JP4074043B2

JP4074043B2 - 皮膚基底膜形成促進剤、人工皮膚形成促進剤及び人工皮膚の製造方法

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Publication number: JP4074043B2
Application number: JP2000087574A
Authority: JP
Inventors: 聡天野; 由紀子松永; 慎二猪股
Original assignee: Shiseido Co Ltd
Current assignee: Shiseido Co Ltd
Priority date: 2000-03-27
Filing date: 2000-03-27
Publication date: 2008-04-09
Anticipated expiration: 2020-03-27
Also published as: CN1365293A; KR20020019920A; US20040038859A1; EP2324863A1; US20060159782A1; TWI289065B; KR100841667B1; US20020193875A1; US7645595B2; EP1180371A4; EP2324863B1; CN1795922A; US20080248571A1; JP2001269398A; EP1180371A1; WO2001072347A1

Description

【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、皮膚基底膜安定化剤に関する。本発明はまた人工皮膚形成促進剤及び人工皮膚の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
化粧および皮膚科学分野では、皮膚に対する日光の照射をはじめとする外界環境の影響や加齢による損傷を軽減もしくは治療すべく多種多様な手段が提案され、また、試みられている。例えば、加齢に伴なう皮膚変化としては、しわの形成、硬化もしくは弾力性の低下等が主なものとしてあげられている。
このような変化の原因として、皮膚真皮におけるコラーゲン、エラスチン、グルコサミノグリカンからなる膠原線維、弾性線維の機能低下に主な関心が向けられている。これまで、このような変化を防止もしくは修復する手段として、ヒドロキシカルボン酸類の使用（例、特許第 2533339号公報）、リゾリン脂質の使用（特開平8-67621 号公報）または日本油化学会誌第４６巻第９号｛(1997) 13-19頁｝が提案されている。
【０００３】
前者の公報には、コラーゲン線維減損の防止により角質やしわを根絶しうることが示唆されている。一方、後者の公報では、リゾリン脂質がヒト線維芽細胞におけるグリコサミノグリカン（具体的にはヒアルロン酸）の産生能を亢進することから、美白効果を奏することが示唆されている。
【０００４】
上記外界環境の皮膚老化に及ぼす影響として、最も強力なものは太陽光に含まれる紫外線であり、明確に老化促進因子として位置づけられており、深いしわを特徴とする光老化と言われる皮膚変化を誘導していることが知られている（Scharffetter-Kochanek, Advance in Pharmacology, 1997, 58, 639-655)。紫外線の皮膚に及ぼす影響は多岐にわたり、遺伝子DNA の傷害から始まり、活性酸素の産生の誘導、そして最近では、マトリックス分解金属酵素の産生誘導がある (Fisherら、Nature, 1996, 379, 335-339) 。
【０００５】
紫外線のもつこの多能性のために、紫外線で誘導される光老化がどのような機構で起るかに関しては十分に解明されてこなかった。ヘアレスマウスに紅斑を起こさない程度のエネルギーの紫外線を照射し続けることによって、マウス背部皮膚にヒトの光老化皮膚に対応するような深いしわが形成されることが明らかになり、このマウスモデルを用いてしわに影響を及ぼす物質の評価も行われてきた (Moloney ら、Photochem. Photobiol. 1992, 56, 495-504)。しかし、十分にしわ形成機構に関しては解明されておらず、その解明が待たれていた。
【０００６】
一方、1994年、Koivukangas らは紫外線を照射した皮膚にて基底膜分解酵素であるゼラチナーゼが高まることを報告している (Acta Derm. Venereol. 1994, 74, 279-282) 。また、日光暴露部位皮膚では、基底膜が構造変化を示し、特に多重化が頻繁に観察されることも報告されている (Lavker, J. Invest. Dermal. 1979, 73, 59-66) 。これは、日光に含まれる紫外線が皮膚における基底膜分解酵素の産生量を高めることによって、基底膜構造に影響を与えた可能性を示唆している。
【０００７】
しかしながら、皮膚基底膜構造の形成を促進する具体的な手段については知られていない。
人工皮膚は、なんらかの原因で損傷を受けた生来の皮膚の代替物として、又は皮膚に対する医薬や化粧品の作用や薬効を試験するための実験材料として重要であり、いずれの用途においても、天然の皮膚の構造を可能な限り模倣した構造を有する人工皮膚が望まれている。
【０００８】
天然の皮膚は、概略的には表皮と真皮と、その間に存在する基底膜とから構成されている。このような天然の皮膚を模倣する人工皮膚の製造方法の１例としては、真皮と類似する構造を有する、ヒト線維芽細胞を含む収縮Ｉ型コラーゲンゲルの上にヒト正常表皮ケラチノサイトを培養して表皮層を形成せしめる方法が知られている。しかしながら、この方法においては、真皮を模倣するコラーゲンゲルと表皮を模倣する表皮層との間に基底膜が十分に形成されないという欠点が存在した。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は、皮膚基底膜安定化するための新規な手段、並びに人工皮膚の製造において基底膜の十分な形成を達成する新規な手段を提供することを目的とするものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、種々検討した結果、マトリックスメタロプロテアーゼの阻害剤、又はマトリックスメタロプロテアーゼとマトリックス蛋白質産生亢進剤の両者を投与することにより皮膚基底膜の構造形成が促進されることを見出し、本発明を完成した。
従って本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤を含んで成る皮膚基底膜形成促進剤を提供する。
【００１１】
本発明はまた、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤及びマトリックス蛋白質産生亢進剤を含んで成る、皮膚基底膜形成促進剤を提供する。
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、種々検討した結果、人工皮膚を製造するための培養において、培地中にマトリックスメタロプロテアーゼの阻害剤、又はマトリックスメタロプロテアーゼとマトリックス蛋白質産生亢進剤の両者を添加することにより基底膜の形成が促進されることを見出し、本発明を完成した。
従って本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤を含んで成る人工皮膚形成促進剤を提供する。
【００１２】
本発明はまた、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤及びマトリックス蛋白質産生亢進剤を含んで成る、人工皮膚形成促進剤を提供する。
本発明はまた、人工皮膚形成培地中にマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤を添加することを特徴とする、人工皮膚の製造方法を提供する。
本発明はさらに、人工皮膚形成培地中にマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤及びマトリックス蛋白質産生亢進剤を添加することを特徴とする、人工皮膚の製造方法を提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤
本発明において使用するマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤としては、このような阻害活性を有する物質であればよく、特に制限はない。マトリックスメタロプロテイナーゼとしては、例えばゼラチナーゼ、コラゲナーゼ、ストロメライシン、マトリライシン等が挙げられる。従って、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤は、例えばゼラチナーゼ、コラゲナーゼ、ストロメライシン、マトリライシン等を阻害する物質として選択することができる。
【００１４】
マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤の具体例としては、例えばCGS27023A 物質（Ｎ−ヒドロキシ−２−［［（４−メトキシフェニル）スルホニル］３−ピコリル）アミノ］−３−メチルブタンアミド塩酸塩）（J. Med. Chem. 1997, Vol. 40, p. 2525-2532)、MMP-インヒビター（p-NH₂-Bz-Gly-Pro-D-Leu-Ala-NHOH)(FN-437)(BBRC, 1994, Vol. 199, p. 1442-1446)などが挙げられる。
【００１５】
