CN101590243A - 微小rna在制备治疗和/或预防淋巴瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微小RNA在制备治疗和/或预防肿瘤药物领域的应用。具体是将微小RNA－15a、微小RNA－16－1、微小RNA－15a的前体、微小RNA－16－1的前体或它们中两种以上的混合物用于制备此类的药物。本发明通过将上述寡核苷酸序列在淋巴瘤细胞中过表达，证明上述序列有抑制淋巴瘤细胞生长和促进其凋亡的作用，并进一步揭示它们与化疗药物如阿糖胞苷等的联用可增强原有药物的效力，从而确证了上述寡核苷酸序列在制备治疗和/或预防肿瘤药物领域的应用潜能。此类的药物可以是单独的包含上述任一种寡核苷酸序列或其混合物及药用载体的组合物，或者是还包括化疗药物的联用组合物。

Description

微小RNA在制备治疗和/或预防淋巴瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及微小RNA及其应用领域，具体涉及微小RNA-15a(miR-15a)和微小RNA-16-1(miR-16-1)在制备治疗和/或预防淋巴瘤药物中的应用。

背景技术

miRNA是基因表达和蛋白翻译过程中的调节分子，在肿瘤的发生过程起到调控的枢纽作用。某些miRNA可能是潜在的癌基因或者抑癌基因，通过寻找具有癌基因和抑癌基因性质的miRNA，不仅可为肿瘤的诊断也能为肿瘤的生物治疗提供新的靶标。

miRNA相关的肿瘤基因治疗包括敲除或敲减癌基因性miRNA，引入抑癌基因性miRNA两方面。一方面引入与具有癌基因特性miRNA互补的合成反义寡核苷酸(Anti-miRNAAntisense Oligonucleotides，AMOs)，可有效的灭活肿瘤中的miRNA，延缓其生长(Weiler J，Hunziker J，Hall J.Anti2miRNA oligonucleotides(AMOs)：ammunition to target miRNAsimplicated in human disease[J].Gene Ther，2006，13(6)：496-502.)。使用与胆固醇耦联的AMOs注射小鼠后可以在不同器官有效抑制miR-16，miR-122，miR-192和miR-194的活性(Krutzfeldt J，Rajewsky N，Braich R，et al.Silencing of microRNAs in vivo with″antagomirs″[J].Nature，2005，438(7068)：685-689.)，因而可能成为一种有希望的治疗药物。临床上，可以通过经常的或者持续的2’-O-甲基化或者锁定核酸(LNA)等修饰的反义寡核苷酸给药使miRNA失活。这些修饰使得寡核苷酸更稳定，比其他治疗手段毒性更低。另一方面，过表达那些具有肿瘤抑制基因作用的miRNA，如let-7家族也可以用于治疗某些特定的肿瘤。利用病毒或者脂质体的表达系统可以瞬时引入大量miRNA。这些技术可以保证在某些组织特异性的启动子控制之下，表达pre-miRNA及其两侧序列，并且刺激内源性的miRNA加工，产生正确的miRNA，抑制特定基因表达。

miR-15a和miR-16-1位于13q14.3，一个30kb的缺失区域，65％的B-CLL这两种基因表达水平下调(Amelia C，George AC，Muller F，et al.MiR-15 and miR-16 induce apoptosis bytargeting Bcl-2[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(39)：13944-13949.)。下调的原因之一是大约40％的肿瘤标本发生13q14区域缺失(Calin GA，Dumitru CD，Shimizu M，et al.Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 inchronic lymphocytic leukemia[J].Proc Natl cad Sci USA，2002，99(24)：15524-15529.)。CLL病例13q14纯合性或杂合性丢失是CLL最常见的染色体异常，50％的套细胞淋巴瘤，16～40％的多发性骨髓瘤和60％的前列腺癌13q14丢失。表明13q14存在一个或多个肿瘤抑制基因，与人类肿瘤的病原学发生有关。另一种可能的解释是，部分白血病患者的miR-15a/miR-16-1前体下游7bp处发生C→T突变，这一突变影响miRNA的加工成熟(Calin GA，Ferracin M，Cimino A，et al.A microRNA signature associated with prognosis and progression in chroniclymphocytic leukemia[J].New Engl J Med，2005，353(17)：1793-1801.)。Amelia等(AmeliaC，George AC，Muller F，et al.MiR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting Bcl-2[J].ProcNatl Acad Sci USA，2005，102(39)：13944-13949.)发现，在CLL中，miR-15a和miR-16-1的表达与Bcl-2的表达成负相关，两种miRNA均可在转录后水平负性调节Bcl-2。miR-15和miR-16靠5’端的9个碱基序列相同，且这9个碱基与Bcl-2的3287-3279碱基互补。将miR-15/miR-16转染入MEG-01细胞，可以发现细胞的凋亡，pro-caspase9和PARP的清除。

现有的研究表明miR-15a/16-1可能与血液肿瘤的发生相关，但目前还没有此两种微小RNA可用于肿瘤，尤其是淋巴瘤治疗和/或预防的证据。

发明内容

本发明的目的是将miR-15a和miR-16-1用于制备预防或治疗淋巴瘤的药物。

为此，本发明提供了以下技术方案：一种微小RNA在制备治疗和/或预防淋巴瘤药物中的应用，所述药物的活性成分包括微小RNA-15a、微小RNA-16-1、微小RNA-15a的前体、微小RNA-16-1的前体或它们中两种以上的混合物。

优选地，所述微小RNA或其前体经过公知的改良性修饰。

作为上述应用的一种具体化，本发明提供一种治疗和/或预防淋巴瘤的药物组合物，该组合物包括有效量的微小RNA和药学上可接受的稀释剂、载体或辅剂，所述微小RNA为微小RNA-15a、微小RNA-16-1、微小RNA-15a的前体、微小RNA-16-1的前体或它们中两种以上的混合物。

作为上述组合物的一种优选：还包括能够诱导肿瘤凋亡的化疗药物。所述的化疗药物更优选能够诱导淋巴瘤细胞凋亡的药物如阿糖胞苷、长春新碱、阿霉素、柔红霉素、甲氨喋呤、三氧化二砷或它们中两种以上的混合物等。

