JP2024019597A - 抗体薬物のコンジュゲーション、精製、及び製剤のための方法 - Google Patents

Abstract

【課題】抗体薬物のコンジュゲーション、精製、及び製剤のための方法の提供。【解決手段】抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の生成、精製及び製剤の方法が本明細書で提供される。本方法は、連続コンジュゲーションプロセス、シングルパス・タンジェンシャルフローろ過、向流ダイアフィルトレーション、及び／またはインラインプロセス自動化技術を使用する。本方法は、処理時間及びコストを減少させ、かつ生成物の均一性を向上させる。【選択図】なし

Description

本発明の技術分野は、概して、連続コンジュゲーションプロセス、シングルパス・タンジェンシャルフローろ過、向流ダイアフィルトレーション、及び／またはインラインプロセス自動化技術を用いた抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の生成、精製及び製剤の方法に関する。

抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）のコンジュゲーションに関連する製造上のボトルネックは、不純物の除去及びＡＤＣの安定なバッファーへの交換である。これは、現在は結合及び溶出カラムクロマトグラフィーまたはタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）によるバルクの（従来の）ダイアフィルトレーションを用いて達成される。バルクのダイアフィルトレーションは、ＴＦＦシステムをバッファーＡ（すなわち、コンジュゲートが最初に存在するバッファー）でプライミングすることを必要とする。次いで（バッファーＡ中の）ＡＤＣを、プライミング量と混合する保持液容器に添加する。保持液容器の供給ポンプは、コンジュゲートを保持液からＴＦＦ膜上へ送り込み、そこで、コンジュゲートは保持される（かつ、保持液へ戻る）か、または廃棄物へと廃棄されるかのいずれかである。別のポンプ（ダイアフィルトレーションポンプ）は、容器から、別個の容器内に含まれるバッファーＢ（すなわち、ＡＤＣが交換されるバッファー）へと、容器から保持液容器内への供給ラインを用いて供給することになる。両方のポンプが起動し、保持液容器内のコンジュゲートがＴＦＦ膜を通過し始める。バッファーは廃棄流を通じて除去されるため、保持液の容量はバッファーＢを（等量で）保持液容器に添加することによって維持される。その結果、コンジュゲートは徐々にバッファーＢに交換される。この精製方法は、ＡＤＣをＴＦＦ膜上で複数サイクル再循環させる必要があることから費用がかかり、ラージスケール製造には最適ではない。再循環によって、高処理量及び多くの処理時間ならびに潜在的な高剪断領域へのＡＤＣの曝露の増加が生じる。バルク処理によるＡＤＣの製造は、精製し、製剤したコンジュゲートのバッチを生成するのに約４～５日を必要とし、多くの場合低収率である。したがって、改良されたＡＤＣのコンジュゲーションプロセスが必要とされている。

Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なものなどのシングルパス・タンジェンシャルフローろ過（ＳＰＴＦＦ）システムは、バイオプロセスプラットフォームにおいて、多くの場合抗体などの生体分子の量を減少させるための手段または生物分子を濃縮するための手段として使用される。しかしながら、本発明者らは驚くべきことに、ＳＰＴＦＦを抗体薬物コンジュゲーション反応に連結させて抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の濃縮を促進できるだけではなく、非コンジュゲート生成物をコンジュゲート反応から除去し、精製したＡＤＣを製剤バッファーに交換でき、それにより完全に連続したＡＤＣの生成及び処理方法が可能となることを見出した。本発明者らはまた、同様の目的のために、向流ダイアフィルトレーションも抗体薬物コンジュゲーション反応に使用できることも見出した。

いくつかの実施形態では、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）組成物を生成するための連続的方法は、（ｉ）抗体またはその抗原結合断片を薬物とコンジュゲートさせてＡＤＣを形成すること、（ｉｉ）非コンジュゲート薬物を除去すること、及び（ｉｉｉ）ＡＤＣを安定なバッファーに交換することを含み、（ｉ）～（ｉｉｉ）が連続的に実施され、非コンジュゲート薬物を除去し及び／またはＡＤＣを安定なバッファーに交換するために、シングルパス・タンジェンシャルフローろ過（ＳＰＴＦＦ）が使用される。

いくつかの実施形態では、ＳＰＴＦＦは、非コンジュゲート薬物を除去してＡＤＣを安定なバッファーに交換するために使用される。いくつかの実施形態では、フロースルーカラムクロマトグラフィーが非コンジュゲート薬物を除去するために使用され、ＳＰＴＦＦがＡＤＣを安定なバッファーに交換するために使用される。

いくつかの実施形態では、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）組成物を生成するための連続的方法は、（ｉ）抗体またはその抗原結合断片を薬物とコンジュゲートさせてＡＤＣを形成すること、（ｉｉ）非コンジュゲート薬物を除去すること、及び（ｉｉｉ）ＡＤＣを安定なバッファーに交換することを含み、（ｉ）～（ｉｉｉ）が連続的に実施され、非コンジュゲート薬物を除去し及び／またはＡＤＣを安定なバッファーに交換するために向流ダイアフィルトレーションが使用される。

いくつかの実施形態では、向流ダイアフィルトレーションは、非コンジュゲート薬物を除去してＡＤＣを安定なバッファーに交換するために使用される。いくつかの実施形態では、フロースルーカラムクロマトグラフィーが非コンジュゲート薬物を除去するために使用され、向流ダイアフィルトレーションがＡＤＣを安定なバッファーに交換するために使用される。

いくつかの実施形態では、方法はさらに、抗体またはその抗原結合断片の前処理を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片の前処理は（ｉ）～（ｉｉｉ）と共に連続的に実施される。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片の前処理はＳＰＴＦＦを使用して実施される。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片の前処理は向流ダイアフィルトレーションを使用して実施される。いくつかの実施形態では、１つのＳＰＴＦＦ段階または向流ダイアフィルトレーション段階のみが前処理に使用される。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片の前処理は、（ｉ）～（ｉｉｉ）の前にバルクで実施される。

いくつかの実施形態では、方法はさらに、コンジュゲーションのための薬物の前処理を含む。

いくつかの実施形態では、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）組成物を生成するための連続的方法は、（ｉ）抗体またはその抗原結合断片を前処理すること、（ｉｉ）抗体またはその抗原結合断片を薬物とコンジュゲートさせてＡＤＣを形成すること、（ｉｉｉ）非コンジュゲート薬物を除去すること、及び（ｉｖ）ＡＤＣを安定なバッファーに交換することを含み、（ｉ）～（ｉｖ）が連続的に実施され、非コンジュゲート薬物を除去し及び／またはＡＤＣを安定なバッファーに交換するために、シングルパス・タンジェンシャルフローろ過（ＳＰＴＦＦ）が使用される。

いくつかの実施形態では、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）組成物を生成するための連続的方法は、（ｉ）抗体またはその抗原結合断片を前処理すること、（ｉｉ）抗体またはその抗原結合断片を薬物とコンジュゲートさせてＡＤＣを形成すること、（ｉｉｉ）非コンジュゲート薬物を除去すること、及び（ｉｖ）ＡＤＣを安定なバッファーに交換することを含み、（ｉ）～（ｉｖ）が連続的に実施され、非コンジュゲート薬物を除去し及び／またはＡＤＣを安定なバッファーに交換するために、向流ダイアフィルトレーションが使用される。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片の前処理は、抗体またはその抗原結合断片をコンジュゲーションのためのバッファーに交換することを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片の前処理は、抗体もしくはその抗原結合断片を還元させること及び／または抗体もしくはその抗原結合断片を酸化させることを含む。いくつかの実施形態では、還元させること及び／または酸化させることはＳＰＴＦＦまたは向流ダイアフィルトレーションを使用せずに達成される。いくつかの実施形態では、還元させること及び／または酸化させることは１つのＳＰＴＦＦ段階または向流ダイアフィルトレーション段階のみを使用して達成される。いくつかの実施形態では、還元させること及び／または酸化させることは２つ以上のＳＰＴＦＦ段階または向流ダイアフィルトレーション段階を使用して達成される。

いくつかの実施形態では、連続コンジュゲーションプロセスで抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を生成するための方法は、コンジュゲーション反応の進行中及び少なくとも１つのコンジュゲーション反応生成物（ＡＤＣ）の形成後、１つ以上のコンジュゲーション反応の反応物質をコンジュゲーション反応に添加することを含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲーション反応の反応物質は抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲーション反応の反応物質はリンカーに結合した薬物を含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲーション反応の反応物質はリンカーを含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲーション反応の反応物質はリンカーに結合した抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲーション反応の反応物質は薬物を含む。

いくつかの実施形態では、コンジュゲーション反応はフローリアクタ内で生じる。

いくつかの実施形態では、方法はさらに、抗体またはその抗原結合断片の前処理を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片の前処理はコンジュゲーション反応と共に連続的に実施される。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片の前処理はＳＰＴＦＦを使用して実施される。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片の前処理は向流ダイアフィルトレーションを使用して実施される。いくつかの実施形態では、１つのＳＰＴＦＦ段階または向流ダイアフィルトレーション段階のみが前処理に使用される。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片の前処理は、コンジュゲーション反応の前にバルクで実施される。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片の前処理は、抗体またはその抗原結合断片をコンジュゲーションのためのバッファーに交換することを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片の前処理は、抗体もしくはその抗原結合断片を還元させること及び／または抗体もしくはその抗原結合断片を酸化させることを含む。

いくつかの実施形態では、ＡＤＣはシングルパス・タンジェンシャルフローろ過を使用して濃縮される。いくつかの実施形態では、ＡＤＣはシングルパス・タンジェンシャルフローろ過を使用して精製される。いくつかの実施形態では、ＡＤＣはシングルパス・タンジェンシャルフローろ過を使用して製剤バッファーへ移される。

いくつかの実施形態では、ＡＤＣは向流ダイアフィルトレーションを使用して濃縮される。いくつかの実施形態では、ＡＤＣは向流ダイアフィルトレーションを使用して精製される。いくつかの実施形態では、ＡＤＣは向流ダイアフィルトレーションを使用して製剤バッファーへ移される。

いくつかの実施形態では、ＡＤＣはフロースルークロマトグラフィーを使用して濃縮され、精製され、及び／または製剤バッファーへ移される。

いくつかの実施形態では、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を濃縮するための方法は、シングルパス・タンジェンシャルフローろ過を使用することを含む。いくつかの実施形態では、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を精製するための方法は、シングルパス・タンジェンシャルフローろ過を使用することを含む。いくつかの実施形態では、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を製剤バッファーへ移すための方法は、シングルパス・タンジェンシャルフローろ過を使用することを含む。いくつかの実施形態では、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を濃縮するための方法は、向流ダイアフィルトレーションを使用することを含む。いくつかの実施形態では、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を精製するための方法は、向流ダイアフィルトレーションを使用することを含む。いくつかの実施形態では、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を製剤バッファーへ移すための方法は、向流ダイアフィルトレーションを使用することを含む。いくつかの実施形態では、ＡＤＣはバッチコンジュゲーションプロセスで生成される。いくつかの実施形態では、ＡＤＣは連続コンジュゲーションプロセスで生成される。

いくつかの実施形態では、シングルパス・タンジェンシャルフローろ過は限外ろ過膜を使用する。いくつかの実施形態では、シングルパス・タンジェンシャルフローろ過はダイアフィルトレーション膜を使用する。

いくつかの実施形態では、方法はＡＤＣ生成の均一性を向上させる。いくつかの実施形態では、方法はＡＤＣ生成のための時間を減少させる。

いくつかの実施形態では、シングルパス・タンジェンシャルフローろ過はＡＤＣ生成の均一性を向上させる。いくつかの実施形態では、シングルパス・タンジェンシャルフローろ過はＡＤＣの濃縮、精製または移動のための時間を減少させる。いくつかの実施形態では、シングルパス・タンジェンシャルフローろ過は使用するバッファーの量を減少させる。

いくつかの実施形態では、向流ダイアフィルトレーションはＡＤＣ生成の均一性を向上させる。いくつかの実施形態では、向流ダイアフィルトレーションはＡＤＣの濃縮、精製または移動のための時間を減少させる。いくつかの実施形態では、向流ダイアフィルトレーションは使用するバッファーの量を減少させる。

いくつかの実施形態では、方法はさらに分析対象のインラインモニタリングを含む。

いくつかの実施形態では、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を生成するための方法は、インラインモニタリングを使用してＡＤＣコンジュゲーション反応への成分の添加を測定することを含む。

いくつかの実施形態では、インラインモニタリングはＡＤＣコンジュゲーション反応に添加する成分の濃度を測定する。

いくつかの実施形態では、インラインモニタリングはＡＤＣコンジュゲーション反応に添加する成分の流量を測定する。いくつかの実施形態では、成分は、抗体もしくはその抗原結合断片、薬物、リンカー、リンカーに結合した薬物、リンカーに結合した抗体もしくはその抗原結合断片及び／またはコンジュゲーションバッファーである。

いくつかの実施形態では、方法はさらに、ｉｎ－ｓｉｔｕ反応への成分の添加を測定するためにインラインモニタリングすることを含む。いくつかの実施形態では、成分は薬物、リンカー、及び／またはｉｎ－ｓｉｔｕ反応バッファーである。

いくつかの実施形態では、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を生成するための方法は、（ｉ）ＡＤＣコンジュゲーション反応へのコンジュゲーションバッファーの添加を停止する時点、（ｉｉ）ＡＤＣコンジュゲーション反応内のコンジュゲーションバッファーの再循環を停止する時点、及び／または（ｉｉｉ）ＡＤＣコンジュゲーション反応からのコンジュゲーションバッファーのすすぎ落としを開始する時点を決定するための分析対象のインラインモニタリングを含む。いくつかの実施形態では、分析対象は非コンジュゲート薬物またはリンカーに結合した非コンジュゲート薬物である。

いくつかの実施形態では、ＡＤＣコンジュゲーションプロセスの後に抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を精製するための方法は、分析対象のインラインモニタリングを含む。いくつかの実施形態では、精製はろ過を含む。いくつかの実施形態では、ろ過は限外ろ過またはダイアフィルトレーションである。いくつかの実施形態では、ろ過はタンジェンシャルフローろ過である。いくつかの実施形態では、タンジェンシャルフローろ過は、シングルパス・タンジェンシャルフローろ過である。いくつかの実施形態では、ろ過は向流ダイアフィルトレーションである。

いくつかの実施形態では、分析対象は保持液中に存在する。いくつかの実施形態では、分析対象は非コンジュゲート薬物またはリンカーに結合した非コンジュゲート薬物の濃度である。いくつかの実施形態では、分析対象は、ＡＤＣまたは抗体もしくはその抗原結合断片の濃度である。いくつかの実施形態では、分析対象はコンジュゲーション反応バッファーまたはろ過バッファーの成分の濃度である。

いくつかの実施形態では、分析対象はｐＨである。

いくつかの実施形態では、分析対象は透過液中に存在する。いくつかの実施形態では、分析対象は、ＡＤＣまたは抗体もしくはその抗原結合断片の濃度である。いくつかの実施形態では、分析対象は非コンジュゲート薬物またはリンカーに結合した非コンジュゲート薬物の濃度である。

いくつかの実施形態では、精製はクロマトグラフィーを含み、分析対象はクロマトグラフィーカラムの終端で測定される。いくつかの実施形態では、分析対象はＡＤＣまたは抗体もしくはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、分析対象は非コンジュゲート薬物、リンカーに結合した非コンジュゲート薬物、コンジュゲーション反応バッファーの成分、またはクロマトグラフィーバッファーの成分である。

いくつかの実施形態では、コンジュゲーション反応はバッチコンジュゲーション反応である。いくつかの実施形態では、コンジュゲーション反応は連続コンジュゲーション反応である。

いくつかの実施形態では、インラインモニタリングは、可変経路長技術、フローセル装置、ＵＶセンサ、ラマン分光法、またはフーリエ変換赤外分光法（ＦＩＴＲ）を使用して実施される。

いくつかの実施形態では、分析対象のインラインモニタリングはＦｌｏｗＶＰＥを使用して実施される。

いくつかの実施形態では、インラインモニタリングはＡＤＣの収率を向上させる。いくつかの実施形態では、インラインモニタリングはＡＤＣの回収率を向上させる。いくつかの実施形態では、インラインモニタリングはＡＤＣ生成のための時間を減少させる。いくつかの実施形態では、インラインモニタリングは使用するバッファーの量を減少させる。

いくつかの実施形態では、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を生成するための方法は、ＡＤＣコンジュゲーション反応へのコンジュゲーション反応成分の添加を停止する時点を決定するための、分析対象のインラインモニタリングを含む。いくつかの実施形態では、成分は、抗体もしくはその抗原結合断片、薬物、リンカー、リンカーに結合した薬物、及び／またはコンジュゲーション反応バッファーである。

いくつかの実施形態では、ＡＤＣは抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＡＤＣは抗体の抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、ＡＤＣは、ＣＤ３７、ＣＤ３３、ＦＯＬＲ１、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ｃＭＥＴ、ＡＤＡＭ９、またはＨＥＲ２に特異的に結合する抗体または抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ｈｕＭｏｖｌ９、Ｚ４６８１Ａ、またはＧ４７３２ＡのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ
ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義のＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ定義のＣＤＲ、またはＡｂＭ定義のＣＤＲである。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号１～６、それぞれ配列番号７～１２、それぞれ配列番号１３～１８、それぞれ配列番号１９～２４、それぞれ配列番号２５～３０、またはそれぞれ配列番号３１～３６の配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３の配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号３７及び３８、それぞれ配列番号３７及び３９、それぞれ配列番号４０及び４１、それぞれ配列番号４２及び４３、それぞれ配列番号４４及び４５、それぞれ配列番号４６及び４７、またはそれぞれ配列番号４８及び４９の配列を含むＶＨ及びＶＬ配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号５０及び５１、それぞれ配列番号５０及び５２、それぞれ配列番号５３及び５４、またはそれぞれ配列番号５５及び５６の配列を含む重鎖配列及び軽鎖配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＡＤＣは、ＳＭＣＣ、ｓＳＰＤＢ、及びペプチドリンカーからなる群から選択されるリンカーを含む。いくつかの実施形態では、ＡＤＣはメイタンシノイドまたはインドリノ－ベンゾジアゼピンを含む。いくつかの実施形態では、メイタンシノイドはＤＭ１またはＤＭ４である。いくつかの実施形態では、インドリノ－ベンゾジアゼピンはＤＧＮ４６２またはＤＧＮ５４９である。

いくつかの実施形態では、ＡＤＣは、ＩＭＧＮ５２９、ＩＭＧＮ７７９、ＩＭＧＮ８５３、ＩＭＧＮ６３２またはＫａｄｃｙｌａである。

いくつかの実施形態では、ＩＭＧＮ８５３を生成するための方法は、（ｉ）ＩＭＧＮ８５３を形成するために、ｈｕＭｏｖｌ９抗体及びスルホ－ＳＰＤＢに結合したＤＭ４を連続コンジュゲーションプロセス中で混合することであって、任意でインラインモニタリングを使用してコンジュゲーション反応に添加したｈｕＭｏｖｌ９抗体の濃度を測定する、混合すること、（ｉｉ）任意でシングルパス・タンジェンシャルフローろ過を使用してＩＭＧＮ８５３を濃縮することであって、任意でインラインモニタリングを使用して保持液中の非コンジュゲート薬物の濃度を測定する、濃縮すること、（ｉｉｉ）シングルパス・タンジェンシャルフローろ過を使用してＩＭＧＮ８５３を精製することであって、任意でインラインモニタリングを使用して保持液中の非コンジュゲート薬物の濃度を測定する、精製すること、ならびに（ｉｖ）シングルパス・タンジェンシャルフローろ過を使用してＩＭＧＮ８５３を製剤バッファーに交換することであって、任意でインラインモニタリングを使用して保持液中の不純物の濃度を測定する、交換することを含む。

