JP4074365B2 - ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子及び該遺伝子破壊株 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ断片及びそれを用いたラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作成方法に関する。更に詳しくは、ブレビバクテリウム・フラバム等のコリネ型細菌由来のラクテートデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ断片及びそれを用いた染色体ＤＮＡとの相同性組換えの原理による、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作成方法に関する。
【０００２】
乳酸は、アミノ酸、有機酸等の各種ファインケミカルズを製造する場合の副生物である。
【０００３】
【従来の技術】
ラクテートデヒドロゲナーゼは、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を補酵素として、ピルビン酸を還元して乳酸を生成する酵素であるが、大腸菌あるいはコリネ型細菌等の微生物を用いて、リジン、トレオニン、イソロイシン、グルタミン酸等のアミノ酸、および、コハク酸、フマル酸、クエン酸等の有機酸等の各種ファインケミカルズを製造しようという場合は、副生物として乳酸等を生成する原因となる。そこで、従来は、例えばリジン製造において副生物の乳酸生成を抑える方法として、培養中の酸素供給濃度を十分に保つことにより乳酸の生成を抑える方法などが知られていた（K.Akashi et al., Agric. Biol. Chem., 43, 2087, 1979）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記方法は、ファインケミカルズの製造に用いる微生物の培養中の、酸素濃度をコントロールするという煩雑な操作等が必要となり、ファインケミカルズを製造しようとする場合において作業効率が低減する結果となる。そこで、このように乳酸生成を抑えるために酸素濃度をコントロールする必要のない、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性の低減あるいは欠如した菌株を取得することが望まれていた。
【０００５】
ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊された微生物菌株としては、大腸菌(Escherichia coli)(J.Bacteriol., Vol.153, p.588-596)等で知られているが、これらの菌株を得る方法は、ランダム変異導入法により変異導入した菌株の中からスクリーニングするという煩雑な実験操作を要する方法であり、これまでに、アミノ酸、あるいは、有機酸等のファインケミカルズ製造において産業上重要なコリネ型細菌において取得された例はなく、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊されたコリネ型細菌の簡便な取得方法が望まれていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、遺伝子組換えの手法を駆使することにより、コリネ型細菌からラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子ＤＮＡを単離することに成功し、該ＤＮＡ断片を用いることにより効率的にラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株を作製することが可能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明の要旨は、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡにある。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【０００８】
上記ＤＮＡとして具体的には、下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【０００９】
また本発明は、前記ＤＮＡがベクターに連結されてなる組換えベクターＤＮＡ、及び、配列番号１記載のＤＮＡもしくはこのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、又はその一部がベクターに連結されてなる組換えベクターＤＮＡを提供する。
【００１０】
本発明はさらに、前記ＤＮＡ又は組換えベクターＤＮＡと、微生物細胞の染色体ＤＮＡ上のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子との相同組換えによりラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊された、微生物のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株を提供する。
【００１１】
本発明はまた、前記ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株を培地で培養し、その培養物からアミノ酸または有機酸（有機酸を除く）を採取することを特徴とする、アミノ酸または有機酸の製造方法を提供する。
【００１２】
上記ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の親株としては、コリネ型細菌、より具体的には、ブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ−２３３株が挙げられる。
本発明の「ラクテートデヒドロゲナーゼ（L-lactate dehydrogenase：EC 1.1.1.27）」とは、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を補酵素として、ピルビン酸を還元して乳酸を生成する酵素を意味する。また、本明細書では、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを、便宜上「ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子」ということがある。
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明のＤＮＡは、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であり、前記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡである。
【００１４】
本発明のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子は、本発明によりその塩基配列が決定されたので、この配列に基づいて合成することも可能であるが、本発明においてはコリネ型細菌からクローニングすることにより、初めて得られたものである。ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の供給源としては、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有するコリネ型細菌であれば特に制限はない。
【００１５】
上記のようなコリネ型細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス、ブレビバクテリウム・フラバム等が挙げられる。さらに具体的には、例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株が挙げられる。本菌株は、昭和５０年４月２８日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現生命工学工業技術研究所）に微工研菌寄第３０６８号として寄託され、昭和５６年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、微工研条寄第１４９７号（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）の受託番号で寄託されている。
【００１６】
以下に、上記微生物からラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子ＤＮＡ断片を取得する方法、該遺伝子ＤＮＡ断片を用いたラクテートデヒドロゲナーゼ破壊株の作製方法の一例を説明する。
【００１７】
本発明のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子ＤＮＡ断片は、コリネ型細菌の染色体ＤＮＡ、具体的には、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）株等の染色体ＤＮＡから以下に述べる方法で単離、塩基配列決定することができる。
【００１８】
まず、上記コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３を常法［例えば、特開昭５１−１３０５９２参照］に従い培養し、培養物から菌体を集め、該菌体から染色体ＤＮＡを抽出する。染色体ＤＮＡは、例えば、特開平５−１５３７８の実施例１（Ａ）に記載の方法等により菌体から容易に抽出することができる。
【００１９】
上記菌株より染色体ＤＮＡを抽出する際には、適当な培地で培養した該菌株の菌体を使用することができるが、培養した菌体を集菌後に凍結保存した保存試料を使用することも可能である。
【００２０】
枯草菌（バチルス・サチリス）等のラクテートデヒドロゲナーゼの一次構造（アミノ酸配列）の相同性の高い部分から逆翻訳したオリゴデオキシリボヌクレオチドをプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の部分断片を得る。このようなプライマーとしては、配列番号３および４に示すアミノ酸配列に相当する配列番号５および６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。配列番号３および４に示すアミノ酸配列は、後記実施例で詳述するように、枯草菌（バチルス・サチリス(Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ)）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、マイコプラズマ・ハイオニューモニア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）間で、それらが持つラクテートデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列において保存されている領域から選択したものである。
【００２１】
ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片を適当なクローニングベクター、例えばｐＧＥＭ−Ｔ（プロメガ社製）へサブクローニングし、エシェリヒア・コリＪＭ１０９株（宝酒造製）を形質転換する。この形質転換株を適当な抗生物質選択下で培養し、培養物から菌体を回収し、菌体から常法、例えばアルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを抽出する。このプラスミドに挿入されたＤＮＡの塩基配列を決定することにより、本発明のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得することができる。
【００２２】
得られたＤＮＡ断片の塩基配列は、例えば、ジデオキシヌクレオチド酵素法［Dideoxy chain termination 法；Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. sci. U.S.A., Vol.74, p.5463, (1977)］により決定することができる。
【００２３】
上記のようにして、後記実施例で得られたラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の部分断片の塩基配列を決定し、アミノ酸配列に翻訳して解析した結果、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の部分断片は、配列番号２記載のアミノ酸配列の８６番目から１７９番目までで示されるアミノ酸配列にあたる部分からなり、またそれをコードする遺伝子は、例えば、配列番号１記載の塩基配列中の２５６番目から５３７番目までの塩基配列で示される部分にあたるものであった。
【００２４】
ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子全体を含むＤＮＡ断片を得るには、遺伝子の単離に関する公知のいずれの方法もが使用できるが、例えば、ブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ２３３等のコリネ型細菌の染色体ＤＮＡライブラリーを作製し、上記ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子部分断片をプローブとするハイブリダイゼーションにより、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子全体を含む染色体ＤＮＡを単離する方法が挙げられる。以下にその一例を説明する。
【００２５】
（Ａ）染色体ＤＮＡライブラリーの作製：