所述微小RNA或其前体可通过化学合成得到，为增强其稳定性、生物利用度、组织靶向性等药学特征，可对其进行公知的改良性修饰，如硫代修饰或甲氧修饰等；或者通过构建真核表达载体得到，也即药物的活性成分中包括含有上述微小RNA序列的表达载体，该载体在体内表达后起到相应的药效作用。所述真核表达载体可为质粒载体或病毒载体，以及其它可通过本领域公知手段获得的载体形式。

优选地，所述真核表达载体为质粒载体或病毒载体。

本发明所述的药物组合物适合用于预防和/或淋巴瘤，尤其Burkitt淋巴瘤的治疗。

本发明的基本原理：本发明首先化学合成miR-15a和miR-16-1寡核苷酸，检测其对Raji细胞有无凋亡诱导作用。化学合成的寡核苷酸片段小，容易转染入细胞。为研究成熟的miR-15a/16-1与其前体对Raji细胞的影响有无功能上的差异性。本发明还构建了miR-15a前体真核表达载体。通过将体外扩增合成的miR-15a前体序列构建于pGCSIL-GFP真核表达载体，转染细胞后，在U₆启动子的作用下转录为“茎环”结构的pre-miR-15a，通过细胞内自身的RNA聚合酶III Dicer的作用下剪接加工成为成熟的miR-15a，从而发挥对靶基因的调控作用。

本发明采用荧光定量PCR法检测转染后各组细胞内成熟miR-15a的表达量，实验证明细胞内miR-15a的表达水平，在转染表达pre-miR-15a重组质粒后显著增高，细胞内Bcl-2蛋白的表达水平显著下降，而各组Bcl-2mRNA的表达水平未见显著性差异，可见miR-15a是在转录后水平对Bcl-2进行调控，即抑制Bcl-2mRNA翻译，从而下调Bcl-2蛋白的表达，而不是直接降解Bcl-2mRNA；进而采用台盼蓝拒染法和CCK8法均检测到miR-15a组、miR-16-1组及pre-miR-15a组细胞48h和72h增殖活性显著下降，Hoechst染色从形态学上可见miR-15a、miR-16-1及pre-miR-15a处理组有明显的凋亡小体；FCM结果也显示该组的细胞凋亡率要高于其他组，即miR-15a和miR-16-1促进了Raji细胞的凋亡。结果表明，miR-15a和miR-16-1可通过抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达，促进Raji细胞凋亡，降低细胞的增殖活性，抑制细胞的生长，可用于制备相关的预防或治疗肿瘤的药物。

许多化疗药物均是通过诱导肿瘤细胞发生凋亡而产生抗癌效应的。Bcl-2家族是细胞凋亡的重要调控基因，在细胞凋亡的过程中处于调控机制的终末部分，该基因家族在维持细胞生理分化、发育和细胞数量的动态平衡中具有重要作用，其表达状态在一定程度上影响着肿瘤的发生、发展及多药耐药性的产生。Bcl-2基因家族是目前最受重视的调控细胞凋亡的基因家族，Bcl-2是Bcl-2家族中研究最广泛深入的成员之一，能够抑制p53对基因损伤反应而诱导的凋亡，其过表达可导致细胞耐受不同的药物。在Bcl-2过表达的细胞中药物仍能进入细胞内诱导细胞损伤，但这种损伤不能有效地转换成凋亡信号，以致肿瘤细胞的生理性凋亡受抑，增加了肿瘤细胞的生存时间，结果在化疗期间表达Bcl-2的肿瘤细胞仍能以较快的速率重新生长。Bcl-2的过表达在白血病细胞的凋亡中起重要作用，化疗药物本身抗凋亡的活性主要依赖于Bcl-2家族蛋白的表达。Bcl-2蛋白过度表达还可明显降低肿瘤细胞对阿糖胞苷(Ara-C)、甲氨喋呤及环磷酰胺等多种化疗药物的敏感性。Ara-C是DNA多聚酶抑制剂，通过对DNA多聚酶的抑制，而影响DNA的复制。Ara-C是治疗急性白血病首选且非常有效的化疗药物，是核苷类抗代谢药物的典范，其杀灭白血病细胞的能力与其诱导肿瘤细胞的凋亡有关。

在本发明中，我们以转染随机序列(或阴性对照质粒)的细胞作为参照物，比较在不同浓度的Ara-C作用下，转染miR-15a/16-1寡核苷酸(或表达pre-miR-15a重组质粒)的Raji细胞与对照细胞之间细胞活力的差异。结果发现，转染miR-15a/16-1(或表达pre-miR-15a重组质粒)的Raji细胞，在不同浓度Ara-C(0～80μg/ml)作用下，细胞活力的抑制明显强于对照细胞，miR-15a/16-1+Ara-C组的IC50值明显降低。CCK8法检测显示miR-15a/16-1(或表达pre-miR-15a重组质粒)与Ara-C联用组的细胞增殖活力要远远低于两者分别单用的组别(P＜0.05)。Hoechst染色可见到经转染miR-15a/16-1(或表达pre-miR-15a重组质粒)的Raji细胞在使用Ara-C后出现大量凋亡小体。FCM检测细胞凋亡率结果显示miR-15a/16-1+Ara-C组(或pre-miR-15a+Ara-C组)的细胞凋亡率明显增高，较单用Ara-C或随机序列+Ara-C组(或阴性对照质粒+Ara-C组)的细胞凋亡率有显著性差异(P＜0.05)。提示miR-15a/16-1可以通过调控Bcl-2的表达，而改变Raji细胞对Ara-C的敏感性。由此，我们有足够的理由相信miR-15a/16-1或其前体可与能够诱导肿瘤凋亡的化疗药物(例如Ara-C)组成一种药物组合物，用于更好预防或治疗相关的肿瘤病症。

本发明具有如下的有益效果：首先是为预防或治疗淋巴瘤提供了新的可选途径，通过大量的实验证明了部分微小RNA应用于制备预防或治疗淋巴瘤的药物是切实可行的；其次是证明了部分微小RNA可用作已知化疗药物的辅助性成分，或与已知的化疗药物联用，能在抑制肿瘤细胞生长和促进肿瘤细胞凋亡方面发挥更好的疗效。

