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CN116916967A - 偶联设备及生成偶联物的方法 - Google Patents

偶联设备及生成偶联物的方法 Download PDF

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CN116916967A
CN116916967A CN202180093383.XA CN202180093383A CN116916967A CN 116916967 A CN116916967 A CN 116916967A CN 202180093383 A CN202180093383 A CN 202180093383A CN 116916967 A CN116916967 A CN 116916967A
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reaction
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outlet
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秦刚
周胜
吕操
约阿希姆·沃尔特
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Genequantum Healthcare Suzhou Co Ltd
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Lisure Science Suzhou Co ltd
Genequantum Healthcare Suzhou Co Ltd
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Abstract

一种偶联设备，包括：至少一个流动反应器，其具有进口和出口，流动反应器完全填充介质，例如包括1)色谱珠、纤维或薄膜，和2)生物催化剂的基质，生物催化剂即为连接酶，其固定到介质上；流体输送单元，其与流动反应器的进口流体连通，并且被配置为根据偶联过程的不同阶段，向流动反应器连续提供至少一种反应流体，例如抗体和连接子‑负载物，该至少一种反应流体中包含待生成的偶联物的第一反应成分和第二反应成分；以及流体收集单元，其与流动反应器的出口流体连通，并且被配置为根据偶联过程的不同阶段，控制对流出流动反应器的出口的流体的收集。在至少一种反应流体连续地流过流动反应器期间，第一反应成分和第二反应成分在连接酶的催化作用下发生偶联反应而生成偶联物。

Description

偶联设备及生成偶联物的方法
技术领域
本公开内容总体上涉及生物技术和药物生产领域，更具体地，本公开内容涉及一种偶联设备及使用该偶联设备生成偶联物的方法。
背景技术
偶联是采用特定的连接子(Linker)通过生物或化学方法将一个分子与另一个分子连接到一起。例如出于生物科学研究、诊断或治疗目的，对高质量的偶联物，尤其是生物偶联物(Bioconjugate)的需求在迅速增加。生物偶联物是靶向分子及负载物通过连接子连接而成的，例如包括抗体-药物偶联物(ADC)、抗体-免疫激动剂偶联物、抗体-细胞因子偶联物、抗体-核素偶联物等。
以ADC为例，ADC的主要成分包括抗体、连接子和小分子化合物。抗体主要用于将小分子化合物投递到特定靶点，小分子化合物(包括但不限于细胞毒素)对靶点产生效应。目前FDA批准上市的九种ADC药物均采用化学偶联方式形成，即随机地将细胞毒素偶联到抗体骨架的赖氨酸或半胱氨酸残基。
在化学偶联方式中，在偶联工序之前，需要先通过上游和下游工艺利用抗体原料完成单抗原液的生产。随后，在偶联工序中执行以下步骤。对抗体进行预处理(如化学还原)，接下来偶联连接子，通过UF/DF和/或色谱分析去除游离的连接子。然后，偶联小分子化合物，接着再通过阳离子和/或阴离子和/或疏水层析去除聚体。最后，通过UF/DF和/或层析去除游离的小分子化合物。
发明内容
化学偶联存在诸多问题，例如，偶联位点随机、产物异质性、中控复杂且产量扩大存在限制。
首先，化学偶联的产物通常是结构和成分不均一的混合物。连接子与抗体发生偶联反应具有高度随机性，导致偶联到抗体的小分子化合物的数目和抗体的偶联位点差异较大，因此导致ADC药物之类的生物偶联物具有不同的药物/抗体比(DAR)值。因此，生物偶联物呈现高度异质性，导致批间差异性大，治疗窗窄，因而给药物的生产和质量控制带来很大的挑战。
其次，如上面所描述的，化学偶联的生产工艺步骤烦冗，包括多个上游和下游纯化步骤，费时且需要大量人工。
再次，在一些情形中，在化学偶联期间，需要生产人员定时取样，并随后计算样本的DAR值，直至计算结果符合内部质量标准，才进行下一步操作。因此，在这些情形中，DAR的计算过程不但费时，成本相对较高，而且还增加了人为操作错误的风险。
另外，化学偶联通常采用传统反应釜，其体积限制了扩大生产规模的可能。此外，在偶联过程中还需要添加有机相，因此偶联过程难以精确控制。
针对上述技术问题，本公开内容的第一方面提出了一种偶联设备。该偶联设备包括：至少一个流动反应器，其具有进口和出口，流动反应器中完全填充有介质(例如包括色谱珠、纤维或薄膜之类的基质)，并且生物催化剂(即连接酶)固定到介质上；流体输送单元，其与流动反应器的进口流体连通，并且被配置为根据偶联过程的不同阶段，向流动反应器连续提供至少一种反应流体(抗体、连接子-毒素、混合的抗体和连接子-毒素等)，该至少一种反应流体包含待生成的偶联物的第一反应成分和第二反应成分；以及流体收集单元，其与流动反应器的出口流体连通，并且被配置为根据偶联过程的不同阶段，控制对流出流动反应器的出口的流体的收集。在至少一种反应流体连续地流过流动反应器期间，第一反应成分和第二反应成分在连接酶的催化作用下发生偶联反应而生成偶联物。
在依据本公开内容的第一方面所提供的偶联设备中，将连接酶定向固定到介质，并填装在流动反应器中，使得当反应流体流经流动反应器时，反应流体中包含的待生成偶联物的两个反应成分连续稳定地偶联。与化学偶联相比，该偶联设备极大地减少了工艺步骤，显著降低了复杂性，并非常适于节约昂贵的制造成本。而且，通过使用流动反应器，能实现偶联工艺的线性放大，以满足对更高产量的工业需求，缩短单位偶联时间并减小制造区域中的占据空间。通过该偶联设备生产生物偶联物，能实现负载物-连接子与靶向分子之间的定点特异性偶联，改善了同质性，因此拓宽了治疗窗。此外，偶联工艺能与诸如单抗之类的生物分子的生产工艺流程进行集成。例如，在单抗中间体和单抗原液的生产阶段都可以完成偶联。因此，该工艺灵活性高，连贯性好。
在一些实施例中，至少一种反应流体包括第一反应流体和第二反应流体，并且，第一反应流体包含第一反应成分，第二反应流体包含第二反应成分。
在一些实施例中，偶联过程依次包括以下阶段：反应前平衡、偶联反应、反应后回收和回收后冲洗，并且，流体输送单元被进一步配置为：在反应前平衡、反应后回收和回收后冲洗期间，向流动反应器连续提供缓冲液；以及在偶联反应期间，向流动反应器连续并同时提供第一反应流体和第二反应流体。
在一些实施例中，缓冲液、第一反应流体和第二反应流体分别被储存在第一容器、第二容器和第三容器中。流体输送单元包括第一输送泵和第二输送泵。第一容器和第二容器分别经由第一容器出口管路和第二容器出口管路连接至第一输送泵，第三容器经由第三容器出口管路连接至第二输送泵，第一输送泵和第二输送泵分别经由第一进口支管和第二进口支管连接至进口主管，进口主管连接至流动反应器的进口。并且，在反应前平衡、反应后回收和回收后冲洗期间，第一输送泵将第一容器中的缓冲液泵送到进口主管中，在偶联反应期间，第一输送泵将第二容器中的第一反应流体泵送到进口主管中，第二输送泵将第三容器中的第二反应流体泵送到进口主管中。
