JP4347211B2

JP4347211B2 - バイオチップ用基板およびバイオチップ

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Publication number: JP4347211B2
Application number: JP2004374686A
Authority: JP
Inventors: 一彦石原; 創平舩岡; 兼久横山
Original assignee: Sumitomo Bakelite Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Bakelite Co Ltd
Priority date: 2004-12-24
Filing date: 2004-12-24
Publication date: 2009-10-21
Anticipated expiration: 2024-12-24
Also published as: JP2006184015A

Description

本発明は、生体試料中の多数の蛋白質、核酸等の並列検出および分析に用いられるバイオチップに関する。より詳細には、本発明は、プロテオミクス、ならびに遺伝子活性の細胞内蛋白質レベルでの測定に用いられるバイオチップ用基板に関する。

遺伝子活性の評価や疾患プロセス、薬物効果の生物学的プロセスを含む生物学的プロセスを解読するための試みは、伝統的に、ゲノミクスに焦点が当てられてきたが、プロテオミクスは、細胞の生物学的機能についてより詳細な情報を提供する。プロテオミクスは、遺伝子レベルというよりもむしろ、蛋白質レベルでの発現を検出し、定量することによる、遺伝子活性の定性的かつ定量的な測定を含む。また、蛋白質の翻訳後修飾、蛋白質間の相互作用など遺伝子にコードされない事象の研究を含む。
膨大なゲノム情報の入手が可能となった今日、プロテオミクス研究はますます迅速高効率（ハイスループット）化が求められている。この目的の分子アレイとしてＤＮＡチップが実用化されてきた。一方、生体機能において最も複雑で多様性の高い蛋白質の検出に関しては、プロテインチップが提唱され、最近研究が進められている。プロテインチップとは、蛋白質、またはそれを捕捉する分子をチップ（微小な基板）表面に固定化したものを総称する。

しかし、現状のプロテインチップは一般にＤＮＡチップの延長線上に位置付けられて開発がなされている為、ガラス基板上に蛋白質、またはそれを捕捉する分子をチップ表面に固定化する検討がなされている（例えば、特許文献１参照）。固定化する方法としては２通りの方法が実施されている。その一つはは蛋白質の物理的吸着による固定化の方法である。この方法では、蛋白質を固定化した後に２次抗体の非特異的吸着を防止するため、吸着防止剤のコーティングが行われているが、これらの非特異的吸着防止能は十分でない。また１次抗体を固定化した後に吸着防止剤をコーティングするため固定化した蛋白質の上にコーティングされてしまい、２次抗体と反応できないという問題があった。このため、１次抗体の固定化後、吸着防止剤をコーティングすることなく、生理活性物質の非特異的吸着量の少ないバイオチップが求められている。
もう一つは化学的共有結合により蛋白質を固定化する方法である。基板表面に設けた、活性エステルなどの官能基を介して蛋白質を固定化する方法である。この方法では、蛋白質を固定化した後に、固定化部以外の場所に残存する官能基を処理することが必要であるが、官能基を十分に残存官能基を処理できずに、２次抗体と残存官能基が反応して、固定化され、結果として信号対雑音費を低下させる原因となり、検出制度を低下させる原因となっていた。
特開２００１−１１６７５０号公報「ＤＮＡマイクロアレイ実戦マニュアル」、林崎良英、岡崎康司編、羊土社、2000年、p.57

本発明は、化学的共有結合により蛋白質を固定化するバイオチップにおいて、その官能基を完全に処理することにより、２次抗体などとの反応による信号対雑音費を低下させることのない検出精度の高いバイオチップ用基板を提供することを目的とする。

