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JP2017503010A - １−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール二量体抗体−薬物コンジュゲート化合物、並びに使用及び処置の方法 - Google Patents

１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール二量体抗体−薬物コンジュゲート化合物、並びに使用及び処置の方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール（ＣＢＩ）二量体薬物部分にリンカーを介してコンジュゲートした抗体を含む抗体薬物コンジュゲート、及び抗体薬物コンジュゲートを使用する方法を提供する。【選択図】図３６

Description

関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１３年１２月１６日に出願された米国仮出願第６１／９１６３８８号及び２０１４年３月２４日に出願された米国仮出願第６１／９６９４９９号、並びに２０１４年６月１６日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４２５６０に対する利益を主張し、これらの全ては本明細書にその全体が参考として援用される。
発明の分野
本発明は、１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール（ＣＢＩ）二量体の薬物部分にコンジュゲートし、治療又は診断用途を有する抗体−薬物コンジュゲートを形成する抗体に関する。抗体は、ＣＢＩ二量体薬物−リンカー中間体とのコンジュゲーションのための反応性の遊離システインアミノ酸により操作されうる。また、本発明は、哺乳動物細胞又は関連する病理学的状態のインビトロ、インサイツ、及びインビボでの診断又は処置のためのＣＢＩ二量体抗体−薬物コンジュゲート化合物を使用する方法にも関する。
発明の背景
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、抗原を発現する腫瘍細胞に対して強力な細胞毒性薬を標的化し、内在化させ、薬物を放出し、これによりそれらの抗腫瘍活性を増強させることにより、抗体及び細胞毒性薬の両方の特性を組み合わせた標的型化学療法分子である（Carter, P. and Senter, P. (2008) The Cancer Jour. 14(3):154-169）。与えられた標的抗原に対するＡＤＣ開発の成功は、抗体の選択、リンカーの設計及び安定性、細胞傷害性薬物の効力及び抗体への薬物及びリンカーコンジュゲーションの様式の最適化に依存する（Polakis, P. (2005) Current Opinion in Pharmacology 5:382-387）。
ＤＮＡ副溝アルキル化剤の５−アミノ−１−（クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール（アミノＣＢＩ）クラスは、強力な細胞毒であり、癌治療のために設計されたプロドラッグの多数のクラスにおいてエフェクター単位として利用されている。これらは、抗体コンジュゲート（Jeffrey, et al. (2005) J. Med. Chem., 48:1344）、ニトロベンジルカルバメートに基づく遺伝子治療のためのプロドラッグ（Hay, et al (2003) J. Med. Chem. 46:2456）及び低酸素活性化プロドラッグとして対応するニトロ−ＣＢＩ誘導体（Tercel, et al (2011) Angew. Chem., Int. Ed., 50:2606-2609）が含まれる。ＣＢＩ及びピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）ファルマコフォアは、アルキル鎖によって連結されている（Tercel et al (2003) J. Med. Chem 46:2132-2151）。２つのピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン・ユニットがアルキレン又はアルキレン−アリーレン鎖によって結合（ｔｅｔｈｅｒ）されるＰＢＤ二量体は、ＤＮＡ副溝中のグアニンと反応する非常に効率的な鎖間架橋剤であり（Rahman et al (2009) Jour. Amer. Chem. Soc. 131(38):13756-13766; Thurston et al (1994) Chem. Rev., 94:433-465; Bose et al (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:4939-4941; Gregson et al (2004) Jour. Med. Chem. 47(5):1161-1174；米国特許第７５１１０３２号；米国特許第７５２８１２６号；米国特許第７５５７０９９号；米国特許第７０４９３１１号；米国特許第７０６７５１１号；米国特許第７２６５１０５号）、グラム陽性菌（Doyle et al (2009) Jour. Antimicrob. Chemo. 65(5):949-959; Hadjivassileva et al (2005) Jour. Antimicrob. Chemo. 56(3):513-518）、ヒトＢ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞（Pepper et al (2004) Cancer Res. 64(18):6750-6755）、及び固体腫瘍（Hochhauser et al (2009) Clin. Cancer Res. 15(6):2140-2147; Alley et al (2004) 64(18):6700-6706; Hartley et al (2004) Cancer Res. 64(18):6693-6699）に対して活性を有する。ＰＤＢの二量体の形態は抗体に連結され、ＡＤＣを形成する（米国特許出願公開第２００９／３０４７１０号；米国特許出願公開第２０１０／０４７２５７号；米国特許出願公開第２００９／０３６４３１号；国際公開第２０１１／１３０５９８号；国際公開第２０１１／１３０６１６号；米国特許出願公開第２０１３／００２８９１９号）。
概要
本発明は、治療又は診断用途を有する抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）化合物を形成するリンカーにより共有結合された１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール（ＣＢＩ）二量体の薬物部分を含む。
発明の一態様は式：
Figure 2017503010
を有する抗体−薬物コンジュゲート化合物であり、
ここで、
Ａｂは抗体であり；
Ｌは、式：
Figure 2017503010
を有するリンカーであり；
ここで、Ｓｔｒは抗体に共有結合したストレッチャー単位であり；Ｐｅｐは２から１２個のアミノ酸残基の任意のペプチド単位であり、Ｓｐは二量体の薬物部分に共有結合した任意のスペーサー単位であり、ｍ及びｎは０及び１から独立に選択され；
ｐは１から８の整数であり；
Ｄは式：
Figure 2017503010
を有する二量体薬物部分であり、
ここで
Ｒ１は、Ｈ，Ｐ（Ｏ）３Ｈ２，Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ，又はＬへの結合から選択され；
Ｒ２は、Ｈ，Ｐ（Ｏ）３Ｈ２，Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ，又はＬへの結合から選択され；
Ｒａ及びＲｂはＨ及び一以上のＦで任意置換されたＣ１−Ｃ６アルキルから独立に選択され，
又はＲａ及びＲｂは５又は６員複素環基を形成し；
Ｔは、Ｃ３−Ｃ１２アルキレン，Ｙ，（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン），（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン），（Ｃ２−Ｃ６アルケニレン）−Ｙ−（Ｃ２−Ｃ６アルケニレン）及び（Ｃ２−Ｃ６アルキニレン）−Ｙ−（Ｃ２−Ｃ６アルキニレン）から選択されるテザー基であり；
ここで、ＹはＯ、Ｓ、ＮＲ１、アリール、及びヘテロアリールから独立に選択され；
ここで、アルキレン、アルケニレン、アリール、及びヘテロアリールは、Ｆ，ＯＨ，Ｏ（Ｃ１−Ｃ６アルキル），ＮＨ２，ＮＨＣＨ３，Ｎ（ＣＨ３）２，ＯＰ（Ｏ）３Ｈ２，及びＣ１−Ｃ６アルキルで独立に任意置換され、ここでアルキルは、一以上のＦで任意置換され；
又はアルキレン、アルケニレン、アリール及びヘテロアリールは、Ｌへの結合で独立に任意置換され；
Ｄ’は、
Figure 2017503010
から選択される薬物部分であり、
ここで波線はＴへの結合部位を示し；
Ｘ１及びＸ２は、Ｏ及びＮＲ３から独立に選択され、ここでＲ３はＨ及び一以上のＦで任意置換されたＣ１−Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ４は、Ｈ，ＣＯ２Ｒ、又はＬへの結合であり、ここでＲはＣ１−Ｃ６アルキル又はベンジルであり；及び
Ｒ５は、Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキルである。
本発明の一態様は、抗体−薬物コンジュゲート及び薬学的に許容される担体、流動促進剤、希釈剤、又は賦形剤の薬学的組成物である。
本発明の一態様は、抗体−薬物コンジュゲート化合物の治療的有効量を患者に投与することを含む、癌を治療する方法である。
本発明の一態様は、
ａ）薬学的組成物；及び
ｂ）使用説明書
を含む癌を治療するためのキットである。
本発明の一態様は、
Figure 2017503010
