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JP3768799B2 - 置換脂肪酸エステル化物を原料とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法 - Google Patents

置換脂肪酸エステル化物を原料とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法 Download PDF

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Description

【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート(以下、PHAと略す)を微生物によって極めて効率的に生産する方法に関する。より具体的には、置換脂肪酸エステル化物を原料として、当該原料に由来する置換基を側鎖に有するPHAを生産し、菌体内に蓄積する能力を有する微生物を用いて、所望の化学構造を呈するPHAを従来法より効率的に生産する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
これまで、多くの微生物がポリ-3-ヒドロキシ酪酸(以下、PHBと略す)あるいはその他のPHAを生産し、菌体内に蓄積することが報告されてきた(「生分解性プラスチックハンドブック」,生分解性プラスチック研究会編,(株)エヌ・ティー・エス,P178-197)。これらのポリマーは従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品の生産に利用することができる。さらに、生分解性であるがゆえに、自然界で微生物により完全分解されるという利点を有している。従って、従来用いられている多くの合成高分子化合物のように自然環境に残留して汚染を引き起こすことがなく、また、焼却処分を行う必要もないため、大気汚染や地球温暖化の防止の観点からも有用な材料となり得る。また、生体適合性にも優れており、医療用軟質部材等としての応用も期待されている。
【0003】
微生物産生PHAは、その生産に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等により、様々な組成や構造のものとなり得ることが知られており、これまで主に、PHAの物性の改良という観点から、このような組成や構造の制御に関する研究がなされてきた。
【0004】
例えば、アルカリゲネス・ユウトロファス H16株(Alcaligenes eutrophusH16、ATCC No.17699)並びにその変異株は、培養時の炭素源を変化させることによって、3-ヒドロキシ酪酸(以下、3HBと略す)と3-ヒドロキシ吉草酸(以下、3HVと略す)との共重合体を様々な組成比で生産することが報告されている(特表平6-15604号公報、特表平7-14352号公報、特表平8-19227号公報 等)。
【0005】
また、特開平9-191893号公報では、コマモナス・アシドボランス・IFO 13852株(Comamonas acidovorans IFO 13852)が、炭素源としてグルコン酸及び1,4-ブタンジオールを用いた培養により、3HBと4-ヒドロキシ酪酸とをモノマーユニットに持つポリエステルを生産することが開示されている。
【0006】
なお、これらの文献に記載されたPHAはメチレン側鎖、エチレン側鎖以外の側鎖を有しないもので、ここでは「usual PHA」とする。
【0007】
一方、特許公報第2642937号では、シュードモナス・オレオボランス・ATCC 29347株(Pseudomonas oleovorans ATCC 29347)に、炭素源として非環状脂肪族炭化水素を与えることにより、炭素数が6から12までの3-ヒドロキシアルカノエート(以下、3HAと略す)をモノマーユニットとするPHAを生産することが開示されている。
【0008】
特開平5-74492号公報では、メチロバクテリウム属(Methylobacterium sp.)、パラコッカス属(Paracoccus sp.)、アルカリゲネス属(Alcaligenes sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)の微生物を、炭素数3〜7の第一級アルコールに接触させることにより、3HBと3HVとの共重合体を生産させる方法が開示されている。
【0009】
特開平5-93049号公報、及び、特開平7-265065号公報では、アエロモナス・キャビエ(Aeromonas caviae)を、オレイン酸やオリーブ油を炭素源として培養することにより、3HBと3-ヒドロキシヘキサン酸(以下、3HHxと略す)の2成分共重合体を生産することが開示されている。
【0010】
さらに、ある種の微生物では、様々な置換基、例えば、不飽和炭化水素、エステル基、アリル基、シアノ基、ハロゲン化炭化水素、エポキシド等が導入されたPHAを生産することが報告されており、このような手法によって微生物産生PHAの物性改良を目指す試みもなされ始めている。
【0011】
