JP3847257B2 - Hbvの検出又は測定方法 - Google Patents
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Description
本発明はB型肝炎ウイルス(HBV)の検出又は測定方法、並びにこれらの検出及び定量に用いられるモノクローナル抗体とそのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。
背景技術
輸血後肝炎は、その名の通り輸血により引き起こされる肝炎を意味するが、この輸血後肝炎の原因ウイルスとして最初に同定されたのがB型肝炎ウイルス(HBV)である。HBV抗原検査では、血液スクリーニングのためにB型肝炎ウイルス表面(HBs)抗原検出法が利用されており、HBVの増殖マーカーとしてはB型肝炎ウイルスe(HBe)抗原測定法が汎用されている。
HBe抗原は、HBV粒子を構成するB型肝炎ウイルスコア蛋白(HBc抗原)と同じプロモーターにより発現されるプレコア蛋白である。この蛋白はHBVの増殖時に積極的に分泌産生されることから、HBe抗体のない状態では、血中のHBe抗原量はHBV量をほぼ反映すると考えられている。しかし、いったんHBe抗体産生が始まるとHBe抗原は免疫複合体を形成し、HBe抗体だけが検出可能となるセロコンバージョンが確立される。このような検体においてはHBe抗原は検出されず、HBV量を反映しない。
一方、B型肝炎の鎮静化を意味するセロコンバージョンの状態であっても、肝炎の活動性を示すAlanine aminotransferase(ALT)値が変動する例が報告され、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)においてHBV DNAが検出されることにより、プレコア変異株の存在が確認された。プレコア変異株とは、プレプロHBe蛋白の28番目のコドンがストップコドンに変異したために、HBe抗原の産生及び分泌が不能となり、HBe抗原が陰性化することである。つまり、HBVキャリアのモニタリングには、HBe抗原抗体測定法だけでは不十分であることが明らかとなった。
また、Nucleic acid Amplification Test(NAT)検査の普及により、HBV DNA量とHBVキャリアの病態との関連が注目され、抗ウイルス剤による治療後のモニタリングにはNAT検査が主に利用されてきている。
しかし、PCR法及びTMA法等のNAT検査法は、遺伝子断片を検出するには高感度な検出方法であるが、検体中からHBVゲノムDNAを抽出する際、用手法において処理時間が2時間も必要であり、複数回の操作工程を含むなど煩雑である。加えて、このように操作が複雑であるために、コンタミネーションの機会が増え、偽陽性検体の生じる可能性を増加させている。また、安定した定量値を得るたには熟練を要し、DNAのように生化学的に不安定な物質を検出するために、検体の保存に多大な注意をはらう必要がある。このようなことから、一度に大量の検体を処理することができにくい。近年、自動化機器の開発により、コンタミネーション対策やDNA抽出の処理時間の短縮がなされてきたが、依然として高価な機器を必要とするため、検体を多量処理する施設以外には一般に普及はしていない。さらに、DNAプライマーが標的遺伝子と一致しなければならないため、プライマーを数種類も使用する必要があり、検査あたりのコストが免疫測定法と比較して高くなるといった問題点がある。
上記のHBVゲノムを検出する方法の代わりに、HBVコア抗原(HBc抗原)を直接検出する方法も開発された。Usudaら(Journal of Virological Methods,72,95−103,1998)は、HBVコア(HBc)抗原に対して特異性を有するモノクローナル抗体を用いて、血清中のHBc抗原を検出する方法を開発し、上記のウイルスゲノムを検出するNAT検査法と同様に臨床的有用性を持つことを示した。しかしながらこの方法にもいくつかの点で問題が残されている。
まず、NAT検査法と比較すると感度が低く、HBV DNA量として105コピー/mlが検出限界であるため、血清スクリーニングやモニタリング検査に用いることが出来ないことである。
さらに、測定のための検体処理の工程が繁雑であり、かつ時間がかかることからスクリーニング及びモニタリングなどの用途に用いようとした際に問題となる。すなわち検体(血清)の処理のために、ウイルス粒子の濃縮と血清成分の除去のためにHBsポリクローナル抗体処理(37℃2時間)、遠心操作(10分間)、上清の除去、界面活性剤処理、アルカリ処理(35分間)、中和剤添加といった多段階処理工程を必要とする。このような工程は、非常に熟練を要する作業であるため、再現性を得るためには熟練度が必要であり、また最低約3時間の処理時間が必要である。さらに遠心操作、上清除去等の工程があるために、自動化が困難で、かつ同時大量処理を困難にしており操作面においても大量処理を必要とする用途に適していない。
このような問題から、臨床検査において実用とされるには到っていない。
一方、HBc抗原検出系は、以下の点でNAT検査法と比較して優れている点がある。すなわち検出過程で増幅処理操作が加わらないため、コンタミネーションに対し比較的寛容である。またDNAのように生化学的に不安定な物質を検出するのではなく、比較的安定な物質である抗原蛋白質を検出することから、検体の保存に過度の注意をはらう必要がなく、検体の輸送も容易になる。
これらの特長は例えば血液事業や健康診断の様に、多数の検体を測定する用途には重要な要件である。しかしながら、開示されているHBc抗原検出法は、前処理が繁雑で自動化に適さず、感度が低くいわゆるスクリーニングや治療モニタリング用途に用いることが出来ず、NAT検査法に対して優れている点を活かすことが出来ていない。また、臨床的に有用性が高い測定方法は、常に感度、特異性、再現性、操作性、低コストを課題とし、これらを全て満たすように鋭意開発していく必要性がある。
これまでの文献では、HBc抗原について以下の[ ]内に示すアミノ酸番号の配列領域を認識する抗体が報告されている。
[73−89];A.Semiletov Iu et al.,Bioorg Khim 20(11),1175−85(1994)
[124−133],[135−147];M.Sallberg et al.,J Gen Virol 74(Pt7),1335−40(1993)
