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JP2020530852A - 抗体コンジュゲーション方法 - Google Patents

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Abstract

抗体-ポリペプチドコンジュゲートを作製するための方法および材料が、本明細書において提供される。

Description

発明の分野
本発明は、抗体-ポリペプチドコンジュゲートを作製するための方法および組成物に関する。
発明の背景
抗体には、診断用途と治療用途の両方がある。モノクローナル抗体は、単一のエピトープに対して作られており、無制限の量で生成することができるため、特に有用である。抗体のその標的への特異的結合を検出するには、付加的な試薬および／または抗体の化学修飾が必要である。抗体、試薬、および／または修飾に応じて、そのような検出システムは抗体の性能に潜在的に影響を及ぼし得る。抗体のその標的への特異的結合を検出する方法の開発が継続的に必要である。
抗体ポリペプチドコンジュゲートを作製する方法が、本明細書において提供される。本方法は、活性化抗体を含む第1溶液を提供する段階；活性化ポリペプチドを含む第2溶液を提供する段階；溶液を、活性化抗体が活性化ポリペプチドと接触する連続流反応器に通し、それによって抗体-ポリペプチドコンジュゲートを形成する段階を含み得る。ポリペプチドは、酵素、ビオチン結合ポリペプチド、または蛍光タンパク質であってよい。溶液は、約0.1 mL/min〜約10.0 mL/minの流速で連続流反応器に通されることができる。流速は、約30秒間〜約15分間の滞留時間を提供し得る。いくつかの態様において、流速は、約1分間〜約5分間の滞留時間を提供し得る。抗体-ポリペプチドコンジュゲートは、1:1〜1:3の抗体：ポリペプチド比を含み得る。
本発明のこれらおよびその他の特徴および利点は、同様の数字が同様の部分を指す添付の図面と共に考慮されるべき以下の本発明の好ましい態様の詳細な説明において、より十分に開示されるか、またはそのような説明によって明白になるであろう。
本方法の1つの態様を例証する略図である。 共有結合性コンジュゲートの収量に及ぼす漸増滞留時間の影響を比較する実験の結果を示すグラフである。 高分子量の共有結合性コンジュゲートの割合に及ぼすHRP-抗体比の影響を比較する実験の結果を示すグラフである。 非共有結合性コンジュゲートの収量に及ぼす漸増滞留時間の影響を比較する実験の結果を示すグラフである。 高分子量の非共有結合性コンジュゲートの割合に及ぼすアビジン：ビオチン化抗体比の影響を比較する実験の結果を示すグラフである。 本方法の1つの態様を例証する略図である。
好ましい態様の詳細な説明
好ましい態様の本説明は、本発明の明細書全体の一部と見なされるべき添付図面と関連して読まれるよう意図されている。描画図は必ずしも一定の縮尺ではなく、本発明のある特定の特徴は、明瞭および簡潔となるように、縮尺の上でまたはある程度模式的形式で誇張して示される場合がある。説明において、「水平の」、「垂直の」、「上方へ」、「下方へ」、「最上部の」、および「底部の」などの相対的用語、ならびにそれらの派生語（例えば、「水平に」、「下向きに」、「上向きに」等）は、その時に説明される、または議論中の描画図において示される方向を指すと解釈されるべきである。これらの相対的用語は説明の利便性のためのものであり、通常は特定の方向を要求することは意図されない。「内向きに」と「外向きに」、「縦方向の」と「横方向の」、および同様のものを含む用語は、必要に応じて、互いに対して、あるいは伸長軸または回転軸もしくは回転中心に対して解釈されるべきである。「接続された」および「相互接続された」などの、付着、連結、および同様のものに関する用語は、特に明確に記載されていない限り、構造物が、直接的に又は介在構造を通じて間接的に互いに固定されているまたは付着している関係、および可動性のまたは強固な付着または関係の両方を指す。「動作可能に接続された」という用語は、関連構造がその関係のおかげで意図通りに動作できるようにするような付着、連結、または接続である。単一の機械のみが図示される場合、「機械」という用語はまた、本明細書で議論される方法論のうちの任意の1つまたは複数を実施するための1組の（または複数組の）指示を個々にまたは共同して実行する機械の任意の集合を含むと捉えられるものとする。特許請求の範囲において、ミーンズ・プラス・ファンクション・クローズが使用される場合には、構造的同等物ばかりでなく同等の構造をも含む、列挙された機能を実施するために明細書または図面によって説明された、示唆された、または明らかとされた構造を包含することが意図される。
本発明は、一部には、抗体をポリペプチドに効率的にコンジュゲートする方法の本発明者の開発に基づいている。ポリペプチドへの抗体のコンジュゲーションは、生成物の不均一性、すなわちコンジュゲートにおける抗体：ポリペプチドの比の不一致、および高分子量凝集物の形成をもたらし得る。抗体：ポリペプチド比の不一致および高分子量凝集物はいずれも、分子診断適用における抗体の性能の変動性をもたらし得る。本発明者は、連続流システムにおいて抗体を検出ポリペプチドにコンジュゲートすることによって、抗体-ポリペプチドの比が規定された抗体-ポリペプチドコンジュゲートが一貫して生成され、かつ抗体-ポリペプチドコンジュゲートの高分子量種ならびに抗体およびポリペプチドの凝集物のレベルが低下することを見出した。
したがって、抗体をポリペプチドにコンジュゲートするための材料および方法が、本明細書において提供される。本方法は、診断適用のための免疫測定法において使用するためのコンジュゲート化抗体を調製するのに有用である。診断適用には、例えば、がん、感染症、自己免疫障害、神経障害、および循環器障害を含む種々の疾患および障害の診断が含まれ得る。
組成物
抗体-ポリペプチドコンジュゲートを作製するための材料および方法が、本明細書において提供される。抗体-ポリペプチドコンジュゲートは、共有結合によって連結された抗体およびポリペプチドを含み得る。いくつかの態様において、コンジュゲートは、抗体に連結された2つまたはそれ以上のポリペプチドを含み得る。いくつかの態様において、抗体-ポリペプチドコンジュゲートは、非共有結合、例えばイオン結合によって連結された抗体およびポリペプチドを含み得る。
抗体
本発明者らは、免疫グロブリンベースの結合分子を広く指すために抗体という用語を使用し、本用語は、通常の抗体（例えば、Gクラスの四量体抗体（例えば、IgG1））、それらの意図された標的と結合する能力を保持するそれらの断片（例えば、Fab'断片）、および一本鎖抗体 (scFv) を包含する。抗体は、ポリクローナル性またはモノクローナル性であってよく、ヒト、マウス、ウサギ、ヒツジ、もしくはヤギ細胞によって、またはこれらの細胞に由来するハイブリドーマによって産生され得る。いくつかの態様において、抗体はヒト化されてよく、またはキメラであってよい。
前記抗体は、様々な立体配置を取ることができ、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる1つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質を包含し得る。インタクトな抗体、抗体多量体、もしくは抗体断片、または抗体の機能的な抗原結合領域を含むそれらの他の変種を含む、種々の抗体構造のうちのいずれか1つが使用され得る。「免疫グロブリン」という用語を、「抗体」と同義に使用してもよい。抗体は、元来はモノクローナル性またはポリクローナル性であってよい。抗体の起源にかかわらず、適切な抗体には、インタクトな抗体、例えば、2本の重鎖 (H) および2本の軽鎖 (L) を有するIgG四量体、一本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、相補性決定領域 (CDR) 移植抗体、ならびに抗体断片、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、およびそのような断片に由来する組換え抗体、例えば、キャメルボディ、マイクロ抗体、ダイアボディ、および二重特異性抗体が含まれる。
インタクトな抗体は、抗原結合可変領域（VHおよびVL）、ならびに軽鎖定常ドメイン (CL) および重鎖定常ドメイン、CH1、CH2、およびCH3を含むものである。定常ドメインは、ネイティブ配列定常ドメイン（例えば、ヒトネイティブ配列定常ドメイン）またはそれらのアミノ酸配列変種であってよい。VHおよびVL領域は、より保存されたフレームワーク領域 (FR) が散在する、「相補性決定領域」 (CDR) と称される超可変性の領域にさらに細分される。抗体のCDRは、典型的に、ネイティブ免疫グロブリン結合部位の天然Fv領域の結合親和性および特異性を共に規定するアミノ酸配列を含む。
