JP2017522026A - 外来抗原を含むヒトサイトメガロウイルス - Google Patents

Abstract

異種抗原を含むヒトサイトメガロウイルスベクターが開示される。ＴＲ株に由来するベクターは、ガンシクロビル感受性であり、活性なＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ６、ＵＳ７およびＵＬ１３１Ａ遺伝子を含み、ｐｐ７１の発現を妨げるＵＬ８２遺伝子における有害なまたは不活性化変異を有する。【選択図】なし

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、米国仮出願第６２／０２５，３４８号（２０１４年７月１６日出願、名称：外来抗原を含むヒトサイトメガロウイルス）に対する優先権を主張するものであり、その全内容が参照により本開示に組み込まれる。

概して、分野はワクチンプラットフォームに関係する。より具体的には、分野は、外来抗原を発現する組み換えヒトサイトメガロウイルスベクターに関係する。

動物実験によって、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ベクター化ワクチンは、ａ）リンパ系外（ｅｘｔｒａｌｙｍｐｈｏｉｄ）Ｔ細胞（いわゆるエフェクターメモリーＴ細胞）の高頻度の応答を誘導し、維持する；ｂ）ＣＭＶ陽性宿主を重感染させる；ｃ）宿主間の伝播が欠けた場合でも免疫原性を維持するという点で際だっていることが実証されている。さらに、動物モデルでの実験によって、動物ＣＭＶ由来のワクチンベクターが、感染症および癌に対する防御免疫応答を誘導することが示されている（米国特許出願公開第２００８／０１９９４９３号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０１４２８２３号明細書；米国特許出願公開第２０１３／０１３６７６８号明細書；および米国特許出願公開第２０１４／０１４１０３８号明細書；それらすべてが参照により本明細書に組み込まれる）。特に際だっているのは、アカゲザルＣＭＶ（ＲｈＣＭＶ）ベクター化サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）ワクチンが、非ヒト霊長類にてＡＩＤＳを防ぐことができるだけでなく、最終的にこれらの動物をＳＩＶから治療したことが見出されたことである（Ｈａｎｓｅｎ ＳＧ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５０２，１００−１０４（２０１３）；参照により本明細書に組み込まれる）。

サイトメガロウイルスワクチンの開発においては、非弱毒化株が宿主から宿主へ伝播でき、少なくとも免疫不全個体において潜在的に病原となり得ることから、弱毒化した株を使用することが重要である。以前に、弱毒化したヒトＣＭＶ（ＨＣＭＶ）株は、ａ）潜伏感染を確立できず（Ｐｌｏｔｋｉｎ ＳＡ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ ＥＳ，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １５２，３９５−３９７（１９８５）；参照により本明細書に組み込まれる）；ｂ）長期にわたって持続する免疫を誘導できず（Ｊａｃｏｂｓｏｎ ＭＡ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｖｉｒｏｌ ３５，３３２−３３７（２００６）；参照により本明細書に組み込まれる）；ｃ）以前にＣＭＶに自然に感染したかなりの割合の集団を再感染させることができず（Ｈｅｉｎｅｍａｎ ＴＣ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １９３，１３５０−１３６０（２００６）；参照により本明細書に組み込まれる）；ｄ）持続的な感染をもたらせなかった（国際公開第２０１３／０３６４６５号；参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、ＨＣＭＶゲノムの臨床株は、線維芽細胞で増殖させた場合に生体外で非常に不安定であり、ＵＬ１３１Ａの欠失などの線維芽細胞適応がもたらされる。

ベクター機能を生体内で発揮する能力に対するそのような組織培養への適応の影響はほとんど知られていない。生体外および生体内で安定であることが弱毒化に必要であることに加えて、これらのベクターを再現性のある結果で製造できることが重要である。最も安定した弱毒化戦略は遺伝子欠失である。しかしながら、これは、一般に、サイトメガロウイルスを増殖させるのに使用される初代細胞にとって達成が困難である細胞株の補完の発生を要する。

ＨＣＭＶ ＴＲ株の遺伝子組み換えバージョンである、著しく弱毒化した、伝播欠損性（すなわち、細胞間の伝播に欠く）ＨＣＭＶ−ＴＲ３由来ベクターが開示される。開示されたベクターは、持続的な感染を確立し、維持し、異種抗原に対するエフェクターメモリーＴ細胞を誘導し、維持し、ＣＭＶ血清陽性宿主を再感染させる。前記ベクターは、非ＣＭＶ病原体特異的抗原または腫瘍抗原などの異種抗原を含む。

具体的には、ＴＲ３を、ガンシクロビル感受性であるように操作した。一例では、これは、活性なＵＬ９７遺伝子（ＴＲ３のオリジナルの臨床分離株において変異したもの）の付加によるものである。さらに、ＴＲ３を、ＴＲ３のオリジナルの臨床分離株のＢＡＣクローニングの間に除去された活性なＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ６、およびＵＳ７遺伝子を含むように操作した。ＴＲ３の追加のバージョンは、ＵＬ８２遺伝子をコードするｐｐ７１において有害な（すなわち、不活性化）変異を含み、ＴＲ３Δｐｐ７１またはＴＲ３ΔＵＬ８２と本明細書で称される。

ベクターのさらなる例では、異種抗原をコードする遺伝子の発現は、ＵＬ８２プロモーター、またはＵＬ７、ＵＬ３８、ＵＬ４５、またはＵＳ１３プロモーターなどの別のウイルスプロモーターによって駆動することができる。さらなる例では、ウイルス遺伝子プロモーターが異種抗原遺伝子の発現を駆動するように、ＵＬ８２、およびＵＬ７、ＵＬ３８、ＵＬ４５、またはＵＳ１３などの別のウイルス遺伝子の代わりに、異種抗原をコードする多数の遺伝子を挿入できる。

また、本明細書では、機能的ｐｐ７１タンパク質（ＵＬ８２遺伝子によってコードされる）を欠くＨＣＭＶを製造する方法が開示される。該方法は、機能的ｐｐ７１タンパク質を欠くＨＣＭＶを細胞に感染させるステップを含み、細胞はＤＡＸＸ遺伝子の発現を停止させるｓｉＲＮＡを含有する。他の実施形態では、該方法は、機能的ｐｐ７１タンパク質を欠くＨＣＭＶを細胞に感染させるステップを含み、細胞内でのＤＡＸＸ遺伝子の発現が、本分野で既知の他の技術によって、例えば、ＲＮＡ干渉（例えばマイクロＲＮＡターゲティングおよび低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）ターゲティング）、リボザイム切断、条件的または誘導性プロモーターによる制御された発現、ＤＡＸＸ結合タンパク質の発現、またはユビキチン化および分解のためのＤＡＸＸもしくはＤＡＸＸタンパク質複合体のターゲティングによって、タンパク質またはＲＮＡレベルで下方制御される。これらの方法を用いて、ＨＣＭＶが補完なしで効率的に生産される。細胞は、ヒト線維芽細胞を含むいずれの細胞でもあり得る。

