなわち、増大させること）またはダウンレギュレーションすること（すなわち、低下させること）を意図する。
本教示に従う遺伝子発現のダウンレギュレーションが典型的には、（本明細書中上記でさらに詳しく示されるような）ミクロＲＮＡポリヌクレオチドを標的細胞（例えば、神経膠細胞または心臓細胞）に投与することによって、または、標的細胞（例えば、神経膠細胞または心臓細胞）において発現させることによって行われる。
特定の実施形態によれば、上記調節することが、上記Ｓｌｃ６ａ４遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることを含むとき、上記調整することは、上記ｍｉＲ−１３５および／またはｍｉＲ−３３５をアップレギュレーションすることを含む。
特定の実施形態によれば、上記調節することが、上記Ｈｔｒ１ａ遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることを含むとき、上記調整することは、上記ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−２６をアップレギュレーションすることを含む。
特定の実施形態によれば、上記調節することが、上記ＭａｏＡ遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることを含むとき、上記調整することは、上記ｍｉＲ−２７をアップレギュレーションすることを含む。
特定の実施形態によれば、上記調節することが、上記Ａｄｒｂ１遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることを含むとき、上記調整することは、上記ｍｉＲ−１９をアップレギュレーションすることを含む。
特定の実施形態によれば、上記調節することが、上記ＣＲＨ１型受容体遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることを含むとき、上記調整することは、上記ｍｉＲ−１５をアップレギュレーションすることを含む。
特定の実施形態によれば、上記調節することが、上記ＣＢ１遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることを含むとき、上記調整することは、上記ｍｉＲ−１９をアップレギュレーションすることを含む。
特定の実施形態によれば、上記調節することが、上記ＦＫＢＰ５遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることを含むとき、上記調整することは、上記ｍｉＲ−１５をアップレギュレーションすることを含む。
別法として、本発明の別の実施形態によれば、遺伝子発現をアップレギュレーションすることが、ミクロＲＮＡの発現をダウンレギュレーションすることができる作用物質を標的細胞（例えば、神経膠細胞または心臓細胞）に投与することによって、または、標的細胞（例えば、神経膠細胞または心臓細胞）において発現させることによって影響される。
ミクロＲＮＡのダウンレギュレーションを、転写および／または翻訳を妨害する様々な分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング作用因、リボザイム、ＤＮＡザイムおよびアンチセンス）を使用してゲノムレベルおよび／または転写物レベルで達成することができる。
ミクロＲＮＡの発現をダウンレギュレーションする方法は、当該技術分野で公知である。
ｍｉＲの活性をダウンレギュレーションする核酸作用因には、標的模倣物、ミクロＲＮＡ抵抗性遺伝子およびｍｉＲＮＡ阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。
標的模倣物またはミクロＲＮＡ抵抗性標的は、下記のミスマッチの１つまたは複数が許されるならば、ミクロＲＮＡに対して本質的に相補的である：
（ａ）ミクロＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチドと、標的模倣物またはミクロＲＮＡ抵抗性標的における対応するヌクレオチド配列との間における１つのミスマッチ；
（ｂ）ミクロＲＮＡの１位〜９位におけるヌクレオチドのいずれか１つと、標的模倣物またはミクロＲＮＡ抵抗性標的における対応するヌクレオチド配列との間における１つのミスマッチ；あるいは
（ｃ）ミクロＲＮＡの１２位〜２１位におけるヌクレオチドのいずれか１つと、標的模倣物またはミクロＲＮＡ抵抗性標的における対応するヌクレオチド配列との間における３つのミスマッチ、ただし、この場合、連続するミスマッチは最大でも２つである。
標的模倣ＲＮＡは、例えば、ミスマッチをもたらすｍｉＲＮＡの１０番目または１１番目のヌクレオチドに対して相補的である標的配列のヌクレオチドに変化をもたらすように配列を改変することによってｍｉＲＮＡ誘導の切断に対して抵抗性になるように改変された標的ＲＮＡと本質的に類似している。
代替において、ミクロＲＮＡ抵抗性標的が実行される場合がある。したがって、ＤＮＡ配列および生じたＲＮＡ配列が、ミクロＲＮＡの結合を妨げる様式で変化し、しかし、タンパク質のアミノ酸配列は変化しないように、サイレント変異が標的遺伝子のミクロＲＮＡ結合部位に導入される場合がある。したがって、新しい配列を既存の結合部位に代わって合成することができ、ただし、この場合、新しい配列において、ＤＮＡ配列が変化し、それにより、ｍｉＲＮＡがその標的に結合しなくなることが生じる。
１つの具体的な実施形態によれば、標的模倣物またはミクロＲＮＡ抵抗性標的は、標的遺伝子を認識するプレｍｉＲＮＡと生来的に会合するプロモーターに連結され、植物細胞内に導入される。このようにして、ｍｉＲＮＡ標的模倣物またはミクロＲＮＡ抵抗性標的ＲＮＡが、ｍｉＲＮＡと同じ環境のもとで発現されるであろうし、また、標的模倣物またはミクロＲＮＡ抵抗性標的ＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ誘導の切断によって分解される非標的模倣物／ミクロＲＮＡ抵抗性標的ＲＮＡの代わりになるであろう。
非機能的ｍｉＲＮＡ対立遺伝子またはｍｉＲＮＡ抵抗性標的遺伝子もまた、ｍｉＲＮＡコード対立遺伝子またはｍｉＲＮＡ感受性標的遺伝子を代用するために相同的組換えによって導入される場合がある。
組換え発現は、目的とする核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ、標的遺伝子、サイレンシング作用因など）を植物プロモーターの発現のもとでの核酸発現構築物にクローン化することによって達成される。
本発明の他の実施形態において、一本鎖の合成核酸がｍｉＲＮＡ阻害剤として使用される。ｍｉＲＮＡ阻害剤は、典型的には長さが約１７ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドの間であり、成熟型ｍｉＲＮＡの５’端から３’端への配列に対して少なくとも９０％相補的である５’端から３’端への配列を含む。特定の実施形態において、ｍｉＲＮＡ阻害剤分子は、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチドまたは２５ヌクレオチドの長さであり、あるいは、それらにおいて導かれ得る任意の範囲である。さらに、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、成熟型ｍｉＲＮＡ、特に、成熟型の天然に存在するｍｉＲＮＡの５’端から３’端への配列に対して、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％相補的であるか、あるいは、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％相補的であるか、あるいは、それらにおいて導かれ得る任意の範囲である（５’端から３’端への）配列を有する。
ｍｉＲＮＡ阻害剤を、一過性トランスフェクション技術を使用して細胞と接触させる場合がある。ｍｉＲＮＡ阻害剤は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどの企業から市販されている。
別法として、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、本明細書中上記で記載されるように発現ベクターの一部である場合がある。この場合、細胞がベクターにより一過性または安定的にトランスフェクションされる場合がある。
特定の実施形態によれば、上記調節することが、上記Ｔｐｈ２遺伝子の発現をアップレギュレーションすることを含むとき、上記調整することは、上記ｍｉＲ−１８１および／または上記ｍｉＲ−２７をダウンレギュレーションすることを含む。
１つの実施形態によれば、ミクロＲＮＡの発現をダウンレギュレーションすることが、ミクロＲＮＡと特異的に結合し、その発現をダウンレギュレーションする核酸配列の使用によって達成される。本発明に従って使用され得る例示的な核酸配列は、いずれかの製造者から、例えば、Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａから購入することができる（ｍｉＡｒｒｅｓｔ、ミクロＲＮＡベクターに基づく阻害剤）。
従って、別の実施形態によれば、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−２７、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−１５およびｍｉＲ−１９またはその前駆体の発現をダウンレギュレーションするための核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。
ｍｉＲ−１８１の発現をダウンレギュレーションするために本発明に従って使用され得る例示的なポリヌクレオチドには、配列番号１３４〜配列番号１３７、および配列番号１５４〜配列番号１５７において示されるポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
ｍｉＲ−１８２の発現をダウンレギュレーションするために本発明に従って使用され得る例示的なポリヌクレオチドには、配列番号１３８〜配列番号１４１、および配列番号１４７において示されるポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
ｍｉＲ−２６の発現をダウンレギュレーションするために本発明に従って使用され得る例示的なポリヌクレオチドには、配列番号１２６〜配列番号１２９、および配列番号１４５〜配列番号１４６において示されるポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
ｍｉＲ−２７の発現をダウンレギュレーションするために本発明に従って使用され得る例示的なポリヌクレオチドには、配列番号１３０〜配列番号１３３、および配列番号１５２〜配列番号１５３において示されるポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
ｍｉＲ−１３５の発現をダウンレギュレーションするために本発明に従って使用され得る例示的なポリヌクレオチドには、配列番号１１０〜配列番号１１３、および配列番号１４２〜配列番号１４３において示されるポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
ｍｉＲ−３３５の発現をダウンレギュレーションするために本発明に従って使用され得る例示的なポリヌクレオチドには、配列番号１１４〜配列番号１１７、および配列番号１４４において示されるポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
ｍｉＲ−１５の発現をダウンレギュレーションするために本発明に従って使用され得る例示的なポリヌクレオチドには、配列番号１１８〜配列番号１２１、および配列番号１５０〜配列番号１５１において示されるポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
ｍｉＲ−１９の発現をダウンレギュレーションするために本発明に従って使用され得る例示的なポリヌクレオチドには、配列番号１２２〜配列番号１２５、および配列番号１４８〜配列番号１４９において示されるポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
そのような核酸配列はさらに、本明細書中上記でさらに詳しく記載されるような発現ベクターに含まれる場合がある。
本発明はさらに、標的遺伝子の発現（例えば、転写物またはポリペプチド）を、ミクロＲＮＡレベルを当該細胞（例えば、神経膠細胞または心臓細胞）においてダウンレギュレーションまたはアップレギュレーションした後で評価することを意図する。
したがって、標的遺伝子（例えば、Ｓｌｃ６ａ４、Ｈｔｒ１ａ、ＭａｏＡ、Ａｄｒｂ１、Ａｄｒｂ２、ＣＲＨ１型受容体、ＣＢ１、ＦＫＢＰ５、Ｔｐｈ２、Ｇｒｍ１、Ｇｒｉｋ３、Ｇｒｍ５、Ｇｒｉｋ２、Ｇｒｍ７、Ｇｒｉａ２、Ｄｓｃａｍ、Ｌ１ｃａｍ、Ｔｓｎａｘ、Ｓｇｋ１および／またはＳｔｘ１ａ）核酸配列（例えば、転写物）の存在および／またはレベルを、（例えば、下記のような）標的遺伝子の核酸配列にハイブリダイゼーションすることができる単離されたポリヌクレオチド（例えば、ポリヌクレオチドプローブ、オリゴヌクレオチドプローブ／プライマー）を使用して求めることができる（例えば、ＮＭ＿００１０４５．４で示されるようなＳｌｃ６ａ４またはその一部；例えば、ＮＭ＿０００５２４．３で示されるようなＨｔｒ１ａまたはその一部；例えば、ＮＭ＿０００２４０．３またはＮＭ＿００１２７０４５８．１で示されるようなＭａｏＡまたはその一部；例えば、ＮＭ＿０００６８４．２で示されるようなＡｄｒｂ１またはその一部；例えば、ＮＭ＿００００２４．５で示されるようなＡｄｒｂ２またはその一部；例えば、ＮＭ＿００１１４５１４６．１、ＮＭ＿００１１４５１４７．１で示されるようなＣＲＨ１型受容体またはその一部；例えば、ＮＭ＿００１１６０２２６．１、ＮＭ＿０３３１８１．３で示されるようなＣＢ１またはその一部；例えば、ＮＭ＿００１１４５７７５．１、ＮＭ＿００１１４５７７７．１で示されるようなＦＫＢＰ５またはその一部；例えば、ＮＭ＿１７３３５３．３で示されるようなＴｐｈ２またはその一部；例えば、ＮＭ＿０００８３８．３、ＮＭ＿００１１１４３２９．１で示されるようなＧｒｍ１またはその一部；例えば、ＮＭ＿０００８３１．３で示されるようなＧｒｉｋ３またはその一部；例えば、ＮＭ＿０００８４２．３、ＮＭ＿００１１４３８３１．２で示されるようなＧｒｍ５またはその一部；例えば、ＮＭ＿００１１６６２４７．１、ＮＭ＿０２１９５６．４で示されるようなＧｒｉｋ２またはその一部；例えば、ＮＭ＿０００８４４．３、ＮＭ＿１８１８７４．２で示されるようなＧｒｍ７またはその一部；例えば、ＮＭ＿０００８２６．３、ＮＭ＿００１０８３６１９．１で示されるようなＧｒｉａ２またはその一部；例えば、ＮＭ＿００１３８９．３で示されるようなＤｓｃａｍまたはその一部；例えば、ＮＭ＿０００４２５．３、ＮＭ＿００１１４３９６３．１、ＮＭ＿０２４００３．２で示されるようなＬ１ｃａｍまたはその一部；例えば、ＮＭ＿００５９９９．２で示されるようなＴｓｎａｘまたはその一部；例えば、ＮＭ＿００１１４３６７６．１、ＮＭ＿００１１４３６７７．１、ＮＭ＿００１１４３６７８．１で示されるようなＳｇｋ１またはその一部、および／あるいは、例えば、ＮＭ＿００１１６５９０３．１、ＮＭ＿００４６０３．３で示されるようなＳｔｘ１ａまたはその一部）。そのようなポリヌクレオチドはどのようなサイズも可能である；例えば、短いポリヌクレオチド（例えば、１５〜２００塩基）および中間的なポリヌクレオチド（例えば、２００〜２０００塩基）、または、２０００塩基より大きい長いポリヌクレオチド。
本発明によって使用される単離されたポリヌクレオチドプローブは、本発明の標的遺伝子ＲＮＡ転写物に対して特異的である直接的または間接的に標識されたＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、インビトロ転写されたＲＮＡ分子）、ＤＮＡ分子（例えば、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ分子、ゲノム分子）および／またはそれらの類似体［例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）］のいずれもが可能である。
本発明の教示に従って設計されるオリゴヌクレオチドは、本明細書中上記で詳しく記載されるように、この技術分野で知られている任意のオリゴヌクレオチド合成法に従って作製することができる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、本明細書中上記で記載される配列変化体との特異的なハイブリダイゼーションが可能である少なくとも１７塩基、少なくとも１８塩基、少なくとも１９塩基、少なくとも２０塩基、少なくとも２２塩基、少なくとも２５塩基、少なくとも３０塩基、または、少なくとも４０塩基のものである。
本発明のオリゴヌクレオチドは、３’から５’へのホスホジエステル連結で結合する、プリン塩基およびピリミジン塩基からなる複素環式ヌクレオシドを含む場合がある。
好ましく使用されるオリゴヌクレオチドが、本明細書中上記で広範に記載されるように、骨格、ヌクレオシド間連結または塩基のいずれかにおいて修飾されるオリゴヌクレオチドである。
本発明によって使用される単離されたポリヌクレオチドは、タグ分子または標識分子を使用して直接的または間接的にそのどちらでも標識することができる。そのような標識として、例えば、蛍光性分子（例えば、フルオレセインまたはテキサスレッド）、放射性分子（例えば、３２Ｐ−γ−ＡＴＰまたは３２Ｐ−α−ＡＴＰ）および発色性基質［例えば、ファストレッド、ＢＣＩＰ／ＩＮＴ、ＡＢＣＡＭ（ケンブリッジ、マサチューセッツ）から入手可能である］が可能である。直接的な標識化を、標識分子を（例えば、固相合成を使用して）ポリヌクレオチドに共有結合によりコンジュゲート化することによって、または、（例えば、インビトロ転写反応またはランダムプライム化標識化を使用する）重合を介した取り込みによって達成することができる。間接的な標識化を、標識されていないタグ分子（例えば、ジゴキシゲニンまたはビオチン）をポリヌクレオチドに共有結合的にコンジュゲート化し、または取り込み、続いて、このポリヌクレオチドを、その標識されていないタグを特異的に認識することができる標識された分子（抗ジゴキシゲニン抗体またはストレプトアビジン）に供することによって達成することができる。