附图说明

图1转染24h后荧光显微镜下图(×100)A，B均为阴性对照质粒组。

图2转染miR-15a和miR-16-寡核苷酸RT-PCR测得Raji细胞的Bcl-2mRNA表达水平；

M：marker，1：空白对照组，2：随机序列组，3：miR-15a组，4：miR-16-1组。

图3转染表达pre-miR-15a重组质粒RT-PCR测得Raji细胞的Bcl-2mRNA表达水平；

M：marker，1：空白对照组，2：阴性对照质粒组，3：pre-miR-15a组。

图4转染miR-15a/16-148h流式细胞仪检测Raji细胞中Bcl-2蛋白的表达；

A：空白对照组，B：随机序列组，C：miR-15a组，D：miR-16-1组。

图5转染表达pre-miR-15a重组质粒48h流式细胞仪检测Raji细胞中Bcl-2蛋白的表达；

A：空白对照组，B：阴性对照质粒组，C：pre-miR-15a组。

图6台盼蓝拒染法检测miR-15a和miR-16-1对Raji细胞的生长抑制作用；

a：转染miR-15a和miR-16-1寡核苷酸    b：转染表达pre-miR-15a重组质粒

^*与空白对照组和随机序列组(或空白对照组和阴性对照质粒组)相比，P＜0.05。

图7转染miR-15a和miR-16-1作用于Raji细胞48h的形态学改变(Hoechst荧光染色×400)；

A空白对照组；B随机序列组；C miR-15a组；D miR-16-1组。

图8转染表达pre-miR-15a重组质粒作用于Raji细胞48h的形态学改变(Hoechst荧光染色×400)；

A空白对照组；B阴性对照质粒组；C pre-miR-15a组。

图9流式细胞仪检测miR-15a和miR-16-1作用于Raji细胞48h的凋亡图(Annexin V/PI双染法)；

A空白对照组；B随机序列组；C miR-15a组；D miR-16-1组。

图10流式细胞仪检测miR-15a和miR-16-1作用于Raji细胞48h的凋亡图(PI染色法)；

A空白对照组；B阴性对照质粒组；C pre-miR-15a组。

图11CCK8法检测miRNA联合Ara-C后Raji细胞活力的抑制；

a：miR-15a或miR-16-1寡核苷酸联合Ara-C；b：表达pre-miR-15a重组质粒联合Ara-C。

图12miR-15a和miR-16-1联合Ara-C对Raji细胞的生长抑制作用；

^*与其它组相比，P＜0.05。

图13表达pre-miR-15a重组质粒联合Ara-C对Raji细胞的生长抑制作用；

^*P＜0.05(与其它组相比)。

图14转染miR-15a/16-1并联合Ara-C作用于Raji细胞48h的形态学改变(Hoechst荧光染色×400)；

A：空白对照组，B：随机序列组，C：miR-15a组，D：miR-16-1组，E：Ara-C组，F：随机序列+Ara-C组，G：miR-15a+Ara-C组，H：miR-16-1+Ara-C组。

图15转染表达pre-miR-15a重组质粒并联合Ara-C作用于Raji细胞48h的形态学改变(Hoechst荧光染色×400)；

A：空白对照组，B：阴性对照质粒组，C：pre-miR-15a组，D：Ara-C组，E：阴性对照质粒+Ara-C组，F：pre-miR-15a+Ara-C组。

图16转染miR-15a/16-1并联合Ara-C 48h后Raji细胞凋亡图。(流式细胞仪-AnnexinV/PI双染法检测)；

A：空白对照组，B：随机序列组，C：miR-15a组，D：miR-16-1组，E：Ara-C组，F：随机序列+Ara-C组，G：miR-15a+Ara-C组，H：miR-16-1+Ara-C组。

图17转染表达pre-miR-15a重组质粒并联合Ara-C 48h后Raji细胞凋亡图。(流式细胞仪-PI染法检测)；

A：空白对照组，B：阴性对照质粒组，C：pre-miR-15a组，D：Ara-C组，E：阴性对照质粒+Ara-C组；F：pre-miR-15a组+Ara-C组。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明做进一步地详细说明，但本发明的实现方式并不局限于此。

一、实验方法

1.miR-15a、miR-16-1及pre-miR-15a(miR-15a前体)寡核苷酸的设计与合成

根据MiRBase(http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna)提供的miRNA基因序列，获取人miR-15a、miR-16-1和pre-miR-15a的序列。采用BLAST软件进行分析，确定随机对照序列，miR-15a、miR-16-1寡核苷酸是由上海生物工程技术服务有限公司合成的单链全硫代修饰。序列如下所示：

化学合成的三条RNA：

miR-15a：               5’-uagcagcacauaaugguuugug-3’        (22bp)

miR-16-1：              5’-uagcagcacguaaauauuggcg-3’        (22bp)

scrambled sequence：    5’-cauuaaugucggacaacucaau-3’        (22bp)

pre-miR-15a(对应的基因序列)：                                 (83bp)

5’-ccttggagtaaagtagcagcacataatggtttgtggattttgaaaaggtgcaggccatattgtgctgcctcaaaaatacaagg-3’

negative control sequence：                                   (83bp)

5’-agcttttccaaaaattctccgaacgtgtcacgttctcttgaaacgtgacacgttcggagaagggttctccgaacgtgtcacgt-3’

2.质粒构建

2.1获得目的片段

(1)从“The miRNA Registry”数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/)中获得pre-miR-15a序列，采用BLAST软件进行分析，确定阴性对照序列。设计并合成pre-miR-15a序列的获得片段(pre-miR-15a-1：5’cgggtaccggtccttggagtaaagtagcagcacataatggtttg tggattttgaaaaggtgc-3’；pre-miR-15a-2：5’ccggaattccttgtatttttgaggcagcacaatatg gcctgcaccttttcaaaatccac-3’)，并引入AgeI、EcoR I酶切位点。(2)PCR扩增获得目的片段：反应体系为：pre-miR-15a-1，2各5μL，ddH₂O6.5μL，10×buffer 2μL，MgCl₂ 0.5μL，DNTPs(2.5mM)0.8μL，pfu polymerase 0.2μL。反应条件：94℃30s；94℃30s；55℃30s；72℃30s；72℃2min，20个循环。(3)酶切PCR片段：使用Age I/EcoR I进行酶切消化，酶切反应体系：PCR产物(100ng/μL)5μL，10×buffer5μL，100×BSA 0.5μL，Age I(10U/μl)1μL，EcoR I(10U/μL)1μL，ddH₂O定容至50μL。置于37℃，1h。

