Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

EA017086B1 - Человеческие моноклональные антитела против о8е и их применение - Google Patents

Человеческие моноклональные антитела против о8е и их применение Download PDF

Info

Publication number
EA017086B1
EA017086B1 EA200870020A EA200870020A EA017086B1 EA 017086 B1 EA017086 B1 EA 017086B1 EA 200870020 A EA200870020 A EA 200870020A EA 200870020 A EA200870020 A EA 200870020A EA 017086 B1 EA017086 B1 EA 017086B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
amino acid
variable region
acid sequence
antibodies
Prior art date
Application number
EA200870020A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200870020A1 (ru
Inventor
Алан Дж. Корман
Марк Дж. Селби
Ли-Шэн Лу
Элисон Витте
Хайчунь Хуан
Original Assignee
Медарекс, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=38123660&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA017086(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Медарекс, Инк. filed Critical Медарекс, Инк.
Publication of EA200870020A1 publication Critical patent/EA200870020A1/ru
Publication of EA017086B1 publication Critical patent/EA017086B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1027—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к выделенным моноклональным антителам, а в частности к человеческим моноклональным антителам, которые специфически связываются с O8E с высокой аффинностью. Настоящее изобретение относится также к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим антитела согласно изобретению, к экспрессирующим векторам, к клеткам-хозяевам и к способам экспрессии антител согласно изобретению. Настоящее изобретение относится также к иммуноконъюгатам, к биспецифическим молекулам и фармацевтическим композициям, содержащим антитела согласно изобретению. Настоящее изобретение относится также к способам лечения рака.

