JP2019180354A - 細胞シートの製造方法及び細胞シート - Google Patents

Abstract

【課題】生体により近い機能を持つ肝細胞又は腸管細胞を含む細胞シートの製造方法を提供すること。【解決手段】平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体であって、上記メッシュ構造の開口部が少なくとも１個の細胞が通過できる大きさである細胞培養支持体を用いて、肝細胞又は腸管細胞を培養することを含む、細胞シートの製造方法。【選択図】なし

Description

本発明は、肝細胞又は腸管細胞を用いた細胞シートの製造方法、及び細胞シートに関する。

培養した細胞を用いて高次細胞構造を作製することで、様々な医療・創薬技術に応用することが試みられている。その代表的な例として、細胞シートの各種、医療・創薬への応用が挙げられる。細胞シートは、通常、隣り合う細胞同士の相互結合により形成される、少なくとも単層のシート状の細胞集合体である。細胞シートは再生医療・創薬などの分野で広く用いられ始めている。

一方で、良質の細胞シートを製造することは簡単ではない。従来、目的の細胞をシャーレ等の容器に播種し、増殖させる方法が用いられている。しかしながら、細胞の数が増えてコンフルエント状態（非常に接近し、密集した状態）になると、細胞の接触阻害（コンタクトインヒビション）が生じるので、継代が必要となり、手間とコストの問題が生じる。場合によっては、上記の問題により、細胞シートの品質に重大な影響がでることがある。

シャーレ等の容器を用いて培養する方法では、細胞が容器に接着するため、得られた細胞シートを容器から剥離させる必要がある。特に、細胞が容器に強く結合している場合などには、細胞シートを回収するために、機械的又は化学的な操作を加える必要がある。さらに、細胞シートを再生医療・創薬に用いる場合は、品質が重要となる。しかしながら、シャーレ等の容器表面で細胞シートを作製する従来の方法では、死細胞を選択的に駆除することはできず、生細胞と死細胞の混在した細胞シートしか作製できなかった。また、上述のとおり、コンタクトインヒビションによる細胞の劣化も生じるので、再生医療・創薬に適合させるためにはさらなる改善が必要であった。

上記のような問題に対して、平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体であって、メッシュ構造の開口部が培養する細胞より大きい細胞培養支持体を用いることが提案された（特許文献１）。そこでは実際に、マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）、ヒト胎児肺線維芽細胞（ＴＩＧ１２０）、マウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の培養繁殖を行っている。こうした細胞培養支持体を培養液中に浮かせた状態で細胞を播種すると、細胞が自発的にメッシュ状構造の開口部に伸展し、接触した細胞同士が接着・連結してメッシュ構造の開口部を埋め、単層の細胞シートが形成される。細胞が増殖しても死細胞や状態の悪い細胞は細胞培養支持体から自然に脱落するので、継代を行わずに長期間、培養を継続することができる。その結果、状態の良い生細胞のみからなる安全性の高い細胞シートが得られるとされる。さらに、培養器内での角度などを調節することで、細胞シートの強度や柔軟性を高めることができるとされる。

また、メッシュを用いてｉＰＳ細胞を培養することによりトロフォブラスト細胞が誘導されることが報告されている（非特許文献１）。

創薬においては、成熟したヒト細胞をＡＤＭＥ試験（吸収、分布、代謝、排泄試験）や毒性試験で使用することの重要性が認識されているが、そのような機能的なヒト細胞を安定的に入手・培養することは未だに難しい。

国際公開ＷＯ２０１５／００５３９４号パンフレット

Okeyo KO et al. Tissue Eng Part C Methods. 2015 Oct;21(10):1105-15. Soldatow, V.Y., et al., In vitro models for liver toxicity testing. Toxicol Res (Camb), 2013. 2(1): p. 23-39.

新規医薬品等の化学物質の毒性や体内動態を評価するために実験動物、正常ヒト肝細胞や腸管細胞、ヒト株化肝細胞や株化腸管細胞等が使用されている。動物実験に関しては、化学物質の代謝や排泄等に大きな種差が存在することが明らかになっており、実験動物からヒトの毒性、代謝や排泄に関わる情報を正確に得ることは困難であると認識されている。また、手術患者などに由来する正常ヒト肝細胞や腸管細胞に関しては、個体差が大きく、さらに、安定的に低コストで入手することができないという問題がある。ヒト株化細胞に関しては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（生体外）での増殖培養・管理が容易という長所がある一方で、生体内の正常細胞と比較して著しく機能が低下しているなどの短所がある。

これらの問題を解決する方法として、ヒト株化細胞を三次元培養することにより機能面で生体内の細胞の状態に近づける研究が活発に行われてきた。一般的な三次元培養法としてスフェロイド培養法があるが、スフェロイド（細胞塊）が大きくなるにしたがい内部の細胞群に酸素や栄養素が行き渡りにくくなったり、さらに、内部の顕微鏡観察がしにくくなったりする等の欠点が生じるため、新たな三次元培養法の開発が望まれている（非特許文献２）。

被検化合物の小腸からの吸収等を評価する目的で、多数の穴が開いたポリカーボネート膜等の上にＣａｃｏ−２細胞を培養する系が利用されている。しかしながら、この培養系ではＣａｃｏ−２細胞は穴の開いた基板の上に平たく接着・伸展するため、基本的には二次元培養系とみなすことができる。この様な培養系では、Ｃａｃｏ−２細胞におけるトランスポーターの発現量が十分でないために正確に被験化合物の動態を評価することができない場合が少なくない。加えて、Ｃａｃｏ−２細胞に対して一般的に使用されている多孔膜の空隙率は１５％前後であるため、この多孔膜上のＣａｃｏ−２細胞シートから得られる経上皮電気抵抗や化合物透過度に関する情報は生体におけるそれらとは異なる性質を持っていると考えられる。

本発明は、生体により近い機能を持つ肝細胞又は腸管細胞を含む細胞シートの製造方法を提供することを解決すべき課題とする。

本発明者らは、例えば非特許文献２に記載されるスフェロイドなどの多くの技術では細胞の成熟度が不十分であったという問題点を解決するために鋭意検討した。その結果、平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体であって、メッシュ構造の開口部は少なくとも１個の細胞が通過できる大きさである細胞培養支持体を用いて、肝細胞又は腸管細胞を培養することによって、予想外にも高い成熟度を有する肝細胞又は腸管細胞を含む細胞シートを製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明によれば、以下の発明が提供される。