さらに、本発明のマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤の具体例としては、種々の植物抽出物やそれから得られる精製物を使用することができる。このような植物としては、イブキジャコウソウ (Thymus serpyllum L.)、カノコソウ (Valeriana fauriei Briquet)又はその他の近縁植物 (Valerianaceae)、カキノキ (Diospyros kaki Thunberg (Ebenaceae))、レンゲソウ (Astragalus sinicus Linne (Leguminosae)) 、サンザシ (Crataegus cuneata Siebold et Zuccarini (Rosaceae))、ボタン (Paeonia suffruticosa Andrews (Poeonia montan Sims) (Paconiaceae)) 、コウチャ (Thea sinensis Linne var. assamica Pierre, (Thcaccae)) 、
【００１６】
ユーカリ (Eucalyptus globulus Labillardiere)又はその近縁植物 (Myrtaceae)、トルメンチラ (Potentilla tormentilla Schrk (Rosaceae))、シナノキ (Tilia corda:a Mill., Tilia platyphyllus Scop., Tilia europaea Linne (Tiliaceae))、シラカバ (Betula alba Linne (Betulaceze)) 、マジョラム (Origanum majorana L.) 、アセンヤク (Uncaria gambir Roxburgh (Rubiaceae))、クルミ殻 (Juglans regia Linne var. sinensis De Candolie)又はその近縁植物 (Juglandaceae) 、クララ (Sophora flavescens Aiton (Leguminosae)) 、ワレモコウ (Sanguisorba officinalis Linne (Rosaceae)) 、オトギリソウ (Hypericum perforatum Linne又はHypericum erectum Thunberg (Guttiferae))、チャ (Thea sinensis Linne (Theaceae)) 、
【００１７】
ウコン (Curcuma longa L (Zingiberaceae))、ウコンの抽出精製物であるクルクミン、ハマスゲ (Symplocos racemosa, Cyperus rotundus) 、ミロバランノキ (Cyperus scariosus, Gaultheria fragrantissima, Acacia fornensia, Terminalia chebula) 、ベンガルボダイジュ (バンヤジュ) (Ficus bengalensis) 、ナンバンサイカチ (Cassia fistula Linn)、ネジキ (Lyonia ovalifolia)、テリハボク (ヤラボ、タマナ) (Calophyllum inophyllum)、テンジクボダイジュ (Ficus religiosa)等を挙げることができる。
【００１８】
これらの植物の抽出物は、草本植物にあっては、根、葉、茎、花等から抽出物が得られ、木本植物にあっては、根、芽、樹皮、果実、葉、花等から抽出物が得られる。
これらの植物からの抽出物は、植物材料を必要に応じて乾燥させ、さらに必要に応じて細断又は粉砕した後、水性抽出剤又は有機溶剤により抽出することにより得られる。水性抽出剤としては、例えば、冷水、温水、又は沸点もしくはそれより低温の熱水を用いることができ、また有機溶剤としては、メタノール、エタノール、１，３−ブタンジオール、エーテル等を、常温で又は加熱して用いることができる。
【００１９】
本発明においてマトリックス蛋白質としては、基底膜の構成成分であるラミニン、IV型コラーゲン、VII 型コラーゲン、パーレカン、ナイドジェン等が挙げられる。
【００２０】
マトリックス蛋白質産生亢進剤
本発明において使用するマトリックス蛋白質産生亢進剤としては、これらの蛋白質の産生を亢進する場合である、例えば、大豆リゾレシチン、トランスフォーミング・グロスファクターα（TGFa）、トランスフォーミング・グロスファクターβ１（TGFb1)、トランスフォーミング・グロスファクターβ２（TGFb2)、トランスフォーミング・グロスファクターβ３（TGFb3)、表皮増殖因子 (EGF)などが挙げられる。
【００２１】
本発明の人工皮膚形成促進剤又は皮膚基底膜安定化剤がマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤及びマトリックス蛋白質産生亢進剤両者を含んで成る場合、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤とマトリックス蛋白質産生亢進剤の比率は、それらの種類や活性により異るが、およそ１：10⁶〜10⁶：１である。
【００２２】
人工皮膚
本発明における人工皮膚の製造に用いる基礎培地としては、人工皮膚の製造に従来から使用されている任意の培地を用いることができ、これらの培地としては１０％の牛胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM) ；１０％の牛胎児血清、トランスフェリン５μg/ml、インシュリン５μg/ml、tri-ヨードチロニン２nM、コレラトキシン0.1nM 、ヒドロコーチゾン 0.4μg/mlを含むDMEM-Ham's F12 (３：１）；ケラチノサイト増殖培地（KGM)と１０％牛胎児血清を含むDMEMとを１：１に混合した培地、等が挙げられる。これらの基礎培地に添加されるマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤の量は、その種類により異るが、およそ１nmol／Ｌ〜10^-2mole／Ｌである。また基礎培地に添加されるマトリックス蛋白質産生亢進剤の量は１ng／Ｌ〜１ｇ／Ｌ程度である。
【００２３】
本発明の人工皮膚の製造においてはまず、金網の上にヒト線維芽細胞を含む収縮Ｉ型コラーゲンゲルを静置する。ヒト線維芽細胞を含む収縮Ｉ型コラーゲンゲルは例えば次のようにして調製することができる。線維芽細胞懸濁コラーゲン溶液を氷上にて作製後、ペトリ皿内にてコラーゲンをゲル化させて調製する。その後、ペトリ皿壁面からゲルを剥離し、コラーゲンゲルをCO₂インキュベーター内にて収縮させる。
【００２４】
次に、上記コラーゲンゲルの上に、表皮細胞、例えばヒト正常表皮ケラチノサイトを培養し、表皮を形成する。皮膚細胞の培養による表皮層の形成は次のようにして行うことができる。収縮コラーゲンゲルを金網の上にのせ、さらにガラスリングをこのゲルの上にのせる。このガラスリング内に液漏れをさせないようにヒト包皮由来の表皮ケラチノサイト懸濁液を入れる。CO₂インキュベーター内にてケラチノサイトを接着させ、リングを外す。上記培地を表皮層の境界まで満たし、表皮層を空気に曝しながら、培養を継続して各層形成する。
【００２５】
この方法によれば、線維芽細胞を含む収縮Ｉ型コラーゲンゲルから成る真皮層と、表皮層との間に十分な基底層が形成された天然皮膚に近い人工皮膚が得られる。
【００２６】
皮膚基底膜形成促進剤
老化に伴う変化として加齢に伴なう基底膜の多重化を特徴とする構造変化の報告 (Lavker, J. Invest. Dermal. 1979, 73, 59-66) に着目し、化粧の主たる対象である顔面皮膚の基底膜構造変化に関して検討した結果によれば、この基底膜の構造変化２０代後半から起り始め、加齢と共に蓄積していくことが見出される。この基底膜の構造変化は、しわの形成、硬化もしくは弾力性の低下等の加齢に伴なう皮膚変化に先行する皮膚変化である。
【００２７】
したがって、表皮基底細胞がきちんと基底膜に結合していることが正常な皮膚機能発現にとって必須であり、基底膜形成の促進が重要であるとの考えられる。日常の紫外線を想定した紫外線照射光老化マウスモデルを用いてシワ形成阻害剤について検討した結果、マトリックス分解金属酵素を阻害できる薬剤にシワ形成を阻害する活性を見出した。したがって、皮膚老化の防御剤として、皮膚における基底膜の基底膜の再生・修復の促進剤が有効である。
【００２８】
したがって、本発明によれば、上記マトリックス分解金属酵素阻害化合物の１種またはそれらの２種以上の混合物、または、このマトリックス分解金属酵素阻害化合物の１種またはそれらの２種以上の混合物とマトリックス蛋白質の産生を高める活性を示す化合物１種または２種以上の混合物を、皮膚基底膜の再生修復の促進、形成促進効果を示すに十分な濃度で含有する皮膚賦活用組成物または基底膜形成促進人工皮膚培養液が新たに提供される。かかる「皮膚賦活」とは、例えば、加齢等による基底膜の構造変化に伴う皮膚の機能低下、具体的には皮膚のしわ、硬化などを防御・改善することを意味する。
【００２９】
上記「基底膜の再生修復の促進、形成促進効果を示すに十分な濃度」は、使用する化合物の種類や該組成物を調整するのに使用されるその他の成分、または剤形、さらには施用時間によって変動しうる。
本発明の皮膚基底膜形成促進剤は、活性成分であるマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、又はマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤とマトリックス蛋白質産生亢進剤とを、組成物に対して0.000001〜60重量％、好ましくは 0.00001〜60重量％含有することができる。
【００３０】