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки
В настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США рег. № 60/748914, поданной 8 декабря 2005 г., и предварительной заявки на патент США рег. № 60/824593, поданной 5 сентября 2006 г., которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
В общих чертах, настоящее изобретение относится к области иммунологии и молекулярной биологии. Более конкретно, настоящее изобретение относится к человеческим моноклональным антителам против О8Е, нуклеиновым кислотам, кодирующим человеческие моноклональные антитела против О8Е, к способам получения человеческих моноклональных антител против О8Е и к способам лечения заболеваний, таких как рак, характеризующийся пролиферацией клеток, экспрессирующих О8Е.
Предшествующий уровень техники
В Соединенных Штатах рак молочной железы и рак яичника являются главными причинами смертности среди женщин, и по количеству смертельных исходов, они занимают второе и четвертое место, соответственно (данные и цифры, представленные Американским Обществом по борьбе с раком (2005)). Американским Обществом по борьбе с раком было установлено, что в 2005 г. в Соединенных штатах от рака молочной железы умерло приблизительно 40000 женщин, и примерно 16000 женщин умерло от рака яичника. Свыше 80% из всех злокачественных опухолей яичника составляют опухоли поверхностного эпителия, которыми являются опухоли серозной оболочки, опухоли слизистой, эндометриоидные опухоли и светлоклеточные карциномы (8е1йтап е! а1. В1аив!еш'в Ра11ю1оду о! Изе Еета1е Сеш!а1 Тгас! 791-4 (Кигтап, еййог, 5<!1> ей. №\ν Уогк, 8ргтдег-Уег1ад, 2002). Рак яичника часто обнаруживается уже на запущенной стадии, когда метастазы распространяются в региональные и периферические участки организма (Ре!!егввоп, (1994) 1п!. Еей. О! Суп. апй ОЬ81е1г1С8. Уо1. 22; и НейИх е! а1 (2001) 1. Ер1йегтю1. Вюв!а!. 6: 107-38). Таким образом, хотя вероятность развития рака молочной железы на протяжении всей жизни значительно выше, чем вероятность развития рака яичника, однако продолжительность жизни пациентов с раком молочной железы, в основном, на 5 лет выше, чем продолжительность жизни пациентов с раком яичника.
В7-подобные молекулы принадлежат к суперсемейству иммуноглобулинов (1д). Внеклеточные части В7-подобных молекул содержат по одному домену 1дУ и 1дС и имеют ~20-40%-ную степень идентичности аминокислот. В7-подобные молекулы играют важную роль в регуляции и тонкой коррекции антигенспецифических иммунных ответов. Молекула О8Е, известная также как В7Н4, В7х и В781, является членом семейства В7 и, очевидно, играет определенную роль в стимулирующей и ингибирующей регуляции Т-клеточных ответов (Саггепо е! а1., (2002) Апп. Рем. 1ттипо1. 20:29-53 и Кйоигу е! а1., (2004) 1ттипйу 20:529-538). Человеческий О8Е был картриван по хромосоме 1, и было установлено, что он состоит из шести экзонов и пяти интронов, охватывающих 66 т.п.н., из которых экзон 6 используется для альтернативного сплайсинга с последующим генерированием двух различных транскриптов (С1ю1 е! а1. (2003) 1. 1ттипо1. 171:4650-4654).
О8Е осуществляет свою физиологическую функцию посредством связывания с рецептором на Тклетках, который, в свою очередь, индуцирует прерывание клеточного цикла и ингибирует секрецию цитокинов, а также развитие цитотоксичности и продуцирование цитокинов СЭ4'- и СЭ8+-Т-клетками (Ргавай е! а1. (2003) 1ттипйу 18:863-873; 8юа е! а1. (2003) 1ттипйу 18:849-861; \Уап§ е! а1 (2004) ΜίсгоЬев РзГесР 6:759-66; и 2апд е! а1. (2003) Ргос. ЫаЙ. Асай. 8с1 И.8.А. 100:10388-10392). Было высказано предположение, что О8Е может служить аттенюатором воспалительных ответов и может играть определенную роль в ингибировании антигенспецифических иммунных и противоопухолевых ответов (2апд е! а1. (2003) Ргос. ЫаЙ. Асай. 8с1. И.8.А. 100:10388-10392; Ргавай е! а1 (2003) 1ттипйу 18:863-873; 81са е! а1. (2003) 1ттипйу 18:849-861; С1ю1 е! а1 (2003) 1. 1ттипо1. 121:4650-4654 и Саггепо е! а1. (2003) Тгепйв 1ттипо1. 24:524-7).
Экспрессия мРНК О8Е, но не белка О8Е, была обнаружена в нормальных соматических тканях широкого ряда, включая ткани печени, скелетной мышцы, почек, поджелудочной железы и тонкого кишечника (81са е! а1. (2003) 1ттипйу 18:849-61 и С1ю1 е! а1. (2003) 1. 1ттипо1. 171:4650-4). О8Е индуцируется после стимуляции Т-клеток, В-клеток, моноцитов и дендритных клеток, однако иммуногистохимический анализ выявил лишь очень незначительную экспрессию О8Е в некоторых периферических тканях, за исключением позитивного окрашивания в некоторых раковых опухолях яичника и легких (1й.). Кроме того, стабильная сверхзкспрессия О8Е наблюдается в первичных и в метастатических раковых опухолях молочной железы, независимо от степени злокачественности или стадии развития опухоли, что дает основание сделать предположение о важной роли этого белка в биологии развития рака молочной железы (Тгшд1ег е! а1. (2005) С11шса1 Сапсег Рев. 11: 1842-48). См. также патенты США №№ 6962980; 6699664; 6468546; 6488931; 6670463 и 6528253, каждый из которых во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Для лечения запущенного рака молочной железы и яичника применяются терапевтические методы широкого ряда, включая лучевую терапию, стандартную химиотерапию с применением цитотоксических противоопухолевых средств, гормональных терапевтических средств (ингибиторов ароматазы, аналогов рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона), бисфосфонатов и ингибиторов передачи сигнала (8ιηί11ι
- 1 017086 (2002) Ьапсе!, 360:790-2). Однако, к сожалению, у многих пациентов либо вырабатывается недостаточный ответ на эти терапевтические средства, либо вообще не вырабатывается ответа ни на одно из указанных терапевтических средств. Таким образом, необходимость поиска новых молекулярных маркеров для обнаружения рака молочной железы и яичника и новых терапевтических средств против таких раковых заболеваний остается актуальной. В соответствии с этим, О8Е представляет собой важную мишень, на которую может быть нацелено терапевтическое средство для лечения рака, включая рак яичника, рак молочной железы и ряд других заболеваний, характеризующихся экспрессией О8Е.
Описание сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к выделенным моноклональным антителам, в частности к моноклональным антителам с человеческой последовательностью, которые связываются с О8Е (также обозначаемым (а/к/а) В7Н4, В781 и В7х), и которые обладают различными нужными свойствами. Такими свойствами являются высокая аффинность связывания с человеческим О8Е. Настоящее изобретение относится также к способам лечения различных О8Е-опосредуемых заболеваний с использованием антител и композиций согласно изобретению.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или к его антигенсвязывающей части, где указанное антитело:
(a) связывается с человеческим О8Е с Кс=1х 10-7 М или менее; и (b) связывается с человеческими клетками СНО, трансфицированными О8Е.
В некоторых вариантах изобретения указанное антитело связывается с опухолевой клеточной линией карциномы молочной железы, такой как клеточная линия 8КВК.3 (АТСС рег. № НТВ-30).
Обычно таким антителом является человеческое антитело, хотя в альтернативных вариантах изобретения таким антителом может быть мышиное антитело, химерное антитело или гуманизованное антитело.
В одном из вариантов изобретения указанное антитело связывается с человеческим О8Е с К 5х10-8 М или менее, с человеческим О8Е с К 2х10-8 М или менее, с человеческим О8Е с Кс 1х10-8 М или менее, с человеческим О8Е с К 5х10-9 М или менее, с человеческим О8Е с Кс 4х10-9 М или менее, с человеческим О8Е с К 3х 10-9 М или менее, или с человеческим О8Е с Кс 2х 10-9 М или менее.
В другом варианте изобретения указанное антитело интернализуется опухолевыми клетками карциномы молочной железы 8КВК.3 после связывания с О8Е, экспрессируемым на этих клетках.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или к его антигенсвязывающей части, где указанное антитело конкурирует с эталонным антителом за перекрестное связывание с О8Е, где указанное эталонное антитело:
(a) связывается с человеческим О8Е с Кс=1х 10-7 М или менее; и (b) связывается с человеческими клетками СНО, трансфицированными О8Е.
В различных вариантах изобретения эталонное антитело включает в себя:
(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ЫО: 1; и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ЫО: 6; либо эталонное антитело включает в себя (a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ЫО: 2; и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ЫО: 7; либо эталонное антитело включает в себя (a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ЫО: 3; и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ЫО: 8; либо эталонное антитело включает в себя (a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ЫО: 4; и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ЫО: 9; либо эталонное антитело включает в себя (a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ЫО: 5; и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ЫО: 10.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или к его антигенсвязывающей части, включающим в себя вариабельную область тяжелой цепи, которая представляет собой продукт человеческого гена УН 4-34 (белковый продукт которого представлен здесь как 8ЕО Ш ЫО: 51) или происходит от этого продукта, где указанное антитело специфически связывается с О8Е. Настоящее изобретение относится также к выделенному моноклональному антителу или к его антигенсвязывающей части, включающим в себя вариабельную область тяжелой цепи, которая
- 2 017086 представляет собой продукт человеческого гена Ун 3-53 (белковый продукт которого представлен здесь как 8ЕО ΙΌ N0: 52) происходит от этого продукта, где указанное антитело специфически связывается с 08Е. Настоящее изобретение относится также к выделенному моноклональному антителу или к его антигенсвязывающей части, включающим в себя вариабельную область тяжелой цепи, которая представляет собой продукт комбинации человеческих генов Ун 3-9/03-10/ШбЬ (белковый продукт которого представлен здесь как 8Е0 ΙΌ N0: 53) происходит от этого продукта, где указанное антитело специфически связывается с 08Е.
Настоящее изобретение относится также к выделенному моноклональному антителу или к его антигенсвязывающей части, включающим в себя вариабельную область легкой цепи, которая представляет собой продукт человеческого гена Ук А-27 (белковый продукт которого представлен здесь как 8Е0 ΙΌ N0: 54) происходит от этого продукта, где указанное антитело специфически связывается с 08Е. Настоящее изобретение относится также к выделенному моноклональному антителу или к его антигенсвязывающей части, включающим в себя вариабельную область легкой цепи, которая представляет собой продукт комбинации человеческих генов Ук Ьб/1К1 (белковый продукт которого представлен здесь как 8Е0 Ш N0: 55) происходит от этого продукта, где указанное антитело специфически связывается с 08Е.
В других своих аспектах настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или к его антигенсвязывающей части, включающим в себя:
(a) вариабельную область тяжелой цепи человеческого гена Ун 4-34, 3-53 или 3-9; и (b) вариабельную область легкой цепи человеческого Ук А27 или Ук Ьб; где указанное антитело специфически связывается с 08Е.
В родственном варианте изобретения указанное антитело включает в себя вариабельную область тяжелой цепи человеческого гена Ун 4-34 и вариабельную область легкой цепи человеческого гена Ук А27. В другом родственном варианте изобретения указанное антитело включает в себя вариабельную область тяжелой цепи человеческого гена Ун 3-53 и вариабельную область легкой цепи человеческого гена Ук А27. В еще одном родственном варианте изобретения указанное антитело включает в себя вариабельную область тяжелой цепи человеческого гена Ун 3-9 и вариабельную область легкой цепи человеческого гена Ук Ьб.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или к его антигенсвязывающей части, содержащим вариабельную область тяжелой цепи, включающую в себя последовательности СЭКЕ СЭЕ2 и СЭЕ3; и вариабельную область легкой цепи, включающую в себя последовательности СЭКЕ СЭЕ2 и СЭЕ3. где:
(a) последовательность ί.ΌΕ3 вариабельной области тяжелой цепи включает в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей 8Е0 ΙΌ N0: 21, 22, 23, 24 и 25 их консервативных модификаций;
(b) последовательность СЭЕ3 вариабельной области легкой цепи включает в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей 8Е0 ΙΌ N0: 3б, 37, 38, 39 и 40 и их консервативных модификаций;
(c) указанное антитело связывается с человеческим 08Е с кс=1х 10-7 М или менее;
(б) указанное антитело связывается с человеческими клетками Сн0, трансфицированными 08Е.
Обычно последовательность ί.ΌΕ2 вариабельной области тяжелой цепи включает в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей 8Е0 ΙΌ N0: 1б, 17, 18, 19 и 20 и их консервативных модификаций, а последовательность СЭЕ2 вариабельной области легкой цепи включает в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей 8Е0 ΙΌ N0: 31, 32, 33, 34 и 35 и их консервативных модификаций. Обычно, последовательность 0ΌΚ1 вариабельной области тяжелой цепи включает в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей 8Е0 ΙΌ N0: 11, 12, 13, 14 и 15 и их консервативных модификаций, а последовательность 0ΌΚ1 вариабельной области легкой цепи включает в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей 8Е0 ΙΌ N0: 2б, 27, 28, 29 и 30 и их консервативных модификаций.
Конкретная комбинация включает в себя:
(a) последовательность 0ΌΚ1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую 8Е0 ΙΌ N0: 11;
(b) последовательность 0ΌΚ2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую 8Е0 ΙΌ N0: 1б;
(c) последовательность 0ΌΚ3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую 8Е0 ΙΌ N0: 21; (б) последовательность 0ΌΚ1 вариабельной области легкой цепи, содержащую 8Е0 ΙΌ N0: 2б;
(е) последовательность 0ΌΚ2 вариабельной области легкой цепи, содержащую 8Е0 ΙΌ N0: 31; и (ί) последовательность 0ΌΚ3 вариабельной области легкой цепи, содержащую 8Е0 ΙΌ N0: 3б. Другая конкретная комбинация включает в себя:
(a) последовательность 0ΌΚ1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую 8Е0 ΙΌ N0: 12;
(b) последовательность 0ΌΚ2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую 8Е0 ΙΌ N0: 17;
(c) последовательность 0ΌΚ3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую 8Е0 ΙΌ N0: 22;
(б) последовательность 0ΌΚ1 вариабельной области легкой цепи, содержащую 8Е0 ΙΌ N0: 27;
- 3 017086 (е) последовательность СЭЕ2 вариабельной области легкой цепи, содержащую 8ЕЦ Ш N0: 32; и (Г) последовательность СЭЕ3 вариабельной области легкой цепи, содержащую 8ЕЦ Ш N0: 37. Другая конкретная комбинация включает в себя:
(a) последовательность СЭЕ1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую 8ЕЦ Ш N0: 13;
(b) последовательность СЭЕ2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую 8ЕЦ Ш N0: 18;
(c) последовательность ί.ΌΕ3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую 8ЕЦ Ш N0: 23; (ά) последовательность СЭЕ1 вариабельной области легкой цепи, содержащую §ЕЦ Ш N0: 28;
(е) последовательность ί.ΌΕ2 вариабельной области легкой цепи, содержащую 8ЕЦ Ш N0: 33; и (Г) последовательность СЭЕ3 вариабельной области легкой цепи, содержащую 8ЕЦ Ш N0: 38. Другая конкретная комбинация включает в себя:
(a) последовательность СЭЕ1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую 8ЕЦ Ш N0: 14;
(b) последовательность СЭЕ2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую 8ЕЦ Ш N0: 19;
(c) последовательность ί.ΌΕ3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую 8ЕЦ Ш N0: 24;
(ά) последовательность СЭЕ1 вариабельной области легкой цепи, содержащую 8ЕЦ Ш N0: 29;
(е) последовательность ί.ΌΕ2 вариабельной области легкой цепи, содержащую 8ЕЦ Ш N0: 34; и (Г) последовательность СЭЕ3 вариабельной области легкой цепи, содержащую 8ЕЦ Ш N0: 39. Другая конкретная комбинация включает в себя:
(a) последовательность СЭЕ1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую 8ЕЦ Ш N0: 15;
(b) последовательность СЭЕ2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую 8ЕЦ Ш N0: 20;
(c) последовательность ί.ΌΕ3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую 8ЕЦ Ш N0: 25;
(ά) последовательность СЭЕ1 вариабельной области легкой цепи, содержащую 8ЕЦ Ш N0: 30;
(е) последовательность ί.ΌΕ2 вариабельной области легкой цепи, содержащую 8ЕЦ Ш N0: 35; и (Г) последовательность СЭЕ3 вариабельной области легкой цепи, содержащую 8ЕЦ Ш N0: 40.
Другие конкретные антитела согласно изобретению или их антигенсвязывающие части включают в себя:
(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0: 1; и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0: 6.
Другая конкретная комбинация включает в себя:
(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0: 2; и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0: 7.
Другая конкретная комбинация включает в себя:
(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0: 3; и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0:8.
Другая конкретная комбинация включает в себя:
(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0: 4; и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0: 9.
Другая конкретная комбинация включает в себя:
(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0: 5; и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0: 10.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к антителам или к их антигенсвязывающим частям, которые конкурируют с любыми вышеупомянутыми антителами за связывание с 08Е.
Антителами согласно изобретению могут быть, например, полноразмерные антитела, например, антитела изотипа 1дС1, 1дС2 или 1дС4. Альтернативно, такими антителами могут быть их фрагменты, такие как ЕаЬ-, ЕаЬ'- или Е(аЬ')2-фрагменты, или одноцепочечные антитела (например, 8сЕу).
Настоящее изобретение относится также к иммуноконъюгату, содержащему антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающую часть, присоединенные к терапевтическому средству, такому как цитотоксин или радиоактивный изотоп. Настоящее изобретение относится также к биспецифической молекуле, включающей в себя антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающую часть, присоединенные ко второй функциональной молекуле, имеющей специфичность связывания, отличающуюся от специфичности связывания указанного антитела или его антигенсвязывающей части.
Настоящее изобретение относится также к композициям, содержащим антитело или его антигенсвязывающую часть, или иммуноконъюгат или биспецифическую молекулу согласно изобретению и фарма
- 4 017086 цевтически приемлемый носитель.
Настоящее изобретение относится также к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим антитела или их антигенсвязывающие части согласно изобретению, а также к экспрессирующим векторам, содержащим указанные нуклеиновые кислоты, к клеткам-хозяевам, содержащим такие экспрессирующие векторы, и к способам получения анти-О8Е-антител с использованием таких клеток-хозяев. Кроме того, настоящее изобретение относится к трансгенным мышам, имеющим трансгены тяжелой и легкой цепей человеческого иммуноглобулина, где у указанной мыши экспрессируется антитело согласно изобретению, а также к гибридомам, полученным от такой мыши, где указанная гибридома продуцирует антитело согласно изобретению.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения заболевания, характеризующегося ростом опухолевых клеток, экспрессирующих О8Е, где указанный способ включает в себя введение индивидууму человеческого анти-О8Е-антитела согласно изобретению в количестве, эффективном для лечения или предупреждения указанного заболевания. Таким заболеванием может быть рак, например карцинома молочной железы.
В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения аутоиммунного расстройства, где указанный способ включает в себя введение индивидууму человеческого анти- О8Еантитела согласно изобретению в количестве, эффективном для лечения указанного аутоиммунного расстройства.
Другие отличительные признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из подробного описания изобретения и из примеров, которые не должны рассматриваться как ограничивающие изобретение. Содержание всех публикаций, данных СеиЬаик, патентов и опубликованных патентных заявок, цитируемых в настоящей заявке, во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Краткое описание графического материала и идентификаторов последовательностей
На фиг. 1А представлена нуклеотидная последовательность (8Е6 ΙΌ N0: 41) и аминокислотная последовательность (8ЕС ΙΌ N0: 1) вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 1611. Также указаны области С1)Н1 (8ЕС ГО N0: 11), С12Н2 (8ЕС ГО N0: 16) и С1)16 (8ЕС ΙΌ N0: 21) и производные V и 1 зародышевой линии.
На фиг. 1В представлена нуклеотидная последовательность (8Е6 ΙΌ N0: 46) и аминокислотная последовательность (8Е6 ΙΌ N0: 6) вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 1611. Также указаны области СЭЕ1 (8Е6 ΙΌ N0: 26), С12Н2 (^Е6 Ц) N0: 31) и С1Ж3 (8ЕС) Ц) N0: 36) и производные V и 1 зародышевой линии.
На фиг. 2А представлена нуклеотидная последовательность (8Е6 ΙΌ N0: 42) и аминокислотная последовательность (8Е6 ΙΌ N0: 2) вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 2А7. Также указаны области СЭК1 (8Е6 ΙΌ N0: 12), СЭК2 (8Е6 ΙΌ N0: 17) и СЭК3 (8Е6 ΙΌ N0: 22) и производные V, Ό и 1 зародышевой линии.
На фиг. 2В представлена нуклеотидная последовательность (8Е6 ΙΌ N0: 47) и аминокислотная последовательность (8Е6 ΙΌ N0: 7) вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 2А7. Также указаны области СЭК1 (8Е6 ΙΌ N0: 27), СЭК2 (8Е6 ΙΌ N0: 32) и СЭК3 (8Е6 ΙΌ N0: 37) и производные V и 1 зародышевой линии.
На фиг. 3А представлена нуклеотидная последовательность (8Е6 ΙΌ N0: 43) и аминокислотная последовательность (8Е6 ΙΌ N0: 3) вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 2Е9. Также указаны области СЭК1 (8Е6 ΙΌ N0: 13), СЭЕ2 (8Е6 ΙΌ N0: 18) и СЭЕ3 (8Е6 ΙΌ N0: 23) и производные V, Ό и 1 зародышевой линии.
На фиг. 3В представлена нуклеотидная последовательность (8Е6 ΙΌ N0: 48) и аминокислотная последовательность (8Е6 ΙΌ N0: 8) вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 2Е9. Также указаны области СЭК.1 (8Е6 ΙΌ N0: 28), СЭВ2 (8Е6 ΙΌ N0: 33) и СЭВ3 (8Е6 ΙΌ N0: 38) и производные V и 1 зародышевой линии.
На фиг. 4А представлена нуклеотидная последовательность (8Е6 ΙΌ N0: 44) и аминокислотная последовательность (8Е6 ΙΌ N0: 4) вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 12Е1. Также указаны области СЭВ1 (8Е6 ΙΌ N0: 14), С12Н2 (8Е6 ΙΌ N0: 19) и С1Ж3 (8Е6 ΙΌ N0: 24) и производные V, Ό и 1 зародышевой линии.
На фиг. 4В представлена нуклеотидная последовательность (8Е6 ΙΌ N0: 49) и аминокислотная последовательность (8Е6 ΙΌ N0: 9) вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 12Е1. Также указаны области СЭВ1 (8Е6 ΙΌ N0: 29), С12Н2 (8Е6 ΙΌ N0: 34) и С1Ж3 (8Е6 ΙΌ N0: 39) и производные V и 1 зародышевой линии.
На фиг. 5А представлена нуклеотидная последовательность (8Е6 ΙΌ N0: 45) и аминокислотная последовательность (8Е6 ΙΌ N0: 5) вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 13Ό12. Также указаны области СЭК.1 (ЗЕ6 ΙΌ N0: 15), С12Н2 (ЗЕ6 ΙΌ N0: 20) и С1)16 (ЗЕ6 ΙΌ N0: 25) и производные V, Ό и 1 зародышевой линии.
На фиг. 5В представлена нуклеотидная последовательность (8Е6 ΙΌ N0: 50) и аминокислотная последовательность (8Е6 ΙΌ N0: 10) вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального
- 5 017086 антитела 13Ό12. Также указаны области (ΌΗ1 (8ЕС) ГО N0: 30), С0Н2 (8ЕС) ГО N0: 35) и СЭВ3 (8ЕС) ΙΌ N0: 40) и производные V и 1 зародышевой линии.
На фиг. 6 проиллюстрировано сопоставление аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи 1011 и 13Ό12 с аминокислотной последовательностью νΗ4-34 человеческой зародышевой линии (8Е0 ΙΌ N0: 51).
На фиг. 7 проиллюстрировано сопоставление аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи 2А7 и 2Р9 с аминокислотной последовательностью νΗ3-53 человеческой зародышевой линии (8Е0 ΙΌ N0: 52).
На фиг. 8 проиллюстрировано сопоставление аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи 12Е1 с объединенной аминокислотной последовательностью νΗ3-9/Ο3-10/1Η66 человеческой зародышевой линии (8Е0 ΙΌ N0:53).
На фиг. 9 проиллюстрировано сопоставление аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи 1011, 2А7, 2Р9 и 13Ό12 с аминокислотной последовательностью νκΑ27 человеческой зародышевой линии (8Е0 ΙΌ N0:54).
На фиг. 10 проиллюстрировано сопоставление аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи 12Е1 с объединенной аминокислотной последовательностью νκΕ6/1Κ1 человеческой зародышевой линии (8Е0 ΙΌ N0:55).
На фиг. 11А и 11В представлены результаты ЕЫ8А-экспериментов, которые продемонстрировали, что человеческие моноклональные антитела против человеческого 08Е специфически связываются с 08Е. На фиг. 11А представлены результаты, полученные на ЕЫ8А-планшете, покрытом человеческими анти-08Е-антителами, в который был затем добавлен очищенный белок 08Е, и который был детектирован кроличьей анти-08Е-антисывороткой. На фиг. 11В представлены результаты, полученные на ЕЫ8Апланшете, покрытом антителом против мышиного Рс, а затем моноклональным анти-С9-антителом (0,6 мкг/мл), с последующим титрованием белком Рсп1а-08Е. как показано на фигуре, а затем человеческими анти-08Е-антителами при 1 мкг/мл.
На фиг. 12 представлены результаты экспериментов, проводимых с помощью проточной цитометрии, указывающие на то, что человеческое моноклональное анти-08Е-антитело 2А7 связывается с 08Етрансфицированными клетками СН0.
На фиг. 13 представлены результаты экспериментов, проводимых с помощью проточной цитометрии, где указанные результаты продемонстрировали экспрессию 08Е в клетках карциномы молочной железы 8КВКЗ, а также в 08Е-трансфицированных клетках 8Κ0ν3 и НЕК.
На фиг. 14 представлены результаты экспериментов по интернализации Нит-Ζαρ, указывающие на то, что человеческие моноклональные антитела против человеческого 08Е могут интернализоваться в 08Е+-клетки СН0.
На фиг. 15 представлены результаты экспериментов по интернализации Нит-Ζαρ, указывающие на то, что человеческие моноклональные антитела против человеческого 08Е могут интернализоваться в 08Е+-клетки 8КВВ3.
На фиг. 16 представлены результаты экспериментов по картированию эпитопов, проводимых с использованием различных человеческих моноклональных анти-08Е-антител, включая антитела 1011, 2А7, 2Р9 и 13Ό12.
На фиг. 17 представлены результаты исследований на антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (АЭСС), указывающие на то, что человеческие моноклональные анти-08Е-антитела обеспечивают АОСС-зависимое уничтожение человеческой клеточной линии рака молочной железы 8КВВ3.
На фиг. 18 представлены результаты анализов на антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (АЭСС), указывающие на то, что человеческие моноклональные анти-08Е-антитела обеспечивают АЭСС-зависимое уничтожение 08Е-трансфицированных клеток 8Κ0ν3.
На фиг. 19 представлены результаты анализов на антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (АЭСС), указывающие на то, что человеческие моноклональные анти-08Е-антитела обеспечивают зависимое от концентрации и АЭСС-зависимое уничтожение клеточной линии рака человеческой молочной железы 8КВВ3.
На фиг. 20 представлены результаты ΐη νίνο исследований на мышах 8СШ, указывающие на ингибирование роста НЕК-В7Н4-опухоли анти-08Е-антителами.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к выделенным моноклональным антителам, в частности, к моноклональным антителам с человеческой последовательностью, которые специфически и с высокой аффинностью связываются с 08Е (также обозначаемым В7Н4, В781 и В7х). В некоторых вариантах изобретения антитела согласно изобретению происходят от конкретных последовательностей тяжелой и легкой цепей зародышевой линии и/или имеют конкретные структурные признаки, такие как области СОВ, содержащие конкретные аминокислотные последовательности. Настоящее изобретение относится к выделенным антителам, к способам получения таких антител, к иммуноконъюгатам и к биспецифическим молекулам, включающим в себя указанные антитела, а также к фармацевтическим композициям, содержащим указанные антитела, иммуноконъюгаты или биспецифические молекулы согласно изобре
- 6 017086 тению. Настоящее изобретение относится также к способам применения указанных антител, например, для детекции О8Е, а также для лечения заболеваний, ассоциированных с экспрессией О8Е, таких как рак. В соответствии с этим настоящее изобретение относится также к способам применения анти-О8Еантител согласно изобретению для лечения различных раковых заболеваний, например, для лечения карциномы молочной железы, метастазов рака молочной железы, карциномы яичника, метастазов рака яичника и карциномы почек.
Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приводится определение некоторых терминов. Определение других терминов приводится в процессе подробного описания настоящего изобретения.
Используемые здесь термины О8Е, В7Н4, В7х и В781 являются взаимозаменяемыми и включают в себя варианты, изоформы, гомологи, ортологи и паралоги человеческого О8Е. Так, например, в некоторых случаях антитела, специфичные в отношении О8Е, могут перекрестно реагировать с белком О8Е, происходящим не от человека, а от других видов. В других вариантах изобретения антитела, специфичные в отношении человеческого О8Е, могут быть специфичны только в отношении человеческого О8Е и не способны перекрестно реагировать с О8Е, происходящим от других видов, или с О8Е других типов. Термин человеческий О8Е означает человеческую последовательность человеческого О8Е, такую как полноразмерная аминокислотная последовательность человеческого О8Е, имеющаяся в базе данных ОепЬаик рег. № ΝΡ 078902 (8ЕО ΙΌ ЫО: 56). О8Е также известен специалистам как, например, ВЬ-САМ, В3, Ьеи-14 и ЬуЬ-8. Последовательность человеческого О8Е может отличаться от последовательности человеческоого О8Е 8ЕО Ш ЫО:56, например, консервативными мутациями или мутациями в неконсервативных областях, а СЭ22. по существу, обладает такой же биологической функцией, как и человеческий О8Е, имеющий последовательность 8ЕО ΙΌ ЫО: 56. Так, например, биологическая функция человеческого О8Е состоит в том, что он имеет эпитоп во внеклеточном домене О8Е, который специфически связывается с антителом согласно изобретению, либо биологическая функция человеческого О8Е заключается, например, в ингибировании пролиферации Т-клеток, ингибировании продуцирования цитокинов, ингибировании клеточного цикла или в связывании с Т-клеточными рецепторами.
Конкретная последовательность человеческого О8Е в основном по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности человеческого О8Е 8ЕО ΙΌ ЫО: 56 и содержит аминокислотные остатки, которые, при их сравнении с аминокислотными остатками последовательности О8Е других видов (например, с мышиной последовательностью), указывают на то, что такая аминокислотная последовательность является человеческой.
В некоторых случаях последовательность человеческого О8Е может быть по меньшей мере на 95%, или даже по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности О8Е 8ЕО ΙΌ ЫО:56. В некоторых вариантах изобретения последовательность человеческого О8Е имеет не более чем 10 аминокислот, отличающихся от аминокислот О8Е 8ЕО ΙΌ ЫО:56. В некоторых вариантах изобретения последовательность человеческого О8Е может иметь не более чем 5 или даже не более чем 4, 3, 2 или 1 аминокислоту, отличающиеся от аминокислот О8Е 8ЕО ΙΌ ЫО:56. Процент идентичности может быть определен, как описано в настоящей заявке.
Термин иммунный ответ означает действие, например, лимфоцитов, антигенпрезентирующих клеток, фагоцитарных клеток, гранулоцитов и растворимых макромолекул, продуцируемых вышеописанными клетками или клетками печени (включая антитела, цитокины и комплемент), которое приводит к селективному разрушению или деструкции в человеческом организме или к элиминации из человеческого организма инвазивных патогенов, клеток или тканей, инфицированных патогенами, раковых клеток или, в случае аутоиммунного ответа или патологического воспаления, нормальных человеческих клеток или тканей.
Термин путь передачи сигнала означает биохимическую взаимосвязь между различными молекулами передачи сигнала, которые играют определенную роль в передаче сигнала от одной части клетки в другую часть клетки. Используемый здесь термин рецептор клеточной поверхности включает в себя, например, молекулы и комплексы молекул, способных принимать сигнал и передавать этот сигнал через плазматическую клеточную мембрану. Примером рецептора клеточной поверхности согласно изобретению является рецептор О8Е.
Используемый здесь термин антитело означает интактные антитела и их любой антигенсвязывающий фрагмент (то есть антигенсвязывающую часть) или их отдельные цепи. Термин антитело означает гликопротеин, содержащий по меньшей мере две тяжелых цепи (Н) и две легких цепи (Ь), соединенных между собой дисульфидными связями, или их антигенсвязывающую часть.
Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначаемой здесь УН) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначаемой здесь Уь) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена Сь. УН- и Уъ-области могут быть также подразделены на гипервариабельные области, называемые комплементарность-определяющими областями (СОЯ) и чередующиеся с областями, которые являются более консервативными и называются каркасными областями (ЕЯ). Каждая УН- и Уъ-область
- 7 017086 состоит из трех СЭВ и четырех РЯ, расположенных от аминоконца до карбоксиконца в следующем порядке: РЯ1, СЭК1. РЯ2, СЭК2. РЯ3, СЭК3. РЯ4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторые клетки) и первый компонент (С'Чс.|) классической системы комплемента.
Используемый здесь термин антигенсвязывающая часть антитела (или часть антитела) означает один или несколько фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, с О8Е). Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может осуществляться фрагментами полноразмерного антитела. Примерами связывающих фрагментов, которые входят в определение термина антигенсвязывающая часть антитела, являются:
(ί) РаЬ-фрагмент, т.е. одновалентный фрагмент, состоящий из доменов Уь, νΗ, Съ и СН1;
(ίί) Р(аЬ')2-фрагмент, т.е. двухвалентный фрагмент, состоящий из двух РаЬ-фрагментов, связанных в шарнирной области дисульфидным мостиком;
(ш) РаЬ'-фрагмент, который, по существу, представляет собой РаЬ-фрагмент с частью шарнирной области (см. РипйатеЩа1 1ттипо1оду (Раи1 ей., 3гй ей. 1993));
(ίν) Рй-фрагмент, состоящий из νΗ- и СН1-доменов;
(ν) Ρν-фрагмент, состоящий из ν^ и ^-доменов одного плеча антитела;
(νί) йАЬ-фрагмент (\Уагй е! а1, (1989) №1Шге 341:544-546), который состоит из ^-домена;
(νίί) изолированная гипервариабельная область (СИЯ); и (νίίί) наноантитело, у которого вариабельная область тяжелой цепи содержит один вариабельный домен и два константных домена. Кроме того, хотя указанные два домена Ρν-фрагмента, У2 и νΗ, кодируются отдельными генами, однако они могут быть присоединены друг к другу рекомбинантными методами посредством синтетического линкера, что позволяет получить эти фрагменты в виде одной белковой цепи, в которой пара ν^ и ^-областей образует одновалентные молекулы (известные как одноцепочечный Ρν ОсРу); см., например, В1гй е! а1. (1988) 8с1епсе 242:423-426; и Ни81оп е! а1. (1988) Ргос. №111. Асай. 8с1. И8А 85: 5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также входят в определение термина антигенсвязывающая часть антитела. Указанные фрагменты антител получают стандартными методами, известными специалистам, и такие фрагменты скринируют на эффективность способом, аналогичным способу скрининга интактных антител.
Используемый здесь термин выделенное антитело означает антитело, которое, по существу, не содержит других антител, обладающих другой антигенной специфичностью (например, выделенное антитело, специфически связывающееся с О8Е, по существу, не содержит антител, которые специфически связываются с антигенами, отличающимися от О8Е). Однако выделенное антитело, которое специфически связывается с О8Е, может обладать перекрестной реактивностью с другими антигенами, такими как молекулы О8Е, происходящие от других видов. Кроме того, выделенное антитело может, по существу, не содержать других клеточных веществ и/или химических веществ.
Используемые здесь термины моноклональное антитело или композиция моноклональных антител означают препарат молекул антитела, имеющих один и тот же молекулярный состав. Композиция моноклональных антител имеет одну специфичность связывания и аффинность к конкретному эпитопу.
Используемый здесь термин человеческое антитело или антитело с человеческой последовательностью означает антитела, имеющие вариабельные области, в которых каркасная и СИЯ-области происходят от последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Кроме того, если данное антитело содержит константную область, то такая константная область также происходит от последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Такие человеческие антитела могут иметь более поздние модификации, включая природные или синтетические модификации. Человеческие антитела согласно изобретению могут включать аминокислотные остатки, которые не кодируются последовательностями иммуноглобулина человеческой зародышевой линии (например, мутации, внесенные посредством неспецифического или сайт-специфического мутагенеза ΐπ νί^Ό, или посредством соматической мутации ίπ νί\Ό). Однако используемый здесь термин человеческое антитело не включает в себя антитела, у которых в человеческие каркасные последовательности были введены последовательности СИЯ, происходящие от молекул зародышевой линии млекопитающих других видов, таких как мышь.
Термин человеческое моноклональное антитело, который после слова человеческое может включать слово последовательность, означает антитела, обладающие одной специфичностью связывания и имеющие вариабельные области, в которых каркасная область и СИЯ-области происходят от последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. В одном из вариантов изобретения указанные человеческие моноклинальные антитела продуцируются гибридомами, которыми являются В-клетки, полученные от трансгенного животного, не являющегося человеком, например, от трансгенной мыши, имеющей геном, содержащий человеческий трансген тяжелой цепи и трансген легкой цепи, встроенный в иммортализованную клетку.
Используемый здесь термин рекомбинантное человеческое антитело включает в себя все челове
- 8 017086 ческие антитела, которые были получены, экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантными методами, такие как (а) антитела, выделенные у животного (например, мыши), которое является трансгенным или трансхромосомным по генам человеческого иммуноглобулина; или гибридомы, полученные от этих животных (подробно описанные ниже), (Ь) антитела, выделенные из клеток-хозяев, трансформированных так, чтобы они экспрессировали человеческое антитело, например, из клеток трансфектомы, (с) антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки человеческих антител, и (б) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими методами, включающими в себя сплайсинг последовательностей генов человеческого иммуноглобулина с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельные области, в которых каркасная область и СПК-области происходят от последовательностей иммуноглобулинов человеческой зародышевой линии. Однако в некоторых вариантах изобретения такие рекомбинантные человеческие антитела могут быть подвергнуты мутагенезу ίη νίίτο (или, в случае использования животного, трансгенного по последовательностям человеческих 1д, соматического мутагенеза ίη νίνο), а поэтому аминокислотные последовательности νΗ- и Уъ-областей рекомбинантных антител, несмотря на то, что они происходят от νΗ- и νι,-последовательностей человеческой зародышевой линии и являются родственными таким последовательностям, могут отсутствовать в репертуаре антител человеческой зародышевой линии ίη νίνο.
Используемый здесь термин изотип означает класс антитела (например, 1дМ или 1дС 1), которое кодируется генами константной области тяжелой цепи.
Используемые здесь термины антитело, распознающее антиген и антитело, специфичное к антигену являются синонимами термина антитело, которое специфически связывается с антигеном.
Термин производные человеческого антитела означает любую модифицированную форму человеческого антитела, например конъюгат антитела с другим агентом или антителом.
Термин гуманизованное антитело означает антитела, в которых последовательности СПК, происходящие от зародышевой линии млекопитающих других видов, таких как мышь, были введены в человеческие каркасные последовательности. В указанные человеческие каркасные последовательности могут быть внесены дополнительные модификации.
Термин химерное антитело означает антитела, в которых последовательности вариабельной области происходят от животного одного вида, а последовательности константной области происходят от животных других видов, например такие антитела, в которых последовательности вариабельной области происходят от мышиного антитела, а последовательности константной области происходят от человеческого антитела.
Используемый здесь термин антитело, которое специфически связывается с человеческим О8Е означает антитело, которое связывается с человеческим О8Е с Кс=1х10-7 М или менее, более предпочтительно 5х10-8 М или менее, еще более предпочтительно 3х10-8 М или менее, еще более предпочтительно 1 х 10-9 М или менее, а наиболее предпочтительно 5х10-9 М или менее.
Используемый здесь термин антитело, которое, по существу, не связывается с белком или клетками, означает антитело, которое вообще не связывается с белком или с клетками или не связывается с белком или клетками с высокой аффинностью, то есть связывается с белком или с клетками с Кс=1х10-6 М или более, более предпочтительно 1х10-5 М или более, более предпочтительно 1х10-4 М или более, еще более предпочтительно 1 х 10-3 М или более, а наиболее предпочтительно 1 х 10-2 М или более.
Используемый здесь термин Касс или Ка означает скорость ассоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген, а используемый здесь термин Кдис или К, означает скорость диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Используемый здесь термин Кс означает константу диссоциации, которую вычисляют исходя из отношения К, к Ка (т.е., К,/Ка) и выражают в виде молярной концентрации (М). Величины Кс для антител могут быть определены методами, хорошо известными специалистам. Предпочтительным методом определения Кс антитела является поверхностный плазмонный резонанс, а предпочтительно метод с использованием биосенсорной системы, такой как система В1асоге®.
Используемый здесь термин высокая аффинность антитела 1дС означает, что данное антитело связывается с антигеном-мишенью с Кс, равным 1х 10-7 М или менее, более предпочтительно 5х10-8 М или менее, более предпочтительно 1 х 10-9 М или менее, а наиболее предпочтительно 5х10-9 М или менее. Однако высокая аффинность связывания для антител других изотипов может варьироваться. Так, например, высокая аффинность связывания антитела изотипа 1дМ означает связывание антитела с Кс=10-6 М или менее, более предпочтительно, 10-7 М или менее, а наиболее предпочтительно, 10-8 М или менее.
Используемый здесь термин индивидуум включает в себя человека или любое животное, не являющееся человеком. Термин животное, не являющееся человеком включает в себя всех позвоночных, например млекопитающих и не-млекопитающих, таких как приматы, не являющиеся человеком, овцы, собаки, кошки, лошади, коровы, куры, амфибии, рыбы, рептилии и т.п.
Используемый здесь термин О8Е является синонимом терминам В7Н4, В781 и В7х, и все эти термины встречаются в научной литературе. Аминокислотная последовательность О8Е (В7Н4) име
- 9 017086 ется в общедоступной базе данных ОепВапк под рег. №№ ΑΑΖ17406, АА813400, ААР37283, СА112739 и СА112737 и описана в публикациях Ргакай е1 а! (2003) ΙιηιηιιηίΙν 18:863-873; 81са е1 а1. (2003) 1ттипйу 18:849-861; а также в патенте США № 6891030, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Различные аспекты настоящего изобретения более подробно описаны в нижеследующих разделах.
Анти-О8Е-антитела
Антитела согласно изобретению отличаются по своим конкретным функциональным признакам или свойствам. Так, например, указанные антитела специфически связываются с человеческим О8Е. Предпочтительно, антитело согласно изобретению связывается с О8Е с высокой аффинностью, например, с Кс=1х10-7 М или менее. Анти-О8Е-антитела согласно изобретению обычно обладают по меньшей мере одним или несколькими из следующих свойств, а именно:
(a) способностью связываться с человеческим О8Е с Кс=1х 10-7 М или менее;
(b) способностью связываться с клетками СНО, трансфицированными человеческим О8Е.
Обычно, указанное антитело связывается с человеческим О8Е с Кс=5х10-8 М или менее, с Кс=1х108 М или менее, с Кс=5х 10-9 М или менее, с Кс=4х 10-9 М или менее, с Кс=3х 10-9 М или менее, с Кс=2х 10-9 М или менее или с Кс=1х 10- 9 М или менее.
Стандартные анализы для оценки способности антител связываться с О8Е известны специалистам, включая, например, ЕЬ18А, вестерн-блот-анализ, РИА и проточный цитометрический анализ. Подходящие анализы подробно описаны в примерах. Кинетика связывания (например, аффинность связывания) антител может быть также оценена с помощью стандартных анализов, известных специалистам, таких как ЕЬ18А-анализ, анализ по Скэтчарду и анализ в системе В1асоге®. Другим примером служат антитела согласно изобретению, которые могут связываться с опухолевой клеточной линией карциномы молочной железы, например с клеточной линией 8КВК3.
Моноклональные антитела 1011, 2А7, 2Т9, 12Е1 и 13Ό12.
Предпочтительными антителами согласно изобретению являются человеческие моноклональные антитела 1011, 2А7, 2Т9, 12Е1 и 13Ό12, выделенные и структурно охарактеризованные, как описано в примерах 1 и 2. Аминокислотные последовательности УН антител 1011, 2А7, 2Т9, 12Е1 и 13Ό12 представлены в 8Е0 ΙΌ ЫО: 1, 2, 3, 4 и 5, соответственно. Аминокислотные последовательности У|, антител 1011, 2А7, 2Т9, 12Е1 и 13Ό12 представлены в 8Е0 ГО ЫО:6, 7, 8, 9 и 10, соответственно.
Принимая во внимание тот факт, что каждое из этих антител может связываться с О8Е, следует отметить, что последовательности УН и У|, могут быть смешаны и соответствующим образом подобраны для создания других О8Е-связывающих молекул антител согласно изобретению. Такие смешанные и соответствующим образом подобранные антитела, связывающиеся с О8Е, могут быть протестированы с помощью анализов на связывание, описанных выше и в примерах (например, ЕАС8 или ЕЫ8А). При смешивании и подборе УН и Уъ-цепей предпочтительно, чтобы последовательность УН в конкретной паре УН/Уь, была заменена структурно сходной последовательностью УН. Аналогичным образом, предпочтительно, чтобы последовательность У|, в конкретной паре УН/УЪ была заменена структурно сходной последовательностью Уь.
В соответствии с этим в одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или к его антигенсвязывающей части, включающим в себя:
(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ ЫО: 1, 2, 3, 4 и 5; и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ ЫО: 6, 7, 8, 9 и 10, где указанное антитело специфически связывается с О8Е, а предпочтительно с человеческим О8Е.
Предпочтительные комбинации тяжелой и легкой цепей включают в себя:
(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ ЫО: 1; и (Ь) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ ЫО: 6; или (b) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ ЫО: 2; и (Ь) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО ЫО:7; или (c) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО ЫО: 3; и (Ь) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО ЫО:8; или (ά) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО ЫО:4; и (Ь) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО ЫО:9; или (е) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО ЫО: 5; и (Ь) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО ЫО: 10.
- 10 017086
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к антителам, содержащим СГОР1. СЭР2 и ΟΌΚ3 тяжелой и легкой цепей антител 1611, 2А7, 2Р9, 12Е1 и 13Ό12 или их комбинации. Аминокислотные последовательности СГОК1 νΗ антител 1611, 2А7, 2Е9. 12Е1 и 13Ό12 представлены в 8ЕО ГО N0: 11. 12. 13. 14 и 15. соответственно. Аминокислотные последовательности СГОР2 νΗ антител 1611, 2А7, 2Е9. 12Е1 и 13Ό12 представлены в 8Е0 ГО N0: 16. 17. 18. 19 и 20. соответственно. Аминокислотные последовательности СГОК3 νΗ антител 1611, 2А7, 2Е9. 12Е1 и 13Ό12 представлены в 8Е0 ГО N0: 21. 22. 23. 24 и 25. соответственно. Аминокислотные последовательности СГОК1 νκ антител 1611, 2А7, 2Е9. 12Е1 и 13Ό12 представлены в 8Е6 ГО N0: 26. 27. 28. 29 и 30. соответственно. Аминокислотные последовательности СГОК2 νκ антител 1611, 2А7, 2Р9, 12Е1 и 13Ό12 представлены в 8Е0 ГО N0: 31. 32. 33. 34 и 35. соответственно. Аминокислотные последовательности СГОК3 νκ антител 1611, 2А7, 2Р9, 12Е1 и 13Ό12 представлены в 8Е0 ГО N0: 36. 37. 38. 39 и 40. соответственно. СГОР-области пронумерованы по системе Кэбата (КаЬар Е. А.. с1 а1. (1991) 8сс.|испсс5 οί Рго1еш8 οί 1ттипо1од1са1 1п1сгс8(. ΡίΠΙι ЕбШоп, И.8. ЭераПтсп1 οί Неа1111 апб Нитаи 8егу1се8, МН РиЬНсабоп N0 91-3242).
Каждая из вышеупомянутых аминокислотных и нуклеотидных последовательностей человеческих антител. представленных здесь антителами 1611, 2А7, 2Р9, 12Е1 и 13Ό12, приводится в нижеследующей табл. 1 и в списке последовательностей.
- 11 017086
Таблица 1. Последовательности вариабельной и константной областей и соответствующих СПК тяжелой и легкой цепей человеческих антител 1011, 2А7, 2Р9, 12Е1 и 13Ό12
Обозначение последовательностей Описание Последовательность
5ΞΏ 10 N0:1 Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 1011 □ν<2ΐςθ«5Α6ί1ΚΡ5ΕΤ1τεΐ.ΤθΑνΥ6ι3£Ε5θΥΓΜΤΐ?ΙΕ10Ρ РСКСЪЕ«16Е1ННЗСТтаУИРЗДК5ЕУТ15А0Т5КМСЕ'5К
5ΕΏ Ю N0:2 Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 2А7 ЕУ0ЬУЕЗСб5Ы0Р<Зб$ДНЬБСААЗСГТУ35ЫУМЙ^ДрА ₽5КС11ЕЙУ5У1УСЭ{=КТУУА05УКСНУТ131фй5ОТ1зУЬ 0Μ^$^ΕΐΑΕ0ΤΑνγΫ^0ΊΥΑΜ0νΐίΘΏΰΤΤντν53
ЗЕО 10 N0:3 Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 2Е9 Ρ6Κ6ΙΕ1*ν3νΐΥΰ5ΰΕΤ0εΑ05νΚ(3ΕΙΕΤΙ3Κ0Ν5ΚΝΤ№ ОМЫЗЬКАЕОТАУУУСАЕОСОУбМПУИСООТТУТУЗЗ
3ΕΏ 10 N0:4 Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 12Е1 ЕУОЬУЕЗСеОЪУОРСНЗЪВЪЗСУАЗСЕ’ТГОоУАМНЯУР.ОА ₽БКбЬЕНУЗС1БИЫ33315УА03УКБКРТ13КОЙАКМ8ЪУ ЬйМКЗЬВАЕВТАЬУУСгГКАДУСЗС£ЗОЕТТУ<ЗМ0'УН0аеТ ТУАУЗЗ
5Е0 10 N0:5 Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 13012 0УСБ0йИйА(5Ы.КРЗЕТЬ5ЬТСА7У<;б35-39УУИЗИ1ВХ2Р РСКСЬЕМ1СК111НЗСЗТ«У¥!Р8ЬК5НУТ13У0Т5ККСГЗЬ ΚίιΝδνΤΑΑΟΤΑνΥΥΟΑΜΙΛΥΕΕΗΪΥϊσΜΟνΐΙΟΟ^ΤΤνΤν 33
8Е0 10 N0:6 Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 1С11 Е1У1ДСРРбТЪЗЬЗРБЕЕАТЬ5СЯА5аЗУ55ТУЪАРЛГ00К РЗОАРКУЫУаАЗВРАТЗТРРКЕЗСЗСЗеТГРТЪИЗКХЕ РЕГГАУУУСОфУБЗЗ ₽ДТгаб<5ТКУЕ1К
5Е0 Ю N0:7 Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 2А7 Е1У1Тр5Р<5ТЬ8Ь5₽БЕААТЬ5СКА305У583У1ЛНУ20К РБОАРВЬЫУйАЗЗВАТеХРОКРЗСЗЗВСТГЕТЬПЗВЪЕ ΡΕΟΡΑνΥΥΟΟΟΥ(353ΡΜΥΤΕΙ300ΤΚ1ΕΙΚ |
8Е0 10 N0:8 Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 2Е9 Е1УЬТ08РСТДЗЬЗРСЕВАТЬ5СКА808735бУ1АКУ20К РС0АРВЪЫУСА53ААТС1Р0КГЗЗЗСЗСГ0ЕТЬТ15ЕгЬЕ РЕОЕАУУУСООУСЗЗРЪУТЕСОСТКЬЕШ
8Е0 10 N0:9 Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 12Е1 Е1УЪТОЗРАТЪЗЦЗРСЕКАТЬЗСКАЗОЗУЗЗУЬАИУОаКР Б0АРЙГ.ЫУОАЗКДАТБ1РАКЕ353еЗЕ’ГОЕТЬТ135ДЕР ΕΏΕΑνγγοΏακκτ рсосткуехк
- 12 017086
5Е2 Ιϋ N0:10 Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 13012 Е17ЬТО5РСТЬЗЪ8РеЕЙА'ГЪесяА50ВУ355УЬА^УООК Р65АРЕЦ.ЫУСА5ЙВАТС1РОКРЗСЗСЗСТОЕ'ТЪТ1ЙНЬЕ ₽ΕΟΓΑνΥΥΟζΧ2Υε23ΡΒΤΕ·506ΤΚνΕΙΚ
ΞΕ2 ΙΕ ΝΟ:11 Аминокислотная последовательность С0Р.1 вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 1С11 βΥΕΤίΤ
5Ε0 Ю N0:12 Аминокислотная последовательность СЭВ1 вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 2А7 5ΝΥΜΝΝ
2Ε0 ΙΕ N0:13 Аминокислотная последовательность СРК1 вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 2Г9 ΚΝΥΜΝ
3Ε0 Ιϋ ΝΟ:14 Аминокислотная последовательность С0К1 вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 12Е1 ОУАме
ΞΕΟ Ю N0:15 Аминокислотная последовательность СОК1 вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 13012 суунз
5Ε0 Ю N0:15 Аминокислотная последовательность С0Р.2, вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 1011 ΕΙΝΗΒΟΤΤΝΥΝΡΒΕΚΞ
3Ε<2 Ю N0:17 Аминокислотная последовательность С0Р.2 вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 2А7 νΐγα3ΘκτϊΥΑ03νκσ
3Ε0 Ю N0:18 Аминокислотная последовательность С0К2 вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 2Г9 71УСЗеКТОСАОЗУКС
3Ε0 Ю N0:19 Аминокислотная последовательность СРВ.2 вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 12Е1 СХЗШЛЗСЗХеУАОЗУКК
- 13 017086
ЗЕО Ιϋ N0:20 Аминокислотная, последовательность 0ϋΚ2 вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 13Ώ12 ΚΙΝΗ3<33ΤΝΥΝΡ3ΕΚ3
5Е0 ΙΟ N0:21 Аминокислотная последовательность £ϋΡ.3 вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 1С11 ЪЗЗИЗНИАЕЕУ
5Ε0 ΙΟ N0:22 Аминокислотная последовательность СОР.З вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 2А7 ΟΤΥΑΜϋν
3Ε0 Ιϋ N0:23 Аминокислотная последовательность СВКЗ вариабельной области тяжелой цели человеческого моноклонального антитела 2Г9 ΌβΟΎΕΜΟν
$Ε0 ΙΟ N0:24 Аминокислотная последовательность СО£3 вариабельной области тяжелей цепи человеческого моноклонального антитела 12Е1 ΕΥβ3<383ΟΪΎΥΥ(3Μ0ν
ВЕС Ιϋ N0:25 Аминокислотная последовательность СОВ.З вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 13012 ΕΙ·ΚΥΪΈΝΥΪϊ6Μ0ν
ΕΕΟ Ιϋ N0:26 Аминокислотная последовательность С0Е1 вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 1611 КАЗОЗУЗЗТУЬА
5Ε0 Ιϋ N0:27 Аминокислотная последовательность СРВ1 вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 2А7 ΚΑ305ν553ΥΐΑ
3Ε0 ΙΟ N0:28 Аминокислотная последовательность С0Н1 вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 2Е9 ΚΆ303ν333ΥΙΛ
3Ε0 ΙΏ N0:29 Аминокислотная последовательность ΟΌΚΙ вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 12Е1 НАЗЙЗУЗЗУЬА
- 14 017086
5Е0 Ю N0:30 Аминокислотная последовательность С0К1 вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 13612 КАЗОЗУЗЗЗУЪА
8Е0 ΙΠ N0:31 Аминокислотная последовательность ΟΰΡ.2 вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 1611 6А5ККАТ
ЗЕО ΙΟ N0:32 Аминокислотная последовательность 0ΩΡ2 вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела ΞΑ7 СА38КАТ
ΞΕΟ Ιϋ N0:33 Аминокислотная последовательность С0В.2 вариабельной области легкой цели человеческого моноклонального антитела 2Е9 елззклт
5Ε0 Ιϋ N0:34 Аминокислотная последовательность С0К2 вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 12Е1 0А5ЫВАТ
3Ε0 ΙΟ N0:35 Аминокислотная последовательность СЕК2 вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 13Ό12 6АЗЗЙАТ
5Ξ0 ΙΟ N0:36 Аминокислотная последовательность СОКЗ вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 1611 ΟΟΥΟΞΞΡΙΖΓ
БЕС Г0 N0:37 Аминокислотная последовательность СОКЗ вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 2А7 ΟΟΥ633ΡΜΥΤ
3ΕΏ ΙΟ N0:33 Аминокислотная последовательность СОВ.З вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 2Р9 аОУСЗЗРЪУТ
3Ε0 ΙΟ N0;39 Аминокислотная последовательность СОР.З вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 12Е1 22НГ.Т
- 15 017086
5Е0 Ю N0:40 Аминокислотная последовательность СОВЗ вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 13Ό12 ОЙУСЗЗРКТ
ЗЕС Ю N0:41 Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цели человеческого моноклонального антитела 1011 САССТбСАССТАСАССАСТСбСССССАбСАСТСТТСААСС СТТСббАбАС ССТОТСССТСАССТССбСгеТСТАТ естос СТССТТСАСТСАТТАСТТСТ ССАССТСбАТССЕ СС АСССС ССАСС 5ДА.066ССТ ОСАСТбСАТТССССАААТСААТСАТ А СТССААССАССААСТАСААССССТСССТСадДАСТСЙАеТ САССАТТТСАССАСАСАССТССААСААССАСТТСТСССТС АСССТСДССТ СТСТСАСССС СССССАСАССССТСТСТАТТ АСТСТСССАСАСТСА6САСС ТССТСбААСГСССССТТ ТСА СТАСТССССССАСССААСССТССТСАССбТСТССТ^А
5Ε0 Ш N0:42 Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 2А7 САОСТОСАбСТСвТССАбТСТССАСаАбССТТСАТССАбС СТСССССбТСССТСАСАСТСТССТСТССАСССТСТСССТТ САСССГеАСТАССААСТАСАТСААСТСССТССбССАСССТ ССАОССААОССССТССАеТССбТСТСАСТТАТТТАТЕССА ОТбСТАбААСАТАТТАСССАСАСТСССТСААССССССАСТ САССАТСТССАСАОАС ААТТСС ААСААСАСССТСТ АТСТ Т САААТСААСАесСТСАСАСССбАбСАСАССЗСССТСТАТТ АСТСТССбАСАСАТАССТАСССТАТССАССТСТССССССА А666АССАСС5ТСАСССТСТССТСТ
5Е0 ГО N0:43 Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 2Г9 САССТССАСГТСЙТбСАСТСТССАбСАСбСТТСАТССАбС СТССССССТСССТСАСАСТСТССТСТССАЗССТСТСССТТ САТСбТСАСТАЗАААСТАСАТСААСТСббТССЗССАСССТ ССАССЙАА6ЙСССТССАСТ5ССТСТСАбТ,ТАТТТАТСбСА СТббТАСбАСАОАСТССССАСАСТСССТСААССССССАТТ САССАТСТССАСАСАСААТТССААСААСАСОСТСТАТСТТ САААТСААСАОССТСАСАСССОАССАС АССССССТрТАТ т АСТеТСССА0АЙАТбСССАСТАСССТАТССАССТС1ГСсЬс ССААСЗСАССАСССТСАСССТСТССТСА
ЗЕС ΙΌ N0:44 Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 12Е1 <СААСТССАССТббТбСАСТСТСЙСбОАббСТТССТАСА13С СТСССАббТСССТЙАСАСТСТССТСГСТАСССТСТОЗАТТ САССТТТСаТ<УУТТАТ6ССАТБС^СТССЗТССЗССААССТ ССАСССАДЭЗЙ СС ТССАСТСССТСТСАбСТАТТАСТТСб А АТАСТССТАССАТАСССТАТБССЗАСТСТСТСААСССССС АТТСАССАТСТССАСАОАСААССССААСААСТСССТеТАТ СТССААЛТбААСАбТСТС АСАССТСАС ОАСАСЙСССТТеТ АТТАСГСТАСАААДеСССТС ГАТССТТСЗСССАЗТТСТСА СТТСТАОТДСТАС(^ТАТССАССТСТ(^СССАА6С13АСС АСОСТСССССТСТССТСА.
ЗЕО ГО N0:45 Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 13012 САбСТССАЗСТАСАСЗСАеТбССССССАЙЗАСТСТТСААСС СТТСЗвАСАСССТСТСССТСАССТбСССТСТСТАТССТМ ЗТССТТСАВТССТТАСТАСТССАбСТбСАТСССССАбССС ССАСССААВСЕССТбСАСТССАТТСССААААТСААТСАТА ССССААСТАССААСТАСААСССбТСССТСААСАбТССАСТ САССАТАТСАЗТАОАСАСеТССААОЛАССАСТТСТСССТС АААСТАААСТСТбТСАСССССССССАСАССССТСТЗТАТТ АСТбТбССАеАСААТТАСОАТАТТТТОААААСТАСТАСГА СССТАТСбАССТСТССССССААСССАССАСССТСАССбТС ТССТСА
ЗЕО ГО N0:46 Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 1611 САААТТбТСТТСАСйСАЙТ ттссадс сассстстстт^ст СТССАССвЗАААСАСЗССАСССТСТССТбСАаСбССАСТСА САбТСТТАСС^САССТАСТТАбССТССТАССАССАСЛАА ССТССССАЙССТСССАСССТССТСАТСТАТйбТССАТССА бААСССССАСТСССАТСССАСАСАССТТСАЗТСССАСТЕС СТСТСССАСАСАСТТСАСТСТСАССАТСАССАОАСТЕСАС ССТСАВДАТТТТССА5Т6ТАТТАСТСТСАССАСТАТССТА ССТСАССССТСАСТТГСССССОАСССАССААССТССАСАТ СААА '--->
ЗЕС ГО N0:47 Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 2А7 ЙАААТТбТСТТбАСССАСТСТССАСбСАСССТСТСТТТСТ ' СТ ССАССССАААСАСССАСССТСТССТССАСС СССАСТСА бАЗТбТТАССАЙСАССТАСТТАбССТЗСТАССАССАСаАА ССТССССАеССТСССАЙССТСС! САТСТЛТСС ТССАТССА ЗСАСССССАСТССС АТ СССАСАСАССТТСАЗТ 6ССΑ6Ί ОС СТСТбССАСАЕАСТТСАСТСТСАССАТСАбСАбАСТССАС ССТСААЙАТТТТССА.СТС'ТАТТАСТСТСАССАСТАТССТА бСТСАСССАТСТАСАСТТТТССССАСЗССАССААССТСбА 6АТСААА
8Е0 ГО N0:43 Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 2Р9 бАААТТСтеТТЙАСССАСТСТССАСССАСССТСТСГТТОТ СТССАССОЗАААСАСССАСССТСТССТССАССбССАСТСА бАСТСТТАССАССАССТАСТТАСССТСОТАССАбСАСАДА ССТССССАЗССТСССАбССТССТСАТСТАТбСТССАТССА бСАССбССАСТСССАТСССАСАСАСбТТСАбТСбСАЙТбЗ СТСТСОСАСАСАСТТСАСТСТСАССАТСАССАСАСТССАб ССТСААСАТТТТССАбТаТАТТАСТСТСАССАСТАТббТА ССТСАССТСТСТАСАСТГТТСЙСсАС&ЗСАССААССТССА САТСААА
- 1б 017086
$Εβ 10 N0:49 Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цели человеческого моноклонального антитела 12Е1 СЛААТТСТСТТСАСАСА^ТСТССАаССАСССТСТСТТЮТ СТССАбЙЙСАААОАбССАСССТСТССТеСАСООССАСТСА ОАСТЙТТАССАССТАСТТАСССТОСТАССААСАСАААССТ ССССАеССТСССАЙбСТССТСАТСТАТСАТССАТССААСА СССССАСТСССАТСССАСССАйеТТСАСТСССАСТСаеТС ТСССАСАеАСГТСАСТСТСАССАТСАеСАбССТАСАОССТ ЙААСАТТТТССАеТТТАТТАСТетСАССАЙСйТАбЙАССТ ТСССССААСЗСЗА^СААЗСТСОАААТСААА
ЗЕ(.) Ю N0:50 Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 13012 еДААТТОТеТТОАСбСЛбТСТССАОйСАСССЮТСТТЮТ СТ ССА(ЗебОААА<ЗА<5ССАСССТСТССГ(ЗС АЙЙСССАСТСА вА0ТСТТАБСАеСА0СТАСТТАСССТ(Я51АССАССЛбЙАА ССТббССАббСТСС САЙЙСТССТ САГСТАТСйТОСАТССА ОСАС63ССАСТЙ<ЗСАТСССАСАСА05ТТСА|лТО<5СА6ТО13 6ТСТйе{ЗАСАеАС,£ТСАСТСТСАССАТСА1лСабАС1,бСА6 ССТЙААЙАТТТТЙСАЗТаТАТТАСТЙТСАЙСАЗТАТбСГА йСТСАССТСССзАСбТ ТСЙбССААБ ОВ АССААйОТейЛААТ СААА
ЗЕ<2 Ю N0:51 Аминокислотная последовательность νΗ4-34 человеческой зародышевой линии ΚΕ3δνΤΑΑ0ΤΑ.νΥΥ0Μ&
ЗЕО Ю N0:52 Аминокислотная последовательность νΗ3-53 человеческой зародышевой линии ф-т 81>ΪΛΕ0ΤΑνΥΥ САК
ЗЕ<2 Ю N0:53 Аминокислотная последовательность УнЗ-9/ОЗ10/ЛН6Ь человеческой зародышевой линии ΧιΟΜΝ3ΐηΑΕΟΤΑί»ΥΥΟΑΚϋϊ{55<32ΥϊΥΥΥ6Μϋνΐί(3Ο<1ΤΤν ТУ35
5Е0 Ю N0:54 Аминокислотная последовательность УкА27 человеческой зародышевой линии Е1УЬТОЗР<ЗТЬЗЬ5₽СЕ₽АТЬВСЕАЗОЗУ525УЬАНУаОК РС0АРВ1ЫУОА35ВАТ(515ОЙГВ35е35ТВРТЬТ13ВЬЕ ΡΕΟΕΆνγγθαθΥσ3£Ρ
ЗЕО 10 N0:55 Аминокислотная последовательность УкЬб/СГК1 человеческой зародышевой линии ЕIVI РАТЬЗЬЗРСЕКАТьгСВАЗОЗУЗЗУГ ΑΗΥΟΟΚΡ 60АРВЪЫУСА5М14АТ61₽АЛЕЗС5630ТОГТ1Т133ХЕР ΕΟΕΑνΥΥΟ02Κ£ΝΗΤΓ<30ατκνΈΙΚ
Принимая во внимание тот факт, что каждое из указанных человеческих антител, обозначенных 1С11, 2А7, 2Е9, 12Е1 и 13Ό12, может связываться с О8Е, и что специфичность связывания с антигеном обеспечивается, главным образом, областями СЭРЕ СЭР2 и СОР3, то следует отметить, что последовательности областей СЭРЕ СЭР2 и СЭР3 УН и последовательности областей СОР1, СЭР2 и СЭР3 УК могут быть смешаны и соответствующим образом подобраны (то есть СОР от различных антител могут быть смешаны и соответствующим образом подобраны, хотя каждое антитело должно содержать СЭРЕ СЭР2 и СЭР3 УН и СОР1, СЭР2 и СЭР3 УК) с получением других молекул антител, связывающихся с О8Е, согласно изобретению. Связывание таких смешанных и соответствующим образом подобранных антител с О8Е может быть протестировано с помощью анализов на связывание, описанных выше и в примерах (например, ЕАС8, ЕЬ18А и анализ в системе В1асоге). Обычно при смешивании и подборе последовательностей СОР УН предпочтительно, чтобы последовательности СОР1, СЭР2 и/или СЭР3 УН в конкретной последовательности УН были заменены структурно сходной(ыми) последовательностью(ями) СОР.
Аналогичным образом, при смешивании и подборе последовательностей СОР УК предпочтительно, чтобы последовательности СЭРЕ СЭР2 и/или СЭР3 в конкретной последовательности УК были заменены структурно сходной(ыми) последовательностью(ями) СОР. Среднему специалисту в данной области очевидно, что новые последовательности УН и Уъ могут быть получены путем замены одной или нескольких последовательностей области СОР УН и/или Уъ структурно сходными последовательностями, происходящими от последовательностей СОР, описанных в настоящей заявке для моноклональных антител 1С11, 2А7, 2Е9, 12Е1 и 13Ό12.
В соответствии с этим, в другом своем аспекте настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или к его антигенсвязывающей части, содержащим:
(a) СЭР1 вариабельной области тяжелой цепи, включающую в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ ЫО: 11, 12, 13, 14 и 15;
(b) СЭР2 вариабельной области тяжелой цепи, включающую в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ ЫО: 16, 17, 18, 19 и 20;
(c) СЭР3 вариабельной области тяжелой цепи, включающую в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ ЫО: 21, 22, 23, 24 и 25;
(й) СЭР1 вариабельной области легкой цепи, включающую в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ ЫО: 26, 27, 28, 29 и 30;
(е) СЭР2 вариабельной области легкой цепи, включающую в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ ЫО: 31, 32, 33, 34 и 35; и (ί) СЭР3 вариабельной области легкой цепи, включающую в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС ΙΌ ЫО: 36, 37, 38, 39 и 40, где указанное антитело спе
- 17 017086 цифически связывается с О8Е, а предпочтительно с человеческим О8Е.
В предпочтительном варианте изобретения указанное антитело содержит:
(a) ί.ΌΕ1 вариабельной области тяжелой цепи, включающую в себя последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 11;
(b) СЭЕ2 вариабельной области тяжелой цепи, включающую в себя последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 16;
(c) СЭЕ3 вариабельной области тяжелой цепи, включающую в себя последовательность 5>Е0 ΙΌ N0: 21; (б) СЭЕ1 вариабельной области легкой цепи, включающую в себя последовательность 5>Е0 ΙΌ N0: 26;
(е) СЭЕ2 вариабельной области легкой цепи, включающую в себя последовательность 5>Е0 ΙΌ N0: 31; и (ί) СЭЕ3 вариабельной области легкой цепи, включающую в себя последовательность 5>Е0 ΙΌ N0: 36. В другом предпочтительном варианте изобретения указанное антитело содержит:
(a) ί.ΌΕ1 вариабельной области тяжелой цепи, включающую в себя последовательность 5>Е0 ΙΌ N0: 12;
(b) СЭЕ2 вариабельной области тяжелой цепи, включающую в себя последовательность 5>Е0 ΙΌ N0: 17;
(c) СЭКЗ вариабельной области тяжелой цепи, включающую в себя последовательность 5>Е0 ΙΌ N0: 22;
(б) СЭЕ1 вариабельной области легкой цепи, включающую в себя последовательность 5>Е0 ΙΌ N0: 27;
(е) ί.ΌΕ2 вариабельной области легкой цепи, включающую в себя последовательность 5>Е0 ΙΌ N0: 32; и (ί) СЭЕЗ вариабельной области легкой цепи, включающую в себя последовательность 5>Е0 ΙΌ N0:
37.
В другом предпочтительном варианте изобретения указанное антитело содержит:
(a) ί.ΌΕ1 вариабельной области тяжелой цепи, включающую в себя последовательность 5>Е0 ΙΌ N0: 13;
(b) СЭЕ2 вариабельной области тяжелой цепи, включающую в себя последовательность 5>Е0 ΙΌ N0:18;