前記抗体は、任意のクラスの免疫グロブリン、例えば、IgA、IgG、IgE、IgD、IgM（ならびにそれらのサブタイプ（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4））に由来してよく、免疫グロブリンの軽鎖は、κ型またはλ型のものであってよい。ヒト免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α（IgA1およびIgA2）、γ（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに多くの免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。
免疫グロブリンまたは抗体の「抗原結合部分」という用語は、一般に、標的に特異的に結合する免疫グロブリンの部分を指す。したがって、免疫グロブリンの抗原結合部分は、1つまたは複数の免疫グロブリン鎖が全長ではないが、標的に特異的に結合する分子である。抗原結合部分または断片の例には、(i) Fab断片、VLC、VHC、CL、およびCH1ドメインからなる一価断片；(ii) F(ab')2断片、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価断片；(iii) 抗体の単一アームのVLCおよびVHCドメインからなるFv断片；ならびに (v) 特異的に結合するのに十分なフレームワークを有する単離されたCDR、例えば可変領域の抗原結合部分が含まれる。軽鎖可変領域の抗原結合部分および重鎖可変領域の抗原結合部分、例えばFv断片の2つのドメイン、VLCおよびVHCは、組換え法を用いて合成リンカーによって連結することができ、これらは合成リンカーによって、VLC領域とVHC領域が対形成して一価分子を形成する単一タンパク質鎖として作製され得る（一本鎖Fv (scFv) として公知である）。そのようなscFvは、抗体の「抗原結合部分」という用語によって包含される。
「Fv」断片は、完全な抗原認識および結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、密接に非共有 (con-covalent) 結合した1つの重鎖可変ドメインおよび1つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。各可変ドメインの3つの超可変領域が相互作用して、VH-VL二量体の表面上で抗原結合部位を規定するのは、この立体配置においてである。6つの超可変領域が抗原結合特異性を付与する一方で、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な3つの超可変領域のみを含むFvの半分）でさえ、結合部位全体よりも低い親和性ではあるものの、抗原を認識しそれと結合する能力を有する。安定性を向上させるために、VH-VLドメインを (Gly4Ser)3 などの可動性ペプチドリンカーにより結合して、一本鎖FvもしくはscFV抗体断片を形成することができ、またはフレームワーク領域内に2つのシステイン残基を導入することによってジスルフィド結合を形成するように操作して、ジスルフィド安定化Fv (dsFv) をもたらすこともできる。
抗体の断片は、全長抗体の所望の特異性を保持する限り、提供される方法において使用するのに適している。抗体断片を調製する方法は、生化学的方法（例えば、インタクトな抗体のタンパク質分解とそれに続き得る化学的架橋）、および所望の断片の合成を指示するよう免疫グロブリン配列を遺伝子操作する組換えDNAベースの方法の両方を包含する。非特異的チオールプロテアーゼであるパパインによる免疫グロブリン全体のタンパク質分解により、抗体断片を得ることができる。パパイン消化によって、それぞれが単一の抗原結合部位を有する、「Fab断片」と称される2つの同一の抗原結合断片、および残りの「Fc断片」が生じる。プロテインA-セファロースまたはイオン交換クロマトグラフィーにより、様々な画分を分離することができる。ウサギおよびヒト起源のIgGからF(ab')2断片を調製するための典型的な手順は、酵素ペプシンによる限定的なタンパク質分解である。インタクトな抗体のペプシン処理によって、2つの抗原連結部位を有し、なお抗原と架橋結合し得るF(ab')2断片が生じる。Fab断片は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一の定常ドメイン (CH1) を含む。Fab'断片は、重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端において、抗体ヒンジ領域由来の1つまたは複数のシステインを含む数個の残基が付加されている点で、Fab断片とは異なる。F(ab')2抗体断片は最初、それらの間にヒンジシステインを有するFab'断片の対として生成された。
モノクローナル抗体は、抗体産生細胞の単一クローンによって産生される、同一の抗原特異性の均一な抗体である。ポリクローナル抗体は一般に、同じ抗原上の異なるエピトープを認識し、抗体産生細胞の2つ以上のクローンによって産生される。各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象とする。モノクローナルという修飾語は、抗体の実質的に均一な集団から得られたという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈されるべきではない。
モノクローナル抗体は、キメラ抗体、すなわち、典型的には特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同的である重鎖および／または軽鎖の一部を有し、その鎖の残りの部分が、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同的である抗体、ならびに所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片であってよい。キメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、類人猿、旧世界ザル、新世界ザル、原猿）由来の可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常領域配列を含む霊長類化抗体がすべて含まれ得る。
ヒト化抗体は一般に、ヒト定常および／もしくは可変領域ドメインまたは特異的変化を有する、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、または他の種由来のキメラまたは変異モノクローナル抗体である。免疫グロブリンのフレームワークは、ヒト、ヒト化、もしくは非ヒト（例えば、ヒトでの抗原性が低下するように改変されたマウスフレームワーク）、または合成フレームワーク（例えばコンセンサス配列）であってよい。ヒト化免疫グロブリンは、フレームワーク残基がヒト生殖細胞系列配列に対応し、CDRがV(D)J組換えおよび体細胞変異から生じるものある。しかしながら、ヒト化免疫グロブリンはまた、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン核酸配列においてコードされないアミノ酸残基（例えば、エクスビボでランダムまたは部位特異的変異誘発により導入される変異）も含み得る。生殖細胞系列配列に基づくが、例えばインビボ体細胞変異過程により導入されたフレームワーク変異を有する抗体可変ドメイン遺伝子は、「ヒト」と称される。
前記抗体を改変してもよい。いくつかの態様においては、抗体を改変して、グリコシル化を減少または消失させることができる。グリコシル化を欠く免疫グロブリンは、全くグリコシル化されていない；完全にはグリコシル化されていない；または変則的にグリコシル化された免疫グロブリンであってよい（すなわち、変異体のグリコシル化パターンは、対応する野生型免疫グロブリンのグリコシル化パターンと異なる）。IgGポリペプチドは、グリコシル化を減弱させる1つまたは複数の（例えば1、2、もしくは3つ、またはそれ以上の）変異、すなわちグリコシル化を欠く、または完全にはグリコシル化されていないもしくは変則的にグリコシル化されたIgG CH2ドメインをもたらす変異を含み得る。例えばN-結合グリカンからフコース部分を排除することにより、オリゴ糖構造を改変することもできる。いくつかの態様においては、非タンパク質ポリマー、例えばポリエチレングリコールへのコンジュゲーションにより抗体を修飾して、安定性およびまたは溶解度を向上させることができる。いくつかの態様において、抗体は、ビオチン化、カルボキシル化、リン酸化、メチル化、アセチル化、ニトロシル化、シトルリン化、または脱アミノ化により修飾され得る。