本願の一部の図面は、特許出願公報で利用できないカラーで示した際により良く理解される。しかしながら、出願人らは、カラー図面を最初の開示の一部とみなし、後の手続きにおいて本願の図面のカラー版を示す権利を保有する。
ＨＣＭＶ ＴＲが、他のＨＣＭＶ株と比較して、潜伏の確立および潜伏からの再活性化（＋Ｇ−ＣＳＦ）においてより優れていることを示す。図１Ａは、図１Ｂにて使用したＨＣＭＶクローンのゲノム組織化の地図である。ＨＣＭＶゲノムは、末端反復（示す通りＴＲＬおよびＴＲＳ）と、ｕｎｉｑｕｅ ｌｏｎｇ（ＵＬ）およびｕｎｉｑｕｅ ｓｈｏｒｔ（ＵＳ）領域を分ける内部反復（ＩＲＳ）と隣接している。それぞれのコンストラクトにおけるＢＡＣカセットの位置は、Ｂと示された領域で示されている。ＨＣＭＶ ＴＲのＵＳ領域は、ＢＡＣカセットの挿入によりＵＳ２−７を欠く。ＴＲΔ４は、ＵＳ２−７の欠失に加えて遺伝子ＵＬ１２８−ＵＬ１５０を欠く。ＵＬ１３１Ａ遺伝子には、ＡＤ１６９がないが、ＡＤ１６９ ＢＡＤ ＵＬ１３１Ａにおいて修復されている（下記のＷａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｅｎｋ，２００５）。Ｔｏｌｅｄｏは、ＵＬ１２８を欠失したＵＬ１３３−１２８領域の反転を有する（下記のＭｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，２００３）。 ＨＣＭＶ ＴＲが、他のＨＣＭＶ株と比較して、潜伏の確立および潜伏からの再活性化（＋Ｇ−ＣＳＦ）においてより優れていることを示す。図１Ｂは、ヒトＣＤ３４＋幹細胞を移植し、示したＨＣＭＶ株に感染させたヒト線維芽細を胞腹腔内に接種したＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒγ−ｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスの結果を要約するプロットである。感染から４週間後、ヒト造血幹細胞を顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）処理で動員し、定量的ＰＣＲによって、肝臓におけるウイルス負荷を測定した。 オリジナルのＨＣＭＶ ＴＲ株に存在するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に対する変化を示すＨＣＭＶ−ＴＲ３ゲノムのグラフィカル表示である。ガンシクロビル感受性を与えるために、ＨＣＭＶ ＴＲのＵＬ９７をＨＣＭＶ ＡＤ１６９のものに置換した。ＢＡＣカセットは、ｌｏｘＰ部位と隣接し、ｃｒｅが媒介する自己切除後に、単独のｌｏｘＰ部位がゲノムにとどまる。ＨＣＭＶ−ＴＲ ＢＡＣは、ＵＳ２−７を欠くことから、ＨＣＭＶ ＡＤ１６９由来の対応する遺伝子を挿入した。末端反復（ａｂおよびｃ’ａ）および内部反復（ｂ’ａ’ｃ）を示す。 ＨＣＭＶ−ＴＲではなくＨＣＭＶ−ＴＲ３がガンシクロビルに対し感受性（ＧＣＶ）であることを示すプロットである。増殖が停止したヒト胎児線維芽細胞ＭＲＣ−５細胞をＨＣＭＶ ＴＲ３、ＨＣＭＶ ＴＢ４０Ｅ、およびオリジナルのＨＣＭＶ ＴＲ（ＭＯＩが１ＰＦＵ／細胞）に感染させるか、または偽感染させた。示した場合、感染から９０分後、広範なウイルス細胞変性効果が未処理の対照で観察されるまで（感染後４日）、ＧＣＶの濃度を上昇させて細胞を処理した。その後、ＭＲＣ−５細胞での標準のプラーク減少アッセイによって、感染力について細胞培養の上清をアッセイした。プラークの数を薬濃度の関数としてプロットし、ＩＣ_５０を決定した。値は２つの独立した定量の平均である。 ＨＣＭＶ−ＴＲ３が、驚くべきことに、多数の継代後に、内皮細胞を感染させる能力を維持し、ゲノム安定性を維持することを示す。図４Ａは、以下を示すゲルの画像である：ＨＣＭＶ−ＴＲ３ ＢＡＣをＭＲＣ−５細胞で再構成し、その後、初代ヒト線維芽細胞にて、２０回生体外で継代した。継代数１代、５代、１０代、１５代および２０代において、ウイルスＤＮＡを感染した細胞から抽出し、そのＵＬ１２８−１３１領域、多数の継代の結果として頻繁に変異する領域の制限消化分析およびＰＣＲ配列決定を行った（下記のＤａｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。 ＨＣＭＶ−ＴＲ３が、驚くべきことに、多数の継代後に、内皮細胞を感染させる能力を維持し、ゲノム安定性を維持することを示す。図４Ｂは、ＭＲＣ−５細胞での多数の継代後のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＴＲ３の感染力を示すプロットである。ウイルスの精製したストックを継代数１０代で作製し、ＨＵＶＥＣをＭＯＩ＝０．５で感染させるのに使用した。同時に、対照として、ＨＣＭＶ ｌａｂ適応株ＡＤ１６９にもＨＵＶＥＣを感染させた。感染後（ｐｉ）５、１０、１５、および２０日目に上清および細胞を回収し、ＭＲＣ−５細胞におけるプラークアッセイによって滴定した。経時的な力価の増加は、無傷のＵＬ１３１Ａ−１２８領域と一致して、ＨＣＭＶ ＴＲ３がＨＵＶＥＣで増殖可能である一方で、ＨＣＭＶ ＡＤ１６９は増殖していないことを示す。 ＵＬ１２８−１３１の存在が、無細胞ＨＣＭＶ−ＴＲ３の収量を減少させないことを示すプロットである。多段階増殖曲線分析を、ＭＯＩ ０．０１にてＨＣＭＶ−ＴＲ３に感染させたＭＲＣ−５細胞と、ＴＲ３と同一であるが、ＵＬ１２８−１３１を欠失した（ＨＣＭＶΔＵＬ１２８−１３１）株を用いて行った。ＭＲＣ−５細胞での標準のプラークアッセイによって、感染した細胞および上清の力価を、感染後２、５、１０、１５および２０日目に測定した。 Ｈａｎｓｅｎ ＳＧ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ １５，２９３−２９９（２００９）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のＢＡＣ変異誘発を用いて、ＥＦ１αプロモーターの制御下のＳＩＶｇａｇをＨＣＭＶ−ＴＲ３ゲノムに挿入した際の結果を示す一連の２つのプロットである。ＣＭＶに対して血清陽性であるアカゲザル（ＲＭ）に、ＳＩＶｇａｇを発現するＨＣＭＶ−ＴＲを１０^５プラーク形成単位（ＰＦＵ）接種した。ＨＣＭＶ可溶化液（菱形）または重複するＳＩＶｇａｇ（四角）ペプチドに応答する、末梢血単核球（ＰＭＢＣ）における％メモリーＴ細胞を示す。古典的なＣＭ９ペプチド（丸）に対するＴ細胞の欠如を認め、これは、ＨＣＭＶによって誘導されたＴ細胞応答がＲｈＣＭＶについて記載されている通りの他のベクターのもの（下記のＨａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３）と異なることを示す。左のプロットは、ＣＤ４^＋Ｔ細胞応答を示す。右のプロットはＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を示す。 ＵＬ７８プロモーターの制御下でＨＩＶｇａｇを発現し、ＵＬ１２８−１３１を欠失したＨＣＭＶ（ΔＵＬ１２８−１３１ ＨＣＭＶｇａｇ）またはＵＬ８２プロモーターの制御下でＨＩＶｇａｇを発現し、ＵＬ１２８−１３１は無傷であるＨＣＭＶ（Δｐｐ７１ ＨＣＭＶｇａｇ）を接種したＲＭにおけるＨＩＶｇａｇ特異的Ｔ細胞応答を示す一連の２つのプロットである。１０^６ＰＦＵのΔＵＬ１２８−１３１ベクターをＲＭに接種した際、ＨＩＶｇａｇに対するＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞応答が観察されなかった。これに対して、ＨＩＶｇａｇ特異的Ｔ細胞応答がΔｐｐ７１ ＨＣＭＶｇａｇベクターで観察された。左のプロットは、ＣＤ４^＋Ｔ細胞応答を示し、右のプロットは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を示す。 野生型ＨＣＭＶによる感染の間、外被タンパク質ｐｐ７１がどのようにして細胞のコリプレッサーＤＡＸＸを分解するかを説明する図である。ｐｐ７１の非存在下では、ＤＡＸＸは、ウイルス遺伝子の発現を抑制し、それ故に溶解性複製を抑制する。しかしながら、ｐｐ７１の非存在下でも、ＤＡＸＸ特異的ｓｉＲＮＡによる遺伝子ノックダウンによってＤＡＸＸ ｍＲＮＡが除去された場合、ウイルス遺伝子の発現は正常に進行できる。 ＤＡＸＸ特異的ｓｉＲＮＡを形質移入し、遺伝子導入から２４時間（ｈ）後に、ＴＲ３およびＴＲ３Δｐｐ７１ＨＩＶｇａｇにＭＯＩ＝０．０５で感染させたＭＲＣ−５細胞のプロットである。示した感染後の時間にて、細胞および上清を別個に回収し、ｐｐ７１を発現する補完細胞で滴定した（ｔｉｔｅｒｅｄ）。 ＨＣＭＶＴＲ３ΔＵＬ８２（Δｐｐ７１）が、ヒト化マウスにおいて潜伏を確立するが、その再活性化および播種の能力を欠損していることを示すプロットである。プロットでは、ＣＤ３４＋幹細胞を移植したＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒγ−ｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスに、ＴＲ３またはＴＲ３ΔＵＬ８２ウイルスに感染させた線維芽細胞を腹腔内接種した。感染から４週間後、ヒト造血幹細胞をＧ−ＣＳＦ処理によって動員し、ウイルス負荷を骨髄（ＴＲ３、図８Ａ）において定量的ＰＣＲによって測定した。 ＨＣＭＶＴＲ３ΔＵＬ８２（Δｐｐ７１）が、ヒト化マウスにおいて潜伏を確立するが、その再活性化および播種の能力を欠損していることを示すプロットである。プロットでは、ＣＤ３４＋幹細胞を移植したＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒγ−ｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスに、ＴＲ３またはＴＲ３ΔＵＬ８２ウイルスに感染させた線維芽細胞を腹腔内接種した。感染から４週間後、ヒト造血幹細胞をＧ−ＣＳＦ処理によって動員し、ウイルス負荷を肝臓（ＴＲ３ΔＵＬ８２、図８Ｂ）において定量的ＰＣＲによって測定した。 ＨＩＶｇａｇを発現する、ｐｐ７１を欠失したＨＣＭＶ−ＴＲ３が、非ヒト霊長類においてＨＩＶｇａｇ特異的エフェクターメモリーＴ細胞を誘導する能力を維持することを示す一連のプロットである。ＨＩＶｇａｇを発現するが、ｐｐ７１を欠くＨＣＭＶを、ＵＬ８２（ｐｐ７１）遺伝子をＨＩＶｇａｇで置換することによって構築した。生じたウイルスを、ＤＡＸＸのｓｉＲＮＡを用いて回収した。１０^６または１０^５ＰＦＵの生じたウイルスをＲＭに皮下接種し、ＨＩＶｇａｇに対するＴ細胞応答を、細胞内サイトカイン染色によって、示した日にて決定した。重複するＨＩＶｇａｇペプチドに対して応答する末梢血単核球（ＰＭＢＣ）におけるＣＤ４^＋（左）およびＣＤ８^＋（中心）メモリーＴ細胞のパーセンテージを示す。右のパネルは、応答するＴ細胞がエフェクターメモリー表現型を呈することを示す。 ＳＩＶｅｎｖおよびＳＩＶｐｏｌの両方を発現する二重ＲｈＣＭＶベクターの結果を示す一連の６つのプロットである。二重発現ベクターを、最初にＲｈ１１０（ｐｐ７１のＲｈＣＭＶ相同体）をＳＩＶｅｎｖで置き換えることによって構築した。次に、ＨＣＭＶ遺伝子ＵＬ７（Ｒｈ１９）、ＵＬ７８（Ｒｈ１０７）またはＵＳ１３（Ｒｈ１９１）の相同体を、ＳＩＶｐｏｌで置換した。生じたベクターを、ｐｐ７１を発現するアカゲザル線維芽細胞にて回収した。それぞれ５ｘ１０^６ＰＦＵのベクターを２匹のＲＭ（一方のＲＭを実線で、他法のＲＭを点刻した線で示す）にそれぞれ接種した。ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を、ＳＩＶｐｏｌまたはＳＩＶｅｎｖのいずれかに対応する重複する１５ｍｅｒのペプチドを用いて、ＰＢＭＣにおいて、示した日に測定した。Ｔ細胞メモリープール内の％ＳＩＶ特異的Ｔ細胞を示す。 ＭＲＣ−５細胞を偽感染させるか、またはＴＲ３ΔＵＬ７ＨＩＶｇａｇ、ＴＲ３ΔＵＬ４５ＨＩＶｇａｇ、もしくはＴＲ３ΔＵＬ７８ＨＩＶｇａｇにＭＯＩ ０．５で感染させた際の結果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像である。タンパク質抽出物を感染から９６時間後（９６ｈｐｉ）に調製した。２０μｇのタンパク質を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、イムノブロットを抗−Ｇａｇ（ｐ２４）抗体で修飾した。 ＥＦ１αプロモーターの制御下のＳＩＶｇａｇによる結果を示す一連の２つのプロットである。Ｈａｎｓｅｎ ＳＧ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ １５，２９３−２９９（２００９）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のＢＡＣ変異誘発を用いて、ＳＩＶｇａｇをＨＣＭＶ−ＴＲ３ゲノムに挿入した。ＣＭＶに対して血清陽性であるアカゲザル（ＲＭ）に、ＳＩＶｇａｇを発現するＨＣＭＶ−ＴＲ３を１０^５プラーク形成単位（ＰＦＵ）接種した。重複するＳＩＶｇａｇペプチドに対して応答する末梢血単核球（ＰＭＢＣ）における％ＣＤ４＋（左パネル）および％ＣＤ８＋（右のパネル）Ｔ細胞を示す。プロットが、２匹のアカゲザル（Ｒｈ３１０１７、Ｒｈ３１２１９）について、接種後３７８日を超えて安定した免疫応答を示すことに注目すべきである。 ＴＲ３ΔＵＬ７８ ＨＣＭＶ／ＨＩＶｇａｇΔＵＬ１２８−１３０を接種した２匹のＲＭのＴ細胞免疫応答をプロットしたものである。ＵＬ１３１Ａの欠失を含んだコンストラクトと異なり、欠失をＵＬ１２８−１３０に限定することで、持続したＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞応答がもたらされる。 細胞当たりの感染粒子の範囲にわたるＤＡＸＸのｓｉＲＮＡの存在下（丸）または非存在下（菱形）でのΔＵＬ８２（ｐｐ７１）ＨＩＶｇａｇに対する野生型ＴＲ３（四角）の増殖速度論を比較するプロットである。ＤＡＸＸ特異的ｓｉＲＮＡを形質移入し、遺伝子導入から２４ｈ後にＴＲ３およびＴＲ３Δｐｐ７１ＨＩＶｇａｇに感染させたＭＲＣ−５細胞が、ｓｉＲＮＡによって機能的に補完されるか、またはＤＡＸＸのｓｉＲＮＡの非存在下で複製できない場合、臨床的に関連性のある低いＭＯＩにて増殖障害が目に見えるようになる。低いＭＯＩで複製がないことは、ウイルスが細胞間の伝播を欠くことを示す。示した感染後の時間にて、上清を回収し、ｐｐ７１補完条件（ＤＡＸＸのｓｉＲＮＡを形質移入したＭＲＣ−５細胞）の下で滴定した（ｔｉｔｅｒｅｄ）。 ＨＣＭＶＴＲ３ΔＵＬ８２（Δｐｐ７１）が、ヒト化マウスにおいて潜伏を確立するが、再活性化および播種する能力を欠くことを実証する一連の３つのグラフである。ＣＤ３４＋幹細胞を移植したＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒγ−ｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスに、ＴＲ３、ＴＲ３ΔＵＬ８２、またはＴＲ３ΔＵＬ８２ΔＵＬ１２８−１３０ウイルスに感染させた線維芽細胞を腹腔内接種した。感染から４週間後、ヒト造血幹細胞をＧ−ＣＳＦ処理によって動員し、ウイルス負荷を、骨髄（左上のパネル）、肝臓（右上のパネル）、および脾臓（下のパネル）において測定した。相対的なウイルスコピー数を、ＤＮＡの合計のμｇの関数として、定量的ＰＣＲに基づいてプロットした。顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の非存在下での値は、潜伏ウイルスの負荷を表し、Ｇ−ＣＳＦ刺激後の値は、潜伏から現れるウイルスの再活性化を表す。ｐｐ７１について欠失したコンストラクトは、潜伏感染を確立するが、ウイルスゲノムＤＮＡのコピーによって測定されるようにＧ−ＣＳＦ刺激に対して応答しない。 ＴＲ３／ＨＣＭＶΔｐｐ７１（ＨＩＶｇａｇ）コンストラクトを接種した３匹のＲＭの免疫応答を特徴付ける一連の３つのプロットである。ｓｉＲＮＡの存在下でベクターを増殖させ、滴定し（ｔｉｔｅｒｅｄ）、皮下接種のために濃縮した。重複するＨＩＶｇａｇペプチドに対して応答する末梢血単核球（ＰＭＢＣ）におけるＣＤ４^＋（左パネル）およびＣＤ８^＋（中央のパネル）メモリーＴ細胞のパーセンテージを示す。異なる用量のコンストラクトに対する応答を、接種から２９４日後までグラフに描いた。右のパネルは、Δｐｐ７１（ＨＩＶｇａｇ）ＴＲ３／ＨＣＭＶのＣＤ８＋応答がＴ−エフェクターメモリー表現型と一致していることを実証する。 ＢＡＣクローン配列と比較した継代数９代にわたるＨＣＭＶ／ＴＲ３ΔＵＬ８２（ｐｐ７１）ＨＩＶｇａｇの配列アラインメントを図示する。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を矢印で示し、自己切除ＢＡＣを白矢印で示し、ウイルスＯＲＦを灰色矢印で示し、ＵＬ８２のＯＲＦを置き換えるＨＩＶｇａｇ挿入を黒色矢印で示す。内部反復および末端反復を灰色楕円形で示す。大きな多型はＬＯＤ１％で見られなかった。 いくつかの感染サイクルにわたるｇａｇ挿入物の発現および均一性を確認する。図１７ａは、ｐｐ７１タンパク質発現がΔＵＬ８２（ｐｐ７１）コンストラクトで存在せず、ＨＩＶｇａｇ（ｐ２４）発現が存在することを確認する複合ウエスタンブロットを示す。ＨＣＭＶ発現（ｐｐ２８）に対して陽性の対照およびβ−アクチンに対するローディング対照が含まれる。 いくつかの感染サイクルにわたるｇａｇ挿入物の発現および均一性を確認する。図１７ｂは、ｇａｇ挿入物の配列が、これらの初期の継代にわたって安定であり、サンガー配列決定によって多型を検出しなかったことを示す。 代替の挿入部位およびプロモーターがどのように挿入安定性に影響を与え得るかの一例を示すプロットである。この例では、ＳＩＶｇａｇ挿入物を駆動するＥＦ１ａプロモーターをＵＬ３６座位に入れた。このコンストラクトは、バックグラウンドレベルを超える多型の出現を示す。この場合、Ｇ＞Ｔ置換の出現が停止コドンを生じ、それによって、ベクター化（ｖｅｃｔｏｒｅｄ）抗原が切断される。

