DE69115702T2

DE69115702T2 - Verbindungen und verfahren zur unterdrückung der genexpression

Info

Publication number: DE69115702T2
Application number: DE69115702T
Authority: DE
Inventors: Paul Cavanaugh; Prasad Chaturvedula; Daniel Delecki; Frederick Hausheer; Patricia Moskwa; Fred Oakes; Alexander Weis
Original assignee: Sterling Winthrop Inc
Current assignee: Sanofi SA
Priority date: 1990-08-03
Filing date: 1991-08-02
Publication date: 1996-06-13
Anticipated expiration: 2011-08-03
Also published as: FI930455A; IL113519A; HUT67834A; PT98562B; GR3018881T3; EP0541722B1; IL113519A0; US5677439A; ATE131827T1; AU692532B2; KR930702372A; DE69115702D1; HU211668A9; IL99066A; TW222641B; IL121421A0; PT98562A; KR100211552B1; BR9106729A; FI930455A0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren zur Unterdruckung der Genexpression. Es sind hierin nucleasebeständige Oligonucleoside beschrieben, die Sequenzen von etwa 6 bis etwa 200 Basen mit dreiatomigen Internucleosidbindungen und Oligonucleotidsequenzen von etwa 9 bis etwa 200 Basen mit einem Diol an einem oder beiden Enden umfassen.

Hintergrund der Erfindung

Eine Antisinn-Verbindung ist eine Verbindung, die an einer Nucleotidsequenz in einer Nucleinsäure, RNA oder DNA bindet oder damit hybridisiert, um die Funktion oder Synthese der Nucleinsäure zu unterdrücken. Aufgrund ihrer Fähigkeit, sowohl mit RNA als auch DNA zu hybridisieren, können Antisinn-Verbindungen die Genexpression auf der Ebene der Transkription, der RNA-Prozessierung oder -Translation stören.
Antisinn-Moleküle können entworfen und synthetisiert werden, um die Transkription spezifischer Gene zu mRNA zu verhindern, indem sie mit genomischer DNA hybridisieren und direkt oder indirekt die Wirkung der RNA-Polymerase unterdrücken. Ein Vorteil, auf DNA abzuzielen, ist der, daß lediglich geringe Mengen der Antisinn-Verbindungen erforderlich sind, um einen therapeutischen Effekt zu erreichen. Alternativ können Antisinn-Verbindungen entworfen und synthetisiert werden, damit sie mit RNA hybridisieren, um post-transkriptionale Modifikationsmechanismen (RNA-Prozessierung) oder Proteinsynthesemechanismen (Translation) zu unterdrucken. Beispielhafte Ziel-RNAS sind messenger-RNA (mRNA), transfer-RNA (tRNA), ribosomale RNA (rRNA) und dergleichen. Beispiele der Prozessierungs- und Translationsmechanismen schließen das Spleißen von prä-mRNA zur Entfernung von Introns, das Capping des 5'-Terminus von mRNA, die Hybridisierungshemmung und die Nuclease-vermittelte mRNA-Hydrolyse ein.
Derzeit wird jedoch die Entwicklung von praktischen wissenschaftlichen und therapeutischen Anwendungen der Antisinn-Technologien durch eine Vielzahl von technischen Problemen behindert; Klausner, A., Biotechnology, 8:303-304 (1990). Synthetische Antisinn-Moleküle sind gegenüber einem schnellen Abbau durch Nucleasen, die sich in den Zielzellen befinden, empfindlich. Zum Beispiele werden die Oligonucleosidsequenzen von Antisinn-DNA oder -RNA durch Exonucleasen zerstört, die entweder am 5'- oder 3'-Terminus der Nucleinsäure wirken. Darüberhinaus können Endonucleasen die DNA oder RNA an innenliegenden Phosphodiesterbindungen zwischen einzelnen Nucleosiden spalten. Als ein Ergebnis einer solchen Spaltung ist die wirksame Halbwertszeit von verabreichten Antisinn-Verbindungen sehr kurz, was die Anwendung von großen, häufig verabreichten Dosierungen notwendig macht.
Ein weiteres Problem sind die äußerst hohen Kosten der Herstellung von Antisinn-DNA oder - RNA bei der Verwendung von verfügbaren halbautomatischen DNA-Synthesizern. Kürzlich wurde abgeschätzt, daß die Kosten der Herstellung eines Gramms einer Antisinn-DNA etwa $ 100.000 beträgt; Armstrong, L., Business Week, 5. März, 1990, Seite 89.
Ein weiteres Problem betrifft die Zuführung von Antisinn-Mitteln zu den gewünschten Zielen innerhalb des Körpers und der Zelle. Auf die genomische DNA abzielende Antisinn-Mittel müssen in den Kern eintreten (d.h., die Mittel müssen das Plasma und die Kernmembran durchdringen). Das Erfordernis nach der Erhöhung der Membranpermeabilität (erhöhte Hydrophobizität) muß allerdings gegen die Erfordernis wäßriger Löslichkeit (erhöhte Hydrophilizität) in Körperflüssigkeitsbereichen, wie dem Plasma und dem Zellcytosol, abgewogen werden.
Ein weiteres Problem betrifft die Stabilität von Antisinn-Mitteln, ob sie nun frei innerhalb des Körpers sind oder mit den Ziel-Nucleosiden hybridisiert sind. Oligonucleotidsequenzen, wie Antisinn-DNA, sind für eine sterische Rekonfiguration um chirale Phosphorzentren empfindlich.
Das Gen-Targeting durch Antisinn-Mittel ist unvermeidlicherweise der nächste Schritt bei der Therapie des Menschen. Armstrong, s.o., 88. Die erfolgreiche Anwendung der Antisinn-Technologie bei der Behandlung von Krankheiten macht es allerdings erforderlich, zu den oben dargestellten Problemen Lösungen zu finden.
Ein Weg zur Herstellung von Antisinn-Verbindungen, welche stabil, nucleasebeständig, in der Herstellung günstig sind und dem Körper zugeführt und mit Nucleinsäure-Zielen innerhalb des gesamten Körpers hybridisiert werden können, ist die Synthese von Oligonucleosidsequenzen, die Modifikationen in der normalen Phosphat-Zucker-Grundgerüststruktur aufweisen.
Allgemein wurden zwei Typen von Oligonucleosidsequenzen mit modifizierten Grundgerüsten berichtet. Der erste Typ schließt Modifikationen an der normalen Internucleosid-Phosphodiester- Bindung ein. Der zweite Typ schließt den Austausch der Phosphodiesterbindung durch Nicht- Phosphat-Internucleosid-Bindungen ein; Uhlmann, E. und Peyman, A., Chemical Reviews, (9(4):544-584 (1990).
Modifizierte Phosphodiesterbindungen, von denen bisher berichtet worden ist, sind Phosphorthioate, Alkylphosphotriester, Methylphosphonate und Alkylphosphoramidate.
Phosphorthioat-modifizierte Phosphodiesterbindungen werden Phosphodiesterbindungen genannt, in denen ein oder mehrere der überbrückenden Sauerstoffatome durch Schwefel ersetzt sind. Solche Bindungen sind allerdings nicht zur Verwendung in Antisinn-Verbindungen geeignet. Der Erhalt des chiralen Phosphorzentrums führt zu einer sterischen Variation der Monothioate. Ferner mangelt es sowohl den Mono- als auch den Dithioaten an sequenzspezifischer Hybridisierung, und beide werden schnell aus dem Plasma abgeführt. Die hohe Affinität von Phosphorthioaten gegenüber Glas und Kunststoff macht die Synthese dieser Verbindungen ebenfalls schwierig und ineffizient.
Es wurden Methyl- und Ethylphosphotriester hergestellt, indem Phosphodiester-verknüpfte Oligonucleoside mit wasserfreiem Methanol oder Ethanol umgesetzt wurden; Miller, P.S. et al., J Am. Chem. Soc., 93:6657-6665 (1971).
Die Triesterbindung in Oligodesoxyribonucleotidethylphosphotriestern ist unter normalen physiologischen pH-Bedingungen stabil, obgleich sie mittels einer starken Säure oder Base hydrolysiert werden kann. Methylphosphotriester sind weniger stabil als Ethyl- und andere Alkylphosphotriester bei neutralem pH, bedingt durch die Möglichkeit des nucleophilen Austausches der Triestermethylgruppe durch Lösungsmittel. Oligodesoxyribonucleotidethylphosphotriester scheinen gegenüber der Hydrolyse durch Exonucleasen vollständig beständig zu sein und nicht durch Nucleasen oder Esterasen, die in fötalem Rinderserum oder menschlichem Blutserum gefünden werden, hydrolysiert zu werden; Uhlmann, s.o.
Die Methylphosphonate besitzen mehrere signifikante Mängel bezüglich des therapeutischen Potentials, was die schlechte Wasserlöslichkeit, chirale Phosphorzentren, das Unvermögen der Regulierung der stereoselektiven Synthese in hoher Ausbeute, die schnelle Plasma-Clearance und die Ausscheidung im Ham einschließt.
Oligodesoxyribonucleosidphosphoramidate besitzen Internucleosidbindungen mit Stickstoff-Phosphor-Bindungen. Diese Nucleinsäureanaloga können aus Phosphoramidit-Zwischenprodukten oder durch die Oxidation von H-Phosphonat-Zwischenprodukten in Gegenwart eines primären oder sekundären Amins hergestellt werden. Die Herstellung der H-Phosphonatanaloga und die Oxidationsreaktion können leicht in einem handelsüblichen DNA-Synthesizer durchgeführt werden.
Eine Vielzahl von nichtionischen Oligonucleosidsequenzen mit Nicht-Phosphat-Internucleosidbindungen, wie Carbonat-, Acetat-, Carbamat- und Dialkyl- oder Diarylsilyl-Derivaten, sind synthetisiert und berichtet worden.
Obgleich die Carbonatbindung gegenüber der Hydrolyse durch Säure beständig ist, wird sie ziem lich leicht durch eine Base gespalten, und somit sind spezielle Vorkehrungen für die Entfernung der Schutzgruppen am Ende der Synthese erforderlich. Obgleich stabile Doppelstränge zwischen Poly(dA)-Analoga mit Carboxymethyl-Internucleotidbindungen und Poly(U)-Analoga festgestellt wurden, sind andere Basen nicht untersucht worden. Somit ist nicht bekannt, ob die Genauigkeit der Doppelstrangbildung bei anderen Basen durch die Carbonatbindung gestört wird.
Es wird berichtet, daß Internucleosidcarbamate stärker wasserlöslich als andere Internucleosidbrücken sind. Allerdings ist die Nützlichkeit der Carbannatbindungen beschränkt, da Thymincarbamate keine Hybride mit komplementärer DNA bilden, wohingegen Cytosincarbamate nicht an Guaninoligomere hybridisieren.
Die Carbamatbindung ist wie die Carbonatbindung unter physiologischen Bedingungen stabil. Anders als die Carbonate ist die Carbamatbindung allerdings gegenüber der Hydrolyse durch Basen stabil, eine Eigenschaft, die die Synthese von Oligomeren, welche diese Bindung enthalten, vereinfacht. Die Carbamatbindung ist gegenüber der Hydrolyse durch Nucleasen beständig.
Wie die Carbonat- und Acetatbindungen ähnelt die Carbamatbindung nicht der Form der Phosphodiester-Internucleotidbindung. Allerdings lassen Molekülmodelle vermuten, daß die Bindung dem Oligomer ermöglichen sollte, Konformationen einzunehmen, die es ihm erlauben, mit komplementären Nucleinsäuren durch Wasserstoffbrücken gebundene Komplexe zu bilden. Es gibt in Konflikt zueinander stehende Berichte über die Stabilität von Doppelsträngen, die durch Carbamatoligomere und komplementäre Nucleinsäuren gebildet wurden. Ein Carbamat-verknüpftes Oligomer mit sechs Thymidineinheiten bildet keine Komplexe mit A(pA)&sub5; oder dA(pA)&sub5;. Andererseits bildet ein Carbamat-verknüpftes Oligomer mit sechs Desoxycytosineinheiten stabile Komplexe mit d-(pG)&sub6; und Poly(dG).
Die Internucleosidbindung von Dialkyl- oder Diphenylsilyl-Oligomeranaloga ähnelt der tetraedrischen Geometrie der normalen Phosphodiesternucleotidbindung in starkem Maße. Die Oligomere werden in Lösung hergestellt, indem ein geeignet geschütztes Nucleosid-3'-O-dialkyl- oder Diphenylsilylchlorid oder Trifluormethansulfonylderivat mit einem 3'-geschützten Nucleosid in wasserfreiem Pyridin umgesetzt wird. Das erstere kann hergestellt werden, indem ein 5'-O-Tritylnucleosid mit Dialkyl- oder Diphenyldichlorsilan oder mit dem Bis(trifiuormethansulfonyl)diisopropylsilan umgesetzt wird.
Da die Dialkyl- und Diphenylsilylbindungen gegenüber der Hydrolyse durch Säure empfindlich sind, muß bei der Wahl der Schutzgruppen für die Synthese Vorsicht walten gelassen werden. Nueleosiddimere und -hexamere mit Siloxan-Internucleosidbindungen und ein Verfahren zur Synthese solcher Polymere wurden von Ogilvie und Cormier berichtet; siehe z.B. Ogilvie, K.K. und Cormier, J.F., Tetrahedron Letters, 26(35):4159-4162 (1985); Cormier J.F. und Ogilvie, K.K., Nucleic Acids Research, 16(10):4583-4594 (1988).
Obgleich die Carbonat-, Carbamat- und Silyl-verknüpften Oligonucleosidsequenzen die erforderliche Nucleasebeständigkeit besitzen, um sie zu attraktiven Kandidaten als Antisinn-Reagenzien zu machen, wurde bisher noch nicht von ihrer Fähigkeit berichtet, in dieser Weise zu wirken. Ferner wurde noch nicht von der Fähigkeit dieser Oligomere berichtet, von Zellen in einer Kultur aufgenommen zu werden. Ein potentieller Nachteil dieser Oligomere ist ihre berichtete geringe Löslichkeit in wäßriger Lösung. Es ist nicht klar, ob ausreichende Konzentrationen für ihre wirk same Anwendung in biologischen Experimenten erhalten werden können, obgleich die Löslichkeit vermutlich erhöht werden könnte, indem hydrophile Gruppen in die Moleküle eingeführt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt zu Oligonucleotiden analoge Verbindungen, solche Verbindungen umfassende Zusammensetzungen, Zwischenprodukte zur Herstellung solcher Verbindungen und Verfahren zur Synthese solcher neuen, stabilen, nucleasebeständigen, zielspezifischen, lipidlöslichen Oligonucleotidanaloga bereit.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt nueleotidanaloge Verbindungen bereit, welche Oligonucleosidsequenzen von etwa 6 bis etwa 200 Basen mit dreiatomigen Internucleosidbindungen umfassen. Die dreiatomige Internucleosidbindung solcher Olignucleosidsequenzen besitzt folgende Formel:
-D-D-D
worin jedes D unabhängig CHR, Sauerstoff oder NR&sup6; ist, worin R unabhängig Wasserstoff, OH, SH oder NH&sub2; ist, R&sup6; Wasserstoff oder C&sub1;-C&sub2;-Alkyl ist, mit der Maßgabe, daß nur ein D Sauerstoff oder NR&sup6; ist.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Oligonucleosidsequenzen Basen, die aus der aus Adenin, Cytosin, Guanin, Uracll, Thyrnin und Modifikationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
Insbesondere umfassen nucleasebeständige Oligonucleoside der vorliegenden Erfindung Sequenzen der Formel I:
worin W die Bedeutung -D-D-D- hat, worin jedes D unabhängig CHR, Sauerstoff oder NR&sup6; ist, worin R unabhängig Wasserstoff, OH, SH oder NH&sub2; ist, R&sup6; Wasserstoff oder C&sub1;-C&sub2;-Alkyl ist, mit der Maßgabe, daß nur ein D Sauerstoff oder NR&sup6; ist; jedes W' unabhängig W
ist;
jedes R¹ unabhängig OH, SH, NR²R³ ist, worin R² und R³ unabhängig Wasserstoff oder C&sub1;-C&sub6;- Alkyl oder NHR&sup4; sind, worin R&sup4; C&sub1;-C&sub1;&sub2;-Acyl ist;
jedes y unabhängig H oder OH ist;
jedes B unabhängig Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil oder eine Modifikation hiervon ist;
j eine ganze Zahl von 1 bis etwa 200 ist;
k 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis etwa 197 ist; und
q 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis etwa 197 ist, mit der Maßgabe, daß die Summe aus j + k + q etwa 4 bis etwa 200 beträgt.
Die Verbindungen der vorligenden Erfindung umfassen Oligonucleosidsequenzen, wahlweise mit einem Diol an einem oder an beiden Enden.
Bevorzugte Diole sind 1,2-Diole (Glykole). Repräsentative Glykole sind Polyalkylenglykole, vorzugsweise Polyethylenglykole oder Polypropylenglykole. Bevorzugte Glykole sind Tetraethylenglykol und Hexaethylenglykol. Geeignete Diole können ebenfalls Polyole einschließen, bei denen alle bis auf zwei Hydroxylgruppen blockiert sind.
Wenn die Verbindungen der vorliegenden Erfindung Oligonucleosidsequenzen mit einem Diol an einem oder beiden Enden sind, besitzen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung die Formel
worin jedes Z unabhängig R¹ oder
worin jedes R¹ unabhängig OH, SH, NHR²R³ ist, worin R² und R³unabhängig Wasserstoff oder C&sub1;-C&sub6;-Alkyl oder NHR&sup4; sind, worin R&sup4; C&sub1;-C&sub1;&sub2;-Acyl ist;
jedes R&sup5; unabhängig Wasserstoff oder C&sub1;-C&sub1;&sub2;-Alkyl ist;
jedes W, W', Y, B, j, k und q die gleiche Bedeutung wie oben besitzen;
jedes e und f unabhängig 0 bis 50 ist;
mit der Maßgabe, daß mindestens eines aus e und f mindestens 1 ist;
jedes m und n unabhängig 1 bis 200 ist; und
jedes p unabhängig 2 bis 4 ist.
In einer bevorzugten Ausfiihrungsform ist die Summe von j + k + q etwa 9 bis etwa 50 Basen, stärker bevorzugt etwa 12 bis etwa 25 und am meisten bevorzugt etwa 15 bis etwa 18. Die Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung können bekannte Internucleosidbindungsgruppen, wie Phophodiester, Silyl und andere gängigerweise bekannte Bindungsgruppen einschließen, vorausgesetzt, sie enthalten eine wirksame Menge der -D-D-D--Bindungsgruppen der vorliegenden Erfindung und gegebenenfalls endständige Diolgruppen der vorliegenden Erfindung Die vorliegende Erfindung richtet sich ebenfalls auf nucleasebeständige Nucleosiddimere der folgenden Formel:
wobei W die Bedeutung -D-D-D- hat, worin jedes D unabhangig CHR, Sauerstoff oder NR&sup6; ist, worin R unabhängig Wasserstoff, OH, SH oder NH&sub2; ist, R&sup6; Wasserstoff oder C&sub1;-C&sub2;-Alkyl ist, mit der Maßgabe, daß nur ein D Sauerstoff oder NR&sup6; ist;
jedes B unabhängig Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil oder eine Modifikation hiervon ist;
R&sup7; OH, t-Butyldimethylsilyloxy oder ein Phosphoramidit ist; und
R&sup8; OH, eine Schutzgruppe oder t-Butyldimethylsilyloxy ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Unterdrückung des Nucleaseabbaus von nucleasebeständigen Oligonucleosiden bereit. Dieses Verfahren umfaßt das Anbringen eines Diols am 5'- oder 3'-Ende oder an beiden Enden der Verbindung. Die Diole werden am 5'- und/oder 3'- Ende angebracht, indem die Oligonucleotidverbindungen mit einem Alkoxytrityldiolcyanophosphin, vorzugsweise einem Dimethoxytritylglykolcyanophosphin oder einem Monomethoxytritylglykolcyanophosphin, umgesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Unterdrückung des Nucleaseabbaus von nativen oder modifizierten Nucleotidverbindungen bereit, umfassend das Herstellen von Oligonucleosidsequenzen von etwa 6 bis etwa 200 Basen mit einer dreiatomigen Internucleosidbindung mit der Formel -D-D-D-, wie hierin definiert.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Zusammensetzungen bereit, die zur Unterdrückung der Genexpression nützlich sind, umfassend nucleasebeständige Oligonucleoside, die Sequenzen von etwa 6 bis etwa 200 Basen mit einer dreiatomigen Internucleosidbindung, wie sie hierin definiert ist, und einen physiologisch annehmbaren Träger umfassen. Die Verbindung kann ein Diol an einem oder an beiden Enden aufveisen. Bevorzugte Diole sind Polyethylenglykole.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Fig. 1a stellt einen Syntheseweg zur Herstellung eines Nucleosidaldehyds (Verbindung 1) dar.
Die Fig. 1b zeigt einen Syntheseweg zur Herstellung eines Phosphoniumiodidnucleosids (Verbindung II).
Die Fig. 2 zeigt einen Syntheseweg zur Herstellung von Nucleosiddimeren, die durch eine dreiatomige Internucleosidbindung verknüpft sind, unter Verwendung des Aldehydnucleosids und des Phosphoniumiodidnucleosids der Fig. 1a bzw. 1b.
Die Fig. 3 zeigt einen Syntheseweg zur Herstellung eines Thymidindimeren unter Verwendung eines Thymidinaldehyds und eines Phosphoniumiodidthymidins (Verbindung I bzw. II).
Die Fig. 4 zeigt einen Syntheseweg zur Herstellung eines Nucleosiddimeren, das durch eine Internucleosidbindung aus zwei Kohlenstoff- und einem Stickstoffatom der Form 3'-C-C-N-5' verknüpft ist. Dimere werden durch die Umsetzung von Aldehyde (CHO) enthaltende Nucleosiden mit Aminfunktionalitäten (NH&sub2;) enthaltenden Nucleosiden unter reduktiven Bedingungen synthetisiert.
Die Fig. 5 zeigt einen Syntheseweg zur Herstellung eines Nucleosiddimeren, das durch eine Internucleosidbindung der Form 3'-N-C-C-5' aus zwei Kohlenstoffatomen und einem Stickstoffatom verknüpft ist. Die Dimere werden durch die Umsetzung von Nucleosiden mit Aldehyd- und Aminfunktionalitäten unter reduktiven Bedingungen synthetisiert.
Die Fig. 6 zeigt einen Syntheseweg zur Herstellung eines Thymidindimeren, das durch eine Internucleosidbindung der Form 3'-C-C-N-5' aus zwei Kohlenstoffatomen und einem Stickstoffatom verknüpft ist. Die Dimere werden durch die Umsetzung von Aldehyde (CHO) enthaltenden Thymidinen mit Aminfunktionalitäten (NH&sub2;) enthaltenden Thymidinen unter reduktiven Bedingungen synthetisiert.
Die Fig. 7 zeigt einen Syntheseweg zur Herstellung eines Thymidindimeren, das durch eine Internucleosidbindung der Form 3'-N-C-C-5' aus zwei Kohlenstoffatomen und einem Stickstoffatom verknüpft ist. Die Dimere werden durch die Umsetzung von Thymidinen mit Aldehyd- und Aminfünktionalitäten unter reduktiven Bedingungen synthetisiert.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die Verbindungen der vorilegenden Erfindung sind im allgemeinen Oligonucleosidsequenzen, die gegenüber dem Nucleaseabbau beständig sind.
Wie hier verwendet, bezeichnet "Nucleosid" eine Kombination aus einer Purin- oder Pyrimidinbase mit einem Zucker aus fünfkohlenstoffatomen (Pentose).
Wie hier verwendet, bezeichnet "Nucleotid" einen Phosphorsäureester eines Nucleosids.
Wie hier verwendet, bezeichnet "Oligonucleotid" Polynucleotide, welche nur Phosphodiesterinternucleosidbindungen aufweisen, z.B. "native" DNA oder RNA.
Beispielhafte Nucleoside sind Adenosin (A), Guanosin (G), Cytidin (C), Uridin (U), Desoxyadenosin (dA), Desoxyguanosin (dG), Desoxycytidin (dC) und Thymidin (T).
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung umfassen Oligonucleosidsequenzen von etwa 6 bis etwa 200 Basen mit einer Phosphodiester- oder einer dreiatomigen Internucleosidbindung. Die dreiatomige Internucleosidbindung (-D-D-D-) enthält 1) drei Kohlenstoffatome, 2) zwei Kohlenstoffatome und ein Sauerstoffatom oder 3) zwei Kohlenstoffatome und ein Stickstoffatom.
Die Oligonucleosidsequenzen sind Sequenzen von nativen oder modifizierten Nucleosiden. Wie hier verwendet, bezeichnet der Ausdruck "Internucleosidbindung" Atome und Moleküle, die eine Brücke zwischen dem Kohlenstoffatom in Position 3 des Zuckerrestes eines nativen oder modifizierten Nucleosids und dem Kohlenstoffatom in Position 5 des Zuckerrestes eines benachbarten Nucleosids bilden. Der Zuckerrest kann entweder ein Ribose- oder ein Desoxyriboserest oder ein Analog davon sein. Somit schließen die Nucleoside A, C, G, U, dA, dC, dG, T oder Modifikationen davon, wie z.B. 5-Brom- oder 5-Ioduracil, 5-Methylcytosin, Isocytosin (2-Amino-4-oxopyrimidin), Isoguanin (2-Oxo-6-aminopurin), Inosin (6-Oxopurin), 5-Vinyluracil und 5-Vinylcytosin ein.
Die dreiatomige Internucleosidbindung besitzt die Formel:
-D-D-D-
worin jedes D unabhängig CHR, Sauerstoff oder NR&sup6; ist, worin R unabhängig Wasserstoff, OH, SH oder NH&sub2; ist, R&sup6; Wasserstoff oder C&sub1;-C&sub2;-Alkyl ist, mit der Maßgabe, daß nur ein D Sauerstoff oder NR&sup6; ist.
Die nucleasebeständigen Oligonucleoside der vorliegenden Erfindung umfassen Sequenzen der Formel I:
worin W die Bedeutung -D-D-D- hat, worin jedes D unabhängig CHR, Sauerstoff oder NR&sup6; ist, worin R unabhängig Wasserstoff, OH, SH oder NH&sub2; ist, R&sup6; Wasserstoff oder C&sub1;-C&sub2;-Alkyl ist, mit der Maßgabe, daß nur ein D Sauerstoff oder NR&sup6; ist;
jedes W' unabhängig W oder
ist;
jedes R¹ unabhängig OH, SH, NR²R³ ist, worin R² und R³ unabhängig Wasserstoff oder C&sub1;-C&sub6;- Alkyl oder NHR&sup4; sind, worin R&sup4; C&sub1;-C&sub1;&sub2;-Acyl ist;
jedes y unabhängig H oder OH ist;
jedes B unabhängig Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil oder eine Modifikation hiervon ist;
j eine ganze Zahl von 1 bis etwa 200 ist;
k 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis etwa 197 ist; und
q 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis etwa 197 ist, mit der Maßgabe, daß die Summe aus j + k + q etwa 4 bis etwa 200 beträgt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Summe von j + k + q etwa 9 bis etwa 50. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Summe von j + k + q etwa 12 bis etwa 25 und stärker bevorzugt etwa 15 bis etwa 18.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können ein Diol an einem oder an beiden Enden aufweisen. Bevorzugte Diole sind Glykole, ebenfalls als 1,2-Diole bekannt, welche zwei Hydroxylgruppen an benachbarten Kohlenstoffatomen besitzen. Bevorzugte Glykole sind Polyalkylenglykole. Der Begriff "Alkylen", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf lineare und verzweigtkettige Reste mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, welche gegebenenfalls so substituierte sein können, wie es hierin angegeben wird. Stellvertretend flir solche Reste sind Ethylen, Propylen, Isobutylen und dergleichen. Bevorzugte Polyalkylenglykole sind Polyethylenglykole, wie Hexaethylenglykol und Tetraethylenglykol. Geeignete Diole können ebenfalls Polyole einschließen, bei denen alle bis auf zwei Hydroxylgruppen blockiert sind.
Die Diole sind entweder am 5'- oder 3'-Ende oder an beiden Enden der Oligonucleoside über Phosphodiesterbindungen angebracht. In einer Ausführungsform sind die Diole nur an einem Terminus einer Oligonucleosidsequenz angebracht.
Das endständige Diol ist mit einem Rest verbunden, der aus der aus Hydroxyl (OH), Sulfhydryl (SH), Amino (NH&sub2;), Alkylamino (NH-Alkyl), Dialkylamino (N[Alkyl]&sub2;) und Amido (NH[Acyl]) bestehenden Gruppe gewählt ist.
Wenn Glykole entweder an einem oder an beiden Enden vorliegen, umfassen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung Oligonucleosidsequenzen der Formel II:
worin jedes Z unabhängig R¹ oder
ist;
worin jedes R¹ unabhängig OH, SH, NHR²R³ ist, worin R² und R³unabhängig Wasserstoff oder C&sub1;-C&sub6;-Alkyl oder NHR&sup4; sind, worin R&sup4; C&sub1;-C&sub1;&sub2;-Acyl ist;
jedes R&sup5; unabhängig Wasserstoff oder C&sub1;-C&sub1;&sub2;-Alkyl ist;
jedes W, W', Y, B, j, k und q die gleiche Bedeutung wie oben besitzen;
jedes e und f unabhängig 0 bis 50 ist;
mit der Maßgabe, daß mindestens eines aus e und f mindestens 1 ist;
jedes m und n unabhängig 1 bis 200 ist; und
jedes p unabhängig 2 bis 4 ist.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind m und n unabhängig 1 bis 6, und die Summe von j + k + q etwa 9 bis etwa 50. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Summe von j + k + q etwa 12 bis 25, stärker bevorzugt etwa 15 bis etwa 18.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfassen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung Oligonucleotidsequenzen von etwa 9 bis etwa 200 Basen mit einer (-D-D-D-)-Bindung der vorliegenden Erfindung.
Bevorzugte Diole sind Glykole, ebenfalls als 1,2-Diole bekannt, welche zwei Hydroxylgruppen an benachbarten Kohlenstoffatomen besitzen. Bevorzugte Glykole sind Polyalkylenglykole. Der Ausdruck "Alkylen", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auflineare und verzweigte Reste mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, welche gegebenenfalls substituiert sein können, wie es hier angegeben ist. Repräsentativ für solche Reste sind Ethylen, Propylen, Butylen und dergleichen.
Bevorzugte Polyalkylenglykole sind Polyethylenglykole. Weiter bevorzugt sind Tetraethylenglykol und Hexaethylenglykol.
Die Diole sind entweder am 5'- oder 3'-Ende oder an beiden Enden der Oligonucleotide über Phosphodiesterbindungen angebracht. Bei einer Ausführungsform sind die Diole nur an einem Ende einer Oligonucleotidsequenz angebracht.
Das endständige Diol ist mit einem Rest verbunden, der aus der aus Hydroxyl (OH), Sulfhydryl (SH), Amino (NH&sub2;), Alkylamino (NH-Alkyl), Dialkylamino (N[Alkyl]&sub2;) und Amido (NH[Acyl]) bestehenden Gruppe gewählt ist. Wie hier verwendet, bezeichnet "Alkyl" lineare oder verzweigte Reste mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, welche gegebenenfalls substituiert sein können, wie hierin beschrieben. Repräsentative Alkyl- und Dialkylaminoreste schließen Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Dimethyl-, Diethyl-, Dipropyl-, Dibutyl-, Dipentyl- und Dihexylamine und dergleichen ein. Wie hierin verwendet, bezeichnen "NH(Acyl)" oder "Amido" lineare oder verzweigte Reste mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen und einer endständigen O-CNH&sub2;-Gruppe. Repräsentative Amidoreste schließen Methanamid, Ethanamid, Propanamid, Butanamid, Pentanamid, Hexanamid, Heptanamid, Octanamid, Nonanamid, Decanamid, Undecanamid und Dodecanamid ein.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind nützlich als Antisinn-Mittel. Antisinn-Mittel hybridisieren mit einer komplementären Nucleotidsequenz in einer Ziel-Nucleinsäure, wodurch die translationale oder transkriptionale Funktion der Ziel-Nucleinsäure unterdrückt wird. Die Ziel- Nucleinsäure kann entweder RNA oder DNA sein.
Antisinn-Verbindungen der vorliegenden Erfindung umfassen Oligonucleosidsequenzen von etwa 6 bis etwa 200 Basen mit Homopolymer- oder Heteropolymersequenzen aus Basen, die aus der aus Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G), Uracil (U), Thymin (T) und Modifikationen dieser Basen bestehenden Gruppe gewählt werden. Besondere Sequenzen werden auf der Basis ihres gewünschten Ziels gewählt. Die gewählte Sequenz hybridisiert mit der Ziel-Nucleinsäure. Beispielhafte Ziele schließen das MYC-Onkogen, das RAS-Onkogen und virale Nucleinsäuren ein.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können durch folgende Verfahren hergestellt werden:

