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JP5374359B2 - 安定化されたポリペプチド化合物 - Google Patents

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Description

（関連出願）
本願は、以下の米国仮特許出願への優先権の利益を請求し、それぞれは、あらゆる目的のために、それらの全体が本明細書中に参考として援用される：
１）２００６年３月１７日に出願された、表題「ＳＴＡＢＩＬＩＺＥＤ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＥＶＡＬＵＡＴＩＮＧ ＡＮＤ ＩＮＣＲＥＡＳＩＮＧ ＴＨＥ ＳＴＡＢＩＬＩＴＹ ＯＦ ＳＡＭＥ」の米国仮特許出願第６０／７８３，６２２号；
２）２００６年６月９日に出願された、表題「ＳＴＡＢＩＬＩＺＥＤ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＥＶＡＬＵＡＴＩＮＧ ＡＮＤ ＩＮＣＲＥＡＳＩＮＧ ＴＨＥ ＳＴＡＢＩＬＩＴＹ ＯＦ ＳＡＭＥ」の米国仮特許出願第６０／８１２，６８８号；
３）２００６年１２月８日に出願された、表題「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＥＶＡＬＵＡＴＩＮＧ ＡＮＤ ＥＮＨＡＮＣＩＮＧ ＢＩＯＰＨＹＳＩＣＡＬ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ ＯＦ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ」の米国仮特許出願第６０／８７３，５０２号；
４）２００６年１２月８日に出願された、表題「ＳＴＡＢＩＬＩＺＥＤ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ」の米国仮特許出願第６０／８７３，９９６号。
本明細書全体にわたって引用される任意の特許、特許出願、および参考文献の内容は、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
（発明の背景）
蛋白質の安定性は、今日、蛋白質、例えば、抗体分子の開発およびスケールアップについての中心的な論点として認識されている。抗体の重鎖および軽鎖可変ドメイン配列は選択圧の下にあり、１つの抗体と別の抗体とで配列が有意に変化し得る（Ｗｕ ａｎｄ Ｋａｂａｔ，１９７０）。ヒトゲノム内に埋め込まれた非常に多数の機能的生殖系可変重鎖（〜４０；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｍａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｈｏｎｊｏ，１９９６）、可変カッパ（〜４０；Ｍｅｉｎｄｌ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｂａｒｂｉｅ ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ，１９９８）および可変ラムダ（〜３０；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｋａｗａｓａｋｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９７）遺伝子がある。重鎖および軽鎖可変ドメイン生殖系の多くの組合せを作り出す免疫系の能力は、抗体多様性を作り出す１つのメカニズムである（Ｅｄｅｌｍａｎ，１９５９；Ｆｒａnｅｋ，１９６１）。さらなる多様性は、可変連結ペプチド領域、Ｊ−連結ペプチド（＋重鎖についてのＤ−連結ペプチド）の、可変ドメインおよび定常ドメインの間への挿入によって誘導される（Ｌｅｄｅｒ，１９８２）。特異的抗原に対する生殖系抗体選択に引き続いて、選択された可変ドメイン生殖系および（Ｄ−）Ｊ−連結ペプチドを含む単一抗体を発現するＢ−細胞は、可変重鎖および軽鎖ドメイン内に超体細胞突然変異のプロセスを受けて、抗原に向けての抗体親和性を増大させる（Ｌｅｄｅｒ，１９８２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。可変ドメイン内の超体細胞挿入または欠失もまた通常に観察されるが、超体細胞突然変異よりもかなり低い（ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。かくして、特定の抗原に対して選択された成熟抗体は、必ずしも安定性に対して最適化されない高度にユニークな可変ドメイン配列を有する。
貧弱な安定性は、種々の細胞系において、例えば、細菌または哺乳動物発現系において発現される場合に、適切に折り畳む抗体または抗体ドメインの能力に影響し得る。誤折り畳みまたは貧弱な安定性もまた、治療的に用いる場合に潜在的に危険なまたは免疫原性である大きな可溶性凝集体を形成する傾向がある非−機能的物質（Ｍａｒｔｓｅｖ ｅｔ ａｌ．，１９９８）および／または抗体の画分集団がもたらされ得る。他の安定性の問題は阻害された再折り畳み、分解、損なわれた結合活性、凝集、貯蔵に続いての活性の喪失を含む。
安定性の問題は天然に生じる抗体に限定されないが、組換え抗体ライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，２００５）、抗体断片（Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．、２００３；Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｗｏｍ ａｎｄ Ｐｌｕｋｔｈｕｎ，２００１；Ｒｅｉｔｅｒ ａｎｄ Ｐａｓｔａｎ，１９９６）、および製造および臨床目的のための作成されたまたはヒト化治療抗体（Ｅｗｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｃａｒｔｅｒ ａｎｄ Ｍｅｒｃｈａｎｔ，１９９７）のような、作成された抗原結合分子において同様に起こり得る。加えて、二特異的分子のような抗体の多価形態は安定性の問題を有し得る。二価抗体はヒトにおけるその治療的利用性のため望ましいが、その生産は予測できない。例えば、二特異的抗体は熱的安定性、生産物収率において、または低分子量凝集体の形成において実質的な減少をもたらし得る。
ＶＨおよびＶＬドメインに対する非天然変化もまた、げっ歯類抗体をヒト化する場合に生起し得る。ヒト化は、一般には、げっ歯類相補性決定領域（ＣＤＲ）を最も同様なヒト生殖系可変ドメインにグラフトすることによって行われる（Ｈｕｒｌｅ ａｎｄ Ｇｒｏｓｓ，１９９４）。ヒト化のために選択された生殖系は、免疫系によって大きな頻度をもって用いることができず、ヒトフレームワーク内の変化は、しばしば、適切な抗原結合を達成するのに必要である。
不安定な蛋白質は：（例えば、低い収率、組立てられていない産物および／または凝集した物質のような望まない副産物のかなりのレベルのため）培養リアクターにおけるスケールアップ生産についての不適当性、蛋白質精製の困難、および（例えば、有意なレベルの分解産物、貧弱な産物の質、および／または不都合なファルマコキネティック特性による）医薬の調製および使用についての不適当性の内の１以上を含む多くの問題に悩んでいる。抗体、Ｆａｂ、Ｆｖまたは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）の可変ドメイン内での不安定性の結果、多くのこれらの問題がもたらされ得る。ｓｃＦｖ構築体は、特に、細菌および哺乳動物発現系の双方において、安定性、可溶性、発現、凝集、分解産物、および総じての製造性についての示された問題を有する（Ｗｏｒｎ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，２００１参照）。加えて、ｓｖＦｖ分子の他の適当な組換え抗体産物への取り込みは、しばしば、新しい組換えデザインに対してこれらの一般的に望ましくない特性を付与する。
従って、抗体のような蛋白質の安定性を予測する改良された方法、および拡張可能な生産に適している改良された安定な抗原結合分子に対する要望が存在する。また、医薬適用に適している安定な抗原結合分子の集団の拡張可能な生産を可能とする改良された方法に対する要望も存在する。
（発明の要旨）
本発明は、少なくとも部分的には、改良された安定性を備えたｓｃＦｖ分子を含む、またはそれよりなる改良されたポリペプチド組成物、例えば、改良された結合分子、およびそれを作成する方法の開発に基づく。
１つの態様において、本発明は安定化されたｓｃＦｖ分子の集団に関し、ここに、該安定化されたｓｃＦｖ分子は、
ｉ）ＶＨドメインおよびＶＬドメインの間に存在するｓｃＦｖリンカー、ここに、該ＶＨおよびＶＬドメインは、ＶＨドメインにおけるアミノ酸およびＶＬドメインにおけるアミノ酸の間のジスルフィド結合によって連結されており、およびここに、ｓｃＦｖ分子のＶＨおよびＶＬドメインは５５℃；よりも高いＴｍ値を有し；または
ｉｉ）ＶＨドメインおよびＶＬドメインの間に存在するｓｃＦｖ、ここに、該ＶＨおよびＶＬドメインはＶＨにおけるアミノ酸およびＶＬドメインにおけるアミノ酸の間のジスルフィド結合によって連結されており、およびここにｓｃＦｖ分子は４９℃よりも高いＴ５０を有する；
を含む。
もう１つの態様において、本発明は安定化されたｓｃＦｖ分子に関し、ここに、該安定化されたｓｃＦｖ分子が、
ａ．ＶＨドメインおよびＶＬドメインの間に存在するアミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを有するｓｃＦｖリンカー、ここにＶＨおよびＶＬドメインはＶＨアミノ酸４４およびＶＬアミノ酸１００；の間のジスルフィド結合によって連結されており；
ｉｉ）ＶＨドメインおよびＶＬドメイン、ここに分子は：
ａ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１３におけるアミノ酸の置換
ｂ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１６におけるアミノ酸の置換
ｃ）ＶＬのＫａｂａｔ位置４６におけるアミノ酸の置換
ｄ）ＶＬのＫａｂａｔ位置４９におけるアミノ酸の置換
ｅ）ＶＬのＫａｂａｔ位置５０におけるアミノ酸の置換
ｆ）ＶＬのＫａｂａｔ位置４９および５０におけるアミノ酸の置換
ｇ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１０１におけるアミノ酸の置換
ｈ）ＶＨのＫａｂａｔ位置２０におけるアミノ酸の置換
ｉ）ＶＨのＫａｂａｔ位置４８におけるアミノ酸の置換
ｊ）ＶＬのＫａｂａｔ位置３におけるアミノ酸の置換
ｋ）ＶＨのＫａｂａｔ位置５５におけるアミノ酸の置換
ｌ）ＶＨのＫａｂａｔ位置６７におけるアミノ酸の置換
ｍ）ＶＨのＫａｂａｔ位置６におけるアミノ酸の置換
ｎ）ＶＨのＫａｂａｔ位置３２におけるアミノ酸の置換
ｏ）ＶＨのＫａｂａｔ位置４９におけるアミノ酸の置換
ｐ）ＶＨのＫａｂａｔ位置４３におけるアミノ酸の置換
ｑ）ＶＨのＫａｂａｔ位置７２におけるアミノ酸の置換
ｒ）ＶＨのＫａｂａｔ位置７９におけるアミノ酸の置換
ｓ）ＶＬのＫａｂａｔ位置５０におけるアミノ酸の置換
ｔ）ＶＬのＫａｂａｔ位置７５におけるアミノ酸の置換
ｕ）ＶＬのＫａｂａｔ位置８０におけるアミノ酸の置換
ｖ）ＶＬのＫａｂａｔ位置８３におけるアミノ酸の置換；
よりなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、または
ｉｉｉ）ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬの間の安定化された界面を備えたＶＨドメインおよびＶＬドメイン、ここに、分子は界面内に直接的にアミノ酸位置において、および／またはＶＨおよびＶＬの間の相互作用の足場となるアミノ酸位置において少なくとも１つの置換を有し、ここに、該少なくとも１つのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔナンバリングに従って、４７Ｈ、３７Ｈ、４５Ｈ、４６Ｈ、５１Ｈ、５９Ｈ、１０９Ｈ、１４Ｈ、２６Ｈ、２７Ｈ、４０Ｈ、６９Ｈ、１０３Ｈ、２９Ｈ、３８Ｈ、４４Ｈ、４９Ｈ、５５Ｈ、６３Ｈ、５４Ｈ、６８Ｈ、７２Ｈ、７４Ｈ、７９Ｈ、８２ｂＨ、８Ｈ、３２Ｈ、３９Ｈ、４１Ｈ、６２Ｈ、８５Ｈ、９１Ｈ、２４Ｈ、６０Ｈ、３７Ｌ、３６Ｌ、４４Ｌ、５９Ｌ、５７Ｌ、６４Ｌ、４６Ｌ、４８Ｌ、６３Ｌ、６７Ｌ、６８Ｌ、３９Ｌ、４５Ｌ、４７Ｌ、５４Ｌ、５６Ｌ、７９Ｌ、８５Ｌ，９８Ｌ，５８Ｌ，７４Ｌ，７７Ｌ，８３Ｌ，８９Ｌおよび１０４Ｌよりなる群から選択され、およびここに、安定化されたｓｃＦｖ分子は、置換を欠如するｓｃＦｖ分子のそれよりも大きなＴ５０を有する；
を含む。
もう１つの態様において、本発明はＶＨドメインおよびＶＬドメインの間に存在する（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ｓｃＦｖリンカーを含む安定化されたｓｃＦｖ分子に関し、ここに、ＶＨおよびＶＬドメインはＶＨにおけるアミノ酸およびＶＬドメインにおけるアミノ酸の間のジスルフィド結合によって連結されている。
もう１つの具体例において、本発明はＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む安定化されたｓｃＦｖ分子に関し、ここに、分子は：
ａ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１６におけるアミノ酸の、例えば、グルタメートまたはグルタミンでの置換、およびＶＬのＫａｂａｔ位置４６におけるアミノ酸の、例えば、リシンでの置換；
ｂ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１６におけるアミノ酸の、例えば、グルタメートまたはグルタミンでの置換；ＶＬのＫａｂａｔ位置４６におけるアミノ酸の、例えば、リシンでの置換；およびＶＨのＫａｂａｔ位置５５におけるアミノ酸の、例えば、グリシンでの置換；および
ｃ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１６におけるアミノ酸の、例えば、グルタメートまたはグルタミンでの置換；ＶＬのＫａｂａｔ位置４６におけるアミノ酸の、例えば、リシンでの置換；ＶＨのＫａｂａｔ位置５５におけるアミノ酸の、例えば、グリシンでの置換；およびＶＨのＫａｂａｔ位置１０１におけるアミノ酸の、例えば、アルパラギン酸での置換；
よりなる群から選択される置換の少なくとも１つの組を有する。
もう１つの具体例において、安定化されたｓｃＦｖ分子は、熱挑戦の条件下で慣用的なＦａｂ断片のそれと同等な安定性を有する。
１つの具体例において、安定性は、標的分子に結合する能力を測定することによって評価される。
１つの具体例において、ｓｃＦｖ分子は、配列番号；９、１４、１６および１８よりなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。
１つの具体例において、ｓｃＦｖ分子は配列番号；１０、１５、１７および１９よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
もう１つの具体例において、本発明は、安定化されたｓｃＦｖ分子を含む融合蛋白質に関する。
１つの具体例において、融合蛋白質は少なくとも２つの抗原結合部位を含む。
もう１つの態様において、本発明は、安定化された多価抗原結合分子の集団に関し、ここに、安定化された結合分子はＶＨドメインおよびＶＬドメインの間に存在するｓｃＦｖリンカーを含む少なくとも１つの安定化されたｓｃＦｖ分子を含み、ここに、ＶＨおよびＶＬドメインはＶＨにおけるアミノ酸およびＶＬドメインにおけるアミノ酸の間のジスルフィド結合によって連結されており、およびここに、安定化された結合分子の集団は、その１０％以下が凝集された形態で存在するモノマー可溶性蛋白質を含む。
１つの具体例において、安定化された多価抗原結合分子はＣＨＯまたはＮＳ０細胞において発現される。
もう１つの態様において、本発明は安定化された多価抗原結合分子の集団に関し、ここに、各多価抗原結合分子は、
ｉ）ＶＨドメインおよびＶＬドメインの間に存在するｓｃＦｖリンカーを含む少なくとも１つのｓｃＦｖ分子、ここに、ＶＨおよびＶＬドメインはＶＨにおけるアミノ酸およびＶＬドメインにおけるアミノ酸の間のジスルフィド結合によって連結されており、およびここに、少なくとも１つのｓｃＦｖ分子のＶＨおよびＶＬドメインは５５℃よりも高いＴｍを有し；または
ｉｉ）ＶＨドメインおよびＶＬドメインの間に存在するｓｃＦｖリンカーを含む少なくとも１つのｓｃＦｖ分子、ここに、ＶＨドメインおよびＶＬドメインはＶＨにおけるアミノ酸およびＶＬドメインにおけるアミノ酸の間のジスルフィド結合によって連結され、およびここに、多価抗原結合分子の少なくとも１つのｓｃＦｖ分子は４９℃よりも高いＴ５０を有する；
を含む。
もう１つの具体例において、本発明は、
ｉ）少なくとも１つの安定化されたｓｃＦｖ分子、ここに、安定化されたｓｃＦｖ分子はＶＨドメインおよびＶＬドメインの間に存在する（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎｓｃＦｖリンカーを含み、およびここに、ＶＨおよびＶＬドメインはジスルフィド結合によって連結され；
ｉｉ）ＶＨドメインおよびＶＬドメインの間に存在するアミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを有するｓｃＦｖリンカーを含む少なくとも１つの安定化されたｓｃＦｖ分子、ここに、ＶＨおよびＶＬドメインはＶＨアミノ酸４４およびＶＬアミノ酸１００の間のジスルフィド結合によって連結されており；
ｉｉｉ）少なくとも１つの安定化されたｓｃＦｖ分子、ここに、安定化されたｓｃＦｖ分子は：
ａ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１３におけるアミノ酸の置換
ｂ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１６におけるアミノ酸の置換
ｃ）ＶＬのＫａｂａｔ位置４６におけるアミノ酸の置換
ｄ）ＶＬのＫａｂａｔ位置４９におけるアミノ酸の置換
ｅ）ＶＬのＫａｂａｔ位置５０におけるアミノ酸の置換
ｆ）ＶＬのＫａｂａｔ位置４９および５０におけるアミノ酸の置換
ｇ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１０１におけるアミノ酸の置換
ｈ）ＶＨのＫａｂａｔ位置２０におけるアミノ酸の置換
ｉ）ＶＨのＫａｂａｔ位置４８におけるアミノ酸の置換
ｊ）ＶＬのＫａｂａｔ位置３におけるアミノ酸の置換
ｋ）ＶＨのＫａｂａｔ位置５５におけるアミノ酸の置換
ｌ）ＶＨのＫａｂａｔ位置６７におけるアミノ酸の置換
ｍ）ＶＨのＫａｂａｔ位置６におけるアミノ酸の置換
ｎ）ＶＨのＫａｂａｔ位置３２におけるアミノ酸の置換
ｏ）ＶＨのＫａｂａｔ位置４９におけるアミノ酸の置換
ｐ）ＶＨのＫａｂａｔ位置４３におけるアミノ酸の置換
ｑ）ＶＨのＫａｂａｔ位置７２におけるアミノ酸の置換
ｒ）ＶＨのＫａｂａｔ位置７９におけるアミノ酸の置換
ｓ）ＶＬのＫａｂａｔ位置５０におけるアミノ酸の置換
ｔ）ＶＬのＫａｂａｔ位置７５におけるアミノ酸の置換
ｕ）ＶＨのＫａｂａｔ位置８０におけるアミノ酸の置換
ｖ）ＶＨのＫａｂａｔ位置８３におけるアミノ酸の置換；
よりなる群から選択される少なくとも１つの置換を含み；または
ｉｖ）ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬの間の安定化された界面を備えたＶＨドメインＶＬドメイン、ここに、分子は直接的に界面内のアミノ酸位置において、および／またはＶＨおよびＶＬの間の相互作用の足場となるアミノ酸位置において少なくとも１つの置換を有し、ここに、少なくとも１つのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔナンバリングに従って、：４７Ｈ、３７Ｈ、４５Ｈ、４６Ｈ、５１Ｈ、５９Ｈ、１０９Ｈ、１４Ｈ、２６Ｈ、２７Ｈ、４０Ｈ、６９Ｈ、１０３Ｈ、２９Ｈ、３８Ｈ、４４Ｈ、４９Ｈ、５５Ｈ、６３Ｈ、５４Ｈ、６８Ｈ、７２Ｈ、７４Ｈ、７９Ｈ、８２ｂＨ、８Ｈ、３２Ｈ、３９Ｈ、４１Ｈ、６２Ｈ、８５Ｈ、９１Ｈ、２４Ｈ、６０Ｈ、３７Ｌ、３６Ｌ、４４Ｌ、５９Ｌ、５７Ｌ、６４Ｌ、４６Ｌ、４８Ｌ、６３Ｌ、６７Ｌ、６８Ｌ、３９Ｌ、４５Ｌ、４７Ｌ、５４Ｌ、５６Ｌ、７９Ｌ、８５Ｌ、９８Ｌ、５８Ｌ、７４Ｌ、７７Ｌ、８３Ｌ、８９Ｌおよび１０４Ｌよりなる群から選択される；
を含む安定化された多価抗原結合分子に関する。
もう１つの態様において、本発明はＶＨドメインおよびＶＬドメインの間に存在する（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ｓｃＦｖリンカーを含む少なくとも１つの安定化されたｓｃＦｖ分子を含む安定化された多価抗原結合分子に関し、ここに、ＶＨおよびＶＬドメインはＶＨにおけるアミノ酸およびＶＬドメインにおけるアミノ酸の間のジスルフィド結合によって連結される。
ｉｉ）ＶＨドメインおよびＶＬドメインの間に存在するアミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを有するｓｃＦｖリンカーを含む少なくとも１つの安定化されたｓｃＦｖ分子、ここに、ＶＨおよびＶＬドメインはＶＨアミノ酸４４およびＶＬアミノ酸１００の間のジスルフィド結合によって連結され；または
ｉｉｉ）少なくとも１つの安定化されたｓｃＦｖ分子、ここに、安定化されたｓｃＦｖ分子は：
ａ）ＶＬのＫａｂａｔ位置３におけるアミノ酸（例えば、グルタミン）の、例えば、アラニン、セリン、バリン、アスパラギン酸、またはグリシンの置換；
ｂ）ＶＬのＫａｂａｔ位置４６におけるアミノ酸（例えば、セリン）の、例えば、ロイシンでの置換；
ｃ）ＶＬのＫａｂａｔ位置４９におけるアミノ酸（例えば、セリン）の、例えば、チロシンまたはセリンでの置換；
ｄ）ＶＬのＫａｂａｔ位置５０におけるアミノ酸（例えば、セリンまたはバリン）の、例えば、セリン、スレオニン、およびアルギニン、アスパラギン酸、グリシンまたはロイシンでの置換；
ｅ）ＶＬのＫａｂａｔ位置４９におけるアミノ酸（例えば、セリン）および、およびＫａｂａｔ位置５０におけるアミノ酸（例えば、セリン）の、各々、チロシンおよびセリン；チロシンおよびスレオニン；チロシンおよびアルギニン；チロシンおよびグリシン；セリンおよびアルギニン；またはセリンおよびリシンでの置換；
ｆ）ＶＬのＫａｂａｔ位置７５におけるアミノ酸（例えば、バリン）の、例えば、イソロイシンでの置換；
ｇ）ＶＬのＫａｂａｔ位置８０におけるアミノ酸（例えば、プロリン）の、例えば、セリンまたはグリシンでの置換；
ｈ）ＶＬのＫａｂａｔ位置８３におけるアミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の、例えば、セリン、アラニン、グリシンまたはスレオニンでの置換；
ｉ）ＶＨのＫａｂａｔ位置６におけるアミノ酸（例えば、グルタミン酸）の、例えば、グルタミンでの置換；
ｊ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１３におけるアミノ酸（例えば、リシン）の、例えば、グルタメートでの置換；
ｋ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１６におけるアミノ酸（例えば、セリン）の、例えば、グルタメートまたはグルタミンでの置換；
ｌ）ＶＨのＫａｂａｔ位置２０におけるアミノ酸（例えば、バリン）の、例えば、イソロイシンでの置換；
ｍ）ＶＨのＫａｂａｔ位置３２におけるアミノ酸（例えば、アスパラギン）の、例えば、セリンでの置換；
ｎ）ＶＨのＫａｂａｔ位置４３におけるアミノ酸（例えば、グルタミン）の、例えば、リシンまたはアルギニンでの置換；
ｏ）ＶＨのＫａｂａｔ位置４８におけるアミノ酸（例えば、メチオニン）の、例えば、イソロイシンまたはグリシンでの置換；
ｐ）ＶＨのＫａｂａｔ位置４９におけるアミノ酸（例えば、セリン）の、例えば、グリシンまたはアラニンでの置換；
ｑ）ＶＨのＫａｂａｔ位置５５におけるアミノ酸（例えば、バリン）の、例えば、グリシンでの置換；
ｒ）ＶＨのＫａｂａｔ位置６７におけるアミノ酸（例えば、バリン）の、例えば、イソロイシンまたはロイシンでの置換；
ｓ）ＶＨのＫａｂａｔ位置７２におけるアミノ酸（例えば、グルタミン酸）の、例えば、アスパルテートまたはアスパラギンでの置換；
ｔ）ＶＨのＫａｂａｔ位置７９におけるアミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の、例えば、セリン、バリンまたはチロシンでの置換；および
ｕ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１０１におけるアミノ酸（例えば、プロリン）の、例えば、アスパラギン酸での置換；
よりなる群から選択される少なくとも１つの置換を含む。
もう１つの態様において、本発明は、少なくとも１つの安定化されたｓｃＦｖ分子を含む多価抗原結合分子に関し、ここに、安定化されたｓｃＦｖ分子は：
ａ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１６におけるアミノ酸の、例えば、グルタメートまたはグルタミンでの置換、およびＶＬのＫａｂａｔ位置４６における、例えば、リシンでの置換；
ｂ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１６におけるアミノ酸の、例えば、グルタメートまたはグルタミンでの置換；ＶＬのＫａｂａｔ位置４６におけるアミノ酸の、例えば、リシンでの置換；ＶＨのＫａｂａｔ位置５５におけるアミノ酸の、例えば、グリシンでの置換；および
ｃ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１６におけるアミノ酸の、例えば、グルタメートまたはグルタミンでの置換；ＶＬのＫａｂａｔ位置４６におけるアミノ酸、例えば、リシンでの置換；ＶＨのＫａｂａｔ位置５５におけるアミノ酸の、例えば、グリシンでの置換；およびＶＨのＫａｂａｔ位置１０１におけるアミノ酸の、例えば、アスパラギン酸での置換；
よりなる群から選択される置換の少なくとも１つの組を含む。
１つの具体例において、少なくとも１つの安定化されたｓｃＦｖ分子は遺伝的に抗体に融合する。もう１つの具体例において、２つの安定化されたｓｃＦｖ分子は遺伝子的に抗体に融合する。
１つの具体例において、少なくとも１つの安定化されたｓｃＦｖ分子は、遺伝子的に、抗体の軽鎖または重鎖のカルボキシ末端に融合する。
１つの具体例において、少なくとも１つの安定化されたｓｃＦｖ分子は、遺伝子的に、抗体の軽鎖または重鎖のアミノ末端に融合する。
１つの具体例において、本発明の結合分子は、癌細胞上で優先的に発現された分子に結合する少なくとも１つの結合部位を含む。
１つの具体例において、本発明のｓｃＦｖ分子のＶＨドメインはＢＨＡ１０抗体から誘導される。
１つの具体例において、本発明のｓｃＦｖ分子のＶＬドメインはＢＨＡ１０抗体に由来する。
１つの具体例において、本発明の結合分子は、ＨＥＲ１、Ｈｅｒ３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、Ｂ７−Ｈ４、ＲＯＮ、ＣＤ２０、ＣＤ４、ＢＡＦＲ、ＥＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、受容体のＴＮＦファミリーのメンバー、Ｔｉｅ受容体、ＭＥＴ、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＴＮＦ、ＴＮＦリガンド、ＩＬ−６、ＴＷＥＡＫ、Ｆｎ１４、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＲＩＰＴＯ、ＨＧＦ、ａｌｐｈａ４ｂｅｔａｌインテグリン、ａｌｐｈａ５ｄｅｄａｌインテグリン、ａｌｐｈａ６ｂｅｔａ４インテグリン、およびａｌｐｈａＶｂａｔａ６インテグリンよりなる群から選択される分子に特異的な少なくとも１つの結合部位を含む。
１つの具体例において、本発明の結合分子は、免疫応答の調節に関与する分子に結合する少なくとも１つの結合部位を含む。１つの具体例において、分子はＦｃ受容体である。
１つの具体例において、本発明の結合分子は、血管新生の調節に関与する分子に結合する少なくとも１つの結合部位を含む。１つの具体例において、本発明の結合分子はＶＥＧＦまたはアンジオポイチンに結合する。
１つの具体例において、本発明の結合分子は、神経学的標的に結合する少なくとも１つの結合部位を含む。
１つの具体例において、本発明の結合分子は多特異的である。１つの具体例において、本発明の結合分子は二特異的である。
もう１つの具体例において、本発明の結合分子はＴＮＦ受容体ファミリーの２つのメンバーに結合する。１つの具体例において、本発明の結合分子はＬＴβＲおよびＴｒａｉｌ Ｒ２に結合する。１つの具体例において、本発明の結合分子は遺伝子的に１４Ａ２抗体に融合したＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ分子を含む。
１つの具体例において、本発明の結合分子は、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３および配列番号：５５よりなる群から選択される配列を有する重鎖を含む。
１つの具体例において、本発明の結合分子は、請求項４ないし８、１１、１２および１８ないし２２のいずれか１つの分子のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
１つの具体例において、本発明は、本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子、または安定化されたｓｃＦｖ分子を含む結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。
１つの具体例において、核酸分子はベクター中にある。もう１つの具体例において、本発明は、そのようなベクターを含む宿主細胞に関する。
１つの具体例において、宿主細胞は哺乳動物宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞またはＮＳ０細胞である。
１つの具体例において、本発明は、ｓｃＦｖ分子を含む結合分子の集団に関し、該集団は、慣用的なｓｃＦｖ分子を含む結合分子の集団を発現する宿主細胞に対して少なくとも１０％少ない凝集体を有する。
１つの態様において、本発明は、安定化された結合分子が生産されるような条件下で宿主細胞を培養することを含む安定化された結合分子を生産する方法に関する。
１つの具体例において、安定化された結合分子の少なくとも１０ｍｇが宿主細胞培養基の１リットル毎に生産され、ここに、結合分子の１０％以下が凝集体形態で存在する。
１つの態様において、本発明は、処理が起こるように結合分子を対象に投与することを含む、本発明の結合分子での処理から利益を受けるであろう対象を治療する方法に関する。
１つの具体例において、対象は癌、自己免疫疾患または障害、および神経学的病気または障害よりなる群から選択される病気または障害に罹っている。
１つの態様において、本発明は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎｓｃＦｖリンカーを用いてＶＨドメインおよびＶＬドメイン遺伝子的に融合し、アミノ酸４４においてシステインを含むようにＶＨドメインを作成し、次いで、アミノ酸１００においてシステインを含んで、安定化されたｓｃＦｖ分子を形成するようにＶＬドメインを作成することを含む、ｓｃＦｖ分子を安定化する方法に関する。
１つの態様において、本発明は、安定化されたｓｃＦｖ分子を含む安定化された多価抗体を作成する方法に関し、該方法は、安定化されたｓｃＦｖ分子を抗体分子の軽鎖または重鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端に遺伝子的に融合させることを含む。
１つの具体例において、本発明は、ｓｃＦｖ分子のＶＨ／ＶＬ界面における少なくとも１つのアミノ酸を置換することを含む安定化されたｓｃＦｖ分子を作成する方法に関し、および／またはｓｃＦｖ分子置換のＶＨ／ＶＬ界面の足場となる少なくとも１つのアミノ酸は、慣用的なｓｃＦｖ分子と比較して、ｓｃＦｖ分子のＶＨおよびＶＬドメイン双方の熱的安定性を同時に改良する。
なおもう１つの具体例において、本発明は、ＶＨおよびＶＬドメインの間の界面において２以上のアミノ酸で共変化するＶＨドメインまたはＶＬドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸を置換することを含む安定化されたｓｃＦｖ分子を作成する方法に関する。
なおもう１つの具体例において、本発明は、ｓｃＦｖ分子のＶＨ／ＶＬ界面における少なくとも１つのアミノ酸、および／またはｓｃＦｖ分子のＶＨ／ＶＬ足場における少なくとも１つのアミノ酸を置換し、ｓｃＦｖ分子をポリペプチドに遺伝子的に融合させ、それにより、安定化された融合蛋白質を作成することを含む、ｓｃＦｖ分子を含む安定化された融合蛋白質を作成する方法に関する。
なおもう１つの具体例において、本発明は、少なくとも１つのｓｃＦｖ分子を含む多価分子の安定性を改良する方法に関し、該方法は、少なくとも１つの安定化突然変異を少なくとも１つのｓｃＦｖ分子に導入して、それにより、多価分子の安定性を改良することを含む。
なおもう１つの具体例において、本発明は、少なくとも１つの安定化突然変異をｓｃＦｖ分子に導入して、それにより、ｓｃＦｖ分子の安定性を改良することを含む、ｓｃＦｖ分子の安定性を改良する方法に関する。
なおもう１つの態様において、本発明は、安定化された融合蛋白質の大規模な製造方法に関し、該方法は：
（ａ）ｓｃＦｖ分子の熱安定性テストを行って、候補ｓｃＦｖ分子の熱安定性を決定し；
（ｂ）該候補ｓｃＦｖ分子の熱安定性を適当な対照と比較して、該対照に対して増加した熱安定性を有する安定化されたｓｃＦｖ分子を同定し；
（ｃ）工程（ｂ）で同定された安定化されたｓｃＦｖ分子を選択し；
（ｄ）少なくとも１つの安定化されたｓｃＦｖ分子を遺伝子的に蛋白質に融合させて、安定化された融合蛋白質を形成し；
（ｅ）哺乳動物宿主細胞を、該安定化された融合蛋白質をコードする核酸分子でトランスフェクトし；
（ｇ）該安定化された融合蛋白質が発現されるような条件下で工程（ｆ）の宿主細胞を培養することを含み、
ここに、該安定化された融合蛋白質は、１０Ｌ以上の培養基中で成長させた場合に、１０％以下の蛋白質凝集でもって発現される。
なおもう１つの態様において、本発明は、アミノ酸の候補配列を含む免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーポリペプチドからの蛋白質折り畳みの熱安定性を決定する方法に関し、該方法は：
ａ）該ポリペプチドのＩｇ折り畳みに対応する配列のキュレーションした参照組の整列を供し；
ｂ）該整列の配列のアミノ酸残基の間の共変動を計算して、共変動データを作成し；
ｃ）該共変動データ内の共変動からの候補配列内のアミノ酸の位置についての配列位置特異的共変動スコアを決定し；次いで、
ｄ）該ポリペプチドの安定性の尺度としてのアミノ酸位置特異的配列共変動スコアを貯蔵し、または出力する工程を含む。
１つの具体例において、該方法は複数の免疫ブロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーポリペプチドについて少なくとも工程ｃ）およびｄ）を反復することを含む。なおもう１つの具体例において、該方法は、さらに、該候補配列の配列位置特異的共変動スコアに基づいて、生産用のＩｇスーパーファミリーポリペプチドを、該複数の免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーポリペプチドの中から選択する工程を含む。
もう１つの具体例において、該方法は、さらに、選択されたＩｇスーパーファミリーポリペプチドを生産し、治療的使用のためにそれを調製する工程を含む。
もう１つの具体例において、Ｉｇスーパーファミリーポリペプチドは、免疫グロブリンまたはその抗原−結合断片、免疫グロブリン受容体、細胞接着蛋白質、インテグリン、アレルゲン、Ｔ−細胞受容体、および主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）よりなる群から選択される蛋白質に由来する。
１つの具体例において、Ｉｇスーパーファミリーポリペプチドは、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、および単一鎖抗体（ｓｃＦｖ）よりなる群から選択される。
もう１つの具体例において、Ｉｇ折り畳みはＶ−クラス折り畳み、Ｉ−クラス折り畳み、Ｃ１−クラス折り畳み、およびＣ２−クラス折り畳みよりなる群から選択される。
１つの具体例において、キュレーションした参照組または整列は少なくとも５０％の多様性を有する。
１つの具体例において、整列の各配列は、整列のあらゆる他の配列に対して９０％未満の同一性を有する。
もう１つの具体例において、少なくとも１つの配列は哺乳動物種からのものであって、少なくとも１つの配列は非−哺乳動物種からのものである。
１つの具体例において、候補配列の残基は、整列において対応する位置に見出される正の共変動を満足させるための割り当てられた正の位置特異的共変動スコアである。
１つの具体例において、候補配列の残基は、整列における対応する位置に見出される負の共変動を満足させるための割り当てられた負の位置特異的共変動スコアである。
１つの具体例において、正の共変動は、約＋０．２５ないし約＋１．０のファイ関連係数（Φ）を有する。
１つの具体例において、負の共変動は約−０．２５ないし約−１．０のファイ関連係数（Φ）を有する。
１つの具体例において、整列は構造−ベースの配列整列、配列−ベースの配列整列、および構造−ベースの構造整列よりなる群から選択される。
１つの具体例において、位置特異的共変動スコアは、整列の各残基位置における全ての可能な残基対について決定される。
１つの具体例において、整列は（ｉ）初期整列からの隠れたマルコブモデル（Ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌ）（ＨＭＭ）を生じさせ；（ｉｉ）ＨＭＭを持つさらなる配列を獲得し；次いで、（ｉｉｉ）初期整列を持つさらなる配列を整列させることによって得られる。
１つの態様において、本発明は、実行されると、プロセッサに本発明の方法を実施させるプロセッサによって実行可能な指令の組を有するコンピュータプログラムまたはコンピュータプログラム製品またはコンピュータ読取り可能媒体に関する。
なおもう１つの具体例において、本発明は、本発明の方法の整列に対応するデータを含むエレクトロニックデバイスで用いるのに適したコンピュータプログラムまたはコンピュータプログラム製品またはコンピュータ読み取り可能媒体に関する。
なおもう１つの具体例において、本発明は、本発明の方法の共変動データを含むエレクトロニックデバイスで用いるのに適したコンピュータプログラムまたはコンピュータプログラム製品またはコンピュータ読み取り可能媒体に関する。
１つの具体例において、本発明は、本発明の方法を行うように配置されたデバイスに関する。
１つの態様において、本発明は：
（ｉ）初期配列収集プロセス；
（ｉｉ）請求項５８ないし７４のいずれか１つの整列からの配列データを保持することができる貯蔵ロケーション；
（ｉｉｉ）共変動データを得るための整列内の残基の対の間の共変動をプログラムにより解析する解析設備；
（ｉｖ）該エレクトロニックデバイスとでインターフェイスを形成する出力デバイス、該出力デバイスは該共変動データを出力する；
を含む、コンピュータデバイスにおけるシステムに関する。
１つの具体例において、本発明は、本発明の方法の工程のいずれかを含む方法を行うための実行可能な工程を保持する計算デバイス中の媒体に関する。
なおもう１つの具体例において、残基用法頻度データのディスプレイは、（ｉ）ポリペプチド配列に対応する連続残基位置；および（ｉｉ）各残基位置における残基タイプについての残基用法頻度を含むマトリックスを含む。
なおもう１つの具体例において、残基用法頻度は記号により示される。
１つの具体例において、全ての２０の天然アミノ酸、ギャップ、および曖昧な残基が表される。１つの具体例において、残基用法頻度は記号のサイズに相関する。
１つの具体例において、残基使用頻度は記号のサイズと正に相関する。
１つの具体例において、（ｉ）残基の位置は行に表示され；および（ｉｉ）残基用法頻度は列に表示される。
もう１つの具体例において、共変動残基内の共変動はネットワークオーバーレイによって示される。
１つの態様において、本発明は：
（ｉ）ポリペプチド配列の参照組についての残基用法頻度データの収集を含むグリッドレイアウト；および
（ｉｉ）共変動オーバーレイ；
のグラフ表示を含むグラフユーザーインターフェイスに関する。
１つの具体例において、該インターフェイスは、さらに：（ｉｉｉ）注目する配列のディスプレイを含む。
１つの態様において、本発明は、改良された生物物理学的特性を持つ免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーポリペプチドを生産する方法に関し、該方法は：
ａ）ポリペプチドのＩｇ折り畳みに対応する配列のキュレーションした参照組の整列を供し；
ｂ）整列の配列の残基の間の共変動を計算して、共変動する残基を同定し；
ｃ）共変動を満足しないポリペプチドの残基を、整列における対応する位置に見出される共変動残基で置換する；
工程を含む。
もう１つの具体例において、生物物理学的特性は、熱安定性、ｐＨ折り畳み解除プロフィール、グリコシル化の安定な除去、溶解性、生化学機能、およびその組合せよりなる群から選択される。
１つの具体例において、生物化学機能は、その化学部位がホスフェート、メチル、アセチル、脂質、洗剤、金属イオン、ハロゲン、ＲＮＡ、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオシドよりなる群から選択される、蛋白質標的または化学的部位の認識よりなる群から選択される。
１つの具体例において、Ｉｇスーパーファミリーポリペプチドは、抗体またはその抗原−結合断片、免疫グロブリン受容体、細胞接着蛋白質、インテグリン、アレルゲン、Ｔ−細胞受容体、および主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子よりなる群から選択される蛋白質に由来する。
１つの具体例において、Ｉｇスーパーファミリーポリペプチドは重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、および単一鎖抗体（ｓＦｖ）よりなる群から選択される。
１つの具体例において、Ｉｇ折り畳みはＶ−クラス折り畳み、Ｉ−クラス折り畳み、Ｃ１−クラス折り畳み、およびＣ２−クラス折り畳みよりなる群から選択される。
もう１つの具体例において、Ｉｇスーパーファミリーポリペプチドは、ドメイン抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、非−ヒトモノクローナル抗体、キメラ抗体、二特異的抗体、ｓｃＦｖ−含有抗体、およびドメイン−欠失抗体よりなる群から選択される修飾された抗体である。
１つの具体例において、共変化残基は、ジスルフィド結合、塩ブリッジ、リガンド結合ポケットまたは表面の部分、およびファンデルワールス、水素結合、および／または電荷−電荷相互作用のネットワークよりなる群から選択される構造的特徴の一部である。
もう１つの具体例において、本発明は、改良された安定性を持つ抗体または修飾された抗体を生産する方法に関し、該方法は：
ａ）実験的に安定であると確証される鋳型抗体の高−分解能構造モデルを供し；
ｂ）該構造モデルを用いて、該鋳型抗体におけるＶＨ／ＶＬインターフェイスおよび／またはインターフェイス足場残基を同定し；
ｃ）相同性モデルを用いて、インターフェイスを安定化させるのに重要な抗体または修飾された抗体の対応するＶＨ／ＶＬインターフェイス残基を同定し；次いで、
ｄ）抗体または修飾された抗体における対応するＶＨ／ＶＬインターフェイス残基を、鋳型蛋白質からのインターフェイス残基で置換する；
工程を含む。
１つの具体例において、該鋳型蛋白質のインターフェイス残基は、インターフェイスにおける少なくとも１０Å２の表面積に埋もれている。
１つの具体例において、該修飾された抗体はドメイン抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、非−ヒトモノクローナル抗体、キメラ抗体、二特異的抗体、ｓｃＦｖ−含有抗体、およびドメイン−欠失抗体よりなる群から選択される。
もう１つの具体例において、本発明は、本発明の方法によって生産されるポリペプチドに関する。
１つの具体例において、該ポリペプチドは、熱安定性、ｐＨ折り畳み解除プロフィール、グリコシル化の安定な除去、溶解性、生化学的機能、およびその組合せよりなる群から選択される生物物理学的特性の改良を呈する。
１つの具体例において、該生化学的機能はリガンド結合親和性または特異性である。
もう１つの態様において、本発明は、安定化されたｓｃＦｖ分子を含むライブラリーを生産する方法に関し、該方法は：
（ａ）ｓｃＦｖ分子の可変ドメイン配列に対応する配列の参照組を供し；
（ｂ）該参照組における対応する位置において存在しない、または低い頻度で見出される可変ドメイン内のアミノ酸を同定し；次いで、
（ｃ）この情報を、参照組における低い頻度で同定されるアミノ酸の修飾は、可変ドメイン内の現存の共変動拘束を満足できることを示唆する共変動データと組合せ；次いで、
（ｄ）工程（ｂ）のアミノ酸を、候補安定化アミノ酸で置き換え、それにより、安定化されたｓｃＦｖ分子を含むライブラリーを作成することを含む。
１つの具体例において、工程（ｂ）のアミノ酸は、０．５未満のコンセンサススコアを有する。もう１つの具体例において、工程（ｂ）のアミノ酸は参照組における配列の１０％未満内に存在する。もう１つの具体例において、工程（ｂ）のアミノ酸は非−コンセンサス残基である。
１つの具体例において、候補安定化アミノ酸は参照組内の対応する位置において見出される。
なおもう１つの具体例において、候補安定化アミノ酸はコンセンサスアミノ酸である。
１つの具体例において、候補安定化アミノ酸は可変領域配列の３−Ｄ構造の分析によって同定される。もう１つの具体例において、安定化アミノ酸は側鎖再パッキング計算によって同定される。
なおもう１つの態様において、本発明は、安定化されたｓｃＦｖ分子を生産する方法に関し、該方法は：
（ａ）請求項５６記載の方法に従って設計されたｓｃＦｖライブラリーを供し、
（ｂ）熱挑戦アッセイでｓｃＦｖライブラリーをスクリーニングして、候補ｓｃＦｖ分子を同定し、
（ｃ）ｓｃＦｖライブラリーの候補ｓｃＦｖ分子の熱安定性を、適当な対照と比較することを含み、
それにより、対照に対する候補ｓｃＦｖ分子の熱安定性の増加は、安定化されたｓｃＦｖ分子として候補ｓｃＦｖ分子を同定する。
もう１つの具体例において、本発明は、本発明の方法を用いて同定された安定化されたｓｃＦｖ分子、または本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子を含む融合蛋白質に関する。
もう１つの態様において、本発明は、候補ドメイン配列を有するアミノ酸配列を含む候補蛋白質の安定性を予測する方法に関し、該方法は：
（ａ）候補蛋白質の候補ドメイン配列に対応するアミノ酸配列の参照組を供し；
（ｂ）テストドメイン配列内の個々のアミノ酸位置における残基頻度を決定して、コンセンサススコアが得られ；および
（ｃ）該コンセンサススコアを用いて、候補蛋白質の安定性を予測することを含み、
ここに、該コンセンサススコアは候補蛋白質の安定性に相関する。
もう１つの態様において、本発明は、候補蛋白質の安定性を予測する方法に関し、該方法は：
（ａ）候補蛋白質のテストドメイン配列に対応する配列の参照組を供し；
（ｂ）テストドメイン配列内の個々のアミノ酸位置における残基頻度を決定して、コンセンサススコアが得られ；次いで、
（ｃ）該コンセンサススコアを用いて、候補蛋白質の安定性を予測することを含み、
ここに、該コンセンサススコアは候補蛋白質の安定性に相関する。
もう１つの具体例において、本発明は、候補蛋白質の安定性を予測する方法に関し、該方法は：
（ａ）候補蛋白質のテストドメイン配列に対応する配列の参照組を供し；
（ｂ）テストドメイン配列内のアミノ酸位置における残基頻度を決定して、コンセンサススコアが得られ；
（ｃ）参照組の配列内の対応するアミノ酸位置における残基頻度を決定して、平均コンセンサススコアを決定し；
（ｄ）コンセンサススコアを平均コンセンサススコアと比較して、配列スコアを決定し；次いで、
（ｅ）配列スコアを用いて、候補蛋白質の安定性を予測することを含み、
ここに、コンセンサススコアは候補蛋白質の安定性に直接的に相関する。
なおもう１つの具体例において、本発明は、候補抗体または候補修飾抗体の安定性を予測する方法に関し、該方法は：
（ａ）該候補抗体または修飾抗体のテストＶＨドメイン配列に対応するＶＨドメイン配列の参照組を供し；
（ｂ）テストＶＨドメイン配列内のアミノ酸位置における残基頻度を決定して、コンセンサススコアが得られ；
（ｃ）参照組の配列内の対応するアミノ酸位置における残基頻度を決定して、平均コンセンサススコアを決定し；
（ｄ）コンセンサススコアを平均コンセンサススコアと比較して、配列スコアを決定し；次いで、
（ｅ）配列スコアを用いて、候補抗体または修飾抗体の安定性を予測することを含み、
ここに、コンセンサススコアは候補抗体または修飾抗体の安定性を直接的に相関する。
１つの具体例において、参照組は候補蛋白質を同一クラスの蛋白質折り畳みを持つ蛋白質からの蛋白質配列を含む。
もう１つの具体例において、参照組がオルソロガス配列を含む。
１つの具体例において、参照組は、例えば、同一Ｋａｂａｔクラスのヒト配列、例えば、ヒトＶＨ配列を含む。
１つの具体例において、参照組はヒトＶＨ生殖系配列を含む。
１つの具体例において、テストドメイン配列は候補蛋白質のドメイン配列の部分である。
１つの具体例において、コンセンサススコアをテスト配列の各部分について決定して、合計コンセンサススコアが得られ、ここに、合計コンセンサススコアは蛋白質安定性と相関する。
もう１つの具体例において、合計コンセンサススコアは式：
Figure 0005374359
 ［式中、
ｃｉ（ｒ）はコンセンサス配列のアミノ酸位置におけるコンセンサス残基頻度と等しく、
ｈｉ（ｒ）はテスト配列のアミノ酸位置のテスト残基頻度と等しく、および
ｉはテスト配列内のアミノ酸位置の数と等しい］
を用いて計算される。
１つの具体例において、蛋白質の安定性は、候補蛋白質のコンセンサススコアを、適当な対照のコンセンサススコアと比較することによって決定される。
もう１つの具体例において、蛋白質の安定性は、候補蛋白質のコンセンサススコアを、候補蛋白質の完全なコンセンサススコアと比較することによって決定される。
なおもう１つの具体例において、安定性は、候補蛋白質の配列スコアを適当な対照と比較することによって決定される。
もう１つの具体例において、安定性は、候補抗体または修飾抗体の配列スコアを適当な対照と比較することによって決定される。
１つの具体例において、蛋白質はマルチ−ドメイン蛋白質であり、ここに、標的ドメイン配列はマルチ−ドメイン蛋白質の最も安定でないドメインに由来する。
なおもう１つの具体例において、蛋白質はラクダ科動物抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、非−ヒトモノクローナル抗体、キメラ抗体、二特異的抗体、ｓｃＦｖ−含有抗体、およびドメイン−欠失抗体よりなる群から選択される修飾された抗体である。
もう１つの具体例において、本発明は、本発明の方法を用いて候補蛋白質の安定性を決定することを含む発現について候補蛋白質を選択する方法に関し、ここに、候補蛋白質は、もしそのコンセンサススコアまたは配列スコアが高い安定性を予測するならば、発現について選択される。
もう１つの具体例において、本発明は、本発明の方法を用いて候補蛋白質の安定性を決定することを含む発現について候補蛋白質を選択する方法に関し、ここに、候補蛋白質を、もしその配列位置特異的共変動スコアが高い安定性を予測するならば、配列について選択される。
もう１つの具体例において、本発明は、ドナー抗体のヒト化で用いられるアクセプター免疫グロブリン可変領域テスト配列を選択する方法に関し、該方法は、本発明の方法を用いて候補配列の安定性を決定することを含み、ここに、候補配列は、もしその配列スコアが高い安定性を予測するならば、選択される。
なおもう１つの具体例において、本発明は、ドナー抗体のヒト化で用いられるアクセプター免疫グロブリン可変領域テスト配列を選択する方法に関し、該方法は、本発明の方法を用いて候補配列の安定性を決定することを含み、ここに、もしその位置特異的共変動スコアが高い安定性を予測するならば、候補配列は選択される。
もう１つの具体例において、テスト配列はヒト生殖系配列である。
（発明の詳細な説明）
本発明は、少なくとも部分的には、安定化されたｓｃＦｖ分子よりなる、またはそれを含む安定化された標的結合分子、およびそのような安定化された結合分子を作成する方法の開発に基づく。加えて、本発明は、抗体分子のような安定な蛋白質を設計するための方法を提供する。
本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子は、安定な多特異的、例えば、二特異的分子を生産するのに特に有用である。本発明の安定化された結合分子、例えば、多特異的結合分子は培養において安定に発現させることができ、大規模生産に適しており、かつイン・ビボで安定である。
また、本発明は、少なくとも部分的には、安定化されたｓｃＦｖ分子よりなる、またはそれを含む安定化された結合分子、およびそのような安定化された結合分子を作成する方法の開発に基づく。加えて、本発明は、安定な蛋白質を設計するための、および抗体分子のような蛋白質の安定性を予測するための方法を提供する。
本発明のさらなる記載の前に、便宜には、ある用語を以下に定義する。
Ｉ．定義
本明細書中で用いるように、用語「ｓｃＦｖ分子」は、１つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）またはその部分、および１つの重鎖可変ドメイン（ＶＬ）またはその部分よりなる結合分子を含み、ここに、各可変ドメイン（またはその部分）は同一または異なる抗体に由来する。ｓｃＦｖ分子は、好ましくは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインの間に存在するｓｃＦｖリンカーを含む。ｓｃＦｖ分子は当該分野で知られており、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号、Ｈｏ ｅｔ ａｌ．１９８９に記載されている。Ｇｅｎｅ ７７：５１； Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３；Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．１９９１． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０１１７； Ｍｉｌｅｎｉｃ ｅｔ ａｌ．１９９１．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５１：６３６３；Ｔａｋｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９１．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４：８３７。
「ｓｃＦｖリンカー」は、本明細書中で用いるように、ｓｃＦｖのＶＬおよびＶＨドメインの間に存在する部位をいう。ｓｃＦｖリンカーは、好ましくは、ｓｃＦｖ分子を抗原結合立体配座に維持する。１つの具体例において、ｓｃＦｖリンカーはｓｃＦｖリンカーペプチドを含み、またはそれよりなる。ある具体例において、ｓｃＦｖリンカーペプチドはｇｌｙ−ｓｅｒ連結ペプチドを含み、またはそれよりなる。他の具体例において、ｓｃＦｖリンカーはジスルフィド結合を含む。
本明細書中で用いるように、用語「ｇｌｙ−ｓｅｒ連結ペプチド」とは、グリシンおよびセリン残基よりなるペプチドをいう。例示的なｇｌｙ／ｓｅｒ連結ペプチドはアミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含む。１つの具体例において、ｎ＝１である。１つの具体例において、ｎ＝２である。もう１つの具体例において、ｎ＝３である。好ましい具体例において、ｎ＝４、すなわち、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４である。もう１つの具体例において、ｎ＝５である。なおもう１つの具体例において、ｎ＝６である。もう１つの例示的ｇｌｙ／ｓｅｒ連結ペプチドはアミノ酸配列Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含む。１つの具体例において、ｎ＝１である。１つの具体例において、ｎ＝２である。好ましい具体例において、ｎ＝３である。もう１つの具体例において、ｎ＝４である。もう１つの具体例において、ｎ＝５である。なおもう１つの具体例において、ｎ＝６である。
本明細書中で用いるように、用語「ジスルフィド結合」とは、２つの硫黄原子の間で形成される共有結合をいう。アミノ酸システインは、第二のチオール基とでジスルフィド結合またはブリッジを形成することができるチオール基を含む。
本明細書中で用いるように、用語「慣用的なｓｃＦｖ分子」とは、安定化されたｓｃＦｖ分子ではないｓｃＦｖ分子をいう。例えば、典型的な慣用的ｓｃＦｖ分子は、安定化突然変異を欠如し、（Ｇ４Ｓ）３リンカーによって連結されたＶＨおよびＶＬドメインを含む。
本発明の「安定化されたｓｃＦｖ分子」は、ｓｃＦｖ分子の安定化をもたらす慣用的なｓｃＦｖ分子と比較して、少なくとも１つの変化または改変を含むｓｃＦｖ分子である。本明細書中で用いるように、用語「安定化突然変異」は、増強された蛋白質安定性（例えば、熱安定性）をｓｃＦｖ分子に、および／または該ｓｃＦｖ分子を含むより大きな蛋白質に付与する突然変異を含む。１つの具体例において、安定化突然変異は、脱安定化アミノ酸の、増強された蛋白質安定性を付与する置換アミノ酸（ここでは、「安定化アミノ酸」）での置換を含む。１つの具体例において、安定化突然変異は、ｓｃＦｖリンカーの長さが最適化されているものである。１つの具体例において、本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子は１以上のアミノ酸置換を含む。例えば、１つの具体例において、安定化突然変異は、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を含み、その置換の結果、ｓｃＦｖ分子のＶＨおよびＶＬ界面の安定性の増加をもたらす。１つの具体例において、アミノ酸は界面内にある。もう１つの具体例において、アミノ酸は、ＶＨおよびＶＬの間の相互作用の足場となるものである。もう１つの具体例において、安定化突然変異は、共変動するＶＨドメインまたはＶＬドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸を、ＶＨおよびＶＬドメインの間の界面における２以上のアミノ酸と置換することを含む。もう１つの具体例において、安定化突然変異は、ＶＨおよびＶＬドメインは、ＶＨにおけるアミノ酸およびＶＬドメインにおけるアミノ酸の間の少なくとも１つのジスルフィド結合によって連結されるように、少なくとも１つのシステイン残基が導入された（すなわち、ＶＨまたはＶＬドメインの１以上に作成された）ものである。ある好ましい具体例において、本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子は、ｓｃＦｖリンカーの長さが最適化され、かつ少なくとも１つのアミノ酸残基が置換されており、および／またはＶＨおよびＶＬドメインがＶＨにおけるアミノ酸およびＶＬドメインにおけるアミノ酸の間のジスルフィド結合によって連結されているものである。１つの具体例において、本明細書中に記載された１を超える安定化突然変異はｓｃＦｖ分子においてなすことができる。
１つの具体例において、ｓｃＦｖ分子に対してなされた１以上の安定化突然変異は、慣用的なｓｃＦｖ分子と比較して、ｓｃＦｖ分子のＶＨおよびＶＬドメイン双方の熱安定性を同時に改良する。
好ましくは、本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子の１以上の集団は、モノマー可溶性蛋白質の集団として発現される。１つの具体例において、１０％以下が凝集された形態で存在する。１つの具体例において、該集団の安定化されたｓｃＦｖ分子は同一の安定化突然変異、または安定化突然変異の組合せを含むことができる。他の具体例において、該集団の個々の安定化されたｓｃＦｖ分子は異なる安定化突然変異を含む。
主題の安定化されたｓｃＦｖ分子を単独で用いて、標的分子に結合させることができるか、あるいはもう１つのポリペプチドに連結させて、安定化されたｓｃＦｖ分子を含む安定化された結合分子を形成することができる。例えば、本発明の結合分子が、例えば、抗体のような、標的結合特異性を付与する、第二のｓｃＦｖ分子または非−ｓｃＦｖ分子に連結されたｓｃＦｖ分子を含むことができる。
本明細書中で用いるように、用語「蛋白質安定性」とは、環境条件（例えば、上昇したまたは低下した温度）に応答する蛋白質の１以上の物理的特性の維持の当該分野で認められた尺度をいう。１つの具体例において、該物理的特性は蛋白質の共有結合構造（例えば、蛋白質分解の不存在、望まない酸化または脱アミド化）の維持である。もう１つの具体例において、該物理的特性は適切に折り畳まれた状態（例えば、可溶性または不溶性凝集体または沈殿の不存在）における蛋白質の存在である。１つの具体例において、蛋白質の安定性は、蛋白質の生物物理学的特性、例えば、熱安定性、ｐＨ折り畳み解除プロフィールグリコシル化の安定な除去、溶解性、生化学機能（例えば、蛋白質（例えば、リガンド、受容体、抗原等）に結合する能力、または化学的部位など）、および／またはその組合せをアッセイすることによって測定される。もう１つの具体例において、生化学機能は、相互作用の結合親和性によって示される。１つの具体例において、蛋白質安定性の尺度は、熱安定性すなわち、熱的挑戦に対する耐性である。安定性は、当該分野で知られ、および／または本明細書中に記載された方法を用いて測定することができる。
ｓｃＦＶ分子のＶＨおよびＶＬドメインは１以上の抗体分子に由来する。また、本発明のｓｃＦＶ分子の可変領域は、それらが、それらが由来する抗体分子からのアミノ酸配列が変化するように修飾することができるのは当業者によって理解されるであろう。例えば、１つの具体例において、アミノ酸残基における保存的置換または変化に導くヌクレオチドまたはアミノ酸置換を（例えば、ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基において）なすことができる。別法として、あるいは加えて、突然変異をＣＤＲアミノ酸残基に対して行って、当該分野で認められた技術を用いて抗原結合を最適化することができる。本発明の結合分子が、抗原に結合する能力を維持する。
本明細書中で用いるように、用語、指定された蛋白質「から由来する」とは、ポリペプチドの起源をいう。１つの具体例において、ポリペプチド、または特定の出発ポリペプチドに由来するアミノ酸配列は可変領域配列（例えば、ＶＨまたはＶＬ）またはそれに関連する配列（例えば、ＣＤＲまたはフレームワーク領域）である。１つの具体例において、特定の出発ポリペプチドに由来するアミノ酸配列は連続的でない。例えば、１つの具体例において、１、２、３、４、５または６のＣＤＲは出発抗体に由来する。１つの具体例において、ポリペプチド、または特定の出発ポリペプチドに由来するアミノ酸配列、またはアミノ酸配列は、当該部分が少なくとも３ないし５アミノ酸、５ないし１０アミノ酸、少なくとも１０ないし２０アミノ酸、少なくとも２０ないし３０アミノ酸、または少なくとも３０ないし５０アミノ酸よりなる出発配列またはその部分のそれと実質的に同一である、あるいはそうでなければ、出発配列にその起源を有するとして当業者に同定可能であるアミノ酸配列を有する。
安定化されたｓｃＦｖ分子またはその部分をコードする単離された核酸分子は、１以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を、１以上のアミノ酸の置換、付加または欠失がコードされた蛋白質に導入されるように、それが由来する慣用的なｓｃＦｖ分子または免疫グロブリンのヌクレオチド配列に導入することによって作成することができる。突然変異は、部位−特異的突然変異誘発およびＰＣＲ−媒介突然変異誘発のような標準的技術によって導入することができる。１つの具体例において、保存的アミノ酸置換を１以上の非必須アミノ酸残基において行う。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基を、同様な側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。同様な側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプロファン）、ベータ−分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプロファン、ヒスチジン）を含む。かくして、免疫グロブリンポリペプチドにおけるアミノ酸残基は、同一側鎖ファミリーからのもう１つのアミノ酸残基で置換えることができる。もう１つの具体例において、アミノ酸のストリングを、側鎖ファミーメンバーの順序および／または組成が異なる構造的に同様なストリングで置換えることができる。もう１つの具体例において、突然変異を導入して、少なくとも１つのシステイン分子をＶＨに、およびＶＬドメインに導入し、それにより、ｓｃＦｖ分子にジスルフィド結合を導入する。もう１つの具体例において、慣用的なｓｃＦｖ分子のアミノ酸を、同様な物理的（例えば、空間的）または機能的特性を有するアミノ酸で置換することができる。好ましくは、慣用的なｓｃＦｖ分子へ置換されたアミノ酸は、ＶＬ／ＶＨ界面の一体性、ＣＤＲ立体配座、およびＶＨおよび／またはＶＬ折り畳みに適合する。
別法として、もう１つの具体例において、突然変異を、免疫グロブリンコーディング配列の全部または部分に沿ってランダムに導入することができる。
本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子、または安定化されたｓｃＦｖ分子を含むポリペプチドは結合分子であり、すなわち、それらは注目する標的分子、例えば、抗原に結合する。本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子が第二の分子に融合する場合、第二の分子は融合蛋白質に結合特異性を付与することもできる。
本発明の結合分子はｓｃＦｖ分子（例えば、ｓｃＦｖリンカーによって接合されたＶＨおよびＶＬドメイン）よりなる、あるいは、本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子を含む。）
１つの具体例において、本発明の結合分子は一価であり、すなわち、（例えば、ｓｃＦｖ分子の場合におけるように）１つの標的結合部位を含む。１つの具体例において、本発明の結合分子は多価であり、すなわち、１を超える標的結合部位を含む。もう１つの具体例において、結合分子は少なくとも２つの結合部位を含む。１つの具体例において、結合分子は２つの結合部位を含む。１つの具体例において、結合分子は３つの結合部位を含む。もう１つの具体例において、結合分子は４つの結合部位を含む。もう１つの具体例において、結合分子は４を超える結合部位を含む。
１つの具体例において、本発明の結合分子はモノマーである。もう１つの具体例において、本発明の結合分子はマルチマーである。例えば、１つの具体例において、本発明のもう１つの分子はダイマーである。１つの具体例において、本発明のダイマーは２つの同一のモノマーサブユニットを含むホモダイマーである。もう１つの具体例において、本発明のダイマーは２つの非−同一モノマーサブユニットを含むヘテロダイマーである。ダイマーのサブユニットは１以上のポリペプチド鎖を含むことができる。例えば、１つの具体例において、ダイマーは少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。１つの具体例において、ダイマーは２つのポリペプチド鎖を含む。もう１つの具体例において、ダイマーは（例えば、抗体分子の場合におけるように）４つのポリペプチド鎖を含む。
本明細書中で用いるように、用語「価数」とは、ポリペプチド中の潜在的標的結合部位の数をいう。各標的結合部位は、特異的に、１つの標的分子、または標的分子上の特異的部位に結合する。ポリペプチドが１を超える標的結合部位を含む場合、各標的結合部位は、特異的に、同一または異なる分子に結合することができる（例えば、異なる分子、例えば、異なる抗原、または同一分子上の異なるエピトープに結合することができる）。
用語「特異性」とは、与えられた標的に特異的に結合する（例えば、それに免疫反応する）能力をいう。ポリペプチドは一特異的であってよく、標的に特異的に結合する１以上の結合部位を含有し、あるいはポリペプチドは多特異的（例えば、二特異的または三特異的）であってよく、同一または異なる標的に特異的に結合する２以上の結合部位を含有する。特異的結合は、本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子、および／または本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子がリンクされた非−ｓｃＦｖ分子によって付与することができる。
１つの具体例において、本発明の結合分子は多特異的である。例えば、１つの具体例において、本発明の多価結合分子は、少なくとも２つの標的、例えば、１を超える標的分子または同一標的分子上の１を超えるエピトープに対する結合特異性を有する二特異的分子（例えば、抗体、ミニボディ、ドメイン欠失抗体、または融合蛋白質、少なくとも１つの安定化されたｓｃＦｖ分子を含む単一ドメイン抗体（例えば、ラクダ科動物、サメ、ヒト））である。１つの具体例において、多価分子が、低下または排除のために標的化された分子に対して特異的な少なくとも１つの結合部位、および細胞上の標的分子を有する。もう１つの具体例において、多特異的分子が低下または排除のために標的化された分子に特異的な少なくとも１つの標的結合部位、および薬物に特異的な少なくとも１つの結合部位を有する。なおもう１つの具体例において、多特異的分子は低下または排除のために標的化された分子に特異的な少なくとも１つの結合部位、およびプロドラッグに特異的な少なくとも１つの結合部位を有する。
１つの具体例において、多特異的分子が可溶性分子に対する１つの特異性、および細胞表面分子に対する１つの特異性を含む。もう１つの具体例において、多特異的分子は１以上の可溶性分子に存在する２つの標的に対する２つの結合特異性を有する。もう１つの具体例において、多特異的分子は（１以上の細胞に存在することができる）１以上の細胞表面分子に存在する２つの標的に対する２つの結合特異性を有する。
１つの具体例において、結合分子は、生物学的効果を媒介する（例えば、細胞表面受容体に結合し、活性化または阻害性シグナルの伝達または阻害をもたらすことによって）細胞活性化を調節し、（例えば、細胞シグナル誘導経路によって、結合分子上に存在するペイロードへの補体の固定または暴露によって）細胞の死滅をもたらす、または（例えば、細胞死滅を媒介し、または促進することによって、フィブリン血餅の分解を促進し、または血餅形成を促進することによって、または生物学的に利用可能な物質の量を調節することによって（例えば、対象においてＴＮＦαのようなリガンドの量を増強し、または低下させることによって））対象において病気または障害を媒介する）分子に特異的な少なくとも１つの標的結合部位を有する。
もう１つの具体例において、本発明の結合分子は、例えば、ＴＮＦファミリー受容体のような細胞表面受容体に結合することによって、シグナルを細胞に変換する少なくとも１つの標的に結合する。「シグナルを変換する」とは、細胞に結合することによって、結合分子が、例えば、シグナル変換経路を調節することによって、細胞表面受容体に対する細胞外影響を細胞応答に変換することを意味する。
１つの具体例において、結合分子は低下または排除のために標的化された分子に特異的な少なくとも１つの標的結合部位、例えば、細胞表面抗原または可溶性抗原に結合する。１つの具体例において、標的への結合分子の結合は、例えば、組織からの、または循環からの標的の低下または排除をもたらす。もう１つの具体例において、標的分子は、標的分子の存在を検出するのに（例えば、汚染を検出するのに、または疾患または障害を診断するのに）用いることができる分子に特異的な少なくとも１つの結合部位を有する。なおもう１つの具体例において、本発明の結合分子は、対象における特異的部位に対して（例えば、腫瘍細胞または血餅に対して）結合分子を標的化する少なくとも１つの結合部位を含む。
好ましい具体例において、多特異的分子は、４つの結合部位を有する四価抗体である。四価分子は二特異的であって、各特異性について二価であってよい。例示的な二特異的分子のさらなる記載を以下に掲げる。
本発明の好ましい結合分子は、フレームワーク、およびヒトアミノ酸配列に由来する定常領域アミノ酸配列を含む。しかしながら、結合ポリペプチドはフレームワークおよび／またはもう１つの哺乳動物種に由来する定常領域配列に含むことができる。例えば、ネズミ配列を含む結合分子はある種の適用で適切であり得る。１つの具体例において、霊長類フレームワーク領域（例えば、非−ヒト霊長類）、重鎖部分、および／またはヒンジ部分は対象結合分子に含まれていてもよい。１つの具体例において、１以上のネズミアミノ酸は結合ポリペプチドのフレーム領域に存在してよく、例えば、ヒトまたは非−ヒト霊長類フレームワークアミノ酸配列は、対応するネズミアミノ酸残基が存在する１以上のアミノ酸逆突然変異を含んでもよく、および／または出発ネズミ抗体に見出されない異なるアミノ酸残基に対する１以上の突然変異を含んでもよい。本発明の好ましい結合分子はネズミ抗体よりも免疫原性が低い。
「融合」またはキメラ蛋白質は、それが天然において自然に連結しない第二のアミノ酸配列に連結された第一のアミノ酸配列を含む。アミノ酸配列は、通常、融合ポリペプチドに一緒にされない別々の蛋白質に存在できるか、あるいはそれらが、通常は同一蛋白質中に存在できるが、融合ポリペプチドにおいて新しい配置に置かれる。融合蛋白質は、例えば、化学合成によって、あるいはペプチド領域が所望の関係にコードされたポリヌクレオチドを作り出し、翻訳することによって作り出すことができる。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに適用される用語「異種」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、それが比較される存在のそれとは遺伝子型が区別される存在に由来することを意味する。例えば、異種ポリヌクレオチドまたは抗原は異なる種、個体の異なる細胞型、または区別される個体の細胞の同一または異なるタイプに由来することができる。
用語「リガンド結合ドメイン」または「リガンド結合部分」とは、本明細書中で用いるように、いずれかの天然受容体（例えば、細胞表面受容体）、あるいは少なくとも定性的なリガンド結合能力、好ましくは、対応する天然受容体の生物学的活性を保有するいずれかの領域またはその誘導体をいう。
用語「受容体結合ドメイン」または「受容体結合部分」とは、本明細書中で用いるように、いずれかの天然リガンド、あるいは少なくとも定性的受容体結合能力、好ましくは、対応する天然リガンドの生物学的活性を保有するそのいずれかの領域または誘導体をいう。
１つの具体例において、本発明の結合分子は、安定化された「抗体」または「免疫グロブリン」分子、例えば、天然に生じる抗体または免疫グロブリン分子（またはその抗原結合断片）、または抗体分子と同様に抗原に結合し、および本発明のｓｃＦｖ分子を含む遺伝子光学により作成された抗体分子である。本明細書中で用いるように、用語「免疫グロブリン」は、それがいずれかの関連特異的免疫反応性を保有するか否かにかかわらず、２つの重鎖および２つの軽鎖の組合せを有するポリペプチドを含む。「抗体」とは、注目する抗原（例えば、腫瘍関連抗原）に対する有意な公知の特異的免疫反応性活性を有するそのような組立体をいう。抗体および免疫グロブリンは、それらの間に鎖間共有結合を含む、または含まない、軽鎖および重鎖を含む。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は比較的よく理解されている。
以下でより詳細に議論するように、一般的用語「免疫グロブリン」は、生化学的に区別することができる５つの区別されるクラスを含む。全ての５つのクラスの抗体は本発明の範囲内にあり、以下の議論は、一般に、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに向けられるであろう。ＩｇＧに関しては、免疫グロブリンは、ほぼ２３，０００ダルトンの分子量の２つの同一のポリペプチド軽鎖、および分子量５３，０００ないし７０，０００の２つの同一の重鎖を含む。４つの鎖は「Ｙ」立体配置にてジスルフィド結合によって接合され、ここに、軽鎖は、「Ｙ」の口で出発し、かつ可変領域を通って継続する重鎖を囲う。
軽鎖および重鎖は共に構造的および機能的相同性の領域に分割される。用語「定常」およいび「可変」は機能的に用いられる。この点に関して、軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）部分双方の可変ドメインは抗原の認識および特異性を決定すると認識されるであろう。逆に、軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の定常領域は、分泌、経胎盤移動度、Ｆｃ受容体結合、補体結合等のような重要な生物学的特性を付与する。約束により、定常領域ドメインのナンバリングは、それらが抗体の抗原結合部位またはアミノ−末端からより末端側となるにつれて増大する。Ｎ−末端は可変領域であって、Ｃ−末端は定常領域であり；ＣＨ３およびＣＬドメインは、現実には、各々、重鎖および軽鎖のカルボキシ−末端を含む。
ｓｃＦｖ分子に対する突然変異の安定化は、ＣＤＲにおける、および／またはｓｃＦｖ可変重鎖および／または可変軽鎖のフレームワーク領域におけるアミノ酸に対してなすことができる。本明細書中で用いるように、用語「可変領域ＣＤＲアミノ酸残基」は、配列または構造ベースの方法を用いて同定されるＣＤＲまたは相補性決定領域におけるアミノ酸を含む。本明細書中で用いるように、用語「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」は、重鎖および軽鎖双方のポリペプチドの可変領域内に見出される非連続的抗原組合せ部位を意味する。これらの特別な領域は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，６６０９−６６１６（１９７７）およびＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（１９９１）によって、およびＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７ （１９８７）によって、およびＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６）によって記載されており、ここに、定義は、相互に対して比較した場合に、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。前記引用文献の各々によって定義されるＣＤＲを含むアミノ酸残基を比較のために記載する。好ましくは、用語「ＣＤＲ」は、配列比較に基づいてＫａｂａｔによって定義されるＣＤＲである。
Figure 0005374359
 １ 残基のナンバリングはＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａの命名法に従う。
２ 残基ナンバリングはＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａの命名法に従う。
３ ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａの命名法に従う。
本明細書中で用いるように、用語「可変領域フレームワーク（ＦＲ）アミノ酸残基」とは、Ｉｇ鎖のフレームワーク領域におけるアミノ酸をいう。用語「フレームワーク領域」または「ＦＲ領域」は、本明細書中で用いるように、（例えば、ＣＤＲのＫａｂａｔ定義を用いて）可変領域の一部であるが、ＣＤＲの一部ではないアミノ酸残基を含む。従って、可変領域フレームワークは長さが約１００ないし１２０アミノ酸の間であるが、ＣＤＲの外部のアミノ酸のみを含む。重鎖可変領域の特別な例について、およびＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．によって定義されたＣＤＲについては、フレームワーク領域１は、アミノ酸１ないし３０を含む可変領域のドメインに対応し；フレームワーク領域２はアミノ酸３６ないし４９を含む可変領域のドメインに対応し；フレームワーク領域３はアミノ酸６６ないし９４を含む可変領域のドメインに対応し、およびフレームワーク領域４は可変領域のアミノ酸１０３ないし末端の可変領域のドメインに対応する。軽鎖についてのフレームワーク領域は、同様に、軽鎖可変領域ＣＤＲの各々によって分離される。同様に、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．またはＭｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．によるＣＤＲの定義を用い、フレームワーク領域の境界は、前記した各ＣＤＲ末端によって分離される。好ましい具体例において、ＣＤＲはＫａｂａｔによって定義される通りである。
天然に生じる抗体において、各モノマー抗体上に存在する６つのＣＤＲは、特異的に位置して、抗体が水性環境中でその三次元立体配置を採るにつれて抗原結合部位を形成するアミノ酸の短い非連続配列である。重鎖および軽鎖可変ドメインの残りは、アミノ酸配列におけるより小さな分子間変動を示し、フレームワーク領域という。フレームワーク領域はβ−シート立体配座をほとんど採り、ＣＤＲは、β−シート構造を連結し、ある場合には、その一部を形成するループを形成する。かくして、これらのフレームワーク領域は、鎖間の非共有結合相互作用によって正しい向きに６つのＣＤＲを位置させることを供する足場を形成するように作用する。位置決定されたＣＤＲによって形成される抗原結合部位は、免疫反応性抗原上のエピトープに対して相補性である表面を否定する。この相補性表面は、抗体の、免疫反応性抗原エピトープへの非共有結合を促進する。ＣＤＲの位置は当業者によって容易に決定できる。
先に示したように、種々の免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および三次元立体配置はよく知られている。本明細書中に用いるように、用語「ＶＨドメイン」は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含む。本明細書中で用いるように、用語「ＶＬドメイン」は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ末端可変ドメインを含む。
用語「断片」とは、無傷または完全ポリペプチドよりも少ないアミノ酸残基を含むポリペプチド（例えば、抗体または抗体鎖）の一部または部分をいう。用語「抗原−結合断片」とは、抗原結合（すなわち、特異的結合）のために抗原に結合する、または無傷抗体（すなわち、それらが由来する無傷抗体）と競合する免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチド断片をいう。本明細書中で用いるように、抗体分子の用語「断片」は抗体の抗原−結合断片、例えば、抗体軽鎖（ＶＬ）、抗体重鎖（ＶＨ）、単一鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、および単一ドメイン抗体断片（ＤＡｂ）を含む。断片は、例えば、無傷または完全抗体または抗体鎖の化学的または酵素的処理を介して、あるいは組換え手段によって得ることができる。
本明細書中で用いるように、用語「結合部位」は、注目する標的分子（例えば、抗原、リガンド、受容体、基質または阻害剤）に選択的に結合することを担うポリペプチドの領域を含む。結合ドメインは少なくとも１つの標的結合部位を含む。例示的な結合ドメインは抗体可変ドメインリガンドの受容体結合ドメイン、受容体のリガンド結合ドメインまたは酵素ドメインを含む。
本発明の結合分子は、当該分野で知られた技術を用いて作成することができる。１つの具体例において、本発明のポリペプチドは「組換えにより産生され」、すなわち、組換えＤＮＡ技術を用いて産生される。そのような分子を作成するための例示的な技術は以下でより詳細に議論する。
１つの具体例において、本発明の結合分子は、安定化されたｓｃＦｖ分子が融合する天然に生じる抗体である。１つの具体例において、本発明の結合分子は、安定化されたｓｃＦｖ分子が融合している修飾された抗体である。本明細書中で用いるように、用語「修飾された抗体」は、それらが天然に生じないように改変された抗体の合成形態を含む。もう１つの具体例において、本発明の結合分子は少なくとも１つのｓｃＦｖ分子を含む融合蛋白質である。
好ましい具体例において、本発明のポリペプチドはヒトにおいて有害な免疫応答を誘導しないであろう。
１つの具体例において、本発明の結合分子が定常領域、例えば、重鎖定常領域を含む。１つの具体例において、そのような定常領域は野生型定常領域と比較して修飾されている。すなわち、本明細書中で開示される発明のポリペプチドは、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）に対して、および／または軽鎖定常領域ドメイン（ＣＬ）に対して改変または修飾を含むことができる。例示的な修飾は１以上のドメインにおける１以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含む。そのような変化はエフェクター機能、半減期等を最適化するように含めることができる。
本明細書中で用いるように、用語「悪性疾患」とは非−良性腫瘍または癌をいう。本明細書中で用いるように、用語「癌」は、脱調節または非制御細胞成長によって特徴付けられる悪性疾患を含む。例示的な癌は：癌腫、肉腫、白血病、およびリンパ腫を含む。用語「癌」は原発性悪性腫瘍（例えば、その細胞が元来の腫瘍の部位以外の対象の身体中の部位に移動していないもの）および二次的悪性腫瘍（例えば、腫瘍細胞の、元来の腫瘍の部位とは異なる二次的部位への転移、移動から生起するもの）を含む。
本明細書中で用いるように、用語「作成された」は、合成手段による（例えば、組換え技術、イン・ビトロペプチド合成による、ペプチドの酵素的または化学的カップリング、またはこれらの技術のいくつかの組合せによる）核酸またはポリペプチド分子の操作を含む。好ましくは、本発明の結合分子はそのような方法を用いて作成される。
本明細書中で用いるように、用語「連結された」、「融合された」または「融合」は相互交換可能に用いられる。これらの用語は、化学的コンジュゲーションまたは組換え手段を含めたいずれの手段によっても、２以上のエレメントまたは成分を一緒に連結することをいう。好ましくは、融合したポリペプチドは遺伝子的に融合されており、すなわち、組換えＤＮＡ技術を用いて融合される。「イン−フレーム融合」とは、元来のＯＲＦの正しいリーディングフレームを維持するように、２以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を接合させて、連続的なより長いＯＲＦを形成することをいう。かくして、得られた融合蛋白質は、（そのセグメントが天然では正常にそのように接合されていない）元来のＯＲＦによってコードされたポリペプチドに対応する２以上のセグメントを含有する単一の蛋白質である。かくして、リ−ディングフレームは融合したセグメントを通じで連続的とされるが、セグメントは、例えば、イン−フレームｓｃＦｖリンカー配列によって物理的にまたは空間的に分離され得る。
ポリペプチドの文脈においては、「線状配列」または「配列」は、アミノ末端ないしカルボキシル末端方向のポリペプチドにおけるアミノ酸の順序であり、ここに、配列中で相互に隣接する残基はポリペプチドの一次構造において連続している。
本明細書中で用いるように、フレーズ「結合分子の投与から利益を受けるであろう対象」は、例えば、（例えば、診断手法のために）結合分子によって認識される抗原の検出のために用いられる結合分子の投与から、および／または結合分子によって認識される法的を低下させ、または排除するための結合分子での処置から利益を受けるであろう哺乳動物対象のような対象を含む。例えば、１つの具体例において、対象は、循環または血清からの可溶性または粒状分子（例えば、トキシンまたは病原体）の低下または排除から、あるいは標的を発現する細胞（例えば、腫瘍細胞）の集団の低下または排除から利益を受けることができる。本明細書中においてより詳細に記載されるように、結合分子はコンジュゲートしていない形態で用いることができ、あるいは例えば、検出可能な部位、薬物、プロドラッグ、または同位体にコンジュゲートさせることができる。
用語「ＴＮＦ受容体」または「ＴＮＦ受容体ファミリーメンバー」とは、受容体の腫瘍壊死因子（「ＴＮＦ」）スーパーファミリーに属するいずれの受容体もいう。ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（「ＴＮＦＲＳＦ」）のメンバーは、システインノットとして配置された２以上のシステイン−リッチなドメイン（各々、〜４０アミノ酸）を持つ細胞外領域によって特徴付けられる（Ｄｅｍｐｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．（２００３）．１４（３−４）：１９３−２０９参照）。それらの同族ＴＮＦリガンドへの結合に際して、ＴＲＡＦ（ＴＮＦ受容体会合因子）として知られた細胞質アダプター蛋白質と直接的にまたは間接的に相互作用することによって、シグナルを変換する。ＴＲＡＦは、いくつかのキナーゼカスケードの活性化を誘導することができ、これは、ＮＦ−ＫａｐｐａＢ、ＪＮＫ、ＥＲＫ、ｐ３８およびＰＩ３Ｋのようなシグナル変換経路の活性化に最終的に至り、これは、今度は、免疫機能および組織分化からアポトーシスの範囲までの細胞プロセスを調節する。
いくつかのＴＮＦ受容体ファミリーメンバーのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は当該分野で知られており、少なくとも２９のヒト遺伝子：ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＤＲ１、ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦ−Ｒ−Ｉ ｐ５５、ＴＮＦ−Ｒ、ＴＮＦＲＩ、ＴＮＦＡＲ、ＴＮＦ−Ｒ５５、ｐ５５ＴＮＦＲ、ｐ５５Ｒ、またはＴＮＦＲ６０、ＧｅｎＢａｎｋ ＧＩ Ｎｏ．４５０７５７５としも知られたＴＮＦＲ１；また、米国特許第５，３９５，７６０号参照）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（ｐ７５、ＴＮＦ−Ｒ、ＴＮＦ−Ｒ−ＩＩ、ＴＮＦＲ８０、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦ−Ｒ７５、ＴＮＦＢＲ、またはｐ７５ＴＮＦＲ；ＧｅｎＢａｎｋ ＧＩ Ｎｏ．４５０７５７７としても知られたＣＤ１２０ｂ）、ＴＮＦＲＳＦ３（ＴＮＦＲ２−ＲＰ、ＣＤ１８、ＴＮＦＲ−ＲＰ、ＴＮＦＣＲ、またはＴＮＦ−Ｒ−ＩＩＩ；ＧＩ Ｎｏｓ．４５０５０３８および２００７２２１２としても知られたリンフォトキシンベータ受容体（ＬＴβＲ））、ＴＮＦＲＳＦ４（ＡＣＴ３５、ＴＸＧＰ１Ｌ、またはＣＤ１３４抗原；ＧＩ Ｎｏｓ．４５０７５７９および８９２６７０２としても知られたＯＸ４０）、ＴＮＦＲＳＦ５（ｐ５０またはＢｐ５０；ＧＩ Ｎｏｓ．４５０７５８１９および２３３１２３７１としても知られたＣＤ４０）、ＴＮＦＲＳＦ６（ＦＡＳ−Ｒ、ＤｃＲ−２、ＤＲ２、ＣＤ９５、ＡＰＯ−１、またはＡＰＴ１としても知られたＦＡＳ；ＧｅｎＢａｎｋ ＧＩ Ｎｏｓ．４５０７５８３、２３５１０４２１、２３５１０４２３、２３５１０４２５、２３５１０４２７、２３５１０４２９、２３５１０４３１、および２３５１０４３４）、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ（ＤｃＲ３、ＤＲ３；ＧｅｎＢａｎｋ ＧＩ Ｎｏｓ．４５０７５６９、２３２０００２１、２３２０００２３、２３２０００２５、２３２０００２７、２３２０００２９、２３２０００３１、２３２０００３３、２３２０００３５、２３２０００３７、および２３２０００３９）、ＴＮＦＲＳＦ７（Ｔｐ５５またはＳ１５２としても知られたＣＤ２７；ＧｅｎＢａｎｋ ＧＩ Ｎｏ．４５０７５８７）、ＴＮＦＲＳＦ８（Ｋｉ−１、またはＤ１Ｓ１６６Ｅとしても知られたＣＤ３０；ＧｅｎＢａｎｋ ＧＩ Ｎｏｓ．４５０７５８９および２３５１０４３７）、ＴＮＦＲＳＦ９（ＣＤ１３７またはＩＬＡとしても知られた４−１−ＢＢ；ＧＩ Ｎｏｓ．５７３００９５および７２８７３８）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＤＲ４またはＡｐｏ２としても知られたＴＲＡＩＬ−Ｒ１；ＧｅｎＢａｎｋ ＧＩ Ｎｏ．２１３６１０８６）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＩＣＫ２Ａ、またはＴＲＩＣＫＢとしても知られたＴＲＡＩＬ−Ｒ２；ＧｅｎＢａｎｋ ＧＩ Ｎｏｓ．２２５４７１１６および２２５４７１１９）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ（ＤｃＲ１、ＬＩＴ、またはＴＲＩＤとしても知られたＴＲＡＩＬ−Ｒ３；ＧｅｎＢａｎｋ ＧＩ Ｎｏ．２２５４７１２１）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ（ＤｃＲ２またはＴＲＵＮＤＤとしても知られたＴＲＡＩＬ−Ｒ４）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（ＲＡＮＫ；ＧｅｎＢａｎｋ ＧＩ Ｎｏ．４５０７５６５；米国特許第６，５６２，９４８号；第６，５３７，７６３号；第６，５２８，４８２号；第６，４７９，６３５号；第６，２７１，３４９号；第６，０１７，７２９号参照）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ（ＯＣＩＦまたはＴＲ１としても知られたオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）；ＧＩ Ｎｏｓ．３８５３０１１６、２２５４７１２２および３３８７８０５６）、ＴＮＦＲＳＦ１２（ＤＲ３、ＷＳＬ−１、ＬＡＲＤ，ＷＳＬ−ＬＲ、ＤＤＲ３、ＴＲ３、ＡＰＯ−３、Ｆｎ１４、またはＴＷＥＡＫＲとしても知られた移動鎖−会合膜蛋白質（ＴＲＡＭＰ）；ＧｅｎＢａｎｋ ＧＩ Ｎｏ．７７０６１８６；米国特許出願公開番号２００４／００３３２２５Ａ１）、ＴＮＦＲＳＦ１２Ｌ（ＤＲ３Ｌ）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（ＴＡＣＩ；ＧＩ Ｎｏ．６９１２６９４）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ（ＢＡＦＦＲ；ＧＩ Ｎｏ．１６４４５０２７）、ＴＮＦＲＳＦ１４（ＡＴＡＲ、ＴＲ２、ＬＩＧＨＴＲ、またはＨＶＥＡとしても知られたヘルペスウイルス進入メディエーター（ＨＶＥＭ）；ＧｅｎＢａｎｋ ＧＩ Ｎｏｓ．２３２０００４１、１２８０３８９５、および３８７８８２１）、ＴＮＦＲＳＦ１６（ニューロトロフィン受容体またはｐ７５（ＮＴＲ）としても知られた低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ）；ＧｅｎＢａｎｋ ＧＩ Ｎｏｓ．１２８１５６および４５０５３９３）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＢＣＭＡ；ＧＩ Ｎｏ．２３２３８１９２としても知られたＢＣＭ）、ＴＮＦＲＳＦ１８（ＧＩＴＲとしても知られたＡＩＴＲ；ＧｅｎＢａｎｋ ＧＩ Ｎｏｓ．４７５９２４６、２３２３８１９４および２３２３８１９７）、ＴＮＦＲＳＦ１９（ＴＡＪとしても知られたＴｒｏｙ／Ｔｒａｄｅ；ＧｅｎＢａｎｋ ＧＩ Ｎｏｓ．２３２３８２０２および２３２３８２０４）、ＴＮＦＲＳＦ２０（ＦＬＪ１４９９３としても知られたＲＥＬＴ；ＧＩ Ｎｏｓ．２１３６１８７３および２３２３８２００）、ＴＮＦＲＳＦ２１（ＤＲ６）、ＴＮＦＲＳＦ２２（Ｔｎｆｒｈ２または２８１００２８Ｋ０６Ｒｉｋとしても知られたＳＯＢａ）、およびＴＮＦＲＳＦ２３（Ｔｎｆｒｈ１としても知られたｍＳＯＢ）を含む。他のＴＮＦファミリーメンバーは（ダウンレス（ＤＬ）、ＥＤ３、ＥＤ５、ＥＤ１Ｒ、ＥＤＡ３、ＥＤＡ１Ｒ、ＥＤＡ−Ａ１Ｒとしても知られたエクトジスプラシンＡ受容体；ＧｅｎＢａｎｋ ＧＩ Ｎｏ．１１６４１２３１；米国特許第６，３５５，７８２号）、ＸＥＤＡＲ（ＥＤＡ−Ａ２Ｒとしても知られている；ＧｅｎＢａｎｋ ＧＩ Ｎｏ．１１１４０８２３）；およびＣＤ３９（ＧＩ Ｎｏｓ．２１３５５８０および７６５２５６）を含む。