上記のポリヌクレオチドは様々なＲＮＡ検出方法において用いることができ、例えば、ノーザンブロット分析、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）［例えば、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、例えば、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ（商標）（Ｒｏｃｈｅ）を使用］、ＲＮＡインサイチューハイブリダイゼーション（ＲＮＡ−ＩＳＨ）、インサイチューＲＴ−ＰＣＲ染色［例えば、Ｎｕｏｖｏ ＧＪ他、１９９３、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｃＤＮＡ、Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ Ｐａｔｈｏｌ、１７：６８３〜９０、および、Ｋｏｍｍｉｎｏｔｈ Ｐ他、１９９４、Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｒｃｈｉｖａｌ ｌｉｖｅｒ ｂｉｏｐｓｉｅｓ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ−ＰＣＲ） ａｎｄ ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＴ−ＰＣＲ、Ｐａｔｈｏｌ Ｒｅｓ Ｐｒａｃｔ．、１９０：１０１７〜２５に記載］、および、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析［例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ（Ａｆｆｔｍｅｔｒｉｘ（登録商標）、サンタクララ、カリフォルニア）を使用］などにおいて用いることができる。
標的遺伝子（例えば、Ｓｌｃ６ａ４、Ｈｔｒ１ａ、ＭａｏＡ、Ａｄｒｂ１、Ａｄｒｂ２、ＣＲＨ１型受容体、ＣＢ１、ＦＫＢＰ５、Ｔｐｈ２、Ｇｒｍ１、Ｇｒｉｋ３、Ｇｒｍ５、Ｇｒｉｋ２、Ｇｒｍ７、Ｇｒｉａ２、Ｄｓｃａｍ、Ｌ１ｃａｍ、Ｔｓｎａｘ、Ｓｇｋ１および／またはＳｔｘ１ａ）アミノ酸配列（例えば、タンパク質）の存在および／またはレベルを、例えば、免疫複合体［すなわち、生物学的試料に存在する標的遺伝子抗原（アミノ酸配列）と、特異的抗体との間で形成される複合体］の形成を介して、特異的抗体を使用して求めることができる。
本発明の免疫複合体は、使用される方法および生物学的試料に依存して変化する場合がある様々な温度、塩濃度およびｐＨ値において形成させることができ、当業者は、それぞれの免疫複合体の形成のために好適な条件を調節することができる。
本明細書で使用される用語「抗体」は、完全な抗体分子、並びにその機能的なフラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ、又は単一ドメイン分子、例えば抗原のエピトープに対するＶＨ及びＶＬを含む。これらの機能的な抗体フラグメントは次のように定義される：（１）Ｆａｂは、抗体分子の一価の抗原結合性フラグメントを含有するフラグメントであり、完全な抗体を酵素パパインで消化して、無傷の軽鎖と、一方の重鎖の一部とを生じさせることによって作製することができる；（２）Ｆａｂ’は、完全な抗体をペプシンで処理し、その後、還元して、無傷の軽鎖と、重鎖の一部とを生じさせることによって得ることができる抗体分子のフラグメントである；２つのＦａｂ’フラグメントが１つの抗体分子あたり得られる；（３）（Ｆａｂ’）２は、その後の還元を行うことなく、完全な抗体を酵素ペプシンで処理することによって得ることができる抗体のフラグメントである；Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって一緒にされた２つのＦａｂ’フラグメントのダイマーである；（４）Ｆｖは、２つの鎖として発現された軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作されたフラグメントとして定義される；（５）単鎖抗体（「ＳＣＡ」）は、遺伝子的に融合された単一鎖分子として好適なポリペプチドリンカーによって連結されて、軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された分子である；そして（６）単一ドメイン抗体は、抗原に対して十分な親和性を示す単一のＶＨ又はＶＬドメインからなる。
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びそのフラグメントの生成方法は、この技術分野では広く知られている（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８を参照のこと。これは参照により本明細書に組み込まれる）。
本発明による抗体フラグメントは、抗体のタンパク質分解的加水分解によって調製することができ、あるいは、フラグメントをコードするＤＮＡの大腸菌又は哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養又は他のタンパク質発現システム）における発現によって調製することができる。抗体フラグメントは、従来の方法による完全な抗体のペプシン消化又はパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体フラグメントを、抗体をペプシンで酵素切断して、Ｆ（ａｂ’）２として示される５Ｓフラグメントを得ることによって製造することができる。このフラグメントは、３．５ＳのＦａｂ’一価フラグメントを製造するために、チオール還元剤、及び場合により、ジスルフィド連結の切断から生じるスルフヒドリル基に対する保護基を使用してさらに切断することができる。あるいは、ペプシンを使用する酵素切断により、２つの一価Ｆａｂ’フラグメント及びＦｃフラグメントが直接的に得られる。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許第４０３６９４５号及び同第４３３１６４７号、並びにそれらに含まれる参考文献に記載されている（それらの特許は本明細書によりその全体が参照により組み込まれる）。また、Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、７３：１１９〜１２６、１９５９も参照のこと。抗体を切断する他の方法、例えば、一価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成させるための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、又は他の酵素的、化学的もしくは遺伝学的な技術などもまた、フラグメントが、無傷の抗体によって認識される抗原に結合する限り、使用することができる。
ＦｖフラグメントはＶＨ鎖及びＶＬ鎖の会合を含む。この会合は、Ｉｎｂａｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６９：２６５９〜６２、１９７２に記載されているように非共有結合性であり得る。あるいは、可変鎖を、分子間ジスルフィド結合によって連結することができ、又は、グルタルアルデヒドなどの化学剤によって架橋することができる。好ましくは、Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーによってつながれたＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含む。これらの単鎖抗原結合タンパク質（ｓcＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによりつながれたＶＨドメイン及びＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。この構造遺伝子は発現ベクターに導入され、続いて、発現ベクターは大腸菌などの宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞により、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単一ポリペプチド鎖が合成される。ｓcＦｖを製造するための様々な方法が、例えば、Ｗｈｉｔｌｏｗ及びＦｉｌｐｕｌａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：９７〜１０５、１９９１；Ｂｉｒｄ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６、１９８８；Ｐａｃｋ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：１２７１〜７７、１９９３；Ｌａｄｎｅｒ他、米国特許第４９４６７７８号（これは本明細書によりその全体が参照により組み込まれる）によって記載されている。
抗体フラグメントの別の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識ユニット」）は、目的とする抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成するためにポリメラーゼ連鎖反応を使用することによって調製される。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ及びＦｒｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：１０６〜１０、１９９１を参照のこと。
抗体はまた、ファージディスプレーライブラリー［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１（１９９１）］を含む、この分野で知られている様々な技術を使用して製造することができる。Ｃｏｌｅ他及びＢｏｅｒｎｅｒ他の技術もまた、ヒトモノクローナル抗体を調製するために利用することができる［Ｃｏｌｅ他、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６〜９５（１９９１）］。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されている遺伝子組換え動物（例えば、マウス）に導入することによって作製することができる。抗原投与したとき、ヒト抗体の産生が認められ、この場合、その産生は、遺伝子再配置、組み立て及び抗体レパートリーを含むすべての点に関してヒトにおいて見られる産生と非常に似ている。この方法は、例えば、米国特許第５５４５８０７号、同第５５４５８０６号、同第５５６９８２５号、同第５６２５１２６号、同第５６３３４２５号、同第５６６１０１６号、及び下記の科学的刊行物：Ｍａｒｋｓ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０、７７９〜７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ他、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８５６〜８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８１２〜１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８４５〜５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８２６（１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３：６５〜９３（１９９５）に記載されている。
本発明に従って使用され得る例示的な抗体には、例えば、下記の抗体が含まれる：例えば、Ａｂｎｏｖａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＡｂｇｅｎｔおよびＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから入手可能な抗Ｓｌｃ６ａ４抗体；例えば、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＧｍｂＨおよびＡｂｎｏｖａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能な抗Ｈｔｒ１ａ抗体；例えば、Ａｂｎｏｖａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．およびＡｂｇｅｎｔから入手可能な抗ＭａｏＡ抗体；例えば、Ｂｉｏｒｂｙｔ、Ａｂｇｅｎｔ、および、ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ｏｎｌｉｎｅから入手可能な抗Ａｄｒｂ１抗体；例えば、Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ａｂｎｏｖａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ｏｎｌｉｎｅから入手可能な抗Ａｄｒｂ２抗体；例えば、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ、ＡｂｃａｍおよびＮｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから入手可能な抗ＣＲＨ１型受容体抗体；例えば、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．およびＥｐｉｔｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．から入手可能な抗ＣＢ１抗体；例えば、ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓおよびＡｂｎｏｖａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能な抗ＦＫＢＰ５抗体；例えば、Ｎｏｖｕｓ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓおよびＡｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＧｍｂＨから入手可能な抗Ｔｐｈ２抗体；例えば、Ｎｏｖｕｓ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓおよびＢｉｏｒｂｙｔから入手可能な抗Ｇｒｍ１抗体；例えば、Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＧｍｂＨおよびＡｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓから入手可能な抗Ｇｒｉｋ３抗体；例えば、ＢｉｏｒｂｙｔおよびＡｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＧｍｂＨから入手可能な抗Ｇｒｍ５抗体；例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．、Ａｖｉｖａ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＢｉｏｌｏｇｙおよびＡｂｇｅｎｔから入手可能な抗Ｇｒｉｋ２抗体；例えば、Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＧｍｂＨおよびａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ｏｎｌｉｎｅから入手可能な抗Ｇｒｍ７抗体；例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．およびＡｂｎｏｖａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能な抗Ｇｒｉａ２抗体；例えば、Ｎｏｖｕｓ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓおよびＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能な抗Ｄｓｃａｍ抗体；例えば、ＧｅｎｅＴｅｘ、Ｎｏｖｕｓ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓおよびＡｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＧｍｂＨから入手可能な抗Ｌ１ｃａｍ抗体；例えば、ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓおよびＧｅｎＷａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能な抗Ｔｓｎａｘ抗体；例えば、Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．およびＡｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＧｍｂＨから入手可能な抗Ｓｇｋ１抗体；ならびに／または、例えば、ＭＢＬ ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌおよびＳｐｒｉｎｇ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能な抗Ｓｔｘ１ａ抗体。
様々な方法を、本発明の免疫複合体の形成を検出するために使用することができ、当業者は、どの方法が、それぞれの免疫複合体のために、および／または、診断のために使用される細胞の型のために好適であるかを決定することができる。
本発明の免疫複合体において使用される特異的抗体（例えば、抗Ｓｌｃ６ａ４抗体；抗Ｈｔｒ１ａ抗体；抗ＭａｏＡ抗体；抗Ａｄｒｂ１抗体；抗Ａｄｒｂ２抗体；抗ＣＲＨ１型受容体抗体；抗ＣＢ１抗体；抗ＦＫＢＰ５抗体；抗Ｔｐｈ２抗体；抗Ｇｒｍ１抗体；抗Ｇｒｉｋ３抗体；抗Ｇｒｍ５抗体；抗Ｇｒｉｋ２抗体；抗Ｇｒｍ７抗体；抗Ｇｒｉａ２抗体；抗Ｄｓｃａｍ抗体；抗Ｌ１ｃａｍ抗体；抗Ｔｓｎａｘ抗体；抗Ｓｇｋ１抗体および／または抗Ｓｔｘ１ａ抗体）は、当技術分野で知られている方法を使用して標識することができる。標識された抗体は、一次抗体（すなわち、特定の抗原、例えば、標的遺伝子特異的抗原に結合する抗体）、または、一次抗体に結合する二次抗体（例えば、標識されたヤギ抗ウサギ抗体、標識されたマウス抗ヒト抗体）のどちらも可能であるものとする。抗体は標識に直接にコンジュゲート化することができ、または、酵素にコンジュゲート化することができる。