2.2重组质粒的构建

(1)Age I和EcoR I酶切pGCSIL-GFP载体以使其线性化。酶切反应体系：纯化的DNA质粒(1μg/μl)2μL，10×buffer 5μL，100×BSA 0.5μL，Age I(10U/μL)1μL，EcoR I(10U/μL)1μL，ddH₂O定容至50μL。置于37℃，1h。(2)氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞。从于37℃培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到含100ml LB的烧瓶中。37℃剧烈振摇培养3h后，转到冰预冷的50ml聚丙烯管中，冰上放置10min。4℃，4000rpm，10min，回收细胞。倒出培养液，10ml冰预冷的CaCl₂(0.1mol/L)重悬每份沉淀，4℃，4000rpm，10min，回收细胞。倒出培养液，CaCl₂(0.1mol/L)重悬每份沉淀。-70℃冻存。(3)连接。反应体系：酶切回收的载体DNA(100ng/μl)1μL，退火的双链DNA(100ng/μl)1μL，10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液1μL，T4噬菌体DNA连接酶1μL，dd H₂O定容至10μL。置于4℃12h。(4)转化。无菌吸头取感受态细胞悬液200μL至无菌微量离心管，加入2μL连接液，混匀，置冰上30min。42℃温浴90s，迅速冷却2min。加入800μL SOC培养基，37℃摇床温浴45min。取150μL转移至含MgSO₄(20mmol/L)和Amp抗性(100μg/ml)的LB琼脂培养基上。37℃培养16h。

2.3阳性克隆的PCR鉴定

利用载体上的序列作为引物进行PCR鉴定阳性克隆。引物序列为：上游引物5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’，下游引物5’GTAATACGGTTATCCACGCG-3’。PCR反应体系：上、下游引物各0.4μL，10×buffer 2μL，MgCL2 0.5μL，DNTPs(2.5mM)0.8μL，Taq polymerase 0.2μL，Template 1μL，ddH2O定容至20μL。

2.4测序

挑选阳性克隆PGCSIL-GFP-pre-miR-15a菌液送测序(美季公司进行ABI 3733型测序仪进行测序分析)。

3.从大肠杆菌中提取质粒

使用商用试剂盒或公知常用的质粒提取法提取质粒。

4.细胞培养

Raji细胞系购于上海细胞库。将Raji细胞接种于含体积分数10％新生牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的RPMI1640培养基中，在含体积分数5％CO₂的培养箱37℃连续培养。

5.实验分组及细胞转染

5.1实验分组

实验在研究miR-15a/16-1寡核苷酸诱导Raji细胞凋亡部分分4组：空白对照组、随机序列组、miR-15a组和miR-16-1组；

在研究表达pre-miR-15a重组质粒诱导Raji细胞凋亡部分分3组：空白对照组、阴性对照质粒组、pre-miR-15a组；

在研究miR-15a/16-1寡核苷酸增强Ara-C诱导Raji细胞凋亡部分分8组：空白对照组、随机序列组、miR-15a组、miR-16-1组、Ara-C组、随机序列+Ara-C组、miR-15a+Ara-C组和miR-16-1+Ara-C组；

在研究表达pre-miR-15a重组质粒增强Ara-C诱导Raji细胞凋亡部分分6组：空白对照组、阴性对照质粒组、pre-miR-15a组、Ara-C组、阴性对照质粒+Ara-C组和pre-miR-15a+Ara-C组

5.2细胞转染：

(1)根据分组，在转染前一天，以4-8×10⁵/mL的细胞密度接种到96孔培养板上；

(2)溶液a的配制按每孔：12.5μL无血清培养基+0.5μL Lipofectamine^TM2000进行；

(3)溶液b的配制按每孔：12.5μL无血清培养基+0.2μg质粒(或寡核苷酸)进行，配好后室温下放置5min；

(4)将溶液a与溶液b混合，室温下置20min；

(5)与此同时，将96孔板中的细胞换用无血清培养基，终体积为125μL；

(6)将溶液a与溶液b的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5％的CO₂中保温5-6h；

(7)6h后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5％的CO₂培养箱中培养。

转染效率的检测：转染24h后，在荧光显微镜下选10个200倍视野，每个视野中统计200个细胞中带绿色荧光的细胞数，计算荧光细胞的百分比。

6.半定量RT-PCR检测转染细胞Bcl-2 mRNA表达水平

将转染48h的各组细胞在无菌条件下进行离心收集。应用细胞总RNA抽提纯化试剂盒和RT-PCR试剂盒测定Bcl-2 mRNA的水平。

6.1细胞总RNA的提取和纯化

1)收集离心细胞，去其上清，用PBS洗两次后，将细胞转移入1.5mL离心管中，每管加Trizol试剂1mL，摇匀，室温下置15min后，反复吹打裂细胞；

2)将各管内消化好的细胞裂液吸到一DEPC处理过的1.5mLEP管中，加氯仿0.2mL(Trizol：氯仿约为5∶1)，轻摇15s，并在冰上孵育15min；

3)12,000rpm，15min，4℃，离心。然后取上清无色水相到DEPC处理过的EP管，加0.5mL异丙醇，室温下置10min；

4)12,000rpm，10min，4℃，离心。观察总RNA在管底的白色沉淀，弃去上清；

5)加入用DEPC水新配制的经预冷的75％乙醇1.0mL，轻轻洗涤沉淀，12,000rpm，5min，4℃离心；

6)去上清，时离心，用小Tip吸干液体；使沉淀自然干燥，DEPC处理水20-30μL加入，混匀，55-60℃水浴10min溶总RNA；

7)用紫外分光光度仪测总RNA纯度和浓度，用琼脂糖胶电泳鉴定RNA是否水，鉴定后于-70℃保存备用。

6.2细胞总RNA的鉴定

浓度分析和纯度鉴定：从提取的RNA中吸取1μL，以DEPC水稀释至100μL，用紫外分光光度仪分别测总RNA的浓度，光吸收度A260和A280的比值(A260/A280)。