有用な抗体は、標的上に存在するエピトープに特異的に結合する。特定の標的は異なり得る。標的の例示的なクラスには、ポリペプチド、炭水化物、脂質、核酸、または代謝産物もしくは治療剤などの小分子が含まれる。エピトープは、パラトープ、すなわち抗体の結合部位が特異的に結合する標的上の抗原決定基を指す。エピトープ決定基は、通常はアミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性のある表面集団からなり、典型的に特異的な三次元構造特性および特異的な電荷特性を有する。ポリペプチド標的の場合、エピトープは一般に、約4個〜約10個の連続したアミノ酸を有するか（直鎖状もしくは連続エピトープ）、またはあるいは特定の構造を規定する一組の非連続アミノ酸であってよい（例えば、高次構造エピトープ）。したがって、エピトープは、少なくとも4個、少なくとも6個、少なくとも8個、少なくとも10個、および少なくとも12個のそのようなアミノ酸からなり得る。アミノ酸の空間的高次構造を決定する方法には、例えばx線結晶学および2次元核磁気共鳴が含まれ得る。
有用な抗体は、閾値レベルの結合活性を示し；かつ／または公知の関連ポリペプチド分子と有意に交差反応しない。いくつかの態様において、抗体は、標的といくらかの相同性を有すると予測される他のタンパク質よりも、標的に対して、少なくとも1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、103倍、104倍、105倍、106倍、またはそれ以上で標的エピトープまたは模倣デコイに結合し得る。
いくつかの態様において、抗体は、10-4 Mもしくはそれ未満、10-7 Mもしくはそれ未満、10-9 Mもしくはそれ未満の高い親和性で、またはナノモル以下（0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 nM、もしくはさらにそれ未満）の親和性で結合する。いくつかの態様において、抗体のそのそれぞれの標的に対する結合親和性は、少なくとも1 x 106 Kaである。いくつかの態様において、抗体のその標的に対する結合親和性は、少なくとも5 x 106 Ka、少なくとも1 x 107 Ka、少なくとも2 x 107 Ka、少なくとも1 x 108 Ka、またはそれ以上である。抗体はまた、その標的への結合親和性に関して記載または特定され得る。いくつかの態様において、抗体は、5×10-2 M、10-2 M、5×10-3 M、10-3 M、5×10-3 M、10-4 M、5×10-5 M、10-5 M、5×10-6 M、10-6 M、5×10-7 M、10-7 M、5×10-8 M、10-8 M、5×10-9 M、5×10-10 M、10-10 M、5×10-11 M、10-11 M、5×10-12 M、10-12 M、5×10-13 M、10-13 M、5×10-14 M、10-14 M、5×10-15 M、もしくは10-15 M未満、またはそれ未満のKdを有する結合親和性を有する。
記述されるように、抗体は、標的に特異的に結合する抗体であってよい。標的は、例えば、疾患または障害に関連した、マーカーとも称されるバイオマーカーであってよい。例示的な疾患または障害には、がん、循環器疾患、炎症、アルツハイマー病および他の認知症などの神経障害、泌尿器障害、骨障害、肺障害、胃腸障害、生殖障害、筋障害、リンパ系障害、免疫系障害、ならびに感染症が含まれる。バイオマーカーは、疾患または障害の予測、予後診断、診断、また代理バイオマーカーであってよい。バイオマーカーは、生体試料、例えば、体液、血液、血清、血漿、尿、精液、脳脊髄液、唾液、涙液、粘液、滑液、母乳、間質液、糞便、リンパ液、胆汁、または膣分泌物中に存在し得る。いくつかの態様において、生体試料は組織試料であってよい。
前記抗体は、がん細胞によって発現される標的に特異的に結合する抗体であってよい。例示的ながんには、非限定的に、白血病およびリンパ腫などの血液がん、星状細胞腫または神経膠芽腫などの神経性腫瘍、メラノーマ、乳がん、肺がん、頭頚部がん、甲状腺がん、胃がんまたは結腸がんなどの胃腸腫瘍、肝がん、膵がん、泌尿生殖器腫瘍、例えば、卵巣がん、膣がん、子宮がん、膀胱がん、精巣がん、前立腺がん、または陰茎がんなど、骨腫瘍、ならびに血管腫瘍が含まれる。
いくつかの態様において、標的は腫瘍関連抗原 (TAA) であってよい。TAAは、腫瘍細胞によって発現され、かつ (a) 正常細胞において発現されるその対応物と質的に異なるか、または (b) 正常細胞よりも腫瘍細胞においてより高レベルで発現される分子（例えば、ポリペプチド、炭水化物、または脂質）であってよい。したがって、TAAは、正常細胞において発現されるその対応物と異なってもよいし（例えば、分子がタンパク質である場合、1つもしくは複数のアミノ酸残基だけ）、または同一であってもよい。好ましくは、それは正常細胞によって発現されない。あるいは、それは、腫瘍細胞の正常対応物よりも腫瘍細胞において少なくとも2倍高い（例えば、2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、40倍、100倍、500倍、1000倍、5000倍、または15000倍高い）レベルで発現される。例示的ながん細胞標的には、CA-125、HE4、がん胎児抗原 (CEA)、MUC（ムチン、例えばMUC1）、前立腺特異的抗原 (PSA)、糖鎖抗原15.3 (CA 15-3)、エストロゲン受容体 (ER)、プロゲステロン受容体 (PgR)、HER2、糖鎖抗原27.29 (CA 27.29)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン-β (HCG-β)、α-フェトプロテイン、カルシトニン、サイログロブリン、CA 19-9、核マトリックスタンパク質22 (NMP-22)、前立腺がん抗原3 (PSA3)、エプスタイン・バーウイルス核抗原、ならびにヒトパピローマウイルス (HPV) E6およびE7が含まれる。
いくつかの態様において、抗体は、非限定的に、ウイルス、ウイロイド、細菌、真菌、プリオン、または寄生虫を含む広範な感染病原体のいずれかによって発現または放出される分子に特異的に結合する抗体であってよい。例えば、ウイルス性病原体には、非限定的に、株A (H1N5) を含むインフルエンザウイルス、肝炎ウイルス（例えば、A型、B型、C型、およびD型肝炎）、アレナウイルス、ブニヤウイルス、フラビウイルス、フィロウイルス、アルファウイルス（例えば、ベネズエラウマ脳炎、東部ウマ脳炎、西部ウマ脳炎）、ハンタウイルス、ヒト免疫不全ウイルスHIV1およびHIV2、ネコ免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、ロタウイルス、パピローマウイルス、呼吸器多核体ウイルス、痘瘡、ならびにウイルス性脳炎（例えば、ウエストナイルウイルス、ラクロス、カリフォルニア脳炎、VEE、EEE、WEE、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林ウイルス）が含まれ得る。細菌性病原体には、炭疽菌 (Bacillus anthracis)、ペスト菌 (Yersinia pestis)、エンテロコリチカ菌 (Yersinia enterocolitica)、ボツリヌス菌 (Clostridium botulinum)、ウェルシュ菌 (Clostridium perfringens)、野兎病菌 (Francisella tularensis)、ブルセラ属種、サルモネラ・エンテリディティス (Salmonella enteriditis) を含むサルモネラ属種、大腸菌 (Escherichia coli) O157:H7を含む大腸菌、肺炎球菌 (Streptococcus pneumoniae)、黄色ブドウ球菌 (Staphylococcus aureus)、鼻疽菌 (Burkholderia mallei)、類鼻疽菌 (Burkholderia pseudomallei)、クラミジア属種、コクシエラ菌 (Coxiella burnetii)、発疹チフスリケッチア (Rickettsia prowazekii)、ビブリオ属種、赤痢菌属種、リステリア菌 (Listeria monocytogenes)、結核菌 (Mycobacteria tuberculosis)、らい菌 (M. leprae)、ライム病ボレリア (Borrelia burgdorferi)、アクチノバチルス・プルロニューモニア (Actinobacillus pleuropneumoniae)、ピロリ菌 (Helicobacter pylori)、髄膜炎菌 (Neisseria meningitidis)、百日咳菌 (Bordetella pertussis)、ジンジバリス菌 (Porphyromonas gingivalis)、およびカンピロバクター・ジェジュニ (Campylobacter jejuni) が含まれ得るが、これらに限定されない。
