JP2024501403A - ガンマ－デルタｔ細胞受容体に結合する抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞受容体に結合することができる抗体に関する。本発明はさらに、本発明の抗体を含む医薬組成物、および医療のための本発明の抗体の使用に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、ヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞受容体のＶδ２鎖に結合することができる新規の抗体に関する。本発明はさらに、本発明の抗体を含む医薬組成物、および医療のための本発明の抗体の使用に関する。

ガンマ－デルタ（γδ）Ｔ細胞は、ガンマ鎖およびデルタ鎖からなるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＴ細胞である。大多数のγδＴ細胞は、Ｖγ９およびＶδ２領域を含むＴＣＲを発現する。Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞は、広範な病原体および腫瘍細胞に対して反応することができる。この広範な反応性は、ＴＣＲ依存性の様式でこのＴ細胞サブセットを特異的に活性化することができるリン酸抗原によってもたらされることは理解される。Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の広範な抗微生物および抗腫瘍反応性は、癌および感染症の免疫制御に直接関与することを示唆する。

病原体または感染細胞または癌細胞に対するＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞反応性を促進する可能性があるため、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を活性化することができる薬剤は、感染症または癌の治療に有用であり得る。国際公開第２０１５１５６６７３号は、Ｖγ９Ｖδ２ ＴＣＲに結合し、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を活性化する能力がある抗体を記載する。国際公開第２０２００６０４０５号は、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞と腫瘍細胞標的の両方に結合し、したがってＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を腫瘍に動員して、それゆえ治療効果を刺激する可能性のある二重特異性抗体を記載する。

宿主細胞における抗体の組み換え産生は、しばしば、ポリペプチド鎖の翻訳後修飾の様々なタイプおよび程度を有する異なる形態の抗体を含む異種産物を生じる。翻訳後修飾は、例えば、標的抗原に対する親和性に関して、薬物動態特性、産物安定性、凝集などに関して、抗体の機能特性を変化させ得るため、そのような不均一性は、医学的使用のための抗体生成物にとって望ましくない。

本発明は、宿主細胞中で産生された時により均質な生成物をもたらし、標的細胞に対する標的結合および機能的効果、ならびに安定性などの良好な構造特性に関して、良好な機能的特性を維持している、改善されたＶγ９Ｖδ２ ＴＣＲ結合抗体配列を提供する。

本発明者らは驚くべきことに、国際公開第２０１５１５６６７３号に記載される抗体５Ｃ８が、この翻訳後修飾の対象となると予測されなかった抗体中の部位で硫酸化されることを見出した。硫酸化は、様々な宿主細胞において部分的に発生し、その結果、異種抗体生成物をもたらす。

驚くべきことに、硫酸化の対象となるチロシン残基は、抗体の抗原結合領域における抗原結合特異性の主要な決定因子であることが知られている、ＣＤＲ３領域に位置するが、抗体の抗原結合特性に影響を与えることなく、フェニルアラニンまたはセリンに変異誘発され得る。

変異を介して硫酸化部位を除去することにより、より均質な抗体生成物を得た。

したがって、第一の態様では、本発明は、ヒトＶδ２に結合する能力がある第一の抗原結合領域を含む抗体を提供し、当該第一の抗原結合領域は、配列番号１に記載されるＣＤＲ１配列、配列番号２に記載されるＣＤＲ２配列、および配列番号３に記載されるＣＤＲ３配列を含む。

さらなる態様では、本発明は、本明細書に定義されるヒトＶδ２に結合する能力がある第一の結合領域および第二の抗原を結合する能力がある第二の抗原結合領域を含む二重特異性抗体を提供し、第二の抗原は、好ましくは、ヒトＥＧＦＲである。さらなる態様では、本発明は、本発明の抗体を含む医薬組成物、医療における本発明の抗体の使用、ならびに本発明の抗体を産生するための核酸構築物、発現ベクター、およびかかる核酸構築物または発現ベクターを含む宿主細胞に関する。さらに、本発明は、硫酸化を回避し、より均質な生成物を生じる本発明の抗体を産生するためのプロセスに関する。

本発明のさらなる態様および実施形態が、以下に記載される。

図１：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ－７５カラムを使用した、タンパク質－Ａ精製したＬＡＶＡ化合物（ＶＨＨ ５Ｃ８を示す）のサイズ排除特性の代表的なクロマトグラム。優性単量体ピークの画分（画分１Ｅ１１－１Ｇ２）をプールし、定量した。 図２：精製したＶＨＨ ５Ｃ８のラボチップポリアクリルアミドゲル電気泳動の代表例。左：非還元、右：還元条件。 図３：精製したＶＨＨ ５Ｃ８（Ａ）およびＶＨＨ ５Ｃ８ｖａｒ１（Ｂ）のＨＰ－ＳＥＣ特性。 同上。 図４：精製した二重特異性ＶＨＨ（ｂｓＶＨＨ）１Ｄ１２ｖａｒ５－５Ｃ８ｖａｒ１の代表的なＨＰ－ＳＥＣ特性。ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の上清からタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーにより発現および精製したｂｓＶＨＨ １Ｄ１２ｖａｒ５－５Ｃ８ｖａｒ１バッチ。Ｂ：ＨＥＫ－２９３ Ｅ細胞からのタンパク質Ａとサイズ排除クロマトグラフィーの両方によって発現および精製したｂｓＶＨＨ １Ｄ１２ｖａｒ５－５Ｃ８ｖａｒ１バッチ。 同上。 図５：非還元条件下での精製したＶＨＨ ５Ｃ８ｖａｒ１－Ｙ１０５Ｆおよび５Ｃ８ｖａｒ１－Ｙ１０５Ｓのラボチップ分析。 図６：ＶＨＨ ５Ｃ８ｖａｒ１－Ｙ１０５Ｆ（Ａ）および５Ｃ８ｖａｒ１－Ｙ１０５Ｓ（Ｂ）のＨＰ－ＳＥＣ分析。 同上。 図７：ＢＬＩを使用した組換えＶγ９Ｖδ２－ＴＣＲタンパク質に結合するＶＨ断片の親和性測定。タンパク質質量（応答、ｎｍ）を時間の関数としてプロットする。点線の垂直線は、解離相（右）から会合相（左）を分離する。Ａ：ＶＨＨ ５Ｃ８ｖａｒ１；Ｂ：ＶＨＨ ５Ｃ８ｖａｒ１－Ｙ１０５Ｆ；Ｃ：ＶＨＨ ５Ｃ８ｖａｒ１－Ｙ１０５Ｓ。黒色の直線は、測定した実際の応答に適合したデータを表す。 図８：ｂｓＶＨＨ ７Ｄ１２ｖａｒ８－５Ｃ８ｖａｒ１－Ｙ１０５ＦとｂｓＶＨＨ ７Ｄ１２－５Ｃ８の両方が、強力なＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞活性化を誘導し、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞介在性腫瘍細胞溶解を引き起こす。Ａ：４時間の脱顆粒アッセイ：ＣＤ１０７Ａ（ＬＡＭＰ－１）＋Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞のパーセンテージを、使用した抗体濃度の関数としてプロットする。左：７Ｄ１２－５Ｃ８（非ヒト化）；右：７Ｄ１２ｖａｒ８－５Ｃ８ｖａｒ１－Ｙ１０５Ｆ。Ｂ：使用した抗体濃度の関数としてＡ４３１腫瘍細胞殺傷パーセンテージを示す２４時間の細胞傷害性アッセイ。左：７Ｄ１２－５Ｃ８（非ヒト化）；右：７Ｄ１２ｖａｒ８－５Ｃ８ｖａｒ１－Ｙ１０５Ｆ。 図９：フローサイトメトリーを使用して、健康なヒトＰＢＭＣから単離した初代γδＴ細胞への７Ｄ１２ｖａｒ８－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃの結合。二つのパネルは、二つの異なるドナーを表す。 図１０：細胞ベースのＥＬＩＳＡによる腫瘍細胞上のＥＧＦＲへの７Ｄ１２ｖａｒ８－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃの結合。 図１１：Ａ４３１細胞株に依存して７Ｄ１２ｖａｒ８－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃが誘導したγδＴ細胞の脱顆粒。 図１２：γδＴ細胞および７Ｄ１２－５Ｃ８との共培養におけるＡ－３８８細胞の生存性。 図１３：健康なドナー由来のＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞（１：１のＥ：Ｔ比）および７Ｄ１２－５Ｃ８（５０ｎＭ）または培地対照を用いた、解離した腫瘍細胞懸濁液（原発ＣＲＣ：ｎ＝１０、腹膜ＣＲＣ転移：ｎ＝５、肝臓ＣＲＣ転移：ｎ＝３、原発ＨＮＳＣＣ：ｎ＝５、および原発ＮＳＣＬＣ：ｎ＝４）の４時間培養後の溶解した腫瘍細胞。 図１４：健康なドナー由来Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞（１：１のＥ：Ｔ比）および７Ｄ１２－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｓ）－Ｆｃ（５０ｎＭ）、ｇｐ１２０－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｓ）－Ｆｃ（５０ｎＭ）又は培地対照を用いた解離した腫瘍細胞懸濁液（腹膜ＣＲＣ転移：ｎ＝４）の２４時間培養後の溶解した腫瘍細胞。 図１５：非ヒト霊長類研究のための構築物の構造。 図１６：７Ａ５－７Ｄ１２ｖａｒ８－Ｆｃの抗原標的への結合。 図１７：７Ａ５－７Ｄ１２ｖａｒ８－Ｆｃが媒介す脱顆粒および細胞傷害性。 図１８：三匹の処置した動物の血液中の７Ａ５－７Ｄ１２ｖａｒ８－Ｆｃ濃度のＰＫ分析。ＩｇＧ様ＰＫを有する分子を示す濃度－時間曲線を示す。 図１９：処置した動物の血中のＴ細胞（ＣＤ３＋、左グラフ）の総数およびＶγ９陽性細胞の数（ＣＤ３＋集団のパーセンテージとして）。矢印は、化合物の注射を示す。凡例の数字は、処置したサルの数である。 図２０：処置した動物の血中のＩＬ－６サイトカインの経時的なレベル。低レベルのサイトカインのみを観察し、放出は最初の注射後にほぼ限定された。矢印は処置モーメントを示す。

定義
本明細書において使用される場合、用語「ヒトＶδ２」は、Ｖγ９Ｖδ２－Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の再構成されたδ２鎖を指す。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ａ０ＪＤ３６（Ａ０ＪＤ３６＿ＨＵＭＡＮ）は、可変ＴＲＤＶ２配列の例を提供する。Ｖδ２は、Ｖγ９Ｖδ２－ＴＣＲのデルタ鎖の一部である。ヒトＶδ２に結合する能力がある抗体は、可変領域内に完全に位置しているエピトープに結合するか、または定常領域内に位置しているエピトープに結合するか、またはデルタ鎖の可変領域と定常領域の残基の組み合わせであるエピトープに結合することができる。

本明細書において使用される場合、用語「ヒトＶγ９」は、Ｖγ９Ｖδ２－Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の再構成されたｙ９鎖を指す。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９６０３＿ＨＵＭＡＮは、可変ＴＲＧＶ９配列の例を提供する。

本明細書において使用される場合、用語「ＥＧＦＲ」は、ヒトＥＧＦＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ００５３３（ＥＧＦＲ＿ＨＵＭＡＮ））を指す。