（配列表）
配列番号１はＨＣＭＶ ＴＲ３ΔＵＬ８２ ＢＡＣの核酸配列である。
配列番号２は、ＤＡＸＸの発現を停止させるｓｉＲＮＡのセンス鎖の核酸配列である。
配列番号３は、ＤＡＸＸの発現を停止させるｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の核酸配列である。

ヒトＤＡＸＸのｍＲＮＡは、多くのスプライスバリアントを含む。スプライスバリアントの例としては、以下のＧｅｎＢａｎｋエントリ：ＡＢ０１５０５１；ＣＲ４５７０８５；ＡＦ００６０４１；ＮＭ＿００１２５４７１７．１；ＮＭ＿００１３５０；ＮＭ＿００１１４１９６９；ＮＭ＿００１１４１９７０；ＨＱ４３６５２９；ＨＱ４３６５２８が挙げられ；それらすべてが参照により本明細書に組み込まれる。

（用語）
本明細書において、「抗原」とは、対象において免疫応答を誘導することが可能な物質、典型的にはタンパク質を指す。また、該用語は、対象に投与すると（直接または対象にタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはベクターを投与することによって）、そのタンパク質に対する液性のおよび／または細胞のタイプの免疫応答を誘発することが可能であるという意味で免疫学的に活性なタンパク質を指す。

本明細書において、「ヌクレオチド配列」および「核酸配列」とは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、または合成核酸が含まれるがこれらに限定されないデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）の配列を指す。核酸は、一本鎖、または部分的にもしくは完全に二本鎖（二重鎖）であり得る。二重鎖核酸はホモ二重鎖またはヘテロ二重鎖であり得る。

本明細書において、「低分子干渉ＲＮＡ」（「ｓｉＲＮＡ」）（本分野で「短分子（ｓｈｏｒｔ）干渉ＲＮＡ」とも称される）とは、約１０〜５０ヌクレオチドの長さ（「ヌクレオチド」はヌクレオチドアナログを含む）、好ましく約１５〜２５ヌクレオチドの長さ、例えば約２０〜２４または２１〜２３ヌクレオチドの長さ、より好ましくは約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドの長さのＲＮＡ剤、好ましくは二重鎖剤を指し、該鎖は任意に、ＲＮＡ干渉に向けるかまたは仲介することが可能な、例えば１、２または３個の重複ヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）を含む重複末端を有する。自然発生ｓｉＲＮＡが、細胞のＲＮＡｉの仕組み（例えばダイサーまたはこの相同体）によって、より長いｄｓＲＮＡ分子（例えば＞２５ヌクレオチドの長さ）から生じる。

「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「アミノ酸配列」は、本明細書にて互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを指す。ポリマーは、直線状または分岐状であり得、修飾アミノ酸またはアミノ酸アナログを含んでもよく、アミノ酸以外の化学的部分によって割り込まれ得る。また、該用語は、自然にまたは介入によって；例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質修飾、アセチル化、リン酸化、または標識または生理活性成分による結合などのいずれの他の操作または修飾によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。

本明細書において「組み換え」とは、自然界で発生しないヌクレオチドまたはタンパク質分子をもたらす組み換えＤＮＡ技術を用いて生じたヌクレオチドまたはタンパク質分子を意味する。組み換え核酸の一例は、異種（非ＣＭＶ）抗原を発現するＨＣＭＶベクターをコードする核酸である。