A. Verbindungen mit dreiatomigen Internucleosidbindungen

Durch eine dreiatomige Internucleosidbindung verknüpfte Oligonucleoside werden synthetisiert, indem Nucleoside mit Aldehyd- und Ylidfünktionalitäten an der 3'- bzw. 6'-Position unter Wittig- Bedingungen umgesetzt werden.
Die Synthesen eines Nucleosidaldehyds und eines Phosphoniumiodidnucleosids aus im Handel erhältlichen Verbindungen sind in der Fig. 1a bzw. 1b dargestellt. Der Aldehyd (Verbindung 1 von Fig. 1a) wird aus dem bekannten 3'-Allyl-3'-desoxy-5'-O-tert-butyldimethylsilyl-3'-thymidin (Verbindung A, Fig. 1) synthetisiert. Die Allylverbindung wird regioselektiv mit einer katalytischen Menge von Osmiumtetroxid und N-Methylmorpholinoxid als Cooxidanz oxidiert. Das resultierende Diol (Verbindung B, Fig. 1a) wird mit Natriumperiodat gespalten, wodurch das Aldehyd in fast quantitativer Ausbeute erhalten wird.
Die Synthese des Phosphoniumiodidnucleosids (Verbindung II, Fig. 1b) geschieht aus einem im Handel erhältlichen 5'-trityliertem Nucleosid (Verbindung C, Fig. 1b). Das tritylierte Nucleosid ist an der 3'-Position mit tert-Butyldimethylsilylchlorid silyliert, und die Tritylgruppe wird unter sauren Bedingungen in hoher Effizienz entfernt. Das resultierende primäre Hydroxyl (Verbindung E, Fig. 1b) wird unter Swern-Bedingungen oxidiert, wodurch der Aldehyd (Verbindung F, Fig. 1b) erhalten wird. Der rohe Aldehyd wird umgehend mit dem von Methyltriphenylphosphoniumbromid abstammendem Ylid umgesetzt, wodurch ein 4'-Vinyl-4'-desoxy-3'-tert-butyldimethylsilylnucleosid in guter Ausbeute erhalten wird. Die Vinylverbindung wird regioselektiv hydroboriert, wodurch ein primärer Alkohol (Verbindung G, Fig. 1b) in guter Ausbeute erhalten wird. Der primäre Alkohol wird seinerseits zu dem entsprechenden Iodid (Verbindung H, Fig. 1b) unter Verwendung von Triphenylphosphiniod in Gegenwart von Imidazol in ausgezeichneter Ausbeute umgewandelt. Schließlich wird das Iodid zu dem gewünschten Phosphoniumiodidnucleosid unter Verwendung von Triphenylphosphin in Acetonitril umgewandelt.
Ein Ylid wird aus dem Phosphoniumiodidnucleosid unter Verwendung von Kalium-tert-butoxid als Base hergestellt und sofort mit dem Aldehyd umgesetzt, wodurch ein Wittig-Produkt (Verbindung 1, Fig. 2) in guter Ausbeute erhalten wird. Das Wittig-Produkt wird regioselektiv mit 10% Palladium auf Kohlenstoff (10% Pd-C) und Wasserstoff bei atmosphärischem Druck in quantitativer Ausbeute hydriert, um die Doppelbindung der Bindung zu sättigen. Die gesättigte Verbindung (Verbindung 2, Fig. 2) wird mit Tetrabutylammoniumfluorid desilyliert, wodurch das Diol (Verbindung 3, Fig. 2) erhalten wird. Das 5'-primäre Hydroxyl des Diols wird dann regioselektiv mit Dimethoxytritylchlorid geschützt, und das resultierende 3'-Hydroxyl (Verbindung 4, Fig. 2) wird zu einem Phosphoramidit (Verbindung 5, Fig. 2) mit 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit umgewandelt.
Die Nucleosiddimere oder höheren Oligomere mit Trialkylsilyloxy-Schutzgruppen werden konjugiert unter Bildung von Oligonucleotiden jeder beliebigen Länge. Nach der Beendigung der Kettenverlängerung werden die Oligomere mittels Standardverfahren entschützt. Für eine weitere Kettenlängenausdehnung in einem Festphasen-Synthesizer, in dem die Oligomere durch Phosphatbindungen verbunden werden, werden die terminalen 5'- und 3'-Hydroxylgruppen der Oligomere in geeigneter Weise fünktionalisiert, entsprechenderweise mit Tritylierungsreagenzien, wie Dimethoxytritylchlorid und Phosphoramidit.