上記菌株より抽出した染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩを用いて部分分解し、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の宿主−ベクター系を用いて染色体ＤＮＡのライブラリーを作製する。具体的に使用し得るベクターとしては、例えばλＦＩＸＩＩ（東洋紡績（株）製）等のラムダファージベクター、ｐＵＣ１１８（宝酒造製）、ｐＢＲ３２２（宝酒造製）、コスミドｐＷＥ−１５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドベクターが挙げられる。
【００２６】
上記部分分解により得られる様々なＤＮＡ断片の上記ベクターへの挿入、例えばファージベクターλＦＩＸＩＩ（東洋紡績（株）製）への挿入は、適当な制限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩで開裂したベクターと部分分解ＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結することにより行うことができる。かくして染色体ＤＮＡライブラリーが得られる。
【００２７】
（Ｂ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むベクターの選別：
上記（Ａ）項で調製した染色体ＤＮＡライブラリーからラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むベクターを選別するには、この染色体ＤＮＡライブラリーを用いて宿主微生物、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の形質導入あるいは形質転換を行い、得られる形質導入体あるいは形質転換体から、適当な手段によりラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を保持するクローンを選別すればよい。
【００２８】
具体的には、上記ファージベクターをエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、例えばＰ２３９２株［Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， Ｖｏｌ．７， ｐ．１５１３ （１９７９）］に感染させ、これを寒天培地上に重層することによりプラークを形成させる。次いでこのプラーク中のファージＤＮＡをニトロセルロース膜に移し取り、このファージＤＮＡを該ニトロセルロース膜に固定し、前記のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の部分断片をプローブとして用いたプラークハイブリダイゼーション［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）］を行う。こうして、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株の染色体ＤＮＡ由来のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を有するファージベクターを含む形質導入体を検出し、選別することが可能である。
【００２９】
あるいは上記プラスミドベクターを用いて染色体ＤＮＡライブラリーを調製した場合には、このライブラリーＤＮＡでエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、得られた形質転換体から前記のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の部分断片をプローブとして用いたコロニーハイブリダイゼーション法［Ｒ． Ｂｒｕｃｅ Ｗａｌｌａｃｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， Ｖｏｌ．９， ｐ．８７９ （１９８１）］を行うことによっても選別可能である。
【００３０】
更に、上記のようにして選別された形質導入体あるいは形質転換体よりファージＤＮＡ、あるいはプラスミドＤＮＡを抽出し、挿入断片を適当な制限酵素でベクターから切り出すことで本発明のＤＮＡを取得することができる。
【００３１】
上記操作によって切り出されたＤＮＡ断片につき、前記のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の部分断片をプローブとして用いてサザンハイブリダイゼーション［Ｅ． Ｍ． Ｓｏｕｔｈｅｒｎ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ．９８， ｐ．５０３ （１９７５）］を行うことにより、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が挿入ＤＮＡ断片内に存在することを再確認できる。
【００３２】
このようにして得られるＤＮＡ断片の１つとして、上記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断して得られる、大きさが約４．８ｋｂのＤＮＡ断片を挙げることができる。さらに、上記ＤＮＡ断片の塩基配列を決定したところ、両断片中にはオープンリーディングフレームの存在が確認され、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子のコード領域は、後記配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列中のアミノ酸番号１〜３１４の３１４個のアミノ酸配列をコードする９４５塩基対から構成されることがわかった。また、得られた塩基配列（配列番号１）には、前記のＰＣＲに用いたプライマーに相当する配列（配列番号５及び６）を含むことが確認された。
【００３３】
本発明におけるラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子は、天然の細菌、例えばコリネ型細菌の染色体ＤＮＡから分離されたもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばベックマン社製／オリゴ１０００Ｍ ＤＮＡ合成装置（Oligo 1000M DNA Synthesizer）を用いて合成されたものであってもよい。
【００３４】
また、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を損なわない範囲で、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡも、本発明に含まれる。ここで「数個」とは、好ましくは４０個以下、より好ましくは２０個以下である。
【００３５】
上記のようなＤＮＡの一態様として、例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸同士、例えば、６０％以上、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。
【００３６】
尚、後述するように、本発明のＤＮＡをコリネ型細菌のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作製に用いる場合には、該ＤＮＡはラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする必要はなく、生理的条件下、すなわち微生物細胞内で、染色体上のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子と相同組換えを起こすことができ、それによってラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を破壊することができる程度の相同性を有していればよい。このような相同性としては、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性が挙げられる。また、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作製に用いるＤＮＡは、染色体上のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子と相同組換えを起こすことができ、それによってラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を破壊することができる程度の大きさであれば、本発明のＤＮＡの一部であってもよい。ここで一部とは、好ましくは５０塩基以上、より好ましくは１００塩基以上の長さを有するものが挙げられる。
【００３７】
本発明のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子は、例えば、ラクテートデヒドロゲナーゼやリンゴ酸の製造に用いることができる。すなわち、本発明のＤＮＡが導入された微生物、例えば本発明のＤＮＡがベクターに連結されてなる組換えベクターＤＮＡで形質転換された微生物は、ラクテートデヒドロゲナーゼを高生産することが予想される。
【００３８】
また、本発明のＤＮＡは、コリネ型細菌のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作製に用いることができる。本発明のＤＮＡ又はその一部を用いたコリネ型細菌のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊法としては、該ＤＮＡをカナマイシン耐性遺伝子あるいはクロラムフェニコール耐性遺伝子等のマーカーと結合した後、電気パルス法(Electroporation)等により菌体内に導入した後、マーカーで選択することにより、相同組換えによって該ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子部分断片を宿主微生物染色体上へ組み込むことが可能となる（Biosci. Biotech. Biochem., Vol.57, p.2036-2038, 1993）。
【００３９】
かくして得られる微生物から、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株を効率的に取得することができる。
上記のようにして得られるラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株は、実質的に活性のあるラクテートデヒドロゲナーゼを産生しないので、アミノ酸、有機酸等の各種ファインケミカルズの製造の際の乳酸の副生を低減することができる。
【００４０】
本発明の方法により製造されるアミノ酸としては、特に限定されないが、具体的にはリジン、トレオニン、イソロイシン、グルタミン酸等が挙げられる。また、本発明の方法により製造される有機酸としては乳酸以外のものであれば特に限定されないが、具体的にはコハク酸、フマル酸、クエン酸等が挙げられる。
【００４１】
【実施例】
以上に本発明を説明してきたが、下記の実施例によりさらに具体的に説明する。しかしながら、実施例は本発明の具体的な認識を得る一助とみなすべきのものであり、本発明の範囲を何等限定するものではない。
【００４２】
〔実施例１〕ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子断片の一部（Ａ断片）のクローン化およびその塩基配列の決定
【００４３】
（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の全ＤＮＡの抽出
半合成培地Ａ培地［組成：尿素２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4 ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、グルコース２０ｇ、蒸留水１Ｌ］１Ｌに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ−２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液１５ｍｌに懸濁した。
【００４４】
次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールをゆっくりと加えた。水層とエタノール層の間に存在するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲに使用した。
【００４５】
（Ｂ）プライマーの選択
ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子は、原核生物では、バチルス・サチリス（Microbiology, 142, 3047-3056, 1996）、ラクトコッカス・ラクティス（J. Bacteriol., 174, 6956-6964, 1992）、マイコプラズマ・ハイオニューモニア（J. Gen. Microbiol., 139, 317-323, 1993）、ストレプトコッカス・ミュータンス（GenBank Database Accession No. M72545）、ラクトバチルス・カゼイ（Appl. Environ. Microbiol., 57, 2413-2417, 1991）等のものが知られている。これら５種の微生物のラクテートデヒドロゲナーゼにおいて保存されている領域を検討し、配列番号３および４のアミノ酸配列を基に、配列番号５および６に示す塩基配列を有する２つのプライマーを選択し、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて合成した。
【００４６】
（配列番号５）CARAARCCNG GNGARAC
（配列番号６）TCNCCRTGYT CNCCNAT
（配列中、ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを示し、ここでＡはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンを示す。）
【００４７】