本発明の抗体は、（抗体にコンジュゲート化された蛍光性色素を使用して）蛍光標識することができ、または、（例えば、放射能標識された例えば、１２５Ｉ抗体を使用して）放射能標識することができ、または、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）にコンジュゲート化することができ、比色反応を生じさせるための発色性基質と一緒に使用することができる。本発明の酵素コンジュゲート化抗体によって利用される発色性基質には、ＡＥＣ、ファストレッド、ＥＬＦ−９７基質［２−（５’−クロロ−２−ホスホリルオキシフェニル）−６−クロロ−４（３Ｈ）−キナゾリノン］、ｐ−ニトロフェニルホスファート（ＰＮＰＰ）、フェノールフタレインジホスファート、およびＥＬＦ３９−ホスファート、ＢＣＩＰ／ＩＮＴ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｒｅｄ（ＶＲ）、アルカリホスファターゼ酵素のためのサーモン・マゼンダホスファート（Ａｖｉｖｉ Ｃ．他、１９９４、Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、１９９４、４２：５５１〜４）、および、Ｎｏｖａ Ｒｅｄ、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、Ｖｅｃｔｏｒ（Ｒ）ＳＧ基質、ペルオキシダーゼ酵素のためのルミノール型化学発光基質が含まれるが、これらに限定されない。これらの酵素基質は、Ｓｉｇｍａ（セントルイス、ミズーリ、米国）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．（ユージーン、オレゴン、米国）、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（バーリンゲーム、カリフォルニア、米国）、Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（サンフランシスコ、カリフォルニア、米国）、Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ（デンマーク）から市販されている。
可溶性の（例えば、分泌された、排出された）標的遺伝子ポリペプチドを含有するかもしない生物学的試料（例えば、血液試料または血清など）における免疫複合体の検出を、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット分析および放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）分析、免疫沈殿（ＩＰ）を使用して行うことができ、または、分子量に基づく取り組みによって行うことができる。
ウエスタンブロットのために、タンパク質が細胞試料から抽出され、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）および膜（例えば、ナイロンまたはＰＶＤＦ）へのブロッティングに供される。その後、膜は、直接に標識され得るか、または、二次標識抗体にさらに供され得る特異的抗体（例えば、抗Ｓｌｃ６ａ４抗体；抗Ｈｔｒ１ａ抗体；抗ＭａｏＡ抗体；抗Ａｄｒｂ１抗体；抗Ａｄｒｂ２抗体；抗ＣＲＨ１型受容体抗体；抗ＣＢ１抗体；抗ＦＫＢＰ５抗体；抗Ｔｐｈ２抗体；抗Ｇｒｍ１抗体；抗Ｇｒｉｋ３抗体；抗Ｇｒｍ５抗体；抗Ｇｒｉｋ２抗体；抗Ｇｒｍ７抗体；抗Ｇｒｉａ２抗体；抗Ｄｓｃａｍ抗体；抗Ｌ１ｃａｍ抗体；抗Ｔｓｎａｘ抗体；抗Ｓｇｋ１抗体および／または抗Ｓｔｘ１ａ抗体）と相互作用させられる。検出が、オートラジオグラフィー、比色反応または化学発光によって行われる場合がある。この方法は、基質の量の定量化と、電気泳動期間中のアクリルアミドゲルにおける移動距離を示す膜上の相対的位置によるその同一性の決定との両方を可能にする。
生物学的試料における抗原の濃度が低い場合、抗原（標的遺伝子アミノ酸配列）の検出を免疫沈殿（ＩＰ）によって行うことができる。免疫沈殿分析のために、特異的抗体（例えば、抗Ｓｌｃ６ａ４抗体；抗Ｈｔｒ１ａ抗体；抗ＭａｏＡ抗体；抗Ａｄｒｂ１抗体；抗Ａｄｒｂ２抗体；抗ＣＲＨ１型受容体抗体；抗ＣＢ１抗体；抗ＦＫＢＰ５抗体；抗Ｔｐｈ２抗体；抗Ｇｒｍ１抗体；抗Ｇｒｉｋ３抗体；抗Ｇｒｍ５抗体；抗Ｇｒｉｋ２抗体；抗Ｇｒｍ７抗体；抗Ｇｒｉａ２抗体；抗Ｄｓｃａｍ抗体；抗Ｌ１ｃａｍ抗体；抗Ｔｓｎａｘ抗体；抗Ｓｇｋ１抗体および／または抗Ｓｔｘ１ａ抗体）が、標的遺伝子ポリペプチドを含む試料（例えば、細胞溶解物）と直接に相互作用する場合があり、形成された複合体をさらに、ビーズにコンジュゲート化された二次抗体を使用して検出することができる（例えば、特異的抗体がマウスモノクローナル抗体であるならば、二次抗体は、例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズにコンジュゲート化された抗マウス抗体であり得る）。ビーズはその後、遠心分離によって沈殿させることができ、その後、沈殿したタンパク質（例えば、標的遺伝子ポリペプチドおよび特異的抗体）を、（例えば、９５℃での変性を使用して）ビーズから引き離し、さらに、抗体を使用するウエスタンブロット分析に供することができる。別法として、特異的抗体およびビーズコンジュゲート化二次抗体が、抗原（標的遺伝子ポリペプチド）を含有する生物学的試料に加えられ、それにより、免疫複合体を形成させる場合がある。別法として、標的遺伝子ポリペプチドが高グリコシル化タンパク質であるならば、標的遺伝子ポリペプチドはまた、ビーズに同様にコンジュゲート化され得るグリコシル化ポリペプチドと結合することができる基質（例えば、コンカバリンＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ウプサラ、スウェーデン）など）を使用して沈殿させることができ、その後、上記で記載されるような特異的抗体を使用するウエスタンブロット分析を行うことができる。
ＦＡＣＳ分析は、細胞膜上に存在する抗原の検出を可能にする。簡単に記載すると、上記のような特異的抗体が蛍光団に連結され、検出が、細胞が光ビームを通過する際にそれぞれの細胞から放射される光の波長を読み取る細胞分取装置によって行われる。この方法では、２つ以上の抗体が同時に用いられる場合がある。
標的遺伝子ポリペプチドの存在および／またはレベルはまた、ＥＬＩＳＡを使用して求めることができる。簡単に記載すると、標的遺伝子抗原を含有する試料が表面（例えば、マイクロタイタープレートのウエルなど）に固定される。酵素にカップリングされた抗原特異的抗体（例えば、抗Ｓｌｃ６ａ４抗体；抗Ｈｔｒ１ａ抗体；抗ＭａｏＡ抗体；抗Ａｄｒｂ１抗体；抗Ａｄｒｂ２抗体；抗ＣＲＨ１型受容体抗体；抗ＣＢ１抗体；抗ＦＫＢＰ５抗体；抗Ｔｐｈ２抗体；抗Ｇｒｍ１抗体；抗Ｇｒｉｋ３抗体；抗Ｇｒｍ５抗体；抗Ｇｒｉｋ２抗体；抗Ｇｒｍ７抗体；抗Ｇｒｉａ２抗体；抗Ｄｓｃａｍ抗体；抗Ｌ１ｃａｍ抗体；抗Ｔｓｎａｘ抗体；抗Ｓｇｋ１抗体および／または抗Ｓｔｘ１ａ抗体）が適用され、抗原に結合させられる。抗体の存在がその後、抗体にカップリングされた酵素を用いる比色反応によって検出され、定量される。この方法において一般に用いられる酵素には、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが含まれる。十分に校正され、かつ、応答の直線範囲の範囲内であるならば、試料に存在する基質の量が、生じる色の量に比例している。基質標準物が一般に、定量精度を改善するために用いられる。
標的遺伝子ポリペプチドの存在および／またはレベルはまた、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）を使用して求めることができる。１つの形式において、この方法は、所望の抗原（標的遺伝子ポリペプチド）を、特異的抗体と、沈殿可能な担体（例えば、アガロースビーズなど）に固定化されている放射能標識された抗体結合タンパク質（例えば、Ｉ１２５により標識されたプロテインＡ）とにより沈殿させることを伴う。沈殿したペレットにおけるカウント数が抗原の量に比例している。
ＲＩＡの代替形式において、標識された抗原と、標識されていない抗体結合タンパク質とが用いられる。未知量の抗原を含有する試料が様々な量で加えられる。標識された抗原から得られる沈殿したカウント数の減少が添加試料における抗原の量に比例している。
標的遺伝子ポリペプチドの存在および／またはレベルはまた、分子量に基づく取り組みを使用して求めることができる。免疫複合体は、その成分よりも大きい分子量を示すので、分子量におけるそのような変化を検出することができる方法もまた用いることができる。例えば、免疫複合体をゲル遅延アッセイによって検出することができる。簡単に記載すると、非変性アクリルアミドゲルに、試料が負荷される。その成分と比較した場合のタンパク質産物のサイズ（分子量）における変化により、免疫複合体の存在が示される。高分子量側へのそのような変化を、非特異的タンパク質染色（例えば、銀染色またはＣｏｍｍａｓｓｉｅブルー染色）を使用して見ることができる。
生物学的試料（例えば、組織切片（例えば、パラフィン包埋物または凍結切片）など）における標的遺伝子ポリペプチドのインサイチュー検出を、細胞上の抗体の結合をその位置で検出する免疫学的染色方法を使用して行うことができる。免疫学的染色手順の例には、蛍光標識された免疫組織化学（抗体にコンジュゲート化された蛍光色素を使用する）、放射能標識された免疫組織化学（放射能標識された（例えば、１２５Ｉ）抗体を使用する）、および、免疫細胞化学［酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）と、比色反応を生じさせるための発色性基質とを使用する］が含まれるが、これらに限定されない。抗体にコンジュゲート化された酵素は、本明細書中上記で記載されるような様々な発色性基質を利用できるものとする。
好ましくは、本発明によって使用される免疫学的染色は免疫組織化学および／または免疫細胞化学である。
免疫学的染色の後には好ましくは、細胞の対比染色が、染色されなかった細胞区画に結合する色素を使用して行われる。例えば、標識された抗体が、細胞の細胞質に存在する抗原に結合するならば、核染色（例えば、ヘマトキシリン−エオシン染色）が適切な対比染色である。
１つの実施形態によれば、上記方法は、上記ｍｉＲ−１８１および／または上記ｍｉＲ−２７をダウンレギュレーションした後に上記Ｔｐｈ２遺伝子の発現を測定することを含む。
１つの実施形態によれば、上記方法は、上記ｍｉＲ−１３５および／または上記ｍｉＲ−３３５をアップレギュレーションした後に上記Ｓｌｃ６ａ４遺伝子の発現を測定することを含む。
１つの実施形態によれば、上記方法は、上記ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−１８２および／または上記ｍｉＲ−２６をアップレギュレーションした後に上記Ｈｔｒｌａ遺伝子の発現を測定することを含む。
１つの実施形態によれば、上記方法は、上記ｍｉＲ−２７をアップレギュレーションした後に上記ＭａｏＡ遺伝子の発現を測定することを含む。
１つの実施形態によれば、上記方法は、上記ｍｉＲ−１９をアップレギュレーションした後に上記Ａｄｒｂ１遺伝子の発現を測定することを含む。
１つの実施形態によれば、上記方法は、上記ｍｉＲ−１９をアップレギュレーションした後に上記ＣＢ１遺伝子の発現を測定することを含む。
１つの実施形態によれば、上記方法は、上記ｍｉＲ−１５をアップレギュレーションした後に上記ＣＲＨ１型受容体遺伝子の発現を測定することを含む。
１つの実施形態によれば、上記方法は、上記ｍｉＲ−１５をアップレギュレーションした後に上記ＦＫＢＰ５遺伝子の発現を測定することを含む。
本発明者らはさらに、ｍｉＲ１３５が、（上記で記載される）セロトニン関連の医学的状態を有する対象においてアップレギュレーションされることを実現している。
従って、本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、セロトニン関連の医学的状態を診断の必要性のある対象において診断する方法であって、ｍｉＲ−１３５の発現レベルを上記対象の血液において測定することを含み、健康な対象の血液試料の場合上記と比較して上記ｍｉＲ−１３５の高い発現レベルが、上記セロトニン関連の医学的状態を示すものである、方法が提供される。
ｍｉＲを血液試料において分析する様々な方法が当技術分野では広く知られており、本明細書中下記において記載される。
診断はさらに、Ｇｏｌｄ標準法を使用して評価し、確立することができる。典型的には、患者の全病歴、理学的検査、および、症状の徹底的評価のうちの少なくとも１つが、うつ病の原因を決定することに役立つ。標準化された質問表が有益であり得る（例えば、ハミルトンうつ病評価尺度およびベック抑うつ質問表など）。
本発明者らはさらに、ｍｉＲ−１３５ａの血漿中レベルが、抗うつ剤（例えば、フルオキセチン（ＳＳＲＩ部類の抗うつ剤）など）により処置される対象において低下し、一方、脳のｍｉＲ−１３５ａレベルがこれらの同じ対象において増大することを示している（図３Ｅ〜図３Ｊ参照）。
したがって、本発明の別の実施形態によれば、抗うつ剤の処置をモニターする方法であって、（ａ）処置の必要性のある対象を抗うつ剤により処置すること、および（ｂ）上記対象の血液におけるｍｉＲ−１３５の発現レベルを上記処置の前後で測定することを含み、上記抗うつ剤による上記処置の前における上記ｍｉＲ−１３５の発現レベルと比較して、上記抗うつ剤による上記処置の後における上記ｍｉＲ−１３５のより低い発現レベルにより、処置が効率的であることが示される、方法が提供される。
本明細書中で使用される場合、用語「抗うつ剤」は、気分障害（例えば、大うつ病および気分変調など）および不安障害（例えば、社会不安障害など）を緩和するために使用される薬物を示す。例示的な抗うつ剤には、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ、例えば、シタロプラム、エスシタロプラム、フルオキセチン、フルボキサミン、パロキセチンおよびセルトラリンなど）、セロトニン−ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ、例えば、デスベンラファキシン、デュロキセチン、ミルナシプランおよびベンラファキシンなど）、ノルアドレナリン作動性かつ特異的なセロトニン作動性抗うつ剤（例えば、ミアンセリンおよびミルタザピンなど）、ノルエピネフリン（ノルアドレナリン）再取り込み阻害剤（ＮＲＩ、例えば、アトモキセチン、マジンドール、レボキセチンおよびビロキサジンなど）、ノルエピネフリン−ドパミン再取り込み阻害剤（例えば、ブプロピオンなど）、選択的セロトニン再取り込み強化剤（例えば、チアネプチンなど）、ノルエピネフリン−ドパミン脱抑制剤（ＮＤＤＩ、例えば、アゴメラチンなど）、三環系抗うつ剤（第三級アミン三環系抗うつ剤および第二級アミン三環系抗うつ剤を含む）、および、モノアミンオキシダーゼ阻害剤（ＭＡＯＩ）が含まれるが、これらに限定されない。
１つの具体的な実施形態によれば、抗うつ剤は選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）またはノルアドレナリン再取り込み阻害剤（ＮＲＩ）を含む。
ｍｉＲ−１３５の発現レベルを測定することが典型的には、対象から得られる血液試料において達成される。
本明細書中で使用される場合、用語「血液試料」は、新鮮な全血、分画化された全血、および、血漿を示す。血液試料は典型的には、抗うつ剤による処置の後の対象から得られ、しかしながら、血液試料はまた、ｍｉＲ−１３５レベルのさらなる比較のために処置前の対象から得られる場合がある。
効率的な抗うつ処置が、ｍｉＲ−１３５のより低い発現レベルが、処置前のｍｉＲ−１３５の発現レベルと比較して処置後に得られるときに明らかにされる。
別の実施形態によれば、精神医学的状態をその必要性のある対象においてモニターする方法であって、ｍｉＲ−１３５の発現レベルを上記対象の血液において測定することを含み、健康な対象と比較して上記ｍｉＲ−１３５の高い発現レベルにより、上記精神医学的状態が示される、方法が提供される。
別の実施形態によれば、精神医学的状態は、うつ病、不安、ストレス、疲労、損なわれた認知機能、パニック発作、脅迫行動、嗜癖、社会恐怖、睡眠障害および食品関連障害を含む。
１つの具体的な実施形態によれば、ｍｉＲ−１３５はｍｉＲ−１３５ａを含む。
ｍｉＲ−１３５の発現レベルを測定することが、当業者に知られているいずれかの方法によって、例えば、ノーザン分析、ＲＮａｓｅ保護アッセイおよびＰＣＲ（例えば、リアルタイムＰＣＲ）によって行われる場合がある。
処置をモニターすることはまた、患者の幸せを評価することによって、また、加えて、あるいは、代替として、対象を、行動試験、ＭＲＩ、または、当業者に知られているいずれかの他の方法に供することによって達成される場合がある。
本出願から成熟する特許の存続期間の期間中には、多くの関連するｍｉＲＮＡの阻害剤または代替的にｍｉＲＮＡの改変が開発されることが予想され、ミクロＲＮＡの用語の範囲は、すべてのそのような新しい技術を先験的に包含することが意図される。
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、「含み、それらに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｎｄ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。
表現「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、さらなる成分、工程および／または部分が、主張される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
実施例１
セロトニンニューロンにおけるｍｉＲの示差的発現
材料および実験手順
５ＨＴニューロンのミクロＲＮＡマイクロアレイ