B. Verbindungen mit Internucleosidbindungen aus zwei Kohlenstoffatomen und einem Sauerstoffatom

Oligonucleosidsequenzen mit Internucleosidbindungen aus zwei Kohlenstoffatomen und einem Sauerstoffatom werden synthetisiert, indem 3'-silyliertes 5'-Toluolsulfonylnucleosid mit einem 5'- geschütztem Nucleosid umgesetzt wird.
Ein 3'-Acetyl-5'-aldehydnucleosid wird aus einem im Handel erhältlichen 3'-Acetylnucleosid unter Verwendung von Standardverfahren, die dem Fachmann in diesem Bereich bekannt sind, hergestellt. Das 3'-Acetyl-5'-aldehydnucleosid wird dann zu einem 3'-Acetyl-5'-carbomethoxymethylennucleosid unter Verwendung einer modifizierten Wittig-Reaktion umgewandelt.
Die 5'-Methylen-Seitenkette wird mit Natriumborhydrid in Alkohol, vorzugsweise Isopropanol, reduziert, gefolgt von der Entschützung der 3'-Acetylgruppe mit Natriummethoxid in einem Alkohol, vorzugsweise Methanol. Die 3'-Hydroxygruppe wird dann mit einer Silylgruppe geschützt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Silylgruppe eine t-Butyldimethylsilylgruppe.
Das 3'-Silyl-5'-carbomethoxymethylnucleosid wird dann weiter zu einem 3'-O-Silyl-5'-desoxy-3'- (2"-ethanol)-Derivat des Nucleosids mit Diisobutylaluminiumhydrid (DIBAL) in Tetrahydrofuran (THF) reduziert. Die 5'-Ethanolgruppe wird zu einer p-Toluolsulfonylgruppe mit p-Toluolsulfonylchlorid in Pyridin umgewandelt. Die exocyclische Amingruppe des Basenrestes des 5'-p- Toluolsulfonylnucleosids wird gegebenenfalls mittels Verfahren geschützt, welche dem Fachmann im Fachbereich wohl bekannt sind und offensichtlich erscheinen. Eine bevorzugte Schutzgruppe für die exocyclischen Aminogruppen von Adenin und Cytosin ist der Benzoylrest. Eine bevorzugte Schutzgruppe für die exocyclische Aminogruppe von Guanin ist der Isobutylrest. Guanin kann ebenfalls an der O&sup6;-Position geschützt werden.
Das 3'-O-Silyl-5'-O-p-toluolsulfonylnucleosid wird dann mit einem 5'-geschützten Nucleosid unter Bildung eines 3'-O-Silyl-5'-geschützten Nucleosiddimeren mit einer lntemucleosidbindung aus zwei Kohlenstoffatomen und einem Sauerstoffatom umgesetzt. Die 5'-O-Schutzgruppe ist bevorzugterweise ein Trityl und weiter bevorzugt ein Dimethoxytrityl Das 3'-O-Silyl-5'-O-geschützte Nucleosid wird gegebenenfalls an den exocyclischen Aminogruppen des Nucleosid-Basenrestes geschützt.
Die Nucleosiddimere werden entschützt und erneut an der Position des 3'-Kohlenstoffatoms mit einem Cyanophosphinreagenz, vorzugsweise 2-Cyanoethoxydiisopropylaminophosphin, zur Verwendung bei einem Phosphoramidit-Festphasen-Syntheseverfahren zur Kettenverlängerung derivatisiert; Gait, 5.0.
Die Nucleosiddimere oder höheren Oligomere mit Trialkylsilyloxy-Schutzgruppen werden konjugiert unter Bildung von Oligonucleosiden jeder beliebigen Länge. Nach der Beendigung der Kettenverlängerung werden die Oligomere mittels Standardverfahren entschützt. Für eine weitere Kettenlängenausdehnung in einem Festphasen-Synthesizer, in dem die Oligomere durch Phosphatbindungen verbunden werden, werden die terminalen 5'- und 3'-Hydroxylgruppen der Oligomere in geeigneter Weise fünktionalisiert, entsprechenderweise mit Tritylierungsreagenzien, wie Dimethoxytritylchlorid und Phosphoramidit.

C. Verbindungen mit Internucleosidbindung aus zwei Kohenstoffatomen und einem Stickstoffatom

Oligonucleosidsequenzen, die durch eine Internucleosidbindung aus zwei Kohlenstoffatomen und einem Stickstoffatom der Form C-C-N verknüpft sind, werden synthetisiert, indem Aldehyde enthaltende Nucleoside mit Aminfunktionalitäten enthaltenden Nucleosiden unter reduktiven Bedingungen, wie es in Fig. 4 gezeigt ist, umgesetzt werden.
Sowohl die Aldehyd- als auch die Aminverbindungen werden aus im Handel erhältlichen Verbindungen hergestellt. Der Aldehyd wird aus 3'-Allyl-3'-desoxy-5'-O-tert-butyldimethylsilylthymidin hergestellt. Die Allylverbindung wird regioselektiv mit einer katalytischen Menge Osmiumtetroxid in Gegenwart von N-Methylmorpholin-N-oxid als Cooxidans oxidiert, um den Diol zu erhalten. Das Diol wird seinerseits mit Natriumperiodat oxidiert, um den Aldehyd in fast quantitativer Ausbeute zu erhalten.
Die Aminverbindung wird aus im Handel erhältlichen Nucleosiden synthetisiert. Bei einem typischen Verfahren wird die primäre Hydroxylgruppe eines Nucleosids regioselektiv in eine Tosylatgruppe mit p-Toluolsulfonylchlorid und dann in ein Iodid umgewandelt. Das 3'-Hydroxy des Iodid-Zwischenproduktes wird mit tert-Butyldimethylsilylchlorid geschützt und die Azidgruppe durch die Reaktion mit Natriumazid eingeführt. Die Azidfunktionalität wird in effizienter Weise zum erforderlichen Amin durch die Reduktion unter Verwendung von 10% Palladium auf Kohlenstoff unter einer Wasserstoffatmosphäre oder unter Raney-Nickel-Reduktionsbedingungen umgewandelt.
Das Amin und der Aldehyd werden (reduktive Aminierung) in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid unter gepufferten Bedingungen gekoppelt. Das Oligonucleosiddimer mit einer C-C-N- Internucleosidbindung wird in guter Ausbeute erhalten. Das Oligonucleosid wird mit Trifluoressigsäureanhydrid, Triethylamin umgesetzt, um den sekundären aliphatischen Stickstoff zu schützen. Das geschützte Oligonucleosid wird mit Tetrabutylammoniumflourid desilyliert, und die primäre Hydroxylgruppe des resultierenden Diols wird selektiv mit Dimethoxytritylchlorid geschützt. Das verbleibende sekundäre Hydroxyl wird zum erforderlichen Phosphoramidit umgewandelt, und zwar durch die Umsetzung mit 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit.
Oligonucleoside, die durch eine Internucleosidbindung aus zwei Kohlenstoffatomen und einem Stickstoffatom der Form N-C-C verknüpft sind, werden durch die Reaktion von Nucleosiden mit Aldehyd- und Aminfunktionalitäten an der 3'- bzw. 5'-Position unter reduktiven Bedingungen, wie es in Fig. 5 gezeigt ist, synthetisiert.
Die Amin- und die Aldehydkomponenten werden aus im Handel erhältlichen Verbindungen synthetisiert. Das Amin wird aus 3'-Azido-3-desoxythymidin (AZT) synthetisiert. Die primäre Hydroxylgruppe von AZT wird mit Dimethoxytritylchlorid geschützt, und das resultierende Azid regioselektiv zu dem gewünschten Amin mit 10% Palladium auf Kohlenstoff in Gegenwart einer Wasserstoffatmosphäre oder unter Verwendung von Raney-Nickel umgewandelt.
Der Aldehyd wird aus im Handel erhältlichem 5'-O-Dimethoxytritylthymidin synthetisiert. Das tritylierte Thymidin wird mit tert-Butyidimetnyisiiyicniorid silyliert, und die Tritylgruppe wird unter sauren Bedingungen entfernt. Die resultierende primäre Hydroxylgruppe wird unter Swern- Bedingungen unter Erhalt des Aldehyds oxidiert. Der Aldehyd wird nicht isoliert, sondern sofort mit (Carbethoxymethylen)triphenylphosphoran umgesetzt, um den ungesättigten Ester zu erhalten. Der ungesättigte Ester wird regioselektiv mit 10% Palladium auf Kohlenstoff hydriert, wodurch ein gesättigter Ester in quantitativer Ausbeute erhalten wird. Der gesättigte Ester wird seinerseits zu dem gewünschten Aldehyd mit Diisobutylaluminiumhydrid (DIBAL-H) in hochselektiver Weise umgewandelt.
Das Amin und der Aldehyd werden in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid unter gepufferten reduktiven Aminierungsbedingungen gekoppelt. Die N-C-C-Internucleosidbindung wird in guter Ausbeute erhalten. Der sekundäre aliphatische Stickstoff des Oligonucleosids wird mit Trifluoressigsäureanhydrid und Triethylamin geschützt. Die geschützte Dimer- oder höhere Oligonucleosidsequenz wird desilyliert, und das resultierende Hydroxyl wird mit 2-Cyanoethyl-N,N- diisopropylchlorphosphoramidit zu Phosphoramidit umgewandelt.
Die Nucleosiddimere oder höheren Oligomere mit Trialkylsiloxy-Schutzgruppen werden unter Bildung von Oligonucleosiden jeder beliebigen Länge konjugiert. Nach der Beendigung der Kettenverlängerung werden die Oligomere durch Standardverfahren desilyliert. Für eine weitere Kettenverlängerung in einem Festphasen-Synthesizer, in dem die Oligomere durch Phosphatbindungen verknüpft werden, werden die endständigen 5'- und 3'-Hydroxylgruppen der Oligomeren in geeigneter Weise, entsprechenderweise mit Tritylierungsreagenzien, wie Dimethoxytritylchlorid und Phosphoramidit, fünktionalisiert.