本発明の皮膚基底膜安定剤は、水溶液、油液、その他の溶液、乳液、クリーム、ゲル、懸濁液、マイクロカプセル、粉末、顆粒、カプセル、固形等の形態をとり得る、それ自体既知の方法でこれらの形態に調製した上で、ローション製剤、乳液剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、ハップ剤、エアゾール剤、注射剤、内服剤（錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、シロップ剤、トローチ剤等）、坐剤等として、身体に塗布、貼付、噴霧、注射、飲用、挿入することができる。これらの製剤形の中でも、ローション製剤、乳液剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、ハップ剤、エアゾール剤等の皮膚外用剤が、本発明の組成物に適する製剤形であると考えられる。ここで記す皮膚外用剤には、医薬品、医薬部外品、化粧料が含まれ、以下同様の意味で用いることとする。
【００３１】
本発明の組成物には、それらを調製する際に常用されている賦形剤、香料等をはじめ、油脂類、界面活性剤、防腐剤、金属イオン封鎖剤、水溶性高分子、増粘剤、粉末成分、紫外線防御剤、保湿剤、薬効成分、酸化防止剤、pH調整剤、洗浄剤、乾燥剤、乳化剤等を適宜配合できる。これら各種成分を本発明の皮膚賦活用組成物に配合する場合には、本発明の所期の効果を損なわない範囲内で行う必要がある。
前記油脂類としては、液体油脂、固体油脂、ロウ類、炭化水素油、高級脂肪酸、高級アルコール、合成エステル油、シリコーン類がある。
【００３２】
具体的には、液体油脂として、アボガド油、ツバキ油、月見草油、タートル油、マカデミアナッツ油、トウモロコシ油、ミンク油、オリーブ油、ナタネ油、卵黄油、ゴマ油、パーシック油、小麦胚芽油、サザンカ油、ヒマシ油、アマニ油、サフラワー油、綿実油、エノ油、大豆油、落花生油、茶実油、カヤ油、コメヌカ油、シナギリ油、日本キリ油、ホホバ油、胚芽油、トリグリセリン、トリオクタン酸グリセリン、トリイソパルミチン酸グリセリン等が、固体油脂としては、カカオ脂、ヤシ油、馬脂、硬化ヤシ油、パーム油、牛脂、羊脂、硬化牛脂、パーム核油、豚脂、牛骨脂、モクロウ核油、硬化油、牛脚脂、モクロウ、硬化ヒマシ油等、
【００３３】
ロウ類としては、ミツロウ、キャンデリラロウ、綿ロウ、カルナウバロウ、ベイベリーロウ、イボタロウ、鯨ロウ、モンタンロウ、ヌカロウ、ラノリン、カポックロウ、酢酸ラノリン、液状ラノリン、サトウキビロウ、ラノリン脂肪酸イソプロピル、ラウリン酸ヘキシル、還元ラノリン、ジョジョバロウ、硬質ラノリン、セラックロウ、POE ラノリンアルコールエーテル、POE ラノリンアルコールアセテート、POE コレステロールエーテル、ラノリン脂肪酸ポリエチレングリコール、POE 水素添加ラノリンアルコールエーテル等、炭化水素油としては、流動パラフィン、オゾケライト、スクワレン、プリスタン、パラフィン、セレシン、スクワレン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックス等の油分が挙げられる。
【００３４】
高級脂肪酸としては、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン（ベヘニン）酸、オレイン酸、１２−ヒドロキシステアリン酸、ウンデシレン酸、トール酸、イソステアリン酸、リノール酸、リノレイン酸、エイコサペンタエン酸（EPA)、ドコサヘキサエン酸 (DHA)等が挙げられる。
【００３５】
高級アルコールとしては、例えば、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、ミリスチルアルコール、オレイルアルコール、セトステアリルアルコール等の直鎖アルコール、モノステアリルグリセリンエーテル (バチルアルコール) 、２−デシルテトラデシノール、ラノリンアルコール、コレステロール、フィトステロール、ヘキシルドデカノール、イソステアリルアルコール、オクチルドデカノール等の分岐鎖アルコール等が挙げられる。
【００３６】
合成エステル油としては、ミリスチン酸イソプロピル、オクタン酸セチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸ミリスチル、オレイン酸デシル、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、酢酸ラノリン、ステアリン酸イソセチル、イソステアリン酸イソセチル、１２−ヒドロキシステアリル酸コレステリル、ジ−２−エチルヘキシル酸エチレングリコール、ジペンタエリスリトール脂肪酸エステル、モノイソステアリン酸Ｎ−アルキルグリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、リンゴ酸ジイソステアリル、ジ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキシル酸トリメチロールプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、テトラ−２−エチルヘキシル酸ペンタンエリスリトール、
【００３７】
トリ−２−エチルヘキシル酸グリセリン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、セチル２−エチルヘキサノエート、２−エチルヘキシルパルミテート、トリミリスチン酸グリセリン、トリ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセライド、ヒマシ油脂肪酸メチルエステル、オレイン酸オイル、セトステアリルアルコール、アセトグリセライド、パルミチン酸２−ヘプチルウンデシル、アジピン酸ジイソブチル、Ｎ−ラウロイル−Ｌ−グルタミン酸−２−オクチルドデシルエステル、アジピン酸ジ−２−ヘプチルウンデシル、エチルラウレート、セバチン酸ジ−２−エチルヘキシル、ミリスチン酸２−ヘキシルデシル、パルミチン酸２−ヘキシルデシル、アジピン酸２−ヘキシルデシル、セバチン酸ジイソプロピル、コハク酸２−エチルヘキシル、酢酸エチル、酢酸ブチル、酢酸アミル、クエン酸トリエチル等が挙げられる。
【００３８】
シリコーン類としては、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、メチルハイドロジェンポリシロキサン等の鎖状ポリシロキサン、デカメチルポリシロキサン、ドデカメチルポリシロキサン、テトラメチルテトラハイドロジェンポリシロキサンなどの環状ポリシロキサン、３次元網目構造を形成しているシリコーン樹脂、シリコーンゴム等が挙げられる。
本発明の皮膚基底膜安定剤は、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤等を単独で、又は組合せて含むことができる。
【００３９】
かような、アニオン界面活性剤としては、例えば、セッケン用素地、ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等の脂肪酸セッケン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸Ｋ等の高級アルキル硫酸エステル塩、POE ラウリル硫酸トリエタノールアミン、POE ラウリル硫酸ナトリウム等のアルキルエーテル硫酸エステル塩、ラウロイルサルコシンナトリウム等のＮ−アシルサルコシン酸、Ｎ−ミリストイル−Ｎ−メチルタウリンナトリウム、ヤシ油脂肪酸メチルタウリッドナトリウム、
【００４０】
ラウリルメチルタウリッドナトリウム等の高級脂肪酸アミドスルホン酸塩、POE オレイルエーテルリン酸ナトリウム、POE ステアリルエーテルリン酸等のリン酸エステル塩、ジ−２−エチルヘキシルスルホコハク酸ナトリウム、モノラウロイルモノエタノールアミドポリオキシエチレンスルホコハク酸ナトリウム、ラウリルポリプロピレングリコールスルホコハク酸ナトリウム等のスルホコハク酸塩、リニアドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、リニアドデシルベンゼンスルホン酸トリエタノールアミン、リニアドデシルベンゼンスルホン酸等のアルキルベンゼンスルホン酸塩、
【００４１】
Ｎ−ラウロイルグルタミン酸モノナトリウム、Ｎ−ステアロイルグルタミン酸ジナトリウム、Ｎ−ミリストイル−Ｌ−グルタミン酸モノナトリウム等のＮ−アシルグルタミン酸塩、硬化ヤシ油脂肪酸グリセリン硫酸ナトリウム等の高級脂肪酸エステル硫酸エステル塩、ロート油等の硫酸化油、POE アルキルエーテルカルボン酸、POE アルキルアリルエーテルカルボン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、高級脂肪酸エステルスルホン酸塩、二級アルコール硫酸エステル塩、高級脂肪酸アルキロールアミド硫酸エステル塩、ラウロイルモノエタノールアミドコハク酸ナトリウム、Ｎ−パルミトイルアスパラギン酸ジトリエタノールアミン、カゼインナトリウム等が挙げられる。
【００４２】
カチオン界面活性剤としては、例えば、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ラウリルトリメチルアンモニウム等のアルキルトリメチルアンモニウム塩、塩化ジステアリルジメチルアンモニウムジアルキルジメチルアンモニウム塩、塩化ポリ（Ｎ，Ｎ′−ジメチル−３，５−メチレンピペリジニウム）、塩化セチルピリジニウム等のアルキルピリジニウム塩、アルキル四級アンモニウム塩、アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩、アルキルイソキノリニウム塩、ジアルキルモリホニウム塩、POE アルキルアミン、アルキルアミン塩、ポリアミン脂肪酸誘導体、アミルアルコール脂肪酸誘導体、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム等が挙げられる。