ｅＰＥＴ ＹＦＰマウスの１２日目の胎児から得られる後脳細胞を培養し、選別して、５ＨＴニューロンを周りの非５ＨＴニューロンから区別した。ｍｉＲＮＡ集団を含む総ＲＮＡを製造者の説明書に従って精製し、標識し、Ｓａｎｇｅｒ ｍｉＲＢａｓｅ（リリース１２．０）に基づくＡｇｉｌｅｎｔマウスｍｉＲＮＡマイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈ、ミシサガ、オンタリオ、カナダ）設計番号０２１８２８に対してハイブリダイゼーションした。マイクロアレイを走査し、データを、Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して取り出し、処理した。走査後、ＧｅｎｅＶｉｅｗ．ｔｘｔファイルの強度出力データを分析して、ミクロＲＮＡの差のある相対的発現を、Ｐａｒｔｅｋ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｓｕｉｔｅ（Ｐａｒｔｅｋ Ｉｎｃ．、セントルイス、ミズーリ）を使用して定量化した。データをｌｏｇ２変換し、分位正規化し、ＧｅｎｅＶｉｅｗファイルにおけるフラグ“ｇＩｓＧｅｎｅＤｅｔｅｃｔｅｄ”に従って選別した。６６６個のマウスｍｉＲのうち、１９８個が、この選別工程を行ったとき、さらなる分析のために残った。その後、示差的に発現したｍｉＲを、１．５倍の変化の閾値をＡＮＯＶＡに従って有意性により使用することによって同定した。コントラストをＡＮＯＶ検定の範囲内で計算した。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ／Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正を偽陽性削減のために使用した（多重検定補正）。
Ｐｓｉｃｈｅｃｋ２ルシフェラーゼ発現プラスミドへの３’ＵＴＲのクローン化
Ｓｌｃ６ａ４、Ｈｔｒ１ａ、ＭａｏＡおよびＴｐｈ２の３’ＵＴＲ配列をマウスのゲノムＤＮＡまたは全脳ｃＤＮＡからＰＣＲ増幅した。３’ＵＴＲのＰＣＲフラグメントを製造者の指針に従ってｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結し、さらに、Ｐｓｉｃｈｅｃｋ２レポータープラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）におけるルシフェラーゼの３’末端での単一ＮｏｔＩ部位にサブクローン化した。変異させた３’ＵＴＲ配列（これはｍｉＲ−１３５シード配列を欠いている）を、シード一致配列全体にわたるプライマー突出とともに合成した。クローン化配向を診断的切断および配列決定によって確認した。
トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を７０％〜８５％の集密度にまで４８ウエル形式でポリ−Ｌ−リシン上で成長させ、下記のプラスミドとともにポリエチレンイミンを使用してトランスフェクションした：５ｎｇのＰｓｉｃｈｅｃｋ２−３’ＵＴＲプラスミドおよび特定のｍｉＲＮＡのための、２１５ｎｇの過剰発現ベクター、または空のｍｉＲ−ｖｅｃ過剰発現プラスミド。トランスフェクションの２４時間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼレポーター活性を以前の記載のようにアッセイした［Ｃｈｅｎ Ａ．他、Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（２００５）１９：４４１〜５８］。ウミシイタケルシフェラーゼの値を、（同じベクターから転写されるが、試験されている３’ＵＴＲによって影響されない）対照のホタルルシフェラーゼのレベルに対して正規化し、１条件あたり６回のウエル反復にわたって平均化した。
動物および収容
成体のＣ５７ＢＬ／６Ｊオスマウス（１０週齢）（ハーラン、エルサレム、イスラエル）を逆の１２時間明暗周期で温度制御部屋（２２±１℃）に収容した。食物および水を自由に摂取させた。すべての実験プロトコルがＷｅｉｚｍａｎ科学研究所の施設内動物管理使用委員会によって承認された。
急性不動化ストレスパラダイム
成体マウスをそれらの暗期周期中に５０ｍｌの通気されたチューブに３０分間入れた。
長期社会的敗北
マウスを、以前に記載されたような社会的敗北プロトコルに供した［Ｋｒｉｓｈｎａｎ Ｖ．他、Ｃｅｌｌ（２００７）１３１：３９１〜４０４］。簡単に記載すると、マウスを攻撃的ＩＣＲマウスのホームケージに入れ、これらのマウスは５分間にわたって物理的に触れ合った。この期間中に、ＩＣＲマウスは侵入者マウスを攻撃し、侵入者は従属的態度を示した。その後、穴の開いた透明なプレキシガラス仕切り板を動物の間に置き、マウスを、感覚的接触を許すために２４時間にわたって同じケージに留めた。その後、この手順を、その後の１０日のそれぞれについて、見慣れないＩＣＲマウスを用いて繰り返した。
抗うつ処置
マウスは、三環系のイミプラミンまたはＳＳＲＩのフルオキセチンまたはＮＲＩのレボキセチン（生理的食塩水において２０ｍｇ／ｋｇ）または生理的食塩水のｉ．ｐ．注射を受けた。長期注射を１８日間〜２１日間連続して行い、急性注射を脳の顕微解剖の２４時間前に行った。
縫線核の顕微解剖および血漿収集
脳試料を、脳を取り出し、アクリル脳マトリックス（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）に置いた後で、マウスの縫線核（ＲＮ）から採取した。スライス片を、指定の解剖学的マーカーに基づいて、標準的なカミソリ刃（ＧＥＭ）を使用して採取した。先を鈍くした１４Ｇ注射器を使用して、ＲＮ領域を、マトリックスから取り出された３ｍｍのスライス片から抜き取った。加えて、体幹の血液を、凝固を避けるためにＥＤＴＡ含有チューブに集めた。遠心分離を３５００ｇで４℃において３０分間行った後、血漿を分離し、ＲＮＡ精製まで−７０℃で保った。
ミクロＲＮＡの精製および定量的ＲＴ−ＰＣＲ発現分析
ｍＲＮＡ（ミクロＲＮＡを含む）を、ｍｉＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用して、選別されたニューロン、凍結された脳打ち抜き物および血漿から単離し、ｍｉＳｃｒｉｐｔ逆転写キットｍｉＲＮＡを使用して処理し、ｃＤＮＡを作製した。その後、ｃＤＮＡ試料を、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の指針に従って使用して、ＡＢ７５００サーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。それぞれのｍｉＲのための特異的プライマーを市販のユニバーサルプライマーと一緒に使用し、一方、Ｕ６のｓｎＲＮＡを内部対照として使用した。
ｍｉＲ１３５ｂ過剰発現ウイルスベクターのクローン化
プレ−ｍｉＲ−１３５ｂを、制限酵素のＡｇｅＩ部位を加えるプライマーとともにマウスのゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅し、その後、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ウィスコンシン）に挿入した。ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙの配列決定、ならびに、ＡｇｅＩによるｐＧＥＭ−Ｔ ＥａｓｙおよびｐＥＧＦＰベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、マウンテンビュー、カリフォルニア）の両方の消化の後、未成熟ｍｉＲ−１３５ｂ配列をｐＥＧＦＰベクターに連結して、発現プラスミドｐＥＧＦＰ−ｍｉＲ−１３５ｂを構築した。その後で、ｐＥＧＦＰ−ｍｉＲ−１３５ｂを、ｐＣＳＣ−Ｅ／Ｓｙｎ−ｅＧＦＰプラスミドを同じ酵素で切断するのと並行してＢａｍＨＩおよびＢｓｒＧＩによって切断し、ｍｉＲ−１３５ｂ−ｅＧＦＰ配列をｐＣＳＣ−Ｅ／Ｓｙｎに連結して、ｐＣＳＣ−ｅＳＮＹ−ｐｒｅ−ｍｉＲ−１３５ｂ−ｅＧＦＰプラスミドを構築し、これを制限エンドヌクレアーゼ分析およびＤＮＡ配列決定によって確認した。
レンチウイルスベクターの作製
組換えレンチウイルスを、以前の記載のように［Ｎａｌｄｉｎｉ Ｌ他、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９６）９３：１１３８２〜８］、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における一過性トランスフェクションによって作製した。簡単に記載すると、感染性レンチウイルスをトランスフェクション後４８時間および７２時間で集め、０．４５μｍ細孔の酢酸セルロースフィルターでろ過し、超遠心分離によって濃縮した。
レンチウイルスの脳内注入
定位手術およびレンチウイルス送達部位の精密な制御を提供するために、本発明者らは、コンピューター誘導定位機器およびモーター駆動ナノインジェクター（Ａｎｇｌｅ Ｔｗｏ（商標）Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、ｍｙＮｅｕｒｏｌａｂ）を使用した。以前に記載されたように［Ｓｉｎｇｅｒ Ｏ．他、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（２００５）、８、１３４３〜９］、マウスを全身麻酔下で定位装置に置き、座標を、ＦｒａｎｋｌｉｎおよびＰａｘｉｎｏｓの図譜によって定義されるように決定した。レンチウイルス調製物を、モーター駆動のナノインジェクターシステムにつながれるＨａｍｉｌｔｏｎ注射器を使用して送達し、溶液を１分毎に０．２μｌの速度で注入した。２週間の回復期間の後、マウスを行動研究および生理学的研究に供し、その後で麻酔し、リン酸塩緩衝化４％パラホルムアルデヒドにより灌流した。固定された脳を、免疫組織化学を使用して注入部位の正確さを確認するために３０μのスライス片に連続切片化した。
免疫組織化学
免疫組織化学のために使用される手順を以前の記載のように行った［Ｃｈｅｎ Ａ他、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（２００６）２６：５５００〜１０］。ＧＦＰ免疫染色のために、本発明者らは、一次抗体としての、ウサギにおいて惹起されるビオチン化抗ＧＦＰ抗体（Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、英国）、および、二次抗体としてのストレプトアビジンコンジュゲート化Ｃｙ２［Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ、ウエスト・グローブ、ペンシルベニア、米国）を使用した。
行動評価
すべての行動評価を、試験部屋に各試験の前の２時間慣らした後で暗期の期間中に行った。
尾懸垂試験
尾懸垂試験をＴＳＥ尾懸垂モニター（ＴＳＥ Ｓｙｓｔｅｍｓ、バドホンブルグ、ドイツ）で行った。それぞれのマウスをその尾の先端によってテープ固定し、力センサーから１０分間ぶら下げた。不動で過ごした時間と、もがいて過ごした時間とを、事前設定された閾値に基づくソフトウエアによって計算し、記録した。
改変強制水泳試験
尾懸垂試験を以前の記載のように行った［Ｋｒｉｓｈｎａｎ ＶおよびＮｅｓｔｌｅｒ ＥＪ、Ｎａｔｕｒｅ（２００８）４５５：８９４〜９０２］。手短に言えば、使用された装置は、２５℃の水が１５ｃｍの深さにまで満たされたプラスチックバケツ（１８ｃｍの直径）であった。それぞれのマウスをバケツの中心に置いて、６分間のビデオ記録された試験期間を開始した。２〜６分の試験期間中において不動で過ごした時間の継続期間を、ＥｔｏＶｉｓｉｏｎ ＸＴ（Ｎｏｌｄｕｓ、ヴァーヘニンゲン、オランダ）を使用して自動的にスコア化した。
自発運動活性
歩行運動における差から生じる行動的影響の可能性について制御するために、マウスの自発運動活性を、馴化に数日先立つ４８時間の期間にわたって調べた。マウスを、特殊化されたホームケージに１匹ずつ収容し、自発運動を、ＩｎｆｒａＭｏｔシステム（ＴＳＥ Ｓｙｓｔｅｍｓ、バドハンブルグ、ドイツ）を使用して測定した。
統計学的解析
データを平均＋／−ＳＥＭとして表した。統計学的有意性について検定するために、スチューデントｔ検定を、２つの群のみが比較される場合には使用した（例えば、マイクロアレイ検証ｑＰＣＲの間など）。１元配置ＡＮＯＶＡを使用して、多数の群の間を比較した（例えば、ルシフェラーゼアッセイにおける異なる処置の間など）。２元配置ＡＮＯＶＡを、２つの独立変数の場合には使用した（例えば、ＳＳＲＩおよびＮＲＩの注入、急性および長期の両方の継続期間において）。ポストホックｔ検定を必要なときには使用して、統計学的有意性を明らかにした。群間の差は、ｐ＜０．０５であるとき、有意であると見なした。
結果
５ＨＴニューロンを、ｅＰＥＴ ＹＦＰの胚のＲＮから単離し、それらのｍｉＲ発現プロフィルを、ｍｉＲマイクロアレイを使用して、同じ核から得られる非５ＨＴニューロンと比較した（図１Ａ）。１４個のｍｉＲが、非５ＨＴニューロンと比較して５ＨＴニューロンにおいて、２倍を超えてアップレギュレーションされることが見出され、２７個が、２倍を超えてダウンレギュレーションされることが見出された（表２Ａ〜表２Ｂ（下記）参照）。アレイ結果の代表的な検証を、５ＨＴニューロンにおいてアップレギュレーションされるｍｉＲ（例えば、ｍｉＲ−３７５（Ｐ＝０．００７１；図１Ｂ）など）について、また、ダウンレギュレーションされるｍｉＲ（例えば、ｍｉＲ−１３５ａ（Ｐ＝０．００７５；図１Ｃ）など）についてリアルタイムＰＣＲを使用して行った。５ＨＴニューロンの調節因子としてのｍｉＲの役割をさらに研究するために、広範囲の生物情報学的分析を仮説に基づいた様式で行った。精神病理に伴うことがこれまでに明らかにされた既知セロトニン関連遺伝子の標的化予測をマイクロアレイ結果と組み合わせた。ＲＮにおける５ＨＴニューロンにおいて発現される下記の４つのタンパク質コード標的遺伝子を試験のために選定した：セロトニン輸送体（これは５ＨＴ再取り込に関わっている）（これはまた、ＳＥＲＴまたはＳｌｃ６ａ４として知られている）、セロトニン阻害受容体１ａ（これはまた、Ｈｔｒ１ａとして知られている）、トリプトファンヒドロキシラーゼ２（Ｔｐｈ２）（これは脳における５ＨＴ合成の律速酵素である）、および、モノアミンヒドロキシラーゼ（ＭａｏＡ）（これは５ＨＴを不活性化する）。これらの遺伝子についてのミクロＲＮＡ標的化予測を、Ｔａｒｇｅｔ Ｓｃａｎ［ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ（ｄｏｔ）ｏｒｇ］およびＭｉｒａｎｄａ［ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｍｉｃｒｏｒｎａ（ｄｏｔ）ｏｒｇ］の２つの異なるウエブ型アルゴリズムを使用して行い、非５ＨＴ細胞と比較して、５ＨＴニューロンのｍｉＲアレイにおいて少なくとも±１．５の差で変化している９１個のｍｉＲのリストと組み合せた。ｍｉＲアレイデータおよび生物情報学的分析に基づいて、８個のｍｉＲをさらなるインビトロ研究のために選定した（図１Ｄ〜図１Ｇ）。
インビトロルシフェラーゼアッセイを、試験された５ＨＴ関連遺伝子の３’ＵＴＲと、それを標的とすることが推定により予測されるｍｉＲとの間におけるｍｉＲ−標的相互作用を調べるために行った。本発明者らは、Ｔｐｈ２の３’ＵＴＲがｍｉＲ−２７ｂ（Ｐ＝０．００５１）およびｍｉＲ−１８１Ｃ（Ｐ＝０．０３０５、図１Ｈ）によって少し（およそ２０％）抑制され、かつ、ＭａｏＡの３’ＵＴＲもまた、ｍｉＲ−２７ｂ（Ｐ＝０．０００８、図１Ｉ）によって抑制されることを見出した。ｍｉＲ−１３５がＳｌｃ６ａ４の３’ＵＴＲを標的とすること（図２Ａおよび図２Ｃ）およびＨｔｒ１ａの３’ＵＴＲを標的とすること（図２Ｂおよび図２Ｄ）により、これらの転写物の翻訳の強固な抑制が生じた。ｍｉＲ−１３５ａは、およそ３０％の抑制をＳｌｃ６ａ４（Ｐ＝０．０１４）およびＨｔｒ１ａ（Ｐ＜０．０００１）に対してもたらしたが、ｍｉＲ−１３５ｂは、およそ５０％の抑制をＳｌｃ６ａ４（Ｐ＝０．０００２）およびＨｔｒ１ａ（Ｐ＜０．０００１）に対して引き起こした。加えて、Ｈｔｒ１ａの３’ＵＴＲの著しい抑制が、ｍｉＲ−３３５（Ｐ＜０．０００１）、ｍｉＲ−１８１ｃ（Ｐ＝０．００２９）およびｍｉＲ−２６ａ（Ｐ＜０．０００１）によってもたらされた（図２Ｄ）。さらなるゲノム的取り組みの生物情報学的分析により、ｍｉＲ−１３５シード一致部の強い保存がｓｌｃ６ａ４の３’ＵＴＲにおいて明らかにされ（図２Ｅ）、また、Ｈｔｒ１ａの３’ＵＴＲにおける２つの特定されたシード一致部のうちの１つにおいて明らかにされた（図２Ｆ）。Ｓｌｃ６ａ４転写物の３’ＵＴＲにおける変異研究では、ｍｉＲ−１３５のｍｉＲシード一致部を除去した場合、Ｓｌｃ６ａ４のｍｉＲ−１３５ａ標的化およびｍｉＲ−１３５ｂ標的化の両方がそのシード一致配列により伝達されたことが明らかにされた。ｍｉＲ−１３５によって誘導される抑制が、Ｓｌｃ６ａ４の３’ＵＴＲにおける変異によって完全に阻止された（図２Ｇ）。Ｈｔｒ１ａのｍｉＲ−１３５シード一致部を個々に、または、ともに変異させることにより、ｍｉＲ−１３５ａが、Ｈｔｒ１ａの３’ＵＴＲを、近位側ではなく、遠位側のシード一致部を介して抑制したこと、一方、ｍｉＲ−１３５ｂは両方の予測された部位を介して作用することが明らかにされた（図２Ｈ）。
本発明者らはさらに、種々の環境的攻撃または薬理学的処置の後におけるインビボでのＲＮ−ｍｉＲ−１３５発現の調節を調べた。マウスの操作（すなわち、急性不動ストレス）の後、ＲＮを取り出し、ＲＮＡを抽出し、ｍｉＲ−１３５レベルを、リアルタイムＰＣＲを使用して調べた。５ＨＴレベルは、急性ストレスによって警報となることが知られているので、本発明者らは、ｍｉＲ−１３５のレベルを急性拘束ストレス後の種々の時点で調べ、ｍｉＲ−１３５ａおよびｍｉＲ−１３５ｂの両方が急性ストレス後９０分でダウンレギュレーションされることを見出した（Ｐ＜０．０００１）。これらのｍｉＲの低下したレベルは、対照マウスと比較して、ストレス後２４時間でも依然としてそのままであった（ｍｉＲ−１３５ａについてはＰ＝０．０３５７、図３Ａ；ｍｉＲ−１３５ｂについてはＰ＝０．００５５、図３Ｂ）。そのうえ、５ＨＴニューロン機能、ならびに、Ｓｌｃ６ａ４およびＨｔｒ１ａの発現レベルは、うつ病患者において、また、抗うつ剤の薬物治療の後で強く影響されることが知られているので、本発明者らは、うつ病様行動の誘導のための環境モデル（長期社会的敗北モデル）にさらされたマウス、および、三環系抑うつ剤のイミプラミンにさらされたマウスにおいてこれら２つのｍｉＲ変化体のレベルを調べた。興味深いことに、長期社会的敗北のストレスはｍｉＲ−１３５のレベルを縫線核において変化させなかったが、急性投与または長期投与されたイミプラミンは、ストレス負荷マウスおよびストレス非負荷マウスの両方で、ＲＮにおいてｍｉＲ−１３５ａの発現レベルを増大させ（Ｐ＝０．００３；図３Ｃ）、ｍｉＲ−１３５ｂの発現レベルを増大させた（Ｐ＝０．００９３；図３Ｄ）。イミプラミンは特異的な５ＨＴ再取り込み阻害剤ではないので、本発明者らはさらに、急性および長期の両方の選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）（フルオキセチン）およびノルアドレナリン再取り込み阻害剤（ＮＲＩ）（レボキセチン）の影響を調べ、急性および長期の両方のＳＳＲＩ処置の後ではｍｉＲ−１３５ａレベルにおける強固な増大をＲＮにおいて見出し（Ｐ＜０．０００１、図３Ｅ）、ｍｉＲ−１３５ｂレベルにおける増大は見出せなかった（図３Ｆ）。ＳＳＲＩ処置後のＲＮにおけるｍｉＲ−１３５レベルにおける変化によって興味がわいたので、本発明者らはマウスの血漿における循環ｍｉＲ−１３５のレベルを調べ、ｍｉＲ−１３５ａレベルにおける強固な低下を急性および長期の両方のＳＳＲＩ投与の後で見出し（薬物についての主影響、Ｐ＜０．０００１、図３Ｇ）、また、循環ｍｉＲ−１３５ｂレベルにおける影響は何ら無いことを見出した（図３Ｈ）。このことは、ＳＳＲＩ投与後のＲＮおよび血漿におけるｍｉＲ−１３５ａレベルの間での強い逆の相関を示唆している（図３Ｉおよび図３Ｊ）。