から選択されるリンカー薬物中間体であり、
ここで、
Ｘは、マレイミド、チオール、アミノ、ブロミド、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ヨウ化物、ヒドロキシル、カルボキシル、ピリジルジスルフィド、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドから選択される反応性官能基である。
Ｌは、式：
Figure 2017503010
を有するリンカーであり；
ここで、ＳｔｒはＸに共有結合したストレッチャー単位であり；Ｐｅｐは２から１２個のアミノ酸残基の任意のペプチド単位であり、Ｓｐは二量体の薬物部分に共有結合した任意のスペーサー単位であり、ｍ及びｎは０及び１から独立に選択され；
Ｄは式：
Figure 2017503010
を有する二量体薬物部分であり、
ここで
Ｒ１は、Ｈ，Ｐ（Ｏ）３Ｈ２，Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ，又はＬへの結合から選択され；
Ｒ２は、Ｈ，Ｐ（Ｏ）３Ｈ２，Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ，又はＬへの結合から選択され；
Ｒａ及びＲｂは、Ｈ及び一以上のＦで任意置換されたＣ１−Ｃ６アルキルから独立に選択され，又はＲａ及びＲｂは、５又は６員複素環基を形成し；
Ｔは、Ｃ３−Ｃ１２アルキレン，Ｙ，（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン），（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン），（Ｃ２−Ｃ６アルケニレン）−Ｙ−（Ｃ２−Ｃ６アルケニレン）及び（Ｃ２−Ｃ６アルキニレン）−Ｙ−（Ｃ２−Ｃ６アルキニレン）から選択されるテザー基であり；
ここで、ＹはＯ、Ｓ、ＮＲ１、アリール、及びヘテロアリールから独立に選択され；
ここで、アルキレン、アルケニレン、アリール、及びヘテロアリールは、Ｆ，ＯＨ，Ｏ（Ｃ１−Ｃ６アルキル），ＮＨ２，ＮＨＣＨ３，Ｎ（ＣＨ３）２，ＯＰ（Ｏ）３Ｈ２，及びＣ１−Ｃ６アルキルで独立に任意置換され、ここでアルキルは、一以上のＦで任意置換され；
又はアルキレン、アルケニレン、アリール及びヘテロアリールは、Ｌへの結合で独立に任意置換され；
Ｄ’は
Figure 2017503010
から選択される薬物部分であり、
ここで波線はＴへの結合部位を示し；
Ｘ１及びＸ２は、Ｏ及びＮＲ３から独立に選択され、ここでＲ３はＨ及び一以上のＦで任意置換されたＣ１−Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ４は、Ｈ，ＣＯ２Ｒ、又はＬへの結合であり、ここでＲはＣ１−Ｃ６アルキル又はベンジルであり；及び
Ｒ５は、Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキルである。
本発明の一態様は、リンカー−薬物中間体に抗体をコンジュゲートすることにより、抗体−薬物コンジュゲートを製造する方法である。
本発明の一態様は式：
Figure 2017503010
を有するＣＢＩ二量体薬物部分の化合物であり、
ここで
Ｒ１は、Ｈ，Ｐ（Ｏ）３Ｈ２，Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂから選択され；
Ｒ２は、Ｈ，Ｐ（Ｏ）３Ｈ２，Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂから選択され；
Ｒａ及びＲｂは、Ｈ及び一以上のＦで任意置換されたＣ１−Ｃ６アルキルから独立に選択され、
又はＲａ及びＲｂは、５又は６員複素環基を形成し；
Ｔは、Ｃ３−Ｃ１２アルキレン，Ｙ，（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン），（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン），（Ｃ２−Ｃ６アルケニレン）−Ｙ−（Ｃ２−Ｃ６アルケニレン）及び（Ｃ２−Ｃ６アルキニレン）−Ｙ−（Ｃ２−Ｃ６アルキニレン）から選択されるテザー基であり；
ここで、ＹはＯ、Ｓ、ＮＲ１、アリール、及びヘテロアリールから独立に選択され；
ここで、アルキレン、アルケニレン、アリール、及びヘテロアリールは、Ｆ，ＯＨ，Ｏ（Ｃ１−Ｃ６アルキル），ＮＨ２，ＮＨＣＨ３，Ｎ（ＣＨ３）２，ＯＰ（Ｏ）３Ｈ２，及びＣ１−Ｃ６アルキルで独立に任意置換され、ここでアルキルは、一以上のＦで任意置換され；
又はアルキレン、アルケニレン、アリール及びヘテロアリールは、Ｌへの結合で独立に任意置換され；
Ｄ’は、
Figure 2017503010
から選択される薬物部分であり、
ここで波線はＴへの結合部位を示し；
Ｘ１及びＸ２は、Ｏ及びＮＲ３から独立に選択され、ここでＲ３は、Ｈ及び一以上のＦで任意置換されたＣ１−Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ４は、Ｈ，ＣＯ２Ｒであり、ここでＲはＣ１−Ｃ６アルキル又はベンジルであり；及び
Ｒ５は、Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキルである。
図１は、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル １−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ５１ａからの（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル ２−（２−ブロモ−Ｎ−メチルアセトアミド）エチル（メチル）カルバメート ５１の合成を示す。 図２は、（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル １−（クロロメチル）−５−（ジフェニルメチレンアミノ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキレラート ５３ａからのＮ−（（Ｒ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｒ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル）−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド ５３の合成を示す。 図３は、（Ｓ）−５−（５−（ベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタン酸 ５７ｃからの１−（（Ｓ）−５−アミノ−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）ペンタン−１，５−ジオン ５３ｊの合成を示す。 図４は、（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル １−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ５３ｋからの非天然エナンチオマー，１−（（Ｒ）−５−アミノ−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−（（Ｒ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）ペンタン−１，５−ジオン ５３ｐの合成を示す。 図５は、（Ｓ）−（２−アミノ−４−ヒドロキシ−５−メトキシフェニル）（２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−イル）メタノン ５４ａからのＮ−（４−（（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（６−（（Ｓ）−７−メトキシ−５−オキソ−２，３，５，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８−イルオキシ）ヘキサノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イルオキシ）メチル）フェニル）−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド ５４の合成を示す。 図６は、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル １−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ５１ａからのＮ−（（Ｓ）−１−（（Ｓ）−１−（４−（（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イルオキシ）メチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イルアミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド ５５の合成を示す。 図７は、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル ８−（６−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（４−ニトロベンジルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−６−オキソヘキシルオキシ）−１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−５−オキソ−２，３，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシレート ５４ｇからの（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル ８−（６−（（Ｓ）−５−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−６−オキソヘキシルオキシ）−１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−５−オキソ−２，３，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシレート ５６ｄの合成を示す。 