JP3768835B2 - ３−ヒドロキシ置換ベンゾイルアルカン酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエート及びその製造方法 - Google Patents
３−ヒドロキシ置換ベンゾイルアルカン酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエート及びその製造方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規なポリヒドロキシアルカノエート(以下、ＰＨＡと略す場合もある)に関する。また、ＰＨＡを生産し菌体内に蓄積する能力を有する微生物を用いた当該ＰＨＡの極めて効率的な製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、多くの微生物がポリ-３-ヒドロキシ酪酸(以下、ＰＨＢと略す場合もある)あるいはその他のＰＨＡを生産し、菌体内に蓄積することが報告されてきた(「生分解性プラスチックハンドブック」、生分解性プラスチック研究会編、(株)エヌ・ティー・エス、Ｐ178-197)。これらのポリマーは従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品の生産に利用することができる。さらに、生分解性であるがゆえに、自然界で微生物により完全分解されるという利点を有しており、従来の多くの合成高分子化合物のように自然環境に残留して汚染を引き起こすことがない。また、生体適合性にも優れており、医療用軟質部材等としての応用も期待されている。
【０００３】
このような微生物産生ＰＨＡは、その生産に用いる微生物の種類や培地組成,培養条件等により、様々な組成や構造のものとなり得ることが知られており、これまで主に、ＰＨＡの物性の改良という観点から、このような組成や構造の制御に関する研究がなされてきた。
【０００４】
《１》まず、３-ヒドロキシ酪酸(以下、３ＨＢと略す)をはじめとする比較的簡単な構造のモノマーユニットを重合させたＰＨＡの生合成としては、次のものが挙げられる。
【０００５】
例えば、アルカリゲネス・ユウトロファス Ｈ16株(Ａlcaligenes eutropus Ｈ16、ＡＴＣＣ Ｎo.17699)及びその変異株は、その培養時の炭素源を変化させることによって、３-ヒドロキシ酪酸と３-ヒドロキシ吉草酸との共重合体を様々な組成比で生産することが報告されている(特公平６-15604 号公報、特公平７-14352 号公報、特公平８-19227 号公報など)。
【０００６】
特開平５-74492 号公報では、メチロバクテリウム属(Ｍethylobacteriuｍ sp.)、パラコッカス属(Paracoccus sp.)、アルカリゲネス属(Ａlcaligenes sp.)、シュードモナス属(Pseudoｍonas sp.)の微生物を、炭素数３から７の第一アルコールに接触させることにより、３-ヒドロキシ酪酸と３-ヒドロキシ吉草酸との共重合体を生産させる方法が開示されている。
【０００７】
特開平５-93049号公報及び特開平７-265065号公報では、アエロモナス・キャビエ(Ａeroｍonas caviae)を、オレイン酸やオリーブ油を炭素源として培養することにより、３-ヒドロキシ酪酸と３-ヒドロキシヘキサン酸との２成分共重合体を生産することが開示されている。
【０００８】
特開平９-191893 号公報では、コマモナス・アシドボランス・IＦＯ 13852 株(Ｃoｍaｍonas acidovorans IＦＯ 13852)が、炭素源としてグルコン酸及び１,４-ブタンジオールを用いた培養により、３-ヒドロキシ酪酸と４-ヒドロキシ酪酸とをモノマーユニットに持つポリエステルを生産することが開示されている。
【０００９】
また、近年、炭素数が 12 程度までの中鎖長(ｍediuｍ-chain-length:ｍclと略記)の３-ヒドロキシアルカン酸からなるＰＨＡについての研究が精力的に行なわれている。このようなＰＨＡの合成経路は大きく２つに分類することが可能であり、その具体例を下記(１)および(２)に示す。
(１)β酸化を利用した合成:
特許公報第 2642937 号では、シュードモナス・オレオボランス・ＡＴＣＣ 29347 株(Pseudoｍonas oleovorans ＡＴＣＣ 29347)に、炭素源として非環状脂肪族炭化水素を与えることにより、炭素数が６から 12 までの３-ヒドロキシアルカン酸のモノマーユニットを有するＰＨＡが生産されることが開示されている。また、Ａppl.Ｅnviron.Ｍicrobiol,58(２),746(1992)には、シュードモナス・レジノボランス(Pseudoｍonas resinovorans)が、オクタン酸を単一炭素源として、３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸(量比 1：15：75：9)をモノマーユニットとするポリエステルを生産し、また、ヘキサン酸を単一炭素源として、３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸(量比 8：62：23：7)をユニットとするポリエステルを生産することが報告されている。ここで、原料の脂肪酸よりも鎖長の長い３-ヒドロキシアルカン酸モノマーユニットは(２)で説明する脂肪酸合成経路を経由していると考えられる。
(２)脂肪酸合成経路を利用した合成
Int.J.Ｂiol.Ｍacroｍol.,16(３),119(1994)には、シュードモナスsp.61-３株(Pseudoｍonas sp.61-３ strain)が、グルコン酸ナトリウムを単一炭素源として、３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸、３-ヒドロキシドデカン酸といった３-ヒドロキシアルカン酸および、３-ヒドロキシ-５-cis-デセン酸、３-ヒドロキシ-５-cis-ドデセン酸といった３-ヒドロキシアルケン酸をユニットとするポリエステルを生産することが報告されている。
【００１０】
ところで、通常、ＰＨＡの生合成は、細胞内の様々な代謝経路の中間体として生じる「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＣoＡ」を基質とし、ＰＨＡシンターゼ(ＰＨＡ synthase)により行なわれる。
【００１１】
ここで、「ＣoＡ」とは「補酵素Ａ(coenzyｍe Ａ)」のことである。そして上記(１)の先行技術に記載されている様に、オクタン酸やノナン酸等の脂肪酸を炭素源とした場合、ＰＨＡの生合成は、「β酸化サイクル」中に生じた「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＣoＡ」が出発物質として行なわれるとされている。
【００１２】
以下に、「β酸化サイクル」を経由してＰＨＡが生合成されるまでの反応を示す。
【００１３】
【化 １５】
【００１４】
一方、上記(２)の先行技術に記載されている様に、グルコース等の糖類を基質とし、ＰＨＡを生合成する場合は、「脂肪酸合成経路」中に生じた「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＡＣＰ」から変換された「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＣoＡ」が出発物質として行なわれるとされている。
ここで、「ＡＣＰ」とは「アシルキャリアプロテイン(acyl carrier protein)」のことである。
【００１５】
ところで、先に述べたとおり、上記(１)および(２)で合成されているＰＨＡは、いずれも側鎖にアルキル基を有するモノマーユニットからなるＰＨＡ、即ち、「usual ＰＨＡ」である。
【００１６】
《２》しかし、このような微生物産生ＰＨＡのより広範囲な応用、例えば機能性ポリマーとしての応用を考慮した場合、アルキル基以外の置換基を側鎖に導入したＰＨＡ(「unusual ＰＨＡ」)が極めて有用であることが期待される。置換基の例としては、芳香環を含むもの(フェニル基、フェノキシ基、ベンゾイル基など)や、不飽和炭化水素、エステル基、アリル基、シアノ基、ハロゲン化炭化水素、エポキシドなどが挙げられる。これらの中でも、特に、芳香環を有するＰＨＡの研究が盛んになされている。
【００１７】
(a)フェニル基もしくはその部分置換体を含むもの
Ｍakroｍol.Ｃheｍ.,１９１，1957-1965(1990)及びＭacroｍolecules,２４，5256-5260(1991)には、５-フェニル吉草酸を基質として、シュードモナス オレオボランス(Pseudoｍonas oleovorans)が３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００１８】
具体的には、シュードモナス・オレオボランスが５-フェニル吉草酸とノナン酸とを基質として(モル比２:１、総濃度 10ｍｍol/L)、３-ヒドロキシ吉草酸、３-ヒドロキシヘプタン酸、３-ヒドロキシノナン酸、３-ヒドロキシウンデカン酸、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸をモノマーユニットとして、0.6：16.0：41.1：1.7：40.6 の量比で含むＰＨＡを、培養液１Lあたり 160ｍg(菌体に対する乾燥重量比 31.6％)生産し、また、５-フェニル吉草酸とオクタン酸とを基質として(モル比１:１、総濃度 10ｍｍol/L)、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸をモノマーユニットとして、7.3：64.5：3.9：24.3 の量比で含むＰＨＡを、培養液１Lあたり 200ｍg(菌体に対する乾燥重量比 39.2％)生産することが報告されている。この報告におけるＰＨＡは、ノナン酸やオクタン酸が用いられていることからも主にβ酸化経路を経て合成されているものと考えられる。
【００１９】
関連する記述は、上記の他Ｃhirality,３,492-494(1991)にもあり、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸ユニットが含まれていることに起因すると思われる、ポリマー物性の変化が認められている。
【００２０】
Ｍacroｍolecules,２９，1762-1766(1996)には、５-(４'-トリル)吉草酸を基質として、シュードモナス オレオボランス(Pseudoｍonas oleovorans)が３-ヒドロキシ-５-(４'-トリル)吉草酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００２１】
Ｍacroｍolecules,３２，2889-2895(1999)には、５-(２',４'-ジニトロフェニル)吉草酸を基質として、シュードモナス オレオボランス(Pseudoｍonas oleovorans)が３-ヒドロキシ-５-(２',４'-ジニトロフェニル)吉草酸及び３-ヒドロキシ-５-(４'-ニトロフェニル)吉草酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００２２】
(b)フェノキシ基もしくはその部分置換体を含むもの
Ｍacroｍol.Ｃheｍ.Ｐhys.,１９５，1665-1672(1994)には、11-フェノキシウンデカン酸を基質として、シュードモナス オレオボランス(Pseudoｍonas oleovorans)が３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸と３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸のＰＨＡコポリマーを生産することが報告されている。
【００２３】
また、Ｍacroｍolecules,２９，3432-3435(1996)には、シュードモナス・オレオボランスを用いて、６-フェノキシヘキサン酸から３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸および３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸をユニットとして含むＰＨＡを、８-フェノキシオクタン酸から３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸および３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸をユニットとして含むＰＨＡを、11-フェノキシウンデカン酸から３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸および３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。この報告におけるポリマーの収率を抜粋すると以下のとおりである。
【００２４】
【表１】
【００２５】
特許公報第 2989175号には、３-ヒドロキシ-５-(モノフルオロフェノキシ)ペンタノエート(３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐ)ユニットあるいは３-ヒドロキシ-５-(ジフルオロフェノキシ)ペンタノエート(３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐ)ユニットからなるホモポリマー、少なくとも３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐユニットあるいは３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐユニットを含有するコポリマー；これらのポリマーを合成するシュードモナス・プチダ；シュードモナス属を用いた前記のポリマーの製造法に関する発明が開示されており、 特許第 2989175号公報には、３-ヒドロキシ-５-(モノフルオロフェノキシ)ペンタノエート(３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐ)ユニットあるいは３-ヒドロキシ-５-(ジフルオロフェノキシ)ペンタノエート(３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐ)ユニットからなるホモポリマー、少なくとも３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐユニットあるいは３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐユニットを含有するコポリマー；これらのポリマーを合成するシュードモナス・プチダ；シュードモナス属を用いた前記のポリマーの製造法に関する発明が開示されている。
【００２６】
これらの生産は以下の様な「二段階培養」で行なわれている。
培養時間: 一段目、24時間 ； 二段目、96時間
各段における基質と得られるポリマーを以下に示す。
(１)得られるポリマー:３-ヒドロキシ-５-(モノフルオロフェノキシ)ペンタノエートホモポリマー
一段目の基質:クエン酸、イーストエキス
二段目の基質:モノフルオロフェノキシウンデカン酸
(２)得られるポリマー:３-ヒドロキシ-５-(ジフルオロフェノキシ)ペンタノエートホモポリマー
一段目の基質:クエン酸、イーストエキス
二段目の基質:ジフルオロフェノキシウンデカン酸
(３)得られるポリマー: ３-ヒドロキシ-５-(モノフルオロフェノキシ)ペンタノエートコポリマー
一段目の基質:オクタン酸あるいはノナン酸、イーストエキス
二段目の基質:モノフルオロフェノキシウンデカン酸
(４)得られるポリマー: ３-ヒドロキシ-５-(ジフルオロフェノキシ)ペンタノエートコポリマー
一段目の基質:オクタン酸あるいはノナン酸、イーストエキス
二段目の基質:ジフルオロフェノキシウンデカン酸
その効果としては、置換基をもつ中鎖脂肪酸を資化して、側鎖末端が１から２個のフッ素原子で置換されたフェノキシ基を有するポリマーを合成することができ、融点が高く良い加工性を保ちながら、立体規則性、撥水性を与えることができるとしている。
【００２７】
この様なフッ素基置換体以外に、シアノ基やニトロ基の置換体の研究もなされている。
【００２８】
Ｃan.J.Ｍicrobiol.,４１，32-43(1995)及び Ｐolyｍer International,３９，205-213(1996)には、シュードモナス オレオボランス(Pseudoｍonas oleovorans)ＡＴＣＣ 29347株及びシュードモナス プチダ(Pseudoｍonas putida)ＫＴ 2442株を用いて、オクタン酸とp-シアノフェノキシヘキサン酸或いはp-ニトロフェノキシヘキサン酸を基質として、３-ヒドロキシ-p-シアノフェノキシヘキサン酸或いは３-ヒドロキシ-p-ニトロフェノキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡの生産が報告されている。
【００２９】
これらの報告は側鎖がアルキル基である一般的なＰＨＡとは異なり、いずれもＰＨＡの側鎖に芳香環を有しており、それに由来する物性を有するポリマーを得る上で有益である。
【００３０】
(c)シクロヘキシル基をモノマーユニット中に含むＰＨＡは、通常の脂肪族ヒドロキシアルカン酸をユニットとして含むＰＨＡとは異なる高分子物性を示すことが期待されており、シュードモナス・オレオボランスによる生産の例が報告されている(Ｍacroｍolecules,30,1611-1615(1997))。
【００３１】
この報告によれば、シュードモナス・オレオボランスを、ノナン酸とシクロヘキシル酪酸あるいはシクロヘキシル吉草酸の共存する培地中で培養すると、シクロヘキシル基を含むユニットと、ノナン酸由来のユニットを含むＰＨＡが得られている(各割合は不明)。
【００３２】
その収率等に関しては、シクロヘキシル酪酸に対して、基質濃度トータル 20 ｍｍol/Lの条件で、シクロヘキシル酪酸とノナン酸の量比を変化させ、表２に示すような結果を得たと報告されている。
【００３３】
【表２】
【００３４】
ＣＤＷ:乾燥菌体重量(ｍg/L)、ＰＤＷ:乾燥ポリマー重量(ｍg/L)、収率:ＰＤＷ/ＣＤＷ(％)
しかしながら、この例では、培養液当たりのポリマー収率は十分なものではなく、また、得られたＰＨＡ自体も、そのモノマーユニット中にはノナン酸由来の脂肪族ヒドロキシアルカン酸が混在しているものである。
【００３５】
《３》また新たなカテゴリーとして、単に物性の変化に留まらず、側鎖に適当な官能基を有するＰＨＡを生産し、その官能基を利用して新たな機能を生み出そうとする研究も行なわれている。
【００３６】
例えばＭacroｍolecules,３１，1480-1486(1996)及び、Journal of ＰolyｍerＳcience:Part Ａ:Ｐolyｍer Ｃheｍistry,３６，2381-2387(1998)などでは、側鎖の末端にビニル基を持つユニットを含むＰＨＡを合成した後、酸化剤によりエポキシ化し、側鎖末端に反応性の高いエポキシ基を含むＰＨＡを合成出来たと報告されている。
【００３７】
またビニル基以外にも、高い反応性が期待されるスルフィドを持つユニットを含むＰＨＡの合成例として、Ｍacroｍolecules,３２，8315-8318(1999)においては、シュードモナス プチダ(Pseudoｍonas putida)27Ｎ01株が 11-フェニルスルファニル吉草酸を基質とし、３-ヒドロキシ-５-(フェニルスルファニル)吉草酸及び３-ヒドロキシ-７-(フェニルスルファニル)ヘプタン酸のＰＨＡコポリマーを生産することが報告されている。
【００３８】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、微生物産生ＰＨＡにおいては、その製造に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等を変えることにより、各種の組成・構造のものが得られているが、プラスチックとしての応用を考えた場合、物性的に未だ十分であるとは言えない。微生物産生ＰＨＡの利用範囲をさらに拡大していくためには、物性の改良をより幅広く検討していくことが重要であり、そのためにはさらに多様な構造のモノマーユニットを含むＰＨＡと、その製造方法、ならびに所望のＰＨＡを効率的に生産しうる微生物の開発、探索が必須である。