動物状況全般におけるｍｉＲ−１３５レベルの重要性をさらに調査するために、本発明者らは、ｍｉＲ−１３５のレベルをインビボで、特に成体マウスのＲＮにおいて操作し、マウスのうつ病様行動に対するその影響を調べた。この目的のために、本発明者らは、強化型シナプシンプロモーター（これはまた、ＧＦＰレポーターを共発現させた）を使用して、ｍｉＲ−１３５ｂをニューロンにおいて特異的に過剰発現する組換えレンチウイルスを構築した（材料および実験手順の節（上記）および図４Ａを参照）。本発明者らは、このレンチウイルスを成体マウスのＲＮに注入することによってこのレンチウイルスをインビボで調べ、ＲＮにおけるｍｉＲ−１３５ｂレベルを対照レンチウイルス注入マウスに対して比較した。ｍｉＲ−１３５ｂレベルのリアルタイムＰＣＲ分析では、１０倍の誘導が、対照レンチウイルス注入マウスと比較して明らかにされた（Ｐ＝０．００３２、図４Ｂ）。ｍｉＲ−１３５ｂ過剰発現を伴う注入された成体マウスを、うつ病様行動を開始させるために長期社会的敗北に供し、続いて行動について試験した。行動試験の後、マウスを灌流処置し、脳を、注入部位を突き止めるために分析した（図４Ｃ〜図４Ｄ）。ＲＮでｍｉＲ−１３５を過剰発現するマウスは、ホームケージでのそれらの自発運動における変化を何ら認めることなく（図４Ｇ〜図４Ｈ）、低下した不動時間を強制水泳において示し（Ｐ＝０．００８８（３分の時点で）、Ｐ＝０．００３３０（４分の時点について）；図４Ｅ）、また、尾懸垂試験において示した（Ｐ＝０．０７３５６（試験の最後の５分で）、図４Ｆ）。このことは、ｍｉＲ−１３５の過剰発現についての抗うつ効果を示唆している。
まとめると、本発明者らは、ＲＮのセロトニン作動性ニューロンおよびセロトニン非作動性ニューロンの特異的なｍｉＲ発現フィンガープリントを明らかにした。本発明者らは、この特異なデータセットを、５ＨＴ関連遺伝子のｍｉＲ標的化のための生物情報学予測と組み合わせた。本発明者らは、Ｔｐｈ２、ＭａｏＡ、Ｓｌｃ６ａ４およびＨｔｒ１ａについての標的化予測を、３’ＵＴＲルシフェラーゼアッセイを使用して、また、変異研究においてインビトロで調べ、他のｍｉＲ−標的相互作用のなかでもとりわけ、Ｓｌｃ６ａ４およびＨｔｒ１ａの両方の３’ＵＴＲに対するｍｉＲ−１３５についての強い阻害影響を明らかにした。さらに、本発明者らは、ＲＮにおけるｍｉＲ−１３５が急性ストレスによってダウンレギュレーションされ、抗うつ剤投与（具体的にはＳＳＲＩ剤）によってアップレギュレーションされることを明らかにした。さらに、本発明者らは、ＳＳＲＩ投与後のＲＮにおけるｍｉＲ−１３５ａレベルと、血漿におけるそのレベルとの間での逆の相関を確認した。最後に、本発明者らは、成体マウスのＲＮにおけるｍｉＲ−１３５の部位特異的な過剰発現が社会的敗北後の低下したうつ病様行動をもたらすことを明らかにした。
実施例２
ｍｉＲ−１９は１型ベータアドレナリン作動性受容体（Ａｄｒｂ１）を特異的に標的とする
材料および実験手順
Ｐｓｉｃｈｅｃｋ２ルシフェラーゼ発現プラスミドへの３’ＵＴＲのクローン化
ＡＤＲｂ１の３’ＵＴＲ配列をマウスのゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。変異させた３’ＵＴＲ配列（これは４つすべてのｍｉＲ−１９シード一致部を欠いている）が、Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（テキサス、米国）によって合成された。３’ＵＴＲのＰＣＲフラグメントを製造者の指針に従ってｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結し、さらに、Ｐｓｉｃｈｅｃｋ２レポータープラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）におけるルシフェラーゼの３’末端での単一ＮｏｔＩ部位にサブクローン化した。クローン化配向を診断的切断および配列決定によって確認した。
トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＨＴ２２ニューロン細胞を７０％〜８５％の密集度まで４８ウエル形式でポリ−Ｌ−リシン上で成長させ、下記のプラスミドとともにポリエチレンイミンを使用してトランスフェクションした：Ｐｓｉｃｈｅｃｋ２−３’ＵＴＲプラスミド、ｐＥＧＦＰプラスミドでのｐｒｅ−ｍｍｕ−ｍｉＲ−１９ｂ過剰発現またはｐＥＧＦＰプラスミド単独（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｍｉＲ−１９ｂノックダウン（ＫＤ）プラスミド（Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ）または対照ＫＤプラスミド（Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ）。トランスフェクションの２４時間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼレポーター活性を以前の記載のようにアッセイした［Ｃｈｅｎ Ａ．他、Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（２００５）１９：４４１〜５８］。ウミシイタケルシフェラーゼの値を、（同じベクターから転写されるが、試験されている３’ＵＴＲによって影響されない）対照のホタルルシフェラーゼのレベルに対して正規化し、１条件あたり６回のウエル反復にわたって平均化した。
結果
いくつかの反復体をその３’ＵＴＲに含有する別個の進化的に保存されたｍｉＲＮＡ標的配列を用いたストレス関連遺伝子についての生物情報学的分析により、ｍｉＲ−１９が、１型ベータアドレナリン作動性受容体（Ａｄｒｂ１）の標的化のための強い候補として明らかにされた（この場合、３つの強く保存されたｍｉＲ−１９シード一致部と、１つのそれほど保存されていないｍｉＲ−１９シード一致部とがＡｒｒｂ１の３’ＵＴＲに存在する）。Ａｄｒｂ１は、扁桃体、海馬および室傍核（ＰＶＮ）を含めて脳の様々な領域において発現されるアドレナリン作動性受容体である。扁桃体のＡｄｒｂ１は以前には、影響を不安様行動［Ｆｕ Ａ他、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ（２００８）１２１１：８５〜９２；Ｒｕｄｏｙ ＣＡおよびＶａｎ Ｂｏｃｋｓｔａｅｌｅ ＥＪ、Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ（２００７）３１：１１１９〜２９］および恐怖記憶［Ｒｏｏｚｅｎｄａａｌ Ｂ他、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（２００４）２４：８１６１〜９；Ｒｏｏｚｅｎｄａａｌ Ｂ他、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（２００６）１３８：９０１〜１０］に及ぼすとして記載された。興味深いことに、Ａｄｒｂ１は、扁桃体のＣＲＦ陽性細胞の表面に見出されたものであり、Ｇを介してその影響を発揮し、それにより、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）をさらに活性化するＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。ＡＣをコードする１０個の遺伝子（すなわち、ＡＤＣＹ１〜１０）が知られている。これらのうちの３つ（ＡＤＣＹ１、ＡＤＣＹ７およびＡＤＣＹ９）が、ｍｉＲ−１９によって標的とされることが生物情報学的に予測された。ＡＤＣＹ１は脳特異的な発現を有しており、マウス前脳におけるその過剰発現が認知記憶およびＬＴＰを高めることが以前に示された［Ｗａｎｇ Ｈ他、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（２００４）７：６３５〜４２］。
ｍｉＲ−１９が実際に、Ａｄｒｂ１またはＡＤＣＹ１の発現を、Ａｄｒｂ１−３’ＵＴＲまたはＡＤＣＹ１−３’ＵＴＲにおけるその推定される標的配列を介して調節するかどうかを調べるために、無傷型形態または変異型形態のＡｄｒｂ１−３’ＵＴＲ（図５）またはＡＤＣＹ１−３’ＵＴＲをＰｓｉｃｈｅｃｋ２発現プラスミドにおいてルシフェラーゼ遺伝子の下流側にクローン化した。変異型形態のＡＤＲｂ１−３’ＵＴＲには、ｍｉＲ−１９ｂのための４つすべてのシード一致部が存在しなかった（図５）。変異型形態の部分的ＡＤＣＹ１−３’ＵＴＲには、（３つのうちの）保存されたシード一致部のみが存在しなかった。
ルシフェラーゼアッセイを、ｍｉＲ−１９とＡｄｒｂ１−３’ＵＴＲとの間における相互作用、および、同様に、ｍｉＲ−１９とＡＤＣＹ１−３’ＵＴＲとの間における相互作用の性質を明らかにするために使用した。ＨＴ２２細胞（これは低レベルのｍｉＲ−１９を内因的に発現する）では、差が、無傷型形態または変異型形態のどちらかのＡＤＲｂ１−３’ＵＴＲによって制御されるルシフェラーゼレベルの間に見出されなかった（図６Ａ）。しかしながら、ｍｉＲ−１９ｂをＨＴ２２細胞において過剰発現させたとき、ルシフェラーゼレベルが、（正規化されたルシフェラーゼ発現における一般的な、非特異的と思われる低下に加えて）、変異型形態のＡＤＲｂ１−３’ＵＴＲに対して、無傷型形態によって駆動されるときには著しく低くなった（およそ２分の１）（図６Ｂ）。高レベルのｍｉＲ−１９を内因的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、ＡＤＲｂ１−３’ＵＴＲによって調節されるルシフェラーゼ発現レベルが、変異型形態のＡＤＲｂ１−３’ＵＴＲによって調節されるときに発現されるルシフェラーゼ発現レベルの１／２〜１／４であった（図６Ｃ）。
ｍｉＲのノックダウン（ＫＤ）系を、ｍｉＲ−１９レベルをＨＥＫ２９３Ｔ細胞において操作するために使用した。すなわち、（１）ｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ ＫＤプローブ（Ｅｘｉｑｏｎ、マサチューセッツ、米国；図６Ｄ）、および、（２）プラスミドに基づくノックダウン配列ｍｉＡｒｒｅｓｔ（Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ、ロックビル、メリーランド、米国；図６Ｅ）。ＬＮＡ−抗ｍｉＲ−１９ｂは、ＡＤＲｂ１−３’ＵＴＲ下で調節されるときに発現されるルシフェラーゼ活性を対照のスクランブル型ＫＤプローブに対して約２０％高め、また、変異型形態のＡＤＲｂ１−３’ＵＴＲに対する影響を何ら有していなかった（図６Ｄ）。これに対して、プラスミドに基づくｍｉＲ−１９ｂＫＤは、対照ＫＤ配列に対して、無傷型形態のＡＤＲｂ１−３’ＵＴＲによって調節されるルシフェラーゼ発現における２倍までの増強を引き起こした（図６Ｅ）。変異形態のＡＤＲｂ１−３’ＵＴＲによって駆動されるルシフェラーゼ活性に対するルシフェラーゼレベルの完全なレスキューが何ら達成されなかった。このことは、プローブ／ゲノム配列のｍｉＲ−１９ｂ特異性（スピアリングｍｉＲ−１９ａ調節）、完全にダウンレギュレーションすることが困難であるかもしれないＨＥＫ２９３Ｔ細胞における高いｍｉＲ−１９レベル、または、ＡＤＲｂ１−３’ＵＴＲにおける同じシード一致配列に結合するかもしれないＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現される他の可能なｍｉＲＮＡの影響のいずれかによって説明されるかもしれない。
実施例３Ａ
ｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂは慢性的ストレスの後のＰＦＣおよび扁桃体においてアップレギュレーションされる
材料および実験手順
動物および収容
ｍｉＲ１７〜９２ｆｌｘ／ｆｌｘマウス［Ｖｅｎｔｕｒａ Ａ他、Ｃｅｌｌ（２００８）８７５〜８６：（５）１３２；７］をＣａｍＫＩＩａ−Ｃｒｅマウス［Ｄｒａｇａｔｓｉｓ Ｉ他、Ｇｅｎｅｓｉｓ、（２０００）２６（２）：１３３〜５］と交雑する。トランスジェニックマウスまたは成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスを逆の１２時間の明暗周期で温度制御部屋（２２±１℃）に収容する。食物および水を自由に摂取させる。すべての実験プロトコルがＷｅｉｚｍａｎｎ科学研究所の施設内動物管理使用委員会によって承認された。
成体脳におけるｍｉＲ−１９ｂ操作のためのレンチウイルスの作製
ｍｉＲ−１９ｂのＫＤ配列をＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ−Ｈ１プロモーターの後においてレンチウイルスプラスミドにクローン化した。加えて、プレ−ｍｉＲ−１９ｂ配列をレンチウイルスプラスミドにおいてニューロン特異的プロモーター（強化型シナプシン、ＥＳｙｎ）の後にクローン化した。レンチウイルスをインビボでのｍｉＲ−１９−ＫＤ実験およびプレ−ｍｉＲ−１９ｂ過剰発現発現（ＯＥ）実験の両方のために作製する。これらのレンチウイルスを使用して、ｍｉＲ−１９ｂのレベルを、ｍｉＲ−１９のレベルが行動的／薬理学的攻撃の後で変化することが見出される標的領域において操作する。
ｍｉＲ−１９を前脳において欠いているマウスの作製
ｍｉＲ−１９を前脳において欠いているマウスを作製するために、本発明者らは、ｍｉＲクラスターｍｉＲ１７〜９２の条件的形態を有するマウスを用いて、ＣｒｅリコンビナーゼをＣａｍＫＩＩａプロモーターの下にコードする遺伝子を有するマウスを育種中である。ｍｉＲ−１９ファミリーはｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂを含む。マウスゲノムにおいて、ｍｉＲ−１９ｂは２つの同一コピー（ｍｉＲ−１９ｂ−１およびｍｉＲ−１９ｂ−２）を有する。ｍｉＲ１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂ−１は、同じｍｉＲＮＡクラスターに、すなわち、ｍｉＲ１７〜９２に位置し、これに対して、ｍｉＲ−１９ｂ−２は、異なるゲノム遺伝子座（ｍｉＲ１０６ａ〜３６３）に位置する。後者は、マウス組織における発現をほとんど、または全く有していないようであり、したがって、ｍｉＲ１７〜９２クラスターのノックアウトは、前脳におけるｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂ発現レベルに対する非常に大きな影響を可能にするために十分であることが予想される。
行動的／薬理学的攻撃
ｍｉＲ１７〜９２クラスターを前脳において欠いているマウス、または、ｍｉＲ−１９が特異的に操作されたマウス（特定の脳領域おいて過剰発現またはダウンレギュレーション（ＫＤ）されたマウス）が、ＡＤＲｂ１、ＡＤＣＹ１ならびに他の転写物および遺伝子産物の発現レベルについて調べられるであろう。これらの動物はまた、不安様行動、自発運動活性および記憶成績について試験されるであろう。さらに、ｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂの発現レベルが、ＷＴ型マウスにおけるノルアドレナリン再取り込み阻害剤のレボキセチンによる急性および長期の全身的処置の後で興味の対象である種々の領域（例えば、海馬、扁桃体および前脳）において調べられる。
結果
ｍｉＲＮＡ−１９とＡｄｒｂ１との間における生理学的つながりを、レボキセチン（ノルアドレナリン再取り込み阻害剤（ＮＲＩ））が急性または長期のどちらかで注射されたマウスの前頭前皮質（ＰＦＣ）におけるｍｉＲ−１９ａ／ｂのレベルを評価することによって研究した（図１２Ａ〜図１２Ｄ）。図１２Ａ〜図１２Ｄに示されるように、ｍｉＲ−１９ａ／ｂレベルがレボキセチンの急性投与の後ではダウンレギュレーションされ（図１２、図１２Ｂ）、レボキセチンの長期投与の後ではアップレギュレーションされた（図１２Ｃ、図１２Ｄ）。
次に、ｍｉＲ−１９のレベルを、ｍｉＲ−１９ａおよびｂのレベルを、社会的敗北プロトコルに供されたマウスのＰＦＣおよび扁桃体において測定することによってストレス後に評価した（図１３Ａ〜図１３Ｄ）。図１３Ａ〜図１３Ｄに示されるように、ｍｉＲ−１９ａおよびｂのレベルが慢性的ストレスの後ではＰＦＣおよび扁桃体の両方において増大した。これらの結果は、中枢ストレス応答の調節におけるｍｉＲ−１９の関与を例示している。
実施例３Ｂ
ｍｉＲＮＡ−１９およびカナビノイド受容体１（ＣＢ１）
材料および実験手順
動物および収容
実施例３Ａ（上記）において記載される通り。
成体脳におけるｍｉＲＮＡ−１９ｂ操作のためのレンチウイルスの作製
実施例３Ａ（上記）において記載される通り。
結果
ＣＢ１は、脳における最も豊富に発現されるＧＰＣＲの１つであり、皮質、扁桃体、海馬、脳幹神経節および小脳において特に多い（図１５Ａ〜図１５Ｂ）［Ｈｅｒｋｅｎｈａｍ Ｍ．他、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：ｔｈｅ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）１１：５６３〜５８３；Ｍａｃｋｉｅ，Ｋ．、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（２００５）２９９〜３２５］。ＣＢ１受容体が、神経伝達を調整するためにＣＢ１受容体がうまく配置される軸索および軸索終末において高度に発現される。本発明者らは、ＣＢ１が、ｍｉＲＮＡ−１９との適合性を有する２つのシード部位を含有することを見出した。