真菌性病原体には、非限定的に、アスペルギルス属、ペネシリウム (Penecillium) 属、スタキボトリス属、トリコデルマ属、マイコプラズマ属のメンバー、ヒストプラズマ・カプスラーツム (Histoplasma capsulatum)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス (Cryptococcus neoformans)、クラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)、およびカンジダ・アルビカンス (Candida albicans) が含まれ得る。
病原性原生動物には、例えば、クリプトスポリジウム属のメンバー、例えばクリプトスポリジウム・パルバム (Cryptosporidium parvum)、ランブル鞭毛虫、微胞子虫、およびトキソプラズマ、例えば、トキソプラズマ・ブルセイ (Toxoplasma brucei)、トキソプラズマ・ゴンディ (Toxoplasma gondii)、赤痢アメーバ (Entamoeba histolytica)、熱帯熱マラリア原虫 (Plasmodium falciparum)、大型リーシュマニア (Leishmania major)、およびシクロスポラ・カヤタネンシス (Cyclospora cayatanensis) が含まれ得る。
ポリペプチド
本発明の組成物は、ポリペプチド、例えば抗体のその標的への特異的結合を検出できるようにするポリペプチドを含み得る。「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、典型的には様々なサイズのペプチド配列を指すが、本明細書において互換的に用いられる。本発明のアミノ酸ベースの組成物を、それらがアミノ酸残基の直鎖状ポリマーであることを伝えるために、およびそれらを全長タンパク質と区別するのを助けるために、「ポリペプチド」と称する場合がある。本発明のポリペプチドは、抗体のその標的への特異的結合を検出できるように十分な活性を保持する限り、ポリペプチドの断片を「構成する」または「含む」ことができる。ポリペプチドは、例えば組換え技法または化学合成を含む種々の方法によって作製することができる。
前記ポリペプチドは、検出ポリペプチド、すなわち抗体にコンジュゲートされた場合に抗体のその標的への特異的結合の検出を促進するポリペプチドであってよい。検出ポリペプチドには、酵素、ビオチン結合ポリペプチド、または蛍光タンパク質が含まれ得る。有用な酵素には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ウレアーゼ、ダイズペルオキシダーゼ、β-ラクタマーゼ、βガラクトシダーゼ、およびグルコース酸化酵素が含まれる。ビオチン結合ポリペプチドは、ビオチンまたはビオチン模倣物に非共有結合的に特異的に結合する任意のポリペプチド、例えば、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジン、または抗ビオチン抗体であってよい。いくつかの態様において、ポリペプチドは、グリコシル化、カルボキシル化、リン酸化、メチル化、アセチル化、脱アセチル化、ニトロシル化、シトルリン化、および脱イミノ化により修飾され得る。
前記抗体、および前記ポリペプチド、例えば前記検出ポリペプチドは、コンジュゲーションの前に精製され得る。抗体およびポリペプチドは、例えば、濾過、遠心分離、および様々なクトマトグラフィー法、例えば、逆相もしくは順相HPLC、サイズ排除、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過、疎水性クロマトグラフィー、接線限外濾過、透析濾過、イオン交換クロマトグラフィー、Sephadex G-などの多糖ゲル媒体での分配クロマトグラフィー、またはアフィニティークロマトグラフィーなどを用いて精製され得る。これらの精製技法はそれぞれ、所望の抗体またはポリペプチドを混合物の他の成分から分離するための分画を伴う。抗体はまた、例えばプロテインA-Sepharoseおよび／またはプロテインG-Sepharoseクロマトグラフィーによって精製され得る。抗体およびポリペプチドの純度は、分光光度法を含む種々の方法によって解析され得る。「本質的に純粋」という用語は、精製前に抗体またはポリペプチドに通常付随するまたはそれらと相互作用する他の成分を実質的または本質的に含まない可能性のある抗体またはポリペプチドの化学的純度を指す。ほんの一例として、抗体またはポリペプチドの調製物が、混入成分の約30%未満、約25%未満、約20%未満、約15%未満、約10%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満、または約1%未満（乾燥重量による）を含有する場合に、抗体またはポリペプチドは「本質的に純粋」であり得る。例えば、精製によって、コンジュゲートされていない反応物または凝集物のうちの1つまたは複数の量が、当初存在していたコンジュゲートされていない反応物または凝集物の量の10%もしくはそれ未満、5%もしくはそれ未満、または1%もしくはそれ未満に減少し得る。したがって、「本質的に純粋な」抗体またはポリペプチドは、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、またはそれ以上の純度レベルを有し得る。
方法
前記抗体と前記ポリペプチドは、連続流装置、例えば連続流反応器中でコンジュゲートさせる。種々のコンジュゲーション化学を用いることができる。概して、抗体とポリペプチドとの間で共有結合を形成するために、抗体もしくはポリペプチドのいずれか一方またはその両方を活性化する。活性化試薬は、抗体とポリペプチドの連結を開始するのに適した任意の試薬であってよい。概して、生化学的コンジュゲーションは、ポリペプチド内の4つの標的：1) ポリペプチドのN末端において、およびリジン残基の側鎖中に見出される一級アミン (-NH2)；2) C末端において、ならびにアスパラギン酸およびグルタミン酸残基の側鎖中に見出されるカルボキシル (-COOH)；3) システイン残基の側鎖において見出されるスルフヒドリル (-SH)；ならびに4) 糖タンパクにおいて炭水化物基を酸化することによって作出されるカルボニル (-CHO) において、共有結合を介して起こり得る。種々の試薬を用いて、これらの残基においてポリペプチドを架橋することができる。
いくつかの態様において、抗体は、一級アミン (-NH2) において終結するリジンの側鎖を介してポリペプチドに共有結合させることができる。アミン反応性試薬には、N-ヒドロキシスクシンイミド (NHS) エステルなどの反応性エステル、イオスチオシアネート (iosthiocyanate)、アルデヒド、無水物、例えばジエチルトリアミン五酢酸無水物 (DTPA) が含まれる。いくつかの態様において、抗体は、ハロアセチル誘導体およびマレイミドなどのチオール活性試薬を介してポリペプチドに共有結合させることができる。いくつかの態様において、抗体は、カルボジイミド、例えば1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 (EDC) を用いて、アルデヒドおよびカルボン酸を介してポリペプチドに共有結合させることができる。いくつかの態様において、抗体は、過ヨウ素酸ナトリウムを介してポリペプチドに共有結合させることができる。いくつかの態様において、抗体は、ヘテロ二官能性試薬、例えばスクシンイミジル6-(N-マレイミド)ヘキサン酸によってポリペプチドに共有結合させることができる。
いくつかの態様においては、ポリペプチド上の一級アミン基を保護スルフヒドロ基に変換して、ヘテロ二官能性架橋を促進することができる。例えば、SATA（N-スクシンイミジルS-アセチルチオ酢酸）は、タンパク質および他のアミン含有分子にスルフヒドリル基を保護型で付加する。SATAはN-ヒドロキシスクシンイミド (NHS) エステルを含み、これは一級アミン（すなわち、リジン残基およびタンパク質のアミノ末端）と安定した共有結合性アミド結合を形成し、副産物としてNHSを放出する。遊離スルフヒドリルを生成するための脱保護（脱アシル化）は、ヒドロキシルアミン-HClによる処理によって行うことができる。