＜１＞平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体であって、上記メッシュ構造の開口部が少なくとも１個の細胞が通過できる大きさである細胞培養支持体を用いて、肝細胞又は腸管細胞を培養することを含む、細胞シートの製造方法。
＜２＞上記細胞培養支持体に、上記肝細胞又は腸管細胞を接触させた状態において培養することを含む、＜１＞に記載の細胞シートの製造方法。
＜３＞上記細胞培養支持体を培地中に設置して、上記肝細胞又は腸管細胞を培養する、＜１＞又は＜２＞に記載の細胞シートの製造方法。
＜４＞上記細胞培養支持体の開口部において上記肝細胞又は腸管細胞が生育する、＜１〜３の何れか１つに記載の細胞シートの製造方法。
＜５＞上記平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体が板状であり、厚さが１μｍ以上５０μｍ以下である、＜１＞〜＜４＞の何れか１つに記載の細胞シートの製造方法。
＜６＞上記平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体が板状であり、平面視において、多角形の開口部を多数有する、＜１＞〜＜５＞の何れか１つに記載の細胞シートの製造方法。
＜７＞上記平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体において、開口部を区分するフレームの平面視における幅が１μｍ以上５０μｍ以下である、＜１＞〜＜６＞の何れか１つに記載の細胞シートの製造方法。
＜８＞上記フレームが、平面視において、横方向に向けて延びる略平行な複数の直線と、２つの横方向の直線に挟まれて、右斜め方向に向けて延びる直線と、左斜め方向に向けて延びる直線とが、上記２つの横方向の直線間を往来するように連続して折れ線構造をなし、横方向の直線と右斜め方向の直線と左斜め方向の直線とで三角形が形成され、これにより支持体内には多数の三角形の開口部が配列されている、＜７＞に記載の細胞シートの製造方法。
＜９＞上記支持体内に形成された多数の三角形の開口部が略正三角形であり、該略正三角形の開口部の一辺の長さが３０μｍ以上５００μｍ以下である、＜８＞に記載の細胞シートの製造方法。
＜１０＞上記平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体が金属製もしくは樹脂製の板状多孔体である、＜１＞〜＜９＞の何れか１つに記載の細胞シートの製造方法。
＜１１＞上記細胞培養支持体を培養槽に入れ、当該培養槽に培地を継続的に供給しかつ排出して、培養槽内に流れを形成する、＜１＞〜＜１０＞の何れか１項に記載の細胞の細胞シートの製造方法。
＜１２＞上記肝細胞又は腸管細胞を培養するための培養器として下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの構造及び機能を有する装置を用いる、＜１１＞に記載の細胞シートの製造方法。
（ａ）１枚の反応プレートと培養槽を有してなり、該プレートには上記培養槽の内部に通じる少なくとも１つの溝が切られており、上記培養槽の略中央には平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体を培養槽の底面から浮かせる形で設置することができ、上記培養槽には上記支持体が浸漬するよう培地で満たすことができ、上記プレートの溝を介し上記平面状メッシュ構造の下部から培地を供給し、上記培養槽の上部に設けられたチューブから培地を排出することで、老廃物を除去しつつ、上記細胞培養支持体の平面状メッシュ構造上で細胞を培養することができる。
（ｂ）１枚の反応プレートを有してなり、該プレートの略中央には培地が貯留する窪み又は開口部でなる培養槽が形成されており、その培養槽の略中央には平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体を設置することができ、上記反応プレートには上記培養槽から放射状に延びる溝が２つ以上切られており、該溝が流路をなし培地を供給および排出して、培養槽に新鮮な培地を送り続けることで、老廃物を除去しつつ、上記細胞培養支持体の平面状メッシュ構造上で細胞を培養することができる。
（ｃ）２枚以上の反応プレートを有してなり、該プレートの少なくとも１つの略中央には培地が貯留する窪み又は開口部でなる培養槽があり、その培養槽の略中央には平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体を設置することができ、前記各反応プレートには前記培養槽から放射状に延びる溝が各プレートで１つ以上切られており、該溝が流路をなし上下のプレートの溝から、同じ培地、異なる培地、または培地と気体の組合せで供給および排出して、細胞の上下で異なる変化を促しつつ、前記細胞培養支持体の平面状メッシュ構造上で細胞を培養することができる。
＜１３＞上記装置の中央に上記平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体を配置することができ、該中央の支持体に向け、３つ以上の放射状の流路が形成されており、培地の供給及び排出を、上記３つ以上の放射状流路を介して行う、＜１２＞に記載の細胞シートの製造方法。
＜１４＞上記平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体を用いて、線維芽細胞とともに腸管細胞を培養する、＜１＞〜＜１３＞の何れか１つに記載の細胞シートの製造方法。
＜１５＞開口部が少なくとも１個の細胞が通過できる大きさである平面上メッシュ構造を有する部材と、肝細胞又は腸管細胞とを含む、細胞シート。
＜１６＞＜１＞から＜１４＞の何れか一に記載に方法により製造される、細胞シート。
＜１７＞冷凍保存されている、＜１５＞又は＜１６＞に記載の細胞シート。

本発明によれば、平面状メッシュ構造を有する支持体を用いることによって、創薬において重要となる肝細胞や腸管細胞を含む細胞シートを提供することがきる。

図１のＡは、カプトン（登録商標）テープで固定されたマイクロメッシュの平面図とその部分拡大図である。図１のＢは、マイクロメッシュ上に細胞を播種している態様を示す斜視図である。図１のＣは、マイクロメッシュを設置したときの培養器の一実施形態を示す斜視図である。図１のＤは、マイクロメッシュを設置したときの培養器の一実施態様を示す断面図である。 図２は、２種類のメッシュサイズＡとＢにおけるＨｅｐＧ２細胞を用いたマイクロメッシュ培養の態様を示す顕微鏡画像である。 図３のＡは、マイクロメッシュ培養用ブロック式灌流デバイスを示すＡ’線の断面図である。図３のＢは、マイクロメッシュ培養用ブロック式灌流デバイスを示す平面図（一部分解図）である。図３のＣは、マイクロメッシュ培養用ブロック式灌流デバイスを示すＣ’線の断面図である。図３のＤは、マイクロメッシュ培養用ブロック式灌流デバイスを示す透視斜視図である。図３のＥは、マイクロメッシュ培養用チップ式灌流デバイスを示すＥ’線の断面図である。図３のＦは、マイクロメッシュ培養用チップ式灌流デバイスを示す平面図である。図３のＧは、マイクロメッシュ培養用チップ式灌流デバイスを示すＧ’線の断面図である。図３のＨは、マイクロメッシュ培養用チップ式灌流デバイスを示す透視斜視図である。 図４は、株化肝細胞ＨｅｐＧ２細胞における肝成熟マーカー遺伝子の相対的発現量を示すグラフである。 図５は、２種類の灌流デバイスを用いて培養した株化肝細胞ＨｅｐＧ２細胞における肝成熟マーカー遺伝子の相対的発現量を示すグラフである。 図６は、株化腸管細胞Ｃａｃｏ−２細胞における腸管成熟マーカー遺伝子の相対的発現量を示すグラフである。 図７は、ＰＤＭＳ製マイクロメッシュシートを示す顕微鏡画像である。 図８は、ＰＤＭＳマイクロメッシュ上でＣｏｃｏ−２細胞を培養している態様を示す顕微鏡画像である。 図９のＡは、マイクロメッシュ培養により形成した細胞シートの経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定するための装置のＡ’線の断面図である。図９のＢは、マイクロメッシュ培養により形成した細胞シートの経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定するための装置の平面図である。図９のＣは、マイクロメッシュ培養により形成した細胞シートの経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定するための装置のＣ’線の断面図である。 図１０は、マイクロメッシュ培養により形成した細胞シートにおける経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の測定値を示すグラフである。 図１１のＡは、マイクロメッシュ培養により形成した細胞シートの上下に、２種類の培養液を別々に灌流するためのデバイスを示すＡ’線の断面図である。図１１のＢは、マイクロメッシュ培養により形成した細胞シートの上下に、２種類の培養液を別々に灌流するためのデバイスを示す平面図である。図１１のＣは、マイクロメッシュ培養により形成した細胞シートの上下に、２種類の培養液を別々に灌流するためのデバイスを示す透視斜視図である。 図１２は、スフェロイド培養とマイクロメッシュ培養との差異を比較した顕微鏡画像である。 図１３は、マイクロメッシュの作製方法の全体像を斜視図により模式的に示す工程説明図である。 図１４は、フォトリソグラフィを利用してフォトマスクを作製する工程の一部を断面図により模式的に示す工程説明図である。 図１５は、マイクロメッシュによるＨｅｐＧ２細胞の培養結果を示す顕微鏡画像（右図：拡大）である。

本発明を実施するための形態を以下に説明する。
本発明の細胞シートの製造方法においては、平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体であって、前記メッシュ構造の開口部は少なくとも１個の細胞が通過できる大きさである細胞培養支持体を用いて、肝細胞又は腸管細胞を培養する。

平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体を用いて細胞を培養することにより形成される細胞シートはスフェロイドよりも薄いため細胞への酸素・栄養供給に優れているものと考えられ、その結果として、成熟度が高い細胞が得られることが推定される。また、細胞シートという特徴から、生体内組織の層状構造を再構築できる可能性が考えられる。さらに、マイクロメッシュ培養により作製した細胞シートは上面と下面の両方から容易に顕微鏡観察ができるという利点もある。また、細胞-基板間接着の割合が小さい細胞シートであるため、被験物質の透過度解析等にも役に立つ可能性がある。それと関連して、細胞シートの上下別々に異なる流体を灌流することも可能であり、薬物透過性の解析に適しているものと考えられる。

（細胞培養支持体）
・平面状メッシュ構造
本発明に用いることができる細胞培養支持体は、平面状メッシュ構造を有する。
平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体を使用することにより、スフェロイド培養法と比べて、細胞への凍結融解ダメージの小さい培養方法を提供することができる。

メッシュ構造の各開口部は、培養する細胞（少なくとも１個の細胞）が通過できる大きさである。細胞培養支持体は、培地（培養液）中に設置するとその形状に沿って細胞を増殖させることができる。従来のスキャフォールド（scaffold：足場）のように細胞より面積の大きな足場に細胞が定着して増殖するものと比し、メッシュの開口部に細胞が自発的に伸展する。従来は、一様な容器の底面で、或いは、ポア等の細胞よりも小さい開口部を有する足場（スキャフォールド）を培養支持体として用いていたため、細胞は足場に定着して増殖して組織を形成する。したがって、細胞同士の接着のみでシート化することは難しい。これに対し、細胞より大きな開口部を有するメッシュ構造の支持体を用いると、細胞同士が開口中心に向かって自発的に伸展して接着する。その結果、開口部を覆うように単層の細胞シートを形成しやすくなる。なお、本明細書において「細胞が伸展する」または「細胞が生育する」とは、細胞が特定の方向に向かって変形、成長、又は増殖することをいう。