例えば、Makromol.Chem.,191, 1957-1965, 1990、 Macromolecules,24, 5256-5260, 1991、 Chirality,3, 492-494, 1991 等では、シュードモナス・オレオボランスが3-ヒドロキシ-5-フェニル吉草酸(以下、3HPVと略す)をモノマーユニットとして含むPHAを生産することが報告されており、3HPVが含まれることに起因すると思われる、ポリマー物性の変化が認められている。
【0012】
なお、これらの文献に記載されたような、側鎖を有するPHAを、ここでは「unusual PHA」とする。
【0013】
従来、微生物産生PHAにおいては、その生産に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等を変えることにより、何通りかの組成・構造のものが得られているが、それらの試みの目的は、専らPHAに含まれる複数の3HAの比率を変え、プラスチックとしての物性の改良を図ることであった。
【0014】
一方、前記のような置換基を側鎖に導入した「unusual PHA」は、導入した置換基の特性等に起因する、極めて有用な機能・特性を具備した「機能性ポリマー」としての展開も期待できる。生分解性に加えて、そのような機能性をも兼ね備えた新たなポリマーと、そのようなポリマーを生産し菌体内に蓄積し得る微生物、並びに、そのような微生物を用いた当該ポリマーの効率的製造方法の開発は極めて有用かつ重要であると考えられる。
【0015】
ところで、様々な置換基を側鎖に導入した「unusual PHA」、即ち、下記化学式[2]で表されるモノマーユニットを含むPHAを微生物により生産する方法としては、先に挙げたシュードモナス・オレオボランスの報告例等に示される通り、導入しようとする置換基を有した下記化学式[6]で表される置換脂肪酸を化学合成したのち、これを微生物に与えて培養し、生産されたPHAを抽出する方法が一般的である。
【0016】
【化6】
Figure 0003768799
【0017】
【化7】
Figure 0003768799
【0018】
例えば、Polymer Prepr.,35, 627-628, 1994 や、Can.J.Microbiol.,41, 32-43, 1995 では、下記化学式[7]で表される方法でPHAを生産したと報告されている。
【0019】
【化8】
Figure 0003768799
【0020】
即ち、まず4-シアノフェノールと6-ブロモヘキサン酸エチルエステルとのWilliamson反応により、6-(4-シアノフェノキシ)ヘキサン酸エチルエステルを合成する。続いて、この6-(4-シアノフェノキシ)ヘキサン酸エチルエステルをアルカリ条件下で加水分解して、6-(4-シアノフェノキシ)ヘキサン酸を合成する。最後に、得られた6-(4-シアノフェノキシ)ヘキサン酸を、PHA生産菌の一つであるシュードモナス・オレオボランスに与えて培養し、PHAを抽出することにより、3-ヒドロキシ-6-(4-シアノフェノキシ)ヘキサン酸をモノマーユニットとして含むPHAを合成することができると報告されている。
【0021】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、前記のような、置換脂肪酸を化学合成して微生物に与えることからなる「unusual PHA」の一般的な製造方法においては、原料である置換脂肪酸の化学合成工程が数段階にも渡る化学反応を要するため、「unusual PHA」を製造するための工程が極めて煩雑となる上、その製造に多くの時間、手間及び費用が費やされることが多かった。さらに、導入しようとする置換基の種類や数、位置等によっては、原料である置換脂肪酸の合成工程における、エステル化物からの加水分解反応が容易に進行しないなどの障害がある可能性があり、これらが、工業レベルでの「unusual PHA」の製造やそのための装置開発の上での課題となっていた。
【0022】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者らは、置換脂肪酸と比較して合成、あるいは、入手の容易な原料を用いた、「unusual PHA」を微生物生産させることからなるPHA製造方法を開発すべく、鋭意研究を重ねてきた。その結果、従来の原料である置換脂肪酸の化学合成工程における中間体であり、また、置換脂肪酸と比較して化学合成が容易でかつその自由度も高い、下記化学式[ ]で表される置換脂肪酸エステル化物を含む培地を微生物の培養に用いることによって、所望の「unusual PHA」を効率的に取得できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0023】
【化9】
Figure 0003768799
【0024】
(ここで、xおよびyは0〜8から選ばれた任意の整数を示す。また、Rは、フェニル基、フェノキシ基、ベンゾイル基、シクロヘキシル基及びチエニル基からなる群から選択された少なくとも一つ、もしくは該選択された基の化学構造中の任意の部位が化学修飾されたものの少なくとも何れか一つを含む)