いくつかの態様において、抗体とポリペプチドは、「ヒンジ法」を用いてコンジュゲートすることができる。抗体をペプシンで消化して、F(ab')2断片を生成する。F(ab')2断片を還元して、遊離チオール基を有するF(ab')断片を生成する。ポリペプチド、例えばアルカリホスファターゼを、一方の末端にチオール選択的マレイミド基および他方の末端にアミノ基選択的N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを含むヘテロ二官能性リンカーと混合する。これら2つの官能基は、スペーサーによって分離され得る。アミノ基選択的N-ヒドロキシスクシンイミドエステルは、アルカリホスファターゼ中の遊離アミノ基と反応してアルカリホスファターゼ-マレイミドを形成する。次いでアルカリホスファターゼ-マレイミドを適切な条件下でF(ab')断片と混合して、アルカリホスファターゼに共有結合されたF(ab')断片を生成する。
いくつかの態様において、抗体とポリペプチドは、「ノンヒンジ法」を用いてコンジュゲートすることができる。抗体をイミノチオランと反応させて、1つまたは複数の一級アミンに連結されたチオール基を有する抗体であるIgG-SHを形成する。上記のように、ポリペプチド、例えばアルカリホスファターゼを、一方の末端にチオール選択的マレイミド基および他方の末端にアミノ基選択的N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを含むヘテロ二官能性リンカーと混合する。これら2つの官能基は、スペーサーによって分離され得る。アミノ基選択的N-ヒドロキシスクシンイミドエステルは、アルカリホスファターゼ中の遊離アミノ基と反応してアルカリホスファターゼ-マレイミドを形成する。次いでアルカリホスファターゼ-マレイミドを適切な条件下でIgG-SHと混合して、アルカリホスファターゼに共有結合されたIgG-SHを生成する。
いくつかの態様において、コンジュゲートは、抗体とポリペプチドが構造スペーサーによって分離されるように構成され得る。構造スペーサーは、用いられる架橋剤に応じて、様々な長さおよび化学組成のものであってよい。いくつかの態様において、スペーサーセグメントは1個または複数個のアミノ酸であってよい。
いくつかの態様において、抗体-ポリペプチドコンジュゲートは、非共有結合、例えばイオン結合によって連結された抗体およびポリペプチドを含み得る。したがって、抗体を修飾し、次いで修飾型抗体と特異的に結合するポリペプチドと接触させることができる。例示的な修飾には、ビオチン化、カルボキシル化、リン酸化、メチル化、アセチル化、ニトロシル化、シトルリン化、または脱アミノ化が含まれる。例えば、抗体をビオチン化することができる。ビオチン化抗体溶液は、ビオチン結合ポリペプチドを含む溶液と共に連続流反応器に通されて、抗体-ビオチン-アビジンコンジュゲートを形成することができる。
一般に、連続流装置は、相互接続されかつ流体連絡し、分析反応または過程を実行するように設計された1つまたは複数のチャンバー、ポート、およびチャネルの統合システムである。連続流システムはまた、試料導入、流体および／もしくは試薬駆動手段、温度制御、検出システム、データ収集、ならびに／または統合システムなどの支援機能を提供する器具類を含み得る。連続流装置は、弁、ポンプ、および、例えば、試料成分または反応物の吸着を妨げ、電気浸透によって試薬の動きを促進するための、内壁上の特殊な機能性コーティングをさらに含み得る。連続流装置は典型的に、ガラス、プラスチック、または他の固体ポリマー材料であってよい固体基材内にまたは固体基材として製作され、特に光学的方法または電気化学的方法により、試料および試薬の動きを容易に検出およびモニターできるように、典型的には平面形式を有する。連続流装置は、広範囲の断面寸法を有し得る。装置の寸法は、反応容積および滞留時間に合うようスケール調整することができる。例示的な滞留時間は、30秒間から10分間に及び得る。流速は一般に、特定のシステムの寸法に依存する。有用な連続流システムは、試薬の迅速な混合をもたらして反応を開始し（始め）かつ終結する（停止する）流速、ならびに十分に制御された、反応の開始と反応の終結との間の時間である滞留時間を有し得る。概して、連続流装置内の試薬は、拡散、乱流混合によって、またはインライン静止混合器により混ざり得る。
迅速な混合のための例示的容積は、マイクロリットル〜ミリットル範囲内である。流路の内径は典型的に、ミリメートル範囲内である。連続流装置は、数百平方マイクロメートル未満の断面寸法を有してよく、通路は典型的に、例えば約500μm〜約0.1μmの最大断面寸法を有する極小の寸法を有する。マイクロ流体装置は典型的に、1μLから10 nL未満まで、例えば10〜100 nLまでの範囲の容積容量を有する。例示的な容積容量には、10 nL、20 nL、30 nL、40 nL、50 nL 60 nL、70 nL、80 nL、90 nL、100 nL、120 nL、130 nL、140 nL、150 nL、160 nL、170 nL、180 nL、190 nL、200 nL、220 nL、240 nL、250 nL、300 nL、3500 nL、400 nL、450 nL、500 nL、600 nL、700 nL、800 nL、900 nL、1000 nLが含まれ得る。
本明細書において開示される方法のための有用な市販の連続流システムには、Corning Low-Flow（商標）反応器、VapourTec R-シリーズまたはE-シリーズシステム；Lonza FlowPlate（商標）シリーズのシステム；Syrris Asia、Titan、Africa、またはDolomiteフローシステム；Chemtrix Labtrix（登録商標）、GRAMFLOW（登録商標）、KILOFPOW（登録商標）、PROTRIX（登録商標）、PLANTRIX（登録商標）、または3D PRINTED FLOWシステムが含まれる。あるいは、連続流システムは、特注のまたは設計された連続流装置であってよい。各システムの寸法は、流速および滞留時間の特定の範囲に合うようにスケール調整される。例示的な滞留時間は、30秒間から10分間に及び得る。流速は一般に、特定のシステムの寸法に依存する。流路の内径は典型的に、ミリメートル範囲内である。これらのシステムを選択するおよび特注することにより、抗体-ポリペプチドコンジュゲーション反応を行うために必要な容積、反応物比、および流速の大きな多様性が可能となる。特定の装置にかかわらず、有用なシステムは、試薬の迅速な混合、ならびに同時に起こるその反応の迅速な開始および終結を可能にする流速を提供する。有用な立体配置により、試薬の実質的に即時的な混合が可能になり、迅速な混合のための例示的容積は、マイクロリットル〜ミリットル範囲内である。反応の迅速な開始および終結によって、より均一なコンジュゲートが生じ、かつ高分子量凝集物の生成が減少する。
例示的な連続流反応器の立体配置を図6に示す。フロー反応器1は、複数のマイクロチャネル3を含むコンジュゲーション反応器ブロック2を含む。ポンプA 4において、活性化抗体が反応器にポンプ注入される。ポンプB 5において、活性化HRPが反応器にポンプ注入される。活性化抗体および活性化HRPはコンジュゲーション反応器ブロック2を通過し、そこでコンジュゲーションが起こる。溶液は次いで停止反応器ブロック6を通過し、そこでは、ポンプC 7において、β-メルカプトエタノール停止溶液が停止反応器ブロック6にポンプ注入される。溶液は次いでクエンチ反応器ブロック8を通過し、そこでは、ポンプD 9において、NEMクエンチ溶液がクエンチ反応器ブロック8にポンプ注入される。溶液は次いでクエンチ反応器ブロック8を出て、そこで収集される。
抗体およびポリペプチドの量は、特定のコンジュゲーション化学およびマイクロリアクターの規模によって変動し得る。抗体とポリペプチドのモル比もまた変動し得る。抗体とポリペプチドのモル比の範囲は、約1:20から約20:1まで変動し得る。例示的な比には、1:20；1:10；1:5；1:4；1:2；1:1；2:1；4:1、5:1；6:1；10:1；14:1；17:1；および20:1が含まれる。