用語「ＴＮＦリガンド」または「ＴＮＦリガンドファミリーメンバー」とは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーに属するリガンドをいう。ＴＮＦリガンドはＴＮＦ受容体スーパーファミリーの区別される受容体に結合し、相互に対して１５ないし２５％アミノ酸配列相同性を呈する（Ｇａｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００３），６６（８）：１４０３−８）。いくつかのＴＮＦ受容体（リガンド）スーパーファミリー（「ＴＮＦＳＦ」）メンバーのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は当該分野で知られており、少なくとも１６のヒト遺伝子：ＴＮＦＳＦ１（リンホトキシン−α（ＬＴＡ），ＴＮＦβまたはＬＴとしても知られている，ＧＩ Ｎｏ．：３４４４４および６８０６８９３）、ＴＮＦＳＦ２（ＴＮＦ、ＴＮＦα、またはＤＩＦとしても知られている；ＧＩ Ｎｏ．２５９５２１１１）、ＴＮＦＳＦ３（リンホトキシン−β（ＬＴＢ），ＴＮＦＣ，またはｐ３３としても知られている）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ−４０Ｌ、ｇｐ３４、ＣＤ１３４Ｌ，またはｔａｘ−転写的活性化糖蛋白質１，３４ｋＤ（ＴＸＧＰ１）としても知られている；ＧＩ Ｎｏ．４５０７６０３）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０ＬＧ、ＩＭＤ３、ＨＩＧＭ１、ＣＤ４０Ｌ、ｈＣＤ４０Ｌ、ＴＲＡＰ、ＣＤ１５４、または ｇｐ３９としても知られている；ＧＩ Ｎｏ．４５５７４３３）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬまたはＡＰＴ１ＬＧ１としても知られている；ＧｅｎＢａｎｋ ＧＩ Ｎｏ．４５５７３２９）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ７０、ＣＤ２７Ｌ、またはＣＤ２７ＬＧとしても知られている；ＧＩ Ｎｏ．４５０７６０５）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０ＬＧ、ＣＤ３０Ｌ、またはＣＤ１５３としても知られている；ＧＩ Ｎｏ．４５０７６０７）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢ−ＬまたはＩＬＡリガンドとしても知られている；ＧＩ Ｎｏ．４５０７６０９）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ、Ａｐｏ−２Ｌ、またはＴＬ２としても知られている；ＧＩ Ｎｏ．４５０７５９３）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ、ＲＡＮＫＬ、ＯＰＧＬ、またはＯＤＦとしても知られている；ＧＩ Ｎｏｓ．４５０７５９５および１４７９０１５２）、ＴＮＦＳＦ１２（Ｆｎ１４Ｌ、ＴＷＥＡＫ、ＤＲ３ＬＧ、またはＡＰＯ３Ｌとしても知られている；ＧＩ Ｎｏｓ．４５０７５９７および２３５１０４４１）、ＴＮＦＳＦ１３（ＡＰＲＩＬとしても知られている）、ＴＮＦＳＦ１４（ＬＩＧＨＴ、ＬＴｇ、またはＨＶＥＭ−Ｌとしても知られている；ＧＩ Ｎｏｓ．２５９５２１４４および２５９５２１４７）、ＴＮＦＳＦ１５（ＴＬ１またはＶＥＧＩとしても知られている）、またはＴＮＦＳＦ１６（ＡＩＴＲＬ、ＴＬ６、ｈＧＩＴＲＬ、またはＧＩＴＲＬとしても知られている；ＧＩ Ｎｏ．４８２７０３４）を含む。他のＴＮＦリガンドファミリーメンバーはＥＤＡＲ１ ＆ ＸＥＤＡＲリガンド（ＥＤ１；ＧＩ Ｎｏ．４５０３４４９；Ｍｏｎｒｅａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＡＭ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．６３：３８０）、Ｔｒｏｙ／Ｔｒａｄｅリガンド、ＢＡＦＦ（ＴＡＬＬ１としても知られている；ＧＩ Ｎｏ．５７３００９７）、およびＮＧＦリガンド（例えば、ＮＧＦ−β（ＧＩ Ｎｏ．４５０５３９１）、ＮＧＦ−２／ＮＴＦ３；ＧＩ Ｎｏ．４５０５４６９）、ＮＴＦ５（ＧＩ Ｎｏ．５４５３８０８））、ＢＤＮＦ（ＧＩ Ｎｏｓ．２５３０６２６７、２５３０６２３５、２５３０６２５３、２５３０６２５７、２５３０６２６１、２５３０６２６４；ＩＦＲＤ１（ＧＩ Ｎｏ．４５０４６０７））を含む。
「転移温度」ともいわれる用語「Ｔｍ」は、マクロ分子、例えば、結合分子の５０％が変性するようになる温度であり、蛋白質の熱安定性を記載するための標準的なパラメーターであると考えられる。
本明細書中で用いるように、用語「足場残基」とは、界面（例えば、ＶＨ／ＶＬ界面）にはないが、界面を維持するにおいて重要であるアミノ酸残基または残基位置をいう。これらのアミノ酸残基は、反対ドメイン上の界面残基と物理的に相互作用せず、あるいは界面に対して表面積を寄与させるが、それにもかかわらず、界面残基についての適切な構造的関係を供するのに重要である。そのようなアミノ酸残基は、ＶＨおよびＶＬの間の相互作用の足場となる。
通常は一緒に起こる候補ポリペプチド配列内の２以上のアミノ酸残基位置は「共変動する」といわれる（「共変動残基位置」または「共変動残基位置」）。２以上のアミノ酸位置の間の共変動は、第一のアミノ酸位置で見出されたアミノ酸のタイプがもう１つのアミノ酸位置で見出されたアミノ酸のタイプに依存する場合に観察される。すなわち、１つの特別なアミノ酸が配列内の第一の位置に見出される場合、第二の特別なアミノ酸は、通常、該配列内の第二の位置に見出される。
本明細書中で用いるように、用語「Ｉｇ折り畳み」は、蛋白質の免疫グロブリンスーパーファミリーに属する蛋白質で見出される蛋白質ドメインを含む。当該分野でよく知られているように、Ｉｇ折り畳みは免疫グロブリンスーパーファミリーの区別される特徴である（例えば、Ｂｏｒｋ，Ｐ．，Ｈｏｌｍ，Ｌ．＆Ｓａｎｄｅｒ，Ｃ．１９９４．Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｏｌｄ．Ｊ ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４２，３０９−３２０参照）。Ｉｇ折り畳みの各クラスについての代表的な構造を図７３に示す。
ＩＩ．安定化されたｓｃＦｖ分子
１つの具体例において、本発明の結合分子は安定化されたｓｃＦｖ分子である。本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子はＶＨドメインおよびＶＬドメインの間に存在するｓｃＦｖリンカーを含むことができ、ここに、ＶＨおよびＶＬドメインは、ＶＨにおけるアミノ酸およびＶＬドメインにおけるアミノ酸の間のジスルフィド結合によって連結される。他の具体例において、本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子は、最適化された長さまたは組成を有するｓｃＦｖリンカーを含む。なお他の具体例において、本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子は、少なくとも１つの安定化アミノ酸置換を有するＶＨまたはＶＬドメインを含む。なおもう１つの具体例において、本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子は前記リストの安定化特徴の内の少なくとも２つを含む。
本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子は改良された安定性を有する。１つの具体例において、本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子の集団、またはそれを含むポリペプチドが、ダイマー、テトラマーまたはそうでなければ凝集した形態が１０％以下であるモノマー可溶性蛋白質として発現される。もう１つの具体例において、本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子の集団は、５５℃を超えるＴｍ−値を持つＶＨおよびＶＬドメインを有する。もう１つの具体例において、本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子の集団は４９℃を超えるＴ５０を有する。もう１つの具体例において、本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子の集団は４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４８℃を超えるＴ５０を有する。なおもう１つの具体例において、本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子の集団は５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、または４９℃を超えるＴ５０を有する。
本発明のｓｃＦｖ分子は注目する標的分子に結合する。ｓｃＦｖを作成するのに用いるＶＨおよびＶＬドメインは同一の抗体または異なる抗体に由来することができる。もう１つの具体例において、本発明の安定化されたｓｃＦｖｄで用いられるＶＨまたはＶＬは、注目する標的に結合する１以上のＣＤＲを含むことができ、他方、ＶＨまたはＶＬドメインの残りは異なる抗体から由来し、または合成のものである。好ましい具体例において、本発明の結合分子は抗体、例えば、注目する標的に結合することが当該分野で知られた抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含む。もう１つの具体例において、本発明の結合分子は与えられた抗体の少なくとも２つのＣＤＲを含む。もう１つの具体例において、本発明の結合分子は与えられた抗体の少なくとも３つのＣＤＲを含む。もう１つの具体例において、本発明の結合分子は与えられた抗体の少なくとも４つのＣＤＲを含む。もう１つの具体例において、本発明の結合分子は与えられた黄体の少なくとも５つのＣＤＲを含む。もう１つの具体例において、本発明の結合分子は与えられた抗体の少なくとも６つのＣＤＲを含む。好ましい具体例において、本発明の結合分子は抗体、例えば、注目する標的に結合することが当該分野で知られた抗体の少なくとも１つのＶＨドメインを含む。好ましい具体例において、本発明の結合分子は与えられた抗体の少なくとも１つのＶＬドメインを含む。もう１つの好ましい具体例において、本発明の結合分子は、注目する標的に結合することが当該分野で知られた抗体の少なくとも１つのＶＨメインおよび１つのＶＬドメインを含む。ｓｃＦｖ分子はＶＨ−リンカー−ＶＬ向きまたはＶＬ−リンカーＶＨ向きに構築することができる。
本発明のｓｃＦｖ分子、またはそれらを含む融合蛋白質の安定性は、慣用的な（非−安定化）ｓｃＦｖ分子または慣用的なｓｃＦｖ分子を含む結合分子の生物物理学的特性（例えば、熱安定性）を参照して評価することができる。１つの具体例において、本発明の結合分子は、対照結合分子（例えば、慣用的なｓｃＦｖ分子）よりも、約０．１、約０．２５、約０．５、約０．７５、約１、約１．２５、約１．５、約１．７５、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０度摂氏高い熱安定性を有する。本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子はセクションＶＩＩＩ ｉｎｆｒａに記載されたように本発明の方法を用いて同定されたものを含む。
他の具体例において、本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子は、最適化された長さおよび／またはアミノ酸組成を持つｓｃＦｖリンカーを含む。本発明の好ましいｓｃＦｖリンカーは、慣用的な結合分子と比較して、少なくとも約２℃または３℃だけ本発明の結合分子の熱安定性を改良する。１つの具体例において、本発明の結合分子は、慣用的な結合分子と比較して、１℃改良された熱安定性を有する。１つの具体例において、本発明の結合分子は、慣用的な結合分子と比較して、２℃改良された熱安定性を有する。もう１つの具体例において、本発明の結合分子は、慣用的な結合分子と比較して、４、５、６℃改良された熱安定性を有する。比較は、例えば、本発明のｓｃＦｖ分子、および先行技術方法を用いて作成されたｓｃＦｖ分子の間で、またはｓｃＦｖ分子、およびｓｃＦｖ ＶＨおよびＶＬが由来する抗体のｆａｂ断片の間で行うことができる。熱安定性は、当該分野で知られた方法を用いて測定することができる。例えば、１つの具体例において、Ｔｍを測定することができる。Ｔｍを測定するための方法、および蛋白質安定性を決定する他の方法は以下でより詳細に記載する。
１つの具体例において、ｓｃＦｖリンカーはアミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４よりなり、あるいは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４配列を含む。他の例示的なリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５配列を含み、またはそれよりなる。本発明のｓｃＦｖリンカーは種々の長さのものとすることができる。１つの具体例において、本発明のｓｃＦｖリンカーは長さが約５ないし約５０アミノ酸である。もう１つの具体例において、本発明のｓｃＦｖリンカーは長さが約１０ないし約４０アミノ酸である。もう１つの具体例において、本発明のｓｃＦｖリンカーは長さが約１５ないし約３０アミノ酸である。もう１つの具体例において、本発明のｓｃＦｖリンカーは長さが約１７ないし約２８アミノ酸である。もう１つの具体例において、本発明のｓｃＦｖリンカーは長さが約１９ないし約２６アミノ酸である。もう１つの具体例において、本発明のｓｃＦｖリンカーは長さが約２１ないし約２４アミノ酸である。
ｓｃＦｖリンカーは、当該分野で知られた技術を用いてポリペプチド配列に導入することができる。例えば、１つの具体例において、ＰＣＲ突然変異誘発を用いることができる。修飾はＤＮＡ配列分析によって確認することができる。プラスミドＤＮＡを用いて、生産されたポリペプチドの安定な生産のために宿主細胞を形質転換することができる。
ある具体例において、本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子は、ＶＬドメイン中のアミノ酸をＶＨドメイン中のアミノ酸と連結する少なくとも１つのジスルフィド結合を含む。システイン残基はジスルフィド結合を供するのに必要である。ジスルフィド結合は、例えば、ＶＬのＦＲ４およびＶＨのＦＲ２を連結するのに、またはＶＬのＦＲ２およびＶＨのＦＲ４を連結するのに、本発明のｓｃＦｖ分子に含めることができる。ジスルフィド結合のための例示的な位置は：ＶＨの４３、４４、４５、４６、４７、１０３、１０４、１０５、および１０６、およびＶＬの４２、４３、４４、４５、４６、９８、９９、１００、および１０１、Ｋａｂａｔナンバリングを含む。システイン残基に対して突然変異したアミノ酸位置の例示的な組合せは：ＶＨ４４−ＶＬ１００、ＶＨ１０５−ＶＬ４３、ＶＨ１０５−ＶＬ４２、ＶＨ４４−ＶＬ１０１、ＶＨ１０６−ＶＬ４３、ＶＨ１０４−ＶＬ４３、ＶＨ４４−ＶＬ９９、ＶＨ４５−ＶＬ９８、ＶＨ４６−ＶＬ９８、ＶＨ１０３−ＶＬ４３、ＶＨ１０３−ＶＬ４４、およびＶＨ１０３−ＶＬ４５を含む。
１つの具体例において、ジスルフィド結合はＶＨアミノ酸４４およびＶＬアミノ酸１００を連結する。
ＶＨおよびＶＬドメインをコードする遺伝子の修飾は、当該分野で知られた技術、例えば、部位−特異的突然変異誘発を用いて達成することができる。
１つの具体例において、本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子はＶＨドメインおよびＶＬドメインの間に存在するアミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４を有するｓｃＦｖリンカーを含み、ここに、ＶＨおよびＶＬドメインはアミノ酸位置４４におけるＶＨ中のアミノ酸およびアミノ酸位置１００におけるＶＬ中のアミノ酸の間のジスルフィド結合によって連結される。
他の具体例において、本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子はｓｃＦｖの可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）内に１以上の安定化突然変異を含む。１つの具体例において、安定化突然変異は：
ａ）例えば、アラニン、セリン、バリン、アスパラギン酸、またはグリシンでの、ＶＬのＫａｂａｔ位置３におけるアミノ酸（例えば、グルタミン）の置換；
ｂ）例えば、ロイシンでの、ＶＬのＫａｂａｔ位置４６におけるアミノ酸（例えば、セリン）の置換；
ｃ）例えば、チロシンまたはセリンでの、ＶＬのＫａｂａｔ位置４９におけるアミノ酸（例えば、セリン）の置換；
ｄ）例えば、セリン、スレオニン、およびアルギニン、アスパラギン酸、グリシン、またはリシンでの、ＶＬのＫａｂａｔ位置５０におけるアミノ酸（例えば、セリンまたはバリン）の置換；
ｅ）各々、チロシンおよびセリン；チロシンおよびスレオニン；チロシンおよびアルギニン；チロシンおよびリシン；セリンおよびアルギニン；またはセリンおよびリシンでの、ＶＬのＫａｂａｔ位置４９におけるアミノ酸（例えば、セリン）およびＫａｂａｔ位置５０におけるアミノ酸（例えば、セリン）の置換；
ｆ）例えば、イソロイシンでの、ＶＬのＫａｂａｔ位置７５におけるアミノ酸（例えば、バリン）の置換；
ｇ）例えば、セリンまたはグリシンでの、ＶＬのＫａｂａｔ位置８０におけるアミノ酸（例えば、プロリン）の置換；
ｈ）例えば、セリン、アラニン、グリシン、またはスレオニンでの、ＶＬのＫａｂａｔ位置８３におけるアミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の置換；
ｉ）例えば、グルタミンでの、ＶＨのＫａｂａｔ位置６におけるアミノ酸（例えば、グルタミン酸）の置換；
ｊ）例えば、グルタメートでの、ＶＨのＫａｂａｔ位置１３におけるアミノ酸（例えば、リシン）の置換；
ｋ）例えば、グルタメートまたはグルタミンでの、ＶＨのＫａｂａｔ位置１６におけるアミノ酸（例えば、セリン）の置換；
ｌ）例えば、イソロイシンでの、ＶＨのＫａｂａｔ位置２０におけるアミノ酸（例えば、バリン）の置換；
ｍ）例えば、セリンでの、ＶＨのＫａｂａｔ位置３２におけるアミノ酸（例えば、アスパラギン）の置換；
ｎ）例えば、リシンまたはアルギニンでの、ＶＨのＫａｂａｔ位置４３におけるアミノ酸（例えば、グルタミン）の置換；
ｏ）例えば、イソロイシンまたはグリシンでの、ＶＨのＫａｂａｔ位置４８におけるアミノ酸（例えば、メチオニン）の置換；
ｐ）例えば、グリシンまたはアラニンでの、ＶＨのＫａｂａｔ位置４９におけるアミノ酸（例えば、セリン）の置換；
ｑ）例えば、グリシンでの、ＶＨのＫａｂａｔ位置５５におけるアミノ酸（例えば、バリン）の置換；
ｒ）例えば、イソロイシンまたはロイシンでの、ＶＨのＫａｂａｔ位置６７におけるアミノ酸（例えば、バリン）の置換；
ｓ）例えば、アスパルテートまたはアスパラギンでの、ＶＨのＫａｂａｔ位置７２におけるアミノ酸（例えば、グルタミン酸）の置換；
ｔ）例えば、セリン、バリン、またはチロシンでの、ＶＨのＫａｂａｔ位置７９におけるアミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の置換；および
ｕ）例えば、アルパラギン酸での、ＶＨのＫａｂａｔ位置１０１におけるアミノ酸（例えば、プロリン）の置換；
よりなる群から選択される。
ｖ）例示的な具体例において、本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子は、前記ａ）ないしｕ）に記載された安定化突然変異の２以上を含む。例示的な具体例において、本発明の安定化されたｓｃＦｖは、例えば、チロシンまたはセリンでの、ＶＬのＫａｂａｔ位置４９におけるアミノ酸の置換、および例えば、スレオニン、およびアルギニン、アルパラギン酸、グリシンまたはリシンでの、ＶＬのＫａｂａｔ位置５０におけるアミノ酸の置換を含む。もう１つの例示的な具体例において、本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子は、例えば、グルタメートまたはグルタミンでの、ＶＨのＫａｂａｔ位置１６におけるアミノ酸の置換、および例えば、リシンでの、ＶＬのＫａｂａｔ位置４６におけるアミノ酸の置換を含む。もう１つの具体例において、本発明の結合分子は、例えば、グルタメートまたはグルタミンでの、ＶＨのＫａｂａｔ位置１６におけるアミノ酸の置換；例えば、リシンでの、ＶＬのＫａｂａｔ位置４６におけるアミノ酸の置換；および例えば、グリシンでの、ＶＨのＫａｂａｉ位置５５におけるアミノ酸の置換を含む。もう１つの具体例において、本発明の結合分子は、例えば、グルタメートまたはグルタミンでの、ＶＨのＫａｂａｔ位置１６におけるアミノ酸の置換；例えば、リシンでの、ＶＬのＫａｂａｔ位置４６におけるアミノ酸の置換；例えば、グリシンでの、ＶＨのＫａｂａｔ位置５５におけるアミノ酸の置換；および例えば、アスパラギン酸での、ＶＨのＫａｂａｔ位置１０１におけるアミノ酸の置換を含む。もう１つの具体例において、本発明の結合分子は、例えば、グルタミンでの、ＶＨのＫａｂａｔ位置６におけるアミノ酸の置換を含む。もう１つの具体例において、本発明の結合分子は、例えば、グルタメートでの、ＶＨのＫａｂａｔ位置１３におけるアミノ酸の置換を含む。もう１つの具体例において、本発明の結合分子は、例えば、グルタメートまたはグルタミンでの、ＶＨのＫａｂａｔ位置１６におけるアミノ酸の置換を含む。もう１つの具体例において、本発明の結合分子は、例えば、イソロイシンでの、ＶＨのＫａｂａｔ位置２０におけるアミノ酸の置換を含む；もう１つの具体例において、本発明の結合分子は、例えば、セリンでの、ＶＨのＫａｂａｔ位置３２におけるアミノ酸の置換を含む。もう１つの具体例において、本発明の結合分子は、例えば、リシンまたはアルギニンでのＶＨのＫａｂａｔ位置４３におけるアミノ酸の置換を含む。もう１つの具体例において、本発明の結合分子は、例えば、イソロイシンまたはグリシンでのＶＨのＫａｂａｔ位置４８におけるアミノ酸の置換を含む。もう１つの具体例において、本発明の結合分子は、例えば、グリシンまたはアラニンでの、ＶＨのＫａｂａｔ位置４９におけるアミノ酸の置換を含む。もう１つの具体例において、本発明の結合分子は、例えば、グリシンでの、ＶＨのＫａｂａｔ位置５５におけるアミノ酸の置換を含む。もう１つの具体例において、本発明の結合分子は、例えば、イソロイシンまたはロイシンでのＶＨのＫａｂａｔ位置６７におけるアミノ酸の置換を含む。もう１つの具体例において、本発明の結合分子は、例えば、アスパルテートまたはアスパラギンでの、ＶＨのＫａｂａｔ位置７２におけるアミノ酸の置換を含む。もう１つの具体例において、本発明の結合分子は、例えば、セリン、バリン、またはチロシンでの、ＶＨのＫａｂａｔ位置７９におけるアミノ酸の置換を含む。もう１つの具体例において、本発明の結合分子は、例えば、アスパラギン酸での、ＶＨのＫａｂａｔ位置１０１におけるアミノ酸の置換を含む。
もう１つの例示的な具体例において、本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子は、本明細書中に記載された安定化アミノ酸置換の１以上、および最適化された長さまたは組成を持つｓｃＦｖリンカー（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４）を含む。もう１つの例示的な具体例において、本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子は、本明細書中に記載されたアミノ酸置換の１以上、およびＶＬドメインにおけるアミノ酸をＶＨドメインにおけるアミノ酸と連結させるジスルフィド結合を含む（例えば、ＶＨ４４ないしＶＬ１００）。なおもう１つの例示的な具体例において、本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子は、本明細書中に記載されたアミノ酸置換の１以上、最適化された長さまたは組成を持つｓｃＦｖリンカー（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４）、およびＶＬドメインにおけるアミノ酸をＶＨドメインにおけるアミノ酸と連結させるジスルフィド結合を含む（例えば、ＶＨ４４−ＶＬ１００）。
安定化されたｓｃＦｖ分子は、当該分野で認められた技術を用いて発現させることができる。例えば、１つの具体例において、そのような分子は、細胞発現系、例えば、細菌または哺乳動物発現系における発現に適した発現ベクターを用いて発現させることができる。
１つの具体例において、ｓｃＦｖ分子は、例えば、ペリプラズム発現に適したベクターを用いてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させることができる。さらなる配列を含めて、発現を最適化することができ、例えば、ｓｃＦｖの精製および／または検出を容易とするためのシグナル配列および／またはタグである。
１つの具体例において、１ないし２％ｔｒｉｔｏｎ（例えば、ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）または１ないし２％グリシン、またはその組合せ（例えば、１％グリシンおよび１％ｔｒｉｔｏｎ）のような添加剤を加えて、ペリプラズムから媒体への分泌を促進することができる。
ＩＩＩ．蛋白質安定性を予測し／決定するための方法
ある態様において、本発明は、大規模な発現について選択された蛋白質、例えば、治療蛋白質または工業用酵素に関する潜在的な生物物理学的問題を先験的に予測する方法を提供する。ある例示的な態様において、本発明の方法は、当業者が、例えば、哺乳動物細胞において組換え的に発現された場合に、固有に貧弱な安定性を有すると予測される蛋白質配列の発現を回避するのを可能とする。代替態様において、本発明の方法を使用して、限定されるものではないが、改良された安定性、ｐＨの変化に対する改良された安定性、および増強された生化学的機能を含めた、改良された生物物理学的特性を有すると予測される蛋白質配列の変種を同定することができる。
ある態様において、本発明は、候補蛋白質のポリペプチド配列（例えば、アミノ酸配列）に基づいて、候補蛋白質、またはその配列変種またはホモログの生物物理学的特性（例えば、熱安定性）を予測するための計算方法を提供する。他の態様において、本発明の方法は構造的モデリングを使用して、候補蛋白質の能力を予測し、または候補蛋白質、例えば、ｓｃＦｖ分子の安定性を改良するのに用いることができる機知の例示的安定性を備えた候補蛋白質のホモログまたは変種を同定することができる。
ａ．共変動解析
ある例示的な態様において、本発明は、生物物理学的特性（例えば、蛋白質安定性）を予測するための「共変動解析」と言われる改良された計算方法を提供する。本明細書中で用いるように、「共変動解析」とは、候補配列のホモログにおいて、通常は共に起こり、または共に変化する候補ポリペプチド配列内の２以上のアミノ酸残基位置（本明細書中においては、「共変化残基位置」または「共変動残基位置」）を同定するための計算方法をいう。２以上のアミノ酸位置の間の共変動は、第一のアミノ酸位置において見出されたアミノ酸のタイプがもう１つのアミノ酸位置で見出されたアミノ酸のタイプに依存する場合に観察される。すなわち、１つの特定のアミノ酸が配列内の第一の位置に見出される場合、第二の特別なアミノ酸は、通常、該配列内の第二の位置において見出される。
共変残基は共進化したようなので、共変動の観察は、通常に共変動する位置に存在するアミノ酸残基の適合性が、機能的または構造的理由で重要らしいことを示す。従って、本発明の共変動方法を用いて、ポリペプチド配列（例えば、候補ポリペプチド配列）内の残基の１以上の共変動残基または群（例えば、共変動残基対）を同定することができる。本明細書中で用いるように、（「連結された残基」とも言われる）「共変動残基」は、ポリペプチド配列内の共変動残基位置において統計学的に優勢なアミノ酸である。
ある具体例において、本発明の共変動方法を用いて、候補配列における重要な機能的残基を同定することができる。さらに、候補ポリペプチド内の共変動残基の数はその安定性を予測するので、この共変動方法を用いて、候補蛋白質の安定性を予測することができる。
他のある具体例において、本発明の共変動方法を使用して、首尾よい蛋白質設計をガイドすることができる。１つの例示的な具体例において、本発明の共変動方法を用いて、候補配列内の共変動アミノ酸を同定することができる。もし存在すれば、共変動残基は、好ましくは、蛋白質配列の引き続いてのエンジニアリングの間に保持される。もう１つの例示的な具体例において、本発明の共変動方法を用いて、他の蛋白質（例えば、参照組の配列に対応する蛋白質）における対応するアミノ酸が正常に共変動するアミノ酸である候補ポリペプチド配列内の非−共変動残基のアミノ酸位置を同定することができる。一旦同定されたならば、（例えば、組換えＤＮＡ方法を用いて）対応する共変動残基で非−共変動残基を置換して、候補ポリペプチド配列の機能を増強させ、またはその生物物理学的特性（例えば、安定性）を改良することができる。
共変動残基位置は、関連するポリペプチド配列のデータベース（例えば、整列した参照組または多数の配列組整列）内の残基位置の統計学的解析（例えば、相関解析）によって同定することができる。好ましい具体例において、共変動解析は、同一の構造的折り畳み（例えば、Ｉｇ折り畳み）を有する多様なポリペプチド配列のキュレーションされたデータベースに対する候補ポリペプチド配列の統計学的比較を含む。
本明細書中に記載された新規な共変動解析においては、以下の基本的な工程を採用して、候補ポリペプチドの安定性を予測する：
１．候補ポリペプチドの配列またはそのドメインまたは部分（本明細書中においては、「テストドメイン配列」）に対応する相同配列の組（本明細書中においては、「参照組」）を供する。
２．相同配列の整列した組（本明細書中においては、「整列した組」）を生じさせるために参照組の配列を整列させる。
３．共変動データまたは共変動データの組（「共変動データ組」）を生じさせるために参照内の２以上の残基位置（例えば、アミノ酸の少なくとも１つの対）の間の共変動を決定する。
４．候補ポリペプチドの安定性を予測するために共変動データを用いる。
工程１：参照組の提供
本発明の共変動方法は、注目する配列または「テスト配列」に相同な（すなわち、関連する）配列の組（「参照組」）を使用する。参照組は、テスト配列に対して中程度または高度な同様性を有する相同配列の組を含むことができる。ある具体例において、参照組の相同配列は、中程度ないし高度なアミノ酸配列同様性を有する。より好ましい具体例において、参照組の相同な配列は、中程度ないし高度な構造的同様性を有する。なおより好ましい具体例において、参照組の相同な配列は高度な構造的同様性を有する（例えば、それらは少なくとも１つの蛋白質ドメインまたは折畳みを共有する）。合理的に偏っていない選択が得られる限り、相同配列の組は大きい必要はない。
例示的な具体例において、本発明の共変動方法は、キュレーションされた参照組を使用する。本明細書中で用いるように、用語「キュレーションされた参照組」とは、成分配列がある選択基準に従って欠失され、またはされない配列が付加された参照組を言う。従って、非−キュレーションされた参照は成分配列の偏っていない選択によって生じるが、キュレーションされたデータベースは偏った選択によって生じる。例えば、相同な配列の参照組を間引きして、ある種の配列、例えば、冗長な配列を排除することができる。別法として、キュレーションされたデータベースは、例えば、適当な数の非−冗長または非−同一配列を含めるように拡大することができる。
ある具体例において、キュレーションされたデータベースは少なくとも１００の配列（例えば、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、７５０以上の配列）を含む。１つの具体例において、キュレーションきされたデータベースは少なくとも１０００の配列（例えば、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００以上の配列）を含む。もう１つの具体例において、キュレーションされたデータベースは少なくとも１０，０００の配列（例えば、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２５０，０００、５００，０００、７５０，０００以上の配列）を含む。１つの具体例において、キュレーションされたデータベースは少なくとも１００００００の個々の配列（例えば、１００００００、２００００００、５００００００、１０００００００以上の配列）を含む。
好ましい具体例において、本発明の共変動方法は、少なくとも５０％多様性（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または以上の多様性）を有するキュレーションされた参照を使用して、人工的なまたは非−情報的共変動を最小化する。本明細書中で用いるように、用語「％多様性」とは、非−冗長または非−同一である参照組における配列のパーセンテージをいう。本明細書中で用いるように、用語「非−冗長」とは、参照組における各他の配列に対して１００％未満の配列同一性を有する配列、すなわち、参照組における各他の配列から少なくとも１つのアミノ酸位置が異なる配列をいう。ある具体例において、参照組の配列は、参照組における各他の配列に対して９９％未満、９５％未満、９０％未満、または８５％未満の配列同一性を有する。好ましい具体例において、参照組の配列は、参照組における各他の配列に対して８０％未満の配列同一性を有する（例えば、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、または５０％未満の配列同一性）。特に好ましい具体例において、参照組の各配列は、参照組における各他の配列に対して８０％未満の配列同一性を有する。例示的な具体例において、参照組の配列は、より多くの共通する配列タイプを含有する配列を間引きするフィルタリングツール（例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆソーティングツール）を用いて好ましい多様性についてキュレーションする。２つの配列が長さが等しい場合、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ重みによるソーティングは、稀な残基のタイプを持つ配列は保持され、他方、より共通する残基タイプを持つ配列は捨てる（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４３：５７４−５７８（１９９４））。
他の好ましい具体例において、参照組は、データベース中の他の配列をコードする遺伝子に進化的に近くない遺伝子によってコードされる配列を含む。例えば、多様性を増大させるためには、参照組は１以上のオルソログ配列、すなわち、異なる種（例えば、異なる哺乳動物種）からのものであるが、同一または同様な生化学的機能を有する配列を含むことができる。１つの例示的な具体例において、参照組は１つのヒト配列および少なくとも１つの非−ヒト配列（例えば、非−哺乳動物配列）を含むことができる。もう１つの例示的な具体例において、参照組は哺乳動物種（例えば、ヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、ブタ、ネコ、ラットまたはマウス）についての少なくとも１つの配列、および少なくとも１つの非−哺乳動物細胞（例えば、非−哺乳動物脊椎動物配列（例えば、真骨魚または鳥類配列）、無脊椎動物配列（例えば、昆虫（例えば、ショウジョウバエ）または線虫（例えば、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）配列）、または真菌、植物または細菌ウイルス配列を含むことができる。他の具体例において、参照組は１以上のパラログ配列、すなわち、最初の配列と同一の種からのものであるが、同一または同様な生化学的機能を有する配列を含むことができる。
なお他の具体例において、参照組の配列はある閾値長さを超える。好ましくは、参照組の配列は長さが少なくとも２０残基である（例えば、長さが２５、３０または４０残基）である。より好ましくは、参照組の配列は長さが少なくとも５０残基である（例えば、長さが６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５残基）である。なおより好ましいものは長さが少なくとも１００残基（例えば、長さが１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０以上の残基）の配列である。例示的な具体例において、参照組の配列は、濾過ツールを用いる濾過によって好ましい長さについてキュレーションされる（例えば、非−ギャップ残基カウント）。非−ギャップ残基カウントを減少させることによるランキングは、より短い配列（例えば、ギャップが入った配列）がより長いものに渡って濾過されることを確実とする。
該配列は、当該分野で知られた配列データベース（例えば、ＮＣＢＩ、ＴＩＧＲデータベース）のいずれかについての配列−ベースの相同性サーチを介して得ることができる。例示的な具体例において、デフォルトパラメータでの標準的なＢＬＡＳＴサーチをテスト配列で行って、注目する相同配列を検索することができる。テスト配列に対する配列同一性の最小パーセンテージ（例えば、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％を超える配列同一性、好ましくは３０％を超える配列同一性）を持つ配列を、参照組への包含について選択することができる。
ある好ましい具体例において、参照組は、同一クラスの蛋白質折畳みを有する蛋白質（例えば、ＳＨ３、ＴＰＲ、ＧＰＣＲを有する蛋白質、セリンプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼグロリン、免疫グロブリン、または他の折畳み）からの配列を含める。そのような蛋白質または構造は、当該分野で公知のバイオインフォーマティックス技術によって（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈの保存ドメインデータベース（ＣＤＤ）を用いる構造−ベースのサーチング）、または所望のＳＣＯＰ分類を用いるＡＳＴＲＡＬデータベースまたはＲＣＳＢ蛋白質データベース（ＰＤＢ）をサーチすることによって同定し、収集することができる。好ましくは、配列は、その三次元構造が、例えば、Ｘ−線結晶学によって高い分解能で解像されている蛋白質に由来する。
好ましい具体例において、収集された構造に対応する配列を当該分野で認められた技術を用いて濾過して、誤ってカテゴリー化された、不完全で冗長なまたはドメインが交換された構造を除去する。１つの具体例において、構造は、分解されない密度またはドメイン交換による対応する配列中の破壊について（例えば、ＳｗｉｓｓＰＤＢ Ｖｉｅｗｅｒを用いて）視覚的に精査される。欠陥のある構造のＰＤＢファイルは構造の対応する組から手動で除去される。もう１つの具体例において、収集された構造に対応する配列（例えば、ＦＡＳＴＡ配列）を濾過して、残りの配列の１００％同一の、または完全なマッチサブストリングであるいずれの配列も除去する。なお他の具体例において、異常に長いまたは短いアミノ酸配列（誤った構造カテゴリー化のホールマーク）を持つＰＤＢ配列を構造データ組から間引きする。長さカットオフ基準は、例えば、参照組の配列の全ての配列長さのヒストグラムを調べることによって決定することができる。なお他の具体例において、構造は誤折畳みについて（例えば、Ｓｗｉｓｓ ＰＤＢ Ｖｉｅｗｅｒを用いて）視覚的に精査される。蛋白質折畳みの標準的なトポロジーに適合しないいずれの構造も好ましくは捨てる。
例示的な具体例において、キュレーションされた参照組は、蛋白質の免疫グロブリンスーパーファミリーに属する蛋白質の免疫グロブリン−タイプ折畳み（「Ｉｇ折畳み」）に対応する配列を含む。当該分野で良く知られているように、Ｉｇ折畳みは免疫グロブリンスーパーファミリーの区別される特徴である（例えば、Ｂｏｒｋ，Ｐ．，Ｈｏｌｍ，Ｌ． ＆ Ｓａｎｄｅｒ，Ｃ．１９９４．Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｏｌｄ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４２，３０９−３２０）参照）。Ｉｇ折畳みは哺乳動物蛋白質に置いてしばしば出現し、種々の機能−特に蛋白質−蛋白質相互作用についてのプラットフォームとして働く。例えば、全ての免疫グロブリンおよびほとんどの免疫グロブリン受容体は多数のＩｇ−折畳みドメインから構成される。Ｉｇ折畳みは、Ｃ１、Ｃ２、Ｉ、およびＶを含めたいくつかのサブファミリーに細分することができる。全てのサブファミリーのメンバーは２−βシート、ギリシャ雷紋トポロジーを含むが、これらのサブファミリーは各シート上のβ−ストランドの数によって、およびβ−シートを横切っての連結によって異なる（例えば、ＡＦ Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，８，（１９８７）参照）。Ｉｇ折畳みの各クラスについての代表的な構造を図７３に示す。
１つの具体例において、参照組は、細胞接着蛋白質、インテグリン、アレルゲン、Ｔ−細胞受容体、主要組織適合性複合体蛋白質（例えば、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ蛋白質）、免疫グロブリン受容体（例えば、Ｆｃガンマ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ））、および免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、またはＩｇＥ免疫グロブリン）よりなる群から選択される免疫グロブリンスーパーファミリー蛋白質のＩｇ−折畳み配列を含む。
ある好ましい具体例において、参照組の配列の全てはＩｇ−折畳みまたはその部分に対応する。１つの具体例において、Ｉｇ−折畳みはＣ１折畳みである。もう１つの具体例において、Ｉｇ−折畳みはＣ２−折畳みである。もう１つの具体例において、Ｉｇ−折畳みはＶ−折畳みである。なおもう１つの具体例において、Ｉｇ−折畳みはＩ−折畳みである。もう１つの具体例において、参照組の配列の全てはＣ１折畳みに対応する。もう１つの具体例において、参照組の配列の全てはＣ２−折畳みに対応する。もう１つの具体例において、参照組の配列の全てはＩ−折畳みに対応する。ある好ましい具体例においては、Ｉｇ−折畳み参照組の配列は長さが約７５ないし約１５０残基内である。
工程２：参照組の整列
第二の工程において、参照組の配列を正確に整列させて、配列の整列された組（または整列）を生じさせる。１つの具体例において、参照組の配列を配列整列アルゴリズム（例えば、ＬＡＬＩＧＮまたはＢＬＡＳＴおよび前記した他の当該分野で認められた整列）を用いて整列させて、配列の整列した組を生じさせる（本明細書中においては、「配列−ベースの配列整列」）。もう１つの具体例において、構造整列アルゴリズム（例えば、シュレジンガーストラクトアラインパッケージを用いる二次構造マッチング（ＳＳＭ）を用いて整列させて、構造の整列した組（本明細書中においては、「構造整列」）を得る。好ましくは、構造整列アルゴリズムは、介入ループの代わりに、各構造のコア領域（例えば、βストランド）が整列するのを確実とする。なおもう１つの具体例において、参照組の配列は、構造−ベースの方法によって（例えば、シュレジンガーパッケージを用いてポリペプチド骨格のα−炭素の間の最も短い距離に基づいて、もう１つの重ねた構造のそれに対して１つの重ねた構造からのアミノ酸をマッチさせることによって）整列させる。
もう１つの具体例において、参照組の配列は、配列−ベースのおよび構造−ベースの双方の整列アルゴリズムを用いて整列させる。好ましくは、参照組の配列に対応する構造を、構造−ベースの整列アルゴリズムまたは他の構造−ガイデッド整列ツールを用いてまず整列させ、続いて、配列−ベースのアルゴリズムで対応する配列を整列させる。より好ましくは、参照組の配列に対応する構造をまず整列させ、続いて、構造−ベースの配列整列を用いて配列の整列を行う。
ある任意の具体例において、配列の整列した組を更にキュレーションする。例えば、胚列の整列した組は（例えば、非−ギャップソーティングによって、またはＨｅｎｉｋｏｆｆソーティングによって）拡大して、その多様性を増大させることができる（例えば、同一折畳みを有する相同配列の非常に大きな組を得る）ことができる。他の具体例において、配列の整列した組をさらにキュレーションのいくつかのラウンドおよび、所望により、さらなる整列（例えば、構造−ベースの整列）に付すことができる。
ある好ましい具体例において、本発明は、比較的少数の配列を含有する整列した組をキュレーションして、その多様性を増強する方法を提供する。整列における配列の数を増大させることによって、共変動解析の頑強性を増加させる。１つの具体例において、該方法は経験的に由来するモデルまたはプロフィールを使用して、大きな公に入手可能な配列データ（例えば、ＮＣＢＩによって維持されたＮＲデータベース）からの追加の相同配列についてサーチすることができる。経験的に由来するモデルは、例えば、部分的最小自乗回帰、複数線形回帰、逆最小自乗回帰、主成分回帰、投影のための変数の重要性等から選択された１以上の回帰−ベースのアルゴリズムを用いて作成することができる。他の具体例において、経験に由来するモデルは、例えば、Ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖモデル、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、神経ネットワーク、分類および回帰ツリー、多変数養子回帰スプライン等から選択される１以上のパターン−ベースのアルゴリズムを用いて作成される。例示的な具体例において、パターン認識アルゴリズムはＨｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖモデルである。ＨＭＭは統計学的モデルであり、ここに、該システムは、観察可能なパラメーターを用いて抽出し、パターン認識の解析で使用される。例えば、当該分野で認められたＨＭＭは予測された二次構造を使用して、純粋に配列−ベースの関連性を有する抗体よりはむしろ、与えられた抗体と同一折畳みの抗体についてサーチすることができる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ３６（１），６８−７６参照）。ＭｅｔａＦａｍ （Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２９（１），４９−５１（２００１）），Ｉｎｔｅｒｐｒｏ（Ａｐｗｅｉｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２９（１），３７−４０，（２００１））、およびＨＭＭＥＲ（Ｂａｔｅｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７（１），２６０−２（１９９９））は例示的なＨＭＭ−ベースのパターン認識ツールである。
あるさらなる具体例において、ＨＭＭアルゴリズムで抽出した配列は、当該分野で認められたバイオインフォーマティックスソフトウエアを用いてそれらの適切な構造クラス帰属について確証することができる。例示的な確証ツールは、Ｗｅｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓによって維持されたＰＦＡＭ分類ツールであって、インターネットで公に入手可能である。例えば、ＰＦＡＭツール「ｐｆａｍｖｅｒｉｆｙ」を各抽出された配列に適応して、構造−ベースの構造整列から作成したクラス−特異的ＨＭＭによってそれが正しく分類されることを確認することができる（Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２４（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ），Ｄ２４７−５１，（２００６））。ＰＦＡＭ族に対応するＨＭＭプロフィール（または蛋白質の関連ファミリー、例えば、Ｉｇ−折畳み族）はＰＦＡＭウェブサイトからダウンロードして、抽出された配列のスコアリングを容易とすることができる。そのスコアが推奨されるカットオフ未満である抽出された配列は、好ましくは、参照組から除去される。
他の具体例において、ＨＭＭアルゴリズムで抽出された配列は、ＨＭＭＣアルゴリズムを用いて整列させることもできる。これらのＨＭＭアルゴリズムは注意深い構造整列に基づくので、このプロセスは、さらなる抽出された配列の構造ガイデッド整列を保証する。例えば、ＨＭＭＥＲパッケージを利用して、ＦＡＳＴＡ出力フォーマットで「ｍａｐａｌｉ」整列を作り出すことができる。
好ましい具体例において、本発明の方法は、整列した組のそれと同様な配列を見出すのみならず、新しい配列を整列させて、正しいコア領域整列を保証する新規なＨＭＭを提供する。例えば、本発明の新規なＨＭＭアルゴリズムは、単一蛋白質（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー）内の別々のドメイン（例えば、Ｉｇ−折畳みドメイン）についてサーチし、各ドメインを別々に抽出し、それを配列の整列した組に加えることができる。ＨＭＭアルゴリズムまたはプロフィールは、（例えば、ｗｗｗ．ｐｓｃ．ｅｄｕにおいてインターネットで公に入手可能であるＨＭＭＥＲソフトウェアパッケージを用いて）構造−ベースの配列整列から形成することができる。各構造−特異的ＨＭＭサーチについて、基準スコア閾値を超えるヒット配列は、好ましくは、そのＨＭＭが用いられる構造クラスの候補メンバーとして保持される。ヒット配列のサブ配列であるそれらのヒット領域ついては、正確なサブ配列ヒットを十分な配列から抽出することができる。
他の例示的な具体例において、本発明は、配列の整列した組をキュレーションして、その冗長性を低下させる方法を提供する。例えば、構造的に整列された組（例えば、Ｉｇ−折畳み整列組）における多数の配列は配列のリッチな源を表すが、いくつかのサブファミリー（例えば、ある種のＩｇ−折畳みサブクラス）は高度に過剰表現され、他方、他のものは高度に過少表現される。過剰または過少表現の結果、密接な共通の先祖による有意な偏りがもたらされ、共変動解析の総じての有用性を制限する。したがって、好ましい具体例において、整列をさらなる濾過工程に付して、整列の冗長性を低下させる。好ましい具体例において、もう１つの配列に対する９０％を超える同一性（例えば、９１％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を持つ少なくとも１つの配列は整列から除去される。特に好ましい具体例において、もう１つの配列に対して８０％を超える配列同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８７％、８８％、８９％、または９０％配列同一性）を共有する少なくとも１つの配列は整列から除去される。
例示的な具体例において、本発明は、整列内の冗長性を低下させるための新規な方法を提供する。そのような方法は所望の配列同一性カットオフの配列を見出し、ランク付けするための経験的アルゴリズムの使用を含む。そのような方法は以下の順次の工程：（１）整列中の配列の全ての対についてのパーセント同一性の計算；（２）同一性値のパーセント同一性の１以上のビンへのグループ分け；（３）非−ギャップ残基カウントを減少させることによる、および／またはＨｅｎｉｋｏｆｆ配列重みによる各ビンの配列のランク付け；および（４）カットオフ基準（例えば、％同一性カットオフレベル）による冗長配列の除去のうち１以上を含む。
冗長な配列の除去は多数の方法で行うことができる。１つの具体例において、ランク付けされた配列を配列同一性の多数のビンにグループ分けする（例えば、９９％ビン、９８％ビン、９７％ビン等）。次いで、配列を、最高％同一性ビンからのランク（例えば、最初の最高にランクされた配列）によって系統的に除去する（すなわち、９９％ビン、続いての９８％ビン、続いての９７％ビン等）。同一性の計算、グループ分けおよび／またはランキング工程（工程（１）ないし（３））を、カットオフ基準を満足する最終ビンが排除されるまで各除去工程の後に所望により反復される。もう１つの具体例において、ランク付けされた配列の単一ビンはカットオフ基準において作成されて、配列はビンからのランクによって系統的に除去される。同一性計算および／またはランキング工程（工程（１）および（３））は、所望により、各除去工程後に反復される。
好ましい具体例において、カットオフ基準は９０％以上（例えば、９１％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列相同性）である。特に好ましい具体例において、カットオフ基準は８０％以上である（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８７％、８８％、８９％、または９０％配列同一性）。
もう１つの任意の工程において、整列した参照組における配列の長さを切形することができる。１つの具体例において、整列内のギャップド領域を除去して、これらの情報性が低い領域についての計算を回避することができる。例えば、配列を見出すのに用いるＨＭＭプロフィールにおいてマッチ状態ではない行を除去することができる。もう１つの具体例において、整列のコンセンサス長さに重複する整列内の配列を切り取って、配列の突出部分を除去する。他の具体例において、重複配列を整列から除去する。
工程３：整列した組の共変動解析
一旦整列した組の配列が編集されたならば、共変動解析を、整列組におけるアミノ酸残基の１以上の次いで行う。共変動解析の結果、整列内の相関残基の統計学的有意性を記載する新規なデータベース（本明細書中においては、「共変動データ組」）の作成がもたらされる。ある具体例において、共変動データ組は、整列内の残基の各可能な対の間の相関をリストする。
好ましい具体例において、共変動の計算はコンピュータで実行されるプロセスである（例えば、Ｊａｖａ（登録商標）−実行可能プロセス）。共変動の計算の結果、いくつかの当該分野で認められた統計学的パラメーターがもたらされ得る。１つの具体例において、共変動の統計学的有意性（例えば、χ２−値）を、χ−自乗解析を用いて計算する。もう１つの具体例において、共変動の統計学的強度（例えば、φ値）が計算される。例えば、負のφ値は負の相関を予測できる。すなわち、整列中の最初の位置における１つのアミノ酸の存在は、第二の位置におけるもう１つの具体的アミノ酸の不存在に好都合である。逆に、正のφ値は正の相関を予測することができ、それにより、第一の位置におけるアミノ酸は第二の位置におけるアミノ酸の存在に好都合であることを示す。
１つの具体例において、φ値は式Ｉ：
Figure 0005374359
 を用いて計算され、式中、
ａｉｂｊは、各々、位置ｉおよびｊにおける同一配列で見出されるタイプ「ａ」または「ｂ」の剰余を掛け合わせた数であり；
Figure 0005374359
 は同一配列から存在しない双方の剰余タイプを掛け合わせた数であり；
Figure 0005374359
 は存在することが見出されるａと不存在であるｂを掛け合わせた数であり；および
Figure 0005374359
 は存在するａと存在しないｂを掛け合わせた数である。
１つの具体例において、φ値は以下の式ＩＩ：
Figure 0005374359
 を用いて計算され、式中、ｃないしｊは行列：
Figure 0005374359
 および
Figure 0005374359
 によって定義される。
ある具体例において、χ２−値は「出現の頻度」ベースの式を用いて計算することができる。他の具体例において、χ２−値は「事象−ベースの」式（すなわち、出現の数）を用いて計算される。例示的な事象−ベースの式は式ＩＩＩ：
Figure 0005374359
 として記載され、式中、ｐ（ｉ）およびｐ（ｊ）は配列の整列した組における、各々、位置ｉおよびｊにおける注目するいずれかの２つの剰余タイプの剰余頻度であり；
ｃ（ｉ，ｊ）は同一配列で観察されるｐ（ｉ）およびｐ（ｊ）を掛け合わせた数であり；および
ｃ（ｔ）は整列における合計配列の数であり；
ここに、剰余頻度は、整列中の特定の位置で観察される剰余タイプを掛け合わせた数を、整列中の配列の合計数で割ったものと定義される。
ある具体例において、天然アミノ酸残基のみが、共変動計算の目的で「剰余タイプ」と考えられる。しかしながら、好ましい具体例においては、剰余タイプは区別される剰余タイプとしてのギャップを含むことができる。というのは、（特にループ部分における）ギャップは、しばしば、１つのモチーフをもう１つのモチーフから区別するのを助ける。
ある具体例において、共変動計算は多様性重み付け関数（例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ重み付けスキーム）を含むことができる。
他の具体例において、配列平均同一性（ＳＡＩ）を用いて、共変動対を濾過することができる。例えば、ＳＡＩを用いて、平均を超える配列同一性を持つ対から共変動を濾過して、密接に関連する配列から生起する潜在的人工共変動を除去することができる。整列が高い同一性閾値（例えば、カットオフ基準として８０％同一性）によるキュレーションに付された具体例において、ＳＡＩ計算を好ましくは取り扱う。
ある具体例において、共変動対は、それらが最少数の回数観察されるのでなければ計算によって報告されない（本明細書中においては、「事象カットオフ」）。１つの具体例において、事象カットオフは１０以上の事象である。より好ましい具体例において、事象カットオフは約２以上、かつ１０未満の事象である（例えば、９、８、７、６または５事象）。
工程４：蛋白質安定性を予測するための共変動データの使用
ある具体例において、共変動データ組内の統計学的に有意な共変動を用いて、候補またはテスト配列内の対応する共変動についてサーチする。特に、候補またはテスト配列内の対応するアミノ酸位置における参照組の１以上の共変動アミノ酸の保存は、これらの残基が機能的に重要であって、好都合な蛋白質安定性を予測することを示す。従って、候補またはテスト配列内で保存された共変動アミノ酸の数を用いて、配列の安定性を予測することができる。
ある例示的な態様において、関連共変動は、共変動データ組の解析のために本発明のグラフユーザーインターフェイス（ＧＵＩ）（例えば、セクションＶ ｉｎｆｒａに記載されたＮＡＰＭＡＰツール）を用いて可視化することができる。共変動データ組におけるデータの解釈は面倒であり得る故にグラフユーザーインターフェイスはデータ解析を容易とし、迅速な蛋白質設計および機能解析を用意とすることができる。
例示的な具体例において、候補配列内に存在する、または存在しない参照組または整列内の共変動残基の存在または不存在を用いて、蛋白質安定性と相関するスコアを確率することができる。例えば、残基の共変動（例えば、正に共変動する）対が候補配列内に保持されていることが判明する場合、第一のスコア（例えば、正のスコア）を候補配列に割り当てることができる。逆に、残基の共変動（例えば、正に共変動する）対が候補配列から失われている場合、第一のスコア（例えば、負のスコア）に対する反対符号の第二のスコアを候補配列に割り当てることができる。１つの好ましい具体例において、テスト配列内の残基の負に共変動する対の不存在には正のスコアが割り当てられ、他方、残基の負に共変動する対の存在には負のスコアが割り当てられる。もう１つの好ましい具体例において、テスト配列の残基の正に共変動する対の存在には正のスコアが割り当てられ、他方、正に共変動する対テスト配列残基の不存在には負のスコアが割り当てられる。
ある具体例において、共変動スコアは、統計学的有意性の閾値レベルを満足する共変動についてのみ生じる。１つの具体例において、共変動スコアはあるχ２−値またはφ値を超える（または未満の）共変動についてのみ生じる。例えば、負の共変動スコアの指名に対するカットオフは、＋０．２未満（約＋０．２ないし約−１．０）、より好ましくは−０．２未満のカイ会合計数（Φ）を持つ共変動であり得る。もう１つの例示的な具体例において、もしそれが−０．２を超える、好ましくは＋０．２を超えるカイ会合計数を有すれば、共変動には正の共変動スコアが割り当てられる。好ましい具体例において、負の共変動スコアは、−０．５未満（例えば、−０．５、−０．６、−０．７、−０．８、−０．９、または−１．０）のカイ会合計数（Φ）に割り当てられ、正の共変動スコアは、＋０．５を超える（例えば、＋０．５、＋０．６、＋０．７、＋０．８、＋０．９、または＋１．０）カイ会合計数（Φ）を持つ共変動に割り当てられ、他方、全ての他の共変動は中性スコア（例えば、ゼロ）を割り当てることによってマスクされる。
ある具体例において、負または正の共変動スコアは、対応する共変動の統計学的有意性または強度を反映するように重み付けすることができる。１つの例示的な具体例において、もしそのカイ会合計数がやはり高いか、またはより低い正の共変動スコアのそのφ値が低いならば、正の共変動には高い正の共変動スコアを割り当てることができる。例えば、＋０．５および＋１．０の各φ値を持つ第一および第二の共変動を有する候補配列には第一の共変動についての低い正の共変動スコア（例えば、＋１）が、および第二の共変動についてのより高い正の共変動スコア（例えば、＋２）を割り当てることができる。
他の具体例において、共変動スコアは、計算された統計学的有意性以外の手段によって確証される共変動に対してのみ割り当てられる。いくつかの非−統計学的基準を用いて、計算された共変動が有意であって、生物学的に意義深いことを確証することができる。１つの具体例によって、共変動は、相互に共変動する残基と、対応する蛋白質の構造モデル内で相互に対するそれらの近接性との間に相関または傾向があるかを調べることによって確証される。もし該残基が構造中で相互に均質性が近い（例えば、３０Å以下、好ましくは１０Å以下）であれば、予測される共変動は真の共変動として確証される。もう１つの具体例において、共変動は、共変動するアミノ酸が、参照組の配列に対応する蛋白質のサブセット内に存在することが既に知られた連結（例えば、既知のジスルフィド結合）を形成するか否かを決定することによって確証される。例えば、ヒトまたはネズミＩｇＧ可変重鎖折畳みのＮ−末端における残基６ないし１０は、アミノ酸の共変動対の保存に基づいて非常に特異的な立体配座を採ることが知られている（Ｅｗｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３４：１８４−１９９（２００４））。
なお他の具体例において、候補配列におけるアミノ酸の共変動スコアは、満足される（または侵される）参照組または整列内の共変動の数を反映するように重み付けることができる。１つの具体例において、候補配列には、それが満足する参照組または整列内の各共変動についての正の共変動スコア、およびそれが侵す参照組内の各共変動についての負の共変動スコアが割り当てられる。好ましい具体例において、テスト配列の特別なアミノ酸についての共変動スコアは、負の共変動スコアの合計によって相殺される正の共変動スコアの合計である。例えば、２の負の共変動および９の正の共変動が、候補配列のアミノ酸に対応するアミノ酸位置における参照組内で観察された場合、候補配列アミノ酸には７の合計共変動スコアを割り当てることができる。
ある具体例において、合計共変動スコアが、候補配列（またはその部分）における全てのアミノ酸について合計され、「配列共変動スコア」が得られる。この配列共変動スコアを使用して、配列の安定性を予測することができる。一般に、負の配列共変動スコアは低い蛋白質安定性を予測し、他方、正の配列共変動スコアは高い蛋白質安定性を予測する。
ｂ．コンセンサススコアリング
他の具体例において、本発明の計算方法は、関連ポリペプチド配列のデータベースに対する候補ポリペプチド配列を比較する「コンセンサス−ベースのスコアリング」と呼ばれる新規なスコアリング技術を使用して、潜在的に低い安定性を持つ蛋白質を同定する。本明細書中で用いるように、「コンセンサス−ベースのスコアリング」とは、関連蛋白質の配列編集から利用可能な情報に基づく、蛋白質（例えば、テスト蛋白質）内の非−コンセンサスアミノ酸の数の計算をいう。該計算の結果、該蛋白質についての「コンセンサススコア」が得られる。後記実施例に示されるように、蛋白質のコンセンサススコアはその経験的に決定された蛋白質安定性とかなり相関する。従って、本発明の目的は、コンセンサス−ベースのスコアリングを使用して、蛋白質の安定性を予測することにある。コンセンサス配列からのテスト蛋白質配列の偏差がより大きければ、コンセンサススコアはより高くなり、かつテスト蛋白質はその安定性に有害なアミノ酸をより含有するようである。
本明細書中に記載された新規なコンセンサススコアリングアプローチにおいては、以下の基本的な工程を採用して、候補またはテスト蛋白質の安定性を予測する：
１．候補蛋白質（本明細書中においては、「テストドメイン配列」）のドメイン（またはその部分）の配列に対応する相同な配列の組（本明細書中においては、「参照組」）を供する。
２．コンセンサススコアを得るための、テストドメイン配列（またはその部分）内の各残基位置における残基頻度を決定する。
３．候補またはテスト蛋白質の安定性を予測するためにコンセンサススコアを用いる。
ある例示的な具体例において、以下の任意の工程を使用して、コンセンサススコアの予測値を増加させる：
４．平均スコアを得るために、参照組（またはそのサブセット）の各配列内における各対応する残基位置における残基頻度を決定する。
５．配列スコアを決定するために、コンセンサススコアを平均コンセンサススコアと比較する。
６．候補またはテスト蛋白質の安定性を予測するために配列スコアを用いる。
工程１：参照組の提供
本発明のコンセンサススコアリングベースの方法は、注目する配列または「テスト配列」に対して相同な（すなわち、それに関連する）配列の組（「参照組」）を使用する。参照組は、テスト配列に対して中程度または高度な同様性を有する相同配列の組を含むことができる。
相同配列の組は、当業者によって、適当な数の非−冗長配列を含めるように決定することができる。合理的に偏っていない選択が得られる限り、相同配列の組は大きい必要がない。それは配列の数ではなく、重要な頻度の比率である。
そのような配列は、当該分野で知られた配列データベース（例えば、ＮＣＢＩ、ＴＩＧＲデータベース）のいずれかの相同性−ベースのサーチを介して得ることができる。例示的な具体例において、デフォルトパラメータでの標準的なＢＬＡＳＴサーチをテスト配列で行って、注目する相同配列を検索することができる。配列同一性の最小パーセンテージ（例えば、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％を超える、好ましくは３０％を超える配列同一性）を持つ配列を、参照組に含めるために選択することができる。ある具体例においては、配列同一性の高い度合い（例えば、８５％、９０％、９５％、または９８％を超える配列同一性、好ましくは９５％を超える配列同一性）を持つ配列は参照組から排除して、偏りを回避する。
ある具体例において、参照組をキュレーションして、該組に含めるための１以上の基準を満足する配列のみを含めることができる。例えば、ある具体例において、参照組は、オルソログ配列（例えば、異なる種）（例えば、異なる哺乳動物種）からのものであるが、同一の生化学的機能を有する配列）を含むことができる。他の具体例において、参照組はヒト配列を含む。例示的な具体例において、相同配列の組や哺乳動物生殖系配列のみを含む。好ましい具体例において、参照組は、テスト蛋白質（例えば、免疫グロブリン−タイプ折畳みを有する蛋白質）に対して同一クラスの蛋白質折畳み（例えば、同様な蛋白質ドメイン）を有する蛋白質からの配列を含む。そのような蛋白質は当該分野で公知のバイオインフォーマティックス技術（例えば、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ ＨｅａｌｔｈのＣｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＤＤ）のサーチング）によって同定することができる。
工程２：テスト配列のコンセンサススコアの決定
参照組の配列が一旦編集されれば、参照組のコンセンサス配列を決定して、本発明のコンセンサススコアリング方法を容易とする。本明細書中で用いるように、用語「コンセンサス配列」とは、配列内の各位置における残基（例えば、アミノ酸残基）が関連配列の整列させた組（すなわち、参照組）におけるその位置の最も共通する残基に対応する配列をいう。
コンセンサス配列を決定するためには、参照配列内の配列を、まず、当該分野で知られた配列整列アルゴリズムを用いて整列させることができる。配列の比較で利用される局所的整列アルゴリズムの好ましい非限定的例は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８５８−７７におけるように修飾された、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−６８のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムはＡｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に取り込まれる。もう１つの具体例において、整列は適当なギャップを導入することによって最適化され、パーセント同一性が整列された配列の長さに渡って決定される（すなわち、ギャップド整列）。比較目的でのギャップド整列を得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されたように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。もう１つの具体例において、整列は、適当なギャップを導入することによって最適化され、パーセント同一性が整列させた配列（すなわち、グローバル整列）の全長に渡って決定される。配列のグローバル比較で利用される数学的アルゴリズムの非限定的例は、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列整列ソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に取り込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長さペナルティーおよび４のギャップペナルティーを用いることができる。
整列された参照の組のコンセンサス配列を決定するためには、整列した参照の組内の各位置における最も頻繁に起こる残基を決定する。コンセンサス配列は視覚により決定することができるか、あるいは公に入手可能なバイオインフォーマティックスプログラムを用いる計算解析によって決定することができる（例えば、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＨｅａｌｔｈのＨｅｌｉｘシステムから入手可能なＥＭＢＯＳＳ ＣＯＮＳツール）。
コンセンサス配列を本発明の方法で使用して、コンセンサススコアを決定する。ある具体例において、コンセンサススコアは、コンセンサス配列中の各アミノ酸位置におけるコンセンサス残基の参照組内での残基の頻度または出現（すなわち、「コンセンサス残基頻度」）テスト配列中の対応する位置におけるアミノ酸の参照組内での残基頻度または出現（すなわち、「テスト残基頻度」）と一致させる数値である。テストまたはコンセンサス配列内の位置における残基頻度は、整列させた参照組中の対応する位置に存在するその位置におけるアミノ酸の回数の数を合計し、次いで、合計された値を参照組内の配列の合計数で割ることによって計算される。例示的な具体例において、各アミノ酸位置におけるコンセンサススコアは、テスト残基頻度をコンセンサス残基頻度で割って、１および０の間の非−ゼロスコアを得ることによって計算される。例えば、その位置におけるコンセンサスアミノ酸と同一の残基には１の完全なスコアが割り当てられ、他方、コンセンサススコアが０に近づくと、その位置におけるアミノ酸は共通度が低くなる。
ある好ましい具体例において、コンセンサススコアは、テスト配列（またはその部分）の各位置について合計して、合計コンセンサススコアを得ることができる。例えば、完全な合計コンセンサススコアはテスト配列中のアミノ酸の数であり、テスト配列がその対応するコンセンサス配列と同一であることを示す。
蛋白質の合計コンセンサススコアを計算するための例示的な式は以下に記載される：
Figure 0005374359
 （式中、
ｃｉ（ｒ）はコンセンサス配列のアミノ酸位置におけるコンセンサス残基頻度と等しく、
ｈｉ（ｒ）はテスト配列のアミノ酸位置のテスト残基頻度と等しく、および
ｉはテスト配列内のアミノ酸位置の数と等しい）。
工程３：蛋白質安定性を予測するためのコンセンサススコアの使用
ついで、コンセンサススコアを使用して、テスト蛋白質の安定性を予測することができる。一般には、コンセンサススコアの値がより高ければ、テスト蛋白質がその意図した使用について適切な安定性を有するであろう確率はより大きくなる。ある具体例において、テスト蛋白質のコンセンサス配列は、対照配列のコンセンサススコアと比較することができる。１つの例示的な具体例において、対照配列は、貧弱なまたは望まない安定性特性を有することが知られた蛋白質（本明細書中においては、「陰性対照」）からのものである。従って、テスト蛋白質は、もしそのコンセンサススコアが陰性対照のそれよりも高いならば、改良された安定性を有すると予測される。もう１つの例示的具体例において、対照配列は、望ましい安定性特性を有することが知られた蛋白質（本明細書中においては、「陽性対照」）からのものである。従って、テスト蛋白質がもしそのコンセンサススコアが陽性対照のそれと実質的に同様であり、またはより高いならば、改良された安定性を有すると予測される。他の具体例において、テスト配列のコンセンサススコアは、テスト配列中のアミノ酸の合計数に対応する値である、その仮定完全コンセンサススコアと比較することができる。
工程４：参照組の平均コンセンサススコアの決定
ある具体例において、参照組内の配列のアミノ酸位置のいくつかまたは全てにおける平均コンセンサススコアは、テスト配列内の対応する位置におけるコンセンサススコアとの比較のために決定される。好ましい具体例において、参照組についての平均合計コンセンサススコアは、テスト配列の合計コンセンサススコアとの比較のために決定される。参照組についての平均合計コンセンサススコアは、参照組内の配列のすべてのアミノ酸位置についての残基頻度の合計を、参照組中の配列の合計数で割ったものである。
工程５：配列スコアの決定
ある具体例において、配列スコアは、参照組の平均コンセンサススコアをテスト配列のコンセンサススコアと比較することによって決定される。これらの値の差は、（本明細書中においては「Δスコア」とも言われる。テスト配列の「配列スコア」である。配列スコアは、平均コンセンサススコアからコンセンサススコアを差し引くことによって決定することができる。
工程６：蛋白質安定性を予測するための配列スコアの使用
配列スコアは、参照組の平均コンセンサススコアからのテスト配列のコンセンサススコアの偏差の尺度を提供する。後記実施例は、蛋白質の配列スコアが蛋白質の安定性（例えば、熱安定性）と高度に相関することを示す。従って、ある具体例においては、配列スコアを用いて、蛋白質の安定性を予測することができる。もし蛋白質のΔスコアが負の値であれば（すなわち、コンセンサススコアが平均コンセンサススコアよりも小さいならば）、予測は、注目する蛋白質の安定性が参照組内の蛋白質の大部分よりも低い安定性を有するであろうということである。
ある具体例において、本発明の方法で使用されるテスト配列は単一−ドメイン蛋白質である。本明細書中で用いるように、「単一ドメイン蛋白質」は１以上のドメインを含む蛋白質であり、ここに、該ドメインの各々は動物タイプのものである（例えば、可変重鎖（ＶＨ）ドメイン）。
他の具体例において、本発明の方法で使用されるテスト配列はマルチ−ドメイン蛋白質である。本明細書中で用いるように「マルチ−ドメイン蛋白質」は２以上のドメインを含む蛋白質であり、ここに、該ドメインの少なくとも２つは異なるタイプのものである。例えば、抗体は、典型的には、６つのドメイン（すなわち、ＶＨ、ＶＬ、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を含む蛋白質である。好ましい具体例において、マルチ−ドメイン蛋白質の最も安定でないドメインの安定性は、本発明の方法を用いて予測される。後記実施例は、本発明の方法は、マルチ−ドメイン蛋白質の最も低い安定性のドメイン（またはその部分）（例えば、抗体のＶＨドメイン）がテスト配列として使用される場合に、熱安定性を予測するのに特に効果的であることを示す。
もし最も低い安定性のドメインが先験的に知られていないならば、それは、（例えば、示差走査型熱量測定（ＤＳＣ）、温度依存性円二色（ＣＤ）、または蛍光測定のような前記した方法のいずれかを用いて）当該分野で知られた実験方法を用いて決定することができる。そのような方法は、最も低い安定性のドメインがまず折畳み解除され（図６９Ａ参照）、あるいは共同的に折畳み解除されるマルチドメイン（すなわち、単一の折畳み解除転移を呈するマルチドメイン蛋白質）の総じての安定性閾値を制限する多数の熱的折りたたみ解除転移の決定を可能とする。最も安定性の低いドメインは多数の更なる方法で同定することができる。突然変異誘発を行って、いずれのドメインが総じての安定性を制限するかを探ることができる。加えて、マルチドメイン蛋白質のプロテアーゼ耐性を、最も安定性が低いドメインがＤＳＣまたは他の分光学的方法を介して固有に折畳み解除されることが知られている条件下で行うことができる（Ｆｏｎｔａｎａ，ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｌｄ．Ｄｅｓ．，２：Ｒ１７−２６，１９９７）。一旦最も低い安定性のドメインが同定されれば、このドメイン（またはその部分）をコードする配列を本発明の方法においてテスト配列として使用することができる。
ある例示的具体例において、本発明の方法を用いて評価されたマルチ−ドメイン蛋白質は抗体である。本発明の方法は、当業者が、免疫系の多様性メカニズムによって作成された可変領域配列の膨大なプールの中からの不適切な可変領域ドメインの選択を排除するのを可能とする。例示的な具体例において、例えば、比較的高い安定性（例えば、熱的安定性）を持つ可変領域（Ｆｖ）ドメインを含むｓｃＦｖ分子または抗体分子は、本発明の方法を用いて同定し、選択することができる。他の例示的な具体例において、許容できる安定性を有するヒト免疫グロブリン可変領域（Ｆｖ）ドメインは本発明の方法を用いて同定し、抗体のヒト化におけるアクセプター免疫グロブリン鎖として用いるのに選択することができる。他の例示的な具体例において、本発明の方法を使用して、候補配列を含む結合分子の合成を進める前に、適当な安定性について、候補作製抗体可変領域（例えば、ヒト化ＶＬまたはＶＨ配列）をスクリーニングすることができる。
当該分野で知られたように、蛋白質の安定性が、天然または作製抗体の多くの可能な変異に基づいて１つの抗体ともう１つの抗体とで変化する。例えば、天然抗体の可変ドメイン内で多様性を作り出すための免疫系の選択圧は、組換え発現系においてそれらの安定性または折畳み性に負に影響しかねない（Ｋｎａｐｐｉｋ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｎｇ．，８：８１−８９，（１９９５）；Ｗａｌｌ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｎｇ，１２：６０５−１１（１９９９）；Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６，（２０００）；Ｅｗｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３２５：５３１−３３，（２００３））。ヒトＩｇＧ１が抗体治療剤で最も通常に使用され、同一イソタイプおよびサブクラスよりなる抗体は、それらの可変ドメインの差に主として基づいて相互から安定性が変化する。というのは、それらの配列の残りは同一だからである。抗体Ｆａｂ断片の熱的折畳み解除は、単一の見かけの転移において圧倒的に起こる。ほとんどの場合、抗体のＦｖ領域は、Ｆｖ（または単一ＶＨまたはＶＬ）安定性が極端に低いか、または極端に高く、かつＦｖ折畳み解除転移がＣＨ１／ＣＬ領域のそれから脱カップリングされる稀な場合を除いて、Ｆａｂの総じての熱安定性を制限する。（Ｓｈｉｍｂａ，ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｒoｔｈｌｉｓｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
ある具体例において、本発明の方法は、テスト配列として抗体の可変領域配列を使用する。ある好ましい具体例において、本発明の方法は、テスト配列として、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（またはその部分）を使用する。後記実施例は、ＶＨドメインが該ドメインを含む抗体の安定性をかなり予測することを示す。
ある具体例において、可変ドメインテスト配列を、可変ドメイン配列を含む、またはそれのみからなる参照組と比較する。該可変ドメインは、免疫グロブリン配列のＫａｂａｔデータベースから編集することができる（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｆｉｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，１９９２）。ある好ましい具体例において、参照組はヒト免疫グロブリン配列を含み、またはそれよりなることができる。
他の好ましい具体例において、参照組はヒト生殖系配列を含む、またはそれのみからなることができる。１つの具体例において、参照は抗体配列の同一Ｋａｂａｔサブクラスからの可変ドメイン配列を含む。
他の具体例において、可変ドメイン（例えば、ＶＨドメイン）の部分を抗体の方法においてテスト配列として用いる。例示的な可変ドメイン部分は、可変領域配列（例えば、ＣＤＲ３およびＦＲ４を除去するように切形されたＶＨ配列）のフレームワーク領域またはＣＤＲのすべて未満を含む配列である。１つの具体例において、ＶＨドメインはＶＨ１ Ｋａｂａｔ生殖系サブクラスのものである。他の具体例において、可変ドメイン配列はＶＨ２ Ｋａｂａｔ生殖系サブクラスのものである。もう１つの具体例において、可変ドメイン配列はＶＨ３ Ｋａｂａｔ生殖系サブクラスのものである。もう１つの具体例において、可変ドメイン配列はＶＨ４ Ｋａｂａｔ生殖系サブクラスのものである。もう１つの具体例において、可変ドメイン配列はＶＨ５ Ｋａｂａｔ生殖系サブクラスのものである。もう１つの具体例において、可変ドメイン配列はＶＨ７ Ｋａｂａｔ生殖系サブクラスのものである。
本発明の方法は、当該分野で知られた蛋白質で使用することができる。１つの具体例において、蛋白質は抗体またはその部分である。ある具体例において、抗体はヒト化抗体である。他の具体例において、抗体はヒト抗体である。他の具体例において、抗体は非−ヒト抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）である。他の具体例において、抗体は単一−ドメイン抗体である（例えば、ラクダ、サメ、ヒト）。なお他の具体例において、抗体はキメラ抗体である。本発明の方法で用いられる他の例示的な修飾された抗体は、ドメイン−欠失抗体および二特異的結合分子を含む。他の例示的な抗体は、ｓｃＦｖ−含有抗体または前記した修飾された抗体を含む。好ましい具体例において、前記した結合蛋白質の安定性は、本発明の方法におけるテスト配列としてその重鎖可変配列（またはその部分）を用いて評価される。
本発明の１つの具体例において、与えられたポリペプチドで得られたデータは貯蔵され、あるいはポリペプチドの能力の尺度として出力される。１つの具体例において、本発明で記載された方法は複数のポリペプチドについて反復することができる。１つの具体例において、ポリペプチドの選択は、得られたデータに基づいてなすことができる。もう１つの具体例において、選択されたポリペプチドは治療用途で処方することができる。
ＩＶ．増強された生物物理学的特性（例えば、蛋白質安定性）を持つ蛋白質を切形／生産する方法
（ａ）共変動設計
もう１つの態様において、本発明は、共変動解析の結果を用いて、それが由来する親分子に対して増強された生物物理学的特性を持つ蛋白質変種を設計する方法を提供する。多くのタイプの蛋白質エンジニアリングの努力があり、そこでは、共変動データを用いて、限定されるものではないが、増強された蛋白質安定性設計ｐＨ折畳み解除プロフィールの修飾、グリコシル化の安定な除去、および生化学的機能の改変を含めた設計を容易とすることができる。
ある具体例において、本発明は、前記セクションＩＩＩの方法に従って、増強されたまたは低下した蛋白質安定性を予測する共変動スコア（または共変動それ自体）の同定に基づいて、増強された安定性設計の蛋白質を設計する方法を提供する。例えば、もし注目する蛋白質に属する配列が失われているか、またはいくつかの鍵となる共変動を侵すならば、蛋白質設計はこれを修正するようになすことができる。また、単一配列内で観察される計算された数の強力な共変動を改良する修飾も含めることができる。
多数の設計が、ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ ＶＨおよびＶＬドメインを安定化するために開発されてきた。特に、２つのｓｃＦｖ ＢＨＡ１０ドメインについての初期のライブラリースクリーング結果は、蛋白質安定性設計のための共変動解析ツールの能力を確証する。最初の例は、熱的挑戦アッセイによって測定して、熱安定性の有意な改良（＋１０℃のΔＴ５０）を付与するＢＨＡ１０ ＶＬドメイン内の安定化突然変異（Ｓ４６Ｌ）の成功した予測を含む。位置４６（Ｋａｂａｔナンバリングシステム）におけるＳｅｒからＬｅｕへの突然変異は、該ツールがＬｅｕ ４６と強く共変動を示す残基３６における現存Ｔｙｒへの正の連結に導く（図７８）。Ｃｏｖａｒｉａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌの利用性の第二の例は、ＢＨＡ１０ ＶＨ Ｑ６Ｅ突然変異の負の効果の分析的同意である。単一残基頻度解析は、この位置におけるかなりより多くの通常に観察されるＧｌｕに対する突然変異が安定性の増加に導くことを示唆する。しかしながら、Ｃｏｖａｒｉａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌは、Ｇｌｕに対する単一の突然変異がＢＨＡ１０ ＶＨ配列内に存在するいくつかの現存共変動を侵すことを示した。安定性の改良を得るためには、この位置において優先的にＧｌｕを安定化するいくつかのアミノ酸を置換えなければならない。
Ｃｏｖａｒｉａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌの予測値のもう１つの例は図７９に示す。Ｍｅｔ８０は、単一残基ライブラリー設計の一部としてＬｅｕへ突然変異した。この単一の突然変異はかなり安定性であろうと考えられた。というのは、Ｌｅｕは配列データベース内でこの位置に観察される最も頻繁なアミノ酸だからである。しかしながら、共変動解析は、２つの他のアミノ酸を突然変異させて（Ｖ６７ＦおよびＴ７０Ｓ）、共変動ハーモニーを達成することを示す。
（ｂ）インターフェイス設計
なお他の態様において、本発明は、合理的設計のための鋳型蛋白質として第一の蛋白質を用い、第二のまたは候補の蛋白質（例えば、抗体）の生物物理学的特性（例えば、蛋白質安定性）を増強させる方法を提供する。
本明細書中で用いるように、用語「鋳型蛋白質」とは、やはり望ましい生物物理学的特性の改良のために第二の蛋白質において同一特性をモデル化するのに用いられる望ましい生物物理学的特性（例えば、高蛋白質熱安定性）を持つ蛋白質をいう。好ましい具体例において、鋳型蛋白質は第二の蛋白質として同一構造クラスのものである（例えば、もし第二の蛋白質が抗体であるならば、抗体は鋳型蛋白質として使用される）。
ある具体例において、鋳型蛋白質は、本発明の方法に従って望ましい生物物理学的特性（例えば、蛋白質安定性）を有するものとして同定される。１つの例示的な具体例において、望ましい安定性特性を持つ鋳型蛋白質は、実施例１５に記載されたもののような実験方法を用い、（前記表２０に記載されたＢＩＩＢ１−４のような）蛋白質の群から同定されているであろう。この鋳型蛋白質は、次いで、設計のための配列プラットフォームとして働く。１つの例示的な具体例において、鋳型蛋白質は、前記にて概説した本発明の共変動解析方法によって改良された生物物理学的特性（例えば、蛋白質熱安定性）を有すると予測される。他の例示的な具体例において、鋳型蛋白質は、前記にて概説したコンセンサススコアリング方法に従って、望ましい蛋白質（例えば、安定化された蛋白質）であると予測される。なおもう１つの例示的な具体例において、鋳型蛋白質は、本発明のスクリーニング方法に従って同定される。
他の具体例において、鋳型蛋白質は、本発明の方法に従って設計された蛋白質である。１つの例示的な具体例において、鋳型蛋白質は、本発明の共変動方法に従って、改良された生物物理学的特性（例えば、増強された蛋白質安定性）を有するように設計された。もう１つの例示的な具体例において、鋳型蛋白質は、コンセンサススコアリング方法に従って、改良された生物物理学的特性を有するように設計される。
本発明のこの態様の方法は以下の工程を含む：
（１）鋳型蛋白質および候補蛋白質の構造的モデルを供する；
（２）安定性について重要な鋳型蛋白質中の残基を同定する；および
（３）重要な残基鋳型蛋白質に対応する候補蛋白質中の残基を置換する。
１つの具体例において、鋳型蛋白質構造モデルは結晶構造（例えば、Ｘ−線結晶構造）であって、候補蛋白質は、鋳型蛋白質の構造モデルを用いる相同性モデリングによって成型される。もう１つの具体例において、重要な残基はＶＨ／ＶＬ界面残基である。本明細書中で用いるように、「界面残基」は、蛋白質内で、または蛋白質の中で、ドメイン−ドメイン相互作用に参画する残基である。好ましくは、界面残基は境界、すなわち、２つの蛋白質ドメインの間の「界面」に存在し、その界面領域を、ドメインの少なくとも１つ（好ましくは双方）に寄与させる。界面における他のものよりも有意により多くの表面領域に埋もれた残基、すなわち、折畳まれた蛋白質の表面に対してそれらの表面領域の有意により多くを露出させない残基は、界面安定性に対してより重要であると考えられる。各残基が界面に寄与する表面領域は、当該分野で認められた技術（例えば、ＭＯＬＭＯＬソフトウェアを用いる解析）を用いて決定することができる。ある具体例において、界面残基は少なくとも１０Å２の表面積（例えば、埋もれた表面積の１０Å２、１５Å２、２０Å２、２５Å２以上）が埋もれている。
鋳型蛋白質の重要な残基（例えば、埋もれた界面残基）のものに対応するアミノ酸位置に局在する候補蛋白質は、もしそれらが非−同一タイプのものであれば好ましくは置換される。ある具体例において、非−保存的置換のみがなされる。他の具体例において、保存的置換のみがなされる。
例示的な具体例において、鋳型および候補蛋白質が結合分子（例えば、抗体またはその変種（例えば、ｓｃＦｖ分子））である。１つの具体例において、調べられる界面は、１つのＦｃドメイン（例えば、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３）およびもう１つのＦｃドメインの間のものである。もう１つの具体例において、界面は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインの間に形成されたものである。
好ましい具体例において、設計は抗体のＶＨおよびＶＬドメインの間の界面に集中される。生物物理学的データ（ＤＳＣデータ−実施例１５参照）は、相互に対するＶＨおよびＶＬの親和性はｓｃＦｖフォーマットでは（すなわち、ＦａｂのＣＨ１およびＣＬドメインの不存在下では）少ない。特に、ＶＨおよびＶＬ相互作用は常には十分に強くない（すなわち、協働的に折畳まれた単一体に導く十分な親和性を有しない。従って、ＶＨ／ＶＬ界面の安定性の改良（すなわち、ＶＨおよびＶＬドメインの間の親和性の増大）は、抗体／ｓｃＦｖ安定性の増強に対して好ましい経路であり得る。界面を安定化することによって、抗体の折畳み転移を単一の事象に転換させ、相互に対するドメインの親和性を生起させ、および（ＡＮＳ−結合実験によって観察されるように）露出された親水性表面領域に導き得るあまり動的でない変動を可能とする。
なお他の具体例において、設計は、当業者がＶＨおよびＶＬの間の真実の親和性増加を非−定量的に観察するのを可能とする示差走査型熱量測定（ＤＳＣ）実験を用いて確証することができる。
（ｃ）組み合わされた共変動および界面設計
本発明のなお他の態様において、本明細書中で記載された配列ベースの設計ツールの２以上を、最適化された蛋白質変種の設計のために使用することができる。１つの例示的な具体例において、界面設計を共変動解析と共に使用して、例えば、蛋白質安定性を含めた蛋白質構造および機能で重要な残基または複数残基位置を決定する。１つの例示的な具体例において、共変動分析を用いて、反対ドメイン上の界面残基と物理的に相互作用しないか、あるいは表面領域を界面に寄与させないが、それにも関わらず、界面残基のための適切な構造的関連を供するのに重要な界面外部の複数残基または残基位置（本明細書中においては、「足場残基」という）を決定する。例えば、共変動解析は、界面残基と共に変動する足場残基を同定するために界面内に位置する残基で行うことができる。好ましくは、表面領域のかなりの程度に埋もれる界面残基（例えば、少なくとも４０Å２の表面領域が埋もれる残基）は共変動解析のために選択される。次いで、本発明の共変動方法を用い、選択された界面残基と共に変動する足場残基が同定される。好ましくは、強く共変動する（例えば、少なくとも０．２５のカイ−値）足場残基が選択される。もう１つの好ましい具体例において、足場残基は、もしそれらが少なくとも２つの界面残基（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の界面残基）と共変動するならば、その残基が選択される。共変動の数が大きくなれば、共変動スコアは足場残基により高く帰すことができる。というのは、共変動の数は、ＶＨ／ＶＬ界面の安定化に対する足場残基によってなされる貢献を予測する。
本発明のこの態様の方法は以下の工程を含む：
（１）鋳型蛋白質および候補蛋白質の構造的モデルを供し；
（２）安定性に重要である鋳型蛋白質中の界面残基（例えば、ＶＨ／ＶＬを同定し；
（３）例えば、本明細書中に記載された共変動解析ツール（Ｃｏｖａｒｉａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓツール）を用い、工程（２）の界面残基と共変動する足場残基を同定し；
（４）候補蛋白質中の１以上の界面残基または足場残基を、工程（２）および（３）で同定された対応する残基または足場残基で置換する。
鋳型蛋白質の重要な残基（例えば、界面または足場残基）のものに対応するアミノ酸位置に位置した候補蛋白質の残基は、もしそれらが非−同一タイプのものであれば好ましくは置換される。ある具体例において、非−保存的置換のみがなされる。他の具体例において、保存的置換のみがなされる。
本発明の１つの具体例において、与えられたポリペプチド改良された配列は貯蔵され、または出力される。もう１つの具体例において、選択されたポリペプチドを治療的用途のために処方することができる。
Ｖ．システム、界面、およびコンピュータ実行方法
本発明の１つの態様は、本発明の選択または設計方法を実行するための方法（例えば、コンピュータ実施方法）、装置、およびソフトウェアに関する。例示的な具体例において、本発明は、候補配列中のアミノ酸残基（例えば、共変動アミノ酸残基）を同定するためのコンピュータ実施方法および装置を提供する。もう１つの具体例において、本発明は、生物物理学的特性（例えば、蛋白質安定性、触媒活性、治療活性、病原体またはトキシンに対する耐性、毒性など）を予測するスコア（例えば、コンセンサススコアまたは共変動スコア）によって１以上のテストまたは候補配列をランク付けするためのコンピュータ実施方法および装置を提供する。