在一些实施例中，流体输送单元进一步包括第一阀、第二阀、第三阀和第四阀。第一阀、第二阀和第三阀分别设置在第一容器出口管路、第二容器出口管路和第三容器出口管路上，分别用于控制第一容器出口管路、第二容器出口管路和第三容器出口管路中的流体流动，并且，第四阀设置在第一进口支管上，用于控制第一进口支管中的流体流动。
在一些实施例中，在反应前平衡、反应后回收和回收后冲洗期间，第一阀和第四阀开启，第二阀和第三阀关闭，并且在偶联反应期间，第一阀关闭，第二阀、第三阀和第四阀开启。
在一些实施例中，第一容器出口管路、第二容器出口管路、第三容器出口管路、第一进口支管、第二进口支管和进口主管为一次性的或非一次性的，并分别由不锈钢、钛和硅胶中的一个制成。第一容器、第二容器和第三容器分别选自以下各项中的一项：一次性储液袋、一次性储液瓶、不锈钢容器、以及一次性和非一次性玻璃或塑料容器。
在一些实施例中，流体收集单元被进一步配置为：在反应前平衡和回收后冲洗期间，使从流动反应器的出口流出的流体被收集到第四容器中；以及在偶联反应和反应后回收期间，使从流动反应器的出口流出的流体被收集到第五容器中。
在一些实施例中，第四容器和第五容器分别经由第四容器进口管路和第五容器进口管路连接至出口主管，出口主管连接至流动反应器的出口，并且，流体收集单元包括第五阀和第六阀，第五阀和第六阀分别设置在第四容器进口管路和第五容器进口管路上，并分别用于控制第四容器进口管路和第五容器进口管路中的流体流动。
在一些实施例中，在反应前平衡和回收后冲洗期间，第五阀开启，第六阀关闭，并且在偶联反应和反应后回收期间，第五阀关闭，第六阀开启。
在一些实施例中，第四容器进口管路和第五容器进口管路为一次性的或非一次性的，并分别由不锈钢、钛和硅胶中的一个制成。第四容器和第五容器分别选自以下各项中的一项：一次性储液袋、一次性储液瓶、不锈钢容器、以及一次性和非一次性玻璃或塑料容器。
在一些实施例中，偶联设备进一步包括：控温单元，其被配置为：在偶联过程中，控制流入流动反应器的进口的流体和流出流动反应器的出口的流体的温度。
在一些实施例中，控温单元包括：加热模块，其设置在流动反应器的进口处，用于对流入进口的流体进行加热；以及冷却模块，其设置在流动反应器的出口处，用于对流出出口的流体进行冷却。
在一些实施例中，偶联设备进一步包括：取样检测单元，其与流动反应器的出口流体连通，并且被配置为：根据预设的取样时间从流出流动反应器的出口的流体中采集样品流体；以及对样品流体中的偶联物进行检测，以获得检测结果，检测结果指示偶联物是否达到预设标准。
在一些实施例中，取样检测单元包括取样泵、第一切换阀、洗脱泵、至少一个分析柱和检测器。取样泵经由取样管路连接至流动反应器的出口，第一切换阀上设有样品环，并且，第一切换阀根据预设的取样时间在第一状态与第二状态之间切换。在第一切换阀处于第一状态时，取样泵与样品环流体连通，并经由取样管路从流出流动反应器的出口的流体中采集样品流体并泵送至样品环中，并且在第一切换阀处于第二状态时，洗脱泵、样品环、至少一个分析柱和检测器经由检测管路流体连通，洗脱泵将洗脱液泵送至检测管路中，使洗脱液流经样品环，从而带动样品环中的样品流体流过至少一个分析柱中的一个分析柱后进入检测器。
在一些实施例中，分析柱为两个，并且取样检测单元进一步包括第二切换阀和清洗泵，第二切换阀在两个状态之间切换。在第二切换阀处于任一状态下，样品环和检测器与两个分析柱中的一个分析柱流体连通，洗脱液带动样品环中的样品流体流入该一个分析柱中，并且，清洗泵与两个分析柱中的另一个分析柱流体连通，并将缓冲液泵送至该另一个分析柱中以对其进行平衡。
在一些实施例中，第一切换阀为六通阀，第二切换阀为十通阀，并且洗脱泵为四元泵。
在一些实施例中，偶联设备进一步包括：循环回收单元，其设置在流动反应器的进口与出口之间。当检测结果指示偶联物未达到预设标准时，流体收集单元被配置为停止对流出流动反应器的出口的流体的收集，并且，循环回收单元被配置为控制流出流动反应器的出口的流体重新进入进口中，以在流动反应器中再次进行偶联反应。
在一些实施例中，循环回收单元包括第七阀，其设置在回收管路上。回收管路连接在流动反应器的进口与出口之间，并且，在回收管路上设有回收容器。当检测结果指示偶联物未达到预设标准时，第七阀开启，流出流动反应器的出口的流体流经回收管路和回收容器后流入进口。
在一些实施例中，流动反应器为偶联柱。
在一些实施例中，第一反应成分包括连接酶受体底物识别序列和连接酶供体底物识别序列中的一个，并且，第二反应成分包括连接酶受体底物识别序列和连接酶供体底物识别序列中的另一个。
在一些实施例中，偶联设备进一步包括以下各项中的至少一项：压力传感模块、流量检测模块、pH计量模块、电导计量模块和UV检测模块，压力传感模块、流量检测模块、pH计量模块、电导计量模块和UV检测模块分别设置在进口和/或出口处。
本公开内容的第二方面提出了一种生成偶联物的方法，包括：提供至少一种反应流体，该至少一种反应流体中包含待生成的偶联物的第一反应成分和第二反应成分；以及使用上述实施例中任一个的偶联设备生成偶联物。
在依据本公开内容的第二方面所提供的生成偶联物的方法中，将连接酶定向固定到介质，并填装在流动反应器中，使得当反应流体流经流动反应器时，反应流体中包含的待生成偶联物的两个反应成分连续稳定地偶联。与化学偶联相比，该偶联方法极大地减少了工艺步骤，显著降低了复杂性，并非常适于节约昂贵的制造成本。而且，通过使用流动反应器，能实现偶联工艺的线性放大，以满足对更高产量的工业需求，缩短单位偶联时间并减小制造区域中的占据。通过使用该偶联方法生产偶联物，能实现负载物-连接子与靶向分子之间的定点特异性偶联，改善了同质性，因此拓宽了治疗窗。此外，偶联工艺能与诸如单抗之类的生物分子的生产工艺流程进行集成。例如，在单抗中间体和单抗原液的生产阶段都可以完成偶联。因此，该工艺灵活性高，连贯性好。
附图说明
结合附图并参考以下详细说明，本公开内容的各实施例的特征、优点及其他方面将变得更加明显，在此以示例性而非限制性的方式示出了本公开的若干实施例，在附图中：
图1示出了根据本公开内容的一个实施例的偶联设备的流路图；
图2示出了图1中的偶联设备的偶联过程；
图3示出了根据本公开内容的另一个实施例的偶联设备的流路图；
图4示出了图3中的偶联设备的偶联过程；以及
图5示出了根据本公开内容的另一个实施例的偶联设备的流路图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实施例说明本发明的技术内容，本领域技术人员可由本说明书公开的内容容易地了解本发明的其他优点与功效。本发明也可以通过其他不同的具体实施例加以施行或应用。本领域技术人员在不背离本发明的精神前提下，进行各种修饰与变更。
在详细介绍本公开内容的具体实施例之前，首先对本公开内容中用到的一些术语进行说明。
一般术语和定义
除非在下文中另有定义，本文中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。提及本文中使用的技术意图指在本领域中通常所理解的技术，包括那些对本领域技术人员显而易见的技术的变化或等效技术的替换。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品。本文引用的所有专利、已经公开的专利申请和出版物均通过引用并入到本文中。
除非文中另有说明，单数形式指代如“一种(个)”、“该”，包含复数指代。表述“一种(个)或多种(个)”或者“至少一种(个)”可以表示1、2、3、4、5、6、7、8、9种(个)或更多种(个)。
如本文中所使用的术语“同时地”是指本文中描述的一个或多个事件同时发生。
如本文中所使用的术语“包括”、“包含”和“含有”及类似术语是开放性的术语，即“包括/包含但不限于”，表示还可以包括其他内容。术语“基于”是“至少部分地基于”。术语“一个实施例”表示“至少一个实施例”；术语“另一个实施例”表示“至少一个另外的实施例”等等。