用語「抗体」は、イムノグロブリン分子、イムノグロブリン分子の断片、またはそのいずれかの誘導体であって、少なくとも約３０分、少なくとも約４５分、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１２時間、約２４時間以上、約４８時間以上、約３、４、５、６、７日以上などの、有意な期間の半減期あるいは任意の他の関連する機能的に定義された期間（例えば、抗原に結合する抗体と関連する生理学的応答を誘導し、促進し、強化し、および／もしくは強化するのに十分な時間ならびに／または抗体がエフェクター活性を動員するのに十分な時間）を有する典型的な生理学的条件下で抗原に特異的に結合する能力を有する。抗原と相互作用する抗原結合領域（または抗原結合ドメイン）は、イムノグロブリン分子の重鎖と軽鎖の両方の可変領域を含んでもよく、または単一ドメイン抗原結合領域、例えば、重鎖可変領域のみであってもよい。抗体の定常領域は、存在する場合、免疫系の様々な細胞（エフェクター細胞およびＴ細胞など）ならびに補体活性化の古典的経路における第一の構成要素であるＣ１ｑなどの補体系の構成要素を含む、宿主組織または因子へのイムノグロブリンの結合を媒介し得る。

イムノグロブリンのＦｃ領域は、イムノグロブリンの二つのＣＨ２－ＣＨ３領域および例えば、ヒンジ領域などの結合領域を含むパパインを有する抗体の消化後に典型的には生成される抗体の断片として定義される。抗体重鎖の定常ドメインは、抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥを定義する。Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体および補体系のタンパク質と呼ばれる細胞表面受容体を用いて抗体のエフェクター機能を介在する。

本明細書で使用される場合、「ヒンジ領域」という用語は、イムノグロブリン重鎖のヒンジ領域を指すことが意図される。したがって、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジ領域は、ＥＵナンバリングによるアミノ酸２１６～２３０に対応する。

本明細書で使用される場合、「ＣＨ２領域」または「ＣＨ２ドメイン」という用語は、イムノグロブリン重鎖のＣＨ２領域を指すことが意図される。したがって、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ２領域は、ＥＵナンバリングによるアミノ酸２３１～３４０に対応する。しかしながら、ＣＨ２領域は、本明細書に記載される他のサブタイプのいずれかであってもよい。

本明細書で使用される場合、「ＣＨ３領域」または「ＣＨ３ドメイン」という用語は、イムノグロブリン重鎖のＣＨ３領域を指すことが意図される。したがって、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ３領域は、ＥＵナンバリングによるアミノ酸３４１～４４７に対応する。しかしながら、ＣＨ３領域は、本明細書に記載される他のサブタイプのいずれかであってもよい。

本発明におけるＦｃ領域／Ｆｃドメインのアミノ酸位置への言及は、ＥＵナンバリングによる（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９６９ Ｍａｙ；６３（１）：７８－８５；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ－１９９１ ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２）。

上で示された通り、本明細書で使用される抗体という用語は、別段の記載がないか、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、抗原に特異的に結合する能力を保持している抗体の断片を含む。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって行われ得ることが示されている。用語「抗体」内に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ’またはＦａｂ断片、すなわち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片または国際公開第２００７０５９７８２号に記載される一価の抗体；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、すなわち、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された二つのＦａｂ断片を含む二価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインから本質的になるＦｄ断片；ならびに（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインから本質的になるＦｖ断片が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の二つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によってコードされているが、組換え法を使用して、ＶＬ領域およびＶＨ領域が対形成して、一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖（単鎖抗体または単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる、例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２，４２３－４２６ （１９８８）およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５，５８７９－５８８３（１９８８））として作られることを可能にする合成リンカーによって結合されてもよい。かかる一本鎖抗体は、文脈によって別段示されない限り、抗体という用語内に包含される。かかる断片は概して抗体の意味に含まれるが、それらは、まとめておよび各々独立して、本発明の固有の特徴であり、異なる生物学的特性および有用性を示す。抗体という用語は、別途指定されない限り、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体およびヒト化抗体、ならびに酵素切断、ペプチド合成、および組み換え技術などの任意の公知技術によってもたらされる抗体断片も含む。

本発明の抗体の一部の実施形態では、第一の抗原結合領域もしくは第二の抗原結合領域、またはその両方は、単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体は当業者に周知であり、例えば、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６，Ｒｏｏｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ９：３２７およびＫｒａｈ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ ３８：２１を参照のこと。単一ドメイン抗体は、単一のＣＤＲ１、単一のＣＤＲ２、および単一のＣＤＲ３を含む。単一ドメイン抗体の例は、重鎖のみの抗体、天然では軽鎖を含まない抗体、従来の抗体に由来する単一ドメイン抗体、および操作された抗体の可変断片である。単一ドメイン抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、サメ、ヤギ、ウサギ、およびウシを含む任意の種に由来し得る。例えば、単一ドメイン抗体は、ラクダ科、例えば、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカおよびグアナコにおいて生じた抗体に由来し得る。抗体全体のように、単一ドメイン抗体は、特定の抗原に選択的に結合することができる。単一ドメイン抗体は、イムノグロブリン鎖の可変ドメイン、すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびフレームワーク領域のみを含有してもよい。このような抗体は、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）、またはＶＨとも呼ばれる。

本明細書で使用される場合、用語「イムノグロブリン」は、二つの対のポリペプチド鎖、一つの対の軽（Ｌ）鎖および一つの対の重（Ｈ）鎖からなる構造的に関連する糖タンパク質のクラスを指すことが意図され、これら四つすべてがジスルフィド結合によって相互に連結される可能性がある。本明細書で使用される場合、「イムノグロブリン重鎖」、「イムノグロブリンの重鎖」、「重鎖」という用語は、イムノグロブリンの鎖のうちの一つを指すことが意図される。重鎖は、典型的には、イムノグロブリンのアイソタイプを定義する重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）および重鎖定常領域（本明細書ではＣＨと略される）からなる。重鎖定常領域は、典型的には、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３である三つのドメインからなる。重鎖定常領域は、ヒンジ領域をさらに含む。イムノグロブリン（例えば、ＩｇＧ）の構造内で、二つの重鎖は、ヒンジ領域内のジスルフィド結合を介して相互結合される。重鎖と等しく、各軽鎖は、典型的には、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）のいくつかの領域からなる。さらに、ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる、超可変領域（または配列における高頻度可変性であるか、および／または構造的に定義されたループを形成する超可変領域）に細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、典型的には、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された三つのＣＤＲおよび四つのＦＲからなる。ＣＤＲ配列は、様々な方法、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１またはＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ｆｉｆｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ．ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎによって提供される方法を使用することによって決定されてもよい。ＣＤＲ決定およびアミノ酸ナンバリングの様々な方法は、ｗｗｗ．ａｂｙｓｉｓ．ｏｒｇ（ＵＣＬ）で比較することができる。

本明細書で使用される場合、用語「アイソタイプ」は、イムノグロブリン（サブ）クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭ）または重鎖定常領域遺伝子によってコードされるＩｇＧ１ｍ（ｚａ）およびＩｇＧ１ｍ（ｆ）などのその任意のアロタイプを指す。各重鎖アイソタイプを、カッパー（ｋ）またはラムダ（λ）軽鎖のいずれかと組み合わせてもよい。本発明の抗体は、任意のアイソタイプを有し得る。

用語「親抗体」は、本発明による抗体と同一であるが、親抗体が、一つ以上の特定の変異を有さない抗体として理解されるべきである。本発明の「バリアント」または「抗体バリアント」または「親抗体のバリアント」は、「親抗体」と比較して一つ以上の変異を含む抗体分子である。アミノ酸置換は、天然のアミノ酸を、別の天然に生じるアミノ酸、または天然に生じないアミノ酸誘導体と置き換え得る。アミノ酸置換は、保存的または非保存的であってもよい。本発明の文脈では、保存的置換は、以下の三つの表のうちの一つ以上に反映されるアミノ酸のクラス内の置換によって定義され得る。

本発明の文脈において、バリアントにおける置換は、オリジナルのアミノ酸－位置－置換されたアミノ酸として示される。

アミノ酸残基を示すためのコードＸａａおよびＸを含む、三文字コードまたは一文字コードが使用される。したがって、記載「Ｔ３６６Ｗ」は、バリアントが、親抗体中の３６６位のアミノ酸に対応するバリアントアミノ酸位置においてトレオニンをトリプトファンで置換することを含むことを意味する。

さらに、用語「置換」は、他の１９個の天然のアミノ酸のいずれか一つに、または非天然のアミノ酸などの他のアミノ酸への置換を包含する。例えば、３６６位のアミノ酸Ｔの置換は、以下の置換：３６６Ａ、３６６Ｃ、３６６Ｄ、３６６Ｇ、３６６Ｈ、３６６Ｆ、３６６Ｉ、３６６Ｋ、３６６Ｌ、３６６Ｍ、３６６Ｎ、３６６Ｐ、３６６Ｑ、３６６Ｒ、３６６Ｓ、３６６Ｅ、３６６Ｖ、３６６Ｗ、および３６６Ｙの各々を含む。

本明細書において使用される場合、用語「全長抗体」は、全ての重鎖および軽鎖定常ドメイン、ならびにそのアイソタイプの野生型抗体に通常存在するドメインに対応する可変ドメインを含有する抗体を指す。

用語「キメラ抗体」は、可変領域が非ヒト種（例えば、齧歯類に由来する）に由来し、定常領域がヒトなどの異なる種に由来する抗体を指す。キメラ抗体は、遺伝子操作によって生成されてもよい。治療適用のためのキメラモノクローナル抗体は、抗体免疫原性を低減させるために開発される。

用語「ヒト化抗体」は、ヒト抗体定常ドメインおよびヒト可変ドメインに対して高レベルの配列相同性を含有するよう修飾された非ヒト可変ドメインを含有する、遺伝子操作された非ヒト抗体を指す。これは、一緒になって抗原結合部位を形成する六つの非ヒト抗体相補性決定領域（ＣＤＲ）を相同なヒト受容体フレームワーク領域（ＦＲ）に移植することによって達成することができる。親抗体の結合親和性および特異性を完全に再構成するために、親抗体（すなわち、非ヒト抗体）からヒトフレームワーク領域（逆変異）へのフレームワーク残基の置換が必要とされ得る。構造相同性モデリングは、抗体の結合特性に重要なフレームワーク領域内のアミノ酸残基を同定するのに役立つ場合がある。したがって、ヒト化抗体は、非ヒトＣＤＲ配列、主に、任意選択的に非ヒトアミノ酸配列への一つ以上のアミノ酸バック変異を含むヒトフレームワーク領域、および任意選択的に完全ヒト定常領域を含んでもよい。任意選択的に、必ずしもバック変異ではない追加のアミノ酸修飾を導入して、親和性および生化学的特性などの好ましい特徴を有するヒト化抗体を得てもよい。非ヒト治療用抗体のヒト化は、ヒト化された抗体が非ヒト起源の抗体の特異性および結合親和性を維持するのと同時に、人におけるその免疫原性を最小化するために行われる。

用語「多特異性抗体」は、少なくとも三つの異なる典型的には重複しないエピトープなどの、少なくとも二つの異なる特異性を有する抗体を指す。こうしたエピトープは、同じまたは異なる標的抗原上にあってもよい。エピトープが異なる標的上にある場合、かかる標的は、同じ細胞もしくは異なる細胞または細胞タイプ上にあってもよい。一部の実施形態では、多重特異性抗体は、一つ以上の単一ドメイン抗体を含んでもよい。

用語「二重特異性抗体」は、二つの異なる典型的には重複しないエピトープについての特異性を有する抗体を指す。こうしたエピトープは、同じまたは異なる標的上にあってもよい。エピトープが異なる標的上にある場合、かかる標的は、同じ細胞もしくは異なる細胞または細胞タイプ上にあってもよい。一部の実施形態では、二重特異性抗体は、一つまたは二つの単一ドメイン抗体を含んでもよい。