これら２つのプライマーを用いて上記（１）で調製した染色体を鋳型としてＰＣＲを行うと、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が存在する限り、（ａ）と（ｂ）の組み合わせで約３００ｂｐの反応産物が得られると期待される。
【００４８】
（Ｃ）ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応はパーキンエルマーシータス社製のＤＮＡサーマルサイクラーを用いて下記の条件で行った。
【００４９】
反応液：
５０ｍＭ ＫＣｌ
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2
鋳型ＤＮＡ ５μｌ
上記（Ｂ）で作製したプライマー 各々０．２５μＭ
ｄＮＴＰｓ 各々２００μＭ
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造） ２．５ｕｎｉｔｓ
以上を混合し、１００μｌとした。
【００５０】
ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒
アニーリング過程：５５℃ １２０秒
エクステンション過程：７２℃ １８０秒
以上を１サイクルとし、３０サイクル行った。
【００５１】
（Ｄ）反応物の検出
上記（Ｃ）で生成した反応液１０μｌを２％アガロースゲルにより電気泳動を行って約３００ｂｐの断片の検出を行った。
【００５２】
（Ｅ）増幅断片のクローン化
上記（Ｃ）項で得た反応液３μｌと、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔ（ＰＲＯＭＥＧＡより市販）１μｌを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2及びＴ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、４℃で１５時間反応させ、結合させた。
【００５３】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含む培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【００５４】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔの長さ３．０ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約３００ｂｐの挿入断片が認められた。
【００５５】
（Ｆ）増幅断片の塩基配列の決定
（Ｅ）項で得られた長さが約３００ｂｐの増幅断片について、その塩基配列をジデオキシヌクレオチド酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法）（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ, ７４，５４６３，１９７７）により決定した。その結果得られたＤＮＡ塩基配列およびその翻訳アミノ酸配列を配列表配列番号１および２に示す。本アミノ酸配列は、枯草菌、あるいは、ラクトバシルスのラクテートデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の一部分と高い相同性を示し、本ＤＮＡ断片がブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ−２３３株由来のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の部分断片であることが明らかになった。
【００５６】
［実施例２］ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子全体のクローン化およびその塩基配列の決定
（Ｇ）ゲノミック・サザンハイブリダイゼーション
上記（Ａ）項で得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の染色体ＤＮＡ溶液の９０μｌに制限酵素ＨｉｎｄIII、５０Ｕ（ｕｎｉｔｓ）を加え、３７℃で１時間反応させ完全分解し、アガロースゲル電気泳動に供した後、アガロースゲルよりＤＮＡをナイロン膜上に移し取った。前記（Ｅ）項で取得したラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子部分断片を、宝酒造製 Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2 を用いて、Exo-free Klenow Fragment 及び［α−32Ｐ］ｄＣＴＰによりラジオアイソトープラベル［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５８，３０７−３１５（１９８６）］した。アイソトープラベルされたプローブを用い、常法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に従ってサザンハイブリダイゼーションを行った。
【００５７】
その結果、ＨｉｎｄIII処理したものは上記ナイロン膜上の約４．８ｋｂの位置に、上記プローブが強くハイブリダイズするＤＮＡ断片の存在を確認した。
【００５８】
（Ｈ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の染色体ＤＮＡライブラリーの作製
上記（Ａ）項で得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の染色体ＤＮＡ溶液の９０μｌに制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ ５ｕｎｉｔｓを加え、３７℃で１０分間反応させて部分分解した。この様々な長さの部分分解ＤＮＡと、制限酵素ＸｈｏＩで切断後、ＤＮＡポリメラーゼクレノーフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ）を用いてｄＴＴＰ（２’−デオキシチミジン５’−トリフォスフェート）、ｄＣＴＰ（２’−デオキシシチジン５’−トリフォスフェート）で切断末端を埋めたファージベクターλＦＩＸＩＩ（λＦＩＸＩＩ／ＸｈｏＩ−ｐａｒｔｉａｌ ｆｉｌｌ−ｉｎ ｔｒｅａｔｅｄ ＤＮＡ：東洋紡績（株）社製）とを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、および、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、１６℃で１０時間反応させて部分分解ＤＮＡとベクターとを連結させ、染色体ＤＮＡのλＤＮＡライブラリーを得た。
【００５９】
（Ｉ）目的組換え体ＤＮＡの選別
上記（Ｈ）項で作製したλＤＮＡライブラリーファージ溶液（２〜５×１０4ｐｆｕ；ＳＭ緩衝液希釈）と、エシェリヒア・コリＰ２３９２の培養液を当量混合し、３７℃で１５分間保温した。これに５０℃にて保温しておいた３〜４ｍｌのλ培地（１％ トリプトン、０．５％ 酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ、０．２％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５％ 寒天）を加え、λプレート（１％ トリプトン、０．５％ ＮａＣｌ、０．２％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１％ 寒天）に均一に塗布し、３７℃で１２〜１６時間培養した。
【００６０】
この培地上にニトロセルロースフィルターを載せ、培地上に形成されたプラークをフィルターに吸着させ、順次５分間ずつ以下イ）〜ハ）の試薬に浸した濾紙上にフィルターをのせて処理した。
【００６１】
イ）０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ
ロ）０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ
ハ）２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ；ＮａＣｌ １７５．３ｇ，クエン酸三ナトリウム二水和物 ８８．２ｇを蒸留水１Ｌに溶解）
上記フィルターを風乾後、８０℃にて２時間乾熱処理をしてＤＮＡを固定した。
【００６２】
前記ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子部分断片をプローブとして用い、上記で作製したフィルターにつきプラークハイブリダイゼーションを常法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に従って行った。
【００６３】
この結果、上記ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子部分断片をプローブとしてハイブリダイゼーション陽性のプラークＬＤＨ２３３を選択した。ＬＤＨ２３３からファージＤＮＡを抽出し、制限酵素ＨｉｎｄIIIにより切断したところ、ゲノミック・サザンハイブリダイゼーションの結果と一致する、長さ約４．８ｋｂのＨｉｎｄIII挿入断片をアガロースゲル電気泳動により確認することができた。
【００６４】
（Ｊ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子のサブクローニング：
上記（Ｉ）項で得られた長さが約４．８ｋｂのＨｉｎｄIII−ＤＮＡ断片上に存在するラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の位置をさらに特定するために、該ＤＮＡ断片を下記のようにプラスミドｐＵＣ１１８（宝酒造（株）社製）へサブクローニングした。
【００６５】
上記ＬＤＨ２３３から抽出したファージＤＮＡからＨｉｎｄIIIで切り出されるＤＮＡ断片と、クローニングベクターｐＵＣ１１８（宝酒造（株）製）を、各々制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断した後、脱リン酸化処理したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2およびＴ４ＤＮＡリガーゼ １ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、１６℃で１０時間反応させ、上記ＨｉｎｄIII断片とベクターを連結させた。
【００６６】
得られた連結反応液を用い、塩化カルシウム法［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５３， ｐ．１５９（１９７０）］により エシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造（株）社製）を形質転換し、アンピシリン ５０μｇ／ｍｌを含む培地［トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【００６７】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを各々制限酵素ＨｉｎｄIIIにより切断し、ハイブリダイゼーション法を用いて挿入断片を調べたところ、プラスミドｐＵＣ１１８の長さ３．４ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約４．８ｋｂのＨｉｎｄIII−ＤＮＡ断片が確認された。
【００６８】
上記で得られたプラスミドを各々ｐＵＣ１１８−ＬＤＨ２３３と命名し、該プラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリＪＭ１０９株（宝酒造（株）製）を各々、ＥＣＬＤＨ２３３と命名した。
【００６９】
（Ｋ）塩基配列の決定
上記（Ｊ）項で得られたラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む長さが約４．８ｋｂのＤＮＡ（ＨｉｎｄIII−ＨｉｎｄIII）断片について、その塩基配列をｐＵＣ１１８（宝酒造（株）社製）を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法）［Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｖｏｌ．７４，ｐ．５４６３，（１９７７）］により決定した。
【００７０】
塩基配列決定の結果、約４．８ｋｂのＤＮＡ（ＨｉｎｄIII−ＨｉｎｄIII）断片は、その塩基配列中のオープンリーデイングフレームの存在から、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子は、後記配列表の配列番号１に示す塩基配列を有し、３１４個のアミノ酸をコードする９４５塩基対より構成されることが判明した。この遺伝子がコードするアミノ酸配列を、配列番号２に示す。尚、この塩基配列の中には、実施例２の（Ｆ）項で決定した塩基配列に相当する配列が含まれていることが確認された。
【００７１】
〔実施例３〕 ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈ遺伝子）の発現
（Ｌ）ＭＪ−２３３由来ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクターの構築実施例３で確認された９４５塩基対より構成される、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子のオープンリーディングフレームについて、エシェリヒア・コリ菌体内での発現を確認するため、該ＤＮＡ断片を下記のようにプラスミドｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社製）へサブクローニングした。
【００７２】