(c) 0ΌΚ3 вариабельной области тяжелой цепи, включающую в себя последовательность 5>Е0 ΙΌ N0: 23;
(б) СЭЕ1 вариабельной области легкой цепи, включающую в себя последовательность 5>Е0 ΙΌ N0: 28;
(е) ί.ΌΕ2 вариабельной области легкой цепи, включающую в себя последовательность 5>Е0 ΙΌ N0: 33; и (ί) СЭЕ3 вариабельной области легкой цепи, включающую в себя последовательность 5>Е0 ΙΌ N0:
38.
В другом предпочтительном варианте изобретения указанное антитело содержит:
(a) ί.ΌΕ1 вариабельной области тяжелой цепи, включающую в себя последовательность 5>Е0 ΙΌ N0: 14;
(b) СЭЕ2 вариабельной области тяжелой цепи, включающую в себя последовательность 5>Е0 ΙΌ N0: 19;
(c) 0ΌΚ3 вариабельной области тяжелой цепи, включающую в себя последовательность 5>Е0 ΙΌ N0: 24;
(б) СЭЕ1 вариабельной области легкой цепи, включающую в себя последовательность 5>Е0 ΙΌ N0: 29;
(е) 0ΌΚ2 вариабельной области легкой цепи, включающую в себя последовательность 5>Е0 ΙΌ N0: 34; и (ί) СЭЕ3 вариабельной области легкой цепи, включающую в себя последовательность 5>Е0 ΙΌ N0:
39.
В другом предпочтительном варианте изобретения указанное антитело содержит:
(a) ί.ΌΕ1 вариабельной области тяжелой цепи, включающую в себя последовательность 5>Е0 ΙΌ N0:15;
(b) СЭЕ2 вариабельной области тяжелой цепи, включающую в себя последовательность 5>Е0 ΙΌ N0: 20;
(c) 0ΌΚ3 вариабельной области тяжелой цепи, включающую в себя последовательность 5>Е0 ΙΌ N0: 25;
(б) СЭЕ1 вариабельной области легкой цепи, включающую в себя последовательность 5>Е0 ΙΌ N0: 30;
(е) СЭЕ2 вариабельной области легкой цепи, включающую в себя последовательность 5>Е0 ΙΌ N0:35; и (ί) СЭЕ3 вариабельной области легкой цепи, включающую в себя последовательность 5>Е0 ΙΌ N0:
40.
- 18 017086
Хорошо известно, что один домен СЭВ3, независимо от домена(ов) СЭР1 и/или СЭВ2, может определять специфичность связывания антитела с когнатным антигеном и что, как предполагается, исходя из известной последовательности СЭВ3, может быть генерировано множество антител, обладающих одной и той же специфичностью связывания. См., например, публикацию Кйтка с1 а1., βπΐίδΐι 1. о£ Сапсег 83 (2):252-260 (2000) (где описано продуцирование гуманизованного анти-СЭ30-антитела с использованием только СЭВ3 вариабельного домена тяжелой цепи мышиного анти-СЭ30 антитела К1-4); публикацию ВеЛоег е1 а1., I. Мо1. Вю1. 296:833-849 (2000) (где описано продуцирование рекомбинантных антител против эпителиального гликопротеина-2 (Е0Р-2) с использованием только последовательности СЭВ3 тяжелой цепи родительского мышиного анти-Е0Р-2 антитела МОС-31); публикацию Вабег е1 а1., Ргос. №И. Асаб. 8с1 И.8.А. 95:8910-8915 (1998) (где описано продуцирование панели гуманизованных антител против интегрина ανβ3 с использованием СЭВ3 вариабельного домена тяжелой и легкой цепей мышиного антитела против интегрина ανβ3 ЬМ609, где каждое из указанных антител содержит отличающуюся последовательность, находящуются за пределами домена СЭВ3 и способную связываться с тем же эпитопом, с которым связывается родительское мышиное антитело, и с такой же аффинностью, как и родительское мышиное антитело, или с более высокой аффинностью); публикацию ВагЬак е1 а1., I. Ат. СРет. 8ос. 116:2161-2162 (1994) (где описано, что домен СЭВ3 играет главную роль в связывании с антигеном); публикацию ВагЬак е1 а1., Ргос. №И. Асаб. 8сР И.8.А. 92:2529-2533 (1995) (где описано встраивание последовательностей СЭВ3 тяжелой цепи трех РаЬ-фрагментов антитела (8Ι-1, 8Ι-40 и 8Ι-32) против ДНК человеческой плаценты в тяжелую цепь РаЬ-фрагмента против столбнячного токсоида, где указанное введение приводит к замене СЭВ3, присутствующего в тяжелой цепи, и указывает на то, что специфичность связывания определяется лишь одним доменом СЭВ3); и публикацию Ойхе1 е1 а1., I. Iттиηο1. 157:739-749 (1996) (где описаны исследования по встраиванию, которые показали, что перенос только одного домена СЭВ3 тяжелой цепи РаЬ родительского полиспецифического антитела ЬХА3 в тяжелую цепь РаЬ моноспецифического антитела ΙβΟ р313 против столбнячного токсоида является достаточным для сохранения специфичности связывания родительского РаЬ). Каждая из этих публикаций во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.
В соответствии с этим, в некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к моноклональным антителам, содержащим один или несколько доменов СЭВ3 тяжелой и/или легкой цепей, происходящих от нечеловеческого антитела, такого как мышиное или крысиное антитело, где указанное моноклинальное антитело обладает способностью специфически связываться с 08Е. В некоторых вариантах изобретения, такие антитела согласно изобретению, содержащие один или несколько доменов СЭВ3 тяжелой и/или легкой цепей, происходящих от нечеловеческого антитела, (а) обладают способностью конкурировать за связывание с соответствующим родительским нечеловеческим антителом; (Ь) сохраняют функциональные свойства указанного родительского антитела; (с) связываются с таким же эпитопом и/или (б) обладают такой же аффинностью связывания, как и соответствующее родительское нечеловеческое антитело.
В других своих аспектах настоящее изобретение относится к моноклональным антителам, содержащим один или несколько доменов СЭВ3 тяжелой и/или легкой цепей, происходящих от первого человеческого антитела, такого как, например, человеческое антитело, полученное от животного, не являющегося человеком, где указанное первое человеческое антитело обладает способностью специфически связываться с 08Е, и где указанный домен СЭВ3 первого человеческого антитела заменяет домен СЭВ3 в человеческом антителе, которое не обладает способностью специфически связываться с 08Е, в результате чего образуется второе человеческое антитело, обладающее способностью специфически связываться с 08Е. В некоторых вариантах изобретения, антитела согласно изобретению, содержащие один или несколько доменов СЭВ3 тяжелой и/или легкой цепей, происходящих от первого человеческого антитела, (а) обладают способностью конкурировать за связывание с соответствующим родительским первым человеческим антителом; (Ь) сохраняют функциональные свойства указанного родительского антитела; (с) связываются с таким же эпитопом и/или (б) обладают такой же аффинностью связывания, как и соответствующее родительское первое человеческое антитело.
Антитела, имеющие конкретные последовательности зародышевой линии
В некоторых вариантах изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи, происходящую от конкретного гена тяжелой цепи иммуноглобулина зародышевой линии и/или вариабельную область легкой цепи, происходящую от конкретного гена легкой цепи иммуноглобулина зародышевой линии.
Так, например, в своем предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или к его антигенсвязывающей части, содержащим вариабельную область тяжелой цепи, которая является продуктом человеческого гена ¥Д-34 или происходит от этого продукта, где указанное антитело специфически связывается с 08Е. В другом своем предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или к его антигенсвязывающей части, включающим в себя вариабельную область тяжелой цепи, которая является продуктом человеческого гена νμ3-53 или происходит от этого продукта, где указанное антитело специфи
- 19 017086 чески связывается с О8Е. В другом своем предпочтительном варианте настоящее изобретение относится также к выделенному моноклональному антителу или к его антигенсвязывающей части, включающей вариабельную область тяжелой цепи, которая является продуктом комбинированного человеческого гена Уц3-9/О3-10/.1Н6Ь или происходит от этого продукта, где указанное антитело специфически связывается с О8Е.
В другом своем предпочтительном варианте настоящее изобретение относится также к выделенному моноклональному антителу или к его антигенсвязывающей части, включающим в себя вариабельную область легкой цепи, которая является продуктом человеческого гена УКА27 или происходит от этого продукта, где указанное антитело специфически связывается с О8Е. В другом своем предпочтительном варианте настоящее изобретение относится также к выделенному моноклональному антителу или к его антигенсвязывающей части, включающим в себя вариабельную область легкой цепи, которая является продуктом комбинированого человеческого гена νκΕ6/!Κ1 или происходит от этого продукта, где указанное антитело специфически связывается с О8Е.
В еще одном своем предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или к его антигенсвязывающей части, где указанное антитело:
(a) содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая является продуктом или происходит от продукта человеческого гена νΗ4-34, человеческого гена νΗ3-53 или комбинированного человеческого гена Уц3-9/О3-10/.1Н6Ь (которые кодируют аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕЦ ГО N0: 51, 52 и 53, соответственно);
(b) содержит вариабельную область легкой цепи, которая является продуктом или происходит от продукта человеческого гена νκΑ27 или комбинированного человеческого гена νκΕ6/!Κ1 (которые кодируют аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕЦ ГО N0: 54 и 55, соответственно); и (c) специфически связывается с О8Е, а предпочтительно, с человеческим О8Е.
Примерами антител, имеющих νΗ и νκ, кодируемых генами νΗ4-34 и νκΑ27, соответственно, являются 1011 и 13Ό12. Примерами антител, имеющих νΗ и νκ, кодируемых генами νΗ3-53 и νκΑ27, соответственно, являются 2А7 и 2Р9. Примером антитела, имеющего νΗ и νκ, кодируемых генами νΗ39/О3-10/1Н6Ь и νκΕ6/!Κ1, соответственно, является 12Е1.
Используемое здесь человеческое антитело содержит вариабельные области тяжелой или легкой цепей, которые являются продуктом или происходят от конкретной последовательности зародышевой линии, если вариабельные области указанного антитела были получены из системы, в которой используются гены иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Такие системы включают в себя иммунизацию трансгенной мыши, несущей гены человеческого иммуноглобулина, представляющим интерес антигеном, или скрининг библиотеки генов человеческого иммуноглобулина, представленных на фаге, с использованием представляющего интерес антигена. Человеческое антитело, которое является продуктом последовательности или происходит от последовательности иммуноглобулина человеческой зародышевой линии, может быть идентифицировано путем сравнения аминокислотной последовательности человеческого антитела с аминокислотными последовательностями иммуноглобулинов человеческой зародышевой линии и отбора последовательности иммуноглобулина человеческой зародышевой линии, которая является наиболее сходной (то есть имеет наибольший % идентичности) с последовательностью человеческого антитела. Человеческое антитело, которое является продуктом конкретной последовательности иммуноглобулина человеческой зародышевой линии или происходит от такой последовательности, может содержать аминокислоты, отличающиеся от аминокислот сравниваемой последовательности зародышевой линии, что обусловлено, например, природными соматическими мутациями или искусственным введением сайт-направленной мутации. Однако аминокислотная последовательность выбранного человеческого антитела, обычно по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина человеческой зародышевой линии и содержит аминокислотные остатки, которые позволяют идентифицировать данное антитело как человеческое антитело при его сравнении с аминокислотными последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии других видов (например, с последовательностями мышиной зародышевой линии). В некоторых случаях, аминокислотная последовательность человеческого антитела может быть по меньшей мере на 95%, или даже по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии. В некоторых вариантах изобретения человеческое антитело, происходящее от конкретной последовательности человеческой зародышевой линии, имеет не более чем 10 аминокислот, отличающихся от аминокислот последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. В некоторых других вариантах изобретения указанное человеческое антитело может иметь не более чем 5, или даже не более чем 4, 3, 2 или 1 аминокислоту, отличающихся от аминокислот последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина человеческой зародышевой линии.
Гомологичные антитела
В другом варианте осуществления изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепей, включающие в себя аминокислотные последовательности, гомологичные аминокислотным последовательностям описанных здесь предпочтительных антител, где
- 20 017086 указанные антитела сохраняют нужные функциональные свойства анти-О8Е-антител согласно изобретению.
Так, например, настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или к его антигенсвязывающей части, содержащим вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где:
(a) указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ N0: 1, 2, 3, 4 и 5;
(b) указанная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 6, 7, 8, 9 и 10;
(c) указанное антитело связывается с человеческим 08Е с Кс=1х 10-7 М или менее;
(б) указанное антитело связывается с клетками СНО, трансфицированными человеческим 08Е.
В других вариантах изобретения, указанным антителом может быть, например, человеческое антитело, гуманизованное антитело или химерное антитело.
В других вариантах изобретения, аминокислотные последовательности νΗ и/или VI, могут быть на 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% гомологичны вышеуказанным последовательностям. Антитело, имеющее области νΗ и νΗ, являющиеся в высокой степени (то есть на 80% или более) гомологичными областям νΗ и ν вышеуказанных последовательностей, могут быть получены путем мутагенеза (например, сайтнаправленного или ПЦР-опосредуемого мутагенеза) молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих последовательности 8Е0 ΙΌ NО: 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 4 9 и 50, с последующим тестированием кодируемого модифицированного антитела на сохранение его функций (то есть функций, указанных выше в пунктах (с)-(б)) в соответствии с описанными здесь функциональными анализами.
Используемый здесь термин процент гомологии двух аминокислотных последовательностей эквивалентен термину процент идентичности двух последовательностей. Процент идентичности двух последовательностей зависит от числа положений идентичных аминокислот в этих двух последовательностях (то есть % гомологии = # идентичных аминокислот в данных положениях/общее число положений х 100) с учетом числа пробелов и длины каждого пробела, которые необходимо ввести для оптимального сопоставления двух последовательностей путем выравнивания. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности двух последовательностей может быть осуществлено с помощью математического алгоритма, описанного ниже в неограничивающих примерах.
Процент идентичности двух аминокислотных последовательностей может быть определен с помощью алгоритма Е. Меуегк апб ^. МШег (Сотри!. Арр1. ВюксЕ, 4:11-17 (1988)), который был введен в программу ΑΓΙΟΝ (уегкюп 2.0), с использованием таблицы весов остатков РАМ120, штрафа на пробелудлинение=12, и штрафа на пробел-пропуск=4. Кроме того, процент идентичности двух аминокислотных последовательностей может быть определен с помощью алгоритма №еб1етап и ХУипксЕ (Г Мо1. В1о1. 48:444-453 (1970)), который был введен в программу ОАР, входящую в пакет программ ОСО (доступных на сайте \\л\лу.дсд.со1п). с использованием либо матрицы В1оккит 62, либо матрицы РАМ250 и весов пробелов-пропусков, составляющих 16, 14, 12, 10, 8, 6, или 4 и весов длин (участков), составляющих 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
Дополнительно или альтернативно, последовательности белка согласно изобретению могут быть также использованы в качестве запрашиваемой последовательности для осуществления поиска в общедоступных базах данных, например, в целях идентификации родственных последовательностей. Такой поиск может быть проведен с помощью программы ХВЬА8Т (уегкюп 2.0) А1!ксйи1, е! а1. (1990) Г Мо1. В1о1. 215:403-10. Поиск белков ВЬА8Т может быть осуществлен с помощью программы ХВЬА8Т, где при весовом коэффициенте=50 и длине слова=3, могут быть получены аминокислотные последовательности, гомологичные последовательностям молекул антител согласно изобретению. Для осуществления выравнивания с пробелами в целях сопоставления последовательностей может быть использована программа Оарреб ВЬА8Т, описанная АНксЕЫ е! а1., (1997) №с1ею Ас1бк Кек. 25(17):3389-3402. При работе с программами ВЬА8Т и Оарреб ВЬА8Т могут быть использованы параметры по умолчанию, установленные в соответствующих программах (например, ХВЬА8Т и №ЬА8Т). См. \у\у\у.псЫ.п1т.ш11.доу.
Антитела с консервативными модификациями
В некоторых вариантах изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую в себя последовательности СЭК1, СЭК2 и СЭК3, и вариабельную область легкой цепи, включающую в себя последовательности СЭК1, СЭК2 и СЭК3, где один или несколько указанных последовательностей СЭК имеют конкретные аминокислотные последовательности, полученные на основе последовательностей описанных здесь предпочтительных антител (например, 1О11, 2А7, 2Е9, 12Е1 и 13Ό12) или их консервативные модификации, и где указанные антитела сохраняют нужные функциональные свойства анти-О8Е-антител согласно изобретению. В соответствии с этим настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или к его антигенсвязывающей части, содержащим вариабельную область тяжелой цепи, включающую в себя последовательно
- 21 017086 сти СЭРЕ СЭР2 и СЭВ3. и вариабельную область легкой цепи, включающую в себя последовательности СОНЕ СОН2 и СИКЗ, где:
(a) последовательность ί.ΌΗ3 вариабельной области тяжелой цепи включает в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей 8ЕЦ ΙΌ N0: 21, 22, 23, 24 и 25 и их консервативных модификаций;
(b) последовательность СЭН3 вариабельной области легкой цепи включает в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей 8ЕЦ ΙΌ N0: 36, 37, 38, 39 и 40 и их консервативных модификаций;
(c) указанное антитело связывается с человеческим 08Е с Кс=1х 10-7 М или менее; и (ά) указанное антитело связывается с клетками СН0, трансфицированными человеческим 08Е.
В предпочтительном варианте изобретения указанная последовательность СЭВ2 вариабельной области тяжелой цепи включает в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей 8ЕЦ ΙΌ N0: 16, 17, 18, 19 и 20 и их консервативных модификаций; а последовательность ί.ΌΗ2 вариабельной области легкой цепи включает в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей 8ЕЦ ΙΌ N0: 31, 32, 33, 34 и 35 и их консервативных модификаций. В другом предпочтительном варианте изобретения указанная последовательность ί.ΌΗ1 вариабельной области тяжелой цепи включает в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей 8ЕЦ ΙΌ N0: 11, 12, 13, 14 и 15 и их консервативных модификаций; а последовательность СЭИ 1 вариабельной области легкой цепи включает в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей 8ЕЦ ΙΌ N0: 26, 27, 28, 29 и 30 и их консервативных модификаций.
В различных вариантах изобретения указанным антителом могут быть, например, человеческие антитела, гуманизованные антитела или химерные антитела.
Используемый здесь термин консервативные модификации последовательности означает аминокислотные модификации, которые не оказывают значительного воздействия или влияния на связывающие свойства антитела, содержащего данную аминокислотную последовательность. Такими консервативными модификациями являются аминокислотные замены, добавления и делеции. Модификации могут быть введены в антитело согласно изобретению стандартными методами, известными специалистам, такими как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредуемый мутагенез. Консервативными аминокислотными заменами являются замены, в которых данный аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, имеющим аналогичную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих аналогичные боковые цепи, известны специалистам. Такие семейства включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), аминокислоты с кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота); аминокислоты с незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан); аминокислоты с неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин); аминокислоты с бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и аминокислоты с ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или несколько аминокислотных остатков в областях СИЯ антитела согласно изобретению могут быть заменены другими аминокислотными остатками, принадлежащими к семейству аминокислотных остатков, имеющих аналогичные боковые цепи, и такое модифицированное антитело может быть протестировано на сохранение его функции.
Антитела, которые связываются с таким же эпитопом, как и анти-О8Е-антитела согласно изобретению
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются с таким же эпитопом на человеческом 08Е, как и анти-08Е-антитела согласно изобретению (то есть антитела, которые обладают способностью конкурировать с любым из моноклональных антител согласно изобретению за перекрестное связывание с 08Е). В предпочтительных вариантах изобретения эталонным антителом, используемым в исследованиях на конкуренцию за перекрестное связывание, может быть моноклональное антитело 1011 (имеющее последовательности УН и Уъ, представленные в 8ЕЦ ΙΌ N0: 1 и 6, соответственно), или моноклональное антитело 2А7 (имеющее последовательности УН и Уъ, представленные в 8Е0 ΙΌ N0: 2 и 7, соответственно), или моноклональное антитело 2Р9 (имеющее последовательности УН и Уъ, представленные в 8ЕЦ ΙΌ N0: 3 и 8, соответственно), или моноклональное антитело 12Е1 (имеющее последовательности УН и Уъ, представленные в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4 и 9, соответственно), или моноклональное антитело 13Ό12 (имеющее последовательности УН и Уъ, представленные в 8ЕЦ ΙΌ N0: 5 и 10, соответственно). Такие конкурирующие за перекрестное связывание антитела могут быть идентифицированы по их способности конкурировать за перекрестное связывание с 1011, 2А7, 2Р9, 12Е1 и 13Ό12 в стандартных анализах на связывание с 08Е. Так, например, анализ в системе ЫАсоте, анализ ЕЫ8А или проточный цитометрический анализ могут быть использованы для иллюстрации конкуренции за перекрестное связывание с антителами согласно изобретению. Способность тестируемого антитела ингибировать связывание антитела, например, 1011, 2А7, 2Р9, 12Е1 или 13Ό12 с человеческим
- 22 017086
08Е, указывает на то. что тестируемое антитело может конкурировать с антителами 1611, 2А7, 2Р9, 12Е1 и 13Ό12 за связывание с человеческим 08Е, а. поэтому оно связывается с тем же эпитопом на человеческом 08Е, с которым связываются антитела 1611, 2А7, 2Р9, 12Е1 или 13Ό12. В предпочтительном варианте изобретения антитело. которое связывается с тем же эпитопом на человеческом 08Е. с которым связываются антитела 1611, 2А7, 2Р9, 12Е1 и 13Ό12, представляет собой человеческое моноклональное антитело. Такие человеческие моноклональные антитела могут быть получены и выделены как описано в примерах. Сконструированные и модифицированные антитела. Антитело согласно изобретению может быть также получено с использованием антитела. имеющего одну или несколько описанных здесь последовательностей νΗ и/или ν!. В качестве исходного материала для конструирования модифицированного антитела. где указанное модифицированное антитело может обладать свойствами. отличающимися от свойств исходного антитела. Антитело может быть сконструировано путем модификации одного или нескольких остатков в одной или обеих вариабельных областях (то есть νΗ и/или Уь), например. в одной или нескольких областях СОК и/или в одной или нескольких каркасных областях. Дополнительно или альтернативно. антитело может быть сконструировано путем модификации остатков в константной(ых) области(ях), например. в целях изменения эффекторной(ых) функции(й) указанного антитела. Одним из подходящих методов конструирования вариабельных областей является присоединение СОК. Антитела взаимодействуют с антигеном-мишенью преимущественно посредством аминокислотных остатков. которые локализованы в шести гипервариабельных областях (СОК) тяжелой и легкой цепей. По этой причине аминокислотные последовательности СОК в отдельных антителах имеют большие отличия. чем последовательности. расположенные за пределами этих СОК. Поскольку последовательности СОК являются ответственными за большинство взаимодействий антитело-антиген. то могут быть экспрессированы рекомбинантные антитела. которые имитируют свойства конкретных природных антител. путем конструирования экспрессирующих векторов. включающих в себя последовательности СОК. происходящие от специфических природных антител. присоединенных к каркасным последовательностями другого антитела с другими свойствами (см.. например. К|есктапп. Ь. е! а1. (1998) МНиге 332:323-327; Лопех. Р. е! а1. (1986) ХаИие 321:522-525; Оиееи. С е! а1. (1989) Ргос. №6. Асаб. δα. И.8.А. 86:10029-10033; патент США № 5225539, №т!ег и патенты США №№ 5530101, 5585089, 5693762 и 6180370, Оиеен е! а1. ).
В соответствии с этим в другом своем варианте настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или к его антигенсвязывающей части. содержащим вариабельную область тяжелой цепи. включающую в себя последовательности СГОК1. СЭК2 и СЭК3. имеющие аминокислотную последовательность. выбранную из группы. состоящей из 8ЕО ГО N0: 11. 12. 13. 14 и 15; 8ЕО ГО N0: 16. 17. 18. 19 и 20 и 8Е0 ГО N0: 21. 22. 23. 24 и 25. соответственно. и вариабельную область легкой цепи. включающую в себя последовательности СГОК1. СГОК2 и СГОК3. имеющие аминокислотную последовательность. выбранную из группы. состоящей из 8Е0 ГО N0: 26. 27. 28. 29 и 30; 8Е0 ГО N0: 31. 32. 33. 34 и 35; и 8Е0 ГО N0: 36. 37. 38. 39 и 40. соответственно. Таким образом. указанные антитела содержат последовательности СОК νΗ и Уь моноклональных антител 1611, 2А7, 2Р9, 12Е1 и 13Ό12, и они могут также содержать различные каркасные последовательности этих антител.
Такие каркасные последовательности могут быть получены из общедоступных баз данных ДНК или известных последовательностей. которые включают в себя последовательности генов антител зародышевой линии. Так. например. последовательности ДНК зародышевой линии. включающие в себя гены вариабельной области человеческой тяжелой и легкой цепей. можно найти в базе данных последовательностей человеческой зародышевой линии УВаке (доступной в Интернете на сайте те^ет.шгссре.сат.ас.пк/уЬахе). а также в публикациях КаЬаЕ Е. А.. е! а1. (1991) 8ес.|иепсе5 οί РгоЮпъ οί 1ттипо1од|са1 1п1егей. ΕίΓιΗ ЕбШоп. И.8. ИерайтеШ οί Неа1(Н апб Нитап Зегуюек, N14 РиЬПсаПоп № 91-3242; ТотШъоп. I. М.. е! а1. (1992) Тке Керейойе оГ Нитап СегтНпе νΗ 8ес.|иепсе5 Кеуеа1к аЬои! Р1йу 6гоир§ оГ Ун 8едтепй \\йк ИгГГегеШ НурегуапаЫе Ьоорк I. Мо1. Вю1. 227:776-798; и Сох, I. Р. Ь. е! а1. (1994) А ИкесЮгу оГ Нитап Сегт-1те Ун 8едтепй Кеуеак а 81гопд В1ак ίπ 1ке1г Иваде Еиг. 1. ^типок 24:827836; содержание которых во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки. В другом примере. последовательности ДНК генов вариабельной области тяжелой и легкой цепей человеческой зародышевой линии можно найти в базе данных 6епЬапк. Так. например. нижеследующие последовательности тяжелой цепи зародышевой линии. присутствующие в мышином НиМАЬ НСо7, имеются в базе данных 6епЬанк под соответствующими регистрационными номерами: 1-69 (N6-0010109, КГ_024637 и ВС070333), 3-33 (N6-0010109 и КГ_024637) и 3-7 (N6-0010109 и КГ_024637). В другом примере. нижеследующие последовательности тяжелой цепи зародышевой линии. присутствующие в мышином НиМАЬ НСо12, имеются в базе данных 6еиЬаик под соответствующими регистрационными номерами: 1-69 (N613010109, КГ_024637 и ВС070333), 5-51 (N6-0010109 и КГ_024637), 4-34 (N6-0010109 КГ_024637), 3-30.3 (СА1556644) и 3-23 (ΑΙ406678).
Белковые последовательности антитела сравнивали с последовательностями белков. имеющихся в компилированной базе данных. с применением программ поиска сходства последовательностей. называемых 6арреб ВБА8Т (Л1йс1ш1 е! а1. (1997) МШек Ас1бк Кекеагск 25:3389-3402), которые хорошо известны специалистам. ВЬА8Т представляет собой эвристический алгоритм. в котором при статистически значимом сопоставлении путем выравнивания последовательности антитела с последовательностью базы
- 23 017086 данных, выравниваемые слова, вероятно, содержат пары сегментов с высокими весовыми коэффициентами (Н8Р). Пары сегментов, весовые коэффициенты которых не могут быть улучшены путем удлинения или усечения, называются наилучшими совпадениями. Вкратце, нуклеотидные последовательности в начале последовательности УВА8Е (уЬа8е.тгс-сре.сат.ас.ик/уЬа8е1/11812.рйр) были транслированы, а область между каркасными областями ЕК1-ЕКЗ, включительно, сохранялась. Последовательности базы данных имеют среднюю длину в 98 остатков. Дубликаты последовательностей, которые имеют точные соответствия по всей длине белка, были удалены. Поиск белков в ВЬА8Т, проводимый с использованием программы Ь1аз1р со стандартными параметрами по умолчанию, за исключением фильтра для последовательностей низкой сложности, который был отключен, и матрицы замен ВЬО8ИМ62, выявил 5 наилучших совпадений последовательностей. Эти нуклеотидные последовательности были транслированы во всех шести рамках считывания, и рамка считывания без стоп-кодонов в сегменте соответствующей последовательности базы данных рассматривалась как последовательность, имеющая, по всей вероятности, наилучшее совпадение. Это, в свою очередь, было подтверждено с помощью программы 1Ь1а81х. входящей в пакет ВЬА8Т и позволяющей транслировать последовательности антитела во всех шести рамках считывания и сравнивать эти транслированные последовательности с нуклеотидными последовательностями УВА8Е, динамически транслируемыми всех шести рамках считывания.
Идентичность означает точные соответствия между последовательностью антитела и последовательностью белка в базе данных на протяжении всей длины данной последовательности. Положительные веса (идентичность + соответствие замен) означают лишь идентичности аминокислотных замен, присваиваемых матрицей замен ВЬО8ИМ62. Если последовательность антитела соответствует двум последовательностям в базе данных с той же степенью идентичности, то совпадение с наибольшим положительным весом должно рассматриваться как наилучшее совпадение последовательностей.
Предпочтительными каркасными последовательностями, используемыми в антителах согласно изобретению, являются последовательности, которые имеют структурное сходство с каркасными последовательностями, используемыми в выбранных антителах согласно изобретению, например, они имеют сходство с каркасными последовательностями УН4-34 (8Е0 ΙΌ ЫО: 51) и/или каркасными последовательностями УН3-53 (8Е0 ΙΌ ЫО: 52) и/или с комбинированными каркасными последовательностями УН3-9/Э310/Ш6Ь (8Е0 ΙΌ ЫО: 53) и/или каркасными последовательностями УКА27 (8Е0 ΙΌ ЫО: 54) и/или с комбинированными каркасными последовательностями УКЬ6/]К1 (8Е0 ΙΌ ЫО: 55), используемым в предпочтительных моноклональных антителах согласно изобретению. Последовательности СЭК!, СЭК2 и СЭК3 УН и последовательности СЭКЕ СЭК2 и СЭК3 УК могут быть присоединены к каркасным областям, которые имеют последовательности, идентичные последовательностям, обнаруженным в гене иммуноглобулина зародышевой линии, от которого происходит данная каркасная последовательность, либо последовательности СЭК могут быть присоединены к каркасным областям, содержащим одну или несколько мутаций по сравнению с последовательностями зародышевой линии. Так, например, было обнаружено, что в некоторых случаях может оказаться предпочтительным введение мутаций в положения остатков в каркасных областях в целях сохранения или усиления антигенсвязывающей способности антитела (см., например, патенты США 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370, Оиееп е! а1.).
Модификация вариабельной области другого типа представляет собой мутацию аминокислотных остатков в областях СЭКЕ СЭК2 и/или СЭК3 УН и/или УК, которую вводят в целях улучшения одного или нескольких связывающих свойств (например, аффинности) представляющего интерес антитела. Сайт-направленный мутагенез или ПЦР-опосредованный мутагенез может быть проведен для введения мутации(й), и их влияние на связывание антитела или другое представляющее интерес функциональное свойство может быть оценено в ίη νίίτο или ίη νίνο анализах, описанных выше и в примерах. Предпочтительными являются консервативные модификации (обсуждаемые выше). Такими мутациями могут быть аминокислотные замены, добавления или делеции, однако предпочтительными являются замены. Кроме того, обычно в область СЭК вводят не более чем одну, две, три, четыре или пять модификаций остатков.
В соответствии с этим в другом своем варианте настоящее изобретение относится к выделенным моноклональным антителам против О8Е или к их антигенсвязывающим частям, включающим в себя вариабельную область тяжелой цепи, содержащую:
(a) область СЭК1 УН, включающую в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ ЫО: 11, 12, 13, 14 и 15, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с 8ЕО ΙΌ ЫО: 11, 12, 13, 14 и 15;
(b) область СЭК2 УН, включающую в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ ЫО: 16, 17, 18, 19 и 20, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с 8ЕО ΙΌ ЫО: 16, 17, 18, 19 и 20;
(c) область СЭК3 УН, включающую в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ ЫО: 21, 22, 23, 24 и 25, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с 8ЕО ΙΌ ЫО: 21, 22, 23, 24 и 25;
- 24 017086 (ά) область СЭЕ1 УК, включающую в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 Ш ЫО: 26, 27, 28, 29 и 30; или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с 8Е0 Ш ЫО: 26, 27, 28, 29 и 30;
(е) область ί.ΌΕ2 УК, включающую в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО Ш ЫО: 31, 32, 33, 34 и 35, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с 8Е0 Ш ЫО: 31, 32, 33, 34 и 35; и (£) область СЭЕ3 УК, включающую в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО Ш ЫО 36, 37, 38, 39 и 40; или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с 8Е0 Ш ЫО: 36, 37, 38, 39 и 40.
Сконструированными антителами согласно изобретению являются антитела, у которых в УН и/или в УК были сделаны модификации каркасных остатков в целях улучшения свойств данного антитела. Обычно, такие модификации в каркасных областях вводят в целях снижения иммуногенности антитела. Так, например, одним из методов является введение обратной мутации одного или нескольких каркасных остатков в соответствующую последовательность зародышевой линии. Более конкретно, антитело, которое было подвергнуто соматической мутации, может содержать каркасные остатки, отличающиеся от остатков последовательности зародышевой линии, от которой происходит данное антитело. Такие остатки могут быть идентифицированы путем сравнения каркасных последовательностей антитела с последовательностями зародышевой линии, от которых происходит данное антитело.
Так, например, в 1011, аминокислотным остатком #71 (в ЕК3) УН является аланин, а соответствующим остатком в последовательности УН4-34 зародышевой линии является валин. Для возвращения последовательностям каркасной области конфигураций, которые они имели в исходной зародышевой линии, соматические мутации могут быть подвергнуты обратной мутации с получением последовательности зародышевой линии, например, посредством сайт-направленного мутагенеза или ПЦРопосредуемого мутагенеза (например, остаток #71 в области ЕК3 в УН антитела 1011 может быть подвергнут обратной мутации путем замены аланина на валин). Такие антитела с обратными мутациями также входят в объем настоящего изобретения.
В другом примере, в 1011, аминокислотным остатком #81 (в ЕК3) УН является аргинин, а соответствующим остатком в последовательности УН4-34 зародышевой линии является лизин. Для возвращения последовательностям каркасной области конфигураций, которые они имели в исходной зародышевой линии, например, остаток #81 в области ЕК3 в УН антитела 1011 может быть подвергнут обратной мутации путем замены аргинина на лизин. Такие антитела с обратными мутациями также входят в объем настоящего изобретения.
В другом примере, в 13Ό12, аминокислотным остатком #83 (в ЕК3) УН является аспарагин, а соответствующим остатком в последовательности УН4-34 зародышевой линии является серин. Для возвращения последовательностям каркасной области конфигураций, которые они имели в исходной зародышевой линии, например, остаток #83 в области ЕК3 в УН антитела 13Ό12 может быть подвергнут обратной мутации путем замены аспарагина на серин. Такие антитела с обратными мутациями также входят в объем настоящего изобретения.
В другом примере, в 2А7, аминокислотным остатком #67 (в ЕК3) УН является валин, а соответствующим остатком в последовательности УН3-53 зародышевой линии является фенилаланин. Для возвращения последовательностям каркасной области конфигураций, которые они имели в исходной зародышевой линии, например, остаток #67 в области ЕК3 в УН антитела 2А7 может быть подвергнут обратной мутации путем замены валина на фенилаланин. Такие антитела с обратными мутациями также входят в объем настоящего изобретения.
В другом примере, в 2Е9, аминокислотным остатком #28 (в ЕК1) УН является изолейцин, а соответствующим остатком в последовательности УН3-53 зародышевой линии является треонин. Для возвращения последовательностям каркасной области конфигураций, которые они имели в исходной зародышевой линии, например, остаток #28 в области ЕК1 в УН антитела 2Е9 может быть подвергнут обратной мутации путем замены изолейцина на треонин. Такие антитела с обратными мутациями также входят в объем настоящего изобретения.
В другом примере, в 12Е1, аминокислотным остатком #23 (в ЕК1) УН является валин, а соответствующим остатком в последовательности УН3-9 зародышевой линии является аланин. Для возвращения последовательностям каркасной области конфигураций, которые они имели в исходной зародышевой линии, например, остаток #23 в области ЕК1 в УН антитела 12Е1 может быть подвергнут обратной мутации путем замены валина на аланин. Такие антитела с обратными мутациями также входят в объем настоящего изобретения.
В другом примере, в 1011, аминокислотным остатком #7 (в ЕК1) УК является фенилаланин, а соответствующим остатком в последовательности УКА27 зародышевой линии является серин. Для возвращения последовательностям каркасной области конфигураций, которые они имели в исходной зародыше
- 25 017086 вой линии, например, остаток #7 в области ЕЯ1 в Ук антитела 1011 может быть подвергнут обратной мутации путем замены фенилаланина на серин. Такие антитела с обратными мутациями также входят в объем настоящего изобретения.
В другом примере, в 1011, аминокислотным остатком #47 (в ЕЯ2) Ук является валин, а соответствующим остатком в последовательности УкА27 зародышевой линии является лейцин. Для возвращения последовательностям каркасной области конфигураций, которые они имели в исходной зародышевой линии, например, остаток #47 в области ЕЯ2 в Ук антитела 1011 может быть подвергнут обратной мутации путем замены валина на лейцин. Такие антитела с обратными мутациями также входят в объем настоящего изобретения.
Модификация каркасной области другого типа включает в себя мутацию одного или нескольких остатков в каркасной области или даже в одной или нескольких областях СЭЯ, вводимую в целях удаления Т-клеточных эпитопов для снижения потенциальной иммуногенности антитела. Этот метод также называется деиммунизацией и подробно описан в публикации заявки на патент США № 2003/0153043, Сагг е! а1.
Сконструированными антителами согласно изобретению также являются антитела, в которые были внесены модификации аминокислотных остатков в целях усиления или ослабления иммуногенных ответов, где указанные модификации приводят к изменению взаимодействия Т-клеточного эпитопа с данным антителом (см. патенты США №№ 6835550; 6897049 и 6936249).
Помимо модификаций или в качестве альтернативы модификациям, вводимым в каркасные области или в области СЭЯ, антитела согласно изобретению могут быть сконструированы так, чтобы они имели модификации в Ес-области, которые обычно приводят к изменению одного или нескольких функциональных свойств данного антитела, таких как время полужизни в сыворотке, фиксация комплемента, связывание с Ес-рецептором и/или антигензависимая клеточная цитотоксичность. Кроме того, антитело согласно изобретению может быть химически модифицировано (например, к такому антителу могут быть присоединены одна или несколько химических групп), или оно может быть модифицировано для изменения уровней его гликозилирования, которое также осуществляют в целях изменения одного или нескольких функциональных свойств антитела. Каждый из этих вариантов изобретения более подробно описан ниже. Остатки в Ес-области пронумерованы в соответствии с Европейской нумерацией по Кэбату.
В одном из вариантов изобретения шарнирную область СН1 модифицируют в целях изменения числа цистеиновых остатков в этой области, например, для их увеличения или снижения. Этот метод подробно описан в патенте США № 5677425, Вобтег е! а1. Число цистеиновых остатков в шарнирной области СН1 изменяют, например, для облегчения сборки легкой и тяжелой цепей или для повышения, или снижения стабильности антитела.
В другом варианте изобретения шарнирную область Ес антитела подвергают мутации для уменьшения биологического времени полужизни данного антитела. Более конкретно, одну или несколько аминокислотных мутаций вводят в область стыка доменов СН2-СН3 шарнирного Ес-фрагмента для того, чтобы данное антитело обладало ослабленной способностью связываться со стафиллококковым белком А (8рА) по сравнению со 8рА-связывающим доменом нативной Ес-шарнирной области. Этот метод подробно описан в патенте США № 6165745, \Уагб е! а1.
В другом варианте изобретения, указанное антитело модифицируют в целях увеличения его биологического времени полужизни. Для этого могут быть применены различные методы. Так, например, могут быть введены одна или несколько из нижеследующих мутаций: Т252Ь, Т2548, Т256Е, как описано в патенте США № 6277375, \Уагб. Альтернативно, для увеличения биологического времени полужизни, указанное антитело может быть модифицировано в области СН1 или Сь, так, чтобы оно содержало эпитоп связывания с рецептором спасения, происходящий от двух петель домена СН2 в Ес-области Ι§0, как описано в патентах США №№ 5869046 и 6121022, РгеЧа е! а1.
В других вариантах изобретения Ес-область модифицируют путем замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком в целях изменения эффекторной(ых) функции(й) антитела. Так, например, одна или несколько аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 и 322, могут быть заменены другим аминокислотным остатком, так, чтобы данная замена приводила к изменению аффинности данного антитела по отношению к эффекторному лиганду, но с сохранением антигенсвязывающей способности родительского антитела. Эффекторным лигандом, по отношению к которому может быть изменена аффинность антитела, может быть, например, Ес-рецептор или компонент С1 комплемента. Этот метод подробно описан в патентах США №№ 5624821 и 5648260, №ш1ег е! а1.
В другом примере одна или несколько аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков 329, 331 и 322, могут быть заменены другими аминокислотными остатками так, чтобы данная замена приводила к изменению способности данного антитела связываться с СЩ и/или к снижению или устранению комплементзависимой цитотоксичности (СЭС). Этот метод подробно описан в патенте США № 6194551, Ии8од1е е! а1.
В другом примере, один или несколько аминокислотных остатков в положениях аминокислот 231 и
- 26 017086
239 модифицируют в целях изменения способности антитела к фиксации комплемента. Этот метод подробно описан в публикации заявки РСТ \УО 94/29351, Во'тег е! а1.
В еще одном примере Ре-область модифицируют в целях повышения способности антитела опосредовать антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ЛЭСС) и/или в целях повышения аффинности данного антитела к Реу-рецептору путем модификации одной или нескольких аминокислот в следующих положениях: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 или 439. Этот метод подробно описан в публикации заявки РСТ \УО 00/42072, Ргейа. Кроме того, сайты связывания на человеческих 1дС1 для РеуКк РеуКП, РеуКШ и РеКп были картированы, и были описаны варианты с улучшенной способностью к связыванию (см. 8Ые1<18, К.Ь. е! а1. (2001) 1. Вю1. СНет. 27 6:6591-6604). Было показано, что специфические мутации в положениях 256, 290, 298, 333, 334 и 339 приводят к повышению уровня связывания с РеуКШ. Кроме того, было показано, что нижеследующие комбинации мутаций, а именно, Т256Л/8298Л, 8298Л/Е333А, 8298Л/К224Л и
8298Л/Е333Л/К334А, приводят к повышению уровня связывания с РеуКШ.
В еще одном варианте изобретения рассматриваются изменения уровня гликозилирования антитела. Так, например, может быть получено негликозилированное антитело (то есть антитело, не содержащее гликозильных групп). Уровень гликозилирования может быть, например, изменен в целях повышения аффинности данного антитела к антигену. Такие углеводные модификации могут быть осуществлены, например, путем введения изменений в один или несколько сайтов гликозилирования в последовательности антитела. Так, например, могут быть введены одна или несколько аминокислотных замен, приводящих к элиминации одного или нескольких сайтов гликозилирования каркасного участка вариабельной области и, тем самым, к удалению гликозильных групп в данном сайте. Такое агликозилирование может приводить к повышению аффинности антитела по отношению к антигену. Этот метод был подробно описан в патентах США №№ 5714350 и 6350861, Со е! а1.
Дополнительно или альтернативно может быть получено антитело, имеющее измененный тип гликозилирования, такое как гипофукозилированное антитело, имеющее пониженное количество фукозильных остатков, или антитело, имеющее большое число групп С1е№е, расщепляющихся между двумя остатками. Было продемонстрировано, что такое изменение характера гликозилирования будет приводить к повышению ЛЭСС-активности антитела. Указанные углеводные модификации могут быть осуществлены, например, путем экспрессии антитела в клетке-хозяине с измененным характером гликозилирования. Клетки с измененным характером гликозилирования описаны в литературе и могут быть использованы в качестве клеток-хозяев, в которых экспрессируются рекомбинантные антитела согласно изобретению и, тем самым, продуцируются антитела с измененным характером гликозилирования. Так, например, в клеточных линиях М§704, М§705 и М§709 отсутствует ген фукозилтрансферазы, РИТ8 (альфа-(1,6)фукозилтрансферазы), а поэтому антитела, экспрессируемые в клеточных линиях М§704, М§705 и М§709 не содержат фукозу в своих углеводах. РИТ8-/--клеточные линии М§704, М§705 и М§709 были созданы путем направленной дизрупции гена РИТ8 в клетках СНО/ЭС44 с использованием двух векторов замещения (см. публикацию патента США № 20040110704, Уатапе е! а1. и публикацию Уатапе-Ойпик1 е! а1. (2004) Вю1ееЬпо1. Вюепд. 87:614-22). Другим примером является клеточная линия, описанная в ЕР 1176195, Напа1 е! а1., а именно, клеточная линия с функционально инактивированным геном РИТ8, который кодирует фукозилтрансферазу, а поэтому антитела, экспрессируемые в такой клеточной линии обнаруживают гипофукозилирование в результате снижения уровня фермента с альфа-1,6-связью или его элиминации. В работе Напа1 и др. также описаны клеточные линии, которые обладают низкой ферментативной активностью в отношении присоединения фукозы к Ν-ацетилглюкозамину, связывающемуся с Ре-областью антитела, или не обладают такой ферментативной активностью, например, клеточная линия крысиной миеломы УВ2/0 (АТСС СКЬ 1662). В публикации заявки РСТ XVО 03/035835, Ргейа, описан вариант клеточной линии СНО, а именно, клетки Ьее 13, которые обладают пониженной способностью присоединять фукозу к А§п(297)-связанным углеводам, что также приводит к гипофукозилированию антител, экспрессирующихся в данной клетке-хозяине (см. также 8Ые1'5, К.Ь. е! а1. (2002) 1. Вю1. СНет. 277:26733-26740). В публикации заявки РСТ VО 99/54342, Итапа е! а1. описаны клеточные линии, сконструированные в целях экспрессии гликопротеин-модифицирующих гликозилтрансфераз (например, бета(1,4)-№ацетилглюкозаминил-трансферазы III (СпТШ)), в результате чего антитела, экспрессируемые в сконструированных клеточных линиях, будут иметь большое число групп С1е№е, расщепляющихся между двумя остатками, что будет приводить к повышению ЛЭСС-активности этих антител (см. также Итапа е! а1. (1999) ΝηΙ. Вю1ееН. 17:176-180). Альтернативно, фукозные остатки антитела могут быть отщеплены под действием фермента фукозидазы. Так, например, альфа-Ь-фукозидаза удаляет фукозильные остатки из антител (ТагепИпо, А.Ь. е! а1. (1975) ВюеНет. 14:5516-23).
Другой модификацией описанных здесь антител, рассматриваемой в настоящем изобретении, является ПЭГилирование. Антитело может быть ПЭГилировано, например, в целях увеличения биологического времени полужизни антитела (например, в сыворотке). Для ПЭГилирования антитела указанное
- 27 017086 антитело или его фрагмент обычно подвергают реакции с полиэтиленгликолем (ПЭГ), таким как реакционноспособное сложноэфирное или альдегидное производное ПЭГ, в условиях, при которых одна или несколько групп ПЭГ присоединяются к антителу или к его фрагменту. Предпочтительно, ПЭГилирование осуществляют посредством реакции ацилирования или реакции алкилирования с реакционноспособной молекулой ПЭГ (или с аналогичным реакционноспособным водорастворимым полимером). Используемый здесь термин полиэтиленгликоль охватывает любые формы ПЭГ, которые были использованы для дериватизации других белков, такие как моно-(С1-С10)-алкокси- или арилоксиполиэтиленгликоль или полиэтиленгликоль-малеимид. В некоторых вариантах изобретения, ПЭГилируемым антителом является агликозилированное антитело. Методы ПЭГилирования белков известны специалистам и могут быть применены к антителам согласно изобретению. См., например, ЕР0154316, МкЫтига е! а1. и ЕР 0401384, 1§Ыка^а е! а1.
Методы конструирования антител
Как обсуждалось выше, анти-О8Е-антитела, имеющие описанные здесь последовательности νΗ и νκ, могут быть использованы для создания новых анти-О8Е-антител путем модификации последовательностей νΗ и/или νκ или присоединенной(ых) к ним константной(ых) области(ей). Таким образом, в другом аспекте изобретения, структурные особенности анти-О8Е-антитела согласно изобретению, например, 1011, 2А7, 2Р9, 12Е1 или 13Ό12, используются для создания структурно родственных антиО8Е-антител, которые сохраняют по меньшей мере одно функциональное свойство антител согласно изобретению, такое как связывание с человеческим О8Е. Так, например, одна или несколько областей СЭЯ антител 1011, 2А7, 2Р9, 12Е1 или 13Ό12 или их мутантов могут быть объединены рекомбинантными методами с известными каркасными областями и/или с другими СЭЯ с получением дополнительных рекомбинантно сконструированных анти-О8Е-антител согласно изобретению, обсуждаемых выше. Модификациями других типов являются модификации, описанные в предыдущем разделе. Исходным материалом для такого метода конструирования являются одна или несколько из описанных здесь последовательностей νΗ и/или νκ или одна или несколько их СЭЯ-областей. Для создания сконструированного антитела, фактически, необязательно получать (то есть экспрессировать в виде белка) антитело, имеющее одну или несколько рассматриваемых здесь последовательностей νΗ и/или νκ или одну или несколько их СЭЯ-областей. Точнее говоря, информация, содержащаяся в указанной(ых) последовательности^), используется в качестве исходного материала для создания последовательности(ей) второй генерации, происходящей(их) от исходной(ых) последовательности(ей), с последующим получением последовательности(ей) второй генерации и их экспрессии в виде белка.
В соответствии с этим, в другом своем варианте настоящее изобретение относится к способу получения анти-О8Е-антитела включающему в себя:
(a) создание антитела, имеющего: (ί) последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела, включающую в себя последовательность СЭЯ1, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ NО: 11, 12, 13, 14 и 15; последовательность СЭЯ2, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ NО: 16, 17, 18, 19 и 20; и/или последовательность СЭЯ3, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ NО: 21, 22, 23, 24 и 25; и/или (и) последовательность вариабельной области легкой цепи антитела, включающую в себя последовательность СЭЯ1, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ NО: 26, 27, 28, 29 и 30; последовательность СЭЯ2, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ NО: 31, 32, 33, 34 и 35; и/или последовательность СЭЯ3, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ NО: 36, 37, 38, 39 и 40;
(b) модификацию по меньшей мере одного аминокислотного остатка в последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела, и/или в последовательности вариабельной области легкой цепи антитела, в целях создания по меньшей мере одной модифицированной последовательности антитела; и (c) экспрессию указанной модифицированной последовательности антитела в виде белка.
Для получения и экспрессии модифицированной последовательности антитела могут быть применены стандартные методы молекулярной биологии.
Обычно, антителом, кодируемым модифицированной(ыми) генныой(ыми) последовательностью(ями) антител, является антитело, которое сохраняет одно, несколько или все функциональные свойства описанных здесь анти-О8Е-антител, где такими функциональными свойствами являются, но не ограничиваются ими;
(ί) связывание с человеческим О8Е с К 1х 10-7 М или менее;
(ίί) связывание с О8Е-трансфицированными человеческими клетками СНО.
Функциональные свойства модифицированных антител могут быть оценены с помощью стандартных анализов, известных специалистам и/или описанных в настоящей заявке, таких как анализы, описанные в примерах (например, анализы с применением проточной цитометрии, анализы на связывание).
В некоторых вариантах методов конструирования антител согласно изобретению, в полноразмерную последовательность, кодирующую анти-О8Е-антитело или в ее часть, могут быть введены неспецифические или специфические мутации, и полученные модифицированные анти-О8Е-антитела могут быть скринированы на активность связывания и/или другие описанные здесь функциональные свойства. Методы введения мутаций описаны в литературе. Так, например, в публикации заявки РСТ \УО 02/092780, 8йот1, описаны методы создания и скрининга мутированных антител с применением сайт-насыщенного
- 28 017086 мутагенеза, синтетической сборки путем лигирования или их комбинаций. Альтернативно, в публикации РСТ \νϋ 03/074679, Ьахаг е! а1., описаны компьютеризированные методы скрининга для оптимизации физико-химических свойств антител.
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела согласно изобретению
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим антитела согласно изобретению. Такие нуклеиновые кислоты могут присутствовать в целых клетках, в клеточных лизатах или в частично очищенной или, по существу, в чистой форме. Нуклеиновая кислота является выделенной или по существу, чистой, если она очищена от других клеточных компонентов или других примесей, например, от других клеточных нуклеиновых кислот или белков, стандартными методами, включая обработку щелочью/ДСН, центрифугирование в градиенте плотности СзС1. колоночную хроматографию, электрофорез на агарозном геле и другие методы, хорошо известные специалистам. См. Р. Ли8иЬе1, е! а1., еб. (1987) Сиггеи! РгоЮсо18 ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Огееие РиЫщЫид аиб νίίον 1и1ег8С1еисе, №\ν Уотк. Нуклеиновая кислота согласно изобретению, может представлять собой, например, ДНК или РНК, и может содержать, а может и не содержать, интронные последовательности. В предпочтительном варианте изобретения нуклеиновой кислотой является молекула кДНК.
Нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут быть получены стандартными методами молекулярной биологии. Для антител, экспрессируемых гибридомами (например, гибридомами, полученными от трансгенных мышей, несущих гены человеческого иммуноглобулина и подробно описанных ниже), кДНК, кодирующие легкую и тяжелую цепи антитела, продуцируемого гибридомами, могут быть получены стандартными методами ПЦР-амплификации или клонирования кДНК. Для антител, полученных из библиотеки генов иммуноглобулина (например, с применением методов фагового представления), нуклеиновая кислота, кодирующая указанное антитело, может быть выделена из этой библиотеки.
Предпочтительными молекулами нуклеиновой кислоты согласно изобретению являются молекулы, кодирующие последовательности Ун и Уъ моноклональных антител 1011, 2А7, 2Р9, 12Е1 или 13Ό12. Последовательности ДНК, кодирующие последовательности Ун антител 1011, 2А7, 2Р9, 12Е1 и 13Ό12, представлены в 8Е0 ΙΌ N0: 41, 42, 43, 44 и 45, соответственно. Последовательности ДНК, кодирующие последовательности Уъ антител 1011, 2А7, 2Р9, 12Е1 и 13Ό12, представлены в 8Е0 ΙΌ N0: 46, 47, 48, 49 и 50, соответственно.
После получения фрагментов ДНК, кодирующих сегменты Ун и Уъ, эти фрагменты ДНК могут быть затем модифицированы стандартными методами рекомбинантных ДНК, например, для конверсии генов вариабельной области в гены, кодирующие цепь полноразмерного антитела, в гены РаЬ-фрагмента или в ген зсРу. При этих манипуляциях Уь- или Ун-кодирующий ДНК-фрагмент функционально присоединяют к другому ДНК-фрагменту, кодирующему другой белок, такой как константная область антитела или гибкий линкер. Термин функционально присоединенный, используемый в данном контексте, означает, что два ДНК-фрагмента присоединены друг к другу так, что аминокислотные последовательности кодируются этими двумя ДНК-фрагментами с сохранением рамки считывания.
Выделенная ДНК, кодирующая область Ун, может быть трансформирована в ген, кодирующий полноразмерную тяжелую цепь, путем функционального присоединения Ун-кодирующей ДНК к другой молекуле ДНК, кодирующей константные области тяжелой цепи (Сн1, Сн2 и Сн3). Последовательности генов константной области человеческой тяжелой цепи известны специалистам (см., например, КаЬаЕ Е. А., е1 а1. (1991) Зедиеисез оГ Рто!еш8 оГ 1ттипо1ощса1 1и!еге8!, ΕίΠΙι Ебйюи, И.8. ОераПтегИ оГИеа1111 аиб нитаи Зегуюез, N14 РиЬйсайои № 91-3242), а ДНК-фрагменты, включающие в себя эти области, могут быть получены стандартным методом ПЦР-амплификации. Константной областью тяжелой цепи могут быть константные области 1д01, 1д02, 1д03, 1д04, 1дА, 1дЕ, 1дМ или Ι§Ό, а наиболее предпочтительно, константная область 1д01 или 1д04. Для гена ЕаЬ-фрагмента тяжелой цепи, Ун-кодирующая ДНК может быть функционально присоединена к другой молекуле ДНК, кодирующей только константную область Сн1 тяжелой цепи.
Выделенная ДНК, кодирующая область Уъ, может быть превращена в ген полноразмерной легкой цепи (а также в ген легкой цепи РаЬ) путем функционального присоединения Уъ-кодирующей ДНК к другой молекуле ДНК, кодирующей константную область легкой цепи, Съ. Последовательности генов человеческой константной области легкой цепи известны специалистам (см., например, РаЬаО Е. А., е! а1. (1991) Зедиеисез оГ Рто!еш8 оГ 1ттиио1од1са1 1и!еге8!, ΕίΓιΒ Ебйюи, И.8. Перайтеи! оГ неаИй аиб нитаи 8егу1се8, ΝΙ4 РиЬНсайои № 91-3242), а ДНК-фрагменты, включающие в себя эти области, могут быть получены стандартным методом ПЦР-амплификации. Константной областью легкой цепи может быть константная область каппа или лямбда, а наиболее предпочтительно константная область каппа.
Для создания гена зсРу, Ун- и Уь-кодирующие ДНК-фрагменты функционально присоединяют к другому фрагменту, кодирующему гибкий линкер, например, кодирующему аминокислотную последовательность (01у4-8ет)3, так, чтобы последовательности Ун и Уъ могли экспрессироваться в виде единого одноцепочечного белка, причем указанные области Уъ и Ун присоединены друг к другу посредством гибкого линкера (см., например, В1гб е! а1. (1988), 8с1еисе 242:423-426; нив!ои е! а1. (1988), Ргос. №И. Асаб. 8с1. И8А 85:5879-5883; МсСаГГейу е! а1., (1990), №!иге 348:552-554).
- 29 017086
Продуцирование моноклональных антител согласно изобретению
Моноклональные антитела (тАЬ) согласно изобретению могут быть продуцированы различными методами, включая стандартную технологию получения моноклональных антител, например, стандартный метод гибридизации соматических клеток, описанный КоЫег и М11к!ет (1975), №!иге 256:495. Хотя процедуры гибридизации соматических клеток являются предпочтительными, однако в принципе, могут быть применены и другие методы продуцирования моноклональных антител, например, вирусная или онкогенная трансформация В-лимфоцитов.
Предпочтительным животным, которое может быть использован для получения гибридом, является мышь. Продуцирование гибридомы у мыши является хорошо разработанной процедурой. Протоколы иммунизации и методы выделения иммунизованных спленоцитов для слияния известны специалистам. Партнеры по слиянию клеток (например, мышиных миеломных клеток) и процедуры такого слияния также известны специалистам.
Химерные или гуманизованные антитела согласно изобретению могут быть получены на основе последовательности мышиного моноклонального антитела, полученного как описано выше. ДНК, кодирующая тяжелую и легкую цепи иммуноглобулина, может быть выделена из представляющей интерес не-человеческой гибридомы и сконструирована стандартными методами молекулярной биологии так, чтобы она содержала человеческие последовательности иммуноглобулина. Так, например, для создания химерного антитела мышиные вариабельные области могут быть присоединены к человеческим константным областям методами, известными специалистам (см., например, патент США № 4816567, СаЬШу е! а1. ). Для создания гуманизованного антитела мышиные области СЭР могут быть встроены в человеческую каркасную область методами, известными специалистам (см., например, патент США № 5225539, Мт!ег и патенты США №№ 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370, Сиееп е! а1.).
В предпочтительном варианте изобретения антителами согласно изобретению являются человеческие моноклональные антитела. Такие человеческие моноклональные антитела против 08Е могут быть генерированы у трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих части не мышиной, а человеческой иммунной системы. Такими трансгенными и трансхромосомными мышами являются мыши, называемые здесь мышами НиМАЬ® и мышами КМ®, соответственно, а в целом, называемые мышами с человеческим Ι§.
Мышь НиМАЬ® (Мебагех, Ιπο.) имеет минилокус гена человеческого иммуноглобулина, кодирующий не-реаранжированные последовательности человеческой тяжелой цепи (μ и γ) и легкой цепи к иммуноглобулина, а также специфические мутации, инактивирующие эндогенные локусы цепи μ и к (см., например, ЬоиЬегд, е! а1. (1994) №!иге 368(6474): 856-859). В соответствии с этим, у данных мышей наблюдался пониженный уровень экспрессии мышиных ^М или к, и в ответ на иммунизацию введенные трансгены человеческой тяжелой и легкой цепей подвергались переключению класса и соматической мутации с продуцированием высокоаффинного человеческого моноклонального антитела Ιμ6κ (ЬоиЬегд, N. е! а1. (1994), см. выше; ЬоиЬегд, N. (1994) НапбЬоок о£ Ехрептеп!а1 РЕагтасо1о§у 113:49-101; ЬоиЬегд, N. апб Никхаг, Ό. (1995) кЛегп. Кеу. Iттиηо1. 13: 65-93 и Нагбтд, Е. аиб ЬоиЬегд, N. (1995) Апп. КУ. Асаб. 8с1. 764:536-546). Получение и использование мышей НиМаЬ и геномные модификации, имеющиеся у таких мышей, подробно описаны в публикациях Тау1ог, Ь. е! а1. (1992) №с1ею Ас1бк Кекеагсй 20:6287-6295; СЕеп, 1. е! а1. (1993) йИегпаиощб Бптипо^ду 5: 647-656; ТиаШоп е! а1. (1993) Ргос. №Ш Асаб. δα. И8А 90:3720-3724; СЬм е! а1. (1993) №!иге бепеИск 4: 117-123; СЕеп, ί. е! а1. (1993) ЕМВ0 ί. 12: 821-830; ТиаШоп е! а1. (1994) 1. Iттиио1. 152:2912-2920; Тау1ог, Ь. е! а1. (1994) Ттегпайопа! Iттиио1оду 6: 579-591; и Е1ШМ1б, Ό. е! а1. (1996) №!иге Вю1ес1то1оду 14:845-851, содержание которых во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки. См. также патенты США №№ 5545806;5569825;5625126;5633425;5789650;5877397;5661016;5814318;5874299 и 5770429,выданные ЬопЬегд и Кау; патент США № 5545807, 8игаш е! а1.; публикацию заявок РСТ №№ XV0 92/03918, XV0 93/12227, М0 94/25585, М0 97/13852, М0 98/24884 и М0 99/45962, поданных БопЬегд и Кау; и публикацию заявки РСТ № М0 01/14424, Когтап е! а1.
В другом варианте изобретения человеческие антитела согласно изобретению могут быть продуцированы у мышей, имеющих последовательности человеческого иммуноглобулина в трансгенах и в трансхромосомах, например, у таких мышей, которые имеют трансген человеческой тяжелой цепи и трансхромосому человеческой легкой цепи. Такие мыши, называемые здесь мышами КМ®, подробно описаны в публикации заявки РСТ М0 02/43478, Шиба е! а1.