二重特異性抗体などの多特異性抗体の異なるクラスの例としては、（ｉ）ヘテロ二量体化を強制する相補的なＣＨ３ドメインを有するＩｇＧ様分子；（ｉｉ）組換えＩｇＧ様二重標的化分子、ここで、分子の二つの側面それぞれが、少なくとも二つの異なる抗体のＦａｂ断片またはＦａｂ断片の一部を含有する；（ｉｉｉ）ＩｇＧ融合分子、ここで、全長ＩｇＧ抗体は、外Ｆａｂ断片またはＦａｂ断片の一部に融合される；（ｉｖ）Ｆｃ融合分子、ここで、一本鎖Ｆｖ分子または安定化されたディアボディは、重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域またはその一部に融合される；（ｖ）Ｆａｂ融合分子、ここで、異なるＦａｂ断片は、重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域またはその部分に一緒に融合される；ならびに（ｖｉ）ＳｃＦｖおよび二重特異性抗体ベースの抗体および重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））、ここで、異なる一本鎖Ｆｖ分子または異なるディアボディまたは異なる重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））を互いに、もしくは別のタンパク質、または重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域またはその部分に融合された担体分子に融合される、が挙げられるが、これらに限定されない。

相補的なＣＨ３ドメイン分子を有するＩｇＧ様分子の例としては、Ｔｒｉｏｍａｂ（登録商標）（Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ／Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅｓ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＣｒｏｓｓＭＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）および電気的適合した（Ａｍｇｅｎ、Ｃｈｕｇａｉ、Ｏｎｃｏｍｅｄ）、ＬＵＺ－Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｗｒａｎｉｋ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１２，２８７（５２）：４３３３１－９，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１２．３９７８６９．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｎｏｖ １）、ＤＩＧボディおよびＰＩＧボディ（Ｐｈａｒｍａｂｃｉｎｅ、国際公開第２０１０１３４６６６号、国際公開第２０１４０８１２０２号）、鎖置換操作されたドメインボティ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ）、Ｂｉｃｌｏｎｉｃｓ（Ｍｅｒｕｓ、国際公開第２０１３１５７９５３号）、ＦｃΔＡｄｐ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、二重特異性ＩｇＧ１およびＩｇＧ２（Ｐｆｉｚｅｒ／Ｒｉｎａｔ）、非対称のスキャフォールド（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ／Ｍｅｒｃｋ）、ｍＡｂ－Ｆｖ（Ｘｅｎｃｏｒ）、二価の二重特異性抗体（Ｒｏｃｈｅ、国際公開第２００９０８０２５４号）ならびにＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）分子（Ｇｅｎｍａｂ）が挙げられるが、これらに限定されない。

組換えＩｇＧ様二重標的化分子の例としては、二重標的化（ＤＴ）－Ｉｇ（ＧＳＫ／Ｄｏｍａｎｔｉｓ、国際公開第２００９０５８３８３号）、Ｔｗｏ－ｉｎ－ｏｎｅ抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｂｏｓｔｒｏｍ，ｅｔ ａｌ ２００９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２３，１６１０－１６１４）、架橋結合したＭａｂ（Ｋａｒｍａｎｏｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、ｍＡｂ２（Ｆ－Ｓｔａｒ）、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（商標）（Ｚｙｎｇｅｎｉａ、ＬａＦｌｅｕｒ ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ．２０１３ Ｍａｒ－Ａｐｒ；５（２）：２０８－１８）、共通の軽鎖を用いたアプローチ、κλＢｏｄｉｅｓ（ＮｏｖＩｍｍｕｎｅ、国際公開第２０１２０２３０５３号）およびＣｏｖＸ－ｂｏｄｙ（登録商標）（ＣｏｖＸ／Ｐｆｉｚｅｒ、Ｄｏｐｐａｌａｐｕｄｉ，Ｖ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ ２００７．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１７，５０１－５０６）が挙げられるが、これらに限定されない。

ＩｇＧ融合分子の例としては、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ（Ａｂｂｏｔｔ）、二重ドメインダブルヘッド抗体（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ；Ｓａｎｏｆｉ Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＩｇＧ様二重特異性抗体（ＩｍＣｌｏｎｅ／Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｆｅｂ；３２（２）：１９１－８）、Ｔｓ２Ａｂ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡＺ、Ｄｉｍａｓｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９ Ｏｃｔ ３０；３９３（３）：６７２－９２）ならびにＢｓＡｂ（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、国際公開第２０１０１１１６２５号）、ＨＥＲＣＵＬＥＳ（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）、ｓｃＦｖ融合（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ｓｃＦｖ融合（Ｃｈａｎｇｚｈｏｕ Ａｄａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ）およびＴｖＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。

Ｆｃ融合分子の例としては、ＳｃＦｖ／Ｆｃ融合物（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ、Ｐｅａｒｃｅ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔ．１９９７ Ｓｅｐ；４２（６）：１１７９）、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ ／Ｔｒｕｂｉｏｎ、Ｂｌａｎｋｅｎｓｈｉｐ ＪＷ，ｅｔ ａｌ．ＡＡＣＲ １００ｔｈ Ａｎｎｕａｌ ｍｅｅｔｉｎｇ ２００９（Ａｂｓｔｒａｃｔ ＃５４６５）；Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ、国際公開第２０１０１１１６２５号）、二重親和性再標的化テクノロジー（Ｆｃ－ＤＡＲＴＴＭ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）および二重（ＳｃＦｖ）２－Ｆａｂ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ－Ｃｈｉｎａ）が挙げられるが、これらに限定されない。

Ｆａｂ融合二重特異性抗体の例としては、Ｆ（ａｂ）２（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＡＭＧＥＮ）、Ｄｕａｌ－ＡｃｔｉｏｎまたはＢｉｓ－Ｆａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｄｏｃｋ－ａｎｄ－Ｌｏｃｋ（登録商標）（ＤＮＬ）（ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ）、二価の二重特異性抗体（Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ）およびＦａｂ－Ｆｖ（ＵＣＢ－Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）が挙げられるが、これらに限定されない。

ＳｃＦｖベースの抗体、二重特異性抗体ベースの抗体およびドメイン抗体の例としては、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー（ＢｉＴＥ（登録商標））（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ、タンデム二重特異性抗体（Ｔａｎｄａｂ）（Ａｆｆｉｍｅｄ）、二重親和性再標的化テクノロジー（ＤＡＲＴＴＭ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、一本鎖二重特異性抗体（Ａｃａｄｅｍｉｃ、Ｌａｗｒｅｎｃｅ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９８ Ａｐｒ ３；４２５（３）：４７９－８４）、ＴＣＲ様抗体（ＡＩＴ、ＲｅｃｅｐｔｏｒＬｏｇｉｃｓ）、ヒト血清アルブミンＳｃＦｖ融合物（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ、国際公開第２０１００５９３１５号）ならびにＣＯＭＢＯＤＹ分子（Ｅｐｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１０ Ａｕｇ；８８（６）：６６７－７５）、二重標的化ナノボディ（登録商標）（Ａｂｌｙｎｘ、Ｈｍｉｌａ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２０１０）、二重標的化重鎖のみのドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

抗原に結合する抗体の文脈において、用語「結合する」または「特異的に結合する」は、抗体の予め決定された抗原または標的（例えば、ヒトＶδ２もしくはヒトＥＧＦＲ）への結合を指し、それへの結合は、典型的には約１０^－６Ｍ以下、例えば、本明細書の実施例に記載されるフローサイトメトリーを使用して決定されたとき、約１０^－９Ｍ以下、約１０^－１０Ｍ以下、または約１０^－１１Ｍ以下などの、約１０^－８Ｍ以下などの１０^－７Ｍ以下のＫ_Ｄに相応する見かけの親和性を有する。あるいは、Ｋ_Ｄ値は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）テクノロジーまたはリガンドとして抗原を、ならびに分析物として結合部分または結合分子を使用したＯｃｔｅｔ ＲＥＤ９６機器におけるバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用して決定することができる。特異的結合は、抗体が、所定の抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合についてのその親和性よりも、例えば、少なくとも１００倍低い、例えば、少なくとも１，０００倍低い、例えば、少なくとも１０，０００倍低い、例えば、少なくとも１００，０００倍低いなど、少なくとも１０倍低いＫ_Ｄに対応する親和性で、所定の抗原に結合することを意味する。結合部分または結合分子のＫ_Ｄが非常に低い（すなわち、結合部分または結合分子が非常に特異的である）場合、次いで、抗原についての親和性が非特異的な抗原についての親和性よりも低い程度が、少なくとも１０，０００倍であり得るように、親和性がより低い程度は、結合部分または結合分子のＫ_Ｄに依存する。本明細書において使用される場合、用語「Ｋ_Ｄ（Ｍ）」は、抗原と結合部分または結合分子との間の特定の相互作用の解離平衡定数を指す。

本発明の文脈において、「競合」または「競合することができる」または「競合する」は、結合パートナーに結合する別の分子（例えば、異なるＥＧＦＲ抗体）の存在下で、特定の結合パートナー（例えば、ＥＧＦＲ）に結合するための特定の結合分子（例えば、ＥＧＦＲ抗体）に対する傾向の任意の検出可能に有意な減少を指す。典型的には、競合とは、例えば、有意な量の二つ以上の競合する分子、例えば、抗体を使用したＥＬＩＳＡ分析またはフローサイトメトリーによって決定される、別の分子、例えば抗体の存在による結合の、少なくとも約２５％の低減、例えば、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約７５％、例えば、少なくとも９０％の低減を意味する。競合的阻害によって結合特異性を決定するためのさらなる方法は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８），Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ，ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）、およびＭｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２，５８９－６０１（１９８３））において見ることができる。

一実施形態では、本発明の抗体は、抗体７Ｄ１２と同じＥＧＦＲ上のエピトープおよび／または抗体５Ｃ８と同じＶδ２上のエピトープに結合する。当技術分野で公知の標的抗原上の抗体エピトープのマッピングのため利用可能ないくつかの方法が存在し、これらは、エピトープの一部であるペプチドの識別を可能にする、架橋結合質量分析法、およびエピトープを形成する抗原上の個々の残基を識別するＸ線結晶構造解析を含むが、これらに限定されない。エピトープ残基は、抗体から５Å以下の、少なくとも一つの原子を有する全てのアミノ酸残基であると決定することができる。５Åは、ファンデルワールス半径内の原子と可能性のある水介在性水素結合とを可能にするためのエピトープカットオフ距離として選択された。次に、エピトープ残基は、８Å以下の少なくとも一つの原子を有するすべてのアミノ酸残基であると決定することができる。８Å以下は、アルギニンアミノ酸の伸長を可能にするためのエピトープカットオフ距離として選択される。架橋結合質量分析は、抗体および抗原を質量標識された化学架橋剤で結合させることによって開始される。次に、複合体の存在が、高質量ＭＡＬＤＩ検出を使用して確認される。架橋結合化学の後、Ａｂ／Ａｇ複合体は非常に安定しているため、多くの様々な酵素および消化条件を複合体に適用して、多くの異なる重複ペプチドを提供することができる。これらのペプチドの同定は、高分解能質量分析およびＭＳ／ＭＳ技術を使用して行われる。架橋結合されたペプチドの同定は、架橋結合試薬に連結された質量タグを使用して決定される。ＭＳ／ＭＳ断片化およびデータ解析後、架橋され、抗原から誘導されたペプチドは、エピトープの一部であり、一方、抗体から誘導されたペプチドは、パラトープの一部である。見出された個々の架橋結合されたペプチド由来の大部分のＮ末端とＣ末端の架橋結合された残基の間のすべての残基は、エピトープまたはパラトープの一部であるとみなされる。抗体７Ｄ１２のエピトープは、Ｓｃｈｍｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２１：１２１４に記載されるＸ線結晶解析によって決定され、ドメインＩＩＩリガンド結合部位に対応するドメインＩＩＩ上の平坦な表面（残基Ｒ３５３、Ｄ３５５、Ｆ３５７、Ｑ３８４、Ｎ４２０）からなる。