【００４３】
両性界面活性剤としては、例えば、２−ウンデシル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−（ヒドロキシエチルカルボキシメチル）−２−イミダゾリンナトリウム、２−ココイル−２−イミダゾリニウムヒドロキサイド−１−カルボキシエチロキシ２ナトリウム塩等のイミダゾリン系両性界面活性剤、２−ヘプタデシル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等のベタイン系界面活性剤等が挙げられる。
【００４４】
親油性非イオン界面活性剤としては、例えば、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノイソステアレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンセスキオレエート、ソルビタントリオレエート、ペンタ−２−エチルヘキシル酸ジグリセロールソルビタン、テトラ−２−エチルヘキシル酸ジグリセロールソルビタン等のソルビタン脂肪酸エステル類、モノ綿実油脂肪酸グリセリン、モノエルカ酸グリセリン、セスキオレイン酸グリセリン、モノステアリン酸グリセリン、α，α′−オレイン酸ピログルタミン酸グリセリン、モノステアリン酸グリセリン、リンゴ酸等のグリセリンポリグリセリン脂肪酸類、モノステアリン酸プロピレングリコール等のプロピレングリコール脂肪酸エステル類、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン・メチルポリシロキサン共重合体等が挙げられる。
【００４５】
親水性非イオン界面活性剤としては、例えば、POE ソルビタンモノオレエート、POE-ソルビタンモノステアレート、POE-ソルビタンモノオレート、POE-ソルビタンテトラオレエート等のPOE ソルビタン脂肪酸エステル類、POE-ソルビットモノラウレート、POE-ソルビットモノオレエート、POE-ソルビットペンタオレエート、POE-ソルビットモノステアレート等のPOE ソルビット脂肪酸エステル類、POE-グリセリンモノステアレート、POE-グリセリンモノイソステアレート、POE-グリセリントリイソステアレート等のPOE グリセリン脂肪酸エステル類、POE モノオレエート、POE ジステアレート、POE モノジオレエート、システアリン酸エチレングリコール等のPOE 脂肪酸エステル類、
【００４６】
POE ラウリルエーテル、POE オレイルエーテル、POE ステアリルエーテル、POE ベヘニルエーテル、POE ２−オクチルドデシルエーテル、POE コレスタノールエーテル等のPOE アルキルエーテル類、POE オクチルフェニルエーテル、POE ノニルフェニルエーテル、POE ジノニルフェニルエーテル等のPOE アルキルフェニルエーテル類、プルロニック等のプルアロニック型類、 POE・POP セチルエーテル、 POE・POP ２−デシルテトラデシルエーテル、 POE・POP モノブチルエーテル、 POE・POP 水添ラノリン、 POE・POP グリセリンエーテル等の POE・POP アルキルエーテル類、テトロニック等のテトラPOE ・テトラPOP エチレンジアミン縮合物類、
【００４７】
POE ヒマシ油、POE 硬化ヒマシ油、POE 硬化ヒマシ油モノイソステアレート、POE 硬化ヒマシ油トリイソステアレート、POE 硬化ヒマシ油モノピログルタミン酸モノイソステアリン酸ジエステル、POE 硬化ヒマシ油マレイン酸等のPOE ヒマシ油硬化ヒマシ油誘導体、POE ソルビットミツロウ等のPOE ミツロウ・ラノリン誘導体、ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド、ラウリン酸モノエタノールアミド、脂肪酸イソプロパノールアミド等のアルカノールアミド、POE プロピレングリコール脂肪酸エステル、POE アルキルアミン、POE 脂肪酸アミド、ショ糖脂肪酸エステル、POE ノニルフェニルホルムアルデヒド縮合物、アルキルエトキシジメチルアミンオキシド、トリオレイルリン酸等が挙げられる。
【００４８】
前記防腐剤としては、メチルパラベン、エチルパラベン、ブチルパラベン等が挙げられる。
前記金属イオン封鎖剤としては、エデト酸ナトリウム塩、EDTA等が挙げられる。
前記水溶性高分子としては、天然の高分子、半合成の高分子、合成の高分子、無機の高分子が挙げられる。
【００４９】
天然の水溶性高分子としては、アラビアガム、トラガカントガム、ガラクタン、グアガム、キャロブガム、カラヤガム、カラギーナン、タマリンドガム、キサンタンガム、ペクチン、カンテン、クインスシード (マルメロ) 、アルゲコロイド (カッソウエキス) 、デンプン (コメ、トウモロコシ、バレイショ、コムギ) 、グリチルリチン酸等の植物系高分子、キサンタンガム、デキストラン、サクシノグルカン、プルラン等の微生物系高分子、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、ゼラチン等の動物系高分子等が挙げられる。
【００５０】
半合成の水溶性高分子としては、デキストリン、カルボキシメチルデンプン、メチルヒドロキシプロピルデンプン等のデンプン系高分子、メチルセルロース、ニトロセルロース、エチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、硫酸セルロースジメチルジアルキル（１２〜２０）アンモニウム、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム（CMC)、結晶セルロース、セルロース末等のセルロース系高分子、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル等のアルギン酸系高分子等が挙げられる。
【００５１】
合成の水溶性高分子としては、ポリビニルアルコール、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルキル変性カルボキシビニルポリマー等のビニル系高分子、ポリエチレングリコール2000, 4000, 6000等のポリオキシエチレン系高分子、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体系高分子、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリエチレンアクリレート、ポリアクリルアミド等のアクリル系高分子、ポリエチレンイミン、カチオンポリマー等が挙げられる。
無機の水溶性高分子としては、ベントナイト、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ラポナイト、ヘクトライト、無水ケイ酸等が挙げられる。
【００５２】
前記粉末成分としては、タルク、カオリン、雲母、絹雲母 (セリサイト) 、白雲母、金雲母、合成雲母、紅雲母、黒雲母、リチア雲母、バーミキュライト、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸バリウム、ケイ酸カルシウム、ケイ酸マグネシウム、ケイ酸ストロンチウム、タングステン酸金属塩、マグネシウム、シリカ、ゼオライト、硫酸バリウム、焼成硫酸カルシウム（焼セッコウ）、リン酸カルシウム、弗素アパタイト、ヒドロキシアパタイト、セラミックパウダー、金属石鹸（ミリスチン酸亜鉛、パルミチン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム）、窒化ホウ素等の無機粉末、ポリアミド樹脂粉末（ナイロン粉末）、
【００５３】
ポリエチレン粉末、ポリメタクリル酸メチル粉末、ポリスチレン粉末、スチレンとアクリル酸の共重合体樹脂粉末、ベンゾグアナミン樹脂粉末、ポリ四弗化エチレン粉末、セルロース粉末等の有機粉末、二酸化チタン、酸化亜鉛等の無機白色顔料、酸化鉄（ベンガラ）、チタン酸鉄等の無機赤色系顔料、γ−酸化鉄等の無機褐色系顔料、黄酸化鉄、黄土等の無機黄色系顔料、黒酸化鉄、カーボンブラック、低次酸化チタン等の無機黒色系顔料、マンゴバイオレット、コバルトバイオレット等の無機紫色系顔料、酸化クロム、水酸化クロム、チタン酸コバルト等の無機緑色系顔料、群青、紺青等の無機青色系顔料、酸化チタンコーテッドマイカ、
【００５４】
酸化チタンコーテッドオキシ塩化ビスマス、酸化チタンコーテッドタルク、着色酸化チタンコーテッドマイカ、オキシ塩化ビスマス、魚鱗箔等のパール顔料、アルミニウムパウダー、カッパーパウダー等の金属粉末顔料、赤色 201号、赤色 202号、赤色 204号、赤色 205号、赤色 220号、赤色 226号、赤色 228号、赤色 405号、橙色 203号、橙色 204号、黄色 205号、黄色 401号、黄色 404号、赤色３号、赤色 104号、赤色 106号、赤色 227号、赤色 230号、赤色 401号、赤色 505号、橙色 205号、黄色４号、黄色５号、黄色 202号、黄色 203号、緑色３号、青色１号などのジルコニウム、バリウム又はアルミニウムレーキ等の有機顔料、クロロフィル、β−カロチン等の天然色素等、チタンイエロー、カーサミン、紅花赤等の色剤、等が挙げられる。
【００５５】
前記紫外線防御剤としては、化学的に紫外線を吸収する物質である「紫外線吸収剤」と、物理的作用によって紫外線を散乱および反射させる物質である「紫外線遮断剤」の両者を含む。