ルシフェラーゼアッセイを、ｍｉＲＮＡ−１９とＣＢ１−３’ＵＴＲとの間における相互作用の性質を明らかにするために使用した。ｍｉＲＮＡ−１９ｂをＣＢ１の３’ＵＴＲと一緒にＨＴ２２細胞において過剰発現させたとき、ルシフェラーゼレベルが、同じ３’ＵＴＲにより過剰発現されるＧＦＰと比較したときには著しく低くなった（５０％）（図１４）。このことは、ＣＢ１レベルの調節におけるｍｉＲ−１９についての可能な役割を裏付けている。さらなる変異実験が、（Ａｄｒｂ１について上記で記載されるような）観測された調節に対する予測されたｍｉＲ−１９シード配列の役割を確認するために行われる。
興味深いことに、以前の研究は、嫌悪記憶の固定が、扁桃体の基底外側核（ＢＬＡ）における、グルココルチコイド、ノルアドレナリン作動性およびカンナビノイドシグナル伝達の間におけるクロストークによって促進されることが説得力をもって明らかにされている［Ｒｏｏｚｅｎｄａａｌ，Ｂ．他、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ（２００６）８６：２４９〜２５５］。ＨｉｌｌおよびＭｃＥｗｅｎによって提案されるモデル［Ｈｉｌｌ Ｍ．Ｎ．およびＭｃＥｗｅｎ Ｂ．Ｓ．、Ｐｒｏｃ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔ Ａｃａｄ ｏｆ Ｓｃｉ ｏｆ ｔｈｅ ＵＳＡ（２００９）１０６：４５７９〜４５８０］は、記憶固定のためのＢＬＡにおける可能な作用機構を示す（図１６）。
今回の結果において示されるように、ＭｉＲＮＡ−１９はＡｄｒｂ１およびＣＢ１の両方をインビトロで調節するようである。例えば、Ａｄｒｂ１およびＣＢ１のレベルが変化させられるかもしれないＢＬＡに特異的に送達されるレンチウイルスを使用するｍｉＲ−１９の過剰発現およびノックダウンが、学習パラダイムおよび記憶パラダイム（例えば、ストレスに満ちた攻撃にさらされることを伴う、または伴わない恐怖条件づけなど）におけるマウスの成績を調べる試験と同様に行われる。
実施例３Ｃ
慢性的ストレスに供されたマウスにおける示差的に発現されるｍｉＲＮＡの同定
材料および実験手順
Ａｇｏ２タンパク質の免疫沈殿
同じ群（「感受性あり」、「立ち直りが速い」または対照）の一部である３匹の動物から得られた３個の扁桃体のプールを、ＲＮａｓｅ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害が補充されたＮＰ４０緩衝液において均質化した。試料を、４℃で２時間、絶えず撹拌しながら維持した。その後、試料を、１２０００ｒｐｍで２０分間、微量遠心分離器において４℃で遠心分離し、上清を、氷上に保たれた新しいチューブに入れ、ペレットを捨てた。磁気プロテインＧビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、室温で１０分間、回転とともにＡｇｏ２モノクローナル抗体（ＷＡＫＯ）とインキュベーションした。数回の洗浄の後、試料をＡｇｏ２被覆のプロテインＧビーズに加え、撹拌下、４℃で一晩インキュベーションした。翌日、ビーズをＰＢＳにより３回洗浄した。ＲＮＡ精製のために、ビーズをＲＬＴ緩衝液において均質化した（ＲＮｅａｓｙキット、ｍｉＲＮＡ補助プロトコル）。ウエスタンブロット分析のために、ビーズを、タンパク質をビーズから遊離させるために試料緩衝液において煮沸した。
ＲＮＡ精製およびマイクロアレイ
Ａｇｏ２免疫沈殿試料からのＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎの補助プロトコル１：ｍｉＲＮＡ含有総ＲＮＡの調製に従って、ＲＮｅａｓｙプラスキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。すべての他の目的のためのＲＮＡを、ｍｉＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の推奨法に従って使用して、凍結された脳打ち抜き物から単離し、ＲＮＡの完全性を、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザーを使用して評価した。Ａｇｏ２免疫沈殿の後の、ストレス負荷マウスの組織に由来するＲＮＡを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｍｉＲＮＡ ２．０アレイ（濃縮ＲＮＡプロトコル）およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｅ １．０ＳＴアレイでさらに分析した。
結果
慢性的ストレスパラダイムに供されたマウスの扁桃体から単離される示差的に発現されるｍｉＲＮＡ、および／または、「立ち直りが速い」もしくは「感受性あり」の行動表現型に伴う示差的に発現されるｍｉＲＮＡを同定し、かつ、研究するために、社会的敗北プロトコルを使用した（方法の節を参照）。
社会的敗北パラダイムの後でのｍｉＲＮＡとそれらの標的遺伝子の３’ＵＴＲとの間における真の結びつきを確認するために、Ａｇｏ２複合体の免疫沈殿（ＩＰ）を行い、共沈殿したｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡの集団を分析した。成熟型ｍｉＲＮＡが形成されたとき、成熟型ｍｉＲＮＡがＲＩＳＣ複合体に取り込まれた。ＲＩＳＣ複合体に存在する間は、Ａｇｏ２は、特定のｍｉＲＮＡとその標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲとの間での相互作用を容易にする［Ｍｅｉｓｔｅｒ Ｇ．他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ（２００４）１５：１８５〜１９７］（図１７Ａ）。
Ａｇｏ２複合体が実際に、その結合したＲＮＡと一緒に沈殿され得ることを確認するために、ＩＰを、実験未使用マウスの扁桃体に対して行った。ＩＰを、モノクローナルＡｇｏ２抗体と反応させられるプロテインＧ磁気ビーズを使用して行った。図１７Ｂに示されるように、特異的なＡｇｏ２バンドが、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞の抽出物（図１７Ｂ、レーン１）、または、扁桃体組織の抽出物（図１７Ｂ、レーン２）から沈殿した。
ＩＰの特異性を明らかにするために、全脳試料を２つに分け、１つを抗Ａｇｏ２により沈殿させ、他方を対照のＩｇＧ１非特異的抗体により沈殿させた。特異的なＡｐｏ２バンドがＡｐｏ２沈殿物にのみ存在した（図１７Ｂ、レーン３、４）。
したがって、Ａｇｏ２複合体を沈殿させ、沈殿物におけるｍｉＲＮＡ集団ならびにｍＲＮＡ集団を分析することによって、所与のｍｉＲＮＡとその標的となったｍＲＮＡの３’ＵＴＲとの間における正しい結びつきを特定の脳領域において発見するためのより大きな機会があった。
社会的敗北パラダイムに供されたマウスの扁桃体からのＡｇｏ２会合ＲＮＡの単離
次に、Ａｇｏ２のＩＰ実験の具体的な結果に基づいて、同じ戦略を、社会的敗北プロトコルに供されたマウスの脳でのｍｉＲＮＡおよびそれらの標的ｍＲＮＡにおける潜在的な違いを明らかにするために実行した。
１０日間の社会的敗北パラダイムの後、マウスを、対照、「感受性あり」および「立ち直りが速い」の３つの群に分類した。マウスを、このマウスが社会的敗北パラダイムの期間中に攻撃を受けた同じ系統に由来する新しいマウスと遭遇したときに社会的回避を示したときには「感受性あり」として特徴づけた。マウスを、このマウスが新しい攻撃的マウスを避けず、そのマウスと触れ合うならば、「立ち直りが速い」として特徴づけた。社会的敗北に供されたマウスの大部分が典型的には、社会的回避を示し、したがって、「感受性あり」として類別されることになる。実験におけるマウスのおよそ１０％〜２０％のみが、「立ち直りが速い」と予想される。下記に示されるのは、行われた社会的回避試験の一例である。
図１８Ａにおいて明らかにされるように、マウスを、慣らすために３分間、特別な迷路に単独で置いた。カメラが、迷路全体にわたるマウスの動きを探知した。図１８Ｃにおいて、同じマウスが、仕切り板の向こう側に置かれた新たなＩＣＲマウスにさらされた。カメラは、マウスを、新たなマウスの場所から遠位側の活動領域の最も遠い隅に探知した。この応答は社会的回避と見なされ、したがって、このマウスは「感受性あり」として類別された。対照的に、図１８Ｂおよび図１８Ｄにおいて、マウスは社会的回避を示さず、したがって、「立ち直りが速い」として類別された。
４０匹のマウスが社会的敗北パラダイムを受け、４０匹のマウスが対照としての役割を果たした。社会的回避試験のあと、９匹の「立ち直りが速い」マウス、９匹の「感受性あり」マウスおよび１２匹の対照マウスを脳の顕微解剖のために選択した。脳の試料を、体幹の血液と一緒に、扁桃体、ＢＮＳＴ、ＰＦＣ、背側縫線核および海馬から、社会的回避試験の８日後に集めた。
３匹の異なるマウスから得られる３つの扁桃体打ち抜き物のプールを一緒にし、抗Ａｇｏ２との免疫沈殿を行った。ＩＰ後、ＲＮＡを沈殿物から抽出した。３つの扁桃体をそれぞれの群から取り出した後、「立ち直りが速い」マウスからの３つのＲＮＡ試料、「感受性あり」マウスからの３つのＲＮＡ試料、および、対照マウスからの４つのＲＮＡ試料、すなわち、合計で１０個のＲＮＡ試料が存在した。それぞれの試料をマウスＳＴマイクロアレイで、同様にまた、ｍｉＲＮＡアレイで調べた（ともにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）。対照群に対する２つの群のそれぞれ（「感受性あり」または「立ち直りが速い」）においてアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされた遺伝子およびｍｉＲＮＡを調べた。ある特定のｍｉＲＮＡと標的遺伝子との間での相互作用が生じるならば、本発明者らは、それらの総レベルにおける正反対の相関を予想した。しかしながら、（抗Ａｇｏ２により沈殿させられる）ＲＩＳＣ複合体に存在するｍＲＮＡは、未だフラグメント化されていないので、高レベルにあることが予想された。したがって、アレイデータを検査している間、本発明者らは、対照試料に対して上昇またはダウンレギュレーションのどちらかをともに示すｍｉＲＮＡおよび潜在的ｍＲＮＡ標的を調べた。これは、このことが、それらがＲＩＳＣ複合体において相互作用することを示すものであったからである。
マイクロアレイ結果
表３（本明細書中下記）は、従来のフィルターを使用して分析された予備的アレイ結果を例示した。
いくつかのｍｉＲＮＡ（これらは、「感受性あり」群および「立ち直りが速い」群のマウスにおいて著しくアップレギュレーションされているものである）が選択され、ヒートマップで例示されている（図１９Ａ〜図１９Ｂ参照）。
遺伝子発現アレイ（ｍＲＮＡ）
脳におけるいくつかの潜在的ｍｉＲＮＡおよびそれらの推定標的が分析される。
実施例４Ａ
ストレス応答の調節因子としてのｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ−１５ｂ
材料および実験手順
総ＲＮＡ抽出
扁桃体組織を急性ストレス手順の９０分後に解剖した。総ＲＮＡを、ｍｉＲＮＡを保存するためにｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。凍結された脳打ち抜き物を溶解緩衝液に移し、直ちに均質化した。ニューロン一次培養物またはＮ２ａ細胞培養物を氷上においてウエル内で溶解した。さらなる処理を製造者の推奨法に従って行った。ＲＮＡ抽出物を使用まで−８０℃で貯蔵した。
ｍｉＲＮＡアレイ
ｍｉＲＮＡの示差的発現を製造者の説明書に従ってＡｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ、サンタクララ、カリフォルニア、米国）またはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、サンタクララ、カリフォルニア、米国）のｍｉＲＮＡマイクロアレイによってアッセイした。ｍｉＲＮＡの示差的発現を、Ａｇｉｌｅｎｔアレイを使用して評価するために、１試料あたり１００ｎｇの総ＲＮＡ（３つの対照試料および２つの急性ストレス試料）をそれぞれ、製造者の説明書に従って標識し、ハイブリダイゼーションさせた。アレイを、Ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイスキャナーを使用して走査した。データを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウエアｖ９を使用して抽出し、Ｐａｒｔｅｋ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｓｕｉｔｅ（Ｐａｒｔｅｋ Ｉｎｃ．、セントルイス、ミズーリ、米国）を使用して分析した。ＧｅｎｅＶｉｅｗ．ｔｘｔファイルからのデータを対数変換および分位正規化に供した。ｍｉＲＮＡの示差的発現を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイを使用して評価するために、１試料あたり１μｇの総ＲＮＡ（２つの対照試料および２つの急性ストレス試料）をそれぞれ、製造者の説明書に従って標識し、ハイブリダイゼーションさせた。アレイを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイスキャナーを使用して走査した。データを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘスキャナーソフトウエアを使用して抽出し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｍｉＲＮＡＱＣｔｏｏｌソフトウエアのデフォルトパラメータを使用して正規化した（バックグラウンド調節、分位正規化、対数変換および閾値決定）。４つのファイルからの正規化データを、Ｐａｒｔｅｋ Ｇｅｎｏｍｉｃｓソフトウエアにインポートした。これらのマイクロアレイのいずれにも提示されない遺伝子は除いた。ｍｉＲＮＡ分布における違いのために、（それぞれのアレイについて約１の標準誤差に対応する）異なる対数比カットオフをそれぞれのアレイについて選定した：Ａｇｉｌｅｎｔについては０．２、Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘについては０．４。対数比がカットオフよりも大きいｍｉＲＮＡをアレイ間で比較した。共通するｍｉＲＮＡを記録する。
Ｐｓｉｃｈｅｃｋ２ルシフェラーゼ発現プラスミドへの３’ＵＴＲのクローン化
ＣＲＦＲ１の３’ＵＴＲ配列をマウスのゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。３’ＵＴＲのＰＣＲフラグメントを製造者の指針に従ってｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結し、さらに、Ｐｓｉｃｈｅｃｋ２レポータープラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）におけるルシフェラーゼの３’末端での単一ＮｏｔＩ部位にサブクローン化した。クローン化配向を診断的切断および配列決定によって確認した。
トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を７０％〜８５％の密集度まで４８ウエル形式でポリ−Ｌ−リシン上で成長させ、下記のプラスミドとともにポリエチレンイミンを使用してトランスフェクションした：Ｐｓｉｃｈｅｃｋ２−３’ＵＴＲプラスミド、ｐＥＧＦＰプラスミドでのｐｒｅ−ｍｍｕ−ｍｉＲ−１５過剰発現またはｐＥＧＦＰプラスミド単独（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。トランスフェクションの２４時間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼレポーター活性を以前の記載のようにアッセイした［Ｃｈｅｎ Ａ．他、Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（２００５）１９：４４１〜５８］。ウミシイタケルシフェラーゼの値を、（同じベクターから転写されるが、試験されている３’ＵＴＲによって影響されない）対照のホタルルシフェラーゼのレベルに対して正規化し、１条件あたり６回のウエル反復にわたって平均化した。
結果
ｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ−１５ｂが、急性拘束ストレス後９０分でアップレギュレーションされるように出現した（図７Ａ〜図７Ｂ）。ｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ−１５ｂの両方がＣＲＦＲ１−３’ＵＴＲを標的とすることが生物情報学的に予測された（図７Ｃ）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｍｉＲ−１５ｂのインビトロ過剰発現は、ＣＲＦＲ１−３’ＵＴＲによって制御されるルシフェラーゼ発現のレベルを著しく低下させた（図７Ｄ）。
実施例４Ｂ
ＦＫＢＰ５に対するｍｉＲ１５の影響
材料および実験手順
実施例４Ａ（本明細書中上記）において例示される通り。
結果
アレイの結果に基づいて、ｍｉＲ−１５ａおよびＦＫ５０６結合タンパク質５（これはまたＦＫＢＰ５として知られている）はともに、対照群と比較して、「感受性あり」マウスおよび「立ち直りが速い」マウスにおいてアップレギュレーションされた（図２０Ａ〜図２０Ｂ）。このことは、慢性的ストレスの結果としてのＲＩＳＣ複合体におけるそれらのアップレギュレーションを示唆している。
遺伝子研究では、外傷後ストレス障害、うつ病および不安におけるＦＫＢＰ５についてのある一定の役割が確認されている。例えば、ＦＫＢＰ５における一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）が、成人の外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）の重篤度を予測させる小児期の外傷と相互作用することが見出されている［Ｂｉｎｄｅｒ，Ｅ．Ｂ．他、Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００４）３６：１３１９〜１３２５］。これらの知見により、小児として虐待される、これらのＳＮＰを有する個体は、成人としてＰＴＳＤに対する感受性がより大きいことが示唆される。ＦＫＢＰ５はまた、現在ＰＴＳＤを患っている個体ではそれほど発現されないことが見出されている［Ｙｅｈｕｄａ，Ｒ．他、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ（２００９）６６：７０８〜７１１］。ＦＫＢＰ５遺伝子は、多数のポリアデニル化部位を有することが見出されており、また、うつ病性障害のより大きい割合と統計学的に関連する［Ｂｉｎｄｅｒ他、上掲］。