図８は、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル ８−（６−（（Ｓ）−５−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−６−オキソヘキシルオキシ）−１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−５−オキソ−２，３，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシレート ５６ｄからのＮ−（（Ｓ）−１−（（Ｓ）−１−（４−（（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（６−（（Ｓ）−７−メトキシ−５−オキソ−２，３，５，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８−イルオキシ）ヘキサノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イルオキシ）メチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イルアミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド ５６の合成を示す。 図９は、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル １−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ５１ａからの（Ｓ）−５−（１−（クロロメチル）−５−（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタン酸 ５７ｄの合成を示す。 図１０は、６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸からの（Ｓ）−１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル ２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ−メチルヘキサンアミド）エチル（メチル）カルバメート ５７ｉの合成を示す。 図１１は、（Ｓ）−１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル ２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ−メチルヘキサンアミド）エチル（メチル）カルバメート ５７ｉからの（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（ホスホノオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル ２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ−メチルヘキサンアミド）エチル（メチル）カルバメート ５７の合成を示す。 図１２は、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル １−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ５１ａからの（Ｓ）−３−（５−（（Ｓ）−５−（４−アミノベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル ４−メチルピペラジン−１−カルボキシレート ５８ｅの合成を示す。 図１３は、（Ｓ）−３−（５−（（Ｓ）−５−（４−アミノベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル ４−メチルピペラジン−１−カルボキシレート ５８ｅからの（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル ４−メチルピペラジン−１−カルボキシレート ５８の合成を示す。 図１４は、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル ５−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ５５ｅからの（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル 二水素リン酸塩 ５９の合成を示す。 図１５は、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル ５−アミノ−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ６１ａからの２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）エチル（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（ホスホノオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イルカルバメート ６１の合成を示す。 図１６は、５１ａからの２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロピル（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（ホスホノオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イルカルバメート ６２の合成を示す。 図１７は、（Ｓ）−２，２，２−トリクロロエチル ６−（５−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４−（２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボニル）−２−メトキシフェノキシ）ヘキサン酸 ５４ｃからの（Ｓ）−３−（６−（４−（（Ｓ）−２−（アセトキシメチル）ピロリジン−１−カルボニル）−５−アミノ−２−メトキシフェノキシ）ヘキサノイル）−１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル ４−メチルピペラジン−１−カルボキシレート ６５ｄの合成を示す。 図１８は、（Ｓ）−２−（アリルオキシカルボニルアミノ）−６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサン酸 ６５ｅからのベンジルアルコールリジン６５ｇの合成を示す。 図１９は、（Ｓ）−３−（６−（４−（（Ｓ）−２−（アセトキシメチル）ピロリジン−１−カルボニル）−５−アミノ−２−メトキシフェノキシ）ヘキサノイル）−１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル ４−メチルピペラジン−１−カルボキシレート ６５からの（Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサンアミド）ベンジル ８−（６−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−６−オキソヘキシルオキシ）−１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−５−オキソ−２，３，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシレート ６５ｋの合成を示す。 図２０は、６５ｋからのビス−トリフルオロ酢酸塩としての（Ｓ）−４−（（Ｓ）−６−アミノ−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）ヘキサンアミド）ベンジル ８−（６−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−６−オキソヘキシルオキシ）−１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−５−オキソ−２，３，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシレート ６５の合成を示す。 図２１は、５１ａから調製された（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル ５−（ベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ５７ａからの（Ｓ）−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル １−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル リン酸 ６６ｄの合成を示す。 図２２は、（２Ｅ，２’Ｅ）−ｔｅｒｔ−ブチル ３，３’−（２−ニトロ−１，４−フェニレン）ジアクリル酸 ６６ｅからのＮ−（３−（２，５−ビス（（Ｅ）−３−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ホスホノキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−３−オキソプロパ−１−エニル）フェニルアミノ）−３−オキソプロピル）−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド ６６の合成を示す。 