活性化抗体および活性化ポリペプチドがフロー反応器を通過する速度もまた変動してよく、一部には所望のスケール調整された反応および用いられる特定のシステムに依存する。反応は、ミリグラム範囲の量からキログラム範囲の量までスケール調整することができる。一般に、流速は約0.1 mL/min〜約10.0 mL/minであってよい。いくつかの態様において、流速は、約1.0 mL/min〜約5.0 mL/min、約2.0 mL/min〜約4.0 mL/minであってよい。したがって、流速は、約0.1 mL/min、約 0.5 mL/min、約 1.0 mL/min、約 1.2 mL/min、約 1.5 mL/min、約 1.8 mL/min、約 2.0 mL/min、約 2.2 mL/min、約 2.5 mL/min、約 2.8 mL/min、約 3.0 mL/min、約 3.2 mL/min、約 3.5 mL/min、約 3.8 mL/min、約 4.0 mL/min、約 4.2 mL/min、約 4.5 mL/min、約 4.8 mL/min、約 5.0 mL/min、約 5.2 mL/min、約 5.5 mL/min、約 5.8 mL/min、約 6.0 mL/min、約 6.2 mL/min、約 6.5 2 mL/min、約 6.8 mL/min、約 7.0 mL/min、約 7.2 mL/min、約 7.5 mL/min、約 7.8 mL/min、約 8.0 mL/min、約 8.2 mL/min、約 8.5 mL/min、約 8.8 mL/min、約 9.0 mL/min、約 9.2 mL/min、約 9.5 mL/min、約 9.8 mL/min、約 10.0 mL/min、約 10.5 mL/min、約 11.0 mL/min、約 11.5 mL/min、約 12.0 mL/min、約 12.5 mL/min、約 13.0 mL/min、約 13.5 mL/min、約 14.0 mL/min、約 14.5 mL/min、または約 15.0 mL/minであってよい。
したがって、滞留時間（保持時間とも称される）もまた変動し得る。反応器内の試薬の滞留時間は一般に、滞留時間＝反応器容積／流速のように、反応器の容積および流速に基づいて算出される。より長い滞留時間は、試薬をよりゆっくりとポンプ注入するか、またはより大きな反応器容積を用いることによって達成され得る。滞留時間には、例えば、約20秒間、約30秒間、約40秒間、約50秒間、約60秒間、約70秒間、約80秒間、約90秒間、約100秒間、約120秒間、約140秒間、約150秒間、約160秒間、約170秒間、約180秒間、約190秒間、約200秒間、または約1分間、約2分間、約3分間、約4分間、約5分間、約6分間、約7分間、約8分間、約9分間、約10分間、約12分間、もしくは約15分間が含まれる。
反応温度もまた、特定のコンジュゲーション化学に応じて変動し得る。反応温度は、約4℃から約45℃；約10℃から約40℃；約15℃から約37℃；約15℃から約25℃；約20℃から約22℃に及び得る。
概して、コンジュゲーション反応は水溶液中で行われ得る。pHを生理的範囲内に維持する緩衝系を用いることができる。有用な緩衝系は、コンジュゲーション反応に関与する活性基と反応しない。いくつかの態様において、pHは弱酸性から弱塩基性に及び得る。例えば、pHは、約6.0、約6.2、約6.4、約6.5、約6.6、約6.7、約6.8、約6.9、約7.0、約7.1、約7.2、約7.3、約7.4、約7.5、約7.6、約7.7、約7.8、約7.9、約8.0、約8.1、約8.2、約8.3、約8.5、約8.8、または約 8.9であってよい。
コンジュゲーション反応は、特定の反応物に応じて種々の方法で終結させることができる。共有結合性のコンジュゲーションについては、例えばβメルカプトエタノールなどの還元剤を添加することによって、反応を終結させることができる。共有結合反応は、N-エチルマレイミドを用いてクエンチすることができる。非共有結合性のコンジュゲーションについては、ビオチンの添加により反応を終結させることができる。
粗製コンジュゲート溶液中のコンジュゲートの濃度は、種々の方法によって決定することができる。例示的な方法には、280 nmにおける吸光度を測定することによる分光光度的決定が含まれる。ポリペプチドが西洋ワサビペルオキシダーゼである場合、コンジュゲートはまた、280 nm、およびペルオキシダーゼ上の補欠分子ヘム基を検出する403 nmの両方における吸光度を測定することによって、分光光度法により解析することができる。コンジュゲートのRZ値、すなわち403 nmにおける吸光度と280 nmにおける吸光度の比を算出することができる。コンジュゲート化西洋ワサビペルオキシダーゼの有用なRZ値は、約0.8から約2.0に及び得る。これは、平均値3:1から4:1のHRP：抗体に相当する。この比はまた、他の方法、例えば、多角度光散乱 (MALS)、液体クロマトグラフィー、または質量分析を用いて決定することもできる。
抗体-ポリペプチドコンジュゲートは、上記の方法、例えば、濾過およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製することができる。
抗体-ポリペプチドコンジュゲートは、種々の免疫測定法形式で用いることができる。免疫測定法には、均一アッセイおよび不均一アッセイの両方、競合アッセイおよび非競合アッセイの両方、直接アッセイおよび間接アッセイの両方、ならびに「サンドイッチ」アッセイが含まれ得る。有用な形式には、酵素免疫測定法、例えば酵素結合免疫吸着測定法 (ELISA)、化学発光免疫測定法 (CLIA)、電気化学発光アッセイ、放射免疫測定法、免疫蛍光法、蛍光偏光測定法、免疫沈降法、平衡透析法、免疫拡散法、免疫ブロット法、凝集、発光近接アッセイ、および比濁法が含まれるが、これらに限定されない。
形式にかかわらず、生体試料を抗体と接触させる。いくつかの態様においては、生体試料を固体支持体上に固定化することができる。いくつかの態様においては、生体試料を、固体支持体上に固定化された抗体と接触させる。固体支持体は、例えば、プラスチック表面、ガラス表面、紙もしくは線維表面、または粒子の表面であってよい。より具体的には、支持体には、マイクロプレート、ビーズ、二フッ化ポリビニルピロリドン (PVDF) 膜、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、多孔性膜、非多孔性膜が含まれ得る。基材の組成は多様であってよい。例えば、支持体または基材は、ガラス、セルロース系材料、熱可塑性ポリマー、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、もしくはポリエステルなど、粒子状物質から構成される焼結構造（例えば、ガラスもしくは様々な熱可塑性ポリマー）、またはニトロセルロース、ナイロン、もしくはポリスルホンから構成されるキャスト膜フィルムを含み得る。一般的な態様において、基材は、抗体またはポリペプチドがその上に固定化され得る任意の表面または支持体であってよく、これには、固体支持体（例えば、スライドガラスもしくは被覆プレートなどのガラス、シリカ、プラスチックもしくは誘導体化プラスチック、常磁性もしくは非磁性金属）、半固体支持体（例えば、ポリマー材料、ゲル、アガロース、もしくは他のマトリックス）、および／または多孔性支持体（例えば、フィルター、ナイロンもしくはニトロセルロース膜、または他の膜）のうちの1つまたは複数が含まれる。いくつかの態様においては、合成ポリマーを基材として用いることができ、これには、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリグリシジルメタクリル酸、アミノ化またはカルボキシル化ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリアミド、およびポリ塩化ビニルが含まれる。
抗体結合は、種々の方法で測定することができる。シグナル、例えば検出可能な標識によって生じたシグナルを解析し、該当する場合には、光学式スキャナー、または複合体形成と関連したシグナル、例えば、蛍光シグナル 発光シグナル、もしくはリン光シグナル、または放射性シグナルの測定を可能にする他の画像取得装置およびソフトウェアを用いて定量化することができる。検出可能なシグナルを測定するための例示的な器具類には、マイクロプレートリーダー、蛍光光度計、分光光度計、およびガンマカウンターが含まれ得るが、これらに限定されない。
本発明のいくつかの態様を説明してきた。それにもかかわらず、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な修正が行われ得ることが理解されるであろう。したがって、他の態様も以下の特許請求の範囲の範囲内である。
実施例1：材料および方法