・開口部
平面状メッシュ構造においては、所定の形状の開口部が規則的又は非規則的に繰り返し並んだ平面状の構造体が好ましい。平面状メッシュ構造においては、平面視において、多角形の開口部を多数有することがより好ましい。所定の形状の開口は、典型的には正三角形、正方形、正六角形などの正多角形であるが、円や楕円、その他の多角形であってもよい。なお、本明細書において正三角形、正方形、正六角形、正多角形と称する場合には、それぞれ厳密な意味での正三角形、正方形、正六角形、正多角形に限定されるわけではなく、略正三角形、略正方形、略正六角形、略正多角形を包含するものとする。

また、開口部は、すべて同じ形状でなくてもよく、複数の開口部を１セットとして、かかるセットが規則的又は非規則的に繰り返し並んだ平面状の構造体であってもよい。

平面状メッシュ構造の開口部以外の部分をフレーム又はフレーム部と呼ぶ。なお、平面状メッシュ構造は開口部がマイクロメートルサイズのときにはマイクロメッシュなどと称することもある。

平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体の開口部は、培養する細胞少なくとも１個が通過できる大きさである。開口部が培養する細胞少なくとも１個が通過できる大きさであるとは、開口部と細胞のそれぞれの大きさが、細胞が変形して又はしないで、開口部を通過できる関係であることを意味する。開口部は、細胞が開口部に接触しないで通過できる大きさであってもよいし、開口部に接触して変形しながら通過できる大きさであってもよい。

開口部が培養する細胞少なくとも１個が通過できる大きさである例として、メッシュ構造の開口部の面積が、播種時の細胞１個の最大面積より大きい場合が挙げられる。細胞１個の最大面積とは、断面積が最大になるように細胞を切断した場合の面積をいう。播種時の細胞の最大面積とは、細胞が播種された時の状態、すなわち細胞が支持体に接着して伸展する前の状態での最大面積を意味する。

また、平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体は、開口部の最小径が、培養する細胞の播種時の最大径よりも大きいものであってもよい。開口部の最小径は、当業者が適宜測定することができるが、例えば、正多角形の場合、中心を通って辺上の二点を結ぶ直線のうち最短の直線の長さをいう。細胞の最大径は、細胞の周辺の二点を結ぶ直線のうち最長の直線の長さをいう。
開口部の形状が２種以上ある場合、いずれかの開口部においてのみ、開口部の最小径が培養する細胞の播種時の最大径より大きくてもよいし、すべての開口部において、開口部の最小径が培養する細胞の播種時の最大径より大きくてもよい。

開口部の最小径が、細胞の最大径より大きい場合、細胞培養支持体を水平に置いてその上方から細胞を播種すると、フレーム部に定着する細胞もあり、フレームに接触せずに下に落ちる細胞もある。フレーム部に定着した細胞だけでは、当初は開口部が埋まらないが、細胞が開口中心に向かって自発的に伸展していく結果、細胞シートが形成される。

細胞培養支持体は、開口部の最小径が、培養する細胞の最大径の２倍、３倍、４倍、５倍、７倍、１０倍等であってもよい。かかる場合も、フレーム部に播種された細胞が自発的に開口部に伸展し、細胞同士が連結して開口部を埋め、細胞シートが形成される。

開口部が正多角形の場合、一辺の長さは特に限定されないが、例えば、３０〜５００μｍ程度、好ましくは３０〜２５０μｍ程度とすることができる。一辺の長さを調節することにより、細胞シートが形成されるまでの時間や、細胞シートの強度、柔軟性を制御することができる。一辺の長さは、５０μｍ以上、６０μｍ以上、８０μｍ以上、１００μｍ以上としてもよい。また、上限としては、５００μｍ未満、２５０μｍ未満、２００μｍ未満、１８０μｍ未満、１５０μｍ未満等としてもよい。

上述のとおりメッシュ構造の開口部は、三角形、四角形、六角形等とすることもでき、この形状によっても、細胞シートが形成されるまでの時間、細胞シートの強度や柔軟性などの物性を制御することが可能である。好ましい具体例としては、メッシュ構造に形成された多数の三角形の開口部が略正三角形であり、該略正三角形の開口部の一辺の長さが３０μｍ以上２５０μｍ以下であることが挙げられる。

・フレーム
平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体のメッシュ構造のフレーム部の幅は、特に限定されないが、例えば、細胞の最大径の半分以下としてもよい。上述のとおり、従来のスキャフォールドでは、細胞が定着するよう細胞の最大径と同等か、より大きな幅の構造体が用いられていたが、平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体では、細胞の大きさよりも細いフレーム部を有するメッシュ構造を用いてもよい。

本明細書において、「フレーム部の幅」は、フレームの長さ方向に垂直な方向の幅を意味する。フレーム部の幅は、細胞の最大径の３分の１以下、４分の１以下、５分の１以下、或いはそれ以下であってもよい。

また、フレーム部の幅は、例えば１μｍ〜５０μｍとすることができ、２μｍ〜１５μｍ、３μｍ〜１０μｍ、４μｍ〜５μｍ等としてもよいがこれらに限定されず、細胞培養支持体の材料や、培養する細胞の大きさに合わせて、当業者が適宜決定することができる。フレーム部の幅を調節することによっても、細胞シートの強度や柔軟性を制御することができる。また、最初に細胞を播種する際、細胞はフレーム部に接着するので、フレーム部の幅を調節することにより、接着する細胞数も制御できる。

このように、比較的細いフレーム部と、比較的大きな開口部分を有するメッシュ構造を用いることにより、細胞が開口部に自発的に伸展し、隣り合った細胞が互いに接着して単層の細胞シートが形成される。

本明細書において「単層の細胞シート」とは、細胞が少なくとも略二次元に並び、隣り合った細胞同士が略隙間なく接着した構造体をいう。細胞シートが単層であるか否かは、例えば細胞核を染色し、細胞核がほぼ平面的に並んでいることによって確認することができる。全体として単層と認められる形状であればよく、一部の細胞が層状に重なっていてもよい。

細胞培養支持体は板状であることが好ましく、その厚みは、細胞培養支持体に接着した状態の細胞の最大径より小さくてもよい。例えば、１μｍ〜５０μｍとすることができ、２μｍ〜１５μｍ、３μｍ〜１０μｍ、４μｍ〜５μｍ等としてもよいがこれらに限定されない。支持体の厚みは、得られる細胞シートの用途に応じて決定してもよい。

平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体の一実施形態においては、そのフレームが、平面視において、横方向に向けて延びる略平行な複数の直線と、２つの横方向の直線に挟まれて、下の横線から上の横線に向けて右斜め上方に延びる直線（右斜め方向に向けて延びる直線）と、この右斜め上昇線に連続して上の横線から下の横線に向けて右斜め下方に延びる直線（左斜め方向に向けて延びる直線）とが、前記２つの横方向の直線間を往来するようにジグザグに連続して折れ線構造をなし、横方向の直線と右斜め方向の直線と左斜め方向の直線とで三角形が形成され、これにより支持体内には多数の三角形の開口部が配列されている。一例としては、前記２つの横線に挟まれたジグザグに連続した折れ線の頂点（三角形の頂点）が、横線に垂直な仮想線を引いたとき、その仮想線上で一致している、あるいは１つおきに一致していてもよい。

本実施形態の平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体の典型例となる平面視の構造としては、例えば、図１Ａのマイクロメッシュ、図２Ａのマイクロメッシュなどが挙げられる。

ただし、本発明の平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体はこれに限定されることはない。例えば、メッシュ構造は、形状的異方性を有するものであってもよい。メッシュ構造を非対称な形状にすると異方性が生じ、細胞の配向性を制御することができるので、所望の秩序構造を有する細胞シートを得ることができる。逆に、メッシュ構造の形状によっては、細胞が等方性に伸展し、配向性を有しない細胞シートが得られる。

・細胞培養支持体の材料と製造方法
図１３は金属製のマイクロメッシュシートを得る工程を模式的に示した斜視図（鳥観図）である。電鋳メッシュ製作プロセスの概略を示す。このプロセスは、１．基板上にフォトレジストを塗布、２．フォトマスクを用いて紫外線露光、３．フォトレジストの現像、４．電鋳、５．フォトレジスト剥離、６．電鋳シートを基板から剥離、７．完成という形で進行する。フォトマスクは、所望の形態に精密加工メーカーが適宜作製する。図１４のプロセスは、より一般的なフォトマスク作製の方法であり、１．ガラス基板上にクロムを成膜、２．フォトレジスト塗布、３．電子線描画又はレーザー描画、４．現像、５．クロムエッチング、６．フォトレジスト除去、７．完成という形で進行する。基板には例えば２．５インチ（６．３５ ｃｍ）、Ｃｒブランクスマスク、ポジレジスト（感光材）付きを使用することができる。

平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体の材料としては、例えば、光硬化性樹脂、生体適合性材料、生体分解性材料などを用いることができる。
光硬化性樹脂を用いれば、フォトリソグラフィ法によって細胞培養支持体を作製することができる。