Кроме того, альтернативные системы трансгенных животных, экспрессирующие гены человеческого иммуноглобулина, известны специалистам и могут быть использованы для продуцирования анти08Е-антител согласно изобретению. Так, например, может быть использована альтернативная трансгенная система, называемая Хепотоике (АЬдешх, Шс.); и такие мыши описаны, например, в патентах США №№ 5939598; 6075181; 6114598; 6150584 и 6162963, Кисйег1ара!1 е! а1.
Более того, альтернативные системы трансхромосомных животных, экспрессирующие гены человеческого иммуноглобулина, известны специалистам и могут быть использованы для продуцирования анти-08Е-антител согласно изобретению. Так, например, могут быть использованы мыши, несущие транс
- 30 017086 хромосому человеческой тяжелой цепи и трансхромосому человеческой легкой цепи, и называемые мышами ТС; и такие мыши описаны в публикации Топн/ика е! а1. (2000) Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 97:722-727. Кроме того, для продуцирования анти-08Е-антитела согласно изобретению могут быть использованы коровы, несущие трансхромосомы человеческой тяжелой и легкой цепей, как было описано в литературе (КигоЕуа е1 а1. (2002) №Ш1ге Вю1есРпо1оду 20:889-894).
Человеческие моноклональные антитела согласно изобретению могут быть также получены с применением методов фагового представления для скрининга библиотек генов человеческого иммуноглобулина. Такие методы фагового представления для выделения человеческих антител известны специалистам. См., например, патенты США №№ 5223409; 5403484 и 5571698, Ьабпег е! а1.; патенты США №№ 5427908 и 5580717, Эо^ег е! а1.; патенты США №№ 5969108 и 6172197, МсСаГГейу е! а1.; и патенты США №№ 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 и 6593081, ΟήίίΐΐΠκ е! а1.
Человеческие моноклональные антитела согласно изобретению могут быть также получены с использованием мышей 8СШ, которым были введены человеческие иммунные клетки, реконструированные так, чтобы у этих мышей, после иммунизации, вырабатывалось человеческое антитело. Такие мыши описаны, например, в патентах США №№ 5476996 и 5698767, ^1коп е! а1.
Иммунизация мышей, вырабатывающих человеческий 1д
Если для продуцирования человеческих антител согласно изобретению используются мыши, вырабатывающие человеческий Ι§, то такие мыши могут быть иммунизованы 08Е-экспрессирующей клеточной линией, очищенным антигеном 08Е или препаратом, обогащенным этим антигеном, и/или рекомбинантным 08Е или гибридным белком 08Е, описанными в публикации ЬопЬегд, N. е! а1. (1994) №11иге 368(6474): 856-859; РкРетПб, Ό. е! а1. (1996) №1Ц.1ге Вю1есРпо1оду 14: 845-851; и в публикациях заявок РСТ XV 0 98/24884 и XV0 01/14424. Предпочтительно, чтобы после первой иммунизации, мыши имели возраст 6-16 недель. Так, например, для внутрибрюшинной иммунизации мышей, вырабатывающих человеческий Ι§, может быть использован очищенный или рекомбинантный препарат (5-50 мкг) антигена 08Е.
Подробное описание процедур получения полностью человеческих моноклональных антител против 08Е приводится ниже в примере 1. Совокупные результаты экспериментов с различными антигенами показали, что у трансгенных мышей при проведении первичной внутрибрюшинной иммунизации (ί.ρ.) антигеном в полном адъюванте Фрейнда, а затем ί.ρ. иммунизации раз в две недели (всего 6 иммунизации) антигеном в неполном адъюванте Фрейнда, наблюдалось вырабатывание иммунного ответа. Однако было также обнаружено, что кроме адъюванта Фрейнда эффективными являются и другие адъюванты. Кроме того, было обнаружено, что в отсутствии адъюванта целые клетки являются в высокой степени иммуногенными. Мониторинг иммунного ответа может быть проведен во время проведения всей процедуры иммунизации пробами плазмы, полученными из ретроорбитальной области. Эта плазма может быть скринирована с помощью ЕЫ8А, и мыши, имеющие достаточно высокие титры человеческого иммуноглобулина против 08Е, могут быть затем использованы для слияния клеток (как описано в примере 1). Мышам может быть повторно введен антиген путем внутривенной инъекции за 3 дня до умерщвления и взятия селезенки. При этом, предполагается, что для каждой иммунизации могут потребоваться 2-3 процедуры слияния клеток. Обычно 6-24 мышей иммунизируют каждым антигеном. Для этого, обычно используют штаммы НСо7 и НСо12. Генерирование мышиных штаммов НСо7 и НСо12 описано в патенте США № 5770429 и в примере 2 публикации заявки РСТ ν0 01/09187, соответственно. Кроме того, оба трансгена НСо7 и НСо12 могут быть переданы вместе одной мыши, имеющей два различных трансгена человеческой тяжелой цепи (НСо7/НСо12). Альтернативно или дополнительно, могут быть использованы мыши штамма КМ®, описанные в публикации заявки РСТ ν0 02/43478.
Генерирование гибридом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела согласно изобретению
Для генерирования гибридом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела согласно изобретению, спленоциты и/или клетки лимфоузлов, взятые от иммунизованных мышей, могут быть выделены и подвергнуты слиянию с соответствующей иммортализованной клеточной линией, такой как клеточная линия мышиной миеломы. Полученные гибридомы могут быть скринированы на продуцирование антигенспецифических антител. Так, например, моноклеточные суспензии лимфоцитов селезенки, взятых от иммунизованных мышей, могут быть подвергнуты слиянию с 1/3 от числа несекретирующих клеток мышиной миеломы 8р2/0 (АТСС, СКВ 1581), связанных с 50% ПЭГ. Альтернативно, моноклеточные суспензии лимфоцитов селезенки, взятых у иммунизованных мышей, могут быть подвергнуты слиянию с равным числом клеток мышиной миеломы 8р2/0 с применением метода электрослияния под действием электрического поля с использованием электропоратора для крупномасштабного слияния клеток Су!о Рике 1агде сРатЬег се11 Гтюп е1ес1горогаЮг (Су!о Рике Заепсек, Шс., 01еп Вигше, МО). Клетки высевали в концентрация примерно 1х 105 клеток/лунку в плоскодонный микротитрационный планшет, а затем инкубировали в течение двух недель в селективной среде, содержащей 10% фетальную бычью сыворотку (Нус1опе, Ьодап, ИТ), 10% Р388^I-кондиционированную среду (АТСС, СВЬ ТШ-63), 3-5% 0пдеп (ШЕН) в ЭМЕМ (Меб1а!есР, СВЬ 10013, с высоким содержанием глюкозы, Ь-глутамина и пирувата
- 31 017086 натрия), а также 5 мМ ΗЕРЕ8, 0,055 мМ 2-, клетки могут быть культивированы в среде, где среда ΗΑТ была заменена средой ИТ. Затем отдельные лунки могут быть скринированы с помощью ЕЫ8А или БАС8 на человеческие моноклональные антитела 1дМ и 1дО. Позитивные клоны могут быть затем скринированы на О8Е-позитивные антитела против рекомбинантного белка О8Е с помощью ЕЫ8А или против О8Е-экспрессирующих клеток, например, О8Е-трансфецированных клеток СΗО, с помощью БАС8. После интенсивного роста гибридом, обычно через 10-14 дней, проводят мониторинг среды. Антителосекретирующие гибридомы могут быть засеяны повторно и снова скринированы, и при получении положительного результата на человеческий 1дО моноклональные антитела могут быть субклонированы по меньшей мере два раза, путем лимитирующего разведения. Затем стабильные субклоны могут быть культивированы ίη νίίΐΌ для генерирования небольших количеств антитела в среде для культивирования тканей в целях их характеризации.
Для очистки человеческих моноклональных антител отобранные гибридомы могут быть культивированы в двухлитровых центрифужных колбах, предназначенных для очистки моноклональных антител. Супернатанты могут быть отфильтрованы и концентрированы, а затем подвергнуты аффинной хроматографии на белке А-сефарозе (РБагтааа, Р1кса1а^ау, N1). Для гарантии нужной чистоты, элюированный 1дС может быть оценен с помощью гель-электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Буферный раствор может быть заменен на РВ8, и концентрация может быть определена по ОЭ280 с использованием коэффициента экстинкции 1,43. Моноклональные антитела могут быть разделены на аликвоты и положены на хранение при -80°С.
Генерирование трансфектом, продуцирующих моноклональные антитела согласно изобретению
Антитела согласно изобретению могут быть также продуцированы в трансфектоме клеток-хозяев с применением комбинированных методов рекомбинантных ДНК и трансфекции генов, хорошо известных специалистам (например, Мотком, 8. (1985) 8с1еисе 229: 1202).
Так, например, для экспрессии антител или их фрагментов ДНК, кодирующие неполные или полноразмерные легкие и тяжелые цепи, могут быть получены стандартными методами молекулярной биологии (например, посредством ПЦР-амплификации или клонирования кДНК с использованием гибридомы, экспрессирующей представляющее интерес антитело), и эти ДНК могут быть встроены в экспрессирующие векторы так, чтобы такие гены были функционально присоединены к последовательностям регуляции транскрипции и трансляции. В этом контексте, термин функционально присоединенный означает, что ген антитела лигируют в вектор так, чтобы указанные последовательности регуляции транскрипции и трансляции в данном векторе выполняли присущую им функцию регуляции транскрипции и трансляции гена антитела. Экспрессирующий вектор и последовательности регуляции экспрессии выбирают так, чтобы они были совместимы с клеткой-хозяином, используемой для такой экспрессии. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть встроены в отдельные векторы, или, чаще всего, оба гена встраивают в один и тот же экспрессирующий вектор. Гены антитела встраивают в экспрессирующий вектор стандартными методами (например, путем лигирования комплементарных рестрикционных сайтов в генные фрагменты антитела и в вектор, или путем лигирования по тупым концам, если такие рестрикционные сайты отсутствуют). Описанные здесь вариабельные области легкой и тяжелой цепей антител могут быть использованы для создания полноразмерных генов антител, кодирующих антитело любого изотипа, путем их встраивания в экспрессирующие векторы, уже кодирующие константные области тяжелой и легкой цепей антитела нужного изотипа так, чтобы сегмент νΗ был функционально присоединен к сегменту(ам) Сн в данном векторе, а сегмент Ук был функционально присоединен к сегменту Сь в данном векторе. Дополнительно или альтернативно, рекомбинантный экспрессирующий вектор может кодировать сигнальный пептид, облегчающий секрецию цепи антитела из клетки-хозяина. Указанный ген цепи антитела может быть клонирован в вектор так, чтобы сигнальный пептид был присоединен к амино-концу гена цепи антитела с сохранением рамки считывания. Таким сигнальным пептидом может быть сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичный сигнальный пептид (то есть сигнальный пептид, происходящий от белка, не являющегося иммуноглобулином).
Рекомбинантные экспрессирующие векторы согласно изобретению, помимо генов цепи антител, несут регуляторные последовательности, которые регулируют экспрессию генов цепи антител в клеткехозяине. Термин регуляторная последовательность включает в себя промоторы, энхансеры и другие элементы регуляции экспрессии (например, сигналы полиаденилирования), регулирующие транскрипцию или трансляцию генов цепей антител. Такие регуляторные последовательности описаны, например, в публикации Ооеббе1 (Сене Ехргеккюг1 Тес1то1оду. МеШобк ίη Еηζутο1οду 185, Асабетю Ргекк, 8аη П1едо, СА (1990)). Следует отметить, что конструирование экспрессирующего вектора, включая секрецию регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор трансформируемой клетки-хозяина, уровень экспрессии нужного белка и т. п. Предпочтительными регуляторными последовательностями, регулирующими экспрессию в клетках-хозяевах млекопитающих, являются вирусные элементы, которые обеспечивают высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, происходящие от цитомегаловируса (СМУ), обезьяньего вируса 40 (8ν40), аденовируса (например, главный поздний промотор аденовируса (АбМЬР) и полиомавируса. Альтернативно, могут быть использованы не-вирусные регуляторные последовательности, такие как
- 32 017086 промотор убихитина или промотор β-глобина. Кроме того, могут быть использованы регуляторные элементы, состоящие из последовательностей, происходящих от различных источников, такие как промоторная система 8Яа, содержащая последовательности раннего промотора 8У40 и длинного концевого повтора вируса Т-клеточного человеческого лейкоза типа 1 (ТакеЬе, Υ. е1 а1. (1988) Мо1. Се11. ΒίοΙ. 8:466472).
Помимо генов цепей антител и регуляторных последовательностей рекомбинантные экспрессирующие векторы согласно изобретению могут содержать дополнительные последовательности, такие как последовательности, регулирующие репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, ориджины репликации) и селективные маркерные гены. Селективный маркерный ген облегчает отбор клеток-хозяев, в которые был введен данный вектор (см., например, патенты США №№ 4399216, 4634665 и 517 9017, выданные Ахе1 е1 а1. ). Так, например, обычно, селективный маркерный ген сообщает клеткам-хозяевам, в которые был введен данный вектор, резистентность к лекарственным средствам, таким как 0418, гигромицин или метотрексат. Предпочтительными селективными маркерными генами являются ген дигидрофолат-редуктазы (ЭНРН) (вводимый в άΙιίΥ-клетки-хозяева при отборе/амплификации с использованием метотрексата) и ген пео (для отбора на резистентность к 0418).
Для экспрессии легкой и тяжелой цепей экспрессирующий(е) вектор(ы), кодирующий(е) тяжелую и легкую цепи, переносят в клетку-хозяина стандартными методами. Термин трансфекция в его различных формах включает в себя методы широкого ряда, обычно используемые для введения экзогенной ДНК в прокариотические или эукариотические клетки-хозяева, например, электропорацию, преципитацию фосфатом кальция, трансфекцию, опосредуемую ОЕАЕ-декстраном, и т.п. Хотя, теоретически, антитела согласно изобретению могут быть экспрессированы в любых прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, однако предпочтительными являются эукариотические клетки-хозяева, а наиболее предпочтительными являются клетки млекопитающих, поскольку такие эукариотические клетки, а в частности, клетки млекопитающих являются более подходящими для правильной сборки и секреции иммунологически активного антитела, чем прокариотические клетки. Сообщалось, что экспрессиия генов антитела в прокариотических клетках оказалась неэффективной для продуцирования высоких уровней активного антитела (Вокк, М. А. & ^οοά, С. Я. (1985) Иптипо^ду Тοάау 6:12-13).
Предпочтительными клетками-хозяевами млекопитающих, подходящих для экспрессии рекомбинантных антител согласно изобретению, являются клетки яичника китайского хомячка (клетки СН0) (включая άΙιίΓ-клетки СН0, описанные в публикации Иг1аиЬ & Сйаып, (1980) Ргос. ИаИ. Асаά. 8а. И8А 77:4216-4220, и используемые с ОНРЯ-селективным маркером, например, как описано в публикации Я. 1. КаиГтап и Р. А. 8йагр (1982) Мо1. Вю1. 159:601-621), клетки миеломы N80, клетки С08 и клетки 8Р2. В частности, для использования с миеломными клетками N80, другой предпочтительной экспрессионной системой является экспрессионная система гена 08, описанная в XV0 87/04462, XV0 89/01036 и ЕР 338841. Если рекомбинантные экспрессирующие векторы, кодирующие гены антитела, вводят в клеткихозяева млекопитающих, то антитела продуцируют путем культивирования указанных клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для осуществления экспрессии антитела в указанных клеткаххозяевах, а более предпочтительно, для секреции указанного антитела в культуральную среду, в которой были культивированы эти клетки-хозяева. Антитела могут быть выделены из культуральной среды стандартными методами очистки белков.
Характеризация связывания антител с антигеном
Антитела согласно изобретению могут быть протестированы на связывание с 08Е, например, с помощью проточной цитометрии. Вкратце, свежие 08Е-экспрессирующие клетки собирают из колб для культивирования ткани и получают моноклеточную суспензию. Суспензии 08Е-экспрессирующих клеток окрашивают первым антителом либо непосредственно, либо после фиксации 1% параформальдегидом в РВ8. Приблизительно один миллион клеток ресуспендируют в РВ8, содержащем 0,5% В8А и 50200 мкг/мл первого антитела, а затем инкубируют на льду в течение 30 мин. Клетки два раза промывают РВ8, содержащим 0,1% В8А, 0,01% NаNз, ресуспендируют в 100 мкл разведенного 1:100 ФИТЦконъюгированного козьего антитела против человеческих Ι§0 (1аск§оп ^типоЯекеагсй, ^е51 0гоуе, РА) и инкубируют на льду в течение еще 30 мин. Затем клетки снова два раза промывают, ресуспендируют в 0,5 мл промывочного буфера и анализируют на флуоресцентное окрашивание на цитометре РАС8Са11Ьиг (ВесФп-Пюкшкоп, 8ап .Токе, СА).
Альтернативно, антитела согласно изобретению могут быть протестированы на связывание с 08Е с помощью стандартного ЕЫ8А. Вкратце, микротитрационные планшеты покрывают очищенным 08Е в концентрации 0,25 мкг/мл в РВ8, а затем блокируют 5% альбумином бычьей сыворотки в РВ8. В каждую лунку добавляют разведения антитела (например, разведения плазмы, взятой от 08Е-иммунизованных мышей) и инкубируют в течение 1-2 ч при 37°С. Планшеты промывают РВ8/твином, а затем инкубируют со вторым антителом (например, для человеческих антител, козьим поликлональным Рсспецифическим антителом против человеческого Ι§0), конъюгированным со щелочной фосфатазой, в течение 1 ч при 37°С. После промывки, в планшеты добавляют субстрат рИРР (1 мг/мл) для проявления окраски и анализируют при 0Ό405-650. Обычно для слияния клеток предпочтительно использовать мышь,
- 33 017086 у которой вырабатывались наибольшие титры антител.
Для скрининга гибридом, которые обнаруживали положительную реактивность с иммуногеном 08Е, можно также проводить анализ ЕЫ8А или ЕЛС8, описанные выше. Гибридомы, которые связываются с 08Е с высокой авидностью, субклонируют, а затем охарактеризовывают. Один клон от каждой гибридомы, который сохраняет реактивность родительских клеток (на что указывает ЕЫ8Л или ЕЛС8), может быть выбран для создания клеточного банка в 5-10 сосудах, которые помещают на хранение при 140°С и используют для очистки антител.
Для очистки анти-08Е-антител отобранные гибридомы могут быть культивированы в двухлитровых центрифужных колбах, предназначенных для очистки моноклональных антител.
Супернатанты могут быть подвергнуты фильтрации и концентрированию, а затем аффинной хроматографии на белке А-сефарозе (Рйатташа, Р1кса1а^ау, N1). Для гарантии нужной чистоты, элюированный Ι§0 может быть оценен с помощью гель-электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Буферный раствор может быть заменен на РВ8, и концентрация может быть определена по 0Э280 с использованием коэффициэнта экстинкции 1,43. Моноклональные антитела могут быть разделены на аликвоты и помещены на хранение при -80°С.
Для того, чтобы определить, связываются ли выбранные моноклональные анти-08Е-антитела с уникальными эпитопами, каждое антитело может быть биотинилировано с использованием коммерчески доступных реагентов (Р1егсе, Воск Го гб, ГЬ). Исследования по конкурентному связыванию с использованием немеченных моноклональных антител и биотинилированных моноклональных антител могут быть проведены на 08Е-сенсибилизированных ЕЫ8А-планшетах, описанных выше. Связывание биотинилированного тАЬ может быть детектировано с использованием стрептавидина-щелочной фосфатазы в качестве зонда. Альтернативно, исследования по конкурентному связыванию могут быть проведены с использованием радиоактивно меченного антитела, а немеченные конкурирующие антитела могут быть детектированы с помощью анализа по Скэтчарду, как подробно описано ниже в примерах.
Для определения изотипа очищенных антител ЕМЗА-анализы на изотип антитела могут быть проведены с использованием реагентов, специфичных к антителам конкретного изотипа. Так, например, для определения изотипа человеческого моноклонального антитела лунки микротитрационных планшетов покрывают 1 мкг/мл антитела против человеческого иммуноглобулина и оставляют на ночь при 4°С. После блокирования 1%-ным В8А, планшеты подвергают реакции с 1 мкг/мл или менее тестируемых моноклональных антител или очищенных антител контрольного изотипа при комнатной температуре в течение 1-2 ч. Затем лунки могут быть подвергнуты реакции с антителами-зондами, специфичными к человеческому ΙβΟ1 или к человеческому ΙβΜ. и конъюгированными с щелочной фосфатазой. Планшеты проявляют и анализируют, как описано выше.
Человеческие ΙβΟ против 08Е могут быть затем протестированы на реактивность с антигеном 08Е с помощью вестерн-блот-анализа. Вкратце, 08Е может быть получен и подвергнут электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. После электрофореза, выделенные антигены переносят на нитроцеллюлозные мембраны, блокируют 10% фетальной телячьей сывороткой и зондируют тестируемыми моноклональными антителами. Связывание с человеческим Ι§0 может быть детектировано с использованием антитела против человеческого ΙβΟ, конъюгированного с щелочной фосфатазой, и таблеток субстрата ВОР/ЛВТ для проявления окраски (81§та СЕет. Со., 8Г. Ьошк, Мо.).
Физические свойства антител
Анти-08Е-антитела согласно изобретению могут быть также охарактеризованы на различные физические свойства. Различные классы таких антител могут быть идентифицированы и/или определены исходя из их физических свойств с помощью различных анализов.
В некоторых вариантах изобретения, антитела согласно изобретению могут содержать один или несколько сайтов гликозилирования в вариабельной области легкой или тяжелой цепи. Присутствие одного или нескольких сайтов гликозилирования в вариабельной области может приводить к повышению иммуногенности антитела или к изменению рК антитела, обусловленному изменением уровня связывания с антигеном (Маткйа11 еГ а1. (1972) Аппи. Веу. Вюсйет. 41:673-702; Оа1а Е.А. & Моткой 8.Ь. (2004) I. Тттипо1. 172:5489-94; ^аШск еГ а1. (1988) I. Ехр. Меб. 168:1099-109; 8рно В.О. (2002) О1усоЬю1о§у 12:43В56В; РагекЕ еГ а1. (1985) №11иге 316:452-7: М1тига еГ а1. (2000) Мо1. Iттиηо1. 37:697-706). Известно, что гликозилирование происходит в мотивах, содержащих последовательность К-Х-8/Т. Гликозилирование вариабельной области может быть протестировано с помощью анализа 01усоЬ1оГ, где тестируемое антитело расщепляют с получением ЕаЬ-фрагмента, а затем тестируют на гликозилирование с помощью анализа, в котором определяют уровень окисления периодатом и образования шиффовых оснований. Альтернативно, гликозилирование вариабельной области может быть протестировано посредством хроматографии Эюпех с применением рассеяния света (Пюпех-ЬС), где сахариды ЕаЬ расщепляют с получением моносахаридов и анализируют на содержание отдельных сахаридов. В некоторых случаях предпочтительно, чтобы анти-08Е-антитело не содержало сайтов гликозилирования в вариабельной области. Это может быть достигнуто либо путем отбора антител, не содержащих мотива гликозилирования в вариабельной области, либо путем мутации остатков в мотиве гликозилирования с применением стандартных
- 34 017086 методов, хорошо известных специалистам.
В предпочтительном варианте изобретения антитела согласно изобретению не содержат сайтов изомеризации аспарагина. Дезамидирование или эффект продуцирования изоаспарагиновой кислоты могут наблюдаться в последовательностях Ν-0 или Ό-0, соответственно. Дезамидирование или эффект продуцирования изоаспарагиновой кислоты приводит к образованию изоаспарагиновой кислоты, что снижает стабильность антитела в результате создания петлевой структуры, но не в главной цепи, а со стороны боковой цепи карбоксиконца. Образование изоаспарагиновой кислоты может быть определено с помощью количественного анализа изомеров, в котором для обнаружения изоаспарагиновой кислоты используется обращенно-фазовая ВЭЖХ.
Каждое антитело имеет уникальную изоэлектрическую точку (ρΙ), но обычно, антитело имеет ρΙ в интервале рН 6-9,5. ρΙ для антитела Ц01 обычно составляет в пределах рН 7-9,5, а ρΙ для антитела Ιβ04 обычно составляет в пределах рН 6-8. Антитела могут иметь рС выходящую за пределы указанного интервала. Хотя влияние таких значений р( по существу, неизвестно, однако существует мнение, что антитела со значением рС выходящим за пределы нормальных интервалов, могут иметь до некоторой степени развернутую укладку и нестабильность в условиях ίη νίνο. Изоэлекстрическая точка может быть определена путем проведения анализа методом каппилярного изоэлектрического фокусирования, в котором создается градиент рН, а для большей точности может быть использовано лазерное фокусирование (1апίηί е! а1. (2002) Е1ес1горНоге515 23:1605-11; Ма е! а1. (2001) СНгота!одгарН1а 53:875-89; Нип! е! а1. (1998) 1. СНгота!одг А 800:355-67). В некоторых случаях, предпочтительно, чтобы анти-О8Е-антитело, имело значение ρI в нормальном интервале. Это может быть достигнуто либо путем отбора антител с ρI в нормальном интервале, либо посредством мутации заряженных поверхностных остатков с применением стандартных методов, хорошо известных специалистам.
Каждое антитело имеет температуру плавления, которая является показателем его термостабильности (КгЫтатигШу Я. & Мапптд М.С. (2002) Сигг. РНагт. Вю!есНпо1. 3:361-71). Чем выше термостабильность антитела, тем выше его общая стабильность ал νί\Ό. Температура плавления антитела может быть измерена стандартными методами, такими как дифференциальная сканирующая калориметрия (СНеп е! а1. (2003) РНагт. Яе§. 20:1952-60; 0Ыг1апбо е! а1. (1999) Iттиηο1. Ье!!. 68:47-52). ТМ1 означает температуру начального развертывания антитела. ТМ2 означает температуру полного развертывания антитела. Обычно, ТМ1 антитела согласно изобретению предпочтительно превышает 60°С, более предпочтительно превышает 65°С, а еще более предпочтительно превышает 70°С. Альтернативно, термостабильность антитела может быть измерена с использованием кругового дихроизма (Миггау е! а1. (2002) Е СНгота!одг 8сЕ 40:343-9).
В предпочтительном варианте настоящего изобретения, отбирают антитела, разложение которых происходит достаточно медленно. Фрагментация анти-О8Е-антитела может быть измерена методами капиллярного электрофореза (КЭ) и МА^^I-М8, хорошо известными специалистам (А1ехапбег Λ.ί. апб НиёНек Ц.Е. (1995) Апа1. СНет. 67:3626-32).
В другом предпочтительном варианте изобретения отбирают антитела, подвергаемые минимальной агрегации. Агрегация может приводить к запуску нежелательного иммунного ответа и/или к вырабатыванию измененных или неблагоприятных фармакокинетических свойств. Обычно, приемлемыми являются антитела, агрегация которых составляет 25% или менее, предпочтительно 20% или менее, еще более предпочтительно 15% или менее, еще более предпочтительно 10% или менее, а наиболее предпочтительно 5% или менее. Агрегация может быть измерена различными методами, хорошо известными специалистам, включая эксклюзионную колоночную хроматографию (ЭКХ), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и метод рассеяния света для идентификации мономеров, димеров, тримеров или мультимеров.
Иммуноконъюгаты
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к анти-О8Е-антителу или к его фрагменту, конъюгированному с терапевтической молекулой, такой как цитотоксин, лекарственное средство (например, иммунодепрессант) или радиотоксин. Такие конъюгаты называются здесь иммуноконъюгатами.
Иммуноконъюгаты, которые включают в себя один или несколько цитотоксинов, называются иммунотоксинами. Цитотоксин или цитотоксическое средство включает в себя любой агент, который оказывает негативное воздействие на клетку (например, разрушает клетку). Примерами являются таксол, цитохалазин В, грамицидин Ό, этидийбромид, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин Ό, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин и их аналоги или гомологи. Терапевтическими средствами также являются, например, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5фторурацилдекарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин, тиотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (В8Ыи) и ломустин (ССЫи), циклофосфамид, бусульфан, дибромманнит, стрептозотоцин, митомицин С и цис-дихлордиаминплатина (ΙΙ) (ΌΌΡ), то есть цисплатин), антрациклины (напри
- 35 017086 мер, даунорубицин (прежнее название: дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (прежнее название: актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (АМС)) и антимитотические средства (например, винкристин и винбластин).
Другими предпочтительными примерами терапевтических цитотоксинов, которые могут быть конъюгированы с антителом согласно изобретению, являются дуокармицины, калихеамицины, майтанзины и ауристатины и их производные. Так, например, конъюгат калихеамицин-антитело является коммерчески доступным (Му1о1агд™ ; \Ууе111-Луегз1).
Цитотоксины могут быть конъюгированы с антителами согласно изобретению с применением линкерной технологии, известной специалистам. Примерами линкеров, которые могут быть использованы для конъюгирования цитотоксина с антителом, являются, но не ограничиваются ими, линкеры, содержащие гидразоны, тиоэфиры, сложные эфиры, дисульфиды и пептиды. Так, например, может быть выбран линкер, который является чувствительным к расщеплению при низком рН в лизосомном компартменте или чувствительным к расщеплению протеазами, такими как протеазы, преимущественно экспрессируемые в опухолевой ткани, такие как, катепсины (например, катепсины В, С, Ό).
Более подробное обсуждение типов цитотоксинов, линкеров и методов конъюгирования терапевтических средств с антителами, можно также найти в публикациях 8а11о, О. е! а1. (2003) Αάν. Эгид ЭеЕу. Кеу. 55:199-215; Тгай, Р.А. е! а1. (2003) Сапсег 1ттипо1. 1ттипо!йег. 52:328-337; Раупе, О. (2003) Сапсег Се11 3:207-212; А11еп, Т.М. (2002) №а!. Кет. Сапсег 2:750-763; Раз!ап, I. апй Кгейтап, К. 1. (2002) Сигг. Орт. 1пуезЕд. Эгидз 3:1089-1091; 8еп!ег, Ρ.Ό. и Брппдег, С.1. (200Υ) Αάν. Эгид ЭеЕу. Кет. 53:247-264.
Антитела согласно изобретению могут быть также конъюгированы с радиоактивным изотопом с получением цитотоксических радиофармацевтических средств, также называемых радиоиммуноконъюгатами. Примерами радиоактивных изотопов, которые могут быть конъюгированы с антителами в целях их применения в диагностике или терапии, являются, но не ограничиваются ими, иод131, иод125, индий111, иттрий90 и лютеций177. Метод получения радиоиммуноконъюгатов хорошо разработан специалистами. Примерами радиоиммуноконъюгатов являются коммерчески доступные радиоиммуноконъюгаты, включая 2еуаЕп™ (ЮЕС РЕагтасеиЕса1з) и Веххаг™ (Сопха Рйагтасеийса1з), и для получения радиоиммуноконъюгатов с использованием антител согласно изобретению могут быть применены аналогичные методы.
Конъюгаты антител согласно изобретению могут быть использованы для модификации данного биологического ответа, при этом выбор лекарственного средства необязательно должен ограничиваться классическими химическими терапевтическими средствами. Так, например, указанным лекарственным средством может быть белок или полипептид, обладающий нужной биологической активностью. Такими белками могут быть, например, ферментативно активный токсин или его активный фрагмент, такой как абрин, рицин А, экзотоксин Рзеийотопаз или дифтерийный токсин; белок, такой как фактор некроза опухоли или интерферон-γ; или модификаторы биологических ответов, такие как, например, лимфокины, интерлейкин-1 (1Ь-1), интерлейкин-2 (1Ь-2), интерлейкин-6 (1Ь-6), гранулоцитарныймакрофагальный колониестимулирующий фактор (ОМ-С8Р), гранулоцитарный колоннестимулирующий фактор (О-С8Р) или другие факторы роста.
Методы конъюгирования таких терапевтических средств с антителами хорошо известны специалистам, см., например, Агпоп е! а1., Мопос1опа1 АпйЬойчез Рог Ептипо1агдеЕпд ОЕ Эгидз 1п Сапсег Тйегару, Мопос1опа1 АпйЬойчез апй Сапсег Тйегару, КечзЕе1й е! а1. (ейз.), рр. 243-56 (А1ап К. Ьчзз, 1пс. 1985); Не11з!гот е! а1, АпйЬойчез Рог Эгид Ое1гуегу, Соп1го11ей Эгид ЭеЕуегу (2пй Ей.), КоЬтзоп е! а1. (ейз.), рр. 62353 (Магсе1 Эеккег, 1пс. 1987); Тйогре, ЛпЕЕойу Сатегз ОЕ Су!о!ох1с Адеп!з 1п Сапсег Тйегару: А Реч^чу, т Мопос1опа1 АпйЬойчез '84: Вю1од1са1 апй С11шса1 АррНсайопз, Ртсйега е! а1. (ейз.), рр. 475-506 (1985); Апа1уз1з, Кези1!з апй Ри!иге Ргозрес!гуе оЕ Тйе Тйегареийс Изе ОЕ Кайю1аЬе1ей АпйЬойу 1п Сапсег Тйегару, т Мопос1опа1 АпйЬойчез Рог Сапсег Ое!есйоп апй Тйегару, Ва1й\уЕч е! а1. (ейз.), рр. 303-16 (Лсайеппс Ргезз 1985) и Тйогре е! а1., Тйе Ргерагайоп апй Су!о!ох1с Ргорегйез ОЕ АпйЬой1у-Тохт Соп)ида!ез, 1ттипо1. Кет., 62:119-58 (1982).
Биспецифические молекулы
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к биспецифическим молекулам, содержащим анти-О8Е-антитело согласно изобретению или его фрагмент. Антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающая часть могут быть дериватизированы или присоединены к другой функциональной молекуле, например, к другому пептиду или белку (например, к другому антителу или лиганду для рецептора) с получением биспецифической молекулы, которая связывается по меньшей мере с двумя различными сайтами связывания или с молекулами-мишенями. Антитело согласно изобретению может быть, фактически, дериватизировано или присоединено к более чем одной другой функциональной молекуле с получением мультиспецифических молекул, которые связываются с более чем двумя различными сайтами связывания и/или с молекулами-мишенями; и такие мультиспецифические молекулы также входят в определение используемого здесь термина биспецифическая молекула. Для создания биспецифической молекулы согласно изобретению антитело согласно изобретению может быть функционально присоединено (например, посредством химического связывания, сцепления генов, нековалентного
- 36 017086 связывания или каким-либо иным методом связывания) к одной или нескольким другим связывающим молекулам, таким как другое антитело, фрагмент антитела, пептид или связывающий миметик, с получением нужной биспецифической молекулы.
В соответствии с этим настоящее изобретение включает в себя биспецифические молекулы, обладающие по меньшей мере одной первой специфичностью связывания с О8Е и второй специфичностью связывания со вторым эпитопом-мишенью. В конкретном варианте изобретения указанным вторым эпитопом-мишенью является Ес-рецептор, например, человеческий ΕογΕΙ (СЭ64) или человеческий Есарецептор (СЭ89). Поэтому настоящее изобретение включает в себя биспецифические молекулы, способные связываться с ЕсγЯ-или ЕсаК-экспрессирующими эффекторными клетками (например, моноцитами, макрофагами или полиморфонуклеарными клетками (ПМНК)) и с клетками-мишенями, экспрессирующими О8Е. Такие биспецифические молекулы осуществляют доставку О8Е-экспрессирующих клеток к эффекторным клеткам и стимулируют опосредуемую Ес-рецептором активность эффекторных клеток, такую как фагоцитоз О8Е-экспрессирующих клеток, антитело-зависимая клеточно-опосредуемая цитотоксичность (АЭСС), высвобождение цитокинов или образование супероксид-аниона.
В варианте изобретения, в котором биспецифическая молекула является мультиспецифической, указанная молекула помимо специфичности связывания с Ес и специфичности связывания с О8Е может дополнительно обладать и третьей специфичностью связывания. В одном из вариантов изобретения такой третьей специфичностью связывания обладает область, направленная против фактора стимуляции (ЕЕ), например, молекула, которая связывается с поверхностным белком, участвующим в цитотоксической активности, и тем самым, усиливающим иммунный ответ против клетки-мишени. Такой областью против фактора стимуляции может быть антитело, фрагмент функционального антитела или лиганд, который связывается с данной молекулой, например с антигеном или рецептором, и, тем самым, способствует усилению связывания эпитопов для Ес-рецептора или антигена клетки-мишени. Такая область против фактора стимуляции может связываться с Ес-рецептором или антигеном клетки-мишени. Альтернативно, область против фактора стимуляции может связываться с молекулой, отличающейся от молекулы, с которой связываются области, обладающие первой и второй специфичностью связывания. Так, например, часть антитела против фактора стимуляции может связываться с цитотоксической Тклеткой (например, посредством СЭ2, СЭ3, СЭ8, СЭ28, СЭ4, СЭ40, ЮАМ-1 или с другими иммунными клетками, что приводит к повышению иммунного ответа против клетки-мишени.
В одном из вариантов изобретения указанные биспецифические молекулы согласно изобретению содержат в качестве молекулы, обладающей специфичностью связывания по меньшей мере одно антитело или его фрагмент, включая, например, ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ')2^, Εά, ЦАЬ или одноцепочечный Εν. Указанное антитело может также представлять собой димер легкой цепи или тяжелой цепи или любой их минимальный фрагмент, такой как Εν, или одноцепочечную конструкцию, описанную в патенте США № 4946778, Ьайпег е! а1., содержание которого во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.
В одном из вариантов изобретения специфичность связывания с Εсγ-рецептором обеспечивается моноклональным антителом, связывание которого не блокируется человеческим иммуноглобулином 0 (Ιβ0). Используемый здесь термин ’ТдО-рецептор означает любой из восьми генов, кодирующих γ-цепь, и локализованных на хромосоме 1. Эти гены кодируют всего двенадцать трансмембранных или растворимых изоформ рецептора, которые подразделяются на три класса Εсγ-рецепторов: ΕсγКI (СЭ64), ΕсγК.II (СЭ32) и ΕсγКIII (СЭ16). В одном из предпочтительных вариантов изобретения Εсγ-рецептором является человеческий высокоаффинный ΡογΕΙ. Человеческий Ес'/Ш представляет собой молекулу размером 72 кДа, которая обладает высокой аффинностью к мономерному ΙβΟ (108-109 М-1).
Продуцирование и характеризация некоторых предпочтительных моноклональных анти-Есу антител описаны в публикации заявки РСТ \УО 88/00052, Еапдег е! а1., и в патенте США № 4954617, описание которых во всей своей полноте вводится в настоящее изобретение посредством ссылки. Эти антитела связываются с эпитопом Ес'/ЕП или Ес'/ЕШ в сайте, который отличается от сайта связывания Εсγ данного рецептора, а поэтому их связывание, по существу, не блокируется Ι§0 на физиологическом уровне. Специфическими анти-Е^К1 антителами, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются тАЬ 22, тАЬ 32, тАЬ 44, тАЬ 62 и тАЬ 197. Гибридома, продуцирующая тАЬ 32, депонирована в Американской Коллекции Типовых Культур, АТСС, рег. № НВ9469. В других вариантах изобретения антитело против Εсγ-рецептора представляет собой гуманизованную форму моноклонального антитела 22 (Н22). Продуцирование и характеризация антитела Н22 описаны в публикации Ога/1апо, К.Е. е! а1. (1995) I. Iттипο1. 155 (10): 4996-5002 и в публикации заявки РСТ XVО 94/10332. Клеточная линия, продуцирующая антитело Н22, депонирована в Американской Коллекции Типовых Культур под названием НА022СЬ1 и имеет рег. № СКЕ 11177.
В еще одном предпочтительном варианте изобретения специфичность связывания с человеческим Ес-рецептором обеспечивается антителом, которое связывается с ^А-рецептором, например Ес-арецептором (ЕсаК1 (СО89)), связывание которого предпочтительно не блокируется человеческим иммуноглобулином А (Т§А). Используемый здесь термин ’ТдА-рецептор означает любой генный продукт,
- 37 017086 кодируемый одним α-геном (РсаЯЦ локализованным на хромосоме 19. Известно, что этот ген кодирует несколько альтернативно сплайсированных трансмембранных изоформ, имеющих размер от 55 до 110 кДа. РсаШ (СЭ89) конститутивно экспрессируется на моноцитах/макрофагах, эозинофильных и нейтрофильных гранулоцитах, но не на популяциях не-эффекторных клеток. РсаЯ! имеет среднюю аффинность (~5х 107 М-1) для обоих !дА1 и Ι^ΛΣ, которая увеличивается под действием цитокинов, таких как 0-С8Р или 0М-С8Р (Мойоп, Н.С. е! а1. (1996) СгШса1 Яеу1е\\ъ ίπ Iттиπо1о§у 16:423-440). Были описаны четыре РсаЯЬспецифичных моноклональных антитела, идентифицированные как антитела А3, А59, А62 и А77, которые связываются с рецептором РсаЯ1, находящимся за пределами домена, связывающегося с лигандом ΙβΛ (Моп!е1го, Я.С. е! а1. (1992) 1. Iттиπо1. 148:1764).
РсаЯ! и ΡсγЯI являются предпочтительными стимулирующими рецепторами, используемыми в биспецифических молекулах согласно изобретению, поскольку они (1) экспрессируются, главным образом, на иммунных эффекторных клетках, например, моноцитах, РМ№ макрофагах и дендритных клетках; (2) экспрессируются на высоких уровнях (например, 5000-100000 на клетку); (3) являются медиаторами цитотоксической активности (например, АЭСС, фагоцитоза) и (4) опосредуют повышенный уровень презентации антигенов, включая нацеленные на них аутоантигены.
Хотя предпочтительными являются человеческие моноклональные антитела, однако в биспецифических молекулах согласно изобретению могут быть использованы и другие антитела, которыми являются мышиные, химерные и гуманизованные моноклональные антитела.
Биспецифические молекулы согласно изобретению могут быть получены путем конъюгирования молекул, обладающих специфичностью связывания, например, с РсЯ и О8Е, с применением методов известных специалистам. Так, например, каждая биспецифическая молекула, обладающая специфичностью связывания, может быть продуцирована отдельно, а затем все эти молекулы могут быть конъюгированы друг с другом. Если молекулами, обладающими специфичностью связывания, являются белки или пептиды, то для ковалентного связывания может быть использован ряд связывающих или перекрестносшивающих агентов. Примерами перекрестно-сшивающих агентов являются белок А, карбодиимид, Νсукцинимидил-3-ацетил-тиоацетат (8АТА), 5,5'-дитиобис(2-нитробензойная кислота) (ΌΤΝΒ), офенилендималеимид (оРОМ), №сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (8РЭР) и сульфосукцинимидил-4-(№малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-8МСС) (см., например, Кагроу^ку е! а1. (1984) I. Ехр. Мей. 160:1686; Яш, МА е! а1. (1985) Ргос. Асай. 8ск И8А 82:8648). Другими методами являются методы, описанные Раи1ик (1985) Векппд Ιπ§. М1!!. № 78, 118-132; Вгеппап е! а1. (1985) 8аепсе 229:81-83) и 01епте е! а1. (1987) I. Iттиπо1. 139:2367-2375). Предпочтительными конъюгирующими агентами являются 8АТА и сульфо-8МСС, поставляемые Р1егсе Скетюа1 Со. (ЯоскГогй, ГО).
Если специфически связывающимися молекулами являются антитела, то они могут быть конъюгированы посредством сульфгидрильной связи с С-концевыми шарнирными областями двух тяжелых цепей. В конкретном предпочтительном варианте изобретения шарнирную область модифицируют так, чтобы она содержала нечетное число сульфгидрильных остатков, а предпочтительно один остаток, а затем осуществляют конъюгирование.
Альтернативно, обе специфически связывающиеся молекулы могут кодироваться в одном и том же векторе и могут экспрессироваться и подвергаться сборке в одной и той же клетке-хозяине. Этот метод является особенно подходящим в том случае, если биспецифической молекулой является гибридный белок тАЬхтАЬ, тАЬхРаЬ, РаЬхР(аЬ')2 или лигандхРаЬ. Биспецифической молекулой согласно изобретению может быть одноцепочечная молекула, содержащая одноцепочечное антитело и детерминанту связывания, или одноцепочечная биспецифическая молекула, содержащая две детерминанты связывания. Биспецифические молекулы могут содержать по меньшей мере две одноцепочечных молекулы. Методы получения биспецифических молекул описаны, например, в патенте США № 5260203; в патенте США № 5455030; в патенте США № 4881175; в патенте США № 5132405; в патенте США № 5091513; в патенте США № 5476786; в патенте США № 5013653; в патенте США № 5258498 и в патенте США № 5482858.
Связывание биспецифических молекул с их конкретными мишенями может быть подтверждено, например, с помощью иммуноферментного твердофазного анализа (ЕЫ8А), радиоиммуноанализа (РИА), РАС8-анализа, биоанализа (например, на ингибирование роста) или вестерн-блот-анализа. В каждом из этих анализов обычно детектируют присутствие представляющих особый интерес комплексов белокантитело с использованием меченного реагента (например, антитела), специфичного к представляющему интерес комплексу. Так, например, комплексы РсЯ-антитело могут быть детектированы с использованием, например, связанного с ферментом антитела или фрагмента антитела, которые распознают указанные комплексы антитело-РсЯ и специфически связываются с ними. Альтернативно, такие комплексы могут быть детектированы с помощью любого из ряда других иммуноанализов. Так, например, антитело может быть радиоактивно меченным и может быть использовано в радиоиммуноанализе (РИА) (см., например, публикацию ^ет!гаиЬ, В., Рг1пс1р1ез оГ Яайюштипоаккаук, 8еνеπίк Тгаттд Соигке оп ЯайюИдапй Аккау Тесктциек, ТНе Епйосппе 8ос1е1у, Магск, 1986, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки). Радиоактивный изотоп может быть детектирован с помощью γ-счетчика или сцинтилляционного счетчика или посредством авторадиографии.
- 38 017086
Фармацевтические композиции
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции. например к фармацевтической композиции. содержащей одно моноклональное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающую(ие) часть (и) или их комбинации в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. Такие композиции могут включать одно антитело или их комбинации (например. два или более различных антител). или иммуноконъюгаты. или биспецифические молекулы согласно изобретению. Так. например. фармацевтическая композиция согласно изобретению может содержать комбинацию антител (или иммуноконъюгатов или биспецифических молекул). которые связываются с различными эпитопами на антигене-мишени или обладают дополнительной активностью.
Фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть также использованы в комбинированной терапии. то есть они могут быть введены в комбинации с другими средствами. Так. например. комбинированная терапия может включать введение анти-08Е-антитела согласно изобретению в комбинации по меньшей мере с одним другим противовоспалительным или иммуносупрессорным средством. Примеры терапевтических средств. которые могут быть использованы в комбинированной терапии. более подробно описаны ниже в разделе. относящемся к применению антител согласно изобретению.
Используемый здесь термин фармацевтически приемлемый носитель включает в себя любые и все растворители; дисперсионные среды; материалы для покрытий; антибактериальные и противогрибковые средства; вещества. придающие изотоничность; и вещества. замедляющие абсорбцию. и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Обычно таким носителем является носитель. подходящий для внутривенного. внутримышечного. подкожного. парентерального. интраспинального или интраэпидермального введения (например. путем инъекции или вливания). В зависимости от способа введения. активное соединение. то есть антитело. иммуноконъюгат или биспецифическая молекула могут иметь покрытие из материала. защищающего данное соединение от действия кислот и других условий окружающей среды. которые могут инактивировать данное соединение.
Фармацевтические соединения согласно изобретению могут включать одну или несколько фармацевтически приемлемых солей. Термин фармацевтически приемлемая соль означает соль. которая сохраняет нужную биологическую активность исходного соединения и не обладает каким-либо нежелательным токсическим действием (см.. например. Вегде, 8.М., е! а1. (1977) Л. Ркагт. 8ск 66:1-19). Примерами таких солей являются кислотно-аддитивные соли и основно-аддитивные соли. Кислотноаддитивными солями являются соли. происходящие от нетоксичных неорганических кислот. таких как соляная. азотная. фосфорная. серная. бромисто-водородная. иодисто-водородная. фосфорная кислоты и т.п.. а также от нетоксичных органических кислот. таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты. замещенные фенилом алкановые кислоты. гидроксиалкановые кислоты. ароматические кислоты. алифатические и ароматические сульфоновые кислоты и т.п. Основно-аддитивными солями являются соли. происходящие от щелочноземельных металлов. таких как натрий. калий. магний. кальций и т.п.. а также от нетоксичных органических аминов. таких как МИ-дибензилэтилендиамин. Мметилглюкамин, хлорпрокаин. холин. диэтаноламин. этилендиамин. прокаин и т. п.
Фармацевтическая композиция согласно изобретению может также включать фармацевтически приемлемый антиоксидант. Примерами фармацевтически приемлемых антиоксидантов являются: (1) водорастворимые антиоксиданты. такие как аскорбиновая кислота. гидрохлорид цистеина. бисульфат натрия. метабисульфит натрия. сульфит натрия и т.п.; (2) растворимые в масле антиоксиданты. такие как аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), лецитин. пропилгаллат, α-токоферол и т.п.; и (3) агенты. образующие хелатные комплексы с металлами. такие как лимонная кислота. этилендиаминтетрауксусная кислота (БИТА). сорбит. винная кислота. фосфорная кислота и т. п.
Примерами подходящих водных и безводных носителей. которые могут быть использованы в фармацевтических композициях согласно изобретению. являются вода. этанол. полиолы (такие как глицерин. пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси. растительные масла. такие как оливковое масло. и органические сложные эфиры для инъекций. такие как этилолеат. Нужная текучесть может быть сохранена. например. путем нанесения покрытий из таких материалов. как лецитин. путем поддерживания требуемого размера частиц в случае дисперсий. и с использованием поверхностноактивных веществ.
Эти композиции могут также содержать адъюванты. такие как консерванты. смачивающие агенты. эмульгирующие агенты и диспергирующие агенты. Защита от микроорганизмов может быть достигнута путем стерилизации. см. выше. и путем включения различных антибактериальных и противогрибковых средств. например. парабена. хлорбутанола, фенолсорбиновой кислоты и т.п. Может также оказаться желательным введение в композиции агентов. придающих изотоничность. таких как сахара. хлорид натрия. и т.п. Кроме того. пролонгированная абсорбция фармацевтического препарата для инъекции может быть достигнута путем включения веществ. замедляющих абсорбцию. таких как моностеарат алюминия и желатин.
Фармацевтически приемлемыми носителями являются стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для быстрого приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекций.
- 39 017086
Применение таких сред и агентов для приготовления фармацевтически активных веществ известно специалистам. В фармацевтических композициях согласно изобретению могут быть использованы любые стандартные среды или агенты, за исключением тех, которые являются несовместимыми с данным активным соединением. В такие композиции могут быть также введены дополнительные активные соединения.
Терапевтические композиции должны быть стерильными и стабильными в условиях их приготовления и хранения. Такие композиции могут быть приготовлены в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или других упорядоченных структур, подходящих для достижения высоких концентраций лекарственных средств. Носителем может быть растворитель или дисперсионная среда, содержащая, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полипропиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси. Нужная текучесть может быть сохранена, например, путем нанесения покрытий из таких материалов, как лецитин, путем поддерживания требуемого размера частиц в случае дисперсий, и с использованием поверхностно-активных веществ. Во многих случаях, может оказаться предпочтительным включение в указанную композицию веществ, придающих изотоничность, например, сахаров, полиспиртов, таких как маннит и сорбит, или хлорида натрия. Пролонгированная абсорбция композиций для инъекций может быть достигнута путем включения в эти композиции веществ, замедляющих абсорбцию, например, моностеаратных солей и желатина.
Стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем включения в соответствующий растворитель активного соединения в требуемом количестве, взятого отдельно или в комбинации с ингредиентами, перечисленными выше, если это необходимо, с последующей микрофильтрацией путем стерилизации. Дисперсии обычно получают путем включения активного соединения в стерильный носитель, содержащий основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из числа ингредиентов, перечисленных выше. В случае стерильных порошков, предназначенных для получения стерильных растворов для инъекций, предпочтительными методами получения таких препаратов являются вакуумная сушка и сушка вымораживанием (лиофилизация), в результате которой из указанного предварительно стерильно отфильтрованного раствора получают порошок, состоящий из активного ингредиента и любого другого нужного ингредиента.
Количество активного ингредиента, который может быть объединен с веществом-носителем в целях приготовления разовой лекарственной формы, может варьироваться в зависимости от индивидуума, подвергаемого лечению, и от конкретного способа введения. Количество активного ингредиента, который может быть объединен с веществом-носителем в целях получения разовой лекарственной формы, обычно представляет собой количество, включенное в композицию, которое продуцирует терапевтический эффект. В основном, такое количество, в расчете на 100% всего количества композиции, составляет в пределах примерно от 0,01 до 99% активного ингредиента, предпочтительно примерно от 0,1 до 70%, а наиболее предпочтительно примерно от 1 до 30% активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
Схему приема лекарственного средства подбирают так, чтобы достигался оптимальный нужный ответ (например, терапевтический ответ). Так, например, может быть введена одна ударная доза или несколько дробных доз в течение определенного периода времени, либо эта доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена в зависимости от терапевтических показаний. Для облегчения введения и обеспечения равномерного введения доз, особенно предпочтительной композицией для парентерального введения является унифицированная лекарственная форма. Используемый здесь термин унифицированная лекарственная форма означает физически дискретную единицу, подходящую для однократного введения дозы индивидууму, подвергаемому лечению; причем каждая такая единица содержит заданное количество активного соединения, необходимое для достижения нужного терапевтического эффекта в комбинации с подходящим фармацевтическим носителем. Спецификация унифицированных лекарственных форм согласно изобретению определяется такими факторами и непосредственно зависит от таких факторов, как (а) уникальные свойства активного соединения и конкретно достигаемый терапевтический эффект, и (Ь) ограничения, с которыми сталкиваются специалисты при приготовлении такого активного соединения, и которые связаны с восприимчивостью индивидуума к применяемому лечению.
Дозы вводимого антитела составляют в пределах примерно от 0,0001 до 100 мг/кг, а обычно от 0,01 до 25 мг/кг массы тела хозяина. Так, например, эти дозы могут составлять 0,3 мг/кг массы тела, 1 мг/кг массы тела, 3 мг/кг массы тела, 5 мг/кг массы тела или 10 мг/кг массы тела или в интервале 1-10 мг/кг.
При необходимости могут быть введены более высокие дозы, например 15 мг/кг массы тела, 20 мг/кг массы тела или 25 мг/кг массы тела. Репрезентативная схема лечения предусматривает введение дозы один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели, один раз в четыре недели, один раз в месяц, один раз в 3 месяца или один раз в 3-6 месяцев. Предпочтительная схема введения анти-О8Еантитела согласно изобретению предусматривает внутривенное введение 1 мг/кг массы тела или 3 мг/кг массы тела, где указанное антитело вводят в соответствии со одной из следующих схем введения:
(ί) через каждые четыре недели, 6 доз, а затем через каждые три месяца;
(ίί) через каждые три недели;
- 40 017086 (ίίί) одну дозу в 3 мг/кг массы тела, а затем одну дозу в 1 мг/кг массы тела через каждые три недели.
В некоторых способах одновременно вводят два или более моноклональных анти-О8Е-антител согласно изобретению с различными специфичностями связывания, и в данном случае доза каждого вводимого антитела составляет в пределах указанных значений. Антитело обычно вводят в виде многократных доз. Разовые дозы могут быть введены с интервалами раз в неделю, раз в месяц, раз в три месяца или раз в год. Интервалы введения доз могут быть также нерегулярными и могут устанавливаться в соответствии с измеряемыми уровнями антитела против антигена-мишени в крови данного пациента. В некоторых способах дозы могут быть скорректированы для достижения концентрации антитела в плазме в пределах примерно 1-1000 мкг/мл, а в некоторых способах, примерно 25-300 мкг/мл.
В других способах, одно или несколько моноклональных анти-О8Е-антител согласно изобретению вводят одновременно с антителом, обладающим другой специфичностью связывания, например, с таким антителом, как анти-СТЬЛ-4-антитело и/или анти-РП-1-антитело, и в этом случае, каждое антитело вводят в дозе, величина которой входит в указанные интервалы.
Альтернативно, антитело может быть введено в виде препарата пролонгированного высвобождения, и в этом случае требуется менее частое его введение. Доза и частота введения варьируются в зависимости от времени полужизни данного антитела в организме пациента. В общих чертах, человеческие антитела имеют наиболее продолжительное время полужизни, а за ними идут гуманизованные антитела, химерные антитела и не-человеческие антитела. Доза и частота введения могут варьироваться в зависимости от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. При профилактическом применении относительно низкую дозу антитела вводят через относительно большие интервалы в течение длительного периода времени. Некоторые пациенты проходят лечение в течение всей жизни. При терапевтическом применении иногда может потребоваться введение относительно высокой дозы через относительно короткие промежутки времени до замедления или прекращения прогрессирования заболевания, а предпочтительно до тех пор, пока у пациента не будет наблюдаться частичное ослабление или полное исчезновение симптомов заболевания. Затем пациенту может быть назначено профилактическое лечение.
Фактические дозы активных ингредиентов в фармацевтических композициях согласно изобретению могут варьироваться в целях получения такого количества активного ингредиента, которое является эффективным для достижения нужного терапевтического ответа у данного пациента при соответствующем составе композиции и при соответствующем способе ее введения, и которое не оказывает токсического воздействия на пациента. Выбор доз зависит от ряда фармакокинетических факторов, включая активность конкретно используемых композиций согласно изобретению или их сложных эфиров, солей или амидов, способ введения, время введения, скорость выведения конкретно используемого соединения, продолжительность лечения, присутствие других лекарственных средств, соединений и/или веществ, используемых в комбинации с данными композициями, а также от возраста, пола, массы тела, тяжести заболевания, общего состояния здоровья и истории болезни пациента, подвергаемого лечению, и от других факторов, хорошо известных специалистам-медикам.
Терапевтически эффективная доза анти-О8Е-антитела согласно изобретению, обычно способствует снижению тяжести симптомов заболевания, увеличению частоты и продолжительности ремиссий заболевания или предотвращению ухудшения состояния или наступления инвалидности, вызываемых данным заболеванием. Так, например, для лечения О8Е+-опухолей, терапевтически эффективная доза предпочтительно, ингибирует рост клеток или опухолей по меньшей мере примерно на 20%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 40%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 60%, а наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно на 80% по сравнению с индивидуумами, не подвергавшимися лечению. Способность соединения ингибировать рост опухоли может быть оценена на животном с предсказуемой моделью активного роста человеческих опухолей. Альтернативно, такое свойство композиции может быть оценено путем определения способности данного соединения ингибировать рост опухоли, где такое ингибирование ш νίΐτο осуществляют с помощью анализов, известных специалистам-практикам. Терапевтически эффективное количество терапевтического соединения может способствовать снижению размера опухоли или ослаблению каких-либо других симптомов у индивидуума. Средний специалист в данной области может самостоятельно определить нужные количества исходя из таких факторов, как масса тела индивидуума, тяжесть симптомов его заболевания, конкретный состав композиции или выбранный способ введения.
Композиция согласно изобретению может быть введена одним или несколькими путями в соответствии с методикой, хорошо известной специалистам. Как известно специалистам, путь и/или способ введения может варьироваться в зависимости от желаемых результатов. Предпочтительными способами введения антител согласно изобретению являются внутривенное, внутримышечное, интрадермальное, внутрибрюшинное, подкожное и интраспинальное введение или другие способы парентерального введения, например, путем инъекции или вливания. Используемый здесь термин парентеральное введение означает способы введения, за исключением внутрикишечного и местного введения, обычно осуществляемые путем инъекции, и такими способами являются, но не ограничиваются ими, внутривенные, внутримышечные, внутриартериальные, интратекальные, интракапсулярные, интраорбитальные, внутрисер
- 41 017086 дечные, интрадермальные, внутрибрюшинные, транстрахеальные, подкожные, субэпидермальные, внутрисуставные, субкапсулярные, субарахноидальные, интраспинальные, эпидуральные и интрастернальные инъекции и вливания.
Альтернативно, антитело согласно изобретению может быть введено путем не-парентерального введения, такого как местное или трансэпидермальное введение или введение через слизистую, например, путем интраназального, перорального, вагинального, ректального, подъязычного или местного введения.
Активные соединения могут быть получены в комбинации с носителями, которые защищают данное соединение от быстрого высвобождения, например, они могут быть получены в виде препарата с регулируемым высвобождением, включая имплантаты, чрескожные пластыри и микроинкапсулированные системы для доставки. Могут быть использованы биологически разлагаемые и биологически совместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие методы приготовления таких препаратов запатентованы или, по существу, известны специалистам. См., например, 8ик1ашеб апб Соп1го11еб Ке1еаке Эгид ЭеЕуегу 8ук!етк, ТК КоЫпкоп, еб., Магсе1 Эеккег, йс., №\ν Уогк, 1978.
Терапевтические композиции могут быть введены с помощью медицинского оборудования, известного специалистам. Так, например, в предпочтительном варианте изобретения терапевтическая композиция согласно изобретению может быть введена с помощью безыгольного устройства для подкожных инъекций, такого как устройства, описанные в патентах США №№ 5399163; 5383851; 5312335; 5064413; 4941880; 4790824 или 4596556. Примеры хорошо известных имплантатов и модулей, используемых в настоящем изобретении, можно найти в патенте США № 4487603, где описан имплантируемый микроинфузионный насос для введения лекарственного средства с регулируемой скоростью; в патенте США № 4486194, где описано терапевтическое устройство для чрескожного введения лекарственных средств; в патенте США № 4447233, где описан медицинский инфузионный насос для введения лекарственного препарата с точно заданной скоростью вливания; в патенте США № 4447224, где описан имплантируемый аппарат для непрерывного вливания лекарственного средства с различной скоростью потока; в патенте США № 4439196, где описана осмотическая система доставки лекарственного средства, имеющая многокамерные отделения; и в патенте США № 4475196, где описана осмотическая система доставки лекарственного средства. Эти патенты вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Специалистам известны и многие другие подобные имплантаты, системы доставки и модули.
В некоторых вариантах изобретения человеческие моноклональные антитела согласно изобретению могут быть приготовлены так, чтобы они имели соответствующее распределение ш у1уо. Так, например, гематознцефалический барьер (ВВВ) не пропускает многие в высокой степени гидрофильные соединения. Для обеспечения прохождения терапевтических соединений согласно изобретению через ВВВ (если это необходимо), они могут быть приготовлены, например, в виде липосом. Методы получения липосом описаны, например, в патентах США №№ 4522811; 5374548 и 5399331. Липосомы могут содержать одну или несколько молекул, которые селективно транспортируются в конкретные клетки или органы, что повышает эффективность направленной доставки лекарственных средств (см., например, V. V. Капабе (1989) Е С1ш. Рйагтасо1. 29:685). Репрезентативными нацеливающими молекулами являются фолат или биотин (см., например, патент США № 5416016, Ьоте е! а1.); маннозиды (итеха\\'а е! а1., (1988) Вюсйет. Вюрйук. Кек. Соттип. 153:1038); антитела (Р.6. В1оетап е! а1. (1995) ЕЕВ8 Ье!!. 357:140; М. 0\νηίκ е! а1. (1995) Ап!1т1сгоЬ. Адеп!к Сйето!йег. 39:180); поверхностно-активный рецепторный белок А (Впксое е! а1. (1995) Ат. 1. Рйукю1. 1233: 134); р120 (8сйге1ег е! а1. (1994) 1. Вю1. СЕет. 269:9090): см. также К. Кетапеп; М.Ь. Ьаиккапеп (1994) ЕЕВ8 Ье!!. 346:123; ^.^. КШюп; ЬЛ. Е1б1ег (1994) ИптипотеШобк 4:273.
Применение и способы согласно изобретению