【００３９】
一方、前述のような、置換基を側鎖に導入したタイプのＰＨＡ(unusual ＰＨＡ)は、導入した置換基を所望とする特性等に応じて選択することで、導入した置換基の特性等に起因する、極めて有用な機能や特性を具備した「機能性ポリマー」としての展開も期待でき、そのような機能性と生分解性とを両立可能であるような優れたＰＨＡと、その製造方法、ならびに、所望のＰＨＡを効率的に生産しうる微生物の開発、探索もまた重要な課題である。
【００４０】
すなわち、様々な置換基を側鎖に導入したＰＨＡを微生物により生産しようとする場合、先に挙げたシュードモナス・オレオボランスの報告例等に見られるように、導入しようとする置換基を有するアルカノエートを、ポリマー原料としての利用に加えて増殖用炭素源としても利用する方法が用いられている。
【００４１】
しかしながら、導入しようとする置換基を有するアルカノエートを、ポリマー原料としての利用に加えて増殖用炭素源としても利用する方法は、当該アルカノエートからのβ酸化によるアセチルＣoＡの生成に基づくエネルギー源の供給が期待されており、このような方法においては、ある程度の鎖長を有する基質でないとβ酸化によりアセチルＣoＡを生成することができず、このためＰＨＡの基質として用いうるアルカノエートが限定されてしまう点が大きな課題である。また、一般的に、β酸化により鎖長がメチレン鎖２つ分ずつ短くなった基質が新たに生成し、これらがＰＨＡのモノマーユニットとして取り込まれるため、合成されるＰＨＡは鎖長がメチレン鎖２つ分ずつ異なるモノマーユニットからなる共重合体となることが多い。前述の報告例では、基質である８-フェノキシオクタン酸由来の３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸と、代謝産物由来の副生物である３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸及び３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸の３種類のモノマーユニットからなる共重合体が生産される。この点で、単一のモノマーユニットからなるＰＨＡを得ようとする場合、この方法を用いることは極めて難しい。さらに、β酸化によるアセチルＣoＡの生成に基づいたエネルギー源の供給を前提とした方法では、微生物の増殖が遅く、ＰＨＡの合成に時間がかかる点、合成されたＰＨＡの収率が低くなりがちな点も大きな課題である。
【００４２】
このため、導入しようとする置換基を有するアルカノエートに加えて、増殖用炭素源として、オクタン酸やノナン酸といった中鎖の脂肪酸等を共存させた培地で微生物を培養したのち、ＰＨＡを抽出する方法が有効と考えられ、一般的に用いられている。
【００４３】
しかしながら、本発明者らの検討によれば、上記のようにオクタン酸やノナン酸といった中鎖の脂肪酸等を増殖用炭素源とし、β酸化経路を経て合成されたＰＨＡは、その純度が低く、得られるポリマーの 50％以上が、増殖用炭素源に由来するモノマーユニット(例えば、３-ヒドロキシオクタン酸や３-ヒドロキシノナン酸等)である、ｍclの３-ヒドロキシアルカン酸モノマーユニット(以下、ｍcl-３ＨＡと略す場合がある)、すなわち「usual ＰＨＡ」のユニットである。これらのｍcl-３ＨＡユニットは、単独の組成においては常温で粘着性のポリマーであり、本発明の目的とするＰＨＡに多量に混在した場合、ポリマーのガラス転移温度(Ｔg)を著しく降下させる。このため、常温で硬いポリマー物性を得ようとする場合、ｍcl-３ＨＡモノマーユニットの混在は望ましくない。また、このようなヘテロな側鎖構造は分子内あるいは分子間での側鎖構造に由来する相互作用を妨害し、結晶性あるいは配向性に大きな影響を与えることが知られている。
【００４４】
ポリマー物性の向上、機能性の付与を達成するにあたり、これらのｍcl-３ＨＡモノマーユニットの混在は大きな課題である。この課題の解決手段としては、特定の置換基を有するモノマーユニットのみで構成されたＰＨＡを取得するために、増殖用炭素源由来のｍcl-３ＨＡモノマーユニット等の「目的外」のモノマーユニットを分離/除去するための精製工程を設けることが挙げられる。しかしながら、操作が煩雑となる上、収率の大幅な低下も避けられない点が課題となる。
【００４５】
さらに大きな問題点は、目的のモノマーユニットと目的外のモノマーユニットとが共重合体を形成している場合、目的外のモノマーユニットのみを除去するのは極めて困難な点である。特に、不飽和炭化水素から得られる基、エステル基、アリル基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン化炭化水素から得られる基、エポキシド等が導入された基を側鎖構造として有するようなモノマーユニットを含むＰＨＡの合成を目的とする場合、ｍcl-３ＨＡモノマーユニットは目的のモノマーユニットと共重合体を形成する場合が多く、ＰＨＡ合成後のｍcl-３ＨＡモノマーユニット除去は極めて困難である。
【００４６】
このため、本発明者らは、機能性ポリマーへの応用を考慮した場合、「unusual ＰＨＡ」を高純度で得られる生合成方法の開発が是非とも必要であるとの認識を持つに至った。よって、前記のような機能性と生分解性とを兼ね備えた優れたポリマーと、当該ポリマーを生産し菌体内に蓄積し得る微生物、並びに、当該ＰＨＡを高純度で効率的に生合成する方法の開発は極めて有用かつ重要であると考えられた。
【００４７】
本発明は前記の課題を解決するものであり、デバイス材料や医用材料等として有用な置換基を側鎖に有する多様な構造のモノマーユニットを含むＰＨＡ(unusual ＰＨＡ)の提供、ならびに、当該「unusual ＰＨＡ」を微生物を利用して製造する方法の提供、特には、目的外のモノマーユニットの混在が少なく、目的とする「unusual ＰＨＡ」を高純度で得ることができ、しかも高収率な製造方法を提供することにある。
【００４８】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者らは、デバイス材料や医用材料等として有用な官能基を側鎖に有するＰＨＡの開発を目指して、各種のＰＨＡを生産し菌体内に蓄積する能力を有する微生物の探索、及び、このような微生物を用いた所望のＰＨＡの生産方法について鋭意研究を重ねてきた。その結果、化学式[７]、
【００４９】
【化 １６】
【００５０】
(ただし、式中nは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒはハロゲン原子,-ＣＮ,-ＮＯ2,-ＣＨ3,-Ｃ2Ｈ5,-Ｃ3Ｈ7,-ＣＦ3,-Ｃ2Ｆ5,-Ｃ3Ｆ7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
で表される置換ベンゾイルアルカン酸を原料として、化学式[８]、
【００５１】
【化 １７】
【００５２】
(ただし、式中ｍはn,n-２,n-４,n-６からなる群より選択される少なくとも１つ以上でありかつ１以上の整数を表し、nは前記化学式[７]中のnと対応する１から８の整数のいずれかを表し、Ｒは前記化学式[７]中のＲと対応するハロゲン原子,-ＣＮ,-ＮＯ2,-ＣＨ3,-Ｃ2Ｈ5,-Ｃ3Ｈ7,-ＣＦ3,-Ｃ2Ｆ5,-Ｃ3Ｆ7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
で表される３-ヒドロキシ置換ベンゾイルアルカン酸ユニットを含む新規なＰＨＡを生産し菌体内に蓄積する能力を有する微生物を見出し、さらに、これら微生物を前記化学式[７]で表される置換ベンゾイルアルカン酸と、糖類,ＴＣＡサイクルに関与する有機酸,酵母エキスまたはポリペプトンの共存下で培養することにより、当該ＰＨＡを生合成することができること、それによって得られる当該ＰＨＡが比較的高純度であることを見出した。
【００５３】
詳しくは、例えば、化学式[９]、
【００５４】
【化 １８】
【００５５】
(ただし、式中Ｒはハロゲン原子,-ＣＮ,-ＮＯ2,-ＣＨ3,-Ｃ2Ｈ5,-Ｃ3Ｈ7,-ＣＦ3,-Ｃ2Ｆ5,-Ｃ3Ｆ7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
で表される置換ベンゾイル吉草酸を原料として、化学式[５]、
【００５６】
【化 １９】
【００５７】
(ただし、式中Ｒは前記化学式[９]中のＲと対応するハロゲン原子,-ＣＮ,-ＮＯ2,-ＣＨ3,-Ｃ2Ｈ5,-Ｃ3Ｈ7,-ＣＦ3,-Ｃ2Ｆ5,-Ｃ3Ｆ7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
で表される３-ヒドロキシ置換ベンゾイル吉草酸ユニットを含む新規なＰＨＡを生産し菌体内に蓄積する能力を有する微生物を見出し、さらに、これら微生物を前記化学式[９]で表される置換ベンゾイル吉草酸と、糖類,ＴＣＡサイクルに関与する有機酸,酵母エキスまたはポリペプトンの共存下で培養することにより、当該ＰＨＡを生合成することができること、それによって得られる当該ＰＨＡが比較的高純度であることを見出した。
さらに詳しくは、例えば、化学式[10]、
【００５８】
【化 ２０】
【００５９】
で表される５-(４-フルオロベンゾイル)吉草酸(以下、ＦＢzＶＡと略す)を原料として、化学式[６]、
【００６０】
【化 ２１】
【００６１】
で表される３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロベンゾイル)吉草酸ユニット(以下、３ＨＦＢzＶと略す場合がある)を含む新規なＰＨＡを生産し菌体内に蓄積する能力を有する微生物を見出し、さらに、これら微生物を置換ベンゾイルアルカン酸と、糖類,ＴＣＡサイクルに関与する有機酸,酵母エキスまたはポリペプトンとの共存下で培養することにより、当該ＰＨＡを生合成することができること、それによって得られる当該ＰＨＡが比較的高純度であることを見出し、本発明を為すに至った。
【００６２】
すなわち、本発明は、化学式[２]、
【００６３】
【化 ２２】
【００６４】
(ただし、式中nは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒはハロゲン原子,-ＣＮ,-ＮＯ2,-ＣＨ3,-Ｃ2Ｈ5,-Ｃ3Ｈ7,-ＣＦ3,-Ｃ2Ｆ5,-Ｃ3Ｆ7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
で表される３-ヒドロキシ置換ベンゾイルアルカン酸ユニットをモノマーユニットとして含むＰＨＡに関するものである。
なお、本発明のＰＨＡでは、目的とするモノマーユニットである前記化学式[２]で示されるもの以外のモノマーユニットは、すべて下記化学式[３]または下記化学式[４]で表されるモノマーユニットから選択される少なくとも１つ以上である。
【化３１】
(ただし、式中pは０から10の整数のいずれかを表す。)
【化３２】
(ただし、式中qは３または５の整数のいずれかを表す。)
本発明のＰＨＡにおいては前記化学式[２]で示されるモノマーユニットの割合は0.01以上１以下である。
さらに好ましくは本発明のＰＨＡは、前記化学式[２]で示されるモノマーユニットの一部として、下記化学式[５]で示されるモノマーユニットを含む。
【化３３】
(ただし、式中Ｒはハロゲン原子,-ＣＮ,-ＮＯ2,-ＣＨ3,-Ｃ2Ｈ5,-Ｃ3Ｈ7,-ＣＦ3,-Ｃ2Ｆ5,-Ｃ3Ｆ7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
また、本発明は、これらのＰＨＡの製造方法であって、置換ベンゾイルアルカン酸を利用して該組成を有するポリヒドロキシアルカノエートを合成し得る微生物である、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株(Pseudoｍonas cichorii Ｈ45、ＦＥＲＭ ＢＰ-7374)、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株(Pseudoｍonas cichorii ＹＮ２、ＦＥＲＭ ＢＰ-7375)、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株(Pseudoｍonas jessenii Ｐ161、ＦＥＲＭ ＢＰ -7376)からなる群から選択される少なくとも１つの株を、該置換ベンゾイルアルカン酸を含む培地で培養する工程と、
前記微生物が産生したポリヒドロキシアルカノエートを単離する工程とを有することを特徴とする。
好ましくは、化学式[７]、
【００６５】
【化 ２３】
【００６６】
(ただし、式中nは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒはハロゲン原子,-ＣＮ,-ＮＯ2,-ＣＨ3,-Ｃ2Ｈ5,-Ｃ3Ｈ7,-ＣＦ3,-Ｃ2Ｆ5,-Ｃ3Ｆ7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
で表される置換ベンゾイルアルカン酸を含む培地で微生物を培養することで、該微生物に、下記化学式[８]、
【００６７】
【化 ２４】
【００６８】
(ただし、式中ｍはn,n-２,n-４,n-６からなる群より選択される少なくとも１つ以上でありかつ１以上の整数を表し、nは前記化学式[７]中のnと対応する１から８の整数のいずれかを表し、Ｒは前記化学式[７]中のＲと対応するハロゲン原子,-ＣＮ,-ＮＯ2,-ＣＨ3,-Ｃ2Ｈ5,-Ｃ3Ｈ7,-ＣＦ3,-Ｃ2Ｆ5,-Ｃ3Ｆ7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
で表される、対応する３-ヒドロキシ置換ベンゾイルアルカン酸ユニットを有するＰＨＡを産生させる工程を有することを特徴とする。
【００６９】
すなわち、本発明のＰＨＡの製造方法は、３-ヒドロキシ置換ベンゾイルアルカン酸ユニットを含むＰＨＡを生産する微生物を、置換ベンゾイルアルカン酸と、糖類,ＴＣＡサイクルに関与する有機酸,酵母エキスまたはポリペプトンとの共存下で培養する工程を有することを特徴とする。
【００７０】
【発明の実施の形態】
本発明のＰＨＡは、デバイス材料や撥水性材料、医用材料等として有用な置換基を側鎖に有する多様な構造のモノマーユニットを含むＰＨＡであり、より具体的には、置換ベンゾイル基を側鎖に有するＰＨＡである。また、本発明のＰＨＡの製造方法は、微生物を利用して高純度かつ高収率に所望のＰＨＡを製造することを可能とするものである。なお、本発明のＰＨＡは、一般にＲ体のみから構成される、アイソタクチックなポリマーである。
【００７１】
＜糖類ならびにＴＣＡサイクルに関与する有機酸 従来技術との差異＞
本発明のＰＨＡ製造方法の１つは、微生物を培養する際、培地に所望とするモノマーユニット導入用のアルカン酸に加えて、当該アルカン酸以外の炭素源として、糖類あるいはＴＣＡサイクルに関与する有機酸を添加することで、微生物が産生・蓄積するＰＨＡにおいて、目的とするモノマーユニットの含有率を著しく高いものとする、あるいは目的とするモノマーユニットのみとする点を特徴としている。この特定のモノマーユニットの優先化を促進する効果は、培地中に当該アルカン酸以外の炭素源として、糖類あるいはＴＣＡサイクルに関与する有機酸のみを添加することにより得られている。
【００７２】
すなわち、発明者らは、糖類あるいはＴＣＡサイクルに関与する有機酸を共存基質として、所望とするモノマーユニット導入用のアルカン酸と共に培養せしめたところ、ノナン酸やオクタン酸といったｍcl-アルカン酸を共存基質として用いた従来の方法に比べ、目的とするＰＨＡが格段に優れた収率および純度で得られること、そしてこのような効果が、微生物の炭素源ならびにエネルギー源であるアセチルＣoＡをβ酸化に拠らない方法により生成することが可能な培養方法であることにより得られるものであるとの知見を得て本発明に至ったものである。
【００７３】
本発明の方法においては、糖類化合物、例えばグルコースやフルクトース,マンノース等は、微生物の増殖基質として利用されることになり、生産されるＰＨＡは、糖類に共存させている所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートから構成され、グルコース等の糖類に由来するモノマーユニットが全く含まれないか、極めて少量しか含まれない。このような点で、本発明の方法は、従来のグルコースなどの糖類そのものをＰＨＡに導入するモノマーユニットの原料基質として用いるＰＨＡ微生物生産方法とは構成及び効果ともに根本的に異なるものである。
【００７４】
＜酵母エキス 従来技術との差異＞
本発明のＰＨＡ製造方法の１つは、微生物を培養する際、培地に所望とするモノマーユニット導入用のアルカン酸に加えて、当該アルカン酸以外の炭素源として酵母エキスのみを添加することで、微生物が産生・蓄積するＰＨＡにおいて、目的とするモノマーユニットの含有率を著しく高いものとする、あるいは目的とするモノマーユニットのみとする点を特徴としている。この特定のモノマーユニットの優先化を促進する効果は、培地中に当該アルカン酸以外の炭素源として酵母エキスのみを添加することにより得られている。
【００７５】
微生物によるＰＨＡの製造に際して、培地に酵母エキスを利用する例として、特開平５-49487 号公報に記載の、ロドバクター属(Ｒhodobacter sp.)に属する微生物を用いた方法が挙げられる。しかしながら、この従来法は、置換基を有しないヒドロキシアルカノエートをモノマーユニットとする、一般的なＰＨＢおよびポリ-３-ヒドロキシ吉草酸(以下、ＰＨＶと略す場合もある)を製造する方法である。本発明が目的とするようなＰＨＡの合成経路は、ＰＨＢおよびＰＨＶを生産する合成経路とは独立した経路であることが知られており、特開平５-49487 号公報においては本発明が目的とするようなＰＨＡの合成経路における酵母エキスの効果については何ら言及がない。また、酵母エキスの効果も、微生物が一般的に生産するＰＨＡやＰＨＶに関して、酵母エキスを添加すると、単に菌体内のＰＨＡ蓄積量の増大が図られる効果があることを示すのみであり、増殖のために酵母エキスが添加されている訳ではないことが明記されている。
【００７６】
本発明は置換ベンゾイルアルカン酸と酵母エキスとを共存させることにより、増殖とともにＰＨＡの生産・蓄積を行なうものであり、酵母エキスの発揮する効果が全く異なる。さらに本発明の効果である、特定のモノマーユニットの優占化について何ら言及されておらず、本発明のように、微生物が生産するＰＨＡ組成における、置換ベンゾイル基を置換基として有する特定のモノマーユニットの優占化という効果は示されていない。
【００７７】
さらに、微生物によるＰＨＡの生産に酵母エキスを利用する例としては、特許第 2989175号公報に記載のシュードモナス・プチダ(Pseudoｍonas putida)を用いた方法が挙げられる。ここで開示されているＰＨＡの製造方法は２段階培養によるもののみであり、ＰＨＡの蓄積は２段階目の培養においてのみ、炭素源以外の栄養源の制限下で行なうことが開示されている。この点で、本発明における、置換ベンゾイルアルカン酸と酵母エキスとを含む培地での１段階培養のみで、所望のＰＨＡを合成・蓄積させる方法とは構成/効果ともに全く異なる。
【００７８】
また、特許第 2989175号公報における酵母エキスの効果は、２段階培養を用いる際、１段階目の培養において、単に２段階目の培養に用いる微生物の増殖のみを目的としたものであり、１段階目は栄養源の豊富な条件下で培養されると明記されている。ここで、ＰＨＡの基質は１段階目には共存していない。本発明における酵母エキスの効果は、置換ベンゾイルアルカン酸と酵母エキスとを共存させることにより、増殖とともにＰＨＡの生産・蓄積を行なうものであり、酵母エキスの発揮する効果が全く異なる。
【００７９】
また、特許第 2989175号公報では、１段階目の培養に、炭素源としてクエン酸、オクタン酸、ノナン酸のいずれかが共存しており、置換ベンゾイルアルカン酸と酵母エキスのみを共存させる本発明とは、構成においても異なるものである。