本明細書において、「ベクター」は、ＣＭＶウイルスなどのウイルスを含めて、１つの環境から別のものまで核酸分子の移行を可能にするかまたは促進するいずれの生物学的な分子も包含する。

タンパク質およびそれらをコードする核酸は、本明細書で例証し、説明した正確な配列とは異なってもよいことを理解すべきである。したがって、異なるＨＣＭＶベクターが、ａ）リンパ系外（ｅｘｔｒａｌｙｍｐｈｏｉｄ）エフェクターメモリーＴ細胞応答（いわゆるエフェクターメモリーＴ細胞）の高い頻度を誘導かつ維持し；ｂ）ＣＭＶ陽性個体を再感染させ；ｃ）依然として伝播欠損性となっている（すなわち、１つの対象または宿主から別の対象または宿主への伝播がない）が免疫原性を維持する一方で、異種抗原に対する免疫応答を依然として生じることが可能である限り、本発明は、示された配列に対する欠失、付加、トランケーションおよび置換を考慮する。

この点で、置換は、自然界で保存的なものであってもよく、すなわち、アミノ酸のファミリー内で起こる置換であってもよい。例えば、アミノ酸は、一般に４つのファミリーに分けられ：（１）酸性−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性−リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性―アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）無電荷極性−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンに分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時折、芳香族アミノ酸と分類される。ロイシンのイソロイシンまたはバリンによる単離した置換、もしくはその逆；アスパラギン酸のグルタミン酸による単離した置換もしくはその逆；トレオニンのセリンによる単離した置換もしくはその逆；または構造的に関連したアミノ酸によるアミノ酸の類似の保存的な置換が、生物学的活性に対し大きな影響を及ぼさないことは合理的に予測可能である。それ故に、例証し、説明した配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するが、ベクターの活性に実質的に影響を与えない小さなアミノ酸置換を有するタンパク質は、本発明の範囲内である。

また、相同体は、記載したタンパク質または核酸配列に対する相同性のパーセントで表すことができる。相同体は、本明細書に記載したＨＣＭＶベクターおよび／または異種抗原に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性または同一性を有し得る。

配列同一性または相同性は、配列ギャップを最小限にしつつ重複および同一性を最大にするように整列させた際に配列を比較することによって決定できる。特に、配列同一性は、多くの数学的アルゴリズムのいずれも用いて決定してもよい。２つの配列の比較のために使用される数学的アルゴリズムの非制限的な例としては、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，５８７３−５８７７（１９９３）におけるものとして修正されたＫａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，２２６４−２２６８（１９９０）のアルゴリズムがある。

配列の比較のために使用される数学的アルゴリズムの別の例としては、Ｍｙｅｒｓ ＆ Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ ４，１１−１７（１９８８）のアルゴリズムがある。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０質量残基表、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを使用できる。局所的な配列類似性およびアラインメントの領域を同定するためのさらに別の有用なアルゴリズムは、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，２４４４−２４４８（１９８８）に記載のＦＡＳＴＡアルゴリズムである。

ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いたものを含めて、生物学的な配列を比較するために使用される方法の他の例は、ＵＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｅｂｓｉｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で容易に入手できる。

（ＨＣＭＶベクター）
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ベクターが本明細書にて開示される。ベクターは、対象から対象へのウイルスの伝播（すなわち、細胞間の伝播）を防ぎ、それでもなおＨＣＭＶに以前に自然感染した対象に持続感染するように操作される。ベクターは、異種抗原に対する持続的な免疫応答を生じ、薬のガンシクロビルに対し感受性である。

具体例では、ベクターは、ＨＣＭＶ ＴＲ株に由来し、活性なＵＬ９７遺伝子（オリジナルのＴＲ臨床分離株中に存在しない）に加えて活性なＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ６およびＵＳ７遺伝子（クローニング中にオリジナルのＴＲ−ＢＡＣから除去）を含むように操作されている。これらの変更を有するＴＲ株のベクターの一例は本明細書でＴＲ３と称される。ＴＲ３は、ＵＬ９７に加えてＡＤ１６９株由来のＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ６およびＵＳ７遺伝子を含む。一部の実施形態では、ＨＣＭＶ ＴＲ株に由来するベクターは、活性なＵＬ１３１Ａ遺伝子をさらに含む。ＴＲ３は無傷のＵＬ１３１Ａ遺伝子を含む。

追加のＴＲ３バリアントは、ＵＬ８２（ｐｐ７１タンパク質をコードする）、ＵＬ７、ＵＬ４５、ＵＬ７８、および／またはＵＳ１３を含む１つ以上の他のウイルス遺伝子中に有害な変異または不活性化変異を有する。有害な変異または不活性化変異は、遺伝子によってコードされるタンパク質の機能の欠如をもたらすいずれの変異でもあり得、遺伝子のコード配列および／またはプロモーターの部分的なまたは全体の欠失を伴う変異を含む。また、有害な変異または不活性化変異は、遺伝子によってコードされるタンパク質の機能の欠如をもたらす遺伝子のコード配列および／またはプロモーターの点変異およびフレームシフト変異も含む。

また、ＴＲ３バリアントは、病原体特異的抗原または腫瘍抗原などの異種抗原も発現することができる。これらの異種抗原は、内在性ＨＣＭＶプロモーターを含むいずれのプロモーターによって発現することができ、該内在性ＨＣＭＶプロモーターは、ＵＬ８２、ＵＬ７、ＵＬ４５、ＵＬ７８および／もしくはＵＳ１３プロモーターまたはＨＣＭＶ最初期プロモーターを含む。関連したＴＲ３バリアントにおいて、ウイルスのＵＬ８２、ＵＬ７、ＵＬ４５、ＵＬ７８および／またはＵＳ１３遺伝子は異種抗原に置き換えられる。さらに他の関連したＴＲ３バリアントでは、ＵＬ８２遺伝子は第１の異種抗原に置き換えられ、ウイルスのＵＬ７、ＵＬ４５、ＵＬ７８またはＵＳ１３遺伝子は第２の異種抗原に置き換えられる。

ＴＲ３バリアントの他の例では、異種抗原には、ＨＣＭＶ以外のＣＭＶ由来のプロモーター（ＭＣＭＶ−ＩＥまたはＲｈＣＭＶ−ＩＥなど）、ＣＭＶ以外のヘルペスウイルス由来のプロモーター、ヘルペスウイルス以外のウイルス由来のプロモーター、またはＥＦ１αなどの非ウイルスプロモーターが与えられる。

一部の実施形態では、プロモーターは、ミニマルプロモーターおよび上流の制御配列に対応するＤＮＡ配列の会合を含む。ミニマルプロモーターは、ＣＡＰ部位に加えてＴＡＴＡボックスを含む。これらは、基本の、未制御の転写のための最小配列である。上流の制御配列は、エンハンサー配列などの上流のエレメントを含む。切断プロモーターは、全長プロモーターの一部が除去されたプロモーターである。

また、本明細書では、本明細書に記載したＨＣＭＶベクターのいずれかをコードする核酸も開示される。例示の核酸配列が提供されるが、当業者であれば、遺伝暗号での縮重により、多くの異なる核酸配列が同一のタンパク質配列をコードすることができることを理解できる。また、ＨＣＭＶベクターおよび／またはＨＣＭＶベクターをコードする核酸配列を含む細胞が開示される。そのような細胞は、ヒト胎児線維芽細胞および他の細胞などの哺乳類のまたはヒトの細胞であり得る。いくつかの例では、ＤＡＸＸ遺伝子などの特定の遺伝子の発現を停止させるｓｉＲＮＡを発現するように、細胞を操作できる。

さらに、本明細書では、弱毒化したＨＣＭＶベクターを細胞（例えば単離した細胞）内で製造する方法が開示される。方法は、弱毒化したＨＣＭＶベクターに細胞を感染させるステップを含む。発現停止させなければ弱毒化したＨＣＭＶベクターが細胞内で増殖するのを妨げる遺伝子の発現を停止させるｓｉＲＮＡを細胞に形質移入するか、または該ｓｉＲＮＡを細胞が発現する。一例では、ＨＣＭＶベクターは、ｐｐ７１の欠失などの有害な変異または不活性化変異を含み、ｓｉＲＮＡがＤＡＸＸ遺伝子の発現を停止させる。また、機能的なｐｐ７１タンパク質を欠く弱毒化したＨＣＭＶベクターを細胞（例えば単離した細胞）内で製造する方法が開示され、該方法では、本分野で既知の他の技術によって、例えばＲＮＡ干渉（例えばマイクロＲＮＡターゲティングおよび低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）ターゲティング）、リボザイム切断、条件的または誘導性プロモーターによる制御された発現、ＤＡＸＸ結合タンパク質の発現、またはユビキチン化および分解のためのＤＡＸＸまたはＤＡＸＸタンパク質複合体のターゲティングによって、細胞内でのＤＡＸＸ遺伝子の発現がタンパク質またはＲＮＡレベルで下方制御される。

本明細書に記載したタイプの部位特異的変異は、合成オリゴヌクレオチドを用いて導入できる。これらのオリゴヌクレオチドは、望ましい変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含有する。Ｍｏｒｉｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２，６４６−６４９（１９８４）に適した方法が開示されている。酵素をコードするヌクレオチド配列に変異を導入する別の方法は、Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｌｏｎｇ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８０，１４７−１５１（１９８９）に記載されている。ＢＡＣのための部位特異的な変異誘発方法が、Ｃｈａｄｂｕｒｎ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ５３，５１３−５２４（２００８）；Ｌｅｅ Ｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ７３，５６−６５（２００１）；およびＹｕ Ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７，５９７８−５９８３（２０００）に記載されており、それらすべてが参照により本明細書に組み込まれる。

