DE10232322A1

DE10232322A1 - Viral kodierte CxC determinieren den Gewebetropismus von HCMV

Info

Publication number: DE10232322A1
Application number: DE10232322A
Authority: DE
Inventors: Gabriele Hahn
Original assignee: Individual
Current assignee: Hahn Gabriele Dr 20249 Hamburg De
Priority date: 2002-07-16
Filing date: 2002-07-16
Publication date: 2004-07-29
Also published as: US20040110188A1

Abstract

In der Patentanmeldung PCT/EP02/01867 wurde die Klonierung eines leukotropen und endothelzelltropen klinischen Isolates des humanen Cytomegalievirus (HCMV) als bakteriell artifizielles Chromosom (BAC) in E.coli beschrieben. Das entsprechende BAC wurde FIX-BAC benannt. Es wurden weiterhin durch Herstellung und phänotypische Testung von Virusmutanten die genetischen Determinanten von Endothelzell Tropismus und Leukozyten Tropismus auf die genetische Region UL132-UL128 eingeengt. 5' und 3' RACE Analysen haben neue Transkripte entschlüsselt, welche gespleisst sind und durch die Region UL131-128 laufen. Die gegenwärtige Patentanmeldung hat den Schwerpunkt auf einer genaueren Analyse der bereits in der PCT/EP02/01867 beschriebenen Transkripte. Die Translation der Transkripte ergibt neue viral kodierte CxC und CC Chemokine, die eine wesentliche Rolle in der Pathogenese sowie im Gewebetropismus von HCMV spielen.