如本文中所使用的术语“和/或”(如在A和/或B的短语中)旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”和“B”。同样，如本文中所使用的术语“和/或”(如在“A、B和/或C”的短语中)旨在涵盖以下实施方案中的各者：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
如本文中所使用的术语“连接”、“相连”、“耦接”或“耦合”等类似的词语并非限定于直接连接，其也包括间接连接。
如本文中所使用的“生物分子”的定义涵盖蛋白质，核酸，脂质，碳水化合物，小核苷酸，氨基酸及其衍生物。
如本文中所使用的“连接酶”是指可以催化两个或更多个分子的共价键的酶。连接酶可以特异性地催化包含连接酶供体底物识别序列的第一反应成分与包含连接酶受体底物识别序列的第二反应成分之间的偶联，以生成目标偶联物。
如本文中所使用的术语“偶联”是指至少两方(例如，至少两个分子或同一分子的至少两个末端)的共价连接。
如本文中所使用的“偶联物”可以由至少两方(例如，至少两个分子或同一分子的至少两个末端)通过共价连接制备。
如本文中所使用的“生物偶联物”是指其中至少一个偶联方是生物分子的偶联物。生物偶联物的示例包括但不限于抗体-药物偶联物、抗体-免疫激动剂偶联物、抗体-细胞因子偶联物、抗体-核素偶联物等。
如本文中所使用的“连接子”是指能够以稳定、共价的方式将负载物偶联至靶向分子的任何化学部分。
如本文中所使用的术语“负载物”是指包含在例如经由连接子连接的偶联物中的功能性部分。负载物的示例包括但不限于小分子化合物(也称为小分子药物，例如抑制剂和毒药物(例如细胞毒药物))、放射性核素、聚糖、核酸和类似物、示踪剂分子等。负载物与连接子通过活性基团共价连接，得到连接子-负载物中间体。
如本文中所使用的术语“靶向分子”是指对特定目标(如受体、细胞表面蛋白、细胞因子等)具有亲和性的分子。靶向分子能够将负载物靶向性地运送到体内的特异位点。靶向分子可以识别一种或多种标靶，其靶向的特异位点由其识别的标靶限定。例如，以受体为标靶的靶向分子能够将细胞毒药物递送至含有大量所述受体的位点。靶向分子的示例包括但不限于抗体、抗体片段、给定抗原的结合蛋白、拟抗体、对指定标靶具有亲和性的支架蛋白、配体等。
如本文中所使用的术语“抗体-药物偶联物(ADC)”是指包含共价偶联至负载物的抗体或抗体片段的偶联物。
如本文中所使用的术语“小分子化合物”是指大小与通常用于药物的有机分子相当的分子。该术语不涵盖生物大分子(例如蛋白质、核酸等)，但是涵盖低分子量肽或其衍生物，例如二肽、三肽、四肽、五肽等。通常，小分子化合物的分子量例如可以为约100-约2000Da、约200-约1000Da、约200-约900Da、约200-约800Da、约200-约700Da、约200-约600Da、约200-约500Da。
如本文所使用的“细胞毒素”是指抑制或阻止细胞的表达活性、细胞功能，和/或导致细胞破坏的物质。在一些情形下，在ADC中通常使用的细胞毒素与化疗药物相比毒性较大。细胞毒素的实例包括但不限于靶向以下靶点的药物：微管细胞骨架、DNA、RNA、驱动蛋白介导的蛋白质转运、细胞凋亡的调节。
如本文中所使用的术语“连续地偶联”或“连续偶联过程”是指在偶联过程中，一种或多种偶联所需的反应流体在偶联反应进行的同时以及在已生成至少一种偶联物之后被继续添加至偶联设备。在偶联反应进行时，可继续从偶联反应收集生成的偶联物。
如本文中所使用的术语“流动反应器”是指用于连续进行化学反应(如偶联)的任何反应容器，其可由不锈钢、玻璃、聚合物等材料制成，通常为管状。流动的反应流体进入流动反应器中，在流动反应器中连续发生化学反应并流出流动反应器。
如本文中所使用的术语“介质”是指可以以固体或半固体形式从反应混合物中分离的水不溶性物质，例如表面，凝胶，聚合物，基质，颗粒，树脂，微球或膜。
如本文中所使用的术语“偶联柱”是一种流动反应器，是指用于连续进行偶联反应的管状或柱状反应容器。
如本文中所使用的术语“在线监测”或“实时监测”是指在偶联设备的使用期间实时检测偶联缓冲液、反应流体、从流动反应器流出的流体的某些参数或性质，如pH值、压力、流量、电导率、反应成分的偶联情况等。与离线检测或分析不同，在线监测或实时监测能提供检测结果的实时反馈。
下面参考图1和图2说明本公开内容的一个实施例。图1示出了根据本公开内容的一个实施例的偶联设备的流路图，图2示出了图1中的偶联设备的偶联过程。为了便于说明，在图1中，偶联设备100的各部件已通过管路进行连接，并连接了用于储存流体的五个容器。连接酶被定向固定到介质(例如基质)，并填装在流动反应器10中。可以根据实际需要来选择介质和连接酶，例如，介质可以包括但不限于硅胶、琼脂糖、丙烯酸纤维、人造纤维、醋酸纤维素膜和聚醚砜膜之类的填料，连接酶可以为转肽酶或糖苷酶。流动反应器10具有进口101和出口102。流体从流动反应器10的进口101连续地流入，流经流动反应器10，并从出口102连续地流出。在本实施例中，流动反应器10为偶联柱。然而在其它实施例中，流动反应器10可以是其它类似的反应容器。
在流动反应器10的进口101侧，流体输送单元11与进口101流体连通。流体输送单元11根据偶联过程的不同阶段，向流动反应器10连续提供第一反应流体和第二反应流体或者缓冲液。在流动反应器10的出口102侧，流体收集单元12与出口流体连通。流体收集单元12根据偶联过程的不同阶段，控制对流出流动反应器10的出口102的流体的收集。在第一反应流体和第二反应流体连续地流过流动反应器10期间，第一反应流体中包含的第一反应成分和第二反应流体中包含的第二反应成分在连接酶的催化作用下发生偶联反应而生成偶联物，偶联物包含在流出流动反应器10的出口102的流体中。
具体地，如图1中示出的，流动反应器10的进口101连接至进口主管131。两条分支管路，即第一进口支管132和第二进口支管133并联设置，并通过流体连接件(如三通接头)连接至进口主管131。第一容器141、第二容器142和第三容器143的开口分别连接至第一容器出口管路134、第二容器出口管路135和第三容器出口管路136。流体输送单元11包括第一阀161、第二阀162、第三阀163、第四阀164、第一输送泵171和第二输送泵172。第一容器出口管路134和第二容器出口管路135并联设置，经由流体连接件连接在一起并连接至第一输送泵171。第三容器出口管路136连接至第二输送泵172。第一输送泵171和第二输送泵172分别经由第一进口支管132和第二进口支管133与进口主管131相连。
在第一容器出口管路134上设有第一夹管阀151和第一阀161。类似地，在第二容器出口管路135和第三容器出口管路136上分别设有第二夹管阀152、第二阀162、第三夹管阀153和第三阀163。第一夹管阀151、第二夹管阀152和第三夹管阀153为手动夹管阀，用于对流体从第一容器141、第二容器142和第三容器143的流出进行控制。在偶联准备过程中，通过蠕动泵分别将缓冲液、第一反应流体和第二反应流体泵入相应容器中。在偶联期间打开第一至第三夹管阀151-153，使缓冲液、第一反应流体和第二反应流体流出相应容器。第一阀161、第二阀162和第三阀163分别用于控制流体在第一容器出口管路134、第二容器出口管路135和第三容器出口管路136中的流动路径。在第一进口支管132上还设有第四阀164，其用于控制流体在第一进口支管132中的流动路径。
作为流体的动力来源，第一输送泵171和第二输送泵172可以是任意类型的泵，包括但不限于注射泵、柱塞泵、蠕动泵和隔膜泵，它们可以提供不同的流速范围。例如，某些注射泵可以是1ml、10ml、50ml精密针筒泵，可提供0.01-50ml/min的流速范围；某些蠕动泵可提供5-200ml/min的流速范围；某些隔膜泵可提供40-400ml/min的流速范围。
尽管在本实施例中示出了第一至第四阀161-164以用于控制缓冲液或反应流体在相应管路中的流动，然而在其它实施例中，流体输送单元11也可以仅包括第一输送泵171和第二输送泵172，而无需第一至第四阀161-164。例如，当第一输送泵171和第二输送泵172为柱塞泵或隔膜泵时，可以无需使用第一至第四阀161-164。
