JP4530895B2 - ペプチド固定化用固相担体及びその使用方法 - Google Patents

Description

本発明は、ペプチドを固相表面に配置・固定する為の固相担体およびその使用方法に関する。

遺伝子活性の評価や、薬物効果の分子レベルでの生理的プロセスを解読するための試みは、伝統的にゲノミクスに焦点が当てられてきたが、プロテオミクスは、細胞の生物学的機能についてより詳細な情報を提供する。プロテオミクスは、遺伝子レベルというよりもむしろ、蛋白質レベルでの発現を検出しそして定量することによる、遺伝子活性の定性的かつ定量的な測定を含む。また、蛋白質の翻訳後修飾、蛋白質間の相互作用など遺伝子にコードされない事象の研究を含む。

「生命の設計図」であるゲノムの構造が明らかにされ、膨大なゲノム情報の入手が可能となった今日、プロテオミクス研究はますます盛んになっており、それに伴って生理活性物質検出の迅速高効率（ハイスループット）化が求められている。この目的の分子アレイとして、ＤＮＡチップが開発され、実用化されつつある。一方、生体機能において最も複雑で多様性の高い蛋白質の検出に関してはプロテインチップが提唱され、近年研究が進められている。プロテインチップとは、蛋白質、またはそれを捕捉する分子をチップ（微小な基板）表面に固定化したものを総称する。

しかし、現状のプロテインチップは一般にＤＮＡチップの延長線上に位置付けられて開発がなされているため、ガラス基板上に蛋白質、またはそれを捕捉する分子をチップ表面に固定化する検討がなされている（例えば特許文献１参照）。

一方で、高機能性分子であるタンパク質を、その機能を保持させたまま効率良く基材表面に固定化し、更にその特異的な相互作用を定量的に検出するということは、克服すべき課題も多く非常に困難を極める。その為、タンパク質の機能をミメティックできる、比較的安定な低分子としてペプチドを利用する場面が増えつつある。ペプチドはコンビナトリアルに合成する技術が確立されてきており、ペプチドアレイはハイスループットな生理活性物質検出という目的に合った手法であると言える。

蛋白質やペプチド等の検体の検出および定量について、ペプチドを固相担体に固定化する場合について考えると、ELISA様の抗原抗体反応によって検出や定量を行う方法が考えられる。すなわち、固相表面にペプチドを結合させ、次いで固定化したペプチドを認識して結合する抗体（一次抗体）を反応させ、更に一次抗体を認識して結合する標識抗体（二次抗体）を反応させ、この標識物を測定することで蛋白やペプチドを定量的に測定する方法である。
この手法を用いる事で、抗体が認識するエピトープを探索したり、特定のタンパク質に結合する抗体をスクリーニングする、などといった作業がハイスループットに行うことが可能となる。（例えば非特許文献１）

またペプチドはタンパク質の断片である為、あるタンパク質に作用する酵素が認識して反応する部位のペプチドを用いる事で、酵素とタンパク質の反応をミメティックする事が可能となる。すなわち、種々のペプチドから作製したペプチドアレイを用いて、特定の酵素の基質や阻害剤のスクリーニングを行うことが可能となる。（例えば非特許文献１）

非常に有用であるペプチドアレイだが、ペプチドは低分子であるがゆえに、タンパク質のように担体表面に物理化学吸着させることは難しい。よって、ペプチドを固定化する為に、担体表面に反応性官能基を導入し、共有結合によってペプチドを固定化する必要がある。これまでは、数段階の処理工程を経てガラス表面に官能基を導入していた。その為ペプチドアレイの作製に時間と手間がかかり、便利性や汎用性に欠けるといった欠点があった。

また、ペプチドを基板上に固定化した後、該表面上で他のタンパク質（ELISA法の場合は一次抗体に相当）と反応させ、更に、標識されたタンパク質（同じく二次抗体に相当）を反応させ最終的に検出機等で検出する場合、ペプチドが固定されていない部分にペプチド以外のタンパク質、すなわち、抗体や標識されたタンパク質が固定されると、検出時にノイズとなり信号対雑音比（Ｓ／Ｎ比）を低下させる原因となり、検出精度を低下させる（例えば非特許文献２参照）。