本明細書において使用される場合、用語「第一の」および「第二の」抗原結合領域は、抗体中のそれらの向き／位置を指すものではなく、すなわち、それらはＮ末端またはＣ末端に関して意味を持たない。「第一の」および「第二の」という用語は、単に、特許請求の範囲および明細書における二つの異なる抗原結合領域を正確かつ一貫して指すのに役立つ。

本明細書において使用される場合、「％配列同一性」は、最適なアライメントのために導入される必要のある、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、異なる配列によって共有される同一のヌクレオチドまたはアミノ酸位置の数（すなわち、％同一性＝同一の位置の数／位置の総数×１００）を指す。二つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の％同一性は、例えば、ＰＡＭ１２０重量残渣表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用してＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれた、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ ４，１１－１７（１９８８）のアルゴリズムを使用して決定されてもよい。

本発明のさらなる態様および実施形態
上で記載された通り、第一の態様では、本発明は、ヒトＶδ２に結合する能力がある第一の抗原結合領域を含む抗体に関し、当該第一の抗原結合領域は、配列番号１に記載されるＣＤＲ１配列、配列番号２に記載されるＣＤＲ２配列、および配列番号３に記載されるＣＤＲ３配列を含む。

一実施形態では、配列番号１のＸ_１は、Ｓ（Ｓｅｒ）である。別の実施形態では、配列番号１のＸ_１は、Ｇ（Ｇｌｙ）である。

一実施形態では、配列番号３のＸ_２は、Ｆ（Ｐｈｅ）である。別の実施形態では、配列番号３のＸ_２、Ｓ（Ｓｅｒ）である。

一実施形態では、配列番号１のＸ_１は、Ｓ（Ｓｅｒ）であり、配列番号３のＸ_２は、Ｆ（Ｐｈｅ）である。

一実施形態では、配列番号１のＸ_１は、Ｓ（Ｓｅｒ）であり、配列番号３のＸ_２は、Ｓ（Ｓｅｒ）である。

一実施形態では、配列番号１のＸ_１は、Ｇ（Ｇｌｙ）であり、配列番号３のＸ_２は、Ｆ（Ｐｈｅ）である。

一実施形態では、配列番号１のＸ_１は、Ｇ（Ｇｌｙ）であり、配列番号３のＸ_２は、Ｓ（Ｓｅｒ）である。

好ましい実施形態では、抗体は、ヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を活性化することができる。Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の活性化は、遺伝子発現および／または（表面）マーカー発現（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ６９、もしくはＣＤ１０７ａなどの活性化マーカー）および／または分泌タンパク質（例えば、サイトカインもしくはケモカイン）特性の変化を測定することによって測定され得る。好ましい実施形態では、抗体は、活性化（例えば、ＣＤ６９および／またはＣＤ２５発現の上方制御）を誘導することができ、その結果、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞によるＣＤ１０７ａ発現および／またはサイトカイン産生（例えば、ＴＮＦ、ＩＦＮγ）の増加によってマークされる脱顆粒をもたらす。

さらなる好ましい実施形態では、抗体は、例えば、１ｎＭ、好ましくは１００ｐＭ、好ましくは１０ｐＭ、好ましくは１ｐＭ、なおより好ましくは１００ｆＭの濃度で、本明細書の実施例９に記載されるように試験されたとき、少なくとも２倍、例えば、少なくとも５倍、ＣＤ１０７ａが陽性の細胞数を増加させることができる。別の好ましい実施形態では、本発明の抗体は、本明細書の実施例９に記載されるＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞およびＡ４３１標的細胞を使用して試験されたとき、１００ｐＭ以下、例えば５０ｐＭ以下、例えば２５ｐＭ以下、例えば２０ｐＭ以下、例えば１５ｐＭ以下のＣＤ１０７ａ陽性細胞のパーセンテージを増加させるためのＥＣ５０値を有する。

一実施形態では、第一の抗原結合領域は、単一ドメイン抗体である。したがって、一実施形態では、本発明の抗体は、ヒトＶδ２に結合する能力がある単一ドメイン抗体を含み、ここで、当該第一の抗原結合領域は、配列番号１に記載されるＣＤＲ１配列、配列番号２に記載されるＣＤＲ２配列および配列番号３に記載されるＣＤＲ３配列を含む。

別の実施形態では、第一の抗原結合領域はヒト化され、好ましくは、抗原結合領域は、
・配列番号４に記載される配列、または
・配列番号４に記載される配列と少なくとも９０％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる。

一実施形態では、配列番号４のＸ_１は、Ｓ（Ｓｅｒ）である。別の実施形態では、配列番号４のＸ_１は、Ｇ（Ｇｌｙ）である。一実施形態では、配列番号４のＸ_２は、Ｆ（Ｐｈｅ）である。別の実施形態では、配列番号４のＸ_２、Ｓ（Ｓｅｒ）である。一実施形態では、配列番号４のＸ_１は、Ｓ（Ｓｅｒ）であり、配列番号４のＸ_２は、Ｆ（Ｐｈｅ）である。一実施形態では、配列番号４のＸ_１は、Ｓ（Ｓｅｒ）であり、配列番号４のＸ_２は、Ｓ（Ｓｅｒ）である。一実施形態では、配列番号４のＸ_１は、Ｇ（Ｇｌｙ）であり、配列番号４のＸ_２は、Ｆ（Ｐｈｅ）である。一実施形態では、配列番号４のＸ_１は、Ｇ（Ｇｌｙ）であり、配列番号４のＸ_２は、Ｓ（Ｓｅｒ）である。

一部の実施形態では、本発明の抗体は、二重特異性抗体などの多重特異性抗体である。したがって、一実施形態では、抗体は、第二の抗原結合領域をさらに含む。一実施形態では、第二の抗原結合領域は、単一ドメイン抗体である。

さらなる実施形態では、抗体は、第一の抗原結合領域と第二の抗原結合領域の両方が単一ドメイン抗体である、二重特異性抗体である。さらなる実施形態では、多特異性抗体は、第一の抗原結合領域が単一ドメイン抗体であり、第二の抗原結合領域が単一ドメイン抗体である、二重特異性抗体である。

一実施形態では、本発明の抗体は、第二の抗原結合領域を含み、第二の抗原結合領域は、ヒトＥＧＦＲに結合する能力がある。Ｖγ９Ｖδ２－Ｔ細胞とＥＧＦＲの両方を標的化する二重特異性抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏマウス異種移植片モデルの両方で、強力なＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞活性化および腫瘍細胞溶解を誘導することが示されている（ｄｅ Ｂｒｕｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １，ｅ１３７５６４１）。

さらなる実施形態では、抗体は、第二の抗原結合領域を含み、第二の抗原結合領域は、配列番号５に記載されるＣＤＲ１配列、配列番号６に記載されるＣＤＲ２配列および配列番号７に記載されるＣＤＲ３配列を含む。

一実施形態では、第二の抗原結合領域はヒト化される。

さらなる実施形態では、抗体は、第二の抗原結合領域を含み、第二の抗原結合領域は、
・配列番号８に記載される配列、または
・配列番号８に記載される配列と少なくとも９０％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる。

さらなる実施形態では、抗体は、ヒトＥＧＦＲへの結合について、配列番号８に記載される配列を有する抗体と競合し（すなわち、競合することができ）、好ましくは、抗体は、配列番号８に記載される配列を有する抗体と同じヒトＥＧＦＲ上のエピトープに結合する。

さらなる実施形態では、本発明の抗体は、第一の抗原結合領域および第二の抗原結合領域を含み、ここで、第一の抗原結合領域は、配列番号１に記載されるＣＤＲ１配列、配列番号２に記載されるＣＤＲ２配列および配列番号３に記載されるＣＤＲ３配列を含み、ここで、第二の抗原結合領域は、配列番号５に記載されるＣＤＲ１配列、配列番号６に記載されるＣＤＲ２配列および配列番号７に記載されるＣＤＲ３配列を含む。

さらなる実施形態では、本発明の抗体は、第一の抗原結合領域および第二の抗原結合領域を含み、ここで、第一の抗原結合領域は、配列番号４に記載される配列を含み、第二の抗原結合領域は、配列番号８に記載される配列を含む。本明細書のさらなる実施形態では、

配列番号４のＸ_１が、Ｓ（Ｓｅｒ）であり、配列番号３のＸ_２が、Ｆ（Ｐｈｅ）であるか、または

配列番号４のＸ_１が、Ｓ（Ｓｅｒ）であり、配列番号４のＸ_２が、Ｓ（Ｓｅｒ）であるか、または

配列番号４のＸ_１が、Ｇ（Ｇｌｙ）であり、配列番号４のＸ_２が、Ｆ（Ｐｈｅ）であるか、または

配列番号４のＸ_１が、Ｇ（Ｇｌｙ）であり、配列番号４のＸ_２が、Ｓ（Ｓｅｒ）である。

さらなる実施形態では、抗体は、ヒトＥＧＦＲ発現細胞の殺傷を媒介する能力がある。好ましい実施形態では、抗体は、本明細書の実施例９に記載されるように試験されたとき、少なくとも５０％、例えば少なくとも２倍などの少なくとも２５％、Ａ４３１細胞などのＥＧＦＲ発現細胞のＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞介在性殺傷を増加させることができる。

さらなる実施形態では、抗体は、ＥＧＦＲ陰性ヒト細胞などのＥＧＦＲ陰性細胞の殺傷を媒介する能力がない。

一実施形態では、抗体は、第一の抗原結合領域および第二の抗原結合領域を含み、ここで、第一の抗原結合領域および第二の抗原結合領域は、ペプチドリンカー、例えば、１～２０アミノ酸長、例えば、１～１０アミノ酸長、例えば、２、３、４、５、６、７、８または１０アミノ酸長を有するリンカーを介して共有結合される。一実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号９に記載される配列ＧＧＧＧＳを含むか、またはからなる。

別の実施形態では、抗体は、第一の抗原結合領域および第二の抗原結合領域を含み、ここで、ヒトＶδ２に結合する能力がある第一の抗原結合領域は、ヒトＥＧＦＲに結合する能力がある第二の抗原結合領域のＣ末端に位置する。

本発明の一実施形態では、抗体は、半減期延長ドメインをさらに含む。一実施形態では、抗体は、ヒト対象に投与されたとき、約１６８時間より長い終末半減期を有する。最も好ましくは、終末半減期は３３６時間以上である。本明細書において使用される場合、抗体の「末端半減期」は、ポリペプチドの血清濃度が、除去の最終段階でｉｎ ｖｉｖｏで、５０％低減するのにかかる時間を指す。