继续参考图1，流动反应器10的出口102连接至出口主管137。第四容器144和第五容器145的开口分别连接至第四容器进口管路138和第五容器进口管路139。流体收集单元12包括第五阀165和第六阀166。第五阀165和第六阀166分别设置在第四容器进口管路138和第五容器进口管路139上。此外，第四容器进口管路138上还设有第四夹管阀154，类似地，第五容器进口管路139上还设有第五夹管阀155。与上面描述的第一至第三夹管阀151-153相同，第四夹管阀154和第五夹管阀155也为手动夹管阀，用于对流体从第四容器144和第五容器145的流出进行控制。第五阀165和第六阀166分别用于控制流体在第四容器进口管路138和第五容器进口管路139中的流动路径。第四容器进口管路138和第五容器进口管路139经由流体连接件与出口主管137连接在一起。
第一至第六阀161-166可以是任意类型的阀，例如气动阀、电动阀、液动阀等等。优选地，第一至第六阀161-166为电磁阀。
可以根据实际需要选择第一至第五容器141-145的容器形式、材质和容量，例如，不同规格的一次性储液袋、一次性储液瓶、不锈钢容器或一次性和非一次性玻璃或塑料容器等等。同时，可以根据实际需要选择连接在偶联设备100的各部件之间的管路的材质和规格(如内径)。管路可以由硅胶、钛、不锈钢、或任何其它适当的材料制成。例如，第一至第三容器出口管路134-136、第四至第五容器进口管路138-139以及出口管路137可以是正常厚度的一次性硅胶管路，而进口主管131以及第一和第二进口支管132-133可以是厚度增加的一次性硅胶管路，从而能够承受较大的流量和压力。优选地，第一至第五容器141-145和各管路为一次性硅胶管路和一次性储液袋的组件，并可以直接用作为已消毒的(例如通过伽马射线辐照)管路和袋。一次性硅胶管路和储液袋的组件能实现在偶联设备100上即插即用，避免反复清洗且使用方便，因此能更便利地匹配药物生产所要求的全封闭系统，而且还能防止药物在生产过程中遭受外界污染。在其它实施例中，第一至第五容器141-145和偶联设备100的各部件之间的管路由不锈钢制成，可以通过清洁验证来反复使用。在这些实施例中，可以降低生产成本，并延长容器和管路的使用寿命。
另外，图1中示出的偶联设备100还包括控温单元18。在本实施例中，控温单元18包括设置在进口主管131上的加热模块181和设置在出口主管137上的冷却模块182。加热模块181和冷却模块182分别对进口主管131和出口主管137进行加热和冷却。加热模块181将流入流动反应器10的进口101的流体加热到适当反应温度(如37℃)，冷却模块182将流出流动反应器10的流体冷却到适当温度(如室温)。可以根据实际需要来选择加热模块181和冷却模块182的控温范围、流速和材质。例如，选择加热模块181的控温范围为20-60℃，冷却模块182的控温范围为10-30℃，加热模块181和冷却模块182均为不锈钢卫生级或者一次性材质。在其它实施例中，控温单元18可以具有其它形式，包括但不限于空气加热控温、水浴锅控温(将流动反应器10置于水浴锅中)、夹套水浴控温(在流动反应器10外部套设夹套并使固定温度的水在夹套中循环流动)、以及线圈缠绕控温等等。
在图1中的偶联设备100中，第一容器141中储存缓冲液，第二容器142和第三容器143中分别储存第一反应流体和第二反应流体。然而，在其它实施例中，可以根据实际需要以不同方式在容器中储存反应流体和缓冲液。储存反应流体或缓冲液的容器的数量也可以根据实际需要进行扩展。例如，与第一容器141、第二容器142和/或第三容器143并联地增加更多容器及容器出口管路、夹管阀和阀，相应地，第一输送泵171和第二输送泵172根据工艺流程来选择需要泵送的反应流体或缓冲液。在其它实施例中，还可以根据实际需要选择输送泵的数量。例如，为每个容器配备一个对应的输送泵。
第一反应流体包含待生成的偶联物的第一反应成分，第二反应流体包含偶联物的第二反应成分。反应流体可以是液体或气体。第一反应成分包括连接酶受体底物识别序列和连接酶供体底物识别序列中的一个，第二反应成分包括连接酶受体底物识别序列和连接酶供体底物识别序列中的另一个。在本实施例中，第一反应成分还包括抗体、抗体片段、给定抗原的结合蛋白和拟抗体之类的靶向分子，第二反应成分还包括细胞因子、小分子毒素和核素之类的分子与连接子连接后形成的连接子-负载物中间体，所生成的偶联物为生物偶联物。在其它实施例中，第一反应成分和第二反应成分可以包括其它类型的分子，只要其中一种分子具有连接酶受体底物识别序列，另一种分子具有连接酶供体底物识别序列即可。
在一实施例中，连接酶为转肽酶。在一实施例中，连接酶选自天然转肽酶、非天然转肽酶、其变体及其组合。非天然转肽酶可以但不限于是由天然转肽酶经过改造得到的。在一优选的实施例中，连接酶选自天然Sortase酶、非天然Sortase酶及其组合。其中天然Sortase酶的种类包括Sortase A、Sortase B、Sortase C、Sortase D、SortaseL.plantarum等(可以参见US20110321183A1)。连接酶的种类与连接酶识别序列对应，用于实现不同分子或结构片段之间的特异性偶联。在一实施例中，连接酶受体底物识别序列选自寡聚甘氨酸、寡聚丙氨酸和寡聚甘氨酸/丙氨酸混合物，聚合度为3-10。在一特别的实施例中，连接酶受体底物识别序列为Gn，其中G为甘氨酸(Gly)，n为3-10的整数。在另一特别的实施例中，连接酶为来源于金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的Sortase A酶。相应地，连接酶识别序列可以是该酶的典型识别序列LPXTG。在又一特别的实施例中，连接酶供体底物识别序列为LPXTGJ，连接酶受体底物识别序列为Gn，其中，X可以是任何天然的或非天然的单个氨基酸；J不存在，或为包含1-10个氨基酸的氨基酸片段，可以任选地带有标签。在一实施例中，J不存在。在又一实施例中，J为包含1-10个氨基酸的氨基酸片段，其中每个氨基酸各自独立地为任何天然的或非天然的氨基酸。在另一实施例中，J为Gm，其中m为1-10的整数。在又一特别的实施例中，连接酶供体底物识别序列为LPETG。在另一特别的实施例中，连接酶供体底物识别序列为LPETGG。在一实施例中，连接酶为来自Staphylococcusaureus的Sortase B，对应的供体底物识别序列可以是NPQTN。在另一实施例中，连接酶为来自Bacillus anthracis的Sortase B，对应的供体底物识别序列可以是NPKTG。在又一实施例中，连接酶为Streptococcus pyogenes的Sortase A，对应的供体底物识别序列可以是LPXTGJ，其中J如上文所定义。在另一实施例中，连接酶为来自Streptomyces coelicolor的Sortase subfamily 5，对应的供体底物识别序列可以是LAXTG。在又一实施例中，连接酶为来自Lactobacillus plantarum的Sortase A，对应的供体底物识别序列可以是LPQTSEQ。连接酶识别序列也可以是其他经人工筛选后的优选转肽酶对应的人为设计的识别序列。
在其它实施例中，可以预先混合第一反应流体和第二反应流体，再通过使用偶联设备100进行偶联。在这样的实施例中，可以在偶联准备过程中将混合后的第一反应流体和第二反应流体泵入第二容器142或第三容器143中。在偶联过程中，仅使用储存反应流体的容器及其关联管道和部件。或者，偶联设备100也可以仅包括第二容器142和第三容器143中的一个及其关联管道和部件。