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二重鎖のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の直接導入によって誘導される転写後の遺伝子発現抑制方法であり、多様な生物において特定の遺伝子の発現をノックアウトするのに有用なツールとして登場した。ＲＮＡｉは、Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９１，８０６−８１１（１９９８）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。１つのそのような方法は、形質移入によるｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）の細胞内への導入を伴う。特定のプラスミドベクター系などの他のシステムは、細胞内での安定したｓｉＲＮＡ発現をもたらす（例えば、ｐＳＵＰＥＲシステム − Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ＴＲ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６，５５０−５５３（２００２）；参照により本明細書に組み込まれる）。任意の遺伝子を効率的に発現停止させることができるｓｉＲＮＡを設計する方法は、本分野で既知である。

（異種抗原）
異種抗原は、ＨＣＭＶにおいて自然に発現していないいずれのタンパク質にも由来し得、病原体特異的抗原、腫瘍抗原、マーカー（蛍光タンパク質または酵素など）、増殖因子、融合タンパク質、または免疫応答が生じ得るいずれの他のタンパク質またはこれらの断片（ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ制限ペプチドなど）を含む。

本明細書に記載したＨＣＭＶベクターにおける異種抗原は、病原体特異的抗原であり得る。例えば、ウイルス病原体由来のタンパク質を使用できる。ウイルス病原体としては、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、単純ヘルペス１型、単純ヘルペス２型、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、カポジ肉腫ヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ヒトパピローマウイルス、狂犬病ウイルス、風疹ウイルス、ヒトボカウイルス、およびパルボウイルスＢ１９が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ＨＣＭＶベクターにおける異種抗原は、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｒｅｖ、ｔａｔおよびｎｅｆを含むＨＩＶ抗原であり得る。好都合に、ＨＩＶ抗原としては、米国特許出願公開第２００８／０１９９４９３号明細書および第２０１３／０１３６７６８号明細書（両方とも参照により本明細書に組み込まれる）に記載のＨＩＶ抗原が挙げられるが、これらに限定されない。

代わりに、異種抗原は、細菌病原体に由来するタンパク質であり得る。細菌病原体としては、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ブルセラ・アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）、ブルセラ・カニス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｃａｎｉｓ）、ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、ブルセラ・スイス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、フェカリス菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、フェシウム菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、レプトスピラ・インターロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ライ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ソンネ菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）、およびペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）が挙げられる。

代わりに、異種抗原は、寄生生物に由来するタンパク質であり得る。寄生生物としては、アカントアメーバ、バベシア症、バランチジウム症、ブラストシスティス感染症、コクシジオイデス、二核アメーバ症、アメーバ症、ジアルジア、イソスポーラ症、リーシュマニア症、初代アメーバ性髄膜脳炎（ＰＡＭ）、マラリア、リノスポリジウム症、トキソプラズマ症、寄生虫肺炎、トリコモナス症、睡眠病、およびシャーガス病などの疾患を引き起こす原虫が挙げられるが、これらに限定されない。

代わりに、異種抗原は蠕虫生物に由来するタンパク質であり得る。蠕虫生物としては、鉤虫、回虫、サナダムシ、ギニア虫、肝臓吸虫、腸管吸虫、肺吸虫、住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｏｓａ）、および鞭虫が挙げられるが、これらに限定されない。

代わりに、異種抗原は、腫瘍に由来するタンパク質であり得る。

異種抗原はコドン最適化することができる。ＨＩＶおよび他のレンチウイルスを含む多くのウイルスが多数のレアコドンを使用し、これらのコドンを望ましい対象（例えばヒト）に慣用のコドンに対応するように変えることによって、抗原の発現増大が達成できる。例えば、ＨＩＶタンパク質にて使用されるレアコドンは、高発現したヒト遺伝子にて頻繁に現れるものに変異できる（Ａｎｄｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２，１４９７−１５０３，（１９９８）。さらに、抗原は、病原体の異なる株に由来する配列断片を含有するコンセンサス配列またはモザイク抗原であり得る。

（免疫原性組成物）
本明細書では、開示された組み換えＨＣＭＶベクターと、医薬的に許容可能な担体または希釈剤とを含有する免疫原性組成物が開示される。組み換えＨＣＭＶベクターを含有する免疫原性組成物は、免疫学的応答を誘発する。応答は、必要ではないが、防御的であり得る。ワクチン組成物は、免疫学的記憶の発達を一般に伴う防御応答を誘発する。

また、対象に免疫学的応答を誘導する方法も開示される。そのような方法は、開示された組み換えＨＣＭＶベクターと、医薬的に許容可能な担体または希釈剤とを含む免疫原性またはワクチン組成物を対象に投与するステップを備える。本明細書において、「対象」はすべての動物およびヒトを含む。

免疫原性またはワクチン組成物は、非経口経路（皮内、筋肉内、または皮下）で投与できる。他の投与は、例えば口腔、経皮、性器などの粘膜経路によるものであり得る。

免疫原性またはワクチン組成物は、医薬分野の当業者に周知の標準の技術に従って処方し、投与することができる。組成物は単独で投与できるか、あるいは他のＨＣＭＶベクター、または他の免疫原性組成物、ワクチン組成物もしくは治療組成物と共に同時投与または連続投与できる。

そのような組成物の例としては、注射剤投与、例えば、非経口投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与もしくは静脈内投与のための調製物などの液体調製物（無菌の懸濁液またはエマルジョンなど）が挙げられる。そのような組成物において、ＨＣＭＶベクターは、滅菌水、生理食塩水、グルコースまたは同種のものなどの適した担体、希釈剤、または賦形剤と混合される。

免疫原性またはワクチン組成物は、アジュバントを含有し得る。ミョウバン（リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）が典型的なアジュバントである。サポニンおよびその精製した成分Ｑｕｉｌ Ａ、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバントおよび他のアジュバントが、研究および獣医学用途にたびたび使用される。

組成物の性質によって、発現産物および他の因子の性質によって決定した投与の有効な投薬量および経路での注射剤投与または他の投与のための単一の剤形に、組成物をパッケージできる。開示されたＨＣＭＶベクターの投薬量はプラーク形成単位（ｐｆｕ）で表すことができ、１０^２ｐｆｕ超、１０^３ｐｆｕ超、１０^４ｐｆｕ超、１０^５ｐｆｕ超、１０^６ｐｆｕ超、または１０^７ｐｆｕ超の投薬量を含む。

以下の実施例は開示された方法を説明するためのものである。この開示に照らして、当業者は、これらの例のバリエーションおよび開示された方法の他の例が過度な実験なしで可能であることを認識するだろう。

（実施例１ ＨＣＭＶ−ＴＲ３ベクタープラットフォーム）
エフェクターメモリーＴ細胞誘導ＣＭＶベクターの臨床用途は、遺伝的に安定であり、持続的な感染を維持するが、ＨＣＭＶが病原性であり得る免疫不全の対象に伝播する能力を欠くベクターを必要とする。臨床試験に入ったＨＣＭＶバリアントのための以前の弱毒化戦略は、線維芽細胞におけるウイルスの連続的な継代（Ｐｌｏｔｋｉｎ ＳＡ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １３４，４７０−４７５（１９７６）；参照により本明細書に組み込まれる）、非弱毒化ＨＣＭＶ株で弱毒化した組み換え（上記のＨｅｉｎｅｍａｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．２００６）または複製欠損性組み換えベクターの生成（国際公開第２０１３／０３６４６５号；参照により本明細書に組み込まれる）に依存するものであった。しかしながら、生じたウイルスは、病原性を保持していたか、または以前にＣＭＶに自然感染した対象における潜伏感染または二次感染を確立する能力などの有益な特徴を失った。

本明細書では、これらの制限を克服するＨＣＭＶベクタープラットフォームであるＨＣＭＶ−ＴＲ３が開示される。ＨＣＭＶ ＴＲ３は、分子クローンＨＣＭＶ−ＴＲ（Ｍｕｒｐｈｙ Ｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００ １４９７６−１４９８１（２００３）；参照により本明細書に組み込まれる）の改変したバージョンである。ＨＣＭＶ ＴＲは、生体内の潜伏および持続の確立において他のＨＣＭＶ株より優れている。また、ＨＣＭＶ−ＴＲは、多数の継代によるＨＣＭＶの典型的な線維芽細胞適応を示さないことから、生体外でＨＣＭＶの他の臨床分離株より優れている。ＴＲ３は、ガンシクロビル感受性となり、以前に感染した対象を再感染させることができ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）システムからのＣＭＶベクターの回収を促進するように変えられた。

具体的に、ＴＲ３からＵＬ８２遺伝子（ｐｐ７１タンパク質をコードする）を欠失させると、伝播欠損性（すなわち、細胞間の伝播が欠損した）ベクターが生じる。しかしながら、以前に、ｐｐ７１発現を欠くウイルスは、生体外での増殖のために補完を要することが示された（Ｂｒｅｓｎａｈａｎ，Ｗ．Ａ．，ａｎｄ Ｔ．Ｅ．Ｓｈｅｎｋ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７：１４５０６−１１（２０００）；参照により本明細書に組み込まれる）。ＵＬ８２ウイルス粒子タンパク質は、ヒトサイトメガロウイルスに感染した細胞における前初期ウイルス遺伝子の発現を活性化し、ウイルスが活性なｐｐ７１を有する野生型に戻るリスクをもたらす。結果として、ｐｐ７１を欠くＨＣＭＶベクターを増殖する新しい方法を開発し、以下に詳細に説明する。

非ヒト霊長類モデルは、ｐｐ７１を欠失したＨＣＭＶ−ＴＲ３がエフェクターメモリーＴ細胞応答を誘導し、維持する能力を維持する一方で、線維芽細胞による継代から通常生じるウイルス適応を再現するＨＣＭＶ−ＴＲ３の指向性を欠損したバージョンは維持しないことをさらに実証する。