Description

Die genetischen Determinanten von Leukotropismus und Endothelzelltropismus wurden bereits in der Patentanmeldung PCT/EP02/01867 auf die Region UL132-128 eingeengt. In der gegenwärtigen Patentanmeldung wird die Region nocheinmal mit weiteren Virusmutanten untersucht (siehe Tabelle) und die Region UL131-128 konnte als diejenige Region bestätigt werden, welche den Tropismus für Leukozyten, Monozyten, Endothelzellen sowie potentiell auch andere Zellen und Gewebe genetisch determiniert. Die Herstellung der Virusmutanten in FIX-BAC E. coli DH10B erfolgte wie in Patentanmeldung PCT/EP02/01867 beschrieben durch homologe Rekombination eines linearen PCR Fragmentes in E. coli, wobei Recombinationsfunktionen des Bacteriophagen λ (red α, β, γ) auf einem Plasmid zur Verfügung gestellt werden.
Die folgenden Primer wurden verwendet, um eine Kan^R Kassette aus dem Plasmid pAYCY 177 (NEB Biolabs) zu amplifizieren.
5' und 3' RACE Analysen hatten wie in der Patentanmeldung PCT/EP02/01867 beschrieben zur Identifizierung bisher unbekannter viraler Transkripte geführt, welche durch die Region UL131 bis UL128 laufen mit einem ATG Startkodon in UL131 und einem Poly A Signal am Ende von UL128. Die jetzige Patentanmeldung umfasst eine genauere Charkterisierung und Translation dieser Transkripte. Wie in der zusammenfassenden 1 gezeigt, ergibt die Translation des RACE Klons 95-3 (2) sowie des RACE Klons 95-8 (3) ein CxC CC Motiv (rot markiert), welches charakteristisch ist für CxC Chemokine. Dem in der 1 rot gekennzeichneten CLC Motiv geht ein putatives Signalpeptid voraus. Ausserdem zeichnen sich beide als HCK-1 und HCK-2 bezeichneten viralen Chemokine durch eine Reihe von N-linked Gykolysierungsstellen (blau markiert) aus. Insbesondere existiert im Chemokin HCK-1 eine Asparagin-linked Gykolysierungsstelle. Das 129 Aminosäuren lange virale Chemokin HCK-1 entsteht dadurch, dass im RACE Klon 95-3 durch das Speissen von UL131 Exon 1 und Exon 2 ein Stopkodon am Ende von Exon 1 enfernt wird. Das virale Chemokin HCK-2 umfasst 79 Aminosäuren und entseht dadurch, dass im RACE Klon 95-8 UL131 ungespleisst vorliegt, wodurch das Stopcodon am Ende von UL131 das virale Chemokin trunkiert. Weiterhin wurde ein CC-Chemokin Motiv CC CC idetifiziert (4) welches für ein virales CC Chemokin kodiert. Dieses Chemokin, welches HCK-3 benannt wurde, umfasst 59 Aminosäuren und wird von dem RACE Klon 128 kodiert.
Es wurde ein weiteres Transkript identifiziert RACE Klon 95-11 (5), in welchem der Stretch von 7 x A (blaue Markierung in 1) in den RACE Klonen 95-3 und 95-8 zu einem Stretch von 9 x A geworden ist. Dieser Stretch von 9 x A zerstört das CxC Chemokin Motiv. Ausserdem liegt in diesem RACE Klon 95-11 auch ein weiterer Spleiss im Gen UL128 vor, der in den beiden anderen RACE Klonen 95-3 und 95-8 fehlt. Es ist zu vermuten, dass die neu identifizierten viralen Chemokine HCK-1, HCK-2 und HCK-3 das Trafficking von Leukozyten und Monozyten in HCMV infizierten Geweben, insbesondere zu Endothelzellen hin dominieren. Es wird vermutet, dass die trunkierte Form des CxC Chemokins HCK-2 ein lösliches Chemokin darstellen kann und somit geignet ist, Leukozyten zu HCMV infizierten Geweben zu dirigieren. Die längere Form des HCK-1 CxC Chemokines weist zahlreiche potentielle N-linked Glykosylierungsstellen auf sowie eine Asparaginlinked Glykosylierungsstelle. Es ist daher anzunehmen, dass HCK-1 ein membrangebundenes Chemokin darstellt, welches durch das Endoplasmatische Retikulum wandert. Dieses membrangebundene Chemokin könnte für die Mikrofusion von HCMV infizierten Endothelzell mit Leukozyten und Monozyten verantwortlich sein und somit ein wesentlicher Pathogenitätsfaktor für die Disseminierung von HCMV im infizierten Organismus darstellen. Es ist ebenfalls anzunehmen, dass durch das viral kodierte CC-Chemokin HCK-3 Monozyten, Makrophagen sowie Dendriten angelockt werden und infektiöses Virus über Mikrofusion (via HCK-1) auf diese Zellpopulation übertragen wird. Mit Hilfe von Virusmutanten (siehe Tabelle) konnte gezeigt werden, dass das humane Cytomegalievirus seinen Tropismus für Leukozyten, Monozyten und Endothelzellen verliert, wenn die genetische Region UL131-128, welche die viralen Chemokine HCK1-3 kodiert, entfernt wird. Damit stellt die genetische Region UL131-128 und die davon kodierten viralen Chemokine mit vollkommen neuartiger Struktur einen Hauptpathogenitätsmechanismus für die Infektion von HCMV dar. Für Drugdesign (small molecules, antisense RNA etc), antivirale Chemotherapie, Impfstoffentwicklung sowie Gentherapie von HCMV und anderen viralen Erkrankungen sowie Autoaggressionserkrankungen und Cancertheraphie sind die neu identifizierten viralen Chemokine von entscheidender Wichtigkeit. Da Viren und Wirt eine Koevolution zeigen ist anzunehmen, dass die neuartige Struktur dieser in der gegenwärtigen Patentanmeldung beschriebenen viralen Chemokine auch potenzielle Ähnlichkeit mit noch unbekannten Chemokinen im Menschen (sezerniert von Immunzellen des Menschen) haben könnte.
Interessanterweise konnte auch ein Transkript (RACE KLON 95-11) identifiziert werden, in dem durch die Elongation eines Stretches von 7 x A zu 9 x A das CxC Chemokinmotiv zerstört wird. Es könnte sich hierbei um einen neuen transkriptionellen Mechanismus von HCMV und Herpesviren handeln, um Gewebetropismus transkriptionell zu regulieren. Es ist möglich, dass in z. B. Fibroblasten vermehrt nur ein bestimmtes Transkript hergestllt wird (z. B. 95-11), während in Endothelzellen vermehrt diejenigen Transkripte hergestellt werden, welche virale Chemokine und Mikrofusionsfaktoren kodieren (95-3 und 95-8).
Anlagen:
1-5 und eine Tabelle.
Tabelle: Tropismus für Leukozyten und Endothelzellen von RVFIX und Virusmutanten.
RVFIX und Mutanten mit einer Deletion in UL127, UL148, UL131-128, UL132 oder UL133-148 wurden phänotypisch auf Verlust von Leukotropismus und Endothelzell Tropismus getestet. Die genetische Region UL131-128 konnte als die essentiell notwendige Region für beide Phänotypen Leukotropismus und Endothelzell Tropismus identifiziert werden.
1 Schematische Darstellung des Speissingmusters der neu identifizierten RACE Klone 95-3, 95-8 sowie 128 und Translation der Klone mit Darstellung der jeweils davon kodierten CxC oder CC Chemokine (rot) HCK-1, HCK-2 und HCK-3; dunkel blau: 7 x A stretch.
2 Genomischer Vergleich von FIX-BAC genomischer Sequenz mit dem RACE Klon 95-3 sowie Translation des von 95-3 kodierten viralen CxC Chemokines HCK-1. Rot: CxC Chemokin Motiv; blau: N-linked Glykosylierungsstellen; dunkel blau: 7 x A stretch.
3 Genomischer Vergleich von FIX-BAC genomischer Sequenz mit dem RACE Klon 95-8 sowie Translation des von 95-3 kodierten viralen CxC Chemokines HCK-2. Rot: CxC Chemokin Motiv; blau: N-linked Glykosylierungsstellen; dunkel blau: 7 x A stretch.
4 Genomischer Vergleich von FIX-BAC genomischer Sequenz mit dem RACE Klon 128 sowie Translation des von 95-3 kodierten viralen CC Chemokines HCK-3. Rot: CC Chemokin Motiv; hell blau: N-linked Glykosylierungsstellen.
5 Genomischer Vergleich von FIX-BAC genomischer Sequenz mit dem RACE Klon 95-11 sowie Translation des von 95-11 kodierten viralen Produktes. Rot: CxC Chemokin Motiv; dunkel blau: 9 x A stretch; pink Box: 2 x A.
SEQUENZPROTOLOLL