接下来同时参考图1和图2说明偶联设备100的偶联过程。在图2的偶联过程200中，步骤201包括对流动反应器10进行反应前平衡，排出废弃流体。在这个阶段，第一阀161、第四阀164和第五阀165均处于开启状态，其它阀均处于关闭状态。第一容器141中的缓冲液在第一输送泵171的控制下连续流出第一容器141并流经第一容器出口管路134、第一进口支管132后进入进口主管131中。缓冲液流出的速度和持续时长可以通过预先设置第一输送泵171的泵速和运行时间来确定。在流入进口主管131的过程中，缓冲液流入加热模块181，加热模块181对其进行预加热。缓冲液流出加热模块181后，随后流入流动反应器10的进口101，对流动反应器10进行平衡。随后，缓冲液从流动反应器10的出口102流出，经过出口主管137流入冷却模块182中进行后冷却处理，经由第四容器进口管路138排出到第四容器144中进行废弃流体收集。通过在提供第一反应流体和第二反应流体之前预先对流动反应器10进行平衡，能够为流动反应器10提供合适的pH、离子强度等反应环境。
之后，在步骤202中进行偶联反应，收集流出流动反应器10的流体。在这个阶段，第一阀161和第五阀165切换到关闭状态，第四阀164保持在开启状态，而第二阀162、第三阀163和第六阀166切换到开启状态。第二容器142中的第一反应流体在第一输送泵171的控制下连续流出第二容器142并流经第二容器出口管路135和第一进口支管132。第三容器143中的第二反应流体在第二输送泵172的控制下连续流出第三容器143并流经第三容器出口管路136和第二进口支管133。通过分别预先设置第一输送泵171和第二输送泵172的泵速来确定第一反应流体和第二反应流体的流速。根据不同的工艺要求，将流动反应器10的反应体积除以反应流体在流动反应器10中的保留时间来计算偶联流速及每种反应流体的流速(如1/2偶联流速)。
两种反应流体随后汇入进口主管131，在加热模块181中进行预加热后流入流动反应器10的进口101。在流动反应器10中，第一反应流体中包含的第一反应成分和第二反应流体中包含的的第二反应成分经由连接酶的催化作用发生偶联反应并生成偶联物。同时，从流动反应器10的出口102连续流出包含该偶联物的反应后流体。从流动反应器10的出口102流出的流体在冷却模块182中进行后冷却处理后，经由第五容器进口管路139流入第五容器145中进行偶联物收集。应当指出，由于第一反应流体和第二反应流体被连续地提供给流动反应器10，因此，上述偶联反应为连续偶联反应。可以通过将第一反应流体和第二反应流体中体积相对较小的反应流体体积除以反应流体的流速来计算理论偶联时间，并预先将第一输送泵171和第二输送泵172的运行时间预先设置为大于理论偶联时间。
在偶联反应结束后，由于各管路和流动反应器10中仍存在一小部分未反应的和正在反应中的反应流体，因此需要对管路和流动反应器10进行冲洗，使得未反应和正在反应中的反应流体尽可能反应完毕并得到收集。因此，步骤203包括进行反应后回收，收集流出流动反应器10的流体。在这个阶段，第一阀161切换到开启状态，第二阀162和第三阀163切换到关闭状态，第四阀164和第六阀166保持开启状态，第五阀165保持关闭状态。第一容器141中的缓冲液在第一输送泵171的控制下连续流出第一容器141并流经第一容器出口管路134和第一进口支管132后进入进口主管131中。类似地，缓冲液流出的速度和持续时长可以通过预先设置第一输送泵171的泵速和运行时间来确定。之后，缓冲液流入加热模块181中，加热模块181对其进行预加热。缓冲液流出加热模块181后流入流动反应器10的进口101，对流动反应器10进行冲洗。随后，缓冲液从流动反应器10的出口102流出，经过出口主管137流入冷却模块182中进行后冷却处理，经由第五容器进口管路139流入第五容器145中继续收集偶联物。通过在偶联反应结束后使用缓冲液进行反应后回收，能充分利用管路和流动反应器10中残留的反应流体，从而提高收率。
在步骤203之后，在步骤204中进行回收后冲洗，排出废弃流体。在这个阶段，第一阀161和第四阀164都保持在开启状态，第五阀165切换到开启状态，第六阀166切换到关闭状态，而第二阀162和第三阀163的开启或关闭状态保持不变。第一容器141中的缓冲液继续在第一输送泵171的控制下连续流出第一容器141并流经第一容器出口管路134和第一进口支管132后进入进口主管131中。类似地，缓冲液流出的速度和持续时长可以通过预先设置第一输送泵171的泵速和运行时间来确定。之后，缓冲液在加热模块181进行预加热，随后进入流动反应器10的进口101，继续对流动反应器10进行冲洗。随后，缓冲液从流动反应器10的出口102流出，经过出口主管137流入冷却模块182中进行后冷却处理，经由第四容器进口管路138排出到第四容器144中进行废弃流体收集。通过在反应后回收结束后提供缓冲液，能充分冲洗管路和流动反应器10中的残留物。
上述第一至第六阀161-166、第一输送泵171以及第二输送泵172能够通过控制信号进行控制，从而确保彼此之间的配合。在本实施例中，上述各部件的控制单元或处理单元通信地耦合到一个计算设备，该计算设备与偶联设备形成物理上整体的偶联系统。在其它实施例中，该计算设备也可以远离偶联设备放置，例如远程计算设备。计算设备经由模拟、数字或组合的模拟/数字总线或者经由无线通信链路或网络通信地耦合到上述各部件，并可以是任意类型的计算设备，例如，服务器、工作站和便携式计算设备(如笔记本电脑、平板电脑、移动电话)等等。计算设备和各部件中分别存储由它们各自执行的多个应用。计算设备接收来自上述部件的信号或与部件有关的其它信息，并执行控制应用，该控制应用例如做出控制决策并基于接收到的信息生成控制信号。随后，控制应用通过通信线路或链路向各部件发送控制信号，由此控制它们的操作。通过使用计算设备中的配置应用，生产人员能够在偶联过程开始之前经由用户界面创建或改变控制应用中的设置参数，例如，偶联过程中各阶段的开始和结束时间、流体流速等等。设置参数可以由生产人员根据具体工艺设计中反应流体的实例和偶联所需条件来确定。计算设备中的查看应用从控制应用接收数据，并经由用户界面将该数据显示给生产人员。例如，数据可以包括当前流速、各阀的状态、各输送泵的泵速、进口流体温度、出口流体温度等等。因此，在偶联过程200中，生产人员可以监控偶联设备的实时状态。计算设备中的数据历史库应用从配置应用和控制应用接收数据，并将包括偶联过程200中的人员历史操作、偶联过程中的历史参数和偶联结果的历史数据保存在计算设备的存储器中。偶联过程200中的步骤201-204可以自动化连续执行，无需人为干预。
在上述实施例中，将连接酶定向固定到介质，并填装在流动反应器中，使得当反应流体流经流动反应器时，反应流体中包含的待生成偶联物的两个反应成分连续稳定地偶联。与化学偶联相比，该偶联设备极大地减少了工艺步骤，显著降低了复杂性，并非常适于节约昂贵的制造成本。而且，通过使用流动反应器，能实现偶联工艺的线性放大，以满足对更高产量的工业需求，缩短单位偶联时间并减小制造区域中的占据空间。通过该偶联设备生产生物偶联物，能实现负载物-连接子与靶向分子之间的定点特异性偶联，改善了同质性，因此拓宽了治疗窗。此外，偶联工艺能与诸如单抗之类的生物分子的生产工艺流程进行集成。例如，在单抗中间体和单抗原液的生产阶段都可以完成偶联。因此，该工艺灵活性高，连贯性好。
接下来参考图3和图4说明根据本公开内容的另一个实施例。图3示出了根据本公开内容的另一个实施例的偶联设备的流路图，图4示出了图3中的偶联设备的偶联过程。在图3中，与图1相同的附图标记表示参考图1描述的相同的特征。与图1相比，图3的偶联设备300的流路图中增加了取样检测流路。图3中的偶联流路与图1相同，在此将不再赘述。