一実施形態では、抗体は、半減期延長ドメインをさらに含み、半減期延長ドメインは、Ｆｃ領域である。さらなる実施形態では、抗体は、Ｆｃ領域を含む二重特異性抗体などの多重特異性抗体である。二重特異性抗体を作製するための様々な方法は、当該技術分野で記載されており、例えば、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２０１７）ＭＡｂｓ ９：１８２によって概説されている。本発明の一実施形態では、Ｆｃ領域は、二つのＦｃポリペプチドを含むヘテロダイマーであり、第一の抗原結合領域は、第一のＦｃポリペプチドに融合され、第二の抗原結合領域は、第二のＦｃポリペプチドに融合され、第一および第二のＦｃポリペプチドは、ホモダイマーの形成よりもヘテロダイマーの形成を支持する非対称なアミノ酸変異を含む（例えば、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）’Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ’ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＨ３ ｄｏｍａｉｎｓ ｆｏｒ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ９：６１７を参照のこと）。本明細書のさらなる実施形態では、ＦｃポリペプチドのＣＨ３領域は、当該非対称なアミノ酸変異を含み、好ましくは、第一のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｗ置換を含み、第二のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ置換を含み、またはその逆も同様であり、アミノ酸位置は、ＥＵナンバリングシステムによるヒトＩｇＧ１に対応する。さらなる実施形態では、第一および第二のＦｃポリペプチドの位置２２０のシステイン残基は、欠失または置換されており、アミノ酸位置は、ＥＵナンバリングシステムによるヒトＩｇＧ１に対応する。さらなる実施形態では、領域は、配列番号１０に記載されるヒンジ配列を含む。

一部の実施形態では、第一および／または第二のＦｃポリペプチドは、抗体を不活性にする、すなわち、エフェクター機能を媒介することができないか、またはエフェクター機能を媒介する低減した能力を有する変異を含有する。一実施形態では、不活性なＦｃ領域は、さらにＣ１ｑに結合することができない。一実施形態では、第一および第二のＦｃポリペプチドは、２３４および／または２３５位に変異を含み、好ましくは、第一および第二のＦｃポリペプチドは、Ｌ２３４ＦおよびＬ２３５Ｅ置換を含み、アミノ酸位置は、ＥＵナンバリングシステムによるヒトＩｇＧ１に相当する。別の実施形態では、抗体は、Ｌ２３４Ａ変異、Ｌ２３５Ａ変異、およびＰ３２９Ｇ変異を含有する。別の実施形態では、抗体は、Ｌ２３４Ｆ変異、Ｌ２３５Ｅ変異およびＤ２６５Ａ変異を含有する。

好ましい実施形態では、第一の抗原結合領域は、配列番号４に記載される配列を含み、第二の抗原結合領域は、配列番号８に記載される配列を含み、
－ 第一のＦｃポリペプチドが、配列番号１１に記載される配列を含み、第二のＦｃポリペプチドが、配列番号１２に記載される配列を含むか、または
－ 第一のＦｃポリペプチドが、配列番号１１に記載される配列を含み、第二のＦｃポリペプチドが、配列番号１２に記載される配列を含む。

さらなる好ましい実施形態では、抗体は、配列番号１６および配列番号１７に記載される配列を含むか、またはそれからなる。

さらなる好ましい実施形態では、抗体は、配列番号１６および配列番号１８に記載される配列を含むか、またはそれからなる。

さらなる主な態様では、本発明は、本明細書に記載される本発明による抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。

抗体は、Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．２０１２ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，ＩＳＢＮ ９７８０８５７１１０２７５において開示されるものなどの従来の技術に従い、薬学的に許容される賦形剤を用いて製剤化され得る。薬学的に許容される賦形剤ならびに任意の他の担体、希釈剤またはアジュバントは、抗体および選択された投与様式に適しているべきである。医薬組成物の賦形剤およびその他の成分についての適合性は、本発明の選択された抗体または医薬組成物の所望の生物学的特性に対する有意な負の影響の欠如（例えば、抗原結合の際の実質的な影響未満（１０％以下の相対阻害、５％以下の相対阻害など））に基づき決定される。

医薬組成物は、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ－２０もしくはＴｗｅｅｎ－８０などの非イオン性界面活性剤）、安定剤（例えば、糖もしくはタンパク質を含まないアミノ酸）、保存剤、組織固定剤、可溶化剤、および／または医薬組成物への含有に適した他の材料を含明でもよい。さらなる薬学的に許容される賦形剤には、本発明の抗体と生理学的に適合する、任意およびすべての適当な溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、酸化防止剤および吸収遅延剤などが含まれる。

さらなる主な態様では、本発明は、医薬として使用するための本明細書に記載の本発明による抗体に関する。

本発明による抗体は、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞による腫瘍細胞の殺傷に有益な微小環境を生じることを可能にする。したがって、好ましい実施形態では、抗体は、癌の治療に使用するためのものである。

一実施形態では、抗体は、原発性もしくは転移性結腸癌または結腸直腸癌の治療に使用するためのものである。別の実施形態では、抗体は、腹膜の癌の治療に使用するためのものである。別の実施形態では、抗体は、肝臓癌の治療に使用するためのものである。別の実施形態では、抗体は、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）の治療に使用するためのものである。別の実施形態では、抗体は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療に使用するためのものである。別の実施形態では、抗体は、皮膚の平上皮細胞癌の治療に使用するためのものである。

同様に、本発明は、本明細書に記載される本発明による多特異性抗体のそれを必要とするヒト対象への投与を含む、疾患を治療する方法に関する。一実施形態では、疾患は癌である。

一部の実施形態では、抗体は、単独療法として投与される。しかしながら、本発明の抗体はまた、併用療法、すなわち、治療される疾患または状態に関連する他の治療剤と組み合わされて投与されてもよい。

「治療」または「治療すること」は、症状または病態を緩和、改善、休止、根絶（治癒）または予防する目的で、本発明による有効量の抗体を投与することを意味する。「有効量」は、望ましい治療結果を達成するために必要な投与量および期間での有効な量を指す。抗体などのポリペプチドの有効量は、個体の病期、年齢、性別、および体重などの要因、ならびに個体において所望の応答を誘発する抗体の能力に応じて変化し得る。有効量はまた、抗体の任意の毒性または有害な作用より、治療上有益な作用が優るものである。投与は、任意の適切な経路によって行われてもよいが、典型的には、静脈内、筋肉内、または皮下などの非経口である。

本発明の多特異性抗体は、典型的には、組換え的に、すなわち、適当な宿主細胞における抗体をコードする核酸構築物の発現、続いて、細胞培養物から産生された組換え抗体を生成することによって生成される。核酸構築物は、当技術分野で周知の標準的な分子生物学的技術によって生成することができる。構築物は、典型的には、発現ベクターを使用して宿主細胞内に導入される。適当な核酸構築物および発現ベクターは、当該技術分野で公知である。抗体の組換え発現に適した宿主細胞は、当該技術分野で周知であり、ＣＨＯ、ＨＥＫ－２９３、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、ＰＥＲ－Ｃ６、ＮＳ／０およびＳｐ２／０細胞を含む。

したがって、さらなる態様では、本発明は、本発明による抗体をコードする核酸構築物に関する。一実施形態では、構築物は、ＤＮＡ構築物である。別の実施形態では、構築物は、ＲＮＡ構築物である

さらなる態様では、本発明は、本発明による抗体をコードする核酸構築物を含む発現ベクターに関する。

さらなる態様では、本発明は、本発明による抗体をコードする一つ以上の核酸構築物を含む宿主細胞、または本発明による抗体をコードする核酸構築物を含む発現ベクターに関する。

さらなる態様では、本発明は、本発明による抗体をコードする一つ以上の核酸を宿主細胞中で発現させることを含む、本発明の抗体を製造するためのプロセスに関する。

さらなる態様では、本発明は、本発明による抗体をコードする一つ以上の核酸を宿主細胞中で発現させることを含む、本発明の抗体の臨床バッチを製造するためのプロセスに関する。本明細書で使用される場合、「臨床バッチ」は、ヒトにおける使用に適した生成組成物を指す。

さらなる態様では、本発明は、本発明による抗体をコードする一つ以上の核酸を宿主細胞中で発現させることを含む、チロシン硫酸化を有さない抗体を製造するためのプロセスに関する。

さらなる態様では、本発明は、ヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を活性化する能力がある抗体のチロシン硫酸化を回避するためのプロセスに関し、当該プロセスは、本発明の抗体をコードする核酸を構築すること、および宿主細胞中で当該核酸の発現によって当該抗体を産生することを含む。

さらなる態様では、本発明は、ヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を活性化する能力がある抗体の均質な抗体調製物を生成するためのプロセスに関し、当該プロセスは、本発明の抗体をコードする核酸を構築すること、および宿主細胞中で当該核酸の発現によって当該抗体を産生することを含む。

一実施形態では、上記製造プロセスにおける宿主細胞は、ＣＨＯ細胞もしくはＨＥＫ細胞などの哺乳動物細胞、またはピキア・パストリス細胞などの酵母細胞である。

本明細書に引用されるすべての参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開公報、および特許出願は、すべての目的のためにその全体が参照により援用される。しかし、本明細書のあらゆる参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開公報、および特許出願の言及は、それらが有効な従来技術を構成している、または世界中のどの国においても共通の一般知識の一部を形成していること承認、または何らかの形の示唆として解釈するものではなく、するべきではない。

実施例１｜ＶＨＨ化合物の生成および精製
ＶＨＨ化合物を、ＨＥＫ２９３－Ｅ ２５３細胞におけるコードプラスミドの一過性トランスフェクション及びタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー、続いて分取ゲル濾過による（産生の１週間後）条件培地からのタンパク質の精製によって主に生成した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ－７５カラムを使用した分取サイズ排除で観察した優性単量体ピーク（画分１Ｅ１１～１Ｇ２）を精製した：図１。

精製したタンパク質は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動における還元条件および非還元条件下で単一のバンドとして遊走することを示した：図２は、代表的な例を示す。

実施例２｜精製したＶＨＨ化合物のＨＰ－ＳＥＣ分析
Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＡＲＣ－ｂｉｏシステムを、精製したＶＨＨ化合物のＨＰ－ＳＥＣ分析に使用した。１０ｕｇの抗体（１ｍｇ／ｍＬの濃度の抗体１０ｕｇ）を、Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ２００ ＳＥＣカラム（ビーズサイズ２．５μｍ、カラム寸法７．８×３００ｍｍ）に注入した。移動層は、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．２Ｍの塩化ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０で構成され、緩衝液速度０．８ｍＬ／分を実行に使用した。タンパク質を、２１４ｎｍの波長での吸収を測定することによって検出した。合計分析時間は、一回の注入当たり１５分であった。ＶＨ化合物を生成し、実施例１に記載されるように精製した。驚くべきことに、ｗｈｅｎ ＶＨＨ ５Ｃ８（配列番号１３）（国際公開第２０１５１５６６７３号に既に記載された）および５Ｃ８ｖａｒ１（配列番号１４）（国際公開第２０２００６０４０５号に既に記載された）を完全性および単量性について試験したとき、二つのピークを観察した：図３。

実施例３｜５Ｃ８の質量分析により、さらなる８０Ｄａの質量が明らかになった
５Ｃ８の二つのアイソフォームが質量において異なっていたかどうかを決定するために、５Ｃ８のタンパク質調製物を、ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ質量分析によって分析した。この分析で見出した主な種は、翻訳後修飾またはシグナルペプチドを有さない５Ｃ８であった。第二の種は、＋８０．３ダルトン（Ｄａ）の質量差を有するタンパク質であり、これは硫酸化またはリン酸化の可能性を示した。これを、ホスファターゼまたはスルファターゼを用いた処理および続く、タンパク質消化後のペプチドのＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ質量分析によってさらに調べた。スルファターゼ処理は、ＣＤＲ３の７番目の残基であるＹ１０５を含有するペプチド（配列番号１５）の質量を８０Ｄａ減少させたが、ホスファターゼ処理は効果を有さなかったことを示した。これは、５Ｃ８中のＹ１０５が、硫酸化によって翻訳後修飾されることを証明する。この硫酸化は、タンパク質調製物の約３０％に存在した。