D. Verbindungen mit einem Diol an einem oder an beiden Enden

Wenn gewünscht, werden Diole entweder an einem oder an beiden Enden mittels einer Modifikation des Festphasen-Phosphoramidit-Verfahrens angebracht; Oligonucleotide Synthesis; A Practiral Approach, herausgegeben von M.J. Gait, Seiten 35-81, IRL Press, Washington, D.C. (1984).
Gemäß unserer Modifikation des Festphasenverfahrens wird ein Diol an einem oder an beiden Enden des Oligonucleotids mittels eines Verfahrens eingeführt, bei dem das Diol mit einer Alkoxytritylverbindung zur Bildung eines tritylierten Diols umgesetzt wird. Das Diol ist vorzugsweise ein Glykol, weiter bevorzugt, ein Polyalkylenglykol. Das Alkoxytritylreagenz ist vorzugsweise Monomethoxytritylchlorid oder Dimethoxytritylchlorid und am stärksten bevorzugt Dimethoxytritylchlorid. Die tritylierten Diole werden dann mit einem Cyanophosphinreagenz zur Bildung einer Trityldiolcyanophosphinverbindung umgesetzt, wobei diese Verbindung als ein Phosphoramidit-Reagenz (nachfolgend als ein "Diol-Phosphoramidit-Reagenz" bezeichnet) bei der Festphasensynthese der Verbindungen der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
Der anfangliche Schritt bei der Festphasensynthese ist das Anbringen eines Nucleosids an einem festen Träger, vorzugsweise einem Glasträger mit kontrollierter Porengröße (CPG). Das Nucleosid wird bevorzugterweise an dem CPG via einer Succinatbindung an der 3'-Hydroxylposition des Nucleosids angebracht. Andere Methoden des Anbringens der Nucleoside an festen Trägern sind bekannt und für jene, die im Bereich der Oligonucleotid-Synthese erfahren sind, leicht offensichtlich. Alternativ kann, um einen Diol am 3'-Ende einzuführen, ein Diol-Phosphoramidit-Reagenz vor der Zugabe des ersten Nucleosids am festen Träger angebracht werden. Das Diol-Phosphoramidit-Reagenz wird am festen Träger unter Verwendung von Succinat oder anderen Bindungen in einer analogen Weise zu für die Anbringung des Nucleosids verwendeten Verfahren angebracht. Methoden der Modifizierung solcher Verfahren zur Verwendung mit Diol- Phosphoramidit-Reagenzien sind den in diesem Fachbereich Erfahrenen in gängiger Weise offensichtlich. Jede beliebige Anzahl an Diolen kann an dem festen Träger vor der Zugabe des ersten Nucleosids angebracht werden. Vorzugsweise werden 1 bis etwa 50 Diole verwendet. Wenn Diole nur an dem 5'-Terminus angebracht werden, werden keine Diole auf dem festen Träger vorgesehen.
Nach der Anbringung des ersten Nucleosids oder des/der Diol(e) am festen Träger, nimmt man eine Kettenverlängerung mittels der in Reihe erfolgenden Schritte des Entfernens der 5'-Hydroxyl Schutzgruppe (eine fünktionalisierte Tritylgruppe), der Aktivierung der 5'-Hydroxylgruppe in Gegenwart eines Phosphoramidit-Reagenzes, d.h. ein 5'-Tritylnucleosid-3'-phosphoramidit, des Blockierens der nicht-umgesetzten Nucleoside und des Oxidierens der Phosphorbindung vor.
Die Schutzgruppe an der 5'-Hydroxylposition der angebrachten Nucleoside wird mittels Säure entfernt, vorzugsweise mittels Trichloressigsäure.
Aktivierende Reagenzien, die in Übereinstimmung mit diesem Verfahren verwendet werden können, sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugte aktivierende Reagenzien sind Tetrazol und Aktivator-Gold (Beckman Instr. Inc., Palo Alto, CA).
Der Aktivierungsschritt tritt in Gegenwart des hinzugesetzten Nucleosid-Phosphoramidit-Reagenzes oder Diol-Phosphoramidit-Reagenzes auf, wobei das letztere Reagenz das Nucleosid-Phosphoramidit-Reagenz herkömmlicher Syntheseverfahren ersetzt, wenn Diol am Ende bzw. an den Enden des Polynucleotids hinzugefügt wird. Nicht-umgesetzte Ketten werden terminiert oder blockiert mit Blockierungsreagenzien, wie Essigsäureanhydrid und N-Methylimidazol.
Die labile dreiwertige Phosphorbindung wird oxidiert, vorzugsweise mit bd, zu der stabilen, füntwertigen Phosphodiesterbindung des Oligonucleotids.
Nachdem der gewünschte Oligonucleotid-Kettenaufbau vervollständigt ist, werden die Phosphat- Schutzgruppen entfernt, die Ketten von dem festen Träger abgetrennt und die Basen- Schutzgruppen mittels herkömmlicher Verfahren beseitigt; Gaits, s.o. auf 67-70.
Die Fachleute werden erkennen, daß andere Methoden der Synthese von Oligonucleotiden in analoger Weise modifiziert werden können, um die Antisinn-Oligonucleotide mit endständigem Diol herzustellen.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind bei der Behandlung von Säugern mit vererbten Leiden oder Krankheiten, die mit veränderten genetischen Expressionsmechanismen in Verbindung stehen, brauchbar. Derzeit sind Versuche im Gange, Antisinn-Therapien zum Einsatz bei der Behandlung von viralen Infektionen, wie HIV, Zytomegalovirus, Herpes simplex, Hepatitis B, Papillomavirus und Picornavirus; Lungen-, Darm-, Zervix-, Brust- und Eierstockkrebs; Entzündungsleiden; und Erkrankungen des Immunsystems, wie dem Syndrom erworbener Immunschwäche (AIDS), hämatologischem Neoplasma und hyperproliferativen Leiden zu entwickeln; Armstrong, s.o. auf 89; Klausner, s.o. auf 303, 304.
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die bei der Unterdrückung der Genexpression brauchbar sind, umfassen physiologisch annehmbare Träger und 1) Verbindungen, die Oligonucleosidsequenzen von etwa 6 bis etwa 200 Basen mit einer Internucleosidbindung der Formel -D-D-D-, wie es hierin angegeben ist, wahlweise mit einem Diol an einem oder an beiden Enden, umfassen oder 2) Verbindungen, die Oligonucleotidsequenzen von etwa 9 bis etwa 200 Basen mit einem Diol an einem oder beiden Enden umfassen.
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die bei der Unterdrückung der Genexpression brauchbar sind, schließen eine oder mehrere der Verbindungen dieser Erfindung ein, die zusammen mit Zusammensetzungen mit einem oder mehreren nichttoxischen, physiologisch annehmbaren Trägern, Hilfsstoffen oder Vehikeln, welche hierin zusammenfassend als Träger bezeichnet sind, formuliert sind, zur parenteralen Injektion, zur oralen Verabreichung in fester oder flüssiger Form, zur rektalen oder topischen Verabreichung und dergleichen. Die Zusammensetzungen können Menschen oder Tieren entweder oral, rektal, parenteral (intravenös, intramuskulär oder subkutan), intrazisternal, intravaginal, intraperitoneal, lokal (Puder, Salben oder Tropfen) oder als ein bukkales oder nasales Spray verabreicht werden. Für die parenterale Injektion geeignete Zusammensetzungen können physiologisch annehmbare, sterile, wäßrige oder nicht wäßrige Lösungen, Dispersionen, Suspensionen oder Emulsionen und sterile Pulver tür die Neubildung von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen umfassen. Beispiele geeigneter wäßriger und nicht wäßriger Träger, Verdünnungsmittel, Lösungsmittel oder Vehikel schließen Wasser, Ethanol, Polyole (Propylenglykol, Polyethylenglykol, Glycerin und dergleichen), geeignete Mischungen davon, Pflanzenöle (wie Olivenöl) und injizierbare organische Ester, wie Ethyloleat, ein. Eine geeignete Fluidität kann, z.B. durch die Verwendung eines Überzuges, wie Lecithin, durch die Einhaltung der erforderlichen Teilchengröße im Fall der Dispersionen oder durch die Ahwendung von oberflächenaktiven Mitteln erreicht werden.
Diese Zusammensetzungen können ebenfalls Hilfsstoffe, wie Konservierungsstoffe, Benetzungsmittel, Emulgiermittel und Dispergiermittel, enthalten. Die Vorbeugung gegen die Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und antitüngale Mittel, z.B. Parabene, Chiorbutanol, Phenol, Sorbinsäure und dergleichen, sichergestellt werden. Es mag ebenfalls wünschenswert sein, isotonische Mittel, z.B. Zucker, Natriumchlorid und dergleichen, einzuschließen. Eine anhaltende Absorption der injizierbaren Form kann durch die Verwendung von die Absorption verzögemden Mitteln, z.B. Aluminiummonostearat und Gelatine, hervorgerufen werden.
Falls gewünscht und für eine effektivere Verteilung, können die Verbindungen in Systeme mit langsamer Freisetzung oder in zielgerichtete Freisetzungssysteme, wie Polymermatrices, Liposome und Mikrosphären, eingebracht werden. Sie können sterilisiert werden, z.B. mittels der Filtration durch einen die Bakterien zuruckhaltenden Filter oder durch das Einbringen von sterilisierenden Mitteln in Form von sterilen festen Zusammensetzungen, welche in sterilem Wasser oder einem anderen sterilen injizierbaren Medium direkt vor der Anwendung gelöst werden können.
Feste Dosierungsformen zur oralen Verabreichung schließen Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver und Granulate ein. In solchen festen Dosierungsformen wird die aktive Verbindung mit mindestens einem inerten gängigen Exzipient (oder Träger), wie Natriumcitrat oder Dicalciumphosphat, oder (a) Füllstoffen oder Streckmitteln, wie z.B. Stärken, Laktose, Saccharose, Glucose, Mannitol und Kieselsäure, (b) Bindemitteln, wie z.B. Carboxymethylcellulose, Alginaten, Gelatine, Polyvinylpyrrolidon, Saccharose und Akazien, (c) Feuchthaltemitteln, wie z.B. Glycerin, (d) desintegrierenden Mitteln, wie z.B. Agar-Agar, Calciumcarbonat, Kartoffel- oder Tapiokastärke, Alginsäure, bestimmte komplexe Silicate und Natriumcarbonat, (e) Lösungs-Retardern, wie z.B. Paraffin, (f) Absorptionsbeschleunigern, wie z.B. quaternären Ammoniurnverbindungen, (g) Benetzungsmitteln, wie z.B. Cetylalkohol und Glycerinmonostearat, (h) Adsorptionsmitteln, wie z.B. Kaolin und Bentonit, und (i) Gleitmitteln, wie z.B. Talk, Calciumstearat, Magnesiumstearat, feste Polyethylenglykole, Natriumlaurylsulfat oder Mischungen davon, vermischt. Im Falle von Kapseln, Tabletten und Pillen können die Dosierungsformen ebenfalls Pufferungsmittel umfassen.
Feste Zusammensetzungen ähnlichen Typs können ebenfalls als Füllstoffe in weich- und hartgefüllte Gelatinekapseln unter Verwendung von solchen Exzipientien, wie Lactose oder Milchzucker sowie hochmolekulargewichtigen Polyethylenglykolen und dergleichen, angewandt werden.
Feste Dosierungsformen, wie Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen und Granulate, können mit Überzügen und Hüllen, wie Darmüberzügen und anderen in diesem Fachbereich wohl bekannten, hergestellt werden. Sie können Trübungsmittel enthalten, und sie können ebenfalls von solcher Zusammensetzung sein, daß sie die aktive Verbindung oder Verbindungen in einem bestimmten Bereich des Magendarmtraktes in verzögerter Weise freisetzen. Beispiele für Einbettungs- Zusammensetzungen, die verwendet werden können, sind polymere Substanzen und Wachse.
Die aktiven Verbindungen können ebenfalls in mikroverkapselter Form vorliegen, falls angemessen, mit einem oder mehreren der oben erwähnten Arzneimittelträger.
Flüssige Dosierungsformen für die orale Verabreichung schließen physiologisch annehmbare Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirupe und Elixiere ein. Zusätzlich zu den aktiven Verbindungen können die flüssigen Dosierungsformen üblicherweise im Fachbereich verwendete inerte Verdünnungsmittel, wie Wasser oder andere Lösungsmittel, Solubilisierungsmittel und Emulgatoren, wie z.B. Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglykol, 1,3-Butylenglykol, Dimethylformamid, Öle, insbesondere Baumwollsaatöl, Erdnußöl, Maiskeimöl, Olivenöl, Kastoröl und Sesamöl, Glycerin, Tetrahydroturfurylalkohol, Polyethylenglykole und Fettsäureester von Sorbitan oder Mischungen dieser Substanzen und dergleichen, enthalten.
Neben solchen inerten Verdünnungsmitteln kann die Zusammensetzung ebenfalls Hilfsstoffe, wie Benetzungsmittel, Emulgatoren und Suspendiermittel, Süßstoffe, Geschmacksstoffe und Parfümierstoffe, einschließen.
Suspensionen können zusätzlich zu den aktiven Verbindungen Suspendiermittel, wie z.B. ethoxylierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylensorbitol und Sorbitanester, mikrokristalline Cellulose, Aluminiummetahydroxid, Bentonit, Agar-Agar und Tragant oder Mischungen dieser Substanzen und dergleichen, enthalten.
Zusammensetzungen für die rektale Verabreichung sind vorzugsweise Zäpfchen, welche hergestellt werden können, indem die Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit geeigneten nichtreizenden Arzneimittelträgem oder Trägern, wie Kakaobutter, Polyethylenglykol oder einem Zäpfchenwachs, vermischt werden, welche bei normalen Temperaturen fest sind, jedoch bei der Körpertemperatur flüssig sind und deshalb in der rektalen oder vaginalen Höhlung schmelzen und die aktive Komponente freisetzen.
Dosierformen für die topische Verabreichung einer Verbindung dieser Erfindung schließen Salben, Pulver, Sprays und Inhalationsmittel ein. Die aktive Komponente wird unter sterilen Bedingungen mit einem physiologisch annehmbaren Träger und jedweden benötigten Konservierungsstoffen, Puffern oder Treibmitteln, wie sie erforderlich sein könnten, vermischt. Augenformulierungen, Augensalben, Pulver und Lösungen werden ebenfalls als innerhalb des Umfangs dieser Erfindung liegend angesehen.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls in Form von Liposomen verabreicht werden. Wie im Fachgebiet bekannt, werden Liposomen allgemein von Phospholipiden oder anderen Lipidsubstanzen abgeleitet. Liposome werden durch mono- oder multilamellare, hydratisierte Flüssigkristalle gebildet, die in einem wäßrigen Medium dispergiert werden. Jedwedes nichttoxische, physiologisch annehmbare und metabolisierbare Lipid, das zur Bildung von Liposomen in der Lage ist, kann verwendet werden. Die vorliegenden Zusammensetzungen in Liposomenform können zusätzlich zu den Lipoxygenase-inhibierenden Verbindungen der vorliegenden Erfindung Stabilisatoren, Konservierungsstoffe, Arzneimittelträger und dergleichen enthalten. Die bevorzugten Lipide sind die Phospholipide und die Phosphatidylcholine (Lecithine), beide sowohl natürlich als auch synthetisch.
Methoden zur Bildung von Liposomen sind im Fachbereich bekannt; siehe z.B. Methods in Cell Biology, herausgegeben von Prescott, Band XIV, Academic Press, New York, N.Y., Seite 33 ff. (1976).
Die tatsächlichen Dosierungsmengen des aktiven Bestandteils in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können variiert werden, so daß eine Menge an aktivem Bestandteil erhalten wird, die wirksam ist, um eine gewünschte therapeutische Reaktion für eine bestimmte Zusammensetzung und eine bestimmte Verabreichungsmethode zu erhalten. Deshalb hängt die ausgewählte Dosierungsmenge von dem gewünschten therapeutischen Effekt, dem Verabreichungsweg, von der gewünschten Behandlungsdauer und anderen Faktoren ab.
Die gesamte Tagesdosis der Verbindungen dieser Erfindung, welche einem Wirt in einer einzelnen oder in aufgeteilten Dosen verabreicht wird, kann in einem Niengenbereich von z.B. etwa 1 Nanomol bis etwa 5 µmol pro kg Körpergewicht liegen. Eine Dosierungseinheit der Zusammensetzungen kann eine solche Menge enthalten oder solche Teilmengen davon, daß die Tagesdosis zusammenkommt. Es versteht sich allerdings, daß die spezifische Dosismenge für einen bestimmten Patienten von einer Vielzahl von Faktoren abhängt, einschließlich dem Körpergewicht, dem allgemeinen Gesundheitszustand, dem Geschlecht, der Ernährung, der Zeit und dem Weg der Verabreichung, den Raten der Absorption und Ausscheidung, der Kombination mit anderen Arzneimitteln und dem Ausmaß der bestimmten, zu behandelnden Krankheit. Die folgenden Beispiele erläutern weiter den besten Weg zur Ausführung der Erfindung und sollen nicht so ausgelegt werden, daß sie die Beschreibung und die Ansptüche in irgendeiner Weise beschränken.

BEISPIEL 1: Herstellung von 5-O'-Dimethoxytrityl-3-O'-t-butyldimethylsilylthymidin

Dimethoxytritylthymidin (5,0 g, 9,2 mmol) und Imidazol (1,2 g, 18,4 mmol) wurden in 15 ml wasserfreiem Dimethylformamid (DMF) gelöst und mit tert-Butyldimethylsilylchlorid (1,7 g, 11,5 mmol) versetzt.
Die Reaktionsmischung wurde 4 Stunden lang bei Raumtemperatur geführt, mit Ethylacetat verdünnt und mit Wasser und dann mit gesättigtem Natriumchlorid gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Es wurde eine quantitative Ausbeute der Titelverbindung erhalten.

BEISPIEL 2: Herstellung von 3'-O-t-Butyldimethylsilylthymidin

5'-O-Dimethoxy-3'-O-t-butyldimethylsilylthymidin, das gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellt worden war, (0,7 g, 1,1 mmol) wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit 13 ml einer 3%igen Trichloressigsäurelösung in Methylenchlorid behandelt. Die Reaktionsmischung wurde dann mit einer 5%igen (w/v) Natriumbicarbonatlösung neutralisiert. Die organische Schicht wurde mit Natriumsulfat getrocknet. Die Titelverbindung wurde mittels Flash-Chromatographie unter Verwendung eines 0 bis 30%-Gradienten von Ethylacetat in Methylenchlorid gereinigt. Die Ausbeute der Reaktion betrug 85%.

BEISPIEL 3: Herstellung von 3'-O-t-Butyldimethylsilylthymidin-4'-aldehyd

Zu einer gut gerührten Lösung von trockenem Methylenchlorid bei -78ºC wurde Oxalylchlorid (33,0 mmol, 2,88 ml) hinzugesetzt, gefolgt von der tropfenweisen Zugabe von DMSO (3,12 ml, 4,4 mmol). Nach 10 Minuten wurde der nach dem Verfahren von Beispiel 2 hergestellte Alkohol (5,6 g, 15,7 mmol) in 20,0 ml CH&sub2;Cl&sub2; tropfenweise über einen Zeitraum von 2 Minuten hinzugegeben und 45 Minuten lang gerührt. Et&sub3;N (8,1 ml, 58,1 mmol) wurde hinzugesetzt, und das Rühren wurde weitere 45 Minuten lang fortgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur gebracht und dann mit Wasser (2 x 10 ml) und danach mit Salzlösung (10 ml) gewaschen und getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;). Der rohe Aldehyd wurde für den nächsten Schritt verwendet.

BEISPIEL 4: Herstellung von 5'-Vinyl-5'-desoxy-3'-t-butyldimethylsilyldesoxythymidin

Zu einer Lösung von Methyltriphenylphosphoniumbromid (0,7 mmol) in trockenem Tetrahydrofüran (THF) wurde bei 0ºC eine Lösung von Natrium-bis-(trimethylsilylamid) (0,6 mmol) tropfenweise hinzugesetzt. Nach 30 Minuten wurde eine Lösung des entsprechenden 4'-Aldehyds in THF tropfenweise unter Stickstoff hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunden lang gerührt, mit Ethylacetat verdünnt, mit Wasser und dann mit Salzlösung gewaschen und getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;). Die Titelverbindung wurde mittels Flash-Chromatographie unter Verwendung von 20% Ethylacetat-Hexan gereinigt. Die Ausbeute betrug 55 bis 60%.

BEISPIEL 5: Herstellung von 3'-O-t-Butyldimethylsilyl-5'-desoxy-5'-hydroxymethylthymidin

Zu einer Lösung von 2 M 2-Methyl-2-buten (1,6 äq., 1,5 ml, 3 mmol) in 3 ml wasserfreiem THF wurden bei 0ºC 1,6 äq. eines 1 M Boran-Tetrahydofüran-Komplexes (3 ml, 2 mmol) langsam unter N&sub2; hinzugegeben.
Die Lösung wurde 10 Minuten lang gerührt, gefolgt von der Zugabe des Vinylthymidins, welches nach dem Verfahren des Beispiels 4 hergestellt worden war (0,7 g, 1,9 mmol) in 5 ml wasserfreiem THF. Die Reaktionsmischung wurde 45 Minuten lang gerührt und 2 Tage lang in einen Kühlschrank gestellt.
Die Aufarbeitung wurde unter Anwendung einer wäßrigen Lösung, die 3,1 äq. 2 M Natriumhydroxid und 3,1 äq. 30%igem Wasserstoffperoxid beinhaltete, durchgeführt (vorzugsweise durch tropfenweise Zugabe von Wasserstoffperoxid zu der wäßrigen Natriumhydroxidlösung bei 0ºC und 10 minütigem Rühren). Die Lösung wurde langsam mit einem Zugabetrichter der Reaktionsmischung bei 0ºC hinzugesetzt, dann wurde sie 1 Stunde lang gerührt, vom Eisbad entfernt, mit Ethylacetat verdünnt, mit Wasser und dann mit gesättigter Natriumchlorid gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Die Titelverbindung wurde mittels Flash-Chromatographie unter Verwendung eines 20-80%-Gradienten von Ethylacetat in Hexan gereinigt. Die Ausbeute betrug 62%.