【００８０】
＜ポリペプトン 従来技術との差異＞
本発明のＰＨＡ製造方法の１つは、微生物を培養する際、培地に所望とするモノマーユニット導入用のアルカン酸に加えて、当該アルカン酸以外の炭素源としてポリペプトンのみを添加することで、微生物が産生・蓄積するＰＨＡにおいて、目的とするモノマーユニットの含有率を著しく高いものとする、あるいは目的とするモノマーユニットのみとする点を特徴としている。この特定のモノマーユニットの優先化を促進する効果は、培地中に当該アルカン酸以外の炭素源として、ポリペプトンのみを添加することにより得られている。
【００８１】
なお、微生物によるＰＨＡの生産にポリペプトンを利用する例として、特開平５-49487号公報、特開平５-64591号公報、特開平５-214081号公報、特開平６-145311号公報、特開平６-284892号公報、特開平７-48438公報、特開平８-89264号公報、特開平９-191893号公報、特開平 11-32789号公報等に、ＰＨＡを微生物に生産させる際に、培地中にポリペプトンを含有させていることが開示されているが、いずれも前培養、つまり、菌体を単に増殖させる段階で用いており、前培養時にＰＨＡのモノマーユニットとなる基質は含まれていない。また、菌体にＰＨＡを生産させる工程でポリペプトンを用いた例はない。
【００８２】
これに対して、本発明は所望のモノマーユニット導入用のアルカン酸と、当該アルカン酸以外の炭素源として、ポリペプトンのみを共存させることにより、増殖とともにＰＨＡの生産・蓄積を行なうものであり、従来のポリペプトンを利用した例とは構成および効果が全く異なる。さらに本発明の効果である、特定のモノマーユニットの優占化について何ら言及されておらず、本発明のように、微生物が生産するＰＨＡ組成における、置換ベンゾイル基を置換基として有する特定のモノマーユニットの優占化という効果は示されていない。
【００８３】
以下に、本発明において利用される微生物、培養工程などについて説明する。
【００８４】
＜ＰＨＡモノマーユニット供給系＞
先ず、目的とするＰＨＡに混在してくるｍcl-３ＨＡモノマーユニットの供給系の１つである「脂肪酸合成経路」について詳細に説明する。
【００８５】
グルコース等の糖類を基質とした場合、細胞成分として必要なアルカン酸は、糖類から「解糖系」を経て生産されるアセチルＣoＡを出発物質とした「脂肪酸合成経路」から生合成される。なお、脂肪酸合成には新規(de novo)合成経路と炭素鎖延長経路があり、以下にこれらについて説明する。
【００８６】
(１)新規(de novo)合成経路
アセチルＣoＡカルボキシラーゼ(ＥＣ 6.4.1.2)と脂肪酸合成酵素(ＥＣ 2.3.1.85)の２つの酵素で触媒される。なお、アセチルＣoＡカルボキシラーゼは、ビオチンを介在し、最終的に以下の反応を触媒し、アセチルＣoＡからマロニルＣoＡを生成する酵素であり、反応は下記式で表わされる。
アセチルCoA+ATP+HCO3 -⇔マロニルCoA+ADP+Pi
また、脂肪酸合成酵素は、転移-縮合-還元-脱水-還元の反応サイクルを触媒する酵素であり、全反応は次の反応式で示される。
アセチルCoA+nマロニルCoA+2nNADPH+2nH+ ⇒ CH3(CH2)2nCOOH+nCO2+2nNADP++(n-1)CoA
なお、酵素の種類によって、反応産物が遊離酸、ＣoＡ誘導体、あるいはＡＣＰ誘導体の場合がある。ここで、アセチルＣoＡは以下の化学式で示され、
【００８７】
【化 ２５】
【００８８】
マロニルＣoＡは以下の化学式で示される。
【００８９】
【化 ２６】
【００９０】
また、ＣoＡとは補酵素Ａ(coenzyｍe Ａ)の略称であり、以下の化学式で示される。
【００９１】
【化 ２７】
【００９２】
本反応経路のうち、以下に示す経路により、ＰＨＡ生合成のモノマー基質となる「Ｄ-３-ヒドロキシアシルＡＣＰ」が中間体として供給される。また、以下の反応式に示すように経路は炭素を２個ずつ付加しながら最終的にはパルミチン酸まで延長される。それゆえＰＨＡ生合成のモノマー基質としては「Ｄ-３-ヒドロブチリルＡＣＰ」から「Ｄ-３-ヒドロキシパルミチルＡＣＰ」の炭素数が偶数の７種類の「Ｄ-３-ヒドロキシアシルＡＣＰ」が供給されることになる。
【００９３】
【化 ２８】
【００９４】
(２)炭素鎖延長経路
この経路は、アシルＡＣＰにマロニルＡＣＰが付加し、最終的に炭素鎖が２つ延長されたアシルＡＣＰ(及びＣＯ2)となる経路(経路Ａとする)と、アシルＣoＡにアセチルＣoＡが付加し、最終的に炭素鎖が２つ延長されたアシルＣoＡとなる経路(経路Ｂとする)の２経路に大別される。以下に各経路について説明する。
・経路Ｂ
R-CO-CoA+アセチル-CoA→R-CO-CH2-CO-CoA
R-CO-CH2-CO-CoA→R-CHOH-CH2-CO-CoA→
R-CH=CH-CO-CoA→R-CH2-CH2-CO-CoA
Ａ、Ｂいずれの系も、中間体として「Ｄ-３-ヒドロキシアシルＣoＡ」あるいは「Ｄ-３-ヒドロキシアシルＡＣＰ」が生じ、「Ｄ-３-ヒドロキシアシルＣoＡ」はそのままＰＨＡ合成のモノマー基質として利用され、「Ｄ-３-ヒドロキシアシルＡＣＰ」はＡＣＰ-ＣoＡ転移酵素により「Ｄ-３-ヒドロキシアシルＣoＡ」に変換された後に、ＰＨＡ合成のモノマー基質として利用されると考えられる。
【００９５】
グルコース等の糖類を基質とした場合、微生物細胞中では以上のような「解糖系」及び「脂肪酸合成経路」を経由してｍcl-３ＨＡモノマーユニットが生成されると考えられる。また、ＴＣＡサイクルに関与する有機酸を基質とした場合、ピルビン酸からはピルビン酸デヒドロゲナーゼにより直接アセチルＣoＡが生成する。オキサロ酢酸からはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼによりホスホエノールピルビン酸がピルビン酸キナーゼにより触媒されてピルビン酸が生成し、さらに上記反応によりアセチルＣoＡが生成する。これらの反応により生成したアセチルＣoＡが「脂肪酸合成経路」を経由してｍcl-３ＨＡモノマーユニットが生成されると考えられる。
【００９６】
ここで、例えばオクタン酸、ノナン酸等のｍcl-アルカン酸、あるいは、例えば、５-フェニル吉草酸、４-フェノキシ酪酸、４-シクロヘキシル酪酸といった、末端に直鎖脂肪族アルキル以外の官能基が付加されたアルカン酸はＣoＡリガーゼ(ＥＣ 6.2.1.3等)によりＣoＡ誘導体となり、β酸化系を担う酵素群により直接的にＰＨＡ生合成のモノマー基質となる「Ｄ-３-ヒドロキシアシルＣoＡ」となると考えられる。
【００９７】
つまり、糖類あるいはＴＣＡサイクルに関与する有機酸から生成するｍcl-３ＨＡモノマーユニットが、きわめて多段階の酵素反応を経て(つまり間接的に)生成されるのに比較し、ｍcl-アルカン酸からはきわめて直接的にｍcl-３ＨＡモノマーユニットが生成されてくることになる。
【００９８】
ここで、微生物の増殖を担うアセチルＣoＡの生成について説明する。目的とするモノマーユニット導入用のアルカン酸に加えてｍcl-アルカン酸を共存させる方法では、これらのアルカン酸がβ酸化系を経由することによりアセチルＣoＡが生成する。一般に、バルキーな置換基を有するアルカン酸(フェニル基、フェノキシ基、シクロヘキシル基等の置換基を有するアルカン酸)に比較し、ｍcl-アルカン酸はβ酸化系の酵素群との基質親和性に優れていると考えられ、ｍcl-アルカン酸の共存により効果的にアセチルＣoＡが生成される。このため、アセチルＣoＡをエネルギー源及び炭素源として用いる微生物の増殖には有利となる。
【００９９】
しかしながら、β酸化系を経由するｍcl-アルカン酸が直接的にＰＨＡのモノマーユニットとなるために、生産されるＰＨＡは、目的のモノマーユニットに加えてｍcl-３ＨＡモノマーユニットの混在が多いものとなってしまうことが大きな課題である。
【０１００】
この課題を解決するためには、ｍcl-アルカン酸以外で、効果的にアセチルＣoＡあるいはエネルギー源及び炭素源を供給し得るような基質を選択し、目的とするアルカン酸と共存させる方法が望ましい。前述のように、アセチルＣoＡは脂肪酸合成経路を経ることによりＰＨＡのモノマーユニットとなり得るが、ｍcl-アルカン酸に比較すればより多段階の反応を経由する必要がある間接的なものであり、また、アセチルＣoＡを生成し得るような基質の濃度等、培養条件を適宜選択することにより、実質的にはｍcl-３ＨＡの混在のない、あるいは少ない製造方法の実現が可能である。
【０１０１】
また、１段階目で微生物の増殖のみを目的に培養し、２段階目においては炭素源として目的とするアルカン酸のみを培地に加える製造方法が汎用されている。ここで、当該アルカン酸をアシルＣoＡ化するβ酸化系の初発酵素であるアシルＣoＡリガーゼがＡＴＰを要求することから、発明者らの検討によれば２段階目においても微生物がエネルギー源として利用し得る基質を共存させる製造方法がより効果的であるとの結果を得て、本発明を完成した。
【０１０２】
本発明の方法におけるアセチルＣoＡあるいはエネルギー源および炭素源を効果的に供給し得る基質としては、グリセロアルデヒド,エリスロール,アラビノース,キシロース,グルコース,ガラクトース,マンノース,フルクトースといったアルドース、グリセロール,エリスリトール,キシリトール等のアルジトール、グルコン酸等のアルドン酸,グルクロン酸やガラクツロン酸等のウロン酸、マルトース,スクロース,ラクトースといった二糖等の糖類のほか、乳酸,ピルビン酸,リンゴ酸,クエン酸,コハク酸,フマル酸及びその塩等のＴＣＡサイクルに関与する有機酸、さらには酵母エキス,ポリペプトン,肉エキス,カザミノ酸などの天然物由来の培地成分など、β酸化系を経ずにアセチルＣoＡあるいはエネルギー源および炭素源を供給し得る化合物であれば、いかなる化合物でも用いることができ、用いる菌株に対する基質としての有用性で適宜選択することができる。また、ｍcl-３ＨＡの混入の少ない組み合わせであれば、複数の化合物を選択して用いることも可能である。
【０１０３】
＜微生物＞
本発明に用いる微生物としては、前記の置換ベンゾイルアルカン酸を原料とし、前記の３-ヒドロキシ置換ベンゾイルアルカン酸ユニットを含むＰＨＡを産生可能であれば、いかなる微生物をも使用することができる。また、本発明の目的を達成できる範囲内で、必要に応じて複数の微生物を混合して用いることもできる。
【０１０４】
本発明者らは、ＦＢzＶＡ等を基質として用いて、前記の３ＨＦＢzＶ等をモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産し菌体内に蓄積する能力を有する微生物の探索を行なった。その結果、本発明者らが土壌より分離した微生物であり、ＰＨＡの生産能力を有する、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株(Pseudoｍonas cichorii Ｈ45)、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株(Pseudoｍonas cichoriiＹＮ２)、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株(Pseudoｍonas jessenii Ｐ161)等が所望の能力を有することを見出した。なお、Ｈ45株は寄託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ-7374」として、ＹＮ２株は寄託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ-7375」として、Ｐ161株は寄託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ-7376」として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（旧経済産業省生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センター）にそれぞれ寄託されている。
【０１０５】
前記のＨ45株、ＹＮ２株およびＰ161株の菌学的性質を列挙すれば以下の通りである。また、Ｐ161株については、16srＲＮＡの塩基配列を配列番号:１に示す。
＜Ｈ45株の菌学的性質＞
(２)生理学的性質
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
Ｏ/Ｆ試験 :酸化型
硝酸塩の還元 :陰性
インドールの生成 :陰性
ブドウ糖酸性化 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陰性
ウレアーゼ :陰性
エスクリン加水分解 :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β-ガラクトシダーゼ :陰性
Ｋing'sＢ寒天での蛍光色素産生:陽性
４％ＮaＣlでの生育 :陰性
ポリ-β-ヒドロキシ酪酸の蓄積 :陰性
(３)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
Ｌ-アラビノース :陰性
Ｄ-マンノース :陽性
Ｄ-マンニトール :陽性
Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陽性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n-カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl-リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性
＜ＹＮ２株の菌学的性質＞
(２)生理学的性質
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
Ｏ/Ｆ試験 :酸化型
硝酸塩の還元 :陰性
インドールの生成 :陽性
ブドウ糖酸性化 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陰性
ウレアーゼ :陰性
エスクリン加水分解 :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β-ガラクトシダーゼ :陰性
Ｋing'sＢ寒天での蛍光色素産生:陽性
４％ＮaＣlでの生育 :陽性(弱い生育)
ポリ-β-ヒドロキシ酪酸の蓄積 :陰性
Ｔｗeen 80 の加水分解 :陽性
(３)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
Ｌ-アラビノース :陽性
Ｄ-マンノース :陰性
Ｄ-マンニトール :陰性
Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陰性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n-カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl-リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性
＜Ｐ161株の菌学的性質＞
(２)生理学的性質
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
Ｏ/Ｆ試験 :酸化型
硝酸塩の還元 :陽性
インドールの生成 :陰性
ブドウ糖酸性化 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陽性
ウレアーゼ :陰性
エスクリン加水分解 :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β-ガラクトシダーゼ :陰性
Ｋing'sＢ寒天での蛍光色素産生:陽性
(３)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
Ｌ-アラビノース :陽性
Ｄ-マンノース :陽性
Ｄ-マンニトール :陽性
Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陽性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n-カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl-リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性
また、シュードモナス属に属する微生物に加えて、アエロモナス属(Ａeroｍonas sp.)、コマモナス属(Ｃoｍaｍonas sp.)、バークホルデリア属(Ｂurkholderia sp.)などに属し、前記の置換ベンゾイルアルカン酸を原料とし、前記の３-ヒドロキシ置換ベンゾイルアルカン酸ユニットをモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産する微生物を用いることも可能である。
【０１０６】
＜培養＞
これらの微生物を所望とするモノマーユニット導入用のアルカン酸と、本発明の増殖用基質とを含む培地で培養することで、目的とするＰＨＡを生産することができる。このようなＰＨＡは、一般にＲ-体のみから構成され、アイソタクチックなポリマーである。
【０１０７】
本発明にかかるＰＨＡの製造方法に用いる微生物の通常の培養、例えば、保存菌株の作成、ＰＨＡの生産に必要とされる菌数や活性状態を確保するための増殖などには、用いる微生物の増殖に必要な成分を含有する培地を適宜選択して用いる。例えば、微生物の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地(肉汁培地,酵母エキスなど)や、栄養源を添加した合成培地など、いかなる種類の培地をも用いることができる。
【０１０８】
培養は液体培養、固体培養等該微生物が増殖し、ＰＨＡを生産する培養方法ならいかなる培養方法でも用いることができる。さらに、バッチ培養,フェドバッチ培養,半連続培養,連続培養等の種類も問わない。液体バッチ培養の形態としては、振とうフラスコによって振とうさせて酸素を供給する方法、ジャーファーメンターによる攪拌通気方式の酸素供給方法がある。また、これらの工程を複数段接続した多段方式を採用してもよい。
【０１０９】
前記したようなＰＨＡ生産微生物を用いて、３-ヒドロキシ置換ベンゾイルアルカン酸ユニットを含むＰＨＡを製造する場合は、ＰＨＡ生産用の原料としてそれぞれ対応する置換ベンゾイルアルカン酸と、微生物の増殖用炭素源とを少なくとも含んだ無機培地などを用いることができる。
増殖用炭素源としては、酵母エキス,ポリペプトン,肉エキス,カザミノ酸などの天然物由来の培地成分を用いることが可能であり、さらに、糖類,ＴＣＡサイクルに関与する有機酸(ＴＣＡ回路中の中間体として生じる有機酸及びＴＣＡ回路から一段階ないしは二段階の生化学反応を経て生じる有機酸)或いはその塩等,β酸化サイクルを経ずにアセチルＣoＡを生じる化合物であれば、いかなる化合物でも用いることができ、用いる菌株に対する基質としての有用性で適宜選択することができる。また、ｍcl-３ＨＡの混入の少ない組み合わせであれば、複数の化合物を選択して用いることも可能である。
【０１１０】
これらのうち、糖類としては、グリセロアルデヒド,エリスロース,アラビノース,キシロース,グルコース,ガラクトース,マンノース,フルクトースといったアルドース、グリセロール,エリスリトール,キシリトール等のアルジトール、グルコン酸等のアルドン酸,グルクロン酸,ガラクツロン酸等のウロン酸、マルトース,スクロース,ラクトースといった二糖等から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
【０１１１】
また、有機酸或いはその塩としては、ピルビン酸,オキサロ酢酸,クエン酸,イソクエン酸,ケトグルタル酸,コハク酸,フマル酸,リンゴ酸,乳酸などがその例であり、或いはその塩から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