抗体の調製および活性化 抗CA 125抗体をFujirebio Diagnosticsから入手した。抗体を50 mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0の溶液に対して透析し、次いでシリンジフィルター（Gelman Acrodisc、25 mm、0.2μフィルター）を通して濾過した。抗体濃度を分光光度法により決定した。抗体濃度をAb緩衝液で10 mg/mlに調整した。Amicon撹拌式セルを用いて抗体を濃縮し、最終濃度を分光光度法により決定した。活性化のため、抗体をビーカーに分注し、20℃の温度制御ウォーターバス内で撹拌した。活性化試薬、スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸 (SMCC) を、8.9 mg/mLの濃度になるようにジメチルホルムアミド (DMF) 中に溶解した。SMCCの最終濃度が約1 mg/mlになるように、撹拌しながら、SMCC/DMF溶液を抗体に1滴ずつ添加した。抗体-SMCC溶液を、22℃で60分間穏やかに撹拌した。活性化抗体を、1つまたは複数のシリンジフィルターを通して濾過し、清潔な琥珀色ガラス容器に入れた。脱塩緩衝液（100 mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.0）で予め平衡化した活性化抗体溶液を脱塩した。活性化抗体を抗体緩衝液に対して16〜24時間透析し、琥珀色のまたはホイルで覆ったガラスボトルに移した。次いで透析済みの抗体を、1つまたは複数のシリンジフィルターを通して濾過し、最終濃度を分光光度法により決定した。活性化抗体を、高速タンパク質液体クロマトグラフィー (FPLC)（ATKA、GE Healthcare Life Sciences）を用いてSephadex G25カラムにてクロマトグラフした。活性化抗体を含有する適切な画分をプールし、プールされた抗体を、1つまたは複数のシリンジフィルターを通して濾過した。抗体濃度を分光光度法により決定した。活性化を含有する画分をプールし、プールされた活性化抗体を、活性化HRPの添加時まで、20℃の温度制御ウォーターバス内で、蓋をきつく閉めて貯蔵した。
HRPの活性化 西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP、Roche）を、HRP：抗体の比が5:1重量／重量 + 25%過剰HRPとなるように、ガラスボトルに分注した。HRPを、20 mg/mlの濃度でHRP緩衝液（100 mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.5）中に溶解した。温度制御ウォーターバス内で20℃において撹拌することにより、溶液を溶解した。N-スクシンイミジル-S-アセチルチオ-酢酸 (SATA) をガラス容器に分注し、50 mg/mlの濃度になるようにDMF中に溶解した。SATA/DMF溶液を、約4.5 mg/mLの最終SATA濃度になるように、撹拌しながらHRPに1滴ずつ添加した。HRP 1 mg当たり0.1 mLの体積のヒドロキシルアミンHCl試薬（NH2OH Cl、Vitros）を、ヒドロキシルアミン（ヒドロキシルアミンHCl試薬の活性成分）の最終濃度が約26.7 mg/mlとなる濃度まで、穏やかに撹拌しながらHRP/SATA混合物に1滴ずつ添加し、20℃で15分間インキュベートした。活性化HRP溶液を、高速タンパク質液体クロマトグラフィー (FPLC)（ATKA、GE Healthcare Life Sciences）を用いてSephadex G25カラムにてクロマトグラフした。活性化HRPを含有する画分をプールし、1つまたは複数のシリンジフィルターを通して濾過し、濃度を分光光度法により決定した。
抗体-HRPコンジュゲーション 抗体-HRPコンジュゲーションは、セットアップされ、脱塩緩衝液で25℃にて平衡化された（Advanced-Flowシリーズの反応器からの）Corning Low-Flow（商標）反応器で実施した。立体配置は、プレート型および注文に応じて作製された：LFSIH、LFR*H、LFR*H、LFR*H、LFSHH、LFR*H、およびLFSHH。初期実験のために、ポンプAを0.57 ml/minに設定し、ポンプBを1.43 ml/minに設定し、ポンプCを0.2 ml/minに設定し、およびポンプDを0.5 ml/minに設定した。反応器をクエンチ溶液および停止溶液で平衡化した。ポンプAを用いてスーパーループAにおいて、抗体溶液を反応器に負荷した。ポンプBを用いてスーパーループBにおいて、西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) を反応器に負荷した。コンジュゲーション反応は、AKTA Unicornシステムコントロールソフトウェアプログラムを用いて、2.7 mL/minの流速で実行した。反応を280 nmおよび403 nmにおいてモニターした。活性化抗体および活性化HRPは、以下で指定される時間にわたって、コンジュゲーション反応器ブロックを通過できるようにした。コンジュゲート溶液は次いで、ポンプCを用いてβメルカプトエタノール停止溶液で平衡化された停止反応器ブロックを通過した。そこから、コンジュゲートは、ポンプDを用いてクエンチ緩衝液で平衡化されたクエンチ反応器ブロックを通過した。粗製コンジュゲートを収集し、280 nmにおける吸光度に基づいて濃度を決定した。YM30膜を備えたAmicon撹拌式セルを用いて、粗製コンジュゲートを濃縮した。濃縮された粗製コンジュゲートを濾過し、次いで遮光クラスボトル中で5℃で貯蔵した。濃縮された粗製コンジュゲートを、AKTA FPLC精製システムを用いて、精製緩衝液で平衡化されたSephacryl S300 HRカラムを用いて精製した。精製コンジュゲートは、直ちに安定化させるか、または安定化の前に2〜8℃で最長24時間まで維持した。精製コンジュゲートは、Proclin（商標）300、フェリシアン化カリウム、およびウシ血清アルブミン (BSA) の添加により安定化させた。
実施例2：コンジュゲート収量に及ぼす滞留時間の影響
CA 125抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼを用いる抗体コンジュゲーション反応を、30秒間、1分間、2分間、5分間、6.7分間、および10分間の滞留時間を用いて、実施例1に記載される通りに実施した。反応産物を分析用HPLCカラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによって解析し、280 nmにおける吸光度を決定した。各条件に関する反応産物の比較を図2に示す。図2に示されるように、より長い滞留時間は、高分子量成分の生成の増加と相関した。
実施例3：高分子量産物収量に及ぼすHRP-抗体比の影響
CA 125抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼを用いる抗体コンジュゲーション反応を、1:1、2:1、4:1、5:1、および6:1のHRP：抗体比を用いて、実施例1に記載される通りに実施した。コンジュゲーションは、1分間、2分間、5分間、および10分間の滞留時間で行った。各条件に関する高分子量産物の収量の比較を図3に示す。図3に示されるように、より低いHRP：抗体比は、より高いHRP：抗体比よりも、より高レベルの高分子量産物をもたらした。
したがって、図2および図3に示されるように、高分子量種の形成は、抗体：HRP比、抗体濃度、およびフロー反応器内での滞留時間に依存した。
実施例4：コンジュゲート特徴決定
HRP：抗体の様々な比および様々な滞留時間を用いて調製されたコンジュゲートについて、HRP取り込みパーセントおよびRz値（403 nmにおける吸光度／280 nmにおける吸光度）を決定した。これらの値を、標準的なバッチ法を用いて調製された対照コンジュゲートと比較した。HRP取り込みパーセントは、HPLCトレースからのAUC値を用いて推定した。この解析の結果を以下の表に示す。表に示されるように、推定されるHRP取り込みおよびRZ値は、以前のバッチ反応に匹敵した。HRP取り込みパーセントは、A403 nm/A280 nmの比に基づいて決定した。
（表１）推定されるHRP取り込みおよびRZ値
Figure 2020530852
コンジュゲートを、バッチ間のばらつきおよび安定性について解析した。上記の方法を用いて調製されたコンジュゲートは、標準的なバッチ法技法を用いて調製されたものに匹敵した。
実施例5：抗体ビオチン化