いくつかの実施形態では、ＩＭＧＮ８５３を生成するための方法は、（ｉ）ＩＭＧＮ８５３を形成するために、ｈｕＭｏｖｌ９抗体及びスルホ－ＳＰＤＢに結合したＤＭ４を連続コンジュゲーションプロセス中で混合することであって、任意でインラインモニタリングを使用してコンジュゲーション反応に添加したｈｕＭｏｖｌ９抗体の濃度を測定する、混合すること、（ｉｉ）任意でシングルパス・タンジェンシャルフローろ過及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用してＩＭＧＮ８５３を濃縮することであって、任意でインラインモニタリングを使用して保持液中の非コンジュゲート薬物の濃度を測定する、濃縮すること、（ｉｉｉ）シングルパス・タンジェンシャルフローろ過及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用してＩＭＧＮ８５３を精製することであって、任意でインラインモニタリングを使用して保持液中の非コンジュゲート薬物の濃度を測定する、精製すること、ならびに（ｉｖ）シングルパス・タンジェンシャルフローろ過及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用してＩＭＧＮ８５３を製剤バッファーに交換することであって、任意でインラインモニタリングを使用して保持液中の不純物の濃度を測定する、交換することを含む。

いくつかの実施形態では、ＩＭＧＮ７７９を生成するための方法は、（ｉ）ＩＭＧＮ７７９を形成するために、Ｚ４６８１Ａ抗体及びスルホ－ＳＰＤＢに結合したＤＧＮ４６２を連続コンジュゲーションプロセス中で混合することであって、任意でインラインモニタリングを使用してコンジュゲーション反応に添加したＺ４６８１Ａ抗体の濃度を測定する、混合すること、（ｉｉ）任意でシングルパス・タンジェンシャルフローろ過を使用してＩＭＧＮ７７９を濃縮することであって、任意でインラインモニタリングを使用して保持液中の非コンジュゲート薬物の濃度を測定する、濃縮すること、（ｉｉｉ）シングルパス・タンジェンシャルフローろ過を使用してＩＭＧＮ７７９を精製することであって、任意でインラインモニタリングを使用して保持液中の非コンジュゲート薬物の濃度を測定する、精製すること、ならびに（ｉｖ）シングルパス・タンジェンシャルフローろ過を使用してＩＭＧＮ７７９を製剤バッファーに交換することであって、任意でインラインモニタリングを使用して保持液中の不純物の濃度を測定する、交換することを含む。

いくつかの実施形態では、ＩＭＧＮ７７９を生成するための方法は、（ｉ）ＩＭＧＮ７７９を形成するために、Ｚ４６８１Ａ抗体及びスルホ－ＳＰＤＢに結合したＤＧＮ４６２を連続コンジュゲーションプロセス中で混合することであって、任意でインラインモニタリングを使用してコンジュゲーション反応に添加したＺ４６８１Ａ抗体の濃度を測定する、混合すること、（ｉｉ）任意でシングルパス・タンジェンシャルフローろ過及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用してＩＭＧＮ７７９を濃縮することであって、任意でインラインモニタリングを使用して保持液中の非コンジュゲート薬物の濃度を測定する、濃縮すること、（ｉｉｉ）シングルパス・タンジェンシャルフローろ過及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用してＩＭＧＮ７７９を精製することであって、任意でインラインモニタリングを使用して保持液中の非コンジュゲート薬物の濃度を測定する、精製すること、ならびに（ｉｖ）シングルパス・タンジェンシャルフローろ過及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用してＩＭＧＮ７７９を製剤バッファーに交換することであって、任意でインラインモニタリングを使用して保持液中の不純物の濃度を測定する、交換することを含む。

いくつかの実施形態では、ＩＭＧＮ６３２を生成するための方法は、（ｉ）ＩＭＧＮ６３２を形成するために、Ｇ４７３２Ａ抗体及びスルホン化ＤＮＧ５４９Ｃを連続コンジュゲーションプロセス中で混合すること、（ｉｉ）任意でシングルパス・タンジェンシャルフローろ過を使用してＩＭＧＮ６３２を濃縮することであって、任意でインラインモニタリングを使用して保持液中の非コンジュゲート薬物の濃度を測定する、濃縮すること、（ｉｉｉ）シングルパス・タンジェンシャルフローろ過を使用してＩＭＧＮ６３２を精製することであって、任意でインラインモニタリングを使用して保持液中の非コンジュゲート薬物の濃度を測定する、精製すること、ならびに（ｉｖ）シングルパス・タンジェンシャルフローろ過を使用してＩＭＧＮ６３２を製剤バッファーに交換することであって、任意でインラインモニタリングを使用して保持液中の不純物の濃度を測定する、交換することを含む。いくつかの実施形態では、Ｇ４７３２Ａ抗体は、コンジュゲーションプロセスの前に１つのＳＰＴＦＦ段階のみにおいて還元及び酸化される。

いくつかの実施形態では、ＩＭＧＮ６３２を生成するための方法は、（ｉ）ＩＭＧＮ６３２を形成するために、Ｇ４７３２Ａ抗体及びスルホン化ＤＮＧ５４９Ｃを連続コンジュゲーションプロセス中で混合すること、（ｉｉ）任意でシングルパス・タンジェンシャルフローろ過及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用してＩＭＧＮ６３２を濃縮することであって、任意でインラインモニタリングを使用して保持液中の非コンジュゲート薬物の濃度を測定する、濃縮すること、（ｉｉｉ）シングルパス・タンジェンシャルフローろ過及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用してＩＭＧＮ６３２を精製することであって、任意でインラインモニタリングを使用して保持液中の非コンジュゲート薬物の濃度を測定する、精製すること、ならびに（ｉｖ）シングルパス・タンジェンシャルフローろ過及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用してＩＭＧＮ６３２を製剤バッファーに交換することであって、任意でインラインモニタリングを使用して保持液中の不純物の濃度を測定する、交換することを含む。いくつかの実施形態では、Ｇ４７３２Ａ抗体は、コンジュゲーションプロセスの前に１つのＳＰＴＦＦ段階または向流ダイアフィルトレーション段階のみにおいて還元及び酸化される。

いくつかの実施形態では、方法は、コンジュゲーションプロセスの第１の温度を少なくとも５℃高温に上昇させることを含み、高温を２０分間以下維持する。

いくつかの実施形態では、ＡＤＣを生成するための方法は、コンジュゲーションプロセスの第１の温度を少なくとも５℃高温に上昇させることを含み、高温を２０分間以下維持する。

いくつかの実施形態では、高温は５５℃以下である。いくつかの実施形態では、第１の温度を少なくとも１０℃、少なくとも１５℃、少なくとも２０℃、または少なくとも３０℃上昇させる。

いくつかの実施形態では、高温は３５℃～５５℃であるか、または４０℃～５０℃である。

いくつかの実施形態では、第１の温度を高温まで上昇させることは、２分よりも長くかからないか、または１分よりも長くかからない。

いくつかの実施形態では、方法はさらに、高温を任意で第１の温度まで低下させることを含む。いくつかの実施形態では、高温を任意で第１の温度まで低下させることは、２分よりも長くかからないか、または１分よりも長くかからない。

いくつかの実施形態では、第１の温度を高温に上昇させ、次いで高温を低下させる段階を、少なくとも２回または少なくとも３回繰り返す。いくつかの実施形態では、第１の温度を高温に上昇させ、次いで高温を低下させる段階を、２～２０回または５～１０回繰り返す。

いくつかの実施形態では、方法は、コンジュゲーションプロセスの第１の温度を少なくとも５℃低温に低下させることを含み、低温を２０分間以下維持する。

いくつかの実施形態では、ＡＤＣを生成するための方法は、コンジュゲーションプロセスの第１の温度を少なくとも５℃低温に低下させることを含み、低温を２０分間以下維持する。いくつかの実施形態では、第１の温度を３０℃以下低下させる。いくつかの実施形態では、温度を少なくとも１０℃、少なくとも１５℃、または少なくとも２０℃低下させる。

いくつかの実施形態では、第１の温度を低温まで低下させることは、２分よりも長くかからないか、または１分よりも長くかからない。

いくつかの実施形態では、方法はさらに、低温を任意で第１の温度まで上昇させることを含む。いくつかの実施形態では、低温を任意で第１の温度まで上昇させることは、２分よりも長くかからないか、または１分よりも長くかからない。

いくつかの実施形態では、第１の温度を低温に低下させ、次いで低温を上昇させる段階を、少なくとも２回または少なくとも３回繰り返す。いくつかの実施形態では、第１の温度を低温に低下させ、次いで低温を上昇させる段階を、２～２０回または５～１０回繰り返す。

いくつかの実施形態では、高温または低温を１５分間以下維持する。いくつかの実施形態では、高温または低温を３０秒～１５分間維持する。いくつかの実施形態では、高温または低温を１５分～２０分間維持する。いくつかの実施形態では、高温または低温を１０分～１５分間維持する。いくつかの実施形態では、高温または低温を５分～１０分間維持する。いくつかの実施形態では、高温または低温を１分～５分間維持する。

いくつかの実施形態では、方法は、コンジュゲーションプロセスの第１のｐＨを少なくとも０．５変化させたｐＨに変化させることを含み、変化させたｐＨを２０分間以下維持する。

いくつかの実施形態では、ＡＤＣを生成するための方法は、コンジュゲーションプロセスの第１のｐＨを少なくとも０．５変化させたｐＨに変化させることを含み、変化させたｐＨを２０分間以下維持する。

いくつかの実施形態では、第１のｐＨを少なくとも１上昇させ、任意で、変化させたｐＨは９を超えない。いくつかの実施形態では、第１のｐＨを少なくとも２または少なくとも３上昇させる。

いくつかの実施形態では、第１のｐＨは少なくとも１低下し、任意で、変化させたｐＨは４を下回らない。いくつかの実施形態では、第１のｐＨを少なくとも２または少なくとも３低下させる。

いくつかの実施形態では、方法はさらに、変化させたｐＨを任意で第１のｐＨへ変化させることを含む。いくつかの実施形態では、第１のｐＨを変化させたｐＨに変化させ、次いで変化させたｐＨを変化させる段階を、少なくとも２回または少なくとも３回繰り返す。いくつかの実施形態では、第１のｐＨを変化させたｐＨに変化させ、次いで変化させたｐＨを変化させる段階を、２～２０回または５～１０回繰り返す。

いくつかの実施形態では、変化させたｐＨを１５分間以下維持する。いくつかの実施形態では、変化させたｐＨを３０秒～１５分間維持する。いくつかの実施形態では、変化させたｐＨを１５分～２０分間維持する。いくつかの実施形態では、変化させたｐＨを１０分～１５分間維持する。いくつかの実施形態では、変化させたｐＨを５分～１０分間維持する。いくつかの実施形態では、変化させたｐＨを１分～５分間維持する。

本明細書にて提供される方法に従って生成されるＡＤＣもまた、本明細書で提供される。

一体化したフィードバック制御機構を備えた完全連続式の抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）製造プロセス（下部）及びその従来のバッチ処理との関係（上部）を示す。 連続化可能技術を組み込んだ半バッチ式操作（下部）及びその従来のバッチ処理との関係（上部）を示すフローチャートである。 半バッチ式単位操作の連結（下部）及びその従来のバッチ処理との関係（上部）を示すフローチャートである。 実施例１に記載されている抗体薬物コンジュゲートＡＤＣ「ＩＭＧＮ８５３」のコンジュゲーションのための連続コンジュゲーションプロセスを示すフローチャートである。「ｍＡｂ」はモノクローナル抗体（すなわち、ｈｕＭｏｖｌ９）を指す。「Ｄ」は薬物（すなわち、メイタンシノイドＤＭ４）を指し、「Ｌ」はリンカー（すなわち、ｓＳＰＤＢ）を指す。 実施例１Ａに記載されている連続コンジュゲーション試験の構成を示す。第１のシリンジポンプ（Ｌ／Ｄ／ＤＭＡ）は、ＤＭＡに溶解したｉｎ－ｓｉｔｕ成分を供給する。バッファー（ＩＳ）シリンジポンプは、ｉｎ－ｓｉｔｕ反応バッファー（コンジュゲーション反応バッファーと同一であるが、ｉｎ－ｓｉｔｕ反応用のｐＨは７．６である）を供給する。第３のシリンジは、抗体及びｐＨ８．７のコンジュゲーション反応バッファーを供給する。「ｍＡｂ」はモノクローナル抗体（すなわち、ｈｕＭｏｖｌ９）を指す。「Ｄ」は薬物（すなわち、メイタンシノイドＤＭ４）を指し、「Ｌ」はリンカー（すなわち、ｓＳＰＤＢ）を指す。「ＩＳ」はｉｎ－ｓｉｔｕを指す。 実施例１Ｂに記載されているＩＬＣ、ＩＬＤＦ１及びＩＬＤＦ２ステージにて採取した試料中の４つの主要な不純物種についての遊離薬物不純物レベルを示す。 実施例１Ｂに記載されているＩＬＤＦ１にて１５ｍｇ／ｍＬの供給濃度において採取した試料中の４つの主要な不純物種についての遊離薬物不純物レベルを示す。 連続精製プロセス及びバッチＴＦＦ精製プロセスの遊離薬物不純物レベルの比較を示す。実施例１Ｂに記載されているように、連続（ストライプバー）コンジュゲート材料は１５ｇ／Ｌの開始濃度で処理され、一方、バッチ（無地バー）材料は３０ｇ／Ｌで処理された。 実施例１Ｂに記載されているＩＬＤＦ１にて３０ｍｇ／ｍＬの供給濃度において採取した試料中の４つの主要な不純物種についての遊離薬物不純物レベルを示す。 実施例２に記載されている抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）「ＩＭＧＮ６３２」のコンジュゲーションのための連続コンジュゲーションプロセスを示すフローチャートである。「ｍＡｂ」はモノクローナル抗体（すなわち、Ｇ４７２３Ａ）を指す。 ＩＭＧＮ６３２の化学構造を示す。ＩＭＧＮ６３２は、亜硫酸水素ナトリウム中で細胞毒性ペイロードＤＧＮ５４９－Ｃに結合した抗ＣＤ１２３ Ｇ４７２３抗体を含有するＡＤＣを含む組成物である。組成物中のＡＤＣの大部分が、上部パネルに示すスルホン化変種で存在する。下部パネルは、細胞毒性ペイロードＤＧＮ５４９－Ｃ（モノイミン構造）に結合した抗ＣＤ１２３ Ｇ４７２３抗体を含有するＡＤＣの非スルホン化形態を示し、これもまた、ＩＭＧＮ６３２組成物中に存在し得る。 インラインプロセス自動化技術（ＰＡＴ）の使用が、制御及び検出感度を向上させるためにどのように使用され得るかを示す。 高温を用いてコンジュゲーション反応をパルスするために使用され得る加熱及び冷却リアクタの概略図を示す。パルスリアクタ（「ＰＲ」と表示されている）では、ジャケット温度を上昇させ、それによりコイル中に含まれる反応成分を一時的に加熱して、短い温度の変位を誘導する。次に、冷却リアクタ（「ＣＲ」と表示されている）では、ジャケット温度はより低温に維持され、コイル中の反応成分を高温から低温に戻す。これは、反応中に生じる凝集の量を減少させることができる。滞留時間リアクタ（ＲＴＲ）は、パルス完了後に所望の反応温度を維持し、その体積は所望の反応時間に基づき得る。 ＩＭＧＮ８５３のコンジュゲーションの速度（左パネル）及び連続した２０℃の温度またはより高い温度での繰り返しのパルスのいずれかに曝露されたコンジュゲーション反応における高分子量（ＨＭＷ；凝集体）種の蓄積を示す。

Ｉ．定義
本明細書で使用する場合、用語「抗体薬物コンジュゲート」（ＡＤＣ）及び「イムノコンジュゲート」は細胞結合物質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）に結合した化合物またはその誘導体を指し、一般式：Ｄ－Ｌ－Ａによって定義され、ここで、Ｄ＝細胞毒性薬物、Ｌ＝リンカー、及びＡ＝抗体または抗体断片である。ＡＤＣは、逆の順番の一般式：Ａ－Ｌ－Ｄによっても定義され得る。ＡＤＣは抗体またはその抗原結合断片あたり複数の薬物及びリンカー、例えば、（Ｄ－Ｌ）_４－ＡまたはＡ－（Ｌ－Ｄ）_２を含み得る。用語「抗体薬物コンジュゲート」及び「イムノコンジュゲート」は、本明細書において互換的に使用される。

「リンカー」は、薬物を細胞結合物質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）に安定な共有結合の様式で結合させることができるあらゆる化学的部分である。リンカーは、化合物または抗体が活性を維持する条件下で、酸誘発性切断、光誘発性切断、ペプチダーゼ誘発性切断、エステラーゼ誘発性切断、及びジスルフィド結合切断に対して感受性であるかまたは実質的に耐性であり得る。好適なリンカーは当該技術分野で周知であり、例えば、ジスルフィド基、チオエーテル基、及びペプチドリンカーが含まれる。

用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を介して、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、または前述のものの組み合わせなどの標的を認識し、かつそれに特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、抗体が所望の生物活性を示す限り、インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体を含む融合タンパク質、及び他の任意の改変免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューと呼ばれるそれらの重鎖定常ドメインの識別に基づいて、免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、またはそれらのサブクラス（アイソタイプ）（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）のうちのいずれかの抗体であり得る。免疫グロブリンの異なるクラスは、異なりかつ周知であるサブユニット構造及び三次元的配置を有する。抗体は裸であり得、または、毒素、放射性同位体などの他の分子とコンジュゲートされ得る。

用語「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部を指す。「抗原結合断片」は、抗原に結合するインタクトな抗体の一部を指す。抗原結合断片は、インタクトな抗体の抗原決定可変領域を含み得る。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、線状抗体、ならびに単鎖抗体が挙げられるがこれらに限定されない。抗体断片は裸であり得、または、毒素、放射性同位体などの他の分子とコンジュゲートされ得る。

本明細書で使用する場合、用語「可変領域」または「可変ドメイン」は互換的に使用され、当該技術分野において一般的である。可変領域は一般に抗体の一部、通常、軽鎖または重鎖の一部、典型的には成熟重鎖のアミノ末端付近の１１０～１２０アミノ酸または１１０～１２５アミノ酸及び成熟軽鎖の約９０～１１５アミノ酸を指し、これらは抗体間の配列において広く異なっており、その特定の抗原に対する特定の抗体の結合及び特異性において使用される。配列の可変性は相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる領域に集中しており、一方、可変ドメイン内のより高度に保存された領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。いかなる特定の機構または理論にも拘束されることを望むものではないが、軽鎖及び重鎖のＣＤＲは、抗体の抗原に対する相互作用及び特異性の主要因であると考えられる。特定の実施形態では、可変領域はヒト可変領域である。特定の実施形態では、可変領域はげっ歯類またはマウスのＣＤＲ及びヒトのフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。特定の実施形態では、可変領域は霊長類（例えば、非ヒト霊長類）の可変領域である。特定の実施形態では、可変領域はげっ歯類またはマウスのＣＤＲ及び霊長類（例えば、非ヒト霊長類）のフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。