実施例４｜同じ抗Ｖγ９Ｖδ２ ＶＨＨを含有する１Ｄ１２ｖａｒ５－５Ｃ８ｖａｒ１は、ＨＰ－ＳＥＣにおいて同じ不均一性、および８０Ｄａの同じさらなる質量を示す。
１Ｄ１２ｖａｒ５－５Ｃ８ｖａｒ１は、抗ＣＤ１ｄ ＶＨＨから構成される二重特異性ＶＨ化合物であり、可撓性リンカーを介して５Ｃ８ｖａｒ１に結合する（国際公開第２０２００６０４０５号の配列番号８７に記載される）。このタンパク質は、上記の通り、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞で発現された。さらに、タンパク質調製物を異なる発現系から得て、二特異性ＶＨＨはまた、ピキア・パストリスおよびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞でも発現された。異なるタンパク質調製物をＨＰ－ＳＥＣ分析で試験したとき、事前ピークを体系的に観察した：図４。

観察した前ピークは、再度、異なるアイソフォームである、有意なパーセンテージのタンパク質を示す。５Ｃ８ ＶＨは硫酸化され、５Ｃ８ｖａｒ１は全く同じＣＤＲ３配列を含有するため、１Ｄ１２ｖａｒ５－５Ｃ８ｖａｒ１バッチも、それらの分子量について質量分析により分析した。タンパク質バッチに応じて、１５％～４０％が、さらなる８０Ｄａの質量を含有することを見出した。これは、ＶＨＨ ５Ｃ８について観察した硫酸化と一致する。

実施例５｜ＶＨＨ ５Ｃ８および５Ｃ８ｖａｒ１のインシリコ分析
５Ｃ８および５Ｃ８ｖａｒ１の相同モデルを、ＰＤＢ ＩＤ ５Ｍ２Ｗに基づき、Ｍａｅｓｔｒｏ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ）を使用して構築した。ＣＤＲ１およびＣＤＲ３は、Ｐｒｉｍｅ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ）を使用したｄｅ ｎｏｖｏループ予測による精密化を必要とした。生成したモデルは、ＣＤＲ３残基Ｙ１０５が、５Ｃ８ｖａｒ１モデル中の２０５．１Å^２及び５Ｃ８のモデル中の１２２．２Å^２の高い溶媒可溶性表面積を示すことを示し、したがって、抗原結合に寄与すると予想する。その後、モデルを、反応性残基について分析し、これは、翻訳後修飾（ＰＴＭ）を受けやすい残基を示している。次に、配列ベースのＰＴＭ予測ツールであるＭｏｄＰｒｅｄを使用してタンパク質配列を解析した。構造と配列の両方で予測した修飾を、表２に列挙する。個々の予測したＰＴＭは、ＨＰ－ＳＥＣ解析で観察した質量差を説明することができなかった。

実施例６｜５Ｃ８ｖａｒ１ ＶＨ ＣＤＲ３変異体Ｙ１０５ＦおよびＹ１０５Ｓの設計および生成
実施例５に記載する相同性モデルを使用して、５Ｃ８および５Ｃ８ｖａｒ１におけるＹ１０５の硫酸化を防止する変異を導入した。二つの異なる変異体を、ＶＨＨのモデル構造に基づき設計した：Ｙ１０５Ｓ（アルコール機能を保持）およびＹ１０５Ｆ（芳香族環を保持）。残基Ｙ１０５は、ＣＤＲ３の７番目の残基であり、変異を導入することによって、結合に対する作用を予想した。上記の通り、両方の変異をヒト化ＶＨ配列５Ｃ８ｖａｒ１において設計し、両方のタンパク質をＨＥＫ２９３Ｅ細胞で産生させ、精製した。ヒト化ＶＨＨのＣＤＲ３アミノ酸配列を、非ヒト化ＶＨＨのアミノ酸配列と同一のままであった。

５Ｃ８ｖａｒ１－Ｙ１０５Ｆと５Ｃ８ｖａｒ１－Ｙ１０５Ｓの両方を良好に生成し、分取サイズ排除において単量体タンパク質として現れた（データは示さず）。両方のタンパク質は、非常に純粋であり（図５）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一種として遊走した。

実施例７｜ 設計したＣＤＲ３変異を含有する精製したＶＨＨのＨＰ－ＳＥＣ分析
ＨＰ－ＳＥＣ分析を、５Ｃ８に記載した通り行った。５Ｃ８ｖａｒ１－Ｙ１０５Ｆならびに５Ｃ８ｖａｒ１－Ｙ１０５Ｓの両方を分析した（図６）。

設計したＣＤＲ３変異を含有する精製したＶＨＨ分子のＨＰ－ＳＥＣ分析から結論付けることができるように、いずれの変異体についても、もはや不均一性を観察しなかった。これは、観察した翻訳後修飾Ｙ１０５は存在せず、タンパク質は均質であることを示した。

実施例８｜ バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用した５Ｃ８ｖａｒ１、５Ｃ８ｖａｒ１－Ｙ１０５Ｆおよび５Ｃ８ｖａ１－Ｙ１０５Ｓのアフィニティ測定は、親和性に差がないことを示している
５Ｃ８ｖａｒ１ ＶＨ抗体断片ならびにバリアント５Ｃ８ｖａｒ１－Ｙ１０５Ｆおよび５Ｃ８ｖａｒ１－Ｙ１０５ＳのＶｙ９Ｖδ２ＴＣＲへの結合を、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６機器（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社）を使用したバイオレイヤー干渉法によって測定した。組換えヒトＶｙ９Ｖδ２－Ｆｃ融合タンパク質（２０μｇ／ｍｌ）を、抗ヒトＦｃ捕捉バイオセンサー上のリガンドとして捕捉した。リガンドが捕捉したバイオセンサーを、１０×動態緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社）中の連続希釈ＶＨＨ抗体断片（４０～０．６３ｎＭ）と共にインキュベートしたときに、センサーグラムを記録した。１：１の結合モデルに適合するグローバルデータを使用して、ｋ_ｏｎ（会合速度定数）および_ｋｏｆｆ（解離速度定数）の値を推定した。これらの値を使用して、ＫＤ＝ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎを用いてＫＤ（平衡解離定数）を計算した。

図７および表３から結論付けることができるように、二つの異なるＹ１０５ ＶＨＨ変異体について見出したＫＤ値は、５Ｃ８ｖａｒ１について見出した値と実質的に異なっていなかった。特に、Ｙ１０５Ｆ変異体は、５Ｃ８ｖａｒ１について見出したものと同程度の親和性を有していた。

実施例９｜Ｙ１０５Ｆ変異を含有する抗（ＥＧＦＲ×Ｖγ９Ｖδ２ ＴＣＲ）二重特異性ＶＨＨの機能性を完全に保持する
５Ｃ８ｖａｒ１と比較してＶＨＨ ５Ｃ８ｖａｒ１－Ｙ１０５Ｆの等しい親和性が、同等の機能性に翻訳されるか否かを決定するために、二特異性ＶＨＨ ７Ｄ１２ｖａｒ８－５Ｃ８ｖａｒ１－Ｙ１０５Ｆを設計し、ヒト化抗ＥＧＦＲ ＶＨＨ ７Ｄ１２ｖａｒ８（Ｇａｉｎｋａｍ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ４９（５）：７８８に記載されるＶＨＨに基づく）を、Ｇ４Ｓリンカーを介して５Ｃ８ｖａｒ１－Ｙ１０５Ｆ ＶＨＨに結合させて、７Ｄ１２ｖａｒ８－５Ｃ８ｖａｒ１－Ｙ１０５Ｆを形成した。二つのＶＨＨ分子を、可撓性Ｇ４Ｓリンカー配列によって分けた。この分子は、上記の通り生成し、精製し、次いで、ＥＧＦＲ陽性腫瘍細胞株（Ａ４３１）に依存してＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞活性化を誘導し、Ｔ細胞介在性腫瘍細胞溶解を引き起こす能力について試験紙た。簡潔に述べると、標準的な手順に従って、抗Ｖδ２抗体と組み合わせて磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）を使用して、健康なドナーの血液からＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を単離した。次いで、これらの細胞を、サイトカインと照射したフィーダー細胞の混合物、すなわちＪＹ細胞株と異なるドナー由来のＰＢＭＣとの混合を使用して、１週間拡大させた。Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞は、アッセイで使用したとき、常に＞９０％純粋であった（ＦＡＣＳにおいてＶγ９およびＶδ２について二重陽性と染色した）。Ａ４３１細胞株（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－１５５５）を、供給元の推奨に従い培養した。活性化または細胞傷害性アッセイアッセイのため、アッセイの前日に、５０，０００個の腫瘍標的細胞を９６ウェルの組織培養プレートに播種した。翌日、５０，０００個の拡大し精製したＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を、濃度範囲の二重特異性ＶＨＨ化合物と共に培地に加えた。活性化アッセイでは、混合物に添加した標識抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ１０７Ａ抗体の混合物を使用して、Ｖｙ９Ｖδ２－Ｔ細胞脱顆粒を評価した。４時間後、細胞を採取し、洗浄し、脱顆粒マーカーＣＤ１０７Ａの発現についてＦＡＣＳにより分析した。細胞傷害性アッセイのため、ＣｙｔｏＴｏｘ－Ｇｌｏ細胞傷害性アッセイキット：（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ９２９０）を使用して、タンパク質分解酵素（細胞死を示す）の存在について、翌日に共培養物の上清を調べた。界面活性剤を使用した細胞溶解を使用して、アッセイの終了時に１００％の殺傷を設定した。図８は、データを示す。

図８は、７Ｄ１２ｖａｒ８－５Ｃ８ｖａｒ１－Ｙ１０５Ｆ、ならびに非ヒト化７Ｄ１２－５Ｃ８が、強力なＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞活性化および腫瘍細胞溶解を誘導したことを示す。これらの結果は、Ｙ１０５変異７Ｄ１２ｗｔ－５Ｃ８を有さない非ヒト化「前駆」分子の効力と一致する。表４は、曲線フィッティング後に取得したＥＣ５０値を示す。７Ｄ１２ｖａｒ８－５Ｃ８ｖａｒ１－Ｙ１０５Ｆは、７Ｄ１２－５Ｃ８と比較して、細胞傷害性アッセイにおいてわずかに低いＥＣ５０を有した。

最大レベルの腫瘍細胞殺傷は、７Ｄ１２－５Ｃ８について観察した腫瘍細胞殺傷のレベルと比較して、７Ｄ１２ｖａｒ８－５Ｃ８ｖａｒ１－Ｙ１０５Ｆの場合、わずかに低かった。しかし、これらは、二つの異なるＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞ドナーを使用した二つの異なる測定値であり、この最高レベルの細胞傷害性は、特にドナー依存性であり得る。

実施例１０｜Ｙ１０５変異を含有するＶＨＨ ５Ｃ８ｖａｒ１の温度安定性は変化しなかった
異なるバリアントに導入した変異が、ＶＨＨフォールディングの熱安定性に影響を与えたかどうかを決定するために、変異体の溶融温度を、ＮａｎｏＤＳＦ（示差走査蛍光測定法）を使用して測定した。抗体試料を、最低濃度の試料と等しくなるまでＰＢＳを使用して希釈した。その後、抗体試料をｎａｎｏＤＳＦグレードのキャピラリーに充填し、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．４８で測定した。実験中、温度は２０～９５°Ｃに上昇した。タンパク質の固有蛍光を、３５０および３３０ｎｍで検出し、反射光の量と共に記録した。これらの測定値から、見かけの融解温度（Ｔｍ）および凝集開始（Ｔａｇｇ）を決定した。三つの抗体断片すべてについて、ＶＨＨが完全に展開した開始融解温度（Ｔ_ｏｎ）および融解温度（Ｔｍ）を報告した（表４）。５Ｃ８ｖａｒ１－Ｙ１０５Ｆおよび５Ｃ８ｖａｒ１－Ｙ１０５Ｓについて測定し融解温度を、５Ｃ８ｖａｒ１の融解温度と一致した：表４。