BEISPIEL 6: Herstellung von 5'-Iodmethyl-5'-desoxy-3'-O-t-butyldimethylsilylthymidin

Zu einer Lösung von 3'-O-t-Butyldimethylsilyl-5'-desoxy-5'-hydroxymethylthymidin, die gemäß dem Verfahren von Beispiel 5 hergestellt worden war (0,3 g, 0,9 mmol), in trockenem Acetonitril (5 ml) und Ether (3,4 ml) wurden 3 äq. Triphenylphosphin (0,7 g, 2,8 mmol), 4 äq. Imidazol (0,3 g, 3,7 mmol) und 2,2 äq. bd (0,5 g, 2,8 mmol) hinzugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 45 Minuten lang gerührt und das Lösungsmittel abgedampft. Ethylacetat wurde dem Rückstand hinzugesetzt, und der Rückstand wurde mit Wasser, dann mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und mittels Natriumsulfat getrocknet. Die Titelverbindung wurde mittels Flash-Chromatographie unter Verwendung eines 30-50%-Gradienten von Ethylacetat in Hexan gereinigt. Die Ausbeute betrug 90%.

BEISPIEL 7: Herstellung von 3'-O-t-Butyldimethylsilyl-5'-desoxy-5'-thymidylmethylphosphoniumiodid

Zu einer gerührten Lösung von 5'-Iodmethyl-5'-desoxy-3'-O-t-butyldimethylsilylthymidin, hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 6 (480 mg, 1 mmol), in trockenem CH&sub3;CN (5 ml) wurde Triphenylphosphin (1,57 g, 6 mmol) hinzugesetzt, und die Mischung wurde 12 Stunden lang bei 90ºC refluxiert. Die Reaktionsmischung wurde gekühlt und das Lösungsmittel entfernt. Die Titelverbindung wurde mittels Flash-Chromatographie unter Verwendung von 5% MeOH in CH&sub2;Cl&sub2; gereinigt. Das Produkt wurde in einer Ausbeute von 95 bis 96% erhalten.

BEISPIEL 8: Herstellung von 5'-t-Butyldimethylsilyl-3'-desoxy-3'-(1",2"-dihydroxy-3"-propyl)thymidin

Osmiumtetraoxid (OsO&sub4;) (4 Tropfen, 2,5 % (w/v)) in Butanol wurde einer gerührten Mischung aus 3'-(2"-Propenyl)-3'-desoxy-5'-O-t-butyldimethylsilylthymidin (183 mg, 0,5 mmol), hergestellt mittels des in J. Org. Chem., 1989, 54:2767-2769 (C.K. Chu et al.) beschriebenen Verfahrens, und 4-Methylmorpholin-N-oxid (53 mg, 0,45 mmol) in 5,0 ml wasserfreiem THF bei 0ºC hinzugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde dann mit einer 10%igen wäßrigen Natriummetabisulfitlösung (2,0 ml) gelöscht, 20 Minuten gerührt, über einer Lage Siliciumdioxid filtriert und mit Ethylacetat (25,0 ml) verdünnt. Die organische Phase wurde mit Wasser (5,0 ml) und Salzlösung gewaschen und dann mit Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wurde verdampft und die Titelverbindung mittels Flash-Chromatographie gereinigt.

BEISPIEL 9: Herstellung von 5'-O-t-Butyldimethylsilyl-3'-desoxy-thymid-3'yl- acetaldeyhd

Natriumperiodat (214 mg, 1 mmol) wurde einer gerührten Lösung aus dem beim Verfahren des Beispiels 2 hergestellten Thymidindiol (200 mg, 0,5 mmol) in THF-H&sub2;O (4:1-Verhältnis, 5,0 ml) zugesetzt. Nach 1 Stunde wurde die Reaktionsmischung mit Ethylacetat (25 ml) verdünnt, mit H&sub2;O (2 x 5 ml) und dann mit Salzlösung gewaschen und getrocknet. Die Titelverbindung wurde mittels Flash-Chromatographie mit 70% Ethylacetat in Hexan gereinigt.

BEISPIEL 10: Herstellung von Thymidindimeren mit einer Internucleosidbindung aus drei Kohlenstoffatomen

Die Verfahren des Beispiels 10a-10e sind in Fig. 3 gezeigt.
10a. Zu einer gerührten Suspension der gemäß des Verfahrens von Beispiel 7 hergestellten Phosphoniumiodidverbindung (241 mg, 0,326 mmol) in trockenem THF (2,0 ml) wurde Kalium-tert-butoxid (0,62 ml, 1,0 M-Lösung in THF, 0,62 mmol) bei -78ºC unter Stickstoff hinzugesetzt. Nach 20 Minuten setzte man die gemäß dem Verfahren von Beispiel 9 hergestellte 3'-Acetaldehydverbindung (80 mg, 0,22 mmol) hinzu. Nach 60 Minuten wurde die Reaktionsmischung mit Ethylacetat (30 ml) verdünnt, mit Wasser (2 x 5 ml) und dann mit Salzlösung (5 ml) gewaschen und getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde abgedampft, und das Olefinprodukt (Verbindung 1) wurde mittels Flash-Chromatographie unter Verwendung von 70% Ethylacetat in Hexan gereinigt. Die Ausbeute lag im Bereich von 55- 60%.
10b. 10% Pd-C (20 mg) wurde einer gerührten Lösung der Verbindung 1 (109 mg) in Methanol (5,0 ml) bei 25ºC und bei 1 Atmosphäre Druck von Wasserstoff hinzugesetzt. Nach 4 Stunden wurde der Katalysator über eine Lage Celite flltriert und das Lösungsmittel abgedampft.
Die Verbindung 2 wurde dadurch gewonnen und mittels Flash-Chromatographie in 80% Ethylacetat in Hexan gereinigt.
10c. Etwa 2,8 Äquivalente Tetrabutylammoniumfluorid wurden bei 0ºC einer gerührten Lösung der Verbindung 2 (350 mg) in 5,0 ml THF hinzugegeben. Nach 3 Stunden wurde das Lösungsmittel abgedampft und die Verbindung 3 mittels Flash-Chromatographie unter Verwendung von 10% Methanol in CH&sub2;Cl&sub2; gereinigt.
10d. Etwa 0,05 Äquivalente 4-Dimethylaminopyridin, 1,4 Äquivalente Triethylamin und 1,2 Äquivalente 4,4'-Dimethoxytritylchlorid wurden zu einer gerührten Lösung von Verbindung 3 (0,6 mmol) in trockenem Pyridin (4,0 ml) hinzugesetzt. Nach 2 Stunden wurde die Reaktionsmischung mit 2,0 ml Wasser gelöscht und dann mit 2,0 ml Ethylacetat verdünnt. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit Salzlösung gewaschen und getrocknet. Die Verbindung 4 wurde mittels Flash-Chromatographie unter Verwendung von 5% Methanol in Methylenchlorid gereinigt.
10e. Etwa 2,0 Äquivalente Diisopropylethylamin und 1,0 mi trockenes Dichlormethan (CH&sub2;Cl&sub2;) wurden einer gerührten Lösung der Verbindung 4 (0,5 mmol) hinzugesetzt. Nach 30 Minuten gab man 0,75 Äquivalente 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit hinzu, und zwar tropfenweise während eines Zeitraums von 20 Minuten, und man setzte das Rühren eine weitere Stunde fort. Dann wurde das Lösungsmittel abgedampft und die Verbindung 5 mittels Flash-Chromatographie unter Verwendung von Ethylacetat (1% Triethylamin enthaltend) unter einer Stickstoffatmosphäre gereinigt.
Die Arbeitsschritte der oben erwähnten Stufen a bis d werden zur Herstellung von Dimeren angewandt, welche 3-Kohlenstoff-Internucleosidbindungen enthalten, in denen alle drei Kohlenstoffe die Formel -CH&sub2;- aufweisen.
Irgendeines oder alle Kohlenstoffatome können gegebenenfalls durch eine Modifizierung des in Fig. 3 erläuterten Verfahrens hydrolysiert werden, und zwar wie folgt. Ein Tropfen einer 2,5%igen (w/v) Lösung von Osmiumtetraoxid in t-Butanol bei 0ºC wurde zu einer gerührten Lösung von Verbindung 1 und 4-Methylmorpholin-N-oxid (9,1 mg) in 0,8 ml THF gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 24 Stunden lang bei 0ºC gehalten, mit einer wäßrigen Lösung von Natriummetabisulfit gelöscht, mit Ethylacetat verdünnt und mit Wasser und Salzlösung gewaschen. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und das resultierende hydroxylierte Dimer wurde mittels Dünnschicht-Chromatographie unter Verwendung von Ethylacetat als Bluent gereinigt.
Dann wird das hydoxylierte Dimer geschützt und die 5'- und 3'-Enden, wie in den oben erwähnten Schriffen b-d modifiziert.

BEISPIEL 11: Herstellung von hydroxylierten Internucleosidbindungen mit drei Kohlenstoffatomen

Die in den Schriffen a bis d hergestellten Thymidindimer-Phosphoramidit-Verbindungen wurden in einem modifizierten Festphasen-Phosphoramidit-Syntheseverfahren eingesetzt, um die Oligonucleosidsequenzen der Tabelle 1 herzustellen.
Die Oligodesoxynucleotide wurden vom 3'- zum 5'-Ende synthetisiert. Tabelle 1 Sequenz Referenz-Code Thymidin Tetraethylenglykol
Die Synthese wurde dann nach einem modifizierten Phosphorannidit-Verfahren fortgesetzt. Die 5'- Hydroxylgruppe des angefügten Thymidins wurde mit Trichloressigsaure umgesetzt, um die 5'- Hydroxylgruppe zu entschützen. Nach diesem Entschützungsschritt wurde das angefügte Thymidin mit dem Aktivierungsmittel Tetrazol und einem aus Dimethoxytrityltetraethylenglykolcyanophosphin bestehenden Phosphoramidit-Reagenz umgesetzt. Nach dem Aktivierungsschritt wurden die 5'-Hydroxylgruppen mit Essigsäureanhydrid und N-Methylimidazol blockiert. Die Phosphorbindung wurde dann mit bd nach Standardverfahren oxidiert. Bei den Sequenzen 1 und 2, die zwei Tetraethylenglykol(TEG)-Reste enthielten, wurden die Schritte des Entschützens, Aktivierens, Blockierens und Oxidierens, wie oben beschrieben, wiederholt.
Man setzte die Kettenverlängerung dann mittels der in Reihe erfolgenden Standardschritte des Entschützens, Aktivierens, Blockierens und Oxidierens mit der Modifikation durch, daß man ein durch drei Kohlenstoffatome verknüpftes Thymidindimer, welches nach den Verfahren der Beispiele 1 bis 9 hergestellt worden war, während eines Aktivierungsschriifes dort in die Kette einführte, wo es erwünscht wurde.
Am Ende des Zusammenbaus der Kette wurden die Thymidinoligomere von dem CPG-Träger mittels konzentriertem Ammoniumhydroxid entfernt. Die Lösung wurde dann bei 55ºC 8 bis 15 Stunden lang weiterbehandelt, um alle Schutzgruppen auf den exocyclischen Aminen der Basen zu entfernen.

BEISPIEL 12: Herstellung von 3'-O-Acetyl-5'-carbomethoxymethyl-5'-desoxythymidin

Etwa 0,39 g Natriumborhydrid wurden einer kalten (Eisbad), gerührten Mischung aus 3,17 g 3'-O-Acetyl-5'-carbomethoxymethylen-5'-desoxythymidin in 95 ml Isopropanol hinzugesetzt. Die Mischung wurde bei 0ºC unter Stickstoffatmosphäre eine halbe Stunde lang gerührt, dann bei Raumtemperatur weitere viereinhalb Stunden lang gerührt.
Die gekühlte Mischung wurde mit 20 ml Methanol gelöscht, gefolgt von 200 ml destilliertem Wasser nach 30 Minuten, und dann wurde sie mit mehreren Portionen Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung behandelt und mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Trocknungsmittel wurde abfiltriert und das Lösungsmittel abgedampft, was zu 2,7 g der Titelverbindung als zurückbleibendes Glas führte.

BEISPIEL 13: Herstellung von 5'-Carbomethoxymethyl-5'-desoxythymidin

Etwa 10 Tropfen einer 25%igen (w/v) methanolischen Lösung von Natriummethoxid wurden einer kalten, gerührten Lösung von 2,22 g 3'-O-Acetyl-6'-carbomethoxymethyl-5'-desoxythymidin, hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 12, in etwa 300 ml trockenem (durch ein Bett aus neutralem Aluminiumoxid gerührten) Methanol hinzugegeben. Die Mischung wurde unter einer Stickstoffatmosphäre etwa 20 Stunden lang gerührt, ohne erneutes Auffüllen des Eisbades.
Eine geringe Menge Kationenaustauschharz (Bio-Rad AG 50WX8) wurde hinzugesetzt, und die Mischung wurde 30 Minuten lang gerührt. Man entfernte das Lösungsmittel unter reduziertem Druck, was zu 2,1 g als zurückbleibendem Glas führte, welches mit warmem Toluol behandelt wurde, und nach dem Abkühlen, Filtrieren und Ausspülen mit Cyclohexan wurde ein Rohprodukt als weißer Feststoff in einer Menge von 1,64 g erhalten.
Die Titelverbindung wurde weiter von Spuren des Ausgangsmaterials mittels Silicagel-Chromatographie unter Elution mit Ethylacetat und anschließender Umkristallisation aus Ethylacetat/Hexan gereinigt, wodurch weiße Kristalle erhalten wurden.

BEISPIEL 14: Herstellung von 3'-O-t-Butyldimethylsilyl-5'-(2"-hydroxyethyl)thymidin

Etwa 19 ml einer Lösung von 1 M Diisobutylaluminiumhydrid in Tetrahydrofüran (THF) wurden einer kalten (-40 bis -30ºC), gerührten Lösung aus 1,88 g 3'-O-t-Butyldimethylsilyl-5'-carboethoxymethyl-5'-desoxythymidin in 40 ml wasserfreiem THF unter Stickstoffatmosphäre zugesetzt. Die Reaktionstemperatur wurde dann langsam auf -20ºC erhöht.
Die Mischung wurde mit etwa 3,5 ml Methanol gelöscht, worauf sich die Reaktionstemperatur auf -10ºC erhöhte. Etwa 18 ml Wasser in 36 ml THF wurden der warnnen Mischung hinzugesetzt, und die Temperatur stieg weiter auf 10ºC an. Fast das gesamte THF wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde mit etwa dem 2-fachen Volumen an Wasser verdünnt. Man extrahierte die wäßrige Phase mehrere Male mit Ethylacetat/Chloroform. Die vereinigten Extrakte wurden mit kalter 2N Salzsäure und Salzlösung gewaschen, mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck von dem Filtrat entfernt, wodurch die Titelverbindung erhalten wurde (etwa 1,6 g).

BEISPIEL 15: Herstellung von 3'-O-t-Butyldimethylsilyl-5'-(2"-iodethyl)-5'-desoxy- thymidin

Etwa 1 g p-Toluolsulfonylchlorid wurde einer Lösung aus 1 g 3'-O-t-Butyldimethylsilyl-5'-(2"- hydroxyethyl)-5'-desoxythymidin, hergestellt gemäß dem Verfahren von Beispiel 14, in 25 bis 30 ml wasserfreien Pyridin hinzugesetzt, und die Mischung wurde zugestöpselt etwa 19 Stunden lang bei etwa 5ºC gehalten.
Die Mischung wurde zu etwa 200 ml Eiswasser gegeben und mehrere Male mit Ether extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit kalter 2 N Salzsäure, Wasser und Salzlösung gewaschen. Die gewaschenen Extrakte wurden mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Das Lösungsmittel wurde vom Filtrat mittels reduziertem Druck entfernt, wodurch 1,24 g zurückbleibendes Glas mit dem p-Toluolsulfonylderivat erhalten wurden.
Etwa 0,54 g des p-Toluolsulfonylderivats und 0,38 g Natriumiodid wurden in 55 ml trockenem (Molekularsiebe 4A) Aceton 3 Tage lang gelöst, gefolgt von der weiteren Zugabe von 0,19 g Natriumiodid unter Rühren während eines letzten Tages.
Die Reaktionsmischung wurde filtriert und das Lösungsmittel wurde abgedampft, wodurch das Rohprodukt erhalten wurde.
Das Rohprodukt wurde mittels Chromatographie auf 85 g Silicagel unter Elution mit 25% Ethylacetat in Hexan gereinigt. Das Lösungsmittel wurde abgedampft, wodurch 0,4 g des gewünschten 3'-O-t-Butyldimethylsilyl-5'(2"-iodethyl)-5'-desoxythymidin erhalten wurden.

BEISPIEL 16: Herstellung von 5'-Carbomethoxymethylen-5'-desoxythymidin

Etwa 10 Tropfen einer 25%igen Natriummethoxidlösung in Methanol wurden einer gerührten Lösung von 1,5 g 3'-O-Acetyl-5'-carbomethoxymethylen-5'-desoxythymidin in 150 ml trockenem Methanol (durch ein Bett aus neutralem Aluminiumoxid gerührt) zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur unter einer Stickstoffatmosphäre während weiterer 6 Stunden gerührt.
Eine geringe Menge eines Kationenaustauschharzes (Bio-Rad AG-50W-X8) wurde der Mischung unter Rühren während 10 Minuten hinzugesetzt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, wodurch ein weißer fester Rückstand mit einem Gewicht von 1,3 g erhalten wurde. Der Rückstand wurde zweimal mit warmem Toluol trituriert, dann in heißem Ethanol aufgenommen, filtriert und abgeltuhlt, wodurch die Titelverbindung als ein weißes kristallines Produkt mit einem Gewicht nach dem Trocknen von 0,85 g erhalten wurde.