コンピュータ実施方法の態様は、以下の操作（ａ）参照組およびテスト配列を特徴付けるデータ（例えば、配列または構造データ）を受け取り；（ｂ）該データから、スコア（例えば、共変動スコアまたはコンセンサススコア）を計算し；（ｃ）該スコアをランク付けして、注目する１以上の配列またはアミノ酸残基を同定する；の配列によって記載することができる。
いくつかの具体例において、スコアをランク付けして、テストまたは候補配列中に固定されたままである１以上のアミノ酸残基を同定する。他の具体例において、スコアをランク付けして、置換のための候補である１以上のアミノ酸残基を同定する。１つの例示的な具体例において、コンピュータ実施方法は、共変動スコアの順番で残基１（またはある位置における特異的残基）をランク付けする。もう１つの例示的な具体例において、コンピュータ実施方法はコンセンサススコアの順番で候補配列をランク付けする。
本発明のなおもう１つの態様は、前記した方法を実施するためのプログラム指令および／またはデータの配置が供される装置およびマシーン読取可能媒体に関する。頻繁には、プログラム指令はある方法操作を実行するための暗号として供される。データは、もし本発明の特徴を実施するのに使用されるならば、データ構造、データベース表、データ目的、または特定の情報の他の適切な配置として供することができる。本発明の方法またはシステムのいずれかを、マシーン読取可能媒体で供されたそのようなプログラム指令および／またはデータとして全部または一部を表することができる。
本発明のコンピュータ実施方法は、ユーザーに情報を提示する出力デバイス（例えば、ＣＲＴディスプレイ、ＬＣＤ、プリンタ、モデム、オーディオ出力などのような通信デバイス）を含むことができる。加えて、計算を実行するための指令（例えば、アルゴリズム）は、部分的に、または全部が、指令を実行するためのエレクトロニックデバイスで用いるのに適した媒体に付与される。かくして、本発明の方法は、ソフトウェア（例えば、コンピュータ読取可能指令）を含む高スループットアプローチ、およびハードウェア（例えば、コンピュータ、ロボットおよびチップ）に使用できる。コンピュータ実施プロセスは特定のコンピュータプラットフォーム、特定のプロセッサ、または特定の高−レベルプログラミング言語に制限されない。
ある具体例において、本発明の方法で用いる計算は、コンピュータプログラミング言語（例えば、ＰＥＲＬで用いるのに適したコンピュータアルゴリズムによって実施される。例示的な具体例において、コンピュータアルゴリズムは、（ｉ）参照組の配列整列、および／または（ｉｉ）アルゴリズムのための入力としての１以上のテスト配列を認識するように設計される。
（ｉ）コンピュータ実施コンセンサスソーティング
１つの態様において、本発明は、コンピュータ実施アルゴリズムを用いて前記した本発明のコンセンサススコアリング方法を実行するためのコンピュータ実施方法、装置およびソフトウェアに関する。例示的な具体例において、アルゴリズムは、以下の工程：（１）整列の各残基位置を行として切り出し、その位置におけるコンセンサス残基頻度を計算し；（２）テスト配列の各残基位置を切り出し、その位置におけるテスト残基頻度を計算し、次いで、（３）テスト残基頻度をコンセンサス残基頻度で割って、コンセンサススコアが得られ；および／または（４）各位置におけるコンセンサススコアを合計して、合計コンセンサススコアを得る；の１以上を実行するように設計される。他の具体例において、アルゴリズムは、以下のさらなる工程：（５）参照組の平均コンセンサススコアを計算し、および／または（６）テスト配列の配列スコアを計算する；の１以上を実行するように設計することができる。
本発明のこれらの態様は、本発明のコンセンサススコアリング方法を実行するためのシステムにおいても具現化される。該システムは（ａ）参照組の少なくとも１つの集団を貯蔵することができるデータベースを含むコンピュータ、および（ｂ）システムソフトウェアを含む。システムソフトウェアは、コンピュータ実施コンセンサススコアリング方法の工程（１）ないし（６）のいずれかを実行するための１以上のロジック指令を含む。
また、本発明は、本発明のコンセンサススコアリング方法を実行するためのコンピュータプログラム製品も提供する。コンピュータプログラム製品は、工程（１）ないし（６）のいずれかを実行するための１以上のロジック指令を有するコンピュータ読取可能媒体を含む。
（ｉｉ）コンピュータ実施共変動解析
本発明のもう１つの態様は、コンピュータ実施アルゴリズムを用いて前記した本発明の共変動解析方法を実行するためのコンピュータ実施方法に関する。例示的な具体例において、該方法は以下の工程：（１）整列した組の各残基位置を行として切り出し；（２）行を行列中に配置し；（３）行列中の種々の行内の相関を計算して、相関項を誘導し；（４）相関項を、アミノ酸残基に対応する線形項に加えて、拡大したプレディクター行列が得られ；（５）拡大されたプレディクター行列から経験的に誘導されたモデル（例えば、隠れたＭａｒｋｏｖモデル）を作製して、重要な相関を同定する；の１以上を実行する。
本発明のこれらの態様もまた、本発明の共変動解析方法を実行するためのシステムに具現化される。該システムは（ａ）キャラクターストリングライブラリーの少なくとも１つの集団を貯蔵することができるデータベースを含むコンピュータ；および（ｂ）システムソフトウェアを含む。該システムソフトウェアは、コンピュータ実施方法共変動スコアリング方法の工程（１）ないし（５）のいずれかを実行するための１以上のロジック指令を含む。
また、本発明は、本発明の共変動スコアリング方法を事項するためのコンピュータプログラム製品も提供する。該コンピュータプログラム製品は、工程（１）ないし（５）のいずれかを実行するための１以上のロジック指令を有するコンピュータ−読取可能媒体を含む。
（ｉｉｉ）共変動解析用のグラフユーザーインターフェイス
ある例示的な態様において、本発明は、本発明の共分散方法で用いられる新規なグラフユーザーインターフェイス（ＧＵＩ）を提供する。ＮＡＰＭＡＰといわれるこの共変動解析ツールは、配列の整列させた組の関係で共変動を可視化するにおいてユーザーを助ける。新規なグラフユーザーインターフェイスは、（例えば、Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．ｏｒｇからの処理ライブラリーを利用するＪａｖａ（登録商標） １．４．２において）当該分野で認められたプログラミング言語を用いて実行されるコンピュータである。
（ａ）グリッドレイアウト
１つの具体例において、本発明のグラフユーザーインターフェイスは、整列（例えば、前記した本発明の方法に従って作り出された配列整列）またはそれに対応するデータのグラフ表示を含む。このディスプレイの単純な形態はグリッドレイアウトである。本明細書中で用いるように、（整列プラットフォームとしても知られた）用語「グリッドレイアウト」とは、整列の特性が表される行列をいう。１つの具体例において、グリッドレイアウトは整列の配列の残基位置をグラフで表す。もう１つの具体例において、グリッドレイアウトは整列内の配列の残基タイプをグラフで表す。もう１つの具体例において、グリッドレイアウトは、整列内の残基タイプの頻度（または「残基用法頻度」）をグラフで表す。なお他の具体例において、グリッドレイアウトは整列内の残基の１以上の特性（例えば、疎水性、電荷、サイズ、ｐＫａなど）を表す。
ある例示的な具体例において、グリッドレイアウトは（ｉ）整列の配列に対応する連続残基位置；および（ｉｉ）整列配列の各残基位置における残基タイプについての残基用法頻度の代表的ディスプレイを含む。１つの具体例において、残基用法頻度は（例えば、丸または四角によって）記号で描かれる。他の具体例において、すべての２０の天然アミノ酸、ギャップ、および曖昧な残基が表される。ある具体例において、残基位置は列に表示され、残基用法頻度は行に表示される。ある具体例において、残基位置は行に表示され、残基用法頻度は列に表示される。
ある具体例において、残基使用頻度は、より多くの保存された残基がより頻度を低く観察される残基から区別できるように記号のサイズ（例えば、丸のサイズ）と相関させる（例えば、正にまたは負に相関させる）。例えば、残基頻度はその用法の頻度に比例した丸の面積を持つ種々のサイズの丸として表すことができる。各丸の半径（Ｒ）は、以下の式（ＩＶ）：
Figure 0005374359
 （式中：
Ａ＝全ての節の所望の平均面積
Ｎ＝この残基を用いる配列の数
Ｍ＝各残基を用いる配列の平均数）
に従って計算された楕円関数を用いて節を描くのに用いることができる。
例示的な具体例において、グリッドレイアウトは連続行および列の行列を含み、ここに、（ｉ）連続行は整列の対応する連続残基位置をグラフで表し；（ｉｉ）連続列の各々は特異的アミノ酸タイプをグラフで表し；および（ｉｉｉ）各残基位置における残基用法頻度は行列の各セルにおいてグラフで表される。好ましくは、全ての残基タイプ（例えば、全ての２０のアミノ酸および／または可能なギャップ）はグリッドレイアウト中に置いて別々の列によって表される。より好ましくは、整列の各残基位置における残基用法頻度は、そのサイズが残基用法頻度に相関する（例えば、正に相関する）記号（例えば、丸）で行列の各セルにおいてグラフにより表される。例示的なグリッドレイアウトは図７６に描かれる。
（ｂ）共変動オーバーレイ
他の態様において、本発明のグラフユーザーインターフェイスは、１以上の共変動（例えば、前記本発明の方法に従って同定された共変動）またはそれに対応するデータのグラフ表示を含む。
ある具体例において、本発明のグラフユーザーインターフェイスは（ｉ）グリッドレイアウト；および（ｉｉ）１以上の共変動双方のグラフ表示を含む。これらの具体例において、グリッドレイアウトは共変動データの表示のための整列プラットフォームとして働くことができる。共変動データは、例えば、グリッドレイアウトに共変動データを重ねることによって表示することができる。このようにして配置された共変動データを「共変動オーバーレイ」と言われる。例えば、共変動は、グリッドレイアウト内にグラフで描かれる２以上の共変動アミノ酸を連結する線または線のネットワークとして共変動オーバーレイに描くことができる。
２以上の共変動アミノ酸の間の連結がユーザーに明らかな限り（例えば、共変動が２つの共変動アミノ酸を連結する半透明棒線として描かれる図７７参照）、共変動オーバーレイの線は種々の厚み（例えば、薄い線または棒線）または連続性（例えば、ダッシュ線または実線、直線またはギザギザ線）のものとすることができる。ある例示的な具体例において、共変動のグラフ表示は、さらに、共変動の統計学的有意性を表すことができる（例えば、そのφまたはχ２−値）。１つの例示的な具体例において、共変動オーバーレイ内の線の厚みは共変動の統計学的有意性に比例させることができる。例えば、共変動オーバーレイの線の厚みは式Ｖ：
Figure 0005374359
 （式中：
Ｗ＝線の厚み
Φ＝ファイ（相関係数）
Ｎ＝強調定数
Ｍ＝最大線の厚み）
に従ってφ値に比例させて描くことができる。
もう１つの例示的な具体例において、正および負の共変動は（例えば、異なる色の線または厚みによって）相互からグラフ的に区別することができる。なお他の例示的な具体例において、統計学的有意性のある閾値レベルを超える共変動のみをユーザーに表示する。例えば、ある具体例において、φ値のカットオフを適用して、所望の相関強度を持つ共変動のみを見ることができる。
（ｃ）配列トレース
他の任意の態様において、グラフユーザーインターフェイスは、注目する配列のグラフ表示を含んで、可能な蛋白質設計努力を助ける。注目する配列はテストまたは候補配列（すなわち、入力配列）とすることができるか、あるいはそれは望ましい共変動が一体化される配列とすることができる（すなわち、出力配列）。注目する配列は線としてグラフ表示することができる。
１つの具体例において、グラフインターフェイスは（ｉ）注目する配列の表示；および（ｉｉ）グリッドレイアウト双方を含む（例えば、注目する配列はグリッドレイアウトに重ねられる）。もう１つの具体例において、グラフインターフェイスは（ｉ）注目する配列の表示；および（ｉｉ）共変動オーバーレイ双方を含む（例えば、注目する配列は共変動オーバーレイに重ねられる）。なお他の具体例において、グラフインターフェイスは（ｉ）注目する配列の表示；（ｉｉ）共変動オーバーレイ；および（ｉｉｉ）グリッドアウトを含む（例えば、注目する配列はグリッドレイアウトに重ねられる共変動オーバーレイに重ねられる（例えば、トレースされる））。
注目する配列は、例えば、グリッドレイアウト内にグラフで描かれる隣接アミノ酸を連結する曲線としてグリッドレイアウトに表示することができる。このようにして表示された注目する配列は「配列トレース」と言われる。好ましい具体例において、配列トレースは、特定の残基位置を表すグリッドレイアウトの特定の行または列についてただ１つのセル（またはアミノ酸タイプのグラフ表示）を通り、またはそれを通って進むべきである。より好ましくは、配列トレースは、注目する配列内の特定の残基位置に出現する残基タイプをグラフで表すセルを通過する。配列トレースが注目する配列内の残基を表すグリッドレイアウトの各セルを通過できるか、あるいはそれは注目する配列の部分を現すセルのみを通過することができる。注目する配列の例示的な配列トレースは図７７に描く。そこで描かれた配列トレース（カットマルーロム（ｃａｔｍｕｌｌ−ｒｏｍ）スプライン）はベジエ関数を用いて描かれた。配列転移ベジエ曲線を描くための２つの説を仮定すれば、説対の従前のおよび次の説はアンカー点として用いられ、２つの説それ自体は第一および第二の制御点として用いられる（アミノ酸配列の最初の残基を表す）第一の列中の説については、第一の制御点はそのアンカー点として二倍となり；最後の行中の説については、その第二の制御点はそのアンカー点として二倍となる。
好ましい具体例において、配列トレーサープロットはユーザーによる操作のために対話形式とされる。例えば、グリッドレイアウト内のセルはユーザーによる選択のために対話形式とすることができる。１つの具体例において、選択されたセルには特定の選択状態（例えば、正、中性、または負選択状態）を割り当てることができる。１つの例示的な具体例において、特定の残基を現すセルは、配列トレースが再度トレースされて、選択されたセルを通過できるようにユーザーによって正に選択できる。例えば、もしセルがユーザーによって負に選択されれば、正に選択されたセルによって表される残基を使用する注目する全ての配列（例えば、参照組または整列内の全ての配列）について多数の配列トレースを生じさせることができる。代替具体例において、特定の残基を表すセルは、配列トレースが選択されたセルを通過しないようにユーザーによって負に選択することができる。したがって、配列トレースは、負に選択されたセルによって表される残基を排除する注目する各配列（例えば、参照組または整列内の全ての配列）について配列トレースを生じさせることができる。
（例えば、異なる線の厚みまたは連続性を用いて）それらがユーザーによって区別できる限り、注目する多数の配列をグラフ表示することができる。例えば、異なる配列整列を比較するために、２以上の整列からの注目する多数の配列を表す配列トレースは、（例えば、異なる色、好ましくは反対の色で）グリッドレイアウト上に重ねて、グローバルスケールの異なる残基用法の可視化を可能とすることができる。
（ｄ）表示モード
グラフユーザーインターフェイスはいずれの当該分野で認められた機能性も容易とすることができる。例えば、ある具体例においては、グラフユーザーインターフェイスはグリッドレイアウトの異なる部分に対して流し撮り、またはズーミングすることができる。例えば、グリッドレイアウトのビューポートサイズは、ユーザーのコンピュータスクリーンの分解能に依存して変化させることができ、可視化は、ビューポートにおいて最初はフィットしない整列を見るためにズーミング、または流し撮りすることができる。
異なる具体例において、データマスキングを使用して、例えば、最も重要な共変動対および／またはいくつかの対を横切ってのネットワークを強調する。本発明のグラフユーザーインターフェイスは、共変動（例えば、統計学的に有意な共変動）を見るために１以上の表示モードを使用することができる。好ましくは、該表示モードは、注目する配列の配列トレースを見る場合に対話形式プロットで利用可能である。例示的なビューワーモードは以下の通りである：
ビューワーモード＃１：注目する配列にやはり存在する残基の間の共変動のみを表示する。これらの共変動は、対応する蛋白質分子を一緒に保持し、機能について重要であり得る仮定された残基−残基相互作用（例えば、統計学的残基対頻度解析によって見出されたもの）と考えることができる。
ビューワーモード＃２：表示される唯一の共変動は、注目する配列に存在する残基対のただ１つの残基を有する残基対の間のものである。これらの共変動は、保存される傾向があるが、注目する配列に存在せず、かつその不存在が蛋白質安定性に対して有害であり得る残基−残基相互作用である。このビューワーモードは、共変動解析ツールを蛋白質の設計のために使用する場合に特に好ましい（前記セクションＩＶ参照）。
ビューワーモード＃３：表示される唯一の共変動は、注目する配列に存在するいずれのアミノ酸数の共変動対も有しない残基対の間のものである。
ある具体例において、全てのビューワーモードはユニークな表示フォーマットにて各々を除いてユーザーに表示される。もう１つの具体例において、全てのビューワーモードは（例えば、別々の表示ウィンドウにおいて）別々に表示される。
図８９は、本発明の具体例を実施するのに適した例示的な環境を描く。計算デバイス８９００は初期配列収集プロセス８９０２および解析施設８９０４を支持する。計算デバイス８９００はワークステーション、サーバー、ラップトップ、メインフレーム、ＰＤＡ、あるいは１以上のプロセッサを装備した他の計算デバイスであってよく、初期配列収集プロセス８９０２および解析施設８９０４を支持することができる。計算デバイス８９００は単一のプロセッサまたは多数のプロセッサを有することができ、プロセッサのおのおのは１つのコアまたは多数のコアを有することができる。解析施設８９０４は、ソフトウェアにて実施され、整列内の残基の対の間の共変動をプログラムにより解析して、共変動データを得る。計算デバイス８９００は出力表示デバイス８９１０に連絡しており、それに対してデータを出力する。出力表示デバイス８９１０は、解析施設８９０４によって生じたグラフユーザーインターフェイス（ＧＵＩ）８９１２を表示する。該ＧＵＩ８９１２はグリッドレイアウト８９１４および共変動オーバーレイ８９１６を含むことができる。計算デバイス８９００もまた、各々、配列データ８９３２および８９４２を保持する１以上の貯蔵ロケーション８９３０および８９４０を備えたネットワーク８９２０上に連絡することもできる。初期配列収集プロセス８９０２は、ユーザー−供給および／または所定のパラメーターに基づいて、配列データ８９３２および８９４２からの候補配列をプログラムにより検索する。検索された配列データは解析施設８９０４によって解析される。初期配列収集プロセス８９０２および解析施設８９０４は図８９においては別々に描かれているが、それらは統合された適用、プロセスまたはプラグ−インの一部として実施することができるのは当業者によって認識されるであろう。同様に、初期配列収集プロセス８９０２および解析施設は、各々、別々にタスク、スレッド、プロセス、適用またはプラグ−インであってよいのは認識されるべきである。計算デバイスコンピュータ８９００は、多数の異なる媒体および立体配置を用いて、貯蔵ロケーション８９３０および８９４０を備えたネットワーク８９２０上に連絡することができる。例えば、ネットワーク８９２０はＬｏｃａｌ Ａｒｅａ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＬＡＮ）、またはＷｉｄｅ Ａｒｅａ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＷＡＮ）、イントラネット、インターネットとしては位置することができ、および／またはワイヤレスネットワークおよび／または電話線、あるいは計算デバイス８９００が貯蔵ロケーション８９３０および８９４０と連絡するのを可能とするいくつかの他のタイプのネットワークであってもよい。貯蔵ロケーション８９３０および８９４０はデータベース、あるいはネットワーク８９２０に接近可能な計算デバイスによって収容されたいくつかの他のタイプの貯蔵データ構造であってよい。本発明の構成要素は図８９において特別な立体配置で描かれているが、他の構成要素立体配置も本発明の範囲内で可能であることに注意すべきである。例えば、初期配列収集プロセス８９０２および解析施設８９０４は別々の計算デバイスに位置させることができ、および／または配列データ８９３２および８９４２は計算デバイス８９００に収容された１以上のデータベースに位置させることができる。
図９０は、本発明の具体例に従って、ポリペプチドの安定性の尺度として用いることができる配列共変動スコアを決定することができる工程の例示的なシーケンスのフローチャートである。該シーケンスは、ポリペプチドのＩｇ折畳みに対応する配列のキュレーションした参照組の整列を供する初期配列収集プロセス８９０２で開始する（工程９０００）。次いで、解析施設８９０４は、本明細書中に記載された整列の配列の残基の間の共変動を計算して、共変動データを作成する（工程９００２）。解析施設８９０４は共変動データを使用して、共変動データ内の共変動からの候補配列についての配列共変動スコアを決定する（工程９００４）。決定された配列共変動スコアはポリペプチドの安定性の尺度のインジケーターを提供し、ＧＵＩ８９１２を介して、またはいくつかの他の方法により貯蔵し、および／またはユーザーに出力することができる（工程９００６）。
前記したように、解析施設８９０４を用いて、コンセンサススコアを決定することもできる。図９１は、本発明の具体例に従って、コンセンサススコアを決定し、それを用いて、候補蛋白質の安定性を予測することができる工程の例示的なシーケンスのフローチャートである。該シーケンスは、初期配列収集プロセス８９０２を用いて、候補蛋白質のテストドメイン配列に対応する配列の参照組を供することによって開始する（工程９１００）。次いで、解析施設８９０４は、テストドメイン配列内のアミノ酸位置における残基頻度を決定して、コンセンサススコアが得られる（工程９１０２）。次いで、決定されたコンセンサススコアを貯蔵し、および／またはユーザーに出力して、候補蛋白質の安定性の予測を供することができる（工程９１０４）。
解析施設８９０４を用いて、平均コンセンサススコアを決定することもできる。図９２は、本発明の具体例に従って、候補蛋白質の安定性の尺度として平均コンセンサススコアを決定し、それを用いることができる工程の例示的シーケンスのフローチャートである。該シーケンスは、初期配列収集プロセス８９０２を用いて、候補蛋白質のテストドメイン配列に対応する配列の参照組を供することによって開始される（工程９２００）。次いで、解析施設８９０４は、テストドメイン配列内のアミノ酸位置における残基頻度を決定して、コンセンサススコアが得られる（工程９２０２）。解析施設８９０４は、参照組の配列内の残基頻度を決定して、平均コンセンサススコアをやはり決定する（工程９２０４）。コンセンサススコアを平均コンセンサススコアと比較して、配列スコアを決定し（工程９２０６）、次いで、決定された配列スコアを貯蔵し、および／またはユーザーに出力して、候補蛋白質の安定性の予測を供することができる（工程９２０６）。
図９３は、本発明の具体例に従って、整列中の対応する位置に見出された共変動残基での共変動を満足しないアミノ酸残基を同定し、それを置換して、ポリペプチドの改良されたアミノ酸配列を決定することができる例示的な工程のシリーズのフローチャートである。該シーケンスは、ポリペプチドのＩｇ折畳みに対応するキュレーションされた配列の参照組の整列を供する初期配列収集プロセス８９０２によって開示される（工程９３００）。次いで、解析施設８９０４は整列の配列の残基の間の共変動を計算して、共変動残基を同定する（工程９３０２）。解析施設８９０４は、共変動を満足せず、整列中の対応する蛋白質で見出された共変動残基を置換えて（工程９３０４）、ポリペプチドの配列を改良することができるポリペプチドの特別な残基を同定することができる。次いで、改良された配列を貯蔵し、またはユーザーに出力することができる（工程９３０６）。
本発明は、１以上の媒体上にまたは中に具現化された１以上のコンピュータ−読取可能プログラムとして提供することができる。該媒体はフロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、コンパクトディスク、デジタル多用途ディスク、フラッシュメモリーカード、ＰＲＯＭ、ＭＲＡＭ、ＲＡＭ、ＲＯＭ、または磁性テープであってよい。一般には、コンピュータ−読取可能プログラムはいずれかのプログラミング言語で実施することができる。用いることができる言語のいくつかの例はＦＯＲＴＲＡＮ、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、ＰｙｔｈｏｎまたはＪａｖａ（登録商標）を含む。ソフトウエアプログラムは目的コードとして１以上の媒体上にまたは中に貯蔵することができる。ハードウェア加速を用いてもよく、該コードの全部または一部をＦＰＧＡ、ＡＳＩＰ、またはＡＳＩＣで実行してもよい。該コードはヴァーチャルマシーンにおけるようなヴァーチャル化環境で実行してもよい。該コードを実行する多数のヴァーチャルマシーンが単一のプロセッサに存在させてもよい。
ＶＩ．蛋白質安定性を評価する方法
本発明の組成物の安定性特性は、当該分野で公知の方法を用いて解析することができる。当業者に許容される安定性パラメーターを使用することができる。例示的なパラメーターは以下でより詳細に記載する。例示的な具体例において、熱安定性が評価される。好ましい具体例において、本発明の組成物の（例えば、％収率によって測定した）発現レベルを評価する。他の好ましい具体例において、本発明の組成物の凝集レベルが評価される。
ある具体例において、本発明の組成物の安定性特性を適当な対照のそれと比較する。例示的な対照は慣用的なｓｃＦｖ分子を含む。特に好ましい対照は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ｓｃＦｖ分子である。
１つの具体例において、以下に記載される１以上のパラメーターが測定される。１つの具体例において、これらのパラメーターの１以上を、哺乳動物細胞における発現に続いて測定する。１つの具体例において、以下に記載する１以上のパラメーターを、大規模な製造条件下で測定する（例えば、バイオリアクターにおけるｓｃＦｖ、またはｓｃＦｖを含む分子の発現）。
ａ）熱安定性
本発明の組成物の熱安定性は、当該分野で知られた多数の非限定的生物物理学または生化学技術を用いて解析することができる。ある具体例において、熱安定性は分析分光測定によって評価される。
例示的な分析分光測定方法は示差操走査型熱量測定（ＤＳＣ）である。ＤＳＣは、ほとんどの蛋白質または蛋白質ドメインの折畳み解除に伴う熱吸収に感受性である熱量計を使用する（例えば、Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒｕｉｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７：１６４８−５２，１９８８参照）。蛋白質の熱安定性を決定するには、蛋白質の試料を熱量計に挿入し、ＦａｂまたはｓｃＦｖが折畳み解除されるまで温度を上昇させる。蛋白質が折畳み解除される温度は、総じての蛋白質安定性を予測する。
もう１つの例示的な分析分光測定方法は円二色性（ＣＤ）分光測定である。ＣＤ分光測定は、組成物の光学活性を、温度上昇の関数として測定する。円二色性（ＣＤ）分光測定は、左回りの偏光−ｖｓ−構造的非対称により上昇する右回りの偏光の吸収の差を測定する。無秩序なまたは折畳み解除された構造の結果、秩序立ったまたは折畳まれた構造のそれとは非常に異なるＣＤスペクトルがもたらされる。ＣＤスペクトルは温度上昇の変性効果に対する蛋白質の感度を反映し、従って、蛋白質の熱安定性を予測する（ｖａｎ Ｍｉｅｒｌｏ ａｎｄ Ｓｔｅｅｍｓｍａ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７９（３）：２８１−９８，２０００参照）。
熱安定性を測定するためのもう１つの例示的な分析分光測定方法は蛍光発光分光測定（ｖａｎ Ｍｉｅｒｌｏ ａｎｄ Ｓｔｅｅｍｓｍａ，ｓｕｐｒａ参照）である。熱安定性を測定するためのさらにもう１つの例示的な分析分光測定方法は、核磁器共鳴（ＮＭＲ）分光測定（例えば、ｖａｎ Ｍｉｅｒｌｏ ａｎｄ Ｓｔｅｅｍｓｍａ，ｓｕｐｒａ参照）である。
他の具体例において、本発明の組成物の熱安定性は生化学的に測定される。熱安定性を評価するための例示的な生化学方法は、熱挑戦アッセイである。「熱挑戦アッセイ」においては、本発明の組成物を、一定範囲の上昇した温度に設定された時間の間付す。例えば、１つの具体例において、テストｓｃＦｖ分子またはｓｃＦｖ分子を含む分子を一定範囲の上昇させる温度に、例えば、１ないし１．５時間付す。次いで、関連する生化学的アッセイによって蛋白質の活性をアッセイする。例えば、もし蛋白質が結合蛋白質（例えば、本発明のｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ−含有ポリペプチド）であれば、結合蛋白質の結合活性は機能的または定量的ＥＬＩＳＡによって決定することができる。
１つの具体例において、そのようなアッセイは高−スループット様式で行うことができる。もう１つの具体例において、ｓｃＦｖ変種のライブラリーは、当該分野で公知の方法を用いて作成することができる。ｓｃＦｖ発現は誘導することができ、ｓｃＦｖは熱挑戦に付すことができる。挑戦されたテスト試料は結合についてアッセイすることができ、安定であるｓｃＦｖはスケールアップし、さらに特徴付けすることができる。
ある具体例において、熱安定性は、前記技術（例えば、分析分光測定技術）のいずれかを用いて本発明の組成物の融解温度（Ｔｍ）を測定することによって評価される。融解温度は、熱転移曲線の中点における温度であり、ここに、組成物の分子の５０％は折畳まれた状態にある。
他の具体例において、熱安定性は、分析熱量測定技術（例えば、ＤＳＣ）を用いて本発明の組成物の比熱または熱容量（Ｃｐ）を測定することによって評価される。組成物の比熱は、１モルの水の温度を１℃だけ上昇させるのに必要な（例えば、ｋｃａｌ／モルで表した）エネルギーである。大きなＣｐは変性したまたは不活性な蛋白質組成物のホールマークである。ある具体例において、組成物の熱容量の変化（ΔＣｐ）は、その熱転移の前および後に組成物の比熱を決定することによって測定される。他の具体例において、熱安定性は、折畳み解除のギブス自由エネルギー（ΔＧ）、折畳み解除のエンタルピー（ΔＨ）、または折畳み解除のエントロピー（ΔＳ）を含めた熱力学的安定性の他のパラメーターを測定または決定することによって評価することができる。
他の具体例において、前記した生化学的アッセイ（例えば、熱挑戦アッセイ）の１以上を用いて、組成物の５０％がその活性（例えば、結合活性）を保有する温度（すなわち、ＴＣ値）を決定する。
ｂ）％凝集
ある具体例において、本発明の組成物の安定性は、凝集するその傾向を測定することによって決定される。凝集は、多数の非限定的生化学または生物物理学技術によって測定することができる。例えば、本発明の組成物の凝集は、クロマトグラフィー、例えば、サイズ−排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて評価することができる。ＳＥＣはサイズに基づいて分子を分離する。カラムには、イオンおよび小さな分子をその内部に受け入れるが、大きなものは受け入れないポリマーゲルの半個体ビーズが充填される。蛋白質組成物がカラムの頂部に適応されると、緻密な折畳まれた蛋白質（例えば、凝集していない蛋白質）は、大きな蛋白質凝集体が利用できるよりも大きな容量の溶媒を通って分布する。その結果、大きな凝集体はカラムを通ってより迅速に移動し、このようにして、混合物はその成分に分離でき、または分画することができる。各画分はそれがゲルから溶出されるにつれ、（例えば、光散乱によって）別々に定量することができる。従って、本発明の組成物の％凝集は、画分の濃度を、ゲルに適用された蛋白質の全濃度と比較することによって決定することができる。安定な組成物は実質的に単一の画分としてカラムから溶出され、溶出プロフィールまたはクロマトグラムにおいては実質的に単一のピークとして出現する。
好ましい具体例において、ＳＥＣをイン−ライン光散乱（例えば、古典的なまたは動的光散乱）と組合せて、組成物の％凝集を決定する。ある好ましい具体例において、静的光散乱を使用して、分子の形状または溶出位置から独立して、各画分またはピークの質量を測定する。他の好ましい具体例において、動的光散乱を使用して、組成物の水力学的サイズを測定する。蛋白質安定性を評価するための他の例示的な方法は高速ＳＥＣを含む（例えば、Ｃｏｒｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２３（８）：１８８８−９４，１９８４参照）。
好ましい具体例において、％凝集は、蛋白質試料内の蛋白質凝集体の分率を測定することによって決定される。好ましい具体例において、組成物の％凝集は、蛋白質試料内の折畳まれた蛋白質の分率を決定することによって測定される。
ｃ）％収率
他の具体例において、本発明の組成物の安定性は、蛋白質の発現（例えば、組換え体発現）に続いて回収される蛋白質の量（ここでは、「％収率」）を測定することによって評価される。例えば、％収率は、宿主培養基の各ｍｌについて回収された蛋白質のミリグラム（すなわち、蛋白質のｍｇ／ｍｌ）を決定することによって測定することができる。好ましい具体例において、％収率は哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）における発現に続いて評価される。
ｄ）％喪失
なお他の具体例において、本発明の組成物の安定性は、貯蔵に続いての一定範囲の温度（例えば、−８０ないし２５℃）における定義された時間の間での蛋白質の喪失をモニターすることによって評価される。回収された蛋白質の量または濃度は、当該分野で知られたいずれかの蛋白質定量方法を用いて決定することができ、蛋白質の初期濃度と比較することができる。例示的な蛋白質定量方法は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析またはブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，２４８，（１９７６））を含む。％喪失を評価するための好ましい方法は、前記した分析ＳＥＣ方法のいずれかを使用する。％喪失測定は、例えば、凍結乾燥された蛋白質調製物を含めたいずれかの貯蔵条件または貯蔵処方の下で決定することができると認められる。
ｅ）％蛋白質分解
なお他の具体例において、本発明の組成物の安定性は、標準的な条件下での彫像に続いて分解された蛋白質の量を決定することによって評価される。例示的な具体例において、蛋白質分解は蛋白質の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定され、そこでは、初期蛋白質の量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに出現する低分子量断片の量と比較される。もう１つの例示的な具体例において、蛋白質分解は質量分析（ＭＳ）によって決定され、そこでは、予測される分子量の蛋白質の量が、試料内の低分子量蛋白質断片の量と比較される。
ｆ）結合親和性
なお他の具体例において、本発明の組成物の安定性は、その標的結合親和性を決定することによって評価することができる。結合親和性を決定するための広く種々の方法が当該分野で知られている。結合親和性を決定するための例示的な方法は、表面プラズモン共鳴を使用する。表面プラズモン共鳴は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ ａｎｄ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いる、バイオセンサーマトリックス内の蛋白質濃度の変化の検出によって、リアルタイム生物特異的相互作用の分析を可能とする光学的現象である。さらなる記載については、Ｊoｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ Ｂｉｏｌ． Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６；Ｊoｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：６２０−６２７；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−１３１；およびＪｏｈｎｎｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８−２７７参照。
ｇ）他の結合実験
なお他の具体例において、本発明の組成物の安定性は、標識された化合物の、結合分子の変性したまたは折畳み解除された部分への結合を定量することによってアッセイすることができる。そのような分子が好ましくは疎水性である。というのは、それらは、好ましくは、通常は天然蛋白質の内部に埋もれているが、変性した、または折畳み解除された結合分子においては露出されるアミノ酸の大きな疎水性パッチと結合し、または相互作用するからである。例示的な標識された化合物は疎水性蛍光色素、１−アニリノ−８−ナフタリンスルホネート（ＡＮＳ）である。
ＶＩＩ．安定な蛋白質を選択する方法
蛋白質安定性の予測のための前記した方法を使用して、さらなる使用のための候補蛋白質（例えば、抗体）を選択することができる。ある具体例において、本発明の方法を使用して、発現用の蛋白質を選択する。他の具体例において、本発明の方法を用いて、修飾のための候補蛋白質を選択する。例示的な具体例において、本発明の予測方法は、（例えば、アクセプター免疫グロブリンを選択するための）非−ヒトドナー抗体のヒト化で使用することができる。
候補蛋白質は、本発明の方法を用いて決定されたその合計コンセンサススコアまたは配列スコアに基づいて選択することができる。ある具体例において、もしそのコンセンサススコアが適当な陰性対照よりも大きければ（例えば、５％よりも大、好ましくは１０％よりも大、より好ましくは２０％よりも大）、候補蛋白質が選択される。他の具体例において、もしそのコンセンサススコアが適当な陽性対照と実質的に同様（例えば、２０％、１０％、または５％内）であるか、より大きい（例えば、５％よりも大、好ましくは１０％よりも大、より好ましくは２０％よりも大）ならば、候補蛋白質が選択される。
他の具体例において、もしそのコンセンサススコアがその理想的なまたは完全なコンセンサススコアと実質的に同様（例えば、３０％内、好ましくは２０％内、より好ましくは１０％内）であるならば、候補蛋白質が選択される。
他の具体例において、もしその配列スコアがゼロよりも大きければ、候補蛋白質が選択される。１つの具体例において、もしその配列スコアが０．５よりも大であるならば、候補蛋白質が選択される。もう１つの具体例において、もしその配列スコアが１よりも大であるならば、候補蛋白質が選択される。他の具体例において、もしその配列スコアが２よりも大であるならば、候補蛋白質が選択される。好ましい具体例において、もしその配列スコアが３よりも大であるならば、候補蛋白質が選択される。
他の具体例において、もしそのΔスコアが少なくとも−３、少なくとも−２、または少なくとも−１、好ましくは少なくとも０、より好ましくは少なくとも１であるならば、候補蛋白質が選択される。
ａ．抗体ヒト化のためのアクセプター免疫グロブリンの選択
ヒト化抗体は組換えＤＮＡ技術を用いて生産することができる。例えば、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８９），８６：１００２９−１００３３；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（１９８６），３２１：５２２−２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（１９８８），３３２：３２３−２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９８８），２３９：１５３４−３６；Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８９），８６：３８３３−３７；米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７６２号；第６，１８０，３７０号参照。好ましい非ヒトドナー抗体がヒト化のために選択された場合、適当なヒトアクセプター抗体は、例えば、発現されたヒト抗体遺伝子の配列データベースから、いくつかのヒト抗体の生殖系Ｉｇ配列またはコンセンサス配列から得ることができる。非ヒトＣＤＲのヒト可変ドメインフレームワークからの置換の結果、もしヒト可変ドメインフレームワークが、ＣＤＲが由来する非ヒト可変フレームワークに対して同一または同様な立体配座を採るならば、それらの正しい空間的向きの保持が最ももたらされるようである。これは、そのフレームワーク配列が、ＣＤＲが由来する非ヒト可変フレームワークドメインに対して高い度合いの配列同一性を呈するヒトアクセプター抗体からのヒト可変ドメインを得ることによって達成される。重鎖および軽鎖可変フレームワーク領域は、同一または異なるヒト抗体配列から由来することができる。好ましくは、ヒトアクセプター抗体は、ドナー抗体のカノニカルおよび界面残基を保持する。加えて、ヒトアクセプター抗体は、好ましくは、ＣＤＲループの長さにおいて実質的同様性を有する。Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４：７５８（１９９１）；Ｋｏｌｂｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６：９７１（１９９３）およびＣａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ ９２／２２６５３参照。
ドナー抗体および適当なヒトアクセプター抗体のＣＤＲを同定したら、次の工程は、もしあるとすれば、これらの成分からのいずれの残基が、得られたヒト化抗体の特性を最適化するのに置換されるべきかを決定することである。典型的には、抗原結合に必要な非ヒトドナー免疫グロブリン軽鎖または重鎖（例えば、１以上のＣＤＲ）のアミノ酸のいくつかまたは全てを用いて、ヒトアクセプター抗体の軽鎖または重鎖からの対応するアミノ酸について置換える。ヒトアクセプター抗体は抗原結合で必要ないアミノ酸のいくつかまたは全てを保有する。必要な場合、ヒトフレームワーク領域における１以上の残基を、ネズミ抗体における対応する位置での残基に変化させて、ヒト化抗体の抗原に対する結合親和性を維持することができる。この変化は、時々、「逆突然変異」といわれる。ヒト可変領域フレームワーク残基からのある種のアミノ酸は、ＣＤＲ立体配座および／または抗原への結合に対するそれらの可能な影響に基づいて逆突然変異について選択される。
しかしながら、いくつかの場合には、ヒト化プロセスの結果、望ましくない無能をヒト化抗体に付与する可変ドメインへの非天然変化がもたらされる。例えば、アクセプター免疫グロブリンは、低い安定性を付与する稀な配列変動を有することができる。これは、免疫系によって大きな頻度で使用することができないある種の生殖系配列で特にあてはまる。
本発明の方法は、ヒト化のための改良された方法を提供する。特に、本発明の方法は、当業者が、候補アクセプター配列（例えば、生殖系配列）の参照組とでいずれのテスト配列（例えば、テスト生殖系配列）が、アクセプター配列のヒト化で用いるのに適切に安定であるかを予測するのを可能とする。許容される安定性を予測するスコアを有する（例えば、参照組の平均コンセンサススコアと比較して高いコンセンサススコアを有する）テストアクセプター配列（例えば、生殖系配列）を、アクセプター免疫グロブリンとして選択することができる。
ＶＩＩＩ．安定化されたｓｃＦｖ分子を同定するためのライブラリーベースの分子
もう１つの態様において、本発明は、改良された蛋白質安定性、例えば、改良された熱安定性を持つｓｃＦｖ分子を同定する方法を提供する。本発明の方法は、（ｉ）候補ｓｃＦｖ分子を含むライブラリーを供し；次いで、（ｉｉ）ライブラリーをスクリーニングして、適当な対照（例えば、対照ｓｃＦｖ分子）に対して改良された蛋白質安定性を持つ候補ｓｃＦｖ分子を同定することを含む。本明細書中で用いるように、「候補ｓｃＦｖ分子」は、１以上の候補安定化突然変異をｓｃＦｖ分子に導入することによって形成されたｓｃＦｖ分子であり、そこでは、ｓｃＦｖ分子の安定性に対する候補安定化突然変異の効果は先験的には知られておらず、すなわち、突然変異が導入され、突然変異が増大した安定性を持つｓｃＦｖ分子をもたらすか否かを決定するのに評価されなければならないｓｃＦｖ分子である。１つの具体例において、候補ｓｃＦｖ分子は、１以上の候補安定化突然変異を慣用的な（すなわち、非−安定化）ｓｃＦｖ分子へ導入することによって形成されたものである。もう１つの具体例において、候補ｓｃＦｖ分子は、前記セクションＩＩに記載された安定化ｓｃＦｖ分子の１つで、１以上の候補安定化突然変異を導入することによって形成されたものである。
本明細書中における「候補ｓｃＦｖ分子のライブラリー」とは、少なくとも２つの非−冗長候補ｓｃＦｖ分子を意味し、少なくとも約１０が好ましく、少なくとも約１００が特に好ましく、少なくとも約１０００が特に好ましい（例えば、少なくとも約１０４、１０５、１０６、１０７、または１０８ｓｃＦｖ分子）。１つの具体例において、いずれかの位置においてランダムに生じる非特異的突然変異で、ライブラリーをランダム化する。もう１つの具体例において、ｓｃＦｖライブラリーは部分的にランダム化され、または設計される。すなわち、特定のアミノ酸残基またはアミノ酸残基のクラスをｓｃＦｖのいずれかの位置においてランダムに導入し、あるいは特定のアミノ酸位置を、非特定のアミノ酸、アミノ酸の特別なクラス、または特定のアミノ酸での突然変異誘発について選択する。好ましい具体例において、ｓｃＦｖ分子の選択された残基を規定されたクラスのアミノ酸、例えば、疎水性アミノ酸、塩基性アミノ酸、親水性アミノ酸、荷電アミノ酸、立体的に偏った（小さなまたは大きないずれかの）アミノ酸、またはジスルフィド結合形成が可能なシステインで置換することによって、ｓｃＦｖライブラリーが設計される。
ある具体例において、ｓｃＦｖライブラリーは、ｓｃＦｖ分子の可変領域（ＶＬおよび／またはＶＨ）内に導入された候補安定化突然変異を持つ候補ｓｃＦｖ分子を含む。他の具体例において、ｓｃＦｖライブラリーは、ｓｃＦｖ分子のｓｃＦｖリンカー内に導入された候補安定化突然変異を持つ候補ｓｃＦｖ分子を含む。他の具体例において、ｓｃＦｖライブラリーは、ｓｃＦｖ分子のｓｃＦｖリンカー内に導入された候補安定化突然変異、および可変領域（ＶＬおよび／またはＶＨ）内に導入された候補安定化突然変異を持つ候補ｓｃＦｖ分子を含む。
ａ．ｓｃＦｖライブラリーの設計
ｓｃＦｖライブラリーを設計するための方法は、分子または計算モデリングによって助けることができる。ある具体例において、ライブラリーの設計はコンピュータ内で実施される。ある具体例において、ｓｃＦｖライブラリーは以下の２−工程方法によって設計することができる：
１）突然変異によって（例えば、アミノ酸置換によって）改変した場合、改良されたｓｃＦｖ安定性をもたらすと予測されるｓｃＦｖにおける標的アミノ酸残基（本明細書中においては、「候補脱安定化残基」）を同定し；次いで、
２）標的アミノ酸残基を、候補安定化アミノ酸残基で置換する。
工程＃１：候補脱安定化残基の同定
ある具体例において、候補脱安定化アミノ酸残基は、配列−ベースの分析によって同定することができる。例えば、候補脱安定化アミノ酸は、ｓｃＦｖの可変領域配列を、可変領域配列、例えば、天然に生じるヒト抗体からの可変領域配列の参照組と比較し、次いで、参照組内のそれらの対応するアミノ酸位置において異常な、または稀であるｓｃＦｖの可変領域アミノ酸残基を選択することによって同定することができる。好ましい具体例において、ｓｃＦｖの可変領域配列のフレームワーク領域のみが解析され、他方、可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を保存して、ｓｃＦｖ分子の結合活性の破壊を回避する。
ある具体例において、候補脱安定化アミノ酸残基は、相同性可変領域配列の参照組内の対応する位置で不存在であるか、または低い頻度で見出されるものである。参照組を編集する方法は前記セクションＩＩＩないしＶに記載されている。好ましい具体例において、候補脱安定化アミノ酸残基は、参照組内の対応する位置において配列の１０％未満内に存在するものである。より好ましい具体例において、候補脱安定化アミノ酸残基は、参照組内の対応する位置における配列の５％未満内に存在するものである。特に好ましい具体例において、候補脱安定化アミノ酸残基は、参照組内の対応する位置における配列の２％未満（例えば、０．５％、０．７５％、または１％）内に存在するものである。
他の具体例において、候補脱安定化アミノ酸残基は、可変領域配列の参照組のコンセンサス配列中の対応する位置に存在するアミノ酸（すなわち、コンセンサスアミノ酸残基）とは異なるものである。参照組のコンセンサス配列を決定するための方法は前記セクションＩＩＩおよびＶに記載されている。
もう１つの具体例において、候補脱安定化アミノ酸残基は低いコンセンサススコアを有するものである。アミノ酸のコンセンサススコアを決定するための方法は前記セクションＩＩＩおよびＶに記載されている。１つの具体例において、候補脱安定化アミノ酸残基は０．５未満の（例えば、０．４未満、０．３未満、０．２未満、または０．１未満）のコンセンサススコアを持つものである。好ましい具体例において、候補脱安定化アミノ酸残基は０．３未満のコンセンサススコアを持つものである。
工程＃２：候補安定化突然変異の選択
１以上の候補脱安定化アミノ酸を同定したら、次の工程は、各脱安定化アミノ酸についての１以上の候補安定化突然変異を選択することである。次いで、ｓｃＦｖライブラリーは、選択される各候補安定化突然変異についての代表的な候補ｓｃＦｖ分子を含むように設計することができる。
ある具体例において、特別な脱安定化アミノ酸の各天然アミノ酸変種は、候補安定化突然変異として選択される（すなわち、各脱安定化アミノ酸についての１９の候補安定化突然変異）。
より好ましい具体例において、特別な脱安定化アミノ酸の天然アミノ酸変種のサブセットは候補安定化突然変異（すなわち、各脱安定化アミノ酸に対して１ないし１８の候補安定化アミノ酸）として選択される。１つの具体例において、候補安定化突然変異のサブセットは、規定されたクラスのアミノ酸、例えば、疎水性アミノ酸、塩基性アミノ酸、親水性アミノ酸、荷電アミノ酸、または立体的に偏ったアミノ酸（小さなまたは大きないずれかの）アミノ酸での置換を含む。
１つの具体例において、候補安定化突然変異のサブセットは、相同可変領域配列の参照組内の脱安定化アミノ酸のそれに対応する位置において高い頻度で存在するアミノ酸での置換を含む。好ましい具体例において、候補安定化突然変異は、１０％よりも大きな頻度にてデータベース内に存在するアミノ酸での置換を含む。より好ましい具体例において、アミノ酸は１５％よりも大きな頻度で存在する。なおより好ましい具体例において、アミノ酸は２０％よりも大きな頻度にて存在する。なおより好ましい具体例において、アミノ酸は２５％よりも大きな頻度で存在する。
もう１つの具体例において、候補安定化突然変異は参照組内の脱安定化アミノ酸の位置に見出されるコンセンサスアミノ酸（すなわち、最も頻繁な残基）での置換である。
もう１つの具体例において、候補安定化突然変異のサブセットは、脱安定化アミノ酸の位置における相同可変領域配列の参照組内に見出される各アミノ酸での置換を含む。従って、次いで、ｓｃＦｖライブラリーは、参照組において表される各候補安定化突然変異についての代表的な候補ｓｃＦｖ分子を含むように設計することができる。
他の具体例において、候補安定化突然変異のサブセットは、ｓｃＦｖ分子の可変領域の三次元構造またはモデルの解析（例えば、視覚による精査または計算的解析）によって同定し、またはスクリーニングのために優先することができる。ポリペプチドの三次元構造はその生物学的活性および安定性に影響し、その構造は多数の方法で決定し、または予測することができる。三次構造は、公知の三次元構造を有する１以上の相同蛋白質（または蛋白質複合体）の三次元構造のモデル形成を用いて予測することができる。Ｘ−線結晶学は、おそらくは、蛋白質構造を決定する最良の方法である（従って、用語「結晶構造」を用語「構造」の代わりに用いることができる）が、評価は、円二色性、光散乱を用いて、あるいは放射線エネルギーの吸収および発光を測定することによってなすこともできる。他の有用な技術は中性子回折、核磁器共鳴（ＮＭＲ）、および相同モデリングを含む。これらの方法の全ては当業者に知られており、それらは標準的なテキスト（例えば、Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｗ．Ｊ．Ｍｏｏｒｅ，Ｐｒｅｎｔｉｓｓ−Ｈａｌｌ，Ｎ．Ｊ．，１９７２，またはＰｙｓｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋ．Ｅ．Ｖａｎ Ｈｏｌｄｅ，Ｐｒｅｎｔｉｓｓ−Ｈａｌｌ，Ｎ．Ｊ．，１９７１参照）および多数の刊行物によく記載されている。これらの技術のいずれかを行って、可変領域オーファンｓｃＦｖ分子（例えば、抗体、Ｆａｂ、またはｓｃＦｖ分子それ自体）を含む分子の構造を決定することができる。
可変領域の構造はイン・シリコでモデル化することができる。例えば、候補安定化突然変異の三次元構造との適合性は、脱安定化突然変異の候補安定化突然変異での置換を計算によりモデル化することによって解析することができる。もしそれがｓｃＦｖ分子の総じての構造に適合すれば、候補安定化突然変異はｓｃＦｖライブラリーに含めるにつき選択することができる。１つの具体例において、候補安定化突然変異は、もしそれがｓｃＦｖ分子の可変領域、またはその１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）の天然折畳みまたは立体配座を乱さないならば、選択することができる。もう１つの具体例において、候補安定化突然変異は、もしそれが天然ＶＬ／ＶＨ界面を形成する可変領域の能力を乱さないならば、選択することができる。
ある具体例において、候補安定化突然変異は、側鎖再パッキング技術を可変領域の構造（例えば、結晶構造またはモデル）に適用することによって選択することができる。側鎖再パッキング計算において、候補安定化残基は計算により修飾することができ、得られた突然変異体の安定性は計算により評価される。側鎖再パッキング計算は、改変された安定性（すなわち、改変された分子間エネルギー）を有する突然変異体のランク付けされたリストを生じさせる。計算により評価される蛋白質突然変異体の数は非常に大となることができる。というのは、各可変アミノ酸位置は全ての２０の標準アミノ酸に突然変異させることができる。計算解析の結果をランク付けするのに用いられる例示的な計算アルゴリズムは、デッド−末端排除およびツリーサーチアルゴリズムを含む（例えば、Ｌａｓｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：８１５−８２２，１９９５）、Ｌｏｏｇｅｒ ａｎｄ Ｈｅｌｌｉｎｇａ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７：４２９−４４５，２００１）、およびＤａｈｉｙａｔ ａｎｄ Ｍａｙｏ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．５：８９５−９０３，１９９６）参照）。従って、次いで、ｓｃＦｖライブラリーは、側鎖再パッキング計算によって生じた突然変異のランク付けされたリストにおける上位にランクされた候補安定化突然変異の各々についての代表的な候補ｓｃＦｖ分子を含めるように設計することができる。ある具体例においては、少なくとも上位にランクされた突然変異が選択される（例えば、上位ランク付け、上位の２つにランクされた、上位の３つにランクされた、上位の４つにランクされた、または上位の５つにランクされた突然変異が選択される）。
ｂ．ｓｃＦｖライブラリーの構築
候補安定化突然変異がｓｃＦｖライブラリーに含まれると決定したら、種々の可能な方法のいずれかを用いて、突然変異を含む候補ｓｃＦｖ分子を生じさせることができる。そのようなペプチド、例えば、組換え方法によって生産することができる。さらに、遺伝暗号の縮重のため、種々の核酸配列を用いて、各所望のｓｃＦｖをコードすることができる。
候補ｓｃＦｖ分子をコードする核酸分子を作成するための例示的な当該分野で認められた方法は、限定されるものではないが、部位−特異的（またはオリゴヌクレオチド−媒介）突然変異に誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、および候補ｓｃＦｖをコードするより早く調製されたＤＮＡのカセット突然変異誘発を含む。
部位−特異的突然変異誘発は、置換変種を調製するための好ましい方法である。この技術は当該分野でよく知られている（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３（１９８５）およびＫｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８（１９８７）参照）。簡単に述べるとＤＮＡの特異的突然変異誘発を行うにおいて、親ＤＮＡは、先ず、所望の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドをそのような親ＤＮＡの単一ストランドにハイブリダイズすることによって改変される。ハイブリダイゼーションの後に、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、および親ＤＮＡの単一ストランドを鋳型として用い、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、全第二のストランドを合成する。かくして、所望の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドが得られた二本鎖ＤＮＡに取り込まれ、これは、次いで、プラスミドまたは他の適当なベクターに連結することができる。
ＰＣＲ突然変異誘発は、候補ｓｃＦｖ分子を作製するのに適している。Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｉｎ ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１７７−１８３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９０）；およびＶａｌｌｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７２３−５８３（１９８９）参照。簡単に述べれば、少量の鋳型ＤＮＡをＰＣＲにおいて出発物質として用いる場合、鋳型ＤＮＡ中の対応する領域とは配列がわずかに異なるプライマーを用いて、プライマーが鋳型とは異なる位置のみにおいて鋳型配列とは異なる比較的大量の特異的ＤＮＡ断片を生じさせることができる。また、ＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ反応のＤＮＡ産物が、次いで、プラスミドまたは他の適当なベクターに直接的に連結できるように、制限部位に取り込むように設計することができる。
変種、カセット突然変異誘発を調製するためのもう１つの方法は、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３４：３１５−３２３（１９８５）によって記載された技術に基づく。出発物質は、突然変異させるべき出発ポリペプチドＤＮＡを含むプラスミド（または他のベクター）である。突然変異させるべき親ＤＮＡ中のコドンを同定する。同定された突然変異部位の各側にユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位がなければならない。もしそのような制限部位が存在しなければ、それらは、出発ポリペプチドＤＮＡ中の適当なロケーションにそれらを導入するための前記したオリゴヌクレオチド−媒介突然変異誘発方法を用いて生じさせることができる。プラスミドＤＮＡがこれらの部位において切断して、それを線状化する。制限部位の間のＤＮＡの配列をコードするが、所望の突然変異を含有する二本鎖オリゴヌクレオチドは標準的な手法を用いて合成され、そこでは、オリゴヌクレオチドの二本鎖が別々に合成され、次いで、標準的な技術を用いて一緒にハイブリダイズさせる。この二本鎖オリゴヌクレオチドはカセットという。このカセットは、それが直接的にプラスミドに連結できるように、線状化プラスミドの末端に適合する５’および３’末端を有するように設計される。
候補ｓｃＦｖ分子の各々についての代表的な核酸は前記した方法により生じさせることができる。次いで、核酸を発現ベクターにクローン化して、発現ベクターライブラリーを形成することができる。次いで、宿主細胞を得られたベクターのライブラリーで形質転換し、宿主細胞を適当な条件下で培養して、各候補ｓｃＦｖ分子を発現させることができる。
ｃ．スクリーニング方法
本発明のｓｃＦｖライブラリーはアッセイ（例えば、高−スループットアッセイ）においてスクリーニングして、所望の蛋白質安定性を持つ候補ｓｃＦｖ分子を同定することができる。そのようなアッセイは、前記セクションＶＩに記載された蛋白質安定性を評価する方法のいずれかを使用することができる。特に好ましい方法は熱挑戦アッセイである。そのようなアッセイ方法は、一般に、候補ｓｃＦｖ分子の熱安定性を適当な対照のそれと比較し、もし熱安定性が対照のそれよりも大きいならば、候補ｓｃＦｖ分子を選択することを含む。例示的な適当な対照は慣用的なｓｃＦｖ分子、例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ ｓｃＦｖ分子を含む。候補ｓｃＦｖ分子は、もしそれらが対照のそれよりも約０．１、約０．２５、約０．５、約０．７５、約１、約１．２５、約１．５、約１．７５、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０度摂氏高い熱安定性を有すれば、選択することができる。例示的な具体例において、候補ｓｃＦｖ分子は、もしそれが対照のそれよりも約３度摂氏高ければ選択される。
ｓｃＦｖライブラリーは異なるアッセイフォーマットで示すことができる。例えば、ｓｃＦｖ分子は溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１）、ビーズ（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４）、チップＦｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ ＵＳＰ ５，２２３，４０９）、胞子上（Ｌａｄｎｅｒ ＵＳＰ ’４０９）、またはファージ上（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０）；（Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６）；（Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２）；（Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０）；（Ｌａｄｎｅｒ ｓｕｐｒａ）で調製することができる。
ある例示的な具体例において、候補ｓｃＦｖ分子は溶液フォーマットでアッセイされる。１つの具体例において、各試料は、同一候補安定化突然変異または複数突然変異を共に候補ｓｃＦｖ分子を有する溶液のアリコットを含む。そのような溶液は、発現プラスミドライブラリーで形質転換された宿主細胞のライブラリーから個々の宿主細胞コロニーを単離し、ｓｃＦｖ分子の発現を容易とする条件下で適当な容器中にて宿主細胞コロニーを培養することによって生じさせることができる。１つの具体例において、候補ｓｃＦｖ分子は宿主細胞から精製し、適当なアッセイ溶液に再度溶解させることができる。より好ましい具体例において、候補ｓｃＦｖ分子が、該ｓｃＦｖ分子が宿主細胞によって宿主細胞培養基へ分泌されるように、切断可能なシグナルペプチド配列に融合させる。なお他の好ましい具体例において、宿主細胞は、宿主細胞蛋白質と共に、候補ｓｃＦｖ分子が媒体に放出されるような条件下で培養することができる。
前記アッセイのフォーマットのいずれの自動化することが望ましいであろう。例えば、ロボットを使用して、迅速な継続にてｓｃＦｖライブラリーの各メンバーを（例えば、個々の宿主細胞コロニーとして）単離することができ、従って、それらは別々の容器中でアッセイすることができる。アッセイ容器の例はマイクロタイタープレート（例えば、９６−ウエルマイクロタイタプレート）、テストチューブ、およびミクロ−遠心機チューブを含む。
ｄ．安定化されたｓｃＦｖ分子のさらなる最適化
前記スクリーニング方法によって同定された安定なｓｃＦｖ分子は再度モデル化し、その蛋白質安定性をさらに改良するようにさらに最適化することができる。かくして、前記した工程を、初期ラウンドの最適化で同定された安定なｓｃＦｖ分子で反復することができる。別法として、２以上の安定化されたｓｃＦｖ分子からの安定化突然変異を単一ｓｃＦｖ分子において組合せて、蛋白質安定性をさらに改良することができる。
ある具体例において、本発明の方法によって同定された安定なｓｃＦｖ分子をさらに最適化することができる。例えば、以下のさらなる改変の１以上をなすことができる。１つの具体例において、安定化されたｓｃＦｖ分子は、ＶＬドメイン中のアミノ酸を、ＶＨドメイン中のアミノ酸と連結させるジスルフィド結合を導入することによってさらに安定化させることができる。例示的なジスルフィド結合は、前記セクションＩＩに記載されたジスルフィド結合のいずれかを含む。特に好ましいジスルフィド結合はＶＨ−４４−ＶＬ１００である。
他の具体例において、本発明の方法によって同定された安定なｓｃＦｖ分子は、最適な長さまたは組成を持つｓｃＦｖリンカーを導入することによってさらに最適化される。例示的なｓｃＦｖリンカーは前記セクションＩＩに記載されている。特に好ましいｓｃＦｖリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ である。
もう１つの具体例において、本発明の方法によって同定された安定なｓｃＦｖ分子は、安定化突然変異をＶＨまたはＶＬドメインの少なくとも１つに導入することによってさらに最適化される。
ＩＸ．結合分子を安定化させる方法
他の態様において、本発明は、結合分子の安定性特性を改良するための方法を提供する。これらの方法は、一般に、本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子を結合分子に一体化させ、または付着させることを含む。驚くべきことに、本明細書中における実施例に示したように、本発明のｓｃＦｖ分子はそれら自体に対して安定であるのみならず、それらは改良された安定性を、それらが一体化された結合分子に付与する。従って、本発明の方法は、貧弱な蛋白質安定性によってしばしば大規模な製造が制限される商業的に価値ある結合分子（例えば、多特異的抗体（例えば、二特異的抗体）および他の修飾された抗体）の安定性を改良するための便宜かつ信頼性がある手段を提供する。
安定化されたｓｃＦｖ分子は、当該分野で公知の蛋白質コンジュゲーション方法を用いて結合分子に一体化させることができる。１つの具体例において、安定化されたｓｃＦｖはポリペプチド、例えば、抗体分子のＮ−またはＣ−末端に直接的に連結される。もう１つの具体例において、非−ペプチドリンカーを使用して、安定化されたｓｃＦｖをポリペプチドのＮ−またはＣ−末端に連結させる。なお他の具体例において、連結ペプチドを用いて、安定化されたｓｃＦｖをポリペプチドに連結させる。例示的な具体例において、連結ペプチドは短いｇｌｙ／ｓｅｒがリッチなペプチドである。例示的なＧｌｙ／Ｓｅｒがリッチなペプチドを以下の表１にリストする。他の例示的な連結ペプチドは当該分野で公知である（例えば、国際ＰＣＴ出公開番号ＷＯ ２００５／０００８９８およびＷＯ ２００５／０００８９９参照）。１つの具体例において、本発明の安定化されたｓｃＦｖは、Ｓ（Ｇ４Ｓ）３リンカーを用いて、結合分子、例えば、抗体分子のＣ−末端に連結される。もう１つの具体例において、本発明の安定化されたｓｃＦｖは、（Ｇ４Ｓ）５リンカーを用い、結合分子、例えば、抗体分子のＮ−末端に連結される。
Figure 0005374359
 １つの具体例において、少なくとも１つの安定化されたｓｃＦｖ分子は抗体分子に付着させて、二特異的分子を作製する。もう１つの具体例において、２つの安定化されたｓｃＦｖ分子は抗体分子に付着させて、二特異的分子を作製する。
ある具体例において、本発明の安定化された結合分子の結果、慣用的なｓｃＦｖ分子または慣用的なｓｃＦｖ分子を含む結合分子と比較して増大した収率がもたらされる。収率を評価するための方法は前記セクションＶＩに記載されている。１つの具体例において、本発明の方法によって生産された安定化された結合分子は、安定化されていない結合分子に対して少なくとも１％の収率の増加を有する。他の具体例において、安定化された結合分子は、安定化されていない結合分子に対して少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも１００％の収率の増加を有する。
ある具体例において、本発明の結合分子の結果、慣用的なｓｃＦｖ分子または慣用的なｓｃＦｖ分子を含む結合分子と比較して低下した凝集がもたらされる。凝集を評価する方法は前記セクションはＶＩに記載されている。１つの具体例において、本発明の方法によって生産された安定化された結合分子は、安定化されていない結合分子に対して少なくとも１％の凝集の減少を有する。他の具体例において、安定化された結合分子は、安定化されていない結合分子に対して少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも１００％の凝集の減少を有する。
他の具体例において、本発明の結合分子の結果、慣用的なｓｃＦｖ分子または慣用的なｓｃＦｖ分子を含む結合分子と比較して増加した長期間の安定性または寿命がもたらされる。寿命を評価する方法は前記セクションＶＩに記載された％喪失または％蛋白質分解を含む。一つの具体例において、本発明の方法によって生産された安定化された結合分子は、安定化されていない結合分子に対して少なくとも一日の寿命の増加を有する。これは、結合分子の調製が、以前の日に存在した安定な結合分子の実質的に同一な量を有することを意味する。他の具体例において、安定化された結合分子が、安定化されていない結合分子に対して少なくとも２日、少なくとも５日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも６ヶ月、または少なくとも１年の寿命の増加を有する。
他の具体例において、本発明の結合分子は、慣用的なｓｃＦｖ分子または慣用的なｓｃＦｖ分子を含む結合分子と比較して、例えば、特別な宿主細胞型において発現させた場合に、改良された安定性をもたらす。例示的な具体例において、本発明の方法の結果、結合分子が宿主細胞、例えば、細菌または真核生物（例えば、酵母または哺乳動物）宿主細胞において発現された場合に、増大された安定性（例えば、増大された収率）を有する結合分子の生産がもたらされる。例示的な哺乳動物宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣
（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＬＡ（ヒト頸部癌腫）細胞、ＣＶＩ（サル腎臓系）細胞、ＣＯＳ（ＣＶＩとＳＶ４０Ｔ抗原との誘導体）細胞、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）細胞、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）細胞、ＨＡＫ（ハムスター腎臓系）細胞、ＳＰ２／Ｏ（マウスミエローマ）細胞、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ細胞（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）細胞および２９３細胞（ヒト腎臓）を含む。好ましい具体例において、２つの安定化されたｓｃＦｖ細胞を抗体分子に付着させて、ＣＨＯ細胞での分泌のための安定化された二特異的分子が作製される。
他の具体例において、安定化された結合分子を発現することができる宿主細胞をスクリーニングして、高レベルの可溶化されたおよび貧弱に折畳まれた安定化された結合分子（例えば、１０％未満の凝集を呈する結合分子）を発現することができる単細胞単離体について選択することができる。そのような方法は蛍光−活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）技術を使用することができる（例えば、Ｂｒｅｚｉｎｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ（２００３）．２７７：１４１−１５５参照）。１つの具体例において、単細胞単離体を無血清条件に適合させて、安定なプロデューサー細胞系を樹立させる。ついで、安定なプロデューサー細胞系を培養して、本発明の安定化された結合分子の大規模な製造を容易とすることができる。
他の具体例において、本発明の方法を使用して、大きな容量の培養基中の宿主細胞から発現される結合分子の安定性を改良する。例示的な具体例において、本発明の方法の結果、結合分子が少なくとも１リットルの培養基において発現された場合、増加した安定性（例えば、増加した収率）がもたらされる。他の具体例において、本発明の方法を用いて、少なくとも２リットル、少なくとも１０リットル、少なくとも２０リットル、少なくとも５０リットル、少なくとも７５リットル、少なくとも１００リットル、少なくとも２００リットル、または少なくとも５００リットルの培養基中で宿主細胞から発現させた場合に、増加した安定性（例えば、収率）を有する安定化された結合分子が生産される。例示的な具体例において、本発明の方法を用いて、培養基の各リットルについて少なくとも１０ｍｇの安定化された結合分子が生産される。
Ｘ．安定化されたｓｃＦｖ分子を含む安定化された結合分子
１つの具体例において、本発明の安定化された結合分子は融合蛋白質である。例えば、本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子は第二のｓｃＦｖ分子または非−ｓｃＦｖ分子に連結させることができる。１つの具体例において、本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子を連結されることができる非−ｓｃＦｖ分子は、少なくとも１つの更なる結合部位を提供する。例えば、本発明の結合分子に含めることができる例示的な結合部位は：リガンドの受容体結合部分、受容体のリガンド結合部分、酵素の基質結合部分、基質の酵素結合部分、または抗体の１以上の抗原結合部分を含む。ｓｃＦｖ分子を、例えば、抗体分子に連結させて修飾された抗体分子を形成でき、あるいは他のポリペプチドを連結させて、融合蛋白質を形成することができる。いくつかの例は以下に記載する。
Ａ．修飾された抗体分子
１つの具体例において、本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子を抗体またはその部分に連結させて、修飾された抗体である安定化された結合蛋白質を形成する。もう１つの具体例において、本発明の安定化されたｓｃＦｖは修飾された抗体、すなわち、天然に生じない抗体分子に連結されて、安定化された結合蛋白質を形成する。好ましい修飾された抗体構築体は以下に更に詳細に記載される。本明細書中で用いるように、用語「修飾された抗体」は、それらが天然に生じないように改変された抗体、例えば、少なくとも２つの重鎖部分を含むが、（ドメイン欠失抗体またはミニボディのような）２つの完全な重鎖を含まない抗体の合成形態；２以上の異なる抗原に、または単一抗原上の異なるエピトープに結合するように改変された抗体の多特異的形態（例えば、二特異的、三特異的など）を含む。加えて、用語「修飾された抗体」は、抗体の多価形態（例えば、同一抗原の３以上のコピーに結合する三価、四価などの抗体）を含む。
本発明の結合分子を議論する場合、本明細書中に記載された例示的な結合特異性は、本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子、本発明のｓｃＦｖ分子を含む結合分子、または双方によって付与することができると理解されるであろう。
１つの具体例において、本発明の安定化された結合蛋白質は、１以上の腫瘍抗原、または免疫障害に関連する抗原と免疫反応性であってよい。例えば、新形成障害では、開示された結合分子の結合部位（すなわち、可変領域またはその免疫反応性断片もしくは組換え体）は、悪性疾患の部位における選択された腫瘍関連抗原に結合する。同様に、１つの具体例において、結合分子は免疫細胞上に存在する少なくとも１つの選択されたマーカーに結合することができる。新形成および免疫障害に関連する報告された抗原の数、および関連抗体の数を仮定すれば、当業者であれば、現在開示された結合分子は、従って、多数の全抗体のいずれか１つに由来することができると認識するであろう。より一般的には、本発明で有用なポリペプチドは、選択された条件に関連する分子またはマーカーと反応する（文献に従前に報告されたものを含めた）いずれかの抗体から得られ、またはそれに由来することができる。更に、本発明の安定化された結合分子を生じさせるのに用いられる親または前駆体抗体、またはその断片はネズミ、ヒト、キメラ、ヒト化、非―ヒト霊長類または霊長類化であってよい。
本明細書中で用いるように、「腫瘍関連抗原」は、例えば、腫瘍細胞で発現された腫瘍細胞に一般に関連する抗原を含む。より一般的には、腫瘍関連抗原は、非−悪性細胞でのその発現に関わらず、新形成細胞への免疫反応性抗体の局所化を供する抗原を含む。そのような抗原は、例えば、悪性細胞の表面への発現が制限された比較的腫瘍特異的であり得る。別法として、そのような抗原は悪性および非−悪性細胞双方で見出すことができる。例えば、ＣＤ２０は、非−ホジキンリンパ腫の治療用の免疫治療抗体に対する極端に効果的な標的であることが判明した悪性および非−悪性Ｂ細胞の表面で見出される汎Ｂ抗原である。この点に関して、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ６およびＣＤ７のような汎Ｔ細胞抗原もまた、本発明の意味の中に腫瘍関連抗原を含む。尚他の例示的な腫瘍関連抗原は、限定されるものではないが、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＭＵＣ−１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ Ｅ６＆Ｅ７、ＴＡＧ−７２、ＣＥＡ、Ｌ６−抗原、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ５２、ＨＬＡ−ＤＲ、ＥＧＦ受容体およびＨＥＲ２受容体を含む。多くの場合、これらの抗原の各々に対する免疫反応性抗体が文献で報告されている。当業者であれば、これらの抗体の各々が、本発明に従って本発明の抗体に対する前駆体として働くことができるのを認識するであろう。
１つの具体例において、本発明の安定化された結合分子は、好ましくは、前記した腫瘍または免疫関連抗原と会合し、およびそれに結合する。従って、以下で幾分詳細に議論するように、本発明の安定化された結合分子は、腫瘍関連抗原と反応する多数の抗体のいずれかひとつに由来し、それから生じ、またはそれから製造することができる。ある具体例において、本発明の安定化された結合分子は、普通の遺伝子工学技術を用いて誘導されるドメイン欠失抗体であり、それにより、１以上の定常領域ドメインの少なくとも一部は、低下した血清中半減期のような所望の生化学的特徴を供するように欠失され、または改変される。更に詳しくは、当業者であれば、主題の安定化された結合分子の可変および／または定常領域に対応する遺伝子配列を容易に単離し、適当なヌクレオチドを欠失させ、または改変して本発明に従ってモノマーサブユニットとして用いられる本発明のポリペプチドを提供することを容易に改変することができる。
腫瘍関連抗原と反応する従前に報告された抗体は、本発明明細書中に記載されたように安定化させて、本発明の安定化された結合分子を提供することができる。開示された安定化された結合分子を生じさせる、または誘導するために抗原結合領域を供するのに用いることができる例示的な抗体は、限定されるものではないが、２Ｂ８およびＣ２Ｂ８（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）およびＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、Ｌｙｍ１およびＬｙｍ２（Ｔｅｃｈｎｉｃｌｏｎｅ）、ＬＬ２（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ Ｃｏｒｔ．，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、ＨＥＲ２（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｇｅｎｉｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、Ｂ１（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｐｈａｒｍ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、アマゴモバブ（Ｍｅｎａｒｉｎｉ，Ｉｔａｌｙ）、ＣＥＡ−ＳｃａｎＴＭ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｍｏｒｒｉｓ Ｐｌａｉｎｓ，ＮＪ）、カプロマブ（Ｐｒｏｓｔａｓｃｉｎｔ（登録商標）、Ｃｙｔｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）、エドレコロマブ（Ｐａｎｏｒｅｘ（登録商標）、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）、イゴボマブ（ＣＩＳ Ｂｉｏ Ｉｎｔｌ．，Ｆｒａｎｃｅ）、ミツモバブ（ＢＥＣ２，Ｉｍｃｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＮＪ）、ノフェツモマブ（Ｖｅｒｌｕｍａ（登録商標）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｌｅｈｅｉｍ，Ｒｉｄｇｅｆｉｅｌｄ，ＣＴ）、ＯｖａＲｅｘ（Ａｌｔａｒｅｘ Ｃｏｒｐ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、サツモマブ（Ｏｎｏｓｃｉｎｔ（登録商標），Ｃｙｔｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標），Ｉｍｃｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｓ．Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、アポリズマブ（ＲＥＭＩＴＯＧＥＮＴＭ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）、ラベツズマブ（ＣＥＡＣＩＤＥＴＭ，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｍｏｒｒｉｓ Ｐｌａｉｎｓ，ＮＪ）、ペルツズマブ（ＯＭＮＩＴＡＲＧＴＭ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｓ．，Ｓ．Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、ＭＢ１、ＢＨ３、Ｂ４、Ｂ７２．３（Ｃｙｔｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．），ＣＣ４９（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）および５Ｅ１０（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ）を含む。主題の結合分子に一体化させることができる他の結合部位はＯｒｔｈｏｃｌｏｎｅ ＯＫＴ３（ＣＤ３）、ＲｅｏＰｒｏ（ＧｐＩＩｂ／ｇＩＩａ）、Ｚｅｎａｐａｘ（Ｃ２５）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（ＴＮＦ−ａ）、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（ＣＤ２５）、Ｓｙｎａｇｉｓ（ＲＳＶ）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（ＣＤ３３）およびＣａｍｐａｔｈ（ＣＤ５２）に見出されるものを含む。好ましい具体例において、本発明の安定化された結合分子は、直前に例示した抗体と同一の腫瘍関連抗原に結合するであろう。特に好ましい具体例において、安定化された結合分子は、２Ｂ８、Ｃ２Ｂ８、ＣＣ４９およびＣ５Ｅ１０と同一の抗原に由来し、またはそれに結合し、なおより好ましくは、ＣＨ２ドメインの全てのまたは一部を欠如するであろう。
１つの具体例において、本発明の結合分子は以下の抗体の１以上に由来する１以上の結合部位を有することができる。トシツモマブ（ＢＥＸＸＡＲ（登録商標））、ムロモナブ（ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ（登録商標））およびイブリツモマブ（ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標））、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸＴＭ）、リツキシマブ（ＭＡＢＴＨＥＲＡ（登録商標）／ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、アブシキシマブ（ＲＥＯＰＲＯ（登録商標））およびバシキシマブ（ＳＩＭＵＬＥＣＴ（登録商標））エファリズマブ（ＲＡＰＴＩＶＡ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））、トラスツマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、ゲムツズマブ（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標））、パリビズマブ（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標））、オマリズマブ（ＸＯＬＡＩＲ（登録商標））、ダクリズマブ（ＺＥＮＡＰＡＸ（登録商標））、ナタリズマブ（ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標））およびラニビスマブ（ＬＵＶＥＮＴＩＳ（登録商標））、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））、およびパニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））。
１つの具体例において、本発明の安定化された結合分子がＣＤ２３に結合する（米国特許第６，０１１，１３３８号）。好ましい具体例において、本発明の安定化された結合分子は５Ｅ８抗体と同一のエピトープに結合する。もう１つの具体例において、本発明の結合分子は抗−ＣＤ２３抗体、例えば、５Ｅ８抗体からの少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、または６のＣＤＲ）を含む。
１つの具体例において、本発明の安定化された結合分子はＴＮＦ受容体に結合する。１つの例示的な具体例において、本発明の安定化された結合分子はＬＴβＲに結合する。もう１つの例示的な具体例において、本発明の安定化された結合分子はＴＲＡＩＬ受容体に結合する。もう１つの具体例において、本発明の安定化された結合分子は抗―ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体（例えば、ネズミまたはキメラ１４Ａ２）からの少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５または６のＣＤＲ）を含む。もう１つの具体例において、本発明の安定化された結合分子は抗―ＬＴβＲ抗体からの少なくとも１つのＣＤＲを含む。抗−ＬＴβＲ抗体の例はＢＫＡ１１、ＣＤＨ１０、ＢＣＧ６、ＡＧＨ１、ＢＤＡ８、ＣＢＥ１１およびＢＨＡ１０を含む。
１つの具体例において、本発明の安定化された結合分子はＣＲＩＰＴＯ−Ｉ抗原（ＷＯ０２／０８８１７０Ａ２またはＷＯ０３／０８３０４１Ａ２）に結合する。好ましい具体例において、本発明の安定化された結合分子はＢ３Ｆ６抗体と同一のエピトープに結合する。もう１つの具体例において、本発明の安定化された結合分子は、抗―ＣＲＩＰＴＯ−Ｉ抗体、例えば、Ｂ３Ｆ６抗体からの少なくとも１つのＣＤＲを含む。
１つの具体例において、安定化された結合分子はＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）と同一の腫瘍関連抗原に結合するであろう。（リツキシマブ、ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８およびＣ２Ｂ８としても知られた）Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）はヒトＢ−細胞リンパ腫の治療用の最初のＦＤＡに認可されたモノクローナル抗体であった（その各々をここに引用して援用する米国特許第５，８４３，４３９号、第５，７７６，４５６号および第５，７３６，１３７号参照）。Ｙ２Ｂ８（９０Ｙ標識２Ｂ８；Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）；イブリツモマブチウキセタン）はＣ２Ｂ８のネズミ親である。Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）は、成長阻害性であって、イン・ビトロにて化学療法剤によるアポトーシスについてのある種のリンパ腫細胞系を報告されているところによれば感受性化するキメラ抗−ＣＤ２０モノクロナル抗体である。該抗体はヒト補体に効果的に結合し、強いＦｃＲ結合を有し、補体依存性（ＣＤＣ）および抗体−依存性（ＡＤＣＣ）メカニズム双方を介してイン・ビトロにてヒトリンパ球を効果的に殺傷することができる（Ｒｅｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８３：４３５−４４５（１９９４））。当業者であれば、本開示に従って修飾されたＣ２Ｂ８または２Ｂ８のダイマー変種（ホモダイマーまたはヘテロダイマー）をコンジュゲートされた、またはコンジュゲートされていない形態で用いて、ＣＤ２０＋悪性疾患を示す患者を効果的に治療することができるのを認識するであろう。より一般的には、本明細書中に開示された安定化された結合分子は、「裸の」またはコンジュゲートされていない状態で用いることができるか、あるいは細胞障害剤にコンジュゲートさせて、多数の障害のいずれか１つを効果的に治療することができる。
本発明の他の好ましい具体例において、本発明の安定化された結合分子は、ＣＣ４９と同一の腫瘍関連抗原に由来し、またはそれに結合するであろう。ＣＣ４９は、ヒト起源のある種の腫瘍細胞、具体的には、ＬＳ１７４Ｔ腫瘍細胞系の表面に会合するヒト腫瘍関連抗原ＴＡＧ−７２に結合する。ＬＳ１７４Ｔ［Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ここではＡＴＣＣ）Ｎｏ．ＣＬ１８８］は、ＬＳ１８０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＬ１８７）結腸腺癌系の変種である。ＴＡＧ−７２に対する結合特異性を有する多数のネズミモノクローナル抗体が開発されていることが更に認識されるであろう。Ｂ７２．３と命名されたこれらのモノクローナル抗体の１つは、ハイブリドーマＢ７２．３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ−８１０８）によって生産されるネズミＩｇＧ１である。Ｂ７２．３は、免疫原としてヒト乳癌腫抽出物を用いて発生させた初代モノクローナル抗体である（その各々をここに引用して援用するＣｏｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），７８：３１９９−３２０３（１９８１）；および米国特許第４，５２２，９１８号および第４，６１２，２８２号参照）。ＴＡＧ−７２に対して向けられた他のモノクローナル抗体は（結腸癌のための）「ＣＣ」と命名されている。Ｓｃｈｌｏｍ ｅｔ ａｌ．（ここに引用して援用する米国特許第５，５１２，４４３号）によって記載されているように、ＣＣモノクローナル抗体は、Ｂ７２．３で精製された、ＴＡＧ−７２を用いて調整された二世代ネズミモノクローナル抗体のファミリーである。ＴＡＧ−７２に対するその比較的良好な結合親和性のため、以下のＣＣ抗体は、アクセス制限が要求されて、ＡＴＣＣに寄託されている：ＣＣ４９（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ９４５９）；ＣＣ８３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ９４５３）；ＣＣ４６（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ９４５８）；ＣＣ９２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ９４５４）；ＣＣ３０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ９４５７）；ＣＣ１１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ９４５５）およびＣＣ１５（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ９４６０）。米国特許第５，５１２，４４３号は、更に、開示された抗体が、当該分野で知られた組換えＤＮＡ技術によって、例えば、マウス定常領域に代えてヒト定常領域（Ｆｃ）ドメインで置換することによってそのキメラ形態に改変できることを教示する。ネズミおよびキメラ−ＴＡＧ−７２抗体の開示以外に、Ｓｃｈｌｏｍｅ ｅｔ ａｌ．は、その各々がやはり引用して援用される、ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５５５２に開示されたヒト化ＣＣ４９抗体の変種、および米国特許第５，８９２，０１９号に開示された単一鎖構築体も生産した。当業者であれば、これまでの抗体、構築体または組換え体、およびその変異の各々を修飾し、それを用いて、本発明に従ってポリペプチドを提供することができることを認識するであろう。
先に議論した抗−ＴＡＧ−７２抗体に加えて、種々のグループが、やはり、ドメイン−欠失ＣＣ４９およびＢ７２．３抗体の構築及び部分的な特徴付けを報告している（例えば、Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，８（１）：９５−１０９（１９９３），Ｓｌａｖｉｎ−Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５３：９７−１０３（１９９３）およびＳｌａｖｉｎ−Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．５５：５９５７−５９６７（１９９５））。
本発明のなお他の好ましい具体例は、Ｃ５Ｅ１０と同一の腫瘍関連抗原に由来し、またはそれに結合する結合部位を含む。同時係属出願０９／１０４，７１７に記載されているように、Ｃ５Ｅ１０は、前立腺腫瘍細胞系（例えば、ＤＵ１４５、ＰＣ３、またはＮＤ１）に特異的なように見えるほぼ１１５ｋＤａの糖蛋白質決定基を認識する抗体である。かくして、本発明と組合せて、Ｃ５Ｅ１０抗体によって認識される同一腫瘍関連抗原に特異的に結合する安定化された結合分子（例えば、ＣＨ２ドメイン−欠失抗体）を、新形成障害の治療のためにコンジュゲートされたまたはコンジュゲートされていない形態で生産し、用いることができよう。特に好ましい具体例において、安定化された結合分子は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８６５を有するハイブリドーマ細胞系から分泌されたＣ５Ｅ１０抗体の抗原結合領域の全てまたは一部に由来し、またはそれを含むであろう。次いで、得られた安定化された結合分子を以下に記載するように放射性核種にコンジュゲートし、本明細書中における方法と組合せて前立腺癌にかかった患者に投与することができよう。