Антитела, а в частности, человеческие антитела, композиции антител и способы согласно изобретению могут быть применены ш У1!го и ш у1уо в различных диагностических и терапевтических целях, например, для детектирования 08Е, для лечения рака или для усиления иммунного ответа путем блокирования 08Е. В предпочтительном варианте изобретения антителами согласно изобретению являются человеческие антитела. Так, например, эти молекулы могут быть введены в клеточную культуру, ш νίΙΐΌ или ех у1уо, или человеку, например, ш у1уо, для лечения, предупреждения и диагностики различных расстройств, или для повышения иммунитета при различных состояниях.
Используемый здесь термин индивидуум включает в себя человека и животных. Такими животными являются все позвоночные, например млекопитающие и не млекопитающие, такие как приматы, не являющиеся человеком, овцы, собаки, кошки, коровы, лошади, куры, амфибии и рептилии. Предпочтительным индивидуумом является человек, а именно, пациент, страдающий расстройствами, ассоциированными с экспрессией 08Е, или нуждающийся в усилении иммунного ответа. Указанные методы являются особенно подходящими для лечения человека, страдающего расстройством, ассоциированным с нарушением экспрессии 08Е. Такие методы также являются особенно подходящими для лечения человека, страдающего расстройством, которое может быть подвергнуто лечению посредством повышения уровня Т-клеточно-опосредуемого иммунного ответа. Для достижения усиления антигенспецифического иммунного ответа анти-08Е-антитела могут быть введены вместе с представляющим интерес антигеном.
- 42 017086
Если антитела против 08Е вводят вместе с другим средством, то эти два компонента могут быть введены либо последовательно, либо одновременно.
Принимая во внимание тот факт, что антитело согласно изобретению специфически связывается с 08Е, следует отметить, что антитела согласно изобретению могут быть использованы для специфической детекции экспрессии 08Е на поверхности клеток, и кроме того, они могут быть использованы для выделения 08Е посредством иммуноаффинной очистки.
Рак
08Е экспрессируется в различных раковых опухолях человека, включая карциномы молочной железы, метастазы рака молочной железы, карциномы яичника, метастазы рака яичника и карциномы почек (Тгтд1ег е! а1. (2005) С11шса1 Сапсег Век. 11: 1842-48; 8а1себа е! а1. (2005) Ехр Се11 Век. 306:128-41; Тппд1ег е! а1. (2006) 0упесо1 0псо1. 100:44-52; КгатЬеск е! а1. (2006) Ргос. №!1. Асаб. 8с1. И8А 103:103916; СРеп е! а1. (2006) К1бпеу Ш!. ЕриЬ; 8ип е! а1. (2006) Ьипд Сапсег 53:143-51; В1дпо!Е е! а1. (2006) 0упесо1 0псо1. 103:405-16; Кпс/ек е! а1. (2006) 1. Ехр. Меб. 203:871-81; 81топ е! а1. (2006) Сапсег Век. 66:1570-5). Анти-08Е-антитело само может быть использовано для ингибирования роста опухолей. Альтернативно, анти-08Е-антитело может быть использовано в комбинации с другими иммуногенными средствами, со стандартной противораковой терапией или с другими антителами, описанными ниже.
Было обнаружено, что аттенюатор В- и Т-лимфоцитов (ВТЬА) представляет собой рецептор для 08Е и обладает действием, ингибирующим иммунные ответы, аналогично цитотоксическому Тлимфоцитарному антигену-4 (СТЬА-4) и антигену 1 запрограммированной гибели клеток (РО-1) (Саггепо & СоШпк (2003) Тгепбк Iттиηο1. 24:524-7). 08Е действует посредством негативной регуляции Тклеточного иммунного ответа путем ингибирования пролиферации Т-клеток и продуцирования цитокинов и ингибирования клеточного цикла (СРо1 е! а1. (2003) 1. Iттиηο1. 171 :4 650-4). Гибридный белок 08Е4д ингибирует активацию Т-клеток, а блокирование 08Е-антителами может усиливать иммунный ответ у пациента. (81са е! а1. (2 003) Iттишίу 18:849-61).
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к лечению индивидуума ш νί\Ό с использованием анти-08Е-антитела, которое ингибирует рост раковых опухолей. Для ингибирования роста раковых опухолей может быть использовано лишь одно анти-08Е-антитело. Альтернативно, анти-08Еантитело может быть использовано в комбинации с другими иммуногенными средствами, со стандартной противораковой терапией или с другими антителами, описанными ниже.
В соответствии с этим в одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к способу ингибирования роста опухолевых клеток у индивидуума, где указанный способ включает в себя введение данному индивидууму терапевтически эффективного количества анти-08Е-антитела или его антигенсвязывающей части. Предпочтительным антителом является человеческое анти-08Е-антитело (например, любое из описанных здесь человеческих антител против человеческого 08Е). Дополнительно или альтернативно, указанным антителом может быть химерное или гуманизованное анти-08Е-антитело.
Предпочтительными раковыми опухолями, рост которых может ингибироваться антителами согласно изобретению, являются раковые опухоли, обычно восприимчивые к иммунотерапии. Неограничивающими примерами раковых опухолей, предпочтительных для лечения антителами согласно изобретению, являются рак молочной железы (например, карцинома молочной железы), рак яичника (например, карцинома яичника) и карцинома почек (КП). Примерами других раковых опухолей, которые могут быть подвергнуты лечению способами согласно изобретению, являются меланома (например, метастизирующая злокачественная меланома), рак предстательной железы, рак толстой кишки, рак легких, рак костей, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головного мозга, хронический или острый лейкоз, включая острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, лимфомы (например, ходжкинская лимфома и не-ходжкинская лимфома, лимфоцитарная лимфома, первичная лимфома ЦНС, Т-клеточная лимфома), карциномы носоглотки, рак головы и шеи, злокачественная меланома кожи или внутриглазная меланома, рак матки, рак прямой кишки, рак заднего прохода, рак желудка, рак яичек, рак матки, карцинома фаллопиевых труб, карцинома эндометрия, карцинома шейки матки, карцинома влагалища, карцинома вульвы, рак пищевода, рак тонкого кишечника, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак коры надпочечника, саркома мягких тканей, рак уретры, рак пениса, солидные опухоли у детей, рак мочевого пузыря, рак почек или мочеточника, карцинома почечной лоханки, опухоль центральной нервной системы (ЦНС), опухолевый ангиогенез, опухоль позвоночника, глиома ствола головного мозга, аденома гипофиза, саркома Капоши, эпидермоидный рак, плоскоклеточный рак, раковые опухоли, индуцируемые влиянием окружающей среды, включая раковые опухоли, индуцируемые асбестом, например, мезотелиома и комбинации указанных раковых заболеваний.
Антитела против 08Е могут быть, но необязательно, объединены с иммуногенным агентом, таким как раковые клетки, очищенные опухолевые антигены (включая рекомбинантные белки, пептиды и углеводные молекулы), клетки, и клетки, трансфицированные генами, кодирующими иммуностимулирующие цитокины (Не е! а1. I. Iттиηο1. 173:4919-28 (2004)). Неограничивающими примерами подходящих для использования противоопухолевых вакцин являются вакцины на основе пептидов меланомных антигенов, таких как пептиды др100, антигены МА0Е, Тгр-2, МАВТ1 и/или тирозиназа, или вакцины на ос
- 43 017086 нове опухолевых клеток, которые были трансфицированы для экспрессии цитокина 0М-С8Р.
Было обнаружено, что некоторые опухоли человека, такие как меланомы, являются иммуногенными. При этом предполагается, что при увеличении порога активации Т-клеток посредством блокады 08Е, можно активировать опухолевые ответы у хозяина.
Вероятно, что блокирование 08Е является наиболее эффективным в комбинации с вакцинацией. Было разработано множество экспериментальных стратегий вакцинации против опухолей (см. ЯокепЬегд, 8., Эеуе1ортеп1 оГ Сапсег Уасстек, А8С0 Еάиса!^οпа1 Воок 8рппд: 60-62 (2000); ЬодоШеБк, А8С0 ЕάисаБопа1 Воок 8ргтд: 300-302 (2000); КБауа!, А8С0 Еάиса!^οпа1 Воок 8рппд: 414-428 (2000); Рооп, А8С0 Еάиса!^οпа1 Воок 8ргтд: 730-738 (2000); см. также ЯекШо, & 8/по1, Сапсег Уассшек, СБ. 61, рр. 3023-3043 т ЭеУБа, е! а1. ^άκ.), Сапсег: Рг1пс1р1ек ηπά РгасБсе оГ 0псо1оду, ΕίΠΙι Εά^^ (1997)). В одной из этих стратегий вакцину получают с использованием аутологичных или аллогенных опухолевых клеток. Обычно, эти клеточные вакцины являются наиболее эффективными при трансдукции опухолевых клеток в целях сообщения им способности экспрессировать 0М-С8Р. Было показано, что 0М-С8Р является сильным активатором презентации антигена и может быть использован для противоопухолевой вакцинации (ЭгапоГГ е! а1. Ргос. №ΐ1. Асаά. 8а И.8.А. 90: 3539-43 (1993)).
Исследование экспрессии генов и паттернов широкомасштабной экспрессии генов в различных опухолях позволило идентифицировать так называемые опухоль-специфические антигены (ЯокепЬегд, Iттишίу 10: 281-7 (1999)). Во многих случаях такие опухоль-специфические антигены представляют собой антигены дифференцировки, экспрессируемые в опухолях и в клетках, от которых произошли эти опухоли, например, антигены меланоцитов др100, антигены МА0Е и Тгр-2. Важно отметить, что многие из этих антигенов, как уже было показано, являются мишенями опухоль-специфических Т-клеток, присутствующих у хозяина. Блокада 08Е может быть осуществлена вместе с использованием набора рекомбинантных белков и/или пептидов, экспрессиируемых в опухоли для генерирования иммунного ответа на эти белки. Такие белки обычно распознаются иммунной системой как аутоантигены, а поэтому являются толерантными к ним. Опухолевым антигеном может быть также протеинтеломераза, которая необходима для синтеза хромосомных теломер, и которая экспрессируется в более чем 85% человеческих раковых опухолей и лишь в ограниченном числе соматических тканей (К1т е! а1. 8с1епсе 266: 2011-2013 (1994)). (Эти соматические ткани могут быть защищены от иммунной атаки различными методами). Опухолевыми антигенами могут быть также неоантигены, экспрессируемые в раковых клетках под влиянием соматических мутаций, которые модифицируют последовательность белка или приводят к образованию гибридных белков между двумя неродственными последовательностями (то есть Ьсг-аЬ1 в хромосоме РЫМе1рЫа) или идиотипа В-клеточных опухолей.
Другие противоопухолевые вакцины могут включать белки вирусов, участвующих в образовании раковых опухолей у человека, таких как человеческие папиломавирусы (НРУ), вирусы гепатита (НВУ и НСУ) и герпесвирус саркомы Капоши (КН8У). Другие формы опухоль-специфических антигенов, которые могут быть использованы в комбинации с блокадой 08Е, представляют собой очищенные белки теплового шока (Н8Р), выделенные из самой опухолевой ткани. Эти белки теплового шока содержат фрагменты белков опухолевых клеток, и такие Н8Р являются в высокой степени эффективными при их доставке к антиген-презентирующим клеткам для вырабатывания противоопухолевого иммунитета (8ио! & 8г1уак1ауа, 8с1епсе 269:1585-1588 (1995); Татига е! а1. 8аепсе 278:117-120 (1997)).
Дендритные клетки (ДК) являются эффективными антиген-презентирующими клетками, которые могут быть использованы для стимуляции антигенспецифических ответов. ДК могут продуцироваться ех У1уо и могут быть нагружены различными белковыми и пептидными антигенами, а также экстрактами опухолевых клеток (№к!1е, Р. е! а1. (1998) №!иге Меά^с^ηе А: 328-332). ДК могут быть также трансдуцированы генетическими методами для сообщения им способности экспрессировать опухолевые антигены. ДК были также непосредственно слиты с опухолевыми клетками в целях иммунизации (Кид1ег, А. е! а1. (2000) №11иге Меά^с^ηе 6:332-336). Иммунизация с использованием ДК, проводимая в целях вакцинации, может быть с успехом проведена в комбинации с блокадой РЭ-1 в целях активации более сильных противоопухолевых ответов.
Блокада 08Е может быть также объединена со стандартной противораковой терапией. Блокада 08Е может быть с успехом осуществлена в комбинации с химиотерапией. В этих случаях может быть снижена доза вводимого химиотерапевтического средства (Мокуг, М. е! а1. (1998) Сапсег Яекеагсй 58: 53015304). Примером такой комбинации является комбинация анти-08Е-антитела с декарбазином, используемым для лечения различных раковых опухолей. Другим примером такой комбинации является комбинация анти-08Е-антитела с интерлейкином-2 (ΙΕ-2), используемым для лечения различных раковых опухолей. Помимо комбинированной терапии с применением блокады 08Е и химиотерапии, существует и другой научный подход, основанный на том, что гибель клеток, которая является следствием цитотоксического действия большинства химиотерапевтических соединений, должна приводить к повышению уровней опухолевого антигена на пути презентации антигена. Другой комбинированной терапией, которая может давать синергический эффект в сочетании с блокадой 08Е и, тем самым, приводить к гибели клеток, является лучевая терапия, хирургическая операция и антигормональная терапия. Каждая из этих стратегий позволяет создавать источник опухолевого антигена у хозяина. Блокада 08Е может быть также
- 44 017086 объединена с ингибированием ангиогенеза. Ингибирование ангиогенеза приводит к гибели опухолевых клеток, которые могут направлять опухолевый антиген на путь презентации антигена хозяина.
08Е-блокирующие антитела могут быть также использованы в комбинации с биспецифическими антителами, которые направляют эффекторные клетки, экспрессирующие Рса- или Рсу-рецепторы, к опухолевым клеткам (см., например, патенты США №№ 5922845 и 5837243). Биспецифические антитела могут быть использованы для доставки двух отдельных антигенов. Так, например, биспецифические антитела против Рс-рецептора/опухолевого антигена (например, нег-2/иеи) были использованы для доставки макрофагов в участки, пораженные опухолью. Такая направленная доставка может более эффективно активировать опухоль-специфические ответы. Блокада 08Е должна приводить к увеличению Тклеточной составляющей этих ответов. Альтернативно, использование биспецифических антител, которые связываются с опухолевым антигеном и со специфическим маркером поверхности дендритных клеток, позволяет осуществлять непосредственную доставку антигена к ДК.
Ускользание опухолей от иммунного надзора хозяина происходит по различным механизмам широкого ряда. Многие из этих механизмов могут быть устранены путем инактивации белков, которые экспрессируются опухолями и являются иммуносупрессорными. Такими белками, среди прочих, являются ТОР-бета (КеЬг1, 1. е! а1. (1986) 1. Ехр. Меб. 163: 1037-1050), Ш-10 (но^агб, М. & О'Оагга, А. (1992) 1ттиио1о§у Тобау 13: 198-200) и лиганд Рак (наЬие, М. е! а1. (1996) 8с1еисе 274: 1363-1365). Антитела против каждой из этих молекул могут быть использованы в комбинации с анти-РЭ-1 антителом для подавления действия иммуносупрессорного агента и индуцирования благоприятных противоопухолевых иммунных ответов у хозяина.
Другие антитела, которые могут активировать иммунные ответы у хозяина, могут быть использованы в комбинации с анти-08Е-антителами. Такими антителами являются молекулы, присутствующие на поверхности дендритных клеток и активирующие функцию ДК и презентацию антигена. Анти-СЭ40антитела могут служить эффективной заменой активности Т-хелперных клеток (К1бде, 1. е! а1. (1998) №1!иге 393: 474-478) и могут быть использованы в сочетании с анти-О8Е-антителами. Активирующие антитела против Т-клеточных костимулирующих молекул, таких как СТЬА-4 (например, патент США № 5811097), ОХ-40 (№етЬег§, А. е! а1. (2000) 1ттиио1. 164: 2160-2169), 4-1ВВ (Ме1его, I. е! а1. (1997) Уинге Мебкте 3: 682-685 (1997), РЭ-1 (бе1 Кто е! а1. (2005) Еиг. 1. 1ттиио1. 35:3545-60) и 1СО8 (ниБоГГ, А. е! а1. (1999) №1Ц1гс 397: 262-266), могут быть также использованы для повышения уровней активации Тклеток.
В настоящее время для лечения различных опухолей гемопоэтической системы применяется трансплантация костного мозга. Хотя осложнением такого лечения может быть реакция трансплантат против хозяина, однако в результате вырабатывания у хозяина ответа трансплантат против опухоли может быть достигнут положительный терапевтический эффект. Блокада О8Е может быть использована для повышения эффективности трансплантированных донорам опухоль-специфических Т-клеток.
Было также разработано несколько экспериментальных стратегий терапии, которые предусматривают активацию ех у1уо, экспансию антигенспецифических Т-клеток и адоптивный перенос этих клеток реципиенту для вырабатывания у него антигенспецифического Т-клеточного противоопухолевого ответа (ОгееиЬегд, К. & К1ббе11, 8. (1999) 8с1еисе 285: 546-51). Эти методы могут быть также применены для активации Т-клеточных ответов на инфекционные агенты, такие как СМУ. Можно предположить, что ех У1уо активация в присутствии анти-О8Е-антител будет увеличивать число и активность адаптивно перенесенных Т-клеток.
Принимая во внимание тот факт, что О8Е экспрессируются на различных опухолевых клетках, следует отметить, что человеческие антитела, композиции антител и способы согласно изобретению могут быть применены для лечения индивидуума, страдающего опухолевым заболеванием, например заболеванием, характеризующимся присутствием опухолевых клеток, экспрессирующих О8Е, включая, например, рак молочной железы (например, карциному молочной железы), рак яичника (например, карциному яичника) и рак почек. Примерами других раковых заболеваний, которые могут быть подвергнуты лечению способами согласно изобретению, являются меланома (например, метастизирующая злокачественная меланома), рак предстательной железы, рак толстой кишки и рак легких, рак костей, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы и шеи, злокачественная меланома кожи или внутриглазная меланома, рак матки, рак прямой кишки, рак заднего прохода, рак желудка, рак яичек, рак матки, карцинома фаллопиевых труб, карцинома эндометрия, карцинома шейки матки, карцинома влагалища, карцинома вульвы, болезнь Ходжкина, не-ходжкинская лимфома, острый миелоидный лейкоз (АЬЬ), хронический лимфоцитарный лейкоз (СЬЬ), лимфома Беркитта, анапластическая крупноклеточная лимфома (ЛЬСЬ), множественная миелома, Т-клеточная лимфома кожи, нодулярная мелкоклеточная дифференцированная лимфома, лимфоцитарная лимфома, лимфомы периферических Т-клеток, лимфома Леннерта, иммунобластные лимфомы, Т-клеточный лейкоз/Т-клеточная лимфома (АТЬЬ), Т-клеточный лейкоз взрослых (ТАЬЬ), энтробластные/центроцитарные (сЬ/сс) фолликулярные лимфомы, диффузная крупноклеточная лимфома В-клеточной линии дифференцировки, Т-клеточная лимфома, подобная ангиоиммунобластной лимфоаденопатии (АШЭ), ВИЧ-ассоциированная лимфома полости тела, эмбриональные карциномы, недифференцированные карциномы носоглотки (например, опухоль Шминке), болезнь Каслмана, сарко
- 45 017086 ма Капоши, множественная миелома, макроглобулинемия Вальденстрема и другие В-клеточные лимфомы, рак пищевода, рак тонкого кишечника, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак коры надпочечника, саркома мягких тканей, рак уретры, рак пениса, хронический или острый лейкоз, включая острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, солидные опухоли у детей, лимфоцитарная лимфома, рак мочевого пузыря, рак почек или мочеточника, карцинома почечной лоханки, опухоль центральной нервной системы (ЦНС), первичная лимфома ЦНС, глиобластома, опухоли головного мозга, карциномы носоглотки, опухолевый ангиогенез, опухоль позвоночника, глиома ствола головного мозга, аденома гипофиза, саркома Капоши, эпидермоидный рак, плоскоклеточный рак, Т-клеточная лимфома, раковые опухоли, индуцируемые влиянием окружающей среды, включая раковые опухоли, индуцируемые асбестом, и комбинации указанных раковых заболеваний. Настоящее изобретение может быть также применено для лечения метастазов рака.
В соответствии с этим в одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к способу ингибирования роста опухолевых клеток у индивидуума, где указанный способ включает в себя введение индивидууму терапевтически эффективного количества анти-О8Е-антитела или его антигенсвязывающей части. Обычно, таким антителом является человеческое анти-О8Е-антитело (например, любое человеческое антитело против человеческого О8Е, описанное в настоящей заявке). Дополнительно или альтернативно, таким антителом может быть химерное или гуманизованное анти-О8Е-антитело.
Инфекционные заболевания
Для лечения пациентов, инфицированных конкретными токсинами или патогенами, применяются другие способы согласно изобретению. В соответствии с этим в другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения инфекционного заболевания у индивидуума, включающему в себя введение указанному индивидууму анти-О8Е-антитела или его антигенсвязывающей части в целях лечения у данного индивидуума инфекционного заболевания. Предпочтительным антителом является человеческое антитело против человеческого О8Е (например, любое из описанных здесь человеческих антиО8Е-антител).
Дополнительно или альтернативно, указанным антителом может быть химерное или гуманизованное антитело.
Аналогично применению способа, обсуждаемого выше для лечения опухолей, опосредуемая антителом блокада О8Е может быть использована отдельно или в качестве вспомогательного средства в комбинации с вакцинами, в целях стимуляции иммунного ответа на патогены, токсины и аутоантигены. Примерами патогенов, против которых применение указанного терапевтического подхода может быть особенно эффективным, являются патогены, которые не поддаются уничтожению с применением современных вакцин, или патогены, против которых действие стандартных вакцин не является достаточно эффективным. Такими патогенами являются, но не ограничиваются ими, ВИЧ, вирус гепатита (А, В и С), вирус гриппа, герпесвирус, паразит 01агб1а, малярийный плазмодий, бактерии ЬеЦНташа, 81арЬу1ососси§ аигеик, Ркеиботопак Аегидтока. Блокада ΡΌ-1 является особенно эффективной против известных инфекций, вызываемых такими патогенами, как ВИЧ, который презентирует модифицированные антигены в процессе инфицирования. При введении антитела против человеческого О8Е такие новые эпитопы распознаются как чужеродные, что приводит к стимуляции вырабатывания сильного Т-клеточного ответа, который не снижается под действием негативных сигналов, передаваемых О8Е.
Некоторыми примерами патогенных вирусов, вызывающих развитие инфекций, поддающихся лечению способами согласно изобретению, являются ВИЧ, вирус гепатита (А, В или С), герпесвирус (например, У2У, Н8У-1, НАУ-6, Н8У-П и СМУ, вирус Эпштейна-Барра), аденовирус, вирус гриппа, флавивирусы, ЕСНО-вирусы, риновирус, вирус коксаки, коронавирус, респираторно-синцитиальный вирус, вирус паротита, ротавирус, вирус кори, вирус коревой краснухи, парвовирус, вирус коровьей оспы, вирус НТЬУ, вирус денге, папилломавирус, вирус контагиозного моллюска, полиовирус, вирус бешенства, вирус Джеймстаун-Каньон (1С) и вирус арбовирусного энцефалита.
Некоторыми примерами патогенных бактерий, вызывающих инфекции, поддающиеся лечению способами согласно изобретению, являются хламидии, риккетсии, микобактерии, стафилококки, стрептококки, пневмококки, менингококки и гонококки, бактерии К1еЬые11а, Рго!еи§, 8еггайа, Ркеиботопак, Ьедюпе11а, О1рН1Ьег1а, 8а1топе11а, ВасШ1, холерный токсин, столбнячный токсоид, ботулинический токсин, токсин сибирской язвы, бактерия, вызывающая чуму; бактерия, вызывающая лептоспироз, и бактерия, вызывающая болезнь Лайма.
Некоторыми примерами патогенных грибов, вызывающих инфекции, поддающиеся лечению способами согласно изобретению, являются Сапб1ба (а1Ысап8, кгикец д1аЬга!а, !горюаШ и т.п.), Сгур!ососси§ пео£огтап§, АкрегдШик (£ит1да!и8, шдег и т.п.,), грибы рода Мисога1е§ (тисог, аЬыб1а, гЫ/орИщ,), 8рого!Нпх ксйепки, В1а§!отусе8 бегтаРРб® РагасосабюМек ЬгакШепык, Сосабюйек 1ттй18 и Нщ!ор1а§та сар§и1а!ит.
Некоторыми примерами патогенных паразитов, вызывающих инфекции, поддающиеся лечению способами согласно изобретению, являются Еп!атоеЬа Н18!о1у!1са, Ва1ап!1бшт сой, Ыаед1епа£оте1еп, АсапШатоеЬа §р., 01агб1а 1атЬ1а, СгурЮ^ропбшт §р., РпеитосуШз сагтл, Р1а§тобшт νίνηχ, ВаЬеыа т1
- 46 017086 сгоГ1, Тгурапокота Ьгисе1, Тгурапокота сги/к Ьещйтата бопоуаш, Тохор1акта допб1 и №ррок1гоп§у1ик ЬгакШепк1к.
Во всех вышеуказанных способах блокада 08Е может быть осуществлена в комбинации с другими формами иммунотерапии, такой как лечение цитокинами (например, интерферонами, СМ-С8Е, С-С8Е, ΙΕ-2) или терапия биспецифическими антителами, которые обеспечивают повышение уровня презентации опухолевых антигенов (см., например, НоШдег (1993) Ргос. №111. Асаб. δα. И8А 90:6444-6448; РоЦак (1994) 81гисГиге 2:1121-1123).
Аутоиммунные реакции
Анти-08Е-антитела могут индуцировать и усиливать аутоиммунные ответы. Действительно, индуцирование противоопухолевых ответов с использованием вакцин на основе опухолевых клеток и пептидов, показало, что многие противоопухолевые ответы вызывают реакции против своего (депигментация, наблюдаемая в меланоме В16, модифицированной антителом против СТЬА-4+СМ-С8Е, уап Е1как еГ а1., см. выше,; депигментация у Тгр-2-вакцинированных мышей (0уетук, V. еГ а1. (1999) Ргос. №Г1. Асаб. δα. И.8.А. 96: 2982-2987); аутоиммунный простатит, индуцируемый противоопухолевыми клеточными вакцинами ТВАМР (ИнглуИ/, А. (2000), см. выше) и вакцинами на основе меланомного пептидного антигена; и витилиго, наблюдаемое в клинических испытаниях с участием человека (ВокепЬегд, 8.А. & \νΐιί№ Э.Е. (1996) 1. ЕптипоШег. Етрйаык Титог Iттипо1. 19 (1): 81-4).
Поэтому блокада 08Е в сочетании с использованием различных аутологичных белков может быть взята за основу при разработке протоколов вакцинации, проводимой для эффективного продуцирования иммунных ответов против указанных аутологичных белков в целях лечения заболевания. Так, например, при болезни Альцгеймера наблюдается неадекватная аккумуляция пептида АЗ в амилоидных отложениях в головном мозге, и удаление таких амилоидных отложений может быть осуществлено под действием антител против амилоида (8сйепк еГ а1., (1999) №11иге 400: 173-177).
Для лечения аллергии и астмы в качестве мишеней могут быть также использованы и другие аутологичные белки, такие как ^Е, а для лечения ревматоидного артрита, могут быть использованы ТОТа. И наконец, гуморальные ответы против различных гормонов могут быть индуцированы анти-08Еантителом. Нейтрализующее антитело, направленное против репродуктивных гормонов, может быть использовано в качестве контрацепции. Возможной целью для вакцинации может быть также ответ, продуцируемый путем вырабатывания нейтрализующего антитела против гормонов и других растворимых факторов, необходимых для роста конкретных опухолей.
Методы, аналогичные методам, описанным выше в случае использования анти-08Е-антитела, могут быть применены в целях индуцирования терапевтических аутоиммунных ответов для лечения пациентов с неадекватной аккумуляцией других аутоантигенов, таких как амилоидные отложения, включая Λβ при болезни Альцгеймера, цитокины, такие как ТНЕа и ^Е.
Вакцины
Анти-08Е-антитела могут быть использованы для стимуляции антигенспецифических иммунных ответов путем введения анти-08Е-антитела в комбинации с представляющим интерес антигеном (например, с вакциной). В соответствии с этим в другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу усиления иммунного ответа на антиген у индивидуума, включающему в себя введение указанному индивидууму: (ί) антигена; и (ίί) анти-08Е-антитела или его антигенсвязывающей части, в целях усиления иммунного ответа на указанный антиген у данного индивидуума. При этом предпочтительным антителом является человеческое антитело против человеческого 08Е (например, любое из описанных здесь человеческих анти-08Е-антител). Дополнительно или альтернативно, таким антителом может быть химерное или гуманизованное антитело. Указанным антигеном может быть, например, опухолевый антиген, вирусный антиген, бактериальный антиген или антиген, происходящий от патогена.
Неограничивающими примерами таких антигенов являются антигены, обсуждаемые в вышеописанных разделах, такие как опухолевые антигены (или противоопухолевые вакцины), обсуждаемые выше, или антигены, происходящие от вирусов, бактерий или других патогенов, описанных выше.
Подходящие способы ш у1уо и ш νίΙΐΌ введения композиций антител (например, человеческих моноклональных антител, мультиспецифических и биспецифических молекул и иммуноконъюгатов) согласно изобретению хорошо известны специалистам и могут быть самостоятельно выбраны средним специалистом в данной области. Так, например, композиции антител могут быть введены путем инъекции (например, внутривенной или подкожной). Подходящие дозы используемых молекул зависят от возраста и массы тела индивидуума, а также от концентрации и/или состава данной композиции антител.
Как было описано ранее, человеческие анти-08Е-антитела согласно изобретению могут быть введены в комбинации с одним или несколькими другими терапевтическими средствами, например, с цитотоксическим средством, радиоактивным токсическими средством или иммуносупрессорным средством. Антитело может быть присоединено к указанному средству (в виде иммунокомплекса), либо оно может быть введено отдельно. В последнем случае (отдельное введение) указанное антитело может быть введено до, во время или после введения указанного средства, либо оно может быть введено в комбинации с проведением другой известной терапии, например противораковой терапии, а именно, лучевой терапии.
- 47 017086
Указанными терапевтическими средствами являются, среди прочих, противоопухолевые средства, такие как доксорубицин (адриамицин), цисплатин, сульфат блеомицина, кармустин, хлорамбуцил и циклофосфамидная соль гидроксимочевины, которые сами по себе являются эффективными только в концентрациях, токсичных или субтоксичных для пациента. Цисплатин вводят внутривенно в количестве 100 мг/мл на дозу один раз в четыре недели, а адриамицин вводят внутривенно в количестве 60-75 мг/мл на дозу один раз через каждые 21 день. Введение человеческих анти-О8Е-антител или их антигенсвязывающих фрагментов согласно изобретению в комбинации с химиотерапевтическими средствами позволяет осуществлять доставку двух противораковых средств, которые действуют по различным механизмам и оказывают цитотоксическое действие на человеческие опухолевые клетки. Такое совместное введение позволяет решать проблемы, связанные с вырабатыванием резистентности к лекарственным средствам или с изменением антигенности опухолевых клеток, которое делает их невосприимчивыми к данному антителу.
Настоящее изобретение относится также к наборам, содержащим композиции антител согласно изобретению (например, человеческих антител, биспецифических или мультиспецифических молекул или иммуноконъюгатов) и инструкции по их применению.
Такой набор может также содержать по меньшей мере один дополнительный реагент или одно или несколько дополнительных человеческих антител согласно изобретению (например, человеческое антитело, обладающее дополнительной активностью, направленной на связывание с эпитопом на антигене О8Е и отличающейся от активности первого человеческого антитела). Обычно такие наборы включают в себя этикетку, на которой приводится инструкция по применению содержимого данного набора. Термин этикетка включает в себя любой текст или отпечатанный материал, наклеенный на упаковку или вложенный в упаковку данного набора, или прилагаемый к данному набору в какой-либо иной форме.
Комбинированная терапия
В одном из вариантов изобретения настоящее изобретение относится к способу лечения гиперпролиферативного заболевания, включающему в себя введение индивидууму антитела против О8Е и антитела против СТЬА-4 и/или РЬ-1. В других вариантах изобретения анти-О8Е-антитело вводят в субтерапевтической дозе, анти-СТЬА-4- и/или анти-РО-1-антитело вводят в субтерапевтической дозе, либо оба этих антитела вводят в субтерапевтической дозе. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к способу подавления побочного эффекта, ассоциированного с лечением гиперпролиферативного заболевания иммуностимулирующим средством, где указанный способ включает в себя введение индивидууму анти-О8Е-антитела и субтерапевтической дозы анти-СТЬА-4- и/или анти-РО-1-антитела. В некоторых вариантах изобретения указанным индивидуумом является человек. В некоторых вариантах изобретения, указанным анти-СТЬА-4-антителом является моноклональное антитело с человеческой последовательностью 10Ό1, а указанным анти-РО-1-антителом является моноклональное антитело с человеческой последовательностью, такие как 17Ό8, 2Ό3, 4Η1, 5С4 и 4А11. Моноклональное антитело с человеческой последовательностью 10Ό1 было выделено и структурно охарактеризовано, как описано в патенте США № 6984720. Моноклональные антитела с человеческой последовательностью 17Ό8 2Ό3, 4Η1, 5С4 и 4А11 были выделены и структурно охарактеризованы, как описано в предварительной заявке на патент США № 60/679466.
Моноклональное анти-О8Е-антитело, моноклональное анти-СТЬА-4-антитело и моноклональное анти-РО-1-антитело (тАЬ) и антитела с человеческой последовательностью согласно изобретению могут быть получены различными методами, включая стандартный метод получения моноклональных антител, например страндартный метод гибридизации соматических клеток, описанный КоЫег и М11к!ет (1975) ΝηΙιιΐΌ 256:495. При этом, может быть применен любой метод получения моноклональных антител, например, метод вирусной или онкогенной трансформации В-лимфоцитов. Одним из животных, используемых для получения гибридом, является мышь. Получение гибридом у мышей является очень хорошо разработанной процедурой. Протоколы и методы иммунизации для выделения иммунизованных спленоцитов, проводимого в целях их последующего слияния, известны специалистам. Партнеры по слиянию (например, клетки мышиной миеломы) и процедуры слияния также известны специалистам (см., например, Ьаг1о^ аиб Ране (1988) АйЛобхек, А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8ргшд ЬагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, Со1б 8ргшд ЬагЬог №\у Уогк).
Комбинация антител может быть использована в целях усиления иммунного ответа для подавления гиперпролиферативного заболевания путем блокирования О8Е и РЬ-1 и/или СТЬА-4. В предпочтительном варианте изобретения антителами согласно изобретению являются человеческие антитела. Так, например, эти молекулы могут быть введены в клеточные культуры, ίη νίίΐΌ или ех у1уо, или человеку, например, ίη νίνΌ, для усиления иммунного ответа в различных ситуациях. В соответствии с этим в одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу модификации иммунного ответа у индивидуума, включающему в себя введение данному индивидууму комбинации антител или комбинации их антигенсвязывающих частей согласно изобретению в целях модификации иммунного ответа у индивидуума. При этом предпочтительно, чтобы такой ответ усиливался, стимулировался или активировался. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к способу устранения побочных эффектов, ассоциированных с лечением гиперпролиферативного заболевания иммуностимулирующим терапевтиче
- 48 017086 ским средством, где указанный способ включает в себя введение индивидууму анти-О8Е-антитело и субтерапевтической дозы анти-СТЬА-4-антитела или анти-РО-1-антитела.
Блокирование О8Е, ΡΌ-1 и СТЬЛ-4 антителами может усиливать иммунный ответ против раковых клеток у пациента. Раковыми опухолями, рост которых может ингибироваться антителами согласно изобретению, являются раковые опухоли, обычно восприимчивые к иммунотерапии. Репрезентативными примерами раковых опухолей, для лечения которых может быть применена комбинированная терапия согласно изобретению, являются меланома (например, метастизирующая злокачественная меланома), рак почек, рак предстательной железы, рак молочной железы, рак толстой кишки и рак легких. Примерами других раковых заболеваний, которые могут быть подвергнуты лечению способами согласно изобретению, являются рак кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы и шеи, злокачественная меланома кожи или внутриглазная мелонома, рак матки, рак яичника, рак прямой кишки, рак заднего прохода, рак желудка, рак яичек, рак матки, карцинома фаллопиевых труб, карцинома эндометрия, карцинома шейки матки, карцинома влагалища, карцинома вульвы, болезнь Ходжкина, не-ходжкинская лимфома, рак пищевода, рак тонкого кишечника, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак коры надпочечника, саркома мягких тканей, рак уретры, рак пениса, хронический или острый лейкоз, включая острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, солидные опухоли у детей, лимфоцитарная лимфома, рак мочевого пузыря, рак почек или мочеточника, карцинома почечной лоханки, опухоль центральной нервной системы (ЦНС), первичная лимфома ЦНС, опухолевый ангиогенез, опухоль позвоночника, глиома ствола головного мозга, аденома гипофиза, саркома Капоши, эпидермоидный рак, плоскоклеточный рак, Т-клеточная лимфома, раковые опухоли, индуцируемые влиянием окружающей среды, включая раковые опухоли, индуцируемые асбестом, и комбинации указанных раковых опухолей. Настоящее изобретение может быть также применено для лечения метастазов рака.
В некоторых вариантах изобретения обсуждаемая здесь комбинация терапевтических антител может быть введена одновременно в виде одной композиции в фармацевтически приемлемом носителе или одновременно в виде отдельных композиций каждого антитела в фармацевтически приемлемом носителе. В другом варианте изобретения такая комбинация терапевтических антител может быть введена последовательно. Так, например, анти-О8Е-антитело и анти-РО-1-антитело могут быть введены последовательно, например, сначала может быть введено анти-О8Е-антитело, а затем анти-РО-1-антитело. либо сначала может быть введено анти-РП-1-антитело, а затем анти-О8Е-антитело. Кроме того, в случае последовательного введения более чем одной дозы комбинации терапевтических средств, порядок такого введения может быть обратным или одним и тем же для каждого времени введения, при этом последовательное введение может быть объединено с одновременным введением, либо оно может быть осуществлено в любой другой комбинации. Так, например, первое введение может быть осуществлено путем одновременного введения анти-О8Е-антитела и анти-РО-1-антитела в комбинации друг с другом, при втором введении, сначала может быть введено анти-О8Е-антитело, а затем анти-РП-1-антитело, а при третьем введении сначала может быть введено анти-РП-1-антитело, а затем анти-О8Е-антитело и т.п. Другая репрезентативная схема может включать первое введение, при котором сначала вводят анти-РЭ-1антитело, а затем анти-О8Е-антитело, а во втором и последующих введениях эти антитела вводят одновременно.
Кроме того, комбинация анти-О8Е-антитела и анти-СТЬЛ-4-антитела и/или анти-РП-1-антитела может быть объединена, но необязательно, с иммуногенным средством, таким как раковые клетки, очищенные опухолевые антигены (включая рекомбинантные белки, пептиды и углеводные молекулы), клетки и клетки, трансфицированные генами, кодирующими иммуностимулирующие цитокины (Не е! а1. (2004) I. 1ттипо1. 173:4919-28). Неограничивающими примерами опухолевых вакцин, которые могут быть использованы, являются вакцины на основе пептидов меланомных антигенов, таких как пептиды др100, антигены МА0Е, Тгр-2, МАКТ1 и/или тирозиназа, или опухолевые клетки, трансфицированные для экспрессии цитокина 0М-С8Р (более подробно обсуждаемого ниже).
Блокирование всех О8Е и РЭ-Ι и/или СТЬА-4 может быть также объединено с вакцинацией. Было разработано много экспериментальных стратегий вакцинации против опухолей (см. КокепЬегд, 8. (2000) Оеуе1ор1пеп1 оГ Сапсег Уассшек, А8СО Ебисайопа1 Воок 8рппд: 60-62; ЬодоШекк, С, 2000, А8СО Ебиса0опа1 Воок 8рппд: 300-302; Ккауа!, Ό. (2000) А8СО Ебисакопа1 Воок 8рппд: 414-428; Рооп, К. (2000) А8СО Ебисакопа1 Воок 8рппд: 730-738; см. также КекШо апб 8хпо1, Сапсег Уасстек, Ск. 61, рр. 30233043 т Эе Ука е! а1 (ебк.), 1997, Сапсег: Рг1пс1р1ек апб Ргасксе оГ Опсо1оду. Р1йк Ебйюп). В одной из этих стратегий вакцину получают с использованием аутологичных или аллогенных опухолевых клеток. Было показано, что такие клеточные вакцины являются наиболее эффективными при введении опухолевых клеток, трансдуцирующих экспрессию 0М-С8Р. Было показано, что 0М-С8Р является сильным активатором презентации антигена, необходимой для противоопухолевой вакцинации (ЭгапоГГ е! а1. (1993) Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8ск И.8.А. 90: 3539-43).
Исследования характера экспрессии генов и крупномасштабной экспрессии генов в различных опухолях позволили выявить так называемые опухолеспецифические антигены (КокепЬегд (1999) 1ттипбу 10:281-7). Во многих случаях такими опухолеспецифическими антигенами являются антигены диффе
- 49 017086 ренцировки, экспрессируемые в опухолях и в клетках, от которых происходит данная опухоль, например, антигены меланоцитов др100, антигены МА0Е и Тгр-2. И что более важно, было показано, что многие из этих антигенов являются мишенями для опухолеспецифических Т-клеток, присутствующих у хозяина. В некоторых вариантах изобретения блокирование всех О8Е и РЬ-1 и/или СТЬА-4 может быть осуществлено с применением описанных здесь композиций антител в комбинации с набором рекомбинантных белков и/или пептидов, экспрессируемых в опухоли, в целях вырабатывания иммунного ответа на эти белки. Указанные белки обычно воспринимаются иммунной системой как аутоантигены, а поэтому она является толерантной к ним. Опухолевым антигеном может быть также протеин-теломераза, необходимая для синтеза теломер в хромосомах и экспрессирующаяся в более чем 85% человеческих раковых опухолей, и лишь в ограниченном числе соматических тканей (К1т е! а1. (1994) 8с1епсе 266: 2011-2013). (Эти соматические ткани могут быть защищены от иммунной атаки различными методами). Опухолевыми антигенами могут быть также нео-антигены, экспрессируемые в раковых клетках вследствие соматических мутаций, которые приводят к изменению последовательности белка или к образованию гибридных белков между двумя неродственными последовательностями (то есть Ьсг-аЬ1 в хромосоме РЫ1айе1рЫа) или идиотипа В-клеточных опухолей.
Другие противоопухолевые вакцины могут включать белки вирусов, участвующих в развитии рака у человека, таких как человеческие папиломавирусы (НРУ), вирусы гепатита (НВУ и НСУ) и герпесвирус, вызывающий саркому Капоши (КН8У). Другой формой опухолеспецифического антигена, который может быть использован в комбинации с блокадой О8Е, является очищенный белок теплового шока (Н8Р), выделенный из самой опухолевой ткани. Такие белки теплового шока содержат фрагменты белков, происходящих от опухолевых клеток, и такие Н8Р являются в высокой степени эффективными при их доставке к антиген-презентирующим клеткам для вырабатывания противоопухолевого иммунитета (8ио! & 8пуа51ауа (1995) 8с1епсе 269:1585-1588; Татига е! а1. (1997) 8аепсе 278:117-120).
Дендритные клетки (ДК) являются высокоэффективными антиген-презентирующими клетками, которые могут быть использованы для индуцирования антигенспецифического ответа. ДК могут быть продуцированы ех νίνο и нагружены различными белковыми и пептидными антигенами, а также опухолевыми клеточными экстрактами (ЫекЙе е! а1. (1998) Ыа!иге Мейюте 4: 328-332). ДК могут быть также трансдуцированы генетическими методами для экспрессии этих опухолевых антигенов. ДК были также подвергнуты прямому слиянию с опухолевыми клетками в целях иммунизации (Кид1ег е! а1. (2000) Ыа!иге Мейюте 6:332-336). В методе вакцинации для активации более сильных противоопухолевых ответов, иммунизация с использованием ДК может быть также с успехом объединена с блокированием всех О8Е и РЬ-1 и/или СТЬА-4.
Блокирование всех О8Е и РЬ-1 и/или СТЬА-4 может быть также объединено со стандартной противораковой терапией. Так, например, блокирование всех О8Е и РЬ-1 и/или СТЬА-4 может быть с успехом объединено с химиотерапией. В этих случаях, как наблюдается при использовании комбинации антиО8Е-антитела и анти-СТЬА-4-антитела и/или анти-РП-1-антитела, доза другого химиотерапевтического реагента, вводимого в комбинации согласно изобретению, может быть уменьшена (Мокуг е! а1. (1998) Сапсег КекеагсЬ 58: 5301-5304). Помимо комбинированной терапии с применением блокады О8Е и РЬ-1 и/или СТЬА-4 и химиотерапии, существует и другой научный подход, основанный на том, что гибель клеток, которая является следствием цитотоксического действия большинства химиотерапевтических соединений, должна приводить к повышению уровней опухолевого антигена на пути презентации антигена. Другой комбинированной терапией, которая может давать синергический эффект в сочетании с блокированием О8Е и РЬ-1 и/или СТЬА-4 и, тем самым, приводить к гибели клеток, является лучевая терапия, хирургическая операция или антигормональная терапия. Каждая из этих стратегий позволяет создавать источник опухолевого антигена у хозяина. Блокирование О8Е и РЬ-1 и/или СТЬА-4 может быть также объединено с ингибированием ангиогенеза. Ингибирование ангиогенеза приводит к гибели опухолевых клеток, которые могут направлять опухолевый антиген на путь презентации антигена хозяина.
Комбинация антител, блокирующих О8Е и РЬ-1 и/или СТЬА-4, может быть также использована в комбинации с биспецифическими антителами, которые направляют эффекторные клетки, экспрессирующие Еса- или Εсγ-рецепторы, к опухолевым клеткам (см., например, патенты США №№ 5922845 и 5837243). Биспецифические антитела могут быть использованы для доставки двух отдельных антигенов. Так, например, биспецифические антитела против Ес-рецептора/опухолевого антигена (например, Нег2/пеи) были использованы для доставки макрофагов в участки, пораженные опухолью. Такая направленная доставка может более эффективно активировать опухоль-специфические ответы.
Блокирование всех О8Е и РЬ-1 и/или СТЬА-4 должно приводить к увеличению Т-клеточной составляющей этих ответов.
Альтернативно, использование биспецифических антител, которые связываются с опухолевым антигеном и со специфическим маркером поверхности дендритных клеток, позволяет осуществлять непосредственную доставку антигена к ДК.
В другом примере, комбинация анти-РЬ-1- и анти-СТЬА-4-антител может быть использована в со
- 50 017086 четании с противоопухолевыми антителами. такими как КИихап® (ритуксимаб), Негсерйп® (трастузумаб). Веххаг® (тозитумомаб), 2еуа1ш® (ибритумомаб), Сатра!к® (алемтузумаб), Ьутркоабе® (эпртузумаб), Дуайт® (бевацизумаб) и Тагсеуа® (эрлотиниб) и т.п. Так, например. не ограничиваясь какойлибо теорией. следует отметить. что лечение противораковым антителом или конъюгированным с токсином противораковым антителом может приводить к гибели раковых клеток (например. опухолевых клеток), что должно усиливать иммунный ответ. опосредуемый 08Е, СТЬЛ-4 или РИ-1. В конкретном варианте изобретения. лечение гиперпролиферативного заболевания (например. раковой опухоли) может предусматривать использование противоракового антитела в комбинации с анти-08Е-антителом и антиРЭ-1-антителом и/или анти-СТЬЛ-4-антителом, вводимых одновременно или последовательно. или в любой другой комбинации. которая может усиливать противоопухолевые иммунные ответы у хозяина.
Ускользание опухолей от иммунного надзора хозяина происходит по различным механизмам широкого ряда. Многие из этих механизмов могут быть устранены путем инактивации белков. которые экспрессируются опухолями и являются иммуносупрессорными. Такими белками. среди прочих. являются Т6Р-бета (Кекг1. 1. е! а1. (1986) 1. Ехр. Меб. 163: 1037-1050), 1Й-10 (Нотеагб. М. & 0'6агга. А. (1992) 1ттипо1оду Тобау 13: 198-200) и лиганд Рак (Накпе. М. е! а1. (1996) 8с1епсе 274: 13 63-1365). В другом примере. антитела против каждой из этих молекул могут быть использованы в комбинации с анти-08Еантителом и анти-РЭ-1-антителом и/или анти-СТЬА-4-антителом для подавления действия иммуносупрессорного агента и индуцирования благоприятных противоопухолевых иммунных ответов у хозяина.
Другие антитела. которые могут активировать иммунные ответы у хозяина. могут быть использованы в комбинации с анти- 08Е-антителом и анти-РИ-1-антителом и/или анти-СТЕА-4-антителом. Такими антителами являются молекулы. присутствующие на поверхности дендритных клеток и активирующие функцию ДК и презентацию антигена. Анти-СО40-антитела могут служить эффективной заменой активности Т-хелперных клеток (К1бде. Р е! а1. (1998) №Шге 393: 474-478), и было обнаружено. что они являются эффективными при их использовании в сочетании с анти-СТЬА-4-антителом (Йо. N. е! а1. (2000) 1ттипоЬю1оду 201 (5) 527-40). Активирующие антитела против Т-клеточных костимулирующих молекул. таких как 0Х-40 (УетЬегд. А. е! а1. (2000) 1ттипо1. 164: 2160-2169), 4-1ВВ (Ме1его. I. е! а1. (1997) Ыатге Мебтте 3: 682-685 (1997). ΓΌ-1 (бе1 Кт е! а1. (2005) Еиг. 1. 1ттипо1. 35:3545-60) и 1С08 (НиЙоГГ, А. е! а1. (1999) №Шге 397: 262-266), могут быть также использованы для повышения уровней активации Т-клеток.
В настоящее время для лечения различных опухолей гемопоэтической системы применяется трансплантация костного мозга. Хотя осложнением такого лечения может быть реакция трансплантат против хозяина. однако в результате вырабатывания у хозяина ответа трансплантат против опухоли может быть достигнут положительный терапевтический эффект. Блокирование всех 08Е и РЭ-1 и/или СТЬА-4 может быть использовано для повышения эффективности трансплантированных донорных опухольспецифических Т-клеток.
Было также разработано несколько экспериментальных стратегий лечения. которые предусматривают активацию ех у1уо, экспансию антигенспецифических Т-клеток и адоптивный перенос этих клеток реципиенту для вырабатывания у него антигенспецифического Т-клеточного противоопухолевого ответа (6геепЬегд, К. & К1ббе11, 8. (1999) 8с1епсе 285: 546-51). Эти методы могут быть также применены для активации Т-клеточных ответов на инфекционные агенты. такие как СМУ. Можно предположить. что ех У1уо активация в присутствии анти-08Е-антитела и анти-РО-1-антитела и/или анти-СТЕА-4-антитела будет увеличивать число и активность адаптивно перенесенных Т-клеток.
После проведения терапии иммуностимулирующими терапевтическими антителами. а именно. после лечения анти-СТЬА-4-антителом, указанные ниже органы могут вырабатывать ассоциированные с иммунным ответом побочные эффекты. такие как диарея и колит (в желудочно-кишечном тракте). и сыпь и зуд (на коже). Так. например. после лечения анти-СТЬА-4-антителом ассоциированные с иммунным ответом побочные эффекты в желудочно-кишечном тракте. за исключением ободочной кишки. также наблюдались в пищеводе (эзофагит). в двенадцатиперстной кишке (дуоденит) и в подвздошной кишке (илеит).
В некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к способу устранения побочных эффектов. ассоциированных с лечением гиперпролиферативного заболевания иммуностимулирующим средством. где указанный способ включает в себя введение индивидууму анти-08Е-антитела и субтерапевтической дозы анти-СТЬА-4-антитела. Так. например. настоящее изобретение относится к способу снижения частоты возникновения колита или диареи. индуцированных иммуностимулирующим терапевтическим антителом. где указанный способ включает в себя введение пациенту неабсорбируемого стероида. Поскольку у любого пациента. подвергаемого лечению иммуностимулирующим терапевтическим антителом. имеется риск развития колита или диареи. индуцированных введением такого антитела. то это означает. что терапия с применением способов согласно изобретению может оказаться эффективной для всего населения. Хотя стероиды были введены для лечения воспалительного заболевания кишечника (ВЗК) и для предупреждения осложнений при ВЗК. однако они не были использованы для предупреждения развития ВЗК (снижения частоты развития ВЗК) у пациентов. у которых ранее не было диагностиро
- 51 017086 вано ВЗК. Серьезные побочные эффекты, ассоциированные с введением стероидов, и даже с введением неабсорбируемых стероидов, не позволяют использовать их в профилактических целях.
В других вариантах изобретения, блокирование всех О8Е и РЭ-1 и/или СТЬА-4 (т.е. использование иммуностимулирующих терапевтических антител против О8Е и РЭ-1 и/или СТЬЛ-4) может быть также объединено с применением любых неабсорбируемых стероидов. Используемый здесь термин неабсорбируемый стероид означает глюкокортикоид, который сначала проходит интенсивный первый путь метаболизма, то есть после метаболизма в печени, биологическая доступность такого стероида становится низкой, то есть менее чем примерно 20%. В одном из вариантов изобретения неабсорбируемым стероидом является будезонид. Будезонид представляет собой глюкокортикостероид местного действия, который после перорального введения подвергается интенсивному метаболизму, главным образом, в печени. ЕЭТОСОКТ ЕС® (Л81га-2епееа) представляет собой пероральный препарат будезонид, действие которого зависит от рН- и от времени введения, и который был разработан для оптимизации доставки лекарственного средства в подвздошную кишку и через толстую кишку. В США, ЕЭТОСОКТ ЕС® был разрешен к применению для лечения болезни Крона легкой или средней тяжести, поражающей подвздошную кишку и/или восходящую толстую кишку. Обычно, пероральная доза препарата ЕNТОСОКТ ЕС® для лечения болезни Крона составляет 6-9 мг/день. ЕКГОСОКТ ЕС® высвобождается в тонкий кишечник, а затем адсорбируется и остается в слизистой кишечника. После прохождения через нужную ткань слизистой кишечника, ЕКГОСОКТ ЕС® подвергается интенсивному метаболизму под действием системы цитохрома Р450 в печени, в результате чего образуются метаболиты, обладающие незначительной глюкокортикоидной активностью. Поэтому его биологическая доступность является низкой (примерно 10%). Низкая биологическая доступность будезонида обеспечивает лучший терапевтический индекс по сравнению с другими глюкокортикоидами с менее интенсивным первым этапом метаболизма. Будезонид дает меньшие побочные эффекты, включая меньшую степень подавления функции гипоталамуса-гипофиза, чем кортикостероиды системного действия. Тем не менее, постоянное введение ЕNТОСОКТ ЕС® может приводить к развитию системных глюкокортикоидных эффектов, таких как гиперкортицизм и подавление функций надпочечников. См., РОК 58!Н е'. 2004; 608-610.
В других вариантах изобретения блокирование комбинации О8Е и РЭ-1 и/или СТЬЛ-4 (то есть иммуностимулирующими терапевтическими анти-О8Е-антителом и анти-РО-1-антителом и/или антиСТЬЛ-4-антителом), осуществляемое в сочетании с неабсорбируемым стероидом, может быть также проведено в сочетании с салицилатом. Салицилатами являются соединения 5-А8А, такие как, например: сульфасалазин (Л2иЬРГО1№®, РНагтае1а & Ир1оЬп); олсалазин (П1РЕ№ТиМ®, РНагтае1а & Ир1оЬп); балсалазид (СОЕА2ЛЬ®, 8а11х РЬагтаееиЕеак, 1пе.) и мезаламин (А8АСОЬ®, Ргое!ег & ОатЫе РНагтаееиЕеак; РЕЭТА8А®, 8Ыге И8; САNА8А®, Ахеап 8еап'1рЬагт, 1пе.; ^νΑδΑ®, 8окау).
В способах согласно изобретению для снижения числа случаев возникновения колита, индуцированного иммуностимулирующими антителами, введение салицилата в комбинации с анти-О8Еантителом и анти-РЭ-1 -антителом и/или с анти-СТЕА-4-антителом и неабсорбируемым стероидом может быть осуществлено путем почти одновременного или последовательного введения салицилата и неабсорбируемого стероида. Так, например, в соответствии с настоящим изобретением способы снижения числа случаев возникновения колита, индуцированного иммуностимулирующими антителами, охватывают введение салицилата и неабсорбируемого стероида одновременно или последовательно (например, салицилат вводят через 6 ч после введения неабсорбируемого стероида) или в любом другом порядке. Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением, салицилат и неабсорбируемый стероид могут быть введены одним и тем же способом (например, они оба могут быть введены перорально) или различными способами (например, салицилат вводят перорально, а неабсорбируемый стероид вводят ректально), которые могут отличаться от способа(ов) введения анти-О8Е-антитела, анти-РО-1-антитела и анти-СТЬА-4-антитела.
Композиции согласно изобретению (например, человеческие антитела, мультиспецифические и биспецифические молекулы и иммуноконъюгаты), имеющие комплемент-связывающие сайты, такие как части, происходящие от 1дС1, -2 или -3 или 1дМ, которые связываются с комплементом, могут быть также использованы в присутствии комплемента. В одном из вариантов изобретения ех νί\Ό обработка популяции клеток, содержащей клетки-мишени, связывающим агентом согласно изобретению и соответствующими эффекторными клетками, может быть осуществлена вместе с введением комплемента или комплемент-содержащей сыворотки. Фагоцитоз клеток-мишеней, покрытых связывающим агентом согласно изобретению, может быть усилен посредством связывания с белками комплемента. В другом варианте изобретения клетки-мишени, покрытые указанными композициями согласно изобретению (например, человеческими антителами, мультиспецифическими и биспецифическими молекулами), могут быть также подвергнуты лизису под действием комплемента. В еще одном варианте изобретения указанные композиции согласно изобретению не активируют комплемент.
Композиции согласно изобретению (например, человеческие антитела, мультиспецифические и биспецифические молекулы и иммуноконъюгаты) могут быть также введены в комбинации с комплементом. В соответствии с этим в объем настоящего изобретения входят композиции, содержащие чело
- 52 017086 веческие антитела, мультиспецифические и биспецифические молекулы, и сыворотку или комплемент. Эти композиции имеют то преимущество, что в них указанный комплемент локализован в непосредственной близости от человеческих антител, мультиспецифических и биспецифических молекул. Альтернативно, человеческие антитела, мультиспецифические и биспецифические молекулы согласно изобретению и комплемент или сыворотка могут быть введены отдельно.
В соответствии с этим пациентам, подвергаемым лечению композициями антител согласно изобретению, может быть дополнительно введено (до, во время или после введения человеческого антитела согласно изобретению) другое терапевтическое средство, такое как цитотоксическое или радиотоксическое лекарственное средство, которое усиливает или улучшает терапевтический эффект человеческого антитела.
В других вариантах изобретения индивидуум может быть также подвергнут лечению средством, которое модулирует, например, усиливает или ингибирует экспрессию или активность Ρсγ или рецепторов Ρсγ, например, путем введения указанному индивидууму цитокина. Предпочтительными цитокинами, подходящими для введения пациенту во время его лечения мультиспецифическими молекулами, являются гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (0-С8Р), гранулоцитарный-макрофагальный колониестимулирующий фактор (0М-С8Р), интерферон-γ (ΙΕΝ-γ) и фактор некроза опухоли (Т№).
Композиции согласно изобретению (например, человеческие антитела, мультиспецифические и биспецифические молекулы) могут быть также использованы для нацеливания на клетки, экспрессирующие ΡсγЯ или О8Е, например, для мечения этих клеток. Для такого применения, связывающий агент может быть присоединен к молекуле, которая может быть детектирована. Так, например, настоящее изобретение относится к способам определения локализации ех νί\Ό или ш ν 11го клеток, экспрессирующих Рс-рецепторы, такие как ΡсγЯ, или О8Е. Такими детектируемыми метками могут быть, например, радиоизотоп, флуоресцентное соединение, фермент или кофермент.
В своем конкретном варианте настоящее изобретение относится к способам детектирования присутствия антигена О8Е в образце, включающим в себя контактирование указанного образца и контрольного образца с человеческим моноклональным антителом или с его антигенсвязывающей частью, которые специфически связываются с О8Е, в условиях, благоприятствующих образованию комплекса между антителом или его частью и О8Е. Затем проводят анализ на образование комплекса, где различия в образовании комплекса в тест-образце по сравнению с контрольным образцом указывают на присутствие антигена О8Е в данном образце.
В других своих вариантах настоящее изобретение относится к способам лечения О8Еопосредуемого расстройства у индивидуума.
В еще одном варианте изобретения иммуноконъюгаты согласно изобретению могут быть использованы для доставки соединений (например, терапевтических средств, меток, цитотоксинов, радиотоксинов, иммунодепрессантов и т.п.) в клетки, имеющие на своей поверхности рецепторы для О8Е, посредством связывания этих соединений с антителом. Так, например, анти-О8Е-антитело может быть конъюгировано с ИРТ, как описано в заявках на патенты США №№ 10/160972, 10/161233, 10/161234, 11/134826, 11/134685 и в предварительной заявке на патент США № 60/720499, и/или с любыми токсинсодержащими соединениями, описанными в патентах США №№ 6281354 и 6548530, в публикациях заявок на патенты США №№ 20030050331, 20030064984, 20030073852 и 20040087497 или в опубликованной заявке \¥О 03/022806, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Таким образом, настоящее изобретение относится также к способам определения локализации ех νί\Ό или 1п νί\Ό клеток, экспрессирующих О8Е (например, с использованием детектируемой метки, такой как радиоизотоп, флуоресцентное соединение, фермент или кофермент). Альтернативно, иммуноконъюгаты могут быть использованы для уничтожения клеток, имеющих на своей поверхности рецепторы для О8Е, путем нацеливания на О8Е цитотоксинов или радиотоксинов.
Настоящее изобретение подробно проиллюстрировано на нижеследующих примерах, которые не должны рассматриваться как ограничение изобретения. Описание всего графического материала и всех публикаций, патентов и опубликованных патентных заявок, цитируемых в настоящей заявке, во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Примеры
Пример 1.
Получение человеческих моноклональных антител против О8Е.
В этом примере описано получение человеческих моноклональных антител, которые специфически связываются с человеческим О8Е (также обозначаемым В7Н4, В781 и В7х).
Антиген
Клетки СНО и НЕК-293 трансфицировали О8Е стандартными рекомбинантными методами трансфекции и использовали в качестве антигена для иммунизации. Кроме того, в качестве антигена для иммунизации был также использован лишь один рекомбинантный О8Е.
Трансгенные мыши НиМАЬ® и КМ®
Полностью человеческие моноклональные антитела против О8Е продуцировали с использованием
- 53 017086 штаммов НСо7 и НСо12 трансгенных мышей НиМАЬ® и штамма трансгенных трансхромосомных мышей КМ, у которых экспрессируются гены человеческих антител. У мышей каждого из этих штаммов эндогенный ген мышиной легкой цепи каппа был подвергнут гомозиготной дизрупции как описано в публикации СНеп е! а1. (1993) ЕМВО 1. 12:811-820, а эндогенный ген мышиной тяжелой цепи был подвергнут гомозиготной дизрупции как описано в примере 1 опубликованной заявки РСТ XVО 01/09187. Каждый из этих мышиных штаммов несет человеческий трансген легкой цепи каппа, КСо5, описанный в публикации Р1з<11й е! а1. (1996) Ыа!иге В1о!есйио1оду 14:845-851. Штамм НСо7 несет трансген человеческой тяжелой цепи НСо7, описанный в патентах США №№ 5545806; 5625825 и 5545807. Штамм НСо12 несет трансген человеческой тяжелой цепи НСо12, описанный в примере 2 публикации заявки РСТ VО 01/09187. Мыши КМ® содержат трансхромосому 8С20, описанную в опубликованной заявке РСТ VО 02/43478.
Иммунизация мышей НиМАЬ и КМ
Для продуцирования полностью человеческих моноклональных антител против О8Е, мышей НиМАЬ® и КМ® иммунизировали О8Е-трансфицированными клетками СНО, О8Е-трансфицированными клетками НЕК293 и/или очищенным рекомбинантным белком О8Е. Общие схемы иммунизации мышей НиМаЬ® описаны в публикациях ЬопЬегд, Ы. е! а1. (1994) Ыа!иге 368(6474): 856-859; Р1з<11й, Ό. е! а1. (1996) Ыа!иге В1о!есНпо1оду 14: 845-851, и в публикации заявки РСТ VО 98/24884. После первого введения антигена возраст мышей составлял 6-16 недель. Очищенный рекомбинантный препарат (5-50 мкг) белка О8Е использовали для иммунизации мышей НиМаЬ™ и мышей КМ™ .
Трансгенные мыши были два раза иммунизованы антигеном в полном адъюванте Фрейнда, либо внутрибрюшинно (1.р.), либо подкожно (з.с.), а затем через 3-21 день, этих мышей иммунизировали 1.р. или з.с. (всего 11 иммунизации) антигеном в неполном адъюванте Фрейнда. Мониторинг иммунного ответа проводили путем взятия крови из ретроорбитальной области. Плазму скринировали с помощью ЕЫ8А (как описано ниже), и мышей с достаточным титрами человеческого анти-О8Е иммуноглобулина использовали для дальнейшей процедуры слияния клеток. За 3 и 2 дня до умерщвления мышам внутривенно вводили бустер-дозу антигена, а затем удаляли селезенку. Обычно проводили 10-35 слияний для каждого антигена. Несколько дюжин мышей иммунизировали каждым из указанных антигенов.
Отбор мышей НиМаЬ™ или КМ™ , продуцирующих анти-О8Е-антитела
Для отбора мышей НиМаЬ™ или КМ™ , продуцирующих антитела, которые связываются с О8Е, сыворотку, взятую от иммунизованных мышей, тестировали с помощью ЕЬ18А, как описано в публикации Р1з<11й, Ό. е! а1. (1996) (см. выше). Вкратце, на микротитрационные планшеты наносили очищенный рекомбинантный О8Е при концентрации 1-2 мкг/мл в РВ8, 50 мкл/лунку, инкубировали при 4°С в течение ночи, а затем блокировали 200 мкл/лунку 5% куриной сыворотки в РВ8/твине (0,05%). В каждую лунку добавляли разведения плазмы, взятой у О8Е-иммунизованных мышей, и инкубировали в течение 1-2 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали РВ8/твином, а затем инкубировали с козьим поликлональным Рс-антителом против человеческого 1дО, конъюгированным с пероксидазой хрена (ПХ), в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки, планшеты проявляли субстратом АБТ8 (81дта, А-1888, 0,22 мг/мл) и анализировали на спектрофотометре при ОЭ 415-495. Мышей, у которых наблюдались самые высокие титры анти-О8Е-антител, использовали для процедуры слияния клеток. Слияние проводили как описано ниже, и супернатанты гибридом анализировали на активность антиО8Е-антитела с помощью ЕЬ18А и РАС8.