ＦＫＢＰ５の３’ＵＴＲのさらなる分析により、ＦＫＢＰ５の３’ＵＴＲが、ｍｉＲ−１５に対する１つの保存されたシード一致部を有することが明らかにされた（図２０Ｃ）。
実際、ｍｉＲ−１５ａがＦＫＢＰ５のｍＲＮＡを調節するならば、ｍｉＲ−１５ａおよびＦＫＢＰ５の両方が、（マイクロアレイの結果（図２０Ｂ）によって示されるように）Ａｇｏ−２沈殿物においてアップレギュレーションされるであろうが、扁桃体試料におけるＦＫＢＰ５のｍＲＮＡまたはタンパク質のどちらかの全体的レベルが低下するであろうことが予想された。
ｍｉＲ−１５ａとＦＫＢＰ５との間での相互作用が扁桃体において生じているかどうかを調べるために、「感受性あり」マウスおよび対照マウスの扁桃体から得られる総ＲＮＡ試料に対するリアルタイムＰＣＲ分析を行った。図２１Ａ〜図２１Ｂに示されるように、ｍｉＲ−１５ａのレベルが、感受性ありのマウスから採取された総ＲＮＡ抽出物において増大し、これに対して、ＦＫＢＰ５のレベルが低下した。これらの結果は、ｍｉＲ−１５ａが慢性的ストレス条件の後の扁桃体においてＦＫＢＰ５のレベルを抑制することを示していた。
ＦＫＢＰ５の無傷型および変異型の３’ＵＴＲ形態をルシフェラーゼアッセイ分析のためにクローン化することが、ｍｉＲ−１５ａとＦＫＢＰ５との間における直接的な相互作用がインビトロで生じるかどうかを見出すために行われる。
ＦＫＢＰ５に加えて、ｍｉＲ−１５は、Ｓｔｘ１ａ（シンタキシン１ａ）、Ｓｇｋ１（血清／グルココルチコイド調節キナーゼ）およびＡｄｒｂ２を含めて、ストレス応答に関与する数多くの遺伝子を潜在的に調節することができる（図２２）。
実施例４Ｃ
ｍｉＲ−１８１はグルタミン酸受容体を調節する
材料および実験手順
Ｐｓｉｃｈｅｃｋ２ルシフェラーゼ発現プラスミドへの３’ＵＴＲのクローン化
Ｇｒｍ１、Ｇｒｉｋ３、Ｇｒｍ５、Ｇｒｉｋ２およびＧｒｍ７の３’ＵＴＲ配列をマウスのゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。３’ＵＴＲのＰＣＲフラグメントを製造者の指針に従ってｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはｐＪＥＴ１．２ベクター（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）のどちらかに連結し、さらに、Ｐｓｉｃｈｅｃｋ２レポータープラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）におけるルシフェラーゼの３’末端での単一ＮｏｔＩまたはＸｈｏＩ部位にサブクローン化した。クローン化配向を診断的切断および配列決定によって確認した。
長期社会的敗北
マウスを、以前に記載されたような社会的敗北プロトコルに供した［Ｋｒｉｓｈｎａｎ Ｖ．他、Ｃｅｌｌ（２００７）１３１：３９１〜４０４］。簡単に記載すると、マウスを攻撃的ＩＣＲマウスのホームケージに入れ、ホームケージにおいてマウスは５分間にわたって物理的に触れ合った。この期間中に、ＩＣＲマウスは侵入者マウスを攻撃し、侵入者は従属的態度を示した。その後、穴の開いた透明なプレキシガラス仕切り板を動物の間に置き、マウスを、感覚的接触を許すために２４時間にわたって同じケージに留めた。その後、この手順を、その後の１０日のそれぞれについて、見慣れないＩＣＲマウスを用いて繰り返した。
結果
ｍｉＲ−１８１ｄのレベルが、慢性的ストレスに苦しむマウスにおいて著しく増大した（図２３）。ｍｉＲ−１８１と潜在的なｍＲＮＡ標的との間における相互作用を見出そうとする試みにおいて、本発明者らは、ｍｉＲ−１８１が多くの型のグルタミン酸受容体を潜在的に調節し得ることを発見した。一般に、グルタミン酸受容体は下記の２つのグループに分けることができる：イオンチャネル型グルタミン酸受容体（ｉＧｌｕＲ）、これは、グルタミン酸がこの受容体が結合するときに活性化するイオンチャネル細孔を形成する；および、代謝型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）、これは、Ｇタンパク質を伴うシグナル伝達カスケードを介して原形質膜上のイオンチャネルを間接的に活性化する。
多くの特異的サブタイプのグルタミン酸受容体のなかで、グルタミン酸よりも選択的に受容体に結合する化学物質によって一次サブタイプを示すことが慣例的である。だが、様々なサブタイプが特定され、化学的親和性が測定されるので、本研究は進行中である。いくつかの化合物がグルタミン酸受容体の研究では常用されており、受容体サブタイプと会合される：
図２４および図２５に例示されるように、ｍｉＲ−１８１の保存されている予測された標的のすべてのなかで、６つのグルタミン酸受容体（Ｇｒｍ１、Ｇｒｉｋ３、Ｇｒｍ５、Ｇｒｉａ２、Ｇｒｉｋ２およびＧｒｍ７）が存在する。
ｍｉＲ−１８１ａが海馬ニューロンにおけるＧｒｉａ２の表面発現を制御することが以前に示されている［Ｓａｂａ．Ｒ．他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１２）３２（３）：６１９〜３２］。ルシフェラーゼアッセイが、ｍｉＲＮＡ−ｍＲＮＡ相互作用を確認するために実施中である。さらに、条件的なｍｉＲ−１８１ＫＯマウス系統が特定のｃｒｅ系統と交雑され、それにより、特定の脳核におけるｍｉＲ−１８１の欠失を得ている。
実施例５Ａ
ｍｉＲ−１８２ａは、正常なニューロン活性の微調整因子であり、また、精神病理学的行動の微調整因子である
材料および実験手順
Ｐｓｉｃｈｅｃｋ２ルシフェラーゼ発現プラスミドへの３’ＵＴＲのクローン化
Ｈｔｒ１ａの３’ＵＴＲ配列をマウスのゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。３’ＵＴＲのＰＣＲフラグメントを製造者の指針に従ってｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結し、さらに、Ｐｓｉｃｈｅｃｋ２レポータープラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）におけるルシフェラーゼの３’末端での単一ＮｏｔＩ部位にサブクローン化した。クローン化配向を診断的切断および配列決定によって確認した。
トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を７０％〜８５％の密集度まで４８ウエル形式でポリ−Ｌ−リシン上で成長させ、下記のプラスミドとともにポリエチレンイミンを使用してトランスフェクションした：Ｐｓｉｃｈｅｃｋ２−３’ＵＴＲプラスミド、ｐＥＧＦＰプラスミドでのｐｒｅ−ｍｍｕ−ｍｉＲ−１８２過剰発現またはｐＥＧＦＰプラスミド単独（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。トランスフェクションの２４時間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼレポーター活性を以前の記載のようにアッセイした［Ｃｈｅｎ Ａ．他、Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（２００５）１９：４４１〜５８］。ウミシイタケルシフェラーゼの値を、（同じベクターから転写されるが、試験されている３’ＵＴＲによって影響されない）対照のホタルルシフェラーゼのレベルに対して正規化し、１条件あたり６回のウエル反復にわたって平均化した。
長期社会的敗北
マウスを、以前に記載されたような社会的敗北プロトコルに供した［Ｋｒｉｓｈｎａｎ Ｖ．他、Ｃｅｌｌ（２００７）１３１：３９１〜４０４］。簡単に記載すると、マウスを攻撃的ＩＣＲマウスのホームケージに入れ、これらのマウスは５分間にわたって物理的に触れ合った。この期間中に、ＩＣＲマウスは侵入者マウスを攻撃し、侵入者は従属的態度を示した。その後、穴の開いた透明なプレキシガラス仕切り板を動物の間に置き、マウスを、感覚的接触を許すために２４時間にわたって同じケージに留めた。その後、この手順を、その後の１０日のそれぞれについて、見慣れないＩＣＲマウスを用いて繰り返した。
縫線核の顕微解剖および血漿収集
脳試料を、脳を取り出し、アクリル脳マトリックス（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）に置いた後で、マウスの縫線核（ＲＮ）から採取した。スライス片を、指定の解剖学的マーカーに基づいて、標準的なカミソリ刃（ＧＥＭ）を使用して採取した。先を鈍くした１４Ｇ注射器を使用して、ＲＮ領域を、マトリックスから取り出された３ｍｍのスライス片から抜き取った。
ミクロＲＮＡの精製および定量的ＲＴ−ＰＣＲ発現分析
ｍＲＮＡ（ミクロＲＮＡを含む）を、ｍｉＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用して、選別されたニューロン、凍結された脳打ち抜き物および血漿から単離し、ｍｉＳｃｒｉｐｔ逆転写キットｍｉＲＮＡを使用して処理し、ｃＤＮＡを作製した。その後、ｃＤＮＡ試料を、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の指針に従って使用して、ＡＢ７５００サーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。それぞれのｍｉＲのための特異的プライマーを市販のユニバーサルプライマーと一緒に使用し、一方、Ｕ６のｓｎＲＮＡを内部対照として使用した。
ｍｉＲ１８２過剰発現ウイルスベクターのクローン化
プレ−ｍｉＲ−１８２を、制限酵素のＡｇｅＩ部位を加えるプライマーとともにマウスのゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅し、その後、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ウィスコンシン）に挿入した。ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙの配列決定、ならびに、ＡｇｅＩによるｐＧＥＭ−Ｔ ＥａｓｙおよびｐＥＧＦＰベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、マウンテンビュー、カリフォルニア）の両方の消化の後、未成熟ｍｉＲ−１８２配列をｐＥＧＦＰベクターに連結して、発現プラスミドｐＥＧＦＰ−ｍｉＲ−１８２を構築した。その後で、ｐＥＧＦＰ−ｍｉＲ−１８２を、ｐＣＳＣ−Ｅ／Ｓｙｎ−ｅＧＦＰプラスミドを同じ酵素で切断するのと並行してＢａｍＨＩおよびＢｓｒＧＩによって切断し、ｍｉＲ−１８２−ｅＧＦＰ配列をｐＣＳＣ−Ｅ／Ｓｙｎに連結して、ｐＣＳＣ−ｅＳＮＹ−ｐｒｅ−ｍｉＲ−１８２−ｅＧＦＰプラスミドを構築し、これを制限エンドヌクレアーゼ分析およびＤＮＡ配列決定によって確認した。
レンチウイルスベクターの作製
組換えレンチウイルスを、以前の記載のように［Ｎａｌｄｉｎｉ Ｌ他、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９６）９３：１１３８２〜８］、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における一過性トランスフェクションによって作製した。簡単に記載すると、感染性レンチウイルスをトランスフェクション後４８時間および７２時間で集め、０．４５μｍ細孔の酢酸セルロースフィルターでろ過し、超遠心分離によって濃縮した。
結果
現在に至るまで、ｍｉＲ−１８２は、主に癌関連の研究（例えば、ヒト肺腺癌細胞、神経膠腫、乳癌、膀胱癌、メラノーマおよびＤＮＡ修復など）において報告されていた。加えて、ｍｉＲ−１８２は、発達過程（例えば、内耳および網膜の発達など）に関与すること、Ｔリンパ球の活性化において免疫系に関与すること、また、狼瘡疾患に関与することが見出された。神経系においては、ｍｉＲ−１８２が、感覚器官特異的なラット後根神経節において、また、概日時計調整因子として暗示され、一方で、プレ−ｍｉＲ−１８２の遺伝子変化型の間における相関が大うつ病患者において見出された［Ｓａｕｓ Ｅ他、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ（２０１０）１９（２０）：４０１７〜２５］。加えて、ｍｉＲ−１８２が、立ち直りが速い行動から学習性無力行動までの雄ラットの前頭前皮質においてダウンレギュレーションされるとして他の１２個のｍｉＲの中に列挙された［Ｓｍａｌｈｅｉｓｅｒ ＮＲ他、Ｉｎｔ Ｊ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ、（２０１１）１〜１１］。
５ＨＴ ｍｉＲマイクロアレイ分析の一部として行われたＨｔｒ１ａ ３’ＵＴＲの生物情報学的分析では、ｍｉＲ−１８２によるこの遺伝子の起こり得る標的化が暗示された。したがって、本発明者らは、ルシフェラーゼアッセイを介したインビトロ試験を行い、これにより、ｍｉＲ−１８２によるＨｔｒ１ａ ３’ＵＴＲの強い抑制が明らかにされた（図８）。ｍｉＲ−１８２についての２つの保存されたシード一致配列がＨｔｒ１ａのマウス３’ＵＴＲに現れた。
調節研究では、対照と比較して、長期社会的敗北にさらされた成体雄マウスのＲＮにおけるｍｉＲ−１８２発現レベルのダウンレギュレーションの強い傾向が示された（図９）。このことは、うつ病様行動を誘導することが知られている環境刺激因子に対する分子応答におけるｍｉＲ−１８２の関与を示唆している。
ｍｉＲ−１８２についての標的化予測を２つのデータベースにおいてもたらすさらなる生物情報学分析では、正常な状態および病理学的な状態の両方におけるニューロン活性に関連づけられる遺伝子を含めて、潜在的な標的の長いリストが明らかにされた（図１０）。
ｍｉＲ−１８２を特異的なｍｉＲ標的相互作用の特定についてインビトロでさらに試験するために、また、正常な行動および病理学的な行動の調節におけるｍｉＲ−１８２の役割をインビボで明らかにするために、ｍｉＲ−１８２を操作するためのプラスミドおよびレンチウイルス系を開発した。ニューロン特異的過剰発現のレンチウイルスを製造し（図１１Ａ）、ニューロン細胞株Ｎ２ａにおいてインビトロ試験した。これらの結果により、増大したｍｉＲ−１８２レベルが、対照と比較して、ｍｉＲ−１８２過剰発現レンチウイルスを感染させた細胞において明らかにされた（図１１Ｂ）。ｍｉＡｒｒｅｓｔと名づけられた、ｍｉＲ−１８２に特異的なノックダウンプラスミド配列（Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ、ロックビル、メリーランド、米国、図１１Ｃ）を購入し、ウイルス構築物にサブクローン化した（図１１Ｃ）。これらの系が、細胞培養において、また、成体マウス脳への部位特異的注入によって試験される。
ｍｉＲ−１８２についてのヌルマウスが、網膜の発達におけるｍｉＲの役割を調査するために開発される。近年、本発明者らは、この系統のための育種用雌雄を得た。コロニーが生じると、ｍｉＲ−１８２ＫＯおよびそれらのＷＴ型の同腹子が行動的および生理学的に表現型分類されている。
実施例５Ｂ
急性ストレスによるｍｉＲ１８２発現レベルの調節
材料および実験手順
実施例５Ａ（本明細書中上記）において記載される通り。
結果
ｍｉＲ１８２レベルに対する急性ストレスの影響を調べた。図２６に例示されるように、急性不動ストレスは、低下したｍｉＲ１８２発現レベルをストレス誘導後２４時間でマウスの縫線核（ＲＮ）において引き起こした（Ｐ＜０．０１）。ｍｉＲ１８２は、低下した発現レベルを急性ストレスの後および慢性的ストレスの後の両方で縫線核において明らかにした。このことは、ｍｉＲ１８２が、５−ＨＴレベルをシナプスにおいて調整するその標的遺伝子Ｈｔｒ１ａにおそらくは影響することによって、ストレスに対する分子応答の縫線核における調整においてある一定の役割を有することを示唆している。
ｍｉＲ１８２の予測された標的遺伝子についてのｍｉＲ−標的相互作用アッセイ
ルシフェラーゼアッセイを使用して、ｍｉＲ１８２の１１個の予測された標的遺伝子（これらは広範囲の生物情報学の後で選定された）を調べた（図２７Ａ）。標的遺伝子の３’ＵＴＲをインビトロ試験して、ｍｉＲ１８２が、コンジュゲート化されたレポーター遺伝子ルシフェラーゼの活性によって測定されるような抑制効果を有するかを調べた。試験された１１個の遺伝子のうち、３つの遺伝子、すなわち、Ｄｓｃａｍ（ダウン症候群細胞接着分子）、Ｌ１ｃａｍ（細胞接着分子Ｌ１）およびＴｓｎａｘ（トランスリン会合タンパク質Ｘ）により、ルシフェラーゼアッセイの場合のようにｍｉＲ１８２による抑制効果が明らかにされた（図２７Ａ）。ｍｉＲ１８２の上記標的遺伝子の３’ＵＴＲを試験したとき、ｍｉＲ１８２についての保存されたシード一致配列が、Ｔｓｎａｘ、Ｌ１ｃａｍおよびＤｓｃａｍにおいて両方で認められ、このことは、このｍｉＲ−標的相互作用が機能的役割を有することを示唆した（データは示されず）。
次に、これら３つの遺伝子に対するｍｉＲ１８２の直接的な抑制効果を確認した。したがって、３’ＵＴＲを、ｍｉＲ１８２のシード一致配列を除くために変異させ、通常の３’ＵＴＲをルシフェラーゼアッセイによってインビトロで変異型３’ＵＴＲと比較した。Ｌ１ｃａｍの３’ＵＴＲに対するｍｉＲ１８２の抑制効果が、そのシード一致配列を変異させたときにはなくなり（図２７Ｂ）、また、同様に、Ｔｓｎａｘに対するｍｉＲ１８２の影響が、変異させた３’ＵＴＲではなくなった（図２７Ｃ）。このことは、ｍｉＲ１８２がこの遺伝子を直接的に標的としたことを示している。変異させた３’ＵＴＲを用いるＤｓｃａｍおよびＨｔｒ１ａについての同様な確認が行われる。
ｍｉＲ１８２を欠いているマウスモデルが、ｍｉＲ１８２とその標的遺伝子との間での相互作用をインビボで研究するために使用される。本発明者らは、ｍｉＲ１８２ＫＯマウスの行動表現型を、社会的行動、学習および記憶、ならびに、統合失調症様行動についての試験において試験中である。
実施例６
成体マウスの血漿および脳におけるｍｉＲ１３５レベルの調節
材料および実験手順
ｍｉＲ１３５過剰発現ウイルスベクターおよびｍｉＲ１３５ＫＤウイルスベクターのクローン化