BEISPIEL 17: Herstellung von 3'-O-t-Butyldimethylsilyl-5'-(2"-hydroxyethylen)-5'- desoxythymidin

Eine Lösung von 296 mg 5'-Carbethoxymethylen-5'-desoxythymidin wurde tropfenweise unter einer Stickstoffatmosphäre einer kalten (Eiswasserbad) gerührten Lösung von 205 mg Imidazol und 227 mg t-Butyldimethylsilylchlorid in 1 ml wasserfreiem Dimethylformamid zugegeben. Nach vollständiger Zugabe wurde die Mischung vom Eis entfernt, und das Rühren wurde bei Umgebungstemperatur 2 Stunden lang, dann bei 35ºC weitere 2 Stunden lang und schließlich eine halbe Stunde lang bei 40ºC fortgesetzt.
Die Mischung wurde dann mit 2 ml Methanol gelöscht, gefolgt von zwei bis drei Volumina Wasser. Die wäßrige Phase wurde mehrere Male mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Wasser, gesättigter Bicarbonatlösung und Salzlösung gewaschen, mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und flitriert. Das Lösungsmittel wurde vom Filtrat mittels reduziertem Druck entfernt, wodurch 0,40 g 3'-O-t-Butyldimethylsilyl-5'-carbomethoxymethylen-5'-desoxythynildin erhalten wurden.
Etwa 4 ml einer 1 M Lösung von Diisobutylalunnniumhydrid in Tetrahydrofüran wurden tropfenweise zu einer auf -30ºC bis -35ºC abgekühlten Lösung von 0,37 g des in 10 ml wasserfreiem Tetrahydrofüran gelösten 3'-O-t-Butyldimethylsilyl-5'-carbomethoxymethylen-5'-desoxythymidin bei einer Temperatur von unter -30ºC zugesetzt. Nachdem die Zugabe abgeschlossen war, wurde die Reaktionsmischung unter einer Stickstoffatmosphäre weitere 2 Stunden gerüht, wobei die Innentemperatur im Bereich zwischen etwa -30ºC und etwa -20ºC gehalten wurde.
Etwa 0,8 ml Methanol wurden der Reaktionsmischung hinzugesetzt, gefolgt von der Zugabe einer Lösung von 4 ml Wasser in 8 mi Tetrahydrofüran. Das meiste des flüchtigen Tetrahydrofürans wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der wäßrige Rückstand wurde mit dem zweifachen seines Volumens an Wasser verdünnt und mehrere Male mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit kalter 1 N Salzsäure und Salzlösung gewaschen, mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filtrat wurde abgestrippt, wodurch eine Ausbeute von 0,267 g an der Titelverbindung zurückblieb.
Ein Teil dieses Materials wurde bis auf analytische Reinheit mittels Chromatographie auf Silicagel unter Elution mit 50% Ethylacetat/Hexan gereinigt.

BEISPIEL 18: Herstellung von Thymidindimeren mit einer Internucleosidbindung aus zwei Kohlenstoffatomen und einem Sauerstoffatom (3'-O-C-C-5')

18a. Zu einer gerührten Lösung von 5'-O-Tritylthymidin wird jeweils eine äquimolare Menge einer Base und 3'-O-t-Butyldimethylsilyl-5'-(2"-iodethyl)-5'-desoxythynnidin bei 0ºC hinzugesetzt. Der Verlauf der Reaktion wird mittels Dünnschicht-Chromatographie (TLC) überwacht. Nach Beendigung der Reaktion wird das gewünschte Dimer isoliert und mittels Flash-Chromatographie gereinigt.
18b. Zu einer gerührten Lösung von 3'-O-t-Butyldimethylsilyl-5'-(2"-hydroxyethyl)-5'-desoxythymidin, die bei einer Temperatur von etwa -5ºC gehalten wurde, wurden 2 Äquivalente an Base hinzugesetzt und das Lösungsmittel bis zur Trockenheit verdampft. Der Rückstand wurde erneut in DMF aufgelöst, und 1 Äquivalent an 5'-Dimethoxytrityl-2',3'-cyclothymidin hinzugesetzt. Die Reaktionsmischung wird auf etwa 40ºC erhitzt, und die Bildung des gewünschten Dimeren mittels TLC überwacht. Nach Beendigung der Reaktion wurde das gewünschte Dimer isoliert und mittels Flash-Chromatographie gereinigt.

BEISPIEL 19: Entschützung des 3'-Endes des Dimeren von Beispiel 18

Die 3'-t-Butyldimethylsilyl-Schutzgruppe der geschützten Dimere wurde durch die Behandlung einer THF-Lösung des Dimeren von Beispiel 18 mit 2,8 Äquivalenten Tetrabutylammoniumf[uorid bei 0ºC entfernt. Nach Beendigung der Reaktion (im allgemeinen etwa 3 Stunden) wurde das Lösungsmittel verdampft und das gewünschte Dimer isoliert und mittels Flash-Chromatographie gereinigt.

BEISPIEL 20: Herstellung einer für die automatisierte Synthese geeigneten funktionalisierten Dimereinheit

Das Dimerprodukt des Beispiels 19 wird in Dichlormethan gelöst und mit 2 Äquivalenten Diisopropylethylamin versetzt. Die Mischung wird 30 Minuten lang gerührt, gefolgt von einer tropfenweisen Zugabe von 0,75 Äquivalenten an 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit wänrend eines Zeitraums von etwa 20 Minuten. Das Rühren wird für eine weitere Stunde fortgesetzt, das Lösungsmittel verdampft, und das resultierende funktionalisierte Dimer auf einer Flash- Chromatographiesäule unter Verwendung von Ethylacetat unter inerter Atmosphäre isoliert und gereinigt.

BEISPIEL 21: Herstellung von 5'-t-Butyldimethylsilyl-3'-desoxy-3'-(1",2"-dihydroxy- 3"-propyl)thymidin

Osmiumtetraoxid (OsO&sub4;) (4 Tropfen, 2,5% w/v) in Butanol wurde zu einer gerührten Mischung aus 3'-(2"-propenyl)-3'desoxy-5'-O-t-butyldimethylsilylthymidin (183 mg, 0,5 mmol), hergestellt gemäß dem Literaturverfahren, und 4-Methylmorpholin-N-oxid (53 mg, 0,45 mmol) in 5,0 ml trockenem THF bei 0ºC hinzugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde dann mit 10%iger wäßriger Natriummetabisulfitlösung (2,0 ml) gelöscht, 20 Minuten lang gerührt, über eine Lage Siliciumdioxid filtriert und mit Ethylacetat (25,0 ml) verdünnt. Die organische Phase wurde mit Wasser (5, ml) und Salzlösung gewaschen und dann mit Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wurde verdampft und die Titelverbindung mittels Flash-Chromatographie gereinigt.

BEISPIEL 22: Herstellung von 3'-Desoxy-thymid-3-yl-acetaldehyd-5'-O-t-butyldimethylsilylthymidin

Natriumperiodat (214 ml, 1 mmol) wurde einer gerührten Lösung des mittels des Verfahrens von Beispiel 21 hergestellten Thymidindiols (200 mg, 0,5 mmol) in THF-H&sub2;O (4;1-Verhältnis, 5,0 ml) hinzugesetzt. Nach 1 Stunde wurde die Reaktionsmischung mit Ethylacetat (25,0 ml) verdünnt, mit H&sub2;O (2 x 5,0 ml) und Salzlösung gewaschen und getrocknet. Die Titelverbindung wurde mittels Flash-Chromatographie mit 70% Ethylacetat in Hexan gereinigt.

BEISPIEL 23: Herstellung von 5'-O-(p-Toluolsulfonyl)thymidin

Zu einer gerührten Lösung von Thymidin (20 g, 82,6 mmol) in trockenem Pyridin (200 ml) wurde p-Toluolsulfonylchlorid (47,2 g, 247,6 mmol) bei 0ºC unter einer Stickstoffatmosphare hinzugesetzt. Nach 3 Stunden wurde die Reaktionsmischung auf Eis gegossen und mit Ethylacetat extrahiert. Das Lösungsmittel wurde verdampft und das Produkt aus einer Mischung von Ethylacetat und Methanol kristallisiert. Die Titelverbindung war ein in einer Ausbeute von 70 bis 75% erhaltener weißer kristalliner Feststoff.

BEISPIEL 24: Herstellung von 5'-Iod-5'-desoxythymidin

Zu einer geruhrten Lösung des gemäß dem Verfahren von Beispiel 23 hergestellten Thymidintosylats (10,65 g, 26,9 mmol) in trockenem Aceton (75 ml) wurde Natriumiodid (10 g, 66,7 mmol) hinzugesetzt und die Mischung 16 Stunden lang refluxiert. Das Lösungsmittel wurde abgedampft, und es wurde mit Ethylacetat verdünnt. Die organische Phase wurde mit Wasser (2 x 20 ml) und Salzlösung (10 ml) gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Die Titelverbindung wurde aus Methanol kristallisiert, und zwar als weißer kristalliner Feststoff in einer Ausbeute von 90 bis 95%.

BEISPIEL 25: Herstellung von 3'-O-t-Butyldimethylsilyl-5'-iod-5'-desoxythymidin

Zu einer gerührten Lösung des gemäß dem Verfahren von Beispiel 24 hergestellten Thymidiniodids (8,0 g, 24,7 mmol) in trockenem DMF wurde Imidazol (4,2 g, 61,7 mmol) hinzugesetzt. Nach 5 Minuten wurde tert-Butyldimethylsilylchlorid (4,47 g, 29,64 mmol) hinzugesetzt und die Mischung 4 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann mit Ethylacetat (250 ml) verdünnt, mit Wasser (2 x 100 ml) und Salzlösung (50 ml) gewaschen und dann mit Natriumsulfat getrocknet. Die Titelverbindung wurde mittels Flash-Chromatographie unter Verwendung von 60% Ethylacetat in Hexan zu einer Ausbeute von 92% gereinigt.

BEISPIEL 26: Herstellung von 3'-O-t-Butyldiinethylsilyl-5'-azido-5'-desoxythymidin

Einer gerührten Lösung von dem durch das Verfahren von Beispiel 25 hergestellten 3'-O-t- Butyldimethylsilyl-5'-iod-5'-desoxythymidin (10,8 g, 20 mmol) in trockenem DMF (50 ml) wurde Natriumazid (3,9 g, 60 mmol) hinzugesetzt, und die Mischung 12 Stunden lang bei 0ºC erhitzt. Dann wurde die Reaktionsmischung mit Ethylacetat (200 ml) verdünnt, mit Wasser (2 x 50 ml) und Salzlösung (50 ml) gewaschen und danach mit Natriumsulfat getrocknet. Die Titelverbindung wurde mittels Flash-Chromatographie unter Verwendung von 50% Ethylacetat in Hexan zu 90%iger Ausbeute gereinigt.

BEISPIEL 27: Herstellung von 3'-O-t-Butyldimethylsilyl-5'-amino-5'-desoxythymidin

Zu einer gerührten Lösung des gemäß dem Verfahren von Beispiel 26 hergestellten Thymidinazids (5,0 g, 13,1 mmol) in MeOH wurden 200 mg 10% Pd-C unter Stickstoffatmosphäre hinzugesetzt. Das Stickstoffgas wurde dann evakniert und durch Wasserstoff ersetzt. Der Evaknierungs- und Austauschschritt wurde zweimal wiederholt, und das Rühren wurde unter einem Wasserstoffdruck von 1 Atmosphäre 12 Stunden lang fortgesetzt. Der Wasserstoff wurde entfernt und der Katalysator über eine Lage Celite filtriert, und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt. Das Rohprodukt reinigte man mittels Flash-Chromatographie unter Verwendung von 5 bis 10% MeOH in CH&sub2;Cl&sub2;, wodurch die Titelverbindung in 85-87%iger Ausbeute erhalten wurde.

BEISPIEL 28: Herstellung von 3'-Azido-3'-desoxy-5'-O-dimethoxytritylthymidin

Zu einer geruhrten Lösung von 3'-Azido-3'-desoxythymidin (2,67 g, 10 mmol) in trockenem Pyridin (50 ml) wurden 4-Dimethylaminopyridin (61 mg, 0,5 mmol), Triethylamin (1,9 ml, 14 mmol) und 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (4,1 g, 12 mmol) der Reihe nach hinzugesetzt. Nach 3 Stunden wurde Wasser (30 ml) hinzugeffigt, und es wurde mit Ethylacetat (250 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit Salzlösung (50 ml) gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Die Titelverbindung wurde mittels Flash-Chromatographie unter Verwendung von 5% Methanol in Methylenchlorid mit 80-85%iger Ausbeute gereinigt.

BEISPIEL 29: Herstellung von 3'-Amino-3'-desoxy-5'-O-dimethoxytritylthymidin

Zu einer gerührten Lösung des gemäß dem Verfahren von Beispiel 28 hergestellten Thymidinazids (3,99 g, 40 mmol) in MeOH wurden 200 mg 10% Pd-C unter Argonatmosphäre hinzugegeben. Das Argongas wurde durch ein angelegtes Vakuum entfernt, und Wasserstoff wurde eingeführt. Diese Prozedur wurde zweimal wiederholt, und das Rühren wurde unter einem Wasserstoffdruck von 1 Atmosphäre 12 Stunden lang fortgesetzt. Dann wurde der Wasserstoff entfernt und der Katalysator über eine Lage Celite flitriert und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wurde mittels Flash-Chromatographie unter Verwendung von 5% MeOH in Methylenchlorid gereinigt, wodurch die Titelverbindung in 90-93%iger Ausbeute erhalten wurde.
¹H NMR (300 MHZ, CDCl&sub3;): δ 7,61 (s, 1 H), 7,60-7,21 (m, 1H) 6,83-6,87 (m, 3 H), 6,85 (t, J=8,5 Hz, 1 H), 3,80 (s, 6 H), 3,81-3,73 (m, 2 H), 3,53-3,49 (m, 1 H), 3,38-3,33 (m, 1 H), 2,36- 2,33 (m, 1 H), 2,25-2,20 (m, 1 H), 1,51 (s, 3 H); IR rein vmax 3020, 2962, 1697, 1605, 1512, 1246, 1030 cm&supmin;¹.

BEISPIEL 30: Herstellung von 5-O'-Dimethoxytrityl-3-O'-t-butyldimethylsilylthymidin

Dimethoxytritylthymidin (5,0 g, 9,2 mmol) und Imidazol (1,2 g, 18,4 mmol) wurden in 15 ml wasserfreiem Dimethylformamid (DMF) gelöst und zu tert-Butyldimethylsilylchlorid (1,7 g, 11,5 mmol) hinzugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, mit Ethylacetat verdünnt und mit Wasser und danach mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und mittels Natriumsulfat getrocknet. Es wurde ein quantitative Ausbeute der Titelverbindung erhalten.

BIESPIEL 31: Herstellung von 3'-O-t-Butyldimethylsilylthymidin

Gemäß dem Verfahren von Beispiel 30 hergestelltes 5'-O-Dimethoxytrityl-3'-O-t-butyldimethylsilylthymidin (0,7 g, 1,1 mmol) wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit 13 mi einer 3%igen Lösung von Trichloressigsäure in Methylenchlorid behandelt. Die Reaktionsmischung wurde dann mit einer 5%igen (w/v) Natriumbicarbonatlösung neutralisiert. Die organische Schicht wurde mit Natriumsulfat getrocknet. Dann reinigte man die Titelverbindung mittels Flash-Chromatographie unter Verwendung eines 0- bis 30%-Gradienten von Ethylacetat in Methylenchlorid. Die Ausbeute der Reaktion betrug 85%.

BEISPIEL 32: Herstellung von 3'-O-t-Butyldimethylsilyl-5'-carbethoxymethylen- 5'-desoxythymidin

Zu einer gut gerührten Lösung von trockenem Methylenchlorid bei -78ºC wurde Oxalylchlorid (33,0 mmol, 2,88 ml) hinzugesetzt, gefolgt von der tropfenweisen Zugabe von DMSO (3,12 ml, 44 mmol). Nach 10 Minuten wurde der gemäß dem Verfahren von Beispiel 31 hergestellte Thymidinalkohol (5,6 g, 15,7 mmol) in 20,0 mi CH&sub2;Cl&sub2; tropfenweise uber einen Zeitraum von 2 Minuten hinzugesetzt, und das Rühren wurde 45 Minuten lang fortgesetzt. Et&sub3;N (8,1 ml, 58,1 mmol) wurde hinzugegeben, und das Rühren wurde weitere 30 Minuten lang fortgesetzt. Dann brachte man die Reaktionsmischung über einen Zeitraum von 30 Minuten auf -23ºC. Dann setzte man Carbethoxymethylentriphenylphosphoran (10,94 g, 31,4 mmol) hinzu und rührte die Reaktionsmischung 12 Stunden lang bei Raumtemperatur. Die Reaktionsmischung wurde dann mit Wasser (2 x 125 ml) und Salzlösung (50 ml) gewaschen und getrocknet (NA&sub2;SO&sub4;). Das Rohprodukt wurde mittels Flash-Chromatographie unter Verwendung von 20% Ethylacetat- Hexan T 40% Ethylacetat-Hexan gereinigt, wodurch sowohl das Trans- als auch das Cis-Isomere der Titelverbindung in einem Verhältnis von 3:1 erhalten wurde. Die Ausbeute betrug zusammen etwa 72-76%.
Daten der Transverbindung: IR (rein) νmax 3205, 3180, 2982, 2964, 1698, 1490, 1274 cm&supmin;¹; ¹H-NMR(300 MHZ, CDCl&sub3;): δ 7,04 (s, 1 H), 6,87 (dd. J=15,6 und 5,4 Hz, 1 H), 6,23 (t, J=6,7 Hz, 1 H), 6,03 (dd, J=15,6 und 1,6 Hz, 1 H), 4,33-4,28 (m, 1H), 4,14 (q, J=71 Hz 2 H) 4,16-4,12 (m, 1 H) 2,28-2,19 (m, 1 H), 2,09-1,98 (m, 1 H) 1,87 (s, 3H), 1,23 (t, J=7,1 Hz, 3H), 0,81 (s, 9H) 0,01 (s, 6 H); berechnet für C&sub2;&sub0;H&sub3;&sub2;O&sub6;N&sub2;Si; C, 56,58; H, 7,60; N, 6,60; gefunden: C, 56,36; H, 7,30; N, 6,60.