まず、上記オープンリーディングフレームの両端に制限酵素ＳｍａＩの切断部位を連結したＤＮＡ断片を、下記に示すプライマーを用いてＰＣＲにより、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の染色体ＤＮＡを鋳型として増幅した。該ＰＣＲ断片とクローニングベクターｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社製）を、各々制限酵素ＳｍａＩで切断した後、脱リン酸化処理したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2およびＴ４ＤＮＡリガーゼ １ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、１６℃で１０時間反応させ、上記ＳｍａＩ断片とベクターを連結させた。
【００７３】
（配列番号７）TCCCCCGGGA TGAAAGAAAC CGTCGGC
（配列番号８）TCCCCCGGGT CAGAAGAACT GCTTCTG
【００７４】
得られた連結反応液を用い、塩化カルシウム法［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５３， ｐ．１５９（１９７０）］により エシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造（株）社製）を形質転換し、アンピシリン ５０μｇ／ｍｌを含む培地［トリプトン１０ｇ，イーストエキストラクト ５ｇ，ＮａＣｌ ５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【００７５】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素ＳｍａＩにより切断し、アガロース電気泳動法を用いて挿入断片を調べたところ、プラスミドｐＫＫ２２３−３の長さ４．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約１ｋｂのＤＮＡ断片が確認された。
【００７６】
これらのプラスミドについて、１ｋｂの挿入断片の方向性の確認を行った。その結果、プラスミドｐＫＫ２２３−３上に存在するｔａｃプロモーターに対して、ｌｄｈ遺伝子のオープンリーディングフレームが順方向に挿入断片が挿入されたプラスミドを選択し、ｐＫＫ２２３−ＬＤＨ２３３と命名した。プラスミドｐＫＫ２２３−ＬＤＨ２３３でエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換して得られた形質転換株をエシェリヒア・コリＥＣｔａｃＬＤＨ２３３と命名した。
【００７７】
（Ｍ）ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素の製造および活性の確認
上記（Ｌ）で作製したエシェリヒア・コリＥＣｔａｃＬＤＨ２３３株をアンピシリン ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地［トリプトン１０ｇ，酵母エキス ５ｇ，ＮａＣｌ ５ｇ）に植菌し、３７℃で１５時間好気的に振とう培養した。得られた培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２０分間）して菌体を回収後、ナトリウム−リン酸緩衝液［組成：50mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3)］で洗浄した。
【００７８】
次いで、洗浄菌体０．５ｇ（湿重量）を上記ナトリウム−リン酸緩衝液２ｍｌに懸濁し、氷冷下で超音波破砕器（ブランソン社製）にかけ菌体破砕物を得た。該破砕物を遠心分離（１０，０００×ｇ，４℃，３０分間）し、上清を粗酵素液として得た。対照として、エシェリヒア・コリＪＭ１０９株の粗酵素液を同様に調製し、以下の活性測定に供した。
【００７９】
ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素活性の確認は、両粗酵素液について、ピルビン酸を基質とした乳酸の生成に伴い、補酵素ＮＡＤＨがＮＡＤ+に酸化されるのを、３４０ｎｍの吸光度変化として測定した［L.Kanarek and R.Ｌ.Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (1964)］。反応は、５０ｍＭ カリウム−リン酸緩衝液(pH7.2)、１０ｍＭ ピルビン酸、０．４ｍＭＮＡＤＨ存在下、３７℃にて行った。その結果、エシェリヒア・コリＪＭ１０９株から調製された粗酵素液に対し、エシェリヒア・コリＥＣｔａｃＬＤＨ２３３から調製された粗酵素液は、約５０倍ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有していた。
【００８０】
〔実施例４〕ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子部分断片を用いたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来染色体ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊
（Ｎ）遺伝子破壊に用いるプラスミドベクターの構築
上記（Ｅ）項で得たプラスミドを２０μｌについて、５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ジチオスレイトール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１００ｍＭ ＮａＣｌ、制限酵素ＳｐｈＩおよびＳａｌＩ １ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、３７℃で１時間反応させ、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子部分断片約３００ｂｐとｐＧＥＭ−Ｔベクター領域約３ｋｂの２つの断片を得た。 得られたＤＮＡ溶液からＧｅｎｅ ＣｌｅａｎＩＩ（フナコシ社製）を用いて３００ｂｐ断片の回収を行い、該ＤＮＡ溶液１０μｌと、クロラムフェニコール耐性のクローニングベクターｐＨＳＧ３９６（宝酒造社製）１μｌのＳｐｈＩ、ＳａｌＩ分解物と混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2及びＴ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、４℃で１５時間反応させ、結合させた。
【００８１】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含む培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【００８２】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＨＳＧ３９６の長さ２．２ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約３００ｂｐの挿入断片が認められた。
【００８３】
（Ｏ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作成
上記（Ｎ）項で得られたプラスミドはＭＪ−２３３菌体内で複製不可能なプラスミドである。該プラスミドを、電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Vol.144, p.181-185, 1993）によりブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３に導入し、クロラムフェニコール ５μｇ／ｍｌを含む培地［尿素 ２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４−５Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ビオチン ２００μｇ、チアミン １００μｇ、イーストエキストラクト １ｇ、カザミノ酸 １ｇ、グルコース ２０ｇ、及び、寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【００８４】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液より染色体ＤＮＡを抽出し、以下に述べるゲノミックサザンハイブリダイゼーションにより染色体上のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊を確認した。染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で分解した後、ナイロンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ アマシャム社製）にブロッティングし、上記で得た３００ｂｐのラクテートデヒドロゲナーゼ部分断片をプローブとしてランダムプライマーラベリングキット（32Ｐ［ｄＣＴＰ］使用）（宝酒造社製）によりラベル化し、ゲノミックサザンハイブリダイゼーションを行った。野生株より抽出した染色体ＤＮＡを用いたゲノミックサザンハイブリダイゼーションのパターンと比較して、遺伝子破壊株のパターンは（Ｎ）項で導入したプラスミド２．５ｋｂ分長いバンドが検出され、染色体上のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊が確認できた。このようにして得られたラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株をブレビバクテリウム・フラバム ＥＳΔｌｄｈ：ｃａｔ１と命名した。
【００８５】
（Ｐ）ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素の製造および活性の確認
上記（Ｏ）で作製したブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ２３３−Δｌｄｈ：ｃａｔ１株をクロラムフェニコール ５μｇ／ｍｌを含む培地［尿素 ２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４−５Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ビオチン ２００μｇ、チアミン １００μｇ、イーストエキストラクト １ｇ、カザミノ酸 １ｇ、グルコース ２０ｇ、及び、寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に植菌し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。得られた培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２０分間）して菌体を回収後、ナトリウム−リン酸緩衝液［組成：50mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3)］で洗浄した。
【００８６】
次いで、洗浄菌体０．５ｇ（湿重量）を上記ナトリウム−リン酸緩衝液２ｍｌに懸濁し、氷冷下で超音波破砕器（ブランソン社製）にかけ菌体破砕物を得た。該破砕物を遠心分離（１０，０００×ｇ，４℃，３０分間）し、上清を粗酵素液として得た。対照として、ブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ２３３−ＥＳ株の粗酵素液を同様に調製し、以下の活性測定に供した。
【００８７】
ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素活性の確認は、両粗酵素液について、ピルビン酸を基質とした乳酸の生成に伴い、補酵素ＮＡＤＨがＮＡＤ+に酸化されるのを、３４０ｎｍの吸光度変化として測定した［L.Kanarek and R.Ｌ.Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (1964)］。反応は、５０ｍＭ カリウム−リン酸緩衝液(pH7.2)、１０ｍＭ ピルビン酸、０．４ｍＭＮＡＤＨ存在下、３７℃にて行った。その結果、ブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ２３３−ＥＳ株から調製された粗酵素液におけるラクテートデヒドロゲナーゼ活性に対し、ブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ２３３−Δｌｄｈ：ｃａｔ１株から調製された粗酵素液におけるラクテートデヒドロゲナーゼ活性は、１０分の１以下であった。
【００８８】
【発明の効果】
本発明のＤＮＡおよびそれを含む組換えベクターは、微生物のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作製に用いることができる。ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株を用いると、培養中の酸素濃度の調節等の操作を行わなくても、アミノ酸、有機酸等の各種ファインケミカルズの製造の際の乳酸の副生を低減することができる。
【００８９】
また、本発明のＤＮＡは、ラクテートデヒドロゲナーゼの製造に利用することができる。
【００９０】
【配列表】
【００９１】
【００９２】
【００９３】
【００９４】
【００９５】
【００９６】
【００９７】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ断片及びそれを用いたラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作成方法に関する。更に詳しくは、ブレビバクテリウム・フラバム等のコリネ型細菌由来のラクテートデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ断片及びそれを用いた染色体ＤＮＡとの相同性組換えの原理による、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作成方法に関する。