即ち、本発明は、 記化学式[ ]で表されるモノマーユニットを有するPHAのの製造方法であって、上記化学式[ ]で表される置換脂肪酸エステル化物を含む培地で、該置換脂肪酸エステル化物を取り込み、該ポリヒドロキシアルカノエートを合成しうる微生物である、シュードモナス・チコリアイ・YN2株 ( seudo onas cichorii YN2、FERM BP -7375) 、シュードモナス・チコリアイ・H 45 ( seudo onas cichorii 45 、FERMBP -7374) 、及びシュードモナス・ジェッセニイ・P 161 ( seudo onas jessenii 161 、FERMBP -7376) からなる群から選択された少なくとも1株を培養する工程と、前記微生物が産生した前記ポリヒドロキシアルカノエートを単離する工程とを有することを特徴とする、PHAの製造方法に関するものである。
【0025】
【化3】
Figure 0003768799
【0026】
( ここで、 x は0〜8から選ばれた任意の整数を示す。また、Rは、フェニル基、フェノキシ基、ベンゾイル基、シクロヘキシル基及びチエニル基からなる群から選択された少なくとも一つ、もしくは該選択された基の化学構造中の任意の部位が化学修飾されたものの少なくとも何れか一つを含む)
【0027】
【発明の実施の形態】
本発明の方法に用いる、化学式[1]で表される置換脂肪酸エステル化物としては、微生物による「unusual PHA」生産の原料として用いられ得るものであれば特に限定されないが、例えば、フェニル基、フェノキシ基、ベンゾイル基、シクロヘキシル基、チエニル基等の官能基や、これら官能基の任意の部位が各種の化学修飾を受けたものを含む脂肪酸を用いることができる。さらに具体的には、例えば、5-フェニル吉草酸メチルエステル、5-(4-フルオロフェニル)吉草酸メチルエステル、6-フェニルヘキサン酸メチルエステル、4-フェノキシ-n-酪酸メチルエステル、4-(3-フルオロフェノキシ)-n-酪酸メチルエステル、4-(4-フルオロフェノキシ)-n-酪酸メチルエステル、4-(4-シアノフェノキシ)-n-酪酸メチルエステル、4-(4-ニトロフェノキシ)-n-酪酸メチルエステル、5-フェノキシ吉草酸メチルエステル、5-(4-フルオロフェノキシ)吉草酸メチルエステル、5-ベンゾイル吉草酸メチルエステル、4-シクロヘキシル酪酸メチルエステル、5-(2-チエニル)吉草酸メチルエステル、5-フェニル吉草酸エチルエステル、5-(4-フルオロフェニル)吉草酸エチルエステル、6-フェニルヘキサン酸エチルエステル、4-フェノキシ-n-酪酸エチルエステル、4-(3-フルオロフェノキシ)-n-酪酸エチルエステル、4-(4-フルオロフェノキシ)-n-酪酸エチルエステル、4-(4-シアノフェノキシ)-n-酪酸エチルエステル、4-(4-ニトロフェノキシ)-n-酪酸エチルエステル、5-フェノキシ吉草酸エチルエステル、5-(4-フルオロフェノキシ)吉草酸エチルエステル、5-ベンゾイル吉草酸エチルエステル、4-シクロヘキシル酪酸エチルエステル、5-(2-チエニル)吉草酸エチルエステル等の置換脂肪酸エステル化物を用いることができる。
【0028】
以下に、本発明において利用される微生物、培養工程等について説明する。
【0029】
(微生物)
本発明の方法に用いる微生物としては、化学式[1]で表される置換脂肪酸エステル化物を原料(基質)にして、化学式[2]で表されるモノマーユニットを含むPHAを生産する能力を有する微生物を用いることができるが、例えば、特願平11-371863号記載のPHA生産微生物である、シュードモナス・チコリアイ・YN2株(Pseudomonas cichorii YN2)、シュードモナス・チコリアイ・H45株(Pseudomonas cichorii H45)、シュードモナス・ジェッセニイ・P161株(Pseudomonas jessenii P161)を用いることができる。なお、YN2株は寄託番号「FERM P-17411」として、H45株は寄託番号「FERM P-17410」として、P161株は寄託番号「FERM P-17445」として、通商産業省 工業技術院 生命工学工業技術研究所(特許微生物寄託センター)にそれぞれ寄託されている。
【0030】
前記のH45株、YN2株およびP161株の菌学的性質を列挙すれば以下の通りである。
【0031】
Figure 0003768799
Figure 0003768799
Figure 0003768799
Figure 0003768799
Figure 0003768799
また、シュードモナス属に属する微生物に加えて、アエロモナス属(Aeromonas sp.)、コマモナス属(Comamonas sp.)、バークホルデリア属(Burkholderia sp.)などに属し、化学式[1]で表される置換脂肪酸エステル化物を原料(基質)として用いて、化学式[2]で表されるモノマーユニットを含むPHAを生産する微生物を用いることも可能である。
【0032】
(培養工程)
本発明にかかるPHAの製造方法に用いる微生物の通常の培養、例えば、保存菌株の作成、PHAの生産に必要とされる菌数や活性状態を確保するための増殖などには、用いる微生物の増殖に必要な成分を含有する培地を適宜選択して用いる。例えば、微生物を通常増殖させる場合、微生物の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地(肉汁培地、L-培地 など)や、栄養源を添加した合成培地など、いかなる種類の培地をも用いることができる。温度、通気、攪拌などの培養条件は、用いる微生物に応じて適宜選択する。
【0033】