6.3逆转录反应

取上述RNA样品，将其稀释成1μg/μL，在PCR管中加入下列试剂的混合物：

RNA                                 3μL(3μg)

Random Primer(10μM)                2μL

dNTP Mixture(2.5μM)                2μL

5×First-Strand Buffer              4μL

DTT(0.1M)                           1μL

RNase inhibitor(10U/μL)            0.5μL

M-MLV(200U)                         1μL

RNase-free ddH₂O定容至50μL

在PCR仪上按照下列条件反应：42℃温浴50min，95℃加热5min，时离心，-20℃保存备用。

6.4PCR扩增

Bcl-2引物序列如下：上游引物：5′-GTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3′，下游引物：5’-CTTCAGAGACAGCCAGGAG-3′，产物长度212bp.内对照β-actin引物序列：上游引物5’-TGTATGCCTCTGGTCGTACCAC-3’，下游5’-ACAGAGTACTTGCGCTCAGGAG-3’，产物长度592bp。

取上述产物cDNA先扩增内参β-actin，然后根据β-actin的结果，确定cDNA合成是否成功，对合成成功的标本进行PCR反应，在扩增管中依次加入下列试剂：

cDNA(模板)                       2μL

上游引物(10μM)                  1μL

下游引物(10μM)                  2μL

dNTP Mixture(2.5mM)              4μL

10×Taq buffer(含MgCl₂)          5μL

Taq酶(2.5U/μL)                  1μL

ddH₂O                            36μL

上述试剂混匀，按如下扩增条件PCR：94℃变性1min，55℃复性45s，72℃延伸1min，循环30次，72℃保温5min。PCR产物在3％的琼脂糖凝胶上电泳观察并照相，于Gel-Doc1000型紫外凝胶图像分析仪上观察、分析。

7.荧光定量PCR检测法(Hairpin-it^TM miRNAs Real-Time PCR Quantitation Kit)检测miR-15a的表达水平

7.1RNA提取(方法同前)

7.2RT反应合成cDNA

按照Hairpin-it^TM miRNAs Real-Time PCR Quantitation Kit提供的说明书进行操作，反应为20μL体系。

5×RT Buffer                     5μL

DTT(0.1M)                        2.5μL

dNTP(10mM)                       0.75μL

Mg2+(25mM)                       3μL

miR-RT primers(1μM)             1.25μL

RNasin(40U/μL)                  0.25μL

MMLV Reverse Transcriptase(200U/μL)        0.5μL

RNA Sample(0.2ng to 200ng total RNA)        XμL

Rnase Free H₂O to 20μL

在逆转录反应之前须将除了逆转录外的各种试剂和逆转录mix混匀，用手指轻弹装试剂的管子。反应条件为：16℃30min，42℃30min，85℃10min。反应产物于-20℃保存。

7.3Real-Time PCR检测miR-15a的表达情况

按照Hairpin-it^TM miRNAs Real-Time PCR Quantitation Kit提供的说明书进行操作，反应为20μL体系。

2×Real-time PCR Buffer                     10μL

miR specific Primer set(5μM)               0.8μL

miRNA RT product                            2μL

Taq DNA polymerase(5U/μL)                  0.2μL

dd H2O To 20μL

反应条件为：95℃预热3min，如下反应进行40个循环：95℃变性12s，55℃复性25s，72℃延伸25s。

8.间接免疫荧光及流式细胞仪检测Bcl-2蛋白表达情况

离心收集转染后48h的各组细胞，用4％多聚甲醛室温固定30min，PBS洗后加体积分数3％H₂O₂，室温10min，PBS洗3次，每次5min，加10g/L TritonX-100，室温10min，PBS洗后加血清室温封闭40min，甩去不洗，滴加鼠抗人Bcl-2抗体，4℃过夜，次日复温30min，PBS洗，加入20μLCy3标记的羊抗鼠二抗孵育细胞，室温避光反应30min，PBS洗3次，每次5min，PBS混匀后上机，流式细胞仪(FCM)测定Bcl-2蛋白表达的阳性率。

9.台盼蓝细胞计数法

将对数生长期的细胞接种于96孔培养板中，按照上述步骤进行转染，分别于24，48和72h收获细胞，常规台盼蓝(0.5％)染色，用血球计数板计数活细胞数目，实验重复三次.

10.CCK8法测细胞生长抑制率及IC50值

将对数生长期的细胞接种于96孔培养板中，按照上述步骤进行转染，置于37℃、饱和湿度、5％CO₂条件下常规培养24、48和72h后，向每孔内加入30μL CCK8，再置于37℃孵育4h。然后直接在联检测仪上450nm波长处测A₄₅₀值，以A₄₅₀间接反映细胞存活数量。实验重复3次，据此可推算miR-15a和miR-16-1转染后各时间点对Raji细胞的抑制率。

按上述方法分组及转染Raji细胞，分别与不同浓度的Ara-C(0、5、10、20、40、80μg/ml)孵育，24h后CCK8法测各组A₄₅₀值，并计算以下参数：

②半数抑制浓度(IC50)：采用概率单位法PROBIT(Probability unit)。

11.Hoechst染色试剂盒观察凋亡细胞形态

收集经脂质体转染48小时的细胞，离心收集细胞样品于1.5ml离心管内，加入0.5ml固定液，混匀，固定10分钟。离心去固定液，PBS洗两遍。最后一次离心后吸去大部分液体保留约50μl液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，晾干.均匀滴上0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟，晾干。PBS洗两遍。滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上一洁净盖玻片，避免气泡。荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。

12.流式细胞仪检测细胞凋亡率

12.1AnnexinV/PI双染法

离心收集转染后48h的各组细胞，PBS洗涤2次，离心去上清，195μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞，加入Annexin V-FITC 5μL，避光孵育10min，离心去上清，190μL AnnexinV-FITC结合液重悬细胞，加入10μL碘化丙啶染色液，冰浴避光放置，随即进行流式细胞仪检测，用MULTCYCLE软件分析处理结果.