【０００２】
乳酸は、アミノ酸、有機酸等の各種ファインケミカルズを製造する場合の副生物である。
【０００３】
【従来の技術】
ラクテートデヒドロゲナーゼは、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を補酵素として、ピルビン酸を還元して乳酸を生成する酵素であるが、大腸菌あるいはコリネ型細菌等の微生物を用いて、リジン、トレオニン、イソロイシン、グルタミン酸等のアミノ酸、および、コハク酸、フマル酸、クエン酸等の有機酸等の各種ファインケミカルズを製造しようという場合は、副生物として乳酸等を生成する原因となる。そこで、従来は、例えばリジン製造において副生物の乳酸生成を抑える方法として、培養中の酸素供給濃度を十分に保つことにより乳酸の生成を抑える方法などが知られていた（K.Akashi et al., Agric. Biol. Chem., 43, 2087, 1979）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記方法は、ファインケミカルズの製造に用いる微生物の培養中の、酸素濃度をコントロールするという煩雑な操作等が必要となり、ファインケミカルズを製造しようとする場合において作業効率が低減する結果となる。そこで、このように乳酸生成を抑えるために酸素濃度をコントロールする必要のない、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性の低減あるいは欠如した菌株を取得することが望まれていた。
【０００５】
ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊された微生物菌株としては、大腸菌(Escherichia coli)(J.Bacteriol., Vol.153, p.588-596)等で知られているが、これらの菌株を得る方法は、ランダム変異導入法により変異導入した菌株の中からスクリーニングするという煩雑な実験操作を要する方法であり、これまでに、アミノ酸、あるいは、有機酸等のファインケミカルズ製造において産業上重要なコリネ型細菌において取得された例はなく、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊されたコリネ型細菌の簡便な取得方法が望まれていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、遺伝子組換えの手法を駆使することにより、コリネ型細菌からラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子ＤＮＡを単離することに成功し、該ＤＮＡ断片を用いることにより効率的にラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株を作製することが可能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明の要旨は、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡにある。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【０００８】
上記ＤＮＡとして具体的には、下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【０００９】
また本発明は、前記ＤＮＡがベクターに連結されてなる組換えベクターＤＮＡ、及び、配列番号１記載のＤＮＡもしくはこのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、又はその一部がベクターに連結されてなる組換えベクターＤＮＡを提供する。
【００１０】
本発明はさらに、前記ＤＮＡ又は組換えベクターＤＮＡと、微生物細胞の染色体ＤＮＡ上のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子との相同組換えによりラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊された、微生物のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株を提供する。
【００１１】
本発明はまた、前記ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株を培地で培養し、その培養物からアミノ酸または有機酸（有機酸を除く）を採取することを特徴とする、アミノ酸または有機酸の製造方法を提供する。
【００１２】
上記ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の親株としては、コリネ型細菌、より具体的には、ブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ−２３３株が挙げられる。
本発明の「ラクテートデヒドロゲナーゼ（L-lactate dehydrogenase：EC 1.1.1.27）」とは、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を補酵素として、ピルビン酸を還元して乳酸を生成する酵素を意味する。また、本明細書では、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを、便宜上「ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子」ということがある。
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明のＤＮＡは、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であり、前記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡである。
【００１４】
本発明のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子は、本発明によりその塩基配列が決定されたので、この配列に基づいて合成することも可能であるが、本発明においてはコリネ型細菌からクローニングすることにより、初めて得られたものである。ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の供給源としては、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有するコリネ型細菌であれば特に制限はない。
【００１５】
上記のようなコリネ型細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス、ブレビバクテリウム・フラバム等が挙げられる。さらに具体的には、例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株が挙げられる。本菌株は、昭和５０年４月２８日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現生命工学工業技術研究所）に微工研菌寄第３０６８号として寄託され、昭和５６年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、微工研条寄第１４９７号（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）の受託番号で寄託されている。
【００１６】
以下に、上記微生物からラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子ＤＮＡ断片を取得する方法、該遺伝子ＤＮＡ断片を用いたラクテートデヒドロゲナーゼ破壊株の作製方法の一例を説明する。
【００１７】
本発明のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子ＤＮＡ断片は、コリネ型細菌の染色体ＤＮＡ、具体的には、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）株等の染色体ＤＮＡから以下に述べる方法で単離、塩基配列決定することができる。
【００１８】
まず、上記コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３を常法［例えば、特開昭５１−１３０５９２参照］に従い培養し、培養物から菌体を集め、該菌体から染色体ＤＮＡを抽出する。染色体ＤＮＡは、例えば、特開平５−１５３７８の実施例１（Ａ）に記載の方法等により菌体から容易に抽出することができる。
【００１９】
上記菌株より染色体ＤＮＡを抽出する際には、適当な培地で培養した該菌株の菌体を使用することができるが、培養した菌体を集菌後に凍結保存した保存試料を使用することも可能である。
【００２０】
枯草菌（バチルス・サチリス）等のラクテートデヒドロゲナーゼの一次構造（アミノ酸配列）の相同性の高い部分から逆翻訳したオリゴデオキシリボヌクレオチドをプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の部分断片を得る。このようなプライマーとしては、配列番号３および４に示すアミノ酸配列に相当する配列番号５および６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。配列番号３および４に示すアミノ酸配列は、後記実施例で詳述するように、枯草菌（バチルス・サチリス(Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ)）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、マイコプラズマ・ハイオニューモニア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）間で、それらが持つラクテートデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列において保存されている領域から選択したものである。
【００２１】
ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片を適当なクローニングベクター、例えばｐＧＥＭ−Ｔ（プロメガ社製）へサブクローニングし、エシェリヒア・コリＪＭ１０９株（宝酒造製）を形質転換する。この形質転換株を適当な抗生物質選択下で培養し、培養物から菌体を回収し、菌体から常法、例えばアルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを抽出する。このプラスミドに挿入されたＤＮＡの塩基配列を決定することにより、本発明のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得することができる。
【００２２】
得られたＤＮＡ断片の塩基配列は、例えば、ジデオキシヌクレオチド酵素法［Dideoxy chain termination 法；Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. sci. U.S.A., Vol.74, p.5463, (1977)］により決定することができる。
【００２３】
上記のようにして、後記実施例で得られたラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の部分断片の塩基配列を決定し、アミノ酸配列に翻訳して解析した結果、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の部分断片は、配列番号２記載のアミノ酸配列の８６番目から１７９番目までで示されるアミノ酸配列にあたる部分からなり、またそれをコードする遺伝子は、例えば、配列番号１記載の塩基配列中の２５６番目から５３７番目までの塩基配列で示される部分にあたるものであった。
【００２４】
ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子全体を含むＤＮＡ断片を得るには、遺伝子の単離に関する公知のいずれの方法もが使用できるが、例えば、ブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ２３３等のコリネ型細菌の染色体ＤＮＡライブラリーを作製し、上記ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子部分断片をプローブとするハイブリダイゼーションにより、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子全体を含む染色体ＤＮＡを単離する方法が挙げられる。以下にその一例を説明する。
【００２５】
（Ａ）染色体ＤＮＡライブラリーの作製：
上記菌株より抽出した染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩを用いて部分分解し、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の宿主−ベクター系を用いて染色体ＤＮＡのライブラリーを作製する。具体的に使用し得るベクターとしては、例えばλＦＩＸＩＩ（東洋紡績（株）製）等のラムダファージベクター、ｐＵＣ１１８（宝酒造製）、ｐＢＲ３２２（宝酒造製）、コスミドｐＷＥ−１５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドベクターが挙げられる。
【００２６】
上記部分分解により得られる様々なＤＮＡ断片の上記ベクターへの挿入、例えばファージベクターλＦＩＸＩＩ（東洋紡績（株）製）への挿入は、適当な制限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩで開裂したベクターと部分分解ＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結することにより行うことができる。かくして染色体ＤＮＡライブラリーが得られる。