[N terminal],[134−140];V.Skrivelis et al.,Scand J Immunol 37(6),637−43(1993)
[2−10],[134−140],[138−154];V.Bichko et al.,Mol Immunol 30(3),221−31(1993)
[126−135];M.Sallberg et al.,Mol Immunol 28(7),719−26(1991)
[76−85];M.Sallberg et al.,J Med Virol 33(4),248−52(1991)
[73−85],[107−118];G.Colucci et al.,J Immunol 141(12),4376−80(1988)
[9−20],[78−83],[127−133],[133−145];P.Pushko et al.,Virology 202(2),912−20(1994)
これらの抗体を用い、検体前処理法と組み合わせて、HBc抗原測定系を組み立てることが可能である。しかしながら、高感度高特異性の測定系には到っていない。
発明の開示
HBVのNAT検査には、現在PCR法及びTMA法があるが、検査コストが高く付く上に操作が煩雑であることが問題点として挙げられる。また、遺伝子増幅法を用いているため、増幅用プライマーが標的DNAと一致しないと偽陰性を引き起こす。一方、免疫測定法は操作が簡便で安価に測定できるが、増殖マーカーとしての現行のHBe抗原測定法では、HBe抗体の存在下では免疫複合体として存在するHBe抗原を測定できない。また、HBc抗原測定法は、HBV DNA量と相関はあるものの、前処理が繁雑で感度不足のため臨床応用されていない。
従って本発明の目的は、B型肝炎のスクリーニングやB型慢性肝炎患者の治療におけるモニタリングなどに用いるため、HBVコア関連抗体(HBe及びHBc抗体)存在下においてもHBVコア関連抗原(HBe及びHBc抗原)を定量する測定法を提供することである。すなわちNAT検査と比較し同等の感度、特異度を持ち、簡便な前処理で、自動化などの大量処理システムに容易に適用可能なHBVコア関連抗原検出系を提供することである。
本発明は、血中のHBV粒子及びHBV関連蛋白を変性することで、HBVコア関連抗原(HBe及びHBc抗原)を十分に露出し、HBe及びHBc抗原に対する抗体が存在する場合には該抗体を不活化して、HBe及びHBc抗原を検出又は定量することによりHBVを高感度に検出又は測定する手段を提供する。
従って本発明は、HBVを含む検体をHBe及びHBc抗原を特異的に認識するプローブに反応させることにより、HBe及びHBc抗原を検出又は定量することを特徴とするHBVの測定方法を提供する。
本発明はさらに、前記の免疫測定方法に用いるための、後記のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含んでなる検体中のHBVの有無を判別するキット、定量するキット又は診断薬を提供する。
本発明はさらに、上記のHBe及びHBc抗原の検出のためのプローブとして適するモノクローナル抗体を生産するHB44(FERM BP−7232)、HB50(FERM BP−7233)、HB61(FERM BP−7234)、HB91(FERM BP−7235)またはHB114(FERM BP−7236)から成る群から選択されるハイブリドーマ細胞株を提供する。
本発明はまた、HB44(FERM BP−7232)、HB50(FERM BP−7233)、HB61(FERM BP−7234)、HB91(FERM BP−7235)またはHB114(FERM BP−7236)から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体を提供する。
本発明はまた、これまでエピトープとして報告されていないHBVコアポリペプチドのアミノ酸番号31〜49(配列番号1)またはアミノ酸番号1−81(配列番号2)のアミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、およびその製造法を提供する。
これに加え本発明は、上記のHBe及びHBc抗原の検出のためのプローブとして適するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞株HB110(FERM BP−7624)、およびそれによって産生されるモノクローナル抗体を提供する。また、上記性質を持つ抗体および抗体を産生するハイブリドーマを作製、選択する方法を提供する。
さらに本発明はこれまでエピトープとして報告されていないHBVコアポリペプチドのアミノ酸番号21−40(配列番号9)に記載のアミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、およびその製造法を提供する。
発明の実施の形態
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明でいうHBVコア関連抗原とは、HBe及びHBc抗原であり、その融合タンパクや断片タンパク、ペプチドも含む。HBe及びHBc抗原のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号3及び4に記載される。183アミノ酸からなるHBc抗原(アミノ酸番号1〜183)のうちN端側の149アミノ酸配列がHBe抗原(アミノ酸番号−10〜149)と同一であり、HBe抗原はHBVのプレコア蛋白と言われている。この共通領域を特異的に認識する抗体を取得し、検体前処理法と組み合わせて測定系を構築することにより、抗体存在下でもHBVコア関連抗原を測定することが可能となる。
まず、HBc抗原を取得するために、配列番号4のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子断片を発現ベクターにクローニングする必要がある。目的の遺伝子断片は、HBV患者血清からウイルス遺伝子を分離して、PCRにより目的遺伝子を増幅することにより調製することができる。さらに、PCR作製時に付加されたリンカー由来の制限酵素部位もしくはその遺伝子断片が挿入されたプラスミド由来の制限酵素部位などを利用し、発現ベクターにクローニングすることができる。
すなわち、宿主として例えば大腸菌、枯草菌もしくは放線菌などの原核生物を用いることができ、また、プロモーターとしては例えばトリプトファン合成酵素オペロン(trp)、ラクトースオペロン(lac)、λファージPL及びPRプロモーターなどを用いることができる。