実施例１１｜半減期延長（Ｆｃ含有）二重特異性構築物
より長いｉｎ ｖｉｖｏ血漿半減期を有する分子を得るために、７Ｄ１２ｖａｒ８－５Ｃ８ｖａｒ１－Ｙ１０５Ｆ二重特異性ＶＨＨを、ヒトＦｃを含有する治療抗体フォーマットに再フォーマット化した。両方のＶＨＨドメインを、以下の特徴を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（すなわち、ＣＨ２およびＣＨ３）ドメインに結合し、ＶＨドメインを、改変ヒンジ（ＡＡＡ、続いてＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、システイン２２０が欠失）ならびにヒトＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインに結合させた。ＣＨ２ドメインを、ＬＦＬＥ変異対（Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ）によってＦｃサイレンシングし、ＣＨ３ドメインを、同じ細胞内の二つの鎖の共発現時に、ヘテロ二量体化する「ノブ・イントゥ・ホール」変異体（ノブ：Ｔ３６６Ｗならびにホール：Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ）を用いて変異誘発した。この変異対は、科学文献（Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ９：６１７）に記載されている。構築物の配列を、配列番号１６および配列番号１７に記載する。Ｆｃ領域を有する得られた抗体構築物７Ｄ１２ｖａｒ８－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）を、７Ｄ１２ｖａｒ８－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃと称した。同様に、１０５位のＹをＳで置換した構築物（７Ｄ１２ｖａｒ８－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｓ）－Ｆｃ）も調製した。構築物の配列を、配列番号１６および配列番号１８に記載する。

実施例１に記載した通り、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞中の二つのコード発現ベクターの同時トランスフェクションおよびタンパク質Ａ アフィニティークロマトグラフィー、続いて分取サイズ排除クロマトグラフィーによって培養上清からの精製を介してタンパク質を作成した。これにより、高度に単量体性タンパク質調製物を得た。

実施例１２｜健康なヒトＰＢＭＣから単離した初代Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞への７Ｄ１２ｖａｒ８－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃの結合
７Ｄ１２ｖａｒ８－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－ＦｃのＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）への結合を示すために、ヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を、磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）により健康な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離し、その後、記載された（ｄｅ Ｂｒｕｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６９（２０１６），１２８－１３８；ｄｅ Ｂｒｕｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９８（１）（２０１７），３０８－３１７）通り拡大した。次いで、拡大したポリクローナルおよび純粋（＞９５％）なＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を、５００００個の細胞／ウェルの密度で播種し、７Ｄ１２ｖａｒ８－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃ抗体または１００ｎＭで開始する半対数滴定における陽性対照としてのＧＰ１２０－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃ抗体のいずれかと、４℃で１時間インキュベートした。抗体のＶγ９Ｖδ２ ＴＣＲへの結合を、蛍光標識した二次抗ＩｇＧ１抗体を使用したフローサイトメトリーによって可視化した。図９は、二つの異なるＰＢＭＣドナー（Ｄ３３６およびＤ３３９）についての、フローサイトメトリーによって測定した抗ＩｇＧ１抗体染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）シグナルを示す。シグモイド曲線は、７Ｄ１２ｖａｒ８－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－ＦｃのＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞への有意な結合を強調し、低いナノモル範囲（約３ｎＭ）の半最大有効濃度（ＥＣ５０）を有する。

実施例１３｜細胞ベースのＥＬＩＳＡによるＥＧＦＲ陽性腫瘍細胞への７Ｄ１２ｖａｒ８－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃの結合
７Ｄ１２ｖａｒ８－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃの上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）への結合を、ＥＧＦＲ発現腫瘍細胞株Ａ－４３１、ＨＣＴ－１１６およびＨＴ－２９を使用して、細胞ベースの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で試験した。この目的のために、腫瘍細胞を、－１日目に異なる濃度でまず播種し、０日目におよそ５００００個の細胞／ウェルの濃度に達した。０日目に、１００ｎＭで開始する、７Ｄ１２ｖａｒ８－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃ抗体又は陰性対照としてのＧＰ１２０－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃ抗体の半対数滴定を、３７℃で１時間加えた。次いで、結合した抗体を、抗ＩｇＧ１－ＨＲＰを用いて３７℃で１時間、二次インキュベーション工程で標識した。次いで、二次抗体結合を、３，３′，５，５′－テトラメチルベンジジンの添加によって分解させ、ＨＲＰによって比色分析変化を誘導し、続いて、Ｈ２ＳＯ４の添加によって、反応を停止させた。次いで、光学密度（ＯＤ）を、波長４５０ｎｍでＵＶ分光計で測定した。図１０は、７Ｄ１２ｖａｒ８－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃが、約７ｎＭのＥＣ５０でＡ－４３１、ＨＣＴ－１１６およびＨＴ－２９腫瘍細胞に強く結合するのに対し、非標的化対照抗体は、試験した細胞株のいずれにも測定可能に結合しなかったことを示す。

実施例１４｜７Ｄ１２ｖａｒ８－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃによって誘導したＡ－４３１細胞に依存したＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の脱顆粒
Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を活性化する７Ｄ１２ｖａｒ８－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃの能力を調べるために、上で記載した通り、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞をまず単離し、拡大させた。次に、異なる濃度の７Ｄ１２ｖａｒ８－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃ抗体及びＰＥ標識抗ＣＤ１０７ａ蛍光抗体の存在下で、１：１のＥ：Ｔ比でＡ－４３１腫瘍細胞と一緒に、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を培養した。２４時間後、細胞を採取し、蛍光標識した抗Ｖγ９および抗ＣＤ３抗体で染色して、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を腫瘍細胞から区別した。フローサイトメトリーを使用して、標的依存性脱顆粒を反映する、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞上のＣＤ１０７ａ発現の程度を調べた。図１１は、７Ｄ１２ｖａｒ８－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃの濃度が増加すると、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞細胞を効率的に誘導して、Ａ－４３１細胞に応じて脱顆粒したことを示す。７Ｄ１２ｖａｒ８－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃによって誘導したＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の脱顆粒のＥＣ５０は、ピコモル範囲（約４０～９０ｐＭ）にある。

実施例１５｜抗体７Ｄ１２－５Ｃ８は、Ｔ細胞介在性標的細胞傷害を誘導する
二重特異性ＶＨＨ ７Ｄ１２－５Ｃ８が、標的細胞に対するＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞介在性細胞傷害性の誘導において効率的であるかどうかを調べるために、Ａ－３８８表皮腫瘍細胞株（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－７９０５）の生存率を、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞およびｂｓＶＨＨ抗体断片との共培養設定で評価した。このアッセイでは、既に記載した通りだが、続いて凍結し、－１５０℃で保存した、健康なＰＢＭＣから単離したＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を使用した。凍結したＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を解凍し、ＩＬ－２補充培地中で一晩静置した。Ａ－３８８腫瘍細胞を、単独または１：１または１：０．１の比率で休止Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞と共に、７Ｄ１２－５Ｃ８（１０ｎＭ）あり、またはなしで播種した。さらなる対照として、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を、抗体７Ｄ１２－５Ｃ８（１０ｎＭ）と共に、またはなしで単独で播種した。７２時間後、ＡＴＰ Ｌｉｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、６０１６７３１）の添加およびマイクロプレートリーダーによる発光シグナルの読み取りによって、細胞の生存率を決定した。図１２は、ＡＴＰ由来蛍光シグナルを示し、これは、生細胞の代謝活性、それによる生細胞数を表す。１：１のＥ：Ｔ比で、抗体は、約５０％の生細胞の減少を誘導し、一方で、Ａ－３８８とＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の未処理の共培養は影響を受けず、Ｔ細胞介在性細胞傷害性を誘発するその能力を強調することを、観察することができる。

実施例１６｜７Ｄ１２－５Ｃ８および７Ｄ１２－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｓ）－Ｆｃ活性化Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞による腫瘍細胞殺傷
ｂｓＶＨＨ ７Ｄ１２－５Ｃ８および抗体７Ｄ１２－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｓ）－Ｆｃが、患者由来の腫瘍細胞に対するＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞介在性細胞傷害性を誘導することができたかどうかを調べるために、かかる腫瘍細胞の生存率を、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞および抗体との共培養設定で評価した。様々な異なるタイプの腫瘍細胞を試験した。

組織試料（すなわち、結腸、腹膜および肝臓、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に由来する原発性および転移性腫瘍材料）を、書面によるインフォームドコンセント後に、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ ＵＭＣ（ロケーションＶＵｍｃ）で癌患者から採取した。組織を外科手術ブレード（サイズＮｏ．２２；Ｓｗａｎｎ Ｍｏｒｔｏｎ Ｌｔｄ）を用いて小さい片に切断し、０．１％のＤＮＡｓｅ Ｉ、０．１４％のコラーゲンＡ、５％のＦＣＳ、１００ ＩＵ／ｍｌのペニシリンナトリウム、１００μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシンおよび２．０ ｍＭのＬ－グルタミンを補充したＩＭＤＭからなる解離培地中に再懸濁し、撹拌棒を含む滅菌フラスコに移し、３７℃の水浴中で４５分間、磁気攪拌器上でインキュベートした。インキュベーション後、細胞懸濁液を１００μＭの細胞ストレーナーに通した。腫瘍を三回解離させ、その後、細胞をトリパンブルー排除を用いた生細胞数のため洗浄した。
解離させた患者由来腫瘍細胞を、５０ｎＭの７Ｄ１２－５Ｃ８の存在下または非存在下で４時間又は７Ｄ１２－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｓ）－Ｆｃ若しくはｇｐ１２０－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｓ）－Ｆｃの存在下又は非存在下で２４時間、健康なドナー由来のＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞（１：１のＥ：Ｔ比）と共にインキュベートした。

接着した細胞を、必要に応じて、トリプシン－ＥＤＴＡを使用して培養期間後に剥離し、ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ウシ血清アルブミンおよび２０μｇ／ｍｌ ＮａＮ３を補充したＰＢＳ）中に再懸濁し、蛍光色素標識した抗体と共に、４度で３０分間インキュベートし、その後、ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ ＸＬ－２０（ＢＤ）を使用してフローサイトメトリーにより染色を測定した。

生細胞を、製造業者の指示に従って、１２３計数ｅＢｅａｄｓ（商標）と組み合わせて、生／死マーカー７ＡＡＤを使用して識別した。フローサイトメトリーのデータを、Ｋａｌｕｚａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ １．３（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）およびＦｌｏｗＪｏ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．６．１および１０．７．２（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析した。

腫瘍細胞の７Ｄ１２－５Ｃ８および７Ｄ１２－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｓ）－Ｆｃ誘導性Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞介在性細胞傷害性を、拡大した健康なドナー由来のＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を、様々な悪性腫瘍（原発性ＣＲＣ、腹膜および肝臓、頭頸部扁平上皮細胞癌および非小細胞肺癌におけるＣＲＣ転移）の単一細胞懸濁液と共にインキュベートすることによって評価した。

図１３に示すように、７Ｄ１２－５Ｃ８は、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞による患者の腫瘍細胞の実質的な溶解を誘導した（７Ｄ１２－５Ｃ８が誘導した溶解の平均％：ＣＲＣ原発５２．３％およびｐ値０．０００３、ＣＲＣ腹膜４６．０％およびｐ値０．００５２、ＣＲＣ肝臓３１．８％およびｐ値０．０３６０、頭頸部扁平上皮細胞癌４６．１％およびｐ値０．０１８７ならびに非小細胞肺癌６４．１％およびｐ値０．０１５３）。