ある具体例において、本発明の安定化された結合分子は、例えば、後記セクションＣにて本明細書中に記載された結合特異性の少なくとも１つを有する。もう１つの具体例において、本発明の安定化された結合分子は、例えば、後記セクションＢまたはＣにて、例えば、本明細書中に記載された注目する標的分子に結合することができる。
免疫―細胞障害（例えば、Ｂ−細胞障害）に関連する抗原と反応する従前に報告された抗体は、本明細書中に記載されたように安定化して、本発明の安定化された結合分子を提供することができる。抗原結合領域を供して、開示された安定化された結合分子を生じさせ、または誘導するのに用いる事ができる例示的な抗体は、限定されるものではないが、抗−ＴＮＦα抗体（例えば、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標），Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｈｏｒｓｈａｍ，ＰＡ）；ＭＡＫ１９５−Ｆ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ．，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）；アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標），Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ．，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）；抗−ＣＤ３抗体（例えば、Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ（ＯＫＴ（登録商標），ＯｒｔｈｏＢｉｏｔｅｃｈ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）；ＭＥＤＩ−５００（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）；ビシビズマブ（ＮＵＶＩＯＮ（登録商標），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ））、抗−ＩｇＥ抗体（例えば、オマリズマブ、ＸＯＬＡＩＲ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、抗−ＶＬＡ−４抗体（例えば、ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標），ＢｉｏｇｅｎＩｄｅｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、抗−ＣＤ１４７抗体（例えば、ＡＢＸ−ＣＢＬ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ））、抗−ＣＤ２５抗体（例えば、バシリキシマブ、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標）（Ｅａｓｔ Ｈａｎｏｖｅｒ，ＮＪ）；イノリモマブ（ＯＰＩ，Ｆｒａｎｃｅ）、抗−ＣＤ１８抗体（例えば、オデュリモマブ、Ａｎｔｉｌｆａ（登録商標），Ｐａｔｅｕｒ Ｍｅｒｉｕｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ）、抗−ＮＣＡ９０（例えば、スレソマブ、Ｌｅｕｋｏｓｃａｎ（登録商標），Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｍｏｒｒｉｓ Ｐｌａｉｎｓ，ＮＪ）、抗−ＧｐＩＩｂ／ｇＩＩａ抗体（例えば、アブシキシマブ、ＲｅｏＰｒｏ（登録商標），Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｈｏｒｓｈａｍ，ＰＡ）、抗―Ｃ２５抗体（例えば、Ｚｅｎａｐａｘ）、抗―ＣＤ３３抗体（例えば、Ｍｙｌｏｔａｒｇ）、および抗−ＣＤ２５抗体（例えば、アレムツズマブ、Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）（Ｍｉｌｌｅｎｅｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ））を含む。好ましい具体例において、本発明の安定化された結合分子は、直前に列挙された抗体と同一の免疫−細胞関連抗原に結合するであろう。
１つの具体例において、用語、本発明による「修飾された抗体」は、免疫グロブリン、抗体、またはその免疫反応性断片もしくは組換え体を含む、そこでは、定常領域ドメインの１以上の少なくともある分率が、非−共有結合的に二量体化する能力、腫瘍の部位に局所化される増大した能力、またはほぼ同一の免疫原性の完全な改変されていない抗体と比較した場合の低下した半減期のような所望の生化学的特徴を供するように欠失され、またはそうでなければ改変されている。好ましい具体例において、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖と同様なポリペプチド鎖を含むが、１以上の重鎖ドメインの少なくとも一部を欠如するドメイン欠失抗体である。１つの具体例において、安定化された結合蛋白質の定常領域の１つの完全なドメインが欠失されるであろう。もう１つの具体例において、ＣＨ２ドメインの全部または一部が欠失されるであろう。
１つの具体例において、本発明の安定化された結合蛋白質はミニボディである。ミニボディは、各々が安定化されたｓｃＦｖ分子（１以上の抗原結合部位、例えば、連結ペプチドを介してＣＨ３ドメインに融合されたＶＨドメインにフレキシブルなリンカーによって連結されたＶＬドメインを含む単一ポリペプチド）を含む、２つのポリペプチド鎖から形成されたキメラ分子である。
ミニボディは、当該分野で記載された方法を用いて、ｓｃＦｖ成分を構築し、ペプチド−ＣＨ３成分を連結することによって作製することができる（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号またはＷＯ ９４／０９８１７Ａ１参照）。これらの成分は、制限断片として別々のプラスミドから単離し、次いで、連結し、適当なベクターに再度クローン化することができる。適当な組立体は、制限消化およびＤＮＡ配列分析によって確証することができる。
もう１つの具体例において、四価ミニボディを構築することができる。四価ミニボディは、２つのｓｃＦｖ分子が、例えば、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）４Ｇ３ＡＳを有するフレキシブルなリンカーを用いて連結されている以外はミニボディと同様にして構築することができる。
１つの具体例において、四価抗体は、抗体をコードするＤＮＡ配列をｓｃＦｖ分子と組合せることによって生産することができる。例えば、１つの具体例において、これらの配列は、ｓｃＦｖ分子がフレキシブルなリンカー（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３のようなｇｌｙ／ｓｅｒリンカー）を介して抗体のＣＨ３ドメインにそのＮ−末端において連結されるように組み合わされる。
もう１つの具体例において、四価抗体は、安定化されたｓｃＦｖ分子を、ＣＨ１ドメインに融合された連結ペプチドに融合させて、安定化されたｓｄＦｖ−Ｆａｂ四価分子を構築することによって作製することができる（Ｃｏｌｏｍａ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ．１９９７．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１５：１５９；ＷＯ ９５／０９９１７）。
１つの具体例において、本発明の安定化された結合分子は、軽鎖のＮ−末端に付着されたｓｃＦｖ内の四価または二特異的四価抗体を含む。本発明のもう１つの具体例において、結合分子は、重鎖のＮ−末端に付着されたｓｃＦｖ内に四価または二特異的四価ＣＨ２ドメイン−欠失抗体を含む。１つの具体例において、ｓｃＦｖのＮ−末端への付着の結果、ｓｄＦｖがカルボキシ−末端において付着している分子と比較して分子の低下した凝集をもたらす。
本発明の安定化された結合分子で用いる抗体またはその断片は、当該分野で認められたプロトコルを用いて得ることができ、例えば、抗体は、好ましくは、関連抗原（例えば、精製された腫瘍関連抗原、または細胞、またはそのような抗原を含む細胞抽出物）およびアジュバントの複数の皮下または腹腔内注射によって哺乳動物において生起させる。この免疫化は、典型的には、活性化された脾臓細胞またはリンパ球からの抗原−反応性抗体の生産を含む免疫応答を誘導する。得られた抗体を動物の血清から収穫して、ポリクローナル調製物が得られるが、脾臓、リンパ節または末梢血液から個々のリンパ球を単離して、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の均一な調製物を得るのがしばしば望ましい。好ましくは、リンパ球は脾臓から単離される。
このよく知られたプロセス（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））においては、抗原を注射された哺乳動物からの比較的短い寿命の、または死滅すべきリンパ球を不滅腫瘍細胞系（例えば、ミエローマ細胞系）と融合させ、かくして、ハイブリッド細胞または「ハイブリドーマ」が生産され、これは、共に、不滅であって、Ｂ細胞の遺伝子的にコードされた抗体を生産することができる。得られたハイブリッドは、単一抗体の形成のために、特異的遺伝子を含む各個々の株での選択、希釈および再成長によって単一遺伝子的株に分離される。それらは抗体を生産し、それは望まれる抗原に対して均一であり、それらの純粋な遺伝子的起源を参照すると、「モノクローナル」と呼ばれる。
各調整されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは、融合していない親ミエローマ細胞の成長または生存を阻害する１以上の物質を含有する適当な培養基に撒き、成長させる。当業者であれば、ハイブリドーマの形成、選択および成長のための試薬、細胞系および培地は多数の源から商業的に入手可能であって、標準化されたプロトコルがよく確立されている。一般に、ハイブリドーマ細胞が成長する培養基は、望まれる抗原に対するモノクローナル抗体の生産についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生産されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈澱によって、あるいはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）のようなイン・ビトロアッセイによって決定される。望まれる特異性、親和性および／または活性の抗体を生産するハイブリドーマ細胞が同定されたのち、限界希釈手法によってクローンをサブクローンし、標準的な方法によって成長させる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテイン−Ａ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気詠動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーのような慣用的精製手法によって、培養基、腹水または血清から分離する事ができるのは更に認識されるであろう。
もう１つの具体例において、望まれるモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、（例えば、ネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離し、慣用的な手法を用いて配列決定することができる。単離され、サブクローンされたハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい源として働く。一旦、単離されたならば、ＤＮＡを発現ベクターに入れることができ、次いで、これを、免疫グロブリンを生産しない、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター断層（ＣＨＯ）細胞またはミエローマ細胞のような原核生物または真核生物宿主細胞にトランスフェクトされる。更に詳しくは、（本明細書中に記載されたように合成であってよい）単離されたＤＮＡを用いて、ここに引用して援用する１９９５年１月２５日に出願されたＮｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，６５８，５７０号に記載されたように、製造抗体のために定常および可変領域配列をクローン化することができる。本質的には、これは、選択された細胞からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの変換、およびＩｇ特異的プライマーを用いるＰＣＲによる増幅を含む。この目的に適したプライマーは米国特許第５，６５８，５７０号にやはり記載されている。以下により詳細に議論するように、望まれる抗体を発現する形質転換細胞を比較的多量に成長させて、免疫グロブリンの臨床的および商業的供給を供することができる。
当業者であれば、抗体または抗体断片（例えば、抗原結合部位）をコードするＤＮＡは、例えば、ｐｄファージまたはＦｄファゲミド技術を用いて抗体ファージライブラリーから誘導することもできることも認識するであろう。例示的な方法は、例えば、その各々をここに引用して援用する、ＥＰ ３６８ ６８４ Ｂ１；米国特許第５，９６９，１０８号，Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ． ａｎｄ Ｃｈａｍｅｓ．２０００．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１：３７１；Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．２００２．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８０１；Ｈｕｉｅ ｅｔ ａｌ．２００１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：２６８２；Ｌｕｉ ｅｔ ａｌ．２００２．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５：１０６３に記載されている。いくつかの刊行物（例えば、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３（１９９２））は、大きなファージライブラリーを構築するための戦略として、鎖シャフリング、ならびにコンビナトーリアル感染およびイン・ビボ組換えによる高親和性ヒト抗体の生産を記載している。もう１つの具体例において、リボソーム表示を用いて、表示プラットフォームとしてのバクテリオファージを置換えることができる（例えば、Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．２０００．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２８７； Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２００１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：３７５０；またはＩｒｖｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２００１ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８：３１参照）。なおもう１つの具体例において、細胞表面ライブラリーを抗体についてスクリーニングすることができる（Ｂｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．２０００．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１０７０１；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．２０００ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４３：２１１）。そのような手法は、モノクローナル抗体の単離および引き続いてのクローニングのための伝統的なハイブリドーマ技術に対する代替法を提供する。
本発明のもう１つの具体例において、本発明の結合分子の結合部位は、ヒトまたは実質的にヒト抗体によって供することができる。ヒトまたは実質的にヒト抗体は、内因性免疫グロブリン生産ができないトランスジェニック動物（例えば、マウス）において作製することができる（例えば、その各々を引用して援用する、米国特許第６，０７５，１８１号、第５，９３９，５９８号、第５，５９１，６６９号および第５，５８９，３６９号参照）。例えば、キメラおよび生殖系突然変異体マウスにおける抗体重鎖接合領域のホモ接合性欠失の結果、内因性抗体生産の完全な阻害がもたらされることが記載されている。ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイのそのような染色系突然変異体マウスへの導入の結果、抗原挑戦に際してヒト抗体の生産がもたらされるであろう。ＳＣＩＤマウスを用いてヒト抗体を生産するもう１つの好ましい手段は、ここに引用して援用する米国特許第５，８１１，５２４号に開示されている。これらのヒト抗体に関連する遺伝物質もまた本明細書中に記載されるように単離し、操作することもできるのは認識されるであろう。
組換え抗体を生じさせるためのなおもう１つの高度に効果的な手段は、Ｎｅｗｍａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１４５５−１４６０（１９９２）によって開示されている。具体的には、この技術の結果、サル可変ドメインおよびヒト定常配列を含有する霊長類化抗体の生成がもたらされる。この参照は、ここに引用してその全体を援用する。更に、この技術は、その各々がここに引用して援用される、共通に譲渡された米国特許第５，６５８，５７０号、第５，６９３，７８０号および第５，７５６，０９６号にやはり記載されている。
もう１つの具体例において、リンパ球は、マイクロ操作および単離された可変遺伝子によって選択することができる。例えば、末梢血液単核細胞は、免疫化哺乳動物から単離し、イン・ビトロにて約７日間培養することができる。培養は、スクリーニング基準を満たす特異的ＩｇＧについてスクリーニングすることができる。陽性ウェルからの細胞を単離することができる。個々のＩｇ−生産Ｂ細胞は、ＦＡＣＳによって、あるいは補体−媒介溶血プラークアッセイにおいてそれらを同定することによって単離することができる。Ｉｇ−生産Ｂ細胞はチューブにミクロ操作することができ、ＶＨおよびＶＬ遺伝子は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅することができる。ＶＨおよびＶＬ遺伝子は、発現のために、抗体発現ベクターにクローン化することができ、細胞（例えば、真核細胞または原核細胞）にトランスフェクトすることができる。
更に、本発明の結合分子を生産するのに有用な遺伝子配列は多数の異なる源から得ることができる。例えば、先に徹底的に議論したように、種々のヒト抗体遺伝子は公にアクセスできる寄託の形態で利用可能である。抗体及び抗体−コーディング遺伝子の多くの配列は既に公開されており、適当な抗体遺伝子を、当該分野で認められた技術を用いてこれらの配列から化学合成することができる。本発明のこの態様に適合するオリゴヌクレオチド合成技術は当業者によく知られており、いくつかの商業的に利用可能な自動合成器のいずれかを用いて行うことができる。加えて、本明細書中に記載された重鎖および軽鎖のいくつかのタイプをコードするＤＮＡ配列は、商業的ＤＮＡ合成販売業者のサービスを通じて得ることができる。次いで、これまでの方法のいずれかを用いて得られた遺伝物質を改変し、または合成のものとして、本発明のポリペプチドを得ることができる。
別法として、抗体−生産細胞系を選択し、当業者によく知られた技術を用いて培養する事ができる。そのような技術は種々の実験室マニュアルおよび主な刊行物に記載されている。この点に関して、以下に記載する本発明で用いるのに適した技術は、ここに引用して、別冊を含めてその全体を援用する、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９１）に記載されている。
本発明の範囲は、当該分野で認められた抗原結合ＤＮＡ配列および本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子の対立遺伝子、変種及び突然変異体を含む安定化された結合分子を含むのが更に認識されるであろう。
よく知られているように、ＲＮＡは、イソチオシアン酸グアニジウム抽出および沈殿、続いての遠心またはクロマトグラフィーのような標準的技術によって、元のハイブリドーマ細胞から、または他の形質転換細胞から単離することができる。望ましい場合、オリゴｄＴセルロース上のクロマトグラフィーのような標準的技術によって、ｍＲＮＡを全ＲＮＡから単離することができる。適当な技術は当該分野において精通されている。
１つの具体例において、抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、よく知られた技術に従って逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼを用いて同時にまたは別々に作製することができる。ＰＣＲは、公表された重鎖および軽鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列に基づいて、コンセンサス定常領域プライマーによって、またはより特異的なプライマーによって開始することができる。先に議論したように、ＰＣＲを用いて、抗体軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離することができる。この場合、ライブラリーは、コンセンサスプライマーあるいはマウス定常領域プローブのようなより大きな相同プローブによってスクリーニングすることができる。
ＤＮＡ、典型的にはプラスミドＤＮＡは、例えば、組換えＤＮＡ技術に関連するこれまでの刊行物において詳細に記載された標準的なよく知られた技術に従って、当該分野で知られた技術を用いて細胞から単離し、制限マッピングし、配列決定することができる。もちろん、ＤＮＡは、単離プロセスまたは引き続いての分析の間のいずれの時点においても本発明に従って合成的であり得る。本発明の結合分子で用いられる例示的な抗体またはその断片は、本明細書中に記載された標的を認識する抗体を含む。
ある具体例において、抗体の抗原結合断片は、当該分野でよく知られた技術を用いて生産することができる。
１つの具体例において、本発明の結合分子は完全な抗体分子および安定化されたｓｃＦｖ分子を含むことができる。もう１つの具体例において、本発明の結合分子は抗体分子の一部及び安定化されたｓｃＦｖ分子を含むことができる。
１つの具体例において、本発明の結合分子は抗体の断片または部分、および安定化されたｓｃＦｖ分子を含む。例えば、１つの具体例において、本発明の結合分子はドメイン欠失抗体および安定化されたｓｃＦｖ分子を含むことができる。ドメイン欠失抗体は、１以上のドメインが部分的にまたは全体的に欠失された抗体分子である。特に好ましい具体例において、適合する安定化された結合分子はドメイン欠失構築体または変種を含み、そこでは、全ＣＨ２ドメインが除去されている（ΔＣＨ２構築体）。他の好ましい具体例では、短い連結ペプチドが、欠失されたドメインに代えて置換されて、可変領域についての柔軟性及び移動の自由を供することができる。当業者であればそのような構築体は、抗体の異化速度に対するＣＨ２ドメインの調節特性のため特に好ましいと認識されるであろう。
ドメイン欠失構築体は、ＩｇＧ１ヒト定常ドメイン（例えば、ＷＯ ０２／０６０９５５Ａ２およびＷＯ ０２／０９６９４８Ａ２）をコードする（例えば、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏから）ベクターを用いて誘導することができる。これらの例示的構築体は、本発明の各ポリペプチドのヒンジ領域に直接的にＣＨドメインを融合させて作製されたことに注意される。他の構築体においては、ヒンジ領域および合成ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインの間にペプチドスペーサーを供するのが望ましいであろう。例えば、適合する構築体を発現させる事ができ、そこでは、ＣＨ２ドメインが欠失されており、残りのＣＨ３ドメイン（合成または非合成）を５ないし２０アミノ酸スペーサーにてヒンジ領域に接合させる。そのようなスペーサーを加えて、例えば、定常ドメインの調節エレメントが自由かつ接近可能なままであり、あるいはヒンジ領域がフレキシブルなままであることを保障することができる。例えば、ＣＨ２ドメインの代わりに置換された短いアミノ酸スペーサーおよびより短いヒンジ領域を有するドメイン欠失Ｂ３Ｆ６構築体（Ｂ３Ｆ６．ΔＣＨ２［ｇｌｙ／ｓｅｒ］）を用いることができる。他の例示的な連結ペプチドは当該分野で知られている（例えば、国際ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ ２００５／０００８９８およびＷＯ ２００５／０００８９９参照）。これらの連結ペプチドは、本発明の結合分子と組合せて用いることができる。好ましくは、連結ペプチドは、ＣＨ２重鎖ドメインを欠如するポリペプチドと共に用いられる。好ましくは、本発明に適合するいずれの連結ペプチドも、比較的非−免疫原性であって、本発明のポリペプチドの非−共有結合会合を阻害しない。
１つの具体例において、モノマーサブユニットの間の所望の共有結合または非−共有結合会合を許容する限り、本発明の結合分子が、数個または単一のアミノ酸さえの欠失または置換を有する免疫グロブリン重鎖を含む。例えば、ＣＨ２ドメインの選択された領域における単一アミノ酸の突然変異は、Ｆｃ結合を実質的に低下させ、それにより、腫瘍の局所化を増大させるのに十分であろう。同様に、調節すべきエフェクター機能（例えば、補体結合）を制御する１以上の定常領域ドメインのその部分を単に欠失させるのが望ましいであろう。定常領域のそのような部分的欠失は、主題の定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能を無傷のままとしつつ、抗体の選択された特徴（血清中半減期）を改良することができる。更に、前記で示唆したように、開示された抗体の定常領域は、得られた構築体のプロフィールを増強させる１以上のアミノ酸の突然変異または置換を通じて合成的とする事ができる。この点に関して、安定化された結合分子の立体配置および免疫原性プロフィールを実質的に維持しつつ、保存された結合部位（例えば、Ｆｃ結合）によって供される活性を破壊することが可能であろう。なお他の好ましい具体例は、エフェクター機能のような望ましい特徴を増強させ、あるいはより多くのサイトトキシンまたは炭水化物付着を供するための、１以上のアミノ酸の定常領域への付加を含むことができる。そのような具体例において、選択された定常領域ドメインに由来する特異的配列を挿入し、または複製するのが望ましいであろう。
定常領域がいくつかのエフェクターの機能を媒介するのは当該分野で知られている。例えば、補体のＣ１成分の抗体への結合は補体系を活性化する。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン化および溶解で重要である。補体の活性化は炎症応答を刺激し、自己免疫過敏にも関与し得る。更に、抗体はＦｃ領域を介して細胞に結合し、抗体Ｆｃ領域のＦｃ受容体部位は細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する。ＩｇＧ（ガンマ受容体）、ＩｇＥ（イプシロン受容体）、ＩｇＡ（アルファ受容体）およびＩｇＭ（ミュー受容体）を含めた、抗体の異なるクラスに対して特異的な多数のＦｃ受容体がある。細胞表面のＦｃ受容体への抗体の結合は、抗体−被覆粒子の飲み込みおよび破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体―被服標的細胞の溶解（抗体−依存性細胞−媒介細胞傷害性、またはＡＤＣＣと呼ばれる）、炎症メディエーターの放出、胎盤導入および免疫グロブリン生産の制御を含めた、多数の重要かつ多様な生物学的応答をトリガーする。
１つの具体例において、標的細胞を枯渇させることができないと考えられるＩｇＧ４抗体の定常領域を用い、またはＦｃ変種を作製することによってエフェクター機能を排除し、低下させることができ、ここに、エフェクター機能に対して臨界的なＦｃ領域中の残基は、当該分野で公知の技術、例えば、米国特許第５，５８５，０９７号を用いて突然変異させる。例えば、定常領域ドメインの（点突然変異または他の手段を通じての）欠失または不活化は、安定化された結合分子を循環し、それにより、腫瘍局所化を増加させるＦｃ受容体結合を低下させることができる。他の場合においては、本発明と合致する定常領域修飾は補体結合を和らげ、かくして、血清中半減期、およびコンジュゲートしたサイトトキシンの非特異的会合を低下させるようである。定常領域のなお他の修飾を用いて、ジスルフィド結合またはオリゴ糖分子を修飾することができ、これは、増大した抗原特異性または抗体フレキシビリティによる増強された局所化を可能とする。より一般的には、当業者であれば、本明細書中に記載されたように修飾された抗体は、容易に認識できるまたはできない多数の些細な効果を発揮できることを認識するであろう。しかしながら、得られた生理学的プロフィール、生物学的利用性、ならびに腫瘍局所化、生体内分布および血清中半減期のような修飾の他の生化学的効果は、過度な実験なくしてよく知られた免疫学的技術を用いて測定し、定量することができる。
１つの具体例において、抗体の修飾された形態は、当該分野で知られた技術を用いて前駆体または親抗体から作製することができる。例示的な技術は本明細書中においてより詳細に議論する。
Ｂ．修飾された融合蛋白質
ある具体例において、本発明の安定化された結合分子は修飾された融合蛋白質である。１つの例示的な具体例において、本発明の結合分子は、受容体のリガンド−結合領域、接着分子、リガンド、または酵素に連結された安定化されたｓｃＦｖ分子を含む融合蛋白質である。もう１つの例示的な具体例において、本発明の結合分子は、リガンドの受容体結合部分に連結された安定化されたｓｃＦｖ分子を含む融合蛋白質である。例えば、本発明の結合分子は、以下の分子の１以上に対する安定化されたｓｃＦｖ分子を含む融合蛋白質である：
サイトカインおよびサイトカイン受容体
サイトカインはリンパ球の増殖、分化、および機能的活性化に対して多面的効果を有する。種々のサイトカイン、またはその受容体結合部分は、本発明の融合蛋白質で利用することができる。例示的なサイトカインはインターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、およびＩＬ−１８）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えば、顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および単球マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ））、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファおよびベータ、およびインターフェロン−α、β、またはγのようなインターフェロンを含む（米国特許第４，９２５，７９３号および第４，９２９，５５４号）。
サイトカイン受容体は、典型的には、リガンド−特異的アルファ鎖および共通ベータ鎖よりなる。例示的なサイトカイン受容体は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３（米国特許第５，６３９，６０５号）、ＩＬ−４（米国特許第５，５９９，９０５号）、ＩＬ−５（米国特許第５，４５３，４９１号）、ＩＦＮγ（ＥＰ０２４０９７５）に対するもの、および受容体のＴＮＦファミリー（例えば、ＴＮＦα（例えば、ＴＮＦＲ−１（ＥＰ ４１７，４６３）、ＴＮＦＲ−２（ＥＰ ４１７，０１４）リンフォトキシンベータ受容体）を含む。
もう１つの具体例において、本発明のｓｃＦｖ分子はサイトカインまたはサイトカイン受容体に結合することができる。
接着蛋白質
接着分子は、細胞を相互に相互作用させる膜−結合蛋白質である。その受容体結合部分の、白血球ホーミング受容体および細胞接着分子を含めた、種々の接着蛋白質を本発明の結合分子に組み込むことができる。白血球ホーミング受容体は炎症の間に白血球細胞表面に発現され、これは、細胞外マトリックス成分への結合を媒介するβ−１インテグリン（例えば、ＶＬＡ−１、２、３、４、５、および６、および血管内皮上の細胞接着分子（ＣＡＭ）に結合するβ２−インテグリン（例えば、ＬＦＡ−１、ＬＰＡＭ−１、ＣＲ３、およびＣＲ４）を含む。例示的なＣＡＭはＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＶＣＡＭ−１、およびＭＡｄＣＡＭ−１を含む。他のＣＡＭは、Ｅ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、およびＰ−セレクチンを含めたセレクチンファミリーのものを含む。
もう１つの具体例において、本発明のｓｃＦｖ分子は接着蛋白質または接着蛋白質受容体に結合することができる。
ケモカイン
感染の部位に向けられた白血球の移動を刺激する化学走性蛋白質であるケモカイン、またはそのケモカイン受容体結合部分もまた、本発明の結合分子に組み込むことができる。例示的なケモカインはマクロファージ炎症蛋白質（ＭＩＰ−１−αおよびＭＩＰ−１−β）、好中球化学走性因子、およびＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｌｙ Ｔ−ｃｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）（活性化に際して調節され、正常Ｔ−細胞により発現され分泌される）を含む。
もう１つの具体例において、本発明のｓｃＦｖ分子はケモカインまたは受容体に結合することができる。
成長因子および成長因子受容体
成長因子またはそれらの受容体（またはその受容体結合またはリガンド結合部分）、あるいはそれらに結合する分子を本発明の結合分子に組み込むことができる。例示的な成長因子はアンジオポエチン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）およびそのイソ形態（米国特許第５，１９４，５９６号）；表皮成長因子（ＥＧＦ）；ａＦＧＦおよびｂＦＧＦを含めた線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）；心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）；肝臓成長因子（ＨＧＦ；米国特許第５，２２７，１５８号および第６，０９９，８４１号）、骨−由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のような神経栄養因子、ニュートロフィン−３、−４、−５、または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）、ＮＧＦ−β血小板−由来成長因子（ＰＤＧＦ）のような神経成長因子（米国特許第４，８８９，９１９号、第４，８４５，０７５号、５，９１０，５７４号および第５，８７７，０１６号）；ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータのようなトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）（ＷＯ ９０／１４３５９）、骨形成蛋白質（ＢＭＰ）を含めた骨誘導因子；インスリン−様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ；米国特許第６，４０３，７６４号および第６，５０６，８７４号）；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；幹−細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ｃ−Ｍｐｌリガンド）、およびＷｎｔポリペプチド（米国特許第６，１５９，４６２号）を含む。
用いることができる例示的な成長因子受容体は、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）；ＶＥＧＦ受容体（例えば、Ｆｌｔ１またはＦｌｋ１／ＫＤＲ）、ＰＤＧＦ受容体（ＷＯ ９０／１４４２５）；ＨＧＦ受容体（米国特許第５，６４８，２７３号および第５，６８６，２９２号）；ＩＧＦ受容体（例えば、ＩＧＦＲ１およびＩＧＦＲ２）、およびＮＧＦ、ＢＤＮＦ、およびＮＴ−３に結合するＰ７５ＮＴＲまたはｐ７５とも呼ばれる低親和性受容体（ＬＮＧＦＲ）、および受容体チロシンキナーゼのｔｒｋファミリー（例えば、ｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ（ＥＰ ４５５，４６０）、ｔｒｋＣ（ＥＰ ５２２，５３０））のメンバーである高親和性受容体を含めた神経栄養因子受容体を含む。もう１つの具体例において、ＩＧＦＲ１およびＶＥＧＦが共に標的とされる。なおもう１つの具体例において、ＶＬＡ４およびＶＥＧＦが標的とされる。もう１つの具体例において、ＬＦＡ１およびＶＬＡ４が共に標的とされる。
他の細胞表面受容体および／またはそれらのリガンドもまた標的とされる（例えば、（本明細書中においてより詳細に記載される）ＴＮＦファミリー受容体またはそれらのリガンド）。
もう１つの具体例において、本発明のｓｃＦｖ分子は成長因子または成長因子受容体に結合することができる。
ホルモン
本発明の結合分子において標的化剤として用いるためにそれらに結合する例示的な成長ホルモンまたは分子は、レニン、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ；米国特許第５，８３４，５９８号）、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）；甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）；チロキシン；プロインスリンおよびインスリン（米国特許第５，１５７，０２１号および第６，５７６，６０８号）；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、カルシトニン、黄体ホルモン（ＬＨ）、レプチン、グルカゴン；ボンベシン；ソマトトロピン；ミュラー−刺激物質；レラキシンおよびプロレラキシン；ゴナドトロピン−関連ペプチド；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；ＯＢ蛋白質；またはミュラー−刺激物質を含む。
もう１つの具体例において、本発明のｓｃＦｖ分子はホルモンまたはホルモン受容体に結合することができる。
凝固因子
本発明の結合分子において標的化剤として用いるための例示的な血液凝固因子は凝固因子（例えば、第Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩおよびＸＩＩＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子）；組織因子（米国特許第５，４３６，９９１号、第５，３４９，９９１号、第５，７２６，１４７号および第６，５９６，８４号）；トロンビンおよびプロトロンビン；フィブリンおよびフィブリノーゲン；プラスミンおよびプラスミノーゲン；ウロキナーゼまたはヒト尿または組織−タイププラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）のようなプラスミノーゲンアクチベータを含む。
もう１つの具体例において、本発明のｓｃＦｖ分子は凝固因子に結合することができる。
他の具体例において、本発明の安定化された結合蛋白質は修飾されたイムノアドヘシンである。当該分野でよく知られたようにイムノアドヘシンは、受容体の標的−結合領域、アドヘシン分子、リガンド、または酵素と、抗体のＦｃ領域とを組み合わせる融合蛋白質である。例示的なイムノアドヘシンは、例えば、その各々をここに引用して援用する、米国特許第５，１１６，９６４号；第５，４２８，１３０号；第５，７１４，１４７号；および第６，４０６，６９７号に記載されている。１つの具体例において、本発明の修飾されたイムノアドヘシンは、安定化されたｓｃＦｖ分子をイムノアドヘシンに連結することによって形成される。
従前に報告されたイムノアドヘシンを本明細書中に記載されたように安定化して、本発明の修飾されたイムノアドヘシンを提供することができる。開示された修飾されたイムノアドヘシンを作製し、または誘導するのに用いることができる例示的なイムノアドヘシンは、限定されるものではないが、アバテセプト（Ｏｒｅｎｃｉａ（登録商標），Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、アレファセプト（Ａｍｅｖｉｖｅ（登録商標），ＢｉｏｇｅｎＩｄｅｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標），Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）、ＳＭＡＲＴＴＭ抗−ガンマインターフェロン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）、ＳＭＡＲＴＴＭ抗−Ｌ−セレクチン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ．Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）、リロナセプト（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）、レガビルマブ（ＴＩ−２３，Ｔｅｉｊｉｎ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、Ｒ２４（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、オプレルベキン（ＮＥＵＭＥＧＡ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ＯＮＣＯＬＹＳＩＮ Ｂ、ＯＮＣＯＬＹＳＩＮ ＣＤ６、ＯＮＣＯＬＹＳＩＮ Ｍ、およびＯＮＣＯＬＹＳＩＮ Ｓ（全て、ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＯＮＣＯＬＹＭＴＭ １３１（Ｔｅｃｈｎｉｃｌｏｎｅ Ｃｏｒｐ．，Ｔｕｓｔｉｎ，ＣＡ）、ＩｍｍｕＲＡＩＴ−ＬＬ２（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｍｏｒｒｉｓ Ｐｌａｉｎｓ，ＮＪ）、ＩＬ−４ ＲＡ（ＢＡＹ １６−９９９６；Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）、ＩＣＩ４（ＩＣＯＳ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）、ＣＹＴ−３５６−Ｙ−９０（ＯＮＣＯＲＡＤ（登録商標）ＰＲ，Ｃｙｔｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、ＣＯＴＡＲＡＴＭ（Ｔｅｃｈｎｉｃｌｏｎｅ Ｃｏｒｐ．，Ｔｕｓｔｉｎ，ＣＡ）、ＣＭＢ−４０１（Ｗｙｅｔｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＮＪ）、ＡＶＩＣＩＤＩＮ（登録商標）コンジュゲート（ＮｅｏＲｘ Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）および抗−ＣＤ１８イムノアドヘシン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を含む。
本発明の結合分子に含めることができるもう１つの例示的な分子は免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー９（ＩＧＳＦ９；Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００２．７９：６６３−７０）である。
Ｃ．結合特異性
１つの具体例において、本発明の結合分子は、細胞の表面に存在する、または可溶性である標的分子に結合する。
１つの具体例において、本発明の結合分子の少なくとも１つの結合特異性は触媒的である。触媒的結合特異性は当該分野で認められた技術を用いて作り出すことができる（例えば、米国特許第６，５９０，０８０号、米国特許第５，６５８，７５３号参照）。触媒的結合特異性は、酵素について同定されたものと同様な多数の基本的なメカニズムによって働いて、転移状態を安定化し、それにより、活性化の自由エネルギーを低下させることができる。例えば、一般的な酸および塩基残基は、触媒への参画のために、最適には、触媒活性部位に位置させることができ；共有結合した酵素−基質中間体を形成することができ、触媒的酵素もまた、反応のために適切な向きとすることができ、少なくとも７つの大きさの順序によって反応体の有効濃度を増加させ（Ｆｅｒｓｈｔ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９０（１９６８）：５８３３）、それにより、化学反応のエントロピーを大いに減少させることができる。最後に、触媒的抗体は、基質結合に際して得られたエネルギーを変換して、転移状態が似ている構造に向けての反応を乱すことができる。
１つの具体例において、酸または塩基残基を、免疫原として相補的荷電分子を用いることによって、結合部位に入れ込むことができる。この技術は、正に荷電したアンモニウムイオンを含有するハプテンを持つ抗体の解明で成功したことが判明した（Ｓｈｏｋａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２７（１９８８）：２６９−２７１）。
もう１つのアプローチにおいて、抗体を、所望の反応の転移状態のサイズ、形状および電荷に似た安定な化合物に誘導することができる（すなわち、転移状態アナログ）。動物を免疫化するための転移状態アナログの使用、および触媒的抗体の生産を記載する米国特許第４，７９２，４４６号および米国特許第４，９６３，３５５号参照。これらの特許は共にここに引用して援用する。１つの具体例において、そのような分子は、例えば、ＫＬＨのような免疫原性担体分子と共に免疫コンジュゲートの一部として投与することができる。
例示的な触媒的結合特異性は、例えば、（その静電的および形状特徴がホスホネート構造；（Ｊａｃｏｂｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９（１９８７）：２１７４−２１７６；Ｄｕｒｆｏｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０（１９８８）：８７１３−８７１４；Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０（１９８８）：２２８２；Ｐｏｌｌａｃｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１（１９８９）：５９６１−５９６２）；ペプチダーゼまたはアミダーゼ活性（Ｊａｎｄａ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１（１９８８）：１１８８−１１９１；Ｉｖｅｒｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３（１９８９）：１１８４−１１８８；Ｐａｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４（１９８９）：１１５８−１１６２）；クライゼン転位（Ｊａｃｋｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０（１９８８）：４８４１−４８４２；Ｈｉｌｖｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（１９８８）：４９５３−４９５５；Ｈｉｌｖｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０（１９８８）：５５９３−５５９４）；レドックス反応（Ｓｈｏｋａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２７（１９８９）：２６９−２７１）；チミンダイマーの光化学切断（Ｃｏｃｈｒａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０（１９８８）：７８８８−７８９０）；立体特異的エステル交換転位（Ｎａｐｐｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７（１９８７）：１０４１−１０４３）；または二分子アミド合成（Ｂｅｎｋｏｖｉｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（１９８８）：５３５５−５３５８； Ｊａｎｄａ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１（１９８８）：１１８８−１１９１）によって模倣され得る荷電転位状態を含めた）エステラーゼ活性を有することができる。
もう１つのアプローチにおいて、慣用的な結合特異性を突然変異させて、それらを触媒的とすることができる。
触媒的抗体活性についてスクリーニングする方法は当該分野でよく知られている（例えば、Ｒｅｙｍｏｎｄ，Ｊ．Ｌ．２００２．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６９：１２５； Ｍｏｕｒａｔｏｕ ｅｔ ａｌ．２００２．Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２６９：１４７）。なおもう１つの具体例において、触媒的Ｂ細胞は、例えば、触媒的Ｂ細胞の選択を容易とする分子を用いて米国特許第６，５９０，０８０号に記載されているように選択することができる。
もう１つの具体例において、触媒的結合特異性は、２工程プロセスの一部として開発することができる。触媒的抗体は、以下の結合特徴がもし示される場合にのみ選択することができる：２つの基が相互に対して反応性位置にあるような基質および反応性基の双方の結合。第二に、選択された抗体は、反応性基を抗体の結合ポケットに共有結合させることによって化学的に作製することができる。Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００２．２６９：８１−９８。
１つの具体例において、触媒的結合特異性がプロドラッグに対して特異的である。そのような結合特異性を用いて、プロドラッグの、イン・ビボで効果的な薬物への変換を触媒することができる。好ましくは、触媒される反応はイン・ビボにて天然の酵素によって達成することができるものである。抗体によるプロドラッグ活性化の例は当該分野で知られている（例えば、Ｍｉｙａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．１９９３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５３３７参照）。
１つの具体例において、本発明の結合分子は、標的細胞に対する少なくとも１つの結合特異性およびプロドラッグに対する少なくとも１つの結合特異性を含む。例えば、好ましい具体例において、本発明の安定化された結合分子は、腫瘍細胞に対する少なくとも１つの結合特異性、および細胞傷害性薬物に変換され得るプロドラッグに対する少なくとも１つの結合特異性を含む。１つの例において、本発明の安定化された結合分子は、カルバメートプロドラッグである４−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−クロロエチル）］アミノフェニル−Ｎ−［（１Ｓ−（１，３−ジカルボキシ）プロピル）カルバメートに対する結合特異性を含み、対応するサイトトキシンナイトロジェンマスタードを生じる（Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．１９９６．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３：７９９）。
１つの具体例において、結合分子をプロドラッグの投与に先立って投与して、標的細胞の部位への蓄積を可能とする。例示的なプロドラッグは当該分野で公知である。プロドラッグは、触媒作用によって放出されるように設計された部分を組み込むことによって、例えば、アルドラーゼ活性を持つ抗体によって触媒された順次のレトロ−アルドール／レトロ−ミカエル反応によって合成することもできる（Ｓｈａｂａｔ ｅｔ ａｌ．２００１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：７４２８）。そのような薬物マスキング部分は、例えば、薬物のヒドロキシルまたはチオール基の修飾によって作製することができる。
１つの具体例において、本発明の結合分子は多特異的であり、すなわち、第一の標的分子または標的分子のエピトープに結合する少なくとも１つの結合部位、および第二の異なる標的分子へ、または該第一の標的分子の第二の異なるエピトープへ結合する少なくとも１つの第二の結合部位を有する。ある具体例において、本発明の多特異的結合分子（例えば、二特異的結合分子）は、例えば、前記セクションＡにおいて本明細書中にて記載された抗体のいずれかからの少なくとも１つの結合部位を含む。
１つの具体例において、本発明の結合分子は二特異的である。二特異的分子は、例えば、同一標的分子上のまたは異なる標的分子上の２つの異なる標的部位へ結合することができる。例えば、抗体の場合には、二特異的分子は、例えば、同一抗原上の、または２つの異なる抗原上の２つの異なるエピトープに結合することができる。二特異的分子は、例えば、診断および治療適用で用いることができる。例えば、それらを用いて、免疫アッセイで用いるための酵素を固定化することができる。それらは、例えば、双方を腫瘍関連分子および検出可能なマーカー（例えば、放射性核種に緊密に結合するキレーター）に結合することによって、癌の診断および治療で用いることもできる。また、二特異的分子は、例えば、（例えば、病原体または腫瘍細胞に、および細胞傷害性トリガー分子へ結合することによって）、Ｔ細胞受容体、またはＦｃγ受容体のような特異的な標的へ細胞傷害性を向けることによって、ヒト療法で用いることもできる。二特異的分子は、例えば、フィブリン溶解剤またはワクチンアジュバントとして用いることもできる。
１つの具体例において、本発明の多特異的結合分子は、細胞−表面分子に対して向けられた少なくとも１つのアーム（例えば、結合部位）、および可溶性分子に対して向けられた少なくとも１つのアームを持つものを含む。もう１つの具体例において、本発明の多特異的抗体は、可溶性分子に結合する２つの結合部位を有する。もう１つの具体例において、本発明の多特異的抗体は細胞表面分子に結合する２つの結合部位を有する。
本発明の多特異的結合分子は各特異性に対して一価であり、または各特異性に対して多価であってよい。１つの具体例において、本発明の二特異的結合分子は、第一の標的分子に反応する１つの結合部位、および第二の標的分子に反応する１つの結合部位を含むことができる（例えば、二特異的抗体分子、融合蛋白質またはミニボディ）。もう１つの具体例において、本発明の二特異的結合分子は、第一の標的分子と反応する２つの結合部位、および第二の標的分子と反応する２つの結合部位を含むことができる（例えば、二特異的ｓｃＦｖ２四価抗体；四価ミニボディまたはダイアボディ）。
ある具体例において、本発明の多特異的結合分子の少なくとも１つの結合部位は、抗体の抗原結合領域、またはその抗原結合断片である。
１つの具体例において、本発明の多特異的結合分子は、第一の標的分子に向けられた少なくとも１つの安定化されたｓｃＦｖを含む１つのアーム、および第二の標的分子に向けられた少なくとも１つの安定化されたｓｃＦｖを含有する第二のアームを持つ二価抗体または抗体変種である。
１つの具体例において、本発明の多特異的結合分子は、重鎖のＣ−末端に連結された少なくとも１つの安定化されたｓｃＦｖ（例えば、２、３、または４のｓｃＦｖ）を含み、ここに、該ｓｃＦｖは同一または異なる結合特異性を有する。このタイプの例示的な結合分子（「Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ」抗体）を図１３に示す。もう１つの具体例において、本発明の多特異的結合分子は、重鎖のＮ−末端に連結された少なくとも１つの安定化されたｓｃＦｖ（例えば、２、３、または４のｓｃＦｖ）を含み、ここに、該ｓｃＦｖが同一または異なる結合特異性を有する。このタイプの例示的な結合分子（「ＮＨ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ」抗体）を図１３に示す。もう１つの具体例において、本発明の多特異的結合分子は、軽鎖のＮ−末端に連結された少なくとも１つの安定化されたｓｃＦｖ（例えば、２、３、または４のｓｃＦｖ）を含み、ここに、該ｓｃＦｖは同一または異なる結合特異性を有する。このタイプの例示的な結合分子（「ＮＬ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ」抗体）を図１３に示す。もう１つの具体例において、本発明の多特異的結合分子は、重鎖または軽鎖のＮ−末端に連結された少なくとも１つの安定化されたｓｃＦｖ（例えば、２、３、または４のｓｃＦｖ）、および重鎖のＣ−末端に連結された少なくとも１つの安定化されたｓｃＦｖ（例えば、２、３、または４のｓｃＦｖ）を含み、ここに、該ｓｃＦｖは同一または異なる結合特異性を有する。
１つの具体例において、本発明の多特異的結合分子は、第一の標的分子に向けられた少なくとも１つのｓｃＦｖ断片を含む１つのアーム、および第二の標的分子に向けられた少なくとも１つのｓｃＦｖを含む第二のアームを持つ二価ミニボディであり、ここに、該ｓｃＦｖ分子の少なくとも１つは安定化されている。例示的な二特異的二価ミニボディ構築体を図４２に示す。図４２において、ＣＨ３ドメインは、そのＮ−末端においてＶＬドメインに融合した（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎフレキシブルリンカーにそのＮ−末端を介して融合したＶＨドメインにそのＮ−末端において融合した連結ペプチドにそのＮ−末端において融合している。
もう１つの具体例において、本発明の多特異的結合分子はｓｃＦｖ四価ミニボディであり、該ｓｃＦｖ四価ミニボディの各重鎖部分は第一および第二のｓｃＦｖ断片を含有し、ここに、ｓｃＦｖ分子の少なくとも１つは安定化されている。該第二のｓｃＦｖ断片は、第一のｓｃＦｖ断片のＮ−末端に連結することができる（例えば、二特異的ＮＨ ｓｃＦｖ四価ミニボディまたは二特異的ＮＬ ｓｃＦｖ四価ミニボディ）。二特異的Ｎ−ｓｃＦｖ四価ミニボディの例は図４３に示す。別法として、第二のｓｃＦｖ断片は、該第一のｓｃＦｖ断片を含有する該重鎖部分のＣ−末端に連結することができる（例えば、二特異的Ｃ−ｓｃＦｖ四価ミニボディ）。二特異的Ｃ−ｓｃＦｖ四価ミニボディの例は図４４に示す。１つの具体例において、第一および第二のｓｃＦｖ断片は同一または異なる標的分子に結合することができる。二特異的四価ミニボディの第一の重鎖部分の第一および第二のｓｃＦｖ断片は同一の標的分子に結合し、二特異的四価ミニボディの第二の重鎖部分の第一および第二のｓｃＦｖ断片の少なくとも１つは、異なる標的分子に結合する。
もう１つの具体例において、本発明の多特異的結合分子が二特異的ダイアボディであり、該ダイアボディの各アームは、その少なくとも１つが安定化されているタンデムｓｃＦｖ断片を含む。１つの具体例において、二特異的ダイアボディは、第一の結合特異性を持つ第一のアーム、および第二の結合特異性を持つ第二のアームを含むことができる（例えば、図４５参照）。もう１つの具体例において、ダイアボディの各アームは、第一の結合特異性を持つ第一のｓｃＦｖ断片、および第二の結合特異性を持つ第二のｓｃＦｖ断片を含むことができる。
もう１つの具体例において、本発明の多特異的結合分子は、ｓｃＦｖ分子を含有するｓｃＦｖ２四価抗体の各重鎖部分を持つｓｃＦｖ２四価抗体であり、ここに、ｓｃＦｖ分子の少なくとも１つは安定化されている。ｓｃＦｖ断片は重鎖部分の可変領域のＮ−末端に連結することができる（例えば、二特異的ＮＨ ｓｃＦｖ２四価抗体または二特異的ＮＬ ｓｃＦｖ２四価抗体）。別法としてｓｃＦｖ断片は、ｓｃＦｖ２四価抗体の重鎖部分のＣ−末端に連結することができる（例えば、二特異的Ｃ−ｓｃＦｃ２四価抗体、例えば、図４６参照）。ｓｃＦｖ２四価抗体の各重鎖部分は、同一または異なる標的分子に結合する可変領域およびｓｃＦｖ断片を有することができる。二特異的ｓｃＦｖ２四価抗体の第一の重鎖部分のｓｃＦｖ断片および可変領域が同一の標的分子に結合する場合、二特異的四価抗体の第二の重鎖部分の第一および第二のｓｃＦｖ断片の少なくとも１つは異なる標的分子に結合する。
もう１つの具体例において、本発明の多特異的結合分子は、その少なくとも１つが安定化された、ｓｃＦｖ断片を含有するｓｃＦｖ２四価抗体の各重鎖部分を持つｓｃＦｖ２四価ドメイン−欠失抗体である。ｓｃＦｖ断片は、重鎖部分の可変領域のＮ−末端に連結できる（例えば、二特異的ＮＨ ｓｃＦｖ２四価ドメイン−欠失抗体（図４８参照）、または二特異的ＮＬ ｓｃＦｖ２四価抗体（図４９参照））。別法として、ｓｃＦｖ断片は、ｓｃＦｖ２四価ドメイン−欠失抗体の重鎖部分のＣ−末端に連結することができる（例えば、二特異的Ｃ−ｓｃＦｖ２四価ドメイン欠失抗体、例えば、図４７参照）。
本発明の結合分子が結合することができる例示的細胞−表面分子は、腫瘍または新形成細胞の表面に過剰発現された受容体または腫瘍細胞抗原、ならびに、例えば、前記セクションＢにて本明細書中に記載されたサイトカイン受容体、接着分子、または成長因子受容体のいずれかを含む。例示的な可溶性分子は、例えば、前記セクションＡにて本明細書中に記載された、抗−腫瘍剤（例えば、トキシン、化学治療剤、およびそのプロドラッグ）、可溶性酵素（例えば、プロドラッグ変換酵素）、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、成長因子、または凝固因子を含む。
従って、腫瘍細胞抗原および抗−腫瘍剤または可溶性酵素の双方に結合する二特異的分しは、抗−癌剤を、該腫瘍細胞抗原を発現する腫瘍細胞に局所化させることができ、それにより、腫瘍細胞上の抗−癌剤の毒性効果を最大化し、正常な細胞での抗−癌剤の毒性効果を最小化することができる。
腫瘍抗原に対する少なくとも１つの結合部位、およびトキシンに対する少なくとも１つの結合部位を持つ例示的な二特異的結合分子は、抗−サポリン／抗−Ｉｄ−１、抗−ＣＤ２２／抗−サポリン、抗−ＣＤ７／抗−サポリン、抗−ＣＤ３８／抗−サポリン、抗−ＣＥＡ／抗−リシンＡ鎖、抗−インターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−アルファ）／抗−ハイブリドーマーイディオタイプ、抗−ＣＥＡ／抗−リンカーアルカロイドを含む。細胞−表面分子に対する少なくとも１つの結合部位、およびプロドラッグ変換酵素に対する少なくとも１つの結合部位を持つ例示的な二特異的結合分子は、例えば、（マイトマイシンリン酸プロドラッグの化学治療剤マイトマイシンアルコールへの変換を触媒する）抗−ＣＤ３０／抗−アルカリ性ホスファターゼを含む。
他の具体例において、二特異的結合分子は腫瘍細胞抗原および診断剤双方に結合し、それにより、該腫瘍細胞抗原を発現する腫瘍細胞に該診断剤を局所化し、イン・ビトロまたはイン・ビボでの腫瘍検出を容易とする。例示的な二特異的結合分子は、抗−ＣＤＡ／抗−ＥＯＴＵＢＥ、抗−ＣＥＡ／抗−ＤＰＴＡ、抗−ＣＥＡ／抗−ベータ−ガラクトシダーゼおよび抗−ｐ１８５ＨＥＲ２／抗−ハプテンを含む。
他の具体例において、本発明の二特異的結合分子は可溶性分子（例えば、可溶性抗原）および非−腫瘍細胞上の細胞表面分子（例えば、免疫細胞）の双方に結合する。例えば、可溶性免疫複合体を免疫細胞上の細胞表面受容体に標的化するのに用いることができ、それにより、細胞−媒介免疫メカニズムによって身体からのそれらのクリアランスを容易とする。このタイプの例示的な二特異的分子は抗−低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）／抗−Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃガンマＲＩ、ＦｃガンマＲＩＩまたはＦｃガンマＲＩＩＩ）、および（抗−ＣＤ３／抗−単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、抗−Ｔ−細胞受容体：ＣＤ３複合体／抗−インフルエンザ、抗−ＦｃガンマＲ／抗−ＨＩＶのような）感染症の治療で用いる二特異的結合分子を含む。
他の具体例において、本発明の二特異的結合分子は、細胞表面受容体およびその可溶性リガンド双方に結合することができる。１つの具体例において、リガンドはＴＮＦファミリー受容体の同族リガンドである。
二特異的結合分子が結合することができる例示的な細胞表面受容体は腫瘍細胞抗原または免疫細胞受容体である。例示的な細胞表面受容体は、例えば、前記セクションＢにおいて本明細書中に記載されたサイトカイン受容体、接着分子、または成長因子受容体も含む。例示的な可溶性リガンドは、例えば、前記セクションＢにて本明細書中に記載されたサイトカイン、ケモカイン、ホルモン、成長因子、または凝固因子を含む。
例示的な二特異的結合分子は抗−ＶＬＡ４／抗−Ｍａｃ−１、抗−ＶＬＡ４／抗−ＶＥＧＦ、抗−ＶＬＡ４／抗−アンジオポエチン、抗−ＶＬＡ４／抗−ＴＮＦα、抗−ＩＧＦＲ１／抗−ＶＥＧＦ、抗−ＩＧＦＲ１／抗−アンジオポエチン、抗−ＩＧＦＲ１／抗−ＥＧＦＲ、抗−ＨＧＦ−ＳＦ／抗−ＶＥＧＦ、抗−ＨＧＦ−ＳＦ／抗−アンジオポエチン、およびＨＧＦ−ＳＦ／いずれかの第二の抗原を含む（例えば、Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ２００１．９８：７４４３；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．２００４．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：２８５６参照）。
他の具体例において、本発明の二特異的結合分子は、第一の可溶性分子（例えば、可溶性リガンド）に対して向けられた少なくとも１つのアーム（すなわち、結合部位）、および第二の可溶性分子（例えば、可溶性リガンド）に対して向けられた少なくとも１つのアームを持つものを含む。そのような二特異的結合分子は診断ツール（例えば、抗−ウサギＩｇＧ／抗−フェリチン、抗−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／抗−ホルモン、抗−ソマトスタチン／抗−サブスタンスＰ、抗−ＨＲＰ／抗−ＦＩＴＣ（Ｎｏｌａｎ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ参照））、またはフィブリン溶解剤（例えば、抗−フィブリン／抗−組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）、抗−フィブリン／抗−ウロキナーゼ−タイプのプラスミノーゲンアクチベータ（ｕＰＡ））として使用することができる。
好ましい具体例において、本発明の二特異的結合分子が結合する可溶性分子はＴＮＦファミリーの可溶性リガンドである。ＴＮＦファミリーリガンドの例は、限定されるものではないが、（ＴＮＦＲ１／ＴＮＦＲＳＦ１Ａに結合する）ＬＴＡ、（ＣＤ１２０ｂ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂに結合する）ＴＮＦ、（ＬＴＢＲ／ＴＮＦＲＳＦ３に結合する）ＬＴＢ、（ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４に結合する）ＯＸ４０Ｌ、（Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６およびＤｃＲ３／ＴＮＦＲＳＦ６Ｂに結合する）、（ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５に結合する）ＣＤ４０Ｌ、（ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７に結合する）ＣＤ２７Ｌ、（ＣＤ／３０ＴＮＦＲＳＦ８に結合する）ＣＤ３０Ｌ、（４−１−ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９に結合する）４−１−ＢＢ−Ｌ、（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、およびＴＲＡＩＬ−Ｒ４／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄに結合する）ＴＲＡＩＬ、（ＲＡＮＫ／ＴＮＦＲＳＦ１１Ａオステオプロテグリン／ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂに結合する）ＲＡＮＫＬ、（ＡＰＯ−３／ＴＮＦＲＳＦ１２およびＤＲ３Ｌ／ＴＮＦＲＳＦ１２Ｌに結合する）ＡＰＯ−３Ｌ、（ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂに結合する）ＡＰＲＩＬ、（ＢＡＦＦＲ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ａに結合する）ＢＡＦＦ、（ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４に結合する）ＬＩＧＨＴ、（ＬＮＧＦＲ、例えば、ＮＧＦ−β、ＮＧＦ−２／ＮＴＦ３、ＮＴＦ５、ＢＤＮＦ、ＩＦＲＤ１に結合する）ＮＧＦリガンド、（ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８に結合する）ＧＩＴＲＬ、ＥＤＡＲ１＆ＸＥＤＡＲリガンド、Ｆｎ１４リガンド、およびＴｒｏｙ／Ｔｒａｄｅリガンドを含む。
他の例示的な具体例において、本発明の二特異的結合分子は、第一の細胞−表面分子に対する少なくとも１つの結合部位、および第二の細胞−表面分子に対する少なくとも１つの結合部位を有する。１つの具体例において、第一および第二の細胞−表面分子が異なる細胞（例えば、異なる細胞型）上に局所化される。例えば、二特異的分子は、腫瘍細胞抗原に対して向けられた少なくとも１つのアーム、および非−腫瘍細胞（例えば、免疫細胞）上の細胞−表面受容体に対して向けられた少なくとも１つのアームを有することができる。このタイプの例示的な二特異的結合分子は、腫瘍細胞抗原に対する少なくとも１つの結合部位、および（抗−ＦｃガンマＲＩ／抗−ＣＤ１５、抗−ｐ１８５．ｓｕｐ．ＨＥＲ２／ＦｃガンマＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、抗−ｐ１８５．ｓｕｐ．ＨＥＲ２／抗−ＶＥＧＦ、抗−ＣＤ３／抗−悪性Ｂ−細胞（１Ｄ１０）、抗−ＣＤ３／抗−ｐ１８５．ｓｕｐ．ＨＥＲ２、抗−ＣＤ３／抗−ｐ９７、抗−ＣＤ３／抗−腎臓細胞癌腫、抗−ＣＤ３／抗−ＯＶＣＡＲ−３、抗−ＣＤ３／Ｌ−Ｄ１（抗−結腸癌種）、抗−ＣＤ３／抗−メラノサイト刺激ホルモンアナログ、抗−ＥＧＦ受容体／抗−ＣＤ３、抗−ＣＤ３／抗−ＣＡＭＡ１、抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ１９、抗−ＣＤ３／ＭｏＶ１８、抗−神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）／抗−ＣＤ３、抗−葉酸結合蛋白質（ＦＢＰ）／抗−ＣＤ３、および抗−汎癌腫関連抗原（ＡＭＯＣ−３１）／抗−ＣＤ３のような）免疫エフェクター細胞の細胞傷害性トリガー分子に対して向けられた少なくとも１つの結合部位を有するものである。腫瘍細胞抗原および細胞傷害性トリガー分子双方に結合する二特異的分子は、腫瘍細胞を免疫エフェクター細胞と効果的に並置することができ、それにより、エフェクター細胞を活性化して、細胞−媒介免疫メカニズムによって腫瘍細胞を破壊する。
もう１つの具体例において、二特異的結合分子が結合することができる第一および第二の細胞−表面分子は同一の細胞または細胞型上に局所化される。同一細胞上の第一および第二の受容体を架橋することによって、本発明の二特異的結合分子は、第一および第二の受容体の一方または双方に関連する活性（例えば、シグナル変換活性）を阻害し、または増強させることができる。１つの具体例において、第一および第二の細胞表面分子は同一タイプのものである（例えば、分子の同一ファミリー中にある）。もう１つの具体例において、該第一及び第二の細胞表面分子は異なるタイプである（例えば、異なる分子のファミリーにある）。二特異的結合分子が結合する例示的な細胞表面受容体は腫瘍細胞抗原または免疫細胞受容体を含む。例示的な細胞表面受容体は、前記セクションＢにて記載したサイトカイン受容体、接着分子、または成長因子受容体のいずれかを含む。
１つの具体例において、本発明の結合分子が結合する例示的な標的分子は、例えば、ヘパリン硫酸、成長因子またはそれらの受容体（例えば、表皮成長因子受容体、インスリン−様成長因子受容体、肝細胞成長因子（ＨＧＦ／ＳＦ）受容体（例えば、Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００１．９８：７４４３；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．２００４．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：２８５６参照））の１以上のエピトープを含む。
例示的な具体例において、本発明の二特異的結合分子が結合する分子の少なくとも１つはＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーのメンバーである。もう１つの例示的な具体例において、本発明の二特異的結合分子が結合する第一および第二の標的分子は、ＴＮＦＲファミリーメンバーの双方である。もう１つの具体例において、本発明の結合分子はＴＮＦＲファミリーリガンドに結合する。なおもう１つの具体例において、本発明の結合分子は、１つのＴＮＦＲファミリーメンバーおよび腫瘍細胞の表面に発現された、例えば、腫瘍細胞上に優先的に発現される抗原に結合する。一特異的ＴＮＦＲ結合分子での腫瘍の治療における制限因子は、しばしば、腫瘍のサブセットのみがそのような療法に対して感受性であるように見えることである。多特異的ＴＮＦＲ結合分子はＴＮＦＲを特異的に活性化することができ、例えば、複数のＴＮＦＲを近接させることによって受容体シグナリングを増強することができる。本発明は、１を超えるＴＮＦＲまたはＴＮＦＲタイプを標的化し、シグナリングを増強させることができ、かくして、癌を治療する改良された方法を提供する改良された二特異的ＴＮＦＲ結合分子を提供する。１つの具体例において、二特異的ＴＮＦＲ結合分子は、二以上の同一タイプのＴＮＦＲに結合し、一緒にすべきＴＮＦＲの数を増加させることによって、シグナル強度を増加させる。もう１つのより好ましい具体例において、二特異的ＴＮＦＲ結合分子は、ＴＮＦファミリーの２つの異なる受容体に結合することができる。
１つの具体例において、二特異的ＴＮＦＲ結合分子が結合するＴＮＦＲの少なくとも１つは死滅ドメインを含有する。用語「死滅ドメイン」とは、当該受容体によって媒介されるＴＮＦ−媒介細胞死滅またはアポトーシスシグナリングおよび細胞−傷害性誘導に関与するＴＮＦファミリー受容体の細胞質領域をいう。この領域はアダプター蛋白質を介して受容体をカスパーゼ活性化にカップリングさせ、その結果、外因性死滅経路の活性化がもたらされる。
死滅ドメインを含有するＴＮＦ受容体の例は、限定されるものではないが、ＴＮＦＲ１（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）、Ｆａｓ（ＴＮＦＲＳＦ６）、ＤＲ−３（ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ）、ＬＮＧＦＲ（ＴＮＦＲＳＦ１６）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）およびＤＲ６（ＴＮＦＲＳＦ２１）を含む。これらの受容体のアポトーシスシグナリングは、同族リガンドに結合、および以下の受容体−リガンド対：ＴＮＦＲ１／ＴＮＦα、Ｆａｓ／ＦａｓＬ、ＤＲ−３／ＤＲ−３ＬＧ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１／ＴＲＡＩＬ、またはＴＲＡＩＬ−Ｒ２／ＴＲＡＩＬ
のいずれかの形成に際して調節される。
死滅ドメインを含有するＴＮＦファミリー受容体を標的化する二特異的ＴＮＦＲ結合分子は癌の治療で有用である。というのは、このタイプのＴＮＦＲは腫瘍細胞でしばしば過剰発現され、受容体の刺激は腫瘍細胞アポトーシスを活性化することができるからである。好ましい具体例において、本発明のＴＮＦＲ結合分子が結合するＴＮＦＲを含有する死滅−ドメインはＴＲＡＩＬ−Ｒ２である。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２はヒト腫瘍療法で好ましい。というのは、その活性化は肝細胞アポトーシスをトリガーせず、よって、低下した毒性を有するはずだからである。
受容体、例えば、ＴＮＦＲ１またはＦａｓを含有する死滅ドメインのいくつかの活性化はイン・ビボ適用において毒性であったが、これらの受容体の他のＴＮＦ受容体への連結は毒性を減少させることができ、かくして、毒性抗体を低い毒性とする。
１つの具体例において、本発明の二特異的ＴＮＦＲ結合分子は、死滅ドメインを含有するＴＮＦＲに向けられた少なくとも１つの結合部位、および死滅ドメインを欠如するＴＮＦＲに向けられた少なくとも１つの結合部位を含む。
ある例示的な具体例において、死滅ドメインを欠如するＴＮＦＲは組織分化に関与するＴＮＦＲを含む。組織分化に関与するＴＮＦＲ受容体の例はＬＴβＲ、ＲＡＮＫ、ＥＤＡＲ１、ＸＥＤＡＲ、Ｆｎ１４、Ｔｒｏｙ／Ｔｒａｄｅ、およびＮＧＦＲを含む。組織分化に関与するＴＮＦＲは、同族リガンドの結合に続いての組織分化に影響し得る。組織分化に関与するＴＮＦＲを標的化するＴＮＦＲ結合分子はいくつかの方法で腫瘍に悪影響を与えることができる。まず、それらは細胞周期の進行を改変することによって腫瘍の成長を直接的に遅らせる能力を有する。第二に、腫瘍細胞トランスフォーメーションの関係での組織分化は、細胞周期のコンフリクトおよび欠陥があるアポトーシスに導くことができる。第三にそのようなコンフリクトする入力は細胞を化学療法に対してより感受性とすることができる。
ある好ましい具体例において、組織分化に関与するＴＮＦＲはリンホトシキンβ受容体（ＬＴβＲ）である。ＬＴβＲは免疫系における種々の特殊化された間質細胞の成熟状態の制御に関与しており、リンパ節原基の間質エレメントの発生の間に臨界的な役割を演じる。形質転換した細胞の関係での上皮または線維芽細胞様細胞における発生プログラムの活性化は、それらの生存に対して有害であって、この作用はＬＴβＲ活性化の抗−腫瘍活性のいくらかを説明することができると提唱されてきた。これらの受容体は、ケモカイン放出を含み、または免疫学的抗−腫瘍応答を促進する炎症プログラムを開始することもできる。そのような放出は腫瘍の炎症状態に悪影響を与える事ができ、および／または腫瘍に対する免疫学的反応を促進するリンパ様エレメントの浸潤を誘発することができよう。かくして、単独で、あるいは死滅ドメイン（例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）を含有するＴＮＦ受容体と組合せて、ＬＴβＲに結合する二特異的ＴＮＦＲ結合分子は本発明に含まれる。
ある例示的具体例において、死滅ドメインを欠如するＴＮＦＲは免疫調節に関与するＴＮＦＲを含む。そのような受容体はＴＮＦＲ２、ＨＶＥＭ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＢＣＭＡ、およびＲＥＬＴを含む。免疫調節に関与するさらなるＴＮＦファミリー受容体はＴＲＡＩＬ−Ｒ３およびＴＲＡＩＬ−Ｒ４を含む。
腫瘍形成において役割を持つ他の標的ＴＮＦファミリー受容体は、種々の腫瘍上に存在し、あるいはそこで理想的に過剰発現されるＴＮＦファミリー受容体を定義するのを可能とする種々の細胞型における受容体発現の現存のＲＮＡデータベースを用いて同定することができる。さらに、現存のＲＮＡデータベースは、本発明の二特異的ＴＮＦＲ結合分子が結合するＴＮＦファミリー受容体の対が、腫瘍タイプまたは腫瘍のサブセットでよりユニークに発現されるが、正常な組織、特に、肝臓および血管系で豊富でない受容体対を同定することによって最適化することができよう。そのようにして、優れたシグナルを腫瘍に送達でき、正常な細胞を見逃す受容体対（またはそれ以上）が同定される。
多特異的分子を生産する方法は当該分野でよく知られている。例えば、組換え技術を用いて、多特異的分子、例えば、ダイアボディ、単一−鎖ダイアボディ、タンデムｓｃＦｖなどを生産することができる。多特異的分子を生産するための例示的な技術は当該分野で知られている（例えば、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２４８：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｐｐ２２７−２４２ ＵＳ ２００３／０２０７３４６ Ａｌおよびそこで引用された文献）。１つの具体例において、マルチマー多特異的分子は、例えば、ＵＳ ２００３／０２０７３４６ Ａ１または米国特許第５，８２１，３３３号、またはＵＳ ２００４／００５８４００に記載されたもののような方法を用いて調整される。
もう１つの具体例において、本発明の多特異的結合分子は多特異的融合蛋白質である。本明細書中で用いるように、フレーズ「多特異的融合蛋白質」は、少なくとも２つの結合特異性を有する（すなわち、リガンドまたは受容体の結合ドメインを組み合わせる）（前記定義の）融合蛋白質を命名する。多特異的融合蛋白質は、例えば、ＷＯ ８９／０２９２２（１９８９年４月６日に公開）において、ＥＰ ３１４，３１７（１９８９年５月３日に公開）、および１９９２年５月２日に発行された米国特許第５，１１６，９６４号において実質的に開示されているように、ヘテロダイマー、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーとして組立てることができる。好ましい多特異的融合蛋白質は二特異的である。二特異的融合蛋白質はＣＤ４−ｓｃＦｖ／ＴＮＦ受容体−ＩｇＧおよびＣＤ４−ｓｃＦｖ／Ｌ−セレクチン−ＩｇＧを含む。最後に述べた分子はリンパ球ホーミング受容体（ＬＨＲ，Ｌ−セレクチン）のリンパ節結合機能、およびＣＤ４のＨＩＶ結合機能を組み合わせ、ＨＩＶ感染、関連疾患の予防または治療における、または診断剤としての潜在的適用を見出す。
もう１つの具体例において、本発明は、公知の標的に結合する少なくとも１つの結合部位、および知られていない標的を認識する少なくとも１つの結合部位（例えば、１つの具体例においては、二特異的分子は、半−合成抗体ファージディスプレイライブラリーから選択される結合部位を組み込む）、および本発明の安定化されたｓｃＦｖを組み込む、多特異的安定化結合分子、例えば、二特異的結合分子、例えば、抗体に関する。
本発明の１つの具体例において、当業者であれば、公知の特異性の単一鎖抗体で出発し、当該分野で公知の技術を用いてＦａｂライブラリーを形成し、あるいは別法として、当業者であれば、公知の特性のＦａｂ断片で出発し、当該分野で公知の技術を用いて安定化された単一鎖ライブラリーを形成することができよう。非免疫化源からの、かつＶ−遺伝子配列の合成組換え（好ましくは、ＶＨとＤＨおよびＪＨとのおよびＶＬとＪＬ配列との組換え）によって調製されたライブラリーを用いて、いずれの抗原に対する抗体も単離することができるのは当該分野で知られている。例えば、特許出願ＷＯ９２／０１０４７は、抗体断片をバクテリオファージの表面に提示でき、それらは抗原に結合することを教示する。抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖおよびＶＨ）はこの特徴を用いて直接的に選択することができる。当該分野で知られた他の方法は、例えば、米国特許第５，６９８，４２６号；第６，２９１，１５９号；第５，６５８，７２７号；第５，６６７，９８８号；および第５，９６９，１０８号に教示されたものを含む。
もう１つの具体例において、公知の標的を認識するｓｃＦｖは、半合成ヒトファージ抗体ディスプレイライブラリーから単離されたｓｃＦｖで二量体化することができる。（例えば、Ｋｒｕｉｆ ａｎｄ Ｌｏｇｔｅｎｂｅｒｇ １９９６．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：７６３０参照）。
１つの具体例において、主題の多特異的分子を、抗体分子を発現させるのに用いる発現系、例えば、哺乳動物細胞、Ｐｉｃｃｈｉａのような酵母、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｃｕｌｏｖｉｒｕｓ等で発現させる。１つの具体例において、主題の二特異的分子にＮＥＯＳＰＬＡベクター系で発現させる（例えば、米国特許第６，１５９，７３０号参照）。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、マウスベータグロビン主要プロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、メオマイシンホスホトランスフェラーゼエクソン１およびエクソン２、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子およびリーダー配列を含有する。
１つの具体例において、主題の多特異的分子は合成連結ペプチドを含む。
これらの多特異的分子は公知の標的に対する１以上の結合部位を有し、１以上の結合部位においてライブラリーを発現する。そのような多特異的分子を用いて、例えば、公知の標的に近接する、またはそれと会合した分子を同定することができる。例えば、当業者であれば、主題の多特異的分子をアッセイで用いて、当該分野で良く知られたスクリーニング方法を用い、特定の応答、例えば、アポトーシスまたは細胞活性化を誘導するものを選択することができよう。次いで、スクリーニングされた応答を生じるものとして同定された二特異的分子を同定し、その特異性を決定することができる。そのような方法を用い、注目する特定の標的、例えば、Ｔ細胞マーカー、あるいは（ＣＲＩＰＴＯ−Ｉ、死滅ドメイン分子、あるいはアポトーシスに関与する分子のような）他のシグナリング分子と密接に会合する分子を同定するのが可能である。公知の標的、および「最も隣接する」として新しく同定された分子の近接性は、免疫沈澱、または当業者に知られた他の技術を用いて核にすることができる。これらの方法を用い、特定の細胞応答を調節するための標的としての分子を同定するのが可能である。
多特異的結合分子、特に、本発明の多特異的抗体または抗体変種の抗原認識部位または全可変領域を含む結合特異性は、１以上の親抗体に由来するであろう。親抗体は天然に生じる抗体または抗体断片、天然に生じる抗体から適合させた抗体または抗体断片、標的分子に対して特異的であることが知られた抗体または抗体断片の配列を用いてデ・ノボ構築された抗体を含むことができる。親抗体に由来することができる配列は重鎖および／または軽鎖、可変領域および／またはＣＤＲ、フレームワーク領域またはその他の部分を含む。
本発明の１つの例示的な具体例において、多特異的ＴＮＦＲ結合分子を構築するのに用いる親抗体は抗−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体、例えば、１４Ａ２、および抗−ＬＴβＲ抗体、例えば、ＣＢＥ１１またはＢＨＡ１０である。多価多特異的抗体は、２以上の可変領域を含む重鎖、および／または１以上の可変領域を含む軽鎖を含有することができ、ここに、可変領域の少なくとも２つはＬＴβＲの異なるエピトープを認識することができる。
多特異的、例えば、二特異的ＴＮＦＲ結合分子は、ネズミまたはヒト化ＢＨＡ１０（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：３３（１９９５）； Ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：８６７（１９９６））、ネズミまたはヒト化ＣＢＥ１１（各々、米国特許第６，３１２，６９１号およびＷＯ ０２／３０９８６）、および／または親抗−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２ネズミまたはキメラ１４Ａ２を含めた、親抗−ＬＴβＲ抗体に由来する種々の異なる配列を用いて種々の異なる方法で構築することができる。本発明の二特異的ＴＮＦＲ結合分子で用いることができる抗−ＬＴβＲ抗体の例は：ＢＫＡ１１、ＣＤＨ１０、ＢＣＧ６、ＡＧＨ１、ＢＤＡ８、ＣＢＥ１１およびＢＨＡ１０またはＢＨＡ１０を含む。モノクローナル抗−ＬＴ−β−Ｒ抗体を生産する以下のハイブリドーマ細胞系を用いて、それから抗体構築体配列を誘導すべき、ブダペスト条約の規定に従ってＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に従前に寄託されており、示されたＡＴＣＣ受託番号が割り当てられた抗−ＬＴβＲ抗体を生産することができる。
Figure 0005374359
 本発明の多特異的ＴＮＦＲ結合分子で用いることができる抗−ＴＮＦ受容体抗体の他の例は、死滅ドメインを含有するＴＮＦ受容体に向けられた抗体を含む。多数の抗体がＴＮＦ受容体を含有する死滅ドメインに対して作成されており、当該分野で良く知られている。そのような抗体は抗−ＴＮＦ−Ｒ１モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ抗−ＴＮＦ−Ｒ１；Ｔｕｌａｒｉｋ ｍＡｂ ＃９８５，米国特許第６，１１０，６９０号；第６，４３７，１１３号）、抗−Ｆａｓ受容体ｍＡｂ ＣＨ−１１（米国特許第６，３１２，６９１号；ＷＯ ９５／１０５４０）、抗−ＤＲ３抗体（米国特許第５，９８５，５４７号；Ｊｏｈｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＩｍｍｕｎｏＢｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＨＬＡ，ｅｄ．Ｄｕｐｏｎｔ，Ｂ．Ｏ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；米国特許第６，４６２，１７６号；第６，４６９，１６６号）、および抗−ＴＲＡＩＬ−Ｒ抗体（米国特許第５，７６３，２２３号；６，０７２，０４７号；第６，５２１，２２８号；第６，５６９，６４２号；第６，６４２，３５８号および米国特許第６，４１７，３２８号）を含む。
多数の抗体が、組織分化に関与するＴＮＦ受容体に対して生起されており、当該分野で知られている。組織分化二関与するＴＮＦ受容体に特異的な抗−ＴＮＦ受容体抗体の例は：抗−ＲＡＮＫモノクローナル抗体（Ｉｍｍｕｎｅｘ−米国特許第６，５６２，９４８号；第６，５３７，７６３号；第６，５２８，４８２号；第６，４７９，６３５号；第６，２７１，３４９号；第６，０１７，７２９号；Ｋｏｍｅｄ − ＷＯ ０３／０８０６７１）、抗−ＥＤＡＲポリクローナル（抗−ヒト）およびモノクローナル（抗−マウス）抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ−ＭＡＢ７４５，ＢＡＦ１５７；Ｅｌｏｍａａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１０：９５３）、抗−ＸＥＤＡＲモノクローナルおよびポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ−ＭＡＢ１０９３ ａｎｄ ＡＦ１０９３）、抗−Ｆｎ１４モノクローナル抗体（Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７０：３４１；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能なＩＴＥＭ−１，ＩＴＥＭ−２，およびＩＴＥＭ−４クローン）、抗−ＴＲＯＹ抗体（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈからのＴ３３２３）、および抗−ＮＧＦＲ（抗−げっ歯類）抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＵＳＡ）を含む。
また、多数の抗体が、免疫調節に関与するＴＮＦ受容体に対して生起されており、当該分野で知られている。免疫調節に関与するＴＮＦ受容体に特異的な抗−ＴＮＦ受容体抗体の例は：免疫調節受容体に対して正規された多くの他の抗体の中でも、抗−ＨＶＥＭ抗体（ＨＧＳＩ−ＷＯ ０３／０８６３０１）、抗−ＣＤ４０抗体（Ｂｉｏｇｅｎ−ＷＯ ９７／２００６３； Ｃｈｉｒｏｎ − 米国特許第５，６７７，１６５号；第５，８７４，０８２号；第６，００４，５５２号；第６，０５６，９５９号；第６，３１５，９９８号；米国特許公開番号２００２／０１０６３７１；米国特許公開番号２００３／００５９４２７；ＵＳ２００３０１１８５８８Ａ１；２００３／０２１１１００Ａ１；ＵＳ２００２０２０１４２３５８Ａ１；米国特許ＵＳ６３１２６９３；ＵＳ６０５１２２８；Ｆａｎｓｌｏｗ ｅｔ ａｌ．−ＵＳ５８０１２２７）、抗−４−１ＢＢ（ＰＣＴ公開番号ＷＯ ０３／０８４９９９；ＥＰ ０９４８３５３；米国特許番号第６２１０６６９号；Ｇｅｎｅｃｒａｆｔ − ＷＯ ０３／０８３０６９）、および抗−ＢＡＦＦ−Ｒ抗体（ウサギポリクローナル−ＰｒｏＳｃｉカタログ＃３０９７）を含む。
種々の他の多価抗体構築体は、例えば、ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；欧州特許出願番号１８４，１８７；欧州特許出願番号１７１，４９６；欧州特許出願番号１７３，４９４；ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ ８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許出願番号１２５，０２３；Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９−３４４３； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２１４−２１８； Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９；Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４；米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；Ｂｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０；および Ｗｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３４９，ｐｐ．２９３−９９（１９９１））に記載されているように、ルーチン的な組換えＤＮＡ技術を用いて当業者によって開発され得る。好ましくは、非−ヒト抗体は、ヒト定常ドメインと非−ヒト抗原結合ドメインとを連結することによって「ヒト化」される（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１， ｐｐ．６８５１−５５（１９８４））。