【００２７】
（Ｂ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むベクターの選別：
上記（Ａ）項で調製した染色体ＤＮＡライブラリーからラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むベクターを選別するには、この染色体ＤＮＡライブラリーを用いて宿主微生物、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の形質導入あるいは形質転換を行い、得られる形質導入体あるいは形質転換体から、適当な手段によりラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を保持するクローンを選別すればよい。
【００２８】
具体的には、上記ファージベクターをエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、例えばＰ２３９２株［Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， Ｖｏｌ．７， ｐ．１５１３ （１９７９）］に感染させ、これを寒天培地上に重層することによりプラークを形成させる。次いでこのプラーク中のファージＤＮＡをニトロセルロース膜に移し取り、このファージＤＮＡを該ニトロセルロース膜に固定し、前記のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の部分断片をプローブとして用いたプラークハイブリダイゼーション［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）］を行う。こうして、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株の染色体ＤＮＡ由来のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を有するファージベクターを含む形質導入体を検出し、選別することが可能である。
【００２９】
あるいは上記プラスミドベクターを用いて染色体ＤＮＡライブラリーを調製した場合には、このライブラリーＤＮＡでエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、得られた形質転換体から前記のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の部分断片をプローブとして用いたコロニーハイブリダイゼーション法［Ｒ． Ｂｒｕｃｅ Ｗａｌｌａｃｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， Ｖｏｌ．９， ｐ．８７９ （１９８１）］を行うことによっても選別可能である。
【００３０】
更に、上記のようにして選別された形質導入体あるいは形質転換体よりファージＤＮＡ、あるいはプラスミドＤＮＡを抽出し、挿入断片を適当な制限酵素でベクターから切り出すことで本発明のＤＮＡを取得することができる。
【００３１】
上記操作によって切り出されたＤＮＡ断片につき、前記のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の部分断片をプローブとして用いてサザンハイブリダイゼーション［Ｅ． Ｍ． Ｓｏｕｔｈｅｒｎ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ．９８， ｐ．５０３ （１９７５）］を行うことにより、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が挿入ＤＮＡ断片内に存在することを再確認できる。
【００３２】
このようにして得られるＤＮＡ断片の１つとして、上記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断して得られる、大きさが約４．８ｋｂのＤＮＡ断片を挙げることができる。さらに、上記ＤＮＡ断片の塩基配列を決定したところ、両断片中にはオープンリーディングフレームの存在が確認され、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子のコード領域は、後記配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列中のアミノ酸番号１〜３１４の３１４個のアミノ酸配列をコードする９４５塩基対から構成されることがわかった。また、得られた塩基配列（配列番号１）には、前記のＰＣＲに用いたプライマーに相当する配列（配列番号５及び６）を含むことが確認された。
【００３３】
本発明におけるラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子は、天然の細菌、例えばコリネ型細菌の染色体ＤＮＡから分離されたもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばベックマン社製／オリゴ１０００Ｍ ＤＮＡ合成装置（Oligo 1000M DNA Synthesizer）を用いて合成されたものであってもよい。
【００３４】
また、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を損なわない範囲で、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡも、本発明に含まれる。ここで「数個」とは、好ましくは４０個以下、より好ましくは２０個以下である。
【００３５】
上記のようなＤＮＡの一態様として、例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸同士、例えば、６０％以上、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。
【００３６】
尚、後述するように、本発明のＤＮＡをコリネ型細菌のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作製に用いる場合には、該ＤＮＡはラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする必要はなく、生理的条件下、すなわち微生物細胞内で、染色体上のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子と相同組換えを起こすことができ、それによってラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を破壊することができる程度の相同性を有していればよい。このような相同性としては、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性が挙げられる。また、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作製に用いるＤＮＡは、染色体上のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子と相同組換えを起こすことができ、それによってラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を破壊することができる程度の大きさであれば、本発明のＤＮＡの一部であってもよい。ここで一部とは、好ましくは５０塩基以上、より好ましくは１００塩基以上の長さを有するものが挙げられる。
【００３７】
本発明のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子は、例えば、ラクテートデヒドロゲナーゼやリンゴ酸の製造に用いることができる。すなわち、本発明のＤＮＡが導入された微生物、例えば本発明のＤＮＡがベクターに連結されてなる組換えベクターＤＮＡで形質転換された微生物は、ラクテートデヒドロゲナーゼを高生産することが予想される。
【００３８】
また、本発明のＤＮＡは、コリネ型細菌のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作製に用いることができる。本発明のＤＮＡ又はその一部を用いたコリネ型細菌のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊法としては、該ＤＮＡをカナマイシン耐性遺伝子あるいはクロラムフェニコール耐性遺伝子等のマーカーと結合した後、電気パルス法(Electroporation)等により菌体内に導入した後、マーカーで選択することにより、相同組換えによって該ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子部分断片を宿主微生物染色体上へ組み込むことが可能となる（Biosci. Biotech. Biochem., Vol.57, p.2036-2038, 1993）。
【００３９】
かくして得られる微生物から、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株を効率的に取得することができる。
上記のようにして得られるラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株は、実質的に活性のあるラクテートデヒドロゲナーゼを産生しないので、アミノ酸、有機酸等の各種ファインケミカルズの製造の際の乳酸の副生を低減することができる。
【００４０】
本発明の方法により製造されるアミノ酸としては、特に限定されないが、具体的にはリジン、トレオニン、イソロイシン、グルタミン酸等が挙げられる。また、本発明の方法により製造される有機酸としては乳酸以外のものであれば特に限定されないが、具体的にはコハク酸、フマル酸、クエン酸等が挙げられる。
【００４１】
【実施例】
以上に本発明を説明してきたが、下記の実施例によりさらに具体的に説明する。しかしながら、実施例は本発明の具体的な認識を得る一助とみなすべきのものであり、本発明の範囲を何等限定するものではない。
【００４２】
〔実施例１〕ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子断片の一部（Ａ断片）のクローン化およびその塩基配列の決定
【００４３】
（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の全ＤＮＡの抽出
半合成培地Ａ培地［組成：尿素２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4 ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、グルコース２０ｇ、蒸留水１Ｌ］１Ｌに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ−２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液１５ｍｌに懸濁した。
【００４４】
次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールをゆっくりと加えた。水層とエタノール層の間に存在するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲに使用した。
【００４５】
（Ｂ）プライマーの選択
ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子は、原核生物では、バチルス・サチリス（Microbiology, 142, 3047-3056, 1996）、ラクトコッカス・ラクティス（J. Bacteriol., 174, 6956-6964, 1992）、マイコプラズマ・ハイオニューモニア（J. Gen. Microbiol., 139, 317-323, 1993）、ストレプトコッカス・ミュータンス（GenBank Database Accession No. M72545）、ラクトバチルス・カゼイ（Appl. Environ. Microbiol., 57, 2413-2417, 1991）等のものが知られている。これら５種の微生物のラクテートデヒドロゲナーゼにおいて保存されている領域を検討し、配列番号３および４のアミノ酸配列を基に、配列番号５および６に示す塩基配列を有する２つのプライマーを選択し、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて合成した。
【００４６】
（配列番号５）CARAARCCNG GNGARAC
（配列番号６）TCNCCRTGYT CNCCNAT
（配列中、ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを示し、ここでＡはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンを示す。）
【００４７】
これら２つのプライマーを用いて上記（１）で調製した染色体を鋳型としてＰＣＲを行うと、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が存在する限り、（ａ）と（ｂ）の組み合わせで約３００ｂｐの反応産物が得られると期待される。
【００４８】
（Ｃ）ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応はパーキンエルマーシータス社製のＤＮＡサーマルサイクラーを用いて下記の条件で行った。
【００４９】
反応液：
５０ｍＭ ＫＣｌ
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2
鋳型ＤＮＡ ５μｌ
上記（Ｂ）で作製したプライマー 各々０．２５μＭ
ｄＮＴＰｓ 各々２００μＭ
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造） ２．５ｕｎｉｔｓ