图3的偶联设备300包括取样检测单元30，其与流动反应器10的出口102流体连通。取样检测单元30根据预设的取样时间从流出流动反应器10的出口102的流体中采集样品流体，并对样品流体中的偶联物进行检测，以获得检测结果，该检测结果指示所述偶联物是否达到预设标准。具体地，在本实施例中，取样检测单元30包括取样泵321、第一切换阀322、洗脱泵323、清洗泵325、第一分析柱326、第二分析柱327和检测器328。取样泵321经由取样管路31连接至出口管路137。第一切换阀322连接至取样泵321。在本实施例中，第一切换阀322为六通阀，其上设有样品环。第一切换阀322在两个状态之间切换来进行取样和送样。第一切换阀322经由检测管路33连接到洗脱泵323和第二切换阀324。在本实施例中，第二切换阀324为十通阀，第一分析柱326和第二分析柱327并联连接形成双柱进样模式。通过在两个状态之间切换第二切换阀324，从两个分析柱326和327中选择一个分析柱，从而允许样品流体流过其中。清洗泵325在样品流体流过所选择的分析柱时泵送缓冲液，从而缓冲液流过另一分析柱以对该另一分析柱进行平衡。
如图3中示出的，第一切换阀322具有1-6号共6个口及进样和送样两个状态，第二切换阀324具有1-10号共10个口及平衡和检测两个状态。第一切换阀322的各个口的连接方式为：1号口与4号口通过外接一根进样环连通；2号口连接至洗脱泵323；3号口连接至第二切换阀的4号口；5号口连接至取样泵321；6号口连接至排废管路。第二切换阀324的各个口的连接方式为：1号口和8号口分别连接至第一分析柱326的两端；2号口连接至清洗泵325；3号口和6号口分别连接至第二分析柱327的两端；4号口连接至第一切换阀322的3号口；5号口连接至10号口；7号口连接至排废管路；9号口连接至检测器328的入口。
参考图4，与图2的偶联方法200相比，偶联方法400中的步骤401、403-404分别与图2中的步骤201、203-204相同，仅步骤402与图2中的步骤202不同。因此，下面将结合图4仅描述步骤402，而对于步骤401、403-404将不再赘述。
步骤402包括进行偶联反应，执行对生成的偶联物的在线监测，以确定生成的偶联物是否达到预设标准。在偶联反应的过程中，取样泵321按照预设的取样时间从出口主管137中采集预定量的样品流体。此时，第一切换阀322处于第一状态(进样状态)。在该状态下，第一切换阀322的5号口与4号口连通，1号口与6号口连通，并且2号口与3号口连通。由于1号口与4号口之间通过样品环连通，因此样品流体的流路为：5号口-4号口-样品环-1号口-6号口。这样，样品流体被泵入并保存在样品环中，多余的样品流体从6号口排出，便完成了取样。可以根据不同的检测方法和每次取样所需样品流体的容量来选择样品环的规格，例如，5μL、10μL、20μL、30μL等。洗脱泵323将缓冲液经由检测管路33泵送到第一切换阀322的2号口，缓冲液流出3号口后，流入第二切换阀324的4号口。此时，第二切换阀324处于第一状态，第二切换阀324的4号口与5号口连通，8号口与9号口连通，10号口与1号口连通，并且2号口与3号口连通。流入的缓冲液在第二切换阀324内的流路为：4号口-5号口-10号口-1号口-第一分析柱326-8号口-9号口-检测器328，从而对第一分析柱326进行预平衡；而此时的清洗泵325的进口管路接收平衡缓冲液，因此平衡缓冲液被泵入第二切换阀324的2号口。平衡缓冲液在第二切换阀324内的流路为：2号口-3号口-第二分析柱327-6号口-7号口-waste排废，从而实现对第二分析柱327进行平衡。
取样完成后，第一切换阀322切换到第二状态(送样状态)。在该第二状态下，第一切换阀322的1号口与2号口连通，3号口与4号口连通，并且5号口与6号口连通。因此，样品流体的流路为：洗脱泵323-2号口-1号口-样品环-4号口-3号口-第二切换阀324的4号口。在进入第二切换阀324后，样品流体的流路为：4号口-5号口-10号口-1号口-第一分析柱326-8号口-9号口-检测器328。在本实施例中，洗脱泵323为四元泵，其控制四种洗脱液的比例，并将洗脱液泵送至检测管路33中，使其流经第一切换阀322中的1号口与4号口之间的样品环，从而带动样品环中的样品流体进入第二切换阀324中。通过由洗脱泵323控制洗脱液的梯度变化来在第一分析柱326中对样品流体进行洗脱，从第一分析柱326流出的流体进入检测器328来检测偶联物。
在下一次进样时，第二切换阀324进行阀位切换，即，1号口与2号口连通，3号口与4号口连通，5号口与6号口连通，7号口与8号口连通，9号口与10号口连通。在该阀位，从第二切换阀324的4号口流入的流体流经3号口进入第二分析柱327中，流出第二分析柱327后依次流经6号口、5号口、10号口和9号口进入检测器328中。同时，第一分析柱326通过清洗泵325泵送的缓冲液进行平衡。
检测器328获得的检测结果指示该偶联物是否达到预设标准。在偶联反应的过程中，取样泵321按照预设的取样时间(如按固定间隔时间)采集样品流体，并对其中的偶联物进行实时检测，从而在线监控整个偶联过程中生成的偶联物。当通过图3中的偶联设备300生产ADC药物时，检测ADC的平均DAR值，用于评估每个抗体分子上偶联的小分子毒素的平均个数，从而能够判断偶联物质量。检测结果也可以被传输至第五阀165和第六阀166的控制单元，从而可以根据检测结果控制第五阀165和第六阀166的开启和关闭。在这种情况下，在对流动反应器10平衡后且在偶联反应刚开始时，第五阀165保持开启状态，而第六阀166保持关闭状态。取样泵321从出口主管137中的流体中采集样品流体并对其中的偶联物进行检测。当偶联物达到预设标准时，第五阀165切换到关闭状态，而第六阀166切换到开启状态，开始将出口主管137中的流体收集到第五容器145中。
上述第一至第六阀161-166、第一输送泵171和第二输送泵172与图1中的偶联设备100相同。各部件的控制单元或处理单元通信地耦合到一个计算设备。本设备还实现了取样泵321的控制和整合。第一切换阀322、洗脱泵323、第二切换阀324和检测器328的控制单元或处理单元通信地耦合到同一个计算设备，从而确保彼此之间的配合。除了上面描述的内容之外，在本实施例中，检测器328将获得的检测结果发送给计算设备中的控制应用，控制应用根据该检测结果来判断偶联物是否满足预设标准。控制应用中的设置参数还可以包括取样开始时间、取样固定间隔时间、取样泵泵速、洗脱泵泵速、清洗泵泵速、各切换阀的阀位切换时间、洗脱液梯度、检测时间、偶联物预设标准(如预设DAR值)等等。计算设备中的查看应用还将从控制应用接收到的上述参数的实时数据经由用户界面进行显示。
在本实施例中，检测器328为UV检测器(紫外吸收检测器)。第一分析柱326和第二分析柱327均为HIC(疏水色谱)分析柱，通过HIC-HPLC(高效液相色谱)检测方法来检测偶联物效率。在其它实施例中，也可以使用RP-HPLC、SEC-HPLC、ProteinA-HPLC等其它检测方法来检测偶联物效率。替代地，检测器328也可以是质谱检测器或荧光检测器等等。在本实施例中，使用双柱检测，通过第二切换阀324切换两个分析柱中的流路。在其它实施例中，也可以使用其它数量的分析柱。例如，可以仅设一个分析柱，在该情况下，无需使用第二切换阀324。
在本实施例中，通过取样泵321经由取样管路31从出口主管137中进行主动取样。取样泵321可以是蠕动泵或注射泵，能精确地控制取样体积，减少取样量，进而提高产品收率。在其它实施例中，也可以不使用取样泵321，而是在取样管路31上设置一个阀。通过阀的阀位切换，使出口主管137中的流体流入取样管路31中并进入第一切换阀322的取样环中。
通过在偶联设备300中增加取样检测单元，能够在线监测流动反应器中生成的偶联物是否符合预设标准，从而有利于符合标准的反应后流体的收集，减少了处理时间和成本，提高了产品的一致性。并且，在偶联过程中，无需生产人员手动进行取样检测，因此增加了工艺便利性，减少了操作复杂性，并避免了可能的人为错误。