これらの中でも、特に糖類を用いるのが好ましく、中でもグルコース,フルクトース,マンノースからなる群から選択される少なくとも一つであることがより好ましい。
【０１１２】
微生物にＰＨＡを生産・蓄積させる方法としては、一旦十分に増殖させて後に、塩化アンモニウムのような窒素源を制限した培地へ菌体を移し、目的ユニットの基質となる化合物を加えた状態で更に培養すると生産性が向上する場合がある。具体的には、前記の工程を複数段接続した多段方式の採用が挙げられる。例えば、Ｄ-グルコースを 0.05％から 5.0％程度、および、置換ベンゾイルアルカン酸を 0.01％から 1.0％程度含んだ無機培地等で対数増殖後期から定常期の時点まで培養し、菌体を遠心分離等で回収したのち、置換ベンゾイルアルカン酸を 0.01％から 1.0％程度含んだ、窒素源を制限した、あるいは実質的に存在しない無機培地でさらに培養する方法がある。
【０１１３】
上記の培養方法に用いる無機培地としては、リン源(例えば、リン酸塩等)、窒素源(例えば、アンモニウム塩,硝酸塩等)等、微生物が増殖し得る成分を含んでいるものであればいかなるものでも良く、例えば無機塩培地としては、ＭＳＢ培地、Ｅ培地(J.Ｂiol.Ｃheｍ.,２１８，97-106(1956))、Ｍ９培地等を挙げることができる。なお、本発明における実施例で用いるＭ９培地の組成は以下の通りである。
Ｎa2ＨＰＯ4 : 6.2g
ＫＨ2ＰＯ4 : 3.0g
ＮaＣl : 0.5g
ＮＨ4Ｃl : 1.0g
(培地１リットル中、pＨ 7.0)
更に、良好な増殖及びＰＨＡの生産のためには、上記の無機塩培地に培地に以下に示す微量成分溶液を 0.3％(v/v)程度添加するのが好ましい。
微量成分溶液
ニトリロ三酢酸: 1.5g
ＭgＳＯ4 : 3.0g
ＭnＳＯ4 : 0.5g
ＮaＣl : 1.0g
ＦeＳＯ4 : 0.1g
ＣaＣl2 : 0.1g
ＣoＣl2 : 0.1g
ＺnＳＯ4 : 0.1g
ＣuＳＯ4 : 0.1g
ＡlＫ(ＳＯ4)2 : 0.1g
Ｈ3ＢＯ3 : 0.1g
Ｎa2ＭoＯ4 : 0.1g
ＮiＣl2 : 0.1g
(１リットル中)
培養温度としては上記の菌株が良好に増殖可能な温度であれば良く、例えば 15〜40℃、好ましくは 20〜35℃、更に好ましくは 20℃から 30℃程度が適当である。
【０１１４】
具体的な例としては、Ｄ-グルコースを 0.05％から 5.0％程度、および、置換ベンゾイルアルカン酸を 0.01％から 1.0％程度含んだ無機培地等で培養し、対数増殖後期から定常期の時点で菌体を回収して目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは全くない所望のＰＨＡを抽出することができる。このようなＰＨＡは、一般にＲ-体のみから構成され、アイソタクチックなポリマーである。
【０１１５】
Ｄ-グルコースの代わりに同量のＴＣＡサイクルに関与する有機酸や、酵母エキス,ポリペプトンを与えても良い。また、それらの組み合わせを用いてもよい。
【０１１６】
＜ＰＨＡの回収＞
本発明にかかる培養液からのＰＨＡの取得には、通常行なわれている方法を適用することができる。ＰＨＡが培養液中に分泌される場合は、培養液からの抽出精製方法が、また、菌体に蓄積される場合は、菌体からの抽出精製方法が用いられる。例えば、微生物の培養菌体からのＰＨＡの回収には、通常行なわれているクロロホルムなどの有機溶媒による抽出が最も簡便ではあるが、クロロホルム以外にジオキサン,テトラヒドロフラン,アセトニトリル,アセトンが用いられる場合もある。また、有機溶媒が使用しにくい環境中においては、ＳＤＳ等の界面活性剤による処理、リゾチーム等の酵素による処理、ＥＤＴＡ等の薬剤による処理によってＰＨＡ以外の菌体成分を除去して、ＰＨＡを回収する方法を用いることもできる。
【０１１７】
なお、本発明の微生物の培養、本発明の微生物によるＰＨＡの生産と菌体への蓄積、並びに、本発明における菌体からのＰＨＡの回収は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１１８】
以下に実施例を示す。なお、以下における「％」は特に標記した以外は重量基準である。
【０１１９】
【実施例】
(参考例) ４'-フルオロ-n-ヘプタノフェノンの合成
四つ口丸底フラスコに 100ｍlのテトラヒドロフランを入れ、４-フルオロベンゾイルクロライド 7.92 g(0.05 ｍol)及びトリス(アセチルアセトン)鉄(III)0.53 g(1.5 ｍｍol)を加え、窒素雰囲気下で攪拌した。この溶液に、室温においてペンチルマグネシウムブロマイドを加えて、室温 10 分間攪拌した。反応終了後、氷浴下において、希塩酸により酸性化し、ジエチルエーテルにより有機相を抽出した。さらに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて中和し、飽和塩化ナトリウム水溶液にて、有機相を洗浄した。有機相は、無水硫酸マグネシウムにて脱水後、ジエチルエーテルをロータリーエバポレーターにより留去し、真空ポンプにより乾燥し、粗製の４'-フルオロ-n-ヘプタノフェノンを得た。
【０１２０】
精製は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒；n-ヘキサン:酢酸エチル＝ 30 :１)にて単離し、更にn-ヘキサンにより再結晶を行ない、４'-フルオロ-n-ヘプタノフェノン 5.23 gを得た。
【０１２１】
得られた化合物は、以下の条件でＮＭＲ分析を行なった。
1Ｈ-ＮＭＲスペクトルを図１に、その帰属結果(化学式[11]参照)を表３にそれぞれ示した。
【０１２２】
【表３】
【０１２３】
【化 ２９】
【０１２４】
また、得られた精製物は、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、同定を行なった。そのＧＣ-ＭＳスペクトルデータを図２に示す。その結果、４'-フルオロ-n-ヘプタノフェノンは、ＧＣ-ＭＳ ＴIＣ エリア比で 87％であった。
(実施例１)
Ｄ-グルコース 0.5％、４'-フルオロ-n-ヘプタノフェノン 0.05％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125 ストローク/分で振盪培養した。５日間後、菌体を遠心分離によって回収し、10％次亜塩素酸ナトリウム溶液に懸濁し、４℃で２時間振盪してＰＨＡを抽出した。抽出液を遠心分離して沈殿を回収し、これを水洗したのち、真空乾燥してＰＨＡを得た。
得られたＰＨＡについて、核磁気共鳴装置(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ 400)を用いて、下記の測定条件で分析した。
＜測定条件＞
測定核種:1Ｈ
使用溶媒:ＣＤＣl3(ＴＭＳ/ＣＤＣl3をキャピラリ封入でreferenceとして使用)
共鳴周波数:1Ｈ＝ 400 ＭＨz
1Ｈ-ＮＭＲスペクトルを図３に、その帰属結果(化学式[12]参照)を表４にそれぞれ示した。
【０１２５】
【表４】
【０１２６】
【化 ３０】
【０１２７】
さらに、得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050,ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果、表５に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１２８】
【表５】
【０１２９】
このＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー ＨＬＣ-8220、カラム；ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝ 26,000、Ｍｗ＝ 142,000 であった。
【０１３０】
(実施例２)
Ｄ-グルコース 0.5％、４'-フルオロ-n-ヘプタノフェノン 0.1％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125 ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。
【０１３１】
この真空乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１３２】
このＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果を表６に示す。
【０１３３】
【表６】
【０１３４】
上記の結果から、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１３５】
(実施例３)
グルタミン酸ナトリウム 0.5％、４'-フルオロ-n-ヘプタノフェノン 0.1％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125 ストローク/分で振盪培養した。７日間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。
【０１３６】
この真空乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１３７】
このＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果を表７に示す。
【０１３８】
【表７】
【０１３９】
上記の結果から、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１４０】
(実施例４)
グルタミン酸ナトリウム 0.5％、４'-フルオロ-n-ヘプタノフェノン 0.1％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125 ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。
【０１４１】
この真空乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１４２】
このＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果を表８に示す。
【０１４３】
【表８】
【０１４４】
上記の結果から、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１４５】
(実施例５)
Ｄ-グルコース 0.5％、ＦＢzＶＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃,125 ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％とＦＢzＶＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍlに再懸濁して、更に 30℃,125 ストローク/分で振盪培養した。40時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１４６】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１４７】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果、表９に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１４８】
【表９】
【０１４９】
このＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー ＨＬＣ-8220、カラム；ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μＭ)、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝ 30,000、Ｍｗ＝ 78,000 であった。
【０１５０】
(実施例６)
Ｄ-グルコース 0.5％、ＦＢzＶＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃,125 ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。
【０１５１】
この真空乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１５２】
このＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果、表 10 に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１５３】
【表 １０】
【０１５４】
(実施例７)
リンゴ酸二ナトリウム 0.5％、ＦＢzＶＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃,125 ストローク/分で振盪培養した。４日間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。
【０１５５】
この真空乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１５６】
このＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果、表 11 に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１５７】
【表 １１】
【０１５８】
(実施例８)
酵母エキス(オリエンタル酵母工業(株)製)0.5％、ＦＢzＶＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125 ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。
【０１５９】
この真空乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１６０】
このＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果を表12 に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１６１】
【表 １２】
【０１６２】
(実施例９)
ポリペプトン(日本製薬(株)製)0.5％、ＦＢzＶＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125 ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。
【０１６３】
この真空乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１６４】
このＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果を表 13 に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１６５】
【表 １３】
【０１６６】
(実施例 10)
Ｄ-グルコース 0.5％、ＦＢzＶＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・チコリアイ・Ｈ 45 株を植菌し、30℃,125 ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％とＦＢzＶＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍlに再懸濁して、更に 30℃,125 ストローク/分で振盪培養した。40時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１６７】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１６８】
このＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果、表 14 に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１６９】
【表 １４】
【０１７０】
このＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー ＨＬＣ-8220、カラム；ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μＭ)、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝ 26,000、Ｍｗ＝ 61,000 であった。
【０１７１】
(実施例 11)
Ｄ-グルコース 0.5％、ＦＢzＶＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株を植菌し、30℃,125 ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％とＦＢzＶＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍlに再懸濁して、更に 30℃,125 ストローク/分で振盪培養した。40時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１７２】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１７３】
このＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果、表 15 に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１７４】
【表１５】
【０１７５】
このＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー ＨＬＣ-8220、カラム；ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μＭ)、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝ 41,000、Ｍｗ＝ 110,000 であった。
【０１７６】
【発明の効果】
本発明により、デバイス材料や医用材料等として有用な置換基を側鎖に有する多様な構造のモノマーユニットを含むＰＨＡ(unusual ＰＨＡ)の提供、ならびに、当該「unusual ＰＨＡ」を微生物を利用して製造する方法が可能となった。
【０１７７】
特に、目的外のモノマーユニットの混在が少なく、目的とする「unusual ＰＨＡ」を高純度で得ることができ、しかも高収率な製造方法の提供が可能となった。
【０１７８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】参考例における1Ｈ-ＮＭＲスペクトルチャートを示す。
【図２】参考例において得られた４'-フルオロ-n-ヘプタノフェノンをＧＣ-ＭＳ測定した際のＴIＣ及びマススペクトルを示す。
【図３】実施例１における1Ｈ-ＮＭＲスペクトルチャートを示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は新規なポリヒドロキシアルカノエート(以下、ＰＨＡと略す場合もある)に関する。また、ＰＨＡを生産し菌体内に蓄積する能力を有する微生物を用いた当該ＰＨＡの極めて効率的な製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、多くの微生物がポリ-３-ヒドロキシ酪酸(以下、ＰＨＢと略す場合もある)あるいはその他のＰＨＡを生産し、菌体内に蓄積することが報告されてきた(「生分解性プラスチックハンドブック」、生分解性プラスチック研究会編、(株)エヌ・ティー・エス、Ｐ178-197)。これらのポリマーは従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品の生産に利用することができる。さらに、生分解性であるがゆえに、自然界で微生物により完全分解されるという利点を有しており、従来の多くの合成高分子化合物のように自然環境に残留して汚染を引き起こすことがない。また、生体適合性にも優れており、医療用軟質部材等としての応用も期待されている。