多価抗体構築体を調製するのに用いることができる他の方法は以下の刊行物：Ｇｈｅｔｉｅ， Ｍａｒｉａ−Ａｎａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｌｏｏｄ ９７：１３９２−１３９８； Ｗｏｌｆｆ， Ｅｄｉｔｈ Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：２５６０−２５６５；Ｇｈｅｔｉｅ，Ｍａｒｉａ−Ａｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：７５０９−７５１４； Ｋｉｍ，Ｊ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ９７（４）：５４２−５４７；Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａ， Ａｎｅｔａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８：４７−６６； Ｃｏｌｏｍａ Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：１５９−１６３；Ｚｕｏ，Ｚｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｕｐｐｌ．）１３（５）：３６１−３６７； Ｓａｎｔｏｓ Ａ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５：３１１８ｓ−３１２３ｓ；Ｐｒｅｓｔａ，Ｌｅｏｎａｒｄ Ｇ．（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：２３７−２５６；ｖａｎ Ｓｐｒｉｅｌ，Ａｎｎｅｍｉｅｋ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｒｅｖｉｅｗ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ２１（８）３９１−３９７に記載されている。
ＸＩ．結合分子の発現
前記した本発明のポリペプチドを提供するための単離された遺伝物質の操作に続いて、遺伝子は、典型的には、特許請求された結合分子を提供する所望の量のポリペプチドを生産するのに用いることができる宿主細胞への導入用の発現ベクターに挿入される。
用語「ベクター」または「発現ベクター」は、本明細書中においては、所望の遺伝子を細胞に導入し、それを発現させるための搬入体としての本発明に従って用いるベクターを意味させるために、明細書および請求項の目的で用いる。当業者に知られているように、そのようなベクターは、ファゲミド、ファージ、ウイルスおよびレテロウイルスよりなる群から容易に選択することができる。一般には、本発明に適合するベクターは選択マーカー、所望の遺伝子のクローニングを容易とするための適当な制限部位、および真核生物または原核生物細胞に進入しおよび／またはそこで複製する能力を含むであろう。
本発明の目的では、多数の発現ベクター系を使用することができる。例えば、ベクターの１つのクラスは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ，ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウイルスのような動物ウイルスに由来するＤＮＡエレメントを利用する。他のものは、内部リボソーム結合部位を持つポリシストロニック系の使用を含む。加えて、ＤＮＡをその染色体に組み込んだ細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能とする１以上のマーカーを導入することによって選択することができる。マーカーは栄養要求性宿主に対するプロトトロフィー、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）、または銅のような重金属に対する耐性を供することができる。選択マーカー遺伝子は発現させるべきＤＮＡ配列に直接的に連結させることができるか、あるいは共形質転換によって同一細胞に導入することができる。さらなるエレメントはｍＲＮＡの最適な合成で必要であろう。これらのエレメントはシグナル配列、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終止シグナルを含むことができる。特に好ましい具体例において、クローン化された可変領域遺伝子を、先に議論した合成の（好ましくはヒトの）重鎖および軽鎖定常領域遺伝子と共に発現ベクターに挿入される。好ましくは、これは、ＮＥＯＳＰＬＡ（米国特許第６，１５９，７３０号）というＩＤＥＣ，Ｉｎｃ．が所有する発現ベクターを用いて行われる。このベクターはサイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、マウスベータグロビン主要プロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエクソン１およびエクソン２、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子およびリーター配列を含有する。以下の実施例で見られるように、このベクターは、可変領域および定常領域遺伝子の組込、ＣＨＯ細胞におけるトランスフェクション、続いての、Ｇ４１８含有培地での選択およびメトトレキセート増幅に際して非常に高レベルの抗体の発現をもたらすことが判明した。べ、クター系は、その各々を個々に引用してその全体を援用する、米国特許第５，７３６，１３７号および第５，６５８，５７０号にも教示されている。この系は、高い発現レベル、例えば、＞３０ｐｇ／細胞／日を提供する。他の例示的なベクター系は、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号に開示されている。
他の好ましい具体例において、本発明のポリペプチドは、ここにその全体を援用する、２００１年１１月１６日に出願された同時係属米国仮出願第６０／３３１，４８１号に開示されたもののようなポリシストロニック構築体を用いて発現させることができる。これらの新規な発現系において、抗体の重鎖および軽鎖のような注目する多数の遺伝子産物を、単一のポリシストロニック構築体から生成することができる。これらの系は、有利には、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を用いて、真核生物宿主細胞において比較的高レベルの本発明のポリペプチドを得る。適合するＩＲＥＳ配列は、やはりここに援用する米国特許第６，１９３，９８０号に開示されている。当業者であれば、そのような発現系を用いて、本発明出願で開示されたポリペプチドの十分な範囲を効果的に生産することができるのを認識するであろう。
より一般的には、結合分子（例えば、修飾された抗体）のモノマーサブユニットをコードするベクターまたはＤＮＡ配列が一旦調製されたならば、発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することができる。すなわち、宿主細胞を形質転換することができる。プラスミドの宿主細胞への導入は、当業者によく知られた種々の技術によって達成することができる。それらは、限定されるものではないが、（電気泳動およびエレクトロポレーションを含めた）トランスフェクション、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープを持ったＤＮＡとの細胞融合、マイクロインジェクション、および無傷ウイルスでの感染を含む。Ｒｉｄｇｗａｙ，Ａ．Ａ．Ｇ．“Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ”Ｃｈａｐｔｅｒ ２４．２，ｐｐ．４７０−４７２ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｅｄｓ．（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．１９８８）参照。最も好ましくは、宿主へのプラスミド導入はエレクトロポレーションを介するものである。形質転換された細胞を、軽鎖および重鎖の生産に適した条件下で成長させ、重鎖および／または軽鎖タンパク質合成についてアッセイする。例示的なアッセイ技術は酵素−結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光−活性化細胞ソーター分析
（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学等を含む。
本明細書中で用いるように、用語「形質転換」は、遺伝子型を変化させ、その結果、受容体細胞の変化をもたらす受容体宿主細胞ＤＮＡへの導入をいうように広い意味で用いるべきである。
同一の系の間では、「宿主細胞」とは、組換えＤＮＡ技術を用いて構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターで形質転換されている細胞をいう。組換え宿主からのポリペプチドの単離からのプロセスの記載においては、用語「細胞」および「細胞培養」は、明瞭に他のことが特定されているのでなければ、抗体の源を示すように相互交換可能に用いる。換言すれば、「細胞」からのポリペプチドの回収は、回転沈降させた全細胞からの、あるいは培地および懸濁した細胞双方を含有する細胞からのいずれかを意味することができる。
１つの具体例において、（例えば、多価結合分子の）蛋白質発現で用いる宿主細胞系は哺乳動物起源であり；当業者であれば、そこで発現させるべき所望の遺伝子産物に最良に適した特別な宿主細胞系を優先的に決定する能力を備えている。例示的な宿主細胞系は、限定されるものではないが、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣系、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト頸部癌腫）、ＣＶＩ（サル腎臓系）、ＣＯＳ（ＣＶＩのＳＶ４０Ｔ抗原との誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓系）、ＳＰ２／Ｏ（マウスミエローマ）、Ｐ３．タイムズ．６３−Ａｇ３．６５３（マウスミエローマ）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、および２９３（ヒト腎臓）を含む。１つの具体例において、ＮＳ０細胞を用いることができる。ＣＨＯ細胞は特に好ましい。宿主細胞系は、典型的には、商業的なサービス期間、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから、あるいは公開された文献から入手可能である。
イン・ビトロ生産は、スケールアップが、大量の所望のポリペプチドを与えることを可能とする。組織培養条件下での哺乳動物細胞培養のための技術は当該分野で知られており、例えば、エアーリフトリアクター中での、または連続的スターラーリアクター中での均一懸濁培養、あるいは例えば、中空繊維、マイクロカプセル中での、アガロースマイクロビーズまたはセラミックカートリッジ上の固定化されたまたは捕獲された細胞培養を含む。もし必要および／または所望であれば、ポリペプチドの溶液は慣用的なクロマトグラフィー方法、例えば、ゲル濾過、イオン−交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロース上でのクロマトグラフィーまたは（イムノ−）アフィニティークロマトグラフィーによって、例えば、合成ヒンジ領域ポリペプチドの優先的な生合成の後に、あるいは本明細書中に記載されたＨＩＣクロマトグラフィー工程に先立って、もしくはそれに引き続いて精製することができる。
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子もまた、細菌または酵母植物細胞のような非−哺乳動物細胞で発現させることもできる。この点に関しては、細菌のような種々の単細胞非−哺乳動物微生物もまた形質転換できることが認識されよう；すなわち、それらは培養または発酵において成長させることができる。形質転換に対して感受性である細菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａの株のような腸内細菌科のメンバー；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのようなバシラス科；Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、およびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅを含む。細菌において発現させた場合、ポリペプチドは典型的には封入体の一部となることもさらに認識されよう。ポリペプチドは単離され、精製し、次いで、機能的分子に組立てられなければならない。抗体の四価形態が望まれる場合、次いで、サブユニットは四価抗体に自己−組立てられるであろう（ＷＯ０２／０９６９４８Ａ２）。
原核生物に加えて、真核生物微生物を用いることもできる。多数の他の株は通常入手可能であるが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または通常のパン酵母は、真核生物微生物の間で最も普通に用いられている。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにおける発現のためには、例えば、プラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０：１５７（１９８０））が通常に用いられる。このプラスミドは、既に、トリプトファン中で成長する能力を欠如する酵母の突然変異体株のための選択マーカーを供するＴＲＰ１遺伝子を含有する、例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７））。従って、酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐｌ病巣の存在は、トリプトファンの不存在下における成長による形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。
ＸＩＩ．結合分子の標識またはコンジュゲーション
本発明の結合分子は非−コンジュゲーテッド形態で用いることができ、あるいは種々のエフェクター、すなわち、例えば、標的検出を容易とするために、または患者のイメージングまたは療法のための機能的分子の少なくとも１つにコンジュゲートさせることができる。本発明のポリペプチドは、精製を行う場合に、精製の前または後いずれかに標識し、またはコンジュゲートさせることができる。特に、本発明のポリペプチドは（放射性同位体、細胞傷害性薬物、またはトキシンのような）細胞トキシン、治療剤、精細胞剤、生物学的トキシン、プロドラッグ、ペプチド、蛋白質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答モディファイアー、医薬剤、免疫学的に活性なリガンド（例えば、リンホトキシンまたは他の抗体、ここに、得られる分子は新形成細胞、およびＴ細胞のようなエフェクター細胞双方に結合する）、ＰＥＧ、またはイメージングでいうような検出可能な分子にコンジュゲートさせることができる。もう１つの具体例において、本発明のポリペプチドは、腫瘍の血管形成を減少させる分子にコンジュゲートさせることができる。他の具体例において、開示された組成物は、薬物またはプロドラッグにカップリングされた本発明のポリペプチドを含むことができる。本発明のなお他の具体例はリシン、ゲロニン、シュードモナスエキソトキシンまたはジフテリアトキシンのような特異的なバイオトキシンまたはそれらの細胞傷害性断片にコンジュゲートした本発明のポリペプチド使用を含む。いずれのコンジュゲートしたまたはコンジュゲートしていないポリペプチドを用いるかの選択は、癌のタイプおよび段階、補助的処置（例えば、化学療法または外部放射線）の使用および患者の状態に依存するであろう。当業者であれば、本明細書中における教示に鑑みてそのような選択を容易になすことができることが認識されよう。
従前の研究においては、同位体で標識された抗−腫瘍抗体は、動物モデルにおいて、およびある場合にはヒトにおいて、個体腫瘍ならびにリンパ腫／白血病において細胞を破壊するのに成功して用いられてきた。例示的な放射性同位体は；９０Ｙ，１２５Ｉ，１３１Ｉ，１２３Ｉ，１１１Ｉｎ，１０５Ｒｈ，１５３Ｓｍ，６７Ｃｕ，６７Ｇａ，１６６Ｈｏ，１７７Ｌｕ，１８６Ｒｅおよび１８８Ｒｅを含む。放射性核種は、核ＤＮＡにおいて多数のストランド破壊を引き起こす電離放射線を生じさせることによって作用し、細胞死滅に導く。治療コンジュゲートを生産するのに用いる同位体は、典型的には、短い経路長を有する高エネルギーα−またはβ−粒子を生じさせる。そのような放射性核種は、それらが均質する細胞、例えば、コンジュゲートが結合した、または進入した新形成細胞を死滅させる。それらは非−局所化細胞に対してほとんどまたは全く効果を有しない。放射性核種は実質的に非−免疫原性である。
本発明と組み合わせた放射性標識コンジュゲートの使用に関しては、本発明のポリペプチドは（ヨウ素化を介するように）直接的に標識することができるか、あるいはキレート化剤の使用を介して間接的に標識することができる。本明細書中で用いるように、フレーズ「間接的標識」および「間接的標識アプローチ」は、共に、キレート化剤が結合分子に共有結合し、および少なくとも１つの放射性核種がキレート化剤と会合していることを意味する。そのようなキレート化剤は典型的には二官能性キレート化剤という。というのは、それらはポリペプチドおよび放射性同位体双方に結合するからである。特に好ましいキレート化剤は１−イソチオシアナトベンジル−３―メチルジオテレントリアミンペンタ酢酸（「ＭＸ−ＤＴＰＡ」）およびシクロヘキシルジエチレンポリアミンペンタ酢酸（「ＣＨＸ−ＤＴＰＡ」）誘導体を含む。他のキレート化剤はＰ−ＤＯＴＡおよびＥＤＴＡ誘導体を含む。間接的標識のための特に好ましい放射性核種は１１１Ｉｎおよび９０Ｙを含む。
本明細書中で用いるように、フレーズ「直接的標識」および「直接的標識アプローチ」は、共に、放射性核種が（典型的には、アミノ酸残基を介して）ポリペプチドに直接的に共有結合していることを意味する。より詳しくは、これらの連結技術はランダム標識および部位−特異的標識を含む。後者の場合には、標識は、コンジュゲートのＦｃ部分にのみ存在するＮ−結合糖残基のようなポリペプチド上の特異的部位に向けられる。さらに、種々の直接的標識技術およびプロトコルは本発明に適合する。例えば、テクネチウム−９９ｍ標識ポリペプチドは、リガンド交換プロセスによって、過テクネチウム酸塩化（ＴｃＯ４ −）を第一スズイオン溶液で還元し、還元されたテクネチウムをセファデックスカラムにキレート化し、ポリペプチドをこのカラムに適応することによって、またはバッチ標識技術によって、例えば、過テクネチウム酸塩、ＳｎＣｌ２のような還元剤、フタル酸、ナトリウム−カリウム溶液のような緩衝液、および抗体をインキュベートすることによって調製することができる。いずれにせよ、抗体を直接的に標識するための好ましい放射性核種は当該分野でよく知られており、直接的標識のための特に好ましい放射性核種はチロシン残基を介して１３１Ｉ共有結合させる。本発明によるポリペプチドは、例えば、放射性ヨウ化ナトリウムまたはカリウムおよび次亜塩素酸ナトリウム、クロラミンＴなどのような化学酸化剤、あるいはラクトペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼおよびグルコースのような酵素酸化剤で誘導することができる。しかしながら、本発明の目的では、間接的な標的アプローチが特に好ましい。
キレーターおよびキレーターコンジュゲートに関する特許は当該分野で知られている。例えば、Ｇａｎｓｏｗの米国特許第４，８３１，１７５号は、ポリ置換ジエチレントリアミンペンタ酢酸キレート、およびそれを含有する蛋白質コンジュゲートおよびそれらの製法に向けられる。Ｇａｎｓｏｗの米国特許第５，０９９，０６９号、第５，２４６，６９２号、第５，２８６，８５０号、第５，４３４，２８７号および第５，１２４，４７１号もまたポリ置換ＤＴＰＡキレートに関する。これらの特許をここに引用してその全体を援用する。適合する金属キレーターの他の例はエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＰＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン、１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン−１，４，８，１１−テトラ酢酸、１−オキサ−４，７，１２，１５−テトラアザヘプタデカン−４，７，１２，１５−テトラ酢酸などである。シクロヘキシル−ＤＴＰＡまたはＣＨＸ−ＤＴＰＡは特に好ましく、以下に多くを例示する。発見されていないものも含めたなお他の適合するキレーターは当業者によって容易に認識でき、明らかに、本発明の範囲内のものである。
同時係属出願第０８／４７５，８１３号、第０８／４７５，８１５号、および第０８／４７８，９６７号においてキレート化を容易とするのに用いられる特異的二機能的キレーターを含めた適合するキレーターは、三価金属に対して高い親和性を提供し、増大した非−腫瘍に対する腫瘍の比率、および減少した骨摂取、ならびに標的部位、すなわち、Ｂ−細胞リンパ腫の腫瘍部位における放射性核種のより大きなイン・ビボ滞留を呈するように選択される。しかしながら、これらの特徴の全てを有しても有さなくてもよい他の二官能性キレーターは当該分野で知られており、腫瘍療法でやはり有益であろう。
また、本明細書中における教示に従って、ポリペプチドを診断および治療目的で異なる放射性標識にコンジュゲートさせることができるのも認識されるであろう。この目的で、ここに引用してその全体を援用する、前記した同時係属出願は、治療抗体の投与前における腫瘍の診断「イメージング」のための放射性標識下治療コンジュゲートを開示する。「Ｉｎ２Ｂ８」コンジュゲートは、二官能性キレーター、すなわち、１−イソチオシアナトベンジル−３−メチル−ＤＴＰＡおよび１−メチル−３−イソチオシアナトベンジル−ＤＴＰＡの１：１混合物を含むＭＸ−ＤＴＰＡ（ジエチレン−トリアミンペンタ酢酸）を介して１１１Ｉｎに結合したヒトＣＤ２０抗原に特異的なネズミモノクローナル抗体２Ｂ８を含む。１１１Ｉｎは診断放射性核種として特に好ましい。なぜならば、約１ないし約１０ｍＣｉの間が検出可能な毒性なくして安全に投与できるからであり；イメージングデータは、通常、引き続いての９０Ｙ−標識抗体の分布を予測する。ほとんどのイメージング研究は５ｍＣｉの１１１Ｉｎ−標識抗体を利用する。なぜならば、この用量は安全であって、より低い用量と比較して増大したイメージング効率を有するからであり、最適なイメージングは抗体投与から３ないし６日後に起こる。例えば、Ｍｕｒｒａｙ，Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．２６：３３２８（１９８５）およびＣａｒｒａｇｕｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．２６：６７（１９８５）参照。
前記で示したように、種々の放射性核種を本発明に適用する事ができ、当業者であれば、いずれの放射性核種が種々の状況下で最も適切であるかを容易に決定することができる。例えば、１３１Ｉは標的化された免疫療法で用いられるよく知られた放射性核種である。しかしながら、１３１Ｉの臨床的有用性は：８日の物理的半減期；血液中および腫瘍部位におけるヨウ素化抗体の脱ハロゲン化；および腫瘍における局所化された用量沈積に対して最適下であり得る発光特徴（例えば、大きなガンマ成分）を含めたいくつかの因子によって制限され得る。優れたキレート化剤の出現に伴い、金属キレート化基を蛋白質に結合するための機会は、１１１Ｉｎおよび９０Ｙのような他の放射性核種を利用する機会を増大させた。９０Ｙはラジオイムノ治療適用での利用のためにいくつかの利点を提供し：６４時間の９０Ｙの半減期は腫瘍による抗体蓄積を可能とするのに十分長くおよび、例えば、１３１Ｉとは異なり、９０Ｙは、１００ないし１，０００細胞直径の組織における範囲にて、その崩壊においてガンマ照射を伴わない高エネルギーの純粋なベータエミッターである。さらに、最少量の貫入放射線は９０Ｙ−標識抗体の外来患者投与を可能とする。加えて、標識された抗体の内部化は細胞殺傷に必要でなく、電離放射線の局所的発光は標的分子を欠如する隣接腫瘍細胞に対して致死的なはずである。
当業者であれば、これらの非−放射性コンジュゲートは、コンジュゲートさせるべき選択された剤に依存して、種々の技術を用いて組立てることもできることを認識するであろう。例えば、ビオチンとのコンジュゲートは、例えば、ビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのようなビオチンの活性化されたエステルと反応化させることによって調製される。同様に、蛍光マーカーとのコンジュゲートは、カップリング剤、例えば、前記リストのものの存在下で、あるいはイソチオシアネート、好ましくは、フルオレセイン−イソチオシアネートとの反応によって調製することができる。本発明のポリペプチドの、静細胞／細胞傷害性物質および金属キレートのコンジュゲートは同様にして調製される。
多くのエフェクター分子は、抗体が連結することができる適当な官能基を欠如する。１つの具体例において、エフェクター分子、例えば、薬物またはプロドラッグを連結分子を介して抗体に結合させる。１つの具体例において、連結分子は、特定の部位における細胞傷害性の活性化を可能とする化学結合を含有する。適当な化学結合は当該分野でよく知られており、ジスルフィド結合、酸不安定結合、光不安定結合、ペプチダーゼ不安定結合、スルフヒドリルおよびマレイミド基の間に形成されたチオエーテル結合、およびエステラーゼ不安定結合を含む。最も好ましくは、連結分子はジスルフィド結合またはチオエーテル結合を含む。本発明によると、連結分子は、好ましくは、反応性化学基を含む。特に好ましい反応性化学基はＮ−スクシンイミジルエステルおよびＮ−スルホスクシンイミジルエステルである。好ましい具体例において、反応性化学基はチオール基の間のジスルフィド結合を介してエフェクターに共有結合できる。１つの具体例において、エフェクター分子はチオール基を含むように修飾される。当業者であれば、チオール基は水素原子に結合した硫黄原子を含有し、典型的には、「−ＳＨ」または「ＲＳＨ」と命名できるスルフヒドリル基とも当該分野で言われることを認識するであろう。
１つの具体例において、連結分子は、エフェクター分子を結合分子と接合させるのに用いることができる。本発明の連結分子は切断可能であっても、または切断不能であってもよい。１つの具体例において、切断可能連結分子は、連結分子が、遊離スルフヒドリル基を持つより高い濃度の分子を含む細胞質および他の領域のような、より低いレドックスポテンシャルを持つ環境において切断可能なように、レドックス−切断可能連結分子である。レドックスポテンシャルの変化のため切断することができる連結分子の例は、ジスルフィドを含有するものを含む。切断刺激を本発明の結合蛋白質の細胞内摂取に際して供することができ、ここに、細胞質のより低いレドックスポテンシャルは連結分子の切断を容易とする。もう１つの具体例において、ｐＨの現象はメイタンシノイドカルゴの標的細胞への放出をトリガーする。ｐＨの減少は、エンドソームトラフィッキング、腫瘍成長、炎症、および心筋虚血症のような多くの生理学的および病理学的プロセスに関連付けられている。ｐＨはエンドソームにおいては生理学的７．４から５ないし６に、またはリソソームにおいては４ないし５まで降下する。癌細胞のリソソームまたはエンドソームを標的化するのに用いることができる酸感受性連結分子の例は、アセタール、ケタール、オルトエステル、ヒドラゾン、トリチル、シス−アコニチルまたはシオカルバモイルで見出されるもののような酸−切断可能結合を持つものを含む（例えば、Ｗｉｌｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９３），Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ．，４：５２１−７；米国特許第４，５６９，７８９号、第４，６３１，１９０号、第５，３０６，８０９号、および第５，６６５，３５８号参照）。他の例示的な酸−感受性連結分子はジペプチド配列Ｐｈｅ−ＬｙｓおよびＶａｌ−Ｌｙｓを含む（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００２），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４５：４３３６−４３）。切断刺激体は、低ｐＨエンドソーム区画（例えば、リソソーム）への細胞内摂取トラフィッキングに際して提供され得る。他の例示的な酸−切断可能連結分子は、２以上のメイタンシノイドの結合用の２以上の酸切断可能結合を含有する分子である（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９９），Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，１０：２７９−８８； ＷＯ ９８／１９７０５）。
切断可能連結分子は、特定の標的細胞に関連する生物学的に供給される切断剤、例えば、リソソームまたは腫瘍−関連酵素に対して感受性であり得る。酵素的に切断することができる連結分子の例は、限定されるものではないが、ペプチドおよびエステルを含む。例示的な酵素切断可能連結分子は、カテプシンＢまたはプラスミンのような腫瘍−関連プロテアーゼに対して感受性であるものを含む（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９９），Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒ．，８３：６７−１２３；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９８），Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，８：３３４１−５２；ｄｅ Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ．，（２０００），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４３：３０９３−１０２；ｄｅ Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）ｍ ４２：５２７７−８３）。カテプシンＢ−切断可能部位はジペプチド配列バリン−シトルリンおよびフェニルアラニン−リシンを含む（Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．，（２００３），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２１（７）：７７８−８４）；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，（２００２），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，１３：８５５−６９）。他の例示的な酵素−切断部位は、好中球、マクロファージおよび他の顆粒球によって優先的に放出される酵素であるチメット（Ｔｈｉｍｅｔ）オリゴペプチダーゼ（ＴＯＰ）のようなトラウゼ（ｔｒｏｕｓｅ）プロテアーゼによって認識される４ないし１６アミノ酸（例えば、Ｓｕｃ−β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ）のオリゴペプチド配列によって形成されるものを含む。
さらなる具体例において、連結分子は、本発明の結合分子を式：
Ｘ−Ｙ−Ｚ
［式中、
Ｘは付着分子であり；
Ｙはスペーサー分子であり；および
Ｚはエフェクター付着部位である］
の連結分子と反応させることによって形成される。
用語「結合分子付着分子」は、連結ペプチドの、本発明の結合分子への共有結合付着を可能とする分子を含む。
付着分子は、例えば、所望により水素原子、および結合分子がその意図した機能を行うのを可能とする他の置換基で置換されていてもよい、１ないし６０の炭素、酸素、窒素、硫黄原子の共有結合鎖を含むことができる。付着分子はペプチド、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、エーテル、チオエーテル等の官能基を含むことができる。好ましくは、付着分子は、それが少なくとも１つの抗原結合部位を含むポリペプチド上の反応性官能基と反応して、本発明の結合分子を形成できるように選択される。付着分子の例は、例えば、アミノ、カルボキシレート、およびチオール付着分子を含む。
アミノ付着分子は、本発明の結合分子が形成されるように、ポリペプチド上のアミノ基と反応する分子を含む。アミノ付着分子は当該分野で知られている。アミノ付着分子の例は（例えば、結合分子上のアミノ基と反応して、尿素基を含む連結分子を形成することができる）活性化されたカルバメート、（例えば、結合分子上のアミノ基と反応することができる）アルデヒド、および（結合分子上のアミノ基と反応して、尿素基を含む連結分子を形成することができる）活性化されたイソシアネートを含む。アミノ付着分子の例は、限定されるものではないが、Ｎ−スクシンイミジル、Ｎ−スルホスクシンイミジル、Ｎ−フタルイミジル、Ｎ−スルホフタルイミジル、２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、３−スルホニル−４−ニトロフェニル、または３−カルボキシ−４−ニトロフェニル分子を含む。
カルボキシレート付着分子は、本発明の結合分子が形成されるように、ポリペプチド上のカルボキシレート基と反応する分子を含む。カルボキシレート付着分子は当該分野で知られている。カルボキシレート付着分子の例は、限定されるものではないが、結合分子上のＣＯＯＨ基と反応して、エステル、チオエステル、またはアミド基を含む連結分子を形成することができる、活性化されたエステル中間体および活性化されたカルボニル中間体を含む。
チオール付着分子は、本発明の結合分子が形成されるように、ポリペプチド上に存在するチオール基と反応する分子を含む。チオール付着分子は当該分野で知られている。チオール付着分子の例は、（結合分子上のスルフヒドリルと反応して、チオエステルを含む連結分子を形成することができる）活性化されたアシル基、（結合分子上のスルフヒドリルと反応して、チオエステル分子を含む連結分子を形成することができる）活性化されたアルキル基、（結合分子上のスルフヒドリルと反応して、ミカエル−タイプの付加生成物を形成することができる）マレイミドまたはアクリル基のようなミカエルアクセプター、レドックス反応を介してスルフヒドリル基と反応する基、（結合分子上のスルフヒドリル基と反応して、例えば、ジスルフィド分子を含む連結分子を形成することができる）活性化されたジスルフィド基を含む。他のチオール付着分子はアクリルアミド、アルファ−ヨードアセタミド、およびシクロプロパン−１，１−ジカルボニル化合物を含む。加えて、チオール付着分子は、結合分子上のチオールを修飾して、連結分子がそれに付着して、本発明の結合分子を形成するもう１つの反応性種を形成する分子を含むことができる。
スペーサー分子Ｙは、１以上のアミノ酸残基を含有することができる原子の共有結合または共有結合鎖である。それは、所望により、水素、あるいは得られた結合分子がその意図した機能を行うことを可能とする他の置換基で置換されていてもよい０ないし６０の炭素、酸素、硫黄または窒素原子を含むことができる。１つの具体例において、Ｙはアルキル、アルケニル、アルキニル、エステル、エーテル、カルボニル、またはアミド分子を含む。
もう１つの具体例において、結合分子上のチオール基は、ケトンまたはアルデヒドのような反応性カルボニル基のような反応性基に変換される。次いで、付着分子はケトンまたはアルデヒドと反応して、本発明の所望の化合物を形成する。カルボニル反応性付着分子の例は、限定されるものではないが、ヒドラジン、ヒドラジド、Ｏ−置換ヒドロキシルアミン、アルファ−ベータ−不飽和ケトン、およびＨ２Ｃ＝ＣＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２を含む。付着分子の他の例、および本発明の結合分子を形成するのに用いることができるチオール分子を修飾する方法はＰｒａｔｔ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２００３ Ｍａｙ ２１；１２５（２０）：６１４９−５９；およびＳａｘｏｎ，Ｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０００ Ｍａｒ １７；２８７（５４６０）：２００７−１０に記載されている。
連結分子は、エフェクター分子またはその誘導体と反応して、本発明の結合分子を形成することができる分子であってよい。例えば、エフェクター分子は、ジスルフィド結合を介して分子の残りの部分に連結することができる。そのような場合において、連結分子は、それが、エフェクター分子が本発明の結合分子に結合するように、適当なエフェクター部位誘導体と反応することができるように選択される。前記したように、全体として、連結分子および／または連結ペプチドは、連結ペプチチドが適当な環境で切断されるように選択することができる。
特に好ましい連結分子は、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（例えば、Ｃａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１７３，７２３−７３７（１９７８）参照）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）（例えば、米国特許第４，５６３，３０４号参照）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）（例えば、ＣＡＳ登録番号３４１４９８−０８−６参照）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）（例えば、Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，３９５−３９９（１９７９）参照）、およびＮ−スクシンイミジル４−メチル−４−［２−（５−ニトロ−ピリジル）−ジチオ］ペンタノエート（ＳＭＮＰ）（例えば、米国特許第４，５６３，３０４号参照）を含む。本発明の組成物で用いる最も好ましい連結ペプチド分子はＳＰＰ，ＳＭＣＣ、およびＳＰＤＢである。好ましい具体例において、ＳＰＤＢを用いて、エフェクター分子を本発明の結合分子に連結させる。
本発明で用いる好ましい細胞傷害性エフェクター分子は細胞傷害性薬物、特に、癌療法で用いられるものである。本明細書中で用いるように、「サイトトキシンまたは細胞傷害性剤」は、細胞の成長および増殖に対して有害であって、細胞または悪性疾患を低下させ、阻害し、または破壊するように作用することができるいずれの剤も意味する。例示的なサイトトキシンは、限定されるものではないが、放射性核種、バイオトキシン、酵素的に活性なトキシン、静細胞または細胞傷害性治療剤、プロドラッグ、免疫学的に活性なリガンド、およびサイトカインのような生物学的応答モディファイアーを含む。免疫反応性細胞または悪性細胞の成長を遅延させ、または遅らせるように作用するいずれのサイトトキシンも本発明の範囲内にある。
例示的なサイトトキシンは、一般には、静細胞剤、アルキル化剤、抗代謝産物、抗−増殖剤、チューブリン結合剤、ホルモンおよびホルモンアンタゴニスト等を含む。本発明に適合する例示的な静細胞剤は、メクロルエタミン、トリエチレンホスファミド、シクロホスファミド、イフォスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファランまたはトリアジクオンのようなアルキル化物質、また、カルムスチン、ロムスチンまたはセムスチンのようなニトロソ尿素化合物を含む。
コンジュゲーションのための特に好ましい分子はメイタンシノイドである。メイタンシノイドは、元来、Ｍａｙｔｅｎｕｓ属に属する東アフリカ低木から単離されたが、引き続いて、Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ ｐｒｅｔｉｏｓｕｍのような土壌細菌の代謝産物であることも発見された（米国特許第３，８９６，１１１号参照）。メイタンシノイドは、当該分野においては、メイタンシン、メイタンシノール、メイタンシノールのＣ−３エステル、および他のメイタンシノールアナログおよび誘導体を含むことが知られている（例えば、米国特許第５，２０８，０２０号および第６，４４１，１６３号参照）。メイタンシノールのＣ−３エステルは天然に生じるまたは合成的に誘導することができる。さらに、天然に生じるおよび合成のＣ−３メイタンシノールエステルは共に、単純なカルボン酸を持つＣ−３エステル、またはＮ−メチル−Ｌ−アラニンの誘導体を持つＣ−３エステルとして分類することができ、後者は前者よりも細胞傷害性である。合成メイタンシノイドアナログもまた当該分野で知られており、例えば、Ｋｕｐｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２１，３１−３７（１９７８）に記載されている。メイタンシノールおよびそのアナログおよび誘導体を生じさせるための方法は、例えば、米国特許第４，１５１，０４２号に記載されている。
抗体コンジュゲートとして用いられる適当なメイタンシノイドは、当該分野で知られた方法を用いて、天然源から単離することができ、合成により製造することができ、または半−合成的に製造することができる。さらに、十分な細胞傷害性が最終的なコンジュゲート分子において維持されるように、メイタンシノイドはいずれかの適当な方法で修飾することができる。
反応性化学基を含有する連結分子を含む特に好ましいメイタンシノイドはメイタンシノールのＣ−３エステルおよびそのアナログであり、ここに、連結分子はジスルフィド結合を含有し、付着分子はＮ−スクシンイミジルまたはＮ−スルホスクシンイミジルエステルを含む。メイタンシノイド上の多くの位置が、例えば、エフェクター付着分子を介して連結分子を化学的に連結させるための位置として働くことができる。例えば、ヒドロキシル基を有するＣ−３位置、ヒドロキシメチルで修飾されるＣ―１４位置、ヒドロキシで修飾されたＣ−１５位置、およびヒドロキシ基を有するＣ−２０位置は全て有用である。連結分子は、最も好ましくは、メイタンシノールのＣ−３位置に連結される。最も好ましくは、本発明の組成物と組合せて用いられるメイタンシノイドはＮ．ｓｕｐ．２’−デアセチル−Ｎ．ｓｕｐ．２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）またはＮ．ｓｕｐ．２’−デアセチル−Ｎ．ｓｕｐ．２’−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）である。
他の化学結合との連結分子もまた、他のメイタンシノイドが可能であるように本発明の関係で用いることもできる。連結分子に取り込むことができる他の化学結合の具体的な例は、例えば、酸不安定結合、チオエーテル結合、光不安定結合、ペプチダーゼ不安定結合およびエステラーゼ不安定結合のような、前記したものを含む。連結分子および／またはエフェクター付着分子を持つメイタンシノイドを製造する方法は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号、および第６，３３３，４１０号に記載されている。
メイタンシノイドの連結分子（および／またはエフェクター付着分子）は、典型的には、かつ好ましくは、抗体をメイタンシノイドに接合させるのに用いるより大きな連結ペプチド分子の一部である。連結分子が、各々、メイタンシノイドおよび抗体の細胞傷害性および標的化特徴の保持を供する限り、いずれの適当な連結ペプチド分子も本発明と組合せて用いることができる。メイタンシノイドおよび抗体が相互に化学的にカップリングされる（例えば、共有結合される）ように、連結分子は（前記したように）化学結合を介してメイタンシノイドを抗体に接合させる。望ましくは、連結分子は、ジスルフィド結合またはチオエステル結合を通じてメイタンシノイドを抗体に化学的にカップリングさせる。最も好ましくは、抗体はジスルフィド結合を介してメイタンシノイドに化学的にカップリングされる。
細胞傷害性剤の他の好ましいクラスは、例えば、薬物のアントラサイクリンファミリー、リンカー薬物、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞傷害性ヌクレオシド、薬物のプテリジンファミリー、ジイネン、およびポドフィロトキシンを含む。それらのクラスの特に有用なメンバーは、例えば、アドリアマイシン、カルミノマイシン、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ドキソルビシン、アミノプテリン、メトトレキセート、メトプテリン、ミタラマイシン、ストレプトニグリン、ジクロロメトトレキセート、マイトマイシンＣ、アクチノマイシン−Ｄ、ポロフィロマイシン、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、フトラフール、６−メルカプトプリン、シタラビン、サイトシンアラビノシド、ポドフィロトキシン、あるいはエトポシドまたはエトポシドフォスフェートのようなポドフィロトキシン誘導体、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ロイロシジン、ビンデシン、ロイロシン等を含む。本明細書中における教示と適合するなお他のサイトトキシンはタキソール、タキサン、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、テノポシド、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ニトキサントロン、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、ポロピラノロール、およびピューロマイシン、およびそのアナログまたはホモログを含む。コルチコステロイド、例えば、プレドニゾン、プロゲスチン、例えば、ヒドロキシプロゲステロンまたはメドロプロゲステロン、エストロゲン、例えば、ジエチルスチルベストロール、抗エストロゲン、例えば、タモキシフェン、アンドロゲン、例えば、テストステロン、およびアロマターゼ阻害剤、例えば、アミノグルテチミドのようなホルモンおよびホルモンアンタゴニストは本明細書中における教示に適合する。先に述べたように、当業者は所望の化合物に対して化学的修飾を行って、本発明のコンジュゲートを調製する目的でより便宜なその化合物の反応を行うことができる。
特に好ましいサイトトキシンの１つの例は、カリケアミシン、エスペラミシンまたはダイネミシンを含めた、抗−腫瘍抗体のエネジインファミリーのメンバーまたは誘導体を含む。これらのトキシンは極端に優れており、核ＤＮＡを切断することによって作用し、細胞の死滅に導く。イン・ビボで切断されて、多くの不活性であるが免疫原性のポリペプチド断片を与えることができる蛋白質トキシンとは異なり、カルケアミシン、エスペラミシンおよび他のエネジインのようなトキシンは、実質的に非−免疫原性である小分子である。これらの非−ペプチドトキシンは、モノクローナル抗体および他の分子を標識するのに従前用いられてきた技術によってダイマーまたはテトラマーに化学的に連結される。これらの連結技術が構築体のＦｃ部分にのみ存在するＮ−結合糖残基を介する部位−特異的結合を含む。そのような部位−指向性連結分子は、構築体の結合特性に対する結合の可能な影響を低下させる利点を有する。
他のサイトトキシンの中でも、ポリペプチドはリシンサブユニットＡ、アブリン、ジフテリアトキシン、ボツリヌス菌、シアンギノシン、サキシトキシン、シガトキシン、破傷風、テトロドトキシン、トリコテセン、ベルコロゲンまたは毒性酵素のようなバイオトキシンと会合することもできることは認識されるであろう。好ましくは、そのような構築体は、結合分子−トキシン構築体の直接的発現を可能とする遺伝子工学技術を用いて作成されるであろう。本発明のポリペプチドに会合することができる他の生物学的応答モディファイアーは、リンホトキシンおよびインターフェロンのようなサイトカインを含む。本開示に鑑みると、当業者であれば、慣用的な技術を用いてそのような構築体を容易に形成することができると主張する。
開示されたポリペプチドと組合せて用いることができる適合サイトトキシンのもう１つのクラスは、腫瘍または免疫反応性細胞に効果的に向けることができる放射線増感薬物である。そのような薬物は、電離放射線に対する感受性を増強させ、それにより、放射線療法の効果を増大させる。腫瘍細胞によって内部化されるコンジュゲートは、放射線感受性化が最大となる場合に核により近い放射線増感剤を送達するであろう。本発明の結合していない放射線増感剤ポリペプチドは血液から迅速に除去され、残存する放射線増感剤を標的腫瘍に局所化させ、正常組織における最小摂取を供する。血液からの迅速な除去の後、補助的放射線療法を３つの方法：１）腫瘍に特異的に向けられた外部ビーム照射、２）腫瘍に直接的にインプラントされた放射能、または３）同一の結合分子との全身放射線免疫療法のうちの１つで投与されるであろう。このアプローチの潜在的に魅力的な変形は、放射線増感イムノコンジュゲートへの治療的放射性同位体の付着であり、それにより、患者に単一薬物を投与する便宜性を供する。
１つの具体例において、ポリペプチドの安定性または有効性を増強させる分子をコンジュゲートすることができる。例えば、１つの具体例において、ＰＥＧを本発明のポリペプチドにコンジュゲートさせて、イン・ビボにてそれらの半減期を増大させることができる。Ｌｅｏｎｇ，Ｓ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．２００１．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １６：１０６；２００２；Ａｄｖ．ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４：５３１；ｏｒ Ｗｅｉｒ ｅｔ ａｌ．２００２．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ３０：５１２。
先に示唆したように、適合するサイトトキシンはプロドラッグを含むことができる。本明細書中で用いるように、用語「プロドラッグ」とは、親薬物と比較して腫瘍細胞に対して細胞傷害性が低く、酵素的に活性化され、より活性な親形態に変換され得る医薬上活性な物質の前駆体または誘導体をいう。発明に適合するプロドラッグは、限定されるものではないが、ホスフェート−含有プロドラッグ、チオホスフェート−含有プロドラッグ、スルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、β−ラクタム−含有プロドラッグ、所望におり置換されていてもよいフェノキシアセタミド−含有プロドラッグまたは所望により置換されていてもよいフェニルアセタミド−含有プロドラッグ、５−フルオロサイトシン、およびより活性な細胞傷害性遊離薬物に変換することができる他の５−フルオロウリジンプロドラッグを含む。１つの具体例において、メイタンシュノイドのような細胞傷害性剤を、ジスルフィド結合の加水分解によって放出されるプロドラッグとして投与する。本発明で用いるプロドラッグ形態に誘導体化することができる細胞傷害性薬物のさらなる例は、前記した化学療法剤を含む。
ＸＩＩＩ．結合分子の投与
本発明の結合分子を調製し、対象に投与する方法は当業者によく知られており、あるいは当業者によって容易に決定される。本発明の結合分子の投与の経路は経口、非経口、吸入または局所であり得る。本明細書中で用いる用語非経口は静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸または膣投与を含む。非経口投与の静脈内、動脈内、皮下および筋肉内形態は一般に好ましい。投与の全てのこれらの形態は本発明の範囲内にあると明瞭に考えられるが、投与のための形態は注射用、特に、静脈内または動脈内注射または点滴用の溶液であろう。通常、発明のための適当な医薬組成物は緩衝液（例えば、酢酸、リン酸またはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、所望により安定化剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含むことができる。しかしながら、本明細書中での教示に適合する他の方法においては、ポリペプチドを直接的に有害な細胞集団の部位に送達することができ、それにより、病気の組織の治療剤への暴露を増加させることができる。
非経口投与用の製剤は滅菌水性または非−水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンを含む。非−水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブのような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射有機エステルを含む。水性担体は水、アルコール／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液を含み、セーラインおよび緩衝化媒体を含む。本発明においては、医薬上許容される担体は、限定されるものではないが、０．０１ないし０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍリン酸緩衝液または０．８％セーラインを含む。他の通常の非経口ビークルは、リン酸ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル、または不揮発性油を含む。静脈内ビークルはリンゲルデキストロースに基づくものなどのような、流体および栄養補充物、電解質補充物を含む。例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスなどのような保存剤および他の添加物を存在させることもできる。さらに詳しくは、注射用途に適した医薬組成物は滅菌水性溶液（水溶性の場合）または分散液、および滅菌注射溶液または懸濁液の即席調製のための滅菌粉末を含む。そのような場合においては、組成物は滅菌されていなければならず、容易なシリンジ性が存在する程度まで流体とすべきである。それは製造および貯蔵の条件下で安定とすべきであり、好ましくは、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保存されるであろう。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液の場合における必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロザール等によって達成することができる。多くの場合において、それは、好ましくは、等張剤、例えば、マンニトール、ソルビトールのような糖、ポリアルコール、あるいは塩化ナトリウムを組成物中に含むのが好ましいであろう。注射組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによって実現することができる。
いずれの場合においても、滅菌注射溶液は、必要な量の活性化合物（例えば、ポリペプチドそれ自体、または他の活性剤との組合せ）を、本明細書中に列挙した成分の１つ、またはその組合せを含む適当な溶媒に配合し、必要に応じて、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、基本的な分散媒体、および前記にて列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビークルに活性な化合物を配合することによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合には、調製の好ましい方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これは、その従前に滅菌濾過した溶液から、有効成分＋いずれかのさらなる所望の成分の粉末を生じる。注射用の製剤を加工し、アンプル、バッグ、瓶、シリンジまたはバイアルのような溶器に充填し、当該分野で知られた方法に従って無菌条件下でシールする。さらに、製剤は、その各々をここに引用して援用する、同時係属Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／２５９，３３７およびＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／２５９，３３８に記載されているもののようなキットの形態でパッケージし、販売することができる。そのような製品は、好ましくは、関連する組成物が自己免疫または新形成障害に悩んでいる、またはその素因がある対象を治療するのに有用であることを示すラベルまたはパッケージ添付文書を有するであろう。前記範囲における中間の用量も本発明の範囲内にあることを意図する。
前記した疾患の治療のための本発明の安定化された結合分子の有効用量は、投与の手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトまたは動物であるか、他の投薬、および処置が予防的または治療的であるかに依存して変化する。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含めた非−ヒト哺乳動物を治療することもできる。治療用量は、当業者に知られたルーチン的方法を用いて滴定して、安全性および有効性を最適化することができる。
本発明の結合分子での受動的免疫化のためには、用量は、例えば、約０．０００１ないし１００ｍｇ／ｋｇ、より通常には０．０１ないし５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．０２ ｍｇ／ｋｇ、０．２５ ｍｇ／ｋｇ、０．５ ｍｇ／ｋｇ、０．７５ ｍｇ／ｋｇ、１ ｍｇ／ｋｇ、２ ｍｇ／ｋｇ等）の宿主体重の範囲とすることができる。例えば、用量は１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重、または１ないし１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇとすることができる。前記範囲において中間的な用量も本発明の範囲内にあることを意図する。
対象には毎日、一日おきに、毎週、または経験的な分析によって決定されたいずれかの他のスケジュールに従ってそのような用量を投与することができる。例示的な処置は、例えば、少なくとも６ヶ月の延長された期間にわたっての多数用量の投与を含む。さらなる例示的処置方法は、２週間ごとに１回、または１ヶ月に１回、または３ないし６ヶ月ごとに１回の投与を含む。例示的な用量は連続日についての１ないし１０ｍｇ／ｋｇまた１５ｍｇ／ｋｇ、１日おき毎に３０ｍｇ／ｋｇ、または毎週６０ｍｇ／ｋｇを含む。いくつかの方法において、異なる結合特性を持つ２以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、その場合、投与された各抗体の用量は示した範囲内のものとすることができる。
本発明の結合分子が多数の場合に投与することができる。単一用量の間の間隔は、例えば、日、週、月または年とすることができる。間隔は、患者におけるポリペプチドまたは標的分子の血中レベルを測定することによって示されるように不規則なものであり得る。いくつかの方法においては、用量を調整して、ある血漿中結合分子またはトキシン濃度、例えば、１ないし１０００μｇ／ｍｌまたは２５ないし３００μｇ／ｍｌを達成することができる。別法として、結合分子は徐放処方として投与することができ、その場合には、より低い頻度の投与が要求される。用量および頻度は患者における抗体の半減期に依存して変化する。一般には、ヒト化抗体は最長の半減期を示し、続いて、キメラ抗体および非ヒト抗体である。１つの具体例において、本発明の結合分子はコンジュゲートされていない形態で投与することができる。もう１つの具体例において、本発明のポリペプチドはコンジュゲートされた形態で多数回投与することができる。さらにもう１つの具体例において、本発明の結合分子はコンジュゲートされていない形態で、次いで、コンジュゲートされた形態で投与することができ、または逆も可能である。
投与の用量および頻度は、処置が予防的であるかまたは治療的であるかに依存して変化し得る。予防的適用においては、本発明の抗体またはそのカクテルを含有する組成物は既に病気状態となっていない患者に投与されて、患者の耐性を増強させる。そのような量は「予防的有効用量」と定義される。この使用においては、正確な量は、再度、患者の健康状態および一般的な免疫性に依存するが、一般には、用量当たり０．１ないし２５ｍｇ、特に用量当たり０．５ないし２．５ｍｇの範囲である。比較的低い用量が長期間にわたって比較的頻繁でない間隔で投与される。ある患者は、継続的にその人生の残りの間処置を受ける。
治療的適用においては、比較的短い間隔での比較的高い用量（例えば、用量当たり約１ないし４００ｍｇ／ｋｇの結合分子、例えば、抗体；５ないし２５ｍｇの用量は放射性イムノコンジュゲートでより通常に用いられ、より高い用量はサイトトキシン−薬物コンジュゲーテッド分子で用いられる）は、時々、病気の進行が低下し、または停止するまで、好ましくは患者が病気の兆候の部分的または完全な緩和を示すまで必要とされる。その後、特許品を予防的方法で投与することができる。
１つの具体例において、対象は（例えば、ベクター中の）本発明のポリペプチドをコードする核酸分子で処置することができる。ポリペプチドをコードする核酸についての用量は、患者当たり約１０ｎｇないし１ｇ、１００ｎｇないし１００ｍｇ、１μｇないし１０ｍｇ、または３０ないし３００μｇ ＤＮＡの範囲である。感染性ウイルスベクターについての用量は、用量当たり１０ないし１００以上のビリオンで変化する。
治療剤は、予防的および／または治療的処置のための非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内または筋肉内手段によって投与することができる。筋肉内注射または静脈内注入が本発明の結合分子の投与で好ましい。いくつかの方法において、特定の治療結合分子が頭蓋に直接的に注射される。いくつかの場合には、結合分子はＭｅｄｉｐａｄＴＭデバイスのような徐放組成物またはデバイスとして投与される。
本発明の剤は、所望により、処置（例えば、予防的または治療的）を必要とする障害または疾患を治療するのに効果的な他の剤と組み合わせて投与することができる。好ましいさらなる剤は、当該分野で認識され、特定の障害で標準的に投与されるものである。
本発明の９０Ｙ−標識ポリペプチドの有効な単一処置用量（すなわち、治療的に効果的な量）は約５および約７ｍＣｉの間、より好ましくは約１０および約４０ ｍＣｉの間の範囲である。１３１Ｉ−標識抗体の効果的な単一処置非−骨髄切除用量は約５および約７０ｍＣｉの間、より好ましくは約５および約４０ｍＣｉの間の範囲である。１３１Ｉ−標識抗体の有効な単一処置切除用量（すなわち、オートロガス骨髄移植を必要とし得る）は、約３０および約６００ｍＣｉの間、より好ましくは約５０および約５００ｍＣｉ未満の間である。キメラ修飾抗体と組合せて、ネズミ抗体に対するより長い循環半減期のため、ヨウ素−１３１標識キメラ抗体の効果的な単一処置非−骨髄切除用量は約５および約４０ｍＣｉの間、より好ましくは約３０ｍＣｉ未満の範囲である。例えば、１１１Ｉｎ標識についてのイメージング基準は、典型的には、約５ｍＣｉ未満である。
多大な臨床的経験が１３１Ｉおよび９０Ｙで獲得されているが、他の放射性標識は当該分野で知られており、同様な目的で用いることができる。なお他の放射性同位体はイメージングで用いられる。例えば、本発明の範囲と適合するさらなる放射性同位体は、限定されるものではないが、１２３Ｉ、１２５Ｉ、３２Ｐ、５７Ｃｏ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、７７Ｂｒ、８１Ｒｂ、８１Ｋｒ、８７Ｓｒ、１１３Ｉｎ、１２７Ｃｓ、１２９Ｃｓ、１３２Ｉ、１９７Ｈｇ、２０３Ｐｂ、２０６Ｂｉ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、４７Ｓｃ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１５３Ｓｍ、１８８Ｒｅ、１９９Ａｕ、２２５Ａｃ、２１１Ａｔ、および２１３Ｂｉを含む。この点に関して、アルファ、ガンマおよびベータエミッターは、全て、本発明に適合する。さらに、本開示に鑑みて、当業者であれば、いずれの放射性核種が過度な実験なくして処置の選択的コースと適合するかを容易に決定することができようと主張する。この目的では、既に臨床的診断で用いられてきたさらなる放射性核種は１２５Ｉ、１２３Ｉ、９９Ｔｃ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、ならびに１１１Ｉｎを含む。抗体も、標的化免疫療法での潜在的用途のために種々の放射性核種で標識されてきた（Ｐｅｉｒｅｒｓｚ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６５：１１１−１２５（１９８７））。これらの放射性核種は、程度は低いが、１８８Ｒｅおよび１８６Ｒｅならびに１９９Ａｕおよび６７Ｃｕを含む。米国特許第５，４６０，７８５号はそのような放射性同位体に関するさらなるデータを提供し、ここに引用して援用する。
本発明の結合分子がコンジュゲートされたまたはコンジュゲートされていない形態で用いられるか否かに関わらず、本発明の主な利点は、骨髄抑制患者、特に、放射性療法または化学療法のような補助的療法を受けている、または受けたことがある患者においてこれらのポリペプチドを用いる能力であると認識される。他の好ましい具体例において、（再度、コンジュゲートされたまたはコンジュゲートされていない形態の）ポリペプチドは、化学療法剤と共に組合せ治療方法で用いることができる。当業者であれば、そのような治療方法は、開示された抗体および１以上の化学療法剤の順次、同時、並列的または広がりを持った投与を含むことができる。本発明のこの態様の特に好ましい抗体は、例えば、Ｄ４メイタンシノイドのようなメイタンシノイドにコンジュゲートした、トキシンコンジュゲーテッド結合分子の投与を含むであろう。
結合分子は直前に記載されたように投与することができるが、他の具体例においては、コンジュゲートされたおよびコンジュゲートされていないポリペプチドを最初の治療剤としてそうでなければ健康な患者に投与することができることを強調しなければならない。そのような具体例において、ポリペプチドは、正常なまたは平均的赤色骨髄の予備を有する患者に、および／または外部ビーム放射線または化学療法のような補助的療法を有しない、それを受けていない患者に投与することができる。
しかしながら、前記したように、本発明の選択された具体例は、骨髄抑制患者への、あるいは放射線療法または化学療法のような１以上の補助的療法（すなわち、組合せ治療方法）との組合せまたは連合にての結合分子の投与を含む。本明細書中で用いるように、補助的療法との連合または組合せでのポリペプチドの投与は、療法および開示された結合分子の順次、同時、広がりを持った、並列的、並存的または同時期投与を意味する。当業者であれば、組合せ療法の種々の成分の投与または適用は、処置の総じての有効性を増強させるようにタイミングを合わせることができると認識されるであろう。例えば、化学療法剤は、本発明の放射性イムノコンジュゲートが数週間以内に続けて投与される処置の標準的なよく知られたコースである。逆に、サイトトキシン関連ポリペプチドは、静脈内、続いて腫瘍局所化外部ビーム照射により投与することができよう。なお他の具体例において、ポリペプチドは単一オフィス訪問において１以上の選択された化学療法剤と同時に投与することができる。技量がある科学者（例えば、経験を積んだ腫瘍学者）は、選択された補助的療法および本明細書の教示に基づいて過度な実験なくして効果的な組合せ治療方法を容易に認識するであろう。
この点に関して、結合分子（コンジュゲートされたまたはされていないのいずれか）および化学療法剤の組合せはいずれかの順序で、かつ患者に治療的利点を与えるいずれかのタイムフレーム内で投与することができることが認識されるであろう。かくして、化学療法剤およびポリペプチドはいずれかの順序でまたは同時に投与することができる。結合分子および化学治療剤は別々に投与することができ、あるいは１つの組成物の形態で投与することができる。選択された具体例において、本発明のポリペプチドは、従前に化学療法を受けたことがある患者に投与されるであろう。なお他の具体例において、ポリペプチドおよび化学療法処置は実質的に同時にまたは並行して投与されるであろう。例えば、患者には、化学療法のコースを受けつつ結合分子を投与することができる。好ましい具体例において、結合分子はいずれかの化学治療剤または処置を１年以内投与されるであろう。他の好ましい具体例において、ポリペプチドはいずれかの化学治療剤または処置を１０、８、６、４または２ヶ月以内に投与されるであろう。なお他の好ましい具体例において、ポリペプチドはいずれかの化学治療剤または処置から４、３、２または１週間以内に投与されるであろう。なお他の具体例において、ポリペプチドは選択された化学治療剤または処置から５、４、３、２または１日以内に投与されるであろう。さらに、２つの剤または処置は数時間または数分以内に（すなわち、実質的に同時に）患者に投与することができる。
さらに、本発明に従うと、骨髄抑制患者は、低下した血液カウントを呈するいずれの患者も意味すると考えるべきである。当業者であれば、骨髄抑制の臨床的インジケーターとして慣用的に用いるいくつかの血液カウントパラメーターがあると認識し、患者において骨髄抑制が起こりつつある程度を容易に測定することができる。当該分野で許容された骨髄抑制測定の例は絶対好中球カウント（ＡＮＣ）または血小板カウントである。そのような骨髄抑制または部分的骨髄切除は種々の生化学的障害または病気の結果であり、あるいはよりありそうには、従前の化学療法または放射線療法の結果であり得る。この点に関しては、当業者であれば、伝統的化学療法を受けた患者は典型的には低下した赤色骨髄の予備を呈すると認識するであろう。先に議論したように、そのような対象は、しばしば、増大した死亡率または罹患率をもたらす貧血または免疫抑制のような許容できない副作用によるサイトトキシン（すなわち、放射性核種）の最適レベルを用いて治療する事ができない。
より具体的には、本発明のコンジュゲートしたまたはコンジュゲートしていないポリペプチドを用いて、約２０００／ｍｍ３未満のＡＮＣ、または約１５０，０００／ｍｍ３未満の血小板カウントを有する患者を効果的に治療することができる。より好ましくは、本発明のポリペプチドを用いて、約１５００／ｍｍ３未満の、約１０００／ｍｍ３未満の、なおより好ましくは約５００／ｍｍ３未満のＡＮＣを有する患者を治療することができる。同様に、本発明のポリペプチドを用いて、約７５，０００／ｍｍ３未満の、約５０，０００／ｍｍ３ 未満の、約１０，０００／ｍｍ３未満さえの血小板カウントを有する患者を治療することができる。より一般的な意味においては、当業者であれば、政府が実施するガイドラインおよび手法を用いていつ患者が骨髄抑制されるかを容易に決定することができるであろう。
前記で示したように、多くの骨髄抑制患者は、化学療法、インプラント放射線療法または外部ビーム放射線療法を含めた処置のコースを受けている。後者の場合においては、外部放射線源は悪性疾患の局所的照射である。放射線療法移植方法では、放射線試薬を悪性疾患内に外科的に局所化させ、それにより、病気の部位を選択的に照射させる。いずれにせよ、開示されたポリペプチドを用いて、原因に関わらず骨髄抑制を呈する患者において障害を治療することができる。
この点に関し、本発明のポリペプチドはイン・ビボにて新形成細胞の成長を排除し、低下させ、阻害しまたは制御するいずれの化学療法剤または複数の剤と連合させてまたは組合せて用いて（例えば、組合せ処置方法を供する）ことができる。議論したように、そのような剤は、しばしば、赤色骨髄の予備の低下をもたらす。この低下は、全体としてまたは部分的に有利には、そのような患者において新形成の攻撃的処置を可能とする本発明の化合物の減少した骨髄毒性によって相殺することができる。他の好ましい具体例において、本明細書中に開示された放射性標識免疫コンジュゲートは、放射性核種に対する新形成細胞の罹患性を増加させる放射線増感剤と共に効果的に用いることができる。例えば、放射性増感剤化合物は、血流からかなり放射性標識結合分子が除去されたが、腫瘍または複数腫瘍の部位において依然として治療的に有効なレベルで残存する後に投与することができる。
本発明のこれらの態様に関しては、本発明に適合する例示的な化学療法剤はアルキル化剤、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、プロカルバジン、メトトレキセートおよびプレドニゾンを含む。４−薬物組合せＭＯＰＰ（メクレタミン（ナイトロゲンマスタード）、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ）、プロカルバジンおよびプレドニゾン）が、種々のタイプのリンパ球を治療するのに非常に効果的であって、本発明の好ましい具体例を含む。ＭＯＰＰ−耐性患者においては、ＡＢＶＤ（例えば、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチンおよびダカルバジン）、ＣｈｌＶＰＰ（クロラムブシル、ビンブラスチン、プロカルバジンおよびプレドニゾン）、ＣＡＢＳ（ロムスチン、ロキソルビシン、ブレオマイシンおよびストレプトゾトシン）、ＭＯＰＰ＋ＡＢＶＤ、ＭＯＰＰ＋ＡＢＶ（ドキソルビシン、ブレオマイシンおよびビンブラスチン）またはＢＣＶＰＰ（カルムスチン、シクロホスファミド、ビンブラスチン、プロカルバジンおよびプレドニゾン）組合せを用いることができる。Ａｒｎｏｌｄ Ｓ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ ａｎｄ Ｌｅｅ Ｍ． Ｎａｄｌｅｒ， Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ，ｉｎ ＨＡＲＲＩＳＯＮ’Ｓ ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＯＦ ＩＮＴＥＲＮＡＬ ＭＥＤＩＣＩＮＥ １７７４−１７８８（Ｋｕｒｔ Ｊ．Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１３ｔｈ ｅｄ．１９９４）ａｎｄ Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）、および標準的な投与およびスケジューリングについてのそこで引用された文献。これらの療法は、本明細書中に記載された本発明の１以上のポリペプチドと組合せて特定の患者に必要なように変化させないか、または改変することができる。
本発明との関係で有用なさらなる養生法は、シクロホスファミドまたはクロラムブシルのような単一のアルキル化剤、あるいはＣＶＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン）、ＣＨＯＰ（ＣＶＰおよびドキソルビシン）、Ｃ−ＭＯＰＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾンおよびプロカルバジン）、ＣＡＰ−ＢＯＰ（ＣＨＯＰ＋プロカルバジンおよびブレオマイシン）、ｍ−ＢＡＣＯＤ（ＣＨＯＰ＋メトトレキセート、ブレオマイシンおよびロイコボリン）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＭＯＰＰ（プレドニゾン、メトトレキセート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシドおよびロイコボリン＋標準ＭＯＰＰ）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＣｙｔａＢＯＭ（プレドニゾン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、シタラビン、ブレオマイシン、ビンクリスチン、メトトレキセートおよびロイコボリン）およびＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキセート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、固定された用量のプレドニゾン、ブレオマイシンおよびロイコボリン）のような組合せの使用を含む。当業者であれば、これらの養生法の各々についての標準的用量およびスケジューリングを容易に決定することができるであろう。ＣＨＯＰもまた、ブレオマイシン、メトトレキセート、プロカルバジン、ナイトロジェンマスタード、サイトシンアラビノシドおよびエトポシドと組み合わせることができる。他の適合する化学療法剤は、限定されるものではないが、２−クロロデオキシアデノシン（２−ＣＤＡ）、２’−デオキシコフォルマイシンおよびフルダラビンを含む。
寛解または再発を達成しない中間的な−および高い−グレードのＮＨＬを持つ患者では、サルベージ療法が用いられる。サルベージ療法は、単独でまたは組合わせて投与されるサイトシンアラビノシド、シスプラチン、エトポシドおよびイフォスファミドのような薬物を使用する。ある種の新形成障害の再発したまたは攻撃的形態においては、以下のプロトコルがしばしば使用される：各々、よく知られた投与率およびスケジュールを持つ、ＩＭＶＰ−１６（イフォスファミド、メトトレキセートおよびエトポシド）、ＭＩＭＥ（メチル−ｇａｇ、イフォスファミド、メトトレキセートおよびエトポシド）、ＤＨＡＰ（デキサメタゾン、高用量シタラビンおよびシスプラチン）、ＥＳＨＡＰ（エトポシド、メチルプレディゾロン、ＨＤシタラビン、シスプラチン）、ＣＥＰＰ（Ｂ）（シクロホスファミド、エトポシド、プロカルバジン、プレドニゾンおよびブレオマイシン）およびＣＡＭＰ（ロムスチン、マイトキサントロン、シタラビンおよびプレドニゾン）。
本発明のポリペプチドと組合せて用いるべき化学療法剤の量は対象によって変化でき、あるいは当該分野で知られたものに従って投与することができる。例えば、Ｂｒｕｃｅ Ａ Ｃｈａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ，ｉｎ ＧＯＯＤＭＡＮ ＆ ＧＩＬＭＡＮ’Ｓ ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＢＡＳＩＳ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ １２３３−１２８７（（Ｊｏｅｌ Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，９ｔｈ ｅｄ．１９９６）参照。
１つの具体例において、本発明の結合分子は、外科的手法を受けたことがある、受けつつある、または受けるであろう対象に投与して、例えば、予防的療法として原発性腫瘍、転移または前癌性成長または組織を除去することができる。
もう１つの具体例において、本発明の結合分子はバイオロジックと組合せて投与される。癌の治療で有用なバイオロジックは当該分野で知られており、本発明の結合分子が、例えば、そのような公知のバイオロジックと組合せて投与することができる。
例えば、ＦＤＡは乳癌の治療のための以下のバイオロジックを認可している：ヘルセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））（トラスツヅマブ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；ＨＥＲ２−陽性乳癌において抗腫瘍活性を有するヒト化モノクローナル抗体）；ファスロデックス（Ｆａｓｌｏｄｅｘ（登録商標））（フルベストラント，ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＰ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ；乳癌を治療するのに用いられるエストロゲン−受容体アンタゴニスト）；アリミデックスＡｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））（アナストロゾール，ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＰ；エストロゲンを作るのに必要な控訴であるアロマターゼをブロックする非ステロイドアロマターゼ阻害剤）；アロマシン（Ａｒｏｍａｓｉｎ（登録商標））（エキセメスタン，Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ；乳癌の治療で用いる不可逆的なステロイドアロマターゼ不活性化剤）；フェマラ（Ｆｅｒｍａｒａ（登録商標））（レトロゾール，Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅａｓｔ Ｈａｎｏｖｅｒ， ＮＪ；乳癌を治療するのにＦＤＡによって認可された非ステロイドアロマターゼ阻害剤）；およびノルバデックス（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標））（タモキシフェン，ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＰ；乳癌を治療するのにＦＤＡによって認可された非ステロイド抗エストロゲン）。本発明の結合分子と組み合わせることができる他のバイオロジックは：アバスチン（ＡｖａｓｔｉｎＴＭ）（ベバシズマブ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．；血管新生を阻害するのに設計された最初のＦＤＡ−認可療法）；およびゼバリン（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））（イブリツモマブチオキセタン，Ｂｉｏｇｅｎ，Ｉｄｅｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ；Ｂ−細胞リンパ腫の治療で現在認可された放射線標識モノクローナル抗体）を含む。
加えて、ＦＤＡは結直腸癌の治療のための以下のバイオロジックを認可している：アバスチン（ＡｖａｓｔｉｎＴＭ ；エルビツクス（ＥｒｂｉｔｕｘＴＭ ）（セツキシマブ，ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹおよびＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ））に対して向けられたモノクローナル抗体）；グリーベックＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標））（イマチニブメシレート；プロテインキナーゼ阻害剤）；およびエルガミゾルＥｒｇａｍｉｓｏｌ（登録商標））（レバミソール塩酸塩，Ｊａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＬＰ，Ｔｉｔｕｓｖｉｌｌｅ，ＮＪ；リュークスの段階Ｃ結腸癌を持つ患者における外科的切除後における５−フルオロウラシルと組み合わせたアジュバント治療としての１９９０年にＦＤＡによって認可された免疫モジュレーター）。
非−ホジキンリンパ腫の治療での使用では、現在認可された療法は：Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）（トシツモマブおよびヨウ素Ｉ−１３１トシツモマブ，ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣ；放射性分子（ヨウ素Ｉ−１３１）に連結されたマウスモノクローナル抗体（トシツモマブ）に関連する多−工程治療）；Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標）Ａ（インターフェロンアルファ−２ｂ，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ， ＮＪ；アントラサイクリン−含有組合せ化学療法（例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン［ＣＨＯＰ］）と組合せた濾胞非−ホジキンリンパ腫の治療のために認可されたあるタイプのインターフェロン）；Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ、およびＢｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ；非−ホジキンリンパ腫の治療で認可されたモノクローナル抗体；Ｏｎｔａｋ（登録商標）（デニロイキンジフチトックス，Ｌｉｇａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；インターロイキン−２に遺伝子的に融合したジフテリアトキシンの断片を含む融合蛋白質）；およびＺｅｖａｌｉｎ（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン，Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ；Ｂ−細胞非−ホジキンリンパ腫の治療のためにＦＤＡによって認可された放射性標識モノクローナル抗体）を含む。
白血病の治療では本発明の結合分子と組合せて用いることができる例示的なバイオロジックはＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標）；Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）−１Ｈ（アレムツヅマブ，Ｂｅｒｌｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ ＣＡ；慢性リンパ球性白血病の治療で用いるあるタイプのモノクローナル抗体）を含む。加えて、ゲナセンス（オブリメルセン，Ｇｅｎｔａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｒｋｌｅｙ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＮＪ；白血病を治療するために開発中のＢＣＬ−２アンチセンス療法は（例えば、単独で、あるいはフルダラビンおよびシクロホスファミドのような１以上の化学療法薬物と組合せて）用いることができる）は、特許請求した結合分子と共に投与することができる。
肺癌の治療では、例示的なバイオロジックはＴａｒｃｅｖａＴＭ （エルロチミブＨＣＬ，ＯＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ；ヒト表皮成長因子受容体１（ＨＥＲ１）経路を標的化するために設計された小さな分子）を含む。
多発性ミエローマの治療では、例示的なバイオロジックスはＶｅｌｃａｄｅ（登録商標）Ｖｅｌｃａｄｅ（ボルテゾミブ，Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ；プロテアソーム阻害剤）を含む。さらなるバイオロジックはＴｈａｌｉｄｏｍｉｄ（登録商標）（サリドマイド，Ｃｌｅｇｅｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｒｒｅｎ，ＮＪ；免疫調節剤）を含み、ミエローマ細胞の成長および生存、および抗脈関係性を阻害する能力を含めた多数の作用を有するように見える。
他の例示的なバイオロジックスは、ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹによって開発されたＭＯＡＢ ＩＭＣ−Ｃ２２５を含む。
加えて、特許請求された結合分子はワクチンまたは他の剤（例えば、サイトカイン）と組合せて投与して、抗−癌免疫応答を調節することができる。例えば、Ｍｅｌａｃｉｎｅ（登録商標）（Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）は、Ｔ３Ｎ０Ｍ０切除メラノーマの治療において融合な結果を有すると報告されている同種異系の腫瘍ワクチンである。ＧＭＫ（登録商標）（Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）は、メラノーマ再発の高い危険性がある患者においてアジュバント相ＩＩＩ剤として投与されるガングリオシド抗原である。抗−ガストリン治療ワクチン（登録商標）（Ａｐｈｔｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）はホルモンＧ１７およびグリエクステネドを中和し、結直腸、膵臓、および胃癌を持つ患者について相ＩＩＩ臨床試験中である。ＣｅａＶａｃ（登録商標）（Ｔｉｔａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）は、結直腸癌で研究されている抗−イディオタイプ抗体ワクチンである。最後に、Ｔｈｅｒａｔｏｐｅ（登録商標）（Ｂｉｏｍｉｒａ Ｉｎｃ．，Ｅｄｍｏｎｔｏｎ，Ａｌｂｅｒｔａ，Ｃａｎａｄａ）は、転移性乳癌を持つ患者において相ＩＩＩ剤として調べられている合成炭水化物治療ワクチンである（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，２０００）。
もう１つの具体例において、本発明の結合分子は抗−脈間形成、例えば、エンドスタチン（微小血管内皮細胞生産を停止させる内因性腫瘍−由来内皮−特異的阻害剤）；抗−ＶＥＧＦ抗体；サリドマイド；または血管の規定膜の合成および分解を阻害するマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤と組合せて投与することができる。
先に議論したように、本発明の結合分子、その免疫反応性断片または組換体は、哺乳動物障害のイン・ビボ治療のための医薬上有効な量で投与することができる。この点に関しては、開示された結合分子は、活性剤の投与を容易とし、その安定性を促進するように処方されるのは認識されるであろう。好ましくは、本発明による医薬組成物は、生理学的セーライン、非−毒性緩衝液、保存剤等のような医薬上許容される非−毒性の滅菌担体を含む。本出願の目的では、治療剤にコンジュゲートした、またはコンジュゲートしていない本発明の結合分子の医薬上有効な量は、標的への効果的な結合を達成し、利点を達成し、例えば、病気または障害の兆候を緩和し、あるいは物または細胞を検出するのに十分な量を意味すると考えるべきである。腫瘍細胞の場合には、ポリペプチドは、好ましくは、新形成または免疫反応性細胞上の選択された免疫反応性抗原と相互作用することができ、それらの細胞の死滅の増加を供する。もちろん、本発明の医薬組成物は単一または複数用量で投与して、ポリペプチドの医薬上有効な量を供する。
本開示の範囲に対応させると、本発明のポリペプチドは、治療または予防効果を生じるのに十分な量にて前記治療方法に従ってヒトまたは他の動物に投与することができる。本発明のポリペプチドは、公知の技術に従って、本発明の結合分子を慣用的な医薬上許容される担体または希釈剤と組合せることによって調製された慣用的な投与形態にてそのようなヒトまたは動物に投与することができる。医薬上許容される担体または希釈剤の形態および特性は、それが組合されるべき有効成分の量、投与の経路および他のよく知られた変数によって示されることが当業者によって認識されるであろう。当業者であれば、さらに、本発明によるポリペプチドの１以上の種を含むカクテルは特に有効であることが判明し得ることを認識するであろう。
ＸＩＶ．使用の方法
本発明の分子は、例えば、診断または治療目的で、安定かされたｘｃＦｖ分子またはそのようなｓｃＦｖ分子を含む組成物を用いるのが望ましい状況で用いることができる。本発明の好ましい具体例は、本発明の結合分子の投与から利益を受けるであろう障害、例えば、そのような治療を必要とする哺乳動物対象における新形成障害の診断および／または治療のための化合物、組成物、ヒトおよび方法を提供する。好ましくは、対象はヒトである。
１つの具体例において、主題の結合分子をアッセイで用いて、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイを用いてイン・ビトロにて腫瘍抗原を検出することができる。例示的なアッセイは当該分野で知られている。例えば、米国特許出願番号２００４００７７０２５参照。
もう１つの具体例において、主題の結合分子は、イメージング技術を用いて腫瘍抗原担持細胞の存在を検出するのに有用である。そのような適用のためには、以下にさらに記載するように、結合分子を検出可能な分子、例えば、放射性標識にコンジュゲートするのが望ましいであろう。
もう１つの具体例において、主題の結合分子は、本発明の結合分子によって認識されるエピトープ（例えば、Ｃｒｉｐｔｏのエピトープ、またはＴＮＦ受容体ファミリーメンバーのエピトープ、例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２またはＬＴβＲ）を担う（例えば、アポトーシスによる）細胞を低下させ、または排除するのに有用である。もう１つの具体例において、主題の結合分子は、循環における可溶性標的分子の濃度を低下させ、または該分子を排除するのに有効である。
もう１つの具体例において、本発明の結合分子は腫瘍サイズを低下させ、腫瘍成長を阻害し、および／または腫瘍−担持主題の生存時間を延長する。別法として、本発明は、ヒトまたは動物に有効な非−毒性量のポリペプチドを投与することによってヒトまたは他の動物において腫瘍を治療する方法に関する。当業者であれば、ルーチン的な実験によって、ポリペプチドのいずれの有効な非−毒性量は悪性疾患を治療する目的のためであるかを決定することが可能であろう。例えば、ポリペプチドの治療上活性な量は、対象の病気の段階（例えば、段階Ｉ−対−段階ＩＶ）、年齢、性別、医学的合併症（例えば、免疫抑制疾患または病気）および体重、および対象において所望の応答を誘導する結合分子の能力のような因子に従って変化し得る。投与養生法を調整して、最適な治療応答を供することができる。例えば、いくつかの分割用量を毎日投与することができるか、あるいは用量は、治療状況の緊急性によって指令されるように、比例して低下させることができる。しかしながら、一般には、有効用量は、日当たり体重キログラム当たり約０．０５ないし１００ミリグラム、より好ましくは、日当たりキログラム体重当たり約０．５ないし１０ミリグラムの範囲であると予測される。
明瞭性の目的で、「哺乳動物」とは、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ等のようなヒト、家畜および農場動物、および動物園、スポーツまたはペット動物を含めた哺乳動物として分類されるいずれの動物もいう。好ましくは、哺乳動物はヒトである。「処置」とは、治療的処置および予防または予防的尺度を共にいう。処置を必要とする者は、既に病気または障害を持つ者、ならびに病気または障害を予防すべき者を含む。よって、哺乳動物は病気または障害を有するものと診断することができ、あるいは該病気の素因がある、または罹患性であり得る。
一般に、開示された組成物は、予防的にまたは治療的に用いることができる。例えば、結合分子によって癌性細胞の標的化を可能とするマーカーを含む新生物は、本発明の結合分子を用いて検出し、または阻害し（例えば、殺傷する）ことができる。好ましい具体例において、本発明の結合分子を用いて、固体腫瘍を治療する。治療することができる例示的な癌は、限定されるものではないが、前立腺癌、結腸癌のような胃癌腫、皮膚癌、乳癌、卵巣癌、肺癌および膵臓癌を含む。もう１つの具体例において、本発明の抗体を用いてカポシ肉腫、ＣＮＳ新形成（毛細血管芽細胞腫、髄膜腫および大脳転移）、メラノーマ、胃腸および腎臓肉腫、横紋筋肉腫、膠芽細胞腫（好ましくは、多形膠芽細胞腫）、平滑筋肉腫、網膜芽細胞腫、卵巣の乳頭嚢胞腺癌、ウイルム腫瘍または小細胞肺癌腫を治療することができる。適当なポリペプチドは、本開示に鑑み、過度な実験なくして、これまでの新形成の各々に関連する腫瘍関連分子について融合することができるのは認識されよう。
開示した発明での治療で使用できる例示的な血液学的悪性疾患は、ホジキンおよび非−ホジキンリンパ腫ならびにＡＬＬ−Ｌ３（バーキットタイプの白血病）、慢性リンパ系白血病（ＣＬＬ）および単球細胞白血病を含めた白血病を含む。本発明の化合物および方法は、低グレード／濾胞非−ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、細胞リンパ腫（ＦＣＣ）、外套細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、広範性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中程度グレード／濾胞ＮＨＬ、中程度グレード広範性ＮＨＬ、高グレード免疫芽細胞性ＮＨＬ、高グレードリンパ系芽細胞性ＮＨＬ、高グレード小非−切断細胞ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬおよびヴァルデンストレームマクログロブリン血症を含めた、種々のＢ−細胞リンパ腫を治療するのに特に効果的であることが認識されよう。これらのリンパ腫は、しばしば、分類のシステムの変化のため異なる名称を有し、および異なる名称下で分類されたリンパ腫を有する患者もまた本発明の組合せ治療養生法から利益を受けることができるのは当業者に明らかなはずである。前記した新形成障害に加えて、開示された発明を有利には用いて、適合腫瘍関連分子を担うさらなる悪性疾患を治療することができるのは認識されよう。