Получение гибридом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела против О8Е
Мышиные спленоциты, выделенные у мышей НиМаЬ™ и КМ™ , были связаны с ПЭГ и подвергнуты слиянию с мышиной миеломной клеточной линией в соответствии со стандартными протоколами на основе ПЭГ. Полученные гибридомы скринировали на продуцирование антигенспецифических антител. Моноклеточные суспензии лимфоцитов селезенки, выделенных у иммунизованных мышей, подвергали слиянию с 1/4 от всех не секретирующих антитело мышиных миеломных клеток 8Р2/0 (АТСС, СКЬ 1581), связанных с 50% ПЭГ (81дта). Клетки высевали в количестве приблизительно 1х 105 на лунку в плоскодонный микротитрационный планшет, а затем инкубировали в течение примерно двух недель в селективной среде, содержащей 10% фетальную бычью сыворотку (Нус1опе, Ьодап, ИТ), 10% Р388В1кондиционированную среду (АТСС, СКЬ Т1В-63), 3-5% Опдеп (1ОЕЫ) в ЭМЕМ (Мей1а!есН, СКЬ 10013, с высоким содержанием глюкозы, Ь-глутамина и пирувата натрия), а также 5 мМ НЕРЕ8, 0,055 мМ 2меркаптоэтанола, 50 мг/мл гентамицина и 1хНАТ (81дта, СКЬ Р-7185). Через 1-2 недели клетки культивировали в среде, в которой среда НАТ была заменена средой НТ. Затем отдельные лунки скринировали с помощью ЕЫ8А или РАС8 (как описано выше) на человеческие моноклональные анти-О8Е-антитела 1дО. После этого, позитивные клоны скринировали на О8Е-позитивные антитела против рекомбинантного белка О8Е с помощью ЕЫ8А или против О8Е-экспрессирующих клеток, например О8Етрансфицированных клеток СНО, с помощью РАС8. Вкратце, свежие О8Е-экспрессирующие клетки собирали из колб для культивирования ткани и получали моноклеточную суспензию. Суспензии О8Еэкспрессирующих клеток окрашивали первым антителом либо непосредственно, либо после фиксации с 1% параформальдегидом в РВ8. Приблизительно один миллион клеток ресуспендировали в РВ8, со
- 54 017086 держащем 0,5% В8А и 50-200 мкг/мл первого антитела, а затем инкубировали на льду в течение 30 мин. Клетки два раза промывали РВ8, содержащим 0,1% В8А, 0,01% NаNз, ресуспендировали в 100 мкл разведенного 1:100 ФИТЦ-конъюгированного козьего антитела против человеческих ^0 (1асккоп IттипоВекеагсР, Vек! Ого^'е, РА) и инкубировали на льду в течение еще 30 мин. Затем клетки снова два раза промывали, ресуспендировали в 0,5 мл промывочного буфера и анализировали на флуоресцентное окрашивание на цитометре РАСЗСаРЬиг (Вес!оп-О1скшкоп, Зап .Токе, СА).
После интенсивного роста гибридомы, обычно через 10-14 дней, проводили мониторинг среды. Антитело-секретирующие гибридомы были повторно засеяны и снова скринированы, и при получении положительного результата на человеческий ^0, моноклональные анти-08Е-антитела субклонировали по меньшей мере два раза путем лимитирующего разведения. Затем стабильные субклоны культивировали 1п νίΙΐΌ в среде для культивирования тканей с получением небольших количеств антитела для их дополнительной характеризации.
Для последующего анализа отбирали гибридомные клоны 1011, 2А7, 2Р9, 12Е1 и 13Ό12.
Пример 2. Структурная характеризация человеческих моноклональных антител 1011, 2А7, 2Р9, 12Е1 и 13Ό12
В этом примере описан анализ последовательностей пяти (5) человеческих моноклональных антител, специфически связывающихся с 08Е.
Последовательности кДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей моноклональных антител 1011, 2А7, 2Р9, 12Е1 и 13Ό12, были получены из гибридом 1011, 2А7, 2Р9, 12Е1 и 13Ό12, соответственно, с применением стандартной ПЦР-технологии, и были секвенированы стандартными методами секвенирования ДНК.
Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела 1011 представлены на фиг. 1А и в 8Е0 ΙΌ N0: 41 и 1, соответственно.
Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи антитела 1011 представлены на фиг. 1В и в 8Е0 ΙΌ N0: 46 и 6, соответственно.
Сравнение последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина 1011 с известными последовательностями тяжелой цепи иммуноглобулина человеческой зародышевой линии показало, что в тяжелой цепи 1011 присутствует сегмент ν^ происходящий от νμ 4-34 человеческой зародышевой линии. Сопоставление путем выравнивания последовательности νυ 1011 с последовательностью ν 4-34 зародышевой линии продемонстрировано на фиг. 6. Дополнительный анализ последовательности νυ 1011 с использованием системы Кэбата для определения локализации СОВ-области позволил идентифицировать области СОВ1, СЭВ2 и СЭВ3 тяжелой цепи, показанные на фиг. 1А и 6 и в 8Е0 ΙΌ N0: 11, 16 и 21, соответственно.
Сравнение последовательности легкой цепи иммуноглобулина 1011 с известными последовательностями легкой цепи иммуноглобулина человеческой зародышевой линии показало, что в легкой цепи 1011 присутствует сегмент ν^ происходящий от УкА27 человеческой зародышевой линии. Сопоставление путем выравнивания последовательности ν 1011 с последовательностью ^А27 зародышевой линии продемонстрировано на фиг. 9. Дополнительный анализ последовательности ν 1011 с использованием системы Кэбата для определения локализации СОВ-области позволил идентифицировать области СОВ1, СЭВ2 и СЭ3 легкой цепи, показанные на фиг. 1В и 9 и в 8Е0 ΙΌ N0: 26, 31 и 36, соответственно.
Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела 2А7 представлены на фиг. 2А и в 8Е0 ΙΌ N0: 42 и 2, соответственно.
Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи антитела 2А7 представлены на фиг. 2В и в 8Е0 ΙΌ N0: 47 и 7, соответственно.
Сравнение последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина 2А7 с известными последовательностями тяжелой цепи иммуноглобулина человеческой зародышевой линии показало, что в тяжелой цепи 2А7 присутствует сегмент ν^ происходящий от 3-53 человеческой зародышевой линии, и сегмент Ш, происходящий от Ш6Ь человеческой зародышевой линии. Сопоставление путем выравнивания последовательности νμ 2А7 с последовательностью νΉ 3-53 зародышевой линии продемонстрировано на фиг. 7. Дополнительный анализ последовательности ν 2А7 с использованием системы Кэбата для определения локализации СОВ-области позволил идентифицировать области СОВ1, СЭВ2 и СЭ3 тяжелой цепи, показанные на фиг. 2А и 7 и в 8Е0 ΙΌ N0: 12, 17 и 22, соответственно.
Сравнение последовательности легкой цепи иммуноглобулина 2А7 с известными последовательностями легкой цепи иммуноглобулина человеческой зародышевой линии показало, что в легкой цепи 2А7 присутствует сегмент ν происходящий от νκ А27 человеческой зародышевой линии. Сопоставление путем выравнивания последовательности ν 2А7 с последовательностью νκ А27 зародышевой линии продемонстрировано на фиг. 9. Дополнительный анализ последовательности ν 2А7 с использованием системы Кэбата для определения локализации СОВ-области позволил идентифицировать области СОВ1, СЭВ2 и СЭ3 легкой цепи, показанные на фиг. 2В и 9 и в 8Е0 ΙΌ N0: 27, 32 и 37, соответственно.
Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела 2Р9 представлены на фиг. 3А и в 8Е0 ΙΌ N0: 43 и 3, соответственно.
Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи антитела
- 55 017086
2Е9 представлены на фиг. 3В и в 8Е0 ΙΌ N0: 48 и 8, соответственно.
Сравнение последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина 2Е9 с известными последовательностями тяжелой цепи иммуноглобулина человеческой зародышевой линии показало, что в тяжелой цепи 2Е9 присутствует сегмент ^, происходящий от 3-53 человеческой зародышевой линии, и сегмент Ж, происходящий от Ж6Ь человеческой зародышевой линии. Сопоставление путем выравнивания последовательности VII 2Е9 с последовательностью VII 3-53 зародышевой линии продемонстрировано на фиг. 7. Дополнительный анализ последовательности V 2Е9 с использованием системы Кэбата для определения локализации СЭЕ-области позволил идентифицировать области СЭКЕ СЭЕ2 и СЭ3 тяжелой цепи, показанные на фиг. 3А и 7 и в 8Е0 ΙΌ N0: 13, 28 и 23, соответственно.
Сравнение последовательности легкой цепи иммуноглобулина 2Е9 с известными последовательностями легкой цепи иммуноглобулина человеческой зародышевой линии показало, что в легкой цепи 2Е9 присутствует сегмент V происходящий от V А27 человеческой зародышевой линии. Сопоставление путем выравнивания последовательности V 2Е9 с последовательностью УК А27 зародышевой линии продемонстрировано на фиг. 9. Дополнительный анализ последовательности V 2Е9 с использованием системы Кэбата для определения локализации СЭЕ-области позволил идентифицировать области СЭКЕ ί.ΌΕ2 и СЭ3 легкой цепи, показанные на фиг. 3В и 9 и в 8Е0 ΙΌ N0: 28, 33 и 38, соответственно.
Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела 12Е1 представлены на фиг. 4А и в 8Е0 ΙΌ N0: 44 и 4, соответственно.
Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи антитела 12Е1 представлены на фиг. 4В и в 8Е0 ΙΌ N0: 49 и 9, соответственно.
Сравнение последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина 12Е1 с известными последовательностями тяжелой цепи иммуноглобулина человеческой зародышевой линии показало, что в тяжелой цепи 12Е1 присутствует сегмент Ун, происходящий от 3-9 человеческой зародышевой линии, сегмент Ό, происходящий от человеческой зародышевой линии 3-10, и сегмент Ж, происходящий от Ж6Ь человеческой зародышевой линии. Сопоставление путем выравнивания последовательности V 12Е1 с последовательностью V 3-9 зародышевой линии продемонстрировано на фиг. 8. Дополнительный анализ последовательности 12Е1 с использованием системы Кэбата для определения локализации СЭЕ-области позволил идентифицировать области СЭК.1, СЭЕ2 и СЭ3 тяжелой цепи, показанные на фиг. 3А и 8 и в 8Е0 ΙΌ N0: 14, 19 и 24, соответственно.
Сравнение последовательности легкой цепи иммуноглобулина 12Е1 с известными последовательностями легкой цепи иммуноглобулина человеческой зародышевой линии показало, что в легкой цепи 12Е1 присутствует сегмент У^ происходящий от V. Е6 человеческой зародышевой линии, и сегмент Ж, происходящий от Ж1 человеческой зародышевой линии. Сопоставление путем выравнивания последовательности V 12Е1 с последовательностью V. Е6 зародышевой линии продемонстрировано на фиг. 10. Дополнительный анализ последовательности V 12Е1 с использованием системы Кэбата для определения локализации СЭЕ-области позволил идентифицировать области СЭКЕ СЭЕ2 и СЭ3 легкой цепи, показанные на фиг. 3В и 10 и в 8Е0 ΙΌ N0: 29, 34 и 39, соответственно.
Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела 13Ό12 представлены на фиг. 5А и в 8Е0 ΙΌ N0: 45 и 5, соответственно.
Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи антитела 13Ό12 представлены на фиг. 5В и в 8Е0 ΙΌ N0: 50 и 10, соответственно.
Сравнение последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина 13Ό12 с известными последовательностями тяжелой цепи иммуноглобулина человеческой зародышевой линии показало, что в тяжелой цепи 13Ό12 присутствует сегмент ^, происходящий от V 4-34 человеческой зародышевой линии. Сопоставление путем выравнивания последовательности VII 13Ό12 с последовательностью VII 4-34 зародышевой линии продемонстрировано на фиг. 6. Дополнительный анализ последовательности 13Ό12 с использованием системы Кэбата для определения локализации СЭЕ-области позволил идентифицировать области СЭКЕ СЭЕ2 и СЭ3 тяжелой цепи, показанные на фиг. 5А и 6 и в 8Е0 ΙΌ N0: 15, 20 и 25, соответственно.
Сравнение последовательности легкой цепи иммуноглобулина 13Ό12 с известными последовательностями легкой цепи иммуноглобулина человеческой зародышевой линии показало, что в легкой цепи 13Ό12 присутствует сегмент ^, происходящий от V А27 человеческой зародышевой линии. Сопоставление путем выравнивания последовательности V 13Ό12 с последовательностью V А27 зародышевой линии продемонстрировано на фиг. 9. Дополнительный анализ последовательности V 13Ό12 с использованием системы Кэбата для определения локализации СЭЕ-области позволил идентифицировать области СЭКЕ СЭЕ2 и СЭ3 легкой цепи, показанные на фиг. 5В и 9 и в 8Е0 ΙΌ N0: 30, 35 и 40, соответственно.
Пример 3. Характеризация специфичности связывания человеческих моноклональных анти-08Еантител
В этом примере описано сравнение анти-08Е-антител с точки зрения их связывания с иммуноочищенным 08Е, проводимое с помощью стандартного ЕЫ8А для оценки специфичности связывания с 08Е.
- 56 017086
Рекомбинантный Н18-меченный и тус-меченный 08Е наносили на планшет и выдерживали в течение ночи, а затем тестировали на связывание с человеческими моноклональными анти-08Е-антителами 2А7, 12Е1 и 13Ό12. После этого проводили стандартные процедуры ЕЫ8А. Затем добавляли человеческие моноклональные анти-08Е-антитела при концентрации 1 мкг/мл и титровали при серийных разведениях 1:2. В качестве второго антитела использовали козье поликлональное антитело против человеческого Ц0 (Рс-специфическое антитело или антитело, специфичное к цепи каппа), конъюгированное с пероксидазой хрена (ПХ).
Рекомбинантный В7Н4Чд очищали от супернатантов клеток 293Т, трансфицированных конструкцией В7Н4Чд с помощью хроматографии на белке А. ЕЫ8А-планшет покрывали человеческими антителами, а затем добавляли очищенный белок и детектировали кроличьей анти-В7Н4 антисывороткой. См. фиг. 11А. Рекомбинантный белок Реп1а-В7Н4 с С-9-меткой очищали от супернатантов клеток 293Т, трансфицированных конструкцией Реп!а-В7Н4-С9, с помощью хроматографии на 2А7-аффинной колонке. ЕЫ8А-планшет покрывали антимышиным Рс, а затем моноклональным анти-С9-антителом (0,6 мкг/мл) и оттитрованным Реп!а-В7Н4 как показано на фигуре, а затем человеческим антителом при 1 мкг/мл. На фиг. 11В показаны ЕЬКА-планшеты, покрытые антителом против мышиного Рс, затем моноклональным анти-С9-антителом (0,6 мкг/мл), а затем оттитрованным белком Реп!а-08Е и человеческими тАЬ при 1 мкг/мл, см. фиг. 11В.
Человеческие моноклональные анти-08Е-антитела 2А7, 12Е1 и 13Ό12 связываются с 08Е с высокой специфичностью.
Пример 4. Характеризация связывания анти-08Е-антитела с 08Е, экспрессируемым на поверхности клеточных линий карциномы молочной железы
В этом примере описана оценка анти-08Е-антител на их связывание с 08Е-трансфектантами СН0 (также обозначаемыми В7Н4, В781 и В7х) и с клетками карциномы молочной железы, экспрессирующими на своей поверхности 08Е, с помощью проточной цитометрии.
Клеточную линию СН0, трансфицированную 08Е, а также клеточную линию карциномы молочной железы 8КВЯ3 (АТСС рег. № НТВ-30) тестировали на связывание с антителом. Связывание человеческого моноклонального анти-08Е-антитела НиМАЬ 2А7 тестировали путем инкубирования 1х 10 клеток с антителом 2А7 при концентрации 1 мкг/мл. Клетки промывали и связывание детектировали с использованием ФИТЦ-меченного АЬ против человеческого Ц0. Проточные цитометрические анализы проводили на проточном цитометре РАС8сап (Вес!оп Оюкткоп, 8ап 1оке, СА). Результаты представлены на фиг. 12 и 13.
Эти данные продемонстрировали, что анти-08Е-антитела НиМАЬ связываются с 08Еэкспрессирующими клетками СН0 и с репрезентативной клеточной линией карциномы молочной железы.
Пример 5. Анализ аффинности связывания моноклональных анти-08Е-антител по Скэтчарду
В этом примере описана оценка человеческих моноклональных антител 1011, 2Р9, 2А7, 12Е1 и 13Ό12 на их аффинность связывания с 08Е-трансфицированной клеточной линией НЕК с помощью анализа по Скэтчарду.
Клетки НЕК трансфицировали полноразмерным 08Е с применением стандартных методов, и культивировали в среде ЯРМф содержащей 10% фетальную бычью сыворотку (РВ8). (На фиг. 12 представлен РАС8-анализ этих 08Е-трансфицированных клеток НЕК с использованием человеческого моноклонального анти-08Е-антитела 2А7). Эти клетки трипсинизировали и один раз промывали связывающим трисбуфером (24 мМ трис, рН 7,2, 137 мМ №С1, 2,7 мМ КС1, 2мМ глюкоза, 1 мМ СаС12, 1 мМ МдС12, 0,1% В8А), а затем клетки доводили до концентрации 2х 106 клеток/мл в связывающем буфере. Планшеты М11Броге (МАРВ N0Β) покрывали 1% обезжиренным сухим молоком в воде и хранили в течение ночи при 4°С. Планшеты три раза промывали 0,2 мл связывающего буфера. Затем в лунки с максимальным уровнем связывания (общее связывание) добавляли 50 мкл только одного буфера. В контрольные лунки добавляли 25 мкл только одного буфера (неспецифическое связывание). Во все лунки добавляли различные концентрации 125Ьмеченного анти-08Е-антитела до объема 25 мкл. (В некоторых случаях, для титрования использовали ФИТЦ-меченные антитела, так как немеченный материал был недоступен, а поэтому в этих случаях, результаты по связыванию могут быть неадекватными). В контрольные лунки добавляли различные концентрации немеченного антитела в 100-кратном избытке в объеме 25 мкл, а во все остальные лунки добавляли 25 мкл 08Е-трансфицированных клеток СН0 (2х106 клеток/мл) в связывающем буфере. Планшеты инкубировали в течение 2 ч при 200 об/мин на шейкере при 4°С. После завершения инкубирования планшеты МББроге три раза промывали 0,2 мл холодного промывочного буфера (24 мМ трис, рН 7,2, 500 мМ №С1, 2,7 мМ КС1, 2 мМ глюкоза, 1 мМ СаС12, 1 мМ МдС12, 0,1% В8А). Фильтры вынимали и подсчитывали в гамма-счетчике. Оценку равновесного связывания осуществляли с использованием параметров односайтового связывания с помощью компьютерной программы Рпкт (8ап О1едо, СА).
Данные анализировали путем нелинейного регрессионного анализа с использованием сигмоидальной кривой зависимости доза-ответ (РЯЕМ™) и полученные данные представляли как концентрации
- 57 017086
ЕС50, которые были использованы для систематизации оценок антител, как проиллюстрировано в табл.
2. Величины ЕС50, вычисленные в этих экспериментах, представляют собой качественные показатели аффинности антител и не являются абсолютными величинами аффинностей связывания с О8Е.
Таблица 2
Антитело ЕС50 95% ДИ
2Г9.Е6-ФИТЦ 407 пМ 250-663 пМ
13012.610 74 6 пМ 569-979 пМ
2А7.С11 750 пМ 519 пМ - 1 нМ
1611.Н11-ФИТЦ 1,69 нМ 1,4-2,0 нМ
12Е1.С9* 19,8 пМ 14-27,6 нМ
*Величины ВОТТОМ и ТОР (нижние и верхние) корректировали как константы для достраивания неполной кривой
Пример 6. Материализация анти-О8Е моноклонального антитела.
В этом примере продемонстрирована оценка анти-О8Е-антитела ниМАЬ на его способность интернализоваться в О8Е-экспрессирующие клетки СнО и в клетки карциномы молочной железы, проводимая с использованием анализа на интернализацию ИнтМар. Анализ нит-Ζηρ представляет собой тест на интернализацию первого человеческого антитела посредством его связывания со вторым антителом, обладающим аффинностью связывания с человеческим 1д0 и конъюгированным с токсином сапорином.
О8Е-экспрессирующую клеточную линию карциномы молочной железы 8КВК3 высевали при 1,25х104 клеток/лунку в 100-микролитровые лунки и выдерживали в течение ночи. В эти лунки добавляли анти-О8Е-антитела ниМАЬ 1011, 2Р9, 2А7, 12Е1 или 13Ό12 при концентрации 10 пМ. В качестве негативного контроля использовали антитело контрольного изотипа, которое является неспецифичным для О8Е. Затем добавляли реагент нитМар (Абуаисеб ТатдеБид 8ук!ет5, 8аи П1едо, СА, 1Т-22-25) при концентрации 11 нМ и планшеты инкубировали в течение 72 ч. Эти планшеты обрабатывали 1,0 мкКи 3н-тимидина в течение 24 ч, а затем собирали и считывали на сцинтилляционном счетчике (Тор Соии! 8ст1111а!юи Соии!ег; Раскагб 1и51титеи!5, Мепбеи, СТ). Результаты представлены ниже в табл. 3 и на фиг. 14-15. Было установлено, что анти-О8Е-антитела 1011, 2Р9, 2А7, 12Е1 и 13Ό12, в зависимости от их концентрации, снижали уровень включения н-тимидина в О8Е-экспрессирующих клетках карциномы молочной железы 8КВК3.
Полученные данные показали, что анти-О8Е-антитела 1011, 2Р9, 2А7, 12Е1 и 13Ό12 интернализуются в клеточную линию карциномы молочной железы.
Таблица 3
Анализ № 1 Анализ № 2 Анализ № 3
% интернализации % интернализации % интернализации
анти-08Е~ антитело среднее ср. КБ.ОТ. среднее ср. кв.от. среднее ср. кв.от.
2А7.С11 29 12 17,5 3,5 40, 7 2,7
2Г9.Е6 37 17 ΝΤ ΝΤ НТ ΝΤ
1611 .НИ 18 8 ΝΤ НТ ΝΤ ΝΤ
13012.610 ΝΤ НТ 12, 1 2,5 12,2 2,8
12Е1.69 ΝΤ ыт 10,4 18,5 4,3 2,7
Систематизированные величины эффективности интернализации были усреднены по трем экспериментам, проводимым с использованием клеток 8КВК3 и двух экспериментов с использованием клеток О8Е-СнО. Систематизированные данные по интернализации, а также данные ЕС50 для связывания с О8Е-СнО представлены в табл. 4 и 5. Полученные результаты показали, что эффективность интернализации не обнаруживала прямой корреляции с аффинностью связывания, что позволяет предположить, что интернализация антител является эпитопзависимой.
Таблица 4. Эффективность интернализации, систематизированная по интернализации в клеточную линию карциномы молочной железы 8ККК3
Интернализация
анти-О8Е- антитело 5КБКЗ СН0-О8Е ЕС50 для связывания с СНО-08Е
2Г9.Е6 1 3 407 пм
2А7 .СИ 2 1 750 пм
1611.НИ 3 4 1,69 пм
13012.610 4 2 74 6 пм
12Е1.69 5 5 19,8 пм
- 58 017086
Таблица 5. Эффективность интернализации, систематизированная по интернализации в клеточную линию О8Е-СΗО
Интернализация
анти-О8Е- антитело зквкз СНО-08Е ЕС50 для связывания с СН0-08Е
2А7.С11 2 1 75 0 пм
13Ω12.С10 4 2 7 4 6 пм
2Г9.Е6 1 3 40 7 пм
1С11.Н11 3 4 1,69 нм
12Е1.Е9 5 5 19,8 пм
Способность к интернализации сапониновых конъюгатов в клетки СΗО-О8Е- в зависимости от дозы определяли с использованием человеческих моноклональных антител 2А7, 2Е9 и 1О11 в концентрациях от ~500 пМ до 1 пМ. Как проиллюстрировано на фиг. 14, при ЕС50 в низких интервалах пМ наблюдается очень эффективная интернализация. В качестве негативного контроля были использованы родительская клеточная линия СΗО и клетки Ηυ 1дО-8АР, которые, как было показано, не обнаруживали значительной фоновой токсичности или неспецифической интернализации. В тестах с клетками 8КВК3 использовали анти- О8Е-антитела, непосредственно конъюгированные с 8АР. Проценты интернализации (по сравнению с контролем) в зависимости от дозы 1д-8АР представлены на фиг. 15.
Пример 7.
Оценка цитолитического действия конъюгированных с токсином анти-О8Е-антител на клеточные линии карциномы молочной железы.
В этом примере описан тест на способность конъюгированных с токсином моноклональных антиО8Е-антител к цитолизу О8Е+-клеточной линии карциномы молочной железы на пролиферацию клеток.
Анти-О8Е-антитела ΗиМΑЬ 1О11, 2Е9, 2А7, 12Е1 или 13Ό12 могут быть конъюгированы с токсином посредством линкера, такого как пептидильный, гидразоновый или дисульфидный линкер. О8Еэкспрессирующую клеточную линию карциномы молочной железы, такую как 8КВК3, засевали при плотности примерно 1-3 х104 клеток/лунку в 100 мкл-лунки и выдерживали в течение 3 ч. В эти лунки добавляли конъюгат анти-О8Е-антитело-токсин при начальной концентрация 30 нМ и титровали при серийных разведениях 1:3. В качестве негативного контроля использовали антитело контрольного изотипа, которое является неспецифичным для О8Е. Планшеты инкубировали в течение 69 ч. Затем планшеты обрабатывали 1,0 мкКи 3Η-тимидина в течение 24 ч, собирали и считывали на сцинтилляционном счетчике (Тор Соип! 8стШ1а1юг1 Соийег; Раскагб ШкЕмтейк, Мепбеи СТ). Как и ожидалось, анти-О8Еантитела вызывали снижение уровня включения ^-тимидина в О8Е-экспрессирующих клетках карциномы молочной железы в зависимости от концентрации конъюгата антитело-токсин. Полученные данные показали, что анти-О8Е-антитела 1О11, 2Е9, 2А7, 12Е1 и 13Ό12, при их конъюгировании с токсином, обладают потенциальной цитотоксичностью для клеток карциномы молочной железы.
Пример 8. Оценка АЭСС-активности анти-О8Е-антитела.
В этом примере описан тест, проводимый с помощью флуоресцентного анализа на антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЭСС) для оценки способности моноклональных анти-О8Еантител к цитолизу О8Е+-клеточных линий в присутствии эффекторных клеток.
Человеческие эффекторные клетки получали из цельной крови следующим образом. Человеческие мононуклеарные клетки периферической крови выделяли из гепаринизированной цельной крови стандартным методом разделения на фиколл-паке. Эти клетки ресуспендировали в среде КРМ1 1640, содержащей 10% ЕВ8 и 200 ед/мл человеческого 1Ь-2, и инкубировали в течение ночи при 37°С. На следующий день клетки собирали и четыре раза промывали в культуральной среде, а затем ресуспендировали при 2х107 клеток/мл. О8Е+-клетки-мишени инкубировали с реагентом ВАТОА (Регкт Е1тег, ^е11ек1еу, МА) при 2,5 мкл ВАТОА на 1 х 106 клеток-мишеней/мл в течение 20 мин при 37°С. Клетки-мишени четыре раза промывали, центрифугировали и доводили до конечного объема 1х 105 клеток/мл.
О8Е+-клеточную линию 8КВК3, а также О8Е-трансфицированную клеточную линию 8КОУ3 тестировали на способность к антитело-специфическому клеточному цитолизу (АОСС) под действием человеческих моноклональных анти-О8Е-антител с помощью флуоресцентно-эмиссионного анализа Ое1Па, описанного ниже. Каждую клеточную линию-мишень (100 мкл меченных клеток-мишеней) инкубировали с 50 мкл эффекторных клеток и 50 мкл антитела. Во всех экспериментах использовали клетки-мишени и эффекторные клетки в отношении 1:50. Во всех исследованиях в качестве негативного контроля использовали человеческое контрольное антитело изотипа 1дО1. После центрифугирования в пульсирующем поле при 2000 об/мин и инкубирования в течение одного часа при 37°С, супернатанты собирали, а затем сразу снова центрифугировали и 20 мкл супернатанта переносили в плоскодонный планшет, в который добавляли 180 мкл раствора Еи (Регкт Е1тег, ^е11ек1еу, МА) и считывали на ридере КиЬу8!аг (ВМС ЬаЬ!есЕ). % лизиса вычисляли следующим образом: (выборочное высвобождение - спонтанное высвобождение х 100)/(максимальное высвобождение - спонтанное высвобождение), где спонтанное высвобождение означает интенсивность флуоресценции в лунках, содержащих только клетки-мишени, а максимальное высвобождение означает интенсивность флуоресценции в лунках, содержащих клетки
- 59 017086 мишени и обработанных 2% тритоном-Х. Клеточная цитотоксичность - % лизиса для клеток 8КВЯ3 в присутствии анти-О8Е-антител 1011, 2Р9 и 2А7 представлена на фиг. 17; клеточная цитотоксичность - % лизиса для О8Е-трансфицированных клеток 8КОУ3 в присутствии анти-О8Е-антител 1011, 2Р9 и 2А7 представлена на фиг. 18; а зависимая от концентрации клеточная цитотоксичность - % лизиса для клеток 8КВЯ3 в присутствии анти-О8Е-антител 2Р9 и 2А7 представлена на фиг. 19. О8Е+- экспрессирующая клеточная линия 8КВЯ3 и О8Е-трансфицированная клеточная линия 8КОУ3 подвергались антителоопосредуемому цитолизу в присутствии анти-О8Е-антител НиМАЬ 1011, 2Р9 и 2А7. Эти данные продемонстрировали, что анти-О8Е-антитела НиМАЬ оказывают специфическое цитотоксическое действие на О8Е+-экспрессирующие клетки.
Пример 9. Обработка ш ν^νо-модели с опухолевым ксенотрансплантатом с использованием оголенных и конъюгированных с цитотоксином анти-О8Е-антител
В этом примере описана ш νί\Ό обработка мышей, которым была имплантирована карцинома молочной железы, анти-О8Е-антителами, конъюгированными с токсином, для оценки влияния указанных антител на рост опухоли ш νί\Ό.
8КВЯ3 или другие подходящие клетки карциномы молочной железы размножали ш у11го в соответствии со стандартными лабораторными процедурами. Самцам бестимусных голых мышей Να- (Тасошс, Нийкоп, ΝΥ) в возрасте 6-8 недель в правый бок подкожно имплантировали 7,5 х 10б клеток Λί,ΉΝ или А498 в 0,2 мл РВ8/Ма!пде1 (1:1) на мышь. После имплантации мышей взвешивали и опухоли измеряли в пространственных координатах электронным штангенциркулем два раза в неделю. Объем опухоли вычисляли по формуле высота х ширина х длина. Мышей с АСНК-опухолями, имеющими средний размер 270 мм3, или с А498-опухолями, имеющими средний размер 110 мм3, произвольно распределяли по группам обработки. Этим мышам на день 0 внутрибрюшинно вводили дозу РВ8-носителя, конъюгированного с токсином антитела контрольного изотипа или конъюгированного с токсином анти-О8Еантитела НиМАЬ. Примеры соединений-токсинов, которые могут быть конъюгированы с антителами согласно изобретению, описаны в находящейся на рассмотрении заявке на патент США, № МЕЭХ0034И84. Мышей, которым вводили анти-О8Е-антитело НиМАЬ, тестировали с использованием трех различных соединений-токсинов. Мониторинг роста опухолей у мышей проводили в течение 60 дней после введения дозы. После того как размер опухоли достигал предельного значения (2000 мм ), мышей умерщвляли. Соответствующие анти-О8Е-антитела, конъюгированные с токсином, способствовали увеличению среднего периода времени до достижения предельного объема опухоли (2000 мм3) и замедлению прогрессирования роста опухоли. Таким образом, обработка указанным конъюгатом анти-О8Еантитело-токсин оказывает непосредственное ингибирующее действие на рост опухоли ш νί\Ό.
Пример 10. Иммуногистохимический анализ с использованием анти-О8Е-антитела НиМАЬ 2А7
В этом примере описан иммуногистохимический анализ на распознавание О8Е анти-О8Еантителом НиМАЬ 2А7, проводимый с использованием наборов нормальных тканей мышей (ГМ0ЕКЕХ Н1к!о-Аггау; Епдепех Согр., 8ап П1едо, СА).
Для иммуногистохимического анализа использовали тканевые 2000 мкм-блоки. После сушки в течение 30 мин срезы фиксировали ацетоном (при комнатной температуре в течение 10 мин) и сушили воздухом в течение 5 мин. Предметные стекла промывали в РВ8, а затем предварительно инкубировали с 10% нормальной козьей сывороткой в РВ8 в течение 20 мин, после чего инкубировали с 10 мкг/мл ФИТЦ-конъюгированного 2А7 в РВ8 и с 10% нормальной козьей сывороткой в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем предметные стекла три раза промывали РВ8 и инкубировали в течение 30 мин с мышиным анти-ФИТЦ антителом (10 мкг/мл ЭАКО) при комнатной температуре. Предметные стекла снова промывали РВ8 и инкубировали с козьим антимышиным антителом, конъюгированным с ПХ (ОАКО), в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем предметные стекла снова три раза промывали РВ8. В качестве субстрата использовали диаминобензидин (81дта), который давал коричневую окраску. После промывки дистиллированной водой предметные стекла подвергали контрастному окрашиванию гематоксилином в течение 1 мин. Затем предметные стекла промывали в течение 10 с в потоке дистиллированной воды и заливали в глицергель (ЭАКО). Результаты этих исследований представлены в табл. 6.
- 60 017086
Таблица 6. Иммунореактивность О8Е в массиве нормальных мышиных тканей
Типы тканей 2А7.С11-ФЙТЦ Ни-1дС1~ФИТЦ
2 мкг/мл 5 мкг/мл 5 мкг/мл
Кожа, мочка уха
Эпидермис - + -
Сальная железа - + -
Другие элементы - - -
Толстая кишка
Поверхностный эпителий ±, 1 + 1 + +
Другие элементы - - -
Тонкий кишечник
Эпителий крипты +,1 + 1 + ,2 + ±
Другие элементы - -
Желудок
Поверхностные и железистые 1 +,2 + у осаз 1 + ,2+,£гер 1+ 2*/осаз
эпителиальные клетки
Нервное сплетение - + ,1 + -
Другие элементы - - -
Поджелудочная железа
Гроздевидный эпителий 1 + 2+ ±, 1 +
Островки - + -
Другие элементы - - -
Слюнная железа
Гроздевидный эпителий ± 1 + -
Другие элементы - - -
Печень
Гепатоциты - ±, - -
Другие элементы - - -
Большой МОЗГ
Нейроны + 2+,1+,£гец +г -
Нейропиль/волокна + 2+,1+,осаэ -
Мост
Нейроны ± ± +
Нейропиль/волокна + 2+,1+,£геч -
Мозжечок
Клетки Пуркинье ±,1 + 1 + ±, -
Белое вещество - 1 + ,2+ -
Другие элементы - - -
Селезенка
Крупные лимфоидные клетки в - 1 + ,2+,гаге -
красной пульпе
Другие элементы - ± -
Тимус - -
Скелетная мышца - - -
Язык - - -
Сердце - -г ± -
Легкие - - -
Корковое вещество почек - ± -
Мозговое вещество почек - - -
Мочевой пузырь
Переходный эпителий - +, 1+ -
Другие элементы - - -
Семенной пузырек
Эпителий + -
Внутрипросветная жидкость 1 + 3+ ±
Другие элементы - - -
Яички
Примордиальные клетки - ±, 1+ -
Спермотоциты
Другие элементы - -
Эпидидимис - - -
Матка
Эндометрий/железистый эпителий ± ± -
Другие элементы - - -
Яичник - ± -
Интенсивность иммунореактивности : ± {неоднозначный результат ); + (слабая);
2+ (умеренная); 3+ (сильная); 4+ (интенсивная ; - (отсутствует), Ггед - в
большинстве случаев; Осаз - иногда; Каге - редко
- 61 017086
Эти данные и соответствующие данные, собранные для анти-08Е-антител 1011 и 2Е9, продемонстрировали, что сильная или интенсивная иммунореактивность 08Е (3+, 4+) наблюдалась в энтероэндокриноподобных клетках толстой кишки и тонкого кишечника, а также во внутрипросветной жидкости семенного пузырька; слабая или умеренная иммунореактивность 08Е (1+, 2+) наблюдалась в нейронах большого мозга, в нейропилях и в волокнах большого мозга и моста, в белом веществе мозжечка, в эпителиальных клетках крипты тонкого кишечника и в небольшом числе крупных лимфоидных клеток селезенки; слабая иммунореактивность 08Е (1+) наблюдалась в поверхностном эпителии толстой кишки, в клетках Пуркинье мозжечка и в гроздевидном эпителии слюнной железы и поджелудочной железы; неопределенная или слабая иммунореактивность 08Е наблюдалась в переходном эпителии мочевого пузыря, в примордиальных спермотоцитах яичек и в нервном сплетении желудка; а во всех других органах, включая кожу, печень, сердце, легкие, тимус, почки, матку, яичник, эпидидимис, язык и скелетные мышцы, наблюдалось отсутствие окрашивания или неопределенное окрашивание.
Пример 11. Получение дефукозилированных НиМАЬ.
В этом примере продемонстрировано получение анти-08Е-антител НиМАЬ, в которых отсутствуют фукозильные остатки.
Было продемонстрировано, что антитела с пониженным числом фукозильных остатков обладают повышенной АЭСС-активностью. Клеточную линию СН0 Мк7 04-РЕ, не содержащую гена фукозилтрансферазы ЕИТ 8 (Вюта, Шс., РгшсеГоп, N1), подвергали электропорации с использованием вектора, экспрессирующего тяжелые и легкие цепи анти-08Е-антитела НиМАЬ. Резистентные к лекарственным средствам клоны отбирали путем их культивирования в среде для роста клеток Ех-Се11 325-РЕ СН0 (1ВН Вюкаепсек, Ьепеха, Κδ) в присутствии 6 мМ Ь-глутамина и 500 мкг/мл 0418 (Iпν^Г^одеп, Саг1кЬаб, СА). Клоны скринировали на экспрессию ΙβΟ с помощью стандартного ЕЬКА-анализа. Были получены два отдельных клона, В8А6 и В8С11, которые имели скорость продуцирования антител от 1,0 до 3,8 пикограммов на клетку в день.
Пример 12. Оценка АЭСС-активности дефукозилированного анти-08Е-антитела.
В этом примере описан тест, проводимый с помощью флуоресцентного анализа на антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЭСС) для оценки способности дефукозилированных и недефукозилированных моноклональных анти-08Е-антител к цитолизу 08Е+-клеточных линий в присутствии эффекторных клеток.
Человеческие моноклональное анти-08Е-антитела подвергали дефукозилированию как описано выше. Человеческие эффекторные клетки получали из цельной крови следующим образом. Человеческие мононуклеарные клетки периферической крови выделяли из гепаринизированной цельной крови стандартным методом разделения на фиколл-паке. Эти клетки ресуспендировали в среде ВРМI 1640, содержащей 10% ЕВδ (культуральной среде) и 200 ед/мл человеческого ΙΕ-2, и инкубировали в течение ночи при 37°С. На следующий день клетки собирали и один раз промывали в культуральной среде, а затем ресуспендировали при 2х107 клеток/мл. 08Е+-клетки-мишени инкубировали с реагентом ВАТЭА (Регкш Е1тег, ’№е11ек1еу, МА) при 2,5 мкл ВАТЭА на 1х 106 клеток-мишеней/мл в культуральной среде, в которую было добавлено 2,5 мМ пробенецида (в аналитической среде), в течение 20 мин при 37°С. Клеткимишени четыре раза промывали в РВδ с 20 мМ НЕРЕδ и 2,5 мМ пробеницида, центрифугировали и доводили до конечного объема 1 х 105 клеток/мл в аналитической среде.
08Е+-клеточную линию АВН-77 (человеческого В-клеточного лимфобластного лейкоза; АТСС рег. № СВЬ-1621) тестировали на способность к антитело-специфическому клеточному цитолизу (АЭСС) под действием дефукозилированного и не-дефукозилированного человеческого моноклонального анти08Е-антитела с помощью флуоресцентно-эмиссионного анализа ОеШа, описанного ниже. Клеточную линию-мишень АВН-77 (100 мкл меченных клеток-мишеней) инкубировали с 50 мкл эффекторных клеток и 50 мкл антитела 1011 или дефукозилированного антитела 1011. Во всех экспериментах использовали клетки-мишени и эффекторные клетки в отношении 1:100. В качестве негативного контроля использовали человеческое контрольное антитело изотипа Ι§01. После центрифугирования в пульсирующем поле при 2100 об/мин и инкубирования в течение одного часа при 37°С, супернатанты собирали, а затем сразу снова центрифугировали и 20 мкл супернатанта переносили в плоскодонный планшет, в который добавляли 180 мкл раствора Ей (Регкш Е1тег, ’№е11ек1еу, МА) и считывали на планшет-ридере Еикюп А1рЕа ТВЕ (Регкш Е1тег). % лизиса вычисляли следующим образом: (выборочное высвобождение спонтанное высвобождение х 100)/(максимальное высвобождение - спонтанное высвобождение), где спонтанное высвобождение означает интенсивность флуоресценции в лунках, содержащих только клетки-мишени, а максимальное высвобождение означает интенсивность флуоресценции в лунках, содержащих клетки-мишени и обработанных 3% лизолом. 08Е+-экспрессирующая клеточная линия АВН-77 обнаруживала антитело-опосредуемую подвергалась цитотоксическому действию в присутствии анти-08Еантитела НиМАЬ 1011, при этом более высокий процент специфического лизиса клеток наблюдался в присутствии дефукозилированной формы анти-08Е-антитела 1011. Таким образом, дефукозилированные анти-08Е-антитела НиМАЬ оказывают повышенное специфическое цитотоксическое действие на 08Е+-экспрессирующие клетки.
- 62 017086
Пример 13. Интернализация анти-О8Е антител НиМаЬ в анализе на иммунофлуоресцентное окрашивание.
Клеточные линии-мишени, О8Е+-8КВЯ3 (рака молочной железы человека, АТССх НТВ-30) и 2Я75 (рака молочной железы человека, АТСС# СКЕ-1500) использовали в тесте на интернализацию антиО8Е-антител НиМаЬ 2А7С11, Ю11Н1 и 2Е9Е6 после связывания с клетками, используемыми в анализе на иммунофлуоресцентное окрашивание.
Клетки 8КВЯ3 и ΖΡ-75 (104 на 100 мкл на лунку в 96-луночном планшете), собранные из колбы для культивирования тканей путем обработки 0,25% трипсином/ЕОТА, инкубировали с каждым из антиО8Е-антител НиМаЬ при 5 мкг/мл в ЕАС8-буфере (РВ8 + 5% ЕВ8, среда) в течение 30 мин на льду. В качестве негативного контроля использовали человеческое контрольное антитело изотипа Ι§01. После 2кратной промывки средой клетки ресуспендировали в среде (100 мкл на лунку), а затем инкубировали с козьим античеловеческим вторым антителом, конъюгированный с ФЭ (1аск§оп [ттипоЯехеагсН ЬаЬ), при разведении 1:100 на льду в течение 30 мин. После промывки средой клетки либо сразу (в 0 мин) визуализировали под флуоресцентным микроскопом (Ы1коп), либо инкубировали при 37°С в течение различных периодов времени. Через различные промежутки времени получали изображения клеточной морфологии и определяли интенсивность иммунофлуоресценции окрашенных клеток, как показано ниже на фигурах. Флуоресценция наблюдалась только в клетках, окрашенных анти-О8Е-антителами НиМаЬ. Клетки, окрашенные только контрольным антителом Ι§01, не обнаруживали флуоресценции. Аналогичные результаты также были получены в анализах с использованием анти-О8Е-антител НиМаЬ, непосредственно конъюгированных с ФИТЦ.
Данные по визуализации указывали на быстрое (в 0 мин) появление флуоресценции на поверхностных клеточных мембранах в присутствии всех трех анти-О8Е-антител НиМаЬ. После инкубирования в течение 30 мин интенсивность флуоресценции мембраны значительно снижалась, а окрашивание внутри клеток усиливалось. Через 120 мин флуоресценция на мембране исчезала, в вместо этого она появлялась во внутриклеточных компартментах. Полученные данные показали, что анти-О8Е-антитела НиМаЬ могут специфически интернализоваться после связывания с О8Е-экспрессирующими эндогенными опухолевыми клетками.
Пример 14. Эффективность действия анти-О8Е-антител на опухоли НЕК-В7Н4 у мышей 8СГО.
В этом примере мышей 8СГО, которым имплантировали опухоли НЕК-В7Н4, обрабатывали ш νί\Ό оголенными анти-О8Е-антителами для оценки влияния антител на рост опухоли ш νί\Ό.
Для исследования роста опухоли были взяты мыши с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (8СГО), у которых отсутствовали функциональные В- и Т-лимфоциты. Клетки опухолевой клеточной линии НЕк, трансфицированные В7Н4, подкожно имплантировали в количестве 5 миллионов клеток/мышь в матригеле (50% об./об.). Каждой мыши на день 0 вводили инокулят 0,2 мл клеток. Начиная со дня 10, мышей оценивали на рост опухоли и мониторинг роста опухоли проводили два раза в неделю в течение приблизительно 6 недель. Когда размер опухоли достигал примерно 130 мм3, мышей произвольно распределяли на три группы по объему опухоли. Мышей обрабатывали 10 мг/кг либо оголенного анти-О8Е-антитела 2А7, либо антитела контрольного изотипа, либо буферным препаратом, используемым в качестве негативного контроля. Эти антитела вводили животным путем внутрибрюшинной инъекции через каждые 5 дней, всего 5 инъекций. Опухоли измеряли в пространственных координатах (высота х ширина х длина) электронным штангенциркулем и вычисляли объем опухоли. Когда объем опухоли достигал 1500 мм3, или когда потеря массы тела мыши составляла более чем 15%, мышей умерщвляли. Результаты представлены на фиг. 20. Обработка анти-О8Е-антителом 2А7 приводила к ингибированию роста опухоли. На день 34, среднее ингибирование роста опухоли для группы животных, обработанных антителом 2А7, составляло 63%. После прекращения введения доз рост опухоли возобновлялся. Полученные результаты показали, что обработка опухолей, экспрессирующих О8Е, анти-О8Еантителами ш νί\Ό является эффективной для подавления роста этих опухолей.
Пример 15. Иммуногистохимический анализ с использованием анти-О8Е-антитела.
Способность анти-В7Н4 антитела НиМАЬ 2А7 распознавать В7Н4 оценивали с помощью иммуногистохимического анализа клинических биоптатов рака яичника, рака легких, рака молочной железы и рака головы и шеи.
Для иммуногистохимического анализа использовали замороженные 5 мкм-срезы (АгбаЦ Шс, И8А). После сушки в течение 30 мин срезы фиксировали ацетоном (при комнатной температуре в течение 10 мин) и сушили воздухом в течение 5 мин. Предметные стекла промывали в РВ8, а затем предварительно инкубировали с 10% нормальной козьей сывороткой в РВ8 в течение 20 мин, после чего инкубировали с 10 мкг/мл ФИТЦ-конъюгированного антитела в РВ8 с 10% нормальной козьей сывороткой в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем предметные стекла три раза промывали РВ8 и инкубировали в течение 30 мин с мышиным анти-ЕГГС антителом (10 мкг/мл ОАКО) при комнатной температуре. Предметные стекла снова промывали РВ8 и инкубировали с козьим антимышиным антителом, конъюгированным с ПХ (ПАКО), в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем предметные стекла снова три раза промывали РВ8. В качестве субстрата использовали диамонобензидин (81дта), который давал ко
- 63 017086 ричневую окраску. После промывки дистиллированной водой предметные стекла подвергали контрастному окрашиванию гематоксилином в течение 1 мин. Затем предметные стекла промывали в течение 10 с в потоке дистиллированной воды и заливали в глицергель (ЭАКО). В иммуногистохимическом анализе на окрашивание клинических биоптатов наблюдалось положительное окрашивание образцов рака легких, рака молочной железы, рака яичника и рака головы и шеи.
Пример 16. Количественная ОТ-ПЦР в нормальных и раковых тканях.
Различные образцы нормальных и раковых тканей скринировали на экспрессию мРНК О8Е с помощью количественной ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР). Экспрессия мРНК указывает на экспрессию белка О8Е.
Для количественной ОТ-ПЦР использовали следующие О8Е-праймеры: В7-Н4.3: АО6АТ66ААТССТ6А6СТ6САСТТ; В7-Н4.4: ТСС6АСА6СТСАТСТТТ6ССТТСТ, поставляемые компанией Орегоп (Нип1этШе, АЬ). Реакцию проводили в стандартных условиях (5 мкл матричной кДНК при 1 нг/мкл, 0,1 мкл обратного праймера при 40 мкМ, 0,1 мкл прямого праймера 40 мкМ, 6 мкл 2хПЦР-смеси 8УВК Огееп (Аррйе' В|о5у5(ет5 # 4367659), и 0,8 мкл воды).
кДНК амплифицировали с проведением раунда в 40 циклов в стандартных условиях ПЦР на устройстве АВ1 Ргып 7900НТ (Аррйе' Вю8у81ет8, Роб!ег Сйу, СА). Результаты количественной ОТ-ПЦР представлены ниже в табл. 7. Образцы с неопределенными значениями представляют собой образцы, которые дают величины флуоресценции ниже порогового уровня. Было показано, что опухоли молочной железы, яичника и головы и шеи экспрессируют О8Е, причем наибольшие уровни экспрессии наблюдались в некоторых образцах рака яичника и рака головы и шеи. Полученные данные показали, что в образцах опухолей молочной железы, яичника и головы и шеи, по сравнению с нормальными тканями, наблюдался повышенный уровень экспрессии О8Е.
Таблица 7. Количественная ОТ-ПЦР-оценка экспрессии в нормальных и раковых тканях.
Ткань Результат подсчета Количество
нор. жировая ткань (#301) 28,953062 25,57793
нор. артерии (#303) 31,856901 3,0423617
нор. мочевой пузырь (#257) 30,620392 7,5326214
нор. костный мозг (#342) неопределенный 0
нор. головной мозг (#258) 34,33955 0,49280354
нор. молочная железа (#259) 25,63064 292,28528
нор. толстая кишка (#261) неопределенный 0
нор. пищевод (#262) 32,27514 2,2388945
нор. сердце (#125) неопределенный 0
нор. почки (#264) 33,599422 0,Θ479082
нор. печень (#266) неопределенный 0
нор. легкие (#268) 32,44523 1,9763907
нор. лимфоузел (#315) неопределенный 0
нор. яичник (#270) 35,045704 0,29364112
нор. поджелудочная железа (#271) 28,446985 37,06916
нор. лейкоциты периферической крови (#302) 34,652363 0,39180183
нор. предстательная железа (#272) 32,635994 1,7184163
нор. сетчатка (#256) 34,70426 0,37717298
нор. скелетная мышца (#119) неопределенный 0
нор. скелетная мышца (#126) неопределенный 0
нор. кожа (#273) неопределенный 0
нор. спинной мозг (#129) 39,383526 0,01220525
нор. селезенка (#274) неопределенный 0
нор. желудок (#275) неопределенный 0
нор. язык (#324) 30,956758 5,886249
нор. миндалины (#325) неопределенный 0
нор. трахея (#314) 29,771343 14,03797
опухоль молочной железы (#176) 33,798374 0,7328206
- 64 017086
опухоль молочной железы (#177) 25,759022 266,02777
опухоль молочной железы (#178) 28,572468 33,81085
опухоль молочной железы (#179) 25,31508 368,374
опухоль молочной железы (#180) 29,323488 19,494516
опухоль головы и шеи (гортань, #402) 28,116425 47,23582
опухоль головы и шеи (глотка, #403) 25,776083 262,72076
опухоль головы и шеи (язык, #403) 26,950275 111,07412
опухоль головы и шеи (миндалины, #404) 23,03704 1957,3722
опухоль почек (#167) 27,029814 104,77927
опухоль яичника (#187) 25,321087 366,77927
опухоль яичника (#188) 22,846964 2250,0833
опухоль яичника (#189) 25,079527 437,81958
опухоль яичника (#190) 27,964441 52,80399
опухоль яичника (#191) 22,686525 2530,9656
Настоящее изобретение не ограничивается описанными здесь конкретными вариантами его осуществления. Действительно. исходя из приведенного выше описания и описания графического материала. для специалиста в данной области очевидно. что в настоящее изобретение. помимо уже описанных вариантов. могут быть внесены различные модификации. Такие модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения.
Патенты. патентные заявки. публикации. описание продуктов и протоколы их получения. указанные в настоящей заявке. во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
- 65 017086
Список последовательностей <110> Мейагех, 1пс.
<120> ЧЕЛОВЕЧЕСКИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ О8Ё <130> 04280/1203606-031 <160> 55 <170> РаКепЫп νειείοη 3.3 <210> 1 <211> 118 <212> БЕЛОК <213> Ното заркепз <400> 1
С1п 1 Ча1 С1п Леи Б1п 5 С1П тгр С1у
ТЬг Леи Зег Леи 20 ТЬг Суз А1а Уа1
РЬе Тгр ТЬг 35 Тгр 11е Агд С1п Рго 40
С1у С1и 50 Не Азп Нкз Зег Е1у 55 ТЬг
Зег 65 Агд Уа1 ТЬг 11е Зег 70 А1а Азр
Леи Зег Зег Уа1 ТЬг 85 АЛ а А1а Азр
Леи Зег Зег Тгр 100 Зег Азп Тгр А1а
Леи Уа1 ТЬг 115 Уа1 Зег Зег
А1а οι у 10 Леи Леи Луз Рго Зек- 15 61и
Туг 25 Е1 у С1у Зег РЬе Зег 30 Азр Туг
Рго С1у Луз С1у Леи 45 С1и Тгр 11е
ТЬг Азп Туг Азп 60 Рго Зег Леи Луз
ТЬг Зег Луз 75 Азп С1п РЬе Зег Агд 80
ТЬг А1а 90 Уа1 Туг Туг Суз А1а 95 Агд
РЬе 105 Е1и Туг Тгр 01 у С1п 110 С1у ТЬг
<210> 2 <211> 115 <212> БЕЛОК <213> Ното заркепз
<400> 2
С1и 1 Уа1 В1п Леи. Уа1 5 61и Зег С1у
Зег Леи Агд Леи 20 Зег Суз А1а А1а
С1у (31у Леи Не С1п Рго С1у Е1у
10 15
Зек С1у РЬе ТЬг Уа1 Зег Зег Азп
25 30
- 66 017086
Туг МеЬ Азп Тгр Уа1 Агд С1п А1а 40 Рго С1у Ьуз С1у Ьеи 45 С1и Тгр Уа1
35
Зег Не Туг О1у Зег 61у Агд ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег 1/а1 Ьуз
50 55 60
61у Агд νθι ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг Ьеи
65 70 75 80
С1п МеС Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз А1а
85 90 95
Агд Азр ТНг Туг А1а МеС Азр Уа1 Тгр СЬу С1п С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг
100 105 110
Уа1 Зег Зег
115
<210> 3
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Ното зар!еп$
<400> 3
С1и Уа1 Й1п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Не С1п Рго 61у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе Не Уа1 Зег Агд Аап
20 25 30
Туг МеС АЗП тгр Уа1 Агд 61п А1а Рго С1у Ьуз 51у Ьеи С1и Тгр Ч7а1
35 40 45
Зег Уа1 11е Туг С1у Зег 61у Агд ТЬг Азр Суз А1а Азр Зег Уа1 Ьуз
50 55 60
СЬу Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг Ьеи
65 70 75 80
С1п мес Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз А1а
85 90 95
Агд Азр С1у Азр Туг С1у МеС Азр Уа1 Тгр С1у Сэ1П С1у ТЬг ТЬг Уа1
100 105 но
ТЬг Уа1 Зег Зег
115
- 67 017086 <210> 4 <211> 126 <212> БЕЛОК <213> Ното зарТепз <400> 4
С1и 1 Уа1 С1п Ьеи Уа1 5 61и Зег 61у
Зег Ьеи Агд Ьеи 20 Зег Суз Уа1 А1а
А1а МеС Н1з 35 Тгр Уа1 Агд С1п А1а 40
Зег С1у 50 Пе Зег Тгр Азп Зег 55 С1у
Ьуз 65 С1у Агд РЬе ТЬг Т1е 70 Зег Агд
Ьеи С1п МеС Азп Зег 65 Ьеи Агд А1а
ТЬг Ьуз А1а Ьеи юо Туг 61 у Зег 51у
МеЬ Азр Уа1 115 Тгр С1у 61п 61у ТЬг 120
<210> <211> <212> 1 <213> 1 5 122 БЕЛОК Ното зариепз
<400> ! 5
С1п 1 Уа1 61п Ьеи 61 п 5 Й1п Тгр 61у
ТЬг Ьеи Зег Ьеи 20 ТЬг Суз А1а Уа1
Туг Тгр Зег 35 Тгр Не Агд 61п Рго 40
61у Ьуз 50 Не Азп Низ Зег Й1у 55 Зег
Зег Агд Уа1 ТЬг 11е Зег Уа1 Азр
Й1у С1у 10 Ьеи 7а1 61п Рго С1у 15 Агд
Зег 25 61у РЬе ТЬг РЬе Азр 30 Азр Туг
Рго 61у Ьуз 61 у Ьеи 45 61и Тгр Уа1
Зег 11е С1у Туг 60 А1а Азр Зег νβΐ
Азр Азп А1а 75 Ьуз Азп Зег Ьеи Туг Θ0
61и Азр 90 ТЬг А1а Ьеи Туг Туг 95 Суз
Зег 105 Зег Азр РЬе Туг Туг но Туг С1у
ТЬг Уа1 А1а Уа1 Зег 125 Зег
А1а С1у Ьеи Ьеи Ьуз Рго Зег 61и
10 15
Туг 25 С1у С1у Зег РЬе Зег 30 61 у Туг
Рго 61у Ьуз 61у Ьеи 45 61и Тгр 11е
ТЬг Азп Туг Азп 60 Рго Зег Ьеи Ьуз
ТЬг Зег Ьуз Азп 61п РЬе Зег Ьеи
- 68 017086
65 70
Ъуз Ьеи Азп Зег Уа1 85 ТЬг А1а А1а
Агд С1и Ьеи Агд 100 Туг РЬе 61и Азп
С1у С1и С1у 115 ТНг ТЬг Уа1 ТНг Уа1 120
<210 <211> <212> <213> 6 108 БЕЛОК Ното зархепз
<400> 6
С1и 1 Не Уа1 Ьеи П1Г 5 С1п РЬе Рго
С1и Агд А1а ТНг 20 Ьеи Зег Суз Агд
Туг Ьеи А1а 35 Тгр Туг С1п С1п Ьуз 40
Не Туг 50 С1у А1а Зег Агд Агд 55 А1а
С1у 65 Зег С1у Зег С1у ТЬг 70 Азр РЬе
Рго С1и Азр РНе А1а 85 Уа1 Туг Туг
Ьеи ТНг РНе (31 у 100 С1у С1у ТЬг Ьуз
<210> <211> <212> <213> 7 109 БЕЛОК Ното зариепз
<400> 7
61и 1 Не Уа1 Ьеи ТЬг 5 С1п Зег Рго
С1и Агд А1а ТЬг 20 Ьеи Зег Суз Агд
17а1 С1и Не Ьуз
105
75 80
Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз А1а
90 95
Туг Туг Туг 61у Мер Азр Уа1 Тгр
105 110
Зег Зег
С1у ТНг 10 Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 15 С1у
А1а 25 Зег С1п Зег Уа1 Зег 30 Зег ТНг
Рго С1у С1п А1а Рго 45 Агд Уа1 Ьеи
ТНг С1у Не Рго 60 АЗр Агд РЬе Зег
ТНг Ьеи ТНг 75 Не Зег Агд Ьеи С1и 80
Суз С1п 90 С1п Туг Е1у Зег Зег 95 Рго
51у ТНг 10 Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 15 С1у
А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Зег
25 30
Туг Ьеи А1а Тгр 35 Туг 61п 61н Ьуз 40 Рго О1у 61п А1а Рго 45 Агд Ьеи Ьеи
Не Туг 61у А1а Зег Зег Агд А1а ТЬг 61у 11е Рго Азр Агд РНе Зег
50 55 60
С1у Зег 61у Зег 61у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТНг Не Зег Агд Ьеи С 1и
65 70 75 80
Рго Азр РНе А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п О1п Туг С1у Зег Зег Рго
85 90 95
МеЬ Туг ТЬг Рке С1у 61п 61у ТЬг Ьуз Ьеи С1и Не Ьуз
100 105
<210> 3
<211> 109
<212> БЕЛОК
<213> Ното зархепз
<400> 8
<3111 Не Уа1 Теи ТНг 61п Зег рго 61у ТЬг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 61у
1 5 10 15
А1а Ьеи А1а С1п Зег
20 25 30
Туг Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго 61у С1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи
35 40 45
Не Туг 61у А1а Зег Зег Агд А1а ТЬг 61у Не Рго Азр Агд РЬе Зег
50 55 60
61у Зег С1у Зег 61у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Агд Ьеи 61и
65 70 75 80
Рго 61и Азр А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п С1п Туг б1у Зег Зег Рио
85 90 95
Ьеи Туг ТНг РНе 31у С1у ТЬг Ьуз Ьеи С1и 11е Ьуз
100 105
<210> 9
<211> 103
<212> : БЕЛОК
<213> Ното зарЬепг
<400> 9
61и 11е Уа1 Ьеи ТЬг 61п Зег Рго А1а ТНг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 61у
- 70 017086
1 5 10 15
С1и Агд А1а ТКг Беи Зег Суз Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Туг
20 25 30
Беи А1а Тгр Туг С1П е1п ъуз Рго С1у С1п А1а Рго Агд Беи Беи Не
35 40 45
Туг Азр А1а Зег Азп Агд А1а ТНг СТу 11е Рго А1а Агд РНе Зег О1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТНг Азр РНе ТНг Беи ТНг Не Зег Зег Беи С1и Рго
65 70 75 80
О11Л Азр РНе А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п С1п Агд Агд ТНг РНе С1у 61п
85 90 95
С1у ТЬг Буз ν^ι С1и Не Буз
100
<210> 10 <211> 108 <212> БЕЛОК <213> Ното зар±епз <400>10
61и 1 Не Уа1 Беи ТЬг 5 С1п Зег Рго 31у ТЬг 10 Беи Зег Беи Зег Рго 15 С1у
С1и Агд А1а ТНг Беи Зег Суз Агд А1а Зег С1П Зег Уа1 Зег 5ег Зег
20 25 30
Туг Беи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго Агд Ьеи Беи
35 40 45
11е Туг С1у А1а Зег Зег Агд А1а ТНг С1у 11е Рго Азр Агд РКе Зег
50 55 60
С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РНе ТНг Беи ТЬг Не Зег Агд Ьеи С1и
65 70 75 80
Рго 61и Азр РНе А1а Уа! Туг Туг Суз С1п СТп Туг СТу Зег 5ег Рго
85 90 95
Агд ТНг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Буз Уа1 С1и Не Буз
100105 <210> 11 <211>5
- 71 017086 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз <400> 11
Айр Туг РЬе Тгр ТЬг
5 <210> 12 <211> б <212> БЕЛОК <213> Ното зар1епз <400>12
Зег Азп Туг мер Азп Тгр <210>13 <211>5 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз <40Э>13
Агд Азп Туг Мер Азп <210>14 <211>5 <212> ЕЕЛОК <213> Ното зарЬепз <400>14
Азр Туг А1а Мер Н1з <210>15 <211>5 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз <400>15
С1у Туг Туг Тгр Зег <210> 16 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Ното зар1епз <400> 16
С51и Не Азп Ηιξ Зег 61у ТЬг ТЬг Азп Туг Азп Рго Зег Ьеи Ьуз Зег 15 10 15
- 72 017086 <210>17 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Ното зар1епз <400>17
Уа1 Не ; Туг 61у Зег С1у Агд ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 Еуз С1у
1 5 10 15
<210> 18
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Ното зар1епз
<400> 18
Уа1 11е ; Туг С1у Зег С1у Агд ТЬг Азр Суз А1а Азр Зег Уа1 Ъуз 01 у
1 5 10 15
<210> 19
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Ното зараепз
<400> 19
О1у 11е Зег Тгр Азп Зег 61у Зег 11е 51у Туг А1а Азр Зег Уа1 Луз
1 5 10 15
С1у
<210> 20
<212> 16
<212> БЕЛОК
<213> Ното зараепз
<4 0 0> 20
ьуз Не : Азп Н13 Зег С1у Зег ТЬг Азп Туг Азп Рго Зег Ьеи Буз Зег
1 5 10 15
<210> 21
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Ното зархепз
<400> 21
Ьеи Зег Зег Тгр Зег Азп Тгр А1а РЬе С1и Туг
10 <210> 22 <211>7 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз
- 73 017086 <400>22
Азр ТНг Туг А1а МеЪ Азр Уа1
<210> 23
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Ното 5ар1епз
<400> 23
Азр 61у Азр Туг С1у Ме! Азр Уа1
5 <21024 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <40024
Ьеи Туг С1у Зег С1у Зег Зег Азр РИе Туг 10 Туг Туг 61у Мее Азр Уа1 15
1 5
<210 25
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Ното аартепз
<4 0□> 25
С1и Леи : Агд Туг РЬе (31и Азп Туг Туг Туг С1у Меб Азр νβΐ
1 5 10
<210> 26
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Ното заргепз
<400> 26
Агд А1а . Зег С1п 5ег Уа1 Зег Зег ТНг Туг Леи А1а
1 5 10
<210> 27
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Ното зараепз
< 4 0 0> 27
Агд А1а . Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Зег Туг Леи А1а
5 10 <210> 28 <211> 12 <212> БЕЛОК
- 74 017086 <213> Ното зарЛепз <400>28
Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Зег Туг 10 леи А1а
1 5
<210> 29
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Ното заргепз
<400> 29
Агд А1а Зег Е1п Зег Уа1 Зег Зег Туг Леи А1а
1 5 10
<210> 30
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Ното зар!епз
<400> 30
Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Зег Туг Леи А1а
1 5 10
<210>31 <211>7 <212> БЕЛОК <213> Ното зарБепз <400>31 <31у А1а Зег Агд Агд А1а ТЬг
<210> 32
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Ното зар1еп5
<400> 32
С1у А1а ι Зег Агд А1а ТИг
5 <210>33 <211>7 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЛепз <400>33
Б1у А1а Зег Зег Агд А1а ТЬг <210>34
- 75 017086 <211>
<212>
<213>
БЕЛОК
Ното .
заргепз <400>
Азр А1а Зег
Азп Агд
А1а
ТЬг <210>
<211>
<212>
<213>
БЕЛОК
Ното :
заргепз <400>
<31у А1а Зег
Зег Агд
А1а
ТЬг <210>
<211>
<212>
<213>
БЕЛОК
Ното , зархепз <400>
С1п С1п Туг
С1у Зег
Зег
Рго
Ьеи
ТЬг <210>
<211>
<212>
<213>
БЕЛОК Ното :
заргепз <400>
С1п С51п Туг
С1у Зег
Зег
Рго
МеЪ
Туг
ТЬг
<210> 38
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Ното .
<400> 38
С1п С1п 1 Туг 1
заргепз б1у Зег
Зег
Рго
Теи
Туг
ТЬг
<210> 39
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Ното ;
<400> 39
С1п С1п . Агд Ϊ
заргепз
Агд ТЬг
- 76 017086 <210>40 <211>9 <212> БЕЛОК <213> Ното зар1епз <400>40
С1п Туг 61у Вег зег Рхо Агд ТЬг <210> 41 <211> 357 <212> ДНК <213> Ното зараепз <400> 41
саддСдсадс Ъасадсад^д дддсдсадда с^дЪЬдаадс сЪ^сддадас ссбдДсссЪс 60
асс£дсдс£д СсДаСдд^дд дСссС'ЬсадЬ даспасССсД ддассДдда11 ссдссадссс 120
ссадддаадд дссЪддад^д даДЬддддаа аДсааЪсаЪа дЪддаассас саас^асаас 180
ссдДсссДса ададЪсдадЬ сассаДДЪса дсадасасдД ссаадаасса дДЪс^сссЪд 240
аддс^дадс! с£д£дассдс сдсддасасд дс^дДдСаДД асЁд-^дсдад асДсадсадс 300
ЬддЪсдаас^ дддссЪДДда дИасДддддс садддаассс Ддд^сассдД сЪссЪса 357
<210> 42 <211> 345 <212> ДНК <213> Ното зараепз <400> 42
даддЬдсадс ЬддСддадЬс Оддаддаддс ООдаЬссадс сСддддддСс ссидадасгс 60
ОссСдЬдсад ссссТдддЬО сассдбсадо адсаасбаса Ьдаасодддп ссдссаддсЬ 120
ссадддаадд ддсбддадЬд ддЬсбсадЬЬ аРОРаЬддса дЬддбадаас асагьасдса 180
дасбссдЬда адддссдадЕ сассаИсбсс ададасааСО ссаадаасас дсЕд-бабсль 240
саааОдааса дссОдададс сдаддасасд дссд!д1:аЪ1. асЬдОдсдад адаЪассЬас 300
дсОаРддасд ОсЬддддсса адддассасд дОсассдОсО ссОсО 345
<210> 43 <211> 348 <212> ДНК <213> Ното зараепз <400> 43
дадд'Ьдса.дЪ ДддЪддадЬс Дддаддаддс ^Сда^ссадс С^ддддддЬс ссбдадасбс 60
Дсс1:д^дсад ссЪс£ддд£± саДсдДсадЬ адааасДаса ДдаасДддд!: ссдссаддсб 120
ссадддаадд ддсЪддадЪд дд£сЬсад1:Ъ а££Ъа1:ддса дЬддЪаддас адасЬдсдса 180
дас^ссдДда адддссдаДД сассаЪсЬсс ададасааДб ссаадаасас дсбдДа^сДЪ 240
- 77 017086
саааЪдааса СасддСаОдд дссОдададс сдаддасасд дссдЪдГ.а'Ы: асддЪсассд асСдОдсдад ЪсСсс^са адаЪддддас 300 348
асдЕссдддд ссаадддасс
<210> 44 <211> 373 <212> ДНК <213> Ното зарьепз
<400> 44 даадедсадс ^ддЕддад^с 1:дддддаддс ГХ.дд£.асадс сг.ддоадд£с ссЬдадасЬс 60
ЬссСд^д^ад сс(;сЪддаЛЪ сасс(Л5даЬ да^ЛаЪдсса ^дсасЪдддЪ ссддсаадс± 120
ссадддаадд дссОддад^д дд^сСсаддЕ а££адС0дда аОад^ддСад саХ.аддсЕаХ; 180
дсддаоЪсЪд Хдаадддссд ас^саооаСс ^ссададаса асдесаадаа сЪсссЬдЪаЪ 240
сЪдсаааЪда асад^с^дад адсЪдаддас асддссЬЪдЪ аЪЪасЪдЪас аааадссс^с 300
^а^ддСЬсдд ддадЬЬсЬда сС^сОасЛас 11асдд^аОдд асдГхЪдддд ссаадддасс 360
асддЪсдосд 378
<210> <211>
<212>
<213>
<400>
366
ДНК
Ното заргепз
садд^дсадс ЕасадсадЬд дддсдсадда с^д'ЬЬдаадс сС'Ьсддадас ссЪдЪсссЪс 60
ассЪдсдсЪд Ъс12а£дд£дд д£сс££сад£ ддЪЪасЪасЪ ддадс^ддад ссдссадссс 120
ссадддаадд ддсХддадЪд да£Х.дддааа а5сааЪса1:а дсддаад^ас саас5.асаас 180
ссдЪссс<:са ададСсдадЬ сассаЪаЪса д^адасасдС ссаадаасса д^Ъс^ссс^д 240
ааас^ааасС с^дХдассдс сдсддасасд дс1;дЪдЪа11£ ас5дХ.дсдад адаа^асда 300
£а1:£Х£:дааа асЪасСасЬа сдд^а^ддас дСсХ.ддддсс аадддассас дд^сассдЪс 360
ЪсеЪса 366
<210>
<211>
<212>
<213>
324
ДНК
Ното зартепз <40О>
дааа'С^дЪд·^ £дасдсад£Ъ Ъссаддсасс с^д^сЪС 1здЬ сЬссадддда аададссасс 60
с^сЪссодса дддссад^са дадЪдЬСадг адсасс^асС НадссХдд^а ссадсадааа 1 го
ссХддссадд сЪсссаддд1; сскса^сЪаЪ ддЪдсаЬсса даадддссас ЪддсаСссса 180
дасадд^са д-ЕддсадСдд дссьдддаса дас^-СсасТх Ъсаоса-есад садас^ддад 240
ссЪдаада^Ъ ССдсадЪдЪа ^^асСдТсад сад'ЬаСдд^а дсЪсассдсС сасЪХСсддс 300
ддадддасса адд^ддада!: сааа 324
- 78 017086 <210>47 <211>327 <212> ДНК <213> Ното заргепз <400> 47
дзааСбд^д!: Ъдасдсадбс Ъссаддсасс сбдбсДЪбд^. сбссадддда аададссасс 60
сбсбссСдса дддссадбса дадДдббадс адсадсДасб С.адсс1:дд1:а ссадсадааа 120
ссИддссадд сДсссаддсЬ ссДсабс^аЪ ддГдсабсса дсадддсоас Ъддсабссса 180
дасаддЪЪса дЪддсадбдд дбсбдддаса дасЬДсасбс Дсассабсад садасбддад 240
ссЛдаадаГС ДЪдсадРдба ЪЪасбдбсад садбабддба дсбсасссаС дДасасЪ СС11 300
ддссадддда ссаадсСдда да£сааа 327
<210>48 <211>327 <212> ДНК <213> Ното зарсепз <400> 48
даааДбдбдб ЪдасдсадДс Ьссаддсасс сЬдДсГХбдД сРссадддда аададссасс 60
сЪсЬссЪдса дддссадбса дадСдббадс адсадсСасТ бадссиддОа ссадсадааа 120
сс^ддссадд сЬсссаддсЪ сссса^сьаб ддДдса<:сса дсадддсоас СддсаЪссса 180
дасаддЁбоа д^ддсадбдд дбсбдддаса дасШсас^с ЬсассаЪсад садасЪддад 240
ссЬдаадаДД &0дсад1:д0а ббасбдЪсад садбабддба дсбсассбсД дбасасДбО^ 300
ддссадддда ссаадсгдда дабсааа 327
<210>49 <211>309 <212> ДНК <213> Ното зарсепз <400> 49
дааа££дДд£ бдасасадДс Оссадссасс сбдЁс^ббдС сгссадддда аададссасс 60
сбсбссбдса дддссадЪса дад^дбИадс адсбасббад ссбддбасса асадааассб 120
ддссаддсСс ссаддсбсс!: сзЪсДаДдаД дсаИссааса дддссас1:дд са^сссадсс 180
аддДбсад^д дсадЬдддбс Сдддасадас ££сас£сЬса ссабсадсад ссДададссб 240
даада^бГСд садбЬДаДДа сДдДсадсад сдбаддасдИ Исддссаадд дассааддбд 300
дааэбсааа 309 <210>50 <211>324 <212> ДНК <213> Ното зараепз
- 79 017086 <400> 50
даааНдЬдЪ Идасдсад^с Ъссаддсасс сХд^сИГСдС. сСссадддда аададссасс 60
сХсСссХдса дддссад£са дадЬдХ^адс адсадсСасЪ Хадсс^дд^а ссадсадааа 12 0
ссСддссадд сХосоаддсЪ сс-ХсаСс^а^ дд^дсаЪССа дсадддссас ХддсаХссса 180
дасаддСЪса д1сддсад^дд д^сЬдддаса дасХЪсас^с ЪсассаЛсад садасХддад 240
ссЪдаадаЪЪ ХГдсадХдХа Ъ£асс.д£сад садхахдд^а дсЁ-сассЪсд дасдхлсддс 300
саадддасса адд^ддааан сааа 324
<210>51 <211>97 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз <400>51
С1П Уа1 С1П Ьеи С1п С1п Тгр О1у АЬа С1у Ьеи Ьеи Ьуз Рго Зег С1и
1 5 10 15
ТЬг Ьеи. Зег Ьеи ТЬг Суз А1а Уа1 Туг С1у С1у Зег РНе Зег С1у Туг
20 25 30
Туг Тгр Зег Тгр Не Агд С1п Рго Рго Й1у Ьуз С1у Ьеи <31и Тгр Не
35 40 45
61у О1и Не Азп Н13 Зег СЬу Зег ТЬг Азп Туг Азп Рго Зег Ьеи Ьуз
50 55 60
Зег Агд Уа1 ТЬг Не Зег Уа1 Азр ТЬг Зег Ьуз Азп С1п РЬе Зег Ьеи
65 70 75 30
Ьуз Ьеи Зег Зег νβΐ ТЬг А1а А1а Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз А1а
85 90 95
Агд
<210> 52
<211> 97
<212> БЕЛОК
<213> Ното 53ρΐβη$
<400> 52
С1и Уа1 С1П Ьеи Уа1 О1и Зег С1у О1у С1у Ьеи Т1е С1п Рго Й1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зех Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг Уа1 Зег Зег Азп
20 25 30
- 80 017086
Туг Мег Зег 35 Тгр Уа1 Агд С1п А1а 40 Рго С1у Луз С1у Леи 45 С1и Тгр Ча1
Зег Уа1 Не Туг Зек С1у С1у Зег ТНг Туг Туг А1. а Азр Зек ча1 Луз
50 55 60
С1у Агд РНе ТЬг 11е Зек Агд Азр Азп Зег Луз Азп ТЬг Леи Туг Леи
65 70 75 80
С1п МеС Азп Зег Леи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз А1а
85 90 95
Агд
<210> 53
<211> 124
<212> БЕЛОК
<213> Ното 8ар±еп£
<400> 53
С1и Уа1 51п Леи Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Леи Уа1 С1п Рго О1у Агд
1 5 10 15'
Зег Леи Агд Леи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Азр Азр Туг
20 25 30
А1а МеЬ Ηίε Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго О1у Луг С1у Леи 61и Тгр Уа1
35 40 45
Зег б1у Не Зег Тгр Азп Зег С1у Зег Не С1у Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Луз 61у Агд РНе ТНг Не Зег Агд Азр Азп А1а Луз Азп Зек Леи Туг
65 70 75 80
Леи С1п НеС Азп Зег Леи Акд А1а С1и Азр ТЬг А1а Леи Туг Тук Суз
85 90 95
А1а Луз Азр Туг С1у Зег С1у Зег Туг Туг Туг Туг Тук СЛу МеС. Азр
100 105 но
Уа1 Тгр О1у С1п С1у ТЬг ТНг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120
<210> 54 <211> 9δ <212> БЕЛОК <213> Ното заркепз
- 81 017086 <400 54
С1и 1 11е Уа1 Ьеи ТНг 5 С1п Зег Рго 61у ТЬг 10 Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 15 С1у
С1и Дгд АТ а ТЬг Ьеи Зег- Суз Агд А1а Зег 61п Зег Уа1 Зег Зег Зег
20 25 30
Туг Ьеи А1а Тгр Туг 01 п С1п Ьуз Рго Е1у С1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи
35 40 45
Не Туг С1у А1а Зег Зег Агд А1а ТЬг Е1у 11е Рго Азр Агд РЬе Зег
50 55 60
С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТНг Не Зег Агд Ьеи С1и
65 70 75 80
Рго С1и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз С1Ь С1п Туг С1у Зег Зег Рго
85 90 95
<210> 55
<211> 105
<212> 1 БЕЛОК
<213> Ното заргепз
<400> 55
С1и Не Уа1 Ьеи ТЬг С1п Зег Рго А1а ТЬг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у
1 5 10 15
61и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Туг
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг 61п 61п Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг Азр А1а Зег Азп Агд А1а ТЬг С1у 11е Рго А1а Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1и Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а Уа1 туг Туг Суз С1п С1п Агд Зег Азп Тгр ТЬг РЬе
85 90 95
С1у 61п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1а 11е Ьуз