さらに、図１４に示すように、７Ｄ１２－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｓ）－Ｆｃは、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞による患者腫瘍細胞の有意な量の溶解を誘導した（７Ｄ１２－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｓ）－Ｆｃが誘導した溶解の平均％：７１．２％ならびにｐ＜０．０００１および０．００１２）。対照化合物ｇｐ１２０－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｓ）－Ｆｃは、測定可能な腫瘍細胞溶解も誘導しなかった。

実施例１７｜非ヒト霊長類研究のための構築物の設計、生成および精製
非ヒト霊長類におけるインビボ研究のため、カニクイザルＶγ９ ＴＣＲ鎖と交差反応する結合ドメインを有する構築物を生成した（図１５）。この結合ドメインは、ＴＣＲ Ｖγ９特異的抗体である抗体７Ａ５に基づいていた（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４６（１）（１９９１），３５－３９）。７Ａ５に基づく抗体は、カニクイザルＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞に結合することが見出されている（国際公開第２０２１０５２９９５号の実施例１を参照）。７Ａ５および抗ＥＧＦＲ ＶＨＨ ７Ｄ１２ｖａｒ８を含む二重特異性Ｆｃ含有抗体を構築した。分子は、ノブ・イン・ホールテクノロジー（ＫｉＨ；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．２００１：２４８、７；ノブ：Ｔ３６６Ｗ；ホール：Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ）を使用してヘテロ二量体化のため操作したヒトＩｇＧ１ Ｆｃテールを含有していた。７Ａ５抗体のＶγ９結合ｓｃＦｖは、「ノブ」鎖に結合し、ＥＧＦＲ結合ＶＨＨ ７Ｄ１２ｖａｒ８を、ＫｉＨ Ｆｃ対の「ホール」鎖と共にインフレームでクローニングした。さらに、上部ヒンジを「ＡＡＡＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ」に操作して、通常ＣＬに架橋するシステイン（Ｃ２２０）を除去し、「ＥＰＫ」を「ＡＡＡ」に変更することによって、さらに柔軟性を高めた。ＣＨ２のＮ末端部分を操作して、ＦｃＲＮ結合を維持しながら、Ｆｃ受容体（ＣＤ１６、３２および６４）相互作用（サイレンシング変異Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ）を破壊した。得られた構築物を、７Ａ５－７Ｄ１２ｖａｒ８－Ｆｃと称した。

ＨＥＫ２９３Ｅ細胞中の二つの異なる鎖をコードする二つのプラスミドの一過性の共トランスフェクションによって分子を生成し、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー続いて分取サイズ排除クロマトグラフィーにより培養上清から精製した（実施例１）。分子は、ＥＬＩＳＡおよび両方の抗原の組み換え形態を使用して、約３ナノモル（ｎＭ）の見かけ親和性で、いずれかの標的に結合することを示した（図１６）。ｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大させたＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞およびその後のＴ細胞媒介性腫瘍細胞溶解の標的依存性活性化（ＣＤ１０７ａ発現）を引き起こしたことを示すことによって、分子の機能性を示した（図１７）。

実施例１８｜二重特異性抗体７Ａ５－７Ｄ１２ｖａｒ８－Ｆｃは、探索性複数用量非ヒト霊長類（ＮＨＰ：カニクイザル）試験で忍容性良好であった

複数用量の探索性ＮＨＰ試験では、メスカニクイザル三匹に、それぞれ１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび２３ｍｇ／ｋｇの用量で７Ａ５－７Ｄ１２ｖａｒ８－Ｆｃを投与した。抗体は、５ｍＬ／ｋｇで３０分間の注入で投与し、４週間毎の注入を行った。１および５ｍｇ／ｋｇの最初の二つの用量群（１用量当たり一匹の動物）を、同時に投与し、三回（週一回）投与後、第三の用量群（２３ｍｇ／ｋｇ）は、一回目の用量を受け取った。ＰＫ解析、臨床化学パラメータの分析、サイトカインレベルの測定、およびフローサイトメトリーによる血液細胞サブセットの分析のため、動物から定期的に血液を採取した。最終投与の１日後、動物を安楽死させ、組織を採取し、病理組織学的検査および免疫組織化学（ＩＨＣ）用に調製した。

処置した動物の血中の７Ａ５－７Ｄ１２ｖａｒ８－Ｆｃ濃度の薬物動態解析（ＥＬＩＳＡで測定、図１８）は、抗体が、８４～１２７時間の範囲の半減期を有するＩｇＧ様ＰＫを示したことを明らかにした。１ｍｇ／ｋｇの用量で投与した動物では、抗体は、三回目の注射後の半減期が短く、これはその動物における抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答の可能性によるようであった。

得られたクリアランス値は、０．３６～０．７２ｍＬ／ｈ／ｋｇであり、分布体積は、５８．５～１１５．２ｍＬ／ｋｇであった。全身曝露は、１～２３ｍｇ／ｋｇの間で用量比例的に増加させた。しかし、反復投与後に蓄積を観察しなかった。

化合物は、異なる組織（リンパ節、筋肉、皮膚および結腸）においてＩＨＣによって検出することができ、予想通り、これらの組織における用量比例性強度の化合物染色があった（データは示さず）。血液細胞のフローサイトメトリー分析は、これらの種類の複数用量試験でしばしば観察し、処置に関連するリンパ球（図１９）のいくつかの一時的な減少を示した。図１９は、投与の２時間後の各時点でのＴ細胞数の一時的な減少を示す。しかし、Ｔ細胞数は、注射の２日後にベースラインレベルに戻った。

対照的に、Ｖγ９陽性Ｔ細胞は、末梢血中の数が減少し、以前の頻度を取り戻さなかった。これらの細胞は、試験の過程中ほとんど存在せず、化合物の特異的な薬力学的効果を示した。処置した動物の血中のサイトカインの測定値は、処置がサイトカイン放出をほとんど引き起こさず、これは、化合物の初回注射にほぼ独占的に限定されたことを示した。図２０は、一例として測定したＩＬ－６のレベルを示す。

一般的な結論として、７Ａ５－７Ｄ１２ｖａｒ８－ＦｃによるＮＨＰの処置は、忍容性が非常に良好であり、毒性の臨床徴候を示さなかった。さらに、調べた器官の肉眼的または顕微鏡的異常を、病理組織学で観察しなかった（データはここに示す）。比較において、抗ＥＧＦＲ×ＣＤ３ ＢｉＴＥは、用量３１μｇ ／ｋｇ／日の持続点滴でＮＨＰに対して致死性であった（Ｌｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ ２０１０：１０７（２８），１２６０５）。

Claims (21)

1. ヒトＶδ２に結合する能力がある第一の抗原結合領域を含む抗体であって、前記第一の抗原結合領域が、配列番号１に記載されるＣＤＲ１配列、配列番号２に記載されるＣＤＲ２配列および配列番号３に記載されるＣＤＲ３配列を含む、抗体。
2. ・配列番号１のＸ_１が、Ｓ（Ｓｅｒ）であり、配列番号３のＸ_２が、Ｆ（Ｐｈｅ）であるか、または
   ・配列番号１のＸ_１が、Ｓ（Ｓｅｒ）であり、配列番号３のＸ_２が、Ｓ（Ｓｅｒ）である、請求項１に記載の抗体。
3. 前記第一の抗原結合領域が単一ドメイン抗体である、請求項１～２のいずれか一項に記載の抗体。
4. 前記第一の抗原結合領域が、
   ・配列番号４に記載される配列、または
   ・配列番号４に記載される前記配列と少なくとも９０％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体。
5. 前記抗体が、第二の抗原結合領域をさらに含み、前記第二の抗原結合領域が、好ましくは、単一ドメイン抗体である、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。
6. 前記抗体が二重特異性抗体である、請求項４に記載の抗体。
7. 前記抗体が、第二の抗原結合領域を含み、前記第二の抗原結合領域が、ヒトＥＧＦＲに結合する能力がある、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体。
8. 前記抗体が、第二の抗原結合領域を含み、前記第二の抗原結合領域が、配列番号５に記載されるＣＤＲ１配列、配列番号６に記載されるＣＤＲ２配列および配列番号７に記載されるＣＤＲ３配列を含み、
   好ましくは、前記第二の抗原結合領域が、
   ・配列番号８に記載される配列、または
   ・配列番号８に記載される前記配列と少なくとも９０％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体。
9. 前記抗体が、第二の抗原結合領域を含み、前記第一の抗原結合領域が、配列番号１に記載される前記ＣＤＲ１配列、配列番号２に記載される前記ＣＤＲ２配列および配列番号３に記載される前記ＣＤＲ３配列を含み、前記第二の抗原結合領域が、配列番号５に記載される前記ＣＤＲ１配列、配列番号６に記載される前記ＣＤＲ２配列および配列番号７に記載される前記ＣＤＲ３配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体。
10. 前記抗体が、ヒトＥＧＦＲ発現細胞の殺傷を媒介する能力がある、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体。
11. 前記第一の抗原結合領域および第二の抗原結合領域が、ペプチドリンカーを介して共有結合している、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体。
12. 前記抗体が、半減期延長ドメイン、例えば、Ｆｃ領域をさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体。
13. 前記抗体がＦｃ領域を含み、前記Ｆｃ領域が、二つのＦｃポリペプチドを含むヘテロダイマーであり、前記第一の抗原結合領域が、第一のＦｃポリペプチドに融合され、前記第二の抗原結合領域が、第二のＦｃポリペプチドに融合され、前記第一および第二のＦｃポリペプチドが、ホモダイマーの形成よりヘテロダイマーの形成を好む非対称なアミノ酸変異を含む、請求項５～１０のいずれか一項に記載の抗体。
14. 前記ＦｃポリペプチドのＣＨ３領域が、前記非対称なアミノ酸変異を含み、好ましくは、前記第一のＦｃポリペプチドが、Ｔ３６６Ｗ置換を含み、前記第二のＦｃポリペプチドが、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ置換を含み、またはその逆も同様であり、前記アミノ酸位置が、ＥＵナンバリングシステムによるヒトＩｇＧ１に対応する、請求項１３に記載の抗体。
15. 前記第一および第二のＦｃポリペプチドが、２３４および／または２３５位に変異を含み、好ましくは、前記第一および第二のＦｃポリペプチドが、Ｌ２３４ＦおよびＬ２３５Ｅ置換を含み、前記アミノ酸位置が、ＥＵナンバリングシステムによるヒトＩｇＧ１に対応する、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の抗体。
16. 前記抗体が、第二の抗原結合領域を含み、前記第一の抗原結合領域が、配列番号４に記載される前記配列を含み、前記第二の抗原結合領域が、配列番号８に記載される前記配列を含み、
    －前記第一のＦｃポリペプチドが、配列番号１１に記載される配列を含み、前記第二のＦｃポリペプチドが、配列番号１２に記載される配列を含むか、または
    －前記第一のＦｃポリペプチドが、配列番号１１に記載される前記配列を含み、前記第二のＦｃポリペプチドが、配列番号１２に記載される前記配列を含む、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の抗体。
17. 前記抗体が、配列番号１６および配列番号１７に記載される配列を含むか、もしくはそれらからなるか、または配列番号１６および配列番号１８に記載される配列を含むか、もしくはそれらからなる、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の抗体。
18. 請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
19. 医薬として使用するため、好ましくは、癌の治療において使用するための、請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体。
20. 請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸構築物、前記核酸を含む発現ベクター、または請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体をコードする一つ以上の核酸構築物を含む宿主細胞。
21. 宿主細胞において請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体をコードする一つ以上の核酸を発現させることを含む、チロシン硫酸化のない抗体を製造するプロセスであって、前記宿主細胞が、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ヒト胚性腎細胞またはピキア・パストリス細胞である、プロセス。