また、酵母、昆虫細胞、植物細胞もしくは動物細胞などの真核生物を宿主として用いることも可能である。この時のプロモーターとしては、酵母などに慣用のプロモーターである3−ホスホグリセレートキナーゼ、エノラーゼなどの解糖系酵素に対するプロモーターやアルコールデヒドロゲナーゼに対するプロモーター、哺乳動物細胞で使用されるウイルスプロモーター、例えばポリオーマウイルス、アデノウイルスサルウイルスSV40、ワクシニアウイルスもしくはサイトメガロウイルスなど由来のプロモーターが挙げられる。
ベクターはさらに、形質転換された細胞の表現型選択を可能にするマーカー配列、例えばアンピシリン、テトラサイクリン耐性遺伝子などや複製開始点、ターミネーター、リボソーム結合部位などを適宜含み得る。
つぎに、発現ベクターを宿主細胞内に形質転換し、その形質転換体を培養してHBc抗原を発現させ、回収する方法を宿主に大腸菌を用いる例として記載する。
形質転換の方法は、塩化カルシウム法などの通常の形質転換方法を適用すればよい。こうして発現ベクターpATtrp−HBcで適当な宿主大腸菌を形質転換することにより組換え大腸菌が得られる。
組換え大腸菌を培養する方法は、通常用いられるL培地、YT培地、M9−CA培地などの栄養豊富な大腸菌用培地で培養すればよい。上記のように作製された発現ベクターは、薬剤耐性遺伝子を有しており、その形質転換大腸菌を培養する場合には、それに対応する薬剤を適当な濃度になるように添加しておくことが望ましい。例えば宿主大腸菌としてHB101株を用いて発現ベクターpATtrp−HBcで形質転換することにより得られた組換え大腸菌HB101[pATtrp−HBc]を培養する場合には、アンピシリンを20〜200μg/mlの濃度になるように培地に添加しておけばよい。
目的遺伝子を発現させる場合には、その上流のプロモーターを適当な方法で働かせて発現誘導を行えばよい。例えば前述のベクターの場合には、適当な培地である程度の菌体量に達するまで培養した後、IAA(インドールアクリル酸)を添加して、遺伝子発現を開始させる方法がとられる。効率的な遺伝子発現を行うためには、対数増殖期の初期ないしは中期にIAAを添加することが望ましい。発現誘導後、さらに培養を継続して目的蛋白を菌体内に蓄積させる。例えば組換え大腸菌HB101[pATtrp−HBc]の場合には、アンピシリンを添加したM9−CA培地で、37℃で13〜16時間培養することにより多くの菌体量が得られ、且つ目的蛋白を高収量で得ることができる。
培養によって得られた菌体から目的蛋白を採取精製する方法は慣用の技術、例えば細胞の超音波破壊、遠心分離、各種クロマトグラフィーなどの操作により達成し得る。すなわち、上記のような方法で目的蛋白を効率よく発現させた場合、多くの蛋白は菌体内で不溶性顆粒を形成するが、HBc抗原は菌体内でHBc粒子を形成する。この特徴を利用して、菌体を生理食塩水などの生理的条件の緩衝液に懸濁した後、超音波処理により細胞を破砕し、菌体破砕物を遠心分離し、可溶性分画をさらに超遠心することによりHBc粒子が回収される。回収されたHBc粒子をゲルろ過、ショ糖密度勾配遠心法、透析により高純度のHBc抗原とした後、免疫原として利用することができる。
本発明のHBc抗原、HBe抗原並びに配列番号1〜5に示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドなどのHBVコア関連抗原に対するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体類は、当業者により容易に作製することができる。
ポリクローナル抗体は、例えばラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどの動物に、上記HBc抗原もしくはポリペプチド(以下、本抗原)を単独あるいはBSA,KLHなどと結合させた抗原として、フロイント完全アジュバントなどのアジュバントと混合して定期的に免疫し、血清を採取することで作製することができる。特定の認識部位を持つポリクローナル抗体を得るためには、目的とする領域の部分ペプチドを免疫源に用いる方法がある。
ハイブリドーマによるモノクローナル抗体の作製はよく知られている。例えばBALB/cマウスなどの腹腔内あるいは皮下に、上記HBc抗原もしくはポリペプチド(以下、本抗原)を単独あるいはBSA,KLHなどと結合させた抗原として、フロイント完全アジュバントなどのアジュバントと混合して定期的に免疫する。血中の抗体価が上昇した時点で、最終免疫として本抗原を尾静脈内に投与し、無菌的に脾臓を摘出した後、適当なマウス骨髄腫細胞株と細胞融合し、ハイブリドーマを得る。本方法は、KohlerとMilsteinの方法(Nature 256:495−497,1975)に従って行なうことができる。
上記方法により得られたハイブリドーマを適当な培養液中で培養し、その後、本抗原に対して特異的な反応を示す抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を選択してクローン化する。抗体産生ハイブリドーマのクローニングには限界希釈法のほか軟寒天法(Eur J Immunol.6:511−519,1976)などを利用することができる。このハイブリドーマを培地中またはマウス腹腔で培養し、培地中や腹水中にモノクローナル抗体を産生させることができる。
そして、血清中のポリクローナル抗体、培地中や腹水中に産生されたモノクローナル抗体はプロテインAカラムクロマトグラフィーなどの方法により精製することができる。ポリクローナル抗体は、担体固定化抗原を用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの方法により、特定の抗原に反応する抗体のみを精製することが可能であり、同様にして特定の抗原に反応しない抗体を得ることもできる。
上記のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体以外にもプローブとして用いる分子は作製することが出来る。例えば組換え抗体については、Hoogenboonの総説などに詳しく記載されている(Trends in Biotechnology,15:62−70,1997)。