１つの具体例において、本発明の結合分子は、腫瘍細胞抗原に特異的に結合することができ、患者において腫瘍細胞の増殖を阻害することができる。ある具体例において、腫瘍細胞は脳、頭部、首、前立腺、乳房、精巣、結腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓および胃腫瘍細胞である。他の具体例において、本発明の結合分子は腫瘍細胞抗原に特異的に結合し、抗原を過剰発現させる腫瘍細胞の成長を阻害する。１つの具体例において、腫瘍細胞は、脳、乳房、精巣、結腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓および胃癌に由来する細胞系のような、抗原を過剰発現する細胞系である。
なお他の具体例において、本発明の結合分子を用いて、限定されるものではないが、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症；アレルギー性鼻炎；自己免疫溶血性貧血；Ａｃａｎｔｈｏｓｉｓ ｎｉｇｒｉｃａｎｓ；アレルギー性接触皮膚炎；アジソン病；アトピー性皮膚炎；円形脱毛症；全身性脱毛症；アミロイドーシス；アナフィラキシー性紫斑病；アナフィラキシー反応；再生不良性貧血；遺伝性血管浮腫；特発性血管性浮腫；強直性脊髄炎；頭部動脈炎；巨細胞動脈炎；高安動脈炎；一時的動脈炎；喘息；毛細血管拡張性運動失調症；自己免疫卵巣炎；自己免疫精巣炎；自己免疫多内分泌腺不全；ベーチェット病；ベルガー病；バーガー病；気管支炎；水疱性類天疱瘡；慢性粘膜皮膚カンジダ症；カプラン症候群；心筋梗塞後症候群；心膜切開術後症候群；心臓炎；セリアック病；シャーガス病；チェディアック−東症候群；シュルグ−シュトラウス病；コウガン症候群；寒冷血球凝集素；寒冷血球凝集素病；クレスト症候群；クローン病；クリオグロブリン血症；潜源性線維化肺胞炎；疱疹状皮膚炎；皮膚筋炎；真性糖尿病；ダイヤモンド−ブラックファン症候群；ディ・ジョージ症候群；円盤状紅斑性狼瘡；好酸球性筋膜炎；上強膜炎；持久性隆起性紅斑；輪郭状紅班；多形性紅班；結節性紅班；家族性地中海熱；フェルティ症候群；肺線維症；アナフィラキシー糸球体腎炎；自己免疫糸球体腎炎；ストレプトコッカス後糸球体腎炎；移植後糸球体腎炎；膜性糸球体腎炎；グッドパスツール症候群；免疫媒介顆粒球減少症；環状肉芽腫；アレルギー性肉芽腫；肉芽腫筋炎；グラーベ病；橋本甲状腺炎；新生児溶血病；特発性ヘモクロマトーシス；ヘーノホ−シェーンライン紫斑病；慢性活動的および慢性進行性肝炎；組織球増殖症Ｘ；好酸球増加症候群；特発性血小板減少性紫斑病；ヨブ症候群；若年性皮膚筋炎；若年性慢性関節リウマチ（若年性慢性関節炎）；川崎病；角膜炎；乾性角結膜炎；ランドリー−ギヤン−バレー−ストロール症候群；癩腫癩；レフラー症候群；狼瘡；ライエル症候群；ライム病；リンパ腫様肉芽腫症；全身性肥満細胞症；混合結合組織病；多発単神経炎；マックル−ウェルズ症候群；粘膜皮膚リンパ節症候群；多中心性細網組織球症；多発性硬化症；重症筋無力症；菌状息肉腫；全身性壊死血管炎；ネフローゼ症候群；重複症候群；脂肪織炎；発作性寒冷血色素尿症；発作性夜間血色素尿症；類天疱瘡；天疱瘡；紅斑性天疱瘡；落葉状天疱瘡；尋常性天疱瘡；鳩飼病；過敏性肺炎；結節性多発性動脈炎；リウマチ性多発性筋痛；多発性筋痛；特発性多発性神経炎；ポルトガル家族性多発性神経障害；子癇前症／子癇；原発性胆汁性肝硬変；進行性全身硬化症（強皮症）；乾癬；乾癬性関節炎；肺胞タンパク症；肺線維症、レイノー現象／症候群；ライデル甲状腺炎；ライター症候群、再発性多発性軟骨炎；リウマチ熱；リウマチ様関節炎；サルコイドーシス；眼球強膜炎；硬化性胆管炎；血清病；セザリー症候群；シェーグレン症候群；スティーブン−ジョンソン症候群；スチル病；亜急性硬化性全汎脳炎；交感性眼炎；全身性紅斑性狼瘡；移植拒絶；潰瘍性結腸炎；未分化結合組織病；慢性じんま疹；寒冷じんま疹；ブドウ膜炎；白斑；ウェーバー−クリスチャン病；ヴェーゲナー肉芽腫症およびウィスコット・アルドリッチ症候群を含む免疫障害を治療することができる。
もう１つの具体例において、本発明の結合分子はプレ標的化適用に用いることができる。例えば、同一の利点が、化学療法薬物送達のためのプレ標的化適用で明らかである。
例えば、プレ標的化においては、腫瘍を、一方の腫瘍−関連抗原に対する、および例えば、他方の放射性標識ハプテンに対する親和性を有する結合構築体で予備標的化する。放射性標識ハプテンは、好ましくは、腫瘍−関連抗原に対する親和性を有する結合構築体が除去された後に、遅くに投与される（例えば、Ｂｏｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．２００３．Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄ．４４：４００）。もう１つの例において、非−毒性であるが、結合分子によって結合された場合にのみ毒性である薬物またはプロドラッグと反応するように誘導体化された抗体。この例における生体内分布データを仮定すれば、本発明の結合分子は、プレ標的化適用での使用によく適している。１つの具体例において、本結合分子を用いることによってプレ標的化方法から排除することができる。
限定すべきものと解釈されるべきではない以下の実施例によって本発明をさらに説明する。本出願を通じて引用された全ての文献、特許および公開された特許出願の内容をここに引用して援用する。
実施例を通じて、特に断りのない限り、以下の材料および方法を用いた。
一般的材料および方法
一般に、本発明の実施は、特に断りのない限り、化学、生物物理学、分子生物学、組換ＤＮＡ技術、免疫学（特に、例えば、抗体技術）、および電気泳動における標準的な技術を使用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），５１０，Ｐａｕｌ，Ｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，１６９），ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｅｄ．，Ｉｒｌ Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ，Ｐｕｂ．（１９９９）；ａｎｄ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９９２）参照。
発現構築体
一般に、特に断りのない限り、以下の実施例におけるｓｃＦｖのための発現構築体は、Ｎ−末端遺伝子ＩＩＩシグナルペプチド、ならびにＭｙｃおよびＨｉｓタグを含むＣ−末端精製ペプチド、およびエンテロキナーゼ切断部位を含んだ。各ペプチドについてのＤＮＡ配列を以下に記載する。
Ｎ−末端遺伝子ＩＩＩシグナルペプチドＤＮＡ配列
Figure 0005374359
 Ｎ−末端遺伝子ＩＩＩシグナルペプチドＤＮＡ配列
Figure 0005374359
 Ｃ−末端精製ペプチドＤＮＡ配列
Figure 0005374359
 Ｃ−末端精製ペプチドＤＮＡ配列
Figure 0005374359
 抗体
ある実施例（ＢＩＩＢ１ないしＢＩＩＢ１８）で用いるＢＩＩＢ抗体は、種々の特異性の治療抗体のコレクションである。１８の抗体のうち１７は安定なバルクまたはクローン性ＣＨＯ細胞系いずれかから発現され、抗体の１つ（ＢＩＩＢ１３）は、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞において一過性トランスフェクションを用いて発現させた。全ての１８の抗体はカッパ軽鎖を含有する。抗体の大部分はヒトＩｇＧ１であり；しかしながら、ＢＩＩＢ２、ＢＩＩＢ５、およびＢＩＩＢ１１はヒトＩｇＧ４であった。１８の抗体のうち１７はヒトまたはヒト化されていた。ＢＩＩＢ１５はＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２０００）であった。各抗体に対するヒト生殖系の同一性は、公に入手可能なヒト生殖系（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，１９９９）に対するＢＩＩＢ ＶＨまたはＶΚ配列のＣｌｕｓｔａｌＷ整列によって評価した（ＣｌｕｓｔａｌＷ ＷＷＷ Ｓｅｒｖｉｃｅ ａｔ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。
１８の合計抗体のうち１５はＩｇＧ１サブクラスであって、残りの３つはＩｇＧ４（ＢＩＩＢ２、ＢＩＩＢ５、およびＢＩＩＢ１１）であった。ＩｇＧ１およびＩｇＧ４ ＣＨ１配列は１０のアミノ酸の差（６つは保存的）、および軽鎖に対して交互ジスルフィド−結合パターンを有する。
二連Ｆｖ領域をもつＩｇＧ１およびＩｇＧ４構築体は、Ｆａｂ安定性に対するＩｇＧサブクラスの効果を調べるのに入手可能であった。ＩｇＧ１またはＩｇＧ４重鎖定常領域いずれかにグラフトされたＢＩＩＢ７のＶＨ領域を含有する２つの構築体を作り出した。
（実施例１）
慣用的なＢＨＡ１０ ｓｃＦｖおよびＦａｂ蛋白質の調製
ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖは、以下の表２に示したオリゴヌクレオチドプライマーと共にポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いてプラスミドｐＸＷＵ０３４からサブクローンした。順方向プライマーＢＨＡ１０−０１ＦはユニークなＳｐｈ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位（下線を施した配列）、続いて、ＢＨＡ１０のＮ−末端重鎖可変ドメイン遺伝子に対して相補的な配列の１８塩基を含有する。逆方向プライマーＢＨＡ１０−０１ＲはＢＨＡ１０ Ｃ−末端軽鎖可変ドメイン遺伝子に対して相補的な配列の２４塩基、エンテルキナーゼ部位に対して相補的な配列の１５塩基、および隣接するＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＸｂａ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する（エンドヌクレアーゼ部位は下線を施す）。ＰＣＲ増幅に続いて、予測されるサイズに対応するＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分解し、切り出し、製造業者の指示に従ってＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＤＡ抽出キットを用いて精製した（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）。精製されたＰＣＲ産物をＳｐｈＩで消化し、ｄＮＴＰの存在下でＤＮＡポリメラーゼＩで消化することによって平滑末端とし、次いで、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。平滑末端とした／ＨｉｎｄＩＩＩ消化産物をＳｃａＩ ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＫＪＳ２１６に連結した。ｐＫＪＳ２１６は、誘導性ａｒａＣプロモーターの制御下にある組換え蛋白質発現を駆動するＥ．ｃｏｌｉベクターである。連結混合物の一部を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ１−Ｂｌｕｅを形質転換した。アンピシリン薬物耐性コロニーをスクリーニングし、ＤＮＡ配列分析は最終ｐＩＥＨ００３構築体の正しい配列を確認した。ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖのＤＮＡおよびアミノ酸配列を、各々、図１Ａおよび１Ｂに示す。
表２ 慣用的なＢＨＡ１０ ｓｃＦｖのＰＣＲ増幅のためのオリゴヌクレオチド
Figure 0005374359
 ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖの発現のためには、プラスミドｐＩＥＨ００３で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．Ｃａｔ．＃２７３２５）の新たに単離されたコロニーを、１Ｌのバッフルドフラスコ中に５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有する４ｘ２５０ｍｌ ＳＢ培地（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈａｌｆ Ｍｏｏｎ Ｂａｙ，Ｃａ．Ｃａｔ．＃Ｓ０１４０）中でＯＤ６００≒０．８まで成長させ、０．０２％アラビノースを加えることによって誘導し、一晩培養した。細菌を遠心によって集めた。ペレットを可溶化し、４０ｍＬ Ｂ−ＰＥＲ蛋白質抽出試薬（Ｃａｔ＃７８２４３，Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて溶解させた。可溶化されたｓｃＦｖを５ｍＬ Ｎｉ−ＮＴＡ−Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラム（Ｃａｔ＃３０４１０，Ｑｉａｇｅｎ）に適用した。結合したｓｃＦｖを６０ ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０で洗浄し、３００ｍＬイミダゾール、ｐＨ８．０で溶出させた。溶出したｓｃＦｖを６ｍＬのプロテインＬアガロースカラム（Ｃａｔ＃２０５１０，Ｐｉｅｒｃｅ）に負荷した。結合した蛋白質をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０で溶出させた。精製されたｓｃＦｖをＰＢＳに対して透析し、−２０℃で貯蔵した。蛋白質の濃度は、ε２８０ｎｍ＝２．１ｍｌｍｇ−１ｃｍ−１を用いて決定した。
ＢＨＡ１０ Ｆａｂの酵素調製のために、ＢＨＡ１０ ＩｇＧを、ｐＨ７．０の、２．４ｍｇ／ｍＬ ＢＨＡ１０ ＩｇＧ１、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、２０ｍＭ ＥＤＴＡを含有する８．３ｍｌの溶液中にて、４μｌの濃縮されたパパインストック（０．３ｍｇ／ｍＬ，３０Ｕｎｉｔｓ／ｍｇ−Ｃａｔ＃１０８０１４，Ｒｏｃｈｅ）と混合した。反応を２５℃において９０十分間進行させた。消化溶液を２０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．０で１：５希釈し、希釈緩衝液で平衡化した６ｍｌのＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムに負荷した。カラムを２カラム容量の希釈緩衝液で洗浄した。粗製Ｆａｂ断片を、３０カラム容量の０ないし２００ｍＭ Ｎａｃｌ直線グラジエントで溶出した。１４０ｍＭ ＮａＣｌ（〜２４ｍＬ合計）を中心とする広いピークを集め、それは、消化されたＩｇＧ物質の大部分を含有した。溶出した容量を遠心によって２ｍＬまで減少させ、ＰＢＳで平衡化した分取用Ｇ３００ ＳＷ Ｔｏｓｏｈａａｓ ＳＥＣカラム（１０９ｍＬ）に負荷した。Ｆａｂを１５ｍＬに渡って０．８カラム容量で溶出した。精製されたＦａｂは２ないし１１ｍｇ／ｍＬの間まで濃縮した。Ｆａｂ濃度は、ε２８０ｎｍ＝１．５ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を用いて決定した。
（実施例２）
慣用的ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ分子の熱的安定性
示差走査型熱量測定（ＤＳＣ）を用いて、単離されたＢＨＡ１０ ｓｃＦｖが固有にそのＦａｂカウンターパートよりも安定性でない否かをテストした。走査は、自動キャピラリー示差操作型熱量計（ｃａｐＤＳＣ，ＭｉｃｒｏＣａｌ，ＬＬＣ）を用いて行った。蛋白質および参照用液は、ロボットアタッチメントを用いて９６−ウェルプレートから自動的にサンプリングした。各蛋白質走査に先立って、二回の走査を試料セル中の緩衝液で行い、バックグラウンドを差し引くために用いた。単一の清浄走査は、各蛋白質走査後に５％リキノックス（Ｌｉｑｕｉｎｏｘ）を用いて行った。各走査後に、機器は参照セルおよび試料セル双方を、０．０１％アジ化ナトリウムを含有する２ｍｌの蒸留した脱イオン水で三回自動的に洗浄した。走査は、増強されたピーク分解のためのメディウムフィードバックモードを用いて１℃／分で行った。走査範囲は２０ないし９５℃であった。蛋白質を含有する全ての９６−ウェルプレートを６℃にて機器内に貯蔵した。
図２は、精製されたＢＨＡ１０ ＦａｂおよびｓｃＦｖ抗体断片でのＤＳＣ測定を示す。熱量計内では、ＦａｂまたはｓｃＦｖが折畳み解除されるまで温度を上昇させた。各蛋白質が折畳み解除される温度（すなわち、ＴＭ値）は、全安定性を示すことができる。ＢＨＡ１０Ｆａｂの全ての４つのドメイン（ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１およびＣＬ）は、７８℃にて協働的に折畳み解除される（図２Ａ）。ｓｃＦｖドメインはＣＨ１およびＣＬドメインを欠如する。この足場がなくては、ｓｃＦｖのドメインはＦａｂよりもかなり低い温度で折畳み解除され、ドメインの熱量的なエンタルピーのかなりの減少があり、これは、安定化相互作用の喪失を示す。ＶＬドメインは６８℃のＴＭで折畳み解除され、他方、ＶＨドメインは、ＢＨＡ１０ Ｆａｂの折畳み解除転移で観察されたものよりも２０℃低い５８℃で折畳み解除される（図２Ｂ）。加えて、ＴＭの走査速度依存性があり、これは、走査速度が遅くなるにつれてｓｃＦｖのＴＭを人工的に降下させる加熱相の間に蛋白質凝集が起こりつつあることを示唆する（Ｓaｎｃｈｅｚ−Ｒｕｉｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７：１６４８−１６５２，１９８８）。低い見掛けの安定性および凝集する傾向は、慣用的なＨｅｒｃｕｌｅ二特異的抗体分子のようなｓｃＦｖを含有する有意な量の安定な非−凝集物質を生じさせるＣＨＯ細胞の無能力に対する決定因子であろう。
（実施例３）
改良された熱安定性を持つＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ分子の構築
実施例２において証明されているように、ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖドメインが固有に不安定であることが分かったので、熱挑戦条件下で熱力学的にまたは機能的にＦａｂに同等な修飾されたｓｃＦｖを生じさせるための組換えＤＮＡ技術の使用を介するｓｃＦｖの作製の結果、二特異的抗体を構築するのに有用なｓｃＦｖドメインがもたらされるはずであると仮定した。さらに、単離されたｓｃＦｖドメインの作製それ自体は、全二特異的分子の成分として再度導入した場合に有益ないずれの生物物理学的特性も付与するはずであるとも仮定した。その目的に向けて、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系を用いてＢＨＡ１０ ｓｃＦｖドメインの生物物理学的安定性、および熱的挑戦アッセイにおいてリガンドに対する熱的抵抗性のｓｃＦｖドメインの結合を測定することによる安定性のモニターされた改良を改善するための努力を開始した。
ｓｃＦｖドメインを安定化するために、２つの方法を適用した：１）ジスルフィド結合のＢＨＡ１０ ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬドメインの間への導入；および２）ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬドメインを連結する（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカーの長さの最適化。
Ａ．ジスルフィド安定化ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖの構築
ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ生産細菌発現ベクターｐＩＥＨ００３を親ベクターとして利用した。製造業者の指示に従って、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位−特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、２つのシステイン残基を導入し、１つはＶＨに、第二のものが、安定化ジスルフィド結合の形成に参画することができるＶＬに導入した。プライマー対ＶＨ４４−ＦおよびＶＨ４４−Ｒ（表３）を用いて、ＢＨＡ１０可変重鎖の位置４４（Ｋａｂａｔナンバリングシステム）におけるＧｌｙ残基（ＧＧＡ）をＣｙｓ残基（ＴＧＣ）に突然変異誘発した。突然変異誘発産物を、キットプロトコルに従って、メチル化感受性酵素ＤｐｎＩで消化し、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ１０−ＧＯＬＤ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に形質転換した。アンピシリン薬物耐性に形質転換されたＥ．ｃｏｌｉコロニーを、ＤＮＡ配列分析によって、正しい配列突然変異についてスクリーニングした。得られたプラスミドｐＩＥＨ００４を引き続いての反応のために利用して、プライマー対ＶＬ１００−ＦおよびＶＬ１００−Ｒを用いてＢＨＡ１０可変軽鎖の位置１００（Ｋａｂａｔナンバリングシステム）におけるＧｌｎ残基（ＣＡＧ）をＣｙｓ残基（ＴＧＣ）に突然変異させた（表３）。順方向（ＶＨ４４−Ｆ）および逆方向（ＶＨ４４−Ｒ）プライマーは、ＶＨ位置４４（下線を施した配列によって示されるＴＧＣ）においてＧｌｙ（ＧＧＡ）をＣｙｓ（ＴＧＣ）に突然変異させる。順方向（ＶＬ１００−Ｆ）および逆方向（ＶＬ１００−Ｒ）プライマーは、ＶＬ位置１００（下線を施した配列によって示されるＴＧＣ）においてＧｌｎ（ＣＡＧ）をＣｙｓ（ＴＧＣ）に突然変異させる。
アンピシリン薬物耐性に形質転換されたＸＬ１０−ＧＯＬＤ（登録商標）Ｅ．ｃｏｌｉコロニーを、ＤＮＡ配列分析によって正しい配列突然変異についてスクリーニングし、プラスミドｐＩＥＨ００６は、位置ＶＨ４４およびＶＬ１００において二重システイン突然変異を含有する者として同定された。ＶＨ４４／ＶＬ１００ジスルフィド−安定化ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖのＤＮＡおよびアミノ酸配列を、各々、図３Ａおよび３Ｂに示す。
表３ ＶＨ４４／ＶＬ１００ジスルフィド−安定化ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖの構築のためのオリゴヌクレオチド
Figure 0005374359
 Ｂ．交互（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカーでのＢＨＡ１０ ｓｃＦｖの構築
慣用的な（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーを持つｈｕＢＨＡ１０ ｓｃＦｖをコードするプラスミドｐＩＥＨ００３を、表４に記載されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ増幅によって（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５リンカーを含有するように修飾した。
ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４は、ｐＸＷＵ００２−Ｆ１と命名された順方向５’ＰＣＲプライマー、およびＸＷＵ００２−Ｒと命名された逆方向３’ＰＣＲプライマーを用いて組立てた。５’ＶＨ ＰＣＲプライマーＸＷ００２−Ｆ１は、ＢＨＡ１０ ＶＨのカルボキシル末端に位置するＢｔｇＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（下線を施した配列）、続いて、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーをコードする配列を含んだ。３’ＶＬ ＰＣＲプライマーＸＷ００２−ＲはＸｂａＩ部位および部分的エンテロキナーゼ部位を含んだ。部分的ＢＨＡ１０ ＶＨ＋（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカー＋ＢＨＡ１０ ＶＬ領域を、（実施例１に記載された）プラスミドＤＮＡ ｐＩＥＨ００３からのＸＷ００２−Ｆ１／ＸＷ００２−Ｒ ＰＣＲプライマー組を用いてＰＣＲ反応で増幅させた。予測されたサイズに対応する部分的ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカー遺伝子断片をアガロースゲル電気泳動によって分解し、切り出し、製造業者の指示（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に従って、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＤＡ抽出キットを用いて精製した。精製したＰＣＲ産物を消化し、Ｂｔｇ Ｉ／Ｘｂａ Ｉ消化ｐＩＥＨ００３ベクターにクローン化し、その結果、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーを含有するＢＨＡ１０ ｓｃＦｖをコードするプラスミドｐＸＷＵ００２がもたらされた。（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５リンカーを含有するＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを、ＰＣＲプライマーＸＷ００３−ＦおよびＸＷ００２−Ｒを用いて同様に構築して、プラスミドｐＸＷＵ００３を得た。順方向５’ＰＣＲプライマー（ＸＷＵ００３−Ｆ）はＢｔｇＩ部位（下線を施した配列）、続いて、ＢＨＡ１０ ＶＨのカルボキシル末端の少数のアミノ酸をコードする配列、および部分的（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５リンカーをコードする配列を含有した。正しい配列は、ＤＮＡ配列分析によって確認された。（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーを含有するＢＨＡ１０ ｓｃＦｖのＤＮＡおよびアミノ酸配列を、各々、図４Ａおよび４Ｂに示す。（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５リンカーを含有するＢＨＡ１０ ｓｃＦｖのＤＮＡおよびアミノ酸配列を、各々、図５Ａおよび５Ｂに示す。
表４ （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５リンカーでのＢＨＡ１０ ｓｃＦｖの構築のためのオリゴヌクレオチド
Figure 0005374359
 実施例４ 改良された熱安定性を持つＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ分子の特徴付け
Ａ．作製されたＢＨＡ１０ ｓｃＦｖの発現およびウェスタンブロット分析
作製されたＢＨＡ１０ ｓｃＦｖの発現のため、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．Ｃａｔ．＃２７３２５）をプラスミドｐＩＥＨ００３、ｐＸＷＵ００２、ｐＸＷＵ００３およびｐＩＥＨ００６で形質転換し、アンピシリン耐性コロニーを選択し、５０ｍｌの円錐型遠心管中にて５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有する１０ｍｌのＳＢ培地（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈａｌｆ Ｍｏｏｎ Ｂａｙ，Ｃａ．Ｃａｔ．＃Ｓ０１４０）中でＯＤ６００≒０．８まで成長させ、０．０２％アラビノースを加えることによって誘導し、一晩培養した。細菌を遠心によって集め、ペレットを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および２０％スクロース（ｗ／ｖ）の１／２０で容量の氷冷等浸透圧溶液に再懸濁させ、氷上で冷却した。２ｍｇ／ｍｌ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（Ｓｉｇｍａ）を含有する、同等な容量の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および２０％スクロース（ｗ／ｖ）を細菌懸濁液に加え、１０分間場合により混同しつつ氷上でインキュベートした。細菌懸濁液を８０００ｘｇ、４℃にて１０分間遠心し、ペリプラズマ画分を保持した。
試料を、天然試料緩衝液、または還元剤ジチオスレイトールを含有する試料緩衝液と混合し、９０℃にて３分間加熱した。還元されたおよび還元されていない試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｔｒｉｓ−グリシンポリアクリルアミドゲル上で電気泳動を行い、電気泳動により、ニトリセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に移した。膜を、５％（ｗ／ｖ）非−脂肪乳および０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するＰＢＳでブロックし、抗−ヒトカッパー抗体（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）と共にインキュベートした膜を洗浄し、次いで、抗−ウサギＨＲＰ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）と共にインキュベートした。製造業者（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に従い、ＥＣＬウェスタンブロッティング分析システムを用い、免疫複合体を検出した。
テストした３つのジスルフィド対の内の１つ、すなわち、ＶＨ４４：ＶＬ１００は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた場合に適当な量の蛋白質を生じた（図６、レーン２）ことが判明した。（（テストした）ＶＨ４４：ＶＬ１０５およびＶＨ１０６：ＶＬ４３ジスルフィドは多くの無傷ｓｃＦｖを生じなかった）。同様に、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカーの長さをｎ＝４（レーン３）またはｎ＝５（示さず）まで延長すると、やはり、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて適当な量の蛋白質を生じた。実施例３に記載された方法を用いてＶＨ４４：ＶＬ１００および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リン化修飾の双方をＢＨＡ１０ ｓｃＦｖに合わせると、適当な量に発現された蛋白質にやはり導かれた（図６、レーン４）。ＶＨ４４：ＶＬ１００でおよび（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカー修飾の組合せを含有するＢＨＡ１０ ｓｃＦｖのＤＮＡおよびアミノ酸配列は、各々、図７Ａおよび７Ｂに示される。ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖがＶＨ４４：ＶＬ１００突然変異を含有する双方の場合において、ｓｃＦｖは変性非−還元ポリアクリルアミドゲルにおいて増大した移動度にて移動することが判明したが、変性還元条件下では慣用的なＢＨＡ１０ ｓｃＦｖと同様に移動た（図６、レーン２および４）。この分析は、ＶＨ４４：ＶＬ１００突然変異を含有するＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ変種が無傷ジスルフィド結合を形成するようであり、よりコンパクトな構造を達成できることを示唆する。
Ｂ．熱変性アッセイ
次いで、熱挑戦事象に続いてそれらの抗原結合活性をｓｃＦｖ分子の５０％が保有する温度を決定するのに用いることができる熱挑戦アッセイにおいて、慣用的および作製されたＢＨＡ１０ ｓｃＦｖの活性を比較した。この温度に対応する数値を「Ｔ５０」値といい、単位は℃で表す。このアッセイにおいては、ｓｃＦｖを、慣用的なＢＨＡ１０ ｓｃＦｖの熱転移温度を含む温度の範囲に付した。
Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．Ｃａｔ．＃２７３２５）を、誘導性ａｒａＣプロモーターの制御下で、慣用的および作製されたＢＨＡ１０ ｓｃＦｖをコードするプラスミドで形質転換した。形質転換体は、１％グリシン、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、０．０２％アラビノース、および５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを補足したＳＢ（Ｔｅｋｎｏｖａ，ＨａｌｆＭｏｏｎ Ｂａｙ，Ｃａ．Ｃａｔ．＃Ｓ０１４０）よりなる発現培地中で３７℃または３２℃で一晩成長させた。細菌を遠心によってペレット化し、さらなる処理のために上清を収穫した。培地にグリシンおよびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含めた結果、ペリプラズムの内容物（天然Ｅ．ｃｏｌｉ蛋白質およびｓｃＦｖ）が培地に放出される（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．（１９９８）６４：２８６９−２８７４）。上清中でのＥ．ｃｏｌｉ蛋白質の存在はこのアッセイの実行に必須である。なぜならば、熱的に変性した蛋白質は「シンク」として作用し、一過的に折畳み解除されたｓｃＦｖ分子を不可逆的な不活性凝集体に捕獲するからである。
処理条件に付された１つの複製からの上清、および未処理参照として働く第二の上清にて、熱挑戦アッセイを用いて各ライブラリーを二連でスクリーニングした。熱的変性アッセイを、安定性を測定するために単一または一定範囲の温度で実行することができる。安定な熱的グラジエントを生じさせることができるサーモサイクラーマシーンを、試料上清を処理するのに用いた（ｉＣｙｃｌｅｒ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ）。
挑戦温度は、親ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ変種の特性に応じて変化し、一般には、実験的に決定されたＴ５０値よりも２ないし３℃高かった。凍結されたマスタープレートを解凍し、それを用いて、ウェル当たり２５０μｌの発現培地を含有する深いウェルマクロタイタープレートを接種し、培養を３２℃にて一晩清澄させた。対照として、親プラスミドを含有する培養を同一条件下で成長させ、ライブラリーとして同時に処理した。細菌をペレット化し、テスト上清の５０ないし１００μｌアリコットをＰＣＲストリップチューブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａ，Ｃａｔ．＃Ｎ８０１−５３５）または９６−ウェルプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａ，Ｃａｔ．＃Ｎ８０１−５６０）いずれか中で平板培養し、試料を６０ないし９０分間加熱した。試料を９６−ウェルｖ−底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，Ｃａｔ．＃３３５７）に移し、冷蔵された臨床遠心器（ＩＥＣ ｍｏｄｅｌ ８Ｒ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）で３０分間遠心し、１００μｌの上清を標準マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，Ｃａｔ．＃３３５７）に移した。上清のアリコットを参照ＤＥＬＦＩＡのために保持した。ほとんどのライブラリーでは、上清の残りを含有するプレートをシールし（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，Ｃａｔ．＃２３５２０５）、適当な挑戦温度に設定されたインキュベーター（Ｅｃｈｏ Ｔｈｅｒｍ，Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ Ｍａｒｃｏｓ，Ｃａ）中に９０分間置いた。多数の挑戦温度（または７５℃よりも高い温度）を必要とするスクリーニングでは、上清を９６−ウェルＰＣＲプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａ，Ｃａｔ．＃Ｎ８０１−５６０）に移し、所望の温度にて９０分間インキュベートした。
熱的挑戦の後、試料を２，０００ＲＰＭで遠心して、凝集した物質を除去した。処理され清澄化された上清に残存する可溶性ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ試料を、ＤＥＬＦＩＡアッセイによって同族ＬＴβＲ Ｉｇ抗原への結合についてアッセイした。９６−ウェルプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，Ｃａｔ．＃４３７１１１）を、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．５中１μｇ／ｍｌにて、ヒトＦｃ領域に融合したＬＴβ受容体（ＬＴβＲ）のエクトドメインよりなる融合蛋白質で被覆した。プレートを４℃にて一晩被覆し、室温にて震盪しつつ、ＤＥＬＦＩＡアッセイ緩衝液（ＤＡＢ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，２０μＭ ＥＤＴＡ，０．５％ＢＳＡ，０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ２０，０．０１％ＮａＮ３，ｐＨ７．４）で１時間ブロックした。プレートをＢＳＡ（洗浄緩衝液）なくしてＤＡＢで３回洗浄し、ＤＡＢ中に希釈したテスト試料を１００μｌの最終容量にてプレートに加えた。室温で振盪しつつプレートを１時間インキュベートし、次いで、洗浄緩衝液で３回洗浄して、結合していないおよび機能的に不活化されたｓｃＦｖ分子を除去した。４０ｎｇ／ｍｌのＥｕ−標識抗−Ｈｉｓ６抗体（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，Ｃａｔ．＃ＡＤ０１０９）を含有するＤＡＢのウェル当たり１００μｌを添加することによって、結合したＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを検出し、振盪しつつ室温にて１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、１００μｌのＤＥＬＦＩＡ増強溶液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，Ｃａｔ．＃４００１−００１０）をウェル当たり加えた。１５分間のインキュベーションに続き、Ｖｉｃｔｏｒ２（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）にて、ユーロピウム方法を用いてプレートを読んだ。
アッセイデータは、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ ＤｉｃｉｓｉｏｎＳｉｔｅソフトウェア（Ｓｐｏｔｆｉｒｅ，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，Ｍａ）を用いて処理し、各クローンについての参照温度に対する挑戦温度で観察されたＤＥＬＦＩＡカウントの比率として表した。親プラスミドで観察されたものを超える、または同等ないし２倍の比率を再現性よく与えたクローンをヒトと考えた。これらの陽性クローンからのプラスミドＤＮＡをミニ−プレプ（Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって単離し、第二の熱的挑戦アッセイを確認するためにＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０に再度形質転換して戻した。
熱的グラジエントについては、モデルとして可変傾きを備えたシグモイド状用量応答を用いるＰｒｉｓｍ４ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ）を用いてデータを分析した。熱的変性曲線の中点で得られた値をＴ５０値といい、生物物理学的に誘導されたＴｍ値と同等であると解釈されない。
熱的挑戦アッセイの結果を図８に示す。図８に示すように、本発明の安定化されたｓｃＦｖ分子の全ての結果、慣用的なｓｃＦｖと比較して結合活性の改良がもたらされた（Ｔ５０＞４９℃）。特に、ＢＨＡ１０ライブラリー位置ＶＬ４６ ｓｃＦｖ（Ｓ４６Ｌ）、ライブラリー位置ＶＨ１６ ｓｃＦｖ（Ｓ１６ＥおよびＳ１６Ｑ）、およびライブラリー位置ＶＬ４９：ＶＬ５０ ｓｃＦｖのＴ５０値は、慣用的なＢＨＡ１０ ｓｃＦｖに対して＋３℃ないし＋１２℃の熱安定性範囲の増加を呈した。加えて、ＢＨＡ１０ライブラリー位置ＶＬ３ ｓｃＦｖ（Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｇ、Ｑ３Ｓ、Ｑ３Ｖ、およびＱ３Ｄ）、ライブラリー位置ＶＨ６７ ｓｃＦｖ（Ｖ６７ＩおよびＶ６７Ｌ）、ライブラリー位置ＶＨ４８ ｓｃＦｖ（Ｍ４８ＩおよびＭ４８Ｇ）、ライブラリー位置ＶＨ２０ ｓｃＦｖ（Ｖ２０Ｉ）およびライブラリー位置ＶＨ１０１ ｓｃＦｖ（Ｐ１０１Ｄ）のＴ５０値は、慣用的なＢＨＡ１０ ｓｃＦｖに対して＋４℃ないし＋１８℃の熱的安定性範囲の増加を呈した。安定化突然変異（ＶＬＫ１３Ｅ）の１つが、思いがけなくも、ＰＣＲ誤差から得られた。これらの安定化突然変異の１つのｐＩＥＨ００９への取り込みは、熱的安定性をさらに改良し、これらの条件下ではＢＨＡ１０ Ｆａｂのそれを超えさえすることが判明した。重要なことには、４つの設計方法（ＶＬ／ＶＨ界面相同性モデリング、コンセンサススコアリング、計算モデリング、および共変動分析）のうち１以上に由来する非−共有結合ＶＬ４６、ＶＨ１０１突然変異、およびＶＨ５５突然変異の結果、ｓｃＦｖ熱的安定性の改良がもたらされ、ジスルフィド突然変異で観察されたものにほとんど近づき、かつこれらの設計ツールの利用性および新規性が確証された。特に、ｐＩＥＨ００６構築体、ＢＨＡ１０ ＶＨ４４：ＶＬ１００ ｓｃＦｖ（５９℃）のＴ５０はただ３℃だけＢＨＡ１０ Ｆａｂ（６２℃）とは異なり、他方、ｐＩＥＨ００９構築体、ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーは、これらの条件下でＢＨＡ１０Ｆａｂと機能的に同等であることが判明した。これらの結果は、本発明の安定化されたｓｃＦｖが、熱的挑戦事象に続いて改良された活性を有することを示す。
Ｃ．アフィニティー測定
等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）を用いて、ＢＨＡ１０ ＩｇＧ１分子の酵素切断を用いて導かれたＢＨＡ１０ Ｆａｂに対するｓＬＴβＲの親和性を測定した。ｓＬＴβＲは従前に記載されているように調製した（Ｅｌｄｒｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（２００６））。ＦａｂおよびｓＬＴβＲを、Ａｍｉｃｏｎ超遠心フィルターデバイス（ＭＷＣＯ １０，０００）を用いて、各々、６．０および２．０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。濃縮されたストック溶液は、ＩＴＣ測定に先立って、ＰＢＳに対して同時に透析された。ＩＴＣは３０℃に設定されたＶＰ−ＩＴＣユニット（ＭｉｃｒｏＣａｌ ＬＬＣ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）で行った。ほぼ５００μＬの７μＭ ｓＬＴβＲ溶液を試料セルに入れ、ＰＢＳ透析物を参照セルに入れた。合計２３４μＬの７０μＭ ＢＨＡ１０ Ｆａｂを、７ｘ１０μＬ、１２ｘ７μＬ、続いて、８ｘ１０μＬ注射にて試料セルに滴定した。反応の化学量論は１：１であった。製造業者によって供給されたＯｒｉｇｉｎソフトウェアを用いてＩＴＣ曲線を解析した。
実施例３に記載され、かつ実施例１に記載された方法を用いて発現させ精製された慣用的ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ、ＢＨＡ１０（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ｓｃＦｖ、およびＢＨＡ１０ ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ｓｃＦｖ調製物のＫＤ測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）にて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて行った。全ての実験はＨＢＳ−ＥＰ緩衝液、ｐＨ７．４中で行った。ビオチニル化ＰＥＮＴＡ−Ｈｉｓ抗体（２０μｇ／ｍＬ，Ｃａｔ＃３４４４０，Ｑｉａｇｅｎ）を、１０μｌ／分の流速にてストレプトアレジン−被覆ＣＭ５チップにほぼ１分間で固定化した。テストｓｃＦｖの０．１μＭ溶液を５μｌ／分の流速にて１０分間でチップに注入し、固定化されたＰＥＮＴＡ−Ｈｉｓ抗体を介して表面に捕獲した。ｓＬＴβＲおよび捕獲されたｓｃＦｖの間の結合を調べるために、ｓＬＴβＲの濃度シリーズ（１、２、５、１０、２５、５０、１００、および２００ｎＭ）を３０μｌ／分の液速にてｓｃＦｖ−被覆表面に二重注入した。緩衝液のみを含有するフローセルからのセンサーグラムデータ、およびＰＥＮＴＡ−Ｈｉｓ表面からのセンサーグラムデータを用いるテスト試料センサーグラムから差し引き、ここに、ｓｃＦｖが注入され、続いて、ｓＬＴβＲの代わりの緩衝液の注入を行った。ＢｉａＥｖａｌ ３．０製造業者ソフトウェアを用いて曲線を解析した。ＫＤ値は、動的会合および解離曲線を１：１ラングミュア結合モデルにフィットさせることによって計算した。チップ表面は、０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０の２回の連続的１０μＬ注入によって再生した。
表５は、Ｂｉａｃｉｏｒｅアフィニティーアッセイの結果を示す。組換えにより生じたＢＨＡ１０ ｓｃＦｖの結合親和性は、実施例１に記載されたように調製されたＢＨＡ１０ Ｆａｂと実質的に同一である。単独での、あるいは安定化ジスルフィド（ＶＨ４４：ＶＬ１００）の存在下での（Ｇ４Ｓ）４リンカー、あるいは該２つの組合せの導入の結果、抗原に対する親和性のいずれの有意な喪失ももたらされなかった。
表５．Ｂｉａｃｏｒｅアフィニティーアッセイ−ＬＴβＲへの結合
Figure 0005374359
 ＊等温滴定熱量測定によって測定。
Ｄ．示差走査型熱量測定研究
示差走査型熱量測定（ＤＳＣ）分析は、ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ、ＢＨＡ１０（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ｓｃＦｖ、およびＢＨＡ１０ ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ｓｃＦｖ調製物で行った。実験は、それを４℃／分の走査速度で行う以外は、酵素的に生じさせたＦａｂに対する慣用的なｓｃＦｖの初期比較について前記したように行った。ＢＨＡ１０ ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ｓｃＦｖは、野生型ｓｃＦｖと比較してすぐれた熱安定性特性を示した。特に、２つのドメインの内より安定でないもの、ＢＨＡ１０ ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ｓｃＦｖのＶＨドメインは、慣用的ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖのそれよりもほぼ５℃を超えて編成した（図９）。「融解温度」またはＴＭの増加は２つの別々の因子、（ｉ）平衡折畳み状態の熱的安定性の増加、または（ｉｉ）凝集する減少した傾向のためであり得た。ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖおよびＢＨＡ１０ ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ｓｃＦｖの〜５℃の温度差は、走査速度（０．２および４．０℃／分の間）から比較的独立しており、これは、観察されたＴＭ変化が平衡折畳み状態の安定化によるものであることを示唆する。
Ｅ．ＡＮＳ結合実験
疎水性蛍光色素１−アニリノ−８−ナフタリンスルホネート（ＡＮＳ）に結合する能力は、しばしば、蛋白質の天然状態、あるいは温度での増加した処理に際して起こり得る部分的に折畳み解除された状態いずれかにおける有意に大きな疎水性領域との相互作用のホールマークである。該色素の固有の蛍光は溶液中で消光され、大きな疎水性表面積に曝露されると有意に増加する。慣用的ＶＨＡ１０ ｓｃＦｖは、ＢＨＡ１０（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ｓｃＦｖ、またはＢＨＡ１０ ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ｓｃＦｖよりもかなり強いレベルでＡＮＳに固有に結合し、これは、疎水性暴露の存在が不適切なサイズのリンカーによってｓｃＦｖに力を加えたことを示す。より長いリンカー、具体的には、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４の添加はこの効果を媒介するように見えた。慣用的なＢＨＡ１０ ｓｃＦｖによる疎水性表面の見掛けの暴露は、他の蛋白質または分子の存在下における、あるいは単離におけるそれ自体の存在下においてでさえ、凝集の増大したレベルに導くことができる。そのＴＭを超えてのＢＨＡ１０ ｓｃＦｖの加熱は、慣用的および作製されたＢＨＡ１０ ｓｃＦｖに対するＡＮＳ結合を誘導するように見えた。興味深いことには、慣用的ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖは、上昇する温度の関数としてのＡＮＳ結合の漸次増加を示し、これは、細菌および哺乳動物細胞培養で用いた温度（すなわち、３７℃）のような、ＴＭ未満の温度での疎水性暴露の可能な増加を示唆する（図１０）。対照的に、ＢＨＡ１０（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４およびＢＨＡ１０ ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ｓｃＦｖの双方はこの特性を呈さず、本発明で記載された安定化突然変異は、疎水性表面領域の低下した暴露に基づいて自己−会合、または他の細胞−培養蛋白質成分と会合する傾向を減少させることを示唆する。
（実施例５）
改良された固有の蛋白質安定性を付与する安定化突然変異の同定
（ｉ）安定化突然変異の同定
種々の配列−ベースの方法（例えば、コンセンサススコアリング、共変動分析、ＶＨ／ＶＬ界面相同性モデリング）を用いて、改良された蛋白質安定性を注目する結合分子に付与する安定化突然変異を同定した。これらの安定化突然変異は、抗体可変領域発現ライブラリーの設計および構築で用いた。
Ａ．共変動分析
多数の設計を、単一配列内の２以上の残基によって呈される強力な共変動に基づいてＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ ＶＨおよびＶＬドメインを安定化させるために開発した。後記実施例１７に記載されたのと同様な方法を用い、共変動解析をＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ ＶＨおよびＶＬドメインで行って、安定化突然変異が予測され、かつ実験的スクリーニングのために抗体可変領域発現ライブラリーに含まれるように、失われたまたは侵害共変動を同定した。
第一の例において、ＢＨＡ１０ ＶＬ内の位置４６（Ｓ４６Ｌ；Ｋａｂａｔナンバリングシステム）におけるＳｅｒからＬｅｕへの突然変異が、共変動分析ツールがＬｅｕ４６と共に強力に共変動することを示した残基３６における現存のＴｙｒへの陽性結合を呈した（図７８参照）。この突然変異もまた、残基頻度解析によって安定化されつつあると予測される。
Ｓ４６Ｌに加えて、共変動によって安定化していると予測された第二の突然変異は、ＢＨＡ１０ ＶＨドメイン内のＶ５５Ｇ突然変異であった。残基頻度は、Ｖａｌがこの位置において低い頻度で観察されることを示したが、この位置がＣＤＲ２内に埋もれており可変である。従って、さらなる情報なくしては、この位置における変化は従前には試みられなかった。共変動解析による精査に際して、しかしながら、共変動データは、この位置が、すでにＢＨＡ１０ ＶＨドメイン内に存在する少なくとも１０の他のアミノ酸と強く相関することを示唆した。位置５５におけるＧｌｙへの突然変異は全ての１０の共変動を満足した。
共変動解析ツールの利用性のもう１つの例は、ＢＨＡ１０ ＶＨ Ｑ６Ｅ突然変異の予測された負の効果であった。単一残基頻度解析は、この位置におけるかなり通常に開発されたＧｌｕに対する突然変異が安定性の増加に導くことを示唆した。しかしながら、共変動解析ツールは、Ｇｌｕへの単一の突然変異が、ＢＨＡ１０ ＶＨ配列内に存在するいくつかの現存の共変動を侵すことを示した。安定性の改良を得るためには、この位置においてＧｌｕを優先的に安定化させるいくつかのアミノ酸を置換えなければならない。
また、共変動解析ツールの予測値のもう１つの例は図７９に示す。Ｍｅｔ８０は、単一残基ライブラリー設計の一部としてＬｅｕに突然変異した。この単一突然変異は高度に安定性であると考えられた。というのは、Ｌｅｕは配列データベース内のこの位置において観察された最も頻繁なアミノ酸だからである。しかしながら、共変動解析は、共変動ハーモニーを達成するためには、２つの他のアミノ酸が突然変異しなければならないことを示す（Ｖ６７ＦおよびＴ７０Ｓ）。
Ｂ．コンセンサススコアリング
コンセンサススコアリングは、突然変異誘発のためのｓｃＦｖ ＶＨおよびＶＬ領域内のアミノ酸残基を同定して、ｓｃＦｖの固有の安定性を改良する方法として利用された。該スコアリングは、超体細胞突然変異および進化による生殖系の変動によるコンセンサスＶＨおよびＶκ配列からの相対的ドリフトを評価する。次いで、この分析に由来する情報を用いて、改良された安定性を持つｓｃＦｖ変種についてスクリーニングするためのライブラリーを設計した。
スコアリング用のコンセンサス配列を誘導するのに用いた哺乳動物ＶＨおよびＶκカッパ配列の参照組、および各残基位置における個々のアミノ酸頻度を収集し、分類し、および従前に記載されているように選択した（Ｄｅｍａｒｅｓｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５，４１−４８（２００４）；Ｄｅｍａｒｅｓｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｓｅｌ．Ｉｎ Ｐｒｅｓｓ，（２００６））。哺乳動物参照組は、進化による種の間のドリフトを介する多様性を得るために種々の哺乳動物からのＶ−遺伝子を含めるようにナイーブに構築した。ＶＨ哺乳動物参照組は、主として、ＮＣＢＩおよびＴＩＧＲからの６１のＶＨ配列を含有し、合計１７の異なる哺乳動物種を表す。Ｖκ哺乳動物参照組は、１３の異なる哺乳動物種からの５３のＶκ配列を含有する。
ＢＨＡ１０ ＶＨおよびＶＬの統計学的解析は、慣用的な設計されたＩｇＧデータベースおよび修飾されたＰＥＲＬスクリプトを用いて行った（Ｄｅｍａｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｄｅｍａｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ＢＨＡ１０ ＶＨおよびＶＬ内の各残基のアミノ酸頻度は慣用的データベースから計算した。個々の配列における、各位置ｉについての、ＢＨＡ１０ ＶＨおよびＶＬ内の各アミノ酸の残基頻度Ｓｉ（ｒ）は、特定の残基−タイプ（ｒ＝Ａ，Ｃ，Ｄ．．．Ｖ，Ｗ，Ｙ）がデータ組内で観察される回数を、配列の合計数で割った数によって計算した。図１１は、ＢＨＡ１０ ＶＨおよびＶＬ残基頻度を、データベースのコンセンサス残基の残基頻度で割ったもので示す。コンセンサス残基頻度で割ることによって、ＢＨＡ１０アミノ酸が共通のＶＨまたはＶＬ配列の中で低頻度で観察される残基位置におけるライブラリーの創生についての厳しいカットオフが得られる。ライブラリーの位置が、その残基頻度を最も頻度が高い残基頻度で割ったもの（Ｓｉ（ｒ）／ＭＦＲｉ（ｒ））が＜０．３であるものによって決定した。残基頻度計算の右側にリストされた残基は公表された（Ｃｈｏｔｈｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８，４５７−４７９，（１９９８））ヒト配列で共通に見出されるものであり、ライブラリーフォーマットにおいて具体的に標的化して、最も安定性のアミノ酸についてスクリーニングすることができる。ＢＨＡ１０ ＶＨおよびＶＬのＣＤＲは、ＬＴβＲとの相互作用の潜在的中断による安定性最適化について考慮したが、第二世代の設計については考慮できなかった。
Ｃ．ＶＨ／ＶＬ界面相同性モデリング
後の実施例１５に記載するように、示差走査型熱量測定分析を１７のヒト抗体について行った。頂部候補、ＢＩＩＢ１−４は、全て、優れた（すなわち、非常に高いおよび所望の）安定性特性を有した。これらの高度に安定な抗体を、低い固有の安定性を持つｓｃＦｖまたは抗体ドメインの安定性を改良するためのプラットフォームとして用いることができる。特に、安定性特性の潜在的により大きなレベルを供するためにＶＨおよびＶＬの間の界面を強調した。
ＢＨＡ１０ ＦａｂをｓｃＦｖフォーマットに変換した結果、２つの個々のより低温の折畳み解除転移によって観察された大いに非−協働的折畳み解除事象（ｓｃＦｖ）に対する、単一のより高い温度の折畳み解除転移によって観察された十分に協働的な折畳み解除事象（Ｆａｂ）を示すＤＳＣサーモグラムの変化がもたらされた。言い換えると、Ｆａｂフォーマットにおいては、ドメイン間接触は、全てのドメインを一緒に単一のより高い温度の折畳み解除転移にロックするのに十分強かった。一旦ＣＨ１およびＣＬドメインが除去されれば、ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬドメインは、もはや、折畳み解除転移を協働的事象へ駆動する能力を有しなかった。界面を安定化することによって、ＶＨおよびＶＬドメイン双方を同時に安定化できるにのみならず、ＶＨ／ＶＬ界面の付着を促進し、凝集を排除することができる。
頂部の４つの最も安定なＢＩＩＢ抗体（ＢＩＩＢ１−４）を用いて、２−工程手法を介してＢＨＡ１０ ｓｃＦｖへの安定性突然変異を設計した。まず、ヒト化ＢＨＡ１０ Ｆａｂの結晶構造を構造解析で利用した。具体的には、結晶構造を使用して、ＶＨおよびＶＬの間の界面における全ての残基、ならびに各残基が界面に寄与する表面積の量を（ＭＯＬＭＯＬソフトウェアを用いて）同定した。界面において他の領域よりもより大きな表面積に埋もれた残基は界面にとってより重要であると考えられる。任意の限界の優先順位付けとして、３０および４０Å２の間に埋もれたものは重要と考えられる。＞４０Å２に埋もれるものは非常に重要と考えられる。これらの２つのカテゴリーには、相同性モデリングおよび突然変異誘発の項目において最高の優先性が与えられた。各残基が界面において埋もれる表面積の量を表６にリストする。第二に、ＶＨおよびＶＬの間の界面におけるアミノ酸タイプを、ＢＩＩＢ１−４における同一位置に存在するアミノ酸（すなわち、極端に安定な抗体）と比較した。この方法は、ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを安定化する多数の顕著な突然変異の同定を可能とした。
２つの突然変異、ＶＬにおけるＳ４６Ｌ、およびＶＨにおけるＰ１０１Ｄは、実施例８に記載したように、実験的に確証された。事実、これらの２つの突然変異は、熱挑戦アッセイでテストした単一の最も安定性突然変異であった（図５０Ａ参照）。双方の突然変異は双方のＶＨおよびＶＬドメインを同時に安定化し、これは、それらが、ドメイン内で協働的に形成するのを助けることを示唆する。
表６．ＢＨＡ１０ ＶＨＶＬ表面積で解析
Figure 0005374359
Figure 0005374359
 （「＊」で標識された残基位置は、ＢＩＩＢ１、２、３または４に見出された残基に対する突然変異を介して安定性設計のための良好な機会を示す）。
Ｄ．計算解析
計算方法を用いて、それにより、アミノ酸置換が安定性を改良するであろう位置に対する推奨を行うためにＢＨＡ１０を分析した。これらの方法は２つの工程：配列−ベースの分析（工程１）；および構造−ベースの分析（工程２）から構成されるものであった。第一の工程の間に、抗体の可変ドメインの配列のデータベースを用いた。（データベース配列の１０％におけるもの未満の）それらの各位置において低い頻度で存在するアミノ酸、または対応するコンセンサスアミノ酸にマッチしなかったアミノ酸を、高−頻度またはコンセンサスアミノ酸に対する置換について選択した（候補突然変異）。第二の工程の間に、抗体のＦａｂ断片の三次元構造またはモデルを用いた。候補突然変異をそれらの構造の関係で評価し、構造特性、相補性決定領域（ＣＤＲ）立体配座との適合性、ＶＬ／ＶＨ界面パッキングにおける役割、および重鎖および軽鎖の折畳みに基づく実験テストについて優先順位をつけた。
ＢＨＡ１０は軽鎖上の位置４６にセリンを有する点で異常である。データベースにおいては、ＶＬ（カッパサブタイプ）配列のほぼ１％はＳ４６を保有し、他方、ＶＬ（カッパサブタイプ）配列のほぼ７９％はＬ４６を有する。また、ヒトコンセンサスＫＶ１はＬ４６を有する。一旦候補突然変異として同定されたならば、Ｓ４６Ｌ置換を、ＢＨＡ１０ Ｆａｂの三次元モデルとの関係で評価した。位置４６は、ＶＨのＹ１０１およびＷ１０３、およびＶＬのＹ３６およびＹ５５と接触するＶＬ／ＶＨ界面に存在することが判明した。構造−ベース分析により、Ｓ４６Ｌ置換が一体性ＶＬ／ＶＨ界面、ＣＤＲ立体配座、およびＶＬ折畳みと適合することが明らかとなった。
セリンは、重鎖の位置１６における低頻度のアミノ酸である。データベースにおいて、ＶＨ配列のほぼ５％はＳ１６を保有し、２５％はＡ１６を有し、２１％はＧ１６を有し、１１％はＥ１６を有し、ほぼ１０％はＱ１６である。また、ヒトコンセンサスＶＨ１はＡ１６を有する。一旦候補突然変異体として同定されたならば、Ｓ１６Ａ、Ｇ、ＥおよびＱ置換を、ＢＨＡ１０ Ｆａｂの三次元モデルとの関係で評価した。位置１６は、ＶＨのＫ１３およびＳ１６と接触を行うＶＨ／ＣＨ１界面に対して基部側のループに存在することが見出された。構造−ベースの分析により、Ｓ１６Ａ、Ｇ、Ｅ、およびＱ置換がＶＬ／ＶＨ界面の一体性、ＣＤＲ立体配座、およびＶＨ折畳みに適合することが明らかとなった。また、Ｅ１６およびＱ１６の長い親水性側鎖が好ましいであろうと結論された。従って、位置ＶＬ４６およびＶＨ１６はライブラリー設計において表された。
計算分析に対する補充的なアプローチは、Ｒｏｓｅｔｔａ（Ｋｕｈｌｍａｎ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２００１９８（１９）：１０６８７−９１）およびＤＥＥＫ（Ｈａｎｆ Ｋ．Ｊ．，Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，ＭＩＴ，２００２）のような構造−べースの蛋白質エンジニアリング技術を用いた。蛋白質界面の三次元構造を仮定すると、これらの方法は、ＶＬに対するＶＨの結合についての改良されたΔΔＧ（結合および未結合状態の間の差）、および／またはＶＨおよびＶＬ折畳みについてのΔΔＧ（折畳まれたおよび参照の折畳み解除された状態の間の差）に導くアミノ酸配列における突然変異を生じさせることができる。これらの方法の使用により、Ｓ４６Ｌは、ＶＬに対するＶＨの結合を改良する突然変異であり、他方、Ｓ１６Ｅは、ＶＨの折畳みを改良する突然変異であることが明らかとなった。
Ｅ．組合された界面および共変動設計アプローチ
共変動解析を用いて、ＶＨおよびＶＬの間の界面を供し、それを支持するのに、およびＶＨ／ＶＬの間の強い親和性を維持し、それにより、増加したｓｃＦｖ安定性をもたらすのに重要な残基ネットワークを決定した。ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬの間の界面に直接的に関与する残基は実施例５Ｃに記載されたように同定し、前記表６にリストされる。前記表６にリストされた最も高度に埋もれた残基と共に強く共変動する残基は、前記セクションＩＩＩ（ａ）に記載された共変動方法を用いて計算した。共変動解析で用いたＨＭＭは、界面に埋もれたＶＨおよびＶＬ双方のドメインのＣＤＲ２およびＣＤＲ３における残基を調査する能力を排除する。それにもかかわらず、これらの残基位置から強い共変動は生じないであろうと考えられる。というのは、それらは、高い親和性でもって抗原を認識することができる抗体について存在する強い選択圧によりかなり可変であるからである。従って、共変動ネットワークが、ＶＨおよびＶＬ双方の間の界面を支持するために共変動ネットワークが存在するか否かを決定するのに用いた残基は以下の通りであった：
Figure 0005374359
 Ｖ−クラス配列整列におけるその出現が前記リストの界面残基と相関する残基を、ファイ−値のカットオフ＞０．２５を用いて決定された。もし、それが前記で直接にリストされた界面残基の少なくとも２つと相関しないならば、ＶＨおよびＶＬの間の強い界面を維持するのに重要と考えられる残基はない。表７および８は、各々、界面残基と２以上の相関を示す。リンクの数が大きければ、インパクトはより大きく、これらのアミノ酸位置の各々は、ＶＨおよびＶＬの間の界面を安定化させるために有すると考えられる。
表７−ＢＨＡ１０ｘ線−結晶構造の界面で観察される構造残基に対する多数の強い相関を持つＶＨを備えた残基
Figure 0005374359
Figure 0005374359
 界面における太文字の埋もれた表面領域における残基。イタリック体の残基は、界面における表面に埋もれた残基に対する一次配列において直接的に隣接するものである。
＊識別サブクラス特徴
＊＊一次残基と同一の残基の多くと共に共変動するが、より弱い残基頻度のため相関レベルはより低い。
表８ ＢＨＡ１０ｘ線−結晶構造の界面で観察された構造残基に対する多数の強い相関を持つＶＬを備えた残基
Figure 0005374359
Figure 0005374359
 界面における太文字の埋もれた表面領域における残基。イタリック体の残基は、界面における表面に埋もれた残基に一次配列が直接的に隣接するものである。
＊Ｑ５０、Ａ８９、Ｙ１３５は重鎖および軽鎖双方において保存されており、共変動は軽鎖位置と相関するように見えない。
表７および８からの残基は、各々、ＢＨＡ１０ ＶＨおよびＶＬの表面にマッピングされており、２つのドメインの間の界面において直接接触する現実の残基と比較されている（図８７および８８参照）。２つはこの解析から支持される。まず、共変動は、界面におけるＣＤＲ２およびＣＤＲ３残基が関係するネットワークについての（この段階における）情報を提供しない。第二に、共変動は、その維持に重要な界面内で直接接触する残基のみならず、直接的界面残基の外側の多くの他の残基は、界面残基の位置の足場となり、およびそれを支持するのに重要である。この点は、共変動ネットワークの表面で説明されているが、界面において表面に直接的に埋もれる残基を計算するための構造を単に用いることによって得られた表面には存在しない残基によって示される。
これらの界面共変動ネットワークの少数の違反は、ＢＨＡ１０またはｐ５Ｅ８（実施例２１において後に記載）ｓｃＦｖ：ＶＨまたはＶＬ配列内に存在することが判明した。表７および８に記載された理想的に支持的な界面アミノ酸残基に対するこれらの位置での天然／非−理想的アミノ酸の突然変異は、ＢＨＡ１０またはｐ５Ｅ８ ｓｃＦｖ：（ａ）ＢＨＡ１０ ＶＬ Ｓ４６Ｌ、および（ｂ）Ｉｄｅｃ１５２ ＶＨ Ｓ４９Ｇ（ｋａｂａｔおよびＸｒａｙ＃）Ｅ７２Ｄ（Ｘ線について７３）のいずれかに対してかなり安定性であることが示された。これらの残基の内の１つ（Ｓ４６ＬＶＬ）は直接的に界面にあり、１つ（Ｓ４９ＧＶＨ）は界面に直接に隣接し、および１つは界面（Ｅ７２ＤＶＨ）に対して末端側にあった。しかしながら、全ての３つは共変動解析に基づいて、界面に対して安定性であると予測された。界面の安定化は、ＶＨおよびＶＬ双方の熱安定性の増加として、ＤＳＣ測定を用いて観察できた。
ｉｉ）改良された熱安定性を持つＢＨＡ１０ ｓｃＦｖライブラリーの構築およびスクリーニング
Ａ）ｓｃＦｖライブラリーの構築
実施例４、５および６に記載された方法を用いて慣用的なＢＨＡ１０ ｓｃＦｖにおいて所望のアミノ酸置換を含有するように設計されたライブラリー（ｐＸＷＵ００２）は、表９にリストされたオリゴヌクレオチドを用いて製造業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）によって供された支持に従ってＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ部位−特異的突然変異誘発キットを用いて作製された。慣用的なｓｃＦｖのＤＮＡ配列を図１に示す。
個々の形質転換されたコロニーを、４００μｌ／ウェルＬＢ＋５０ｍｇ／ｍｌカルベニシリンを含有する深い−ウェル９６ウェル皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，Ｃａｔ．＃３９６０）に拾い、３７℃にて一晩成長させた。マスタープレートは、２０％グリセロールを含有する等容量のＬＢを深い−ウェル９６ウェル皿の各々に加え、細菌懸濁液の５０μｌアリコットを滅菌マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，Ｃａｔ．＃３３５９）に移し、貯蔵のために−８０℃で凍結させた。
表９ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖの安定性エンジニアリングのためのオリゴヌクレオチド
Figure 0005374359
Figure 0005374359
 †突然変異誘発のために標的化された位置は下線によって示す。曖昧な塩基は以下のように省略される：Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｖ＝ＡまたはＣまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｓ＝ＣまたはＧ、Ｍ＝ＡまたはＣ、Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴ、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｂ＝ＣまたはＧまたはＴ（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６１（１）：１３−７（１９８６））。
Ｂ．熱挑戦アッセイ
次いで、慣用的なおよび作製されたＢＨＡ１０ ｓｃＦｖｓの活性を、熱挑戦事象後にｓｃＦｖ分子の５０％がそれらの抗原結合活性を保有する温度を決定するのに用いることができる熱挑戦アッセイで比較した。この温度に対応する数値をＴ５０値といい、単位は℃で表す。このアッセイにおいては、ｓｃＦｖを、慣用的なＢＨＡ１０ ｓｃＦｖの熱転移温度を含む一定範囲の温度に付した。
誘導性ａｒａＣプロモーターの制御下で、Ｅ．ｃｏｌｉ 株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．Ｃａｔ．＃２７３２５）を、慣用的および作製されたＢＨＡ１０ ｓｃＦｖをコードするプラスミドで形質転換した。形質転換体は、１％グリシン、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、０．０２％アラビノース、および５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを補足したＳＢ（Ｔｅｋｎｏｖａ，ＨａｌｆＭｏｏｎ Ｂａｙ，Ｃａ．Ｃａｔ．＃Ｓ０１４０）よりなる発現培地中で３７℃または３２℃いずれかで一晩成長させた。細菌は遠心によってペレット化し、さらなる処理のために上清を収穫した。グリシンおよびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を培地に含めた結果、ペリプラズマ内容物（天然Ｅ．ｃｏｌｉ蛋白質およびｓｃＦｖ）が培地に放出された。上清中のＥ．ｃｏｉｌ蛋白質の存在はこのアッセイの性能に必須である。何故ならば、熱的に変性した蛋白質は「シンク」として作用し、一過的に折畳み解除されたｓｃＦｖ分子は不可逆的不活性凝集体に捕獲されるからである。
各ライブラリーは、処理条件に付された１つの複製からの上清、および未処理参照として働く第二の上清にて熱挑戦アッセイを用いて二連でスクリーニングした。熱挑戦アッセイは、安定性を測定するために単一または一定範囲の温度で実行することができる。安定な熱グラジエントを生じさせることができるサーモサイクラーマシーンを、試料上清を処理するのに用いる（ｉＣｙｃｌｅｒ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ）。
挑戦温度は、親ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ変種の特性に応じて変動し、一般には、実験的に決定されたＴ５０値よりも２ないし３℃高かった。凍結されたマスタープレートを解凍し、それを用いて、ウェル当たり２５０μｌの発現培地を含有する深い−ウエルマイクロタイタプレートを接種し、培養を３２℃で一晩成長させた。対照として、親プラスミドを含有する培養を同一条件下で成長させ、ライブラリーとして同時に処理した。細菌を、２０００ｒｐｍにおける３０分間の遠心（ＩＥＣ ｍｏｄｅｌ ８Ｒ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）によって深い−ウェルプレート中でペレット化し、１００μｌの上清を標準マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，Ｃａｔ．＃３３５７）に移した。上清のアリコットを参照ＤＥＬＦＩＡのために保持した。ほとんどのライブラリーについては、上清の残りを含有するプレートをシールし（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，Ｃａｔ．＃２３５２０５）、適当な挑戦温度に設定されたインキュベーター（Ｅｃｈｏ Ｔｈｅｒｍ，Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ Ｍａｒｃｏｓ，Ｃａ）中に９０分間置いた。多数の挑戦温度（または７５℃よりも高い温度）を必要とするスクリーニングでは、上清を９６−ウェルＰＣＲプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａ，Ｃａｔ．＃Ｎ８０１−５６０）に移し、所望の温度にて９０分間インキュベートした。
熱挑戦後に、凝集した物質を遠心によって除去し、処理された清澄化された上清に残存する可溶性ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ試料を、ＤＥＬＦＩＡアッセイによって同族ＬＴβＲ Ｉｇ抗原への結合についてアッセイした。９６−ウェルプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，Ｃａｔ．＃４３７１１１）を、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．５中１μｇ／ｍｌにおいて、ヒトＦｃ領域に融合したＬＴβ受容体（ＬＴβＲ）のエクトドメインよりなる融合蛋白質で被覆した。プレートを４℃にて一晩被覆し、室温にて震盪しつつ、ＤＥＬＦＩＡアッセイ緩衝液（ＤＡＢ，１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，２０μＭ ＥＤＴＡ，０．５％ ＢＳＡ，０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ２０，０．０１％ ＮａＮ３，ｐＨ７．４）で１時間ブロックした。プレートを、ＢＳＡ（洗浄緩衝液）を含まないＤＡＢで３回洗浄し、ＤＡＢに希釈されたテスト試料を１００μｌの最終容量にてプレートに加えた。プレートを振盪しつつ室温にて１時間インキュベートし、次いで、洗浄緩衝液で３回洗浄して、未結合および機能的に不活化されたｓｃＦｖ分子を除去した。結合したＢＨＡ１０ ｓｃＦｖは、４０ｍｇ／ｍｌのＥｕ−標識抗−Ｈｉｓ６抗体（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，Ｃａｔ．＃ＡＤ０１０９）を含有するＤＡＢのウェル当たり１００μｌの添加によって形質し、振盪しつつ室温にて１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、１００μｌのＤＥＬＦＩＡ増強溶液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，Ｃａｔ．＃４００１−００１０）をウェル当たり加えた。１５分間のインキュベーションに続き、Ｖｉｃｔｏｒ２（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）にてユーロピウム方法を用いてプレートを読んだ。
Ｓｐｏｔｆｉｒｅ ＤｅｃｉｓｉｏｎＳｉｔｅソフトウェア（Ｓｐｏｔｆｉｒｅ，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，Ｍａ．）を用いてアッセイデータを処理し、各クローンについて参照温度に対する挑戦温度で観察されたＤＥＬＦＩＡカウントの比率として表した。親プラスミドで観察されたものの２倍よりも大きな、またはそれと等しい比率を再現性よく与えたクローンをヒトと考えた。これらの陽性クローンからのプラスミドＤＮＡをミニ−プレプ（Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって単離し、第二の熱挑戦アッセイのためにＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０に再度形質転換して戻した。
熱グラジエントについては、モデルとして可変傾きを持つシグモイド状用量応答を用いるＰｒｉｓｍ４ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｄｏ，Ｃａ）を用いてデータを解析した。熱変性曲線の中点で得られた値をＴ５０値といい、生物物理学的に導かれたＴｍ値と同等であると解釈されない。
これらのアッセイからの主たるおよび確認的結果を表１０に示す。本発明のいくつかの安定化されたｓｃＦｖ分子の結果、慣用的なｓｃＦｖと比較して結合活性の改良がもたらされた（Ｔ５０＞４９℃）。特に、ＢＨＡ１０ライブラリー位置ＶＬ４６ ｓｃＦｖ（Ｓ４６Ｌ）、ライブラリー位置ＶＨ１６ ｓｃＦｖ（Ｓ１６ＥおよびＳ１６Ｑ）、およびライブラリー位置ＶＬ４９：ＶＬ５０ ｓｃＦｖのＴ５０値は、慣用的なＢＨＡ１０ ｓｃＦｖと比較して＋３℃ないし＋１２℃の範囲の熱的安定性の増加を呈した。加えて、ＢＨＡ１０ライブラリー位置ＶＬ３ ｓｃＦｖ（Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｇ、Ｑ３Ｓ、Ｑ３Ｖ、およびＱ３Ｄ）、ライブラリー位置ＶＨ６７ ｓｃＦｖ（Ｖ６７ＩおよびＶ６７Ｌ）、ライブラリー位置ＶＨ４８ ｓｃＦｖ（Ｍ４８ＩおよびＭ４８Ｇ）、ライブラリー位置ＶＨ２０ ｓｃＦｖ（Ｖ２０Ｉ）およびライブラリー位置ＶＨ１０１ ｓｃＦｖ（Ｐ１０１Ｄ）のＴ５０値は、慣用的なＢＨＡ１０ ｓｃＦｖに対して＋４℃ないし＋１８℃の範囲の熱的安定性の増加を呈した。安定化突然変異（ＶＬ Ｋ１３Ｅ）の１つは、思いがけなくも、ＰＣＲ誤差に由来した。これらの安定化突然変異の１つのｐＩＥＨ００９への取り込みは、熱的安定性をさらに改良し、これらの条件下でＢＨＡ１０ ｓｃＦｖのそれを超えさえすることが判明した（図１２）。重要なことには、４つの設計方法（ＶＬ／ＶＨ界面相同性モデリング、コンセンサススコアリング、計算モデリング、および共変動解析）の１以上に由来する非−共有結合ＶＬ４６突然変異およびＶＨ５５突然変異の結果、ジスルフィド突然変異で観察されたものにほとんど近づくｓｃＦｖ熱的安定性の改良がもたらされ、これらの設計ツールの利用性および新規性が確証される。
図１Ｂは慣用的なＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ（配列番号：４）のアミノ酸配列を示し、図９４ＡおよびＢは、各々、Ｓ４６Ｌ（ＶＬ）安定化突然変異（配列番号：１３７）、およびＶ５５Ｇ（ＶＨ）安定化突然変異（配列番号：１３８）を含有する安定化されたＢＨＡ１０ ｓｃＦｖのアミノ酸配列を示す。野生型ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ（配列番号：３）のＤＮＡ配列を図１Ａに示す。安定化突然変異はボックスに入れた残基によって示される。リーダー配列、ｇｌｙ／ｓｅｒ連結ペプチド、およびＣＨ１ドメインは、各々、下線を施した、太文字の、およびイタリック体の残基によって示される。
表１０ ＢＨＡ１０ ＶＨおよびＶＬライブラリーの位置、ライブラリーの組成、およびスクリーニングの結果
Figure 0005374359
Figure 0005374359
 ｎａ＝適用不可能
表１１は、慣用的なｓｃＦｖに導入された種々の個々のおよび組み合わされた安定化突然変異の包括的な熱的安定性解析の結果を示す。これらの結果は、活性の改良が相加的であって、本発明に記載された方法が、天然Ｆａｂのそれを超えさえするｓｃＦｖの熱的安定性特性を改良することができることを示す。位置ＶＨ４４−ＶＬ１００における共有ジスルフィド結合の不存在下においてさえ、組合せに際して、慣用的ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖに対して＋１９℃ないし＋３３℃の範囲の熱的安定性の増加を呈した安定化突然変異が同定された。
表１１ 変種蛋白質を生じさせるのに用いられたＢＨＡ１０構築体の特徴付け、および熱挑戦アッセイからのＴ５０結果
Figure 0005374359
Figure 0005374359
 ｎａ＝適用不可能
ａａ＝アミノ酸
まとめ
３つの安定化突然変異（ＶＬ＿Ｓ４６Ｌ、ＶＨ＿Ｖ５５Ｇ、およびＶＨ＿Ｐ１０１Ｄ）は熱挑戦（Ｔ５０）アッセイによって実験的に確証された。
ＶＬ＿Ｓ４６ＬおよびＶＨ＿Ｖ５５Ｇ突然変異の双方は、前記実施例３に記載された共変動解析に基づいて個々のＶＨおよびＶＬドメインに対して安定化性であると予測された。図５０ＡおよびＢに示されるように、これらの突然変異の双方はＢＨＡ１０ ｓｃＦｖのＴ５０の有意な増加に導いた。特に、ＶＬ＿Ｓ４６Ｌ突然変異が〜７ないし８℃だけｓｃＦｖを安定化し、他方、ＶＨ＿Ｖ５５Ｇ突然変異は〜１２℃だけｓｃＦｖを安定化する。これらの突然変異の双方もまた、ＤＳＣによって決定されるようにＶＨおよびＶＬの間のＴＭギャップを有意に縮める（図５１参照）。ＤＳＣデータは、双方の突然変異が、ｓｃＦｖについて、ＶＨおよびＶＬドメイン双方のＴＭ（熱折畳み解除転移の中点）、および熱量測定エンタルピー（すなわち、曲線下面積）の双方の有意な増加に導くことを示す。これらの値の増加は、これらの予測される安定化突然変異が、事実、ｓｃＦｖに対して安定化性であるという実験的確証を提供する。さらに、これらの突然変異はＶＨおよびＶＬドメインの双方を同時に安定化するので、それらはＶＨおよびＶＬドメインの間の形成協働性において重要なようである。従って、ＶＨおよびＶＬの間の界面の強化は安定性を増大させるのを助けるのみならず、同様に凝集体を形成する傾向を低下させると予測される。
ＶＬ＿Ｓ４６Ｌ安定化突然変異および第三の安定化突然変異（ＶＨ＿Ｐ１０１Ｄ）もまた、前記実施例４に記載されたＶＨ／ＶＬ界面相同性モデリングに基づいて安定化性であると予測される。熱挑戦アッセイによって測定して、ＶＨ＿Ｐ１０１Ｄ安定化突然変異は〜１５℃だけｓｃＦｖを安定化した（図５０Ｃ）。加えて、ＤＳＣ（図５２参照）は、この安定化突然変異がＶＨおよびＶＬドメイン双方のＴＭおよび熱量測定エンタルピーの有意な増加に導くことを示し、これは、この突然変異もまた、ＶＨ／ＶＬ界面を介して全体としてｓｃＦｖを協働的に安定化するらしいことを示す。
（実施例６）
安定化突然変異を含む安定化されたＢＨＡ１０ ｓｃＦｖの生物物理学的特徴付け
表１１にリストされた種々のプラスミドからのＶ領域遺伝子配列を修飾されたＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターにサブクローンして、誘導性ａｒａＣプロモーターの制御下にある組換え蛋白質発現を駆動した。変種ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを発現させ、前記した方法を用いて精製した。ＶＬドメインのＮ−末端における見掛けの切断部位は、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析によって判断してほとんどのｓｃＦｖ調製物において低いレベルのＶＬに導いた（図５３）。
各ｓｃＦｖの水力学特性は、静的光散乱および屈折率ディテクター（ＭｉｎｉＤＡＷＮ／ＲｅＸ，Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でのサイズ排除ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって調べた。各ｓｃＦｖは圧倒的にモノマーであることが判明し、しかしながら、野生型（安定化されていない）ｓｃＦｖを含めた少数のｓｃＦｖは、低いレベルのダイマー物質を呈した（表１２）。精製されたｓｃＦｖのいずれも、ダイマーよりも大きな検出可能なレベルのオリゴマーを有しなかった。
表１２ ｓｄＦｖのＳＥＣ／光散乱の結果
Figure 0005374359
 ａ標準誤差のない蛋白質は一回発現された。
ｂｎ．ｄ．、測定せず。
ｃ分取ＳＥＣを行って凝集体を低下させた後に、これらの値を決定した。
実験の最終的な目標は、設計された突然変異が安定性を増強させ、凝集に対するより低い傾向に導くか否かを調べることであった。各ｓｃＦｖの熱安定性を、２つの別々の方法を用いて評価した。まず、ＤＳＣを用いてｓｃＦｖの熱的折畳み解除を分析した（図５４Ａ）。第二に、各ｓｃＦｖの熱安定性は、蛍光疎水性色素、１−アニリノ−８−スルホネートの存在下で蛋白質を過熱することによって知られた（ＡＮＳ図５４Ｂ）。ＡＮＳは、一般に、部分的に折畳み解除された蛋白質、またはコンパクトな折畳み解除された状態の熱−変性蛋白質に結合する。露出された疎水性表面領域との会合に際して、ＡＮＳの蛍光は、恐らくは、溶媒の消光影響の封鎖のため、有意に増大する。
温度依存性ＡＮＳ曲線は、以下に記載するように２−状態蛋白質折畳み解除転移にフィットされた。緩衝液はＰＢＳであって、各実験で用いたｓｃＦｖの濃度は７５０ｎｍであった。蛍光測定は、ペルチエ加熱デバイスおよび外部水浴を備えたＪＡＳＣＯモデル８１２円二色性分光偏光計で行った。光路に対して垂直な光電子増倍管を含有するアクセサリーを用いて蛍光を集めた。該アクセサリーは、４８０ｎｍに設定された調整可能なモノクロメーターを備えていた。感度は６００Ｖに設定された。加熱は１２０℃／分の連続速度で行った。励起モノクロメーターは３７０ｎｍに設定された。
この実験における各ｓｃＦｖの熱的折畳み解除は、ＡＮＳ蛍光の増加に導いた。各ｓｃＦｖ蛋白質ドメインの熱的折畳み解除の中点（すなわち、ＴＭ）は、製造業者（ＭｉｃｒｏＣａｌ，Ｉｎｃ）によって製造されたＯｒｉｇｉｎ ７．０ソフトウェアを用いてギブス−ヘルムホルツ方程式に各折畳み解除ピークをフィットさせることによってＤＳＣを用いて決定した。ＴＭは、ＫａｌｅｉｇｈｄａＧｒａｐｈＴＭ：
Figure 0005374359
 （式中、ΔＧＵ°（Ｔ）は折畳み解除に際してのギブス自由エネルギーの温度−依存性変化であり、ΔＨＵ°（Ｔ）は折畳み解除に関連するエンタルピー変化であってΔＳＵ°（Ｔ）は折畳み解除に関連するエントロピーである）
において、ギブス−ヘルムホルツ方程式を非−線形曲線フィッティングルーチンへの取り込みによりＡＮＳ蛍光を用いても誘導された。該方程式は：
Figure 0005374359
 （式中、ＴＭは折畳み解除曲線の中点であって、ΔＣＰ°は折畳まれたおよび折畳み解除された状態の間の熱容量の変化である）
まで拡大することができる。この方程式を用いて、蛍光強度が折畳まれたおよび折畳み解除されたｓｃＦｖの存在下における固有のＡＮＳ蛍光の総和：
Figure 0005374359
 （式中、ｉＴ（Ｔ）は温度−依存性合計蛍光シグナル、ｉＦおよびｉＵは、各々、折畳まれたおよび折畳み解除された状態の蛍光強度であって、ｆＦおよびｆＵは各々、与えられた温度における折畳まれたおよび折畳み解除されたｓｃＦｖの分立である）
であると仮定することによって、ＡＮＳ蛍光強度の温度−依存性を誘導することができる。折畳まれた分率は、平衡折畳み解除定数および折畳み解除の自由エネルギーに関連する：
Figure 0005374359
 ＫＵ（Ｔ）およびΔＧＵ°（Ｔ）を方程式（３）に因数分解し、折畳まれたおよび折畳み解除されたｓｃＦｖの存在下でのＡＮＳの蛍光強度が温度に直線的に依存すると仮定し（すなわち、ｉＦ＝ｉ１＋ｉ２ＴおよびｉＵ＝ｉ３＋ｉ４Ｔ）、以下の方程式が得られた：
Figure 0005374359
 データにフィットさせるのに利用された最終方程式を得るためには、方程式（２）におけるΔＧＵ°（Ｔ）に対する関係は、ΔＣＰ°が温度から独立し、かつ折畳まれたおよび折畳まれていない状態の間の溶媒露出面積の差に比例すると仮定して、方程式（５）に置換した（Ｈａｙｎｉｅ ＆ Ｆｒｉｅｒｅ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｅｔ．１６：１１５−１４０，（１９９３）；Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．４：２１３８−２１４８（１９９５））。
ＤＳＣおよびＡＮＳ−結合実験に由来する全てのｓｃＦｖについての熱安定性測定は比較可能であった。各ｓｃＦｖの折畳み解除は不可逆的であり；従って、凝集はＤＳＣまたはＡＮＳ−結合によって測定された絶対ＴＭに対して影響を有した。２つの技術が試料を異なってかつ異なる速度で加熱したので、ＴＭは実験フォーマットにわたって同一であると予測されなかった（Ｓaｎｃｈｅｚ−Ｒｕｉｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７：１６４８−１６５２，（１９８８））。しかしながら、各実験技術で観察された傾向は同一であった（表１３）。ＤＳＣ実験は、ＶＨおよびＶＬ折畳み解除転移の間を容易に区別した。ＡＮＳ−結合実験は２つの転移を正確に識別することはできなかた（すなわち、ＶＨ ｖｓ．ＶＬ折畳み解除）；かくして、見掛けのＴＭのみがＡＮＳ−結合実験で提供された。ＡＮＳ−結合によって観察された見掛けのＴＭが、ＤＳＣによって決定されるように、突然変異に依存してＶＨまたはＶＬいずれかを折畳み解除する最後のドメインのＴＭによく相関するように見えた。双方のアッセイフォーマットにおける折畳み解除された物質の凝集のため、ＴＭをガイドとして用いて、折畳み解除のｓｃＦｖ自由エネルギー等のさらなる解釈なくして各突然変異によって供された安定性増強をランク付けした。
表１３ 各ｓｃＦｖの熱安定性測定
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 ａこれらの特定の突然変異は単一の協働的ＶＨ／ＶＬ折畳み解除事象に導いた。
ｂ全ての引き続いてのｓｃＦｖは（Ｇ４Ｓ）＊４ ２０アミノ酸リンカーで構築した。
ｃ多重転移複雑化分析
ｄＶＨ ｖｓ．ＶＬを識別できず
まとめ
ライブラリースクリーニングから拾った全ての設計された単一突然変異：ＶＨＳ１６Ｅ、Ｓ１６Ｑ、Ｖ５５Ｇ、Ｐ１０１Ｄ、およびＶＬＳ４６Ｌは、ＶＨドメインを有意に安定化させ、いくつかの例においては、同様にＶＬドメインを有意に安定化させた（図５３）。安定化増強のためのこれらの位置のテストの背後の原理は、しばしば、分析の多数の形態に由来した。コンセンサス方法は、突然変異ＶＨＳ１６Ｅ、Ｓ１６Ｑ、Ｖ５５Ｇ、Ｐ１０１Ｄ、およびＶＬＳ４６Ｌの全てがＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを安定化させるであろうと予測した（実施例３）。しかしながら、ＶＨＶ５５ＧおよびＰ１０１Ｄ（ちなみに、２つの最も安定化性突然変異）は、各々、ＶＨのＣＤＲ２およびＣＤＲ３内に位置し、これらの２つの位置における突然変異が安定化事象に導くことができることを示唆したさらなる予測的証拠が蓄積するまで、突然変異誘発については考慮されなかった。ＶＨＶ５５ＧおよびＶＬＳ４６Ｌの双方もまた、共変動解析に基づいて安定化性であると予測された。最後に、ＶＨＰ１０１ＤおよびＶＬＳ４６Ｌは、高度に安定なヒト抗体の界面組成に基づいてＶＨ／ＶＬ界面に対して潜在的に安定化性であると予測された（実施例３）。
ＶＨ／ＶＬ界面における単一の突然変異が双方のドメインの安定性を増加させ、他方、界面の外側のＶＨ突然変異はＶＨドメインそれ自体を安定化させたに過ぎなかった。ＶＨＳ１６Ｅ、Ｓ１６Ｑ、およびＶ５５Ｇは界面の外側にあり、各々、ＢＨＡ１０ ＶＨの見掛けのＴＭを、各々、３、２および１１℃だけ増加させたに過ぎなかった。ＶＬ安定性はこれらの突然変異によって比較的影響されなかった。ＶＨＶ５５Ｇ突然変異は、ＶＬ安定性の検出可能な増加に導くことなく、ＶＨの安定性を増加させて、ＶＬドメインのそれにマッチするように見えた。界面における双方の突然変異、ＶＨＰ１０１ＤおよびＶＬＳ４６Ｌは、双方のドメインの安定性を有意に増加させた。Ｐ１０１Ｄ突然変異は、特に、ＶＨおよびＶＬドメインの十分に協働的な折畳み解除に導き、これは、ＶＨおよびＶＬの間の界面および折畳みの協働性は有意に強化されたことを示唆する。かくして、ＶＨ／ＶＬ界面における突然変異は、安定化されたＦｖ領域を形成する最も効果的な手段を提供することができ、Ｆｖ界面の外側の残基に向けられる設計よりもｓｃＦｖのＶＨ／ＶＬ界面に対する安定性設計を優先する原理を提供することができる。
ＶＨ突然変異を組合せると、結局は、ＶＨ／ＶＬ 折畳み解除の協働性の間の断絶に導いた（表１３）。ＶＨＴＭが７５℃を超えて上昇すると（ＶＨ突然変異の組合せの結果）、ＶＬのＴＭはより低い温度に向けて移動し始めた。これは、ＶＬドメイン内の補償突然変異における形成なくしてのＶＨドメインの超安定化は、減少した折畳み協働性、および２つのドメインの間の弱められた相互作用に導くことができる。（野生型ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖのＴＭを含めた）ＶＨおよびＶＬドメインのＴＭはしばしばかなり異なったが、２つのドメインの間の界面における突然変異は双方のドメインを同時に安定化するという証拠は、２つのドメインが相互とあるレベルで相互作用することを示唆するが、単離されたドメインの間の見掛けの親和性は、おそらくは、ＶＨＰ１０１Ｄ安定化変種におけるを除いて極端に高いと予測されない（Ｂｒａｎｄｔｓ ＆ Ｌｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９：６９２７−６９４０，（１９９０））。
ｓｃＦｖの安定性の増大は、雰囲気温度（１５℃、図５５）における疎水性蛍光色素ＡＮＳの減少した固有の結合に導いた。野生型ｓｃＦｖはＡＮＳに弱く結合し、これは、蛋白質が疎水性表面領域を溶媒に永久的にまたは一過的に暴露できることを示唆する。安定化されたｓｃＦｖは雰囲気条件下でＡＮＳに結合する能力を完全に失ったように見え−最も安定化されたｓｃＦｖの存在下におけるＡＮＳの蛍光は、溶媒中のＡＮＳ単独のそれ以下であった。１５℃における折畳まれた蛋白質の存在下での、（ＤＳＣまたは温度−依存性ＡＮＳ−結合実験によって測定された）ＶＨ＿ＴＭ ｖｓ．ＡＮＳ−蛍光のプロットは、ｓｃＦｖ安定性が増加するにつれて、ｓｃＦｖ−依存性ＡＮＳ蛍光が減少することを示した（図５５）。ｓｃＦｖ安定化によるＡＮＳ−結合の低下は、疎水性が低い表面領域が溶媒に露出されるようになり、安定化されたｓｃＦｖは凝集に対してより低い固有の傾向を有することができることを示すことができる。
種々の個々のおよび組合された安定化ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ突然変異のＫＤ測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００機器にて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて行った。表１３は、Ｂｉａｃｏｒｅアフィニティーアッセイの結果を示す。可変ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖの結合アフィニティーは、親ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖの１×ないし２．５×の範囲であった。
（実施例７）