本発明は、
（１）固相基板の表面に生理活性物質を固定化するバイオチップ用基板であって、基板表面にホスホリルコリン基及び活性エステル基を有する高分子物質を含む層が形成され、前記層の膜厚が１ｎｍ以上２０未満であることを特徴とするバイオチップ用基板、
（２）ホスホリルコリン基が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である（１）記載のバイオチップ用基板、
（３）活性エステル基がｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基及び5−ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド基から選ばれる少なくとも１つの基を有するものである（１）又は（２）いずれか記載のバイオチップ用基板、
（４）前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体である（１）〜（３）いずれか記載のバイオチップ用基板、
（５）固相基板がプラスチック製である（１）〜（４）いずれか記載のバイオチップ用基板、
（６）プラスチックが飽和環状ポリオレフィン、である（５）記載のバイオチップ用基板、
（７）固相基板がガラス製である（１）〜（４）いずれか記載のバイオチップ用基板、
（８）（１）〜（７）いずれか記載のバイオチップ用基板に生理活性物質を固定化したバイオチップ、
である。

本発明によれば、２次抗体の固定化されることなく、検出対象物質の非特異的な吸着・結合を抑制できる検出精度の高いバイオチップ用基板を得ることができる。

本発明のバイオチップ用基板は、ホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を含む層を１ｎｍ以上２０ｎｍ未満として有することを特徴とする。ホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を有する層は、生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質と生理活性物質を固定化する性質とを併せ持つポリマーで、ホスホリルコリン基は生理活性物質の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、活性エステルは生理活性物質を固定化する役割を果たす。

本発明に使用するバイオチップ用基板の固相基板の素材は、ガラス、プラスチック、金属その他を用いることができるが、表面処理の容易性、量産性の観点から、プラスチックが好ましく、熱可塑性樹脂がより好ましい。
熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましく、たとえばポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィン、ポリメチルメタクリレート、含フッ素樹脂等を用いることが好ましく、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる飽和環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体をさす。

本発明に使用する高分子物質は、ホスホリルコリン基及び活性エステル基を含む。
本発明に使用するホスホリルコリン基としては、例えば２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、アリルホスホリルコリン、ブテニルホスホリルコリン、ヘキセニルホスホリルコリン、オクテニルホスホリルコリン、デセニルホスホリルコリン等を挙げられるが、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。

本発明に使用する「活性エステル基」は、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。実際的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。
このような活性エステル基としては、たとえばｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、5−ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド基等で活性化された活性エステル基が挙げられるが、ｐ−ニトロフェニル基で活性化されたp−ニトロフェニルカルボニルオキシ基が好ましく用いられる。
本発明に使用する高分子物質は、ホスホリルコリン基及び活性エステル基以外に他の基を含んでもよく、ブチルメタクリレート基を含む単量体との共重合体が好ましい。

基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を含む層を導入するには、ホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質の溶液に基板を浸漬した後に風乾する方法が好ましい。またホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質の溶液に基板を浸漬した後、良溶媒と貧溶媒の混合溶媒にて基板を洗浄し、風乾あるいは遠心乾燥する方法が好ましい。またスピンコーティングにより層を形成する方法も好ましい。

ホスホリルコリン基及び活性エステル基を有する高分子物質を含む層の膜厚は、１ｎｍ以上２０ｎｍ未満であることが必要である。１ｎｍ未満ではシグナル強度が十分に得られない問題がある。２０ｎｍを超えるとバックグランド値が高くなる問題がある。

ホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質の溶液に基板を浸漬した後に風乾する方法では、ホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質の濃度は０．０１〜０．３重量％が好ましい。さらに好ましくは０．０５〜０．１５重量％である。これによって、層の厚みを１〜２０nmに調整することが可能になる。

ホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質の溶液に基板を浸漬した後、良溶媒と貧溶媒の混合溶媒にて基板を洗浄し、風乾あるいは遠心乾燥する方法では、ホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質の濃度は０．０５〜１．０重量％が好ましい。さらに好ましくは０．０５〜０．３重量％である。良溶媒としてはアルコール類が好ましく、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノールなどが挙げられる。特に好ましくはエタノール、メタノールである。貧溶媒としては水が好ましい。良溶媒と貧溶媒の混合比率は良溶媒：貧溶媒＝１０：９０〜９０：１０（体積分率）であることが好ましい。特に好ましくは良溶媒：貧溶媒＝５０：５０（体積分率）である。これによって、層の厚みを１〜２０nmに調整することが可能になる。