このため、抗体や標識されたタンパク質の非特異吸着を防止するため、ブロッキング剤のコーティングが必要となるが、これらの非特異吸着防止能は十分でない。また、ペプチドを固定化した後にブロッキング剤をコーティングするため、固定化したペプチドの上にコーティングされてしまう場合があり、一次抗体と反応しにくいという問題があった。このため、ペプチド固定化後のブロッキング工程がなく、かつ生理活性物質の非特異吸着量の少ないバイオチップが求められている。

一方、すべてのタンパク質（プロテオーム）の変動をプロファイリングする技術面では、超微量のタンパク質や数ナノリットルというような超微量の溶液の操作を可能とするマイクロフルイディクスの技術や、チップ上での前処理、分離、検出を目標とする「ラボ・オン・チップ」の概念が重要となってくる。この技術においては、サンプルであるタンパク質などの生理活性物質が、流路内に固定化されたキャプチャーと特異的に反応し、かつキャプチャー部以外の流路の内壁への非特異吸着を抑制することが必要となる。
特開２００１−１１６７５０号公報 「DOJIN NEWS １０９号 ケミストからみたポストゲノム９」、同仁化学研究所、2004年 「ＤＮＡマイクロアレイ実戦マニュアル」、林崎良英、岡崎康司編、羊土社、2000年、p.57

本発明の目的は、簡便で短時間評価が可能なペプチド固定化用の固相担体及び固相担体の使用方法を提供することである。

本発明は以下のとおりである。
（１）固相表面にペプチドを固定化し、固定化した該ペプチドと特異的に反応する生理活性物質を作用させ、該ペプチドと特異的に反応した生理活性物質、又は特異的に反応した該ペプチドを蛍光、発光又は発色を用いて検出する際に用いる固相担体であって、固相材質がプラスチックからなり、かつ固相表面にホスホリルコリン基を有する単量体及び活性エステル基を有する単量体を共重合して得られる高分子物質を有することを特徴とするペプチド固定化用固相担体。
（２）固相の形態が、平板状基板、マイクロウェルプレート、微細流路を有する基板、又はマイクロビーズである（１）記載のペプチド固定化用固相担体。
（３）前記ホスホリルコリン基が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である（１）又は（２）記載のペプチド固定化用固相担体。
（４）前記活性エステル基がｐ − ニトロフェニルエステル基又はＮ − ヒドロキシスクシンイミドエステル基である（１）〜（３）いずれか記載のペプチド固定化用固相担体。
（５）前記高分子物質が更にブチルメタクリレート基を含む単量体との共重合体である（１）記載のペプチド固定化用固相担体。
（６）前記プラスチックがポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、飽和環状ポリオレフィン、ポリペンテン、ポリアミド、又はそれらの共重合体よりなる群より選択された少なくとも１ 種である（１）〜（５） いずれか記載のペプチド固定化用固相担体。
（７）（１）〜（６） いずれか記載のペプチド固定化用固相担体にペプチドを固定化した固相担体。
（８）（１）〜（６）いずれか記載のペプチド固定化用固相担体の使用方法であって、
（ａ）固相表面にペプチドを固定化する工程、
（ｂ）該ペプチドと特異的に反応する生理活性物質を作用させる工程、及び（ｃ）該ペプチドと特異的に反応した生理活性物質又は特異的に反応した該ペプチドを蛍光、発光又は発色を用いて検出する工程、を含むペプチド固定化用固相担体の使用方法。
（９）前記ペプチドと特異的に反応する生理活性物質が蛋白質である（８）記載のペプチド固定化用固相担体の使用方法。

本発明の固相担体によれば、ペプチドを効率よく簡単に固相担体に結合する事が可能となり、また、タンパク質や蛍光色素の非特異吸着を効果的に抑制する事から、簡便かつハイスループットなペプチドアレイやペプチドプレートの評価、ペプチド抗体のスクリーニング等が可能となる。