用語「ＶＬ」及び「ＶＬドメイン」は互換的に使用され、抗体の軽鎖可変領域を指す。

用語「ＶＨ」及び「ＶＨドメイン」は互換的に使用され、抗体の重鎖可変領域を指す。

「Ｋａｂａｔ付番」及び類似の用語は当該技術分野において認識されており、抗体またはその抗原結合断片の重鎖及び軽鎖の可変領域におけるアミノ酸残基の付番システムを指す。特定の態様では、ＣＤＲはＫａｂａｔ付番システムに従って決定され得る（例えば、Ｋａｂａｔ ＥＡ ＆ Ｗｕ ＴＴ（１９７１）Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １９０：３８２－３９１及びＫａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２を参照のこと）。Ｋａｂａｔ付番システムを使用すると、抗体の重鎖分子内のＣＤＲは一般にアミノ酸位置３１～３５に存在しており、３５（Ｋａｂａｔ付番スキームでは３５Ａ及び３５Ｂと称される）（ＣＤＲ１）、アミノ酸位置５０～６５（ＣＤＲ２）、及びアミノ酸位置９５～１０２（ＣＤＲ３）に続く１つまたは２つの追加のアミノ酸を任意で含み得る。Ｋａｂａｔ付番システムを使用すると、抗体の軽鎖分子内のＣＤＲは一般に、アミノ酸位置２４～３４（ＣＤＲ１）、アミノ酸位置５０～５６（ＣＤＲ２）、及びアミノ酸位置８９～９７（ＣＤＲ３）に存在している。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体のＣＤＲはＫａｂａｔ付番スキームに従って決定される。

Ｃｈｏｔｈｉａは代わりに、構造ループの位置を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））。Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ－Ｈ１ループの末端は、Ｋａｂａｔ付番の慣例を使用して付番した場合、ループの長さに応じてＨ３２とＨ３４の間で変化する（これは、Ｋａｂａｔ付番スキームがＨ３５Ａ及びＨ３５Ｂで挿入を配置するためであり、３５Ａと３５Ｂのいずれも存在しない場合はループは３２で終了し、３５Ａのみが存在する場合はループは３３で終了し、３５Ａと３５Ｂの双方が存在する場合はループは３４で終了する）。ＡｂＭ超可変領域はＫａｂａｔ ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造ループとの間の折衷を表し、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されている。

本明細書で使用する場合、用語「定常領域」または「定常ドメイン」は互換的であり、当該技術分野において共通の意味を有する。定常領域は、抗体の抗原との結合に直接関与しないが、Ｆｃ受容体との相互作用などの様々なエフェクター機能を示し得る抗体の部分、例えば、軽鎖及び／または重鎖のカルボキシル末端部分である。免疫グロブリン分子の定常領域は、通常、免疫グロブリン可変ドメインと比較して、より保存されたアミノ酸配列を有する。特定の態様では、抗体または抗原結合断片は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に十分な定常領域またはそれらの部分を含む。

本明細書で使用する場合、用語「重鎖」は、抗体に関して使用するとき、ＩｇＧのサブクラス、例えばＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、及びＩｇＧ_４を含むＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭクラスの抗体をそれぞれ生じる定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてあらゆる異なる型、例えば、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）、及びミュー（μ）を指し得る。重鎖のアミノ酸配列は、当該技術分野において周知である。特定の実施形態では、重鎖はヒト重鎖である。

本明細書で使用する場合、用語「軽鎖」は、抗体に関して使用するとき、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてあらゆる異なる型、例えば、カッパ（κ）またはラムダ（λ）を指し得る。軽鎖のアミノ酸配列は、当該技術分野において周知である。特定の実施形態では、軽鎖はヒト軽鎖である。

本明細書で使用する場合、用語「コンジュゲーションプロセス」は、コンジュゲーション反応の反応物質（例えば、細胞結合物質、薬物、及びリンカー；細胞結合物質及びリンカーに結合した薬物；またはリンカーと薬物に結合した細胞結合物質）を、反応物質を反応させＡＤＣを形成させることができる条件下で混合するプロセスを指す。

本明細書で使用する場合、用語「バッチコンジュゲーションプロセス」は、コンジュゲーション反応の反応物質をバルクで共に混合し、コンジュゲーション反応が生じてコンジュゲーション反応生成物（ＡＤＣ）が形成され、次いで、コンジュゲーション反応生成物（ＡＤＣ）をバルクで取り出すコンジュゲーションプロセスを指す。

本明細書で使用する場合、用語「連続コンジュゲーションプロセス」は、コンジュゲーション反応の進行中及び少なくとも１つのコンジュゲーション反応生成物（ＡＤＣ）の形成後、１つ以上のコンジュゲーション反応の反応物質をコンジュゲーション反応に添加し続けるコンジュゲーションプロセスを指す。コンジュゲーション反応生成物（ＡＤＣ）は、コンジュゲーション反応の進行に伴いコンジュゲーション反応から取り出し続けることができる。

本明細書で使用する場合、用語「ｉｎ－ｓｉｔｕ反応」は、薬物とリンカーを混合してリンカーに結合した薬物を形成するプロセスを指す。次いで、リンカーに結合した薬物を細胞結合物質（例えば、抗体）とのコンジュゲーション反応に使用して、ＡＤＣを形成することができる。

本明細書で使用する場合、用語「フローリアクタ」は、連続反応化学作用に用いられるあらゆる反応容器を指し、典型的には管状である。フローリアクタはステンレス鋼、ガラス、ポリマーなどで製造することができる。

本明細書で使用する場合、用語「インラインモニタリング」は分析対象をリアルタイムで、例えば、コンジュゲーション反応、濃縮プロセス、精製プロセス、またはバッファー交換プロセスが生じている間にモニタリングすることを指す。

本明細書で使用する場合、用語「フィルタ」は、流体中の種を分離できる選択的障壁を指す。分離は、流体の１つ以上の種をフィルタを通して選択的に通過させ（透過させ）、その一方で、１つ以上の他の種の通過を遅延させることにより達成される。

本明細書で使用する場合、用語「供給流」は、フィルタまたは膜中の成分を分離するためにフィルタまたは膜に供給されている流体を指す。

本明細書で使用する場合、用語「保持液」は、フィルタを通過しない供給流の一部を指す。

本明細書で使用する場合、用語「透過液」は、フィルタを通過する供給流の一部を指す。

本明細書で使用する場合、用語「タンジェンシャルフローろ過」（ＴＦＦ）は、供給流が膜表面に対して平行に通過する膜ベースのろ過プロセスを指す。供給流の一部は膜を通過し（透過液）、一方で、残り（保持液）は再循環して供給リザーバへと戻る。ＴＦＦは、クロスフローろ過とも称される。ＴＦＦを実施するためのシステムは周知であり、例えば、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ型システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）、Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｃａｓｓｅｔｔｅシステム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＡＧ，Ｅｄｇｅｗｏｏｄ，ＮＹ）、及びＣｅｎｔｒａｓｅｔｔｅ型システム（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ，ＮＹ）が挙げられる。

本明細書で使用する場合、用語「シングルパス・タンジェンシャルフローろ過」（ＳＰＴＦＦ）は、供給流がろ過膜上を１回のみ通過するタンジェンシャルフローろ過プロセスを指す。ＳＰＴＦＦを実施するためのシステムは周知であり、例えばＣａｄａｎｃｅ型システム（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）が挙げられる。ＳＰＴＦＦを実施するためのシステム及び方法は、例えば、米国特許第７，３８４，５４９号、米国特許第７，５１０，６５４号、米国特許第７，６８２，５１１号、米国特許第７，９６７，９８７号、米国特許第８，１５７，９９９号、及び米国特許第８，２３１，７８７号に開示されており、これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用する場合、用語「連続ダイアフィルトレーション」は、供給流を希釈剤と混合し、透過液及び保持液を除去しながら供給流を膜全体へ送り込むことにより、連続方式で溶質の選択的分離が達成されるダイアフィルトレーションプロセスを指す。ろ過プロセスの進行に伴い、生成物は容器中には形成されず、代わりにろ過の過程中、系から連続的に回収される。「向流ダイアフィルトレーション」は、プロセス流（例えば、透過液または保持液）をダイアフィルトレーション段階にて再循環させる連続ダイアフィルトレーションプロセスを指す。

用語「インラインモニタリング」は、分析対象をリアルタイムで、例えば、生成プロセスまたは精製プロセス中にモニタリングすることを指す。インラインモニタリングは、リアルタイムのフィードバックを提供しないインプロセスの試料採取またはオフラインの分析とは区別される。

用語「インラインプロセス自動化技術」は、プロセス中に分析対象をモニタリングするために使用されるあらゆるインライン測定装置を指す。

本明細書で使用する場合、用語「分析対象」は広義の用語であり、分析することができる流体中の物質または化学成分を指すが、これらに限定されない。分析対象には、天然由来の物質、人工の物質、代謝物及び／または反応生成物が含まれ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法における測定のための分析対象は、抗体もしくはその抗原結合断片、薬物、リンカー、抗体もしくはその抗原結合断片に結合したリンカー、薬物に結合したリンカー、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、薬物抗体比（ＤＡＲ）、及び／または不純物である。

本明細書で使用する場合、用語「反応バッファー」は、反応が生じ得るバッファーを指す。したがって、本明細書で使用する場合、用語「コンジュゲーション反応バッファー」または「コンジュゲーションバッファー」は、コンジュゲーション反応（連続コンジュゲーション反応またはバッチコンジュゲーション反応）が生じ得るバッファーを指す。同様に、本明細書で使用する場合、用語「ｉｎ－ｓｉｔｕ反応バッファー」または「ｉｎ－ｓｉｔｕバッファー」は、ｉｎ－ｓｉｔｕ反応が生じ得るバッファーを指す。

本明細書で使用する場合、用語「製剤バッファー」は、有効成分の生物活性を有効にし、かつ製剤を投与する対象に対して許容できない毒性を有する付加的な成分を含まないバッファーを指す。

本明細書で使用する場合、用語「インドリノベンゾジアゼピン」（ＩＧＮ）は、インドリノベンゾジアゼピンコア構造を有する化合物を指す。インドリノベンゾジアゼピンは、置換または非置換であり得る。インドリノベンゾジアゼピンは、リンカーによって結合した２つのインドリノベンゾジアゼピンコアを有する化合物も含む。インドリノベンゾジアゼピンコアの一部としてのイミン官能基（－Ｃ＝Ｎ－）は還元され得る。特定の実施形態では、インドリノベンゾジアゼピン化合物は

で表されるコア構造を含み、任意に置換することができる。

いくつかの実施形態では、インドリノベンゾジアゼピン化合物は

で表されるコア構造を含み、さらに置換することができる。

本明細書で使用する場合、用語「ピロロベンゾジアゼピン」（ＰＢＤ）は、ピロロベンゾジアゼピンコア構造を有する化合物を指す。ピロロベンゾジアゼピンは、置換または非置換であり得る。ピロロベンゾジアゼピンは、リンカーによって結合した２つのピロロベンゾジアゼピンコアを有する化合物も含む。インドリノベンゾジアゼピンコアの一部としてのイミン官能基（－Ｃ＝Ｎ－）は還元され得る。特定の実施形態では、ピロロベンゾジアゼピン化合物は

で表されるコア構造を含み、任意に置換することができる。特定の実施形態では、ピロロベンゾジアゼピン化合物は

で表されるコア構造を含み、任意に置換することができる。

本開示及び特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈により別途明確に指示されない限り、複数形も含まれる。

本明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉で実施形態が記載される場合はいつでも、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び／または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語で記載される別の類似の実施形態もまた、提供されることが理解される。

本明細書における「Ａ及び／またはＢ」などの表現において使用される用語「及び／または」は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」、及び「Ｂ」のいずれも含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」などの表現において使用される用語「及び／または」は、以下の実施形態：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）の各々を包含することが意図される。

ＩＩ．連続コンジュゲーション、シングルパス・タンジェンシャルフローろ過、及び向流ダイアフィルトレーション
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成及び／または処理するための連続的方法が、本明細書で提供される。バッチ形成及びバッチ処理では、成分をプロセスに添加し、プロセスを一定時間進行させ、次いでプロセスの生成物をバルクで取り出す。対照的に、本明細書で提供される連続的方法では、成分を進行中のプロセスに添加し続け、生成物はプロセス終了時のバルクによる代わりに、プロセス全体を通して取り出され得る。例えば、連続コンジュゲーションプロセスでは、反応の進行中及び少なくとも１つのコンジュゲーション反応生成物（ＡＤＣ）の形成後、１つ以上のコンジュゲーション反応の反応物質をコンジュゲーション反応に添加し続ける。同様に、下流の連続濃縮プロセス、精製プロセス、及び／またはバッファー交換プロセスでは、これらのプロセスの進行に伴い、ＡＤＣ、バッファー、及び／または他の成分を濃縮プロセス、精製プロセス、及び／またはバッファー交換プロセスに連続的に添加して、濃縮し、精製し、及びバッファー交換したＡＤＣを、これらの進行中のプロセスから連続的に取り出すことができる。したがって、ＡＤＣのコンジュゲーションからＡＤＣの製剤までのＡＤＣプロセス全体は、連続的であり得る（例えば、図１（下部）を参照のこと）。

本発明者らは、コンジュゲーションプロセスがフローリアクタを用いて連続的に実施され得ることを実証した。フローリアクタによって、コンジュゲーション反応の進行中及び少なくとも１つのコンジュゲーション反応生成物（ＡＤＣ）の形成後、１つ以上のコンジュゲーション反応の反応物質をコンジュゲーション反応に連続的に添加することができる。コンジュゲーションプロセスにおいてフローリアクタを使用することによって、コンジュゲーション反応の制御及びコンジュゲーションプロセスの汎用性（例えば、急速な温度変化／より厳格な温度制御、拡散により媒介されるためより均一である混合、及び容器または一組の（ｓｕｉｔｅ）の制限による制約がないこと）ならびにＡＤＣコンジュゲーションプロセスの改善された拡張性（すなわち、従来のバッチ処理のスケールアップリスクが当てはまらず、空時収率が最適化される（例えば、現行のプロセスを長時間実行することにより擬似的なスケールアップ（生成量の増加）を実施すること））が可能になる。

本発明者らは、さらに、連続ＡＤＣ処理は、非コンジュゲート薬物をＡＤＣから良好に分離できるシングルパス・タンジェンシャルフローろ過（ＳＰＴＦＦ）を用いて達成することができることを実証した。バルクの（従来の）ダイアフィルトレーションは、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）システムを第１のバッファーＡ（生成物が最初に存在するバッファー）でプライミングすることを含む。次いで、生成物を、プライミング量と混合する保持液容器に添加する。保持液容器用の供給ポンプは、生成物を保持液からＴＦＦ膜上へ送り込み、そこで、コンジュゲートは保持される（かつ、保持液へ戻る）か、または廃棄物へと廃棄されるかのいずれかである。別のポンプ（ダイアフィルトレーションポンプ）は、容器から、別個の容器内に含まれるバッファーＢ（生成物が交換されるバッファー）へと、容器から保持液容器への供給ラインを用いて供給することになる。両方のポンプが起動し、保持液容器内の生成物がＴＦＦ膜を通過し始める。バッファーは廃棄流を通じて除去されるため、保持液の容量はバッファーＢを（等量で）保持液容器に添加することによって維持される。その結果、生成物は徐々にバッファーＢに交換される。

ＳＰＴＦＦは、最初にバッファーＡに存在する生成物のバッファーＢへの交換という関連する概念を使用する。しかしながら、生成物は膜上を常に１回しか通過しないため、完全なバッファー交換を達成するためのバッファーＢの適切な容量のすべてが達成されなければならない。これを行うために、ＳＰＴＦＦは積層したステージ上にバッファーＢを添加することができる。したがって、生成物は膜を１回のみ通過する。すなわち、バッファーＡに入り、バッファーＢ中のモジュールを出る。

同様に、連続ＡＤＣ処理は向流ダイアフィルトレーションを用いて実現することができる。

したがって、本明細書にて提供される連続ＡＤＣ処理法（例えば、ＳＰＴＦＦ及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用すること）は、バッチＡＤＣ処理と比較して、処理時間を減少させ、収率を改善し、及び／または生成物の均一性を向上させることができる。本明細書にて提供される連続ＡＤＣ処理法（例えば、ＳＰＴＦＦ及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用すること）は、バッチコンジュゲーションプロセスで用いられる保持段階を省略することもできる。本明細書にて提供される連続ＡＤＣ処理法（例えば、ＳＰＴＦＦ及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用すること）により、より小さな装置の使用も可能になる。ＳＰＴＦＦはまた、剪断力によって潜在的に生じ得る酸化に対し感受性である抗体が、ＳＰＴＦＦにより適し得るため好都合である。

ＡＤＣ処理は、ＡＤＣのコンジュゲーション（形成）、ＡＤＣの濃縮、ＡＤＣの精製、及び／またはＡＤＣの製剤を含み得る。ＡＤＣのコンジュゲーションから製剤までのプロセス全体を連続的にする（例えば、図１に示すように）ことが特に有用であるが、連続処理段階をバッチ処理段階と組み合わせる（例えば、図２及び図３に示すように）ことも可能である。さらに、上流の処理段階（例えば、抗体、リンカー及び／または薬物の調製）を連続的にして、ＡＤＣのコンジュゲーションへと連続的に供給することが可能である。

したがって、本明細書にて提供されるいくつかの方法では、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成するコンジュゲーションプロセスは連続的である。連続コンジュゲーションプロセスでは、コンジュゲーション反応の進行中及び少なくとも１つのコンジュゲーション反応生成物（ＡＤＣ）の形成後、１つ以上のコンジュゲーション反応の反応物質をコンジュゲーション反応に添加し続ける。構築したＡＤＣを系から取り出す間に、コンジュゲーション反応の反応物質を系に入れることができる。例えば、本明細書にて提供されるいくつかの連続コンジュゲーションプロセスでは、細胞結合物質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）、リンカーに結合した薬物、及びコンジュゲーション反応バッファーを、コンジュゲーション反応の進行中及び少なくとも１つのＡＤＣの形成後、コンジュゲーション反応に連続的に添加する。本明細書にて提供されるいくつかの連続コンジュゲーションプロセスでは、リンカーに結合した細胞結合物質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）、薬物、及びコンジュゲーション反応バッファーを、コンジュゲーション反応の進行中及び少なくとも１つのＡＤＣの形成後、コンジュゲーション反応に連続的に添加する。本明細書にて提供されるいくつかの連続コンジュゲーションプロセスでは、細胞結合物質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）、薬物、リンカー、及びコンジュゲーション反応バッファーを、コンジュゲーション反応の進行中及び少なくとも１つのＡＤＣの形成後、コンジュゲーション反応に連続的に添加する。連続的に添加する反応物質は、単一の供給流中に共に添加することができ、または収集容器に別々に供給するか、もしくは反応容器に直接供給することができる。

本明細書にて提供されるいくつかの連続コンジュゲーションプロセスでは、細胞結合物質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）、リンカーに結合した細胞結合物質、薬物、リンカーに結合した薬物、リンカー、またはコンジュゲーション反応バッファーのうち１つのみを、コンジュゲーション反応の進行中及び少なくとも１つのＡＤＣの形成後、コンジュゲーション反応に連続的に添加する。本明細書にて提供されるいくつかの連続コンジュゲーションプロセスでは、細胞結合物質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）、リンカーに結合した細胞結合物質、薬物、リンカーに結合した薬物、リンカー及びコンジュゲーション反応バッファーからなる群から選択される２つの反応物質を、コンジュゲーション反応の進行中及び少なくとも１つのＡＤＣの形成後、コンジュゲーション反応に連続的に添加する。

ＳＰＴＦＦの使用によって、コンジュゲーション反応からの成分の連続的な添加及び／または除去が可能となる。したがって、ＳＰＴＦＦは、ＡＤＣコンジュゲーションのための反応物質の調製及び構築したＡＤＣの処理のために使用することができる。ＳＰＴＦＦは、特定のＡＤＣのための処理段階（例えば、生成、濃縮、精製、及び／または製剤）のすべて（もしくは一部）が同時に起こり得るように、連続ＡＤＣ処理を可能にすることができる。向流ダイアフィルトレーションもまた、ＡＤＣコンジュゲーションのための反応物質の調製及び構築したＡＤＣの処理のために使用することができる。