【０００３】
このような微生物産生ＰＨＡは、その生産に用いる微生物の種類や培地組成,培養条件等により、様々な組成や構造のものとなり得ることが知られており、これまで主に、ＰＨＡの物性の改良という観点から、このような組成や構造の制御に関する研究がなされてきた。
【０００４】
《１》まず、３-ヒドロキシ酪酸(以下、３ＨＢと略す)をはじめとする比較的簡単な構造のモノマーユニットを重合させたＰＨＡの生合成としては、次のものが挙げられる。
【０００５】
例えば、アルカリゲネス・ユウトロファス Ｈ16株(Ａlcaligenes eutropus Ｈ16、ＡＴＣＣ Ｎo.17699)及びその変異株は、その培養時の炭素源を変化させることによって、３-ヒドロキシ酪酸と３-ヒドロキシ吉草酸との共重合体を様々な組成比で生産することが報告されている(特公平６-15604 号公報、特公平７-14352 号公報、特公平８-19227 号公報など)。
【０００６】
特開平５-74492 号公報では、メチロバクテリウム属(Ｍethylobacteriuｍ sp.)、パラコッカス属(Paracoccus sp.)、アルカリゲネス属(Ａlcaligenes sp.)、シュードモナス属(Pseudoｍonas sp.)の微生物を、炭素数３から７の第一アルコールに接触させることにより、３-ヒドロキシ酪酸と３-ヒドロキシ吉草酸との共重合体を生産させる方法が開示されている。
【０００７】
特開平５-93049号公報及び特開平７-265065号公報では、アエロモナス・キャビエ(Ａeroｍonas caviae)を、オレイン酸やオリーブ油を炭素源として培養することにより、３-ヒドロキシ酪酸と３-ヒドロキシヘキサン酸との２成分共重合体を生産することが開示されている。
【０００８】
特開平９-191893 号公報では、コマモナス・アシドボランス・IＦＯ 13852 株(Ｃoｍaｍonas acidovorans IＦＯ 13852)が、炭素源としてグルコン酸及び１,４-ブタンジオールを用いた培養により、３-ヒドロキシ酪酸と４-ヒドロキシ酪酸とをモノマーユニットに持つポリエステルを生産することが開示されている。
【０００９】
また、近年、炭素数が 12 程度までの中鎖長(ｍediuｍ-chain-length:ｍclと略記)の３-ヒドロキシアルカン酸からなるＰＨＡについての研究が精力的に行なわれている。このようなＰＨＡの合成経路は大きく２つに分類することが可能であり、その具体例を下記(１)および(２)に示す。
(１)β酸化を利用した合成:
特許公報第 2642937 号では、シュードモナス・オレオボランス・ＡＴＣＣ 29347 株(Pseudoｍonas oleovorans ＡＴＣＣ 29347)に、炭素源として非環状脂肪族炭化水素を与えることにより、炭素数が６から 12 までの３-ヒドロキシアルカン酸のモノマーユニットを有するＰＨＡが生産されることが開示されている。また、Ａppl.Ｅnviron.Ｍicrobiol,58(２),746(1992)には、シュードモナス・レジノボランス(Pseudoｍonas resinovorans)が、オクタン酸を単一炭素源として、３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸(量比 1：15：75：9)をモノマーユニットとするポリエステルを生産し、また、ヘキサン酸を単一炭素源として、３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸(量比 8：62：23：7)をユニットとするポリエステルを生産することが報告されている。ここで、原料の脂肪酸よりも鎖長の長い３-ヒドロキシアルカン酸モノマーユニットは(２)で説明する脂肪酸合成経路を経由していると考えられる。
(２)脂肪酸合成経路を利用した合成
Int.J.Ｂiol.Ｍacroｍol.,16(３),119(1994)には、シュードモナスsp.61-３株(Pseudoｍonas sp.61-３ strain)が、グルコン酸ナトリウムを単一炭素源として、３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸、３-ヒドロキシドデカン酸といった３-ヒドロキシアルカン酸および、３-ヒドロキシ-５-cis-デセン酸、３-ヒドロキシ-５-cis-ドデセン酸といった３-ヒドロキシアルケン酸をユニットとするポリエステルを生産することが報告されている。
【００１０】
ところで、通常、ＰＨＡの生合成は、細胞内の様々な代謝経路の中間体として生じる「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＣoＡ」を基質とし、ＰＨＡシンターゼ(ＰＨＡ synthase)により行なわれる。
【００１１】
ここで、「ＣoＡ」とは「補酵素Ａ(coenzyｍe Ａ)」のことである。そして上記(１)の先行技術に記載されている様に、オクタン酸やノナン酸等の脂肪酸を炭素源とした場合、ＰＨＡの生合成は、「β酸化サイクル」中に生じた「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＣoＡ」が出発物質として行なわれるとされている。
【００１２】
以下に、「β酸化サイクル」を経由してＰＨＡが生合成されるまでの反応を示す。
【００１３】
【化 １５】
一方、上記(２)の先行技術に記載されている様に、グルコース等の糖類を基質とし、ＰＨＡを生合成する場合は、「脂肪酸合成経路」中に生じた「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＡＣＰ」から変換された「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＣoＡ」が出発物質として行なわれるとされている。
ここで、「ＡＣＰ」とは「アシルキャリアプロテイン(acyl carrier protein)」のことである。
【００１５】
ところで、先に述べたとおり、上記(１)および(２)で合成されているＰＨＡは、いずれも側鎖にアルキル基を有するモノマーユニットからなるＰＨＡ、即ち、「usual ＰＨＡ」である。
【００１６】
《２》しかし、このような微生物産生ＰＨＡのより広範囲な応用、例えば機能性ポリマーとしての応用を考慮した場合、アルキル基以外の置換基を側鎖に導入したＰＨＡ(「unusual ＰＨＡ」)が極めて有用であることが期待される。置換基の例としては、芳香環を含むもの(フェニル基、フェノキシ基、ベンゾイル基など)や、不飽和炭化水素、エステル基、アリル基、シアノ基、ハロゲン化炭化水素、エポキシドなどが挙げられる。これらの中でも、特に、芳香環を有するＰＨＡの研究が盛んになされている。
【００１７】
(a)フェニル基もしくはその部分置換体を含むもの
Ｍakroｍol.Ｃheｍ.,１９１，1957-1965(1990)及びＭacroｍolecules,２４，5256-5260(1991)には、５-フェニル吉草酸を基質として、シュードモナス オレオボランス(Pseudoｍonas oleovorans)が３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００１８】
具体的には、シュードモナス・オレオボランスが５-フェニル吉草酸とノナン酸とを基質として(モル比２:１、総濃度 10ｍｍol/L)、３-ヒドロキシ吉草酸、３-ヒドロキシヘプタン酸、３-ヒドロキシノナン酸、３-ヒドロキシウンデカン酸、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸をモノマーユニットとして、0.6：16.0：41.1：1.7：40.6 の量比で含むＰＨＡを、培養液１Lあたり 160ｍg(菌体に対する乾燥重量比 31.6％)生産し、また、５-フェニル吉草酸とオクタン酸とを基質として(モル比１:１、総濃度 10ｍｍol/L)、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸をモノマーユニットとして、7.3：64.5：3.9：24.3 の量比で含むＰＨＡを、培養液１Lあたり 200ｍg(菌体に対する乾燥重量比 39.2％)生産することが報告されている。この報告におけるＰＨＡは、ノナン酸やオクタン酸が用いられていることからも主にβ酸化経路を経て合成されているものと考えられる。
【００１９】
関連する記述は、上記の他Ｃhirality,３,492-494(1991)にもあり、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸ユニットが含まれていることに起因すると思われる、ポリマー物性の変化が認められている。
【００２０】
Ｍacroｍolecules,２９，1762-1766(1996)には、５-(４'-トリル)吉草酸を基質として、シュードモナス オレオボランス(Pseudoｍonas oleovorans)が３-ヒドロキシ-５-(４'-トリル)吉草酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００２１】
Ｍacroｍolecules,３２，2889-2895(1999)には、５-(２',４'-ジニトロフェニル)吉草酸を基質として、シュードモナス オレオボランス(Pseudoｍonas oleovorans)が３-ヒドロキシ-５-(２',４'-ジニトロフェニル)吉草酸及び３-ヒドロキシ-５-(４'-ニトロフェニル)吉草酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００２２】
(b)フェノキシ基もしくはその部分置換体を含むもの
Ｍacroｍol.Ｃheｍ.Ｐhys.,１９５，1665-1672(1994)には、11-フェノキシウンデカン酸を基質として、シュードモナス オレオボランス(Pseudoｍonas oleovorans)が３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸と３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸のＰＨＡコポリマーを生産することが報告されている。
【００２３】
また、Ｍacroｍolecules,２９，3432-3435(1996)には、シュードモナス・オレオボランスを用いて、６-フェノキシヘキサン酸から３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸および３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸をユニットとして含むＰＨＡを、８-フェノキシオクタン酸から３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸および３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸をユニットとして含むＰＨＡを、11-フェノキシウンデカン酸から３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸および３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。この報告におけるポリマーの収率を抜粋すると以下のとおりである。
【００２４】
【表１】
特許公報第 2989175号には、３-ヒドロキシ-５-(モノフルオロフェノキシ)ペンタノエート(３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐ)ユニットあるいは３-ヒドロキシ-５-(ジフルオロフェノキシ)ペンタノエート(３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐ)ユニットからなるホモポリマー、少なくとも３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐユニットあるいは３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐユニットを含有するコポリマー；これらのポリマーを合成するシュードモナス・プチダ；シュードモナス属を用いた前記のポリマーの製造法に関する発明が開示されており、 特許第 2989175号公報には、３-ヒドロキシ-５-(モノフルオロフェノキシ)ペンタノエート(３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐ)ユニットあるいは３-ヒドロキシ-５-(ジフルオロフェノキシ)ペンタノエート(３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐ)ユニットからなるホモポリマー、少なくとも３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐユニットあるいは３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐユニットを含有するコポリマー；これらのポリマーを合成するシュードモナス・プチダ；シュードモナス属を用いた前記のポリマーの製造法に関する発明が開示されている。
【００２６】
これらの生産は以下の様な「二段階培養」で行なわれている。
培養時間: 一段目、24時間 ； 二段目、96時間
各段における基質と得られるポリマーを以下に示す。
(１)得られるポリマー:３-ヒドロキシ-５-(モノフルオロフェノキシ)ペンタノエートホモポリマー
一段目の基質:クエン酸、イーストエキス
二段目の基質:モノフルオロフェノキシウンデカン酸
(２)得られるポリマー:３-ヒドロキシ-５-(ジフルオロフェノキシ)ペンタノエートホモポリマー
一段目の基質:クエン酸、イーストエキス
二段目の基質:ジフルオロフェノキシウンデカン酸
(３)得られるポリマー: ３-ヒドロキシ-５-(モノフルオロフェノキシ)ペンタノエートコポリマー
一段目の基質:オクタン酸あるいはノナン酸、イーストエキス
二段目の基質:モノフルオロフェノキシウンデカン酸
(４)得られるポリマー: ３-ヒドロキシ-５-(ジフルオロフェノキシ)ペンタノエートコポリマー
一段目の基質:オクタン酸あるいはノナン酸、イーストエキス
二段目の基質:ジフルオロフェノキシウンデカン酸
その効果としては、置換基をもつ中鎖脂肪酸を資化して、側鎖末端が１から２個のフッ素原子で置換されたフェノキシ基を有するポリマーを合成することができ、融点が高く良い加工性を保ちながら、立体規則性、撥水性を与えることができるとしている。
【００２７】
この様なフッ素基置換体以外に、シアノ基やニトロ基の置換体の研究もなされている。
【００２８】
Ｃan.J.Ｍicrobiol.,４１，32-43(1995)及び Ｐolyｍer International,３９，205-213(1996)には、シュードモナス オレオボランス(Pseudoｍonas oleovorans)ＡＴＣＣ 29347株及びシュードモナス プチダ(Pseudoｍonas putida)ＫＴ 2442株を用いて、オクタン酸とp-シアノフェノキシヘキサン酸或いはp-ニトロフェノキシヘキサン酸を基質として、３-ヒドロキシ-p-シアノフェノキシヘキサン酸或いは３-ヒドロキシ-p-ニトロフェノキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡの生産が報告されている。
【００２９】
これらの報告は側鎖がアルキル基である一般的なＰＨＡとは異なり、いずれもＰＨＡの側鎖に芳香環を有しており、それに由来する物性を有するポリマーを得る上で有益である。
【００３０】
(c)シクロヘキシル基をモノマーユニット中に含むＰＨＡは、通常の脂肪族ヒドロキシアルカン酸をユニットとして含むＰＨＡとは異なる高分子物性を示すことが期待されており、シュードモナス・オレオボランスによる生産の例が報告されている(Ｍacroｍolecules,30,1611-1615(1997))。
【００３１】
この報告によれば、シュードモナス・オレオボランスを、ノナン酸とシクロヘキシル酪酸あるいはシクロヘキシル吉草酸の共存する培地中で培養すると、シクロヘキシル基を含むユニットと、ノナン酸由来のユニットを含むＰＨＡが得られている(各割合は不明)。
【００３２】
その収率等に関しては、シクロヘキシル酪酸に対して、基質濃度トータル 20 ｍｍol/Lの条件で、シクロヘキシル酪酸とノナン酸の量比を変化させ、表２に示すような結果を得たと報告されている。
【００３３】
【表２】
ＣＤＷ:乾燥菌体重量(ｍg/L)、ＰＤＷ:乾燥ポリマー重量(ｍg/L)、収率:ＰＤＷ/ＣＤＷ(％)
しかしながら、この例では、培養液当たりのポリマー収率は十分なものではなく、また、得られたＰＨＡ自体も、そのモノマーユニット中にはノナン酸由来の脂肪族ヒドロキシアルカン酸が混在しているものである。
【００３５】
《３》また新たなカテゴリーとして、単に物性の変化に留まらず、側鎖に適当な官能基を有するＰＨＡを生産し、その官能基を利用して新たな機能を生み出そうとする研究も行なわれている。
【００３６】
例えばＭacroｍolecules,３１，1480-1486(1996)及び、Journal of ＰolyｍerＳcience:Part Ａ:Ｐolyｍer Ｃheｍistry,３６，2381-2387(1998)などでは、側鎖の末端にビニル基を持つユニットを含むＰＨＡを合成した後、酸化剤によりエポキシ化し、側鎖末端に反応性の高いエポキシ基を含むＰＨＡを合成出来たと報告されている。
【００３７】
またビニル基以外にも、高い反応性が期待されるスルフィドを持つユニットを含むＰＨＡの合成例として、Ｍacroｍolecules,３２，8315-8318(1999)においては、シュードモナス プチダ(Pseudoｍonas putida)27Ｎ01株が 11-フェニルスルファニル吉草酸を基質とし、３-ヒドロキシ-５-(フェニルスルファニル)吉草酸及び３-ヒドロキシ-７-(フェニルスルファニル)ヘプタン酸のＰＨＡコポリマーを生産することが報告されている。
【００３８】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、微生物産生ＰＨＡにおいては、その製造に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等を変えることにより、各種の組成・構造のものが得られているが、プラスチックとしての応用を考えた場合、物性的に未だ十分であるとは言えない。微生物産生ＰＨＡの利用範囲をさらに拡大していくためには、物性の改良をより幅広く検討していくことが重要であり、そのためにはさらに多様な構造のモノマーユニットを含むＰＨＡと、その製造方法、ならびに所望のＰＨＡを効率的に生産しうる微生物の開発、探索が必須である。
【００３９】
一方、前述のような、置換基を側鎖に導入したタイプのＰＨＡ(unusual ＰＨＡ)は、導入した置換基を所望とする特性等に応じて選択することで、導入した置換基の特性等に起因する、極めて有用な機能や特性を具備した「機能性ポリマー」としての展開も期待でき、そのような機能性と生分解性とを両立可能であるような優れたＰＨＡと、その製造方法、ならびに、所望のＰＨＡを効率的に生産しうる微生物の開発、探索もまた重要な課題である。
【００４０】
すなわち、様々な置換基を側鎖に導入したＰＨＡを微生物により生産しようとする場合、先に挙げたシュードモナス・オレオボランスの報告例等に見られるように、導入しようとする置換基を有するアルカノエートを、ポリマー原料としての利用に加えて増殖用炭素源としても利用する方法が用いられている。
【００４１】