本発明に従って調製されたモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は、HBVコア関連抗原の検出および定量用に、エンザイム−リンクイムノソルベントアッセイ(ELISA)、酵素イムノドットアッセイ、ラジオイムノアッセイ、凝集に基づいたアッセイ、あるいは他のよく知られているイムノアッセイで検査試薬として用いることができる。また、検出に標識抗体が使用される場合は、標識としては例えば蛍光物質、化学発光物質、放射性物質、酵素などが使用される。
例えば、検体中のHBVコア関連抗原を検出するためにサンドイッチ反応系を原理とした方法を用いる場合、使用すべき診断キットは、固体支持体(例えばマイクロタイターウェルの内壁)に結合された本発明の1種類以上の抗体および標識物質と結合させた1種類以上の抗体またはそのフラグメントを含む。固体支持体に結合させる抗体および標識抗体の組み合わせは自由であり、高感度、高特異性の得られる組み合わせを選択できる。
使用できる固体支持体としてはポリスチレンやポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリビニール製のマイクロタイタープレート、試験管、キャピラリー、ビーズ(ラテックス粒子や赤血球、金属化合物など)、膜(リポソームなど)、フィルターなどが挙げられる。
本発明における検体には、全血、血漿、血清、尿、唾液、脳脊髄液などの生物学的体液、および肝組織などの組織が含まれる。
本発明においては、検体を煩雑な操作なく、プローブ例えばモノクローナル抗体と結合反応させるのに適した状態に検体中のHBVコア関連抗原を処理する方法が重要な要件である。すなわち、検体中に含まれるHBc抗体、HBe抗体を不活化し、ウイルス粒子中などに含まれるHBc抗原や、血清アルブミン等と結合したHBe抗原を効率よく遊離させることが重要になる。
つまり本発明の測定方法における前処理方法には、検体中に存在するHBVコア関連抗原を効率よく遊離させることのみならず、同時に検体中に存在するHBVコア関連抗原に結合する抗体をも失活させる必要がある。すなわち、検体にSDSを含む溶液を加えて熱処理することで、HBVコア関連抗原を遊離させ、検体中のHBVコア関連抗体の機能破壊をおこさせる。
また、本発明においては、上記のように変性された抗原に対し、特異的に結合するプローブを用いることが重要な要件である。プローブとして抗体を用いる場合、このような変性処理によってもHBVコア関連抗原のエピトープが存続し、イムノアッセイにおける特異的な抗原抗体反応を起こすことができる抗体およびその組み合わせを見いだすことが重要である。本発明においては、こうした性質を満たす抗体を作製するため、あらかじめSDSにて変性処理を行った抗原を免疫し、さらに抗体の選択にも工夫を凝らす必要がある。あらかじめ変性処理した固相化抗原に対し、SDSを含む溶液中で反応する抗体を選択することにより、本発明のイムノアッセイに適した抗体が得られる。このような観点から抗体を選択すると、これまで報告されていない領域を認識する抗体も必要となり得る。本発明ではこのような抗体認識部位として、HBVコアポリペプチドのアミノ酸番号31−49の領域(配列番号1)および、アミノ酸番号1−81の領域(配列番号2)の2箇所の領域を提示する。さらに、このような認識部位としてアミノ酸番号21−40の領域(配列番号9)を提示する。
このエピトープを認識する抗体の有用性は実施例に示すが、同様のエピトープを有するモノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体を用いることも可能である。このような抗体は、目的領域の部分ペプチドを単独あるいはKLH,BSAなどのキャリアタンパクと結合して免疫源に用いることで、容易に作製し得る。また、モノクローナル抗体のスクリーニングに目的領域の部分ペプチドを抗原に用いるなどの方法により、目的の領域に反応する抗体のみを選択することも可能である。ポリクローナル抗体は、目的とする抗原を固相化し、アフィニティークロマトグラフィーを行うことで特定の抗原に反応する抗体を精製することができる。
このようにして、検体前処理法、特異的プローブを測定に適した条件で組み合わせることにより、HBVコア関連抗体の存在下においてもHBVコア関連抗原を簡便にかつ感度よく検出、及び定量することが可能となる。
また本発明によって示される測定方法を利用して、検体中のHBVの有無を判別するキット、定量するキット及び診断薬を作製することが可能となる。また本発明の測定法は、HBVのスクリーニングおよび患者のモニタリングの手段を提供する。
実施例
以下の実施例は本発明を例証するものであるが、これによって本発明の範囲を制限するものではない。
実施例1. HBVコア関連抗原の発現および精製
(A)HBc抗原発現プラスミドの構築
HBVのコア領域に相当する発現プラスミドは以下の方法で構築した。HBV患者血清100μlをDNA抽出液100μl[1M Tris−HCl(pH8.4)が10μl,250mM EDTAが8μl,10%SDSが40μl,5M NaClが8μl,20mg/ml ProteinaseKが10μl,tRNA(5μg/μl)が1μl,滅菌水が23μl]と混合させ、54℃、30分間保温した。200μlのフェノール・クロロホルム(1:1)溶液を加えて混合し、15Krpmで5分間の遠心分離の後、上清を取り出し150μlのイソプロパノールと7μlの5M NaClを加えて−20℃1時間静置した。15Krpm、4℃で5分間遠心分離し、沈殿物を70%エタノールでリンスし、15Krpm、4℃で再度5分間遠心分離した。沈殿物を自然乾燥させ、20μlの滅菌水に溶解させてHBV DNA溶液とした。
このHBV DNA溶液の5μlを2つのプライマー(5′−GAATTCATGGACATTGACCCGTATAAA−3′(配列番号:6),5′−GGATCCTAACATTGAGATTCCCGAGA−3′(配列番号:7)を用いPCRを行なった。PCRはGeneAmpTM(DNA Amplification Reagent Kit,Perkin Elmer Cetus製)のキットを用いDNA変性95℃1分、アニーリング55℃1分、DNA合成72℃1分の条件で行い、得られたDNA断片を0.8%アガロースゲル電気泳動により分離し、グラスパウダー法(GeneClean)で精製した。この増幅されたHBc遺伝子断片0.5μgを制限酵素反応液20μl〔50mM Tris−HCl(pH7.5),10mM MgCl2,1mM ジチオスレイトール、100mM NaCl,15単位のEooRIおよび15単位のBamHI酵素〕中で37℃1時間消化し、その後0.8%アガロースゲル電気泳動を行い、約570bpのEooRI−BamHI断片を精製した。