図２３は、（２Ｅ，２’Ｅ）−ｔｅｒｔ−ブチル ３，３’−（２−（３−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）プロパンアミド）−１，４−フェニレン）ジアクリル酸 ６６ｇからのＮ−（３−（２，５−ビス（（Ｅ）−３−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−３−オキソプロパ−１−エニル）フェニルアミノ）−３−オキソプロピル）−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド ６７の合成を示す。 図２４は、６６ｄ、６７ｃ、６７ｄからの（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（（Ｅ）−３−（４−（（Ｅ）−３−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−３−オキソプロパ−１−エニル）−２−（３−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）プロパンアミド）フェニル）アクリロイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル 二水素リン酸塩 ６８の合成を示す。 図２５は、ＳＫ−ＢＲ−３の３日目のインビトロ細胞生存率対Ｔｈｉｏ ｈｕ 抗ＣＤ２２ ＨＣ Ａ１２１Ｃ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−（ＣＢＩ二量体）１０１及びＴｈｉｏ ｈｕ 抗Ｈｅｒ２ ＨＣ Ａ１２１Ｃ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−（ＣＢＩ二量体）１０２の濃度（μｇ／ｍｌ）のプロットにおける抗体−薬物コンジュゲートの有効性を示す。 図２６は、ＳＫ−ＢＲ−３の３日目のインビトロ細胞生存率対Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗Ｈｅｒ２ ４Ｄ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−（ＣＢＩ−ＰＢＤ）１０３及びＴｈｉｏ Ｈｕ 抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−（ＣＢＩ−ＰＢＤ）１０４の濃度（μｇ／ｍｌ）のプロットにおける抗体−薬物コンジュゲートの有効性を示す。 図２７は、ＳＫ−ＢＲ−３の３日目のインビトロ細胞生存率対Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−（ＣＢＩ二量体）１１６及びＴｈｉｏ Ｈｕ 抗Ｈｅｒ２ ４Ｄ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−（ＣＢＩ二量体）１１７の濃度（μｇ／ｍｌ）のプロットにおける抗体−薬物コンジュゲートの有効性を示す。 図２８は、ＥＯＬ−１の３日目のインビトロ細胞生存率対Ｔｈｉｏ Ｈｕ抗ＣＤ３３ １５Ｇ１５．３３ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ＭＭＥＤ−（ＣＢＩ二量体ｐｈｏｓ）１２５の濃度（μｇ／ｍｌ）のプロットにおける抗体−薬物コンジュゲートの有効性を示す。 図２９は、ＥＯＬ−１の３日目のインビトロ細胞生存率対Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＭＵＣ１６ ３Ａ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ＥＤ−（ＣＢＩ二量体ＤＶＢ ｄｉｐｈｏｓ）１２６及びＴｈｉｏ Ｈｕ 抗ＣＤ３３ １５Ｇ１５．３３ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ＥＤ−（ＣＢＩ二量体 ＤＶＢ ｄｉｐｈｏｓ）１２７の濃度（μｇ／ｍｌ）のプロットにおける抗体−薬物コンジュゲートの有効性を示す。 図３０は、ＥＯＬ−１の３日目のインビトロ細胞生存率対Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＣＤ３３ １５Ｇ１５．３３ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ＥＤ−（ＣＢＩ 二量体 ＤＶＢ ｄｉｐｈｏｓ）１２７， Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＣＤ３３ １５Ｇ１５．３３ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ＥＤ−（ＣＢＩ二量体 ＤＶＢ ｐｈｏｓ）１２９，及びＴｈｉｏ Ｈｕ 抗ＭＵＣ１６ ３Ａ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ＥＤ−（ＣＢＩ 二量体 ＤＶＢ ｐｈｏｓ）１３０の濃度（μｇ／ｍｌ）のプロットにおける抗体−薬物コンジュゲートの有効性を示す。 図３１は、ＩＶで１回、（１）ビヒクル：ヒスチジン緩衝液＃８：２０ｍＭヒスチジン酢酸，ｐＨ５．５，２４０ｍＭスクロース，０．０２％ ＰＳ ２０，（２）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ＭＭＥＤ−（ＣＢＩ 二量体 ｐｈｏｓ）１１０，（３）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−（ＣＢＩ二量体 ＭｅＰｉｐ）１０８，（４）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−（ＣＢＩ二量体 ｐｈｏｓ）１１１，（５）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗Ｈｅｒ２ ４Ｄ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ＭＭＥＤ−（ＣＢＩ二量体 ｐｈｏｓ）１０９，（６）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗Ｈｅｒ２ ４Ｄ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−（ＣＢＩ二量体 ＭｅＰｉｐ）１０７，（７）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗Ｈｅｒ２ ４Ｄ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−（ＣＢＩ二量体 ｐｈｏｓ）１１２を投与された後の、ＣＲＬ ｎｕ／ｎｕマウスの乳房脂肪パッドに接種されたＭＭＴＶ−ＨＥＲ２ Ｆｏ５トランスジェニック乳腺腫瘍においてインビボでフィットされた経時的腫瘍体積変化のプロットにおける抗体−薬物コンジュゲートの有効性を示す。ＡＤＣは１０ｍｇ／ｋｇで投与された。 図３２は、ＩＶで１回、（１）ビヒクル：ヒスチジン緩衝液＃８：２０ｍＭヒスチジン酢酸，ｐＨ５．５，２４０ｍＭスクロース，０．０２％ ＰＳ ２０，（２）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＤＳＥ−（ＣＢＩ二量体 ｐｈｏｓ）１２０，１０ｍｇ／ｋｇ，（３）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＤＳＥ−（ＣＢＩ二量体 ｐｈｏｓ）１２２，１０ｍｇ／ｋｇ，（４）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−（Ｎ１０，ＰＢＤ−ＣＢＩ ＭｅＰｉｐ）１２４，１０ｍｇ／ｋｇ，（５）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗Ｈｅｒ２ ４Ｄ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＤＳＥ−（ＣＢＩ二量体 ｐｈｏｓ）１１９，３ｍｇ／ｋｇ，（６）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗Ｈｅｒ２ ４Ｄ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＤＳＥ−（ＣＢＩ二量体 ｐｈｏｓ）１１９，１０ｍｇ／ｋｇ，（７）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗Ｈｅｒ２ ４Ｄ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＤＳＰ−（ＣＢＩ二量体 ｐｈｏｓ）１２１，３ｍｇ／ｋｇ，（８）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗Ｈｅｒ２ ４Ｄ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＤＳＰ−（ＣＢＩ二量体 ｐｈｏｓ）１２１，１０ｍｇ／ｋｇ，（９）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗Ｈｅｒ２ ４Ｄ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−（Ｎ１０，ＰＢＤ−ＣＢＩ ＭｅＰｉｐ）１２３，３ｍｇ／ｋｇ，（１０）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗Ｈｅｒ２ ４Ｄ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−（Ｎ１０，ＰＢＤ−ＣＢＩ ＭｅＰｉｐ）１２３、１０ｍｇ／ｋｇを投与された後の、ＣＲＬ ｎｕ／ｎｕマウスの乳房脂肪パッドに接種されたＭＭＴＶ−ＨＥＲ２ Ｆｏ５トランスジェニック乳腺腫瘍においてインビボでのフィットされた経時的腫瘍体積変化のプロットにおける抗体−薬物コンジュゲートの有効性を示す。 