本明細書にて提供される方法に従って、ＳＰＴＦＦは、ＡＤＣを濃縮するために、ＡＤＣを精製するために、及び／またはＡＤＣを製剤するために（例えば、ＡＤＣを製剤バッファーに交換することによって）使用することができる。ＳＰＴＦＦは、ＡＤＣを第１のバッファーから第２のバッファーへ移すために使用することができる。向流ダイアフィルトレーションもまた、ＡＤＣを濃縮するために、ＡＤＣを精製するために、及び／またはＡＤＣを製剤するために（例えば、ＡＤＣを製剤バッファーに交換することによって）使用することができ、向流ダイアフィルトレーションはまた、ＡＤＣを第１のバッファーから第２のバッファーへ移すために使用することもできる。

本明細書にて提供されるいくつかの方法では、ＳＰＴＦＦはＡＤＣの生成、精製、及び製剤の全体にわたり使用され、ＡＤＣ生成から製剤までのプロセス全体を連続的にする。本明細書にて提供されるいくつかの方法では、向流ダイアフィルトレーションはＡＤＣの生成、精製、及び製剤の全体にわたり使用され、ＡＤＣ生成から製剤までのプロセス全体を連続的にする。したがって、例示的な図４及び図１０に示すプロセス全体は、連続的であり得る。

本明細書にて提供されるいくつかの方法では、ＳＰＴＦＦは、例示的な図４及び図１０に示すプロセスのいくつかの部分が連続的であり、その一方で他の部分はバッチで実施されるように、従来のＴＦＦと組み合わせて使用される。例えば、抗体またはその抗原結合断片を、コンジュゲーションの前に、従来の（バッチの）ＴＦＦ（例えば、図４のＴＦＦ１を参照のこと）を使用してバッファー交換することができ、次いで、ＳＰＴＦＦが下流のプロセス（例えば、図４のＴＦＦ２ステージＩ及びＩＩを参照のこと）に使用される連続プロセスへと供給する。このような方法において、向流ダイアフィルトレーションをＳＰＴＦＦの代わりに、またはＳＰＴＦＦと組み合わせて使用することができる。

図４及び図１０において、点線で示した各枠は、バッチ方式または連続方式のいずれかで行うことができるプロセスの個々の部分を表す。例えば、図４の左上の枠に示す、コンジュゲーションのために抗体をバッファーに入れるプロセスは、ＳＰＴＦＦを使用して連続方式で実施することができ、または従来のＴＦＦを使用してバッチ方式で実施することもできる。コンジュゲーションのために抗体をバッファーに入れるプロセスをバッチ方式で実施するかまたは連続方式で実施するかどうかに関わらず、コンジュゲーション反応の下流の枠に示すＡＤＣの濃縮及び精製プロセスは、ＳＰＴＦＦを使用して連続方式で実施することができ、または従来のＴＦＦを使用してバッチ方式で実施することもできる。同様に、コンジュゲーションのために抗体をバッファーに入れるプロセスをバッチプロセスで実施するかまたは連続プロセスで実施するかどうかに関わらず、かつＡＤＣをバッチプロセスで濃縮及び精製するかまたは連続プロセスで濃縮及び精製するかどうかに関わらず、連続方式でＳＰＴＦＦを使用してまたはバッチ方式で従来のＴＦＦを使用してＡＤＣを製剤することができる。このような方法において、向流ダイアフィルトレーションをＳＰＴＦＦの代わりに、またはＳＰＴＦＦと組み合わせて使用することができる。

いくつかの実施形態では、ＡＤＣプロセスの少なくとも２つの段階がＳＰＴＦＦを使用して実施される。例えば、いくつかの実施形態では、ＳＰＴＦＦが抗体またはその抗原結合断片をコンジュゲーションバッファーに移すために使用され、かつＡＤＣの形成後、ＡＤＣを濃縮及び精製するために使用されるが、一方で、ＳＰＴＦＦまたはＴＦＦのいずれかがＡＤＣを製剤バッファーに交換するために使用される。いくつかの実施形態では、ＳＰＴＦＦが抗体またはその抗原結合断片をコンジュゲーションバッファーに移すために使用され、かつ精製したＡＤＣを製剤バッファーに交換するために使用されるが、一方で、ＳＰＴＦＦまたはＴＦＦのいずれかがＡＤＣの形成後、ＡＤＣを濃縮及び精製するために使用される。いくつかの実施形態では、ＳＰＴＦＦがＡＤＣを濃縮及び精製するために使用され、かつ濃縮し精製したＡＤＣを製剤バッファーに交換するために使用されるが、一方で、ＳＰＴＦＦまたはＴＦＦのいずれかが抗体またはその抗原結合断片をコンジュゲーションバッファーに移すために使用される。

ＳＰＴＦＦは、例えば、ＡＤＣを濃縮する方法において限外ろ過膜を使用することができる。ＳＰＴＦＦは、例えば、ＡＤＣを精製する方法及び／またはＡＤＣをバッファー（例えば、製剤バッファー）に移す方法においてダイアフィルトレーション膜を使用することができる。

いくつかの実施形態では、ＡＤＣプロセスの少なくとも２つの段階がＳＰＴＦＦ及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用して実施される。例えば、いくつかの実施形態では、ＳＰＴＦＦ及び／または向流ダイアフィルトレーションが抗体またはその抗原結合断片をコンジュゲーションバッファーに移すために使用され、かつＡＤＣの形成後、ＡＤＣを濃縮及び精製するために使用されるが、一方で、ＳＰＴＦＦ、向流ダイアフィルトレーション及び／またはＴＦＦがＡＤＣを製剤バッファーに交換するために使用される。いくつかの実施形態では、ＳＰＴＦＦ及び／または向流ダイアフィルトレーションが抗体またはその抗原結合断片をコンジュゲーションバッファーに移すために使用され、かつ精製したＡＤＣを製剤バッファーに交換するために使用されるが、一方で、ＳＰＴＦＦ、向流ダイアフィルトレーション及び／またはＴＦＦがＡＤＣの形成後、ＡＤＣを濃縮及び精製するために使用される。いくつかの実施形態では、ＳＰＴＦＦ及び／または向流ダイアフィルトレーションがＡＤＣを濃縮及び精製するために使用され、かつ濃縮し精製したＡＤＣを製剤バッファーに交換するために使用されるが、一方で、ＳＰＴＦＦ、向流ダイアフィルトレーション及び／またはＴＦＦが抗体またはその抗原結合断片をコンジュゲーションバッファーに移すために使用される。

カラムクロマトグラフィーもまた、本明細書にて提供される連続ＡＤＣ処理法（例えば、ＳＰＴＦＦ及び／または向流ダイアフィルトレーションの組み合わせ）において、フロースルーモードで使用できる。例えば、コンジュゲーション反応物（例えば、連続コンジュゲーション反応物）をフロースルーカラムクロマトグラフィーへ供給し、コンジュゲーション反応物から非コンジュゲート薬物を除去することができる（図４のＩＬＤＦ段階のＴＦＦ２ステージの役割と類似している）。次いで、フロースルーカラムクロマトグラフィーを介して精製したＡＤＣを、製剤バッファーへのバッファー交換のためのＳＰＴＦＦプロセスに供給することができる（例えば、図５のＩＬＤＦ段階のＴＦＦ２、ステージＩＩ）。フロースルーカラムクロマトグラフィーを介して精製したＡＤＣを、製剤バッファーへのバッファー交換のための向流ダイアフィルトレーションプロセスにも供給することができる。

場合によっては、本明細書にて提供される連続フローコンジュゲーションプロセスの反応パラメータは、急速に変化させることができるか、または「パルス」できる。例えば、連続フローコンジュゲーションにおいて、例えば、水浴、密封したリアクタ、ヒーター、熱電供給源を使用することによって、及び／または反応が流れて通過するコイル及び／またはチューブの一部分を絶縁することによって、温度を急激に変化させることができる。さらに、連続フローコンジュゲーションにおいて、例えば、酸または塩基を添加することによってｐＨを急速に変化させることができる。したがって、特定の場合には、コンジュゲーション反応はパルスされたパラメータを使用して実施される。パルスされたパラメータの使用により、例えば、生成物品質を損なうことなく反応時間を減少させ（すなわち、反応速度を増加させ）、急速な温度の低下により反応を一時的に抑制または停止させ、他の摂動（例えば、他の化学反応物質の添加）の導入前に溶液中でコンジュゲートを安定させることができるが、これに対して同一のパラメータに対するより長い曝露は劇的に生成物品質または生成物安定性を低下させる場合がある。

特定の場合には、コンジュゲーション反応を特定の時間増分で特定の回数、変化させた（例えば、上昇させたまたは低下させた）温度に曝露させる。例えば、一例では、温度を少なくとも２℃、少なくとも３℃、少なくとも４℃、または少なくとも５℃上昇させる。それに応じて、温度を少なくとも５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、または３５℃上昇または低下させることができる。例えば、温度を５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、または３５℃上昇または低下させることができる。温度はまた、約５℃～約１０℃、約１０℃～約１５℃、約１５℃～約２０℃、約２０℃～約２５℃、約２５℃～約３０℃、または約３０℃～約３５℃上昇または低下させることができる。したがって、例えば、温度を（例えば、約２０℃から）２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、または５５℃の高温まで上昇させることができる。温度はまた、（例えば、約２５℃から）３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、または５５℃の高温まで上昇させることができる。特定の場合には、温度は５５℃を超えない。特定の場合には、温度を（例えば、約２０℃から）約３５℃～約５５℃の範囲の高温まで、または約４０℃～約５０℃の範囲の高温まで上昇させる。特定の場合には、温度を（例えば、約２０℃から）約６０℃～約７０℃まで、約８０℃まで、約９０℃まで、または約１００℃までの高温まで、（例えば、１０秒などの短い時間増分の間）上昇させる。特定の場合には、温度を（例えば、約２０℃から）６０℃～７０℃の範囲、７０℃～８０℃の範囲、８０℃～９０℃の範囲、または９０℃～１００℃の範囲の高温まで、（例えば、１０秒などの短い時間増分の間）上昇させる。特定の場合には、温度を高温または低温に上昇または低下させるために要する時間は２分以下である。特定の場合には、温度を高温または低温に上昇または低下させるために要する時間は１分以下である。

特定の場合には、コンジュゲーション反応を特定の時間増分で特定の回数、変化させた（例えば、上昇させたまたは低下させた）ｐＨに曝露させる。例えば、一例では、ｐＨを、約１、約２、約３、約４、または約５上昇または低下させる。一例では、ｐＨを約１～約２、約２～約３、約３～約４、または約４～約５上昇させる。したがって、例えば、ｐＨを（例えば、約４から）約５、約６、約７、約８、または約９まで上昇させることができる。ｐＨはまた、（例えば、約５から）約６、約７、約８、または約９まで上昇させることができる。ｐＨはまた、（例えば、約９から）約８、約７、約６、約５、または約４に低下させることができる。

特定の場合には、パルス（例えば、変化させた温度及び／またはｐＨへの曝露）は約３０秒、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１５分、約３０分、約１時間、約１．５時間、または約２時間生じる。パルス（例えば、変化させた温度への曝露及び／または）はまた、例えば、約３０秒～約１分間、約１分間～約２分間、約２分間～約３分間、約３分間～約４分間、約４分間～約５分間、約６分間～約７分間、約７分間～約８分間、約８分間～約９分間、または約９分間～約１０分間生じ得る。パルス（例えば、変化させた温度への曝露及び／または）はまた、例えば、約１分間～１０分間、約１分間～１５分間、約１分間～３０分間、約１分間～１時間、約１分間～約１．５時間、または約１分間～約２時間生じ得る。パルス（例えば、変化させた温度への曝露及び／または）はまた、例えば、約１分間～５分間、または約５分間～１０分間、約１０分間～約１５分間、約１５分間～約３０分間、約３０分間～約１時間、約１時間～約１．５時間、または約１．５時間～約２時間生じ得る。特定の場合には、パルス（例えば、変化させた温度及び／またはｐＨへの曝露）は、２時間、１時間、３０分、２０分、または１５分を超えない。

特定の場合には、パルス（例えば、変化させた温度及び／またはｐＨへの曝露）は１回生じる。特定の場合には、パルス（例えば、変化させた温度への曝露及び／または）は、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回繰り返される。特定の場合には、パルス（例えば、変化させた温度への曝露及び／または）は１回～５回生じる。特定の場合には、パルス（例えば、変化させた温度への曝露及び／または）は２～２０回または５～１０回生じる。

連続ＡＤＣ処理（例えば、ＳＰＴＦＦ及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用すること）は、インラインモニタリングプロセスと共に、またはインラインモニタリングプロセスなしで使用することができる（後述する）。

ＩＩＩ．インラインプロセス自動化技術（インラインＰＡＴ）
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成及び処理するために使用されるインラインプロセス自動化技術が、本明細書にて提供される。このような技術は直接測定を提供して、オフラインアッセイを不要にし、オペレーターによる材料の取扱いを減少させることができる。インラインモニタリングをＡＤＣ（タンパク質）濃度及び遊離薬物の除去のモニタリングに使用することができる。これは、プロセス（例えば、精製プロセス）に使用される比容積またはダイアフィルトレーション容量（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）数に基づく代わりに、インラインの測定値より得られたデータに基づくＡＤＣの最終濃度を標的とすることを可能にする。ＰＡＴの実施により、制御及び検出感度を向上させることが可能となり（例えば、定常運転中の変化を使用して、生成物品質に影響を及ぼす前に問題を検知することができる）、多数のＰＡＴモジュール（例えば、ＦｌｏｗＶＰＥ、ＵＶセンサ、ｐＨメーター、導電率計、圧力センサ、または流量計）を使用することにより、個々の単位操作全体にわたり堅牢なプロセス性能を保証することができる。

インラインモニタリングを、例を挙げると、例えばｉｎ－ｓｉｔｕ反応及び／またはＡＤＣコンジュゲーション反応（例えば、連続コンジュゲーション反応またはバッチコンジュゲーション反応）における任意のポンプからの供給流中の流量をモニタリングするために使用することができる。インラインモニタリングを、例えば、ｉｎ－ｓｉｔｕ反応及び／またはＡＤＣコンジュゲーション反応（例えば、連続コンジュゲーション反応またはバッチコンジュゲーション反応）に添加する成分の濃度をモニタリングするために使用することができる。このようなモニタリングは、反応の化学量論に対する適切な制御を確実にすることができる。インラインモニタリングは、例えば、抗体もしくはその抗原結合断片、薬物、リンカー、リンカーに結合した薬物、リンカーに結合した抗体もしくはその抗原結合断片及び／またはコンジュゲーションバッファーの流量または濃度をモニタリングすることができる。インラインモニタリングは、コンジュゲーション反応バッファー内への抗体またはその抗原結合断片の濃度の流量をモニタリングすることができる。

インラインモニタリングはまた、例えば、コンジュゲーションバッファーの添加を停止することによって、コンジュゲーションバッファーの循環を停止することによって、及び／またはコンジュゲーションバッファーのすすぎ落としまたは除去を開始することによって、コンジュゲーション反応を停止する時点を決定するためなどにも使用できる。本明細書にて提供されるいくつかの実施形態では、非コンジュゲート薬物またはリンカーに結合した非コンジュゲート薬物のインラインモニタリングを使用することができる。非コンジュゲート薬物またはリンカーに結合した非コンジュゲート薬物の測定値を、コンジュゲーション反応において達成される抗体あたりの薬物の平均数（ＤＡＲ）を推測するために使用することができる。したがって、コンジュゲーション反応を、標的のＤＡＲに達したときに停止することができる。

インラインモニタリングはまた、ＡＤＣの濃縮及び／または精製をモニタリングするために使用することができる。例えば、インラインモニタリングは、例示的な図４に示すＩＬＣ及び／またはＴＦＦ２ ＩＬＤＦプロセスの前後または例示的な図１０に示すＩＬＣまたはＴＦＦ３ ＩＬＤＦプロセスの前後に使用することができる。濃縮及び／または精製は、ろ過（例えば、限外ろ過、ダイアフィルトレーション）を使用することができる。ろ過は、シングルパス・タンジェンシャルフローろ過（ＳＰＴＦＦ）を含むタンジェンシャルフローろ過であり得る。ろ過は、向流ダイアフィルトレーションであり得る。ろ過をモニタリングするために使用する場合、インラインモニタリングは、保持液または透過液のいずれかに存在する分析対象を測定するために使用することができる。したがって、例えば、保持液中の非コンジュゲート薬物またはリンカーに結合した非コンジュゲート薬物のインラインモニタリングは、ＡＤＣの精製の程度を評価するために使用することができる。非コンジュゲート薬物またはリンカーに結合した非コンジュゲート薬物のレベルは、コンジュゲーション反応の直後の保持液中においては高いが、精製後の保持液中では低い場合がある（例えば、図１２を参照のこと）。保持液または透過液におけるＡＤＣのインラインモニタリングは、濃縮及び／または精製プロセス中のＡＤＣの損失を評価するために使用することができる（例えば、図１２を参照のこと）。

精製は、クロマトグラフィー（例えば、フロースルーカラムクロマトグラフィー）を使用することもできる。クロマトグラフィーカラムの終端でのインラインモニタリングは、例えば、ＡＤＣレベルを測定することができ、カラムが過負荷であるとき、またはＡＤＣのブレイクスルーがあるときを特定するために使用することができる。

インラインモニタリングはまた、ｐＨを測定するためにも使用することができ、例えば、バッファー交換の完全性を判定するために使用することができる（例えば、図１２を参照のこと）。

例示的なインラインモニタリング技術としては、例えば、フーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）フローセル、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、または超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）の使用が挙げられる。

インラインモニタリング技術は、例えば、ＦｌｏｗＶＰＥまたはＵＶセンサを使用することができる。いくつかの実施形態では、ＦｌｏｗＶＰＥを使用してインラインモニタリングを実施する。ＦｌｏｗＶＰＥは連続モニタリングのためにフローセルを使用する。

タンジェンシャルフローろ過（例えば、シングルパス・タンジェンシャルフローろ過（ＳＰＴＦＦ））の有効性は、ＦｌｏｗＶＰＥ、ＵＶセンサ、ｐＨメーター、導電率計、圧力センサ、流量計などを用いてインラインでモニタリングすることができる。向流ダイアフィルトレーションの有効性もまた、ＦｌｏｗＶＰＥ、ＵＶセンサ、ｐＨメーター、導電率計、圧力センサ、流量計などを用いてインラインでモニタリングすることができる。

インラインモニタリングプロセスは、例えばシングルパス・タンジェンシャルフローろ過及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用する連続コンジュゲーションプロセス（上述）と組み合わせて、またはバッチコンジュゲーションプロセス（これらは当該技術分野で既知である）と組み合わせて使用することができる。

ＩＶ．抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）
本明細書にて提供される場合、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は細胞結合物質、リンカー、及び薬物を含み得る。

細胞結合物質は、抗体またはその抗原結合断片、例えば、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片であり得る。細胞結合物質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）は、ヒト化することができる。細胞結合物質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）は、ヒトであり得る。

細胞結合物質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）は、ヒトＣＤ３７、ＣＤ３３、ＦＯＬＲ１、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ｃＭＥＴ、ＡＤＡＭ９、またはＨＥＲ２に特異的に結合し得る。

細胞結合物質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）は、表１に提供される抗体の６つのＣＤＲを含み得る。