さらに、ｐｐ７１を欠失したＨＣＭＶ−ＴＲ３ベクターは潜伏感染を維持するが、ヒト化マウスにて再活性化する能力を欠く。

さらに、異種抗原を挿入し、発現するのに使用できる内部の発現部位が開示される。これらは、多数の異種抗原を含むＨＣＭＶベクターを生産するのに使用できる。

（実施例２ ＨＣＭＶ−ＴＲは、潜伏感染の確立において他のＨＣＭＶ株より優れている）
ＨＣＭＶの潜伏および再活性化の研究を可能にするヒト化マウスモデルがＳｍｉｔｈ ＭＳ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ ８，２８４−２９１（２０１０）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。このモデルを使用して、ＨＣＭＶ−ＴＲが、持続的な感染の確立において他のＨＣＭＶ株（ＡＤ１６９、Ｔｏｌｅｄｏ）より優れていることを実証する。エフェクターメモリーＴ細胞の誘導にとって、持続的な感染が重要である。持続的な感染を生じる能力は、ＵＬ１２８−１５０領域から独立しており、該領域は、ＨＣＭＶワクチンの臨床試験に以前に使用されたすべての株を含む多くのＨＣＭＶ株（ＡＤ１６９、ＴｏｗｎｅおよびＴｏｌｅｄｏ）において変異している。ＡＤ１６９株におけるＵＬ１３１Ａの修復は、潜伏を確立する能力を回復しないが、ＵＬ１２８−１５０を欠くＨＣＭＶ−ＴＲΔ４株は潜伏を確立する能力を維持する（図１Ｂ）。これらの以前の臨床試験は、異種抗原を含むＨＣＭＶを伴わなかったことに留意すべきである。これらの株の遺伝子地図を図１Ａに示す。

（実施例３ ＨＣＭＶ−ＴＲ３は、ガンシクロビルに対し感受性であり、ＵＳ２−７領域を含む一方で、オリジナルのＨＣＭＶ−ＴＲはそうではない）
ＨＣＭＶ ＴＲを、抗ウイルス薬ガンシクロビルに対して抵抗性であるウイルス分離株からのＢＡＣ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇによってクローン化した（Ｓｍｉｔｈ ＩＬ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １７６，６９−７７（１９９７）；参照により本明細書に組み込まれる）。ガンシクロビルによる処理が、ＨＣＭＶ系ベクターによって引き起こされるＣＭＶ関連疾患の場合には重要であることから、ガンシクロビル抵抗性はＨＣＭＶベクターにおいて望ましい形質ではない。ガンシクロビル抵抗性の確認を図３に示す。

無傷のＵＬ９７遺伝子をＨＣＭＶ ＴＲに挿入して（図２）ガンシクロビル感受性ベクターを生成した。ＨＣＭＶ−ＴＲの分子のクローンをさらに修飾した。ＨＣＭＶ ＴＲのオリジナルのクローニング中のＢＡＣカセットの挿入の結果、ＵＳ２−７領域の欠失がもたらされた（上記のＭｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．２００３）。ＵＳ２−７が、ＣＭＶ陽性個体の再感染に必須である領域であると後で決定された（Ｈａｎｓｅｎ ＳＧ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２８，１０２−１０６（２０１０）；参照により本明細書に組み込まれる）。ＨＣＭＶ株ＡＤ１６９のＵＳ２−７領域を挿入してＢＡＣカセットを改変したＨＣＭＶ−ＴＲの改変バージョンを生成した。オリジナルのＨＣＭＶ ＴＲクローンにおいて、ウイルスを線維芽細胞の形質移入によって再構成した際にＢＡＣカセットが除去できなかったことから（Ｌａｕｒｏｎ Ｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８８，４０３−４１６（２０１４）；参照により本明細書に組み込まれる）、この改変を行った。それ故に、ＨＣＭＶ−ＴＲ３は、全ゲノム配列決定によって示されるように（図２）、ウイルス再構成により、ＡＤ１６９のＵＳ２−７領域とｌｏｘＰ部位もＵＳ７とＵＳ８との間に含む。

（実施例４ ＨＣＭＶ−ＴＲ３は、線維芽細胞を介した多数の継代の際に優れたゲノム安定性を示す）
線維芽細胞におけるＨＣＭＶの継代は、ＵＬ１２８−１３１Ａ領域（Ｄａｒｇａｎ ＤＪ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ９１，１５３５−１５４６（２０１０）；参照により本明細書に組み込まれる）およびＲＬ１３遺伝子（Ｓｔａｎｔｏｎ ＲＪ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２０，３１９１−２０８；（２０１０）；参照により本明細書に組み込まれる）における有害な（すなわち、不活性化）変異を有するベクターの優先的な選択をもたらす。しかしながら、線維芽細胞を介した継代はワクチンを生産する際に最も高いウイルス収量をもたらす。図４Ａは、驚くべきことに、ＨＣＭＶ−ＴＲ３のゲノムが、線維芽細胞において２０継代後でも安定したままであることを示す。

（実施例５ ＵＬ１２８−１３１Ａの存在は、ＨＣＭＶの他の株と異なり、無細胞ＨＣＭＶ−ＴＲ３の収量を減少させない）
ワクチン製造のために、細胞ペレットよりもむしろ細胞上清が、ワクチンベクターを単離するのに好まれる。多くのＨＣＭＶ株では、線維芽細胞からの無細胞ウイルスの収量が、遺伝子ＵＬ１３１Ａ、ＵＬ１３０およびＵＬ１２８が無傷である場合に大幅に減少する（Ｗａｎｇ Ｄ ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ Ｔ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９，１０３３０−１０３３８（２００５）；参照により本明細書に組み込まれる）。驚くべきことに、ＵＬ１３１Ａ−１２８の除去は、ＨＣＭＶ−ＴＲ３での無細胞と細胞結合ウイルスとの比率に影響を与えない（図５）。

（実施例６ ＨＣＭＶ−ＴＲ３は、サルにおいてエフェクターメモリーＴ細胞を誘導する一方で、ＵＬ１２８−１３１領域を欠くＨＣＭＶ変異体はそのようにできない。）
ＳＩＶのＧａｇ抗原を発現するＨＣＭＶ−ＴＲ３は、非ヒト霊長類においてＧａｇに対するエフェクターメモリーＴ細胞応答を誘導できる（ＮＨＰ；図６Ａ）。重要なことに、このエフェクターメモリーＴ細胞応答は長い間維持される（図１１）。これに対して、生体外での連続的な継代によって弱毒化したＨＣＭＶ株において頻繁に変異される遺伝子領域である、遺伝子ＵＬ１２８−１３１を欠くＨＣＭＶ−ＴＲ３はそのようにできない（図６Ｂ）。また、これは、非ヒト霊長類モデルにおいて異種抗原に対する免疫応答を誘導するＨＣＭＶベクターの最初の既知の実証である。さらに、このゲノム領域の欠失は、ＵＬ１２８およびＵＬ１３０を欠くウイルスが、親ベクターと類似の、生体内での異種抗原に対する免疫応答を誘発できることを実証した（図１２）。したがって、ＵＬ１３１ＡがＨＣＭＶによる感染に必須であると結論づけた。

（実施例７ ＤＡＸＸのｓｉＲＮＡを用いる、補完されず、ｐｐ７１を欠失したＨＣＭＶ−ＴＲ３の生成。補完またはＦＫＢＰの融合なしで、弱毒化したウイルスを増殖させる方法）
必須遺伝子、または生体外での最適な複製に必要とされる遺伝子を欠くＨＣＭＶの製造のための主な制限は、補完、すなわち、産生細胞株における欠失した遺伝子の外来発現の必要性である。産生細胞株は、特にＧＭＰワクチン製造との関連で、製造および維持が困難であることが周知である。

補完に使用される１つのアプローチは、分解ドメイン（ＦＫＢＰなど）に必須遺伝子を融合することであり、戦略は国際公開第２０１３／０３６４６５号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。ＦＫＢＰ融合は、生体内で複製欠損した非持続的なワクチンの製造に有用である可能性があるが、本明細書に記載した変異ＨＣＭＶの場合、分解ドメインが変異し、その結果弱毒化を失い、ＨＣＭＶが宿主間で伝播できるようになるリスクがある。

本明細書では、例えばｓｉＲＮＡを用いた抗ウイルス宿主細胞因子の発現抑制を伴うアプローチが開示される。その結果、変異ＨＣＭＶが、生体内で弱毒化したままであっても、生体外で増殖できることから、細胞株は補完を必要としない。この方法の例を図７Ａに図示する。上記の通り、リン酸化タンパク質７１（ｐｐ７１）をコードするＵＬ８２遺伝子を欠くＨＣＭＶ−ＴＲ３は、線維芽細胞で増殖できない。しかしながら、抗ウイルスタンパク質ＤＡＸＸの発現を、線維芽細胞にて発現したｓｉＲＮＡによって停止させた場合、ＨＣＭＶ−ＴＲ３ΔＵＬ８２は、高い収量で増殖できる（図７Ｂおよび図１３）。