以上を混合し、１００μｌとした。
【００５０】
ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒
アニーリング過程：５５℃ １２０秒
エクステンション過程：７２℃ １８０秒
以上を１サイクルとし、３０サイクル行った。
【００５１】
（Ｄ）反応物の検出
上記（Ｃ）で生成した反応液１０μｌを２％アガロースゲルにより電気泳動を行って約３００ｂｐの断片の検出を行った。
【００５２】
（Ｅ）増幅断片のクローン化
上記（Ｃ）項で得た反応液３μｌと、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔ（ＰＲＯＭＥＧＡより市販）１μｌを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2及びＴ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、４℃で１５時間反応させ、結合させた。
【００５３】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含む培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【００５４】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔの長さ３．０ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約３００ｂｐの挿入断片が認められた。
【００５５】
（Ｆ）増幅断片の塩基配列の決定
（Ｅ）項で得られた長さが約３００ｂｐの増幅断片について、その塩基配列をジデオキシヌクレオチド酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法）（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ, ７４，５４６３，１９７７）により決定した。その結果得られたＤＮＡ塩基配列およびその翻訳アミノ酸配列を配列表配列番号１および２に示す。本アミノ酸配列は、枯草菌、あるいは、ラクトバシルスのラクテートデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の一部分と高い相同性を示し、本ＤＮＡ断片がブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ−２３３株由来のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の部分断片であることが明らかになった。
【００５６】
［実施例２］ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子全体のクローン化およびその塩基配列の決定
（Ｇ）ゲノミック・サザンハイブリダイゼーション
上記（Ａ）項で得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の染色体ＤＮＡ溶液の９０μｌに制限酵素ＨｉｎｄIII、５０Ｕ（ｕｎｉｔｓ）を加え、３７℃で１時間反応させ完全分解し、アガロースゲル電気泳動に供した後、アガロースゲルよりＤＮＡをナイロン膜上に移し取った。前記（Ｅ）項で取得したラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子部分断片を、宝酒造製 Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2 を用いて、Exo-free Klenow Fragment 及び［α−32Ｐ］ｄＣＴＰによりラジオアイソトープラベル［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５８，３０７−３１５（１９８６）］した。アイソトープラベルされたプローブを用い、常法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に従ってサザンハイブリダイゼーションを行った。
【００５７】
その結果、ＨｉｎｄIII処理したものは上記ナイロン膜上の約４．８ｋｂの位置に、上記プローブが強くハイブリダイズするＤＮＡ断片の存在を確認した。
【００５８】
（Ｈ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の染色体ＤＮＡライブラリーの作製
上記（Ａ）項で得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の染色体ＤＮＡ溶液の９０μｌに制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ ５ｕｎｉｔｓを加え、３７℃で１０分間反応させて部分分解した。この様々な長さの部分分解ＤＮＡと、制限酵素ＸｈｏＩで切断後、ＤＮＡポリメラーゼクレノーフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ）を用いてｄＴＴＰ（２’−デオキシチミジン５’−トリフォスフェート）、ｄＣＴＰ（２’−デオキシシチジン５’−トリフォスフェート）で切断末端を埋めたファージベクターλＦＩＸＩＩ（λＦＩＸＩＩ／ＸｈｏＩ−ｐａｒｔｉａｌ ｆｉｌｌ−ｉｎ ｔｒｅａｔｅｄ ＤＮＡ：東洋紡績（株）社製）とを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、および、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、１６℃で１０時間反応させて部分分解ＤＮＡとベクターとを連結させ、染色体ＤＮＡのλＤＮＡライブラリーを得た。
【００５９】
（Ｉ）目的組換え体ＤＮＡの選別
上記（Ｈ）項で作製したλＤＮＡライブラリーファージ溶液（２〜５×１０4ｐｆｕ；ＳＭ緩衝液希釈）と、エシェリヒア・コリＰ２３９２の培養液を当量混合し、３７℃で１５分間保温した。これに５０℃にて保温しておいた３〜４ｍｌのλ培地（１％ トリプトン、０．５％ 酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ、０．２％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５％ 寒天）を加え、λプレート（１％ トリプトン、０．５％ ＮａＣｌ、０．２％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１％ 寒天）に均一に塗布し、３７℃で１２〜１６時間培養した。
【００６０】
この培地上にニトロセルロースフィルターを載せ、培地上に形成されたプラークをフィルターに吸着させ、順次５分間ずつ以下イ）〜ハ）の試薬に浸した濾紙上にフィルターをのせて処理した。
【００６１】
イ）０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ
ロ）０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ
ハ）２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ；ＮａＣｌ １７５．３ｇ，クエン酸三ナトリウム二水和物 ８８．２ｇを蒸留水１Ｌに溶解）
上記フィルターを風乾後、８０℃にて２時間乾熱処理をしてＤＮＡを固定した。
【００６２】
前記ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子部分断片をプローブとして用い、上記で作製したフィルターにつきプラークハイブリダイゼーションを常法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に従って行った。
【００６３】
この結果、上記ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子部分断片をプローブとしてハイブリダイゼーション陽性のプラークＬＤＨ２３３を選択した。ＬＤＨ２３３からファージＤＮＡを抽出し、制限酵素ＨｉｎｄIIIにより切断したところ、ゲノミック・サザンハイブリダイゼーションの結果と一致する、長さ約４．８ｋｂのＨｉｎｄIII挿入断片をアガロースゲル電気泳動により確認することができた。
【００６４】
（Ｊ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子のサブクローニング：
上記（Ｉ）項で得られた長さが約４．８ｋｂのＨｉｎｄIII−ＤＮＡ断片上に存在するラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の位置をさらに特定するために、該ＤＮＡ断片を下記のようにプラスミドｐＵＣ１１８（宝酒造（株）社製）へサブクローニングした。
【００６５】
上記ＬＤＨ２３３から抽出したファージＤＮＡからＨｉｎｄIIIで切り出されるＤＮＡ断片と、クローニングベクターｐＵＣ１１８（宝酒造（株）製）を、各々制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断した後、脱リン酸化処理したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2およびＴ４ＤＮＡリガーゼ １ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、１６℃で１０時間反応させ、上記ＨｉｎｄIII断片とベクターを連結させた。
【００６６】
得られた連結反応液を用い、塩化カルシウム法［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５３， ｐ．１５９（１９７０）］により エシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造（株）社製）を形質転換し、アンピシリン ５０μｇ／ｍｌを含む培地［トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【００６７】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを各々制限酵素ＨｉｎｄIIIにより切断し、ハイブリダイゼーション法を用いて挿入断片を調べたところ、プラスミドｐＵＣ１１８の長さ３．４ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約４．８ｋｂのＨｉｎｄIII−ＤＮＡ断片が確認された。
【００６８】
上記で得られたプラスミドを各々ｐＵＣ１１８−ＬＤＨ２３３と命名し、該プラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリＪＭ１０９株（宝酒造（株）製）を各々、ＥＣＬＤＨ２３３と命名した。
【００６９】
（Ｋ）塩基配列の決定
上記（Ｊ）項で得られたラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む長さが約４．８ｋｂのＤＮＡ（ＨｉｎｄIII−ＨｉｎｄIII）断片について、その塩基配列をｐＵＣ１１８（宝酒造（株）社製）を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法）［Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｖｏｌ．７４，ｐ．５４６３，（１９７７）］により決定した。
【００７０】
塩基配列決定の結果、約４．８ｋｂのＤＮＡ（ＨｉｎｄIII−ＨｉｎｄIII）断片は、その塩基配列中のオープンリーデイングフレームの存在から、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子は、後記配列表の配列番号１に示す塩基配列を有し、３１４個のアミノ酸をコードする９４５塩基対より構成されることが判明した。この遺伝子がコードするアミノ酸配列を、配列番号２に示す。尚、この塩基配列の中には、実施例２の（Ｆ）項で決定した塩基配列に相当する配列が含まれていることが確認された。
【００７１】
〔実施例３〕 ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈ遺伝子）の発現
（Ｌ）ＭＪ−２３３由来ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクターの構築実施例３で確認された９４５塩基対より構成される、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子のオープンリーディングフレームについて、エシェリヒア・コリ菌体内での発現を確認するため、該ＤＮＡ断片を下記のようにプラスミドｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社製）へサブクローニングした。
【００７２】
まず、上記オープンリーディングフレームの両端に制限酵素ＳｍａＩの切断部位を連結したＤＮＡ断片を、下記に示すプライマーを用いてＰＣＲにより、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の染色体ＤＮＡを鋳型として増幅した。該ＰＣＲ断片とクローニングベクターｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社製）を、各々制限酵素ＳｍａＩで切断した後、脱リン酸化処理したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2およびＴ４ＤＮＡリガーゼ １ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、１６℃で１０時間反応させ、上記ＳｍａＩ断片とベクターを連結させた。
【００７３】
（配列番号７）TCCCCCGGGA TGAAAGAAAC CGTCGGC
（配列番号８）TCCCCCGGGT CAGAAGAACT GCTTCTG