図３３は、ＩＶで１回、（１）ビヒクル：ヒスチジン緩衝液＃８：２０ｍＭヒスチジン酢酸，ｐＨ５．５，２４０ｍＭスクロース，０．０２％ ＰＳ ２０，（２）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＣＤ３３ １５Ｇ１５．３３ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ＥＤ−（ＣＢＩ二量体ＤＶＢ ｄｉｐｈｏｓ）１２７，３ｍｇ／ｋｇ，（３）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＭＵＣ１６ ３Ａ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ＥＤ−（ＣＢＩ二量体 ＤＶＢ ｄｉｐｈｏｓ）１２６，３ｍｇ／ｋｇ，（４）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＭＵＣ１６ ３Ａ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ＥＤ−（ＣＢＩ二量体 ＤＶＢ ｄｉｐｈｏｓ）１２６，１ｍｇ／ｋｇを投与された後の、Ｃ．Ｂ−１７ ＳＣＩＤマウスに接種されたＯＶＣＡＲ３Ｘ２．１ヒト卵巣腫瘍においてインビボでのフィットされた経時的腫瘍体積変化のプロットにおける抗体−薬物コンジュゲートの有効性を示す。 図３４は、ＩＶで１回、２０μｇ／ｍ２で、（１）ビヒクル：ヒスチジン緩衝液＃８：２０ｍＭヒスチジン酢酸，ｐＨ５．５，２４０ｍＭスクロース，０．０２％ ＰＳ ２０，（２）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＣＤ３３ １５Ｇ１５．３３ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ＭＭＥＤ−（ＣＢＩ二量体 ｐｈｏｓ）１２５，（３）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＣＤ３３ １５Ｇ１５．３３ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ＥＤ−（ＣＢＩ二量体 ＤＶＢ ｄｉｐｈｏｓ）１２７，（４）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＭＵＣ１６ ３Ａ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ＭＭＥＤ−（ＣＢＩ二量体 ｐｈｏｓ）１２８，（５）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＭＵＣ１６ ３Ａ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ＥＤ−（ＣＢＩ二量体 ＤＶＢ ｄｉｐｈｏｓ）１２６を投与された後の、Ｃ．Ｂ−１７ ＳＣＩＤマウスに接種されたＨＬ−６０ヒト急性骨髄性白血病においてインビボでのフィットされた経時的腫瘍体積変化のプロットにおける抗体−薬物コンジュゲートの有効性を示す。 図３５ａは、ＨＬ−６０ヒト急性骨髄性白血病の腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおけるＡＤＣ１３８の有効性を示す。ＡＤＣ１３８は、ビヒクル群と比較して腫瘍増殖の用量依存的阻害を実証した。非標的性対照のＡＤＣ１３５は、腫瘍増殖には影響を与えなかった。 図３５ｂは、ＨＬ−６０ヒト急性骨髄性白血病の腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおけるＡＤＣ１３９の有効性を示す。ＡＤＣ１３９は、ビヒクル群と比較して腫瘍増殖の用量依存的阻害を実証した。非標的性対照のＡＤＣ１３６は１ｍｇ／ｋｇで腫瘍増殖に対して適度な効果を有したが、しかし、一致する用量でのＡＤＣ１３９は、完全な腫瘍寛解が得られ、実質的により効果的であった。 図３６は、Ｉｇｒｏｖ−１卵巣腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおけるＡＤＣ１３４の有効性を示す。ＡＤＣ１３４は、ビヒクル群と比較して腫瘍増殖の用量依存的阻害を実証した。非標的性対照のＡＤＣ１３７は、腫瘍増殖には影響を与えなかった。 図３７は、Ｎ−（３−（２，５−ビス（（Ｅ）−３−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−３−オキソプロパ−１−エニル）フェニルアミノ）−３−オキソプロピル）−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド（化合物番号６９、表４）の合成を示す。 図３８は、２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロピル ２，５−ビス（（Ｅ）−３−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（ホスホノオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−３−オキソプロパ−１−エニル）フェニルカルバメート（表４、化合物番号７２、図３８）の合成を示す。 図３９は、［（１Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−［（Ｅ）−３−［４−［（Ｅ）−３−［（１Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ホスホノオキシ−１，２−ジヒドロベンゾ［ｅ］インドール−３−イル］−３−オキソ−プロパ−１−エニル］−２−［２−［２−（２，５−ジオキソピロール−１−イル）エトキシ］エトキシ］フェニル］プロパ−２−エノイル］−１，２−ジヒドロベンゾ［ｅ］インドール−５−イル］二水素リン酸塩（化合物番号７８、表４、図３９）の合成を示す。 図４０は、［（１Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−［（Ｅ）−３−［４−［（Ｅ）−３−［（１Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ホスホノオキシ−１，２−ジヒドロベンゾ［ｅ］インドール−３−イル］−３−オキソ−プロパ−１−エニル］−２−［２−（２，５−ジオキソピロール−１−イル）エトキシ］フェニル］プロパ−２−エノイル］−１，２−ジヒドロベンゾ［ｅ］インドール−５−イル］二水素リン酸塩（化合物番号７９、表４、図４０）の合成を示す。 図４１は、２−（２−ピリジルジスルファニル）プロピル Ｎ−［１−（クロロメチル）−３−［５−［１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロベンゾ［ｅ］インドール−３−イル］−５−オキソ−ペンタノイル］−１，２−ジヒドロベンゾ［ｅ］インドール−５−イル］カルバメート（化合物番号８０、表４、図４１）の合成を示す。 図４２〜４３は、２−（２−ピリジルジスルファニル）プロピル ３−［６−［１−（クロロメチル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）オキシ−１，２−ジヒドロベンゾ［ｅ］インドール−３−イル］−６−オキソ−ヘキソキシ］−６−ヒドロキシ−２−メトキシ−１１−オキソ−６ａ，７，８，９−テトラヒドロ−６Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−カルボキシレート，及び２−（２−ピリジルジスルファニル）プロピル ３−［６−［１−（クロロメチル）−５−ホスホノオキシ−１，２−ジヒドロベンゾ［ｅ］インドール−３−イル］−６−オキソ−ヘキソキシ］−６−ヒドロキシ−２−メトキシ−１１−オキソ−６ａ，７，８，９−テトラヒドロ−６Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−カルボキシレート及び２−（２−ピリジルジスルファニル）プロピル ３−［６−［１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロベンゾ［ｅ］インドール−３−イル］−６−オキソ−ヘキソキシ］−６−ヒドロキシ−２−メトキシ−１１−オキソ−６ａ，７，８，９−テトラヒドロ−６Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−カルボキシレート（化合物番号８１〜８３、表４、図４２〜４３）の合成を示す。 図４４は、（１Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（（２Ｅ）−３−｛４−（（１Ｅ）−３−｛（１Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−［（６−メチル−β−Ｄ−グルコピラヌロノシル）オキシ］−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３−イル｝−３−オキソ−１−プロペニル）−２−［（３−｛［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル］アミノ｝プロパノイル）アミノ］フェニル｝−２−プロペノイル）−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル メチル β−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸（化合物番号８４、表４、図４４）の合成を示す。 