すなわち、長波長紫外線（UVA)吸収剤として、メチルアントラニレート、ホモメンチル−Ｎ−アセチルアントラニレート等のアントラニル酸系紫外線吸収剤、例えば２，４−ジヒドロキシベンゾフェノン、２，２−ジヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、２，２′−ジヒドロキシ−４，４′−ジメトキシベンゾフェノン、２，２′，４，４′−テトラヒドロキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシ−４′−メチルベンゾフェノン、
【００５６】
２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン−５−スルホン塩酸、４−フェニルベンゾフェノン、２−エチルヘキシル−４′−フェニル−ベンゾフェノン−２−カルボキシレート、２−ヒドロキシ−４−ｎ−オクトキシベンゾフェノン、４−ヒドロキシ−３−カルボキシベンゾフェノン等のベンゾフェノン系紫外線吸収剤、例えば２，２′−ヒドロキシ−５−メチルフェニルベンゾトリアゾール、２−（２′−ヒドロキシ−５′−ｔ−オクチルフェニル）ベンゾトリアゾール、２−（２′−ヒドロキシ−５′−メチルフェニル）ベンゾトリアゾール等のベンゾトリアゾール系紫外線吸収剤、例えばジアニソイルメタン、４−メトキシ−４′−ｔ−ブチルジベンゾイルメタン等を挙げることができる。
【００５７】
これらの長波長紫外線吸収剤の中でも、４−メトキシ−４′−tert−ブチルジベンゾイルメタン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン誘導体、たとえば２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン−５−スルホン酸塩は安全性及び有効性に優れた長波長紫外線吸収剤であり、好ましいものである。
【００５８】
また、中波長紫外線（UVB)吸収剤として、パラアミノ安息香酸 (以下、PABAという。) 、PABAモノグリセリンエステル、Ｎ，Ｎ−ジプロポキシPABAエチルエステル、Ｎ，Ｎ−ジエトキシPABAエチルエステル、Ｎ，Ｎ−ジメチルPABAエチルエステル、Ｎ，Ｎ−ジメチルPABAブチルエステル、Ｎ，Ｎ−ジメチルPABAアミルエステル等の安息香酸系紫外線吸収剤、ジプロピレングリコールサリシレート、エチレングリコールサリシレート、ミリスチルサリシレート、メチルサリシレート、アミルサリシレート、メンチルサリシレート、ホモメンチルサリシレート、オクチルサリシレート、フェニルサリシレート、ベンジルサリシレート、ｐ−イソプロパノールフェニルサリシレート等のサリチル酸系紫外線吸収剤、
【００５９】
オクチルシンナメート、エチル−４−イソプロピルシンナメート、メチル−２，５−ジイソプロピルシンナメート、エチル−２，４−ジイソプロピルシンナメート、メチル−２，４−ジイソプロピルシンナメート、プロピル−ｐ−メトキシシンナメート、イソプロピル−ｐ−メトキシシンナメート、イソアミル−ｐ−メトキシシンナメート、オクチル−ｐ−メトキシシンナメート（２−エチルヘキシル−ｐ−メトキシシンナメート）、２−エトキシエチル−ｐ−メトキシシンナメート、シクロヘキシル−ｐ−メトキシシンナメート、エチル−α−シアノ−β−フェニルシンナメート、２−エチルヘキシル−α−シアノ−β−フェニルシンナメート、グリセリルモノ−２−エチルヘキサノイル−ジパラメトキシシンナメート、
【００６０】
メトキシケイ皮酸オクチル、３，４，５−トリメトキシケイ皮酸−３−メチル−４−［メチルビス（トリメチルシロキシ）シリル］ブチル、ｐ−ジメトキシケイ皮酸モノエチルエステル等のケイ皮酸系紫外線吸収剤、３−（４′−メチルベンジリデン）−ｄ、１−カンファー、３−ベンジリデン−ｄ、１−カンファー、５−（３，３−ジメチル−２−ノルボルニリデン）−３−ペンチン−２−オン等のカンファー誘導体、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチルエステル、２−フェニル−５−メチルベンゾオキサゾール、ジベンザラジン等を挙げることができる。
【００６１】
さらに、紫外線遮断剤として、酸化チタン（TiO₂）、タルク（MgSiO₂) 、カルミン (FeO₂) 、ベントナイト、カオリン、酸化亜鉛 (ZnO)等を挙げることができる。
前記保湿剤としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、１，３−ブチレングリコール、ヘキシレングリコール、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ムコイチン硫酸、カロニン酸、アテロコラーゲン、コレステリル−１２−ヒドロキシステアレート、乳酸ナトリウム、胆汁酸塩、ｄ１−ピロリドンカルボン酸塩、短鎖可溶性コラーゲン、ジグリセリン（ＥＯ）ＰＯ付加物、イザヨイバラ抽出物、セイヨウノコギリソウ抽出物、メリロート抽出物等を挙げることができる。
【００６２】
前記薬効成分としては、アルブチン、ビタミンＣおよびその誘導体、コウジ酸胎盤抽出物、グルタチオン、ユキノシタ抽出物等の美白剤、グリチルリチン酸誘導体、グリチルレチン酸誘導体、サリチル酸誘導体、ヒオキチオール、酸化亜鉛、アラントイン等の消炎剤、ローヤルゼリー、感光素、コレステロール誘導体、幼牛血液抽出物等の賦活剤、ノニル酸ワレニルアミド、ニコチン酸ベンジルエステル、ニコチン酸β−ブトキシエチルエステル、カプサイシン、ジンゲロン、カンタリスチンキ、イクタモール、カフェイン、タンニン酸、α−ボルネオール、ニコチン酸トコフェロール、イノシトールヘキサニコチネート、シクランデレート、シンナリジン、トラゾリン、アセチルコリン、
【００６３】
ベラパミル、セファランチン、γ−オリザノール等の血行促進剤：硫黄、チアントール等の抗脂漏剤、多様な目的から、オクバク抽出成分、オウレン抽出成分、シコン抽出成分、シャクヤク抽出成分、センブリ抽出成分、バーチ抽出成分、セージ抽出成分、ビワ抽出成分、ニンジン抽出成分、アロエ抽出成分、ゼニアオイ抽出成分、アイリス抽出成分、ブドウ抽出成分、ヨクイニン抽出成分、ヘチマ抽出成分、ユリ抽出成分、サフラン抽出成分、センキュウ抽出成分、ショウキョウ抽出成分、オトギリソウ抽出成分、オノニス抽出成分、ローズマリー抽出成分、ニンニク抽出成分、トウガラシ抽出成分、チンピ、トウキ等、レチノール、酢酸レチノール等のビタミンＡ類、リボフラビン、酪酸リボフラビン、フラビンアデニンヌクレオチド等のビタミンＢ₂類、ピリドキシン塩酸塩、ピリドキシンジオクタノエート等のビタミンＢ₂類、
【００６４】
Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸ジパルミチン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸−２−硫酸ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル、ＤＬ−α−トコフェロール−Ｌ−アスコルビン酸リン酸ジエステルジカリウム等のビタミンＣ類、パントテン酸カルシウム、Ｄ−パントテニルアルコール、パントテニルエチルエーテル、アセチルパントテニルエチルエーテル等のパントテン酸類、エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール等のビタミンＤ類、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ニコチン酸ベンジル等のニコチン酸類、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、ニコチン酸ＤＬ−α−トコフェロール、コハク酸ＤＬ−α−トコフェロール等のビタミンＥ類、ビタミンＰ、ビオチン等のビタミン類、を挙げることができる。
【００６５】
なお、その薬剤成分に関しては、その配合により本発明の所期の効果が損われない範囲で広く配合することができる。
こうして調製された本発明の組成物は、基底膜の構造変化に伴う機能低下を防止し、また、皮膚の賦活化を促進することができる。
【００６６】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１．マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤を用いた人工皮膚の製造
コラーゲンゲルは、ヒト真皮由来の線維芽細胞(0.3〜１×10⁵Cell/ml)懸濁コラーゲン溶液１０ml (コラーゲンは高研株式会社製品I-ACを使用した。) を氷上にて作製後、６０mmのペトリディシュ内にて３７℃でコラーゲンをゲル化した。その後、シャーレ壁面からゲルを剥離し、コラーゲンゲルをCO₂インキュベーター内にて収縮させた。
【００６７】
この真皮に相当する収縮コラーゲンゲルを金網の上にのせ、さらにガラスリング (内径１２mm）をこのゲルの上にのせる。このガラスリング内に液漏れをさせないようにヒト包皮由来の表皮ケラチノサイト（１×10⁶/ml)懸濁液｛５％牛胎児血清を含むKGM-DMEM (1:1)混合培地｝を 0.4ml入れる。一晩、CO₂インキュベーター内にてケラチノサイトを接着させ、翌日、リングを外す。上記培地を表皮層の境界まで満たし、表皮層を空気に曝しながら、培養を継続して角層形成を示す重層化した表皮を持つ皮膚モデルを作製した。
【００６８】