光硬化性樹脂としては、例えば、アクリレート化合物、メタクリレート化合物、エポキシ化合物、イソシアネート化合物、チオール化合物、シリコーン系化合物などが挙げられる。これらの２種以上を組み合わせて用いてもよい。光硬化性樹脂の具体例としては、ウレタンアクリレート、ポリエステルアクリレート、エポキシアクリレート、ポリ（メタ）アクリル酸メチル、エトキシ化ビスフェノールＡアクリレート、脂肪族ウレタンアクリレート、ポリエステルアクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリカーボネート、アクリル変性脂環式エポキシド、２官能アルコールエーテル型エポキシド、アクリルシリコーン、アクリルジメチルシロキサン等が挙げられるがこれらに限定されない。

露光した部分が除去されるポジ型のレジストを用いてマイクロメッシュシートを作製することができる。例えば、ＤＮＱ（ジアゾナフトキノン）ノボラック系樹脂ポジ型レジスト、ｔ−ブトキシカルボニル、テトラヒドロピラン、フエノキシエチル、トリメチルシリル、t−ブトキシカルボニルメチル等の脱保護反応型、ポリフタルアルデヒド、ポリカーボネート、ポリシリエルーテル等の解重合反応型のものが挙げられる。現像液にはテトラメチルアンモニウムヒドロキシド（ＴＭＡＨ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＭＥＫ（メルエチルケトン）、ＧＢＬ（γ−ブチロラクトン）、ＥＬ（乳酸エチル）などが用いられる。

生体適合性材料や生体分解性材料を用いて得られる細胞シートは、そのまま支持体ともに生体に移植するなど再生医療・創薬に好適に用いられる。

生体適合性材料としては、シリコーン、ポリエーテルブロックアミド（ＰＥＢＡＸ）、ポリウレタン、シリコーン−ポリウレタン共重合体、セラミックス、コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、ナイロン、ポリエチレンテレフタレート、ゴアテックス（商標）などの超高分子量ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、その他生体由来材料などが挙げられるがこれらに限定されない。平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体は、生体適合性材料以外の材料で形成し、表面を生体適合性材料で処理したものであってもよい。

生体分解性材料としては、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、及びそれらの共重合体、ＰＨＢ−ＰＨＶ系ポリ（アルカン酸）類、ポリエステル類、デンプン、セルロース、キトサンなどの天然高分子やその誘導体などが挙げられるがこれらに限定されない。

平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体の材料としては、上記の中でも、蛍光顕微鏡観察のために自家蛍光が低いポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が好ましい。
また、平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体を、ＰＤＭＳの様に弾性変形可能な材料で作製することも好ましい。平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体は、例えば周囲を補強して持ち運びしやすくするなど、各種の工夫を加えることができ、かかる工夫を加えた支持体も本発明に包含される。

図１４ではガラス基板１０１を利用して所望のフォトマスクを作製する例を示している。ガラス基板１０１の上にクロム等の金属の蒸着層１０２を付し、その上にポジ型のフォトレジストを塗布している。レーザー直接照射装置により、所望のパターの光１０５をポジ型レジストに照射する。照射を受けた部分１０３ａのみ軟化している。そこに、テトラメチルアンモニウムヒドロキシド（ＴＭＡＨ）などの現像液を塗布することで現像し、パターンＨ１を得ることができる。さらに、残されたレジスト１０３ｂをマスクにして、例えばウエットエッチングやドライエッチングなどにより金属層をさらにエッチングしてパターンＨ２を作製することができる。つぎに、残されたレジスト１０３ｂも所定の薬液で除去すると、ガラス基板上に付されたパターンＨ２を有する金属層１０２ｂが得られる。これをフォトマスクとして利用することができる。例えば、パターンＨ２を正三角形が連続したマイクロメッシュに対応する構造とすることで、このフォトマスクを使用して上記で図示したような正三角形の連続したマイクロメッシュ構造の金属膜を得ることができる。

（細胞シートの製造方法、及び細胞の培養装置）
本発明の細胞シートの製造方法においては、細胞培養支持体に、肝細胞又は腸管細胞を接触させた状態において培養することが好ましい。
本発明の細胞シートの製造方法においては、細胞培養支持体を培地中に設置して、肝細胞又は腸管細胞を培養することが好ましい。
本発明の細胞シートの製造方法においては、細胞培養支持体の開口部において肝細胞又は腸管細胞が生育することが好ましい。

培養方法の一実施形態としては、細胞培養支持体に細胞を播種する工程と、細胞を培養する工程とを含む方法が挙げられる。このとき、本実施形態においては、平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体を用い、細胞を播種する工程に先立って、細胞培養装置（培養器）に細胞培養支持体を設置することが好ましい。細胞培養装置及び細胞培養支持体は、適宜滅菌しておくことが好ましい。培養液は細胞の種類に合わせて、当業者が適宜選択、調製することができる。培養液その他の材料もオートクレーブ又はろ過により滅菌するとよい。

細胞培養支持体は、予め細胞接着促進材料でコーティングしてもよい。細胞接着促進材料は、細胞を培養支持体に定着させて伸展や増殖をしやすくするために用いられ、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなどの細胞外マトリックスタンパク質、ポリＬリジンなどの陽性電荷物質などが挙げられる。

必要な前処理を行った細胞培養支持体は、細胞培養装置に適宜設置する。細胞の播種は、公知の方法又はそれに準ずる方法で適宜行うことができる。例えば、培養液で細胞を懸濁し、ピペットマン等で細胞培養支持体に滴下すればよい。細胞数は、培養する細胞の種類や製造する細胞シートのサイズに応じて、適宜決定することができる。細胞を培養する工程では、培養液に流れを生じさせてもよい。細胞培養支持体の主面の近傍で、当該主面と平行な方向に流れを生じさせることにより、余分な細胞が積み重なってコロニーを形成するのを防ぐことができ、単層の細胞シートをより短時間で得ることができる。

培養液の流れは、細胞を培養する工程の間、継続して生じさせてもよく、断続的に生じさせてもよい。例えば、細胞培養支持体を培養槽に入れ、培養槽に培地を継続的に供給しかつ排出して、培養槽内に流れを形成することができる。また、細胞を播種してからしばらくは流れを起こさずに静置し、その後断続的に流れを起こしてもよい。培養液中に浮かせた状態で細胞培養支持体を設置することにより、すべての細胞が必要な栄養を培養液から取り込み、老廃物を排出することができるので、細胞を良い状態で維持できる。

また、本発明に係る細胞シートの製造方法では、細胞の種類によっては、細胞を継代、すなわち別の容器に移す必要がなく、必要に応じて細胞培養装置中に細胞培養支持体を設置したまま培養液を交換又は循環等すればよい。平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体によれば、細胞シートが形成された後も細胞は分裂を繰り返し、死細胞や劣化した細胞は自然に細胞培養支持体から脱落するので、細胞培養装置中で、細胞シートを長期間培養及び維持することができる。

上記のような細胞の培養を実現する具体的な装置としては、図３及び図１１の装置が挙げられる。図３Ｄの装置では、１枚の反応プレートと培養槽を有してなり、該プレートには前記培養槽の内部に通じる少なくとも１つの溝が切られている。反応プレートとしては、ガラス、樹脂、又は金属の板が挙げられる。培養槽としては、ガラス、樹脂、又は金属の円筒容器が挙げられる、底部が開口されつつ、反応プレートと当接することで、水が漏れない機密構造をとることが好ましい。前記培養槽の略中央には平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体が培養槽の底面から浮かせる形で設置される。略中央とは中央から半径で５０％程度ずれていてもよい意味である。培養槽は前記支持体が浸漬するほどに培地（培養液）で満たされている。前記プレートの溝は平面状メッシュ構造にまで延びており、これを介し前記平面状メッシュ構造の下部から培養液を供給する。前記平面状メッシュ構造の上部で培養槽の頭部（上部）には、チューブが設けられており、そこから培養液を排出する。このように供給排出して細胞培養支持体の開口部（主面）に対して垂直方向の流れを形成することで、老廃物を培養系から除去しつつ、上記細胞培養支持体の平面状メッシュ構造上で細胞を培養することができる。

図３Ｈの装置においては、１枚の反応プレートを有してなり、該プレートの略中央には培地（培養液）が貯留する窪み又は開口部でなる培養槽が形成されている。略中央とは前記と同義であり、以下も同様である。その培養槽の略中央には平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体が設置されている。前記反応プレートには前記培養槽から放射状に延びる溝が２つ以上切られており、該溝が流路をなし培養液を供給および排出して、培養槽に新鮮な培養液を送り続けることができる。本実施形態においては、培養槽内の流れが、細胞培養支持体の開口部（主面）に沿って平行に形成されている。反応プレートの材料としては、ガラス、樹脂、又は金属の板が挙げられる。このように培養液の流を作ることで、老廃物を除去しつつ、細胞を前記平面状メッシュ構造上で培養することができる。