在上述实施例中，将连接酶定向固定到介质，并填装在流动反应器中，使得当反应流体流经流动反应器时，反应流体中包含的待生成偶联物的两个反应成分连续稳定地偶联。与化学偶联相比，该偶联设备极大地减少了工艺步骤，显著降低了复杂性，并非常适于节约昂贵的制造成本。而且，通过使用流动反应器，能实现偶联工艺的线性放大，以满足对更高产量的工业需求，缩短单位偶联时间并减小制造区域中的占据空间。通过该偶联设备生产生物偶联物，能实现负载物-连接子与靶向分子之间的定点特异性偶联，改善了同质性，因此拓宽了治疗窗。此外，偶联工艺能与诸如单抗之类的生物分子的生产工艺流程进行集成。例如，在单抗中间体和单抗原液的生产阶段都可以完成偶联。因此，该工艺灵活性高，连贯性好。
接下来参考图5说明根据本公开内容的另一个实施例。图5示出了根据本公开内容的另一个实施例的偶联设备的流路图。在图5中，与图1和图3相同的附图标记表示参考图1和图3描述的相同的特征。
与图3相比，图5的偶联设备500的流路图中增加了循环回收流路。在图5的流路图中，循环回收单元50设置在流动反应器10的进口101与出口102之间。在偶联反应的过程中，当检测器328的检测结果指示偶联物未达到预设标准时，流体收集单元12停止对流出流动反应器10的出口102的流体的收集，并且，循环回收单元50控制流出流动反应器10的出口102的流体重新进入进口101中，以使其在流动反应器10中进行循环偶联反应。
具体地，在图5中，出口主管137除了连接取样管路31之外，还连接至循环管路51的一端。循环管路51的另一端和第三容器出口管路136经由流体连接件共同连接至第二进口管路133。循环管路51上设有回收容器53、第六夹管阀521、第七夹管阀522、第七阀523和第八阀524。
回收容器53用于储存未达到预设标准的反应流体。与第一至第五容器141-145类似，可以根据实际需要来选择回收容器53的容器形式、材质和容量，例如，不同规格的一次性储液袋、一次性储液瓶、不锈钢容器和一次性和非一次性玻璃或塑料容器等等。可以根据实际需要选择循环管路51的材质和规格(如管路内径)，例如，正常厚度的一次性硅胶管路。优选地，回收容器53、第一至第五容器131-135及各管路为一次性硅胶管路和储液袋的组件。
第七夹管阀521和第八夹管阀522为手动夹管阀，用于对流体流入和流出回收容器53进行控制。第七阀523和第八阀524用于在循环偶联过程中控制流体在循环管路51中的流动路径。与第一至第六阀161-166类似，第七阀523和第八阀524可以是任意类型的阀，例如气动阀、电动阀、液动阀等等。优选地，第七阀523和第八阀524为电磁阀。
在偶联反应的过程中，取样泵321按照预设的取样时间从出口主管137中采集预定量的样品流体。样品流体经由洗脱泵323与第一切换阀322的配合进入第二切换阀324中，并流过分析柱326和327之一后流入检测器328中。检测器328对样品流体进行检测，检测结果指示样品流体中的偶联物是否达到预设标准。具体的检测过程与图3相同，在此将不再赘述。如果样品流体中的偶联物未达到预设标准，则第一至第六阀161-166均切换到关闭状态，第七阀523和第八阀524开启。从出口主管137中流出的流体流入循环管路51，在回收容器53中暂存。之后，暂存的流体在第二输送泵172的控制下流经第八阀524，流入进口管路131中并在流动反应器10中再次进行偶联。
如果再次偶联后取样的样品流体中的偶联物达到预设标准，则第六阀166切换到开启状态，第七阀523切换到关闭状态，从出口主管137流出的流体被收集到第五容器145中。如果再次偶联后取样的样品流体中的偶联物仍未达到预设标准，则第一至第六阀161-166保持关闭状态，第七阀523和第八阀524保持开启状态，再次偶联后的流体继续流入循环管路51以继续进行偶联，直至得到的偶联物达到预设标准为止。在循环偶联的过程中，在流动反应器10中发生偶联反应的流体为由循环管路51输送的流体，直到回收容器53和循环管路51中的流体基本排空为止。流体的流速可以通过预先设置第二输送泵172的泵速来确定。根据不同的工艺要求，将回收容器53的保存体积(如流动反应器10的反应体积的1/3)除以保存时间来计算循环偶联的流速。当回收容器53和循环管路51中的流体基本排空时，第二阀162、第三阀163和第四阀164切换到开启状态，第七阀523和第八阀524切换到关闭状态，从而使得第二容器142中的第一反应流体和第三容器143中的第二反应流体继续流入流动反应器10中进行偶联反应。偶联设备500的偶联过程与图3中的偶联设备300的偶联过程400相同，在此将不再赘述。
如上所述，可以在线监测反应流体中包含的反应成分的偶联情况。通过在偶联设备500中增加循环流路，当偶联物的检测结果达到标准时，自动收集流出流动反应器的流体，而当偶联物的检测结果未达标准时，流出流动反应器的流体可以再回收到流动反应器中再次进行偶联直至达到标准。偶联物的整个生产过程自动化完成，不需要生产人员在生产过程中手动取样，从而增加了工艺便利性，减少了人员操作复杂性，并避免了可能的人为错误。
此外，如图5中示出的，在本实施例中，在偶联流路的进口主管131上还分别设有压力传感模块525和流量检测模块526。因此，进入进口主管131的流体首先流过压力传感模块525和流量检测模块526再进入加热模块181。可以预先为压力传感模块525设置压力阈值，当压力传感模块525测量到的流体压力超过该压力阈值时，偶联设备500发出警报并自动暂停，以避免流动反应器10由于压力过大而爆裂。流量检测模块526可以实时监测流过进口主管131的流量。
在其它实施例中，压力传感模块525和/或流量检测模块526也可以设置在出口主管137上，以便实时监测从流动反应器10的出口102流出的流体的压力和流量。此外，在其它实施例中，还可以在进口主管131和/或出口主管137上设置电导计量模块、pH计量模块、UV检测模块等其它测量设备，以便实时监测偶联缓冲液、反应流体和/或从流动反应器10的出口102流出的流体的电导率、pH、UV值等参数。在其它实施例中，还可以在出口主管137上设置自动收集器，以便分段收集从流动反应器10的出口102流出的流体。
上述第一至第六阀161-166、第一输送泵171、第二输送泵172、取样泵321、第一切换阀322、洗脱泵323、第二切换阀324和检测器328与图3的偶联设备300中的那些相同，各部件的控制单元或处理单元通信地耦合到一个计算设备。压力传感模块525、流量检测模块526和第七至第八阀523-524的控制单元或处理单元通信地耦合到同一个计算设备，从而确保彼此之间的配合。除了上面描述的内容之外，在本实施例中，压力传感模块525和流量检测模块526将测量结果发送给计算设备中的控制应用。控制应用根据测量结果做出控制决策并向相关部件发送控制信号。控制应用中的设置参数还可以包括压力阈值、流量阈值、循环偶联时的流速等等。计算设备中的查看应用还将从控制应用接收到的上述参数的实时数据经由用户界面进行显示。
在上述实施例中，将连接酶定向固定到介质，并填装在流动反应器中，使得当反应流体流经流动反应器时，反应流体中包含的待生成偶联物的两个反应成分连续稳定地偶联。与化学偶联相比，该偶联设备极大地减少了工艺步骤，显著降低了复杂性，并非常适于节约昂贵的制造成本。而且，通过使用流动反应器，能实现偶联工艺的线性放大，以满足对更高产量的工业需求，缩短单位偶联时间并减小制造区域中的占据空间。通过该偶联设备生产生物偶联物，能实现负载物-连接子与靶向分子之间的定点特异性偶联，改善了同质性，因此拓宽了治疗窗。此外，偶联工艺能与诸如单抗之类的生物分子的生产工艺流程进行集成。例如，在单抗中间体和单抗原液的生产阶段都可以完成偶联。因此，该工艺灵活性高，连贯性好。
本公开内容的另一个实施例提出了一种生成偶联物的方法。该方法包括：提供至少一种反应流体，该至少一种反应流体中包含待生成的偶联物的第一反应成分和第二反应成分；以及使用上述实施例中任一个的偶联设备生成偶联物。
以上所述仅为本公开内容的可选实施例，并不用于限制本公开内容的实施例。对于本领域的技术人员来说，本公开内容的实施例可以有各种更改和变化。
权利要求的范围符合最宽泛的解释，因此包含所有修改及等同结构和功能。凡在本公开内容的实施例的精神和原则之内，所作的任何修改、等同方式和改进均包括在本公开内容的权利要求的保护范围之内。