次に発現ベクターであるpATtrpのDNA0.5μgを制限酵素反応液20μl〔50mM Tris−HCl(pH7.5),10mM MgCl2,1mM ジチオスレイトール、100mM NaCl,15単位のEooRIおよび15単位のBamHI酵素〕中で37℃で1時間消化し、その反応液に水39μlを加え、70℃で5分間熱処理した後にバクテリアアルカリ性ホスファターゼ(BAP)1μl(250単位/μl)を加えて37℃で1時間保温した。
この反応液にフェノールを加えてフェノール抽出を行い、得られた水層をエタノール沈殿し、沈殿物を乾燥した。得られたEooRI−BamHI処理ベクターDNA0.5μgと上述のHBc570bp断片を10×リガーゼ用緩衝液〔660mM Tris−HCl(pH7.5),66mM MgCl2,100mMジチオスレトール、1mM ATP〕5μl,T4リガーゼ1μl(350単位/μl)に水を加えて50μlとし、16℃で一晩保温し、連結反応を行なった。発現プラスミドpATtrp−HBcを得るために、この連結反応液を用いて大腸菌HB101を形質転換した。
形質転換に用いる感受性大腸菌株は塩化カルシウム法〔Mandel,M.とHiga,A.,J.Mol.Biol.,53,159−162(1970)〕により作られる。形質転換大腸菌を25μg/mlのアンピシリンを含むLBプレート(1%トリプトン、0.5%NaCl,1.5%寒天)上に塗布し、37℃に一晩保温した。プレート上に生じた菌のコロニーを1白金耳取り、25μg/mlのアンピシリンを含むLB培地に移し、一晩37℃で培養した。
1.5mlの菌培養液を遠心して集菌し、プラスミドDNAのミニプレパレーションをアルカリ法〔Manniatisら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(1982)〕により行なった。得られたプラスミドDNA1μgを制限酵素反応液20μl〔50mM Tris−HCl(pH7.5),10mM MgCl2,1mM ジチオスレイトール、100mM NaCl,15単位のEooRIおよび15単位のBamHI酵素〕中で37℃1時間消化し、アガロースゲル電気泳動を行なって、約570bpのEooRI−BamHI断片が生じるpATtrp−HBc発現プラスミドを選別した。
(B)HBc抗原をコードするポリペプチドの発現および精製
発現プラスミドpATtrp−HBcをもつ大腸菌HB101株を50μg/mlのアンピシリンを含む3mlの2YT培地(1.6%トリプトン、1%酵母エキス、0.5%NaCl)に接種し、37℃で9時間培養する。この培養液1mlを50μg/mlのアンピシリンを含む100mlのM9−CA培地(0.6%Na2HPO4,0.5%KH2PO4,0.5%NaCl,0.1%NH4Cl,0.1mM CaCl2,2mM MgSO4,0.5%カザミノ酸、0.2%グルコース)に植え継ぎ、37℃で培養した。OD600=0.3の時に終濃度40mg/lになるようにインドールアクリル酸を加え、さらに16時間培養した。この培養液を5Krpm、10分間遠心分離して菌体を集めた。
菌体に20mlの緩衝液A〔50mM Tris−HCl(pH8.0),1mM EDTA,30mM NaCl〕を加えて懸濁し、再び遠心分離を行なって発現菌体2.6gを得た。得られた菌体を緩衝液A 10ml中に懸濁し、超音波破砕により大腸菌膜を破砕した後に12Krpm,4℃,30分間遠心分離を行い、HBc粒子を含む可溶性画分を得た。回収した上清を23Krpm、4℃にて2時間遠心し(Beckman SW28.1ローター)、沈殿を得た。沈殿は5%ショ糖を含むTris−EDTA緩衝液(50mM Tris−HCl(pH8.0),5mM EDTA)に再懸濁した。5%ショ糖を含むTris−EDTA緩衝液にて平衡化したSepharose CL4B(Amasham−Pharmacia Biochem)カラム(2.6cm×85cm)にアプライし同緩衝液にて溶出させた。分画をSDS−PAGEにより解析し、HBc抗原の分子量22kDaのバンドが検出された分画を集めた。集めた分画を限外濾過(排除分子量50kDa)により濃縮した後、60%ショ糖、50%ショ糖、40%ショ糖を含むTris−EDTA緩衝液を重層させたステップ密度勾配上に濃縮液を重層させ、39Krpm、4℃にて5時間遠心した(Beckman Ty60Tiローター)。遠心後底から順に分画し、分画をSDS−PAGEにより解析した。HBc抗原は高密度分画と低密度分画の2層に分画され、それぞれを集め、HBc抗原精製品として用いた。
(C)HBe−HBc融合抗原の発現プラスミドの構築
次にHBe−HBc融合抗原のプラスミドの構築を行った。前述のHBV患者血清より調整したHBV DNA溶液の5μlを2つのプライマー(5′−GAATTCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTT−3′(配列番号:8),5′−GGATCCTAACATTGAGATTCCCGAGA−3′(配列番号:7)を用いPCRを行なった。PCRはGeneAmpTM(DNA Amplification Reagent Kit,Perkin Elmer Cetus製)のキットを用いDNA変性95℃1分、アニーリング55℃1分、DNA合成72℃1分の条件で行い、得られたDNA断片を0.8%アガロースゲル電気泳動により分離し、グラスパウダー法(GeneClean)で精製した。この増幅されたHBe−HBc遺伝子断片0.5μgを制限酵素反応液20μl〔50mM Tris−HCl(pH7.5),10mM MgCl2,1mM ジチオスレイトール、100mM NaCl,15単位のEooRIおよび15単位のBamHI酵素〕中で37℃1時間消化し、その後0.8%アガロースゲル電気泳動を行い、約600bpのEooRI−BamHI断片を精製した。
次に発現ベクターであるpATtrpEのDNA0.5μgを制限酵素反応液20μl〔50mM Tris−HCl(pH7.5),10mM MgCl2,1mM ジチオスレイトール、100mM NaCl,15単位のEooRIおよび15単位のBamHI酵素〕中で37℃で1時間消化し、その反応液に水39μlを加え、70℃で5分間熱処理した後にバクテリアアルカリ性ホスファターゼ(BAP)1μl(250単位/μl)を加えて37℃で1時間保温した。