安定化された二特異的「Ｈｅｒｃｕｌｅｓ」抗体の生産
慣用的ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖおよび本発明の安定化されたＢＨＡ１０ ｓｃＦｖの双方を用いて、「Ｈｅｒｃｕｌｅｓ」という二特異的抗体を構築した。Ｈｅｒｃｕｌｅｓ二特異的抗体は、ＬＴβＲに結合するＢＨＡ１０ ｓｃＦｖと共にＴＲＡＩＬ Ｒ２受容体に結合するキメラ１４Ａ２ ＩｇＧ抗体の融合を含む。Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体はＮ−末端およびＣ−末端ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ融合双方として組立てられた（図１３参照）。Ｎ−末端ｓｃＦｖ融合は、軽鎖および／または重鎖融合として作成することができる（各々、「ＮＬ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ」または「ＮＨ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ」）。いずれのアミノ末端Ｖ領域（重鎖または軽鎖）をｓｃＦｖを接合させるのに選択するかに関する決定は、第一に、Ｆａｂドメインの第二の標的抗原への結合に認識可能に干渉できずして、いずれの鎖が第一の標的抗原を認識することができる融合されたｓｃＦｖを許容すると考えられるかによって駆動される。
また、例えば、図４２ないし４９に示すように、抗体ヒンジ領域に、またはＣＨ２またはＣＨ３ドメインに直接的に融合した安定化されたｓｃＦｖのみからなる四価または二価抗体を作成するのに本発明に記載された方法を用いることが可能である。該抗体は全長Ｆｃ領域（例えば、図４６参照）、またはＣＨ２−ドメイン欠失Ｆｃ領域（例えば、図４２参照）を含むことができる。他の例示的な実験において、２以上の安定化されたｓｃＦｖドメインを重鎖または掲載の同一末端に融合させることができる（例えば、）図４３参照）。
Ａ．「ＮＨ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ」の、ＢＨＡ１０慣用的（Ｇ４Ｓ）４、ＶＨ４４：ＶＬ１００、およびＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ ｓｃＦｖでの構築
４つの抗−ＬＴβＲ（ＢＨＡ１０）ｘ抗−ＴＲＡＩＬ Ｒ２（ｃｈｉ１４Ａ２）二特異的抗体の設計は、抗−ＴＲＡＩＬ Ｒ２抗体重鎖のアミノ末端への慣用的および変種ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを付着させることに基づいた。実施例３に記載されたＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ ＤＮＡを用いて、表１４に記載されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ増幅によってＮＨ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ二特異的抗体を構築した。（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５リンカーを用いて、ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを、ｃｈｉ１４Ａ２重鎖成熟アミノ末端に連結させた。順方向５’ＶＨＰＣＲプライマー（ｓｃＦｖＢＨＡ１０−Ｆ１）は、クローニングのためのＭｌｕ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位（下線を施した配列）、続いての、重鎖シグナルペプチドの最後の３つのアミノ酸、およびＢＨＡ１０ ＶＨのアミノ末端をコードする配列を含む。逆方向３’ＰＣＲプライマーを用いて、ＢＨＡ１０ ＶＬのカルボキシル末端、続いての、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５リンカーをコードする内部逆方向プライマーＸＷＵ００５−Ｒ、およびクローニングのための部分的抗−ＴＲＡＩＬ Ｒ２ ＶＨ領域およびＢｇｌＩＩ部位（下線を施した配列）をコードする逆方向プライマーｓｃＦｖＢＨＡ１０−Ｒ１を持つＰＣＲ産物を生じさせた。
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 ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ＋（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５リンカー＋部分的抗−ＴＲＡＩＬ Ｒ２ ＶＨ遺伝子配列は、図１４Ａに示した（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５リンカーをコードする通常の重複配列を通じて２つの連続ＰＣＲ反応で増幅させて、プラスミドＤＮＡ ｐＸＷＵ０３４からの慣用的ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ、プラスミドｐＸＷＵ００２からのＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４、プラスミドｐＩＥＨ００６からのＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ ＶＨ４４：ＶＬ１００、およびプラスミドｐＩＥＨ００９からのＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４を調製した。増幅されたＢＨＡ１０ ｓｃＦｖのパネルからのＰＣＲ産物を、製造業者の指示（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に従って、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＤＡ抽出キットを用いるアガロースゲル電気泳動によって精製した。精製されたＰＣＲ産物をＭｌｕ Ｉ／ＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ｃｈｉｌ４Ａ２ ＩｇＧ１コーディング配列に存在する内部ＢｇｌＩＩ部位を除去するように従前に修飾されたｃｈｉｌ４Ａ２ ＩｇＧ１を含有するＭｌｕＩ／ＢｇｌＩＩ消化ｐＮ５ＫＧ１ベクターに連結した。哺乳動物発現ベクターｐＮ５ＫＧ１は、転写的に活性な統合事象について選択するための翻訳が損なわれた修飾された（イントロン−含有）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、およびメトトレキセートでの増幅を可能とするためのネズミジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を含有する（Ｂａｒｎｅｔｔ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．（Ｉｍａｎａｋａ，Ｈ．Ｙ．Ｗ．ａ．Ｔ．，ｅｄ），ｐｐ．２７−４０，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，（１９９５））を含有する。
構築体の得られたパネルは、２５アミノ酸（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５リンカーを介する抗−ＴＲＡＩＬ Ｒ２抗体ＶＨドメインのアミノ末端に対する変種ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖの融合蛋白質を形成する。慣用的ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ遺伝子配列の、抗−ＴＲＡＩＬ Ｒ２抗体重鎖遺伝子配列のアミノ末端への融合は、プラスミドｐＸＷＵ００５を生じた。ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４遺伝子配列の、抗−ＴＲＡＩＬ Ｒ２抗体重鎖遺伝子配列のアミノ末端への融合は、プラスミドｐＸＷＵ０２６を生じた。ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ ＶＨ４４：ＶＬ１００遺伝子配列の、抗−ＴＲＡＩＬ Ｒ２抗体重鎖遺伝子配列のアミノ末端への、ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ ＶＨ４４：ＶＬ１００遺伝子配列への融合は、プラスミドｐＸＷＵ０２７を生じた。ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ ＶＨ４４：ＶＬ１００（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４遺伝子配列の、抗−ＴＲＡＩＬ Ｒ２抗体重鎖遺伝子配列のアミノ末端への融合は、プラスミドｐＸＷＵ０２８を生じた。連結混合物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＴＯＰ １０コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を形質転換した。アンピシリン薬物耐性に対して形質転換されたＥ．ｃｏｌｉコロニーをインサートの存在についてスクリーニングした。ＤＮＡ配列分析は、最終構築体の正しい配列を確認した。
用いたキメラ１４Ａ２軽鎖は全てのＮ−およびＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ二特異的抗体の間で通常のものであり、ＤＮＡ（配列番号：２８）およびアミノ酸配列（配列番号：２９）を図１５Ａおよび１５Ｂに示す。キメラ１４Ａ２軽鎖は、以下のＤＮＡおよびアミノ酸配列：
Figure 0005374359
 を有するＮ−末端においてシグナルペプチドと共に発現される。
慣用的なＢＨＡ１０ ｃｓＦｖ ＮＨ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓについての重鎖ＤＮＡ（配列番号：３０）およびアミノ酸配列（配列番号：３１）を、各々、図１６および１７に示す。ＢＨＡ １０ｓｃＦｖ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ＮＨ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓについての重鎖ＤＮＡ（配列番号：３２）およびアミノ酸（配列番号：３３）配列を、各々、図１８および１９に示す。ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ ＶＨ４４：ＶＬ１００Ｎ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓについての重鎖ＤＮＡ（配列番号：３４）およびアミノ酸（配列番号：３５）配列を、各々、図２０および２１に示す。ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４Ｎ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓにつての重鎖ＤＮＡ（配列番号：３６）およびアミノ酸（配列番号：３７）配列を、各々、図２２および２３に示す。重鎖の各々を、以下のＤＮＡおよびアミノ酸配列：
Figure 0005374359
 を有するＮ−末端におけるシグナルペプチドと共に発現された。
Ｂ．ＢＨＡ１０慣用的（Ｇ４Ｓ）４，ＶＨ４４：ＶＬ１００、およびＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ｓｃＦｖでのＣ−ｓｃＦｖ「Ｈｅｒｃｕｌｅｓ」の構築
４つの抗−ＬＴβＲ（ＢＨＡ１０）ｘ抗−ＴＲＡＩＬ Ｒ２（ｃｈｉ１４Ａ２）二特異的抗体の設計は、慣用的および変種ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖの抗−ＴＲＡＩＬ Ｒ２抗体重鎖のカルボキシル末端への慣用的および変種ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖの付着に基づくものであった。実施例３に記載されたＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ ＤＮＡを用いて、表１５に記載されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ増幅によってＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ二特異的抗体のパネルを構築した。Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーを用いて、ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを、ｃｈｉ１４Ａ２重差のカルボキシル末端へ連結させた。順方向５’ＶＨ ＰＣＲプライマー（ＸＷＵ００６−Ｆ１）は、クローニングのためのＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（下線を施した配列）、続いて、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーペプチドの一部をコードする配列、およびＢＨＡ１０ ＶＨのアミノ末端を含む。逆方向３’ＶＬ ＰＣＲプライマー（ＸＷＵ００６−Ｒ１）はＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ軽鎖の起点となり、クローニングのための停止コドン、続いての、ＢａｍＨＩ部位（下線を施した配列）を含む。順方向５’内部重複ＰＣＲプライマー（ＸＷＵ００６−Ｆ２）は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーをコードする配列を含み、太文字タイプで示されるサイレント突然変異を含有する。逆方向３’末端重複ＰＣＲプライマー（ＸＷＵ００６−Ｒ２）は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーをコードする配列を含み、太文字タイプで示されるサイレント突然変異を含有して、ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカー領域に位置するＢａｍＨ Ｉ部位を除去する。
表１５ ＢＨＡ１０の慣用的（Ｇ４Ｓ）４，ＶＨ４４：ＶＬ１００，およびＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ｓｃＦｖでのＣ−ＨｅｒｃｕｌｅｓのＰＣＲ増幅のためのオリゴヌクレオチド
Figure 0005374359
 図１４Ｂに表されるように、ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ遺伝子配列は、５’ＶＨ ＸＷＵ００６−Ｆ１＋３’ＶＬ ＸＷＵ００６−Ｒ１ ＰＣＲプライマー組、およびＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ リンカー領域内のＢａｍＨＩ部位を排除するように設計された内部重複ＰＣＲプライマー（ＸＷＵ００６−Ｆ２およびＸＷＵ００６−Ｒ２）の組を用いて２−工程ＰＣＲ反応で増幅した。これらのＰＣＲ条件を用いて、プラスミドｐＸＷＵ０３４からの慣用的なＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ、プラスミドｐＸＷＵ００２からのＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４、プラスミドｐＩＥＨ００６からのＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ ＶＨ４４：ＶＬ１００、およびプラスミドｐＩＥＨ００９からのＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４を調製した。増幅されたＢＨＡ１０ ｓｃＦｖのパネルからのＰＣＲ産物を、製造業者の指示（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に従って、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＤＡ抽出キットを用いるアガロースゲル電気泳動によって精製した。精製したＰＣＲ産物をＢａｍＨ Ｉ制限エンドヌクレアーゼで消化し、いくつかの修飾を含有するように従前に設計されたｐＮ５ＫＧ１ベクターの単一ＢａｍＨＩ部位に連結した。簡単に述べると、ｃｈｉ１４Ａ２ ＩｇＧ１を含有するｐＮ５ＫＧ１ベクターを修飾して、重鎖遺伝子の３’末端における停止コドンを除去し、アミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙをコードするヌクレオチド、すぐに続いての、クローニングのための（Ｇｌｙ−Ｓｅｒをコードする）ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を導入した。最後に、ｃｈｉ１４Ａ２ ＶＬ領域における内部の望まないＢａｍＨ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位もやはり排除した。
構築体の得られたパネルは、１６アミノ酸Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーを通じての抗−ＴＲＡＩＬ Ｒ２抗体重鎖のカルボキシル末端に対する変種ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖの融合蛋白質を形成した。抗−ＴＲＡＩＬ Ｒ２抗体重鎖遺伝子配列のカルボキシル末端に対する慣用的ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ遺伝子配列の融合は、プラスミドｐＸＷＵ００６を生じた。抗−ＴＲＡＩＬ Ｒ２抗体重鎖遺伝子配列のカルボキシル末端へのＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ 遺伝子配列の融合は、プラスミドｐＸＷＵ０３４を生じた。抗−ＴＲＡＩＬ Ｒ２抗体重鎖遺伝子配列のカルボキシル末端へのＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ ＶＨ４４：ＶＬ１００遺伝子配列の融合は、プラスミドｐＸＷＵ０３５を生じた。抗−ＴＲＡＩＬ Ｒ２抗体重鎖遺伝子配列のカルボキシル末端へのＢＨＡ１０ ｓｃＦＶ ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４遺伝子配列の融合は、プラスミドｐＸＷＵ０３６を生じた。
連結混合物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＴＯＰ １０コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を形質転換した。アンピシリン薬物耐性に形質転換されたＥ．ｃｏｌｉコロニーをインサートの存在についてスクリーニングした。ＤＮＡ配列分析は、最終構築体の正しい配列を確認した。用いたキメラ１４Ａ軽鎖は全てのＮ−およびＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ二特異的抗体の間で通常のものであって、ＤＮＡおよびアミノ酸配列を図１５Ａおよび１５Ｂに示す。慣用的なＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓについての重鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列を、各々、図２４および２５に示す。ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓについての重鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列を、各々、図２６および２７に示す。ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ ＶＨ４４：ＶＬ１００ Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓについての重鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列を、各々、図２８および２９に示される。ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓについての重鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列は、各々、図３０および３１に示される。Ｃ−末端二特異的Ｈｅｒｃｕｌｅｓ構築体のまとめは表１６に見出される。
表１６ 「Ｈｅｒｃｕｌｅｓ」をコードする中間および発現プラスミド
Figure 0005374359
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 Ｃ．ＣＨＯ細胞における二特異的抗体の一過性発現
プラスミドＤＮＡ ｐＸＷＵ００５、ｐＸＷＵ０２６、ｐＸＷＵ０２７、ｐＸＷＵ０２８；およびｐＸＷＵ００６、ｐＸＷＵ０３４、ｐＸＷＵ０３５、およびｐＸＷＵ０３６（表１６）を用いて、抗体蛋白質の一過的生産のためにＣＨＯ ＤＧ４４細胞を形質転換した。各２０ｕｇのプラスミドＤＮＡを、０．４ＭＬの１ＸＰＢＳの用量中の４ｘ１０６細胞と合わせた。混同物を０．４ｃｍキュベット（ＢｉｏＲａｄ）に加え、氷上に１５分間置いた。細胞を、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒエレクトロポレーター（ＢｉｏＲａｄ）にて、６００ｕｆおよび３５０ボルトで電気泳動に付した。細胞を、Ｔ−２５フラスコ中の１００ｕＭヒポキサンチンおよび１６ｕＭチミジンを含有するＣＨＯ−ＳＳＦＭ ＩＩ培地に入れ、３７°で４日間インキュベートした。
一過的ＣＨＯ発現系によって生産されたＨｅｒｃｕｌｅｓ蛋白質を含有する上清を含有するウェスタンブロットによって評価した。図３２は、ＶＨ４４：ＶＬ１００（ｄｓ＝ジスルフィド）またはＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカー安定化ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖいずれかを含有するＨｅｒｃｕｌｅｓ抗体が、ｓｃＦｖがＮＨ−またはＣ−末端に融合したか否かとは独立して、改良された発現収率を劇的に改良したことを示す（レーン３、４、７、８）。驚くべきことに、野生型ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖまたは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ Ｎ−末端融合で分泌された蛋白質は検出されず、これは、発現に対するｓｃＦｖ安定化の利益を示す（レーン６および７）。加えて、慣用的なＢＨＡ１０ ｓｃＦｖおよび（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ Ｃ−末端融合は、安定化された構築体が実質的に低下した有意な量の〜５５ないし６０分子量副産物を呈し、これは、ｓｃＦｖ安定化が産物の品質を改良できることを示唆する。
Ｄ．二特異的結合ＥＬＩＳＡアッセイ
上清を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、組換えにより生産されたＴＲＡＩＬ Ｒ２およびＬＴβＲ受容体に対する個々の結合活性についてテストした。双方のアッセイにおいて、受容体をプレートに固定化し、テスト試料をインキュベートして受容体に対する結合を許した。結合した試料を標識された抗体で検出した。
９６−ウェルマイクロタイターＩｍｍｕｌｏｎ ＩＩプレート（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ＃１４２４５−６１）を、Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３緩衝液ｐＨ９．５中の１００μｌ／ウェルの２μｇ／ｍｌ ＬＴβＲ−Ｉｇで４℃にて一晩被覆し、２００μｌの希釈緩衝液（ＰＢＳ中の０．５％無脂肪乾燥μ＋０．０１％チメロザール）で３７℃にて１時間ブロックした。次の工程において、希釈緩衝液中の１００μｌの個々の「Ｈｅｒｃｕｌｅｓ」上清、または精製された蛋白質を二連のウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。水道水で洗浄した後、１００μｌの１００ｎｇ／ｍｌ ＴＲＡＩＬ−Ｒ２ Ｆｃ ６Ｘ−Ｈｉｓタグド融合蛋白質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）をウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄の後、１００μｌの、Ｐｅｎｐａ−Ｈｉｓ ＨＲＰコンジュゲート（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃａｔ＃３４４６０）の１／２０００希釈を各ウェルに加え、３７℃にて１時間インキュベートした。洗浄の後、１００μｌ／ウェルのＨｒｐｏ基質組合せＴＭＢペルオキシダーゼ基質／ペルオキシダーゼ溶液Ｂ（Ｋｉｒｄｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｓ，Ｃａｔ．５０−７６−００）を加えた。反応を５ないし１０分後に１００μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４で停止させた。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダーを用い、ＯＤを４５０ｎｍおよび５４０ｎｍで測定し、結合曲線を作成した。
図３３および３４は、ＶＨ４４：ＶＬ１００（ＤＳ＝ジスルフィド）またはＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカー安定化ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖいずれかを含有するＮ−末端（図３３Ａ、３４Ａ）およびＣ−末端（図３３Ｂ、３４Ｂ）Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体の双方が、慣用的なＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ（ｗｔ）を含有するＨｅｒｃｕｌｅｓと比較して、各々、ＬＴβＲ（図３３）およびＴＲＡＩＬ Ｒ２（図３４）に対する改良された結合を示すことを示す。
Ｅ．ＣＨＯ細胞における二特異的抗体の安定な発現、抗体精製および特徴付け
プラスミドＤＮＡ ｐＸＷＵ０２７、ｐＸＷＵ０２８、およびｐＸＷＵ００６、ｐＸＷＵ０３５およびｐＸＷＵ０３６（表１６）を用いて、抗体蛋白質の安定な生産のためにＤＨＦＲ−欠乏ＣＨＯ ＤＧ４４細胞を形質転換した。１０％透析胎児ウシ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を補足した２ｍＭグルタミンを含有するアルファマイナスＭＥＭ培地中でトランスフェクトされた細胞を成長させ、蛍光標識抗体および反復蛍光−活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）（Ｂｒｅｚｉｎｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２７７（１−２）：１４１−５５（２００３））を用いて安定なバルク培養プールとして豊富化させた。また、ＦＡＣＳを用いて、個々の細胞を生じさせた。細胞プールまたは細胞系を無血清条件に適合させ、抗体生産を測った。
１）ＶＨ４４：ＶＬ１００で安定化ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えたＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、２）ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカー安定化ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えたＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓを発現するトランスフェクトされたＣＨＯ細胞プールまたは細胞系、ならびに３）ＶＨ４４：ＶＬ１００安定化ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えたＮ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、および４）ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカー安定化ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えたＮ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓを発現するクローンＣＨＯ細胞系からの上清を集め、ＰＢＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ実行緩衝液を用いるプロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（６ｍＬ）カラムを用いて精製した。０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０を用いてＨｅｒｃｕｌｅｓ蛋白質を溶出させ、Ｔｒｉｓ塩基を用いて直ちにｐＨ７．５ないし８．５まで中和した。加えて、慣用的なＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを含有するＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓを発現させ、比較のためにプロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。慣用的なＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを含有するＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＶＨ４４：ＶＬ１００ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えたＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、およびＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えたＣ−末端ＨｅｒｃｕｌｅｓからのプロテインＡ溶出物を、分析サイズ排除クロマトグラフィーによって凝集体の存在について知られた（図３５）。慣用的なＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを含有するＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓのクロマトグラムプロフィールは、〜４０％凝集体を示した。対照的に、ＶＨ４４：ＶＬ１００ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えたＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓは凝集体レベルを２０％まで低下させ、ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えたＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓを通じて達成されたさらなる安定化は、凝集体のレベルを１０％まで低下させた。凝集のレベルは、ｓｃＦｖの特性に依存するように見え、それが１４Ａ２ ＩｇＧのＮＨ−またはＣ−末端に付着しているかには依存しないようであった（データは示さず）。プロテインＡ Ｈｅｒｃｕｌｅｓ溶出物を、０．１Ｍ酢酸塩ｐＨ５．０への透析、および透析物として同一の実行緩衝液を用いるＭｏｎｏＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カチオン交換クロマトグラフィーによる精製によってさらに精製した。Ｈｅｒｃｕｌｅｓ蛋白質は、０．１Ｍ酢酸塩ｐＨ５．０、０．５Ｍ ＮａＣｌへの段階グラジエントを用いて溶出させた。ＭｏｎｏＳ溶出物を集め、ＴｏｓｏＨａａｓ分取ＳＥＣカラムを通して、凝集体を除去した。
図３６Ａおよび３６Ｂは、各々、ＶＨ４４：ＶＬ１００安定化ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えた精製されたＮ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、およびＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカー安定化ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えたＮＨ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、およびＶＨ４４：ＶＬ１００安定化ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えたＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、およびＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカー安定化ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えたＣ−末端ＨｅｒｃｕｌｅｓのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。低下したレーンは、重鎖および軽鎖蛋白質の予測されるサイズを示す。重要なことには、しばしば、野生型ｓｃＦｖドメインを含有するＨｅｒｃｕｌｅｓで観察された有意なレベルの分解したまたは望まないより低い分子量の副産物はない。
図３７（パネルＡおよびＣ）は、初期プロテインＡ精製工程に引き続いて、各々、ＶＨ４４：ＶＬ１００安定化ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えたＮＨ−末端ＨｅｒｃｕｌｅｓおよびＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカー安定化ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えたＮＨ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓの分析ＳＥＣ溶出プロフィールを示す。図３７（パネルＢおよびＤ）もまた、残存非−モノマー蛋白質汚染物の分取ＳＥＣ除去に続いて、各々、ＶＨ４４：ＶＬ１００安定化ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えたＮＨ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、およびＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカー安定化ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えたＮＨ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓの分析ＳＥＣ溶出プロフィールを示す。同様に、図３８（パネルＡおよびＣ）は、初期プロテインＡ精製工程に引き続いて、各々、ＶＨ４４：ＶＬ１００安定化ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えたＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、およびＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカー安定化ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えたＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓの分析ＳＥＣ溶出プロフィールを示す。図３８（パネルＢおよびＤ）は、残存非―モノマー蛋白質汚染物の分取ＳＥＣ除去に続いて、各々、ＶＨ４４：ＶＬ１００安定化ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えたＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、およびＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカー安定化ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えたＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓの分析ＳＥＣ溶出プロフィールを示す。これらの実験は、ＶＨ４４：ＶＬ１００ジスルフィドまたはＶＨ４４：ＶＬ１００ジスルフィドおよび（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーいずれかの添加によるＢＨＡ１０ ｓｃＦｖの安定化の結果、より高いオーダーの分子量種を実質的に含まない＞９８％純粋なモノマーＨｅｒｃｕｌｅｓ二特異的抗体の分取量がもたらされることを示す。
同一条件下で行ったＤＳＣ実験は、Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖが、慣用的なＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを含有するＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓよりも熱安定性であることを示す（図３９）。慣用的なＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを含有するＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓについての変性プロフィールは、Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖで観察されたプロフィールよりも〜５℃低い温度で開始する。これらの結果は、ｓｃＦｖがＨｅｒｃｕｌｅｓ分子の全熱安定性を制限できることを示唆する。これは、慣用的なＢＨＡ１０ ｓｃＦｖのそれに対してＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖついての５℃ ＴＭ観察増加に相関する。
次いで、安定化されたＨｅｒｃｕｌｅｓ構築体の精製されたバージョンを、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、組換えにより生産されたＴＲＡＩＬ−Ｒ２およびＬＴβＲ受容体に対する二特異的結合活性についてテストした。このアッセイにおいて、ＬＴβＲ Ｉｇ受容体をプレートに固定化し、次いでテスト試料をインキュベートして、受容体に対する結合を行った。未結合試料は洗浄、続いての、ＴＲＡＩＬ Ｒ２−（Ｈｉｓ）６での第二のインキュベーション工程によって除去した。洗浄工程に続き、二重結合複合体を標識された抗−（Ｈｉｓ）６抗体に検出した。この実験の結果、および各構築体の有効濃度（ＥＣ５０、μ／ｍｌで表す）を図４０に示す。図４０は、ＶＨ４４：ＶＬ１００（ｄｓ＝ジスルフィド）またはＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカー安定化ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖいずれかを備えたＮ−末端およびＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体は共にＬＴβＲおよびＴＲＡＩＬ Ｒ２の双方への明瞭な二特異的結合を示す。ＬＴβＲ―結合抗体（ＣＢＥ１１）の多価（ペンタマー）バージョンを対照として用いて、ＬＴβＲ単独の単一の認識は結合アッセイにおいてシグナルを生じないことを示した。
（実施例８）
ＣＨＯ細胞における安定化された二特異的（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）抗体の大規模生産
プラスミドＤＮＡ ｐＸＷＵ０２８およびｐＸＷＵ０３６で安定にトランスフェクトされたＤＨＦＲ−欠乏ＣＨＯ細胞系（表１６）をスクリーニングして、本発明の方法を用いて安定かされた高レベルの安定化されかつ適切に折畳まれたＨｅｒｃｕｌｅｓ分子を発現することができる単一細胞単離体について選択した。該細胞スクリーニング方法は、Ｂｒｅｚｉｎｋｙ ｅｔ ａｌ．（Ｂｒｅｚｉｎｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ（２００３）．２７７；１４１−１５５）の蛍光−活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析を使用した。簡単に述べると、蛍光タグド抗−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体を用いて、それらの表面にＨｅｒｃｕｌｅｓ抗体の一過性発現を呈するＣＨＯ細胞を標識した。次いで、細胞ソーター装置のゲーティングをそのシグニチャーに対して仕立てることによって、シグニチャー蛍光強度を呈する細胞を選択した。高レベルの生産性を呈する単一細胞を、それにより、選択し、安定なプロデューサー細胞系を確立するために無血清条件に適合させた。プロデューサー細胞系を、引き続いて、二特異的抗体蛋白質の生産および精製のためにスケールアップした。
１１日バイオリアクター実行からのＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ（ＸＷＵ０２８）上清を含有する８０ＬのＮ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓを収穫し、限外濾過によって予め清澄化させた。プロテインＡクロマトグラフィーによって二特異的抗体を捕獲し、１２１８ｍｌ容量で溶出させた。アニオン交換クロマトグラフィー、続いての、分取用サイズ排除クロマトグラフィーによって、プロテインＡ画分を２つの別々のバッチにさらに精製した。第一のバッチは９８．９％純度および０．１３ＥＵ／ｍｇのエンドトキシン負荷と共にＰＢＳ中４．８５ｍｇ／ｍｌの濃度において８２５．５ｍｇを生じた。第二のバッチは、９９．１％の純度および２．３７ＥＵ／ｍｇのエンドトキシン負荷にて１０．３ｍｇ／ｍｌの濃度で３１８ｍｇを生じた。ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを含有する合計１１４３．５ｍｇの高度に精製されたモノマーＮ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓを回収した。
１１日バイオリアクター実行からのＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ（ＸＷＵ０３６）を含有する２４ＬのＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓを収穫し、限外濾過によって予め清澄化した。二特異的抗体を、粗生成物を捕獲するためのプロテインＡクロマトグラフィー、続いて、アニオン交換クロマトグラフィーおよび分取用サイズ排除クロマトグラフィーを用いて前記したように２つの別々のバッチに精製した。第一のバッチは、９８．５％純度および０．０１ＥＵ／ｍｇエンドトキシン負荷にて１３ｍｇ／ｍｌの濃度で９８５．５ｍｇを生じた。９９％の純度および１．９１ＥＵ／ｍｇエンドトキシン負荷にて１１．４２ｍｇ／ｍｌの濃度で５７０ｍｇを生じた。ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを含有する合計１５５５．５ｍｇの高度に精製されたモノマーＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓを回収した。
ＸＷＵ０５４二特異的抗体を生産するＣＨＯ細胞系を単離し、それは２１．５ｍｇ／Ｌを生産することが判明した。これは、増幅されていないＣＨＯ細胞系の研究グレードについての予測される範囲内にあり、もし我々が細胞系の生産を生じさせるとすれば、我々はより高い生産性を予測するであろう。
これらの大規模生産実験は増幅されていないＣＨＯ細胞系で行い、生物物理学的に安定な二特異的抗体の、１ｍｇを超える高い品質の収率を生じた。恐らくは、細胞系増幅戦略は、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞系の細胞生産性を多いに増強させ、商業的な適用に適したプロセスの開発を可能とする。これらの実験は、製造に適した細胞系（例えば、ＣＨＯ）における安定な二特異的抗体の大規模生産を可能とするための本発明に記載された方法の利用性を例示する。
（実施例９）
二特異的「Ｈｅｒｃｕｌｅｓ」抗体の生物学的活性
腫瘍細胞系ＷｉＤｒ、（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２１８）ヒト結腸癌腫細胞系、Ｍｅ１８０、（ＡＴＣＣ ＨＴＢ ３３）ヒト頸部上皮癌腫細胞系、およびＭＤＡ２３１、（Ｄｒ．Ｄａｊｕｎ Ｙａｎｇ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ）ヒト乳癌腫細胞系を、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１×非−必須アミノ酸０．５ｍＭピルビン酸ナトリウム、およびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＭＥＭ−Ｅａｒｌｅｓ中で培養した。腫瘍培養系をＰＢＳで１回濯ぎ、トリプシンでの消化によって細胞を放出させた。細胞を遠心によって集め、完全培地中に再懸濁させ、カウントし、９６−ウェル組織培養プレートをＷｉＤｒおよびＭｅ１８０について５０００細胞／ウェルで蒔き、ＭＤＡ２３１については１５００細胞／ウェルで蒔いた。ヒトＩＦＮγ（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ，Ｃｏｒｐ）を細胞懸濁液に加えて、ＷｉＤｒについては８０Ｕ／ｍｌおよびＭｅ１８０については５０Ｕ／ｍｌの最終サイトカイン濃度が得られた。５０μｌの腫瘍細胞／ＩＦＮγ懸濁液を、完全培地中に調製されたテスト抗体の５０μｌの２×濃縮３倍系列希釈と混同した。テスト抗体の最終濃度は、典型的には、５０００ｐＭないし０．０７ｐＭの範囲であった。細胞を、５％ＣＯ２湿潤チャンバー中で３７℃にて４日間（ＷｉＤｒ＆Ｍｅ１８０）または３日間（ＭＤＡ２３１）成長させ、細胞死滅を、２０μＬ／ウェルＰｒｏｍｅｇａ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の添加によって評価した。プレートを４９０ｎＭにてマイクロタイタープレートリダーで読んだ（Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘ Ｐｌｕｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）。データを、Ｍｉｃｒｏ Ｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｉｎｃ，ＷＡ）を用いてグラフ化した。
これらの実験からの結果を図４１Ａないし４１Ｄに示す。図４１Ａは、１４Ａ２ ＩｇＧ抗体はＷｉＤｒ腫瘍細胞の成長阻害において中程度の活性を有し、ＢＨＡ１０ ＩｇＧと組合せて、ＢＨＡ１０ ＩｇＧ単独と比較して抗−腫瘍細胞活性のわずかな増加を呈した。対照的に、二特異的Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体の双方はＷｉＤｒ細胞の増強された腫瘍細胞殺傷を示した。図４１Ｂは、１４Ａ２ ＩｇＧおよびＢＨＡ１０ ＩｇＧ抗体の双方が、もし無視できないならば、単一の剤として、または組合せて、Ｍｅ１８０腫瘍細胞の成長の阻害において中程度の活性を有したことを示す。対照的に、二特異的Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体の双方は、Ｍｅ１８０細胞の腫瘍細胞殺傷を示した。図４１Ｃは、１４Ａ２ ＩｇＧおよびＢＨＡ１０ ＩｇＧ抗体の双方は、単一の剤としてＭＤＡ２３１腫瘍細胞の成長を阻害するにおいて無視できる活性、および恐らくは、組合せて用いる場合にいくらかの活性を有したことを示す。対照的に、二特異的Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体ＸＷＵ０３６（ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカー安定化ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えたＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）はＭＤＡ２３１細胞の腫瘍細胞殺傷を示した。図４１Ｄは、抗体のいずれも、対照培養ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対するいずれの活性も示さないことを示し、これは、二特異的抗体の細胞殺傷活性が差がなくはないことを示す。ＨＵＶＥＣは、ＦＡＣＳ分析（データは示さず）によるＬＴβＲおよびＴＲＡＩＬ−Ｒ２についての陽性染色を示すことを示し、これは、受容体の存在を示し、および二特異的抗体の活性は腫瘍細胞におけるトリガリング特異的またはユニーク経路成分に依存し得ることを示す。
（実施例１０）
二特異的「Ｈｅｒｃｕｌｅｓ」抗体の安定性実験
２ないし８℃にて３ヶ月間貯蔵したＮ−およびＣ−末端二特異的抗体試料ＸＷＵ０２８（ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ Ｎ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）およびＸＷＵ０３６（ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）のリアルタイム安定性実験を行った。蛋白質の品質を（１）凝集、（２）沈殿、（３）ポリペプチド切断または蛋白質分解、および（４）脱アミド化または酸化のような翻訳後修飾について評価した。
該実験で用いた高および低濃度Ｎ−およびＣ−末端二特異的抗体試料は１．８ｍｇ／ｍＬ（低）および１０．３ｍｇ／ｍＬ（高）におけるＸＷＵ０２８、および５．０ｍｇ／ｍＬ（低）および１１．４ｍｇ／ｍＬ（高）におけるＸＷＵ０３６であった。抗体をＰＢＳ中に処方した。安定性実験では、初期（Ｔ＝０）、中間（Ｔ＝１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月）および最終（Ｔ＝３ヶ月）の時点の試料を、資料収集に続いて直ちに分析した。加えて、初期（Ｔ＝０）試料を冷凍し、３ヶ月実験の最後の第二の分析のために解凍するまで−７０℃で貯蔵した。ＢＨＡ１０ ＩｇＧ（８．７ｍｇ／ｍＬ）を対照として用い、同様に取り扱った。
Ａ．蛋白質凝集および沈殿分析
蛋白質凝集または沈殿をインライン光散乱および屈折率ディテクター（各々、（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＭｉｎｉＤａｗｎ ａｎｄ ｒＥＸ）に連結された分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いてモニターした。ＳＥＣ／光散乱分析は、凝集、または沈殿を通じて起こるかもしれない物質喪失の証拠を示さなかった。ＸＷＵ０２８、ＸＷＵ０３６、およびＢＨＡ１０についての初期Ｔ＝０、および最終Ｔ＝３ヶ月の時点のＳＥＣ溶出プロフィールはほとんど同一であった（各々図５６Ａ、５６Ｂ、および５６Ｃ）。ＸＷＵ０２８およびＸＷＵ０３６試料は、共に、実験の完了までに〜１％凝集物質を蓄積し；しかしながら、これらの凝集体の検出はこの方法で決定された検出の下方限界近かった（表１７）。凝集体形成は蛋白質濃度と独立していた。光散乱検出を用いて決定された分子質量に基づき、テスト試料中の低レベルの凝集体は、ダイマーに変換されるモノマー種の産物のようである可能性がある。二特異的抗体試料ＸＷＵ０２８またはＸＷＵ０３６のいずれも検出可能なレベルも高次凝集体を蓄積しなかったが、このタイプの凝集体はこれらの方法を用いて容易に観察されていた。ＢＨＡ１０抗体は、実験の３ヶ月の経過に渡って凝集体の増加を示さなかった（表１７）。
表１７ 分析サイズ排除クロマトグラフィーを用いて検出されたパーセントモノマー
Figure 0005374359
Figure 0005374359
 Ｂ．蛋白質分解および翻訳後修飾分析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）無傷質量分析（エレクトロスプレイ界面を介してＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＬＣシステムにカップリングされた（Ａｇｉｌｅｎｔ ＬＣ／ＭＳＤ ＴＯＦ）を用いて蛋白質分解をモニターした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析については、５ｕｇの蛋白質をレーンあたりに負荷した。還元された試料を、５％β―メルカプトエタノールを含有する１×Ｔｒｉｓグリシン試料緩衝液中で調製した。ＸＷＵ０２８およびＸＷＵ０３６は、非−還元および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって決定して、２ないし８℃の３ヶ月間貯蔵期間に渡って蛋白質分解の証拠を示さなかった（図５７ＡおよびＢ）。同様に、ＸＷＵ０２８およびＸＷＵ０３６は、ＬＣ／ＭＳ分析によって決定して２ないし８℃の３ヶ月貯蔵期間に渡るより低い分子量の蛋白質分解産物の証拠を示さなかった（図５８）。
翻訳後修飾をＬＣ／ＭＳを用いてモニターした。Ｔ＝０、Ｔ＝１ヶ月、およびＴ−３ヶ月の試料を非−還元および還元形態双方で分析した。還元された試料を、５０ｍＭ ＤＴＴ／４Ｍグアニジン塩酸塩中で３７℃にて１時間処理することによって調製した。ＨＰＬＣ緩衝液Ａは水中の０．０３％ＴＦＡよりなり、ＨＰＬＣ緩衝液Ｂはアセトニトリル中の０．０２５％ＴＦＡを含有する。流速を分当たり１００μｌにて一定に保った。７．５μｇの各試料（還元および非−還元）を２．１ｘ５０ｍｍ Ｃ４カラムに注入し、Ａｇｉｌｅｎｔ ＥＳＩ−ＴＯＦによって分析した。結合−および−溶出方法を非−還元試料で用い、他方、グラジエント方法を還元された試料で用いた。スペクトルをＡｎａｌｙｓｔを用いて入手し、機器に含まれたＭａｘＥｎｔ１ソフトウェアパッケージを用いてデコンボリュートした。Ｔ＝０、Ｔ＝１ヶ月およびＴ＝３ヶ月におけるＸＷＵ００２８およびＸＷＵ０３６（高濃度）のデコンボリュートされたマススペクトルを図５８に示す。ＸＷＵ０２８またはＸＷＵ０３６のいずれも、それらのマススペクトルにおいていずれの検出可能な変化も示さず、これは、二特異的抗体機能または安定性に潜在的に悪影響し得る翻訳後修飾の不存在を示す。
一緒にするとデータは、安定化されたｓｃＦｖドメインを含有するＮ−およびＣ−末端二特異的抗体が、生物学的薬物産物に必要なもののような延長された貯蔵条件下で安定であることを示す。これらの結果は特に刺激的である。何故ならば、これらの安定性実験は、単純な緩衝液（ＰＢＳ）中で調製されたＮ−およびＣ−末端二特異的抗体で行い、最適な処方で調製された溶液で行ったのではないからである。
（実施例１１）
二特異的「Ｈｅｒｃｕｌｅｓ」抗体のイン・ビボファルマコキネティック活性および血清中安定性
リン酸−干渉化生理食塩水ＰＢＳ中に希釈された１０ｍｇ／ｋｇ（１ｍｇ／ｍｌ）のＮ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（ＸＷＵ０２８）またはＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（ＸＷＵ０３６）の単一ボーラス注射を雄ＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスに腹腔内投与した。各二特異的抗体について、時点当たり３匹のマウスを用いて、マウスを注射から０、０．５、６、２４、４８、７２、９６、１６８、２４０および３３６時間後に犠牲にした。血清中試料をＥＬＩＳＡアッセイによる分析のために調製して、二特異的抗体のレベルを定量した。ＥＬＩＳＡプレートをヤギ−抗−ヒトＩｇＧで被覆し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡでブロックし、二特異的抗体を含有する血清の希釈物でＰＢＳ／１％ＢＳＡに系列的に希釈し、プレートに加え、インキュベートした。区画された抗体をヤギ−抗−ヒトカッパー鎖−ＨＲＰ−連結抗体で検出した。ファルマコキネティック実験の結果を表１８に示す。Ｎ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（ＸＷＵ０２８）は１０．３日の排除半減期（ｔ１／２）を有し、ピーク血清中濃度は７５．６７μｇ／ｍｌであった。Ｃ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（ＸＷＵ０３６）は１５．１日のより長い排除半減期（ｔ１／２）を有し、ピーク血清中濃度は１０５．６７μｇ／ｍｌであった。双方の分子は、同様な分布の容量（Ｖｄ）を有したが、これらの値は生物学的利用性のために調整しなかった。
表１８ ファルマコキネティックパラメーター
Figure 0005374359
 血清中試料もまた、実施例７に記載された二特異的結合をＥＬＩＳＡで分析した。このアッセイにおいて、前記したＮ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（ＸＷＵ０２８）またはＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（ＸＷＵ０３６）を含有する血清試料を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、組換えにより生産されたＴＲＡＩＬ−Ｒ２およびＬＴβＲ受容体に対する二特異的結合活性についてテストした。図５９ＡおよびＢは、Ｎ−およびＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ処理マウスからの血清試料が、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２およびＬＴβＲの双方に二特異的に結合する抗体を含有し、ＰＫ実験から観察された排除プロフィールと密接に並行することを示し、これは、二特異的抗体が延長された期間の間、生理学的条件下で無傷のままであることを示す。
（実施例１２）
二特異的「Ｈｅｒｃｕｌｅｓ」抗体のイン・ビボ生物学的活性
（Ａ）結腸癌腫瘍モデルにおける二特異的「Ｈｅｒｃｕｌｅｓ」抗体のイン・ビボ生物学的活性
ＷｉＤｒヒト結腸癌腫マウス当たり２×１０Ｅ６細胞）細胞を、１２５匹の無胸腺ヌードマウスに皮下移植した。腫瘍をそれがほぼ１００ｍｇに到達するまで成長させ、その時点において、合計７０匹のマウスを実験のために選択し、１０匹のマウスの７つの群に分割した。ＩＰ処理を投与し、以下のように移植後１３日に開始した：群１＝パイロジェンフリーＰＢＳ；群２＝ＣＢＥ１１、２ｍｇ／ｋｇ、１×／ｗｋ；群３＝ｈＢＨＡ１０、２ｍｇ／ｋｇ、２×／ｗｋ；群４＝ｃｈ１４Ａ２、２ｍｇ／ｋｇ、２×／ｗｋ；群５＝Ｈｅｒｃｕｌｅｓ−ＩＩ ＸＷＵ０２８、２ｍｇ／ｋｇ、１×／ｗｋ；群６＝Ｈｅｒｃｕｌｅｓ−ＩＩ ＸＷＵ０３６、２ｍｇ／ｋｇ、１×／ｗｋ；群７＝ｈＢＨＡ１０＋ｃｈ１４Ａ２、各々１ｍｇ／ｋｇ、２×／ｗｋ。腫瘍のサイズおよび体重を毎２週間記録した。ビークル群の平均腫瘍サイズがほぼ２０００ｍｇに到達した場合に実験を停止した。腫瘍容量は式：（Ｌ×Ｗ２／２）を用いて計算したＸＷＵ００２８およびＸＷＵ０３６で処理したマウスの暫定的分析はＰＢＳビークル対照と比較して双方の二特異的抗体について有意な抗−腫瘍活性（ｐ＜０．００１）を示した（図６０）。
ＸＷＵ０２８については、単一ｈＢＨＡ１０またはｃｈ１４Ａ２ Ｍａｂ処理での応答と比較して、有意な抗−腫瘍応答（ｐ＜０．０５）が観察された。ＸＷＵ０３６については、ｃｈ１４Ａ２ ｍＡｂ処理での応答と比較して有意な抗−腫瘍応答（ｐ＜０．０５）が観察され、顕著には、ｈＢＨＡ１０ ｍＡｂと比較してより大きな有意な応答（ｐ＜０．０１）が観察された。重要なことには、二特異的抗体は、週当たり一回のみ投与したが優れたイン・ビボ抗−腫瘍活性を示し、これは、本発明に記載された安定性増強の結果、生理学的条件下で改良された抗体特定および物理的安定性をもたらすことを示唆する。
（Ｂ）乳癌腫瘍モデルにおける二特異的「Ｈｅｒｃｕｌｅｓ」抗体のイン・ビボ生物学的活性
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌腫細胞を、１３５匹の無胸腺ヌードマウス（マウスあたり２×１０Ｅ６細胞）を皮下移植した。腫瘍を１３日まで成長させ、その時点で、ほぼ１６８ｍｇの平均サイズを持つ７５匹の腫瘍−担持マウスに処理（Ｎ＝１０）およびビークル対照（Ｎ＝１５）群に割り当てた。マウスは１３日に出発して抗体およびビークルＩＰを受けた。例示的な群を以下に示す：群１＝パイロジェンフリーＰＢＳ；１×／ｗｋ；群２＝ｈＢＨＡ１０、２ｍｇ／ｋｇ、２×／ｗｋ；群３＝ｃｈ１４Ａ２、２ｍｇ／ｋｇ、２×／ｗｋ；群４＝Ｈｅｒｃｕｌｅｓ−ＩＩ ＸＷＵ０３６、２ｍｇ／ｋｇ、２×／ｗｋ；群３＝ｃｈ１４Ａ２、２ｍｇ／ｋｇ、２×／ｗｋ；群４＝Ｈｅｒｃｕｌｅｓ−ＩＩ ＸＷＵ０３６、２ｍｇ／ｋｇ、１×／ｗｋ；群５＝ｈＢＨＡ１０＋ｃｈ１４Ａ２、各々１ｍｇ／ｋｇ、２×／ｗｋ。腫瘍のサイズおよび体重は毎２週間ごとに記録した。ビークル群の平均腫瘍サイズがほぼ２８００ｍｇに到達した場合に、実験を停止した。式：（ＬｘＷ２／２）を用いて腫瘍容量を計算した。ＸＷＵ０３６は、ｈＢＨＡ１０またはｃｈ１４Ａ２ ｍＡｂでの単一処理いずれかと、あるいは２つの抗体の混合物での処理と比較して、統計学的に有意な（ｐ＜０．００１）抗−腫瘍活性を示した。重要なことには、二特異的抗体ＸＷＵ０３６は、週投与スケジュールあたり１回でイン・ビボ投与される良好な抗−腫瘍活性を示し、これは、本発明に記載された安定性増強の結果、生理学的条件下で改良された抗体特性および物理学的安定性をもたらすことを示唆する（図８６参照）。
（実施例１３）
非−共有結合安定化性ｓｃＦｖ突然変異を含有する安定化された二特異的「Ｈｅｒｃｕｌｅｓ」抗体の生産
単独で、およびＶＨ４４：ＶＬ１００ジスルフィド結合と組合せて非−共有結合安定化性突然変異を含有する本発明のＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを用いて、ＴＲＡＩＬ Ｒ２受容体に結合するキメラ１４Ａ２ ＩｇＧ抗体と、ＬＴβＲに結合するＢＨＡ１０ ｓｃＦｖとの融合を含む安定化された二特異的Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体を構築した。二特異的抗体は、実施例７に実質的に記載された方法を用いてＣ−末端ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ融合として構築した。
Ａ．ＢＨＡ１０ ＶＨＳ１６Ｅ＋ＶＬＳ４６ＬおよびＶＨ４４−ＶＬ１００／ＶＨＳ１６Ｅ＋ＶＬＳ４６Ｌ ｓｃＦＶを持つＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ二特異的抗体の構築
ＰＣＲを用いて、表１９に記載されたオリゴヌクレオチドプライマーを用い、各々、ＢＨＡ１０ ＶＨＳ１６Ｅ＋ＶＬＳ４６ＬおよびＶＨ４４−ＶＬ１００／ＶＨＳ１６Ｅ＋ＶＬＳ４６Ｌ ｓｃＦＶを含有する、プラスミドＤＮＡ ｐＩＥＨ−０５０（高発現プラスミドｐＩＥＨ０７６の親プラスミド）およびｐＩＥＨ−０５２（高発現プラスミドｐＩＥＨ０８０の親プラスミド）からの変種ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ遺伝子断片を増幅した。変種ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ遺伝子断片をゲル単離した。プラスミドｐＩＥＨ−０５０およびｐＩＥＨ−０５２のリンカー領域中のＢａｍＨＩ部位のため、遺伝子断片をｐＰｕＭＩおよびＫｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、同一制限エンドヌクレアーゼで消化された修飾されたプラスミドｐＮ５ＫＧ１に連結し、その結果、１６アミノ酸Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーを介する抗−ＴＲＡＩＬＲ２（１４Ａ２）抗体ＣＨ３ドメインのカルボキシル末端への安定化された抗−ＬＴＢＲ（ＢＨＡ１０）ｓｃＦｖの融合産物がもたらされた。正しい配列はＤＮＡ配列分析によって確認した。
表１９ ＢＨＡ１０ ＶＨＳ１６Ｅ＋ＶＬＳ４６ＬおよびＶＨ４４−ＶＬ１００／ＶＨＳ１６Ｅ＋ＶＬＳ４６Ｌ ｓｃＦＶのＰＣＲ増幅のためのオリゴヌクレオチド
Figure 0005374359
 抗−ＴＲＡＩＬ Ｒ２抗体重鎖遺伝子配列のカルボキシル末端へのＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ ＶＨＳ１６Ｅ＋ＶＬ４６Ｌ遺伝子配列の融合は、プラスミドｐＸＷＵ０５４を生じた。抗−ＴＲＡＩＬ Ｒ２抗体重鎖遺伝子配列のカルボキシル末端へのＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ ＶＨ４４−ＶＬ１００／ＶＨＳ１６Ｅ４＋ＶＬＳ４６Ｌ遺伝子配列の融合はプラスミドｐＸＷＵ０５５を生じた。
連結混合物を用いて、ｅ．ｃｏｉｌ株ＴＯＰ１０コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を形質転換した。アンピシリン薬物耐性に形質転換されたｅ．ｃｏｉｌコロニーを、インサート存在についてスクリーニングした。ＤＮＡ配列分析は、最終構築体の正しい配列を確認した。キメラ１４Ａ２軽鎖ＤＮＡ（配列番号：２８）およびアミノ酸配列（配列番号：２９）を図１５Ａおよび１５Ｂに示す。Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ ＶＨＳ１６Ｅ＋ＶＬＳ４６Ｌ二特異的抗体についての重鎖ＤＮＡ（配列番号：５２）およびアミノ酸配列（配列番号：５３）を、各々、図６１および６２に示す。Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ ＶＨ４４−ＶＬ１００／ＶＨＳ１６Ｅ＋ＶＬＳ４６Ｌについての重鎖ＤＮＡ（配列番号：５４）およびアミノ酸配列（配列番号：５５）を、各々、図６３および６４に示す。
重鎖は、従前に用いたのと同一のシグナルペプチドを使用した。
Ｂ．ＣＨＯ細胞における二特異的抗体の安定な発現、抗体精製および特徴付け
プラスミドＤＮＡ ｐＸＷＵ０５４およびｐＸＷＵ０５５で安定にトランスフェクトされ、かつ無血清条件に適合されたＤＨＦＲ−欠乏ＣＨＯ細胞系を、二特異的抗体蛋白質の生産について測定し、実施例８に記載されたように蛋白質を精製した。安定化されたＶＨＳ１６Ｅ＋ＶＬＳ４６Ｌ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えたＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、および安定化されたＶＨ４４−ＶＬ１００／ＶＨＳ１６Ｅ＋ＶＬＳ４６Ｌ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えたＣ−二特異的抗体を含有する上清からのプロテインＡ溶出物を、分析サイズ排除クロマトグラフィーによって凝集体の存在について調べた（図６５）。慣用的ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを含有するＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓのクロマトグラムプロフィールは〜４０％凝集体を示した。対象的に、安定化されたＶＨＳ１６Ｅ＋ＶＬＳ４６Ｌ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えたＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓは、標準ＩｇＧで観察されたのに匹敵するレベルまで凝集体を有意に低下させた。
図６６Ａおよび６６Ｂは、各々、ＶＨＳ１６Ｅ＋ＶＬＳ４６Ｌ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えた精製されたＣ−末端ＨｅｒｃｕｌｅｓおよびＶＨ４４：ＶＬ１００／ＶＨＳ１６Ｅ＋ＶＬＳ４６Ｌ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えたＣ−末端ＨｅｒｃｕｌｅｓのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。還元されたレーンは重鎖および軽鎖蛋白質の予測されたサイズを示す。重要なことには、野生型ｓｃＦｖドメインを含有するＨｅｒｃｕｌｅｓでしばしば観察された有意なレベルの分解されたまたは望まないより低い分子量特産物はなかった。
図６７Ａおよび６７Ｂは、初期プロテインＡ精製工程に続いて、各々、ＶＨＳ１６Ｅ＋ＶＬＳ４６Ｌ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えたＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、およびＶＨ４４−ＶＬ１００／ＶＨＳ１６Ｅ＋ＶＬＳ４６Ｌ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えたＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓの分析ＳＥＣ溶出プロフィールを示す。これらの実験は、単独で、およびＶＨ４４：ＶＬ１００ジスルフィドと組み合わせた、ＶＨＳ１６Ｅ＋ＶＬＳ４６Ｌ突然変異の付加によるＢＨＡ１０ ｓｃＦｖの安定化の結果、より高次の分子量種を実質的に含まない分取量の＞９８％純粋なモノマーＨｅｒｃｕｌｅｓ二特異的抗体をもたらす。
（実施例１４）
非−共有結合安定化ｓｃＦｖ突然変異を含有する二特異的「Ｈｅｒｃｕｌｅｓ」抗体の生物学的活性
ＶＨＳ１６Ｅ＋ＶＬＳ４６Ｌ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えたＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（ＸＷＵ０５４）およびＶＨ４４−ＶＬ１００／ＶＨＳ１６Ｅ＋ＶＬＳ４６Ｌ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えたＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（ＸＷＵ０５５）のイン・ビトロ生物学的活性を、実施例７に記載されたように、腫瘍細胞増殖アッセイでテストした。
これらの実験からの結果を図６８に示す。図６８Ｂは、１４Ａ２ ＩｇＧ抗体が、ＷｉＤｒ腫瘍細胞の成長を阻害するにおいて中程度の活性を有し、ＢＨＡ１０ ＩｇＧと組合せて、ＢＨＡ１０ ＩｇＧ単独と比較して抗−腫瘍細胞活性のわずかな増加を呈したことを示す。対照的に、二特異的Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ抗体（ＸＷＵ０５４およびＸＷＵ０５５）の双方は、実施例１０に記載されたＸＷＵ０３６分子ＶＨ４４−ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ リンカー安定化ＤＨＡ１０ ｓｃＦｖを備えたＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ）
観察されたのと匹敵するＷＩＤｒ細胞の増強された腫瘍細胞殺傷を示した。図６８Ａは、１４Ａ２ ＩｇＧおよびＢＨＡ１０ ＩｇＧ抗体の双方は、単一剤として、ならびに組合せて用いた場合に、ＭＤＡ２３１腫瘍細胞の成長を阻害するにおいて無視できる活性を有した。対称的に二特異的Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体（ＸＷＵ０５４およびＸＷＵ０５５）は、実施例１０に記載されたＸＷＵ０３６分子／ＶＨ４４−ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカー安定化ＢＨＡ１０ ｓｃＦＶを備えたＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ／観察されたのと匹敵するＭＤＡ２３１細胞の増強された腫瘍殺傷を示した。
（実施例１５）
ヒトまたはヒト化抗体配列の熱安定性を測定するための示差走査型熱量測定
（ＤＳＣ）の利用
抗体の見掛け安定性の範囲を評価するために示差走査型熱量測定（ＤＳＣ）を１７のヒトまたはヒト化ＢＩＩＢ抗体の組で行った。
ＢＩＩＢ抗体を、ｐＨ６．０の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液に対して専ら透析した。透析物を熱量計の参照セル内で用いて、各抗体走査のベースラインを定義した。透析に引き続いて、ＢＩＩＢ１−１７の濃度を２８０ｎｍ吸光度によって測定した。（Ｐａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．４，２４１１−２４２３，１９９５）。ＤＳＣ用いた抗体溶液を濃縮されたストックを透析物で希釈することによって１ｍｇ／ｍＬにて普遍的に調製した。
自動毛細管示差走査型熱量測定計（ｃａｐＤＳＣ，ＭｉｃｒｏＣａｌ，ＬＬＣ）を用いて走査を行った。蛋白質および参照溶液をロボットアタッチメントを用いて９６−ウェルプレートカラー自動的にサンプリングした。各蛋白質走査に先立って、試料細胞中の緩衝液で２回走査を行い、バックグラウンドを差し引くために用いた。単一清浄化走査を、各蛋白質走査後に５％リクノックス（Ｌｉｕｑｉｎｏｘ）を用いて行った。各走査の後に、機器を、０．０１％アジ化ナトリウムを含有する３×−２ｍＬ蒸留脱イオンＨ２Ｏで参照および試料細胞双方を自動的に濯いだ。増強された分解のために中程度フィードバックモードを用いて走査を１℃／分行った。走査範囲は２０ないし９５℃であった。蛋白質を含有する全ての９６℃−ウェルプレートを６℃機器内で貯蔵した。
走査は、製造業者によって供給されたＯｒｉｇｉｎソフトウェアを用いて分析した。バックグラウンドの差し引きに続き、三次多項式を用いて非−ゼロベースラインを修正した。各ＩｇＧ１ドメインの折畳み解除転移は、マルチ−ピーク曲線を３つの別々の転移にフィットさせることによってレコンボリュートした。組換えＩｇＧ１およびＩｇＧ４ Ｆｃγドメインを利用して、各転移内のＣＨ２およびＣＨ３ピークを同定した。残りの転移は、抗体のＦａｂ部分の折畳み解除に対応すると推定された。
１７の抗体のＦａｂ部分のほとんどは、各個々のＦｖのユニークな特性に依存して、５７ないし８２℃の範囲の熱折畳み解除（ＴＭ）の中点にて見掛けの単一転移において折畳み解除された。３つの抗体ＢＩＩＢ１５，ＢＩＩＢ１６およびＢＩＩＢ１７のみが４つの転移を呈した。典型的なＩｇＧ１ ＤＳＣトレースを図６９Ａに示す。Ｆａｂ部分についてのＣＰｍａｘ（すなわち、ＤＳＣピークの高さ）は、一般には、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインのそれよりも有意に大きい。これは、抗体内のＦａｂ蛋白質の質量はＣＨ２またはＣＨ３ドメインいずれかのそれよりも４倍大きく、抗体のＦａｂ部分が、その転移が各々単一ホモダイマー界面のみの破壊を含むＣＨ２およびＣＨ３とは反対に４つのドメインの間の埋もれた表面領域を含有することを考慮すると合理的である。一般に、各ＩｇＧ１抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインで観察された転移は相互によく重なった。これは３つのＩｇＧ４のＣＨ２およびＣＨ３ドメインについても当てはまる。これらの理由のため、各ＩｇＧ１またはＩｇＧ４分子のＦａｂ転移は容易に同定された。１つの抗体（ＢＩＩＢ１８）はＤＳＣによって実験しなかった。ＢＩＩＢ１８は可溶性／非−凝集物質を貧弱にしか発現せず、そのような物質を決してもたらさなかった。この抗体は実施例１６に記載された配列分析に含めた。
抗体の１つであるＢＩＩＢ７はヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４様式の双方において分析した。それらの熱折畳み解除転移（ＴＭ）中点によって測定してＩｇＧ１およびＩｇＧ４様式でのＢＩＩＢ７の見掛けのＦａｂ熱安定性は非常に似ていた（図６９Ｂ参照）。一定ドメインサブクラスにおける変動は、Ｆａｂ ＴＭまたはＦａｂ熱量測定折畳み解除エンタロピーに悪影響しなかった。
ＩｇＧ４ ＦｃのＣＨ２およびＣＨ３ドメインに対応する重複する転移はＩｇＧ１のそれよりも有意に低い温度で起こり、Ｆａｂ転移をＩｇＧ４については〜１ないし２℃人工的によりひどくする。一旦ＩｇＧ転移が完全にデコンボリュートされると、Ｆａｂ ＴＭは、それらがＤＳＣトレースで出現するよりもかなり近かった（ΔＴＭ＜１℃）。ＩｇＧ１およびＩｇＧ４様式のＢＩＩＢ７のＦａｂ ＤＳＣ曲線はかなり似ているという事実は、ＩｇＧ１ ＦａｂおよびＩｇＧ４ Ｆａｂの熱安定性を正しく比較することができることを示唆する。
ヒト化ＢＩＩＢ抗体の１７でのＤＳＣ測定は、Ｆｖ領域がそれらの各Ｆａｂの見掛けの安定性にかなり影響したことを示す。例えば、図７０は、ＢＩＩＢ１、ＢＩＩＢ４、ＢＩＩＢ６およびＢＩＩＢ１６で得られた非常に異なるＤＳＣ曲線を示す。全ての４つの抗体はＩｇＧ１であり、それらの間の配列の差のみがＦｖ領域に存在する。全ての１７の抗体のＣＨ２およびＣＨ３ ＤＳＣ転移の位置および大きさは、それらが付着したＦａｂから独立している（図７０参照）。表２０における頂部１７抗体についてのＦａｂ ＴＭの範囲は５７．２および８１．６℃（±２４．４℃）の間であり、ＢＩＩＢ１は最高の見掛けのＦａｂ安定性を呈し、およびＢＩＩＢ１７は最低の見掛けのＦａｂ安定性を呈する。
最低の測定可能なＦａｂ ＴＭ値ＢＩＩＢ１５、ＢＩＩＢ１６およびＢＩＩＢ１７を持つ３つの抗体は、Ｆａｂ内のドメイン折畳み解除転移の間の断絶を示す（ＢＩＩＢ１６のＤＳＣ曲線については図７０参照）。予測されたＦａｂピークは２つの別々の転移に分裂した。より低いＴＭ転移は表２０にリストしたが、ＣＨ１／ＣＬ構造単位の折畳み解除を表すことができる第二の転移は、各々、ＢＩＩＢ１５、ＢＩＩＢ１６およびＢＩＩＢ１７について７４、７２および７０℃のＴＭで起こった。ＢＩＩＢ１８は、発現せず、そのＶＨ配列がコンセンサスから有意に発散した抗体の例として実験に含めた（実施例１６参照）。
ＤＳＣ分析は、個々のＦｖ−領域のユニークな特性が抗体の全Ｆａｂ部分の見掛けのＴＭをかなり減衰させることができることを示した。ＢＩＩＢ１５、ＢＩＩＢ１６およびＢＩＩＢ１７の極端な場合には、見掛けのＦｖ安定性は、Ｆａｂ部分内のドメインの折畳み解除転移が相互にカップリングしなくなるのに十分低かった。Ｆａｂの全ての４つのドメインの折畳み解除についての見掛けの単一の転移を維持するためには、最小全ＴＭ限界があり得（本明細書中に記載された走査条件下でＩｇＧ１については＞７０℃）、そうでなければ多数の転移が出現する。ＢＩＩＢ１５、ＢＩＩＢ１６およびＢＩＩＢ１７の低い温度の折畳み解除転移をＦｖに割り当て、第二のより高い温度の転移をＣＨ１／ＣＬドメインに割り当てるのが便宜である。しかしながら、Ｅｗｅｒｔおよび共同研究者は、ＶＨ／ＶＬドメイン折畳み解除が常にはカップリングせず、サブクラス、ＶＨ／ＶＬ安定性、およびＶＨ／ＶＬ相補性に依存し得ることを示した（Ｅｗｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２５：５３１−５５３，２００３）。事実、コンセンサス−由来フレームワークを持つ非常に少数のそれらのＶＨ／ＶＬ ｓｃＦＶ構築体は協働的な折畳み解除を呈した。従って、転移が脱カップリングするにつれ、折畳み解除シナリオは、Ｆｖ−領域およびＣＨ１／ＣＬ−領域を表す２つの転移に単純に分裂するよりも複雑となり得る。
ＢＩＩＢ７ ＩｇＧ１およびＩｇＧ４ ＦａｂについてＤＳＣによって測定された見掛けの安定性はかなり似ているか、２つのサブクラスの間ではＣＨ１配列およびジスルフィド−結合の実質的な固有の差がある。（１）ＣＨ１がＩｇＧ１またはＩｇＧ４であるかに拘わらず、ＢＩＩＢ７ Ｆａｂの熱安定性天井をＦｖの生物物理学的特性が設定する、（２）ＣＨ１／ＣＬ領域の見掛けの安定性がＩｇＧ１およびＩｇＧ４の間で同一である、または（３）ＣＨ１／ＣＬ構造単位はＤＳＣ実験のタイムフレーム内で折畳み解除しない、のようなこれについての多くの可能な説明がある。ＢＩＩＢ７ Ｆａｂが単一のＴＭにおいて、かつＩｇＧ１およびＩｇＧ４様式の双方において同様な熱量測定エンタルピーでもって折畳み解除したという事実は、定常領域ではなくＦｖに対する潜在的安定性依存性を示唆する。
Figure 0005374359
 （実施例１６）
最適下安定性を持つ抗体可変領域を同定するためのコンセンサススコアリングの利用
コンセンサススコアリングは、ＢＩＩＢ抗体のいずれがそれらのＦｖ領域内で非常に多数の非−最適アミノ酸を有意に含有したかを同定するための方法として利用した。該スコアリングは、過剰体細胞突然変異および進化的生殖系変動によるコンセンサスＶＨおよびＶＫ 配列からの相対的なドリフトを評価する。１７の抗体についてのＤＳＣ測定を用いて、貧弱な抗体安定性を予測するコンセンサススコアリングアプローチの能力を定量した。
スコアリングのためのコンセンサス配列および各残基位置における個々のアミノ酸頻度を誘導するのに用いた哺乳動物ＶＨおよびＶκカッパ配列の参照組を収集し、分類し、従前に記載されているように選択した（Ｄｅｍａｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６；４１−４８，２００４）。哺乳動物参照組は、種々の哺乳動物からのＶ−遺伝子を含めて、主の間の進化的ドリフトを介して多様性を得るためにナイーブに構築した。ＶＨ哺乳動物参照組は、主として、合計１７の異なる哺乳動物種を表すＮＣＢＩおよびＴＩＧＲからの６１のＶＨ配列を含有する。Ｖκ哺乳動物参照組は１３の異なる哺乳動物種からの５３のＶκ配列を含有する。
参照組を形成するための（またはテスト配列として用いるための）ヒトＶＨおよびＶκ配列を、各々、サーチ基準「Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ抗体可変重鎖」および「Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ抗体カッパ可変軽鎖」を用いてＮＣＢＩデータベースから集めた。合計１８２のヒトＶ−遺伝子配列１１４ＶＨおよび６８Ｖκを、哺乳動物ＶＨおよびＶκデータベースに対する比較のためにＮＣＢＩデータベースから半ランダムに選択した。ＮＣＢＩデータベースを半ランダムに良質なものだけを選択することによって得られたヒトＶＨおよびＶκ配列のサブクラスの分布は、天然生殖系ＶＨまたはＶκ用法に基づいて予測されたサブクラス表示を生じ（Ｇｕｉｇｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、これは、配列がＮＣＢＩから選択された方法においてほとんど偏りがないことを示唆する。
次いで、配列を、ＡｈｏのＡｍａｚｉｎｇ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｎａｔｏｍｙウェブサイトから得られたサブクラスコンセンサス配列に対するＣｌｕｓｔａｌＷ整列によってそれらの個々の可変ドメインサブクラス（ＶＨ１−ＶＨ７およびＶκ１−Ｖκ４）にカテゴリー分けした。公に入手可能な人生殖系配列に対する整列によって、該サブクラスをさらに確認した（Ｌａｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７，２０９−２１２，１９９９）。いずれか１つのマルチ−配列ＮＣＢＩ提出からの５以下のヒト配列を参照組に含んで、プライマー組または抗原−ベースのＶ−遺伝子用法によって導入された潜在的な偏りを低下させた。配列の収集はナイーブに行い；従って、サブクラスグループ分けの後に天然に豊富なＶＨ３およびＶＫ１配列があった。（以下に、および表２０に記載された）平均スコアおよび標準偏差は、２５ＶＨ１、３ＶＨ２、４４ＶＨ３、３４ＶＨ４、５ＶＨ５、３ＶＨ７、２９Ｖκ１、４Ｖκ２、１９Ｖκ３および１６Ｖκ４ヒト配列を用いて各サブクラスについて計算した。１８の抗体のうち２つ（ＢＩＩＢ５およびＢＩＩＢ１４）のみが、最小亜群配列集団（すなわち、ＶＨ２、ＶＨ５、またはＶＨ７）を持つＶＨドメインを含有した。１８の抗体のうち４つ（ＢＩＩＢ３、ＢＩＩＢ４、ＢＩＩＢ１７およびＢＩＩＢ１８）は、そのサブクラスが配列スペースにおいて過少表現され、そのスコアリング精度が悪く定義されたＶκ２サブクラス可変ドメインを含有した。ヒトＶＨ配列参照組内で天然ＶＨ６配列は見出されなかった。これは関心事ではなかった。というのは、ＢＩＩＢ抗体構築体のいずれもＶＨ６ドメインを含有しなかったからである。
１８ＢＩＩＢ抗体の可変ドメイン配列、およびＮＣＢＩから入手した１８２のヒトＶＨおよびＶκ配列の可変ドメイン配列は、哺乳動物抗体配列の参照組に対してスコアをつけた。全てのＶＨおよびＶκ配列はＣＤＲ３に先立って（コンセンサスＹＹＣ残基後２つの残基）切形して、Ｖ−（Ｄ−）Ｊ−Ｃ接合領域の超可変性質によって導入された非予測性を低下させた。哺乳動物データベース内のあらゆる位置に置ける残基頻度（ｐｉ（ｒ））は、各アミノ酸（Ａ，Ｃ，Ｄ．．．Ｖ，Ｗ，Ｙ，−）がデータベース内の各残基位置で起こる回数を配列の合計数で割った数を総計することによって計算した。スコアは以下の式：
Figure 0005374359
 （式中、ｃｉ（ｒ）は哺乳動物可変ドメインデータベースの各位置におけるコンセンサス残基頻度に等しく、およびｈｉ（ｒ）はヒト可変ドメインテスト配列の各アミノ酸のテスト残基頻度と等しい）
を用いて各ヒトＶＨおよびＶκテスト配列について計算した。哺乳動物データベースのコンセンサス配列についての完全なコンセンサススコアはＶＨについては１０４であって、Ｖκについては１００であった。
Ａ．哺乳動物Ｖ−遺伝子データベースを用いるランダムＶＨおよびＶκ配列のスコアリング
ＶＨおよびＶκサブクラスコンセンサス配列を哺乳動物データベースコンセンサスに対してスコア取りし、各々、図７１Ａおよび７１Ｃにおいてプロットした。ＶＨ３−サブクラスコンセンサスは哺乳動物データベースコンセンサスの仮定「完全」スコアよりも低い１ポイントのみをスコア取りし、合計３つの残基だけ哺乳動物データベースコンセンサスから異なった。かくして、哺乳動物データベースはＶＨ３−様配列に向けて偏っていることは明らかである。全ての他のヒトＶＨサブクラスコンセンサス配列はかなり低いスコアであった。Ｖκ４配列に向けての偏りは、哺乳動物Ｖκデータベースで観察された（図７１Ｃ）。ヒトまたはヒト化ＢＩＩＢ配列スコアは、匹敵するサブクラスのヒトＮＣＢＩ配列の性能に基づいて分析した。個々のＶＨ配列スコアの分布を図７１Ｂに示し、個々のＶκ配列スコアの分布を図７１Ｄに示す。
Ｂ．ＢＩＩＢ１ないしＢＩＩＢ１８についてのスコアリング結果
全ての１８のＢＩＩＢ抗体についてのＶＨおよびＶκスコアを計算し、ＮＣＢＩヒトＶ−遺伝子配列参照組に由来する相対数と比較した（表２０）。また、ＢＩＩＢ Ｖ−遺伝子スコアおよび平均サブクラススコアの間の差も表２０に含める。潜在的安定性傾向を調べるために用いたのはこれらのスコアの間の差である。ＢＩＩＢ１ないし１８を、それらの測定したＦａｂ安定性の下がる順に記した。Ｖ−遺伝子サブクラス、およびＢＩＩＢ ＶＨおよびＶκ遺伝子についての最も近い個々のヒト生殖系をＣｌｕｓｔａｌＷ分析によって決定した。
コンセンサス−ベースのスコアは１８のＢＩＩＢ抗体について誘導し、実験的に決定されたＦａｂ熱的折畳み解除プロフィールと比較した。ＢＩＩＢ Ｖ−遺伝子スコアおよびそれらの平均サブクラススコア（すなわち、最低の配列スコア）の間の最大の差を持つＢＩＩＢ抗体は、実施例１５に測定された低いＦａｂ ＴＭと相関した（表２０、図７２Ａ）。ＶκスコアをＤＳＣによって測定されたＴＭと相関させる明らかな傾向は無かった（図７２Ｂ）。事実、最低のスコアリングＶκ配列は、二番目に高い見掛けのＦａｂ安定性を有したＢＩＩＢ２に属した。
異常なＣＤＲアミノ酸挿入および欠失がＢＩＩＢ１５およびＢＩＩＢ１６、ならびに全てのＢＩＩＢ抗体の最悪なＶＨスコアを有し、認識可能なレベルで決して発現されなかったＢＩＩＢ１８で見出された。ＶＨスコアリングはＢＩＩＢ１５およびＢＩＩＢ１６についての潜在的な安定性の問題を示唆せず；しかしながら、それらのＦａｂ ＴＭはテストした最低の２つであった（図７２Ａ）。ＢＩＩＢ１５は異常に長いＣＤＲ１（長さが１３アミノ酸、我々の哺乳動物データベースにおけるいずれのＶＨ３−様ドメインよりも、または我々のヒト配列の組におけるＶＨ３ドメインよりも２長い）を含有し、ＢＩＩＢ１６は異常に短いＣＤＲ２（長さが１５アミノ酸、我々の哺乳動物ＶＨデータベースおよび我々のヒトＶＨの参照組双方における他のＶＨ３ ＣＤＲ２のかなり大部分よりも１アミノ酸短い）を含有した。
Ｃ．残基頻度分析およびＢＩＩＢ Ｆａｂの安定性予測のための小さな哺乳動物配列データベースの利用性
ＶＨ配列の哺乳動物データベースに対するＢＩＩＢ ＶＨドメインのスコアリングは、Ｆａｂの全安定性を制限し得る各ＶＨドメイン内の非−最適アミノ酸の豊富性を決定するための有用なツールであることが判明した。スコアは、低い安定性、ならびに低下したイン・ビトロ長寿および増大した凝集速度の潜在能力を持つＦａｂを拾い出すのに有用であった。哺乳動物をＶ−遺伝子データベースで観察されたサブクラス偏りに基づき、本明細書中で用いた哺乳動物データベースとは反対にコンセンサススコアリングを行うための厳格にヒトのＶ−遺伝子データベースを用いるのは最良であるか否かの疑問があろう。しかしながら、非−コンセンサスアミノ酸の正確な残基１、ＶＨ／ＶＬ相互作用の強さ、Ｖ−（Ｄ−）Ｊ−Ｃ接合の性質、および過剰体細胞挿入または欠失の発生率のような、スコアリングが反映しない変数を決定する有意な数の安定性に基づき、全てのヒトＶＨデータベースが有意な改良を供すると考えるのは困難である。スコアリングで用いる厳格にヒトのデータベースもまた、哺乳動物データベース内にナイーブに含まれた進化的多様性にマッチするのに有意により大きな数の配列を必要とするであろう。哺乳動物データベースアプローチがよく働くことを示すデータの一つのピースは、ヒトサブクラスコンセンサスＶＨ配列が、それらのゲノムサブクラスの豊富性および見掛けのサブクラス用法の上昇する順番のスコアとなったことである（Ｇｕｉｇｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｔｅａｌｅ ａｎｄ Ｍｅｄｉｎａ，１９９２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。哺乳動物ＶＨデータベースは、ヒトＶＨサブクラスの全寄与を適切に重み付けするように見える。各ＶＨおよびＶκサブクラスコンセンサス配列は一般にはＮＣＢＩから拾った個々のかつユニークなヒト配列のほとんど大部分よりも高いスコアであったという事実は、偏りがＶＨ３に向けて存在するのに拘わらず、哺乳動物データベースが全てのサブクラスについてコンセンサス情報を捕獲していることを示唆する。従って、スコアリングが取り込まない他の安定性に影響する因子の存在のため、図７２Ａで観察された傾向は、スコアリングで用いるＶＨ配列データベースの微妙なチューニングによって改良されないようである。
ＶＨドメインにおける異常な挿入または欠失は、コンセンサススコアリングによって反映されない安定性に対して有意な効果を有するように見える。ＢＩＩＢ１５の異常に長い（１３アミノ酸）ＣＤＲ１、およびＢＩＩＢ１６の異常に短い（１５アミノ酸）ＣＤＲ２は、元来のマウス配列からのヒト化のキャリー−オーバーのようである。事実、ＢＩＩＢ１６ ＶＨ配列は、やはり１５アミノ酸ＣＤＲ２を含有した我々の哺乳動物データベース中の２つのマウスＶＨ配列と密接に整列する。異常に短いＣＤＲをヒトフレームワークに強制するのは、この抗体の安定性に悪影響を与えたであろう。ＢＩＩＢ１８は、全てのＢＩＩＢ配列の最低のＶＨスコアを呈するのみならず、異常に長いＣＤＲ２（通常の１９アミノ酸最大と比較して２２残基）を含有した。かくして、精製されていない上清での極端に粗い生物学的アッセイ以外のものを可能とする発現レベルに決して到達しないのは、ＢＩＩＢ１８の配列内に固有の多数の可能な問題を考慮すると驚くべきことではない。ＢＩＩＢ１５、ＢＩＩＢ１６およびＢＩＩＢ１８についての結果は、異常なＶＨ挿入または欠失が、ほとんどの単一点突然変異よりも抗体の熱安定性に対してより大きな効果を有するであろうことを示唆する。ＢＩＩＢ１８の例外的に貧弱な挙動は、その配列についてのおざなりの観察に基づいては予測されなかった。というのは、そのＦｖは、Ｖ−遺伝子折畳み内で厳格に保存された全ての「必須の」アミノ酸を含有したからである。幾分綿密な調査を用いて面倒な抗体を拾い出す能力を有することは、スコアリングアプローチの現実の利用性である。
Ｖκスコアに対して測定されたＦａｂ安定性を比較すると、傾向は明らかでなかった。ＶκスコアをＶＨスコアと組み合わせると、ＶＨスコア単独で観察された傾向を単に低下させる。コンセンサススコアそれ自体は、全て、それらの個々のヒトカッパサブクラス配列よりも良好なスコアであったに拘わらず（図７２Ｂ）、ＶＨスコアリング結果とは異なり、ヒトＶκコンセンサススコアは、Ｖκ生殖系の天然の豊富性および遺伝子用法と一致していなかった（Ｇｕｉｇｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｍｅｉｎｄｌ ｅｔ．ａｌ．，１９９０；Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。Ｖκコンセンサススコアの予測された順序からのこれらの偏りは、低い安定性のＶκドメインを正確に予測する哺乳動物データベースの能力を損ないかねないのは憶測に過ぎない。また、Ｖκ２サブクラスの平均スコアを定義するのに十分なＶκ２配列は無かった。サブクラス分布を６８のヒトＶκ配列について決定した後、４つのみが（Ｖκ２用法をかなりよく反映する）Ｖκ２であった。反対の例は文献で入手可能である（Ｒoｔｈｌｉｓｂｅｒｇｅｒ ｅｔ．ａｌ．，２００６）が、これらの欠点があるにも拘わらず、Ｖκの結果は、依然として、ＶＨ遺伝子のより大きな配列多様性は、ＶＨドメインをＦａｂの安定性―決定成分としないよりはむしろしばしばする（Ｄｅｍａｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，２００６）。
Ｄ．ＶＨまたはＶＬ生殖系およびＶＨ／ＶＬ対合に対する安定性依存性
１８の抗体の多くは、そのＣＤＲおよび過剰体細胞突然変異が変化し、そのＶＨまたはＶＫ対合が同一または異なる重複生殖系Ｖ−遺伝子を含有した。これは、それらが由来する個々の生殖系に対して抗体Ｆａｂ安定性を比較することを可能とした。２つの最も安定なＦａｂ、ＢＩＩＢ１およびＢＩＩＢ２は、同一のＶＨ１およびＶκ１生殖系組合せを有する。ＶＨおよびＶκ対合は、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者による研究に基づいて明らかな固有の偏りを有するようには見えないが、「受容体駆動」されると考えられる（ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９９９ｂ）。ＢＩＩＢ１およびＢＩＩＢ２は比較的似ていない抗原ＣＣＬ２およびＶＬＡ４に結合し；従って、組合せはランダムに起こったか、またはヒト化の結果であった。最も安定でないＦａｂ、ＢＩＩＢ１７およびＢＩＩ８（すなわち、低い配列スコア；ＢＩＩＢ１８は異常な挿入を含んだ）のＶＨドメイン内に非−最適アミノ酸の明瞭な豊富性は無かった。これらの抗体の双方は、同一のＶκ２に生殖系をやはり含有し、これは、スコアリングによって同定されたＶＨ−ベースの論点の頂部にある軽鎖蛋白質安定性の論点を潜在的に示唆する。興味がある将来の研究は、この特定のＶκ２がこれらの２つの抗体の貧弱な生物物理学的挙動に対して寄与するものであるか否かを決定することであろう。Ｖκ２サブクラスは、一般には、貧弱なＦａｂ安定性と関連しなかった。というのは、ＢＩＩＢ３およびＢＩＩＢ４はやはりＶκ２サブクラス遺伝子を含有するからである。ＡＢ０１９４３８ＶＨ１生殖系（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，１９９９）は４回まで収穫された。これらのＦａｂ（ＢＩＩＢ１２，ＢＩＩＢ１１，ＢＩＩＢ７およびＢＩＩＢ３）についてのＴＭ−値は７１．２ないし７８．２の範囲であった。興味深いことには、それらのＶＨ配列スコアはそれらの見掛けのＦａｂ安定性に相関した（ＢＩＩＢ１２＜ＢＩＩＢ１１＜ＢＩＩＢ７〜ＢＩＩＢ３）。正ＶＨスコアリング相関もまた、同一ＶＨ１生殖系について前記したＢＩＩＢ１およびＢＩＩＢ２抗体で見出された。しかしながら、ＶＨスコアリングの見掛けの不正確性は、共にＭ９９６４９ＶＨ３生殖系を含有したＢＩＩＢ４およびＢＩＩＢ６で観察された負の安定性相関によって強調された。