しかしながら、導入しようとする置換基を有するアルカノエートを、ポリマー原料としての利用に加えて増殖用炭素源としても利用する方法は、当該アルカノエートからのβ酸化によるアセチルＣoＡの生成に基づくエネルギー源の供給が期待されており、このような方法においては、ある程度の鎖長を有する基質でないとβ酸化によりアセチルＣoＡを生成することができず、このためＰＨＡの基質として用いうるアルカノエートが限定されてしまう点が大きな課題である。また、一般的に、β酸化により鎖長がメチレン鎖２つ分ずつ短くなった基質が新たに生成し、これらがＰＨＡのモノマーユニットとして取り込まれるため、合成されるＰＨＡは鎖長がメチレン鎖２つ分ずつ異なるモノマーユニットからなる共重合体となることが多い。前述の報告例では、基質である８-フェノキシオクタン酸由来の３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸と、代謝産物由来の副生物である３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸及び３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸の３種類のモノマーユニットからなる共重合体が生産される。この点で、単一のモノマーユニットからなるＰＨＡを得ようとする場合、この方法を用いることは極めて難しい。さらに、β酸化によるアセチルＣoＡの生成に基づいたエネルギー源の供給を前提とした方法では、微生物の増殖が遅く、ＰＨＡの合成に時間がかかる点、合成されたＰＨＡの収率が低くなりがちな点も大きな課題である。
【００４２】
このため、導入しようとする置換基を有するアルカノエートに加えて、増殖用炭素源として、オクタン酸やノナン酸といった中鎖の脂肪酸等を共存させた培地で微生物を培養したのち、ＰＨＡを抽出する方法が有効と考えられ、一般的に用いられている。
【００４３】
しかしながら、本発明者らの検討によれば、上記のようにオクタン酸やノナン酸といった中鎖の脂肪酸等を増殖用炭素源とし、β酸化経路を経て合成されたＰＨＡは、その純度が低く、得られるポリマーの 50％以上が、増殖用炭素源に由来するモノマーユニット(例えば、３-ヒドロキシオクタン酸や３-ヒドロキシノナン酸等)である、ｍclの３-ヒドロキシアルカン酸モノマーユニット(以下、ｍcl-３ＨＡと略す場合がある)、すなわち「usual ＰＨＡ」のユニットである。これらのｍcl-３ＨＡユニットは、単独の組成においては常温で粘着性のポリマーであり、本発明の目的とするＰＨＡに多量に混在した場合、ポリマーのガラス転移温度(Ｔg)を著しく降下させる。このため、常温で硬いポリマー物性を得ようとする場合、ｍcl-３ＨＡモノマーユニットの混在は望ましくない。また、このようなヘテロな側鎖構造は分子内あるいは分子間での側鎖構造に由来する相互作用を妨害し、結晶性あるいは配向性に大きな影響を与えることが知られている。
【００４４】
ポリマー物性の向上、機能性の付与を達成するにあたり、これらのｍcl-３ＨＡモノマーユニットの混在は大きな課題である。この課題の解決手段としては、特定の置換基を有するモノマーユニットのみで構成されたＰＨＡを取得するために、増殖用炭素源由来のｍcl-３ＨＡモノマーユニット等の「目的外」のモノマーユニットを分離/除去するための精製工程を設けることが挙げられる。しかしながら、操作が煩雑となる上、収率の大幅な低下も避けられない点が課題となる。
【００４５】
さらに大きな問題点は、目的のモノマーユニットと目的外のモノマーユニットとが共重合体を形成している場合、目的外のモノマーユニットのみを除去するのは極めて困難な点である。特に、不飽和炭化水素から得られる基、エステル基、アリル基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン化炭化水素から得られる基、エポキシド等が導入された基を側鎖構造として有するようなモノマーユニットを含むＰＨＡの合成を目的とする場合、ｍcl-３ＨＡモノマーユニットは目的のモノマーユニットと共重合体を形成する場合が多く、ＰＨＡ合成後のｍcl-３ＨＡモノマーユニット除去は極めて困難である。
【００４６】
このため、本発明者らは、機能性ポリマーへの応用を考慮した場合、「unusual ＰＨＡ」を高純度で得られる生合成方法の開発が是非とも必要であるとの認識を持つに至った。よって、前記のような機能性と生分解性とを兼ね備えた優れたポリマーと、当該ポリマーを生産し菌体内に蓄積し得る微生物、並びに、当該ＰＨＡを高純度で効率的に生合成する方法の開発は極めて有用かつ重要であると考えられた。
【００４７】
本発明は前記の課題を解決するものであり、デバイス材料や医用材料等として有用な置換基を側鎖に有する多様な構造のモノマーユニットを含むＰＨＡ(unusual ＰＨＡ)の提供、ならびに、当該「unusual ＰＨＡ」を微生物を利用して製造する方法の提供、特には、目的外のモノマーユニットの混在が少なく、目的とする「unusual ＰＨＡ」を高純度で得ることができ、しかも高収率な製造方法を提供することにある。
【００４８】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者らは、デバイス材料や医用材料等として有用な官能基を側鎖に有するＰＨＡの開発を目指して、各種のＰＨＡを生産し菌体内に蓄積する能力を有する微生物の探索、及び、このような微生物を用いた所望のＰＨＡの生産方法について鋭意研究を重ねてきた。その結果、化学式[７]、
【００４９】
【化 １６】
(ただし、式中nは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒはハロゲン原子,-ＣＮ,-ＮＯ2,-ＣＨ3,-Ｃ2Ｈ5,-Ｃ3Ｈ7,-ＣＦ3,-Ｃ2Ｆ5,-Ｃ3Ｆ7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
で表される置換ベンゾイルアルカン酸を原料として、化学式[８]、
【００５１】
【化 １７】
(ただし、式中ｍはn,n-２,n-４,n-６からなる群より選択される少なくとも１つ以上でありかつ１以上の整数を表し、nは前記化学式[７]中のnと対応する１から８の整数のいずれかを表し、Ｒは前記化学式[７]中のＲと対応するハロゲン原子,-ＣＮ,-ＮＯ2,-ＣＨ3,-Ｃ2Ｈ5,-Ｃ3Ｈ7,-ＣＦ3,-Ｃ2Ｆ5,-Ｃ3Ｆ7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
で表される３-ヒドロキシ置換ベンゾイルアルカン酸ユニットを含む新規なＰＨＡを生産し菌体内に蓄積する能力を有する微生物を見出し、さらに、これら微生物を前記化学式[７]で表される置換ベンゾイルアルカン酸と、糖類,ＴＣＡサイクルに関与する有機酸,酵母エキスまたはポリペプトンの共存下で培養することにより、当該ＰＨＡを生合成することができること、それによって得られる当該ＰＨＡが比較的高純度であることを見出した。
【００５３】
詳しくは、例えば、化学式[９]、
【００５４】
【化 １８】
(ただし、式中Ｒはハロゲン原子,-ＣＮ,-ＮＯ2,-ＣＨ3,-Ｃ2Ｈ5,-Ｃ3Ｈ7,-ＣＦ3,-Ｃ2Ｆ5,-Ｃ3Ｆ7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
で表される置換ベンゾイル吉草酸を原料として、化学式[５]、
【００５６】
【化 １９】
(ただし、式中Ｒは前記化学式[９]中のＲと対応するハロゲン原子,-ＣＮ,-ＮＯ2,-ＣＨ3,-Ｃ2Ｈ5,-Ｃ3Ｈ7,-ＣＦ3,-Ｃ2Ｆ5,-Ｃ3Ｆ7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
で表される３-ヒドロキシ置換ベンゾイル吉草酸ユニットを含む新規なＰＨＡを生産し菌体内に蓄積する能力を有する微生物を見出し、さらに、これら微生物を前記化学式[９]で表される置換ベンゾイル吉草酸と、糖類,ＴＣＡサイクルに関与する有機酸,酵母エキスまたはポリペプトンの共存下で培養することにより、当該ＰＨＡを生合成することができること、それによって得られる当該ＰＨＡが比較的高純度であることを見出した。
さらに詳しくは、例えば、化学式[10]、
【００５８】
【化 ２０】
で表される５-(４-フルオロベンゾイル)吉草酸(以下、ＦＢzＶＡと略す)を原料として、化学式[６]、
【００６０】
【化 ２１】
で表される３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロベンゾイル)吉草酸ユニット(以下、３ＨＦＢzＶと略す場合がある)を含む新規なＰＨＡを生産し菌体内に蓄積する能力を有する微生物を見出し、さらに、これら微生物を置換ベンゾイルアルカン酸と、糖類,ＴＣＡサイクルに関与する有機酸,酵母エキスまたはポリペプトンとの共存下で培養することにより、当該ＰＨＡを生合成することができること、それによって得られる当該ＰＨＡが比較的高純度であることを見出し、本発明を為すに至った。
【００６２】
すなわち、本発明は、化学式[２]、
【００６３】
【化 ２２】
(ただし、式中nは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒはハロゲン原子,-ＣＮ,-ＮＯ2,-ＣＨ3,-Ｃ2Ｈ5,-Ｃ3Ｈ7,-ＣＦ3,-Ｃ2Ｆ5,-Ｃ3Ｆ7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
で表される３-ヒドロキシ置換ベンゾイルアルカン酸ユニットをモノマーユニットとして含むＰＨＡに関するものである。
なお、本発明のＰＨＡでは、目的とするモノマーユニットである前記化学式[２]で示されるもの以外のモノマーユニットは、すべて下記化学式[３]または下記化学式[４]で表されるモノマーユニットから選択される少なくとも１つ以上である。
【化３１】
【化３２】
本発明のＰＨＡにおいては前記化学式[２]で示されるモノマーユニットの割合は0.01以上１以下である。
さらに好ましくは本発明のＰＨＡは、前記化学式[２]で示されるモノマーユニットの一部として、下記化学式[５]で示されるモノマーユニットを含む。
【化３３】
また、本発明は、これらのＰＨＡの製造方法であって、置換ベンゾイルアルカン酸を利用して該組成を有するポリヒドロキシアルカノエートを合成し得る微生物である、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株(Pseudoｍonas cichorii Ｈ45、ＦＥＲＭ ＢＰ-7374)、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株(Pseudoｍonas cichorii ＹＮ２、ＦＥＲＭ ＢＰ-7375)、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株(Pseudoｍonas jessenii Ｐ161、ＦＥＲＭ ＢＰ -7376)からなる群から選択される少なくとも１つの株を、該置換ベンゾイルアルカン酸を含む培地で培養する工程と、
前記微生物が産生したポリヒドロキシアルカノエートを単離する工程とを有することを特徴とする。
好ましくは、化学式[７]、
【００６５】
【化 ２３】
(ただし、式中nは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒはハロゲン原子,-ＣＮ,-ＮＯ2,-ＣＨ3,-Ｃ2Ｈ5,-Ｃ3Ｈ7,-ＣＦ3,-Ｃ2Ｆ5,-Ｃ3Ｆ7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
で表される置換ベンゾイルアルカン酸を含む培地で微生物を培養することで、該微生物に、下記化学式[８]、
【００６７】
【化 ２４】
(ただし、式中ｍはn,n-２,n-４,n-６からなる群より選択される少なくとも１つ以上でありかつ１以上の整数を表し、nは前記化学式[７]中のnと対応する１から８の整数のいずれかを表し、Ｒは前記化学式[７]中のＲと対応するハロゲン原子,-ＣＮ,-ＮＯ2,-ＣＨ3,-Ｃ2Ｈ5,-Ｃ3Ｈ7,-ＣＦ3,-Ｃ2Ｆ5,-Ｃ3Ｆ7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
で表される、対応する３-ヒドロキシ置換ベンゾイルアルカン酸ユニットを有するＰＨＡを産生させる工程を有することを特徴とする。
【００６９】
すなわち、本発明のＰＨＡの製造方法は、３-ヒドロキシ置換ベンゾイルアルカン酸ユニットを含むＰＨＡを生産する微生物を、置換ベンゾイルアルカン酸と、糖類,ＴＣＡサイクルに関与する有機酸,酵母エキスまたはポリペプトンとの共存下で培養する工程を有することを特徴とする。
【００７０】
【発明の実施の形態】
本発明のＰＨＡは、デバイス材料や撥水性材料、医用材料等として有用な置換基を側鎖に有する多様な構造のモノマーユニットを含むＰＨＡであり、より具体的には、置換ベンゾイル基を側鎖に有するＰＨＡである。また、本発明のＰＨＡの製造方法は、微生物を利用して高純度かつ高収率に所望のＰＨＡを製造することを可能とするものである。なお、本発明のＰＨＡは、一般にＲ体のみから構成される、アイソタクチックなポリマーである。
【００７１】
＜糖類ならびにＴＣＡサイクルに関与する有機酸 従来技術との差異＞
本発明のＰＨＡ製造方法の１つは、微生物を培養する際、培地に所望とするモノマーユニット導入用のアルカン酸に加えて、当該アルカン酸以外の炭素源として、糖類あるいはＴＣＡサイクルに関与する有機酸を添加することで、微生物が産生・蓄積するＰＨＡにおいて、目的とするモノマーユニットの含有率を著しく高いものとする、あるいは目的とするモノマーユニットのみとする点を特徴としている。この特定のモノマーユニットの優先化を促進する効果は、培地中に当該アルカン酸以外の炭素源として、糖類あるいはＴＣＡサイクルに関与する有機酸のみを添加することにより得られている。
【００７２】
すなわち、発明者らは、糖類あるいはＴＣＡサイクルに関与する有機酸を共存基質として、所望とするモノマーユニット導入用のアルカン酸と共に培養せしめたところ、ノナン酸やオクタン酸といったｍcl-アルカン酸を共存基質として用いた従来の方法に比べ、目的とするＰＨＡが格段に優れた収率および純度で得られること、そしてこのような効果が、微生物の炭素源ならびにエネルギー源であるアセチルＣoＡをβ酸化に拠らない方法により生成することが可能な培養方法であることにより得られるものであるとの知見を得て本発明に至ったものである。
【００７３】
本発明の方法においては、糖類化合物、例えばグルコースやフルクトース,マンノース等は、微生物の増殖基質として利用されることになり、生産されるＰＨＡは、糖類に共存させている所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートから構成され、グルコース等の糖類に由来するモノマーユニットが全く含まれないか、極めて少量しか含まれない。このような点で、本発明の方法は、従来のグルコースなどの糖類そのものをＰＨＡに導入するモノマーユニットの原料基質として用いるＰＨＡ微生物生産方法とは構成及び効果ともに根本的に異なるものである。
【００７４】
＜酵母エキス 従来技術との差異＞
本発明のＰＨＡ製造方法の１つは、微生物を培養する際、培地に所望とするモノマーユニット導入用のアルカン酸に加えて、当該アルカン酸以外の炭素源として酵母エキスのみを添加することで、微生物が産生・蓄積するＰＨＡにおいて、目的とするモノマーユニットの含有率を著しく高いものとする、あるいは目的とするモノマーユニットのみとする点を特徴としている。この特定のモノマーユニットの優先化を促進する効果は、培地中に当該アルカン酸以外の炭素源として酵母エキスのみを添加することにより得られている。
【００７５】
微生物によるＰＨＡの製造に際して、培地に酵母エキスを利用する例として、特開平５-49487 号公報に記載の、ロドバクター属(Ｒhodobacter sp.)に属する微生物を用いた方法が挙げられる。しかしながら、この従来法は、置換基を有しないヒドロキシアルカノエートをモノマーユニットとする、一般的なＰＨＢおよびポリ-３-ヒドロキシ吉草酸(以下、ＰＨＶと略す場合もある)を製造する方法である。本発明が目的とするようなＰＨＡの合成経路は、ＰＨＢおよびＰＨＶを生産する合成経路とは独立した経路であることが知られており、特開平５-49487 号公報においては本発明が目的とするようなＰＨＡの合成経路における酵母エキスの効果については何ら言及がない。また、酵母エキスの効果も、微生物が一般的に生産するＰＨＡやＰＨＶに関して、酵母エキスを添加すると、単に菌体内のＰＨＡ蓄積量の増大が図られる効果があることを示すのみであり、増殖のために酵母エキスが添加されている訳ではないことが明記されている。
【００７６】
本発明は置換ベンゾイルアルカン酸と酵母エキスとを共存させることにより、増殖とともにＰＨＡの生産・蓄積を行なうものであり、酵母エキスの発揮する効果が全く異なる。さらに本発明の効果である、特定のモノマーユニットの優占化について何ら言及されておらず、本発明のように、微生物が生産するＰＨＡ組成における、置換ベンゾイル基を置換基として有する特定のモノマーユニットの優占化という効果は示されていない。
【００７７】
さらに、微生物によるＰＨＡの生産に酵母エキスを利用する例としては、特許第 2989175号公報に記載のシュードモナス・プチダ(Pseudoｍonas putida)を用いた方法が挙げられる。ここで開示されているＰＨＡの製造方法は２段階培養によるもののみであり、ＰＨＡの蓄積は２段階目の培養においてのみ、炭素源以外の栄養源の制限下で行なうことが開示されている。この点で、本発明における、置換ベンゾイルアルカン酸と酵母エキスとを含む培地での１段階培養のみで、所望のＰＨＡを合成・蓄積させる方法とは構成/効果ともに全く異なる。
【００７８】
また、特許第 2989175号公報における酵母エキスの効果は、２段階培養を用いる際、１段階目の培養において、単に２段階目の培養に用いる微生物の増殖のみを目的としたものであり、１段階目は栄養源の豊富な条件下で培養されると明記されている。ここで、ＰＨＡの基質は１段階目には共存していない。本発明における酵母エキスの効果は、置換ベンゾイルアルカン酸と酵母エキスとを共存させることにより、増殖とともにＰＨＡの生産・蓄積を行なうものであり、酵母エキスの発揮する効果が全く異なる。
【００７９】
また、特許第 2989175号公報では、１段階目の培養に、炭素源としてクエン酸、オクタン酸、ノナン酸のいずれかが共存しており、置換ベンゾイルアルカン酸と酵母エキスのみを共存させる本発明とは、構成においても異なるものである。
【００８０】
＜ポリペプトン 従来技術との差異＞
本発明のＰＨＡ製造方法の１つは、微生物を培養する際、培地に所望とするモノマーユニット導入用のアルカン酸に加えて、当該アルカン酸以外の炭素源としてポリペプトンのみを添加することで、微生物が産生・蓄積するＰＨＡにおいて、目的とするモノマーユニットの含有率を著しく高いものとする、あるいは目的とするモノマーユニットのみとする点を特徴としている。この特定のモノマーユニットの優先化を促進する効果は、培地中に当該アルカン酸以外の炭素源として、ポリペプトンのみを添加することにより得られている。
【００８１】
なお、微生物によるＰＨＡの生産にポリペプトンを利用する例として、特開平５-49487号公報、特開平５-64591号公報、特開平５-214081号公報、特開平６-145311号公報、特開平６-284892号公報、特開平７-48438公報、特開平８-89264号公報、特開平９-191893号公報、特開平 11-32789号公報等に、ＰＨＡを微生物に生産させる際に、培地中にポリペプトンを含有させていることが開示されているが、いずれも前培養、つまり、菌体を単に増殖させる段階で用いており、前培養時にＰＨＡのモノマーユニットとなる基質は含まれていない。また、菌体にＰＨＡを生産させる工程でポリペプトンを用いた例はない。
【００８２】
これに対して、本発明は所望のモノマーユニット導入用のアルカン酸と、当該アルカン酸以外の炭素源として、ポリペプトンのみを共存させることにより、増殖とともにＰＨＡの生産・蓄積を行なうものであり、従来のポリペプトンを利用した例とは構成および効果が全く異なる。さらに本発明の効果である、特定のモノマーユニットの優占化について何ら言及されておらず、本発明のように、微生物が生産するＰＨＡ組成における、置換ベンゾイル基を置換基として有する特定のモノマーユニットの優占化という効果は示されていない。