本発明のバイオチップ用基板を使用して各種の生理活性物質を固定化することができる。固定化する生理活性物質として核酸を用いる場合、活性エステル基との反応性を高めるため、アミノ基の導入位置は分子鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端にアミノ基が導入されていることが好ましい。生理活性物質がアプタマー、蛋白質、オリゴペプチド、糖鎖、糖蛋白質の場合もアミノ基を有することが好ましい。

（実施例１）
飽和環状ポリオレフィン樹脂をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して固相基板を作成した。この固相基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート共重合体の０．０５重量％エタノール溶液に浸漬、風乾することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を有する層を導入した。エリプソメータによる層の厚みは１５ｎｍであった。

（実施例２）
飽和環状ポリオレフィン樹脂をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して固相基板を作成した。この固相基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート共重合体の０．３重量％エタノール溶液に浸漬したあと、エタノール／水の混合溶媒にて洗浄、風乾することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を有する層を導入した。エリプソメータによる層の厚みは５ｎｍであった。

(比較例１)
飽和環状ポリオレフィン樹脂をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して固相基板を作成した。固相基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート共重合体の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を有する層を導入した。エリプソメータによる層の厚みは６０ｎｍであった。

(比較例２)
飽和環状ポリオレフィン樹脂をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して固相基板を作成した。固相基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート共重合体の０．００１重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を有する層を導入した。エリプソメータによる層の厚みは０．１ｎｍであった。

（実験）
次に該基板上でサンドイッチ法を実施した。詳細はまず、該基板に自動スポッターにより表１に示した希釈倍率で調製された一次抗体である抗マウスＩｇＧ２ａをスポット後、室温４℃の環境下に２４時間静置した。その後、0.1規定の水酸化ナトリウム水溶液に浸漬することにより活性エステルを失活させた。その後1.0％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液に1時間浸漬した。
その後、抗原であるマウス IgG2aと抗原抗体反応を実施後、二次抗体であるビオチン標識抗マウス IgG2aと抗原抗体反応を実施した。最後にCy5標識されたストレプトアビジンと反応させ、各スポットについて蛍光量測定を行った。結果を表１に示す。

実施例および比較例における蛍光量の測定には、Packard BioChip Technologies社製マイクロアレイスキャナー「ScanArray」を用いた。測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度６０％、励起波長６４９ｎｍ、測定波長６７０ｎｍ、解像度５０μｍであった。
実施例は、高いスポットシグナル値、低いバックグランド値が観測されたが、比較例１は高いバックグランド値をしめした。比較例２はバックグランド値は低いがスポットシグナル強度が低かった。

Claims

固相基板の表面に生理活性物質を固定化するバイオチップ用基板であって、基板表面にホスホリルコリン基及び活性エステル基を有する高分子物質を含む層が形成され、前記層の膜厚が１ｎｍ以上２０ｎｍ未満であることを特徴とするバイオチップ用基板。
ホスホリルコリン基が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である請求項１記載のバイオチップ用基板。
活性エステル基がｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基及び5−ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド基から選ばれる少なくとも１つの基を有するものである請求項１又は２記載のバイオチップ用基板。
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む単量体との共重合体である請求項１〜３いずれか記載のバイオチップ用基板。
固相基板がプラスチック製である請求項１〜４いずれか記載のバイオチップ用基板。
プラスチックが飽和環状ポリオレフィン、である請求項５記載のバイオチップ用基板。
固相基板がガラス製である請求項１〜４いずれか記載のバイオチップ用基板。
請求項１〜７いずれか記載のバイオチップ用基板に生理活性物質を固定化したバイオチップ。