この反応液にフェノールを加えてフェノール抽出を行い、得られた水層をエタノール沈殿し、沈殿物を乾燥した。得られたEooRI−BamHI処理ベクターDNA0.5μgと前述のHBc−HBe融合抗原をコードするDNA600bp断片を10×リガーゼ用緩衝液〔660mM Tris−HCl(pH7.5),66mM MgCl2,100mMジチオスレトール、1mM ATP〕5μl,T4リガーゼ 1μl(350単位/μl)に水を加えて50μlとし、16℃で一晩保温し、連結反応を行なった。発現プラスミドpATtrpE−HBe−HBcを得るために、この連結反応液を用いて大腸菌HB101を形質転換した。
形質転換に用いる感受性大腸菌株は塩化カルシウム法〔Mandel,M.とHiga,A.,J.Mol.Biol.,53,159−162(1970)〕により作られる。形質転換大腸菌を25μg/mlのアンピシリンを含むLBプレート(1%トリプトン、0.5%NaCl,1.5%寒天)上に塗布し、37℃に一晩保温した。プレート上に生じた菌のコロニーを1白金耳取り、25μg/mlのアンピシリンを含むLB培地に移し、一晩37℃で培養した。
1.5mlの菌培養液を遠心して集菌し、プラスミドDNAのミニプレパレーションをアルカリ法〔Manniatisら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(1982)〕により行なった。得られたプラスミドDNA1μgを制限酵素反応液20μl〔50mM Tris−HCl(pH7.5),10mM MgCl2,1mMジチオスレイトール、100mM NaCl,15単位のEooRIおよび15単位のBamHI酵素〕中で37℃1時間消化し、アガロースゲル電気泳動を行なって、約600bpのEooRI−BamHI断片が生じるpATtrpE−HBe−HBc発現プラスミドを選別した。
(D)HBe−HBc融合抗原をコードするポリペプチドの発現および精製
発現プラスミドpATtrpE−HBe−HBcをもつ大腸菌HB101株を50μg/mlのアンピシリンを含む3mlの2YT培地(1.6%トリプトン、1%酵母エキス、0.5%NaCl)に接種し、37℃で9時間培養する。この培養液1mlを50μg/mlのアンピシリンを含む100mlのM9−CA培地(0.6%Na2HPO4,0.5%KH2PO4,0.5%NaCl,0.1%NH4Cl,0.1mM CaCl2,2mM MgSO4,0.5%カザミノ酸、0.2%グルコース)に植え継ぎ、37℃で培養した。OD600=0.3の時に終濃度40mg/lになるようにインドールアクリル酸を加え、さらに16時間培養した。この培養液を5Krpm、10分間遠心分離して菌体を集めた。
菌体に20mlの緩衝液A〔50mM Tris−HCl(pH8.0),1mM EDTA,30mM NaCl〕を加えて懸濁し、再び遠心分離を行なって発現菌体2.6gを得た。得られた菌体を緩衝液A10ml中に懸濁し、超音波破砕により大腸菌膜を破砕した後に遠心分離を行い、HBe−HBc融合抗原を含む不溶性画分を得た。
この不溶性画分を8M尿素,10mMジチオスレイトール,1mM EDTAを含むPBS3mlに溶解し、6M尿素存在下セファクリルS300HRカラムにてゲルろ過を行った。目的物はボイドに溶出した。ボイド画分6mlにSDSを60mg、ジチオスレイトールを9mg加え、0.1%SDS存在下下セファクリルS300HRカラムにてゲルろ過を行い、HBe−HBc融合抗原をほぼ単一に精製した。
このHBe−HBc融合抗原は、BCA法によりタンパク定量を行い、実施例5の患者検体からのHBV関連抗原の検出において、標準物質として用いた。
実施例2. ハイブリドーマの作製
前記方法により調製したポリペプチド(HBc)にSDSを終濃度が10%となるように加え100℃5分間変性処理した。この変性HBc抗原を、0.15M NaClを含む10mMリン酸緩衝液(pH7.3)(PBS)に終濃度が0.2〜1.0mg/mlとなるように希釈し、等量のフロイントアジュバントと混和し、4〜6週令のBALB/cマウスに10−20μg腹腔内投与した。2−4週間ごとに計5回同様の追加免疫を行い、さらにPBSに溶解したHBc 10μgを最終免疫として尾静脈内に投与した。
最終免疫後3日目にこのマウスより脾臓を無菌的に摘出し、ハサミおよび金属メッシュを用いて脾臓を個々の細胞にほぐし、RPMI−1640培地で3回洗浄した。対数増殖期のマウス骨髄腫細胞株Sp2/OAg14をRPMI−1640培地で3回洗浄後、該細胞と脾臓細胞を1:5の細胞数比で混合した。200×g、5分間遠心分離後、上清を除去し、細胞隗を緩やかに混合しながら50%ポリエチレングリコール(PEG)4000(メルク社)を含むRPMI−1640培地1mlをゆっくりと加え、さらにRPMI−1640培地10mlを加えて細胞融合させた。
融合細胞は、遠心分離(200×g、5分間)によってPEGを除いた後、10%ウシ胎児血清およびヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン(HAT)を含むRPMI−1640培地に懸濁し、96ウエル細胞培養プレートに播種した。約10日間培養してハイブリドーマのみを増殖させた後、培養上清の一部をとり、あらかじめSDSにより変性させたHBcを固相化抗原に用いたELISA法により抗HBc抗体を産生するウェルをスクリーニングし、変性HBcに対する反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得た。さらに、SDS存在下で同様のスクリーニングを行い、SDS存在下でも変性HBcに対する反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択した。
得られたハイブリドーマについて、限界希釈法により単一クローン化を行い、抗体産生ハイブリドーマを樹立した。得られたハイブリドーマをHB44、HB50、HB61,HB91、およびHB114と命名した。該5種類のハイブリドーマに関しては、生命工学工業技術研究所に平成12年7月19日付で、それぞれ、FERM BP−7232,FERM BP−7233,FERM BP−7234,FERM BP−7235及びFERM BP−7236として寄託された。