Claims

Studium der genetischen Region UL131-128, welche Leukotropismus, Monozytentropismus und Endothezelltropismus im humanen Cytomegalievirus (HCMV) bestimmt, in FIX-Bac und allen HCMV Labor- und Wildtyp-Stämmen sowie BAC klonierten HCMV Stämmen (TowL-BAC, HB5-BAC, TowS-BAC, TB40E-BAC, Phoebe-BAC, Powers-BAC, AD169-BAC).
Studium und Synthese der neu identifizierten viralen Transkripte in der genetischen Region UL131-128, welche ein differentiell gespleisstes Muster zeigen und für strukturell vollkommen neuartige virale CxC und CC Chemokine kodieren.
Studium und Synthese der neu identifizierten viralen Chemokine HCK-1, HCK-2 und HCK-3 sowie potentiell weiterer in der UL132-128 genetischen Region codierten viralen Chemokine und Mikrofusionsfaktoren, Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen HCK-1, HCK-2 und HCK-3, Herstellung von Chemotherapeutika und small molecules gegen HCK-1, HCK-2 und HCK-3.
Herstellung und Studium von Zelllinien, welche HCK-1, HCK-2 und HCK-3 exprimieren oder sezernieren.
Studium von Gewebetropismus und Pathogenität von HCMV mittels Virusmutanten, welche HCK-1, HCK-2 und HCK-3 oder die neu identifizierten Transkripte (RACE Klone95-3, 95,8, 95-11, 128) oder weitere noch unbekannte Transkripte in der Region von UL132-128 exprimieren.
Studium der transkriptionellen und posttransriptionellen Reglemechanismen, welche die Kodierung von HCK-1, HCK-2 und HCK-3 und potentiell weiterer von UL132-128 codierter Chemokine/Nikrofusionsfaktoren regulieren und Gewebetropismus/Pathogenität von HCMV und anderen Herpesviren sowie anderen DNA und RNA Viren bestimmen.
Expression von HCK-1, HCK-2 und HCK-3 oder der neu identifizierten Transkripte (RACE Klone95-3, 95,8, 95-11, 128) in humanen oder tierischen Zellen/Immunzellen, um das Trafficking dieser Immunzellen zu beinflussen.
Anwendung der neu identifizierten viral codierten Chemokine/small molecules gegen diese Chemokine bzw. deren humanen Kounterparts sowie potentiell weiterer von UL132-128 codierter Proteine für die Therapie von viralen Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen, Krebserkrankungen, rheumatischen Erkrankungen, Gentherapie, Vektorentwicklung, Impfstoffentwicklung, Studium des Einflusses auf die Migration von Leukozyten, Monozyten, Dendritischen Zellen NK-Tellen, T-Zellen, B-Zellen, Studium von Latenz und Reaktivierung von HCMV, Apoptose Induktion oder Verhinderung, Aktivierung oder Resistenz von NK- und CTL-Zell Erkennung von viral infizierten Targetellen (DNA und RNA Viren).
Studium des CxC und CC Chemokin-Rezeptor vermittelten Eintritts von HCMV sowie anderer DNA und RNA Viren in Gewebezielzellen sowie Studium der Zelladhärenz.
Strukturanalyse von HCK-1, HCK-2 und HCK-3 sowie weiterer von UL132-128 kodierter Chemokine und Mikrofusionsfaktoren.
Studium der Koinfektion von Zielzellen durch HCMV und andere DNA sowie RNA Viren, insbesondere HIV-Virus.