12.2PI染色法

离心收集转染后48h的各组细胞，PBS洗涤2次，离心去上清，用-20℃预冷的体积分数70％乙醇在4℃固定30min，然后弃去乙醇，加500μL PBS混匀细胞，然后加入碘化丙啶(PI)，避光染色15min。置流式细胞仪测定各组细胞凋亡率，用MULTICYCLE软件分析处理结果。

13.统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行数据的统计学分析。实验数据以均值±标准差表示，多组间数据比较，采用完全随机区组设计的单因素方差分析，组间的比较选用可进行多个样本均数间每两个均数比较的q检验或Bonferroni检验，IC50值计算采用Probit单位概率法。

二、miR-15a和miR-16-1抑制Raji细胞生长

1、pre-miR-15a重组质粒的成功构建

质粒测序结果如下：

AATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGTCCTTGG AGTAAAGTAGCAGCACATAATGGTTTGTGGATTTTGAAAAGGTGCAGGCCATATTGTGCTGCCTCAAAAATACAAGGAATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCC，测序结果显示所得重组质粒成功插入pre-miR-15a序列。

2、细胞转染效率

将转染阴性对照质粒24h后的细胞置于倒置荧光显微镜下观察，可见到部分细胞呈现绿色荧光(转染质粒中含有编码绿色荧光蛋白的基因)，在荧光显微镜下选10个200倍视野每个视野中统计200个细胞中带绿色荧光的细胞数，计算荧光细胞的百分比即转染率，其值为(39±2.4％)。后面的实验均按该转染效率下的脂质体与质粒比例进行转染。图1为转染24h后在倒置荧光显微镜下见到的图片。

3、荧光定量PCR法检测miR-15a的表达水平

转染表达pre-miR-15a重组质粒24h后，各组C_T值及摩尔数见表1。经统计学分析，pre-miR-15a组的miR-15a C_T值及摩尔数较空白对照组和阴性对照质粒组明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1转染pre-miR-15a 24h后Raji细胞中miR-15a的表达量x±s，n＝3)

^*与其他组相比，P＜0.05

4、RT-PCR检测转染后Bcl-2mRNA表达水平

由Bcl-2扩增产物的凝胶电泳(图2，3)可见，内对照β-actin在各处理组均有表达，Bcl-2扩增产物电泳区带约在210bp位置，与设计引物的理论值一致。对电泳产物分析，计算Bcl-2mRNA/β-actin的光密度OD比值，反映各组相对丰度。转染miR-15a和miR-16-1寡核苷酸48h后，各处理组Bcl-2表达的相对丰度依次为：空白对照组0.985±0.006，随机序列组0.978±0.009，miR-15a组0.974±0.010，miR-16-1组0.989±0.003，各组间差异无显著性(P＞0.05)。转染pre-miR-15a表达质粒48h后，各处理组Bcl-2表达的相对丰度依次为：空白对照组0.976±0.005，阴性对照质粒组0.985±0.007，pre-miR-15a组0.969±0.009，各组间亦无显著性差异(P＞0.05)。表明miR-15a和miR-16-1不降解Bcl-2 mRNA。

5.间接免疫荧光及流式细胞仪检测Bcl-2蛋白表达情况(图4，5)

图4，5的结果显示，Raji细胞经转染miR-15a和miR-16-1(或pre-miR-15a表达质粒)48h后，Bcl-2蛋白的表达量均降低，与空白对照组和随机序列组(或空白对照组和阴性对照质粒组)比较，差异有显著性(P＜0.05)；而空白对照组与随机序列组(或空白对照组与阴性对照质粒组)间差异无显著性(P＞0.05)，各组Bcl-2蛋白表达量见表2，3。

表2转染miR-15a/16-1寡核苷酸48h Bcl-2    表3转染表达pre-miR-15a重组质粒48h蛋白表达量(x±s，n＝3)                  Bcl-2蛋白表达量(x±s，n＝3)

^*与其它组相比，P＜0.05                  ^*与其它组相比，P＜0.05

6、台盼蓝拒染法检测miR-15a和miR-16-1对淋巴瘤细胞Raji的生长抑制作用

结果显示，终浓度为0.6μmol/L的miR-15a和miR-16-1寡核苷酸(或pre-miR-15a表达质粒)转染Raji细胞后，24h作用效果不明显，差异无显著性(P＞0.05)，48h和72h可发挥对细胞的生长抑制作用，且随着作用时间的增加，效果逐渐增强，48h作用效果明显，有明显的时效关系(图6)。

7、CCK8法检测miR-15a和miR-16-1对Raji细胞生长的影响

表4显示：转染miR-15a和miR-16-1寡核苷酸的Raji细胞增殖能力最差，其24h，48h和72hOD值均明显低于空白对照组和随机序列组(P＜0.05)，其中转染24h后，miR-15a组与随机序列组之间经Bonferroni检验即显示差异有显著性，P＝0.005，miR-16-1组与随机序列组之间差异亦有显著性，P＝0.014；表5显示pre-miR-15a组细胞的增殖能力较空白对照组和阴性对照质粒组弱，差异有显著性(P＜0.05)，其中转染24h后，pre-miR-15a与阴性对照质粒组之间经Bonferroni检验显示差异有显著性，P＝0.004；说明miR-15a和miR-16-1能够抑制Raji细胞的生长与增殖，且24h，48h和72h均可发挥作用，随作用时间的增加，效果逐渐增强，72h作用效果最明显，且有明显的时效关系。

表4转染miR-15a和miR-16-1后CCK8法检测Raji细胞吸光度A值(x±s，n＝5)

^*与其他组相比，P＜0.05

表5转染表达pre-miR-15a重组质粒后CCK8法检测Raji细胞吸光度A值(x±s，n＝5)

^*与其他组相比，P＜0.05

8、Hoechst染色检测细胞凋亡形态

图7，8为转染后48h Hoechst染色图。miR-15a组和miR-16-1组及pre-miR-15a组均可见明显的凋亡细胞：核膜完整，体积变小，核质固缩；而其他组未见明显凋亡细胞。

9、流式细胞仪检测细胞凋亡率

转染miR-15a和miR-16-1寡核苷酸后48h，流式细胞仪-AnnexinV/PI双染法显示miR-15a组的早期凋亡率和晚期凋亡率分别为9.74％和9.65％，，miR-16-1组的早期凋亡率和晚期凋亡率分别为9.70％和9.34％，与空白对照组和随机序列组比较差异有显著性(P＜0.05)。而空白对照组和随机序列组的凋亡率差异无显著性(P＞0.05)，见表6。转染表达pre-miR-15a重组质粒后48h，pre-miR-15a组的凋亡率为12.43％，显著高于空白对照组和阴性对照质粒组(P＜0.05)，而空白对照组与阴性对照质粒组间差异无显著性(P＞0.05)，见表7。可见，miR-15a和miR-16-1可诱导Raji细胞的凋亡(图9，10)。