【００８３】
以下に、本発明において利用される微生物、培養工程などについて説明する。
【００８４】
＜ＰＨＡモノマーユニット供給系＞
先ず、目的とするＰＨＡに混在してくるｍcl-３ＨＡモノマーユニットの供給系の１つである「脂肪酸合成経路」について詳細に説明する。
【００８５】
グルコース等の糖類を基質とした場合、細胞成分として必要なアルカン酸は、糖類から「解糖系」を経て生産されるアセチルＣoＡを出発物質とした「脂肪酸合成経路」から生合成される。なお、脂肪酸合成には新規(de novo)合成経路と炭素鎖延長経路があり、以下にこれらについて説明する。
【００８６】
(１)新規(de novo)合成経路
アセチルＣoＡカルボキシラーゼ(ＥＣ 6.4.1.2)と脂肪酸合成酵素(ＥＣ 2.3.1.85)の２つの酵素で触媒される。なお、アセチルＣoＡカルボキシラーゼは、ビオチンを介在し、最終的に以下の反応を触媒し、アセチルＣoＡからマロニルＣoＡを生成する酵素であり、反応は下記式で表わされる。
アセチルCoA+ATP+HCO3 -⇔マロニルCoA+ADP+Pi
また、脂肪酸合成酵素は、転移-縮合-還元-脱水-還元の反応サイクルを触媒する酵素であり、全反応は次の反応式で示される。
アセチルCoA+nマロニルCoA+2nNADPH+2nH+ ⇒ CH3(CH2)2nCOOH+nCO2+2nNADP++(n-1)CoA
なお、酵素の種類によって、反応産物が遊離酸、ＣoＡ誘導体、あるいはＡＣＰ誘導体の場合がある。ここで、アセチルＣoＡは以下の化学式で示され、
【００８７】
【化 ２５】
マロニルＣoＡは以下の化学式で示される。
【００８９】
【化 ２６】
また、ＣoＡとは補酵素Ａ(coenzyｍe Ａ)の略称であり、以下の化学式で示される。
【００９１】
【化 ２７】
本反応経路のうち、以下に示す経路により、ＰＨＡ生合成のモノマー基質となる「Ｄ-３-ヒドロキシアシルＡＣＰ」が中間体として供給される。また、以下の反応式に示すように経路は炭素を２個ずつ付加しながら最終的にはパルミチン酸まで延長される。それゆえＰＨＡ生合成のモノマー基質としては「Ｄ-３-ヒドロブチリルＡＣＰ」から「Ｄ-３-ヒドロキシパルミチルＡＣＰ」の炭素数が偶数の７種類の「Ｄ-３-ヒドロキシアシルＡＣＰ」が供給されることになる。
【００９３】
【化 ２８】
(２)炭素鎖延長経路
この経路は、アシルＡＣＰにマロニルＡＣＰが付加し、最終的に炭素鎖が２つ延長されたアシルＡＣＰ(及びＣＯ2)となる経路(経路Ａとする)と、アシルＣoＡにアセチルＣoＡが付加し、最終的に炭素鎖が２つ延長されたアシルＣoＡとなる経路(経路Ｂとする)の２経路に大別される。以下に各経路について説明する。
R-CO-CoA+アセチル-CoA→R-CO-CH2-CO-CoA
R-CO-CH2-CO-CoA→R-CHOH-CH2-CO-CoA→
R-CH=CH-CO-CoA→R-CH2-CH2-CO-CoA
Ａ、Ｂいずれの系も、中間体として「Ｄ-３-ヒドロキシアシルＣoＡ」あるいは「Ｄ-３-ヒドロキシアシルＡＣＰ」が生じ、「Ｄ-３-ヒドロキシアシルＣoＡ」はそのままＰＨＡ合成のモノマー基質として利用され、「Ｄ-３-ヒドロキシアシルＡＣＰ」はＡＣＰ-ＣoＡ転移酵素により「Ｄ-３-ヒドロキシアシルＣoＡ」に変換された後に、ＰＨＡ合成のモノマー基質として利用されると考えられる。
【００９５】
グルコース等の糖類を基質とした場合、微生物細胞中では以上のような「解糖系」及び「脂肪酸合成経路」を経由してｍcl-３ＨＡモノマーユニットが生成されると考えられる。また、ＴＣＡサイクルに関与する有機酸を基質とした場合、ピルビン酸からはピルビン酸デヒドロゲナーゼにより直接アセチルＣoＡが生成する。オキサロ酢酸からはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼによりホスホエノールピルビン酸がピルビン酸キナーゼにより触媒されてピルビン酸が生成し、さらに上記反応によりアセチルＣoＡが生成する。これらの反応により生成したアセチルＣoＡが「脂肪酸合成経路」を経由してｍcl-３ＨＡモノマーユニットが生成されると考えられる。
【００９６】
ここで、例えばオクタン酸、ノナン酸等のｍcl-アルカン酸、あるいは、例えば、５-フェニル吉草酸、４-フェノキシ酪酸、４-シクロヘキシル酪酸といった、末端に直鎖脂肪族アルキル以外の官能基が付加されたアルカン酸はＣoＡリガーゼ(ＥＣ 6.2.1.3等)によりＣoＡ誘導体となり、β酸化系を担う酵素群により直接的にＰＨＡ生合成のモノマー基質となる「Ｄ-３-ヒドロキシアシルＣoＡ」となると考えられる。
【００９７】
つまり、糖類あるいはＴＣＡサイクルに関与する有機酸から生成するｍcl-３ＨＡモノマーユニットが、きわめて多段階の酵素反応を経て(つまり間接的に)生成されるのに比較し、ｍcl-アルカン酸からはきわめて直接的にｍcl-３ＨＡモノマーユニットが生成されてくることになる。
【００９８】
ここで、微生物の増殖を担うアセチルＣoＡの生成について説明する。目的とするモノマーユニット導入用のアルカン酸に加えてｍcl-アルカン酸を共存させる方法では、これらのアルカン酸がβ酸化系を経由することによりアセチルＣoＡが生成する。一般に、バルキーな置換基を有するアルカン酸(フェニル基、フェノキシ基、シクロヘキシル基等の置換基を有するアルカン酸)に比較し、ｍcl-アルカン酸はβ酸化系の酵素群との基質親和性に優れていると考えられ、ｍcl-アルカン酸の共存により効果的にアセチルＣoＡが生成される。このため、アセチルＣoＡをエネルギー源及び炭素源として用いる微生物の増殖には有利となる。
【００９９】
しかしながら、β酸化系を経由するｍcl-アルカン酸が直接的にＰＨＡのモノマーユニットとなるために、生産されるＰＨＡは、目的のモノマーユニットに加えてｍcl-３ＨＡモノマーユニットの混在が多いものとなってしまうことが大きな課題である。
【０１００】
この課題を解決するためには、ｍcl-アルカン酸以外で、効果的にアセチルＣoＡあるいはエネルギー源及び炭素源を供給し得るような基質を選択し、目的とするアルカン酸と共存させる方法が望ましい。前述のように、アセチルＣoＡは脂肪酸合成経路を経ることによりＰＨＡのモノマーユニットとなり得るが、ｍcl-アルカン酸に比較すればより多段階の反応を経由する必要がある間接的なものであり、また、アセチルＣoＡを生成し得るような基質の濃度等、培養条件を適宜選択することにより、実質的にはｍcl-３ＨＡの混在のない、あるいは少ない製造方法の実現が可能である。
【０１０１】
また、１段階目で微生物の増殖のみを目的に培養し、２段階目においては炭素源として目的とするアルカン酸のみを培地に加える製造方法が汎用されている。ここで、当該アルカン酸をアシルＣoＡ化するβ酸化系の初発酵素であるアシルＣoＡリガーゼがＡＴＰを要求することから、発明者らの検討によれば２段階目においても微生物がエネルギー源として利用し得る基質を共存させる製造方法がより効果的であるとの結果を得て、本発明を完成した。
【０１０２】
本発明の方法におけるアセチルＣoＡあるいはエネルギー源および炭素源を効果的に供給し得る基質としては、グリセロアルデヒド,エリスロール,アラビノース,キシロース,グルコース,ガラクトース,マンノース,フルクトースといったアルドース、グリセロール,エリスリトール,キシリトール等のアルジトール、グルコン酸等のアルドン酸,グルクロン酸やガラクツロン酸等のウロン酸、マルトース,スクロース,ラクトースといった二糖等の糖類のほか、乳酸,ピルビン酸,リンゴ酸,クエン酸,コハク酸,フマル酸及びその塩等のＴＣＡサイクルに関与する有機酸、さらには酵母エキス,ポリペプトン,肉エキス,カザミノ酸などの天然物由来の培地成分など、β酸化系を経ずにアセチルＣoＡあるいはエネルギー源および炭素源を供給し得る化合物であれば、いかなる化合物でも用いることができ、用いる菌株に対する基質としての有用性で適宜選択することができる。また、ｍcl-３ＨＡの混入の少ない組み合わせであれば、複数の化合物を選択して用いることも可能である。
【０１０３】
＜微生物＞
本発明に用いる微生物としては、前記の置換ベンゾイルアルカン酸を原料とし、前記の３-ヒドロキシ置換ベンゾイルアルカン酸ユニットを含むＰＨＡを産生可能であれば、いかなる微生物をも使用することができる。また、本発明の目的を達成できる範囲内で、必要に応じて複数の微生物を混合して用いることもできる。
【０１０４】
本発明者らは、ＦＢzＶＡ等を基質として用いて、前記の３ＨＦＢzＶ等をモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産し菌体内に蓄積する能力を有する微生物の探索を行なった。その結果、本発明者らが土壌より分離した微生物であり、ＰＨＡの生産能力を有する、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株(Pseudoｍonas cichorii Ｈ45)、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株(Pseudoｍonas cichoriiＹＮ２)、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株(Pseudoｍonas jessenii Ｐ161)等が所望の能力を有することを見出した。なお、Ｈ45株は寄託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ-7374」として、ＹＮ２株は寄託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ-7375」として、Ｐ161株は寄託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ-7376」として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（旧経済産業省生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センター）にそれぞれ寄託されている。
【０１０５】
前記のＨ45株、ＹＮ２株およびＰ161株の菌学的性質を列挙すれば以下の通りである。また、Ｐ161株については、16srＲＮＡの塩基配列を配列番号:１に示す。
＜Ｈ45株の菌学的性質＞
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
Ｏ/Ｆ試験 :酸化型
硝酸塩の還元 :陰性
インドールの生成 :陰性
ブドウ糖酸性化 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陰性
ウレアーゼ :陰性
エスクリン加水分解 :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β-ガラクトシダーゼ :陰性
Ｋing'sＢ寒天での蛍光色素産生:陽性
４％ＮaＣlでの生育 :陰性
ポリ-β-ヒドロキシ酪酸の蓄積 :陰性
(３)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
Ｌ-アラビノース :陰性
Ｄ-マンノース :陽性
Ｄ-マンニトール :陽性
Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陽性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n-カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl-リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性
＜ＹＮ２株の菌学的性質＞
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
Ｏ/Ｆ試験 :酸化型
硝酸塩の還元 :陰性
インドールの生成 :陽性
ブドウ糖酸性化 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陰性
ウレアーゼ :陰性
エスクリン加水分解 :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β-ガラクトシダーゼ :陰性
Ｋing'sＢ寒天での蛍光色素産生:陽性
４％ＮaＣlでの生育 :陽性(弱い生育)
ポリ-β-ヒドロキシ酪酸の蓄積 :陰性
Ｔｗeen 80 の加水分解 :陽性
(３)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
Ｌ-アラビノース :陽性
Ｄ-マンノース :陰性
Ｄ-マンニトール :陰性
Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陰性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n-カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl-リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性
＜Ｐ161株の菌学的性質＞
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
Ｏ/Ｆ試験 :酸化型
硝酸塩の還元 :陽性
インドールの生成 :陰性
ブドウ糖酸性化 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陽性
ウレアーゼ :陰性
エスクリン加水分解 :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β-ガラクトシダーゼ :陰性
Ｋing'sＢ寒天での蛍光色素産生:陽性
(３)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
Ｌ-アラビノース :陽性
Ｄ-マンノース :陽性
Ｄ-マンニトール :陽性
Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陽性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n-カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl-リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性
また、シュードモナス属に属する微生物に加えて、アエロモナス属(Ａeroｍonas sp.)、コマモナス属(Ｃoｍaｍonas sp.)、バークホルデリア属(Ｂurkholderia sp.)などに属し、前記の置換ベンゾイルアルカン酸を原料とし、前記の３-ヒドロキシ置換ベンゾイルアルカン酸ユニットをモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産する微生物を用いることも可能である。
【０１０６】
＜培養＞
これらの微生物を所望とするモノマーユニット導入用のアルカン酸と、本発明の増殖用基質とを含む培地で培養することで、目的とするＰＨＡを生産することができる。このようなＰＨＡは、一般にＲ-体のみから構成され、アイソタクチックなポリマーである。
【０１０７】
本発明にかかるＰＨＡの製造方法に用いる微生物の通常の培養、例えば、保存菌株の作成、ＰＨＡの生産に必要とされる菌数や活性状態を確保するための増殖などには、用いる微生物の増殖に必要な成分を含有する培地を適宜選択して用いる。例えば、微生物の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地(肉汁培地,酵母エキスなど)や、栄養源を添加した合成培地など、いかなる種類の培地をも用いることができる。
【０１０８】
培養は液体培養、固体培養等該微生物が増殖し、ＰＨＡを生産する培養方法ならいかなる培養方法でも用いることができる。さらに、バッチ培養,フェドバッチ培養,半連続培養,連続培養等の種類も問わない。液体バッチ培養の形態としては、振とうフラスコによって振とうさせて酸素を供給する方法、ジャーファーメンターによる攪拌通気方式の酸素供給方法がある。また、これらの工程を複数段接続した多段方式を採用してもよい。
【０１０９】
前記したようなＰＨＡ生産微生物を用いて、３-ヒドロキシ置換ベンゾイルアルカン酸ユニットを含むＰＨＡを製造する場合は、ＰＨＡ生産用の原料としてそれぞれ対応する置換ベンゾイルアルカン酸と、微生物の増殖用炭素源とを少なくとも含んだ無機培地などを用いることができる。
増殖用炭素源としては、酵母エキス,ポリペプトン,肉エキス,カザミノ酸などの天然物由来の培地成分を用いることが可能であり、さらに、糖類,ＴＣＡサイクルに関与する有機酸(ＴＣＡ回路中の中間体として生じる有機酸及びＴＣＡ回路から一段階ないしは二段階の生化学反応を経て生じる有機酸)或いはその塩等,β酸化サイクルを経ずにアセチルＣoＡを生じる化合物であれば、いかなる化合物でも用いることができ、用いる菌株に対する基質としての有用性で適宜選択することができる。また、ｍcl-３ＨＡの混入の少ない組み合わせであれば、複数の化合物を選択して用いることも可能である。
【０１１０】
これらのうち、糖類としては、グリセロアルデヒド,エリスロース,アラビノース,キシロース,グルコース,ガラクトース,マンノース,フルクトースといったアルドース、グリセロール,エリスリトール,キシリトール等のアルジトール、グルコン酸等のアルドン酸,グルクロン酸,ガラクツロン酸等のウロン酸、マルトース,スクロース,ラクトースといった二糖等から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
【０１１１】
また、有機酸或いはその塩としては、ピルビン酸,オキサロ酢酸,クエン酸,イソクエン酸,ケトグルタル酸,コハク酸,フマル酸,リンゴ酸,乳酸などがその例であり、或いはその塩から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
これらの中でも、特に糖類を用いるのが好ましく、中でもグルコース,フルクトース,マンノースからなる群から選択される少なくとも一つであることがより好ましい。
【０１１２】
微生物にＰＨＡを生産・蓄積させる方法としては、一旦十分に増殖させて後に、塩化アンモニウムのような窒素源を制限した培地へ菌体を移し、目的ユニットの基質となる化合物を加えた状態で更に培養すると生産性が向上する場合がある。具体的には、前記の工程を複数段接続した多段方式の採用が挙げられる。例えば、Ｄ-グルコースを 0.05％から 5.0％程度、および、置換ベンゾイルアルカン酸を 0.01％から 1.0％程度含んだ無機培地等で対数増殖後期から定常期の時点まで培養し、菌体を遠心分離等で回収したのち、置換ベンゾイルアルカン酸を 0.01％から 1.0％程度含んだ、窒素源を制限した、あるいは実質的に存在しない無機培地でさらに培養する方法がある。
【０１１３】
上記の培養方法に用いる無機培地としては、リン源(例えば、リン酸塩等)、窒素源(例えば、アンモニウム塩,硝酸塩等)等、微生物が増殖し得る成分を含んでいるものであればいかなるものでも良く、例えば無機塩培地としては、ＭＳＢ培地、Ｅ培地(J.Ｂiol.Ｃheｍ.,２１８，97-106(1956))、Ｍ９培地等を挙げることができる。なお、本発明における実施例で用いるＭ９培地の組成は以下の通りである。
Ｎa2ＨＰＯ4 : 6.2g
ＫＨ2ＰＯ4 : 3.0g
ＮaＣl : 0.5g
ＮＨ4Ｃl : 1.0g
(培地１リットル中、pＨ 7.0)
更に、良好な増殖及びＰＨＡの生産のためには、上記の無機塩培地に培地に以下に示す微量成分溶液を 0.3％(v/v)程度添加するのが好ましい。
微量成分溶液
ニトリロ三酢酸: 1.5g
ＭgＳＯ4 : 3.0g
ＭnＳＯ4 : 0.5g
ＮaＣl : 1.0g
ＦeＳＯ4 : 0.1g
ＣaＣl2 : 0.1g