表１：抗体の相補性決定領域配列

細胞結合物質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）は、表２に提供される抗体の可変重鎖及び／または可変軽鎖を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞結合物質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）は、表２に提供される抗体の可変重鎖及び可変軽鎖のＣＤＲ（例えば、Ｋａｂａｔ定義、ＡｂＭ定義、またはＣｈｏｔｈｉａ定義ＣＤＲ）を含む。

表２：抗体の可変重鎖配列及び可変軽鎖配列

細胞結合物質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）は、表３に提供される抗体の重鎖及び／または軽鎖を含み得る。

表３：抗体の重鎖配列及び軽鎖配列

特定の実施形態では、抗ＦＯＬＲ１抗体は、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０に所在するＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に、ブダペスト条約の下で２０１０年４月７日に寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号がＰＴＡ－１０７７２及びＰＴＡ－１０７７３または１０７７４であるプラスミドによってコードされる。

細胞結合物質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）は、ＣＤ３７－３、ｈｕＭｏｖｌ９、Ｚ４６８１Ａ、Ｇ４７３２Ａ、ｈｕＢ４、ｈｕＣＭＥＴ－２７、ｈｕＡＤＡＭ９、またはＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ）であり得る。

薬物は細胞毒性物質であり得る。細胞毒性物質は、細胞の死をもたらす、または細胞死を誘導する、または何らかの方法で細胞生存能を低下させるあらゆる化合物であり得、例えば、メイタンシノイド、メイタンシノイド類似体、ベンゾジアゼピン（例えば、インドリノ－ベンゾジアゼピン（ＩＧＮ）またはピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ））、タキソイド、ＣＣ－１０６５及びＣＣ－１０６５類似体、デュオカルマイシン及びデュオカルマイシン類似体、エンジイン（例えば、カリケアマイシン）、ドラスタチン及びドラスタチン類似体（アウリスタチンを含む）、トメイマイシン誘導体、レプトマイシン誘導体、メトトレキサート、シスプラチン、カルボプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシルならびにモルホリノドキソルビシンが含まれる。一実施形態では、メイタンシノイドはＤＭ１であり得る。別の実施形態では、メイタンシノイドはＤＭ４であり得る。一実施形態では、インドリノ－ベンゾジアゼピンはＤＧＮ４６２であり得る。別の実施形態では、インドリノ－ベンゾジアゼピンはＤＧＮ５４９であり得る。他の実施形態では、ピロロベンゾジアゼピンは、タリリン、テシリン、ＳＪＧ１３６、またはＳＧＤ１８８２であり得る。

好適な連結基は当該技術分野において周知であり、例えば、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、感光性基、ペプチダーゼ不安定基及びエステラーゼ不安定基が含まれる。リンカー分子としては、例えば、Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）（例えば、Ｃａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１７３：７２３－７３７（１９７８）を参照のこと）、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルジチオ）ブタノアート（ＳＰＤＢ）（例えば、米国特許第４，５６３，３０４号を参照のこと）、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルジチオ）２－スルホブタノアート（スルホ－ＳＰＤＢ）（例えば、米国出願公開第２００９０２７４７１３号を参照のこと）、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルジチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）（例えば、ＣＡＳ登録番号３４１４９８－０８－６を参照のこと）、２－イミノチオランまたはアセチルコハク酸無水物が挙げられる。リンカーは、ＳＭＣＣ、ｓＳＰＤＢ、またはペプチドリンカーであり得る。

ＡＤＣは抗体あたり複数の薬物を含有し得る。抗体あたりの薬物数は多くの場合、薬物抗体比（ＤＡＲ）と称される。一態様では、細胞結合物質に結合できる薬物分子の数は、平均すると約２～約８であり得る。したがって、例として、本明細書で提供されるプロセスは、約３～約４のＤＡＲを標的とすることができる。

いくつかの実施形態では、ＡＤＣは「ＩＭＧＮ８５３」である。本明細書で使用する場合、「ＩＭＧＮ８５３」はｈｕＭｏｖｌ９抗体、スルホＳＰＤＢリンカー、及びＤＭ４メイタンシノイドを含有するＡＤＣを指す。ｈｕＭｏｖｌ９（Ｍ９３４６Ａ）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）にＰＴＡ－１０７７２として寄託されたプラスミドによってコードされる重鎖のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む重鎖、及び（ｉｉ）ＡＴＣＣにＰＴＡ－１０７７４として寄託されたプラスミドによってコードされる軽鎖のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。ＩＭＧＮ８５３はＷＯ２０１１／１０６５２８に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ＡＤＣは「ＩＭＧＮ７７９」である。本明細書で使用するとき、「ＩＭＧＮ７７９」は、Ｚ４６８１Ａ抗体、スルホＳＰＤＢリンカー、及びインドリノ－ベンゾジアゼピンＤＧＮ４６２を含有するＡＤＣを指す。

いくつかの実施形態では、ＡＤＣは「ＩＭＧＮ６３２」である。本明細書で使用する場合、「ＩＭＧＮ６３２」は図１１に示すＡＤＣ組成物を指す。ＡＤＣ組成物は、スルホン化変種のｈｕＣＤ１２３－６Ｇｖ４．７（「Ｇ４７２３Ａ」）抗体あたり平均１．５～２．１のＤＧＮ５４９－Ｃ細胞毒性物質を含むＡＤＣを含む（図１１、上部パネル）。ＡＤＣ組成物は、非スルホン化ＡＤＣ（図１１の下部パネルに示すモノイミン構造）も含み得る。

ＡＤＡＭ９に結合する例示的なＡＤＣは、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６７８２３（ＷＯ２０１８１１９１９６として公開されている）に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＡＤＡＭ９に結合する例示的なＡＤＣはまた、２０１８年６月２８日に出願された米国出願第６２／６９１，３４２号に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ｃＭＥＴに結合する例示的なＡＤＣは、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１２１６８（ＷＯ２０１８１２９０２９として公開されている）に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＣＤ１９に結合する例示的なＡＤＣは、ＷＯ２０１２１５６４５５に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Ｖ．実施例
実施例１：ＩＭＧＮ８５３のコンジュゲーションのための連続コンジュゲーションプロセス
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）のラージスケール製造の処理時間を減少させ収率を向上させるために、連続コンジュゲーションプロセスが開発された。連続コンジュゲーションでは、処理段階は同時に起こる。精製段階及びバッファー交換段階中のコンジュゲートの再循環、ならびにバッチコンジュゲーション中に用いられた中間保持段階を、連続コンジュゲーションを使用して省略した。このようにしてプロセスを４～５日間連続して実施し、ＴＦＦ精製段階を通過した後にコンジュゲートを直接製剤した。加えて、インラインプロセス解析工学（ＰＡＴ）システムを使用することでコンジュゲートの直接測定が可能となり、そのため、オフラインアッセイ及びオペレーターによる材料の取扱いが不要となった。さらに、処理時間が削減されたので大量のコンジュゲートを生成するための大型装置への要求は不要となり、大量の生成物を生成するために、より小さな装置及びより短い処理時間で十分であった。加えて、最終的に生成したコンジュゲートの所与の量に関して、連続処理を使用して生成した場合、生成物品質プロファイルはより均一であった。対照的に、バルクコンジュゲーションにおける複数のバッチの必要性は、生成物品質におけるバッチ間変動の増加の可能性をもたらす。

ＡＤＣ「ＩＭＧＮ８５３」のコンジュゲーションのための連続コンジュゲーションプロセスは、図４に示されるフローチャートに詳述されている。ＩＭＧＮ８５３は、スルホ－ＳＰＤＢリンカーを介してＤＭ４メイタンシノイド薬物にコンジュゲートした抗ＦＯＬＲ１抗体（「ｈｕＭｏｖｌ９」）を含有する。ＩＭＧＮ８５３はＷＯ２０１１／１０６５２８に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

実施例１Ａ：フローケミストリー試験
従来のＩＭＧＮ８５３のコンジュゲーションは、７０％Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）中のメイタンシノイド薬物ＤＭ４とＮ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルジチオ）－２－スルホブタノアート（ｓＳＰＤＢ）リンカーとの間のｉｎ－ｓｉｔｕ反応を含む。適切な量のＤＭ４及びｓＳＰＤＢ原液を、ｉｎ－ｓｉｔｕ反応容器に添加する。追加のＤＭＡ（溶媒）をｉｎ－ｓｉｔｕ容器に添加して、７０体積％のＤＭＡを標的とする。ｉｎ－ｓｉｔｕ反応容器に添加する最後の反応物質は、反応バッファーである。反応バッファーを添加後、ｉｎ－ｓｉｔｕ反応を開始させ、６０～１２０分間混合する。次いで、ｉｎ－ｓｉｔｕ成分を、反応バッファー中にダイアフィルトレーションしたＭ９３４６Ａ（ｈｕＭｏｖｌ９）抗体を含有するコンジュゲーション容器に添加する。すべての成分を混合し、コンジュゲーション反応を一晩穏やかに混合しながら進行させ、標的薬物抗体比（ＤＡＲ）が３．４である所望のコンジュゲートを生成する。

この試験では、ＩＭＧＮ８５３の連続コンジュゲーションを実施した。連続コンジュゲーション反応は、１つの顕著な例外を除いて、同一の化学量論的なＩＭＧＮ８５３のすべてのパラメータを使用した。コンジュゲーション反応の反応バッファーのｐＨを、７．６から８．７に上昇させた。ｉｎ－ｓｉｔｕ反応バッファーのｐＨは変化させず、７．６のままとした。コンジュゲーション反応の反応速度を増加させるため、ｐＨの上昇を開始した。コンジュゲーション反応の標的を１８時間とする代わりに、より高いｐＨのバッファーでは、約４時間でコンジュゲートが生成され、より速い読み出し及びより柔軟な実験プロトコルが可能となった。

連続コンジュゲーション実験については、反応物質を連続的に添加するためにシリンジポンプを使用した。その構成を図５に示す。３つのシリンジポンプを使用した。第１のシリンジポンプは、ＤＭＡに溶解したｉｎ－ｓｉｔｕ成分の添加を制御した。これらは、ＤＭ４（ペイロード）、ｓＳＰＤＢ（リンカー）、及びＤＭＡ（追加の溶媒）を含んでいた。これらの３つの成分を化学量論比で組み合わせ、次いで２．５ｍＬのＨａｍｉｌｔｏｎ
Ｇａｓｔｉｇｈｔシリンジに吸引した。第２のシリンジポンプはｉｎ－ｓｉｔｕ反応バッファーの添加を計量した。５ｍＬのプラスチックＢＤシリンジを使用した。１／１６’’ＰＥＥＫチューブを連続コンジュゲーション試験に使用した。ｉｎ－ｓｉｔｕ反応バッファー及びＤＭＡ成分の供給ラインをインラインスタティックミキサーに供給して、２つの反応物質の適切な混合を確実にした。これら２つの供給流は一体になり、同一のチューブ材料のスタティックミキサーから単一の１本のチューブを通って出て行った。ｉｎ－ｓｉｔｕバッファー及びＤＭＡ成分の流量は、それぞれ９５２．９ｎＬ／分及び２．２２３３μＬ／分であった。９０分間のｉｎ－ｓｉｔｕ反応を標的とするには、２つの入口流の流量及び使用されるチューブの断面積に基づいて、１８．６センチメートルのＰＥＥＫチューブが必要であった。ｉｎ－ｓｉｔｕ反応が生じるこの長さのＰＥＥＫチューブを、第２のインラインスタティックミキサーに供給した。第２のスタティックミキサーへの他の入口は、第３のシリンジポンプからのものであった。第３のシリンジは、抗体及びコンジュゲーション反応バッファー（ｐＨ８．７）の添加を制御した。抗体及びコンジュゲーション反応バッファーを合わせて、３０ｍＬのプラスチックＢＤシリンジに吸引した。同一のＰＥＥＫチューブを用いて、抗体及びコンジュゲーション反応バッファーを２４．６１５μＬ／分の流量で供給した。ｉｎ－ｓｉｔｕスタティックミキサーと同様に、第２のスタティックミキサーは、コンジュゲーション反応成分が十分に混合され単一の流出流に集約されることを確実にした。コンジュゲーション反応物質は長さ４．３メートルの同一の１本のＰＥＥＫチューブ内のスタティックミキサーから出て行き、標的の４時間のコンジュゲーション反応持続時間を達成した。

試験は、いずれの流出の開始前に３つのシリンジすべてを充填することによって実施した。まず、ｉｎ－ｓｉｔｕ反応バッファー（シリンジ２）及びＤＭＡ成分（シリンジ１）のポンプを同時に起動した。約９０分後、ポンプ３（抗体及びコンジュゲーション反応バッファー）を起動した。最初の２つのポンプの起動から約５時間、コンジュゲートは長さ４．３メートルの１本のＰＥＥＫチューブから溶出した。試料の分析を、末端部から直接収集することにより実施した（すなわち、十分に混合されたコンジュゲートのプールからプール試料を収集した）。（いずれのポンプからの）ｉｎ－ｓｉｔｕの供給流及びコンジュゲーションの供給流の流量を測定するために、さらに、流量計を使用することができる。流量計は、反応の化学量論に対する適切な制御を確実にするためのプロセス解析工学（ＰＡＴ）機構として機能する。

第１のＩＭＧＮ８５３の連続コンジュゲーション試験の結果を表４に示す。

表４：第１のＩＭＧＮ８５３の連続コンジュゲーション試験の結果

試験により、連続コンジュゲーションの生成物品質は、並列で実施した対照（バッチ）の生成物品質と同等であることが示された。生成物品質は、「初期」の時点でのより低い薬物抗体比（ＤＡＲ）から明らかなように、定常状態へ達するのに多少の時間がかかった。これは、３０分の試料もまたわずかに低いＤＡＲであった第２の試験において一致した。第２の試験において３時間までに、生成物品質は、（並列バッチの対照と比較して）標的ＤＡＲで定常状態に達した。ＤＡＲに加えて、生成物品質はモノマーレベル及び遊離薬物レベルに関しても同等であった。総合すると、これらの結果は連続コンジュゲーションプロセスが良好に実施され、生成物品質に関して並列バッチの対照と同等であることを示す。

第２の試験の結果を表５に示す。

表５：第２のＩＭＧＮ８５３の連続コンジュゲーション試験の結果

この試験では上記の試験と同じパラメータを使用したが、プロセスを４０時間連続して実施し、１００ｍｇの装置の設定を使用してプロセスをより長く実施することにより、１０倍多い生成物を生成できることを示した。結果は、コンジュゲートが溶出した３０分～３時間の間にコンジュゲートが定常状態に達し、ＳＥＣ及び遊離薬物分析によって並列バッチの対照と同等であることを示した。３時間での生成物品質は４０時間で溶出したコンジュゲートとほぼ同一であり、供給反応物質が反応チューブに供給される限り、連続プロセスが一貫して実施されることを示した。

製造設定において、各個別の反応物質のためのポンプを使用して原液を分離させておくことができる。ＤＭ４、ｓＳＰＤＢ、またはＤＭＡを単一の供給流に集約する代わりに、各原液を別々に収集容器に供給するか、またはｉｎ－ｓｉｔｕ反応に直接供給することができる。同じことが抗体及びコンジュゲーション反応バッファーにも適用できる。抗体の原液は指定のポンプを使用して供給することができ、一方で、別個のポンプは、他のコンジュゲーション反応成分へのコンジュゲーション反応バッファーの適切な体積比での添加を制御する。

他のＰＡＴ機構を使用して、反応の進行につれてｉｎ－ｓｉｔｕ反応またはコンジュゲーション反応のいずれかをモニタリングすることができる。フーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）フローセルをインラインで使用して、ｉｎ－ｓｉｔｕ反応またはコンジュゲーション反応の性能をモニタリングすることができる。さらに、複数のＦＴＩＲフローセルまたは類似のＰＡＴツールを、ｉｎ－ｓｉｔｕ反応チューブ及びコンジュゲーション反応チューブに沿った中間位置に配置して、反応が生じたときにその反応をモニタリングすることができる。所望のコンジュゲートの形成を、反応の開始から終了まで始終測定することができる。次いで、ＰＡＴシグナルの著しい変化のいずれも、ｉｎ－ｓｉｔｕ反応またはコンジュゲーション反応（開始、中間または終了）のいずれかにおいてエラーが生じた場所を特定するために使用することができる。コンジュゲートに対しては、代替的ＰＡＴ機構は、ＵＶセンサ付属またはＵＶセンサなしの迅速高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ベースの機器（超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ））であり得る。ＨＰＬＣベースの分析はＤＡＲを測定するために使用することができ、一方で、インラインに配置されたＵＶセンサはコンジュゲーション反応における抗体濃度をモニタリングすることができる。

実施例１Ｂ：シングルパス・タンジェンシャルフローろ過試験
従来のタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）は、ＩＭＧＮ８５３原薬のプロセス中に２回使用される。まず、コンジュゲーション反応（ＴＦＦ１）の前に、配合した抗体をコンジュゲーション反応バッファーにバッファー交換するためにＴＦＦを実施する。コンジュゲーション反応後、ＴＦＦは、粗反応の混合機から残留不純物を除去し、コンジュゲーション反応バッファーから基礎製剤バッファー（ＴＦＦ２）にコンジュゲートをバッファー交換するために使用される。これらの従来のＴＦＦ段階の両方をシングルパスＴＦＦ（ＳＰＴＦＦ）法に置き換えるために、連続プロセスが開発された。連続ＳＰＴＦＦは、Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓによるインライン濃縮（ＩＬＣ）及びインラインダイアフィルトレーション（ＩＬＤＦ）技術を利用した。

ＴＦＦ１については、従来の処理の間、抗体を３０ｍｇ／ｍＬで８ダイアフィルトレーション容量に対してダイアフィルトレーションした。従来のＴＦＦ１処理の間、流入する抗体を６０ｍｇ／ｍＬで配合してダイアフィルトレーションの前に希釈した。連続処理の間、６０ｍｇ／ｍＬで配合した抗体をＴ－コネクタに供給し、ここに別のポンプがコンジュゲーション反応バッファーを添加して、抗体を３０ｍｇ／ｍＬの標的濃度まで希釈した。Ｔ－コネクタの後、３０ｍｇ／ｍＬの抗体の単一供給流をＩＬＤＦモジュールに供給した。ＩＬＤＦのダイアフィルトレーションのバッファーポンプは、バッファー交換が１回の通過で達成されるように、ＩＬＤＦモジュールへのコンジュゲーション反応バッファーの添加を制御した。ＩＬＤＦを出た抗体は、コンジュゲーション反応バッファー中で３０ｍｇ／ｍＬであった。

この単位操作をモニタリングしかつ制御するために、ＰＡＴ制御を様々な場所で実施することができる。ＦｌｏｗＶＰＥまたはＵＶセンサを、配合した抗体供給流（６０ｍｇ／ｍＬ）、希釈した抗体供給流（３０ｍｇ／ｍＬ）、及び／またはコンジュゲーション反応バッファー中のバッファー交換した抗体上に配置することができる。ＦｌｏｗＶＰＥまたはＵＶセンサを使用して、異なる供給流中の抗体の濃度を測定することができる。加えて、ＩＬＤＦ中のバッファー交換が３０ｍｇ／ｍＬで起こることを確実にするために、すべての供給流上の流量計を使用して任意の成分の流量をモニタリング及び調整することができる。さらに、ＩＬＤＦ後に伝導性プローブまたはｐＨプローブを使用して、コンジュゲーション反応バッファーへの抗体のバッファー交換の完了を確実にすることができる。