図４５は、（Ｓ）−（１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジイル）ビス（（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）メタノン）（化合物番号１５、表１、図４５）の合成を示す。 図４６は、Ｎ−（２，５−ビス（（Ｅ）−３−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−３−オキソプロパ−１−エニル）フェニル）アセトアミド（化合物番号１６、表１、図４６）の合成を示す。 図４７は、（Ｓ，２Ｅ，２’Ｅ）−３，３’−（２−メトキシ−１，４−フェニレン）ビス（１−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）プロパ−２−エン−１−オン）（化合物番号１７、表１、図４７）の合成を示す。 図４８は、（Ｓ，２Ｅ，２’Ｅ）−３，３’−（１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジイル）ビス（１−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）プロパ−２−エン−１−オン）（化合物番号１８、表１、図４８）の合成を示す。 図４９は、（Ｓ）−３，３’−（２−メトキシ−１，４−フェニレン）ビス（１−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）プロパ−２−イン−１−オン）（化合物番号１９、表１、図４９）の合成を示す。
典型的な実施態様の詳細な説明
本発明の特定の実施態様について詳細に述べられ、その例は、付随する構造と式に示される。本発明は説明される実施態様と併せて説明されるが、それらの実施態様に本発明を限定するものではないことが理解されるであろう。一方、本発明は、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれ得る全ての代替、改変、及び均等物を包含することを意図している。
当業者は、本発明の実施において使用され得る本明細書に記載のものに類似するか又は等価な多くの方法及び材料を認識するであろう。本発明は、説明される方法と材料に決して限定されない。
別に規定されない限り、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるように、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は同じ意味を持ち、Singleton et al (1994) Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd Ed., J. Wiley & Sons, New York, NY; and Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New Yorkと一致する。
定義
特に明記しない限り、本明細書で使用する以下の用語と語句は、以下の意味を有することが意図される。
商品名が本明細書で使用されるとき、出願人は、商品名製品の製剤、ジェネリック医薬品、及び商品名製品の活性薬学的成分を独立に包含することを意図する。
用語「抗体」は本明細書において最も広範な意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及びそれらが所望の生物学的活性を示すものであれば、抗体断片を特に網羅する。抗体は、マウス、ヒト、ヒト、キメラ、又は他の種に由来し得る。抗体は、特異的抗原を認識し結合することができる免疫系によって産生されるタンパク質である。（Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New York）。標的抗原は、複数の抗体のＣＤＲによって認識され、エピトープとも呼ばれる多数の結合部位を一般的に有している。異なるエピトープに特異的に結合する抗体の各々は異なる構造を有している。従って、一つの抗原は、複数の対応する抗体を有し得る。抗体は、完全長の免疫グロブリン分子又は完全長免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、目的の標的の抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子又はその部分を含み、そのような標的は、限定されないが、癌細胞又は自己免疫疾患に関連する自己免疫抗体を産生する細胞を含む。本明細書に開示される免疫グロブリンは、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１及びＩｇＡ２）又は免疫グロブリン分子のサブクラスとすることができる。免疫グロブリンは任意の種に由来することができる。しかしながら、一態様では、免疫グロブリンは、ヒト、マウス、又はウサギ起源のものである。
「抗体断片」は、完全長抗体の一部、一般にはその抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ、線形抗体；ミニボディー（Olafsen et al (2004) Protein Eng. Design & Sel. 17(4):315-323）、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成された断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ＣＤＲ（相補性決定領域）、及び癌細胞抗原、ウイルス抗原又は微生物抗原に免疫特異的に結合する上記の何れかのエピトープ結合断片、単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。
本明細書中で用いる用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわちこの集団を含む個々の抗体は、微量で存在し得る天然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であって、単一の抗原部位に対するものである。更に、典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含む、ポリクローナル抗体製剤とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して指向される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが、他の免疫グロブリンにより汚染されずに合成される点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特徴を示し、何れかの特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って用いるべきモノクローナル抗体は、Kohler et al (1975) Nature, 256:495によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作成されてもよく、あるいは組換えＤＮＡ方法によって作成されてもよい（例えば、米国特許第４８１６５６７号；米国特許第５８０７７１５号を参照）。モノクローナル抗体は、例えば、Clackson et al (1991) Nature, 352:624-628; Marks et al (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。
本明細書中のモノクローナル抗体は、具体的には、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の種に由来する又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同であるが、その（それらの）鎖の残部は別の種に由来する又は別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体、並びにそのような抗体の断片を、それらが望ましい生物学的活性を示す限り、包含し得る（米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855）。本明細書における対象のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば旧世界ザル、類人猿など）及びヒト定常領域配列に由来する可変ドメイン抗原結合配列を含む霊長類化抗体が含まれる。
本明細書において「インタクトな抗体」とは、ＶＬ及びＶＨドメイン、並びに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメインン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む、抗体である。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体であり得る。インタクトな抗体は、抗体のＦｃ定常領域（天然型配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因し得る生物学的活性を指す、１つ以上の「エフェクター機能」を有し得る。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；ファゴサイトーシス；及び細胞表面レセプター、例えば、Ｂ細胞レセプター及びＢＣＲなどのダウンレギュラーションが挙げられる。