本発明の担体は、固相表面にホスホリルコリン基及び活性エステル基を有する高分子物質を有することを特徴とする。ホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質は、タンパク質や蛍光物質の非特異的吸着を抑制する性質とペプチドを固定化する性質とを併せ持つポリマーである。ホスホリルコリン基を有するポリマーは、生体膜（リン脂質二重層膜）類似の構造を有しているポリマーであって、生理活性物質の吸着を抑制する効果を有する（例えばIshihara K, Tsuji T, Kurosaki T, Nakabayashi N, Journal of Biomedical Materials Research, 28(2), pp.225-232, (1994)４など）。また、活性エステルはペプチドを固定化する役割を果たす。上記ポリマーの特性により、固相担体表面への生理活性物質や蛍光物質の非特異的吸着を効果的に抑制する事が可能となり、その結果、固相担体表面に固定化したペプチドと特異的に反応した生理活性物質のみを捕獲する事が可能となる。

本発明に使用するホスホリルコリン基としては、例えば２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、アリルホスホリルコリン、ブテニルホスホリルコリン、ヘキセニルホスホリルコリン、オクテニルホスホリルコリン、デセニルホスホリルコリン等を挙げられるが、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンがより好ましい。

本発明に使用する活性エステル基としては、例えばｐ−ニトロフェニルエステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、コハク酸イミドエステル基、フタル酸イミドエステル基、５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドエステル基、等が好ましく、ｐ−ニトロフェニルエステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基がより好ましい。
本発明に使用する高分子物質は、ホスホリルコリン基を有する単量体及び活性エステル基を有する単量体を共重合して得られる高分子物質であることが好ましい。更にホスホリルコリン基及び活性エステル基以外に他の基を含んでもよく、ブチルメタクリレート基を含む単量体との共重合体が好ましい。

（固相担体の素材）
本発明の固相担体は、固相材質がプラスチックであることを特徴とする。
プラスチックとしては、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂を用いることができるが、熱可塑性樹脂の方が製造効率の観点から好ましい。熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましく、例えばポリエチレンやポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリアミド、環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等が挙げられる。耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα―オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体をさす。

前者の例としては、例えばノルボルネン、ジシクロペンタジエン、テトラシクロドデセンに代表されるノルボルネン系モノマー、および、これらのアルキル置換体を開環重合して得られる重合体を水素添加して製造される飽和重合体である。

後者の共重合体はエチレンやプロピレン、イソプロピル、１−ブテン、３−メチル−１−ブテン、１−ペンテン、３−メチル−１−ペンテン、１−ヘキセン、１−オクテン等のα―オレフィンと環状オレフィン系モノマーのランダム共重合体を水素添加することにより製造される飽和重合体である。共重合体では、エチレンとの共重合体が最も好ましい。
これら樹脂は単独で用いてもよく、２種類またはそれ以上の共重合体あるいは混合物であってもよい。また、樹脂成分以外に繊維状、球状その他の形状を有する無機物あるいは有機物充填材、または各種添加剤成分を含んでもよい。

（固相担体の形状）
固相担体の形状としては、平板状基板、マイクロウェルプレート、マイクロビーズ、微細流路形状を有した基板等が挙げられる。
マイクロビーズ表面にペプチドを固定化させた担体の場合、基板やプレートに固定化させた場合に比べペプチドを固定化できる表面積が大幅に増加するため、結果的に多くの検出目的となるタンパク質を捕獲でき、Ｓ／Ｎ比の増加が可能となる。
また微細流路内にペプチドを固定化した場合、ペプチドが検出目的となるタンパク質を捕獲できる頻度が相対的に増加するため、反応時間の短縮ができる。
さらには、ペプチドを固定化したマイクロビーズを微細流路内に封入した場合、前記の利点の両方が達成できる。