コンジュゲーション後、従来のＴＦＦ２は一般に全て単一の単位操作において生じる３つの段階で実施される。まず、コンジュゲーション後の粗反応混合物を、限外ろ過により（コンジュゲーション反応後の１５ｍｇ／ｍＬから）３０ｍｇ／ｍＬに濃縮する。次いで、ＴＦＦ２のステージＩと称されるものの中で、コンジュゲートをコンジュゲーション反応バッファーに対して４ダイアフィルトレーション容量でダイアフィルトレーションする。ステージＩの間に、残留不純物を粗反応混合物から除去する。ステージＩの直後に、コンジュゲートを８ダイアフィルトレーション容量の基礎製剤バッファーに対してダイアフィルトレーションすることによりステージＩＩを実施する。ステージＩＩは厳密にバッファー交換段階として設計されているが、残留不純物の付加的な除去にも寄与する。

ＳＰＴＦＦを利用する連続プロセスについて、３つの別々の段階を評価した。まず、濃縮用のＩＬＣモジュールを使用した。ＩＬＣはコンジュゲーション反応チューブの後に続いた。１回の通過で、１５ｍｇ／ｍＬでＩＬＣに入るコンジュゲートを３０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、除去された容量は廃棄物へと迂回させた。ＩＭＧＮ８５３に使用され、この例に記載された濃度係数は２であるが、ダイアフィルトレーションの前にコンジュゲートを濃縮するという同一の結果を得るために、他の濃度係数を代わりに使用することができる。

ＩＬＣ後、３０ｍｇ／ｍＬのコンジュゲートの供給流を、ステージＩの模倣を意図した第１のＩＬＤＦ（ＩＬＤＦ１）に供給した。ＩＬＤＦ１へのダイアフィルトレーションバッファーの供給はコンジュゲーション反応バッファーであり、１回の通過で所望のダイアフィルトレーション容量数を達成するために適切な容量で添加した。ＩＭＧＮ８５３については、ステージＩは従来の４ダイアフィルトレーション容量で達成した。概念実証試験にて、ダイアフィルトレーションバッファー供給ポンプの流量を調整することによって、ダイアフィルトレーション容量数の関数として残留不純物の除去を評価した。

ＩＬＤＦ１後、コンジュゲートは３０ｍｇ／ｍＬのままであったが、存在する不純物の濃度は極めて低かった。ＩＬＤＦ１からの出口流を、ダイアフィルトレーションバッファーが基礎製剤バッファーであるＩＬＤＦ２に供給した。コンジュゲートはコンジュゲーション反応バッファー（ｐＨ７．６～８．７）中に３０ｍｇ／ｍＬでＩＬＤＦに入り、ｐＨ５．０のバッファー中に３０ｍｇ／ｍＬでＩＬＤＦ２を出た。

最初の概念実証試験は、０．１１ｍ^２の膜面積を有するＴ０１モジュールを用いたＰａｌｌ Ｌｉｆｅ ＳｃｉｅｎｃｅｓのＩＬＤＦモジュールを使用して実施した。コンジュゲートの供給に関して、モジュールを１～４ｍＬ／分の間の流量で評価した。ダイアフィルトレーションバッファーの供給速度は、ダイアフィルトレーション容量数が変化するように変化させた。ＩＬＤＦを用いて、１～１３のダイアフィルトレーション容量間の処理を評価した。すべての試験について、コンジュゲート材料を従来のバッチ処理を用いて生成し、アリコート中で凍結した。遊離のメイタンシノイド種を凍結前に定量化し、解凍前に（処理前に）再度定量化した。粗反応混合物をＩＬＣに供給した。保持液流の流量を流量計を用いて測定し、モジュール全体で達した濃度係数を算出した。ＩＭＧＮ８５３のプロセス及びすべての試験を、標的濃度係数２を用いて実施した。

ＩＭＧＮ８５３のコンジュゲーション反応からの残留不純物のクリアランスを評価するため、ＩＬＤＦを用いた第１の試験を実施した。バルクコンジュゲーションを実施して、標的の反応条件を使用する試験用の材料を生成した。コンジュゲーション後の粗反応混合物をろ過し、アリコートにして、使用前に凍結した。解凍後、粗反応混合物を、濃度係数２を標的としたシングルパスＩＬＣモジュールを用いて濃縮した。粗反応混合物は１５ｍｇ／ｍＬであり、ＩＬＣ後のコンジュゲートの標的保持液濃度は３０ｍｇ／ｍＬであった。次いで、ＩＬＣ後のコンジュゲートをコンジュゲーション反応バッファーを用いて１０ｍｇ／ｍＬに希釈して、低開始濃度でＩＬＤＦモジュールを試験した。ＩＬＤＦの前の３０ｍｇ／ｍＬから１０ｍｇ／ｍＬへの希釈は、コンジュゲート供給物中の遊離薬物不純物の量を効果的に減少させた。このことは、ＩＬＣの前後の４つの主要な不純物種についての遊離薬物不純物レベルを示す図６において明らかである。コンジュゲーション後の粗反応混合物は、高い不純物レベルを有する。ＩＬＣ上で濃縮し、次いで１０ｍｇ／ｍＬに希釈した後、不純物の濃度は開始濃度の約１／３に低下した。

ステージＩにおいて、１０ｍｇ／ｍＬのコンジュゲートを、７ダイアフィルトレーション容量の処理を標的として４ｍＬ／分でＴ０１ ＩＬＤＦモジュールに供給した。ステージＩのダイアフィルトレーションバッファーは、コンジュゲーション反応バッファー（１５ｍＭリン酸カリウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．７）であった。試料を保持液ラインから採取してタンパク質濃度を分析し、コンジュゲートが系から溶出した時点を決定した。濃度が定常状態に到達した後、試料を保持液ラインから収集し、ＲＰ－ＨＰＬＣで分析して遊離薬物不純物レベルを定量化し、ＩＬＤＦ上のクリアランスを算出した。図６は、ＩＬＤＦ１段階より採取した３つの試料（初期、後期、及びプール試料）についての結果を示す。初期試料は、ＩＬＤＦ上で定常状態に達した直後に採取した。３つの試料すべてにおける不純物レベルは、規格限界を十分下回った。ＩＬＤＦ上の遊離薬物レベルの減少は著しく、プロセス性能の観点から許容可能であった。

ＴＦＦ２のステージＩを模倣するためのコンジュゲーション反応バッファーに対するＩＬＤＦの最初の通過の後、次いで、得られたプールされたコンジュゲートを再びモジュールに通過させてステージＩＩを模倣した。ステージＩＩの前にモジュールをフラッシュし、次いで、基礎製剤バッファー（１０ｍＭ酢酸、９％スクロース、ｐＨ５．０）に対するダイアフィルトレーションの準備をした。コンジュゲートを４ｍＬ／分で供給し、ダイアフィルトレーションバッファー供給流量をＩＬＤＦ全体で１３ダイアフィルトレーション容量を標的とするように設定した。この数値は、従来のＴＦＦ処理の８ダイアフィルトレーション容量と適合するように選択した。

ＩＬＤＦ１と同様に、試料を保持液ラインから収集して分析し、抗体の濃度を測定した。タンパク質濃度が検出されたとき、生成物を回収して試料を保持液ラインから定期的に採取した。系が定常状態に到達した後、試料を保持液ラインから収集し、ＲＰ－ＨＰＬＣで分析して残留不純物レベルを定量化し、ＩＬＤＦ２上のクリアランスを算出した。生成物がＩＬＤＦ上を通過して回収された後、プールされた材料をろ過し、次いでＳＥＣ及びＲＰ－ＨＰＬＣで分析した。従来のＴＦＦ２処理の間のステージＩＩのバッファー交換を模したＩＬＤＦ２からのすべての試料の結果を図６に示す。遊離薬物レベルはすべて１％未満であり、これは精製原薬（ＤＳ）の最終規格より十分低い。これらの結果は、ＳＰＴＦＦによるＩＭＧＮ８５３コンジュゲートの連続精製が実施可能であり、かつＳＥＣ及びＲＰ－ＨＰＬＣにより測定される許容可能な生成物品質を備えた精製コンジュゲートを生成することができることを立証している。

次の試験は、１５ｍｇ／ｍＬの供給濃度で残留不純物を除去するＩＬＤＦのクリアランス能力を調査した。この濃度は、第１の試験が１０ｍｇ／ｍＬで十分なクリアランスを示した後に選択した。この試験の間、コンジュゲートにはＩＬＣによる処理を施さなかった。バルクコンジュゲーションからの粗コンジュゲート反応混合物を解凍し、ＩＬＤＦへ直接供給した。Ｔ０１ ＩＬＤＦモジュールを使用し、供給流量は４ｍＬ／分であった。コンジュゲーション反応バッファーをダイアフィルトレーションバッファーに使用し、供給流量は１ダイアフィルトレーション容量を初期標的とするように設定した。濃度を測定することにより保持液中でコンジュゲートを検出したとき、試料を保持液ラインから収集し、ＲＰ－ＨＰＬＣで分析して遊離薬物レベルを定量化した。結果を図７に示す。コンジュゲーション後の粗反応混合物は、以前のコンジュゲートと一致する高い開始レベルを有していた。１ダイアフィルトレーション容量の処理に相当する１回の通過後、全遊離薬物レベルは、供給物中の約２６％から保持液中の７％へと低下した。

次いで、ダイアフィルトレーションの供給流量を、従来のＴＦＦ処理の標的の４ダイアフィルトレーション容量と同等である、７ダイアフィルトレーション容量を標的とするように増加させた。系が定常状態に達した後、遊離薬物レベルを保持液中で測定した。図４に示されているように、これらの処理条件下での１回の通過後、遊離薬物レベルは顕著に低下した。最終の全遊離薬物レベルは１％を下回り、これは最終生成物品質の許容範囲内であった。これらの結果はＩＬＤＦが１５ｍｇ／ｍＬの供給コンジュゲート濃度で良好に機能し、７ダイアフィルトレーション容量で処理した場合、規格限界を下回るレベルまで不純物を除去することを示す。

比較のために、バッチのＴＦＦ２精製プロセスによる遊離薬物不純物のクリアランス値を図８に示す。４ダイアフィルトレーション容量の従来のＴＦＦ２バッチ処理後（無地バー）、全遊離薬物の不純物レベルは３．４％であった。従来の４ダイアフィルトレーション容量に相当する７ダイアフィルトレーション容量のＳＰＴＦＦ処理後（ストライプバー）、全遊離薬物レベルは０．７％であった。これら２つの試験の間の１つの重要な違いは、精製中のコンジュゲートの濃度であった。連続処理試験については、ＩＬＤＦモジュールへのコンジュゲートの供給は１５ｍｇ／ｍＬであった。従来のバッチＴＦＦ処理は３０ｍｇ／ｍＬで実施した。

ＩＬＤＦは圧力または生成物品質の懸念なく１５ｍｇ／ｍＬで十分に機能したため、後続の試験において、ＩＬＤＦからの収率を最適化するために供給物のコンジュゲート濃度を増加させた。標的の供給コンジュゲート濃度は３０ｍｇ／ｍＬであった。まず、粗反応混合物を濃度係数２を標的としたＩＬＣに通過させた。コンジュゲートを１５ｍｇ／ｍＬでＩＬＣに入れ、３０ｍｇ／ｍＬの標的まで濃縮させた。３０ｍｇ／ｍＬで得られたコンジュゲートをＩＬＤＦに供給する前に回収した。ＩＬＤＦ用のダイアフィルトレーションバッファーはコンジュゲーション反応バッファーであり、供給流量は７ダイアフィルトレーション容量を標的とするように設定した。Ｔ０１ ＩＬＤＦモジュール上の３０ｍｇ／ｍＬのコンジュゲートの供給流量は４ｍＬ／分であった。保持液流中にタンパク質が検出された後、コンジュゲートを回収して試料を収集した。この系を定常状態に到達させてから、試料をＲＰ－ＨＰＬＣにより分析して遊離薬物レベルを定量化しＩＬＤＦ上のクリアランスを算出した。結果を図９に示す。ＩＬＤＦ後の遊離薬物レベルを、ＩＬＣ前に採取した試料（１５ｍｇ／ｍＬの粗反応混合物）及びＩＬＣ後に採取した試料（３０ｍｇ／ｍＬ）と比較した。ＩＬＣ後の遊離薬物レベルはわずかに上昇し、これはコンジュゲートのわずかな過濃縮に起因していた。ＩＬＣ後のコンジュゲートは３１ｍｇ／ｍＬと測定され、濃度係数２．１が使用されたことを示した。得られた遊離薬物レベルはわずかに高かったが、ＩＬＤＦを正確に評価するために、ＩＬＤＦへ供給する前に適切な量のコンジュゲーション反応バッファーをプールした材料に添加することによって、コンジュゲートを３０ｍｇ／ｍＬに希釈した。

４ｍＬ／分でＩＬＤＦから収集しＲＰ－ＨＰＬＣによって分析した試料は、ＩＬＤＦ前／ＩＬＣ後の試料からの遊離薬物種のクリアランスを示した。しかしながら、保持液中のコンジュゲートの濃度は約２０ｍｇ／ｍＬと測定された。コンジュゲート濃度の低下は、カセット内の膜上の生成物の凝集及び蓄積に起因すると仮定した。あらゆる目詰まりを軽減させ系内の圧力を減少させるために、流量を３ｍＬ／分に減少させた。それに応じて、７ダイアフィルトレーション容量が処理の標的となるように、ダイアフィルトレーションバッファー供給ポンプの流量も減少させた。ＩＬＤＦの入口流量を減少させた後、試料を保持液から収集し、濃度及び遊離薬物レベルについて分析した。試料の濃度は２２．５ｍｇ／ｍＬと測定され、遊離薬物レベルは４ｍＬ／分にて測定した試料と同等であった。総合すると、これは７ダイアフィルトレーション容量の処理はコンジュゲートの精製に十分であるが、最大で２３ｍｇ／ｍＬの保持液中のコンジュゲート濃度が観察されたことを示す。

実施例２：ＩＭＧＮ６３２のコンジュゲーションのための連続コンジュゲーションプロセス
ＡＤＣ ＩＭＧＮ６３２のコンジュゲーションのための連続コンジュゲーションプロセスは、図１０に示されるフローチャートに詳述されている。ＩＭＧＮ６３２は、細胞毒性ペイロードＤＧＮ５４９－Ｃに結合した抗ＣＤ１２３抗体（「Ｇ４７３２Ａ」）を含有する。ＩＭＧＮ６３２を図１１に示す。

実施例２Ａ：フローケミストリー試験
反応の構成は図５に示す構成と同様である。第１のシリンジは、ＤＭＡに溶解したＤＮＡアルキル化ＩＧＮペイロード「ＤＧＮ５４９Ｃ」を含有する。第２のシリンジは、亜硫酸水素塩原液及びｐＨ３．３の５０ｍＭコハク酸塩を適切な体積比で含有する。これら双方の供給流をスタティックインラインミキサー中で混合し、スルホン化反応を開始する。ＤＧＮ５４９Ｃは、混合流中で１ｍＭの最終濃度を標的とする。得られた混合物は、亜硫酸水素塩のＤＧＮに対する比が１．４モル過剰であるｐＨ３．３の５０ｍＭコハク酸塩及び５０％ＤＭＡである。２本の供給流は単一流でスタティックインラインミキサーを出る。チューブの長さは、３時間をチューブ内の反応物質の滞留時間の標的とするように体積流量に基づいて決定する。スルホン化反応の温度は２５℃であり、チューブを温度制御した水浴中に浸漬させることによりその温度を維持する。第３のシリンジ（図５の抗体＋バッファーシリンジ）は、５％コハク酸でｐＨ６．０に調整した再酸化した抗ＣＤ１２３抗体（「Ｇ４７２３」）を含有する。適量のＤＭＡ及び５０ｍＭのリン酸カリウムを、再酸化した抗体混合物に添加する。均一な混合物をシングルシリンジに吸い上げて、インラインでスルホン化反応物と合わせる。

スルホン化供給流は、ｐＨ調整した再酸化した抗体と混合される場所である第２のスタティックミキサーに入る。第２のスタティックミキサーを出る最終コンジュゲーションの流れが抗体濃度２．０ｍｇ／ｍＬ、ＤＭＡ １５％、及びＤＧＮの抗体に対するモル比３．５の所望の反応条件を達成するように、体積流量を調整する。コンジュゲートのチューブコイルの長さは、２０時間のコンジュゲーション反応持続時間を滞留時間の標的とするように選択する。スルホン化のチューブと同様に、コンジュゲーションのチューブを２５℃に設定した温度制御した水浴中に浸漬させる。

実施例２Ｂ：シングルパス・タンジェンシャルフローろ過試験
ｐＨ４．２にｐＨ調整した粗コンジュゲート混合物を、保持液が約８ｍｇ／ｍＬとなるように、濃度係数４を標的として２ｍｇ／ｍＬの濃度でＩＬＣに供給する。８ｍｇ／ｍＬの得られたコンジュゲート材料をＩＬＤＦ ＳＰＴＦＦモジュールに供給する。第１のＩＬＤＦのダイアフィルトレーションバッファーは１０％（ｖ／ｖ）のＤＭＡを含む１０ｍＭコハク酸塩、ｐＨ４．２の５０μＭ亜硫酸水素塩である。ＩＬＤＦの流量を、従来のバッチ処理中に使用される４ダイアフィルトレーション容量と適合する７ダイアフィルトレーション容量を標的とするように調整する。

第１のＩＬＤＦの後、ダイアフィルトレーションバッファーが１０ｍＭコハク酸塩、ｐＨ４．２の５０μＭ亜硫酸水素塩である第２のＩＬＤＦモジュールに、材料を同一の濃度で供給する。ダイアフィルトレーションバッファー供給の流量及び生成物供給の流量を、従来のバッチＴＦＦ処理中に標的とした１０ダイアフィルトレーション容量と同様のバッファー交換を達成するために、標的ダイアフィルトレーション容量数が１５となるように設定する。

実施例３：パルス処理はＩＭＧＮ８５３のコンジュゲーションを改善する
本発明者らは、連続フローコンジュゲーションがパラメータ（例えば、温度またはｐＨ）のパルス変化を可能にすることを発見した。パルスは、反応物質が少量でコイル及びチューブを通過する際に反応が生じる連続フローコンジュゲーションプロセスで可能である。例えば、コイルまたはチューブの短い部分を急速に加熱して（例えば、絶縁によって）または冷却して短い温度の変位、すなわち「パルス」を生成することができる（例えば、図１２を参照のこと）。

発明者らはさらに、反応パラメータにおけるパルス変化は、例えば、変化させたパラメータへのより長い曝露がプロセスに損害を与えるか、または生成物品質に悪影響を及ぼす場合に好都合であることを発見した。例えば、コンジュゲーション反応の温度を長時間にわたり上昇させることは凝集の増加をもたらし得る。対照的に、本明細書に示すように、短い時間のパルスのみにおいてコンジュゲーション反応の温度を上昇させることで、凝集形成の大幅な増加を伴わずに反応速度を増加させることができる。

ＩＭＧＮ８５３のコンジュゲーションをバイアル中で温度パルスを用いて実施した。このコンジュゲーションには、コンジュゲーション反応成分を含むバイアルを２０℃で約３０分間載置すること、次いでより高温の水浴中に特定のパルス時間バイアルを載置することでパルスすること、及びその後バイアルを２０℃に戻すことが含まれた。次のパルスが生じるまでバイアルを２０℃に戻し、プロセスを特定のパルス数繰り返した。４パルスを４０℃でそれぞれ７分間、４パルスを４２．５℃でそれぞれ７分間、５パルスを５０℃でそれぞれ１分間、及び５パルスを６０℃でそれぞれ１分間の、４つの異なるパルス条件を評価した。対照反応は、一定の２０℃の温度で実施した。