図１１の装置においては２枚以上の反応プレートを有してなり、該プレートの少なくとも１つの略中央には培地が貯留する窪み又は開口部でなる培養槽があり、その培養槽の略中央には平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体を設置することができ、前記各反応プレートには前記培養槽から放射状に延びる溝が各プレートで１つ以上切られており、該溝が流路をなし上下のプレートの溝から、同じ培地、異なる培地、または培地と気体の組合せで供給および排出して、細胞の上下で異なる変化を促しつつ、前記細胞培養支持体の平面状メッシュ構造上で培養することができる。

本発明の一例においては、上記した装置の中央に、平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体を配置することができ、該中央の支持体に向け、３つ以上の放射状の流路が形成されており、培地の供給及び排出を、前記３つ以上の放射状流路を介して行うことができる。

（培地（培養液））
培地の成分は通常この種の細胞の培養に用いられるものを適宜用いることができる。培地は、固体培地でも液体培地でもよいが、液体培地（培養液）であることが好ましい。培地の成分としては、例えば、塩類、炭素源、窒素源を含む溶液が挙げられる。細胞に適した浸透圧とｐＨを維持するための緩衝剤を用いてもよい。炭素源ないし窒素源としては、グルコース、ビタミン、アミノ酸、ホルモンなどが挙げられる。これらの成分を血清、組織抽出液などの天然物質で構成した天然培地でも、アミノ酸、塩類などの化学物質と天然物質とで構成した半合成培地でも、既知の化学物質で構成した合成培地でもよい。なかでも、血清等を用いた天然培地または半合成培地が好ましい。血清としては、異種血清および同種血清を用いることができる。異種血清は、細胞培養物を細胞医療等に用いる場合、そのレシピエントとは異なる種の生物に由来する血清を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ウシやウマに由来する血清、例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＦＣＳ）、仔ウシ血清（ＣＳ）、ウマ血清（ＨＳ）などが異種血清に該当する。また、「同種血清」は、レシピエントと同一の種の生物に由来する血清を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ヒト血清が同種血清に該当する。同種血清は、自己血清（自家血清ともいう）、すなわち、レシピエントに由来する血清、およびレシピエント以外の同種個体に由来する同種他家血清を含む。

緩衝剤としては、リン酸塩、炭酸水素ナトリウム、二酸化炭素ガスなどが挙げられる。
培地には、代謝阻害剤や抗生物質を含ませてもよい。抗生物質としては、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン等が挙げられる。

具体的には、血清として１０％ 牛胎児血清、抗生物質としてペニシリン、ストレプトマイシンを用いたＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）（ＧＩＢＣＯ）、ＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ （ＳＩＧＭＡ）、２０％ 牛胎児血清（ＦＢＳ）、０．１ ｍＭ ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）（ＧＩＢＣＯ）、１００ ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、１００ μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）を含有したＭＥＭ（イーグル最小必須培地）（ＳＩＧＭＡ）等が挙げられる。

培養条件は、この種の細胞の培養における一般的な条件を適用すればよいが、培養温度は、２５℃以上５０℃以下であることが好ましく、３０℃以上４５℃以下であることがより好ましく、３５℃以上４０℃以下であることがさらに好ましい。インキュベータ内には、例えば、５％二酸化炭素（ＣＯ_２）を供給することが好ましい。

（肝細胞、腸管細胞）
本発明においては、培養する細胞として、肝細胞又は腸管細胞を採用した。肝細胞としては、例えば、生体から採取した初代細胞、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞から誘導した肝細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＨｅｐａＲＧ細胞等の肝癌細胞（ヒト肝癌由来細胞）などが使用可能であるが、中でも、トランスポーター、代謝活性、アルブミン産生などの肝細胞機能を比較的保持し、ロット差が小さい株化肝細胞であるという観点から、ＨｅｐＧ２細胞、ＨｅｐａＲＧ細胞が好ましい。上記肝細胞は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。

腸管細胞としては、小腸および大腸などの腸管上皮細胞に分化できる細胞、又は腸管上皮細胞に分化した細胞を用いることができる。生体から採取した初代細胞、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞から誘導した腸管細胞でもよい。また、腸管細胞は、そのがん細胞であってもよく、例えば、Ｃａｃｏ−２細胞（ヒト結腸癌由来）が挙げられる。上記腸管細胞は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。

（細胞シート、細胞構造体）
本発明はさらに、開口部が少なくとも１個の細胞が通過できる大きさである平面上メッシュ構造を有する部材と、肝細胞又は腸管細胞とを含む、細胞シートに関する。
本発明の細胞シートは、上記した本発明により細胞シートの製造方法により製造することができる。
本発明の製造方法により得られる細胞シートは、細胞培養支持体を内包していてもよい。かかる細胞シートは、容器から剥離する工程を経ずに作製されるため、剥離によるダメージを受けない。また細胞によっては、死細胞や劣化した細胞は製造過程で自動的に脱落するので、状態のよい細胞のみで形成されており、品質及び安全性が高い。また、保存性にも優れ、輸送もしやすい。細胞培養支持体を生体適合性材料や生体分解性材料で形成すれば、そのまま移植に用いることもできる。
また本発明により提供される細胞シートは、冷凍保存が可能である。
例えば、本発明の細胞シートの製造方法により製造した細胞シートは製品として、製薬企業などの創薬を行うユーザーへ販売されることが想定される。ユーザーへの販売の際には細胞シートは輸送されることになるが、そのような場合に、冷凍保存された細胞シートを輸送することができる

また、細胞シートの少なくとも１面に異種の細胞を播種して増幅させ、異種細胞の結合面を有する高次細胞構造体を製造することもできる。かかる構造体は、各種基礎研究及び再生医療に有用であり、医薬品候補のスクリーニング等に用いることもできる。

また、本発明に係る細胞シートは、強度や柔軟性を自由に制御できるので、適当な強度及び柔軟性を有する細胞シートを作製し、これを変形させたり、積層させたりすることにより、所望の形状及び機能を有する細胞構造体を作製することもできる。一例として、細胞シートを丸めて血管様構造を作製することが挙げられる。

また、細胞シートを積層したり、細胞シート状で別の種類の細胞を培養したりすることもでき、かかるシートで細胞構造体を作製し、体内の組織や器官を模したモデルや病態モデルとすることも可能である。

また、上述のとおり、メッシュ構造に形状的異方性を持たせることにより、所望の配向性や秩序構造を有する細胞シートを作製することができる。かかる細胞シートは、例えば細胞配向性を有する心筋組織の再生等に応用することが可能である。

本発明の好ましい実施形態においては、線維芽細胞とともに腸管細胞を培養（共培養）することができる。なかでも、Ｔｉｇ−１−２０細胞（線維芽細胞）／Ｃａｃｏ−２細胞の共培養形態が特に好ましい。このような共培養をすることで、細胞の伸展を大幅に向上させることができ、培養条件や培養期間によっては、例えば、経上皮電気抵抗測定値の結果で、３〜５倍の向上を促すことができる。また、上記した共培養により細胞間接着の強い細胞シートを製造することができるが、このような細胞間接着の強い細胞シートは薬物の透過試験において有用である。即ち、本発明の細胞シートを用いて、薬物の腸管での吸収を評価することができる。

（凍結・融解ダメージの低減）
本発明の好ましい実施形態によれば、細胞への凍結・融解のダメージを小さくすることができる。細胞の凍結温度は特に限定されないが、例えば、−５０℃〜−１００℃で凍結することが挙げられる。融解は、２５℃〜４５℃で行うことが挙げられる。凍結保存期間も特に限定されないが、数日間から数年間までの広い期間での保存が考えられる。本発明の好ましい実施形態によれば、このような凍結保存においても、融解後に良好な細胞の状態が維持されており、再生医療・創薬の現場への細胞輸送や研究用途等への好適な応用が可能となる。

（マーカー遺伝子の発現レベルの向上）
本発明の好ましい実施形態によれば、肝細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）における成熟肝マーカー遺伝子の発現が有意に上昇する。ヒト肝臓の成熟マーカーとしては、アルブミン、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の遺伝子が挙げられる。なお、遺伝子の発現レベルの比較は、β−アクチンの発現レベルを用いて標準化することができる。マーカー遺伝子の発現レベルの上昇率は培養条件や培養期間によって異なるが、ウェル上で培養した時又はスフェロイドとして培養したときを１００％として、１０５％以上、１１０％以上、１２０％以上、又は１５０％以上であることが好ましい。