用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸長する。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しているか、又は存在していない場合がある。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を意味する。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。従って、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は、一般に次のＶＨ（又はＶＬ）配列：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４に現れる。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、インタクトな抗体は、異なる「クラス」に割り当てることができる。インタクトな免疫グロブリン抗体の５つの主要なクラスがあり：ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧ，及びＩｇＭ；これらのうちの幾つかは、「サブクラス」（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２）へと更に分割され得る。種々のクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。種々のクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び３次元構造は周知である。Ｉｇ形態はヒンジの修飾又はヒンジ欠損形態を含む（Roux et al (1998) J. Immunol. 161:4083-4090; Lund et al (2000) Eur. J. Biochem. 267:7246-7256；米国特許出願公開第２００５／００４８５７２号；米国特許出願公開第２００４／０２２９３１０号）。
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリー又は他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般的には、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔら、免疫学的に興味のあるタンパク質の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）、第６版, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), 1~3巻にあるサブグループである。一実施態様において、ＶＬについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらに記載のサブグループカッパＩである。一実施態様において、ＶＨについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループＩＩＩである。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来アミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に三つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に三つの六つのＨＶＲＳを含む。ＨＶＲは、一般に超可変ループから及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含み、後者は最も高い配列可変性のものであり、及び／又は抗原認識に関与している。典型的な超可変ループはアミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる。（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。典型的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２で生じる。（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。ＶＨのＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」も含む。ＳＤＲは、略称（abbreviated-）ＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれる、ＣＤＲの領域内に含まれている。典型的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２で生じる。（Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照のこと）。特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上掲のＫａｂａｔらに従い、本明細書において番号が付けられる。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の可変重鎖ドメイン及び軽鎖（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各ドメインを有し、一般的に似たような構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 第６版, W.H. Freeman and Co., 91頁 (2007)を参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインが、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのそれぞれのライブラリーをスクリーニングするために、抗原に特異的に結合する抗体からのＶＨ又はＶＬドメインを用いて単離することができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照。
本明細書で使用される、用語「ベクター」は、それがリンクされている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なように連結されている核酸の発現を導くことができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。
「遊離システインアミノ酸」は、親抗体で操作され、チオール官能基（−ＳＨ）を有し、分子内又は分子間ジスルフィド架橋として対合されないシステインアミノ酸残基を指す。
「リンカー」、「リンカーユニット」又は「連結（ｌｉｎｋ）」は、抗体を薬剤部分に共有結合させる原子鎖を含む。様々な実施態様において、リンカーは２価のラジカルであり、Ｌとして特定される。
置換基の数を示す場合には、用語「一以上」は、一の置換基から置換の可能性のある最高数までの範囲を指し、すなわち、置換基による１個の水素の置換から全ての水素の置換までを指す。用語「置換基」は、親分子の水素原子を置換する原子又は原子の基を意味する。用語「置換される」は、特定の基が一以上の置換基を有することを意味する。任意の基が複数の置換基を有していてもよく、様々な可能な置換基が提供される場合、置換基は独立に選択され、同じである必要は無い。用語「非置換」は、特定の基が置換基を有しないことを意味する。用語「必要に応じて置換された」は、特定の基が可能な置換基の群から独立に選択される、一以上の置換基により非置換である又は置換されることを意味する。置換基の数を示す場合には、用語「一以上」は、一の置換基から置換の可能性のある最高数までを意味し、すなわち、置換基による１個の水素の置換から全ての水素の置換までを意味する。
用語「アルキル」は、本明細書において使用する場合、１〜１２個の炭素原子の任意の長さの飽和直鎖又は分岐鎖の一価炭化水素基（Ｃ１−Ｃ１２）を意味し、アルキル基は、下記の１個又は複数の置換基で独立に任意選択で置換されていてもよい。別の実施態様において、アルキル基は１から８の炭素原子（Ｃ１−Ｃ８）、又は１から６の炭素原子（Ｃ１−Ｃ６）である。アルキル基の例は、限定するものでないが、メチル（Ｍｅ、−ＣＨ３）、エチル（Ｅｔ、−ＣＨ２ＣＨ３）、１−プロピル（ｎ−Ｐｒ、ｎ−プロピル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−プロピル（ｉ−Ｐｒ、ｉ−プロピル、−ＣＨ（ＣＨ３）２）、１−ブチル（ｎ−Ｂｕ、ｎ−ブチル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−メチル−１−プロピル（ｉ−Ｂｕ、ｉ−ブチル、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２−ブチル（ｓ−Ｂｕ、ｓ−ブチル、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、２−メチル−２−プロピル（ｔ−Ｂｕ、ｔ−ブチル、−Ｃ（ＣＨ３）３）、１−ペンチル（ｎ−ペンチル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２）、２−メチル−２−ブチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ３）、３−メチル−２−ブチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２）、３−メチル−１−ブチル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２−メチル−１−ブチル（−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、１−ヘキシル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−ヘキシル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−ヘキシル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３））、２−メチル−２−ペンチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−メチル−２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、４−メチル−２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、３−メチル−３−ペンチル（−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）２）、２−メチル−３−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２）、２，３−ジメチル−２−ブチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ（ＣＨ３）２）、３，３−ジメチル−２−ブチル（−ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ（ＣＨ３）３、１−ヘプチル、１−オクチルなどを含む。