実施例3. モノクローナル抗体の作製および解析
実施例2に記載の方法により得られたハイブリドーマを、あらかじめプリスタンを腹腔投与しておいたBALB/cマウス腹腔に移植し、7〜14日後産生されたモノクローナル抗体を含む腹水を採取した。該モノクローナル抗体は、プロテインAセファロースカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによりIgGフラクションを分離精製した。
抗マウスIg各アイソタイプ抗体を用いたアイソタイプタイピングキット(Zymed社)により、それぞれのモノクローナル抗体の(サブ)クラスを同定した。その結果、HB44,HB50,HB61,HB91およびHB114共にIgG1、κであった。
実施例1(HBc(1−183))と同様にして、HBc欠失変異体であるTrx−HBc(1−47),Trx−HBc(1−81),TrpE−HBc(1−106),HBc(1−149)を作製した。また、HBVコア関連抗原のアミノ酸配列に相当する20アミノ酸前後の部分ペプチドPHB−1〜PHB−19をそれぞれ合成した。アミノ酸番号はHBc抗原のN末端を1とした。
各(ポリ)ペプチドをマイクロタイタープレートに固相化し、得られたモノクローナル抗体について、各(ポリ)ペプチドに対する反応性を調べ、エピトープ解析を行なった。
結果を表1に示す。この結果より、HB44モノクローナル抗体はPHB−5ペプチドに反応し、その他の部分ペプチドには反応しないことから、アミノ酸番号31−49の領域を認識するモノクローナル抗体であることがわかった。同様にHB91モノクローナル抗体はPHB−2ペプチドに反応し、その他の部分ペプチドには反応しないことから、アミノ酸番号1−19の領域を認識するモノクローナル抗体であることがわかった。HB61モノクローナル抗体はPHB−14およびPHB−15ペプチドに反応し、その他の部分ペプチドには反応しないことから、共通部分であるアミノ酸番号131−140の領域を認識するモノクローナル抗体であることがわかった。HB50モノクローナル抗体はPHB−16,17,18,19ペプチドに反応したが、この領域は類似した繰り返し配列となっていることから、より強い反応を示すアミノ酸番号168−176の領域を認識し、類似配列を含むPHB16,17にも交差反応すると推測された。HB114モノクローナル抗体はPHB−1〜19の全ての部分ペプチドおよびTrx−HBc(1−47)には反応せず、Trx−HBc(1−81)およびそれより広い領域を含むポリペプチドに反応したことから、アミノ酸番号1−81の領域に存在する構造エピトープを認識すると推測された。それぞれのモノクローナル抗体の認識部位を表2にまとめた。
本発明においてアミノ酸番号31−49の領域(配列番号1)および、アミノ酸番号1−81の領域(配列番号2)の領域に存在する構造エピトープを認識する抗体はこれまで報告がなく、HB44モノクローナル抗体およびHB114モノクローナル抗体はそれぞれ新規のエピトープを認識している。
実施例4. HBVコア抗原の検出および測定法
抗HBVコア抗原モノクローナル抗体HB44,HB61,HB114を終濃度がそれぞれ2,1,1μg/mlになるように0.5M NaCl,0.1M炭酸緩衝液(pH9.6)で希釈し、黒色96ウエルマイクロプレート(ヌンク社)につき100μl/ウェル分注し、4℃で一晩静置した。0.15M NaClを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)0.4mlで2回洗浄し、ブロッキング液(0.5%カゼインナトリウム,3%スクロース,150mM NaCl,10mMリン酸緩衝液(pH7.4))0.4mlを添加し、さらに室温で2時間静置した。ブロッキング液を除去後、真空乾燥した。
血清50μlに、処理液(15%SDS、3%CHAPS,1%セチルトリメチルアンモニウムブロマイド)を25μl添加し、56℃30分間処理をおこない、その50μlを測定試料とした。
上記ウェルに反応緩衝液100μlと測定試料50μlを加え、室温で一夜反応させた。
洗浄液(0.05%Tween20,0.15M NaCl,10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4))0.4mlで5回洗浄後、アルカリフォスファターゼ(AP)標識モノクローナル抗体HB50を0.5μg/mlに希釈し、100μl/ウェル添加し、室温2時間反応させた。洗浄液0.4mlで6回洗浄後、発光基質としてCDP−Star with Emerald II(TROPIX社)溶液100μlを加え室温20分間反応させた後、発光強度を測定した。
BBI社B型肝炎パネル血清25例の測定結果を表3に示す。同時に測定した健常人血清10例においては全て陰性であった。B型肝炎パネル血清25例中13例でHBVコア抗原が陽性であった。また、PHJ201−04,05,06,07,08,12,13,17,25の9例においてはHBc抗体が陽性であるにもかかわらず、HBVコア抗原を測定することができた。
本発明のモノクローナル抗体と検体処理法を組み合わせ、測定系を構築することにより、簡便にHBVコア抗原を検出、定量できることが明らかとなった。
実施例5. HBVコア関連抗原の検出および測定法
抗HBVコア抗原モノクローナル抗体HB44,HB61,HB114を終濃度がそれぞれ2,1,1μg/mlになるように0.5M NaCl,0.1M炭酸緩衝液(pH9.6)で希釈し、黒色96ウエルマイクロプレート(ヌンク社)につき100μl/ウェル分注し、4℃で一晩静置した。0.15M NaClを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)0.4mlで2回洗浄し、ブロッキング液(0.5%カゼインナトリウム,3%スクロース,150mM NaCl,10mMリン酸緩衝液(pH7.4))0.4mlを添加し、さらに室温で2時間静置した。ブロッキング液を除去後、真空乾燥した。
血清50μlに、処理液(15%SDS、2%Tween60)を25μl添加し、56℃30分間処理をおこない、その50μlを測定試料とした。
上記ウェルに反応緩衝液100μlと測定試料50μlを加え、室温で一夜反応させた。