表皮細胞を接種した後、１週間目より、（１）10μM のCGS23027A （マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤）、又は（２） 300μM のMMP-インヒビター（p-NH₂-Bz-Gly-Pro-D-Leu-D-Ala-NHOH(FN-437)(BBRC, 1994, 199, p. 1442-1446) (Cabbiochem. Novabiochem Corporation より入手） (マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤) を含む培地に変え、その後２〜３日おきに、同種の同一濃度のマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤を含有する培地と交換し、さらに２週間培養した。また、（３）マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤を添加することなく同様の培養を行い対照とした。
【００６９】
結果を図１に示す。この図から明らかな通り、対照（３）においては表皮の基底細胞直下に基底膜様構造が観察されなかったが、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤である（１） CGS27023A化合物、又は（２）MMM-インヒビターを添加した場合には基底膜形成の亢進が明らかに観察された。
上記マトリックスメタロプロテナーゼが阻害化合物に代えて、下記の植物の抽出物について同様の実験を行い、基底膜形成の亢進が確認された。
【００７０】
イブキジャコウソウ（Thymus serpyllum L.)、カノコソウ (Valeriana fauriei Briquet)又はその他の近縁植物 (Valerianaceae)、カキノキ (Diospyros kaki Thunberg (Ebenaceae))、レンゲソウ (Astragalus sinicus Linne (Leguminosae)) 、サンザシ (Crataegus cuneata Siebold et Zuccarini (Rosaceae))、ボタン (Paeonia suffruticosa Andrews (Poeonia montan Sims) (Paconiaceae)) 、コウチャ (Thea sinensis Linne var. assamica Pierre, (Thcaccae)) 、ユーカリ (Eucalyptus globulus Labillardiere)又はその近縁植物 (Myrtaceae)、
【００７１】
トルメンチラ (Potentilla tormentilla Schrk (Rosaceae))、シナノキ (Tilia corda:a Mill., Tilia platyphyllus Scop., Tilia europaea Linne (Tiliaceae))、シラカバ (Betula alba Linne (Betulaceze)) 、マジョラム (Origanum majorana L.) 、アセンヤク (Uncaria gambir Roxburgh (Rubiaceae))、クルミ殻 (Juglans regia Linne var. sinensis De Candolie)又はその近縁植物 (Juglandaceae) 、クララ (Sophora flavescens Aiton (Leguminosae)) 、ワレモコウ (Sanguisorba officinalis Linne (Rosaceae)) 、オトギリソウ (Hypericum perforatum Linne又はHypericum erectum Thunberg (Guttiferae))、
【００７２】
チャ (Thea sinensis Linne (Theaceae)) 、ウコン (Curcuma longa L (Zingiberaceae))、ウコンの抽出精製物であるクルクミン、ハマスゲ (Symplocos racemosa, Cyperus rotundus) 、ミロバランノキ (Cyperus scariosus, Gaultheria fragrantissima, Acacia fornensia, Terminalia chebula) 、ベンガルボダイジュ (バンヤジュ) (Ficus bengalensis) 、ナンバンサイカチ (Cassia fistula Linn)、ネジキ (Lyonia ovalifolia)、テリハボク (ヤラボ、タマナ) (Calophyllum inophyllum)、テンジクボダイジュ (Ficus religiosa)についても同様の効果が確認された。
【００７３】
実施例２．マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤及びマトリックス蛋白質産生亢進剤の両者を用いた人工皮膚の製造
実施例１と同様の方法を反復したが、被験物質として下記のものを用いた。
（１）マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤「CGS27023A 」10μＭのみ；
（２）マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤「CGS27023A 」10μＭ、及びマトリックス蛋白質産生亢進剤「トランスフォーミング・グロスファクターα」（TGFa）10ng/ml ；
【００７４】
（３）マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤「CGS27023A 」10μＭ、及びマトリックス蛋白質産生亢進剤「トランスフォーミング・グロスファクターβ１」（TGFb1) 10ng/ml ；
（４）マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤「CGS27023A 」10μＭ、並びにマトリックス蛋白質産生亢進剤「トランスフォーミング・グロスファクターα」（TGFa）10ng/ml 、及び「トランスフォーミング・グロスファクターβ１」（TGFb1) 10ng/ml 。
【００７５】
（５）さらに、無添加対照の培養も行った。
形成された人工皮膚は、ヘマトキシエオジン染色（Ｈ＆Ｅ）、並びに免疫染色〔抗−ラミニン５（LN5)抗体、抗−VI型コラーゲン（IVC)抗体、及び第VII 型コラーゲン (VIIC) 抗体を使用〕により染色した。結果を図２及び３並びに表１に示す。なお、H&E 及びLN5 の結果は図２に示し、VIC 及びVIICの結果は図３に示す。
【００７６】
対照においては表皮／真皮接合部の接着が弱く、表皮が真皮から剥離しやすく、組織的にも空隙が観察された。これに対して、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤CGS27023A 処理群においては、表皮と真皮との間の接着性が明確である。また、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤CGS27023A に加えて、マトリックス蛋白質産生亢進剤であるトランスフォーミング・グロスファクターα（TGFa）、トランスフォーミング・グロスファクターβ１（TGFb1)、又はこの両者（TGFa+TGFb1) を加えた場合には、特にVII 型コラーゲンの染色性の亢進が顕著で、表皮と真皮との接着性が更に亢進していることが確認された。
【００７７】
【表１】

【００７８】
上記のマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤CGS27023A に代えて、下記の植物の抽出物を用い、上記の同様の培養を行った。
イブキジャコウソウ（Thymus serpyllum L.)、カノコソウ (Valeriana fauriei Briquet)又はその他の近縁植物 (Valerianaceae)、カキノキ (Diospyros kaki Thunberg (Ebenaceae))、レンゲソウ (Astragalus sinicus Linne (Leguminosae)) 、サンザシ (Crataegus cuneata Siebold et Zuccarini (Rosaceae))、ボタン (Paeonia suffruticosa Andrews (Poeonia montan Sims) (Paconiaceae)) 、コウチャ (Thea sinensis Linne var. assamica Pierre, (Thcaccae)) 、ユーカリ (Eucalyptus globulus Labillardiere)又はその近縁植物 (Myrtaceae)、
【００７９】
トルメンチラ (Potentilla tormentilla Schrk (Rosaceae))、シナノキ (Tilia corda:a Mill., Tilia platyphyllus Scop., Tilia europaea Linne (Tiliaceae))、シラカバ (Betula alba Linne (Betulaceze)) 、マジョラム (Origanum majorana L.) 、アセンヤク (Uncaria gambir Roxburgh (Rubiaceae))、クルミ殻 (Juglans regia Linne var. sinensis De Candolie)又はその近縁植物 (Juglandaceae) 、クララ (Sophora flavescens Aiton (Leguminosae)) 、ワレモコウ (Sanguisorba officinalis Linne (Rosaceae)) 、
【００８０】