Claims (39)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Выделенное человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 90% гомологична аминокислотной последовательности, кодируемой геном УН4-34 человека, геном УН3-53 человека или геном УН3-9, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 90% гомологична аминокислотной последовательности, кодируемой геном УКА27 или геном УКЬ6 человека, где указанное антитело или его антигенсвязывающая часть:
    (a) специфически связывается с человеческим О8Е с Кс=1х 10-7 М или менее;
    (b) индуцирует лизис О8Е+ опухолевых клеток карциномы молочной железы 8КВК3 и О8Етрансфицированных клеток 8КОУ3 посредством антитело-зависимой клеточной цитотоксичности
    - 82 017086 (АЭСС);
    (е) интернализуется О8Е+ опухолевыми клетками карциномы молочной железы 8КВК3.
  2. 2. Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, которые представляют собой полноразмерное антитело изотипа 1дО1 или 1дО4 или его антигенсвязывающую часть.
  3. 3. Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, которые представляют собой фрагменты РаЬ, РаЬ' или РаЬ'2 или одноцепочечное антитело.
  4. 4. Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, где указанное антитело или его антигенсвязывающая часть связываются с человеческим О8Е с Кс=5,5х 10-9 М или менее.
  5. 5. Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, где указанное антитело или его антигенсвязывающая часть связываются с человеческим О8Е с Кс=3х 10-9 М или менее.
  6. 6. Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, где указанное антитело или его антигенсвязывающая часть связываются с человеческим О8Е с Кс=2х 10-9 М или менее.
  7. 7. Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, где указанное антитело или его антигенсвязывающая часть не содержит фукозильных остатков.
  8. 8. Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, содержащие:
    (a) 0ΌΚ1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΙΤ) ГО ΝΘ: 11;
    (b) СЭК2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΙΤ) ГО ΝΘ: 16;
    (е) 0ΌΚ3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΙΤ) ГО ΝΘ: 21;
    (') СЭК1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΙΤ) ГО ΝΘ: 26;
    (е) СЭК2 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΙΤ) ГО ΝΘ: 31;
    (ί) СЭК3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΙΤ) ГО ΝΘ: 36.
  9. 9. Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, содержащие:
    (a) СОК1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΙΤ) ГО ΝΘ: 12;
    (b) СЭК2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΙΤ) ГО ΝΘ: 17;
    (е) СОК3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΙΤ) ГО ΝΘ: 22;
    (') СЭК1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΙΤ) ГО ΝΘ: 27;
    (е) СЭК2 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΙΤ) ГО ΝΘ: 32; и (ί) СЭК3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΙΤ) ГО ΝΘ: 37.
  10. 10. Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, содержащие:
    (a) СОК1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΙΤ) ГО ΝΘ: 13;
    (b) СЭК2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΙΤ) ГО ΝΘ: 18;
    (е) СОК3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΙΤ) ГО ΝΘ: 23;
    (') СЭК1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΙΤ) ГО ΝΘ: 28;
    (е) СЭК2 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΙΤ) ГО ΝΘ: 33; и (ί) СЭК3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΙΤ) ГО ΝΘ: 38.
  11. 11. Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, содержащие:
    (a) СОК1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΙΤ) ГО ΝΘ: 14;
    (b) СЭК2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΙΤ) ГО ΝΘ: 19;
    (е) СОК3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΙΤ) ГО ΝΘ: 24;
    (') СЭК1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность
    - 83 017086
    8ЕО ΙΌ ЫО: 29;
    (е) ί.'ΌΕ2 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ ЫО: 34; и (ί) СЭЕ3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ ЫО: 39.
  12. 12. Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, содержащие:
    (a) СПР1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ ЫО: 15;
    (b) СЭЕ2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ ЫО: 20;
    (c) СПР3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ ЫО: 25;
    (й) СПР1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ ЫО: 30;
    (е) СЭЕ2 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ ЫО: 35; и (ί) СЭЕ3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ ЫО: 40.
  13. 13. Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, содержащие:
    (a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95% гомологична аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ ЫО: 1; и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95% гомологична аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ ЫО: 6.
  14. 14. Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, содержащие:
    (a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95% гомологична аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ ЫО: 2; и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95% гомологична аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ ЫО: 7.
  15. 15. Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, содержащие:
    (a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95% гомологична аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ ЫО: 3; и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95% гомологична аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ ЫО: 8.
  16. 16. Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, содержащие:
    (a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95% гомологична аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ ЫО: 4; и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95% гомологична аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ ЫО: 9.
  17. 17. Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, содержащие:
    (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95% гомологична аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ ЫО: 5;
    и (Ь) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95% гомологична аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ ЫО: 10.
  18. 18. Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности СЭРЕ СЭЕ2 и СПЕ3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательности СЭРЕ СЭЕ2 и СОК3, где:
    (a) последовательность ί.'ΌΕ3 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей 8ЕО ΙΌ ЫО: 21, 22, 23, 24 и 25 и их консервативных модификаций, и (b) последовательность СПР3 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей 8ЕО ΙΌ ЫО: 36, 37, 38, 39 и 40 и их консервативных модификаций.
  19. 19. Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.18, где:
    (a) последовательность ί.'ΌΕ2 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей 8ЕО ΙΌ ЫО: 16, 17, 18, 19 и 20 и их консервативных модификаций, и (b) последовательность СЭЕ2 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную после
    - 84 017086 довательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей δΕρ ΙΌ N0: 31, 32, 33, 34 и 35 и их консервативных модификаций.
  20. 20. Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.18, где:
    (a) последовательность ί.'ΌΒ1 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей δΕρ ΙΌ N0: 11, 12, 13, 14 и 15 и их консервативных модификаций, и (b) последовательность СОВ1 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей δΕρ ΙΌ N0: 26, 27, 28, 29 и 30 и их консервативных модификаций.
  21. 21. Композиция, содержащая антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из пп.1-20 и фармацевтически приемлемый носитель.
  22. 22. Иммуноконъюгат, содержащий антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из пп.1-20, связанные с терапевтическим средством.
  23. 23. Композиция, содержащая иммуноконъюгат по п.22 и фармацевтически приемлемый носитель.
  24. 24. Иммуноконъюгат по п.22, где терапевтическим средством является цитотоксин.
  25. 25. Композиция, содержащая иммуноконъюгат по п.24 и фармацевтически приемлемый носитель.
  26. 26. Иммуноконъюгат по п.22, где терапевтическим средством является радиоактивный изотоп.
  27. 27. Композиция, содержащая иммуноконъюгат по п.26 и фармацевтически приемлемый носитель.
  28. 28. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из пп.1-20.
  29. 29. Экспрессирующий вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.28.
  30. 30. Клетка-хозяин, содержащая экспрессирующий вектор по п.29.
  31. 31. Способ получения анти-08Е-антитела, включающий экспрессию указанного антитела в клеткехозяине по п.30 и выделение указанного антитела из клетки-хозяина.
  32. 32. Способ лечения или предупреждения заболевания, характеризующегося ростом опухолевых клеток, экспрессирующих 08Е, где указанный способ включает введение индивидууму антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-20 в количестве, эффективном для лечения или предупреждения указанного заболевания.
  33. 33. Способ по п.32, где указанным заболеванием является рак.
  34. 34. Способ по п.33, где указанным раковым заболеванием является карцинома молочной железы.
  35. 35. Способ по п.33, где указанным раковым заболеванием является рак яичника.
  36. 36. Способ по п.33, где указанным раковым заболеванием является рак почек.
  37. 37. Способ по п.33, где указанным раковым заболеванием является рак головы и шеи.
  38. 38. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые содержат:
    (a) СОВ1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΕρ ΙΌ N0: 12;
    (b) СОВ2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΕρ ΙΌ N0: 17;
    (c) СОВ3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΕρ ΙΌ N0: 22;
    (б) СОВ1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΕρ ΙΌ N0: 27;
    (е) СОВ2 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΕρ ΙΌ N0: 32; и (ί) СОВ3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΕρ ΙΌ N0: 37, где указанное антитело специфически связывается с 08Е.
  39. 39. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые содержат:
    (a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΕρ ΙΌ N0: 2;
    (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΕρ ΙΌ N0: 7, где указанное антитело специфически связывается с 08Е.
EA200870020A 2005-12-08 2006-12-08 Человеческие моноклональные антитела против о8е и их применение EA017086B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US74891405P 2005-12-08 2005-12-08
US82459306P 2006-09-05 2006-09-05
PCT/US2006/061816 WO2007067991A2 (en) 2005-12-08 2006-12-08 Human monoclonal antibodies to o8e