反応完了の程度（％）を用いて反応速度を決定した。定常の２０℃の温度では、ＩＭＧＮ８５３のコンジュゲーション反応が完了に達するのに約８時間を要する。（図１４、左パネルを参照のこと）。試験したすべてのパルス条件は反応時間を減少させた（すなわち、より短時間で１００％完了に達した）。（図１４、左パネルを参照のこと）。６０℃で１パルスあたり１分間のパルス（５回）は、高分子量（ＨＭＷ；凝集体）種の発生を劇的に増加させた。（図１４、右パネルを参照のこと）。対照的に、試験した他のすべてのパルス条件はＨＷＭ（凝集体）種の発生にほとんど影響を与えなかった。

このデータは、連続フローコンジュゲーションによって可能となる反応条件が、生成物品質を損なうことなく反応速度及び生産性を改善できることを立証する。

実施例４：コンジュゲーションのための抗体の１段階調製
実施例２では、ＩＭＧＮ６３２の原薬プロセスは、コンジュゲーションのためのＧ４７２３Ａ抗体を調製するための２つの段階、すなわち還元及び再酸化を含む（図１０、左上の枠）。Ｇ４７２３Ａ抗体の還元は天然のシステイン間の鎖間ジスルフィドを還元し、Ｃ４４２改変システイン残基上のキャッピング基を除去する。この段階は、２５モル当量のＴＣＥＰのＧ４７２３Ａ抗体への添加を含む。還元反応後、還元された抗体混合物をバッファー交換して任意の残留ＴＣＥＰを除去し、再酸化反応のための抗体を調製する。再酸化段階は、還元されたＧ４７２３Ａ抗体に８モル当量のＤＨＡＡを添加して、抗体の鎖間ジスルフィドを再形成することを含む。この反応は、Ｃ４４２改変システイン残基を、マレイミド官能基を介してペイロードとコンジュゲートできる遊離チオールの状態とする。

連続方式においてこれらの反応を実施することの実現可能性を立証するため、マイクロスケールのフローリアクタを使用してスモールスケール試験を実施した。

実施例４Ａ：還元反応
配合したＧ４７２３Ａ抗体がフローリアクタ中で還元され、並列バッチの反応と同様の均一な生成物品質を有する抗体をもたらすことができることを立証するために、還元反応を実施した。

Ｇ４７２３Ａ抗体をベースとした１５０ｍｇの縮小スケールを実施して、フローリアクタ中の連続還元を立証した。５１．１ｍｇ／ｍＬで配合したＧ４７２３Ａ抗体を１本の供給流として使用した。抗体溶液をシリンジに吸引した。ｐＨ７．５の５０ｍＭリン酸カリウム中に１００ｍＭで調製したＴＣＥＰ－ＨＣｌ原液を、連続反応のための第２の供給流として追加のｐＨ７．５の５０ｍＭリン酸カリウムと合わせた。これは、それらが別々である場合、低流量であり、かつＴＣＥＰ－ＨＣｌ原液対ｐＨ７．５の供給流である５０ｍＭリン酸カリウムの体積比が低いために実施した。還元反応のためには、配合したＧ４７２３Ａ抗体を５ｍｇ／ｍＬに希釈するため、ｐＨ７．５バッファーである追加の５０ｍＭリン酸カリウムが必要である。

Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓのシリンジポンプ及び１／１６ＰＥＥＫチューブを用いて反応を設定した。２本の供給流の体積比を、混合後の最終反応の化学量論が標的反応条件、すなわち抗体に対し２５モル当量のＴＣＥＰ－ＨＣｌ、５ｍｇ／ｍＬの抗体となるように選択した。２本の供給流を組み合わせた体積流量を使用して、反応持続時間、すなわちフローリアクタ中の滞留時間が１６時間となるために必要なＰＥＥＫチューブの長さを算出した。この実験については、並列バッチの対照反応及び連続反応の双方を周囲温度にて実施した。

並列バッチの対照の還元反応は、２０ｍｇのＧ４７２３Ａ抗体のスケールで設定した。すべての反応パラメータを一致させた。１６時間の反応持続時間後、対照反応物及び連続反応物を試料採取して、分析のために標識した。連続還元反応物はフローリアクタの出口から試料採取した。バルク対照のバッチ反応物を分析のため試料採取した。

還元反応の特性決定のため、抗体上の遊離チオールと反応しＵＶ分光測定法により検出できるＡｌｅｘａ－ＭＡＬ ４８８フルオロフォアで試料を標識した。試料をＡｌｅｘａ－ＭＡＬ ４８８と反応させ、ＳＥ－ＨＰＬＣで分析してＡｌｅｘａ－抗体比を算出した。連続反応及び並列の対照反応の結果を表６に示す。

表６：バッチ対連続還元反応

表６に示すデータは、Ｇ４７２３Ａ抗体が従来のバッチ処理及び連続処理によって還元されたことを示す。還元前の配合したＧ４７２３Ａ抗体については、Ａｌｅｘａ標識は観察されなかった。還元反応中に鎖間ジスルフィドが還元され遊離チオールを形成後に、Ａｌｅｘａ－ＭＡＬ４８８は遊離チオールと反応してコンジュゲートすることができる。抗体の改変システイン及び天然システインの完全な還元は、１０個の標識を生じる。

約７～８個のＡｌｅｘａ－ＭＡＬ４８８標識が両方の試料中に検出され、Ｇ４７２３Ａ抗体が還元されたことを示した。これらの結果は、還元反応後に８個のＡｌｅｘａ－ＭＡＬ ４８８標識が確認された、以前のより小さなスケールの開発研究に一致する。理論的標的である１０個の標識との差異は、スモールスケールにて生じる反応容器中の空気により駆動される多少の再酸化が、遊離チオールにジスルフィドの再形成を生じさせ、Ａｌｅｘａ－ＭＡＬ４８８とのコンジュゲーションのための利用可能な抗体上の遊離チオール数を減少させることに起因すると考えられる。

後続の試験をより大きなスケールで、約３時間のより短い還元時間を標的にして繰り返した。同様に、これらの試験から生成された抗体をＡｌｅｘａ－ＭＡＬ４８８で標識し、ＳＥ－ＨＰＬＣで特性決定して反応効率を比較した。２本の供給流の体積流量を増加させることによって３時間の還元反応時間を標的とした、後続の試験による生成物品質データを表７に示す。

表７：連続還元反応の生成物品質評価

バッチの対照反応及び連続反応の還元反応の程度を比較するＡｌｅｘａ：抗体比に加えて、２つの反応生成物のモノマー値及びＨＭＷ値を測定した。表７のデータは、より大きな体積流量を用いたより大きなスケールでは、連続還元反応はバッチの対照と同等であることを示す。さらに、連続反応によって生成された抗体のモノマーは、わずかに増加している。

これらの結果は、還元反応がフローケミストリーを用いて連続方式で問題なく実施され得ることを立証する。

実施例４Ｂ：再酸化反応
連続方式において還元されたＧ４７２３Ａ抗体が再酸化され得ることを立証するために、再酸化反応を実施した。

反応及びフローリアクタ装置のスケールのため、再酸化試験への供給に使用する還元された抗体をＮＡＰ精製した。ＩＭＧＮ６３２の製造中、任意の残留ＴＣＥＰ－ＨＣｌを反応溶液から除去するために、還元された抗体をＴＦＦ精製する。ＴＣＥＰ－ＨＣｌの除去後、コンジュゲーションのために２個の改変Ｃ４４２システイン残基を遊離させている間に、ＤＨＡＡを反応プールに添加して抗体の鎖間ジスルフィドを再形成する。

再酸化試験については、再酸化反応条件のためにフローリアクタ装置の設置が必要となることから、まず、Ｇ４７２３Ａ抗体をバッチ反応を用いて還元させた。還元反応を、５ｍｇ／ｍＬの抗体濃度で抗体に対して２５モル当量の同一のＴＣＥＰ－ＨＣｌを用いて３７℃で１時間実施して、抗体を完全に還元させた。還元反応後、反応物の試料をＡｌｅｘａで標識して抗体の還元を確認した。

次いで、ＤＨＡＡの添加前に、還元された抗体をＮＡＰ精製して溶液から残留ＴＣＥＰ－ＨＣｌを除去した。再酸化反応の設定が適切な化学量論比を標的とすることを確実にするために、ＮＡＰ精製した材料の濃度を測定した。連続再酸化試料を用いて並列バッチの対照反応物を対照として設定できるように、ＮＡＰ精製した還元された抗体を分割した。

連続再酸化反応については３本の供給流を使用した。１本目はＮＡＰ精製した還元された抗体であった。２本目は、ＤＭＡ中の１００ｍＭのＤＨＡＡ原液を、最終５％（ｖ／ｖ）の反応の標的を標的とするために必要な別のＤＭＡと合わせたものであった。３本目は、ＮＡＰ精製し還元された抗体を反応のために標的の２．５ｍｇ／ｍＬ抗体濃度まで希釈する、５０ｍＭリン酸カリウムのｐＨ７．５バッファーであった。これら３本の供給流の体積比を、ＮＡＰ精製し還元された抗体の濃度に基づいて決定した。組み合わされた供給流が混合後に最終的な標的の再酸化反応条件を与えるように、この比を調整した。体積流量は、６時間の反応持続時間を標的とするために必要な１／１６ＰＥＥＫチューブの量を算出するためにも用いた。並列の再酸化反応及び連続再酸化反応の双方を周囲温度で設定した。

５０ｍｇの再酸化反応を連続反応及び対照反応のために設定した。３本の供給流の体積流量に基づいて、６時間を標的にするためには合計１９．９フィートの１／１６ＰＥＥＫチューブが必要であった。連続再酸化反応では、反応開始の６．５時間後に開始し断続的にフローリアクタの出口より試料採取した。フローリアクタ内の潜在的な背圧に基づいて、反応が定常状態に達することを確実にするために、さらなる時間を与えた。フローリアクタの出口からまたはバッチ再酸化反応のバルクから採取した試料をすべて、Ａｌｅｘａ－ＭＡＬ ４８８フルオロフォアで標識してＳＥ－ＨＰＬＣで特性決定した。再酸化反応物を経時的に試料採取して、定常状態が達成されることを確実にした。さらに、シリンジ内に含まれ、連続再酸化反応の供給流のうちの１本として供給され還元された抗体もまた、試験終了後に標識した。試験の持続時間にわたりシリンジ内に位置していた間、還元された抗体が再酸化していないことを確実にするために、この試料を試験した。周囲条件によって潜在的に引き起こされる還元された抗体におけるあらゆる変化を理解するために、この試料を還元後の試料と比較した。この連続再酸化試験の結果を表８に示す。

表８：連続再酸化反応の生成物品質

これらのデータは、連続処理を使用して再酸化反応を問題なく実施できることを示す。フローリアクタ内で実施した再酸化反応は、約２．４個のＡｌｅｘａ－ＭＡＬ４８８標識を有する良好な再酸化を示した。バッチの対照反応によるデータは、約２．２個のＡｌｅｘａ－ＭＡＬ４８８標識と同等であった。再酸化前の還元された抗体は、ＤＨＡＡの添加がジスルフィドの再形成を生じさせたことを示す約８個の標識を有していた。Ａｌｅｘａ－ＭＡＬ４８８とコンジュゲートした残存標識は、コンジュゲーションに使用され得る改変システイン残基である。さらに、表８に示すデータは、還元された抗体が周囲条件下で極めてわずかな再酸化を受けることを示す。還元された抗体は、８．１５個の標識で開始し、再酸化試験の持続時間後は７．３６個へとわずかに減少した。このデータは、再酸化はＤＨＡＡとの反応によって駆動され、反応容器またはバッファー中に存在する空気により駆動されていないことを示す。

総合すると、これらの結果は再酸化反応がフローリアクタ中で連続処理を使用して問題なく達成され得ることを示す。

発明の概要及び要約の項ではなく、発明を実施するための形態の項が、特許請求の範囲を解釈するために使用されることを意図していることを理解されたい。発明の概要及び要約の項は、すべてではないが１つ以上の本発明者（複数可）によって意図されるような本発明の例示的な実施形態を記載でき、したがって、本発明及び添付の特許請求の範囲をいかなる形でも限定することを意図するものではない。

本発明は、特定の機能の実施態様及びそれらの関係を示す機能的構成要素を用いて上述されている。これらの機能的構成要素の境界は、説明の便宜上、本明細書において任意に定義されている。特定の機能及びそれらの関係が適切に実施される限り、代替の境界を定義することができる。

特定の実施形態の前述の説明は、本発明の一般的な性質を十分に明らかにするので、他者は、本技術分野の範囲内の知識を適用することによって、過度の実験を行うことなく、本発明の一般概念から逸脱することなく、そのような特定の実施形態を様々な用途に容易に改変及び／または適応させることができる。したがって、そのような適応及び改変は、本明細書で提示される教示及び指導に基づいて、開示される実施形態の等価物の意味及び範囲内にあることが意図される。本明細書の術語または専門用語は説明の目的のためのものであり、限定の目的のためのものではなく、したがって、本明細書の専門用語または術語は、教示及び指導に照らして当業者によって解釈されるべきであることを理解されたい。