洗浄液(0.05%Tween20,0.15M NaCl,10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4))0.4mlで5回洗浄後、アルカリフォスファターゼ(AP)標識モノクローナル抗体HB91を0.5μg/mlに希釈し、100μl/ウェル添加し、室温2時間反応させた。洗浄液0.4mlで6回洗浄後、発光基質としてCDP−Star with Emerald II(TROPIX社)溶液100μlを加え室温20分間反応させた後、発光を測定した。
一部の検体については102〜107倍に段階希釈を行い、同様に測定すると共にHBe抗原およびTMA法によるHBV−DNA量を測定した。
B型肝炎患者血清50例の測定結果を表3に示す。同時に測定した健常人27例においては全て陰性であった。HBV−DNA陽性の29例中28例でHBVコア関連抗原を検出でき、HBV−DNA陰性の21例中10例でHBVコア関連抗原を検出できた。すなわちTMA法より高感度にHBVを検出できることが示された。また、HBe抗体陽性の検体においてもHBVコア抗原を検出できた。
BBI社B型肝炎パネル血清25例の測定結果を表3に示す。同時に測定した健常人血清10例においては全て陰性であった。B型肝炎パネル血清25例中17例でHBVコア関連抗原が陽性であった。また、PHJ201−13,15,16,18,21,25の6例においては、HBe抗体陽性でHBe抗原陰性であるにもかかわらず、HBVコア関連抗原を測定することができた。
B型肝炎患者パネル血清4検体について102−107倍に段階希釈を行い、HBVコア関連抗原、HBV−DNAおよびHBe抗原をそれぞれ測定し、感度を比較した。結果を表4に示す。PHJ201−04,07,08,13の各検体において、TMA法によるHBV−DNAは105,104,103,104倍希釈まで、RIA法によるHBe抗原は104,104,104,103倍希釈までそれぞれ検出できた。これに対しHBVコア関連抗原は106,105,105,105倍まで希釈しても検出でき、4検体全てにおいてHBV−DNAおよびHBe抗原測定系より高感度であった。
本発明のモノクローナル抗体と検体処理法を組み合わせ、測定系を構築することにより、簡便かつ高感度にHBVコア抗原を検出、定量できることが明らかとなった。
実施例6.
実施例2と同様にして、HB110ハイブリドーマを樹立し、生命工学工業技術研究所に平成13年6月7日付で、FERM BP−7624として寄託された。
実施例3と同様にモノクローナル抗体HB110を作製し、(サブ)クラスを同定した結果、IgG1、κであった。
実施例3と同様にエピトープ解析を行なった結果を表5に示す。この結果より、HB110モノクローナル抗体はPHB−4ペプチドに反応し、その他の部分ペプチドには反応しないことから、アミノ酸番号21−40の領域を認識するモノクローナル抗体であることがわかった。認識部位を表6に示した。アミノ酸番号21−40の領域(配列番号9)を認識する抗体はこれまで報告がなく、本発明のHB110モノクローナル抗体は新規のエピトープを認識している。
実施例7. HBVコア関連抗原の検出および測定法
実施例5と同様にしてHBVコア関連抗原測定を行った。ただし、アルカリフォスファターゼ(AP)標識モノクローナル抗体としてHB91に加えHB110を用いた。BBI社B型肝炎患者パネル血清4検体について102−107倍に段階希釈を行い、HBVコア関連抗原、HBV−DNAおよびHBe抗原をそれぞれ測定し、感度を比較した。結果を表7に示す。PHJ201−04,07,08,13の各検体において、TMA法によるHBV−DNAは105,104,103及び104倍希釈まで、RIA法によるHBe抗原は104,104,104及び103倍希釈までそれぞれ検出できた。これに対しHBVコア関連抗原は105,105,104及び105倍まで希釈しても検出でき、HBV−DNAおよびHBe抗原測定系より高感度であった。
本発明のモノクローナル抗体と検体処理法を組み合わせ、測定系を構築することにより、簡便かつ高感度にHBVコア抗原を検出、定量できることが明らかとなった。
【配列表】
Claims (12)
- HBc 抗原及び HBe 抗原を同時に測定する方法であって、
(1) HBV 粒子、 HBc 抗原及び HB e抗原を変性し;
(2)上記(1)で変性した、 HBV を含む検体を SDS の存在下で結合する抗体と反応させ;そして
(3)前記抗体に捕捉された HBc 抗原及び HBe 抗原を検出する;
工程を含む方法。 - HBVコア関連蛋白質に結合特異性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞HB44(FERM BP-7232)、HB50(FERM BP-7233)、 HB61(FERM BP-7234)、HB91(FERM BP-7235)、HB114(FERM BP-7236)、HB110(FERM BP-7624)。
- HBVコア関連蛋白質に対する結合特異性を有する請求項2に記載のハイブリドーマ細胞によって生産されるモノクローナル抗体。
- HBVコアポリペプチドのアミノ酸番号31-49の配列に、SDSの存在下で結合する抗体。
- HBVコアポリペプチドのアミノ酸番号1-81の配列に、SDSの存在下で結合する抗体。
- HBVコアポリペプチドのアミノ酸番号21-40の配列に、SDSの存在下で結合する抗体。
- HBVコアポリペプチドのアミノ酸番号168-176の配列に、SDSの存在下で結合する抗体。
- HBVコアポリペプチドのアミノ酸番号131-140の配列に、SDSの存在下で結合する抗体。
- HBVコアポリペプチドのアミノ酸番号1-19の配列に、SDSの存在下で結合する抗体。
- SDS の存在下で結合する抗体が、請求項3から9いずれかに記載の抗体である請求項1に記載の測定方法。
- 請求項1又は請求項 10に記載の測定方法に用いるための、請求項3から9いずれかに記載の抗体を含んでなる検体中のHBc 抗原と HBe 抗原とを同時に測定する診断キット。
- 請求項1又は 10 に記載の測定方法において使用できる、SDSの存在下で抗原と結合する抗体を取得する方法であって、
(1)SDSにて変性処理を行ったHBc 抗原及び HBe 抗原で動物を免疫する段階、および
(2)SDSを含む溶液中でHBc 抗原及び HBe 抗原の両者と反応する抗体を選択する段階、
を含む方法。
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