ＣoＣl2 : 0.1g
ＺnＳＯ4 : 0.1g
ＣuＳＯ4 : 0.1g
ＡlＫ(ＳＯ4)2 : 0.1g
Ｈ3ＢＯ3 : 0.1g
Ｎa2ＭoＯ4 : 0.1g
ＮiＣl2 : 0.1g
(１リットル中)
培養温度としては上記の菌株が良好に増殖可能な温度であれば良く、例えば 15〜40℃、好ましくは 20〜35℃、更に好ましくは 20℃から 30℃程度が適当である。
【０１１４】
具体的な例としては、Ｄ-グルコースを 0.05％から 5.0％程度、および、置換ベンゾイルアルカン酸を 0.01％から 1.0％程度含んだ無機培地等で培養し、対数増殖後期から定常期の時点で菌体を回収して目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは全くない所望のＰＨＡを抽出することができる。このようなＰＨＡは、一般にＲ-体のみから構成され、アイソタクチックなポリマーである。
【０１１５】
Ｄ-グルコースの代わりに同量のＴＣＡサイクルに関与する有機酸や、酵母エキス,ポリペプトンを与えても良い。また、それらの組み合わせを用いてもよい。
【０１１６】
＜ＰＨＡの回収＞
本発明にかかる培養液からのＰＨＡの取得には、通常行なわれている方法を適用することができる。ＰＨＡが培養液中に分泌される場合は、培養液からの抽出精製方法が、また、菌体に蓄積される場合は、菌体からの抽出精製方法が用いられる。例えば、微生物の培養菌体からのＰＨＡの回収には、通常行なわれているクロロホルムなどの有機溶媒による抽出が最も簡便ではあるが、クロロホルム以外にジオキサン,テトラヒドロフラン,アセトニトリル,アセトンが用いられる場合もある。また、有機溶媒が使用しにくい環境中においては、ＳＤＳ等の界面活性剤による処理、リゾチーム等の酵素による処理、ＥＤＴＡ等の薬剤による処理によってＰＨＡ以外の菌体成分を除去して、ＰＨＡを回収する方法を用いることもできる。
【０１１７】
なお、本発明の微生物の培養、本発明の微生物によるＰＨＡの生産と菌体への蓄積、並びに、本発明における菌体からのＰＨＡの回収は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１１８】
以下に実施例を示す。なお、以下における「％」は特に標記した以外は重量基準である。
【０１１９】
【実施例】
(参考例) ４'-フルオロ-n-ヘプタノフェノンの合成
四つ口丸底フラスコに 100ｍlのテトラヒドロフランを入れ、４-フルオロベンゾイルクロライド 7.92 g(0.05 ｍol)及びトリス(アセチルアセトン)鉄(III)0.53 g(1.5 ｍｍol)を加え、窒素雰囲気下で攪拌した。この溶液に、室温においてペンチルマグネシウムブロマイドを加えて、室温 10 分間攪拌した。反応終了後、氷浴下において、希塩酸により酸性化し、ジエチルエーテルにより有機相を抽出した。さらに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて中和し、飽和塩化ナトリウム水溶液にて、有機相を洗浄した。有機相は、無水硫酸マグネシウムにて脱水後、ジエチルエーテルをロータリーエバポレーターにより留去し、真空ポンプにより乾燥し、粗製の４'-フルオロ-n-ヘプタノフェノンを得た。
【０１２０】
精製は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒；n-ヘキサン:酢酸エチル＝ 30 :１)にて単離し、更にn-ヘキサンにより再結晶を行ない、４'-フルオロ-n-ヘプタノフェノン 5.23 gを得た。
【０１２１】
得られた化合物は、以下の条件でＮＭＲ分析を行なった。
【０１２２】
【表３】
【化 ２９】
また、得られた精製物は、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、同定を行なった。そのＧＣ-ＭＳスペクトルデータを図２に示す。その結果、４'-フルオロ-n-ヘプタノフェノンは、ＧＣ-ＭＳ ＴIＣ エリア比で 87％であった。
(実施例１)
Ｄ-グルコース 0.5％、４'-フルオロ-n-ヘプタノフェノン 0.05％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125 ストローク/分で振盪培養した。５日間後、菌体を遠心分離によって回収し、10％次亜塩素酸ナトリウム溶液に懸濁し、４℃で２時間振盪してＰＨＡを抽出した。抽出液を遠心分離して沈殿を回収し、これを水洗したのち、真空乾燥してＰＨＡを得た。
得られたＰＨＡについて、核磁気共鳴装置(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ 400)を用いて、下記の測定条件で分析した。
＜測定条件＞
測定核種:1Ｈ
使用溶媒:ＣＤＣl3(ＴＭＳ/ＣＤＣl3をキャピラリ封入でreferenceとして使用)
共鳴周波数:1Ｈ＝ 400 ＭＨz
1Ｈ-ＮＭＲスペクトルを図３に、その帰属結果(化学式[12]参照)を表４にそれぞれ示した。
【０１２５】
【表４】
【化 ３０】
さらに、得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050,ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果、表５に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１２８】
【表５】
このＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー ＨＬＣ-8220、カラム；ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝ 26,000、Ｍｗ＝ 142,000 であった。
【０１３０】
(実施例２)
Ｄ-グルコース 0.5％、４'-フルオロ-n-ヘプタノフェノン 0.1％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125 ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。
【０１３１】
この真空乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１３２】
このＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果を表６に示す。
【０１３３】
【表６】
上記の結果から、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１３５】
(実施例３)
グルタミン酸ナトリウム 0.5％、４'-フルオロ-n-ヘプタノフェノン 0.1％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125 ストローク/分で振盪培養した。７日間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。
【０１３６】
この真空乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１３７】
このＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果を表７に示す。
【０１３８】
【表７】
上記の結果から、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１４０】
(実施例４)
グルタミン酸ナトリウム 0.5％、４'-フルオロ-n-ヘプタノフェノン 0.1％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125 ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。
【０１４１】
この真空乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１４２】
このＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果を表８に示す。
【０１４３】
【表８】
上記の結果から、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１４５】
(実施例５)
Ｄ-グルコース 0.5％、ＦＢzＶＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃,125 ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％とＦＢzＶＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍlに再懸濁して、更に 30℃,125 ストローク/分で振盪培養した。40時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１４６】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１４７】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果、表９に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１４８】
【表９】
このＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー ＨＬＣ-8220、カラム；ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μＭ)、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝ 30,000、Ｍｗ＝ 78,000 であった。
【０１５０】
(実施例６)
Ｄ-グルコース 0.5％、ＦＢzＶＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃,125 ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。
【０１５１】
この真空乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１５２】
このＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果、表 10 に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１５３】
【表 １０】
(実施例７)
リンゴ酸二ナトリウム 0.5％、ＦＢzＶＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃,125 ストローク/分で振盪培養した。４日間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。
【０１５５】
この真空乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１５６】
このＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果、表 11 に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１５７】
【表 １１】
(実施例８)
酵母エキス(オリエンタル酵母工業(株)製)0.5％、ＦＢzＶＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125 ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。
【０１５９】
この真空乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１６０】
このＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果を表12 に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１６１】
【表 １２】
(実施例９)
ポリペプトン(日本製薬(株)製)0.5％、ＦＢzＶＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125 ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。
【０１６３】
この真空乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１６４】
このＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果を表 13 に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１６５】
【表 １３】
(実施例 10)
Ｄ-グルコース 0.5％、ＦＢzＶＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・チコリアイ・Ｈ 45 株を植菌し、30℃,125 ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％とＦＢzＶＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍlに再懸濁して、更に 30℃,125 ストローク/分で振盪培養した。40時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１６７】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１６８】
このＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果、表 14 に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１６９】
【表 １４】
このＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー ＨＬＣ-8220、カラム；ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μＭ)、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝ 26,000、Ｍｗ＝ 61,000 であった。
【０１７１】
(実施例 11)
Ｄ-グルコース 0.5％、ＦＢzＶＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍlにシュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株を植菌し、30℃,125 ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％とＦＢzＶＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍlに再懸濁して、更に 30℃,125 ストローク/分で振盪培養した。40時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１７２】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍlのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１７３】
このＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果、表 15 に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１７４】
【表１５】
このＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー ＨＬＣ-8220、カラム；ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μＭ)、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝ 41,000、Ｍｗ＝ 110,000 であった。
【０１７６】
【発明の効果】
本発明により、デバイス材料や医用材料等として有用な置換基を側鎖に有する多様な構造のモノマーユニットを含むＰＨＡ(unusual ＰＨＡ)の提供、ならびに、当該「unusual ＰＨＡ」を微生物を利用して製造する方法が可能となった。
【０１７７】
特に、目的外のモノマーユニットの混在が少なく、目的とする「unusual ＰＨＡ」を高純度で得ることができ、しかも高収率な製造方法の提供が可能となった。
【０１７８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】参考例における1Ｈ-ＮＭＲスペクトルチャートを示す。
【図２】参考例において得られた４'-フルオロ-n-ヘプタノフェノンをＧＣ-ＭＳ測定した際のＴIＣ及びマススペクトルを示す。
【図３】実施例１における1Ｈ-ＮＭＲスペクトルチャートを示す。
Claims (4)
- 下記式[１]で表されるモノマーユニット組成を有することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート。
ＡxＢ(1-x)[１]
(ただし、式中Ａは下記化学式[２]で表される少なくとも１つ以上であり、Ｂは下記化学式[３]または下記化学式[４]で表されるモノマーユニットから選択される少なくとも１つ以上であり、xは0.01以上１以下である。)
- 化学式[５]で表されるモノマーユニットを含むことを特徴とする、請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエート。
- 下記式[１]で表されるモノマーユニット組成を有するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法であって、
置換ベンゾイルアルカン酸を利用して該組成を有するポリヒドロキシアルカノエートを合成し得る微生物である、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株(Pseudoｍonas cichorii Ｈ45、ＦＥＲＭ ＢＰ-7374)、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株(Pseudoｍonas cichorii ＹＮ２、ＦＥＲＭ ＢＰ-7375)、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株(Pseudoｍonas jessenii Ｐ161、ＦＥＲＭ ＢＰ -7376)からなる群から選択される少なくとも１つの株を、該置換ベンゾイルアルカン酸を含む培地で培養する工程と、
前記微生物が産生したポリヒドロキシアルカノエートを単離する工程とを有することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
ＡxＢ(1-x)[１]
(ただし、式中Ａは下記化学式[２]で表される少なくとも１つ以上であり、Ｂは下記化学式[３]または下記化学式[４]で表されるモノマーユニットから選択される少なくとも１つ以上であり、xは0.01以上１以下である。)
- 置換ベンゾイルアルカン酸が下記化学式[７]で表される置換ベンゾイルアルカン酸であり、ポリヒドロキシアルカノエートが下記化学式[８]で表されるモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートである、請求項３に記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
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