表6转染miR-15a和miR-16-1后48h流式细胞仪-AnnexinV/PI双染法检测Raji细胞的凋亡(x±s，n＝5)

^*与其它组比，P＜0.05

表7转染表达pre-miR-15a重组质粒后48h流式细胞仪-PI染法检测Raji细胞的凋亡(x±s，n＝5)

^*与其它组相比，P＜0.05

三、miR-15a和miR-16-1可增强Raji细胞对阿糖胞苷敏感性

1.CCK8法检测IC50值变化

1.1转染miR-15a/16-1寡核苷酸入Raji细胞后Ara-C IC50值的变化

转染miR-15a的Raji细胞在0、5、10、20、40、80μg/ml 6种浓度的Ara-C作用24h后，细胞活力分别为(97.15±5.87％)、(67.0±3.96％)、(37.23±2.98％)、(20.15±2.24％)、(0.85±0.02％)、(0.01±0.01％)，转染miR-16-1的Raji细胞活力分别为(96.85±6.14％)、(66.38±4.53％)、(37.77±3.61％)、(20.85±3.01％)、(1.69±0.75％)、(0.31±0.06％)，明显低于相应Ara-C浓度作用下，转染随机序列的Raji细胞活力分别为(99.54±6.23％)、(73.00±4.09％)、(51.06±3.52％)、(26.46±2.96％)、(4.62±1.38％)、(1.92±0.96％)，P值均＜0.05，见图11a。可见，转染miR-15a/16-1寡核苷酸入Raji细胞后可使Ara-C的IC50值明显降低，各组IC50值见表8。

1.2转染表达pre-miR-15a重组质粒入Raji细胞后Ara-C IC50值的变化

转染表达pre-miR-15a重组质粒的Raji细胞在0、5、10、20、40、80μg/ml 6种浓度的Ara-C作用24h后，细胞活力分别为(96.08±6.3％)、(67.85±4.9％)、(38.46±2.1％)、(14.62±2.4％)、(1.00±0.4％)、(0.08±0.08％)，明显低于相应Ara-C浓度作用下，转染阴性对照质粒的Raji细胞活力分别为(96.00±5.3％)、(72.00±4.8％)、(51.38±4.4％)、(26.00±3.8％)、(8.00±2.1％)、(2.23±1.6％)，P值均＜0.05，见图11b。可见，转染表达pre-miR-15a重组质粒入Raji细胞可使Ara-C的IC50值明显降低，各组IC50值见表9。

表8转染miR-15a/16-1寡核苷酸入        表9表达pre-miR-15a重组质粒入Raji细胞Ara-C IC50值的变化           Raji细胞Ara-C IC50值的变化

^*与其它组相比，P＜0.05               ^*与其它组相比，P＜0.05

2.台盼蓝拒染法检测细胞生长抑制情况

2.1miR-15a/16-1寡核苷酸联合Ara-C后对Raji细胞的生长抑制作用实验结果显示，终浓度为0.6μmol/L的miR-15a/16-1寡核苷酸转染Raji细胞后，miR-15a+Ara-C组和miR-16-1+Ara-C组的细胞数较单用miR-15a组、单用miR-16-1组、单用Ara-C组及随机序列+Ara-C组明显降低，miR-15a/16-1寡核苷酸作用24h时开始发挥作用，且随着作用时间的增加，其效果逐渐增强，72h作用效果明显.(图12)

2.2表达pre-miR-15a重组质粒联合Ara-C后对Raji细胞的生长抑制作用

实验结果显示，表达pre-miR-15a重组质粒联合10μg/ml的Ara-C后，Raji细胞的生长较其他组明显受到抑制(P＜0.05)，于24h开始发挥作用，且随着作用时间的增加，其效果逐渐增强，72h作用效果明显.(图13)

3.CCK8法检测细胞增殖情况

3.1CCK8法检测miR-15a/16-1寡核苷酸联合Ara-C对Raji细胞生长的影响

CCK8结果(表10)显示：Raji细胞在经miR-15a/16-1寡核苷酸和10μg/mL Ara-C联合处理后，细胞增殖活性大大降低，并明显低于其它组别(P＜0.05)；而Ara-C与随机序列联合作用导致的细胞增殖活力与单用Ara-C组相当，无显著差异(P＞0.05)。这说明转染miR-15a或miR-16-1寡核苷酸可以增强Ara-C对Raji细胞生长的抑制作用。

表10miR-15a和miR-16-1寡核苷酸联合Ara-C CCK8法检测Raji细胞吸光度A值(x±s，n＝5)

^*其他组相比，P＜0.05。

3.2CCK8法检测表达pre-miR-15a重组质粒联合Ara-C对Raji细胞生长的影响

CCK8结果(表11)显示：转染表达pre-miR-15a重组质粒并加用10μg/mL Ara-C后的Raji细胞增殖能力最差，pre-miR-15a+Ara-C组的CCK8值要显著低于空白对照组、阴性对照质粒组、pre-miR-15a组、Ara-C组、阴性对照质粒+Ara-C组(P＜0.05)；而Ara-C联用阴性对照质粒与单用Ara-C相比细胞增殖活性无明显差别(P＞0.05)。这说明表达pre-miR-15a重组质粒与化疗药物Ara-C联用后可以增强Ara-C对Raji细胞生长的抑制作用。

表11表达pre-miR-15a重组质粒联合Ara-C CCK8法检测Raji细胞吸光度A值(x±s，n＝5)

^*与其他组相比，P＜0.05。

4.Raji细胞凋亡的形态学改变

经转染miR-15a/16-1寡核苷酸或表达pre-miR-15a重组质粒并联合Ara-C组经Hoechst染色后均可见大量凋亡细胞：核膜完整，体积变小，核质固缩；而其他组未见或仅见少量凋亡细胞(图14，15)。