（実施例８ ＵＬ８２（ｐｐ７１）を欠くＨＣＭＶ−ＴＲ３は、生体内での持続を維持するが、潜伏から再活性化する能力が欠如している）
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）は、時間的発現ウイルス遺伝子によって制御された宿主細胞における潜伏感染を確立する。ＨＣＭＶ ｐｐ７１は、細胞のタンパク質Ｄａｘｘ（デスドメイン関連タンパク質）の宿主固有の免疫分解に対抗する外被タンパク質である（Ｐｅｎｋｅｒｔ，ＲＲ，およびＲＦ Ｋａｌｅｊｔａ，Ｆｕｔｕｒｅ Ｖｉｒｏｌ ７，８５５−８６９（２０１２）；参照により本明細書に組み込まれる）。ｐｐ７１によるＤａｘｘの分解は、最適な前初期遺伝子発現および溶解性複製にとって必要である。生体外でのデータは、感染した細胞の細胞質においてｐｐ７１を隔離することによって、ＨＣＭＶが、潜伏の確立の間にｐｐ７１が媒介するＤａｘｘの分解を妨げることを示唆する。しかしながら、ＨＣＭＶの持続、潜伏の維持および再活性化におけるｐｐ７１の生体内の役割は未知のままである。免疫欠損マウス（ＨＵ−ＮＳＧ）に移植したヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）のＨＣＭＶ感染が、Ｇ−ＣＳＦ処理の後に再活性化できるウイルス潜伏をもたらすことを以前に示した。このモデルは重要であるが、ＨＵ ＮＳＧマウスは成熟ヒトＴ細胞を欠く。これに対して、ヒト胎児肝臓および胸腺と共にＨＳＣを移植したＮＳＧマウス（ＢＬＴマウス）が、成熟ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞を含む機能的ヒト免疫系に必要なすべてのヒト造血細胞系譜を発達させる。この新しいヒト化マウスモデルでは、ＨＣＭＶが、ＨＵ−ＮＳＧマウスと類似して、潜伏および再活性化を確立することが実証された。また、潜在的に感染したマウスは、ヒトＩｇＧに加えてＨＣＭＶ特異的Ｔ細胞応答を生じる。重要なことに、条件的に発現するｐｐ７１（ＴＲ ＵＬ８２−ＦＫＢＰ）またはｐｐ７１ノックアウト（ＴＲ（Δ）ＵＬ８２）へのＢＬＴマウスの感染は、感染の確立をもたらしたが、再活性化しなかった。これらのデータは、ｐｐ７１がＨＣＭＶの再活性化に重要な役割を果たし、そのような複製欠損ウイルスがＴ細胞応答を生じることができることを示す。生体外での複製能力は、図１Ｂに示すように、ウイルスが潜伏を確立できるかどうかの良い予測因子ではない。例えば、に図１Ｂに示すように、ＡＤ１６９は、生体外では良好に複製するが、潜伏を確立できない。しかしながら、ＤＡＸＸのｓｉＲＮＡを発現するＭＲＣ−５細胞で増殖させたＨＣＭＶ−ＴＲ３ΔＵＬ８２はヒト化マウスにて潜伏を確立するが、再活性化しないか、または広がらない（図８）。類似の結果が、ＨＣＭＶ−ＴＲ３ΔＵＬ８２およびＨＣＭＶ−ＴＲ３ΔＵＬ８２ΔＵＬ１２８−１３０のＮＳＧマウスにて得られた（図１４）。

（実施例９ ｐｐ７１を欠失したＨＩＶｇａｇ発現ＨＣＭＶ−ＴＲ３は、ＨＩＶｇａｇ特異的エフェクターメモリーＴ細胞を生体内で誘導する能力を維持する）
大きなゲノムにより、ＨＣＭＶは、多数の異種抗原をウイルスベクター内へ挿入する機会を与える。ＨＣＭＶによる多数の異種抗原の発現は、ベクター機能へ影響を与えることなく、外来配列の挿入に使用できる内在性遺伝子の同定を必要とする。以前に、トランスポゾン分析は、生体外でのＨＣＭＶゲノムにおけるすべての非必須遺伝子を特定した（Ｙｕ Ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００，１２３９６−１２４０１（２００３）；参照により本明細書に組み込まれる。

しかしながら、これは、生体外での非必須遺伝子が生体内で必須でないか、さらに、置換した遺伝子のプロモーターによって異種抗原の発現を駆動した際に、異種抗原をコードする遺伝子でのウイルス遺伝子の置換が免疫応答を誘導するか否かの予測をもたらすものではない。図９および図１５は、ＨＩＶｇａｇでのＵＬ８２（ｐｐ７１）の置換がエフェクターメモリータイプＴ細胞免疫応答を生体内で誘発し、維持することを示す。

異種抗原での置換の追加の部位としては、ＨＣＭＶのＵＬ７、ＵＬ７８およびＵＳ１３が挙げられる。抗原（ＳＩＶｅｎｖ）でのｐｐ７１−ＯＲＦの置換が既にあるベクターにて、これらをそれぞれ異種抗原（ＳＩＶｐｏｌ）で置換した際、毎回免疫応答が生じた。結果を図１０Ａに要約する。図１０Ｂは、ＨＣＭＶにおけるＨＩＶｇａｇでのＵＬ７、ＵＬ４５およびＵＬ７８の置換が、生体外でのＨＩＶｇａｇ発現をもたらすことを示す。

（実施例１０ 条件的補完の下での増殖および生産によるｐｐ７１を欠失したＨＣＭＶ−ＴＲ３の安定性）
以前の研究は、線維芽細胞で増殖させた際に、ＨＣＭＶの臨床分離株が、生体外で迅速な適応を起こすことを実証した。特に、ＲＬ１３における未成熟停止コドンと１つ以上の５量体の複合体タンパク質（ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａ）の発現の喪失をもたらすフレームシフト変異が、組織培養における低い継代数でも生じ得る（Ｓｔａｎｔｏｎ ＲＪ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２０（９），３１９１−３２０８（２０１０）；参照により本明細書に組み込まれる）。ＢＡＣにおける完全なヒトサイトメガロウイルスゲノムの再構築によって、ＲＬ１３が複製の強力な阻害剤（Ｉｄ．）であることが明らかになる。結果として、臨床試験に以前に使用されたすべてのＨＣＭＶ株（ＡＤ１６９、Ｔｏｗｎｅ、Ｔｏｌｅｄｏ）が、多数の再構成および欠失を示す（Ｍｕｒｐｈｙ，ＥＤ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（２５），１４９７６−１４９８１（２００３）；参照により本明細書に組み込まれる）。これらの線維芽細胞適応は、ＡＤ１６９で見られたように、ＵＬ１３１Ａの欠失をもたらす可能性があり、それ故に、ウイルスが生体内で感染しなくなる可能性がある。ＤＡＸＸのｓｉＲＮＡで処理した線維芽細胞で増殖した、ＵＬ８２を欠失したＨＣＭＶ−ＴＲ３／ＨＩＶｇａｇが、同様に多数の継代により不安定性を示すか決定するために、次世代配列決定（ＮＧＳ）によってウイルスゲノムを分析した。

具体的に、線維芽細胞内への導入前に組み換え細菌人工染色体ＤＮＡを配列決定し、線維芽細胞における再構成の時点で、継代数５代および継代数９代でウイルスＤＮＡを単離した。２０％スクロースクッションによるウイルス精製後、感染したヒト線維芽細胞の上清から、Ｈｉｒｔ抽出（Ｈｉｒｔ Ｂ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２６（２）：３６５−３６９（１９６７）；参照により本明細書に組み込まれる）によって、ゲノムＤＮＡを単離した。ＴｒｕＳｅｑ ＤＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて、ＤＮＡライブラリーを生成し、既知のプライマー結合部位を有するアダプターをＤＮＡ断片の各末端に連結した。未知のＤＮＡの各末端上の１５０ｂｐを分析するペアードエンド配列決定を、ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔｓ ｖ２を３００サイクルの間使用するＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ＮＧＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで実施した。得られた配列読み取りデータをＧｅｎｅｉｏｕｓ８．１．４に取り込み、最も低い起こり得るエラー確率限界０．００１で整えた。これは、より高いエラー確率０．１％の塩基対すべてを削除することを意味する。デノボ配列アセンブリを、２５０．０００〜１．０００．０００の読み取りデータで実施して、不偏な様式でＤＮＡ配列を決定した。予測した配列と比較すると、主な挿入、欠失またはゲノム再配列は見られなかった。次に、すべての読み取りデータのリファレンスガイドアセンブリ（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ−ｇｕｉｄｅｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ）を、十分かつ正しい大多数の配列を決定するための基準としてデノボ配列を用いて実施した。平均最小被覆度は＞１５０倍であった。

図１６は、得られた配列のアラインメントを示す。自己切除ＢＡＣカセットにおいてコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、白矢印で示し、ウイルスＯＲＦは灰色矢印で示した。黄色矢印は、ＵＬ８２ ＯＲＦに代わるＨＩＶｇａｇ ＯＲＦを示す。灰色楕円形は、内部および末端の反復を示す。非翻訳領域は、黒色の棒として示した翻訳領域に割り込むものとして示される。予想した通り、ＢＡＣカセットは、組織培養におけるウイルス再構成の時点で切除された。しかしながら、大多数の配列におけるすべての他のヌクレオチドが、予測した配列（コンセンサス）と同一であった。重要なことに、９回の継代を通じて、ＯＲＦにおいていずれのアミノ酸の変化も見られなかった。これは、ＵＬ１２８−１３１Ａ遺伝子、ＲＬ１３に加えてＡＤ１６９由来遺伝子ＵＬ９７およびＵＳ２−７をコードするＯＲＦを含む。これらの観察結果は、ＤＡＸＸｓｉＲＮＡの存在下で線維芽細胞における多数の継代にもかかわらず、ＵＬ８２を削除したＨＣＭＶ−ＴＲ３の驚くべき安定性を示唆する。

重要なことに、ＵＬ８２プロモーターによって発現するＨＩＶｇａｇをコードするＯＲＦに変化がなかった。これは、ＵＬ８２（ｐｐ７１）を欠失したＨＣＭＶ−ＴＲ３の再構成後に、継代数５代、６代および７代にて、ＨＩＶｇａｇ挿入のイムノブロットおよびサンガー配列決定によって独立に確認した。図１７Ａは、示したウイルスに感染した線維芽細胞からの可溶化液のイムノブロットを示す。可溶化液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ナイロン膜上へ転写し、ｐｐ７１、ＨＩＶｇａｇ（ｐ２４）およびウイルスタンパク質ｐｐ２８および細胞のタンパク質アクチンに特異的な抗体と反応させた。予想した通り、ｐｐ７１は親のＴＲ３ウイルスに存在したが、ＨＩＶｇａｇでのＵＬ８２の置換により、ＨＩＶｇａｇを発現するベクターに存在しなかった。重要なことに、ＨＩＶｇａｇは、それぞれの継代の時点で安定して発現した。図１７Ｂは、ＨＩＶｇａｇ遺伝子にまたがるＰＣＲ断片の配列分析に基づき、示した継代数のウイルスＤＮＡから得られたアラインメントを示す。ヌクレオチドの変化は見られなかった。

内在性ＵＬ８２プロモーターによって発現したＨＩＶｇａｇの驚くべき安定した発現に対して、異種プロモーターによる異種抗原の発現は、多数の継代により日常的に不安定である。例えば、ＲｈＣＭＶ６８−１．２ベクターにおける異種ＥＦ１αプロモーターによって発現したＳＩＶｇａｇは、点変異による翻訳領域の未成熟破壊を示した。図１８は、ＥＦ１αプロモーターを用いてＳＩＶｇａｇを発現するＲｈＣＭＶ６８−１．２のクローンに由来する、ＵＬ３６を欠失したＲｈＣＭＶベクターの次世代配列決定分析からのリファレンス配列と比較した、単一のヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の頻度を示す。ゲノムの約３８％が、ＳＩＶｇａｇ配列における未成熟停止コドンを明らかに示した。