（ペプチドの固定化）
本発明においてペプチドを固相上に固定化する際には、ペプチドを溶解又は分散させる液体を付着する方法が好ましい。ペプチドを溶解又は分散した液体のｐHは８〜１０であることが好ましく、ｐH９．０〜９．５がより好ましい。下限値未満だと固定化反応の効率が著しく低下し、上限値を超えるとペプチドが変性する可能性が高くなる。
ペプチド付着後は、固相表面のホスホリルコリン基の特性により、界面活性剤を含む水や緩衝液で洗浄することで、ペプチドと反応しうるタンパク質や蛍光物質の固相表面への非特異吸着を抑制することが可能となる。しかし、タンパク質や蛍光物質に固相表面の活性エステルと反応しうる官能基が多く含まれる場合、ペプチドを固定化した以外の固相表面に残存する活性エステルの不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行うことが好ましい。
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを好ましく用いることができる。
一級アミノ基を有する化合物としては、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５−アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ−２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを好ましく用いることができ、水酸化ナトリウム、アミノエタノール、グリシンがより好ましい。

（固定化するペプチドの配列）
活性エステル基との反応性を高めるため、固定化するペプチドにはシステイン残基やリジン残基を導入することが好ましい。システインやリジン残基の導入位置はペプチド鎖末端であることが望ましい。

以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例）
ポリスチレン樹脂製の９６ウェルマイクロプレート（住友ベークライト製 ELISA用プレートS MS-8496F）の各ウェルを２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−ｐ−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート共重合体の０．３重量％エタノール溶液１５０mlに浸漬することにより、基材表面にホスホリルコリン基を有するポリマーを導入した。
次に、リン酸緩衝液を用いて２０mg/mlに希釈し、ｐＨが９．０に調整されたソマトスタチンペプチド１００mlを添加したウェルと、リン酸緩衝液１００mlのみを添加したウェルを準備し、37℃で２時間静置してペプチド固定化させた後に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有のＰＢＳで洗浄を行った。その後、一次抗体である市販のウサギ抗ソマトスタチン抗体（biomeda社製 ４１６M）および市販のビオチン標識ヒツジ抗ウサギIgG抗体（Serotec社製 ２AB０２B）を用いて抗原抗体反応を起こさせ、更に市販のペルオキシダーゼ標識アビジン（ICN社製 ５５８９８）を用いて酵素標識した。その後、ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト社製 ＭＬ−１１２０Ｔ）を用いて、過酸化水素を基質とする発色反応を行い、発色基質として用いたTMBZ（３，３‘，５，５’テトラメチルベンチジン）の吸光度を測定した。その際のシグナル値、ブランク値、およびＳ／Ｎ比（Signal/noise ratio）を計算した。結果を表１に示す。

（比較例）
表面にカルボキシル基が直接結合した、ポリスチレン樹脂製の９６ウェルマイクロプレート（住友ベークライト製 ELISA用プレートカルボ MS-8796F）をペプチド固定化用基材として用いた。
ＰＢＳ（ｐH５．８）で１０mg/mlに調製したＷＳＣ（１-エチル-３-（３-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）１００mlを各ウェルに添加し、37℃で2時間静置した。反応後、ＰＢＳ（ｐＨ５．８）で洗浄し、ＰＢＳ（ｐＨ５．８）で２０mg/mlに希釈したソマトスタチンペプチド１００mlと、ＰＢＳ（ｐＨ５．８）１００mlのみを添加したウェルを準備し、37℃で2時間反応させた後に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有のＰＢＳで洗浄を行った。
ペプチドと反応させるタンパク質が基材表面へ非特異吸着するのを抑制する為、ブロッキング剤として５％スキムミルク溶液３００mlを各ウェルに添加し、室温で2時間静置した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有のＰＢＳで洗浄を行った。
その後、実施例と同様に、市販のウサギ抗ソマトスタチン抗体（biomeda社製 ４１６M）および市販のビオチン標識ヒツジ抗ウサギIgG抗体（Serotec社製 ２AB０２B）を用いて抗原抗体反応を起こさせ、更にペルオキシダーゼ標識アビジン（ICN社製 ５５８９８）を用いて酵素標識した。その後、ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト社製 ＭＬ−１１２０Ｔ）を用いて、過酸化水素を基質とする発色反応を行い、発色基質として用いたTMBZ（３，３‘，５，５’テトラメチルベンチジン）の吸光度を測定した。その際のシグナル値、ブランク値、およびＳ／Ｎ比（Signal/noise ratio）を計算した。結果を表１に示す。