Claims (19)

1.一种偶联设备，包括：
至少一个流动反应器，其具有进口和出口，所述流动反应器填充有介质，所述介质上固定有连接酶；
流体输送单元，其与所述流动反应器的所述进口流体连通，并且被配置为根据偶联过程的不同阶段，向所述流动反应器连续提供至少一种反应流体，所述至少一种反应流体中包含待生成的偶联物的第一反应成分和第二反应成分；以及
流体收集单元，其与所述流动反应器的所述出口流体连通，并且被配置为根据所述偶联过程的不同阶段，控制对流出所述流动反应器的所述出口的流体的收集，其中，
在所述至少一种反应流体连续地流过所述流动反应器期间，所述第一反应成分和所述第二反应成分在所述连接酶的催化作用下发生偶联反应而生成所述偶联物。
2.根据权利要求1所述的偶联设备，其中，所述至少一种反应流体包括第一反应流体和第二反应流体，并且，所述第一反应流体中包含所述第一反应成分，所述第二反应流体中包含所述第二反应成分。
3.根据权利要求2所述的偶联设备，其中，所述偶联过程依次包括以下阶段：反应前平衡、偶联反应、反应后回收和回收后冲洗，并且，所述流体输送单元被进一步配置为：
在所述反应前平衡、所述反应后回收和所述回收后冲洗期间，向所述流动反应器连续提供缓冲液；以及
在所述偶联反应期间，向所述流动反应器连续并同时提供所述第一反应流体和所述第二反应流体。
4.根据权利要求3所述的偶联设备，其中，所述缓冲液、所述第一反应流体和所述第二反应流体分别被储存在第一容器、第二容器和第三容器中，
所述流体输送单元包括第一输送泵和第二输送泵，所述第一容器和所述第二容器分别经由第一容器出口管路和第二容器出口管路连接至所述第一输送泵，所述第三容器经由第三容器出口管路连接至所述第二输送泵，
所述第一输送泵和所述第二输送泵分别经由第一进口支管和第二进口支管连接至进口主管，所述进口主管连接至所述流动反应器的所述进口，
在所述反应前平衡、所述反应后回收和所述回收后冲洗期间，所述第一输送泵将所述第一容器中的所述缓冲液泵送到所述进口主管中，并且
在所述偶联反应期间，所述第一输送泵将所述第二容器中的所述第一反应流体泵送到所述进口主管中，所述第二输送泵将所述第三容器中的所述第二反应流体泵送到所述进口主管中。
5.根据权利要求3所述的偶联设备，其中，所述流体输送单元进一步包括第一阀、第二阀、第三阀和第四阀，
所述第一阀、所述第二阀和所述第三阀分别设置在所述第一容器出口管路、所述第二容器出口管路和所述第三容器出口管路上，分别用于控制流体在所述第一容器出口管路、所述第二容器出口管路和所述第三容器出口管路中的流动路径，并且，
所述第四阀设置在所述第一进口支管上，用于控制流体在所述第一进口支管中的流动路径。
6.根据权利要求5所述的偶联设备，其中，
在所述反应前平衡、所述反应后回收和所述回收后冲洗期间，所述第一阀和所述第四阀开启，所述第二阀和所述第三阀关闭，并且
在所述偶联反应期间，所述第一阀关闭，所述第二阀、所述第三阀和所述第四阀开启。
7.根据权利要求4所述的偶联设备，其中，
所述第一容器出口管路、所述第二容器出口管路、所述第三容器出口管路、所述第一进口支管、所述第二进口支管和所述进口主管是一次性的或非一次性的，并分别由不锈钢、钛和硅胶中的一个制成，并且，
所述第一容器、所述第二容器和所述第三容器分别选自以下各项中的一项：一次性储液袋、一次性储液瓶、不锈钢容器以及一次性和非一次性玻璃或塑料容器。
8.根据权利要求3所述的偶联设备，其中，所述流体收集单元被进一步配置为：
在所述反应前平衡和所述回收后冲洗期间，将从每个所述流动反应器的所述出口流出的流体收集到第四容器中；以及
在所述偶联反应和所述反应后回收期间，将从每个所述流动反应器的所述出口流出的流体收集到第五容器中。
9.根据权利要求8所述的偶联设备，其中，
所述第四容器和所述第五容器分别经由第四容器进口管路和第五容器进口管路连接至出口主管，所述出口主管连接至所述流动反应器的所述出口，并且，
所述流体收集单元包括第五阀和第六阀，所述第五阀和所述第六阀分别设置在所述第四容器进口管路和所述第五容器进口管路上，用于控制流体在所述第四容器进口管路和所述第五容器进口管路中的流动路径。
10.根据权利要求9所述的偶联设备，其中，
在所述反应前平衡和所述回收后冲洗期间，所述第五阀开启，所述第六阀关闭，并且
在所述偶联反应和所述反应后回收期间，所述第五阀关闭，所述第六阀开启。
11.根据权利要求9所述的偶联设备，其中，
所述第四容器进口管路、所述第五容器进口管路和所述出口主管是一次性的或非一次性的，并分别由不锈钢、钛和硅胶中的一个制成，并且，
所述第四容器和所述第五容器分别选自以下各项中的一项：一次性储液袋、一次性储液瓶、不锈钢容器以及一次性和非一次性玻璃或塑料容器。
12.根据权利要求1所述的偶联设备，进一步包括：
取样检测单元，其与所述流动反应器的所述出口流体连通，并且被配置为：
根据预设的取样时间从流出所述流动反应器的所述出口的流体中采集样品流体；以及
对所述样品流体中的所述偶联物进行检测，以获得检测结果，所述检测结果指示所述偶联物是否达到预设标准。
13.根据权利要求12所述的偶联设备，其中，
所述取样检测单元包括取样泵、第一切换阀、洗脱泵、至少一个分析柱和检测器，所述取样泵经由取样管路连接至所述流动反应器的所述出口，所述第一切换阀上设有样品环，并且，所述第一切换阀能够根据所述预设的取样时间在第一状态与第二状态之间切换，并且其中，
在所述第一切换阀处于所述第一状态时，所述取样泵与所述样品环流体连通，并经由所述取样管路从流出所述流动反应器的所述出口的流体中采集所述样品流体并将所述样品流体泵送至所述样品环中，并且
在所述第一切换阀处于所述第二状态时，所述洗脱泵、所述样品环、所述至少一个分析柱和所述检测器经由检测管路流体连通，所述洗脱泵将洗脱液泵送至所述检测管路中，使所述洗脱液流经所述样品环，从而使得所述样品环中的所述样品流体流过所述至少一个分析柱中的一个后进入所述检测器。
14.根据权利要求13所述的偶联设备，其中，
所述分析柱为两个，并且所述取样检测单元进一步包括第二切换阀和清洗泵，所述第二切换阀能够在两个状态之间切换，并且
在所述第二切换阀处于任一状态下，所述样品环和所述检测器与所述两个分析柱中的一个分析柱流体连通，所述洗脱液使得所述样品环中的所述样品流体流入所述一个分析柱中，所述清洗泵与所述两个分析柱中的另一个分析柱流体连通，并将缓冲液泵送至所述另一个分析柱中以进行平衡。
15.根据权利要求12所述的偶联设备，进一步包括：循环回收单元，其设置在所述流动反应器的所述进口与所述出口之间，其中，
当所述检测结果指示所述偶联物未达到所述预设标准时，所述流体收集单元被配置为停止对流出所述流动反应器的所述出口的流体的收集，并且，所述循环回收单元被配置为控制流出所述流动反应器的所述出口的流体重新进入所述进口，以在所述流动反应器中再次进行偶联反应。
16.根据权利要求15所述的偶联设备，其中，所述循环回收单元包括第七阀，其设置在回收管路上，所述回收管路连接在所述流动反应器的所述进口与所述出口之间，并且，在所述回收管路上设有回收容器，其中，
当所述检测结果指示所述偶联物未达到所述预设标准时，所述第七阀开启，流出所述流动反应器的所述出口的流体流经所述回收管路和所述回收容器后流入所述进口。
17.根据权利要求1所述的偶联设备，其中，所述流动反应器为偶联柱。
18.根据权利要求1所述的偶联设备，其中，所述第一反应成分包括连接酶受体底物识别序列和连接酶供体底物识别序列中的一个，并且，所述第二反应成分包括所述连接酶受体底物识别序列和所述连接酶供体底物识别序列中的另一个。
19.一种生成偶联物的方法，包括：
提供至少一种反应流体，所述至少一种反应流体中包含待生成的偶联物的第一反应成分和第二反应成分；以及
使用根据权利要求1-18中任一项所述的偶联设备生成所述偶联物。
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