マウス抗ヒトMUC1抗体 (DF3) 抗体をFujirebio Diagnosticsから入手した。抗体を100 mMリン酸カリウム緩衝液、pH 8.5の溶液に対して透析した。抗体濃度を分光光度法により決定した。抗体濃度を、100 mMリン酸カリウム緩衝液、pH 8.5で10 mg/mLに調整した。ビオチン化のため、抗体をビーカーに分注し、25℃の温度制御ウォーターバス内で撹拌した。ビオチン-e-アミノカプロン酸N-ヒドロキシ-スクシンイミド-エステル (ビオチン-X-NHS) を、3.47 mg/mlの濃度でジメチルスルホキシド (DMSO) 中に溶解した。ビオチン-X-NHSの最終濃度が約0.18 mg/mlになるように、撹拌しながら、ビオチン-X-NHS/DMSO溶液を抗体溶液に1滴ずつ添加した。抗体／ビオチン-X-NHS溶液を、25℃で90分間穏やかに撹拌した。リジンの最終濃度が約3 mg/mLになるように、撹拌しながら、1 Mリジン溶液、pH 8.5を抗体／ビオチン-X-NHSに1滴ずつ添加することにより、反応をクエンチした。抗体／ビオチン-X-NHS／リジン溶液を、25℃で30分間穏やかに撹拌した。次いで抗体／ビオチン-X-NHS／リジン溶液を2 mMリン酸カリウム緩衝液、pH 7.5の溶液に対して透析して、ビオチン化抗体を精製した。
実施例6：アビジン-ビオチン化抗体コンジュゲーション
アビジン-ビオチン化抗体コンジュゲーションは、セットアップされ、100 mMリン酸カリウム緩衝液、pH 6.8で22℃にて平衡化された（Advance-Flowシリーズの反応器からの）Corning Low-Flow（商標）反応器で実施した。立体配置は、プレート型および注文に応じて作製された：LFSIH、LFR*H、LFR*H、LFR*H、およびLFSHH。ポンプAを用いてスーパーループAにおいて、ビオチン化抗体溶液を反応器に負荷した。ポンプBを用いてスーパーループBにおいて、アビジン溶液 (Sigma Aldrich) を反応器に負荷した。ポンプCを用いてスーパーループCにおいて、非コンジュゲート化ビオチンクエンチ溶液を反応器に負荷した。コンジュゲーション反応は、AKTA Unicornシステムコントロールソフトウェアプログラムを用いて実行した。反応を280 nmにおいてモニターした。ビオチン化抗体およびアビジンは、以下で指定される時間にわたって、コンジュゲーション反応器ブロックを通過できるようにした。コンジュゲート溶液は次いで、ポンプCを用いて非コンジュゲート化ビオチンで平衡化されたクエンチ反応器ブロックを通過した。
実施例7：コンジュゲート分子量に及ぼす滞留時間の影響：
ビオチン化抗体およびアビジンを用いる抗体コンジュゲーション反応を、20秒間、40秒間、60秒間、および120秒間の滞留時間を用いて、上記の通りに実施した。反応産物を分析用UPLCカラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによって解析し、280 nmにおける吸光度を決定した。各条件に関する反応産物の比較を図2に示す。図4に示されるように、より長い滞留時間は、高分子量コンジュゲートの生成の増加と相関した。
実施例8：コンジュゲート分子量に及ぼすアビジン-ビオチン化抗体の影響：
抗体コンジュゲーション反応を、1:4、1:6、1:8、および1:10のアビジン：ビオチン化抗体比を用いて、上記の実施例5〜7に記載される通りに実施した。各条件に関する高分子量産物の比較を図6に示す。図6に示されるように、より低いアビジン：ビオチン化抗体比は、より高いアビジン：ビオチン化抗体比よりも、より高レベルの高分子量コンジュゲートをもたらした。

Claims (32)

  1. (a) 活性化抗体を含む第1溶液を提供する段階；
    (b) 活性化ポリペプチドを含む第2溶液を提供する段階；
    (c) 該第1溶液および第2溶液を、該活性化抗体が該活性化ポリペプチドと接触する連続流反応器に通し、それによって該抗体と該ポリペプチドとの間で共有結合を形成する段階
    を含む、抗体-ポリペプチドコンジュゲートを作製する方法。
  2. 前記抗体がIgGである、請求項1に記載の方法。
  3. 前記抗体が抗CA125抗体である、請求項1に記載の方法。
  4. 前記ポリペプチドが検出ポリペプチドである、請求項1に記載の方法。
  5. 前記検出ポリペプチドが、酵素、ビオチン結合ポリペプチド、または蛍光タンパク質である、請求項1に記載の方法。
  6. 前記酵素が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびウレアーゼからなる群より選択される、請求項4に記載の方法。
  7. 前記抗体が、スクシンイミジルエステル、ヘテロ二官能性試薬、カルボジイミド、または過ヨウ素酸ナトリウムにより活性化される、請求項1に記載の方法。
  8. 前記スクシンイミジルエステルがスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸である、請求項6に記載の方法。
  9. 前記ポリペプチドがN-スクシンイミジル-S-アセチルチオ-酢酸により活性化される、請求項1に記載の方法。
  10. 活性化抗体：活性化ポリペプチドの比が1:1〜約1:4である、請求項1に記載の方法。
  11. 約0.1 mL/min〜約10.0 mL/minの流速で前記溶液が前記連続流反応器に通される、請求項1に記載の方法。
  12. 約1.0 mL/min〜約5.0 mL/minの流速で前記溶液が前記連続流反応器に通される、請求項10に記載の方法。
  13. 前記流速が約30秒間〜約15分間の滞留時間を提供する、請求項11に記載の方法。
  14. 前記流速が約1分間〜約5分間の滞留時間を提供する、請求項11に記載の方法。
  15. 前記抗体-ポリペプチドコンジュゲートが1:1〜約1:3の抗体：ポリペプチド比を含む、請求項1に記載の方法。
  16. 段階 (c) の後に、停止溶液、クエンチャー、またはそれらの組み合わせを連続流反応器に添加する段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
  17. 前記抗体-ポリペプチドコンジュゲートを精製する段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
  18. (a) 修飾型抗体を含む第1溶液を提供する段階；
    (b) 該修飾型抗体に特異的に結合する検出ポリペプチドを含む第2溶液を提供する段階；
    (c) 該溶液を、該修飾型抗体が該ポリペプチドと接触する連続流反応器に通し、それによって該抗体と該検出ポリペプチドとの間で非共有結合を形成する段階
    を含む、抗体-ポリペプチドコンジュゲートを作製する方法。
  19. 抗体の修飾が、ビオチン化、カルボキシル化、リン酸化、メチル化、アセチル化、ニトロシル化、シトルリン化、および脱アミノ化からなる群より選択される、請求項18に記載の方法。
  20. 前記抗体がIgGである、請求項18に記載の方法。
  21. 前記抗体が抗CA125抗体である、請求項18に記載の方法。
  22. 前記検出ポリペプチドが、酵素、ビオチン結合ポリペプチド、または蛍光タンパク質である、請求項18に記載の方法。
  23. 前記酵素が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびウレアーゼからなる群より選択される、請求項22に記載の方法。
  24. 前記ビオチン結合ポリペプチドが、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジン、または抗ビオチン抗体である、請求項22に記載の方法。
  25. 活性化抗体：検出ポリペプチドの比が1:1〜約1:4である、請求項18に記載の方法。
  26. 約0.1 mL/min〜約10.0 mL/minの流速で前記溶液が前記連続流反応器に通される、請求項18に記載の方法。
  27. 約1.0 mL/min〜約5.0 mL/minの流速で前記溶液が前記連続流反応器に通される、請求項26に記載の方法。
  28. 前記流速が約30秒間〜約15分間の滞留時間を提供する、請求項26に記載の方法。
  29. 前記流速が約1分間〜約5分間の滞留時間を提供する、請求項26に記載の方法。
  30. 前記抗体-ポリペプチドコンジュゲートが1:1〜約1:3の抗体：ポリペプチド比を含む、請求項18に記載の方法。
  31. 段階 (c) の後に、停止溶液、クエンチャー、またはそれらの組み合わせを連続流反応器に添加する段階をさらに含む、請求項18に記載の方法。
  32. 前記抗体-ポリペプチドコンジュゲートを精製する段階をさらに含む、請求項18に記載の方法。
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