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200870020A1 EA200870020A1 (ru) 2009-12-30
EA017086B1 true EA017086B1 (ru) 2012-09-28

Family

ID=38123660

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200870020A EA017086B1 (ru) 2005-12-08 2006-12-08 Человеческие моноклональные антитела против о8е и их применение

Country Status (13)

Country Link
US (3) US8609816B2 (ru)
EP (1) EP1963371A2 (ru)
JP (1) JP5714212B2 (ru)
KR (1) KR101469287B1 (ru)
AU (1) AU2006321553B2 (ru)
BR (1) BRPI0620601A2 (ru)
CA (1) CA2630483C (ru)
EA (1) EA017086B1 (ru)
IL (1) IL191340A (ru)
NO (1) NO20083053L (ru)
NZ (1) NZ568015A (ru)
SG (1) SG170080A1 (ru)
WO (1) WO2007067991A2 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2701797C2 (ru) * 2014-12-09 2019-10-01 Ринат Ньюросайенс Корп. Антитела к PD-1 и способы их применения

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5714212B2 (ja) 2005-12-08 2015-05-07 メダレックス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＭｅｄａｒｅｘ， Ｌ．Ｌ．Ｃ． Ｏ８ｅに対するヒトモノクローナル抗体
US9121853B2 (en) * 2006-03-20 2015-09-01 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-H4 expression on tumor vasculature
US8865875B2 (en) 2007-08-22 2014-10-21 Medarex, L.L.C. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with C-terminal extensions
TW200918553A (en) * 2007-09-18 2009-05-01 Amgen Inc Human GM-CSF antigen binding proteins
KR101811965B1 (ko) 2007-11-07 2017-12-22 셀덱스 쎄라퓨틱스, 인크. 인간 수지상 및 상피 세포 205(ｄｅｃ-205)에 결합하는 항체
CN101951959A (zh) * 2007-11-30 2011-01-19 百时美施贵宝公司 抗b7h4单克隆抗体-药物缀合物和使用方法
AR077594A1 (es) 2009-07-31 2011-09-07 Organon Nv Anticuerpos completamente humanos para btla (atenuante de linfocitos b y t)
US8394922B2 (en) 2009-08-03 2013-03-12 Medarex, Inc. Antiproliferative compounds, conjugates thereof, methods therefor, and uses thereof
US10307450B2 (en) * 2010-01-11 2019-06-04 Phoenix Biotechnology, Inc. Method of treating neurological conditions with extract of Nerium species or Thevetia species
US9011937B2 (en) * 2010-11-22 2015-04-21 Phoenix Biotechnology, Inc. Method of treating neurological conditions with extract of Nerium species or Thevetia species
WO2012145568A1 (en) * 2011-04-21 2012-10-26 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Antibodies to human b7x for treatment of metastatic cancer
US8852599B2 (en) 2011-05-26 2014-10-07 Bristol-Myers Squibb Company Immunoconjugates, compositions for making them, and methods of making and use
EP2773651B1 (en) * 2011-11-03 2020-12-23 The Trustees of the University of Pennsylvania Isolated b7-h4 specific compositions and methods of use thereof
SI2814829T1 (sl) 2012-02-13 2017-02-28 Bristol-Myers Squibb Company Spojine enediyna, njegovi konjugati in uporaba in postopki
SG11201504764SA (en) * 2012-12-19 2015-07-30 Amplimmune Inc Anti-human b7-h4 antibodies and their uses
LT2956173T (lt) 2013-02-14 2017-06-26 Bristol-Myers Squibb Company Tubulizino junginiai, gavimo ir panaudojimo būdai
AU2014244424A1 (en) 2013-03-14 2015-08-27 Genentech, Inc. Anti-B7-H4 antibodies and immunoconjugates
US9777013B2 (en) 2013-08-14 2017-10-03 William Marsh Rice University Derivatives of uncialamycin, methods of synthesis and their use as antitumor agents
EP3191518B1 (en) 2014-09-12 2020-01-15 Genentech, Inc. Anti-b7-h4 antibodies and immunoconjugates
WO2016070001A1 (en) * 2014-10-31 2016-05-06 Jounce Therapeutics, Inc. Methods of treating conditions with antibodies that bind b7-h4
US10077287B2 (en) 2014-11-10 2018-09-18 Bristol-Myers Squibb Company Tubulysin analogs and methods of making and use
CA2968382A1 (en) 2014-11-21 2016-05-26 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
MX2017009144A (es) 2015-01-14 2017-11-22 Bristol Myers Squibb Co Dimeros de benzodiazepina unidos con puentes de heteroarileno, conjugados de estos, y sus metodos de preparacion y uso.
HRP20220436T1 (hr) 2015-11-03 2022-05-27 Janssen Biotech, Inc. Protutijela koja se specifično vežu na pd-1 i njihove uporabe
CA3008678A1 (en) 2015-12-21 2017-06-29 Bristol-Myers Squibb Company Variant antibodies for site-specific conjugation
KR20190005924A (ko) 2016-05-10 2019-01-16 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 향상된 안정성을 갖는 튜부리신 유사체의 항체-약물 접합체
JP7023933B2 (ja) 2016-08-19 2022-02-22 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー セコ－シクロプロパピロロインドール化合物、その抗体－薬物コンジュゲート、ならびに製造および使用方法
WO2018075842A1 (en) 2016-10-20 2018-04-26 Bristol-Myers Squibb Company Condensed benzodiazepine derivatives and conjugates made therefrom
CN110719915A (zh) 2017-05-25 2020-01-21 百时美施贵宝公司 包含经修饰的重链恒定区的抗体
US10472361B2 (en) 2017-08-16 2019-11-12 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a benzotriazole moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10508115B2 (en) 2017-08-16 2019-12-17 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having heteroatom-linked aromatic moieties, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10487084B2 (en) 2017-08-16 2019-11-26 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a heterobiaryl moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10494370B2 (en) 2017-08-16 2019-12-03 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a pyridine or pyrazine moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10457681B2 (en) 2017-08-16 2019-10-29 Bristol_Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a tricyclic moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
JP7437301B2 (ja) 2017-08-25 2024-02-22 ファイヴ プライム セラピューティクス インク Ｂ７－ｈ４抗体及びその使用方法
EA202091810A1 (ru) 2018-03-02 2021-01-29 Файв Прайм Терапьютикс, Инк. Антитела к b7-h4 и способы их применения
WO2019209811A1 (en) 2018-04-24 2019-10-31 Bristol-Myers Squibb Company Macrocyclic toll-like receptor 7 (tlr7) agonists
AU2019277094A1 (en) 2018-05-29 2021-01-21 Bristol-Myers Squibb Company Modified self-immolating moieties for use in prodrugs and conjugates and methods of using and making
KR20210035805A (ko) 2018-06-15 2021-04-01 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. 세포후 신호전달 인자의 조절을 통한 면역 활성의 증가
US11554120B2 (en) 2018-08-03 2023-01-17 Bristol-Myers Squibb Company 1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidine compounds as toll-like receptor 7 (TLR7) agonists and methods and uses therefor
EP3887397A1 (en) 2018-11-28 2021-10-06 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
CN113453725A (zh) 2018-11-30 2021-09-28 百时美施贵宝公司 包含含有谷氨酰胺的轻链c末端延伸的抗体、其缀合物以及方法和用途
US20220031860A1 (en) 2018-12-12 2022-02-03 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies modified for transglutaminase conjugation, conjugates thereof, and methods and uses
EP3962493A2 (en) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of modulating immune activity/level of irf or sting or of treating cancer, comprising the administration of a sting modulator and/or purinergic receptor modulator or postcellular signaling factor
US20220289863A1 (en) * 2019-06-14 2022-09-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Antibodies against muc1 and methods of use thereof
WO2021055306A1 (en) 2019-09-16 2021-03-25 Bristol-Myers Squibb Company Dual capture method for analysis of antibody-drug conjugates
WO2021127217A1 (en) 2019-12-17 2021-06-24 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Combination anti-cancer therapies with inducers of iron-dependent cellular disassembly
US20230355804A1 (en) 2020-06-29 2023-11-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Viruses engineered to promote thanotransmission and their use in treating cancer
TW202241954A (zh) 2021-01-04 2022-11-01 美商梅爾莎納醫療公司 靶向ｂ７－ｈ４之抗體－藥物共軛體和使用彼之方法
WO2022212784A1 (en) 2021-03-31 2022-10-06 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
KR20240026507A (ko) 2021-06-29 2024-02-28 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. 타노트랜스미션을 촉진시키도록 엔지니어링된 면역 세포 및 이의 용도
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer
US20240269251A1 (en) 2023-01-09 2024-08-15 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Genetic switches and their use in treating cancer

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002002624A2 (en) * 2000-06-30 2002-01-10 Amgen, Inc. B7-like molecules and uses thereof
WO2002006317A2 (en) * 2000-07-17 2002-01-24 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
WO2004101756A2 (en) * 2003-05-09 2004-11-25 Diadexus, Inc. Ovr110 antibody compositions and methods of use
WO2004113500A2 (en) * 2003-06-16 2004-12-29 The University Of Washington B7s1: an immune modulator
WO2006104677A2 (en) * 2005-03-24 2006-10-05 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Antibodies that bind ov064 and methods of use therefor

Family Cites Families (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6255458B1 (en) * 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US6107045A (en) * 1994-06-30 2000-08-22 Oklahoma Medical Research Foundation Antibodies to lipoproteins and apolipoproteins and methods of use thereof
WO1999063088A2 (en) 1998-06-02 1999-12-09 Genentech, Inc. Membrane-bound proteins and nucleic acids encoding the same
US20020198149A1 (en) * 1997-06-16 2002-12-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
WO1999025877A1 (en) 1997-11-18 1999-05-27 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the breast
US20020034749A1 (en) 1997-11-18 2002-03-21 Billing-Medel Patricia A. Reagents and methods useful for detecting diseases of the breast
US7339033B2 (en) 1998-06-26 2008-03-04 Genentech, Inc. Pro1481
DE69939874D1 (de) 1998-09-02 2008-12-18 Diadexus Inc Verfahren zur diagnose, bewertung sowie bilddarstellung verschiedener krebserkrankungen
US7888477B2 (en) 1998-12-17 2011-02-15 Corixa Corporation Ovarian cancer-associated antibodies and kits
US6699664B1 (en) 1998-12-17 2004-03-02 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US6528253B1 (en) 1998-12-17 2003-03-04 Corixa Corporation Compositions and methods for diagnosis of ovarian cancer
US6962980B2 (en) 1999-09-24 2005-11-08 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US6468546B1 (en) 1998-12-17 2002-10-22 Corixa Corporation Compositions and methods for therapy and diagnosis of ovarian cancer
US6488931B1 (en) 1998-12-17 2002-12-03 Corixa Corporation Compositions and methods for therapy and diagnosis of ovarian cancer
US6670463B1 (en) 1998-12-17 2003-12-30 Corixa Corporation Compositions and methods for therapy of ovarian cancer
US6858710B2 (en) * 1998-12-17 2005-02-22 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US7708993B2 (en) 1999-02-03 2010-05-04 Amgen Inc. Polypeptides involved in immune response
EP1149114B1 (en) 1999-02-03 2014-04-02 Amgen Inc. Polypeptides involved in immune response
US7232889B2 (en) 1999-03-08 2007-06-19 Genentech, Inc. PRO300 antibodies
US7368527B2 (en) 1999-03-12 2008-05-06 Human Genome Sciences, Inc. HADDE71 polypeptides
US6943235B1 (en) 1999-04-12 2005-09-13 Agensys, Inc. Transmembrane protein expressed in prostate cancer
EP1210418B1 (en) 1999-06-02 2010-08-18 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
JP2003501108A (ja) 1999-06-11 2003-01-14 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド ４７個のヒト分泌タンパク質
JP5004390B2 (ja) 1999-08-23 2012-08-22 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド 新規ｂ７−４分子およびその用途
BR0013581A (pt) 1999-08-23 2002-07-02 Dana Faber Cancer Inst Inc Pd-1, um receptor para b7-4, e usos para isto
US6429303B1 (en) 1999-09-03 2002-08-06 Curagen Corporation Nucleic acids encoding members of the human B lymphocyte activation antigen B7 family and methods of using the same
AU1807401A (en) 1999-11-30 2001-06-12 Corixa Corporation Compositions and methods for therapy and diagnosis of breast cancer
US20020146727A1 (en) 1999-11-30 2002-10-10 Dillon Davin C. Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
US20040142361A1 (en) 1999-11-30 2004-07-22 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
US20040259152A1 (en) 2000-02-22 2004-12-23 Richard Murray Novel methods of diagnosing and screening for modulators of tissue remodeling and treating related diseases
AU6802801A (en) 2000-03-01 2001-09-24 Genentech Inc Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20060154313A1 (en) 2000-04-13 2006-07-13 Immunex Corporation Human B7 polypeptide B7-H3A
US7030219B2 (en) 2000-04-28 2006-04-18 Johns Hopkins University B7-DC, Dendritic cell co-stimulatory molecules
US20030031675A1 (en) 2000-06-06 2003-02-13 Mikesell Glen E. B7-related nucleic acids and polypeptides useful for immunomodulation
DE60132699T2 (de) 2000-06-06 2009-01-29 Bristol-Myers Squibb Co. Nukleinsäuren und polypeptide, die sich auf b7 beziehen und ihre verwendungen zur immunmodulierung
AU2001275437A1 (en) 2000-06-09 2001-12-17 Idec Pharmaceuticals Corporation Gene targets and ligands that bind thereto for treatment and diagnosis of ovarian carcinomas
JP2004502414A (ja) 2000-06-30 2004-01-29 ヒューマン　ジノーム　サイエンシーズ，　インコーポレイテッド Ｂ７様ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体
AU2001283507A1 (en) 2000-07-27 2002-02-13 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-h3 and b7-h4, novel immunoregulatory molecules
WO2002043478A2 (en) * 2000-11-30 2002-06-06 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
US20040005592A1 (en) 2001-03-05 2004-01-08 Emtage Peter C.R. Materials and methods relating to therapy and diagnosis using targeting of cells that express DCAL-Hy polypeptides
US6783969B1 (en) 2001-03-05 2004-08-31 Nuvelo, Inc. Cathepsin V-like polypeptides
US20040053250A1 (en) 2001-03-05 2004-03-18 Tang Y. Tom Novel arginine-rich protein-like nucleic acids and polypeptides
US20030087250A1 (en) 2001-03-14 2003-05-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules and proteins for the identification, assessment, prevention, and therapy of ovarian cancer
WO2002086083A2 (en) 2001-04-20 2002-10-31 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods of enhancing cell responsiveness
KR100932577B1 (ko) * 2001-05-18 2009-12-17 기린 홀딩스 가부시키가이샤 항 ｔｒａｉｌ-ｒ 항체
JP4181032B2 (ja) 2001-05-25 2008-11-12 アムジェン インコーポレーテッド Ｂ７関連タンパク質−２分子およびその使用
WO2002098358A2 (en) 2001-06-04 2002-12-12 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis and treatment of androgen-dependent prostate cancer, prostate cancer undergoing androgen-withdrawal, and androgen-independent prostate cancer
JP2005508144A (ja) 2001-06-18 2005-03-31 イオス バイオテクノロジー，インコーポレイティド 卵巣癌の診断方法、卵巣癌のモジュレーターをスクリーニングする組成物及び方法
US7189507B2 (en) 2001-06-18 2007-03-13 Pdl Biopharma, Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
AU2002322280A1 (en) 2001-06-21 2003-01-21 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer
US20040076955A1 (en) 2001-07-03 2004-04-22 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of bladder cancer, compositions and methods of screening for modulators of bladder cancer
JP2003052374A (ja) 2001-08-10 2003-02-25 Kirin Brewery Co Ltd 新規樹状細胞膜分子及びそれをコードするｄｎａ
WO2003022806A2 (en) 2001-09-07 2003-03-20 The Scripps Research Institute Cbi analogues of cc-1065 and the duocarmycins
US20070042360A1 (en) 2001-09-17 2007-02-22 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer
US7135174B2 (en) * 2002-01-07 2006-11-14 Amgen Fremont, Inc. Antibodies directed to PDGFD and uses thereof
JP2003245082A (ja) 2002-02-25 2003-09-02 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd 糸球体硬化症の疾患マーカーおよびその利用
US20080025981A1 (en) 2002-03-04 2008-01-31 Young Paul E Cancer-linked genes as targets for chemotherapy
AU2003249691A1 (en) 2002-06-07 2003-12-22 Avalon Pharmaceuticals, Inc Cancer-linked gene as target for chemotherapy
US7304149B2 (en) 2002-06-20 2007-12-04 Washington University In St. Louis BTLA nucleic acids
US7052694B2 (en) 2002-07-16 2006-05-30 Mayo Foundation For Medical Education And Research Dendritic cell potentiation
EP1581641A4 (en) 2002-12-06 2006-11-15 Diadexus Inc COMPOSITIONS, SPREADING VARIATIONS AND METHODS RELATED TO OVARAL SPECIFIC GENES AND PROTEINS
AU2004211958A1 (en) 2003-02-05 2004-08-26 Genentech, Inc. Identification of cellular polypeptides differentially expressed by tumor cells
JP2007528720A (ja) * 2003-08-12 2007-10-18 ダイアックス コーポレイション Ｔｉｅ１結合リガンド
US20050208627A1 (en) 2003-09-18 2005-09-22 Bowdish Katherine S Elicitation of antibodies to self peptides in mice by immunization with dendritic cells
US20070054378A1 (en) 2003-09-18 2007-03-08 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Elicitation of antibodies to self peptides in mice by immunization with dendritic cells
PT1725249E (pt) 2003-11-06 2014-04-10 Seattle Genetics Inc Compostos de monometilvalina capazes de conjugação a ligandos
JP5047626B2 (ja) 2003-12-10 2012-10-10 メダレックス インコーポレイテッド インターフェロンα抗体及びその使用
BRPI0510909A2 (pt) 2004-05-19 2008-12-16 Medarex Inc composto de ligaÇço fÁrmaco-ligante citotàxico, formulaÇço farmacÊutica, mÉtodo para matar uma cÉlula e mÉtodo para retardar ou interromper o crescimento de tumor
US7501119B2 (en) 2004-06-30 2009-03-10 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and molecules for modulating an immune response
JP5173428B2 (ja) 2004-11-10 2013-04-03 ディアデクサス インコーポレーテッド Ｏｖｒ１１０抗体組成物および使用方法
JP2008526883A (ja) 2005-01-07 2008-07-24 ディアデクサス インコーポレーテッド Ｏｖｒ１１０抗体組成物および使用方法
EP1863340A2 (en) 2005-03-11 2007-12-12 Genentech, Inc. Gene disruptions, compositions and methods relating thereto
US20090118175A1 (en) 2005-05-06 2009-05-07 Macina Roberto A Compositions and Methods for Detection, Prognosis and Treatment of Breast Cancer
CA2607291A1 (en) 2005-05-12 2006-11-23 Steven D. Levin Compositions and methods for modulating immune responses
SI1907000T2 (sl) 2005-06-08 2020-07-31 Dana-Farber Cancer Institute Postopki in sestavki za zdravljenje persistentne HIV infekcije z inhibicijo programiranih celični smrtnih 1 (PD-1) poti
WO2006138670A2 (en) 2005-06-16 2006-12-28 Virxsys Corporation Antibody complexes
AU2006294554B2 (en) 2005-09-26 2013-03-21 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Antibody-drug conjugates and methods of use
CA2624730A1 (en) 2005-10-04 2007-04-12 The John Hopkins University Compositions and methods for treating inflammation
EP1957539B1 (en) * 2005-12-08 2013-04-17 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to protein tyrosine kinase 7 (ptk7) and their use
CA2633161A1 (en) 2005-12-08 2007-06-14 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Methods and compositions for expanding t regulatory cells
JP5714212B2 (ja) 2005-12-08 2015-05-07 メダレックス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＭｅｄａｒｅｘ， Ｌ．Ｌ．Ｃ． Ｏ８ｅに対するヒトモノクローナル抗体
JP5564181B2 (ja) 2005-12-08 2014-07-30 シルワン，ハヴァル 免疫刺激組成物および方法
US20090215084A1 (en) 2006-01-05 2009-08-27 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-h1 and b7-h4 in cancer
AU2007227292B2 (en) 2006-03-17 2012-04-12 Biogen Ma Inc. Stabilized polypeptide compositions
US9121853B2 (en) 2006-03-20 2015-09-01 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-H4 expression on tumor vasculature
JP5564249B2 (ja) 2006-06-23 2014-07-30 アレシア・バイオセラピューティクス・インコーポレーテッド 癌に関与するポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列
TWI412367B (zh) 2006-12-28 2013-10-21 Medarex Llc 化學鏈接劑與可裂解基質以及其之綴合物
CN101951959A (zh) 2007-11-30 2011-01-19 百时美施贵宝公司 抗b7h4单克隆抗体-药物缀合物和使用方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002002624A2 (en) * 2000-06-30 2002-01-10 Amgen, Inc. B7-like molecules and uses thereof
WO2002006317A2 (en) * 2000-07-17 2002-01-24 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
WO2004101756A2 (en) * 2003-05-09 2004-11-25 Diadexus, Inc. Ovr110 antibody compositions and methods of use
WO2004113500A2 (en) * 2003-06-16 2004-12-29 The University Of Washington B7s1: an immune modulator
WO2006104677A2 (en) * 2005-03-24 2006-10-05 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Antibodies that bind ov064 and methods of use therefor

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FISHWILD D. M. ET AL.: "High-avidity human IgG kappa monoclonal antibodies from a novel strain of mini locus transgenic mice", NATURE BIOTECHNOLOGY, JUL 1996, vol. 14, no. 7, July 1996 (1996-07), pages 845-851, XP002442150, ISSN: 1087-0156, the whole document *
LONBERG NILS: "Human antibodies from transgenic animals", NATURE BIOTECHNOLOGY SEP 2005, vol. 23, no. 9, September 2005 (2005-09), pages 1117-1125, XP002442149, ISSN: 1087-0156, the whole document *
SHIELDS ROBERT L. ET AL.: "Lack of fucose on human IgG1 N-linked oligosaccharide improves binding to human Fcgamma RIII and antibody-dependent cellular toxicity", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 26 JUL 2002, vol. 277, no. 30, 26 July 2002 (2002-07-26), pages 26733-26740, XP002442140, ISSN: 0021-9258, cited in the application the whole document *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2701797C2 (ru) * 2014-12-09 2019-10-01 Ринат Ньюросайенс Корп. Антитела к PD-1 и способы их применения

Also Published As

Publication number Publication date
US8609816B2 (en) 2013-12-17
US20160168249A1 (en) 2016-06-16
JP5714212B2 (ja) 2015-05-07
KR20080090389A (ko) 2008-10-08
NO20083053L (no) 2008-09-08
US20090074660A1 (en) 2009-03-19
US9296822B2 (en) 2016-03-29
IL191340A (en) 2015-08-31
WO2007067991A3 (en) 2007-09-13
CA2630483C (en) 2015-05-19
CA2630483A1 (en) 2007-06-14
EA200870020A1 (ru) 2009-12-30
JP2009518049A (ja) 2009-05-07
AU2006321553A1 (en) 2007-06-14
US9988453B2 (en) 2018-06-05
US20140134180A1 (en) 2014-05-15
KR101469287B1 (ko) 2014-12-04
WO2007067991A2 (en) 2007-06-14
EP1963371A2 (en) 2008-09-03
AU2006321553B2 (en) 2012-03-08
BRPI0620601A2 (pt) 2011-11-16
NZ568015A (en) 2012-03-30
SG170080A1 (en) 2011-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA017086B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела против о8е и их применение
ES2386366T3 (es) Anticuerpo monoclonal humano contra el antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA)
KR101960509B1 (ko) 클라우딘 6 특이적 항체
ES2562790T3 (es) Anticuerpos monoclonales contra Glipicano-3
JP5535074B2 (ja) メソテリンに結合するヒト抗体およびその使用
EA019344B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела против лиганда-1 запрограммированной гибели клеток (pd-l1) и их применения
ES2489641T3 (es) Nuevo anticuerpo anti-CD98
DK2403878T3 (en) CADM1-SPECIFIC FULLY HUMAN ANTIBODIES
EA018836B1 (ru) Человеческие антитела, которые связываются с cxcr4, и их применение
EA017812B1 (ru) Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, которые связываются с протеинтирозинкиназой 7 ( ptk7) человека, и их применение
EA017491B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела к фукозил-gm1 и способы применения антифукозил-gm1 антител
EA016186B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела к cd70 и их применение
EA023032B1 (ru) Человеческие антитела, связывающие ген активации лимфоцитов-3 (lag-3), и их применение
ES2696518T3 (es) Anticuerpos monoclonales para el tratamiento de cáncer
JP2012502938A (ja) 癌の治療のためのモノクローナル抗体
EA030182B1 (ru) Антитела, специфические для кадгерина-17
KR20150080032A (ko) 암치료용 모노클로날 항체
EP2616100B1 (en) Compositions and methods for treatment of drug resistant multiple myeloma
RU2638457C2 (ru) Антитела, специфически связывающие рецептор 1 типа фактора роста фибробластов, применение антител для лечения онкологического заболевания, способ получения антител

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

PD4A Registration of transfer of a eurasian patent in accordance with the succession in title
PD4A Registration of transfer of a eurasian patent in accordance with the succession in title