当該微生物を用いて、化学式[2]で表されるモノマーユニットを含むPHAを生産・蓄積させる場合は、化学式[1]で表される置換脂肪酸エステル化物と、グルコース、ポリペプトン、酵母エキス等の微生物の増殖基質とを含んだ無機培地等で対数増殖後期から定常期の時点まで培養し、菌体を遠心分離等で回収したのち、化学式[1]で表される置換脂肪酸エステル化物と上記増殖基質とを含んだ、無機窒素源を制限した無機培地で更に培養する2段階培養法を用いることができる。また、化学式[1]で表される置換脂肪酸エステル化物と上記増殖基質とを含んだ無機培地等で対数増殖後期から定常期の時点まで培養する1段階培養法を用いることもできる。
【0034】
前記の培養方法に用いる無機培地としては、リン源(例えば、リン酸塩など)、無機窒素源(例えば、アンモニウム塩、硝酸塩など)など、当該微生物が増殖し得る成分を含んでいるものであればいかなるものでも良く、例えば、MSB培地、M9培地などを挙げることができる。なお、本発明における実施例で用いるM9培地の組成は以下の通りである。
Na2HPO4 :6.2 g
KH2PO4 :3.0 g
NaCl :0.5 g
NH4Cl :1.0 g
(培地1リットル中、pH7.0)
また、培地に添加する原料の置換脂肪酸エステル化物の濃度は、微生物の属種、菌体密度、あるいは培養方法に応じて適宜選択するものであるが、通常、培地中の含有率を 0.01%から 0.5%程度に選択して添加するとよい。ただし、前記の2段階培養法においては、1段階目の培養時に置換脂肪酸エステル化物を添加せずに培養することも可能である。
【0035】
加えて、グルコース、フルクトース、マンノース、ポリペプトン、酵母エキス等の微生物の増殖基質を添加する際は、その濃度は、微生物の属種、菌体密度、あるいは培養方法に応じて適宜選択するものであるが、通常、培地中の含有率を 0.1%から 1.0%程度に選択して添加するとよい。ただし、前記の2段階培養法においては、2段階目の培養時に増殖基質を添加せずに培養することも可能である。
【0036】
前記の培養方法は、バッチ式培養、流動バッチ式培養、連続培養、リアクター形式培養、固体培養など、通常の微生物の培養に用いるいかなる方法をも用いることができる。その際の培養温度は、微生物の属種、菌体密度、あるいは培養方法に応じて適宜選択するものではあるが、通常、使用する微生物が生育・増殖可能な範囲、例えば14〜40℃、好ましくは20〜35℃程度に維持することが好ましい。
【0037】
本発明における、微生物の菌体からのPHAの回収は、通常行われているクロロホルムなどの有機溶媒による抽出が最も簡便ではあるが、有機溶媒が使用しにくい環境中においては、SDS等の界面活性剤による処理、リゾチーム等の酵素による処理、EDTA、次亜塩素酸ナトリウム、アンモニア等の薬剤による処理によって菌体成分を除去して、PHAを回収する方法を用いることもできる。
【0038】
なお、本発明の微生物の培養、本発明の微生物によるPHAの生産と菌体内への蓄積、並びに、本発明における菌体からのPHAの回収は、上に例示した具体的な方法に限定されるものではない。
【0039】
【実施例】
以下に具体例を示し、本発明のPHA製造方法をより詳しく説明する。これらの具体例は、本発明における最良の態様の一例ではあるが、本発明は以下の具体例によって何ら限定されるものではない。
【0040】
[実施例1]
D-グルコース 0.5%と、5-フェニル吉草酸メチルエステル 0.1%とを含むM9培地 200mLに、シュードモナス・チコリアイ・YN2株、シュードモナス・チコリアイ・H45株、シュードモナス・ジェッセニイ・P161株のうち何れか1株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。66時間後、菌体を遠心分離によって回収し、 D-グルコース 0.5%と、5-フェニル吉草酸メチルエステル 0.1%とを含む、無機窒素源(NH4Cl)を含まないM9培地 200mLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。44時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【0041】
この凍結乾燥ペレットを 20mLのクロロホルムに懸濁し、60℃で24時間攪拌してPHAを抽出した。抽出液を孔径 0.45μmのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してPHAを得た。得られたPHAは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(GC-MS,島津QP-5050、EI法)で分析し、PHAモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表1に示す通り、3-ヒドロキシ-5-フェニル吉草酸をモノマーユニットとして含むPHAの生産が確認された。
【0042】
【表1】
Figure 0003768799
【0043】
[実施例2]
D-グルコース 0.5%と、5-フェニル吉草酸メチルエステル 0.01%とを含むM9培地 200mLに、シュードモナス・チコリアイ・YN2株、シュードモナス・チコリアイ・H45株、シュードモナス・ジェッセニイ・P161株のうち何れか1株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。46時間後、菌体を遠心分離によって回収し、 D-グルコース 0.5%と、5-フェニル吉草酸メチルエステル 0.1%とを含む、無機窒素源(NH4Cl)を含まないM9培地 200mLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。41時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【0044】