BEISPIEL 33: Herstellung von 3'-O-t-Butyldiniethylsilyl-5'-carbethoxymethyl-5'- desoxythymidin

Zu einer gerührten Lösung des gemäß dem Verfahren von Beispiel 32 hergestellten ungesättigten Thymidinesters (4,24 g, 10 mmol) in EtOAc wurden 200 mg 10% Pd-C unter Stickstoffatmosphäre hinzugesetzt. Das Stickstoffgas wurde durch Vakuum entfernt, und Wasserstoff wurde eingeführt. Diese Prozedur wurde zweimal wiederholt, und das Rühren wurde unter einem Wasserstoffdruck von 1 Atmosphäre 16 Stunden lang fortgesetzt. Dann wurde der Katalysator über eine Lage Celite filtriert und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Das Produkt wurde aus einer Mischung von Hexan und Ethylacetat kristallisiert. Die Titelverbindung wurde mit 95%iger Ausbeute erhalten.
IR (rein) νmax: 3180, 2925, 2950, 1696, 1486, 1260, 1240 cm&supmin;¹; ¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;): δ 7,20 (s, 1 H), 6,11 (t, 6,6=Hz, 1 H) 4,07 (q, J=7,1 Hz, 2 H), 4,03-3,98 (m, 1 H), 3,73-7,69 (m, 1H), 2,51-2,32 (m, 2 H), 2,24-2,15 (m, 1 H), 1,18 (t, J=7,1 Hz, 3 H), 0,81 (s, 9 H), 0,01 (s, 6 H), Anal. berechnet für C&sub2;&sub0;H&sub3;&sub4;O&sub6;N&sub2;Si: C, 56,31; H, 8,03; N, 6,57; gefünden: C, 55,91; H, 7,74; N, 6,50.

BEISPIEL 34: Herstellung von 3'-O-t-Butyldimethylsilyl-5'-desoxy-thymid-5-yl- acetaldehyd

Zu einer gerührten Lösung des gemäß dem Verfahren von Beispiel 33 hergestellten Thymidin esters (3,41 g, 8 mmol) in 60 nil trockenem CH&sub2;Cl&sub2; wurde bei -78ºC DiBAL-H (16,4 ml, 1,0 M- Lösung in Hexan, 16,4 mmol) tropfenweise über einen Zeitraum von 3 Minuten hinzugesetzt. Nach 20 Minuten wurde die Reaktionsmischung mit 300 ml EtOAc verdünnt und zweimal mit 50 ml einer gesättigten Natriumkaliumtartratlösung gewaschen. Die organische Phase wurde mit Salzlösung (25 ml) gewaschen und getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;). Die Titelverbindung wurde mittels Flash-Chromatographie unter Verwendung von 50% bis 70% Ethylacetat-Hexan mit einer Ausbeute von 85-87% gereinigt.

BEISPIEL 35: Herstellung von einem Desoxythymidindimeren mit einer 3'-C-C-N-5'- Internucleosidbindung (Fig. 3)

35a. Zu einer gerührten Lösung des Thymidinamins von Beispiel 27 (1,07 g, 3 mmol) und des Thymidinaldehyds von Beispiel 22 (1,38 g, 3,6 mmol) in 50 ml Ethanol und 10 ml einer wäßrigen Pufferlösung (pH = 5,5, NaH&sub2;PO&sub4;-NaOH) wurde eine Lösung von NaCNBH&sub3; in THF (12 ml, 1,0 M-Lösung in THF, 12 mmol) tropfenweise bei einer Temperatur von 5ºC während einer Zeitdauer von 1 Stunde hinzugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde weitere 4 Stunden gerührt und mit 2,50 ml Ethylacetat verdünnt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser (2 x 40 ml) und Salzlösung (25 ml) gewaschen und getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;). Die Verbindung 1 (Fig. 6) wurde mittels Flash-Chromatographie mit einer Ausbeute von 62- 64% gereinigt, indem zuerst mit Ethylacetat und dann mit 5T8%-MeOH-CH&sub2;Cl&sub2; eluiert wurde.
¹H-NMR (300 MHZ, CDCl&sub3;) δ 7,60 (s, 1 H), 7,19 (s, 1 H), 6,18 (t, J=6,6 Hz, 1 H), 6,08 (t, J=3,9 Hz, 1 H), 4,29-4,23 (m, 1 H), 4,15-3,98 (m, 1 H), 3,91-1,85 (m, 1 H), 3,70-3,78 (m, 2 H), 2,95-2,87 (m, 1 H), 2,84-2,66 (m, 3 H), 2,35-2,05 (m, 5 H), 1,94 (s, 3 H), 1,93 (s, 3 H), 1,80-1,63 (m, 1 H), 1,55-1,45 (m, 1 H), 0,93 (s, 9 H), 0,69 (s, 9 H), 0,11 (s, 6 H), 0,07 (s, 6 H).
35b. Verbindung 1 (Fig. 6) (166 mg, 0,23 mmol) wurde einer gerührten Lösung aus Trifluoressigsäureanhydrid (0,32 ml, 2,3 mmol) und Triethylamin (0,64 ml, 4,6 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (5,0 ml) hinzugesetzt. Nach 2 Stunden wurde die Reaktionsmischung mit wäßrigem NaHCO&sub3; (5,0 ml) gelöscht und mit EtOAc (25 ml) verdünnt. Die organische Phase wurde mit Wasser (2 x 10 ml) und Salzlösung (5 ml) gewaschen und getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;). Die Verbindung 2 (Fig. 6) wurde mittels Flash-Chromatographie unter Verwendung von 7% MEOH in CH&sub2;Cl&sub2; mit einer Ausbeute von 91-93% gereinigt.
35c. Zu einer gerührten Lösung der Verbindung 2 (164 mg, 0,2 mmol) in THF (4,0 ml) wurde Tetrabutylammoniumfluorid (0,8 mmol) bei 0ºC hinzugesetzt. Nach 2 Stunden wurde das Lösungsmittel abgedampft, und die Verbindung 3 (Fig. 6) wurde mittels Flash-Chromatographie unter Verwendung von 5%-8% MEOH in CH&sub2;Cl&sub2; mit einer Ausbeute von 90% gereinigt.
35d. Zu einer gerührten Lösung der Verbindung 3 (151 mg, 0,26 mmol) in trockenem Pyridin (3,0 ml) wurden 4,4-Dimethylaminopyridin (1,6 mg, 0,0128 mmol) und Triethylamin (0,057 ml, 0,42 mmol) gegeben. Nach 5 Minuten wurde Dimethoxytritylchlorid (121 mg, 0,358 mmol) hinzugesetzt und fortgesetzt gerührt. Nach 2 Stunden wurde die Reaktionsmischung mit Ethylacetat (25 ml) verdünnt und mit Wasser (2 x 10 ml) und Salzlösung (5 ml) gewaschen und getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;). Das Rohprodukt wurde mittels Flash-Chromatographie unter Verwendung von 7% MeOH in CH&sub2;Cl&sub2; gereinigt, wodurch die Verbindung 4 (Fig. 3) zu einer Ausbeute von 85-87% erhalten wurde.
35e. Trockenes Diisopropylethylamin (0,15 ml, 0,67 mmol) wurde der Verbindung 4 (150 mg, 0,168 mmol) hinzugesetzt, gefolgt von trockenem CH&sub2;Cl&sub2; (0,5 ml). Dann wurde der Kolben geschüttelt, um den Alkohol zu lösen, und 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit (0,056 ml, 0,25 mmol) wurde während eines Zeitraums von 20 Sekunden hinzugesetzt. Nach 45 Minuten wurde die Reaktionsmischung mit CH&sub3;OH (1,0 ml) gelöscht, mit EtOAc (50 ml) und Et&sub3;N (1,0 ml) verdünnt, mit 10% wäßrigem K&sub2;CO&sub3; (2 x 5,0 ml) gewaschen, dann mit Salzlösung (5,0 ml) gewaschen und getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;). Das Rohprodukt wurde mittels Flash-Chromatographie unter Verwendung von EtOAc gereinigt, wodurch die Verbindung 5 (Fig. 6) in 70-75%iger Ausbeute erhalten wurde.

BEISPIEL 36: Herstellung eines Desoxythymidindimeren mit einer 3'-N-C-C-5'- Internucleosidbindung (Fig. 4)

36a. Zu einer gerührten Lösung des Amins von Beispiel 29 (2,72 g, 5 mmol) und des Aldehyds von Beispiel 34 (2,29 g, 6 mmol) in 50 ml Ethanol und 10 ml wäßriger Pufferlösung (pH = 5,5, NaH&sub2;PO&sub4;-NAOH) wurde eine Lösung von NaCNBH&sub3; in THF (12 ml, 1,0 M-Lösung in THF, 12 mmol) tropfenweise wahrend eines Zeitraums von 1 Stunde bei 5ºC hinzugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde weitere 4 Stunden lang gerührt und dann mit 250 ml Ethylacetat verdünnt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser (2 x 60 ml) und Salzlösung gewaschen und getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;). Die Verbindung 1 (Fig. 7) wurde mittels Flash- Chromatographie gereinigt, indem zuerst mit Ethylacetat und dann mit 5% MEOH-CH&sub2;Cl&sub2; eluiert wurde. Die Verbindung 1 (Fig. 7) wurde in einer Ausbeute von 72-74% erhalten.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;) δ 7,56 (m, 1 H), 7,36-7,34 (m, 2 H), 7,29-7,15 (m, 8 H), 7,03 (s, 1 H), 6,77 (m, 3 H), 6,20 (t, J=6,0 Hz, 1 H), 6,08 (t, J=6,7 Hz, 1 H) 4,01-3,97 (m, 2 14), 3,84-3,72 (m, 1 H), 3,72 (s, 6 H), 3,71-3,63 (m, 1 H), 3,48-3,32 (m, 2 H), 3,30-3,22 (m, 1 H), 3,48-3,32 (m, 2 H), 3,30-3,22 (m, 1 H), 7,52 (m, 2 H), 2,27-2,14 (m, 3 H), 2,08- 1,97 (m, 1 H), 1,83 (s, 3 H), 1,67-1,48 (m, 3 H), 1,43 (s, 3H), 1,22-1,15 (m, 1 H), 0,82 (s, 9 H), 0,01 (s, 6 H).
36b. Zu einer gerührten Lösung von Trifluoressigsaureanhydrid (0,32 ml, 2,3 mmol) und Triethylamin (0,64 ml, 4,6 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (5,0 ml) wurde Verbindung 1 (Fig. 7) (210 mg, 0,23 mmol) hinzugegeben. Nach 2 Stunden wurde die Reaktionsmischung mit wäßrigern NaHCO&sub3; (5,0 ml) gelöscht und mit EtOAc (25 ml) verdünnt. Die organische Phase wurde mit Wasser (2 x 10 ml) und Salzlösung (5 ml) gewaschen und getrocknet (Na&sub2;SO4). Die Verbindung 2 (Fig. 7) wurde mittels Flash-Chromatographie unter Verwendung von 7% MEOH in CH&sub2;Cl&sub2; gereinigt. Die Verbindung 2 wurde in einer Ausbeute von 89-91% erhalten.
36c. Zu einer gerührten Lösung von Verbindung 2 (180 mg, 0,2 mmol) in THF (4,0 ml) wurde Tetrabutylammoniumfluorid (0,4 ml, 1,0 M-Lösung in THF, 0,4 mmol) bei 0ºC hinzugesetzt. Nach 2 Stunden wurde das Lösungsmittel abgedampft und das Produkt mittels Flash- Chromatographie unter Anwendung ansteigender Polarität, 5T8% MEOH in CH&sub2;Cl&sub2; gereinigt, wodurch die Verbindung 3 (Fig. 7) in einer Ausbeute von 89% erhalten wurde.
36d. Trockenes Diisopropylethylamin (0,15 ml, 0,67 mmol) wurde der Verbindung 3 (150 mg, 0,168 mmol) hinzugegeben, gefolgt von der Zugabe von trockenem CH&sub2;Cl&sub2; (0,5 ml). Der Kolben wurde danach geschüttelt, um den Alkohol zu lösen, und 2-Cyanoethyl-N,N- diisopropylchlorphosphoramidit (0,056 ml, 0,25 mmol) wurde über einen Zeitraum von 20 Sekunden hinzugesetzt. Nach 45 Minuten wurde die Reaktionsmischung mit CH&sub3;OH (0,1 ml) gelöscht und mit EtOAc (50 ml) und Et&sub3;N (1,0 ml) verdünnt und mit wäßriger 10%iger K&sub2;CO&sub3;-Lösung (2 x 5,0 ml) und Salzlösung (5,0 ml) gewaschen und getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;). Das Produkt wurde mittels Flash-Chromatographie unter Verwendung von EtOAc gereinigt, wodurch die Verbindung 4 in 70-75%iger Ausbeute erhalten wurde.

BEISPIEL 37: Synthese von Desoxythymidinoligomeren, die eine 3'-N-C-C-5'- Internucleosidbindung enthalten

Die Thymidindimer-Phosphoramidit-Verbindungen, die mittels der obigen Schritte a-d hergestellt wurden, wurden in einem modifizierten Festphasen-Phosphoramidit-Syntheseverfahren eingesetzt, um die Oligonucleosidsequenzen der Tabelle 2 herzustellen. Tabelle 2 Sequenzen Referenz-Code Thymidin
Die Oligodesoxynucleosidsequenzen wurden vom 3'- bis zum 5'-Ende synthetisiert.
Der anfangliche Schritt war das Anbringen eines 5'-Dimethoxytrityldesoxythymidins an einen CPG-Träger mittels einer 3'-Succinatbindung. Die 5'-O-Dimethoxytritylgruppe des angebrachten Thymidins wurde mit Trichloressigsäure umgesetzt, um die 5'-Hydroxylgruppe zu entschützen.
Die Kettenverlängerung erfolgte dann mittels der in Reihe erfolgenden Standardschritte der Entschützung, Aktivierung, Blockierung und Oxidation mit der Modifizierung, daß ein gemäß den Verfahren der Beispiele 30 bis 37 hergestelltes -N-C-C--verbundenes Thymidindimer während eines Aktivierungsschrittes wo gewünscht der Kette hinzugefügt wurde.
Am Ende der Kettenbildung wurden die Thymidinoligomere vom CPG-Träger mit konzentrierter Ammoniumhydroxidlösung entfernt. Die Lösung wurde dann bei 55ºC 8 bis 15 Stunden lang weiterbehandelt, um alle Schutzgruppen auf den exocyclischen Aminen der Basen zu entfernen.

BEISPIEL 38:* Herstellung von Anti-RAS-Onkogen-DNA mit endständigem Tetraethylenglykol

38a. Herstellung von Dimethoxytrityltetraethylenglykol (DMTTEG)

Ein Überschuß an Tetraethylenglykol TEG (etwa 100 ml) wurde mit etwa 7 ml (5,1 g, 40 mmol) Hunig-Base in einem Rundkolben vermischt. Etwa 3,08 g (10 mmol) Dimethoxytritylchlorid (DMTCl) wurde der TEG-Mischung hinzugesetzt, und die DMTCL-TEG- Mischung wurde bei konstantem Rühren während etwa 8 bis 12 Stunden bei Raumtem peratur (etwa 25ºC) gehalten, um DMTTEG zu bilden.

38b. Herstellung von Dimethoxytrityltetraethylenglykolcyanophosphin (DMTTEGCP)

6 g des DMTTEG von Schritt (a) wurden mit 20 ml trockenem Dichlormethan vermischt. Etwa 6,2 ml der Hunig-Base wurden der Mischung hinzugesetzt, gefolgt von der tropfenweisen Zugabe einer Chlorphosphinmischung unter Bildung von DMTTEGCP. Die Chlorphosphinmischung wurde hergestellt, indem 1,67 g 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit in 5 ml trockenem Dichlormethan gelöst wurden.