また、本発明の好ましい実施形態によれば、腸管細胞（例えば、Ｃａｃｏ−２）における成熟ヒト腸管マーカー遺伝子の発現が有意に上昇する。具体的には、トランスポーター遺伝子やタイトジャンクション関連遺伝子、薬物代謝酵素遺伝子の発現が有意に上昇する。なお、遺伝子の発現レベルの比較は、β−アクチンの発現レベルを用いて標準化することができる。マーカー遺伝子の発現レベルの上昇率は培養条件や培養期間によって異なるが、マイクロメッシュ単体（非灌流式）で、ウェルのときを１００％として１０５〜２００％以上であることが好ましい。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが本発明はこれにより限定して解釈されるものではない。

＜平面状メッシュ構造の作製例＞
金属製のマイクロメッシュの作製プロセスとして、まず基板上にフォトレジストを塗布する。フォトマスクを用いて基板上のフォトレジストに紫外線を露光した。フォトレジストを現像することにより、紫外線が露光されていない部分を除去した。フォトレジストの除去により生じた溝に、電気鋳造（電鋳）により金属を付着させた。フォトレジストを剥離した後、電鋳シート（金属製マイクロメッシュ）を基板から剥離した。金属としてニッケルを使用した。

＜マイクロメッシュ培養の方法＞
図１にマイクロメッシュ培養の方法を示す。カプトン（登録商標）テープを用いてマイクロメッシュシート２を直径４ｍｍ円の穴の開いたシリコン板１の上に固定した。ラボコータ ＰＤＳ−２０１０（日本パリレン）を用いて、金属製マイクロメッシュ２／シリコン板１に生体適合性に優れたパリレン（ＤＰＸＣ，ＣＡＳ Ｎｏ． ２８８０４−４６−８）（日本パリレン）を蒸着被覆した。マイクロメッシュに対する細胞の接着度を上げる目的で、プラズマクリーナー（ＨＡＲＲＩＣＫ ＰＬＡＳＭＡ）を用いて、パリレンコートされたマイクロメッシュ２／シリコン板１を親水化処理した。マイクロメッシュ２／シリコン板１を紫外線照射により殺菌処理した後、２ｘ１０^６細胞／ｍＬの細胞懸濁液 ５０μＬ（合計１ｘ１０^５個）を直径４ｍｍのマイクロメッシュ円（約０．１２６ｃｍ^２）の上にピペット３を用いて播種し、培養を開始した。マイクロメッシュ２／シリコン板１を下板５のついたステージ４に載置した。培養は、これを培養液６中に浸漬して行った。なお、ステージ４は平面状メッシュ構造の開口部を塞がない形態となっている（図１Ｄ）。
図２に、目の大きさと形が異なる２種類のマイクロメッシュシートＡとＢを用いたマイクロメッシュ培養の顕微鏡写真を示す。細胞はＨｅｐＧ２細胞（後術）を用いた。実施例に示すマイクロメッシュ培養の全ての結果は、マイクロメッシュシートＡのメッシュサイズのメッシュシートを用いて得た結果である。

＜２種類の灌流デバイスの作製方法＞
灌流装置はＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）（商品名： ＳＩＬＰＯＴ １８４， 東レ・ダウコーニング）を用いて作製した。主剤と硬化剤を１０：１で混合させたＰＤＭＳ溶液を型に流し込み、その後加熱処理することにより各パーツを作製した。型は３ＤプリンタＡＧＩＬＩＳＴＡ−３２００（キーエンス）によって造形し、その後パリレンで被覆することにより作製した。シリコンチューブから培地を送液するための装置としてシリンジポンプ（ｋｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。各灌流デバイスの特徴として、ブロック型灌流培養デバイス（図３のＡ−Ｄ）は、装置にある蓋の取り外しが容易であるため、マイクロメッシュ２／シリコン板１（ステージ４）の出し入れが容易である。しかしながら、下面からの細胞観察は可能であるが上面からの細胞観察が難しく、さらに、デバイス作製に要するＰＤＭＳパーツの数が多い。一方でチップ型灌流デバイス（図３のＥ−Ｈ）は、ＰＤＭＳパーツが１つであるため作製に時間がかからない。さらに、下からの細胞観察だけでなく、例えば実体顕微鏡などを用いた上面からの細胞観察も容易に行うことができる。短所として、マイクロメッシュ２／シリコン板１（ガラス板４）を出し入れする際、ＰＤＭＳデバイスを基板から剥がす必要がある部分が考えられた。なお、図中、７がチューブ、８が台座、９が床板である。

＜実施例１＞（図４）
ヒト肝癌由来細胞株（ＨｅｐＧ２細胞）のマイクロメッシュ培養
・材料と方法
細胞入手と維持管理
ＨｅｐＧ２細胞（製品番号ＲＣＢ１８８６）は理化学研究所バイオリソースセンター（ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ）から入手した。細胞培養のために、１０％ 牛胎児血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ）と１００ ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンと１００ μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）を含有したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）（ＧＩＢＣＯ）を使用した。細胞は３７℃、５％二酸化炭素（ＣＯ_２）条件下のインキュベータ内で培養した。

マイクロメッシュ培養
ＨｅｐＧ２細胞１ｘ１０^５個を直径４ｍｍ円のマイクロメッシュシート上に播種し５日間培養した。培地交換は２日毎に２ｍＬ／ウェル／回で行った。マイクロメッシュ上に播種した細胞は、１２穴プレートのウェルの中で静置培養（２ｍＬ培地／ウェル）もしくはブロック型灌流デバイス（図３Ａ−Ｄ）を用いて灌流培養を行った。流速１ｍＬ／日で培地の灌流を行った。独立した実験として、合計１０日間培養した実験も同様に行った。比較対象として、１２穴プレート（ＩＷＡＫＩ）のウェル、もしくは１２穴プレートのウェル内に設置した２５６穴アガロースゲルプレート上に細胞を播種し培養した。２５６穴アガロースゲルプレートはＭｉｃｒｏＴｉｓｓｕｅｓ ３Ｄ Ｐｅｔｒｉ Ｄｉｓｈ ｍｉｃｒｏ−ｍｏｌｄ ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ （ｓｉｚｅ Ｓ， １６ ｘ １６ ａｒｒａｙ， ｆｉｔｓ １２ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅｓ） （製品番号Ｚ７６４０００−６ＥＡ， ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）を用いて作製した。これらの培養系（灌流培養系を除く）は、上記マイクロメッシュ培養の培養系と同様に２日毎に培地交換を行った。

遺伝子発現解析
ＨｅｐＧ２細胞からのＲＮＡの抽出はＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行い、抽出したＲＮＡとＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｋｉｔ（東洋紡）を用いてｃＤＮＡを合成した。上記の方法により、５日間培養した細胞もしくは１０日間培養した細胞からそれぞれｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡサンプル、ＤＮＡプライマー、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）を用いて遺伝子発現解析を行った。ヒト肝臓の成熟マーカーとして知られている、アルブミン、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の遺伝子発現レベルを解析した。各遺伝子の発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子として知られているβ−アクチンの発現レベルを用いて標準化した。値は平均±ＳＥ（Ｎ＝３）。

・結果
図４に遺伝子発現解析の結果を示す。ＨｅｐＧ２細胞を通常のウェル（Ｗ）上で培養した時と比較して、スフェロイド（Ｓ）培養やマイクロメッシュ（Ｍ）培養（静置）をした時の方が、アルブミンとＣＹＰ１Ａ２の遺伝子発現量が高かった。さらに、マイクロメッシュ培養を培地灌流（Ｄ）下で行うことにより、これらの遺伝子の発現がさらに上昇した。１０日間の培地灌流下でマイクロメッシュ培養を行った条件が、本実験における上記の遺伝子発現を最も促進させる条件だった。

＜実施例２＞（図５）
２種類の灌流デバイスを用いたＨｅｐＧ２細胞の灌流培養と、その遺伝子発現への影響
・材料と方法
実施例１と同様の方法と条件で、ＨｅｐＧ２細胞をブロック型灌流デバイスもしくはチップ型灌流デバイスで培養した。ただし、培養期間は実施例１と異なり、本実験では７日間であった。ＲＮＡ抽出から遺伝子発現解析までの方法は実施例１を参照。値は平均±ＳＥ（Ｎ＝３）。
・結果
図５に遺伝子発現解析の結果を示す。ブロック型灌流デバイス（Ｂ）もしくはチップ型灌流デバイス（Ｃ）を用いた培養系の間で、ＨｅｐＧ２細胞におけるアルブミン遺伝子とＣＹＰ１Ａ２遺伝子の発現量に有意な差は認められなかった。