この凍結乾燥ペレットを 20mLのクロロホルムに懸濁し、60℃で24時間攪拌してPHAを抽出した。抽出液を孔径 0.45μmのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してPHAを得た。得られたPHAは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(GC-MS,島津QP-5050、EI法)で分析し、PHAモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表2に示す通り、3-ヒドロキシ-5-フェニル吉草酸をモノマーユニットとして含むPHAの生産が確認された。
【0045】
【表2】
Figure 0003768799
【0046】
[実施例3]
D-グルコース 0.5%と、4-フェノキシ-n-酪酸エチルエステル 0.1%とを含むM9培地 200mLに、シュードモナス・チコリアイ・YN2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。67時間後、菌体を遠心分離によって回収し、 D-グルコース 0.5%と、4-フェノキシ-n-酪酸エチルエステル 0.1%とを含む、無機窒素源(NH4Cl)を含まないM9培地 200mLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。21時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【0047】
この凍結乾燥ペレットを 20mLのクロロホルムに懸濁し、60℃で24時間攪拌してPHAを抽出した。抽出液を孔径 0.45μmのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してPHAを得た。得られたPHAは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(GC-MS,島津QP-5050、EI法)で分析し、PHAモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表3に示す通り、3-ヒドロキシ-4-フェノキシ-n-酪酸をモノマーユニットとして含むPHAの生産が確認された。
【0048】
【表3】
Figure 0003768799
【0049】
[実施例4]
D-グルコース 0.5%と、4-フェノキシ-n-酪酸エチルエステル 0.1%とを含むM9培地 200mLに、シュードモナス・チコリアイ・H45株、シュードモナス・ジェッセニイ・P161株のうち何れか1株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。45時間後、菌体を遠心分離によって回収し、D-グルコース 0.5%と、4-フェノキシ-n-酪酸エチルエステル 0.1%とを含む、無機窒素源(NH4Cl)を含まないM9培地 200mLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。40時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【0050】
この凍結乾燥ペレットを 20mLのクロロホルムに懸濁し、60℃で24時間攪拌してPHAを抽出した。抽出液を孔径 0.45μmのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してPHAを得た。得られたPHAは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(GC-MS,島津QP-5050、EI法)で分析し、PHAモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表4に示す通り、3-ヒドロキシ-4-フェノキシ-n-酪酸をモノマーユニットとして含むPHAの生産が確認された。
【0051】
【表4】
Figure 0003768799
【0052】
[実施例5]
D-グルコース 0.5%と、4-フェノキシ-n-酪酸エチルエステル 0.01%とを含むM9培地 200mLに、シュードモナス・チコリアイ・YN2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、 D-グルコース 0.5%と、4-フェノキシ-n-酪酸エチルエステル 0.1%とを含む、無機窒素源(NH4Cl)を含まないM9培地 200mLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。42時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【0053】