38c. Herstellung von Anti-RAS-Onkogen-DNA mit endständigem TEG

Die Oligodesoxynueleotide von Tabelle 3 wurden gemäß einer modifizierten Festphasen- Phosphoramidit-Methode hergesteilt; GAIT, s.o. Die Oligodesoxynucleotide wurden vom 3'- bis zum 5'-Ende synthetisiert. Tabelle 3 Sequenzen Referenz-Code
A, C, G & T stehen für die Desoxynucleotide Adenyl-, Cytidyl-, Guanidyl- bzw. Thymidylsäure. * Dieses Beispiel und die folgenden Beispiele gehören nicht zum beanspruchten Gegenstand.
Entweder wurde das Nucleosid Adenosin (7, 8, 9, 10) oder Thymidin (11) unter Verwendung einer Succinatbindung an einem festen CPG-Träger angebracht; GAIT, s.o. Die Synthese 11 geschah gemäß standardmäßigen Festphasen-Phosphoramidit-Verfahren. Bei den Sequenzen 7, 8, 9 und 10 geschah die Synthese gemäß einem modifizierten Phosphoramidit-Verfahren. Die 5'- Hydroxylgruppe des angebrachten Adenosinnucleosids wurde mit Trichloressigsaure umgesetzt, um die 5'-Hydroxylgruppe zu entschützen. Nach diesem Entschützungsschritt wurde das angebrachte Adenosinnucleosid mit dem Aktivierungsmittel Tetrazol und einem DMTTEGCP umfassenden Phosphoramiditreagenz, das durch die obenstehenden Verfahrensschritte a und b hergestellt worden war, umgesetzt. Nach dem Aktivierungsschritt wurden die nicht umgesetzten 5'-Hydroxylgruppen mit Essigsäureanhydrid und N-Methylimidazol blockiert. Die Phosphorbindung wurde dann mit Iod gemäß standardmäßigen Verfahren oxidiert.
Bei den Sequenzen 8 und 10, die zwei TEG-Reste enthielten, wurden die Schritte des Entschützens, Aktivierens, Blockierens und Oxidierens, wie oben beschrieben, wiederholt. Die Kettenverlangerung geschah mittels der in Reihe erfolgenden Schritte des Entschützens, Aktivierens, Blockierens und Oxidierens, wie es oben beschrieben worden ist, mit der Modifikation, daß das gewünschte Nucleosidphosphoramiditreagenz anstelle des DMTTEGCP während des Aktivierungsschrittes eingesetzt wurde. Nach dem Anbringen des letzten gewunschten Nucleosids wurden entweder ein oder zwei TEG-Reste an dem 5'-Ende in einer Weise angebracht, die der des Anbringens von TEG am 3'-Ende analog war.
Am Ende des Kettenaufbaus wurde der DNA-Strang von dem CPG-Träger mit konzentriertem Amnnoniumhydroxid entfernt. Die Lösung wurde dann bei 55ºC 8 bis 15 Stunden weiterbehandelt, um alle Schutzgruppen auf den exocyclischen Aminen der Basen zu entfernen.

BEISPIEL 39: Herstellung von Anti-RAS-Onkogen-DNA mit endständigem Hexaethylenglykol (HEG)

Anti-RAS-Onkogen-DNA mit endständigem Hexaethylenglykol (HEG) wurde gemäß der Verfahren von Beispiel 38 hergestellt. HEG wurde mit DMTCl unter Bildung von DMTHEG umgesetzt. Das DMTHEG wurde dann mit einer Cyanophosphinverbindung unter Bildung von DMTHEGCP umgesetzt, welches bei dem modifizierten Festphasen-Phosphoramidat-Syntheseverfahren des Beispiels 38(c) verwendet wurde, um Anti-RAS-Onkogen-DNA mit endständigem HEG zu bilden. Die Sequenzen dieser Oligonucleotide sind in der nachfolgenden Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4

Sequenz

X ist HEG
A, C, G & T stehen für die Desoxynucleotide Adenyl-, Cytidyl-, Guanidyl- bzw. Thymidylsäuren.

BEISPIEL 40: Nucleasebeständigkeit von Anti-RAS-Onkogen-DNA mit endständigem TEG

Die Oligonucleotide der Tabelle 4 wurden in Wasser gelöst. Die DNA-Konzentrationen wurden dann bestimmt, indem die Absorption der Proben bei 260 nm (auf einem Perkin-Elmer-Lambda- 4C-Spektrophotometer bei umgebender Raumtemperatur) gemessen und die berechneten Extinktionskoeffizienten [Methode von Cantor und Warsaw, CRC Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, 3. Ausgabe, Band 1, CRC Press, Seite 589 (1975)] verwendet wurden.
Die Oligonucleotide wurden 2 Stunden lang bei 37ºC bei einer Gesamtstrangkonzentration von 6 oder 7 µM in einem Zellkulturmedium mit RPMI 1640; 20 mM N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'- (2-ethansulfonsäure), pH 7,4; und 10% fötalem Kälberserum (FCS) (GIBCO Laboratories, Grand Island, NY) inkubiert. Das FCS wurde durch Hitze bei 56ºC während 0,5 Stunden vor der Anwendung inaktiviert. Die Proben wurden dann auf Eis gestellt und entproteinisiert, unter Anwendung von fünf Extraktionen mit 24:1 Chloroform:Isoamylalkohol. Die Proben wurden entweder gefroren bei -20ºC gelagert oder sofort in einen gekühlten (4ºC) WISP(Waters)-HPLC- Autoinjektor gefüllt.
Die Oligonucleotidhydrolyse wurde quantifiziert, indem die Menge des Verschwindens der Eltemverbindung bestimmt wurde. Die Oligonucleotide (von der Reaktionsinischung) wurden auf dem LKB-Ultrachrome-GTI-dual pump-Chromatographiersystem, das mit einem Detektor festgelegter Wellenlänge (260 nm) und einem Aufzeichnungsintegrator ausgestattet war, unter Verwen dung einer Genpak-FAX(Waters)-Anionenaustauschersäule, die mit einem Puffer A (Inim EDTA; 15 mM Natriumphosphat, pH 8,5) äquilibriert worden war, getrennt. Die Säulentemperatur wurde unter Verwendung eines Waters-Säulenofens bei 60ºC gehalten. Probeninjektionsvolumen von 50 µl wurden angewandt. Die Oligonucleotide wurden unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0% bis 100% an Puffer B (Puffer A mit 0,5 M NaCl) während 60 Minuten eluiert. Die Pufferfließrate betrug 1 ml/min.
Nach der Inkubation (2 h) in Gegenwart von mit fötalem Kälberserum assoziierter Exonuclease wurde kein Abbau der Verbindungen 7 oder 10 beobachtet (Tabelle 5, siehe % Abbau des Haupt- Peaks). Während einer ähnlichen Inkubationsdauer verblieben 87,0% und 82,1% an 9 bzw. 8. Im Vergleich dazu verblieben nur 24,7% des Oligomeren 11 nach der gleichen Inkubationszeit. Tabelle 5 PROBE ID FLÄCHE DES HAUPT-PEAKS % ABBAU DES HAUPT-PEAKS
Alle vier TEG-Oligomere wurden gegenüber der Hydrolyse durch die FCS-assoziierten Exonucleasen beständig. Die Bis-diTEG-Oligomere (7 und 10) schienen gegenüber der Hydrolyse vollständig beständig zu sein. TEG-derivatisierte Oligodesoxynucleotide zeigen signifikante Verbesserungen gegenüber nicht-modifizierten Verbindungen im Hinblick auf die Beständigkeit gegenüber der Hydrolyse durch Exonuclease.

BEISPIEL 41: Vermögen von TEG-Antisinn-Oligomeren zur Inhibierung der Proteinexpression und des Wachstums bei Tumorzellinien des Menschen und der PHA-Stimulierung von peripheren Blut-Lymphozyten

Es ist von anderen gezeigt worden (Heikkila, R. et al., Nature, 328:445-449, 1987), daß nicht- modifizierte Antisinn-Oligonucleotide, die gegen die Initiationscodon-Region des c-myc-Onkogen gerichtet sind, die Expression von c-myc-Protein in PHA-stimulierten peripheren Blut-Lymphozyten (PBL) inhibieren konnten, was zu einer Blockierung der Progression von Zellen in die S-Phase des Zellzyklus führt. Es zeigte sich, daß c-myc-gerichtete Antisinn-DNA ebenfalls das Wachstum der HL-60-Erythroleukämie-Zeilen des Menschen in vitro inhibiert (Wickstrom, E.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:1028-1032, 1988). Die in Tabelle 6 gezeigten Sequenzen wurden hergestellt und mittels der Verfahren der Beispiele 41a und 41b beurteilt. Tabelle 6

41a. Vergleich der Wirkung von modifizierter (mit TEG) zu nicht-modifizierter C-MYC- Antisinn-DNA auf die Progression von PHA-stimulierten PBL in die S-Phase des Zellzyklus.

Menschliche PBLs wurden mlt PHA 48 Stunden lang in Gegenwart oder in Abwesenheit der Antisinn-Oligonucleotidsequenzen von Tabelle 6 stimuliert. Die Prozentzahl der Population an Zellen wurde in jeder Behandlungsgruppe in der S-Phase des Zellzyklus im Vergleich zu der nicht-behandelten Kontrolle unter Verwendung von flußzytometrischen Standardtechniken bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7 OLIGONUCLEOTID KONZENTRATION (µM) % KONTROLLE S-PHASE KEINES
Die Daten zeigen, daß die Gegenwart von TEG sowohl am 3'- als auch am 5'-Ende nicht den inhibitorischen Effekt der Antisinn-DNA verändert.

41b. Vergleich des Effektes von modifizierter (mit TEG) zu nicht-modifizierter C-MYC- Antisinn-DNA auf die C-MYC-Proteinexpression im menschlichen MOLT-4-T-Zell- Leukämie-Zellen.

Asynchron exponentiell wachsende Molt-4-Zellen wurden 8 Stunden lang in Gegenwart oder Abwesenheit von 60 µM auf c-myc-gerichtete Antisinn-DNA inkubiert. Die Zellen wurden dann 45 Minuten lang in Gegenwart von ³&sup5;S-Methionin inkubiert, und der Gehalt an c-myc-Protein unter Verwendung der Radioimmunoprazipitation mit einem c-myc-Antikörper quantifiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8 OLIGONUCLEOTID KONZENTRATION (µM) % REDUKTION AN C-MYC-PROTEIN KEINES
Die TEG enthaltende Antisinn-DNA war etwas potenter als die nicht-modifizierte Antisinn- DNA.

41c. Vergleich des Effektes von modifizierter (mit TEG) zu nicht-modifizierter C-MYC- Antisinn-DNA auf die Inhibition des Wachstums von menschlichen CCRF-CEM-T- Zell-Leukämiezellen in vitro.

Asynchron exponentiell wachsende CCRF-CEM-Zellen wurden 48 Stunden lang in Gegenwart oder Abwesenheit von Antisinn-DNA inkubiert und dann wurden die Zellzahlen in jeder Behandlungsgruppe bestimmt. Die Konzentration der Antisinn-DNA, welche erforderlich war, um das Zellwachstum um 50% zu inhibieren, wurde dann bestimmt (IC&sub5;&sub0;). Sowohl die modifizierte als auch nicht-modifizierte Antisinn-DNA der Tabelle 5 zeigten etwa aquivalente (IC&sub5;&sub0;)-Konzentrationen von 40 µM.
Diese Daten zeigen, daß die Gegenwart von TEG am 3'- und 5'-Ende der Antisinn-DNA nicht das Vermögen solcher Antisinn-DNA beeinträchtigt, mit Ziel-Nucleinsäuren zu hybridisieren und die Funktion der Zielnucleinsäuren zu inhibieren.

BEISPIEL 42: Zusätzliche Exonuclease-stabile Oligonucleotide

Die in Tabelle 9 aufgeführten Exonuclease-stabilen Oligonucleotide wurden gemäß den Verfahren von Beispiel 38 hergestellt. Tabelle 9
X ist TEG.

Claims

1. Nucleasebeständiges Oligonucleosid, umfassend eine Sequenz von 6 bis 200 Basen, gekennzeichnet durch eine dreiatomige Internucleosidbindung der Formel:

worin jedes D unabhängig CHR, Sauerstoff oder NR&sup6; ist, worin R unabhängig Wasserstoff, OH, SH oder NH&sub2; ist, R&sup6; Wasserstoff oder C&sub1;-C&sub2;-Alxyl ist, mit der Maßgabe, daß nur ein D Sauerstoff oder NR&sup6; ist.

2. Oligonucleosid nach Anspruch 1, welches ein Diol an einem oder beiden Enden aufweist.

3. Oligonucleosid nach Anspruch 1, wobei das Diol Tetraethylenglykol oder Hexaethylenglykol ist.

4. Nucleasebeständiges Oligonucleosid, umfassend eine Sequenz der Formel:

worin W die Bedeutung -D-D-D- hat, worin jedes D unabhängig CHR, Sauerstoff oder NR&sup6; ist, worin Runabhängig Wasserstoff, OH, SH oder NH&sub2; ist, R&sup6; Wasserstoff oder C&sub1;-C&sub2;-Alkyl ist, mit der Maßgabe, daß nur ein D Sauerstoff oder NR&sup6; ist;

jedes W, unabhängig W oder

ist;

jedes R¹ unabhängig OH, SH, NR²R³ ist, worin R² und R³ unabhängigwasserstoff oder C&sub1;-C&sub6;-Alkyl oder NHR&sup4; sind, worin R&sup4; C&sub1;-C&sub1;&sub2;-Acyl ist;

jedes y unabhängig H oder OH ist;

jedes B unabhängig Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil oder Modifikationen hiervon ist;

j eine ganze Zahl von 1 bis etwa 200 ist;

k 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis etwa 197 ist; und

q 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis etwa 197 ist, mit der Maßgabe, daß die Summe aus j + k + q etwa 4 bis etwa 200 beträgt.

5. Nucleasebeständiges Oligonucleosid, umfassend eine Sequenz von 6 bis 200 Basen mit der Formel:

worin jedes Z unabhängig R¹ oder

ist:

W die Bedeutung -D-D-D- hat, worin jedes D unabhängig CHR, Sauerstoff oder NR&sup6; ist, worin Runabhängig Wasserstoff, OH, SH oder NH&sub2; ist, R&sup6; Wasserstoff oder C&sub1;-C&sub2;-Alkyl ist, mit der Maßgabe, daß nur ein D Sauerstoff oder NR&sup6; ist, jedes W' unabhängig W oder

ist;

jedes R¹ unabhängig OH, SH, NR²R³ ist, worin R² und R³ unabhängig Wasserstoff oder C&sub1;-C&sub6;-Alkyl oder NHR&sup4; sind, worin R&sup4; C&sub1;-C&sub1;&sub2;-Acyl ist;

jedes R&sup5; unabhängig Wasserstoff oder C&sub1;-C&sub1;&sub2;-Alkyl ist;

jedes y unabhängig H oder OH ist;

jedes B unabhängig Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil oder eine Modifikation hiervon ist;

jedes e und f unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 50 ist;

mit der Maßgabe, daß mindestens eines aus e und f mindestens 1 ist;

j eine ganze Zahl von 1 bis etwa 200 ist;

k 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis etwa 197 ist; und

jedes m und n unabhängig eine ganze Zahl von 1 bis 200 ist;

jedes p unabhängig 2 bis 4 Ist; und

6. Verfahren zur Unterdrückung des Nucleaseabbaus von Oligonucleosiden, umfassend die Herstellung von Oligonucleosidsequenzen mit 6 bis 200 Basen mit einer dreiatomigen Internucleosidbindung der Formel:

worin jedes D unabhängig CHR, Sauerstoff oder NR&sup6; ist, worin R unabhängig Wasserstoff, OH, SH oder NH&sub2; ist, R&sup6; Wasserstoff oder C&sub1;-C&sub2;-Alkyl ist, mit der Maßgabe, daß nur ein D Sauerstoff oder NR&sup6; ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Oligonucleosidsequenzen die folgende Formel aufweisen:

worin w die Bedeutung -D-D-D- hat, worin jedes D unabhängig CHR, Sauerstoff oder NR&sup6; ist, worin R unabhängig Wasserstoff, OH, SH oder NH&sub2; ist, R&sup6; Wasserstoff oder C&sub1;-C&sub2;-Alkyl ist, mit der Maßgabe, daß nur ein D Sauerstoff oder NR&sup6; ist;

jedes W' unabhängig W oder

ist;

jedes R¹ unabhängig OH, SH, NR²R³ ist. worin R² und R³ unabhängig Wasserstoff oder C&sub1;-C&sub6;-Mkyl oder NHR&sup4; sind, worin R&sup4; C&sub1;-C&sub1;&sub2;-Acyl ist;

jedes y unabhängig H oder OH ist;

j eine ganze Zahl von 1 bis 200 ist;

k 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 197 ist; und

q 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 197 ist, mit der Maßgabe, daß die Summe aus j + k + q 4 bis 200 beträgt.

8. Verfahren zur Stabilisierung von Oligonucleosidsequenzen gemäß Anspruch 7, umfassend das Anbringen eines Polyalkylenglykolrestes an ein oder beide Enden der Oligonucleosidsequenz.

9. Zur Unterdrückung der Genexpression geeignete Zusammensetzung, umfassend einen physiologisch annehmbaren Träger und ein nucleasebeständiges Oligonucleosid, umfassend Sequenzen von 6 bis 600 Basen mit einer nichtphosphathaltigen, dreiatomigen Internucleosidbindung der Formel:

-D-D-D-;

10. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Oligonucleosidsequenz die folgende Formel aufweist:

worin W die Bedeutung -D-D-D- hat, worinjedes D unabhängig CHR, Sauerstoff oder NR&sup6; ist, worin R unabhängig Wasserstoff, OH, SH oder NH&sub2; ist, R&sup6; Wasserstoff oder C&sub1;-C&sub2;-Alkyl ist, mit der Maßgabe, daß nur ein D Sauerstoff oder NR&sup6; ist;

jedes W' unabhängig W oder

ist;

jedes y unabhängig H oder OH ist;

j eine ganze Zahl von 1 bis 200 ist;

k 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 197 ist; und

11. Verwendung eines nucleasebeständigen Oligonucleosids nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Unterdrückung der Genexpression in einem Säuger.

12. Nucleasebeständiges Nucleosiddimer der Formel:

R&sup7; OH, t-Butyldimethylsilyloxy oder ein Phosphoramidit ist; und

R&sup8; OH, eine Schutzgruppe oder t-Butyldimethylsilyloxy ist.