本発明の広さ及び範囲は、上述の例示的な実施形態のいずれによっても限定されるべきではなく、以下の特許請求の範囲及びそれらの等価物に従ってのみ定義されるべきである。

本出願の特許請求の範囲は、親出願または他の関連出願の特許請求の範囲とは異なる。したがって、出願人は、親出願または本出願に関連するあらゆる前の出願においてなされた特許請求の範囲のいかなる放棄を撤回する。したがって、審査官は、いかなるそのような以前の放棄及びそれを回避するためになされた引用文献を再考する必要があり得ることを勧告される。さらに、審査官はまた、本出願においてなされたいかなる放棄も、親出願に読み込まれるべきではなく、または親出願に反して読まれるべきではないことに留意されたい。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）組成物を生成するための連続的方法であって、
（ｉ）抗体またはその抗原結合断片を薬物とコンジュゲートさせてＡＤＣを形成すること、
（ｉｉ）非コンジュゲート薬物を除去すること、及び
（ｉｉｉ）前記ＡＤＣを安定なバッファーに交換すること
を含み、
（ｉ）～（ｉｉｉ）が連続的に実施され、
前記非コンジュゲート薬物を除去し及び／または前記ＡＤＣを前記安定なバッファーに交換するために、シングルパス・タンジェンシャルフローろ過（ＳＰＴＦＦ）及び／または向流ダイアフィルトレーションが使用される、
前記方法。
（項目２）
前記非コンジュゲート薬物を除去して前記ＡＤＣを前記安定なバッファーに交換するために、ＳＰＴＦＦ及び／または向流ダイアフィルトレーションが使用される、項目１に記載の方法。
（項目３）
フロースルーカラムクロマトグラフィーが前記非コンジュゲート薬物を除去するために使用され、ＳＰＴＦＦ及び／または向流ダイアフィルトレーションが前記ＡＤＣを前記安定なバッファーに交換するために使用される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記抗体またはその抗原結合断片の前処理をさらに含む、項目１～３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
前記抗体またはその抗原結合断片の前記前処理が（ｉ）～（ｉｉｉ）と共に連続的に実施される、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記抗体またはその抗原結合断片の前記前処理が、ＳＰＴＦＦ及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用して実施され、任意で１つのＳＰＴＦＦ段階または向流ダイアフィルトレーション段階のみが前記前処理に使用される、項目４または５に記載の方法。
（項目７）
前記抗体またはその抗原結合断片の前記前処理が（ｉ）～（ｉｉｉ）の前にバルクで実施される、項目４に記載の方法。
（項目８）
前記方法が、コンジュゲーションのための前記薬物の前処理をさらに含む、項目１～７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）組成物を生成するための連続的方法であって、
（ｉ）抗体またはその抗原結合断片を前処理すること、
（ｉｉ）前記抗体またはその抗原結合断片を薬物とコンジュゲートさせてＡＤＣを形成すること、
（ｉｉｉ）非コンジュゲート薬物を除去すること、及び
（ｉｖ）前記ＡＤＣを安定なバッファーに交換すること
を含み、
（ｉ）～（ｉｖ）が連続的に実施され、
前記非コンジュゲート薬物を除去し及び／または前記ＡＤＣを前記安定なバッファーに交換するために、シングルパス・タンジェンシャルフローろ過（ＳＰＴＦＦ）及び／または向流ダイアフィルトレーションが使用される、
前記方法。
（項目１０）
前記抗体またはその抗原結合断片の前記前処理が、前記抗体またはその抗原結合断片をコンジュゲーションのためのバッファーに交換することを含む、項目４～９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記抗体またはその抗原結合断片の前記前処理が、
前記抗体もしくはその抗原結合断片を還元させること及び／または
前記抗体もしくはその抗原結合断片を酸化させることを含み、任意で、
（ａ）前記還元させること及び／または前記酸化させることが、ＳＰＴＦＦもしくは向流ダイアフィルトレーションを使用せずに達成されるか、または
（ｂ）前記還元させること及び／または前記酸化させることが、１つのＳＰＴＦＦ段階もしくは向流ダイアフィルトレーション段階のみを使用して達成される、
項目４～１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
連続コンジュゲーションプロセスで抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を生成するための方法であって、
コンジュゲーション反応の進行中及び少なくとも１つのコンジュゲーション反応生成物（ＡＤＣ）の形成後、１つ以上のコンジュゲーション反応の反応物質を前記コンジュゲーション反応に添加することを含む、前記方法。
（項目１３）
前記コンジュゲーション反応の反応物質が抗体またはその抗原結合断片を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記コンジュゲーション反応の反応物質がリンカーに結合した薬物を含む、項目１２または１３に記載の方法。
（項目１５）
前記コンジュゲーション反応の反応物質がリンカーを含む、項目１２または１３に記載の方法。
（項目１６）
前記コンジュゲーション反応の反応物質がリンカーに結合した抗体またはその抗原結合断片を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１７）
前記コンジュゲーション反応の反応物質が薬物を含む、項目１２、１３、１５または１６に記載の方法。
（項目１８）
前記コンジュゲーション反応がフローリアクタ内で生じる、項目１２～１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
抗体またはその抗原結合断片の前処理をさらに含む、項目１２～１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
前記抗体またはその抗原結合断片の前記前処理が、コンジュゲーション反応と共に連続的に実施される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記抗体またはその抗原結合断片の前記前処理が、ＳＰＴＦＦ及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用して実施され、任意で１つのＳＰＴＦＦ段階または向流ダイアフィルトレーション段階のみが前記前処理に使用される、項目１９または２０に記載の方法。
（項目２２）
前記抗体またはその抗原結合断片の前記前処理が、コンジュゲーション反応の前にバルクで実施される、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
前記抗体またはその抗原結合断片の前記前処理が、前記抗体またはその抗原結合断片をコンジュゲーションのためのバッファーに交換することを含む、項目１９～２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
前記抗体またはその抗原結合断片の前記前処理が、前記抗体もしくはその抗原結合断片を還元させること及び／または前記抗体もしくはその抗原結合断片を酸化させることを含む、項目１９～２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
前記ＡＤＣがシングルパス・タンジェンシャルフローろ過及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用して濃縮される、項目５～１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記ＡＤＣがシングルパス・タンジェンシャルフローろ過及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用して精製される、項目５～１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記ＡＤＣがシングルパス・タンジェンシャルフローろ過及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用して製剤バッファーへ移される、項目５～１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
前記ＡＤＣがフロースルークロマトグラフィーを使用して濃縮され、精製され、及び／または製剤バッファーへ移される、項目１２～２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
シングルパス・タンジェンシャルフローろ過及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用することを含む、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を濃縮するための方法。
（項目３０）
シングルパス・タンジェンシャルフローろ過及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用することを含む、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を精製するための方法。
（項目３１）
シングルパス・タンジェンシャルフローろ過及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用することを含む、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を製剤バッファーへ移すための方法。
（項目３２）
前記ＡＤＣがバッチコンジュゲーションプロセスで生成される、項目２９～３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記ＡＤＣが連続コンジュゲーションプロセスで生成される、項目２９～３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３４）
前記シングルパス・タンジェンシャルフローろ過が限外ろ過膜を使用する、項目２５、２９、３２及び３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
前記シングルパス・タンジェンシャルフローろ過がダイアフィルトレーション膜を使用する、項目２６、２７、３０及び３１～３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
前記方法が前記ＡＤＣ生成の均一性を向上させる、項目１～３５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
前記方法がＡＤＣ生成のための時間を減少させる、項目１～３６のいずれか１項に記
載の方法。
（項目３８）
前記シングルパス・タンジェンシャルフローろ過及び／または前記向流ダイアフィルトレーションが、前記ＡＤＣ生成の均一性を向上させる、項目１～１１、２１、２３～２７、及び２９～３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目３９）
前記シングルパス・タンジェンシャルフローろ過及び／または前記向流ダイアフィルトレーションが、ＡＤＣの濃縮、精製または移動のための時間を減少させる、項目１～１１、２１、２３～２７、及び２９～３８のいずれか１項に記載の方法。
（項目４０）
前記シングルパス・タンジェンシャルフローろ過及び／または前記向流ダイアフィルトレーションが、使用するバッファーの量を減少させる、項目１～１１、２１、２３～２７、及び２９～３９のいずれか１項に記載の方法。
（項目４１）
前記方法が分析対象のインラインモニタリングをさらに含む、項目１～４０のいずれか１項に記載の方法。
（項目４２）
インラインモニタリングを使用してＡＤＣコンジュゲーション反応への成分の添加を測定する、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を生成するための方法。
（項目４３）
前記インラインモニタリングが前記ＡＤＣコンジュゲーション反応に添加する成分の濃度を測定する、項目４１または４２に記載の方法。
（項目４４）
前記インラインモニタリングが前記ＡＤＣコンジュゲーション反応に添加する成分の流量を測定する、項目４１～４３のいずれか１項に記載の方法。
（項目４５）
前記成分が、抗体もしくはその抗原結合断片、薬物、リンカー、リンカーに結合した薬物、リンカーに結合した抗体もしくはその抗原結合断片及び／またはコンジュゲーションバッファーである、項目４２～４４のいずれか１項に記載の方法。
（項目４６）
前記方法が、ｉｎ－ｓｉｔｕ反応への成分の添加を測定するためにインラインモニタリングすることをさらに含む、項目４２～４４のいずれか１項に記載の方法。
（項目４７）
前記成分が薬物、リンカー、及び／またはｉｎ－ｓｉｔｕ反応バッファーである、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を生成するための方法であって、
分析対象のインラインモニタリングを使用して、
（ｉ）ＡＤＣコンジュゲーション反応へのコンジュゲーションバッファーの添加を停止する時点、
（ｉｉ）ＡＤＣコンジュゲーション反応内のコンジュゲーションバッファーの再循環を停止する時点、及び／または
（ｉｉｉ）ＡＤＣコンジュゲーション反応からのコンジュゲーションバッファーのすすぎ落としを開始する時点を決定する、
前記方法。
（項目４９）
前記分析対象が非コンジュゲート薬物またはリンカーに結合した非コンジュゲート薬物である、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
ＡＤＣコンジュゲーションプロセスの後に抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を精製するための方法であって、分析対象のインラインモニタリングを含む、前記方法。
（項目５１）
前記精製がろ過を含む、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記ろ過が限外ろ過またはダイアフィルトレーションであり、任意で、前記ダイアフィルトレーションが向流ダイアフィルトレーションである、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記ろ過がタンジェンシャルフローろ過を含む、項目５１に記載の方法。
（項目５４）
前記タンジェンシャルフローろ過がシングルパス・タンジェンシャルフローろ過である、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記分析対象が保持液中に存在する、項目４２～５４のいずれか１項に記載の方法。
（項目５６）
前記分析対象が非コンジュゲート薬物またはリンカーに結合した非コンジュゲート薬物の濃度である、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記分析対象がＡＤＣまたは抗体もしくはその抗原結合断片の濃度である、項目５５または５６に記載の方法。
（項目５８）
前記分析対象がコンジュゲーション反応バッファーまたはろ過バッファーの成分の濃度である、項目５５～５７のいずれか１項に記載の方法。
（項目５９）
前記分析対象がｐＨである、項目５５～５７のいずれか１項に記載の方法。
（項目６０）
前記分析対象が透過液中に存在する、項目５０～５９のいずれか１項に記載の方法。
（項目６１）
前記分析対象がＡＤＣまたは抗体もしくはその抗原結合断片の濃度である、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記分析対象が非コンジュゲート薬物またはリンカーに結合した非コンジュゲート薬物の濃度である、項目６０または６１に記載の方法。
（項目６３）
前記精製がクロマトグラフィーを含み、前記分析対象がクロマトグラフィーカラムの終端で測定される、項目５０～６２のいずれか１項に記載の方法。
（項目６４）
前記分析対象がＡＤＣまたは抗体もしくはその抗原結合断片である、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記分析対象が非コンジュゲート薬物、リンカーに結合した非コンジュゲート薬物、コンジュゲーション反応バッファーの成分、またはクロマトグラフィーバッファーの成分である、項目６３または６５に記載の方法。
（項目６６）
前記コンジュゲーション反応がバッチコンジュゲーション反応である、項目４２～６５のいずれか１項に記載の方法。
（項目６７）
前記コンジュゲーション反応が連続コンジュゲーション反応である、項目４２～６５のいずれか１項に記載の方法。
（項目６８）
前記インラインモニタリングが、可変経路長技術、フローセル装置、ＵＶセンサ、ラマン分光法、またはフーリエ変換赤外分光法（ＦＩＴＲ）を使用して実施される、項目４２～６７のいずれか１項に記載の方法。
（項目６９）
前記分析対象の前記インラインモニタリングがＦｌｏｗＶＰＥ（登録商標）を使用して実施される、項目４２～６７のいずれか１項に記載の方法。
（項目７０）
前記インラインモニタリングがＡＤＣの収率を向上させる、項目４２～６９のいずれか１項に記載の方法。
（項目７１）
前記インラインモニタリングがＡＤＣの回収率を向上させる、項目４２～７０のいずれか１項に記載の方法。
（項目７２）
前記インラインモニタリングがＡＤＣ生成のための時間を減少させる、項目４２～７１のいずれか１項に記載の方法。
（項目７３）
前記インラインモニタリングが使用するバッファーの量を減少させる、項目４２～７２のいずれか１項に記載の方法。
（項目７４）
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を生成するための方法であって、
分析対象のインラインモニタリングを使用して、ＡＤＣコンジュゲーション反応へのコンジュゲーション反応成分の添加を停止する時点を決定する、
前記方法。
（項目７５）
前記成分が、抗体もしくはその抗原結合断片、薬物、リンカー、リンカーに結合した薬物、及び／またはコンジュゲーション反応バッファーである、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記ＡＤＣが抗体を含む、項目１～７５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７７）
前記ＡＤＣが抗体の抗原結合断片を含む、項目１～７５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７８）
前記ＡＤＣが、ＣＤ３７、ＣＤ３３、ＦＯＬＲ１、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ｃＭＥＴ、ＡＤＡＭ９、またはＨＥＲ２に特異的に結合する抗体もしくは抗原結合断片を含む、項目１～７７のいずれか１項に記載の方法。
（項目７９）
前記抗体またはその抗原結合断片が、ｈｕＭｏｖｌ９、Ｚ４６８１Ａ、またはＧ４７３２ＡのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義のＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ定義のＣＤＲ、またはＡｂＭ定義のＣＤＲである、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
項目７８に記載の方法であって、前記抗体またはその抗原結合断片が、それぞれ配列番号１～６、それぞれ配列番号７～１２、それぞれ配列番号１３～１８、それぞれ配列番号１９～２４、それぞれ配列番号２５～３０、またはそれぞれ配列番号３１～３６の配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３の配列を含む、前記方法。
（項目８２）
項目７８に記載の方法であって、前記抗体またはその抗原結合断片が、それぞれ配列番号３７及び３８、それぞれ配列番号３７及び３９、それぞれ配列番号４０及び４１、そ
れぞれ配列番号４２及び４３、それぞれ配列番号４４及び４５、それぞれ配列番号４６及び４７、またはそれぞれ配列番号４８及び４９の配列を含むＶＨ及びＶＬ配列を含む、前記方法。
（項目８３）
前記抗体が、それぞれ配列番号５０及び５１、それぞれ配列番号５０及び５２、それぞれ配列番号５３及び５４、またはそれぞれ配列番号５５及び５６の配列を含む重鎖配列及び軽鎖配列を含む、項目７８に記載の方法。
（項目８４）
前記ＡＤＣが、ＳＭＣＣ、ｓＳＰＤＢ、及びペプチドリンカーからなる群から選択されるリンカーを含む、項目１～８３のいずれか１項に記載の方法。
（項目８５）
前記ＡＤＣがメイタンシノイドまたはインドリノ－ベンゾジアゼピンを含む、項目１～８４のいずれか１項に記載の方法。
（項目８６）
前記メイタンシノイドがＤＭ１またはＤＭ４である、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
前記インドリノ－ベンゾジアゼピンがＤＧＮ４６２またはＤＧＮ５４９である、項目８５に記載の方法。
（項目８８）
前記ＡＤＣが、ＩＭＧＮ５２９、ＩＭＧＮ７７９、ＩＭＧＮ８５３、ＩＭＧＮ６３２またはＫａｄｃｙｌａである、項目１～８７のいずれか１項に記載の方法。
（項目８９）
ＩＭＧＮ８５３を生成するための方法であって、
（ｉ）ＩＭＧＮ８５３を形成するために、ｈｕＭｏｖｌ９抗体及びスルホ－ＳＰＤＢに結合したＤＭ４を連続コンジュゲーションプロセス中で混合することであって、任意でインラインモニタリングを使用してコンジュゲーション反応に添加したｈｕＭｏｖｌ９抗体の濃度を測定する、前記混合すること、
（ｉｉ）任意でシングルパス・タンジェンシャルフローろ過及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用してＩＭＧＮ８５３を濃縮することであって、任意でインラインモニタリングを使用して保持液中の非コンジュゲート薬物の濃度を測定する、前記濃縮すること、
（ｉｉｉ）シングルパス・タンジェンシャルフローろ過及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用してＩＭＧＮ８５３を精製することであって、任意でインラインモニタリングを使用して保持液中の非コンジュゲート薬物の濃度を測定する、前記精製すること、ならびに
（ｉｖ）シングルパス・タンジェンシャルフローろ過及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用して前記ＩＭＧＮ８５３を製剤バッファーに交換することであって、任意でインラインモニタリングを使用して保持液中の不純物の濃度を測定する、前記交換すること
を含む、前記方法。
（項目９０）
ＩＭＧＮ７７９を生成するための方法であって、
（ｉ）ＩＭＧＮ７７９を形成するために、Ｚ４６８１Ａ抗体及びスルホ－ＳＰＤＢに結合したＤＧＮ４６２を連続コンジュゲーションプロセス中で混合することであって、任意でインラインモニタリングを使用してコンジュゲーション反応に添加したＺ４６８１Ａ抗体の濃度を測定する、前記混合すること、
（ｉｉ）任意でシングルパス・タンジェンシャルフローろ過及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用してＩＭＧＮ７７９を濃縮することであって、任意でインラインモニタリングを使用して保持液中の非コンジュゲート薬物の濃度を測定する、前記濃縮すること、
（ｉｉｉ）シングルパス・タンジェンシャルフローろ過及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用してＩＭＧＮ７７９を精製することであって、任意でインラインモニタリングを使用して保持液中の非コンジュゲート薬物の濃度を測定する、前記精製すること、ならびに
（ｉｖ）シングルパス・タンジェンシャルフローろ過及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用して前記ＩＭＧＮ７７９を製剤バッファーに交換することであって、任意でインラインモニタリングを使用して保持液中の不純物の濃度を測定する、前記交換すること
を含む、前記方法。
（項目９１）
ＩＭＧＮ６３２を生成するための方法であって、
（ｉ）ＩＭＧＮ６３２を形成するために、Ｇ４７３２Ａ抗体及びスルホン化ＤＮＧ５４９Ｃを連続コンジュゲーションプロセス中で混合すること、
（ｉｉ）任意でシングルパス・タンジェンシャルフローろ過及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用してＩＭＧＮ６３２を濃縮することであって、任意でインラインモニタリングを使用して保持液中の非コンジュゲート薬物の濃度を測定する、前記濃縮すること、
（ｉｉｉ）シングルパス・タンジェンシャルフローろ過及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用してＩＭＧＮ６３２を精製することであって、任意でインラインモニタリングを使用して保持液中の非コンジュゲート薬物の濃度を測定する、前記精製すること、ならびに
（ｉｖ）シングルパス・タンジェンシャルフローろ過及び／または向流ダイアフィルトレーションを使用して前記ＩＭＧＮ６３２を製剤バッファーに交換することであって、任意でインラインモニタリングを使用して保持液中の不純物の濃度を測定する、前記交換すること
を含み、
任意で前記Ｇ４７３２Ａ抗体が、前記コンジュゲーションプロセスの前に１つのＳＰＴＦＦ段階または向流ダイアフィルトレーション段階のみにおいて還元及び酸化される、
前記方法。
（項目９２）
項目１～２８または３４～９１のいずれか１項に記載の方法であって、
コンジュゲーションプロセスの第１の温度を少なくとも５℃高温に上昇させることを含み、前記高温を２０分間以下維持する、前記方法。
（項目９３）
コンジュゲーションプロセスの第１の温度を少なくとも５℃高温に上昇させることを含み、前記高温を２０分間以下維持する、ＡＤＣを生成するための方法。
（項目９４）
前記高温が５５℃以下である、項目９２または９３に記載の方法。
（項目９５）
前記第１の温度を少なくとも１０℃上昇させる、項目９４に記載の方法。
（項目９６）
前記第１の温度を少なくとも１５℃上昇させる、項目９４に記載の方法。
（項目９７）
前記第１の温度を少なくとも２０℃上昇させる、項目９４に記載の方法。
（項目９８）
前記第１の温度を少なくとも３０℃上昇させる、項目９４に記載の方法。
（項目９９）
前記高温が３５℃～５５℃である、項目９２～９８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１００）
前記高温が４０℃～５０℃である、項目９９に記載の方法。
（項目１０１）
前記第１の温度を前記高温まで上昇させることが２分よりも長くかからない、項目９２～１００のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０２）
前記第１の温度を前記高温まで上昇させることが１分よりも長くかからない、項目１０１に記載の方法。
（項目１０３）
前記高温を任意で前記第１の温度まで低下させることをさらに含む、項目９２～１００のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０４）
前記高温を任意で前記第１の温度まで低下させることが２分よりも長くかからない、項目１０３に記載の方法。
（項目１０５）
前記高温を任意で前記第１の温度まで低下させることが１分よりも長くかからない、項目１０４に記載の方法。
（項目１０６）
前記第１の温度を前記高温に上昇させ、次いで前記高温を低下させる段階を、少なくとも２回または少なくとも３回繰り返す、項目１０３～１０５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０７）
前記第１の温度を前記高温に上昇させ、次いで前記高温を低下させる段階を、２～２０回または５～１０回繰り返す、項目１０３～１０５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０８）
項目１～２８または３４～９１のいずれか１項に記載の方法であって、
コンジュゲーションプロセスの第１の温度を少なくとも５℃低温に低下させることを含み、前記低温を２０分間以下維持する、
前記方法。
（項目１０９）
コンジュゲーションプロセスの第１の温度を少なくとも５℃低温に低下させることを含み、前記低温を２０分間以下維持する、ＡＤＣを生成するための方法。
（項目１１０）
前記第１の温度を３０℃以下低下させる、項目１０８または１０９に記載の方法。
（項目１１１）
前記温度を少なくとも１０℃低下させる、項目１０８～１１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１２）
前記温度を少なくとも１５℃低下させる、項目１０８～１１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１３）
前記温度を少なくとも２０℃低下させる、項目１０８～１１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１４）
前記第１の温度を前記低温まで低下させることが２分よりも長くかからない、項目１０８～１１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１５）
前記第１の温度を前記低温まで低下させることが１分よりも長くかからない、項目１１４に記載の方法。
（項目１１６）
前記低温を任意で前記第１の温度まで上昇させることをさらに含む、項目１０８～１１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１７）
前記低温を任意で前記第１の温度まで上昇させることが２分よりも長くかからない、項目１１５に記載の方法。
（項目１１８）
前記低温を任意で前記第１の温度まで上昇させることが１分よりも長くかからない、項目１１６に記載の方法。
（項目１１９）
前記第１の温度を前記低温に低下させ、次いで前記低温を上昇させる段階を、少なくとも２回または少なくとも３回繰り返す、項目１１６～１１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２０）
前記第１の温度を前記低温に低下させ、次いで前記低温を上昇させる段階を、２～２０回または５～１０回繰り返す、項目１１６～１１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２１）
前記高温または前記低温を１５分間以下維持する、項目９２～１２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２２）
前記高温または前記低温を３０秒～１５分間維持する、項目９２～１２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２３）
前記高温または前記低温を５分～１０分間または１０分～１５分間維持する、項目１２２に記載の方法。
（項目１２４）
前記高温または前記低温を１分～５分間維持する、項目１２２に記載の方法。
（項目１２５）
項目１～２８、または３４～１２４のいずれか１項に記載の方法であって、
コンジュゲーションプロセスの第１のｐＨを少なくとも０．５変化させたｐＨに変化させることを含み、前記変化させたｐＨを２０分間以下維持する、
前記方法。
（項目１２６）
コンジュゲーションプロセスの第１のｐＨを少なくとも０．５変化させたｐＨに変化させることを含み、前記変化させたｐＨを２０分間以下維持する、ＡＤＣを生成するための方法。
（項目１２７）
前記第１のｐＨを少なくとも１上昇させ、任意で、前記変化させたｐＨが９を超えない、項目１２５または１２６に記載の方法。
（項目１２８）
前記第１のｐＨを少なくとも２上昇させる、項目１２７に記載の方法。
（項目１２９）
前記第１のｐＨを少なくとも３上昇させる、項目１２７に記載の方法。
（項目１３０）
前記第１のｐＨが少なくとも１低下し、任意で、前記変化させたｐＨが４を下回らない、項目１２５または１２６に記載の方法。
（項目１３１）
前記第１のｐＨを少なくとも２低下させる、項目１３０に記載の方法。
（項目１３２）
前記第１のｐＨを少なくとも３低下させる、項目１３１に記載の方法。
（項目１３３）
前記変化させたｐＨを任意で前記第１のｐＨへ変化させることをさらに含む、項目１２５～１３２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３４）
前記第１のｐＨを前記変化させたｐＨに変化させ、次いで前記変化させたｐＨを変化させる段階を、少なくとも２回または少なくとも３回繰り返す、項目１３３に記載の方法。
（項目１３５）
前記第１のｐＨを前記変化させたｐＨに変化させ、次いで前記変化させたｐＨを変化させる段階を、２～２０回または５～１０回繰り返す、項目１３３に記載の方法。
（項目１３６）
前記変化させたｐＨを１５分間以下維持する、項目１２５～１３５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３７）
前記変化させたｐＨを３０秒～１５分間維持する、項目１２５～１３６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３８）
前記変化させたｐＨを５分～１０分間または１０分～１５分間維持する、項目１３７に記載の方法。
（項目１３９）
前記変化させたｐＨを１分～５分間維持する、項目１３７に記載の方法。
（項目１４０）
項目１～１３９のいずれか１項に記載の方法に従って生成されるＡＤＣ。

Claims (1)

1. 明細書に記載の発明。