成人ヒトにおけるＶＨ生殖系ファミリーの用法はかなりランダムなように見えるが、ＶＨ３ファミリーはヒトにおけるほとんどのメンバーを含有する。ＶＨ３またはＶＨ３−様遺伝子は、ヒト参照組および哺乳動物データベースにおいてよりしばしば確率的に出現した。ＥｗｅｒｔおよびＰｌuｃｋｔｈｕｎの結果は、コンセンサス−由来ヒトＶＨ３配列がコンセンサス−由来ＶＨドメインの最も安定なものであることを示した（Ｅｗｅｒｔ ａｎｄ Ｐｌuｃｋｔｈｕｎ，２００３）。この結果は、ＶＨ３サブクラスが、他のサブクラスと比較して最適なコンセンサスの創生に寄与するより多くの生殖系配列を有することを考慮すると、全く予測されないというのでは無かろう。我々の安定性のデータは、ＶＨ３生殖系を含有するＩｇＧが、一般には、より高いＦａｂ ＴＭ−値を呈しないことを示す。安定性リストの頂部および底部双方にＶＨ３およびＶＨ１サブクラス遺伝子がある。多くの他の因子、特に、Ｆｖ内のＶκカウンターパートの特性はＦａｂの総じての安定性に寄与するが、もしＶＨ３ドメインが一般には他のサブクラスよりも安定であるならば、ＶＨ３サブクラス生殖系を含有するものについてのより高いＦａｂ安定性に向けての傾向が予測されるであろう。これは、本明細書中に記載された限定された安定性実験からの場合ではないように見える。
（実施例１７）
Ｉｇ−折畳みポリペプチドの共変動解析
Ａ．Ｉｇ―折畳み構造の収集および濾過
哺乳動物蛋白質からのＩｇ−折畳み蛋白質またはＩｇ−折畳みドメインの構造は、ＳＣＯＰヒエラルヒーにマッチするドメイン構造を含有するＡＳＴＲＡＬデータベースから集めた。免疫グロブリン特異的Ｉｇ−ドメインはＳＣＯＰヒエラルヒー内の以下の分類の下で見出された：「全てのベータ蛋白質」→「免疫グロブリン―様ベータ―サンドイッチ」→「免疫グロブリン」。免疫グロブリンの下では、構造の４つの組が入手可能であった：「Ｖ組」、「Ｃ１組」、「Ｃ２組」、および「Ｉ組」。４つの慣用的なダウンロードスクリプトを別々に行って、「Ｖ−クラス」、「Ｃ１−クラス」、「Ｉ−クラス」、および「Ｃ２−クラス」ｐｄｂファイルを得た。
一旦各サブファミリーについての構造ファイルをダウンロードすれば、いくつかの濾過を行って、誤ってカテゴリー分けされ、不完全な、冗長な、またはドメインが交換された構造を除去した（Ｌｉｕ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．（２００２），１２８５−１２９９）。以下に記載する４つの主な濾過工程があった：
工程＃１ 切断を有する配列の除去
各サブクラスからの構造を、配列中の切断（分解されない密度、またはドメイン交換による失われたセクションいずれか）について、ＳｗｉｓｓＰＤＢ Ｖｉｅｗｅｒを用いて肉眼で精査した。誤った構造のＰＤＢファイルをＶ−、Ｃ１−、Ｃ２−、およびＩ−クラス構造データ組から手動で除去した。
工程＃２ １００％同一配列の除去
ＰＤＢ様式構造をＦＡＳＴＡ様式アミノ酸配列に変換し、濾過して、残りの配列に１００％同一であるか、またはその完全なマッチサブストリングであるかのいずれかであるいずれの配列も除去した。
工程＃３ 異常な長さの配列の除去
異常に長いまたは短いアミノ酸配列を持つＰＤＢ構造を構造データ組から除去した。長さのカットオフ基準は、全ての配列の長さのヒストグラムを調べることによって決定した（図７４）。該ヒストグラムは幾分正規分布したように見えた。平均から２標準偏差の外側にある配列を各サブファミリーデータ組から除去した。免疫グロブリンスーパーファミリーについての残基の全平均数は１０６．１０であって、標準偏差は１２．１９であった。その結果、用いた全体的カットオフは＜＝８１および＞＝１３１残基であった。平均長さおよび標準偏差の内訳を表２１に示す。
表２１ 構造データ組の配列長さ基準
Figure 0005374359
 工程＃４ 誤って折畳まれた配列の除去
ＳｗｉｓｓＰＤＢ Ｖｉｅｗｅｒを用い、構造を誤った折畳みについて肉眼で精査した。２つのベータ―シートサンドイッチトポロジーに適合しないいずれの構造も捨てた。５つのＣ２−クラスドメインのみがＳＣＯＰから得られたので、Ｃ２−サブクラスＩｇ−折畳みは更には追求しなかった。以後、Ｃ１−クラスをＣ−クラスをいう。
Ｂ．構造整列からの配列整列の入手
各別々のクラスについて、Ｓｃｈｒoｄｉｎｇｅｒのｓｔｒｕｃｔａｌｉｇｎパッケージ（重ね合わせの創生についての指示に関するＳｃｈｒoｄｉｎｇｅｒ Ｐｒｉｍｅプログラム書類参照）内の二次構造マッチング（ＳＳＭ）を用いて、Ｉｇ−折畳み構造を相互に重ね合わせた。重ね合わせは、「全部―対―全部」または「全部―対−一つ」に基づいて行った。各アリゴリズムは同様な品質の整列に導き、従って、重ね合わせのために「全部―対―一つ」を選択した。幾らかの重ね合わせを修正して、各構造のコア領域がループの代わりに重ね合わせられていることを確実とした。次いで、重ね合わせを用いて、各構造整列内の全てのＶ−クラス、Ｉ−クラス、およびＣ−クラス配列の構造―ベースの配列整列を作り出した。相互への各配列の整列は、ポリペプチド骨格のα―炭素の間の最も短い距離に基づいて第二の配列のそれに対して１つの配列からのアミノ酸をマッチングさせることによってＳｃｈｒoｄｉｎｇｅｒパッケージを用いて行った。
Ｃ．キュレーションしたＩｇ−折畳み配列データベースの構築
多数の規定された工程を作り出して、頑強な共変動統計学を計算するためのキュレーションされたＩｇ−折畳みデータ組を生じさせた。
工程＃１ ＨＭＭプロフィールの構築
３つの隠されたマルコフモデル（Ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌ）（ＨＭＭ）プロフィールを形成し、各々は、３つのＩｇ−折畳みクラスの内の１つについての構造―ベースの配列整列に基づくものであった。標準オプションでのコマンド「ｈｍｍｂｕｉｌｄ」および「ｈｍｍｃａｌｉｂｒａｔｅ」を用い、プロフィールをＨＭＭＥＲソフトウェアパッケージ（バージョン１．８）で作り出した。次いで、これらのＨＭＭを用いて、ＮＣＢＩにおいて維持されたＮＲ−データベース中の更なるＩｇ−折畳み配列を検出し、整列させた。
工程＃２ 新しいＶ−、Ｉ−、およびＣ−クラスＨＭＭプロフィールを用いるＮＲのサーチング
３つのクラス―特異的ＨＭＭを用いて、局所的ＮＲデータベース中の同様な配列についてサーチした。ＮＲデータベースは〜３００万の非−冗長蛋白質配列を含有する大きなファイルである。Ｖ−、Ｉ−、およびＣ−クラスＨＭＭの各々について、ＨＭＭＥＲコマンド「ｈｍｍｓｅａｒｃｈ」を用いて、ＮＲをサーチした。各出力を用いたＨＭＭに対するそれらのスコアによってＮＲ配列をランク付けし、ＨＭＭによる領域ヒトの数、および各ＮＲ配列内のヒト領域の位置についての情報を供した。各Ｉｇ−折畳みクラス―特異的ＨＭＭサーチについて、推奨される基準スコア閾値を超えるヒトＮＲ配列は、そのＨＭＭを用いたＩｇ−折畳みクラスの候補メンバーとして保持した。ＮＲ配列のサブ配列であるヒト領域については、正確なＮＲサブ配列ヒトは、カスタムプログラムを用いて全ＮＲ配列から抽出した。
工程＃３ ＰＦＡＭを用いるＩｇ−折畳みクラス割り当ての確証
ＰＦＡＭは、個々の蛋白質配列に適用することができる、Ｗｅｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｆｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，（２００６），３４：Ｄ２４７−Ｄ２５１）において作り出され、維持されている蛋白質ファミリーおよびドメイン分類ツールである。Ｐｆａｍツール「ｐｆａｍｖｅｒｉｆｙ」を、前記工程２で得られた各Ｉｇ−折畳み候補配列に適用して、それが、構造―ベースの配列整列から作り出されたＩｇ−折畳みクラス―特異的ＨＭＭによって正しく分類されたことを確認した。（Ｖ−、Ｉ−、Ｃ１−、Ｃ２−、およびより特異的でないＩｇ ＨＭＭを含めた）ＰＦＡＭのＩｇ−ｃｌａｎ ＨＭＭプロファイルをＰＦＡＭウェブサイトからダウンロードした。ＮＲからの各配列をＩｇ−ｃｌａｎ ＨＭＭによってスコア取りし、どれくらいよく各配列が各ＰＦＡＭ ＨＭＭに適合するかを明らかにした。そのスコアがＶ−、Ｉ−、またはＣ−クラスについて推奨されたカットオフ（ＰＦＡＭウェブサイトにおいて定義されたＴＣ１）未満である配列は、各配列組から除去した。かくして、工程２において見出された候補クラス―特異的Ｉｇ−折畳み配列は、もしそれらのＰＦＡＭスコアがそれらのＩｇ−折畳みクラス割り当てを確証した場合にのみ保持された。
工程＃４ 新しいＩｇ−折畳み配列の整列
ＨＭＭサーチにてＮＲから引っ張り出された、および前記工程３で残ったＩｇ−折畳み配列を、次に、それらの割り当てられたクラスの我々のカスタムＨＭＭに対して整列させた。これらのＨＭＭは注意深い構造割り当てに基づいていたので、このプロセスは新しい配列の構造がガイドする整列を保証した。ＨＭＭＥＲパッケージを利用して、後に記載する配列共変動ツールで用いるべきｆａｓｔａ出力様式の「ｍａｐａｌｉ」整列を生じさせた。該整列は「Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ」出力様式における出力でもあり、手動で省略した異常なまたは誤って整列した配列について精査した。元来の構造的に整列した配列およびＮＲからの加えられたＨＭＭ−整列配列よりなる群から選択される得られた整列は、以下の数の配列を含有した：〜５０，０００のＶ−クラス；〜１０，０００のＣ−クラス；〜１０，０００のＩ−クラス。
工程＃５ 冗長なまたは同様な配列の除去
我々は、これらの整列は、稀な配列の過少表示および、結果としての配列多様性のマスキングを伴って、頻繁に観察される配列に対して偏っていると予測した。例えば、我々はネズミおよびヒト免疫グロブリン可変ドメインに対するＶ−クラスＩｇ−折畳み配列整列における大きな偏りを予測した。特定の配列タイプの過剰表示は共変動解析の有用性を制限するので、濾過ツールを作り出し、これを適用して、整列冗長性を低下させた。該ツールは新規な問題解決アルゴリズムを用いて、相互に＞８０％同一性を持つ配列を見出し、整列からそれらを除去した。簡単に述べると、パーセント同一性を全ての配列対について計算した。次いで、同一性値をパーセント同一性のビンにグループ分けした（すなわち、９９％ビン、９８％ビン、９７％ビン等）。各ビンの低下の間に、非−ギャップ残基カウントを減少させることによって、次いで、それらのＨｅｎｉｋｏｆｆ配列重み（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ Ｓ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＪＧ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９４），２４３：１８４−１９９）によって、各ビンの配列をランク付けした。この工程の後、各整列における配列の残りの数は：２，７８６のＶ−クラス；１，５８７のＩ−クラス；および５１８のＣ−クラスであった。
工程＃６ 最終整列を作り出すためのギャップの除去
最終整列において、これらの配列を見出すのに用いたＨＭＭプロファイルにおける状態にマッチしなかった行（ＨＭＭＥＲマニュアル参照）を除去した。従って、配列のうち多くは最終整列長さよりも多くのアミノ酸を含有するが、長さは、整列のより情報的でないギャップ領域での計算を回避するために切形された。整列内の（ギャップを含めた）残基の最終数は、Ｖ−クラスについては１４４、Ｉ−クラスについては６０、およびＣ−クラスについては１１１であった。
Ｄ．最終整列の一般的記載
ａ）Ｖ―クラス
最終８０％フィルターを適用した後、２，７８６のＶ−クラス配列は３つのカテゴリーに分割できた：（１）多様な免疫グロブリンのＶＨおよびＶＬドメイン双方を含む免疫グロブリン可変遺伝子クラス、４９％；（２）超可変ドメインを含有したＴ−細胞受容体Ｖ−クラス遺伝子、１６％；および（３）他のＶ−クラス遺伝子、３５％。免疫グロブリンＶ−クラス遺伝子は、軟骨魚から霊長類までの範囲の非常に種々の種に由来する。ヒトＶ−クラス配列に対して偏りがあった（１２７２配列の内５３７）しかしながら、他の脊椎動物種は最小に表されたに過ぎなかった：マウス（３３）、ウシ（５）、ラクダ（２３）、リャマ（３１）、マカクザル（１７）、ニワトリ（６）など。配列のＴ−細胞受容体は魚類から霊長類までの範囲までほとんど多様なものであり、ヒト配列に対する偏りは含有しなかった。「他の」カテゴリーは、非常に多数の多様な配列からなり、残りの配列の１ないし２％を超えて含む現実のサブカテゴリーはなかった。「他の」カテゴリーは、（主として、脊索動物、軟骨魚類、頭足動物、および昆虫を含めたより広い種のアレイさえ含有した。
ｂ）Ｃ−クラス
最終８０％フィルターを適用した後、５１８のＣ−クラス配列は３つのカテゴリーに分割することができた：（１）免疫グロブリン定常ドメイン、４４％；（２）ＭＨＣ−タイプのＩｇ−折畳み、２１％；および（３）他のＣ−クラスのＩｇ−折畳み、３５％。免疫グロブリン定常ドメインカテゴリーは、軟骨魚類から霊長類までの範囲の多様な配列を含有した。Ｃ−クラスの免疫グロブリンサブカテゴリーは、霊長類または哺乳動物配列さえによって偏らなかった（３つのヒト配列のみが濾過されないままであった：ＩｇＥ−ＣＨ４、カッパＣＬ、およびラムダＣＬ）。また、ＭＨＣサブカテゴリーは軟骨魚類から霊長類までの範囲であり、また、１つの進化群に対してほとんど偏りは示さなかった。「他の」Ｃ−クラスカテゴリーは多くの未知の蛋白質、種々のベータ―２−ミクログロブリンの非常に小さなサブカテゴリー、およびサブカテゴリーの価値がある頻度でもって観察されなかった多くの他の蛋白質を含有した。
ｃ）Ｉ―クラス
Ｉ―クラスはいずれかの明瞭なサブカテゴリーを有しなかった。巨大または巨大―様分子は、細胞―接着または細胞―接着―様分子がそうであったのと共通して収穫された。
Ｅ．共変動統計学の計算
整列におけるアミノ酸の全ての可能な対の間の共変動の（φ―値で表した）相関強度および（χ２−値で表した）有意性は、当該分野で認められた方法に基づいて計算したが、以下の変動を含むものであった：（１）ギャップは区別される残基タイプとして含まれ；（２）Ｈｅｎｉｋｏｆｆ重み付けスキームは行わなかった；（３）配列平均同一性（ＳＡＩ）を用いて、共変動対を濾過しなかった；（４）χ２値は頻度よりはむしろ事象ベースのカウント（出現の数）を用いて計算した；および（５）共変動対は、それらが最少数の回数観察されたのでなければ、プログラムによって報告しなかった。統計学の二つのボディを作成し、最初のもの（およびより小さな組）は１０の事象カットオフを持ち、第二のもの（かなり大きな組）は６事象の事象カットオフを持つものであった。いずれかの与えられた配列整列についてのこれらのパラメーターを計算する能力は実行可能なＪａｖａ（登録商標）にコード化され、Ｊａｖａ（登録商標） Ｒｕｎｔｉｍｅ Ｅｎｇｉｎｅ ＪＲＥ）バージョン１．４．２でテストした。
整列内の位置の数、および（ギャップ、Ｂ、およびＺのあいまいな残基を含めた）各位置における合計２３の可能な残基に基づき、Ｃ−クラスについて計算された２４０万の相関、Ｉ−クラスについて計算された７０万、およびＶ−クラスについて計算された４１０万があった。図７５は高いχ２有意性でもってＶ−クラスについて計算されたφ値を示す。
φ値は−１ないし＋１の範囲である。正φ値は０から離れて（すなわち、＋１に向けて）移動するにつれ、整列内の規定された位置における２つのアミノ酸の間の相関（すなわち、共変動）の強さは増加する。負の相関（すなわち、第二の部位におけるもう１つの特異的アミノ酸の不存在を強いる整列中の１つの部位におけるアミノ酸の存在）は、φ値が―１に向けて移動するにつれ増加する。真実の共変動であるものに対するカットオフは幾分任意であるが、φ値＜０．５を持つものは相互に対して強く相関する。かくして、図７５によると、Ｃ−クラス内の可能な２４０万の相関のうち３７０のみが強い。しかしながら、０．３を超える相関は重要なものとして報告されており、〜１０−倍だけ全ての３つのクラスについて観察された正の相関の数を増加させるであろう。これらの相関は、更なる分析で用いられるデータ組の非常に小さいが重要なピースを表し、蛋白質設計、または機能的残基位置の予測を生じさせる。
Ｆ．共変動統計学の確証
Ｉｇ―折畳みデータベースから由来する強い共変動が有意であって、計算に基づく統計学的強さから離れて意味があることを確証するのに用いたいくつかの基準があった。第一のものは、相互に共変動する残基、および既知の構造のＩｇ−折畳み内部のそれらの近接性の間に傾向があるか否かを分析するものであった。文献中の従前の研究は、我々の結果と合致して、共変動する位置および相互に対するそれらの近接性の間に相関が存在するが、それらは非常に弱いことを示している。第二の基準は、既知のＩｇ−折畳みサブセット内に存在することが既に報告されているアミノ酸位置の間において、Ｉｇ―折畳み共変動計算が既知の関係を生じたか否かを見るものであった。１つの明らかなテストケースは、ヒト／ネズミＩｇＧ可変重鎖折畳み（Ｖ−クラスの一部）のＮ−末端におけるものであった。残基６ないし１０は、アミノ酸の共変動対の保存に基づく非常に特異的な確認を採用することが知られている（Ｅｗｅｒｔ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，（２００４），２４：１８４−１９９）。共変動アミノ酸の３つの報告された対のうち２つは、データ組の見掛けのバックグラウンドを十分に超える、約０．３を超えるφ値を有することが判明した。
（実施例１８）
慣用的ｐ５Ｅ８ ｓｃＦｖを含むＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）Ｐ５Ｅ８価抗体の調製。
ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標） ｐ５Ｅ８Ｇ１は、各々、ヒトガンマ１およびカッパ定常領域に融合したマカクザル重鎖および軽鎖可変領域を含有するキメラマカクザル／ヒト（ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標））である。ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８Ｇ１はヒトＣＤ２３、ＩｇＥに対する低親和性受容体（ＦｃεＲＩＩ）に結合する（Ｍａｖｒｏｍａｔｉｓ ａｎｄ Ｃｈｅｓｏｎ．２００３．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２１：１８７４；米国特許出願２００３００５９４２４）。四価ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８抗体は、実施例１ないし８に記載されたものと同様な戦略を用いて構築した。４価抗体を構築するために用いたＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ ｓｃＦｖは、ＶＬ→（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカー→ＶＨの向きに短いリンカーによって連結されたｐ５Ｅ８ ＶＬおよびＶＨ領域配列よりなり、実施例１９により詳細に記載する。正しい配列はＤＮＡ配列解析によって確認した。プラスミドＤＮＡを用いて、抗体蛋白質の安定な生産のためにＣＨＯ ＤＧ４４細胞を形質転換した。図８０は、慣用的なｓｃＦｖを含む重鎖Ｃ−末端４価ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８抗体のＤＮＡ配列を示す。図８１は、慣用的なｓｃＦｖを含む重鎖Ｃ−末端四価ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８抗体のアミノ酸配列を示す。図８２Ａは、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８軽鎖のＤＮＡ配列を示す。図８２Ｂは、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８軽鎖のアミノ酸配列を示す。
（実施例１９）
ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ ｓｃＦｖおよびＦａｂ蛋白質の調製
双方の向き（ＶＬ→（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカー→ＶＨ（ＶＬ／ＶＨ）およびＶＨ→（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカー→ＶＬ（ＶＨ／ＶＬ））のＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ ｓｃＦｖは、米国特許出願２００５０１６３７８２に記載されたプラスミドからＰＣＲ増幅によってサブクローンされた。構築で用いたオリゴヌクレオチドは表２２に示す。
ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標） ｐ５Ｅ８ ｓｃＦｖ（ＶＬ／ＶＨ）は、ｇｐＩＩＩリーダー配列の一部をコードする２９塩基、続いて、ｐ５Ｅ８ Ｎ−末端軽鎖可変ドメイン遺伝子に相補的な配列の１５塩基を含有する順方向プライマーＰ５Ｅ８−ＶＬ０１Ｆ、およびｐ５Ｅ８ Ｃ−末端重鎖可変ドメインに相補的な配列の１５塩基、続いて、ユニークな隣接するＳａｌ Ｉエンドヌクレアーゼ部位（エンドヌクレアーゼ部位は下線を施す）を含有する逆方向プライマーＰ５Ｅ８−ＶＨ０１Ｒを用いるＰＣＲによって構築した。同様に、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ ｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）は、ｇｐＩＩＩリーダー配列の一部をコードする２９塩基、続いての、ｐ５Ｅ８ Ｎ−末端可変重鎖ドメイン遺伝子に相補的な配列の１８塩基を含有する順方向プライマーＰ５Ｅ８−ＶＨ０１Ｆ、およびｐ５Ｅ８ Ｃ−末端可変軽鎖ドメイン遺伝子に相補的な配列の１２塩基、続いての、ユニークな隣接するＳａｌＩエンドヌクレアーゼ部位（エンドヌクレアーゼ部位に下線を施す）を含有する逆方向プライマーＰ５Ｅ８−ＶＬ０１Ｒを用いるＰＣＲによって構築した。
表２２ 慣用的なＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ ｓｃＦｖのＰＣＲ増幅用のオリゴヌクレオチド
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 ＰＣＲ増幅に従い、プライマーＰ５Ｅ８−Ｌｅａｄｅｒ０１を第二のＰＣＲ反応用の双方の反応に加えた。プライマーＰ５Ｅ８−Ｌｅａｄｅｒ０１は、ユニークなＮｄｅＩエンドヌクレアーゼ部位、続いて、ｇｐＩＩＩリーダー配列のＮ−末端部分をコードする２５塩基、続いて、Ｐ５Ｅ８−ＶＬ０１ＦおよびＰ５Ｅ８−ＶＨ０１Ｆの５’末端に相補的な２２塩基、および再度増幅されたＰＣＲを含有する。予測されるサイズに対応するＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分解し、切り出し、製造業者の指示に従い（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＤＡ抽出キットを用いて精製した。精製されたＰＣＲ産物を、引き続いて、ＮｄｅＩおよびＳａｌＩで消化し、誘導性ａｒａＣプロモーターの制御下で組換え蛋白質発現を駆動するように設計された修飾されたＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターのＮｄｅＩ／ＳａｌＩ部位にクローン化した。発現ベクターは、ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖの開始コドンと重複するユニークなＮｄｅＩ部位をコードする修飾を含有した。個々の連結反応はゲル精製ＰＣＲ産物、および消化された発現ベクターの各々で行い連結混合物の各々の一部を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ１−Ｂｌｕを形質転換した。アンピシリン薬物耐性コロニーをスクリーニングし、ＤＮＡ配列分析は、ｐＩＥＨ−１６２をコードする最終ｐ５Ｅ８（ＶＨ／ＶＬ）、およびｐＩＥＨ−１６３構築体をコードするｐ５Ｅ８（ＶＬ／ＶＨ）の正しい配列を確認した。ｐ５Ｅ８（ＶＬ／ＶＨ）ｓｃＦｖのＤＮＡおよびアミノ酸配列を、各々、図８３Ａおよび８３Ｂに示す。ｐ５Ｅ８（ＶＨ／ＶＬ）ｓｃＦｖのＤＮＡおよびアミノ酸配列を、各々、図８４Ａおよび８４Ｂに示す。
慣用的なｐ５Ｅ８ ｓｃＦｖの発現のために、プラスミドｐＩＥＨ−１６２およびｐＩＥＨ−１６３で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．Ｃａｔ．＃２７３２５）の新たに単離されたコロニーを培養し、培養上清またはペリプラズム抽出物を実施例４に記載されたように調製した。
ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ Ｆａｂは実施例１に記載された方法に従いＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ ＩｇＧの酵素消化によって調製した。精製されたＦａｂは２ないし１１ｍｇ／ｍＬの間まで濃縮した。ε２８０ｎｍ＝１．５ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を用い、Ｆａｂ濃度を決定した。
（実施例２０）
慣用的なｐ５Ｅ８ ｓｃＦｖ抗体の熱安定性
実施例４および５に記載された熱挑戦アッセイを用いて得られたＴ５０値、およびＤＳＣ分析（ｒ２＝０．９３）によって計算されたＴｍ値の間で、優れた相関が観察されたので、熱挑戦アッセイを使用して、ｐ５Ｅ８（ＶＬ／ＶＨ）およびｐ５Ｅ８（ＶＨ／ＶＬ）ｓｃＦＶの相対的熱安定性を評価した。１ｕｇ／ｍｌの可溶性ＣＤ２３抗原を用いて、プレートをコーティングし、Ｅｕ−標識抗―６Ｈｉｓ抗体（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ．Ｃａｔ．＃ＡＤ０１０９）の濃度を２５０ｎｇ／ｍｌまで増加させる以外は、実施例４および５に記載されたように、熱挑戦アッセイを利用した。このアッセイからの結果は、ｐ５Ｅ８（ＶＬ／ＶＨ）のＴ５０値を３８℃であると、およびｐ５Ｅ８（ＶＨ／ＶＬ）が３４℃よりもわずかに低いと決定した（図８５）。双方のｓｃＦｖの顕著に低いＴ５０値、および２つのｐ５Ｅ８（ＶＬ／ＶＨ）がわずかにより熱的に安定であるという観察を仮定して、ｐ５Ｅ８（ＶＬ／ＶＨ）を更なる安定性エンジニアリングのために選択した。
（実施例２１）
改良された熱的安定性を持つｐ５Ｅ８ ｓｃＦｖ分子の構築
実施例３および５に記載された方法を用いる慣用的ｐ５Ｅ８（ＶＨ／ＶＬ）ｓｃＦｖにおける所望のアミノ酸置換を含有するように設計された個々の変種およびライブラリーは、表２３にリストされたオリゴヌクレオチドを用いて従前に記載されたように作成した。
表２３において、各オリゴヌクレオチドの名称は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従ってＶｈまたはＶＬにおける位置でのアミノ酸置換に対する参照を与える。「原理」とは、使用された設計方法をいう。該方法は前記実施例５に詳細に記載されている。突然変異誘発残基は大文字として示される。ＶＨ／ＶＬジスルフィドを導入するためのオリゴヌクレオチド対はボックスに入れる。略語は：「ＣＯＭＰ」−計算解析、「ＣＯＶＡＲ」−共変動解析、「ＣＯＮＳ」−コンセンサススコアリング、「ＩＮＴＥＲ−ＶＨ／ＶＬ」界面設計、「ＳＳ」−ＶＨ−ＶＬジスルフィド結合、および「ＴＢＤ」−決定すべきことである。
表２３ 変種ｐ５Ｅ８（ＶＬ／ＶＨ）ｓｃＦｖの構築のためのオリゴヌクレオチドおよび原理
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 †突然変異誘発のために標的化された位置は下線によって示される。あいまいな延期は以下のように省略される：Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｖ＝ＡまたはＣまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｓ＝ＣまたはＧ、Ｍ＝ＡまたはＣ、Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴ、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｂ＝ＣまたはＧまたはＴ（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６１（１）：１３−７（１９８６））。
実施例５に詳細に記載された方法に従い、個々の形質転換されたコロニーを深い―ウェル９６ウェル皿に拾い処理し、およびスクリーニングした。形質転換体は、０．６％グリシン、０．６ ％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、０．０２％アラビノース、および５０μｇｍｌカルベニシリンを補足したＳＢ（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈａｌｆ Ｍｏｏｎ Ｂａｙ，Ｃａ．Ｃａｔ．＃Ｓ０１４０）よりなる発現培地中で３７℃または３２℃いずれかにおいて一晩成長させた。熱挑戦の後、凝集した物質を遠心によって除去し、実施例３に記載されたように可溶性ＣＤ２３ ＤＥＬＦＩＡにおいてアッセイした。Ｓｐｏｔｆｉｒｅ ＤｅｃｉｓｉｏｎＳｉｔｅソフトウェア（Ｓｐｏｔｆｉｒｅ，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，Ｍａ．）を用いてアッセイデータを処理し、各クローンについて、参照温度に対する挑戦温度で観察されたＤＥＬＦＩＡカウントの比率として表した。親プラスミドで観察されたものの２倍よりも大きな、またはそれと同等な比率を再現性よく与えたクローンはヒトと考えた。これらの陽性クローンからのプラスミドＤＮＡをｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ（Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって単離し、二次熱挑戦アッセイの確認のために、ならびにＤＮＡ配列決定のためにＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０に再度戻し形質転換した。
これらのアッセイからの一次および確認的結果を表２４に示す。本発明のいくつかの安定化されたｓｃＦｖ分子の結果、慣用的なｐ５Ｅ８ ｓｃＦｖと比較して結合活性の改良
（Ｔ５０＞３８℃）がもたらされた。特に、ｐ５Ｅ８ライブラリー位置ＶＨ６（Ｅ６Ｑ）、ライブラリー位置ＶＨ４９（Ｓ４９ＧおよびＳ４９Ａ）、ライブラリー位置ＶＨ４３（Ｑ４３Ｋ）、ライブラリー位置ＶＨ７２（Ｅ７２ＤおよびＥ７２Ｎ）、およびライブラリー位置ＶＨ７９（Ｆ７９Ｓ）のＴ５０値は、慣用的なｐ５Ｅ８ ｓｃＦｖに対して＋４℃ないし＋５℃の範囲の熱安定性の増加を呈した。ｐ５Ｅ８ライブラリー位置ＶＬ５０（Ｖ５０ＤおよびＶ５０Ｓ）、ライブラリー位置ＶＬ７５（Ｖ７５Ｉ）、ライブラリー位置ＶＬ８０（Ｐ８０Ｓ）、およびライブラリー位置ＶＬ８３（Ｆ８３Ａ、Ｆ８３Ｇ、Ｆ８３ＳおよびＦ８３Ｔ）のＴ５０値は、慣用的なｐ５Ｅ８ ｓｃＦｖに対して＋３℃ないし＋７℃の範囲の熱安定性の増加を呈した。
加えて、ｐ５Ｅ８ライブラリー位置ＶＨ３２（Ｎ３２Ｓ）およびライブラリー位置ＶＨ７９（Ｆ７９Ｙ）のＴ５０値は、慣用的なｐ５Ｅ８ ｓｃＦｖに対して＋２℃の熱安定性の増加を呈した。
突然変異の安定化は、実施例５に記載された設計方法の仕分けを用いて同定された−ＶＨ６（Ｅ６Ｑ）、ＶＬ７５（Ｖ７５Ｉ）、ＶＬ８０（Ｐ８０Ｓ）およびＶＬ８３（Ｆ８３Ａ、Ｆ８３Ｇ、Ｆ８３ＳおよびＦ８３Ｔ）突然変異は計算解析を用いて誘導し、ＶＨ３２（Ｎ３２Ｓ）突然変異はコンセンサススコアリングを用いて誘導し、および４つの突然変異ＶＨ４９（Ｓ４９ＧおよびＳ４９Ａ）、ＶＨ４３（Ｑ４３Ｋ）、ＶＨ７２（Ｅ７２ＤおよびＥ７２Ｎ）、ＶＨ７９（Ｆ７９ＳおよびＦ７９Ｙ）突然変異は、共変動解析を用いて誘導し、およびＶＬ５０（Ｖ５０ＤおよびＶ５０Ｓ）突然変異はＶＨ／ＶＬ界面解析、有用性の確証、およびこれらの設計ツールの新規性を用いて誘導した。ＶＨ４３ＱおよびＶＨ３２Ｓ突然変異をＶＨ４９Ｇ、ＶＨ７２Ｄ、またはＶＨ４９Ａ安定化突然変異と組み合わせると、５３℃までのｐ５Ｅ８の熱安定性（Ｔ５０）、慣用的なｐ５Ｅ８ ｓｃＦｖに対する１５℃の増加を増強した。
表２４ ｐ５Ｅ８ ＶＨおよびＶＬライブラリー位置、ライブラリー組成、およびスクリーニングの結果
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 表２５は、慣用的なｓｃＦｖに導入された種々の個々のおよび組み合わされた安定化性突然変異の包括的な熱安定性解析の結果を示す。安定化性突然変異が同定され、これは、組み合わせに際して、慣用的なｐ５Ｅ８ ｓｃＦｖに対して＋１０℃ないし＋１５℃の範囲の熱安定性の増加を呈した。これらの結果は、実施例５に示したと同様に、活性の改良は相加的であり、および本発明に記載された方法が、該方法の一般的な有用性を示す第二のテストｓｃＦｖの熱安定性特性を改良することができることを示す。
表２５ 変種蛋白質を生産するのに用いたｐ５Ｅ８構築体の特徴、および熱挑戦アッセイからのＴ５０結果
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 （実施例２２）
安定化されたｐ５Ｅ８四価抗体の生産
本発明の安定化されたｐ５Ｅ８ ｓｃＦｖを用いて、図１３に示された立体配置と同様なＮ−末端およびＣ−末端ｓｃＦｖ融合双方としての四価抗体を構築する。
Ａ．ＮＨ−ｐ５Ｅ８四価抗体の構築
実施例２１に記載されたｐ５Ｅ８ ｓｃＦｖ ＤＮＡを用いて、前記実施例７に記載されたのと同様なＮＨ−ｐ５Ｅ８四価抗体を構築する。（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５リンカーを用いて、ｐ５Ｅ８ ｓｃＦｖをＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ ＩｇＧ重鎖の成熟アミノ末端に連結させる。該分子の組織化はｐ５Ｅ８ ｓｃＦｖ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５リンカー−ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ ＩｇＧ重鎖である。この分子は軽鎖と共に組立てられて、四価抗体を形成する。正しい配列はＤＮＡ配列解析によって確認されるであろう。該構築体は、ＮＨ−ｐ５Ｅ８四価抗体の大規模生産のために、実施例８に記載されたようにＣＨＯ細胞をトランスフェクトするのに用いることができよう。トランスフェクトされたＣＨＯ細胞は、ＤＥＬＦＩＡアッセイによって、固定化されたＣＤ２３抗原への結合についてスクリーニングすることができる。９６−ウェルプレート。例えば、（ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，Ｃａｔ．＃４３７１１１）は、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．５中の１ｕｇ／ｍｌにおいて可溶性ＣＤ２３抗原でコーティングすることができる。プレートは４℃にて一晩コーティングし、室温にて震盪しつつ、ＤＥＬＦＩＡアッセイ緩衝液（ＤＡＢ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５％ ＢＳＡ，０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ２０，０．０１％ ＮａＮ３，ｐＨ ７．４）で１時間ブロックする。プレートはＢＳＡ（洗浄緩衝液）なくしてＤＡＢで３回洗浄し、ＤＡＢに希釈されたテスト試料を、１００ｕｌの最終容量にてプレートに加える。室温にて振盪しつつ、プレートを１時間インキュべートし、次いで、洗浄緩衝液で３回洗浄して、未結合物質を除去する。結合された抗体は、２５０ｎｇ／ｍｌのＥｕ−標識ヒト抗体（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，Ｃａｔ．＃１２４４−３３０）を含有するＤＡＢのウェル当たり１００μｇ添加によって検出し、振盪しつつ室温にて１時間インキュベートする。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、および１００ｕｌのＤＥＬＦＩＡ増強溶液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，Ｃａｔ．＃４００１−００１０）をウェル当たり加える。１５分間のインキュベーションに続いて、Ｖｉｃｔｏｒ ２プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）にてユーロピウム方法を用いてプレートを読む。
Ｂ．Ｃ−ｐ５Ｅ８四価抗体の構築
前記実施例２１に記載されたｐ５Ｅ８ ｓｃＦｖ ＤＮＡを用いて、前記実施例７に記載されたようにＣ−ｐ５Ｅ８四価抗体を構築する。Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーペプチドを用いて、ｐ５Ｅ８ ｓｃＦｖをＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ ＩｇＧ重鎖のカルボキシ末端に連結させる。分子の組織化はＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８ ＩｇＧ重鎖−Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカー−ｐ５Ｅ８ ｓｃＦｖである。この分子を軽鎖とで組立てて、四価抗体を形成する。正しい配列はＤＮＡ配列解析によって確認されるであろう。構築体は、Ｃ−ｐ５Ｅ８四価抗体の大規模生産のために、実施例８に記載されたように、ＣＨＯ細胞をトランスフェクトするのに用いることができよう。トランスフェクトされたＣＨＯ細胞は、前記したようにスクリーニングすることができる。
同等物
当業者であれば、ルーチン的実験のみを用い、本明細書中に記載された発明の具体的な実施対応に対して多くの同等物を認識し、あるいはそれを確認することができるであろう。そのような同等物は、特許請求の範囲に含まれることを意図する。
図１Ａは、（太文字タイプで示された）（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーを含む慣用的なＢＨＡ１０ｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列（配列番号：３）を示す。図１Ｂは、慣用的なＢＨＡ１０ｓｃＦｖ構築体のアミノ酸配列（配列番号：４）を示す。 図２は、ＢＨＡ１０の精製された慣用的ＦａｂまたはｓｃＦｖ断片での示差走査熱量測定（ＤＳＣ）の結果を示す。図２Ａは、ＢＨＡ１０の慣用的ＦａｂおよびｓｃＦｖ断片の折畳み解除を比較するＤＳＣ実験の結果を示す。図２Ｂは、１℃／分および２℃／分の走査速度での精製されたＢＨＡ１０ｓｃＦｖのＤＳＣ走査の結果を示す。 図３Ａは、（太文字タイプで示された）（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーを含む安定化されたＶＨ４４／ＶＬ１００ジスルフィド−安定化ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ構築体をコードするＤＮＡ配列（配列番号：９）を示す。図３Ｂは、ＶＨ４４／ＶＬ１００ジスルフィド−安定化ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ構築体のアミノ酸配列（配列番号：１０）を示す。ＶＨ４４／ＶＬ１００ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は太文字のイタリック体で示す。 図４Ａは、（太文字タイプで示された）（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーを含む安定化されたＢＨＡ１０ｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列（配列番号：１４）を示す。図４Ｂは、（Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ）４ ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ構築体のアミノ酸配列（配列番号：１５）を示す。注釈は図４Ａと同一である。 図５Ａは、（太文字タイプで示された）（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５リンカーを含むＢＨＡ１０ｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列（配列番号：１６）を示す。図５Ｂは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５ ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ構築体のアミノ酸配列（配列番号：１７）を示す。注釈は図５Ａと同一である。 図６は、慣用的ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ（レーン１）および本発明の安定化されたＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ分子（レーン２ないし４）の発現レベルを比較するウェスタンブロット分析の結果を示す。各資料は還元（左側パネル）および非−還元（右パネル）条件下で電気詠動に付した。 図７Ａは、（太文字タイプで示された）（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーを含むＶＨ４４／ＶＬ１００ジスルフィド安定化ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列（配列番号：１８）を示す。図７Ｂは、ＶＨ４４／ＶＬ１００ジスルフィド＋（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４−安定化ＢＨＡ１０ｓｃＦｖのアミノ酸配列（配列番号：１９）を示す。注釈は図７Ａと同一である。ＶＨ４４／ＶＬ１００ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は太文字のイタリック体で示す。 図８は、熱挑戦アッセイの結果を示し、該アッセイでは、本発明の安定化されたＢＨＡ１０ｓｃＦｖ分子の熱安定性を慣用的ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ分子のそれと比較した。ｓｃＦｖ分子の５０％がそれらの結合活性を保有する温度（Ｔ５０）は図面の脚注に示す。 図９は慣用的ＢＨＡ１０ｓｃＦｖおよびａＢＨＡ１０ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ ｓｃＦｖで行った示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析の結果を示す。 図１０は、慣用的なＢＨＡ１０ｓｃＦｖ，ＢＨＡ１０（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ ｓｃＦｖ およびＢＨＡ１０ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ ｓｃＦｖへの疎水性蛍光色素１−アニリノ−８−ナフタリンスルホネート（ＡＮＳ）の結合の結果を示す。 図１１は、ＢＨＡ１０ＶＨおよびＶＬドメインの残基頻度分析の結果を示す。図１１Ａは、ＩｇＧ可変ドメイン配列の残基頻度分析に基づくスクリーニングのためのＢＨＡ１０ＶＨライブラリー位置をリストする。図１１Ｂは、ＩｇＧ可変ドメイン配列の残基頻度分析に基づくスクリーニングのためのＢＨＡ１０ＶＬライブラリー位置をリストする。 図１２は、熱挑戦アッセイの結果を示し、該アッセイでは、熱安定性に対する安定化性ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ突然変異の効果、および安定化性突然変異の相加性を評価した。（ＧＳ３は（Ｇ４Ｓ）３を示し、ＧＳ４は（Ｇ４Ｓ）４を示し；ＳＳはジスルフィド結合を示す） 図１３は、本発明の例示的な安定化されたＬＴβＲ／ＴＲＡＩＬ−Ｒ２二特異的抗体（「Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（ハーキュレズ）」抗体）を示す。Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体は、本発明の安定化されたＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ分子の１４Ａ２ ＩｇＧ抗体への融合によって形成される。ｓｃＦｖ分子は重鎖（Ｃ−ＨｅｒｃｕｌｅｓまたはＮＨ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）のＣ−末端またはＮ−末端へ、あるいは軽鎖のＮ−末端（ＮＬ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）に融合させることができる。 図１４は、慣用的および作製されたＢＨＡ１０ｓｃＦｖを、１４Ａ２重鎖のアミノ末端（図１４Ａ）またはカルボキシル末端（図１４Ｂ）へ融合させるのに用いる順次のＰＣＲ反応を模式的に示す。 図１５Ａは、シグナルペプチド（下線を施す）を含むキメラ１４Ａ２軽鎖のＤＮＡ配列（配列番号：２８）を示す。図１５Ｂは、キメラ１４Ａ２軽鎖のアミノ酸配列（配列番号：２９）を示す。 図１６は、慣用的なＢＨＡ１０ｓｃＦｖ ＮＨ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓの重鎖のＤＮＡ配列（配列番号：３０）を示す。 図１７は、慣用的ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ ＮＨ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓのアミノ酸配列（配列番号：３１）を示す。 図１８は、ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ ＮＨ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓの重鎖のＤＮＡ配列（配列番号：３２）を示す。 図１９は、ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ ＮＨ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓの重鎖のアミノ酸配列（配列番号：３３）を示す。 図２０は、ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ ＶＨ４４：ＶＬ１００Ｎ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓの重鎖のＤＮＡ配列（配列番号：３４）を示す。 図２１は、ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ ＶＨ４４：ＶＬ１００ＮＨ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓの重鎖のアミノ酸配列（配列番号：３５）を示す。 図２２は、ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ ＮＨ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓの重鎖のＤＮＡ配列（配列番号：３６）を示す。 図２３は、ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ ＮＨ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓの重鎖のアミノ酸配列（配列番号：３７）を示す。 図２４は、慣用的なＢＨＡ１０ｓｃＦｖ Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓの重鎖のＤＮＡ配列（配列番号：４４）を示す。 図２５は、慣用的なＢＨＡ１０ｓｃＦｖ Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓの重鎖のアミノ酸配列（配列番号：４５）を示す。 図２６は、ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓの重鎖のＤＮＡ配列（配列番号：４６）を示す。 図２７は、ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓの重鎖のアミノ酸配列（配列番号：４７）を示す。 図２８は、ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ ＶＨ４４：ＶＬ１００ Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓの重鎖のＤＮＡ配列（配列番号：４８）を示す。 図２９は、ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ ＶＨ４４：ＶＬ１００ Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓの重鎖のアミノ酸配列（配列番号：４９）を示す。 図３０は、ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓの重鎖のＤＮＡ配列（配列番号：５０）を示す。 図３１は、ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓの重鎖のアミノ酸配列（配列番号：５１）を示す。 図３２は、ＣＨＯ細胞における一過的に発現されたＣ−およびＮＨ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ二特異的抗体のウェスタンブロット分析からの結果を示す。左側パネルは非−還元条件下で分析し、右側パネルは還元条件下で分析する。 図３３は、本発明の安定化されたＨｅｒｃｕｌｅｓ抗体の、ＬＴβＲ受容体への結合活性を評価するＥＬＩＳＡの結果を示す。図３３Ａは、安定化されたＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体での結果を示す。図３３Ｂは、安定化されたＮＨ Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体での結果を示す。「ｗｔ」は、慣用的なＮＨ Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体である。「ＧＳ４」は安定化された（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ ｓｃＦｖを含む安定化されたＮＨ Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体である。「ｄｓ」は、ＶＨ４４／ＶＬ１００ジスルフィドリンカーを含む安定化されたｓｃＦｖを含む安定化されたＮＨ Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体である。 図３４は、本発明の安定化されたＨｅｒｃｕｌｅｓ抗体の、ＴＲＡＩＬ Ｒ２受容体への結合活性を評価するＥＬＩＳＡの結果を示す。図３４Ａは、安定化されたＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体での結果を示す。図３４Ｂは、安定化されたＮＨ Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体での結果を示す。「ｗｔ」はＮＨ Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体である。「ＧＳ４」は、安定化された（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ ｓｃＦｖを含む安定化されたＮＨ Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体である。「ｄｓ」は、ＶＨ４４／ＶＬ１００ジスルフィドリンカーを含む安定化されたｓｃＦｖを含む安定化されたＮＨ Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体である。 図３５は、プロテインＡクロマトグラフィーに従う安定化されたＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ二特異的抗体のＳＥＣ分析の結果を示す。 図３６は、精製された安定化されたＨｅｒｃｕｌｅｓ二特異的抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。図３６Ａは、ＮＨ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ二特異的抗体での結果を示す。図３６Ｂは、Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ二特異的抗体での結果を示す。５ｕｇの試料を各レーンにおいて負荷した。 図３７は、精製された安定化されたＮ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ二特異的抗体の分析的ＳＥＣ分析の結果を示す。パネルＡは、プロテインＡクロマトグラフィーに従うＶＨ４４：ＶＬ１００ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖでのＮ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓのプロフィールを示し、パネルＢは、分取用ＳＥＣに従うものを示す。パネルＣは、プロテインＡクロマトグラフィーに従うＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇ４Ｓ）４ ＢＨＡ１０ｓｃＦｖでのＮ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓのプロフィールを示し、パネルＤは、分取用ＳＥＣに従うものを示す。 図３８は、精製された安定化されたＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ二特異的抗体の分析的ＳＥＣ分析の結果を示す。パネルＡは、プロテインＡクロマトグラフィーに従うＶＨ４４：ＶＬ１００ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖでのＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓのプロフィールを示し、パネルＢは分取用ＳＥＣに従うものを示す。パネルＣは、プロテインＡクロマトグラフィーに従うＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇ４Ｓ）４ ＢＨＡ１０ｓｃＦｖでのＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓのプロフィールを示し、パネルＤは分取用ＳＥＣに従うものを示す。 図３９は、慣用的ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇ４Ｓ）４ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖでのＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、および慣用的ＢＨＡ１０ｓｃＦｖでのＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓで行った示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析の結果を示す。 図４０は、本発明の安定化されたＨｅｒｃｕｌｅｓ抗体の、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２およびＬＴβＲ Ｉｇ受容体への二特異的結合活性を評価するＥＬＩＳＡの結果を示す。Ｎ−「Ｈｅｒｃｕｌｅｓ」ＣｙｓおよびＣ−「Ｈｅｒｃｕｌｅｓ」Ｃｙｓは、ＶＨ４４／ＶＬ１００ジスルフィド結合を有するＮＨ−またはＣ−末端ｓｃＦｖを含むＨｅｒｃｕｌｅｓ抗体である。Ｎ−「Ｈｅｒｃｕｌｅｓ」ＣｙｓおよびＮ−「Ｈｅｒｃｕｌｅｓ」ＤＭは、ＶＨ４４／ＶＬ１００ジスルフィドおよび（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーを含むＮＨ−またはＣ−末端ｓｃＦｖを含むＨｅｒｃｕｌｅｓ抗体である。ＣＢＥ１１ペンタマーは、一特異的ＬＴβＲ結合活性を持つ対照抗体である。 図４１は、腫瘍細胞成長に対する、安定化されたＮ−およびＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ二特異的および一特異的抗体の効果を示す。図４１Ａないし４１Ｄは、各々、ＷｉＤｒ腫瘍細胞、Ｍｅ１８０腫瘍細胞、ＭＤＡ２３１腫瘍細胞、およびＨＵＶＥＣ細胞に対する効果を示す。 図４１は、腫瘍細胞成長に対する、安定化されたＮ−およびＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ二特異的および一特異的抗体の効果を示す。図４１Ａないし４１Ｄは、各々、ＷｉＤｒ腫瘍細胞、Ｍｅ１８０腫瘍細胞、ＭＤＡ２３１腫瘍細胞、およびＨＵＶＥＣ細胞に対する効果を示す。 図４２は、安定化されたｓｃＦｖを含む安定化された２鎖キメラミニボディの模式的ダイアグラムを示す。例示的ミニボディは、ＴＲＡＩＬ Ｒ２抗原に対する結合特異性を持つ安定化されたｓｃＦｖを含む第一の鎖部分、およびＬＴβＲ抗原に対する結合特異性を持つ安定化されたｓｃＦｖを含む第二の鎖部分を含有する。ｓｃＦｖにおけるＶＨおよびＶＬドメインの向きを変化させることができ、各結合特異性を改変することができる。 図４３は、アミノ末端に付着された本発明の安定化されたｓｃＦｖ断片を含む例示的な安定化二特異的２鎖ダイマー四価ミニボディ（安定化された二特異的Ｎ−ｓｃＦｖ四価ミニボディ）の模式的ダイアグラムを示す。例示的な安定化された二価四価ミニボディは、ＴＲＡＩＬ Ｒ２抗原に対する結合特異性を持つ２つの安定化されたｓｃＦｖを含む第一の鎖部分、およびＬＴβＲ抗原に対する結合特異性を持つ２つの安定化されたｓｃＦｖを含む第二の鎖部分を含有する。他の立体配置も可能であり、例えば、該二特異的四価ミニボディは、各鎖部分が異なる特異性を持つ２つの安定化されたｓｃＦｖ断片を含有するように構築することができる。もう１つの具体例において、ｓｃＦｖにおけるＶＨおよびＶＬドメインの向きを変化させることができる。もう１つの具体例において、全てよりは少ないｓｃＦｖを安定化させる。 図４４は、二価ミニボディの双方のカルボキシル末端に付着された安定化されたｓｃＦｖ断片を含む例示的な安定化された二特異的２鎖ダイマー四価ミニボディ（安定化された二特異的Ｃ−ｓｃＦｖ四価ミニボディ）の模式的ダイアグラムを示す。例示的な安定化された二価四価ミニボディは、ＴＲＡＩＬ Ｒ２抗原に対する結合特異性を持つ２つの安定化されたｓｃＦｖを含む第一の鎖部分、およびＬＴβＲ抗原に対する結合特異性を持つ２つの安定化されたｓｃＦｖを含む第二の鎖部分を含有する。他の立体配置も可能であり、例えば、二特異的２−鎖ダイマー四価ミニボディは、各鎖が異なる特異性を持つ２つの安定化されたｓｃＦｖ断片を含有するように構築することができる。もう１つの具体例において、ｓｃＦｖにおけるＶＨおよびＶＬドメインの向きを変化させることができる。もう１つの具体例において、全てよりも少ないｓｃＦｖを安定化させる。 図４５は、本発明の安定化されたｓｃＦｖを含む安定化された二特異的４鎖ダイマーダイアボディの模式的ダイアグラムを示す。他の立体配置も可能であり、例えば、安定化された二特異的２−鎖ダイマー四価ミニボディは、各アームが異なる特異性を持つ安定化されたｓｃＦｖ断片を含有するように構築することもできる。ＶＨおよびＶＬドメインの向きを変化させることができる。もう１つの具体例において、全てよりも少ないｓｃＦｖを安定化させる。 図４６は、ＣＨ３のカルボキシル末端に付着した安定化されたｓｃＦｖ、およびペプチドを連結するヒンジを含む安定化された二特異的４鎖ダイマー四価ｓｃＦｖ抗体の模式的ダイアグラムを示す。安定化されたｓｃＦｖにおけるＶＨおよびＶＬドメインの向きを変化させることができる。別法として、安定化されたｓｃＦｖ断片を重鎖または軽鎖いずれかの部分のアミノ末端に付着させて、各々、ＮＨ−ｓｃＦｖ四価抗体またはＮＬ−ｓｃＦｖ四価抗体を形成することができる。 図４７は、ＣＨ３のカルボキシル末端に付着された安定化されたｓｃＦｖ、およびペプチドを連結するヒンジを含む安定化された４−鎖四価Ｃ−ｓｃＦｖＣＨ２ドメイン欠失二特異的抗体（安定化されたＣ−ｓｃＦｖ四価ＣＨ２ドメイン欠失二特異的抗体）の模式的ダイアグラムを示す。二特異的抗体の各重鎖部分は、ＴＲＡＩＬ Ｒ２抗原に対する結合特異性を持つＦｖ領域、およびＬＴβＲ抗原に対する結合特異性を持つ安定化されたｓｃＦｖ領域を含有する。安定化されたｓｃＦｖにおけるＶＨおよびＶＬドメインの向きは変化させることができ、各抗原結合特異性を改変することができる。もう１つの具体例において、全てより少ないｓｃＦｖを安定化させる。 図４８は、ＶＨのアミノ末端に付着された安定化されたｓｃＦｖを含み、およびペプチドを連結するヒンジを含む安定化された４−鎖四価ｓｃＦｖＣＨ２ドメイン欠失二特異的抗体（安定化されたＮＨ−ｓｃＦｖ四価ＣＨ２ドメイン欠失二特異的抗体）の模式的ダイアグラムを示す。二特異的抗体の各重鎖部分は、ＴＲＡＩＬ Ｒ２抗原に対する結合特異性を持つＦｖ領域、およびＬＴβＲ抗原に対する結合特異性を持つ安定化されたｓｃＦｖ領域を含有する。安定化されたｓｃＦｖにおけるＶＨおよびＶＬドメインの向きを変化させることができ、各抗原結合特異性を改変することができる。もう１つの具体例において、全てよりも少ないｓｃＦｖが安定化される。 図４９は、ＶＬのアミノ末端に付着された安定化されたｓｃＦｖを含み、およびペプチドを連結するヒンジを含む安定化された４−鎖四価ｓｃＦｖＣＨ２ドメイン欠失二特異的抗体（安定化されたＮＬ−ｓｃＦｖ四価ＣＨ２ドメイン欠失二特異的抗体）を含有する。二特異的抗体の各重鎖部分は、ＴＲＡＩＬ Ｒ２に対する結合特異性を持つＦｖ領域、およびＬＴβＲ抗原に対する結合特異性を持つ安定化されたｓｃＦｖ領域を含有する。安定化されたｓｃＦｖにおけるＶＨおよびＶＬドメインの向きを変化させることができ、各抗原結合特異性を改変することができる。もう１つの具体例において、全てよりも少ないｓｃＦｖを安定化させる。 図５０は、野生型ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ（塗り潰ぶした丸印）−対−ＶＬ＿Ｓ４６Ｌ（図５０Ａ、塗り潰ぶしていない丸印）、ＶＨ＿Ｖ５５Ｇ（図５０Ｂ、塗り潰ぶしていない丸印）、およびＶＨ Ｐ１０１Ｄ（塗り潰ぶしていない丸印）（図５０Ｃ）安定化性突然変異を含有するＢＨＡ１０ ｓｃＦｖのＴ５０曲線を示す。 図５１は、野生型ＶＨ−（ＧＳ）４−ＶＬ−６Ｈｉｓ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ（灰色の線）−対−ＶＬ Ｓ４６Ｌ（黒色の線）（図５１Ａ）およびＶＨ Ｖ５５Ｇ（黒色の線）（図５１Ｂ）安定化性突然変異を含有するＢＨＡ１０ ｓｃＦｖｂのＤＳＣ曲線を示す。 図５２は、野生型ＶＨ−（ＧＳ）４−ＶＬ−６Ｈｉｓ ＢＨ１０ ｓｃＦｖ（灰色の線）−対−ＶＨ＿Ｐ１０１Ｄ安定化性突然変異を含有するＢＨ１０ ｓｃＦｖ（黒色の線）のＤＳＣ曲線を示す。 図５３は、野生型（「ＷＴ（Ｇ４Ｓ）Ｘ３」）および安定化された突然変異体ｓｃＦｖのＤＳＤ−Ｐａｇｅ分析を示す。全ての突然変異体ｓｃＦｖは、Ｎ−末端ＶＨおよびＣ−末端ＶＬの間に式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４のペプチドを連結するｇｌｙ−ｓｅｒ（「（Ｇ４Ｓ）Ｘ４」）を含有する。各レーンにおけるｓｃＦｖの同一性を示す。レーン１２ないし１４は、ＶＨ４４およびＶＬ１００の間のジスルフィド結合を有するＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを含有する。（Ｇ４Ｓ）Ｘ４／ジスルフィド安定化ｓｃＦｖを「二重突然変異体」の代わりに「ＤＭ」という。最後の２つのレーンは、ジスルフィド連結ｓｃＦｖに対してやはり安定化された命名された突然変異を含む。 図５４Ａは、野生型（「ＶＨ−（ＧＳ）４−ＶＬ−６Ｈｉｓ」）ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ（ダッシュ線）、ＶＨ Ｓ１６Ｅ突然変異体ｓｃＦｖ（薄い灰色の線）、ＶＬ Ｓ４６Ｌ突然変異体ｓｃＦｖ（薄い黒色の線）、ＶＨ Ｖ５５Ｇ突然変異体ｓｃＦｖ（濃い灰色の線）、およびＶＨ Ｐ１０１Ｄ突然変異体ｓｃＦｖ（薄い黒色の線）のＤＳＣ曲線を示す。図５４Ｂは、ＰＢＳ中の（塗り潰ぶしていない丸印）、あるいは野生型（「ＶＨ−（ＧＳ）４−ＶＬ−６Ｈｉｓ」）ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ（塗り潰ぶした灰色の丸印）、ＶＨ Ｓ１６Ｅ突然変異体ｓｃＦｖ（菱形）、ＶＬ Ｓ４６Ｌ突然変異体ｓｃＦｖ（四角）、ＶＨ Ｖ５５Ｇ突然変異体ｓｃＦｖ（倒立した三角形）、およびＶＨ Ｐ１０１Ｄ突然変異体ｓｃＦｖ（三角形）の存在下における１０ｍＭ ＡＮＳの温度依存性蛍光を示す。曲線を通る直線は２−状態折畳み解除モデルに対するフィットである。 図５５は、野生型および突然変異体ｓｃＦｖの存在下における１５℃でのＡＮＳ蛍光を示す。各ｓｃＦｖによって誘導されたＡＮＳ蛍光を、ＤＳＣ（図５５Ａ）、および各ｓｃＦｖの折畳み解除転移によるＡＮＳ蛍光の温度−依存性増加（図５５Ｂ）によって決定された同一ｓｃＦｖのＶＨドメインのＴＭに対してプロットする。 図５６は、６つの時点（Ｔ＝０、Ｔ＝１週、Ｔ＝２週、Ｔ＝１ヶ月、Ｔ＝２ヶ月およびＴ＝３ヶ月）および低温（２ないし８℃）における、高濃度の安定化されたＮ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（ＸＷＵ０２８；ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４Ｎ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ；図５６Ａ）、安定化されたＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（ＸＷＵ０３６；ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ；図５６Ｂ）、および野生型ＢＨＡ１０抗体（図５６Ｃ）のサイズ−排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を示す。ｘ−軸は時間（分）であって、ｙ−軸は２８０ｎｍにおけるｍＡＵ（吸光度単位）である。溶出プロフィールの有意な変化は経時的に観察されなかった。 図５７は、２ないし８℃における貯蔵前、およびその３ヶ月後における、ＸＷＵ０２８およびＸＷＵ０３６のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。パネルＡ。試料は還元されていなかった（「ＮＲ」と命名する）。予測されたＭＷ、〜２００ｋＤａは二特異的試料で観察される。ＢＨＡ１０は〜１５０ｋＤａのその予測されたＭＷにおいて移動する。レーン１ないし４はＸＷＵ０２８試料である。レーン５ないし８はＸＷＵ０３６試料である。レーン９ないし１０はＢＨＡ１０ ＩｇＧ試料である。パネルＢ。試料はＤＴＴで還元した（還元されたについては「赤色」として示す）。重鎖の予測されるＭＷである〜７５ｋＤａ、および軽鎖の予測されるＭＷである〜２５ｋＤａが、還元条件下で二特異的試料で観察される。ＢＨＡ１０重鎖および軽鎖は、還元条件下で、各々、５０ｋＤａおよび２５ｋＤａのそれらの予測されるＭＷで移動する。レーン１、２、６および７はＸＷＵ０２８試料である。レーン３、４、８および９はＸＷＵ０３６試料である。レーン５および１０はＢＨＡ１０ ＩｇＧ試料である。 図５８は、Ｔ＝０、Ｔ＝１ヶ月、およびＴ＝３ヶ月におけるＸＷＵ０２８（パネルＡ）およびＸＷＵ０３６（パネルＢ）の完全な質量分析を示す。ＣＨ２におけるＮ−結合炭水化物の種々のレベルのシリル化のため多数のピークが各蛋白質で観察される。二特異性の炭水化物分布は標準ＩｇＧ１蛋白質で典型的である。 図５９は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２およびＬＴβＲ受容体に対する、Ｎ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（ＸＷＵ０２８；図５６Ａ）またはＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（ＸＷＵ０３６；図５６Ｂ）を含有する血清試料の二特異的結合を測定するサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。 図６０は、安定化された二特異的抗体（ＸＷＵ０２８（菱形）およびＸＷＵ０３６（塗り潰ぶしていない四角））、および一特異的抗体単独で（ｈＣＢＥ１１（塗り潰ぶした三角形）（ｈＢＨＡ１０（倒立した三角形））およびｃｈ１４Ａ２（菱形））および組合せて（塗り潰ぶしていない三角形）腫瘍異種移植片マウスモデルに対して投与された一特異的抗体の相対的イン・ビボ活性を評価する実験の結果を示す。投与は１３日に開始した。ｈＣＢＥ１１ ｖ．ＶＣ：Ｐ＜０．００１；ｈＢＨＡ１０ ｖ．ＶＣ：Ｐ＜０．００１；ｃｈ１４Ａ２ ｖ．ＶＣ：Ｐ＜０．０１；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ−ＩＩ ＸＷＵ０２８ ｖ．ＶＣ．：Ｐ＜０．００１；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ−ＩＩ ＸＷＵ０２８ ｖ．ｈＢＨＡ１０：Ｐ＜０．０５；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ−ＩＩ ＸＷＵ０２８ ｖ．ｃｈ１４Ａ２：Ｐ＜０．００５；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ−ＩＩ ＸＷＵ０３６ ｖ．ＶＣ：Ｐ＜０．００１；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ−ＩＩ ＸＷＵ０３６ ｖ．ｈＢＨＡ１０：Ｐ＜０．０１；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ−ＩＩ ＸＷＵ０３６ ｖ．ｃｈ１４Ａ２：Ｐ＜０．０５；ｃｏｍｂｏ ｖ．Ｖ．Ｃ．：Ｐ＜０．００１。 図６１は、Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ ＶＨ Ｓ１６Ｅ ＋ ＶＬ Ｓ４６Ｌ二特異的抗体についての重鎖ＤＮＡ配列（配列番号：５２）を示す。 図６２は、Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ ＶＨ Ｓ１６Ｅ ＋ ＶＬ Ｓ４６Ｌ二特異的抗体についての重鎖アミノ酸配列（配列番号：５３）を示す。 図６３は、Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ ＶＨ４４−ＶＬ１００／ＶＨ Ｓ１６Ｅ ＋ ＶＬ Ｓ４６Ｌ二特異的抗体についての重鎖ＤＮＡ配列（配列番号：５４）を示す。 図６４は、Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ ＶＨ４４−ＶＬ１００／ＶＨ Ｓ１６Ｅ ＋ ＶＬ Ｓ４６Ｌ二特異的抗体についての重鎖アミノ酸配列（配列番号：５５）を示す。 図６５は、安定化されたＶＨ Ｓ１６Ｅ ＋ ＶＬ Ｓ４６Ｌ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖ （ＸＷＵ０５４）を持つＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、および慣用的な（「ＷＴ」）ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを持つＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓを含有する上清からのプロテインＡ溶出物の分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の結果を示す。 図６６は、ＶＨ Ｓ１６Ｅ ＋ ＶＬ Ｓ４６Ｌ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを持つ精製されたＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（図６６Ａ）、およびＶＨ４４：ＶＬ１００／ＶＨ Ｓ１６Ｅ ＋ ＶＬ Ｓ４６Ｌ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを持つ精製されたＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（図６６Ｂ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。 図６７は、ＶＨ Ｓ１６Ｅ ＋ ＶＬ Ｓ４６Ｌ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを持つＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（図６７Ａ）、およびＶＨ４４：ＶＬ１００／ＶＨ Ｓ１６Ｅ ＋ ＶＬ Ｓ４６Ｌ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを持つＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（図６７Ｂ）の、初期プロテインＡ精製工程に続いての分析的ＳＥＣ溶出プロフィールを示す。 図６８は、ＶＨ Ｓ１６Ｅ ＋ ＶＬ Ｓ４６Ｌ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを持つＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（ＸＷＵ０５４）、およびＶＨ４４：ＶＬ１００／ＶＨ Ｓ１６Ｅ ＋ ＶＬ Ｓ４６Ｌ ＢＨＡ１０ ｓｃＦｖを持つＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（ＸＷＵ０５５）の活性のイン・ビトロ腫瘍細胞増殖アッセイの結果を示す。ＭＤＡ２３１（図６８Ａ）およびＷｉＤｒ細胞（図６８Ｂ）は共に抗体が投与された。Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体双方についての活性を、単独で、または組合せて投与された、安定化されたＸＷＵ０３６二特異的抗体、および一特異的抗体（ｈＢＨＡ１０およびｃｈ１４Ａ２）と比較した。 図６９Ａは、残存する１８のＢＩＩＢヒト（化）抗体で用いるのと同一の条件下で取られたＢＩＩＢ７ ＩｇＧ１のＤＳＣ折畳み解除曲線を示す（実線）。ＤＳＣ曲線内で明らかな個々のＦａｂ、ＣＨ２およびＣＨ３転移を標識し、点線でスケッチする。図６９Ｂは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４様式双方でのＢＩＩＢ７抗体のＤＳＣ折畳み解除曲線を示す。 図７０は、４つのヒト（化）ＩｇＧ１抗体、ＢＩＩＢ１６、ＢＩＩＢ６、ＢＩＩＢ４およびＢＩＩＢ１の熱的折畳み解除曲線を示す。全ての４つのＩｇＧ１構築体についてのＣＨ２およびＣＨ３ドメインの折畳み解除転移は同一であり、他方、Ｆａｂ折畳み解除転移は高度に可変である。 図７１は、１８２のヒト抗体可変ドメイン参照配列および個々のサブクラスコンセンサス配列についてのコンセンサススコアリング結果を示す。Ａ。哺乳動物ＶＨデータベースに対する残基頻度分析によって誘導されたＶＨサブクラス配列スコア。Ｂ。ＮＣＢＩから選択された参照ＶＨ配列からのスコアの分布。ＶＨ配列スコアはサブクラスに従ってクラスター化される。Ｃ。哺乳動物Ｖκデータベースに対する残基頻度分析によって誘導されたＶκサブクラスコンセンサス配列スコア。Ｄ。ＮＣＢＩから選択された参照Ｖκ配列からのスコアの分布。Ｖκ配列スコアはサブクラスに従ってクラスター化される。 図７２は、ＤＳＣによって測定された、対応するＦａｂ ＴＭを持つ１８のＢＩＩＢ抗体についての配列スコアを比較する二次元プロットを示す。図７２Ａは、Ｆａｂ ＴＭに対してプロットされたＢＩＩＢ１−１８ ＶＨスコアを示す。各点の同一性は表２０において見出すことができる。ＢＩＩＢ１５およびＢＩＩＢ１６のＶＨはそれらのＣＤＲにおいて異常な挿入／欠失を含有する。ＢＩＩＢ１５およびＢＩＩＢ１６についての結果は四角として表示する。ＢＩＩＢ１８のＴＭは（ＢＩＩＢ１７からの最低の測定されたＴＭにマッチさせるため）５７．２℃として人工的に表示する。というのは、それ自身のＴＭは発現の欠如のため測定不能だったからである。ＢＩＩＢ１８のＴＭは、その極端に低い配列スコアおよび発現するその無能力に基づいてかなり低いようである。ＢＩＩＢ１８についてのＦａｂ結果を三角形として表示する。残りのＢＩＩＢ抗体ＶＨ結果は丸印として表示する。図７２Ｂは、Ｆａｂ ＴＭに対してプロットされたＢＩＩＢ１−１８ Ｖκスコアを示す。記号は、スコアがＶκについての物である以外はプロット（Ａ）について記載したのと同一である。 図７３は、Ｉｇ折畳みのＶ−クラス、Ｃ−クラス、およびＩ−クラスについての代表的な構造を示す。 図７４は、ＳＣＯＰから得られたＶ−、Ｉ−、Ｃ１−、およびＣ２−クラスＩｇ−折畳み配列の長さのヒストグラムを示す。 図７５は、Ｃ−クラスデータ組内のあらゆる残基組合せについて計算されたｆ−値相関係数のヒストグラムを示す。 図７６は、共変動解析が基礎とされる整列プラットフォームの一部を含むＮＡＰＭＡＰビジュアルツールの出力を示す。プラットフォームは、Ｖ領域内の各位置（残基位置＃）についてのギャップ（残基タイプ）を含めたアミノ酸のすべてを含有する行を表示する。 図７７は、ＮＡＰＭＡＰ鋳型へのＩｇ−折畳み共変動統計学のオーバーレイを示す。注目する配列は、関連アミノ酸を通っての曲がった線として示される。共変動は、関連共変動アミノ酸残基の間の真っ直ぐな棒線として示される。 図７８は、実施例７に記載されたような、Ｋａｂａｔ位置３６におけるＴｙｒ（残基位置＃４８）およびＫａｂａｔ位置４６における突然変異Ｓｅｒ→Ｌｅｕ（残基位置＃６７）の間の共変動を強調するＢＨＡ１０ ＶＬの共変動解析からの詳細を示す。 図７９は、Ｋａｂａｔ位置６７におけるＶａｌ（残基位置＃１００）、Ｋａｂａｔ位置７０におけるＴｈｒ（残基位置＃１０４）およびＫａｂａｔ位置８０における突然変異Ｍｅｔ→Ｌｅｕ（残基位置＃１１６）の間のコンフリクトする共変動を強調するＢＨＡ１０ ＶＨの共変動解析からの詳細を示す。 図８０（配列番号：６３）は、慣用的なｓｃＦｖを含む重鎖Ｃ−末端四価ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８抗体の一本鎖ＤＮＡ配列を示す。 図８１（配列番号：６４）は、慣用的なｓｃＦｖを含む重鎖Ｃ−末端四価ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８抗体のアミノ酸配列を示す。 図８２Ａ（配列番号：６５）は、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８軽鎖の一本鎖ＤＮＡ配列を示す。シグナルペプチド配列を下線を施して示す。図８２Ｂ（配列番号：６６）は、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８軽鎖のアミノ酸配列を示す。 図８３Ａ（配列番号：６７）は、慣用的なＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８（ＶＬ／ＶＨ）ｓｃＦｖの一本鎖ＤＮＡ配列を示す。シグナルペプチド配列を下線を施して示す。図８３Ｂ（配列番号：６８）は、慣用的なＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８（ＶＬ／ＶＨ）ｓｃＦｖのアミノ酸配列を示す。 図８４Ａ（配列番号：６９）は、慣用的なＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８（ＶＬ／ＶＨ）ｓｃＦｖの一本鎖ＤＮＡ配列を示す。図８４Ｂ（配列番号：７０）は、慣用的なＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８（ＶＬ／ＶＨ）ｓｃＦｖのアミノ酸配列を示す。 図８５は、慣用的なｐ５Ｅ８（ＶＬ／ＶＨ）ｓｃＦｖ（塗り潰ぶされた丸印）−対−慣用的ｐ５Ｅ８（ＶＬ／ＶＨ）ｓｃＦｖ（塗り潰ぶしてない丸印）のＴ５０曲線を示す。 図８６は、単独で（ｈＶＨＡ１０（倒立した塗り潰ぶした三角形）およびｃｈ１４Ａ２（塗り潰ぶした菱形））、および組み合わせて（塗り潰ぶしていない倒立三角形）ヒト乳癌の腫瘍異種移植片マウスモデル（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）に対して投与される安定化された二特異的「Ｈｅｒｃｕｌｅｓ−ＩＩ」抗体（ＸＷＵ０３６（塗り潰ぶした丸印））および一特異的抗体の相対的イン・ビボ活性を評価する実験の結果を示す。 図８７は、界面維持で重要な共変動ネットワークに関与するＶＨ残基（図８７Ａ）、およびＶＨ／ＶＬ界面との直接的接触を行うことに関与し、ＶＨドメインの表面に直接的にマッピングされる界面残基（図８７Ｂ）を示す。矢印は、ＶＨ／ＶＬ相互作用を安定化させるのに、およびＶＨ／ＶＬ安定性で重要であることを共変動解析が知らせる現実の界面の外側の残基位置を示す。ＶＨおよびＶＬの間の界面において直接的接触を行う超可変ＣＤＲ３残基の位置をボックス内に囲う。 図８８は、界面維持に重要な共変動ネットワークに関与するＶＬ残基（図８８Ａ参照）、およびＶＨ／ＶＬ界面との直接的接触を行うのに関与し、およびＶＬの表面に直接的にマッピングされる界面残基（図８８Ｂ）を示す。矢印は、共変動解析が、ＶＨ／ＶＬ相互作用を安定化するのに、およびＶＨ／ＶＬ安定性のために重要であることを知らせる現実の界面の外側の残基位置を示す。ＶＨおよびＶＬの間の界面において直接的接触を行う超可変ＣＤＲ３残基の位置をボックス内に囲う。 図８９は、本発明の具体例を実施するのに適した例示的な環境を示す。 図９０は、ポリペプチドの安定性の尺度として用いることができる配列雇用変動スコアを決定するために本発明の具体例がそれに続くことができる工程の例示的配列のフローチャートである。 図９１は、コンセンサススコアを決定し、それを用いて、候補蛋白質の安定性を予測するために本発明の具体例が続くことができる工程の例示的配列のフローチャートである。 図９２は、候補蛋白質の安定性の尺度として平均コンセンサススコアを決定し、それを用いるために本発明の具体例が続くことができる工程の例示的配列のフローチャートである。 図９３は、ポリペプチドの代替残基を用いて、該ポリペプチドの改良された配列を決定するために本発明の具体例を続けることができる工程の例示的なシリーズの負ローチャートである。 図９４Ａおよび９４Ｂは、Ｓ４６Ｌ（ＶＬ）安定化性突然変異（配列番号：１３７）およびＶ５５Ｇ（ＶＨ）安定化性突然変異（配列番号：１３８）を含有する安定化されたＢＨＡ１０ ｓｃＦｖのアミノ酸配列を示す。安定化性突然変異はボックスに入れた残基によって示される。リーダー配列、ｇｌｙ／ｓｅｒ連結ペプチドおよびＣＨ１ドメインは、各々、下線を施した、太文字の、およびイタリック体の残基によって示される。

Claims (22)

  1. 安定化された抗体またはその抗原結合断片を設計するための方法であって、該安定化された抗体またはその抗原結合断片は、候補抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメイン由来の安定化されたＶＨドメインおよび安定化されたＶＬドメインを含み、ここで該方法は、
    （ａ）免疫グロブリンスーパーファミリーポリペプチドに属するアミノ酸配列のキュレーションされた参照組を提供する工程；
    （ｂ）該参照組のアミノ酸配列を整列して、整列された組を生成する工程；
    （ｃ）該整列された組における２以上のアミノ酸位置の間の共変動を計算して、共変動データセットを作成する工程；
    （ｄ）該候補抗体ＶＨドメインまたは該候補抗体ＶＬドメインにおいて共変動しないアミノ酸を同定する工程であって、ここで、該共変動しないアミノ酸は、該共変動データセットにおいて１以上の共変動を満足しない、工程；および
    （ｅ）該候補抗体ＶＨドメインまたは候補抗体ＶＬドメインにおける該共変動しないアミノ酸のうちの１以上を、該整列された組において対応するアミノ酸位置で見出された、該共変動データセットにおける共変動を満足するアミノ酸で置換することにより、改良された生物物理学的特性を有する安定化された抗体およびその抗原結合断片を作製する工程
    を含む、方法。
  2. 前記生物物理学的特性が、熱安定性、ｐＨ折り畳み解除プロフィール、グリコシル化の安定な除去、溶解性、生化学機能、およびそれらの組合せよりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記安定化された抗体またはその抗原結合断片は、ドメイン抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、非ヒトモノクローナル抗体、キメラ抗体、二特異的抗体、ｓｃＦｖ分子、ｓｃＦｖ含有抗体、ドメイン欠失抗体、およびこれらの抗体断片のいずれかの組合せよりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  4. （ｂ）における前記共変動データセットにおける前記アミノ酸は、ジスルフィド結合、塩架橋、リガンド結合ポケットまたは表面の一部分、ファンデルワールス相互作用のネットワーク、水素結合相互作用のネットワーク、電荷−電荷相互作用のネットワーク、およびこれらの構造的特徴のうちの２つ以上の組合せよりなる群から選択される構造的特徴の
    一部である、請求項１に記載の方法。
  5. （ｂ）における前記整列された組の各アミノ酸配列は、該整列された組における他の配列と９５％未満の同一性を有する、請求項１に記載の方法。
  6. 前記アミノ酸配列のキュレーションされた参照組の構築は、
    （ａ）Ｉｇ折畳みの三次元構造の組を収集する工程であって、ここで、該構造は、Ｖ−クラス折畳み、Ｉ−クラス折畳み、Ｃ１−クラス折畳み、Ｃ２−クラス折畳みおよびこれらのＩｇ折畳みクラスの組み合わせよりなるＩｇ折畳みクラスの群より選択されるＩｇ折畳みを含む、工程；
    （ｂ）破壊、１００％配列同一性、異常な長さ、または誤って折畳まれたトポロジーの提示を有する配列を含むＩｇ折畳み構造を捨てることにより、該Ｉｇ折畳み構造の組をフィルタリングする工程；
    （ｃ）構造整列を構築する工程であって、ここで、該フィルタリングされたＩｇ折畳み構造の組は、互いに重ねられる、工程；
    （ｄ）該構造整列から配列整列を得る工程であって、ここで、１つの構造の配列からのアミノ酸は、該ポリペプチド骨格のα−炭素環の最も短い距離に基づいて、第２の構造の配列からのアミノ酸に適合する、工程；
    （ｅ）該Ｉｇ折畳みクラスのうちの１つについての構造ベースの配列整列に基づいて隠れたマルコブモデル（ＨＭＭ）を構築する工程；
    （ｆ）該Ｉｇ折畳みクラスに特異的なＨＭＭのうちの１以上を用いて蛋白質配列データベースを検索する工程であって、ここで、該蛋白質配列データベースにおける該ＨＭＭに適合する配列が収集される、工程；および
    （ｇ）蛋白質ドメインの注釈されたデータベースを用いて（ｆ）において収集された該蛋白質配列の該Ｉｇ折畳みクラスの整列を確認する工程であって、ここで、（ｆ）において見出される候補Ｉｇ折畳み蛋白質配列は、該蛋白質ドメインの注釈されたデータベースにおけるＩｇ折畳みクラスに対するそれらの割り当てが統計学的に有意な場合にのみ保持される、工程；
    を含む、請求項１に記載の方法。
  7. 前記整列がさらに、
    （ａａ）（ｂ）において得られた前記配列整列から冗長なまたは高度に類似するアミノ酸配列を除去する工程；および
    （ｂｂ）ＨＭＭプロフィールにおいて適合状態にない該整列における列を除去する工程
    を含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記（ｃ）の計算が、（ｉ）区別されるアミノ酸タイプとしてのギャップの同定；（ｉｉ）重み付け関数、ここで、該重み付け関数は、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ多様性重み付け関数ではない；（ｉｉｉ）共変動対についてのフィルタリング関数、ここで、該関数は、配列平均同一性（ＳＡＩ）を使用しない；（ｉｖ）事象カットオフ、ここで、共変動対は、最少数の回数観察されたのでない限り報告されず、そしてここで該事象カットオフは、約２以上の事象である；ならびに（ｖ）これらの特徴のうちの２以上の組み合わせよりなる群から選択される１以上の特徴を含む、請求項１に記載の方法。
  9. 前記（ｃ）の計算が、χ２解析を用いた変動の統計学的有意性の計算を含む、請求項１に記載の方法。
  10. 前記χ２の値が、事象ベースのカウントの式を用いて計算される、請求項９に記載の方法。
  11. 前記事象ベースのカウントの式が、
    Figure 0005374359
    であり、ここで、
    ｐ（ｉ）およびｐ（ｊ）は、前記整列した配列の組における、各々、位置ｉおよびｊにおける注目するいずれかの２つのアミノ酸タイプのアミノ酸頻度であり；
    ｃ（ｉ，ｊ）は、ｐ（ｉ）およびｐ（ｊ）が同一配列内で観察される回数であり；および
    ｃ（ｔ）は、該整列における合計配列の数であり；そして
    ここで、アミノ酸頻度は、あるアミノ酸タイプが整列中の特定の位置で観察される回数を、該整列中の配列の合計数で割ったものであると定義される、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記（ｃ）の計算が、以下の式：
    Figure 0005374359
    を用いて行われる相関係数（φ）の計算を含み、ここで、
    ａｉｂｊは、各々、位置ｉおよび位置ｊにおいてタイプａまたはｂのアミノ酸が同一配列で見出される回数であり；
    Figure 0005374359
    は双方のアミノ酸タイプが同一配列に存在しない回数であり；
    Figure 0005374359
    は、アミノ酸ｂが不存在でありながらもアミノ酸ａが存在することが見出される回数であり；および
    Figure 0005374359
    は、アミノ酸ｂが存在しながらもアミノ酸ａが存在しない回数であり、そしてここで、該相関係数（φ）は、該共変動の統計学的強さを測定する、請求項１に記載の方法。
  13. 前記共変動の計算は、統計学的有意性の閾値レベルを満足する共変動についてのみ共変動スコアの作成を含む、請求項１に記載の方法。
  14. 前記共変動スコアは、閾値χ２値またはφ値を超えるかまたは下回る共変動についてのみ作成される、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記候補配列のアミノ酸位置に、＋０．２５〜＋１．０のφ相関係数を有する正の共変動については正の特定の共変動スコアが割り当てられる、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記候補配列のアミノ酸位置に、−０．２５〜−１．０のφ相関係数を有する負の共変動については負の特定の共変動スコアが割り当てられる、請求項１４に記載の方法。
  17. （ａａ）鋳型抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメインおよび前記候補抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメインの構造モデルを提供する工程；
    （ｂｂ）鋳型抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメイン中の、安定性に重要である蛋白質−蛋白質界面アミノ酸を同定する工程；
    （ｃｃ）該（ｂｂ）の界面アミノ酸と共変動する骨格アミノ酸を同定する工程；
    （ｄｄ）該候補抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメイン中の１以上の界面アミノ酸または骨格アミノ酸を、（ｂｂ）および（ｃｃ）で同定された対応する界面アミノ酸または骨格アミノ酸で置換する工程、
    をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  18. 前記鋳型抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメインは、Ｉｇスーパーファミリー折畳みを含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記蛋白質−蛋白質界面アミノ酸は、候補のＶＨドメインまたはＶＬドメインのＶＨ／ＶＬ界面に位置する、請求項１７に記載の方法。
  20. （１）前記候補抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメインの１以上のアミノ酸位置についてコンセンサスベースのスコアを計算する工程；
    （２）該コンセンサスベースのスコアを、前記共変動データセット中のデータと合わせる工程；および
    （３）該候補抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメインを安定化すると予測されるアミノ酸置換を選択する工程であって、ここで、該選択は、コンセンサスベースのスコアおよび共変動データの組み合わせに基づく、工程
    をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  21. 前記コンセンサスベースのスコアの計算が、
    （ｉ）前記免疫グロブリンスーパーファミリーに属するポリペプチド配列のキュレーションされた参照組を提供する工程；
    （ｉｉ）該参照組の配列を整列して整列された組を生成する工程；および
    （ｉｉｉ）該候補抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメイン中の各アミノ酸位置について試験アミノ酸頻度を計算する工程であって、ここで、該頻度は、該アミノ酸位置における該アミノ酸が、該整列された組における対応する位置に存在する回数を合計し、そして該合計された値を該参照組中の配列の合計数によって割ることにより計算される、工程
    を含む、請求項２０に記載の方法。
  22. さらなる工程：
    （ａ）コンセンサス配列を計算する工程であって、該配列中の各位置における前記アミノ酸が、前記整列された組中の該位置での最も一般的なアミノ酸に対応する、工程；
    （ｂ）該コンセンサスポリペプチド配列中の各アミノ酸位置について該コンセンサスアミノ酸頻度を計算する工程であって、ここで、該配列は、該アミノ酸位置における該アミノ酸が、該整列された組の対応する位置において存在する回数を合計し、そして該合計された値を該参照組中の配列の合計数によって割ることにより計算される、工程；および
    （ｃ）前記試験アミノ酸頻度を該コンセンサスアミノ酸頻度によって割って、コンセンサススコアを得る工程；
    を含む、請求項２１に記載の方法。
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