オトギリソウ (Hypericum perforatum Linne又はHypericum erectum Thunberg (Guttiferae))、チャ (Thea sinensis Linne (Theaceae)) 、ウコン (Curcuma longa L (Zingiberaceae))、ウコンの抽出精製物であるクルクミン、ハマスゲ (Symplocos racemosa, Cyperus rotundus) 、ミロバランノキ (Cyperus scariosus, Gaultheria fragrantissima, Acacia fornensia, Terminalia chebula) 、ベンガルボダイジュ (バンヤジュ) (Ficus bengalensis) 、ナンバンサイカチ (Cassia fistula Linn)、ネジキ (Lyonia ovalifolia)、テリハボク (ヤラボ、タマナ) (Calophyllum inophyllum)、テンジクボダイジュ (Ficus religiosa)。
【００８１】
その結果、マトリックスメタロプロテアーゼとしてCGS27023A を用いた場合と同様の結果が得られた。またウコンの抽出精製物であるクルクミンについても同様の結果が得られた。
さらに、マトリックス蛋白質産生亢進剤として、トランスフォーミング・グロスファクターの代りに大豆レシチンを30μg/ml用いた場合には基底細胞の直下に基底膜様の構造物が連続的に観察された。この結果を図４に示す。
【００８２】
実施例３．人工皮膚培養培地の調製
一般に表皮細胞の培養に用いられるKGM(Keratinocyte growth medium) と、一般に線維芽細胞の培養に用いられる１０％牛胎児血清含有ダルベッコの改変イーグル培地を１：１で混合した基本培地に、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤である CGS27023A又はMMP-インヒビターを10μM 濃度となるように添加した。なお、KGM は、MCDB153 培地（10.93g/L）にHEPES (6.7g/L)、NaHCO₃ (1.2g/L) 、Insulin (5mg/L）、Transferrin （10mg/L）、Hydrocortisone(0.5mg/L）、Phosphorylethanolamine（14.1mg/L）を添加し、pH7.4 とした。さらに牛下垂体抽出物（極東製薬）を２０ｇ添加して調製した。
【００８３】
実施例４．人工皮膚培養培地の調製
実施例３における人工皮膚培養培地に、マトリックス蛋白質産生亢進剤として、トランスフォーミング・グロスファクターα（TGFa）又はトランスフォーミング・グロスファクターβ１（TGFb1)の少なくとも１種を10ng/ml の濃度となるように添加した。
また、上記TGFa又はTGFb1 に代えて大豆リゾレシチン30μｇ/ml を添加した。
【００８４】
製剤例１：クリーム
ポリオキシエチレン（２０モル付加）セチルアルコールエーテル 1.0
メチルフェニルポリシロキサン（20cs） 2.0
流動パラフィン 3.0
２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン 5.0
活性成分 0.2
プロピレングリコール 5.0
グリセリン 2.0
エチルアルコール 15.0
カルボキシビニルポリマー 0.3
ヒドロキシプロピルセルロース 0.1
２−アミノメチルプロパノール 0.1
防腐剤適量
香料適量
イオン交換水適量
【００８５】
（製造方法）
イオン交換水に、プロピレングリコール、グリセリン、エチルアルコール、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルセルロース、２−アミノメチルプロパノールを加え７０℃に加熱調整する（水相）。
メチルフェニルポリシロキサン、流動パラフィン、ポリオキシエチレンセチルアルコールエーテル、防腐剤、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、活性成分（リピデュール、CGS27023A など）、香料を混合して７０℃に調整する（油相）。
油相に水相を徐々に添加して予備乳化し、ホモミキサーを用いて乳化粒子を均一にした後、脱気、冷却を行ってクリームを得た。
【００８６】
製剤例２：クリーム
ポリオキシエチレン（２０モル付加）セチルアルコールエーテル 1.0
メチルフェニルポリシロキサン（20cs） 2.0
流動パラフィン 3.0
２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン 5.0
活性成分 0.2
プロピレングリコール 5.0
グリセリン 2.0
エチルアルコール 15.0
カルボキシビニルポリマー 0.3
ヒドロキシプロピルセルロース 0.1
２−アミノメチルプロパノール 0.1
防腐剤適量
香料適量
イオン交換水適量
【００８７】
（製造方法）
イオン交換水に、プロピレングリコール、グリセリン、エチルアルコール、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルセルロース、２−アミノメチルプロパノールを加え７０℃に加熱調整する（水相）。
メチルフェニルポリシロキサン、流動パラフィン、ポリオキシエチレンセチルアルコールエーテル、防腐剤、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、活性成分（リピデュール、CGS27023A など）、香料を混合して７０℃に調整する（油相）。
【００８８】

【００８９】
活性成分 0.1
トラネキサム酸 1.0
ポリオキシエチレン（１０）モノオレイン酸エステル 1.0
グリセロールモノステアリン酸エステル 1.0
クインスシード抽出液（５％水溶液） 20.0
防腐剤適量
香料適量
イオン交換水適量
【００９０】
製法
イオン交換水にグリセリン、１，３−ブチレングリコールを加えて混合し７０℃に加熱調整する（水相）。セチルアルコール、ミツロウ、ワセリン、スクワラン、ジメチルポリシロキサン、活性成分（リピデュール、CGS27023A など）、トラネキサム酸、ポリオキシエチレン（１０）モノオレイン酸エステル、グリセロールモノステアリン酸エステル、防腐剤を混合物して７０℃に加熱調整する（油相）。油相に水相を加えて予備乳化を行ない、これにクインスシード抽出液、エチルアルコールを加え撹拌し、ホモミキサーにて乳化粒子を均一にした後、脱気、ろ過、冷却を行なって乳液を得た。
【００９１】

【００９２】
活性成分 0.1
トラネキサム酸 1.0
ポリオキシエチレン（１０）モノオレイン酸エステル 1.0
グリセロールモノステアリン酸エステル 1.0
クインスシード抽出液（５％水溶液） 20.0
防腐剤適量
香料適量
イオン交換水適量
【００９３】
製法
イオン交換水にグリセリン、１，３−ブチレングリコールを加えて混合し７０℃に加熱調整する（水相）。セチルアルコール、ミツロウ、ワセリン、スクワラン、ジメチルポリシロキサン、活性成分（リピデュール、CGS27023A など）、トラネキサム酸、ポリオキシエチレン（１０）モノオレイン酸エステル、グリセロールモノステアリン酸エステル、防腐剤を混合物して７０℃に加熱調整する（油相）。油相に水相を加えて予備乳化を行ない、これにクインスシード抽出液、エチルアルコールを加え撹拌し、ホモミキサーにて乳化粒子を均一にした後、脱気、ろ過、冷却を行なって乳液を得た。
油相に水相を徐々に添加して予備乳化し、ホモミキサーを用いて乳化粒子を均一にした後、脱気、冷却を行ってクリームを得た。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、人工皮膚の形成のための培養において、培地にマトリックスメタロプロテアーゼCGS27023A(10μM)又はMMP-インヒビター(300μM)を添加した場合と、いずれも添加しなかった対照とを比較した人工皮膚の断面の写真であり、生物の形態を表わす図面代用写真である。
【図２】図２は、人工皮膚の形成のための培養において、培地にマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤CGS27023A (CGSとして示す）のみ、あるいはCGS のほかに、マトリックス蛋白質産生亢進剤であるトランスフォーミング・グロスファクターαを加えた場合 (CGS+TGFa）、CGS のほかにマトリックス蛋白質産生亢進剤であるトランスフォーミング・グロスファクターβ１を加えた場合 (CGS+TGFb1)、及びCGS のほかにTGFa及びTGFb1 の両方を加えた場合 (CGS+TGFa&TGFb1) に、形成された人工皮膚をヘマトキシエオシン染色（H&E)、並びに免疫染色〔ラミニン５の検出（LN5)〕を行った場合の結果を示す、人工皮膚の断面図であり、生物の形態を表わす図面代用写真である。
【図３】図３は、図２と同じ実験において、免疫染色〔IV型コラーゲンの検出（IVC)及びVII 型コラーゲンの検出（VIIC）〕を行った場合の結果を示す、人工皮膚の断片であり、生物の形態を表わす図面代用写真である。
【図４】図４は、人工皮膚の形成のための培養において、培地にマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤CGS27023A とマトリックス蛋白質産生亢進剤である大豆レシチンを添加した場合(CGS＋大豆レシチン）、とこれらを添加しなかった場合（Contral)において形成された人工皮膚の断面であり、生物の形態を表わす図面代用写真である。

Claims

人工皮膚形成培地中にマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤を添加することを特徴とする人工皮膚の製造方法において、この方法は、