＜実施例３＞（図６）
ヒト腸管由来細胞株（Ｃａｃｏ−２細胞）のマイクロメッシュ培養
・材料と方法
細胞入手と維持管理
Ｃａｃｏ−２細胞（製品番号ＲＣＢ０９８８）は理化学研究所バイオリソースセンター（ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ）から入手した。細胞培養のために、２０％ 牛胎児血清（ＦＢＳ）、０．１ ｍＭ ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）（ＧＩＢＣＯ）、１００ ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、１００ μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）を含有したＭＥＭ（イーグル最小必須培地）（ＳＩＧＭＡ）を使用した。細胞は３７℃、５％二酸化炭素（ＣＯ_２）条件下のインキュベータ内で培養した。

マイクロメッシュ培養
Ｃａｃｏ−２細胞 １ｘ１０^５個を直径４ｍｍ円のマイクロメッシュの上に播種し７日間培養した。マイクロメッシュ上に播種した細胞を、１２穴プレート（ＩＷＡＫＩ）のウェルの中で静置培養（２ｍＬ培地／ウェル）した。比較対象として、１２穴プレートのウェルに細胞を播種した。２日毎に培地交換を行った。

遺伝子発現解析
Ｃａｃｏ−２細胞からのＲＮＡの抽出はＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行い、抽出したＲＮＡとＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｋｉｔ（東洋紡）を用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡサンプル、ＤＮＡプライマー、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）を用いて遺伝子発現解析を行った。成熟ヒト腸管組織で発現の高い遺伝子の発現レベルを解析した。各遺伝子の発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子として知られているβ−アクチンの発現レベルを用いて標準化した。値は平均±ＳＥ（Ｎ＝３）。

・結果
図６にＣａｃｏ−２細胞における遺伝子発現解析の結果を示す。Ｃａｃｏ−２細胞を通常ウェル上で培養した時と比較して、マイクロメッシュ培養をした時の方が、密着結合関連遺伝子（ＺＯ−１遺伝子、Ｏｃｃｌｕｄｉｎ遺伝子、Ｃｌａｕｄｉｎ−１遺伝子、Ｃｌａｕｄｉｎ−４遺伝子、Ｃｌａｕｄｉｎ−７遺伝子、Ｔｒｉｃｅｌｌｕｌｉｎ遺伝子）、トランスポーター遺伝子（ＢＣＲＰ遺伝子、ＯＡＴＰ１Ａ２遺伝子、ＰＥＰＴ１遺伝子）、薬物代謝酵素遺伝子（ＣＹＰ１Ａ２遺伝子）の発現量が上昇した。

＜実施例４＞（図７、８）
ＰＤＭＳマイクロメッシュの作製
・材料と方法
マイクロメッシュ培養を行った細胞を蛍光顕微鏡下で観察するために、ＰＤＭＳを用いて自家蛍光の極めて小さいマイクロメッシュを作製した。作製手順として、まず主剤と硬化剤を１０：１の比で混合させたＰＤＭＳ溶液（東レ・ダウコーニング）を調整した。ＰＤＭＳ溶液と溶剤（例えばヘキサン［和光純薬］）を１：１２の比で混合させることによりＰＤＭＳ溶液の粘性を減少させた。調整したＰＤＭＳ／ヘキサン溶液をスピンコーターＭＳ−Ｂ１００（ミカサ）を用いて６０００ ｒｐｍ、１０秒で金属マイクロメッシュに塗布し、加熱処理をしてＰＤＭＳを硬化させた（ＰＤＭＳコート１回）。マイクロメッシュの強度を上げるために、再びＰＤＭＳ／ヘキサン溶液の塗布（８０００ ｒｐｍ、５秒）と加熱処理を行った（ＰＤＭＳコート２回）。０．１ Ｎ ＨＣｌ溶液でマイクロメッシュの金属部分をエッチングした。洗浄後に乾燥させてＰＤＭＳマイクロメッシュを完成させた（図７）。細胞播種の約１−２時間前にはプラズマ処理を行った。

Ｃａｃｏ−２細胞のＰＤＭＳマイクロメッシュを用いた培養と顕微鏡観察
・材料と方法
ＰＤＭＳマイクロメッシュをプラズマ処理し、直径４ｍｍのメッシュ円の上にＣａｃｏ−２細胞を１Ｘ１０^５個播種した。メッシュを固定するシートは厚さ０．１−０．２ｍｍ程のものを使用した。細胞培養は実施例３と同様の方法により行った。培養４日目に、細胞膜を染色するために０．０５ｍｇ／ｍＬ ＤｉＩ （１，１’’−ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ−３，３，３’，３’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ）を含んだ培地で３７℃、２０分間処理した。洗浄後、４％ パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で細胞を固定し、洗浄後にＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）を含んだ封入剤ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ （ＶＥＣＴＯＲ）と共に細胞／ＰＤＭＳマイクロメッシュシートをカバーガラスとスライドガラスの間に固定した。共焦点顕微鏡 ＬＳＭ ８００（ＺＥＩＳＳ）により細胞膜（ＤｉＩ）と細胞核（ＤＡＰＩ）を観察した。結果を図８に示した。

＜実施例５＞（図９、１０）
マイクロメッシュ培養により作製したＴｉｇ−１−２０細胞／Ｃａｃｏ−２細胞シートの経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ； Ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）測定
・材料と方法
胎児肺由来正常線維芽細胞Ｔｉｇ−１−２０細胞（製品番号ＪＣＲＢ０５０１）はＪＣＲＢ細胞バンク（国立研究開発法人 医薬基板・健康・栄養研究所）から入手した。経上皮電気抵抗測定用ＰＤＭＳ製デバイス（図９）の直径４ｍｍのマイクロメッシュ円にｉＭａｔｒｉｘ−５１１ Ｓｉｌｋ（ニッピ）をコーティングし、１ｘ１０^５個のＴｉｇ−１−２０細胞を播種した。播種２日後、Ｔｉｇ−１−２０細胞シート上に、１ｘ１０^５個のＣａｃｏ−２細胞を播種した。対象群として、Ｔｉｇ−１−２０細胞（ｉＭａｔｒｉｘ−５１１ Ｓｉｌｋあり）もしくはＣａｃｏ−２細胞（ｉＭａｔｒｉｘ−５１１ Ｓｉｌｋなし）を播種した経上皮電気抵抗測定デバイスを用意した。本実施例の場合は週に２度、全量もしくはその約１／３量の培地を新鮮培地と交換した。上記の培地交換の方法と頻度以外の培養条件は実施例３と同様である。経上皮電気抵抗はＥＶＯＭ２ （ＷＰＩ）とＥＶＯＭ２用電極ＳＴＸ２（ＷＰＩ）を用いて行った。Ｔｉｇ−１−２０細胞／Ｃａｃｏ−２細胞の共培養（Ｎ＝３、平均±ＳＥ）、Ｔｉｇ−１−２０細胞単独（Ｎ＝３、平均±ＳＥ）、Ｃａｃｏ−２細胞（Ｎ＝５−６、平均±ＳＥ）。なお、図中の８は円筒壁付きの台座である。

・結果
図１０にＴｉｇ−１−２０細胞（線維芽細胞）／Ｃａｃｏ−２細胞共培養、Ｃａｃｏ−２細胞単独培養、もしくはＴｉｇ−１−２０細胞単独培養における経上皮電気抵抗測定値の結果を示す。Ｔｉｇ−１−２０細胞単独培養とＣａｃｏ−２細胞単独培養では経上皮電気抵抗値の大きな変化はなかった。これは、線維芽細胞であるＴｉｇ−１−２０細胞が高度な密着結合をしていないためと考えられる。また、Ｃａｃｏ−２細胞のみからなる細胞シートの場合は、マイクロメッシュの目をＣａｃｏ−２が均一に隙間なく埋めることができず、隙間を電気が流れたためと考えられた。一方で、共培養においては、共培養翌日から高い電気抵抗値が測定された。この結果から、Ｔｉｇ−１−２０細胞により形成された細胞シートの上にＣａｃｏ−２細胞が隙間なくシートを形成したことが推測された。Ｔｉｇ−１−２０細胞／Ｃａｃｏ−２細胞の共培養が示したその電気抵抗値（約８０−１４０ Ω・ｃｍ^２）は、既報のｉｎ ｖｉｖｏにおける大腸（３００−４００ Ω・ｃｍ^２）もしくは小腸（５０−１００ Ω・ｃｍ^２）の電気抵抗値に匹敵するものであった(Srinivasan, B., et al., TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom, 2015. 20(2): p. 107-26)。このことは共培養下にあるＣａｃｏ−２細胞群が、生体における腸管の細胞群と一部類似した機能（例えば細胞間接着力など）を獲得した可能性を示唆していた。

上下灌流デバイス（図１１）
マイクロメッシュシートを用いて作製した細胞シートの上下に異なる液体もしくは気体を流すことができれば、例えば生体における腸管の管腔側（頂端側）と基底膜側（側底側）を再構築する際にマイクロメッシュシートが有用なツールになるものと考えられた。図１１に上下の流路の接合面がマイクロメッシュシートになっている灌流デバイスの模式図を示す。このデバイスを用いることにより、例えばマイクロメッシュ培養により作製した細胞シートに対する薬剤の透過性や移動方向などを評価することが可能となるものと考えられた。