Claims (51)

1. （１）少なくとも１種の異種抗原と；
   （２）ＵＬ８２遺伝子における不活性化変異と；
   （３）活性なＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ６、ＵＳ７およびＵＬ１３１Ａ遺伝子と；
   を含み、
   組み換えヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＴＲ株に由来し；
   ガンシクロビル感受性であることを特徴とする組み換えＨＣＭＶ。
2. 活性なＵＬ９７遺伝子をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の組み換えＨＣＭＶ。
3. 活性なＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ６およびＵＳ７遺伝子は、ＨＣＭＶのＡＤ１６９株に由来することを特徴とする請求項１または２に記載の組み換えＨＣＭＶ。
4. 少なくとも１種の異種抗原の発現が、ＵＬ８２プロモーター、ＵＬ７プロモーター、ＵＬ４５プロモーター、ＵＬ７８プロモーターまたはＵＳ１３プロモーターによって駆動されることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の組み換えＨＣＭＶ。
5. ＵＬ８２遺伝子における不活性化変異がＵＬ８２遺伝子のすべてまたは一部の欠失であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の組み換えＨＣＭＶ。
6. ＵＬ８２遺伝子のすべてまたは一部が少なくとも１種の異種抗原に置き換えられていることを特徴とする請求項５に記載の組み換えＨＣＭＶ。
7. ＵＬ８２遺伝子のすべてまたは一部に代わる少なくとも１種の異種抗原の発現がＵＬ８２プロモーターによって駆動されることを特徴とする請求項６に記載の組み換えＨＣＭＶ。
8. ＵＬ７、ＵＬ３８、ＵＬ４５およびＵＳ１３からなる群より選択されるＨＣＭＶ遺伝子における不活性化変異をさらに含むことを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の組み換えＨＣＭＶ。
9. ＵＬ７遺伝子における不活性化変異がＵＬ７遺伝子のすべてまたは一部の欠失であることを特徴とする請求項８に記載の組み換えＨＣＭＶ。
10. ＵＬ７遺伝子のすべてまたは一部が少なくとも１種の異種抗原に置き換えられていることを特徴とする請求項９に記載の組み換えＨＣＭＶ。
11. ＵＬ７遺伝子のすべてまたは一部に代わる少なくとも１種の異種抗原の発現がＵＬ７プロモーターによって駆動されることを特徴とする請求項１０に記載の組み換えＨＣＭＶ。
12. ＵＬ３８遺伝子における不活性化変異がＵＬ３８遺伝子のすべてまたは一部の欠失であることを特徴とする請求項８に記載の組み換えＨＣＭＶ。
13. ＵＬ３８遺伝子のすべてまたは一部が少なくとも１種の異種抗原に置き換えられていることを特徴とする請求項１２に記載の組み換えＨＣＭＶ。
14. ＵＬ３８遺伝子のすべてまたは一部に代わる少なくとも１種の異種抗原の発現がＵＬ３８プロモーターによって駆動されることを特徴とする請求項１３に記載の組み換えＨＣＭＶ。
15. ＵＬ４５遺伝子における不活性化変異がＵＬ４５遺伝子のすべてまたは一部の欠失であることを特徴とする請求項８に記載の組み換えＨＣＭＶ。
16. ＵＬ４５遺伝子のすべてまたは一部が少なくとも１種の異種抗原に置き換えられていることを特徴とする請求項１５に記載の組み換えＨＣＭＶ。
17. ＵＬ４５遺伝子のすべてまたは一部に代わる少なくとも１種の異種抗原の発現がＵＬ４５プロモーターによって駆動されることを特徴とする請求項１６に記載の組み換えＨＣＭＶ。
18. ＵＳ１３遺伝子における不活性化変異がＵＳ１３遺伝子のすべてまたは一部の欠失であることを特徴とする請求項８に記載の組み換えＨＣＭＶ。
19. ＵＳ１３遺伝子のすべてまたは一部が少なくとも１種の異種抗原に置き換えられていることを特徴とする請求項１８に記載の組み換えＨＣＭＶ。
20. ＵＳ１３遺伝子のすべてまたは一部に代わる少なくとも１種の異種抗原の発現がＵＳ１３プロモーターによって駆動されることを特徴とする請求項１９に記載の組み換えＨＣＭＶ。
21. ＵＬ１２８遺伝子またはＵＬ１３０遺伝子における不活性化変異を含むことを特徴とする請求項１乃至２０のいずれか１項に記載の組み換えＨＣＭＶ。
22. ＵＬ１２８遺伝子およびＵＬ１３０遺伝子における不活性化変異を含むことを特徴とする請求項２１に記載の組み換えＨＣＭＶ。
23. 少なくとも１種の異種抗原が病原体特異的抗原または腫瘍抗原であることを特徴とする請求項１乃至２２のいずれか１項に記載の組み換えＨＣＭＶ。
24. 組み換えＨＣＭＶゲノムをコードする核酸配列および少なくとも１種の異種抗原が、線維芽細胞を介した多数の継代にて安定であることを特徴とする請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の組み換えＨＣＭＶ。
25. 第２の異種抗原をさらに含むことを特徴とする請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の組み換えＨＣＭＶ。
26. ＵＬ８２遺伝子のすべてまたは一部が第１の異種抗原に置換されており、ＵＬ７、ＵＬ４５、ＵＬ７８およびＵＳ１３からなる群より選択されるＨＣＭＶ遺伝子のすべてまたは一部が第２の異種抗原に置換されていることを特徴とする請求項２５に記載の組み換えＨＣＭＶ。
27. 第１の異種抗原の発現がＵＬ８２プロモーターによって駆動され、第２の異種抗原の発現がＵＬ７プロモーター、ＵＬ４５プロモーター、ＵＬ７８プロモーターまたはＵＳ１３プロモーターによって駆動されることを特徴とする請求項２６に記載の組み換えＨＣＭＶ。
28. 第１の異種抗原が病原体特異的抗原または腫瘍抗原であることを特徴とする請求項２５乃至２７のいずれか１項に記載の組み換えＨＣＭＶ。
29. 第２の異種抗原が、第１の異種抗原と異なる病原体特異的抗原または腫瘍抗原であることを特徴とする請求項２８に記載の組み換えＨＣＭＶ。
30. 組み換えＨＣＭＶゲノムと、第１および第２の異種抗原をコードする核酸配列が、線維芽細胞を介した多数の継代時に安定であることを特徴とする請求項２５乃至２９のいずれか１項に記載の組み換えＨＣＭＶ。
31. 請求項１乃至２４のいずれか１項に記載の組み換えＨＣＭＶと、医薬的に許容可能な担体と、を含む免疫原性組成物。
32. 対象において免疫応答を誘導する方法であって、
    有効量の請求項３１に記載の免疫原性組成物を対象に投与するステップを備えることを特徴とする方法。
33. 組み換えＨＣＭＶの投与が、少なくとも１種の異種抗原に対する長期のエフェクターメモリーＴ細胞応答を誘導し、維持することを特徴とする請求項３２に記載の方法。
34. 請求項２５乃至３０のいずれか１項に記載の組み換えＨＣＭＶと、医薬的に許容可能な担体と、を含む免疫原性組成物。
35. 対象において免疫応答を誘導する方法であって、
    有効量の請求項３４に記載の免疫原性組成物を対象に投与するステップを備えることを特徴とする方法。
36. 組み換えＨＣＭＶの投与が、第１および第２の異種抗原に対する長期のエフェクターメモリーＴ細胞応答を誘導し、維持することを特徴とする請求項３５に記載の方法。
37. 請求項１乃至３０に記載の組み換えＨＣＭＶをコードする単離したポリヌクレオチド。
38. 配列番号１と少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むことを特徴とする請求項３７に記載の単離したポリヌクレオチド。
39. 請求項３７または３８に記載の単離したポリヌクレオチドを含む単離した細胞。
40. ＤＡＸＸ遺伝子の発現を停止させるｓｉＲＮＡをさらに含むことを特徴とする請求項３９に記載の単離した細胞。
41. ＤＡＸＸのｓｉＲＮＡが、配列番号２と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるセンス鎖と、配列番号３と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアンチセンス鎖とを含むことを特徴とする請求項４０に記載の単離した細胞。
42. 哺乳類細胞であることを特徴とする請求項３９乃至４１のいずれか１項に記載の単離した細胞。
43. ヒト細胞であることを特徴とする請求項４２に記載の単離した細胞。
44. 線維芽細胞であることを特徴とする請求項３９乃至４３のいずれか１項に記載の単離した細胞。
45. ｐｐ７１欠損ＨＣＭＶを製造する方法であって、
    （１）ＤＡＸＸの発現を停止させるｓｉＲＮＡを含む細胞をｐｐ７１欠損ＨＣＭＶに感染させるステップと；
    （２）細胞をインキュベートするステップと；
    （３）ｐｐ７１欠損ＨＣＭＶを回収するステップと、を備えることを特徴とする方法。
46. ｐｐ７１欠損ＨＣＭＶがＵＬ８２遺伝子における不活性化変異を有することを特徴とする請求項４５に記載の方法。
47. ＵＬ８２遺伝子における不活性化変異がＵＬ８２遺伝子のすべてまたは一部の欠失であることを特徴とする請求項４６に記載の方法。
48. ＤＡＸＸのｓｉＲＮＡが、配列番号２と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるセンス鎖と、配列番号３と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアンチセンス鎖と、を含むことを特徴とする請求項４５乃至４７のいずれか１項に記載の方法。
49. 細胞が哺乳類細胞であることを特徴とする請求項４５乃至４８のいずれか１項に記載の方法。
50. 細胞がヒト細胞であることを特徴とする請求項４９に記載の方法。
51. 細胞が線維芽細胞であることを特徴とする請求項４５乃至５０のいずれか１項に記載の方法。