5.细胞凋亡率分析

5.1转染miR-15a/16-1寡核苷酸及联用Ara-C(流式细胞仪-AnnexinV/PI双染法)

各组细胞凋亡率见表12。miR-15a或miR-16-1寡核苷酸与Ara-C(10μg/mL)联用时的细胞凋亡率最高，与单用miR-15a或miR-16-1寡核苷酸、单用Ara-C、随机序列联用Ara-C组相比有显著性差异(P＜0.05)；而随机序列+Ara-C组与单用Ara-C组之间、miR-15a与miR-16-1之间比较细胞凋亡率未见显著性差异(P＞0.05)。表明miR-15a/16-1寡核苷酸与Ara-C联用可显著增加细胞的凋亡率。(图16)

表12转染miR-15a/16-1及并联合Ara-C后48h流式细胞仪双染法检测Raji细胞凋亡率(x±s，n＝5)

^*与其他组相比，P＜0.05

5.2转染表达pre-miR-15a重组质粒及联用Ara-C(流式细胞仪-PI染法)

各组细胞凋亡率见表13。表达pre-miR-15a重组质粒与Ara-C(10μg/mL)联用的细胞凋亡率最高，与单用表达pre-miR-15a重组质粒、单用阴性对照质粒、单用Ara-C、阴性对照质粒联用Ara-C相比有显著性差异(P＜0.05)；而单用Ara-C与阴性对照质粒联用Ara-C之间细胞凋亡率未见显著性差异(P＞0.05)。表明表达pre-miR-15a重组质粒与Ara-C联用可显著增加细胞的凋亡率。(图17)

表13转染表达pre-miR-15a重组质粒及联合Ara-C后48h流式细胞仪单染法检测Raji细胞凋亡率(x±s，n＝5)

^*与其它组相比，P＜0.05

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>暨南大学

<120>微小RNA在制备治疗和/或预防淋巴瘤药物中的应用

<130>090612

<160>13

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>22

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<221>microRNA

<222>(1)..(22)

<223>miR-15a序列

<400>1

uagcagcaca uaaugguuug ug                                        22

<210>2

<211>22

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<221>microRNA

<222>(1)..(22)

<223>microRNA16-1序列

<400>2

uagcagcacg uaaauauugg cg                                        22

<210>3

<211>22

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>随机序列

<400>3

cauuaauguc ggacaacuca au                                        22

<210>4

<211>83

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>gene

<222>(1)..(83)

<223>pre-miR-15a前体基因序列

<400>4

ccttggagta aagtagcagc acataatggt ttgtggattt tgaaaaggtg caggccatat    60

tgtgctgcct caaaaataca agg                                            83

<210>5

<211>83

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>gene

<222>(1)..(83)

<223>根据pre-miR-15a前体基因序列设计的阴性对照序列

<400>5

agcttttcca aaaattctcc gaacgtgtca cgttctcttg aaacgtgaca cgttcggaga    60

agggttctcc gaacgtgtca cgt                                            83

<210>6

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(62)

<223>pre-miR-15a前体基因的获得片段1

<400>6

cgggtaccgg tccttggagt aaagtagcag cacataatgg tttgtggatt ttgaaaaggt    60

gc                                                                   62

<210>7

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(59)

<223>pre-miR-15a前体基因的获得片段2

<400>7

ccggaattcc ttgtattttt gaggcagcac aatatggcct gcaccttttc aaaatccac    59

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(24)

<223>包含pre-miR-15a前体基因序列的重组质粒构建过程所用阳性克隆鉴定引物

1

<400>8

cctatttccc atgattcctt cata                                            24

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>包含pre-miR-15a前体基因序列的重组质粒构建过程所用阳性克隆鉴定引物

2

<400>9

gtaatacggt tatccacgcg                                                 20

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(19)

<223>Bcl基因检测引物1

<400>10

gtggccttct ttgagttcg                                                  19

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(19)

<223>Bcl基因检测引物2

<400>11

cttcagagac agccaggag                                                  19

<210>12

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>β-actin引物1

<400>12

tgtatgcctc tggtcgtacc ac                                              22

<210>13

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>β-actin引物2

<400>13

acagagtact tgcgctcagg ag                                            22

Claims (10)

1、微小RNA在制备治疗和/或预防淋巴瘤药物中的应用，其特征在于：所述药物的活性成分包括微小RNA-15a、微小RNA-16-1、微小RNA-15a的前体、微小RNA-16-1的前体或它们中两种以上的混合物。

2、根据权利要求1所述微小RNA在制备治疗和/或预防淋巴瘤药物中的应用，其特征在于：所述微小RNA或其前体经过公知的改良性修饰。

3、根据权利要求2所述微小RNA在制备治疗和/或预防淋巴瘤药物中的应用，其特征在于：所述微小RNA或其前体为单链或由该单链和该单链的互补链构成的双链形式。

4、一种治疗和/或预防淋巴瘤的药物组合物，其特征在于：包括有效量的微小RNA和药学上可接受的稀释剂、载体或辅剂，所述微小RNA为微小RNA-15a、微小RNA-16-1、微小RNA-15a的前体、微小RNA-16-1的前体或它们中两种以上的混合物。

5、根据权利要求4所述治疗和/或预防淋巴瘤的药物组合物，其特征在于：所述药物的活性成分还包括能够诱导肿瘤凋亡的化疗药物。

6、根据权利要求5所述治疗和/或预防淋巴瘤的药物组合物，其特征在于：所述化疗药物为阿糖胞苷、长春新碱、阿霉素、柔红霉素、甲氨喋呤、三氧化二砷或它们中两种以上的混合物。

7、根据权利要求6中任一项所述治疗和/或预防淋巴瘤的药物组合物，其特征在于：所述微小RNA或其前体经过公知的改良性修饰。

8、根据权利要求4-7中任一项所述治疗和/或预防淋巴瘤的药物组合物，其特征在于：所述微小RNA或其前体通过化学合成得到；或者通过构建真核表达载体得到。

9、根据权利要求8所述治疗和/或预防淋巴瘤的药物组合物，其特征在于：所述真核表达载体为质粒载体或病毒载体。

10、根据权利要求4-7中任一项所述治疗和/或预防淋巴瘤的药物组合物，其特征在于：所述淋巴瘤为Burkitt淋巴瘤。

Images