＜実施例６＞（図１２）
マイクロメッシュ培養もしくはスフェロイド培養されたＨｅｐＧ２細胞の凍結融解後の形態変化
・方法
ＨｅｐＧ２細胞１ｘ１０^５個を直径４ｍｍ円のマイクロメッシュシート上に播種して培養した。本実験では細胞をＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ （ＳＩＧＭＡ）で培養した。比較対象として、１２穴プレートのウェル内に設置した２５６穴アガロースゲルプレート上に細胞を播種し培養した。２日後にウェルから培地を除去し、細胞保存液ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１（ＺＥＮＯＡＱ）を加え（２ ｍＬ／ウェル）、−８０℃フリーザー内にプレートごと静置した。４時間後に、プレートを−８０℃から３７℃のインキュベーター内に移動した。約５０分後にＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１が完全に溶解していることを確認した。ウェル内のＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１を培地に置換し、２日間培養後の細胞形態を調べた。細胞の形態変化に対応する細胞膜安定性変化を確認する目的で、その２日間の培養に用いた培地には１ μｇ／ｍＬ ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）を添加した。
・結果
凍結融解２日後の細胞形態を図１２に示す。凍結融解後の２日間培養によりスフェロイドの形態が大きく崩れた一方でマイクロメッシュ培養下にある細胞シートには顕著な形態変化が観察がされなかった。スフェロイド培養法と比較してマイクロメッシュ培養は細胞への凍結融解ダメージがより小さい培養法である可能性が示唆された。

本発明においては、肝細胞又は腸管細胞を用いる。細胞の由来は特に限定されないが、ヒト由来のものであることが好ましい。機能の面で有利な正常肝細胞であるラット初代培養肝細胞等を用いることもできるが、機能、特に代謝酵素はその動物種によって全く異なるため、ヒト細胞を用いることが望ましい。

・Ｃａｃｏ−２
小腸膜モデルとして、ヒト大腸ガン由来細胞株Ｃａｃｏ−２が好ましく用いられる。Ｃａｃｏ−２細胞は、腸管による吸収性を評価できる培養細胞系として近年注目されている細胞で、１９７７年にヒトの大腸ガンから分離、樹立された細胞である。Ｃａｃｏ−２細胞を単層培養すると、絨毛やタイトジャンクションの形成等の形態学的、生化学的な膜の極性を示し、小腸の吸収上皮細胞様に分化することが知られている。

・ＨｅｐＧ２
ＨｅｐＧ２はＡｄｅｎらにより樹立されたヒト肝臓ガン由来細胞株であり、培養の簡便な株化細胞である。ヒト細胞を用いる利点は大きい。ヒト由来のこの細胞株は、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）１Ａ１／２という代謝酵素を持っている。通常の培養状態では生体内の１０分の１以下の活性しか有していないが、この酵素の生成を促す誘導作用を有する化学物質（３−メチルコラントレン等）を添加することによって、活性を最大限に高めることができる。また、生体内では、肝細胞は非常に高密度の状態で存在しており、このことが肝機能の発現に大きく関与すると言われている。

Ｃａｃｏ−２細胞やＨｅｐＧ２細胞は、ガン由来細胞であるため、無限に増殖可能であるので、均一な状態の細胞を大量に得ることができる。それに加えて、遺伝子配列が同じであるヒト由来の細胞を利用するので、ヒト健康リスクを評価する上で説得力ある結果が得られる。

上記の点はいずれも治療や検査など臨床展開、あるいは生化学分野の研究利用を始めとした様々な応用展開に示唆を与える。

１ シリコン板
２ マイクロメッシュシート
３ ピペット
４ ステージ
５ 下板
６ 培地（培養液）
７ チューブ
８ 台座
９ 床板
１０１ ガラス基板
１０２ 金属層
１０３ レジスト層
１０５ 紫外線（光）

Claims (17)

1. 平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体であって、前記メッシュ構造の開口部が少なくとも１個の細胞が通過できる大きさである細胞培養支持体を用いて、肝細胞又は腸管細胞を培養することを含む、細胞シートの製造方法。
2. 前記細胞培養支持体に、前記肝細胞又は腸管細胞を接触させた状態において培養することを含む、請求項１に記載の細胞シートの製造方法。
3. 前記細胞培養支持体を培地中に設置して、前記肝細胞又は腸管細胞を培養する、請求項１又は２に記載の細胞シートの製造方法。
4. 前記細胞培養支持体の開口部において前記肝細胞又は腸管細胞が生育する、請求項１〜３の何れか１項に記載の細胞シートの製造方法。
5. 前記平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体が板状であり、厚さが１μｍ以上５０μｍ以下である、請求項１〜４の何れか１項に記載の細胞シートの製造方法。
6. 前記平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体が板状であり、平面視において、多角形の開口部を多数有する、請求項１〜５の何れか１項に記載の細胞シートの製造方法。
7. 前記平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体において、開口部を区分するフレームの平面視における幅が１μｍ以上５０μｍ以下である、請求項１〜６の何れか１項に記載の細胞シートの製造方法。
8. 前記フレームが、平面視において、横方向に向けて延びる略平行な複数の直線と、２つの横方向の直線に挟まれて、右斜め方向に向けて延びる直線と、左斜め方向に向けて延びる直線とが、前記２つの横方向の直線間を往来するように連続して折れ線構造をなし、横方向の直線と右斜め方向の直線と左斜め方向の直線とで三角形が形成され、これにより支持体内には多数の三角形の開口部が配列されている、請求項７に記載の細胞シートの製造方法。
9. 前記支持体内に形成された多数の三角形の開口部が略正三角形であり、該略正三角形の開口部の一辺の長さが３０μｍ以上５００μｍ以下である、請求項８に記載の細胞シートの製造方法。
10. 前記平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体が金属製もしくは樹脂製の板状多孔体である、請求項１〜９の何れか１項に記載の細胞シートの製造方法。
11. 前記細胞培養支持体を培養槽に入れ、当該培養槽に培地を継続的に供給しかつ排出して、培養槽内に流れを形成する、請求項１〜１０の何れか１項に記載の細胞シートの製造方法。
12. 前記肝細胞又は腸管細胞を培養するための培養器として下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの構造及び機能を有する装置を用いる、請求項１１に記載の細胞シートの製造方法。
    （ａ）１枚の反応プレートと培養槽を有してなり、該プレートには前記培養槽の内部に通じる少なくとも１つの溝が切られており、前記培養槽の略中央には平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体を培養槽の底面から浮かせる形で設置することができ、前記培養槽には前記支持体が浸漬するよう培地で満たすことができ、前記プレートの溝を介し前記平面状メッシュ構造の下部から培地を供給し、前記培養槽の上部に設けられたチューブから培地を排出することで、老廃物を除去しつつ、前記細胞培養支持体の平面状メッシュ構造上で培養することができる。
    （ｂ）１枚の反応プレートを有してなり、該プレートの略中央には培地が貯留する窪み又は開口部でなる培養槽が形成されており、その培養槽の略中央には平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体を設置することができ、前記反応プレートには前記培養槽から放射状に延びる溝が２つ以上切られており、該溝が流路をなし培地を供給および排出して、培養槽に新鮮な培地を送り続けることで、老廃物を除去しつつ、前記細胞培養支持体の平面状メッシュ構造上で培養することができる。
    （ｃ）２枚以上の反応プレートを有してなり、該プレートの少なくとも１つの略中央には培地が貯留する窪み又は開口部でなる培養槽があり、その培養槽の略中央には平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体を設置することができ、前記各反応プレートには前記培養槽から放射状に延びる溝が各プレートで１つ以上切られており、該溝が流路をなし上下のプレートの溝から、同じ培地、異なる培地、または培地と気体の組合せで供給および排出して、細胞の上下で異なる変化を促しつつ、前記細胞培養支持体の平面状メッシュ構造上で培養することができる。
13. 前記装置の中央に前記平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体を配置することができ、該中央の支持体に向け、３つ以上の放射状の流路が形成されており、培地の供給及び排出を、前記３つ以上の放射状流路を介して行う、請求項１２に記載の細胞シートの製造方法。
14. 前記平面状メッシュ構造を有する細胞培養支持体を用いて、線維芽細胞とともに腸管細胞を培養する、請求項１〜１３の何れか１項に記載の細胞シートの製造方法。
15. 開口部が少なくとも１個の細胞が通過できる大きさである平面上メッシュ構造を有する部材と、肝細胞又は腸管細胞とを含む、細胞シート。
16. 請求項１から１４の何れか一項に記載に方法により製造される、細胞シート。
17. 冷凍保存されている、請求項１５又は１６に記載の細胞シート。