この凍結乾燥ペレットを 20mLのクロロホルムに懸濁し、60℃で28時間攪拌してPHAを抽出した。抽出液を孔径 0.45μmのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してPHAを得た。得られたPHAは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(GC-MS,島津QP-5050、EI法)で分析し、PHAモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表5に示す通り、3-ヒドロキシ-4-フェノキシ-n-酪酸をモノマーユニットとして含むPHAの生産が確認された。
【0054】
【表5】
Figure 0003768799
【0055】
[実施例6]
D-グルコース 0.5%を含むM9培地 200mLに、シュードモナス・チコリアイ・YN2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、D-グルコース 0.5%と、4-フェノキシ-n-酪酸エチルエステル 0.1%とを含む、無機窒素源(NH4Cl)を含まないM9培地 200mLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。42時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【0056】
この凍結乾燥ペレットを 20mLのクロロホルムに懸濁し、60℃で28時間攪拌してPHAを抽出した。抽出液を孔径 0.45μmのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してPHAを得た。得られたPHAは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(GC-MS,島津QP-5050、EI法)で分析し、PHAモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表6に示す通り、3-ヒドロキシ-4-フェノキシ-n-酪酸をモノマーユニットとして含むPHAの生産が確認された。
【0057】
【表6】
Figure 0003768799
【0058】
【発明の効果】
本発明により、微生物産生ポリヒドロキシアルカノエートの効率的な製造方法が提供される。これにより、機能性ポリマーとしても有用な、各種官能基を導入したポリヒドロキシアルカノエートが極めて効率的に生産でき、デバイス材料や医用材料等の各分野への応用が期待できる。

Claims (4)

  1. 下記化学式[ ]で表されるモノマーユニットを有するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法であって、
    下記化学式[ ]で表される置換脂肪酸エステル化物を含む培地で、該置換脂肪酸エステル化物を取り込み、該ポリヒドロキシアルカノエートを合成しうる微生物である、シュードモナス・チコリアイ・YN2株 ( seudo onas cichorii YN2、FERM BP -7375) 、シュードモナス・チコリアイ・H 45 ( seudo onas cichorii 45 、FERM BP -7374) 、及びシュードモナス・ジェッセニイ・P 161 ( seudo onas jessenii 161 、FERMBP -7376) からなる群から選択された少なくとも1株を培養する工程と、
    前記微生物が産生した前記ポリヒドロキシアルカノエートを単離する工程とを有することを特徴とする、ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
    Figure 0003768799
    (ここで、xおよびyは0〜8から選ばれた任意の整数を示す。また、Rは、フェニル基、フェノキシ基、ベンゾイル基、シクロヘキシル基及びチエニル基からなる群から選択された少なくとも一つ、もしくは該選択された基の化学構造中の任意の部位が化学修飾されたものの少なくとも何れか一つを含む)
    Figure 0003768799
    (ここで、xは0〜8から選ばれた任意の整数を示す。また、Rは、フェニル基、フェノキシ基、ベンゾイル基、シクロヘキシル基及びチエニル基からなる群から選択された少なくとも一つ、もしくは該選択された基の化学構造中の任意の部位が化学修飾されたものの少なくとも何れか一つを含む)
  2. 微生物の培養が、前記化学式[ ]で表される置換脂肪酸エステル化物と増殖基質とを含む培地による培養と、これに続く、前記化学式[ ]で表される置換脂肪酸エステル化物と増殖基質とを含む窒素源を制限した培地による培養の2段階で行われる請求項1に記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
  3. 微生物の培養が、前記化学式[ ]で表される置換脂肪酸エステル化物と増殖基質とを含む培地による培養のみの1段階で行われる請求項1に記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
  4. 増殖基質がグルコースである請求項またはに記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
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