使用した試薬の希釈倍率（濃度）は以下のとおりである。
ウサギ抗ソマトスタチン抗体（１０mg/ml）： ２５０倍希釈で使用
ビオチン標識ヒツジ抗ウサギIgG抗体（１mg/ml）：５０００倍希釈で使用
ペルオキシダーゼ標識アビジン（５mg）：１０００倍希釈で使用

実施例および比較例における吸光度の測定には、ＴＥＣＡＮ社製ＳＰＥＣＴＲＡＦＬＵＯＲを用い、測定波長４５０ｎｍ、参照波長６２０ｎｍで測定した。
実施例は、シグナル値は比較例に比べて高く、ブランク値は比較例に比べて低かった。ＳＮ比に関しても、実施例は比較例に比べて高く、高感度でのペプチドの検出が可能であった。更に実施例は、基材表面の活性化やタンパク質の非特異吸着を防ぐ為の操作などは一切不要であり、比較例に比べて操作が簡便であり、評価時間も短縮された。

本発明のペプチド固定化用固相担体を用いることで、ブロッキング剤をコーティングすることなしに、ペプチドを固相担体の任意の位置に固定化し、それ以外の部分への不要な生理活性物質や蛍光物質の吸着および結合を抑制することでき、高感度でハイスループットなペプチドアレイやペプチドプレートの評価が可能となる。また形状の自由度も高く、マイクロビーズやマイクロフルイディクスを含む各種バイオチップの検出方法に適用できる。

Claims (9)

1. 固相表面にペプチドを固定化し、固定化した該ペプチドと特異的に反応する生理活性物質を作用させ、該ペプチドと特異的に反応した生理活性物質、又は特異的に反応した該ペプチドを蛍光、発光又は発色を用いて検出する際に用いる固相担体であって、固相材質がプラスチックからなり、かつ固相表面にホスホリルコリン基を有する単量体及び活性エステル基を有する単量体を共重合して得られる高分子物質を有することを特徴とするペプチド固定化用固相担体。
2. 固相の形態が、平板状基板、マイクロウェルプレート、微細流路を有する基板、又はマイクロビーズである請求項１記載のペプチド固定化用固相担体。
3. 前記ホスホリルコリン基が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である請求項１又は２記載のペプチド固定化用固相担体。
4. 前記活性エステル基がｐ − ニトロフェニルエステル基又はＮ − ヒドロキシスクシンイミドエステル基である請求項１〜３いずれか記載のペプチド固定化用固相担体。
5. 前記高分子物質が更にブチルメタクリレート基を含む単量体との共重合体である請求項１記載のペプチド固定化用固相担体。
6. 前記プラスチックがポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、飽和環状ポリオレフィン、ポリペンテン、ポリアミド、又はそれらの共重合体よりなる群より選択された少なくとも１ 種である請求項１〜５ いずれか記載のペプチド固定化用固相担体。
7. 請求項１〜６ いずれか記載のペプチド固定化用固相担体にペプチドを固定化した固相担体。
8. 請求項１〜６いずれか記載のペプチド固定化用固相担体の使用方法であって、
   （ ａ ） 固相表面にペプチドを固定化する工程、
   （ ｂ ） 該ペプチドと特異的に反応する生理活性物質を作用させる工程、及び（ ｃ ） 該ペプチドと特異的に反応した生理活性物質又は特異的に反応した該ペプチドを蛍光、発光又は発色を用いて検出する工程、を含むペプチド固定化用固相担体の使用方法。
9. 前記ペプチドと特異的に反応する生理活性物質が蛋白質である請求項８記載のペプチド固定化用固相担体の使用方法。