ｍｉＲ１３５ｂ ＫＤプラスミドのｐＥＺＸ−Ｈ１−ｍｉＲ１３５ＫＤ−ＣＭＶ−ｍＣｈｅｒｒｙおよび対照のｐＥＺＸ−Ｈ１−対照ＫＤ−ＣＭＶ−ｍＣｈｅｒｒｙをＧｅｎｅＣｏｐｅｉａ（米国）から購入した。Ｈ１プロモーターおよびＫＤ配列を、隣接ＮｈｅＩ部位を有するプライマーを使用して増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙに連結した。ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙを配列決定し、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙおよびｐ１５６−ｐＲＲＬ−ＣＭＶ−ＧＦＰの両方をＮｈｅＩ部位により消化した後、Ｈ１−ＫＤ ｍｉＲと、ニック導入のｐ１５６とを連結して、ｐ１５６−ｐＲＲＬ−Ｈ１−ｍｉＲ１３５ｂＫＤ−ＣＭＶ−ＧＦＰおよびｐ１５６−ｐＲＲＬ−Ｈ１−対照ＫＤ−ＣＭＶ−ＧＦＰを作製した。
行動評価
すべての行動評価を、試験部屋に各試験の前の２時間慣らした後の暗期の期間中に行った。
明暗移動試験
明暗移動試験装置および実験条件は以前に記載された通りであった。簡単に記載すると、装置は、マウスが試験開始時に入れられた暗い覆い付きチャンバーと、マウスが５分の試験の期間中に自由に移ることができる明るく照明されたチャンバーとの２つのチャンバーを含んでいた。明るい区画で過ごした時間、明所で移動した距離、明るいチャンバーを訪れるまでの待ち時間、および、明暗移動の回数を、ビデオ録画追跡システム（ＶｉｄｅｏＭｏｔ２；ＴＳＥ Ｓｙｓｔｅｍｓ、バドハンブルグ、ドイツ）を用いて定量化した。
オープンフィールド試験
オープンフィールド試験を、マウスが１０分の試験のために入れられる１２０ｌｕｘで照明された５０×５０×２２ｃｍの白色箱において行った。中心で過ごした時間、中心における訪問回数、中心を訪れるまでの待ち時間、後ろ足立ち回数、および、移動した総距離を、ビデオ録画追跡システム（ＶｉｄｅｏＭｏｔ２；ＴＳＥ Ｓｙｓｔｅｍｓ、バドハンブルグ、ドイツ）を使用して定量化した。
高架式十字迷路試験
この試験装置は十字形状を有し、２つの障壁と、２つの開放されている非常に低い照明された（６ｌｕｘ）アームとを含んでいた。進入回数、移動した距離、および、開放アームで過ごした時間が、５分の試験の期間中、ビデオ録画追跡システム（ＶｉｄｅｏＭｏｔ２；ＴＳＥ Ｓｙｓｔｅｍｓ、バドハンブルグ、ドイツ）を使用して自動的にスコア化された。
結果
ｍｉＲ１３５レベルに対する抗うつ剤投与の影響を、ＲＮからセロトニン作動性ニューロンによって神経支配され、かつ、気分調節に関与することが知られている脳部位、すなわち、扁桃体（ＡＭＹ）および前頭前皮質（ＰＦＣ）において試験した。ＡＭＹにおいて、ｍｉＲ１３５の両方の変化体が急性セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）およびノルアドレナリン再取り込み阻害剤（ＮＲＩ）によってアップレギュレーションされたが、これらの薬物の長期投与による場合にはアップレギュレーションされなかった（ｍｉＲ１３５ａについて、ＳＳＲＩについてはＰ＝０．０００１、ＮＲＩについてはｐ＝０．００３、図２８Ａ；ｍｉＲ−１３５ｂについて、ＳＳＲＩについてはｐ＝０．０００１、ＮＲＩについてはｐ＝０．００３、図２８Ｂ）。ＰＦＣにおいて、ｍｉＲ１３５ｂのレベルが急性でのＳＳＲＩおよびＮＲＩによってアップレギュレーションされ（ＳＳＲＩについてはＰ＝０．０１８３、ＮＲＩについてはｐ＝０．００１３、図２８ｃ）、しかし、ｍｉＲ１３５ａのレベルは有意に変化しなかった（図２８Ｄ）。加えて、長期ＳＳＲＩはｍｉＲ１３５ａおよびｍｉＲ１３５ｂの低下したレベルをＰＦＣにおいて引き起こした（ｍｉＲ１３５ａについてはＰ＝０．０２４１、図２８Ｃ；ｍｉＲ１３５ｂについてはＰ＝０．００６７、図２８Ｄ）。
加えて、循環系におけるｍｉＲ１３５レベルを社会的敗北パラダイムの後で試験した。ｍｉＲ１３５ａのレベル（Ｐ＝０．００８９；図２９Ａ）およびｍｉＲ１３５ｂのレベル（Ｐ＝０．００３３；図２９Ｂ）が、リアルタイムＰＣＲで測定される場合、対照マウスと比較して、長期社会的敗北にさらされたマウスの血漿において増大した。したがって、今回の結果は、血漿におけるｍｉＲ１３５が、うつ病様行動をマウスにおいて誘導することが知られている慢性的ストレスの後でアップレギュレーションされ、抗うつ剤の投与によって頑強に低下したことを明らかにした。これらの発見は、血漿におけるｍｉＲ１３５レベルをセロトニン作動性関連のうつ病状態のためのバイオマーカーとして示唆している。
実施例７
ｍｉＲ１３５ノックダウン系の確立；クローン化、レンチウイルス作製、ならびに、インビトロおよびインビボでの検証
材料および実験手順
ｍｉＲ１３５ＫＤウイルスベクターのクローン化
ｍｉＲ１３５ｂ ＫＤプラスミドのｐＥＺＸ−Ｈ１−ｍｉＲ１３５ＫＤ−ＣＭＶ−ｍＣｈｅｒｒｙおよび対照のｐＥＺＸ−Ｈ１−対照ＫＤ−ＣＭＶ−ｍＣｈｅｒｒｙをＧｅｎｅＣｏｐｅｉａ（米国）から購入した。Ｈ１プロモーターおよびＫＤ配列を、隣接ＮｈｅＩ部位を有するプライマーを使用して増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙに連結した。ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙを配列決定し、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙおよびｐ１５６−ｐＲＲＬ−ＣＭＶ−ＧＦＰの両方をＮｈｅＩ部位により消化した後、Ｈ１−ＫＤ ｍｉＲと、ニック導入のｐ１５６とを連結して、ｐ１５６−ｐＲＲＬ−Ｈ１−ｍｉＲ１３５ｂＫＤ−ＣＭＶ−ＧＦＰおよびｐ１５６−ｐＲＲＬ−Ｈ１−対照ＫＤ−ＣＭＶ−ＧＦＰを作製した。
結果
マウスの５−ＨＴ関連行動に対するＲＮにおける低下したｍｉＲ１３５レベルの影響を評価するために、プラスミドに基づくｍｉＲ１３５ｂ阻害剤を利用し、その効率をルシフェラーゼアッセイで試験した。このアッセイでは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が、ｍｉＲ１３５ＯＥプラスミド、ｍｉＲ１３５ＫＤプラスミドおよび３’ＵＴＲプラスミドにより共トランスフェクションされ、ｍｉＲ１３５ｂＫＤプラスミドが、Ｓｌｃ６ａ４およびＨｔｒ１ａの３’ＵＴＲに対するｍｉＲ１３５の抑制効果を阻止し得るかが試験された。Ｈｔｒ１ａの３’ＵＴＲのｍｉＲ１３５ｂ抑制効果がｍｉＲ１３５ＫＤプラスミドによって阻止された（図３０Ａ）。同様に、Ｓｌａｃ６ａ４の３’ＵＴＲに対するｍｉＲ１３５ｂの影響がｍｉＲ１３５ＫＤによって阻止された（図３０Ｂ）。これらの結果は、ｍｉＲ１３５ＫＤプラスミドが実際にｍｉＲ１３５の生物学的活性を阻止することを示している。
ｍｉＲ１３５ＫＤ配列および対照配列をウイルスベクターにサブクローン化し（図３０Ｃ）、異なるノックダウン（ＫＤ）配列を発現するレンチウイルスを作製した。脳組織に感染するレンチウイルスの能力を試験するために、マウスのＲＮにレンチウイルスのいずれか１つを感染させた。実際、感染はＧＦＰの発現を誘発し（図３０Ｄ〜図３０Ｅ）、これにより、ｍｉＲ１３５ｂＫＤレンチウイルスは脳組織に感染し得ることが明らかにされた。
実施例８
成体マウスのＲＮにおけるｍｉＲ１３５ノックダウンの行動的影響
材料および実験手順
行動評価
マウスを、実施例６（上記）で記載されるような不安およびうつ病様行動についての試験を使用することによって行動的に特徴づけした。
結果
ｍｉＲ１３５ＫＤレンチウイルスのインビトロおよびインビボ検証の後で、ｍｉＲ１３５ＫＤレンチウイルスを使用して、ｍｉＲ１３５のレベルをＲＮにおいて操作し、また、マウスの行動に対するそれらの影響を試験した。成体マウスに、ｍｉＲ１３５ＫＤレンチウイルスまたはＫＤ対照レンチウイルスのどちらかをＲＮに対して注入し、回復期間の後、マウスを不安およびうつ病様行動について試験した。ｍｉＲ１３５は５−ＨＴの負の調節因子を抑制するので、本発明者らは、ｍｉＲ１３５ＫＤがシナプスにおける５−ＨＴレベルを低下させ、それによって、増大した不安およびうつ病様行動を引き起こすことを予想した。
オープンフィールド試験において、差が群間に何ら認められず（図３１Ａ）、しかしながら、高架式十字迷路試験では、ｍｉＲ１３５ＫＤマウスが、開放アームにおいて時間をあまり費やさない傾向（Ｐ＝０．０６４４）および開放アームにおいてあまり訪問しない傾向（Ｐ＝０．０５７２）を明らかにすることによって（図３１Ｂ）、より大きい不安様行動を明らかにした。加えて、ｍｉＲ１３５ＫＤマウスは、開放アームにおいて有意に少ない距離を歩行し（Ｐ＝０．０４３３）、開放アームにおけるより長い訪問傾向を有した（Ｐ＝０．０１２４）（図３１Ｂ）。同様に、基礎的ストレス条件のもとで行われた明暗試験において、ｍｉＲ１３５ＫＤマウスは、明所において時間をあまり過ごさないこと（Ｐ＝０．０４５４、図３１Ｃ）、明るいチャンバーにおいてあまり訪問しないこと（Ｐ＝０．０１０７、図３１Ｄ）、および、明るいチャンバーにおいてより小さい距離を歩行すること（Ｐ＝０．０４０２ｓ、図３１Ｅ）によって、対照と比較して、著しい増大した不安様行動を明らかにした。これらの結果は、急性ストレス後４０分および２４時間でのｍｉＲ１３５レベルにおける低下を例示した（図３０Ａ〜図３０Ｂ）。したがって、現在の理論は、ストレスを受けたｍｉＲ１３５ＫＤマウスは、急性ストレスの後で試験されたとき、不安様行動がそれらの対照と異ならないであろうということであった。これは、対照マウスはまた、ストレスに起因する低下したｍｉＲ１３５レベルを有するであろうからである。実際、明暗移動試験で再試験されたときの群間には、どのような差も、急性ストレス後４０分または２４時間で試験されたときの両方でパラメーターのいずれにおいても認められなかった（図３１Ｃ〜図３１Ｅ）。
ｍｉＲ１３５ＫＤのうつ病様行動を、基礎的条件下および薬理学的操作後の両方で試験した。ｍｉＲ１３５のレベルは、ＳＳＲＩ投与後、ＲＮにおいて増大することが示されたので（図３１Ｅ）、推測は、ｍｉＲ１３５レベルの低下は、ＳＳＲＩに対する低下した応答をもたらすかもしれないということであった。基礎的レベルおよびＳＳＲＩ投与後の両方で行われた尾懸垂試験では、ｍｉＲ１３５ｂ ＫＤマウスと、対照ＫＤマウスとの間には、不動時間において差が無く（図３１Ｆ）、ＳＳＲＩ処置に起因する不動時間の予想された減少が観測された（Ｐ＜０．０００８）。しかしながら、強制水泳試験では、ＳＳＲＩ注射についての主影響に加えて（Ｐ＜０．０００１）、ＳＳＲＩが注射されたｍｉＲ１３５ＫＤマウスの方が、対照ＫＤマウスと比較して、試験の最後の２分において不動であった（Ｐ＝０．０１４１、５分；Ｐ＝０．０４０４、６分；図３１Ｇ）。このことは、ＳＳＲＩの抗うつ効果が、ｍｉＲ１３５のレベルをＲＮにおいて低下させることによって弱まることを示唆している。この結果は、ｍｉＲ１３５が、ＳＳＲＩによって引き起こされる行動変化をもたらす内在的変化の一部であることを暗示している。
実施例９
５−ＨＴニューロンにおけるｍｉＲ１３５の過剰発現
材料および実験手順
ｍｉＲ１３５ａを５−ＨＴニューロンにおいて過剰発現するマウスを、ｍｉＲ１３５およびその標的遺伝子の発現レベルと行動的なものの両方で、それらの同腹子対照に対して比較した。
結果
ｍｉＲ１３５のレベルを特異的にマウスのＲＮにおける５−ＨＴニューロンにおいて操作することの影響を不安およびうつ病様行動について試験した。その目的のために、遺伝子系を、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を使用して開発した。具体的には、５−ＨＴ特異性を、Ｃｒｅリコンビナーゼを５−ＨＴ ＲＮ陽性ニューロンにおいて特異的に発現するｅＰＥＴ Ｃｒｅマウスを使用して得、ｍｉＲ１３５の過剰発現を、５−ＨＴ特異的Ｃｒｅ系統（ｅＰＥＴ Ｃｒｅ）を、ｍｉＲ１３５ａについての条件的過剰発現を有するトランスジェニックマウス系統と交雑することによって行った（図３２）。
ｍｉＲ１３５を５−ＨＴニューロンにおいて特異的に過剰発現するマウス（ｍｉＲ１３５ＯＥ）のＲＮにおけるｍｉＲ１３５発現レベルを、ｍｉＲ１３５についてリアルタイムＰＣＲによって試験し、ｍｉＲ１３５の条件的過剰発現対立遺伝子について陽性であるが、ｅＰｅｔ ＣＲＥについて陰性である対照マウスと比較した。ｍｉＲ１３５ＯＥマウスは、対照マウスと比較して、２倍近い過剰発現を明らかにした（図３３Ａ；Ｐ＜０．０５）。ｍｉＲ１３５の過剰発現レベルは、ＳＳＲＩ投与後のマウスのＲＮにおいて測定されるレベルと類似していた。このことは、このマウス系統が、ｍｉＲ１３５の抗うつ特徴を研究するための良好なモデルであったことを示唆している。加えて、ｍｉＲ１３５標的遺伝子のｍＲＮＡ、すなわち、Ｓｌｃ６ａ４（図３３Ｂ；Ｐ＜０．０５）およびＨｔｒ１ａ（図３３Ｃ；Ｐ＜０．１）が、対照と比較して、ｍｉＲ１３５ＯＥマウスのＲＮにおいてダウンレギュレーションされ、このことにより、ｍｉＲ１３５またはその標的遺伝子によるインビボ抑制が明らかにされた。
ｍｉＲ１３５の過剰発現を特異的に５−ＨＴニューロンにおいて試験するために、ｍｉＲ１３５ＯＥマウスおよびそれらの同腹子対照を長期社会的敗北パラダイム（うつ病および不安様行動を誘導することが知られている手順）に供し、続いて、不安およびうつ病様行動について試験した。
ｍｉＲ１３５ＯＥマウスは、対照の同腹子と比較して、増大した不安様行動を社会的敗北の後で明らかにした。オープンフィールドでは、増大した不安についての傾向が、ｍｉＲ１３５ＯＥマウスの、中心への時間および中心訪問回数において観測された（Ｐ＜０．１、図３４Ａ）。一方、明暗移動試験では、ｍｉＲ１３５ＯＥマウスはより多くの時間を明所において過ごし（Ｐ＜０．０５、図３４Ｂ）、明るいチャンバーにおいてあまり時間を過ごさなかった（Ｐ＜０．０１、図３４Ｂ）。類似する結果が高架式十字迷路において観測され（Ｐ＜０．０５、図３４Ｂ）、一方、ｍｉＲ１３４ＯＥマウスは、より多くの時間を開放アームにおいて過ごし（Ｐ＜０．０５、図３４Ｃ）、より長い距離を開放アームにおいて移動した（Ｐ＜０．０５、図３４Ｃ）。
社会的敗北後のｍｉＲ１３５ＯＥマウスのうつ病様行動が、対照同腹子のうつ病様行動よりも少なかった。対照と比較して、ｍｉＲ１３５ＯＥマウスの減少した不動時間への傾向が、強制水泳試験における著しく減少した不動時間（Ｐ＜０．０５、図３４Ｅ）と一緒に、尾懸垂試験において観測された（Ｐ＜０．１、図３４Ｄ）。
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。

Claims (14)

  1. セロトニンレベルの上昇が治療上有益である医学的状態を処置する必要のあるヒト対象 において、前記セロトニンレベルの上昇が治療上有益である医学的状態を処置するための、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−１３５の前駆体、または前記ｍｉＲ−１３５もしくは前記ｍｉＲ−１３５の前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドを有効成分として含む医薬組成物。
  2. 前記ｍｉＲ−１３５または前記ｍｉＲ−１３５の前駆体をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが核酸構築物中に含まれており、前記外因性ポリヌクレオチドが、シス作用調節要素の転写制御下にある、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 前記シス作用調節要素は神経膠細胞中で特異的に活性である、請求項２に記載の医薬組成物。
  4. 前記ｍｉＲ−１３５は、配列番号６１〜６２に示される通りである、請求項１に記載の医薬組成物。
  5. 前記ｍｉＲ−１３５前駆体は、配列番号５８〜６０に示される通りである、請求項１に 記載の医薬組成物。
  6. 前記ｍｉＲ−１３５前駆体は、修飾された骨格、修飾されたヌクレオシド間連結、および修飾された塩基からなる群から選択される修飾を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  7. 前記修飾された骨格は、ホスホロチオアート；キラルなホスホロチオアート；ホスホロジチオアート；ホスホトリエステル；アミノアルキルホスホトリエステル；メチルホスホナート；アルキルホスホナート；キラルなホスホナート；ホスフィナート；ホスホルアミダート；アミノアルキルホスホルアミダート；チオノホスホルアミダート；チオノアルキルホスホナート；チオノアルキルホスホトリエステル；ボラノホスフェート、ホスホジエステル、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、および２’−Ｏ−メトキシエチルからなる群から選択される修飾を含む、請求項６に記載の医薬組成物。
  8. 前記ｍｉＲ−１３５は、糖およびヌクレオシド間連結の両方に修飾を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  9. 前記医学的状態は、うつ病、不安、ストレス、疲労、損なわれた認知機能、パニック発作、脅迫行動、嗜癖、社会恐怖、睡眠障害、食品関連障害、成長障害および生殖障害からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
  10. 前記医学的状態は気分障害である、請求項１に記載の医薬組成物。
  11. ｍｉＲ−１３５またはｍｉＲ−１３５の前駆体をコードする核酸配列を含む核酸構築物と、医薬的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物であって、前記核酸配列が、神経膠細胞中で特異的に活性であるシス作用調節要素の転写制御下にあり、前記医薬組成物が、セロトニンレベルの上昇が治療上有益である医学的状態を処置する必要のあるヒ ト対象において、前記セロトニンレベルの上昇が治療上有益である医学的状態を処置するためのものである、医薬組成物。
  12. 前記ｍｉＲ−１３５は、配列番号６１〜６２に示される通りである、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 前記ｍｉＲ−１３５前駆体は、配列番号５８〜６０に示される通りである、請求項１１ に記載の医薬組成物。
  14. 前記ｍｉＲ−１３５は、糖およびヌクレオシド間連結の両方に修飾を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
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