（１）ヒト線維芽細胞を含むコラーゲンのゲル層を形成し；
（２）前記コラーゲンゲル層上で表皮ケラチノサイトを培養して、当該ケラチノサイトを前記ゲル層に接着させて表皮層を形成し；そして
（３）前記表皮層を空気に曝しながら人工皮膚形成培地中で培養を継続して基底膜の形成を促進する；
工程を含んでなり、前記人工皮膚形成培地はマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤を含有し、
ここで、前記マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤が、ゼラチナーゼ阻害剤、コラーゲナーゼ阻害剤、ストロメライシン阻害剤又はマトリライシン阻害剤である、
ことを特徴とする方法。
前記マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤が、CGS27023A 物質（Ｎ−ヒドロキシ−２−［［（４−メトキシフェニル）スルホニル］３−ピコリル）アミノ］−３−メチルブタンアミド塩酸塩）又はMMP-インヒビター（p-NH₂-Bz-Gly-Pro-D-Leu-Ala-NHOH)(FN-437)である、請求項１に記載の方法。
前記マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤が、イブキジャコウソウ (Thymus serpyllum L.)、カノコソウ (Valeriana fauriei Briquet)又はその他の近縁植物 (Valerianaceae)、カキノキ(Diospyros kaki Thunberg (Ebenaceae))、レンゲソウ (Astragalus sinicus Linne (Leguminosae)) 、サンザシ (Crataegus cuneata Siebold et Zuccarini (Rosaceae))、ボタン (Paeonia suffruticosa Andrews (Poeonia montan Sims) (Paconiaceae)) 、コウチャ (Thea sinensis Linne var. assamica Pierre, (Thcaccae)) 、ユーカリ (Eucalyptus globulus Labillardiere)又はその近縁植物 (Myrtaceae)、トルメンチラ (Potentilla tormentilla Schrk (Rosaceae))、シナノキ (Tilia corda:a Mill., Tilia platyphyllus Scop., Tilia europaea Linne (Tiliaceae))、シラカバ (Betula alba Linne (Betulaceze)) 、マジョラム (Origanummajorana L.) 、アセンヤク (Uncaria gambir Roxburgh (Rubiaceae))、クルミ殻 (Juglans regia Linne var. sinensis De Candolie)又はその近縁植物 (Juglandaceae) 、クララ (Sophora flavescens Aiton (Leguminosae)) 、ワレモコウ(Sanguisorba officinalis Linne (Rosaceae)) 、オトギリソウ (Hypericum perforatum Linne又はHypericum erectum Thunberg (Guttiferae))、チャ (Thea sinensis Linne (Theaceae)) 、ウコン (Curcuma longa L (Zingiberaceae))、ウコンの抽出精製物であるクルクミン、ハマスゲ (Symplocos racemosa, Cyperus rotundus) 、ミロバランノキ(Cyperus scariosus, Gaultheria fragrantissima, Acacia fornensia, Terminalia chebula) 、ベンガルボダイジュ (バンヤジュ) (Ficus bengalensis) 、ナンバンサイカチ (Cassia fistula Linn)、ネジキ (Lyonia ovalifolia)、テリハボク (ヤラボ、タマナ) (Calophyllum inophyllum)、及びテンジクボダイジュ (Ficus religiosa)から成る群から選択される植物抽出物である、請求項１に記載の方法。
ことを特徴とする人工皮膚の製造方法。
人工皮膚形成培地中にマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤及びマトリックス蛋白質産生亢進剤を添加して基底膜の形成を促進することを特徴とする人工皮膚の製造方法において、この方法は、
（１）ヒト線維芽細胞を含むコラーゲンのゲル層を形成し；
（２）前記コラーゲンゲル層上で表皮ケラチノサイトを培養して、当該ケラチノサイトを前記ゲル層に接着させて表皮層を形成し；そして
（３）前記表皮層を空気に曝しながら人工皮膚形成培地中で培養を継続して基底膜の形成を促進する；
工程を含んでなり、前記人工皮膚形成培地はマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤及びマトリックス蛋白質産生亢進剤を含有し、
ここで、前記マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤が、ゼラチナーゼ阻害剤、コラーゲナーゼ阻害剤、ストロメライシン阻害剤又はマトリライシン阻害剤であり、そして
前記マトリックス蛋白質産生亢進剤が、大豆リゾレシチン、トランスフォーミング・グロスファクターα（ TGFa ）、トランスフォーミング・グロスファクターβ１（ TGFb1) 、トランスフォーミング・グロスファクターβ２（ TGFb2) 、トランスフォーミング・グロスファクターβ３（ TGFb3) 又は表皮増殖因子 (EGF) である、
ことを特徴とする方法。
前記マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤が、CGS27023A 物質（Ｎ−ヒドロキシ−２−［［（４−メトキシフェニル）スルホニル］３−ピコリル）アミノ］−３−メチルブタンアミド塩酸塩）又はMMP-インヒビター（p-NH₂-Bz-Gly-Pro-D-Leu-Ala-NHOH)(FN-437)である、請求項４に記載の方法。
前記マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤が、イブキジャコウソウ (Thymus serpyllum L.)、カノコソウ (Valeriana fauriei Briquet)又はその他の近縁植物 (Valerianaceae)、カキノキ(Diospyros kaki Thunberg (Ebenaceae))、レンゲソウ (Astragalus sinicus Linne (Leguminosae)) 、サンザシ (Crataegus cuneata Siebold et Zuccarini (Rosaceae))、ボタン (Paeonia suffruticosa Andrews (Poeonia montan Sims) (Paconiaceae)) 、コウチャ (Thea sinensis Linne var. assamica Pierre, (Thcaccae)) 、ユーカリ (Eucalyptus globulus Labillardiere)又はその近縁植物 (Myrtaceae)、トルメンチラ (Potentilla tormentilla Schrk (Rosaceae))、シナノキ (Tilia corda:a Mill., Tilia platyphyllus Scop., Tilia europaea Linne (Tiliaceae))、シラカバ (Betula alba Linne (Betulaceze)) 、マジョラム (Origanummajorana L.) 、アセンヤク (Uncaria gambir Roxburgh (Rubiaceae))、クルミ殻 (Juglans regia Linne var. sinensis De Candolie)又はその近縁植物 (Juglandaceae) 、クララ (Sophora flavescens Aiton (Leguminosae)) 、ワレモコウ(Sanguisorba officinalis Linne (Rosaceae)) 、オトギリソウ (Hypericum perforatum Linne又はHypericum erectum Thunberg (Guttiferae))、チャ (Thea sinensis Linne (Theaceae)) 、ウコン (Curcuma longa L (Zingiberaceae))、ウコンの抽出精製物であるクルクミン、ハマスゲ (Symplocos racemosa, Cyperus rotundus) 、ミロバランノキ(Cyperus scariosus, Gaultheria fragrantissima, Acacia fornensia, Terminalia chebula) 、ベンガルボダイジュ (バンヤジュ) (Ficus bengalensis) 、ナンバンサイカチ (Cassia fistula Linn)、ネジキ (Lyonia ovalifolia)、テリハボク (ヤラボ、タマナ) (Calophyllum inophyllum)、及びテンジクボダイジュ (Ficus religiosa)から成る群から選択される植物抽出物である、請求項４に記載の方法。