【００７４】
得られた連結反応液を用い、塩化カルシウム法［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５３， ｐ．１５９（１９７０）］により エシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造（株）社製）を形質転換し、アンピシリン ５０μｇ／ｍｌを含む培地［トリプトン１０ｇ，イーストエキストラクト ５ｇ，ＮａＣｌ ５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【００７５】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素ＳｍａＩにより切断し、アガロース電気泳動法を用いて挿入断片を調べたところ、プラスミドｐＫＫ２２３−３の長さ４．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約１ｋｂのＤＮＡ断片が確認された。
【００７６】
これらのプラスミドについて、１ｋｂの挿入断片の方向性の確認を行った。その結果、プラスミドｐＫＫ２２３−３上に存在するｔａｃプロモーターに対して、ｌｄｈ遺伝子のオープンリーディングフレームが順方向に挿入断片が挿入されたプラスミドを選択し、ｐＫＫ２２３−ＬＤＨ２３３と命名した。プラスミドｐＫＫ２２３−ＬＤＨ２３３でエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換して得られた形質転換株をエシェリヒア・コリＥＣｔａｃＬＤＨ２３３と命名した。
【００７７】
（Ｍ）ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素の製造および活性の確認
上記（Ｌ）で作製したエシェリヒア・コリＥＣｔａｃＬＤＨ２３３株をアンピシリン ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地［トリプトン１０ｇ，酵母エキス ５ｇ，ＮａＣｌ ５ｇ）に植菌し、３７℃で１５時間好気的に振とう培養した。得られた培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２０分間）して菌体を回収後、ナトリウム−リン酸緩衝液［組成：50mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3)］で洗浄した。
【００７８】
次いで、洗浄菌体０．５ｇ（湿重量）を上記ナトリウム−リン酸緩衝液２ｍｌに懸濁し、氷冷下で超音波破砕器（ブランソン社製）にかけ菌体破砕物を得た。該破砕物を遠心分離（１０，０００×ｇ，４℃，３０分間）し、上清を粗酵素液として得た。対照として、エシェリヒア・コリＪＭ１０９株の粗酵素液を同様に調製し、以下の活性測定に供した。
【００７９】
ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素活性の確認は、両粗酵素液について、ピルビン酸を基質とした乳酸の生成に伴い、補酵素ＮＡＤＨがＮＡＤ+に酸化されるのを、３４０ｎｍの吸光度変化として測定した［L.Kanarek and R.Ｌ.Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (1964)］。反応は、５０ｍＭ カリウム−リン酸緩衝液(pH7.2)、１０ｍＭ ピルビン酸、０．４ｍＭＮＡＤＨ存在下、３７℃にて行った。その結果、エシェリヒア・コリＪＭ１０９株から調製された粗酵素液に対し、エシェリヒア・コリＥＣｔａｃＬＤＨ２３３から調製された粗酵素液は、約５０倍ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有していた。
【００８０】
〔実施例４〕ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子部分断片を用いたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来染色体ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊
（Ｎ）遺伝子破壊に用いるプラスミドベクターの構築
上記（Ｅ）項で得たプラスミドを２０μｌについて、５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ジチオスレイトール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１００ｍＭ ＮａＣｌ、制限酵素ＳｐｈＩおよびＳａｌＩ １ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、３７℃で１時間反応させ、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子部分断片約３００ｂｐとｐＧＥＭ−Ｔベクター領域約３ｋｂの２つの断片を得た。 得られたＤＮＡ溶液からＧｅｎｅ ＣｌｅａｎＩＩ（フナコシ社製）を用いて３００ｂｐ断片の回収を行い、該ＤＮＡ溶液１０μｌと、クロラムフェニコール耐性のクローニングベクターｐＨＳＧ３９６（宝酒造社製）１μｌのＳｐｈＩ、ＳａｌＩ分解物と混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2及びＴ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、４℃で１５時間反応させ、結合させた。
【００８１】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含む培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【００８２】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＨＳＧ３９６の長さ２．２ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約３００ｂｐの挿入断片が認められた。
【００８３】
（Ｏ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作成
上記（Ｎ）項で得られたプラスミドはＭＪ−２３３菌体内で複製不可能なプラスミドである。該プラスミドを、電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Vol.144, p.181-185, 1993）によりブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３に導入し、クロラムフェニコール ５μｇ／ｍｌを含む培地［尿素 ２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４−５Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ビオチン ２００μｇ、チアミン １００μｇ、イーストエキストラクト １ｇ、カザミノ酸 １ｇ、グルコース ２０ｇ、及び、寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【００８４】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液より染色体ＤＮＡを抽出し、以下に述べるゲノミックサザンハイブリダイゼーションにより染色体上のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊を確認した。染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で分解した後、ナイロンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ アマシャム社製）にブロッティングし、上記で得た３００ｂｐのラクテートデヒドロゲナーゼ部分断片をプローブとしてランダムプライマーラベリングキット（32Ｐ［ｄＣＴＰ］使用）（宝酒造社製）によりラベル化し、ゲノミックサザンハイブリダイゼーションを行った。野生株より抽出した染色体ＤＮＡを用いたゲノミックサザンハイブリダイゼーションのパターンと比較して、遺伝子破壊株のパターンは（Ｎ）項で導入したプラスミド２．５ｋｂ分長いバンドが検出され、染色体上のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊が確認できた。このようにして得られたラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株をブレビバクテリウム・フラバム ＥＳΔｌｄｈ：ｃａｔ１と命名した。
【００８５】
（Ｐ）ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素の製造および活性の確認
上記（Ｏ）で作製したブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ２３３−Δｌｄｈ：ｃａｔ１株をクロラムフェニコール ５μｇ／ｍｌを含む培地［尿素 ２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４−５Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ビオチン ２００μｇ、チアミン １００μｇ、イーストエキストラクト １ｇ、カザミノ酸 １ｇ、グルコース ２０ｇ、及び、寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に植菌し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。得られた培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２０分間）して菌体を回収後、ナトリウム−リン酸緩衝液［組成：50mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3)］で洗浄した。
【００８６】
次いで、洗浄菌体０．５ｇ（湿重量）を上記ナトリウム−リン酸緩衝液２ｍｌに懸濁し、氷冷下で超音波破砕器（ブランソン社製）にかけ菌体破砕物を得た。該破砕物を遠心分離（１０，０００×ｇ，４℃，３０分間）し、上清を粗酵素液として得た。対照として、ブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ２３３−ＥＳ株の粗酵素液を同様に調製し、以下の活性測定に供した。
【００８７】
ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素活性の確認は、両粗酵素液について、ピルビン酸を基質とした乳酸の生成に伴い、補酵素ＮＡＤＨがＮＡＤ+に酸化されるのを、３４０ｎｍの吸光度変化として測定した［L.Kanarek and R.Ｌ.Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (1964)］。反応は、５０ｍＭ カリウム−リン酸緩衝液(pH7.2)、１０ｍＭ ピルビン酸、０．４ｍＭＮＡＤＨ存在下、３７℃にて行った。その結果、ブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ２３３−ＥＳ株から調製された粗酵素液におけるラクテートデヒドロゲナーゼ活性に対し、ブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ２３３−Δｌｄｈ：ｃａｔ１株から調製された粗酵素液におけるラクテートデヒドロゲナーゼ活性は、１０分の１以下であった。
【００８８】
【発明の効果】
本発明のＤＮＡおよびそれを含む組換えベクターは、微生物のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作製に用いることができる。ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株を用いると、培養中の酸素濃度の調節等の操作を行わなくても、アミノ酸、有機酸等の各種ファインケミカルズの製造の際の乳酸の副生を低減することができる。
【００８９】
また、本発明のＤＮＡは、ラクテートデヒドロゲナーゼの製造に利用することができる。
【００９０】
【配列表】
Claims (4)
- ５０ｍＭ カリウム−リン酸緩衝液(pH7.2)、１０ｍＭ ピルビン酸、０．４ｍＭＮＡＤＨ存在下、３７℃の条件下でのラクテートデヒドロゲナーゼ酵素活性が、親株のラクテートデヒドロゲナーゼ酵素活性と比較して１０分の１以下であるコリネ型細菌のラクテートデヒドロゲナーゼ活性低減株であって、コリネ型細菌の染色体ＤＮＡ上の下記のＤＮＡ：
配列番号１記載のＤＮＡ；又は
配列番号１記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
の破壊により得られるコリネ型細菌のラクテートデヒドロゲナーゼ活性低減株。 - コリネ型細菌の染色体ＤＮＡ上の下記のＤＮＡ：
配列番号１記載のＤＮＡ；又は
配列番号１記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
の相同組換えにより得られる請求項１に記載のコリネ型細菌のラクテートデヒドロゲナーゼ活性低減株。 - コリネ型細菌がブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ−２３３株であることを特徴とする請求項１または２に記載のラクテートデヒドロゲナーゼ活性低減株。
- 請求項１〜３のいずれか一項に記載のラクテートデヒドロゲナーゼ活性低減株を培地で培養し、その培養物からアミノ酸または乳酸以外の有機酸を採取することを特徴とする、アミノ酸または有機酸の製造方法。
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