用語「アルキレン」は、本明細書において使用する場合、１〜１２個の炭素原子の任意の長さの飽和直鎖又は分岐鎖のニ価炭化水素基（Ｃ１−Ｃ１２）を意味し、アルキレン基は、下記の１個又は複数の置換基で独立に任意選択で置換されていてもよい。別の実施態様において、アルキレン基は１から８個の炭素原子（Ｃ１−Ｃ８）、又は１から６個の炭素原子（Ｃ１−Ｃ６）である。アルキレン基の例は、限定しないが、メチレン（−ＣＨ２−）、エチレン（−ＣＨ２ＣＨ２−）、プロピエン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）等を含む。
用語「アルケニル」は、少なくとも１つの部位の不飽和、すなわち、炭素−炭素ｓｐ２二重結合を有する、２〜８個の任意の長さの炭素原子の直鎖又は分岐鎖の一価炭化水素基（Ｃ２−Ｃ８）を意味し、ここでアルケニル基は、本明細書に記載されている１個又は複数の置換基で独立に任意選択で置換されていてもよく、「ｃｉｓ」及び「ｔｒａｎｓ」配向、又は代わりに、「Ｅ」及び「Ｚ」配向を有する基が含まれる。例には、限定されないが、エチレン又はビニル（−ＣＨ＝ＣＨ２）、アリル（−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）などを含む。
用語「アルケニレン」は、少なくとも１つの部位の不飽和、すなわち、炭素−炭素ｓｐ２二重結合を有する、２〜８個の任意の長さの炭素原子の直鎖又は分岐鎖の二価炭化水素基（Ｃ２−Ｃ８）を意味し、ここでアルケニレン基は、本明細書に記載されている１個又は複数の置換基で独立に任意選択で置換されていてもよく、「ｃｉｓ」及び「ｔｒａｎｓ」配向、又は代わりに、「Ｅ」及び「Ｚ」配向を有する基が含まれる。例には、限定されないが、エチレニレン又はビニレン（−ＣＨ＝ＣＨ−）、アリル（−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ−）などを含む。
用語「アルキニル」は、少なくとも１つの部位の不飽和、すなわち、炭素−炭素ｓｐ三重結合を有する、２〜８個の任意の長さの炭素原子の直鎖状又は分岐状の一価炭化水素基（Ｃ２−Ｃ８）を意味し、アルキニル基は、本明細書に記載されている１個又は複数の置換基で独立に任意選択で置換されていてもよい。その例は、限定されないが、エチニル（−Ｃ≡ＣＨ）、プロピニル（プロパルギル、−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）などを含む。
用語「アルキニレン」は、少なくとも１つの部位の不飽和、すなわち、炭素−炭素ｓｐ三重結合を有する、２〜８個の任意の長さの炭素原子の直鎖状又は分岐状の二価炭化水素基（Ｃ２−Ｃ８）を意味し、アルキニレン基は、本明細書に記載されている１個又は複数の置換基で独立に任意選択で置換されていてもよい。その例は、限定されないが、エチニレン（−Ｃ≡Ｃ）、プロピニレン（プロパルギレン、−ＣＨ２Ｃ≡Ｃ）などを含む。
用語「炭素環」、「カルボシクリル」、「炭素環」及び「シクロアルキル」は、単環式環として３〜１２個の炭素原子（Ｃ３−Ｃ１２）、又は二環式環として７〜１２個の炭素原子を有する、一価非芳香族の飽和又は部分不飽和環を意味する。７から１２の原子を有する二環式炭素環は、例えばビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］又は［６，６］系として配置され得、９又は１０の環原子を有する二環式炭素環は、ビシクロ［５，６］又は［６，６］系として、又はビシクロ［２．２．１］ヘプタン、ビシクロ［２．２．２］オクタン及びビシクロ［３．２．２］ノナンのような架橋系として配置され得る。スピロ部分もこの定義の範囲内に含まれる。単環式炭素環の例には、限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、１−シクロペンタ−１−エニル、１−シクロペンタ−２−エニル、１−シクロペンタ−３−エニル、シクロヘキシル、１−シクロヘキサ−１−エニル、１−シクロヘキサ−２−エニル、１−シクロヘキサ−３−エニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、シクロウンデシル、シクロドデシル等が含まれる。炭素環基は本明細書に記載される一以上の置換基で独立に任意で置換される。
「アリール」は、親芳香族環系の単一炭素原子から一つの水素原子を取り除くことによって誘導される６−２０の炭素原子（Ｃ６−Ｃ２０）の一価芳香族炭化水素基を意味する。幾つかのアリール基は「Ａｒ」として例示構造において表される。アリールは飽和、部分的不飽和環、又は芳香族炭素環に縮合した芳香族環を含む二環式基を含む。典型的なアリール基には、限定されないが、ベンゼンから誘導された基（フェニル）、置換ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、インデニル、インダニル、１，２−ジヒドロナフタレン、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル等が含まれる。アリール基は本明細書に記載される一以上の置換基で独立に任意で置換される。
「アリーレン」は、親芳香族環系の単一炭素原子から一つの水素原子を取り除くことによって誘導される６−２０の炭素原子（Ｃ６−Ｃ２０）の二価芳香族炭化水素基を意味する。幾つかのアリーレン基は「Ａｒ」として例示構造において表される。アリーレンは飽和、部分的不飽和環、又は芳香族炭素環に縮合した芳香族環を含む二環式基を含む。典型的なアリーレン基には、限定されないが、ベンゼンから誘導された基（フェニレン）、置換ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニレン、インデニレン、インダニレン、１，２−ジヒドロナフタレン、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル等が含まれる。アリーレン基は本明細書に記載される一以上の置換基で任意で置換される。
「複素環」、「ヘテロシクリル」及び「複素環式環」なる用語は、ここでは交換可能に使用され、少なくとも一の環原子が、窒素、酸素及び硫黄から選択されるヘテロ原子であり、残りの環原子がＣであり、一又は複数の環原子は以下に記載の一又は複数の置換基で独立して置換されていてもよい、３から２０の環原子の飽和又は部分的不飽和（つまり、環内に一又は複数の二重及び／又は三重結合を有する）炭素環式基を意味する。複素環は、３から７の環員（２から６の炭素原子とＮ、Ｏ、Ｐ、及びＳから選択される１から４のヘテロ原子）を有する単環、又は７から１０の環員（４から９の炭素原子とＮ、Ｏ、Ｐ、及びＳから選択される１から６のヘテロ原子）を有する二環、例えば、ビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］、又は［６，６］系でありうる。複素環は、Paquette, Leo A.;"Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968)、特に１、３、４、６、７、及び９章；"The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs"(John Wiley & Sons, New York, 1950 to present）、特に１３、１４、１６、１９、及び２８巻；及びJ. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566に記載されている。「ヘテロシクリル」はまた複素環基に飽和、部分的不飽和環、又は芳香族炭素環又は複素環式環が縮合した基を含む。複素環式環の例には、限定されないが、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペリジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、チオキサニル、ピペラジニル、ホモピペラジニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ホモピペリジニル、オキセパニル、チエパニル、オキサゼピニル、ジアゼピニル、チアゼピニル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、インドリニル、２Ｈ−ピラニル、４Ｈ−ピラニル、ジオキサニル、１，３−ジオキソラニル、ピラゾリニル、ジチアニル、ジチオラニル、ジヒドロピラニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロフラニル、ピラゾリジニルイミダゾリニル、イミダゾリジニル、３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサニル、３−アザビシクロ［４．１．０］ヘプタニル、及びアザビシクロ［２．２．２］ヘキサニル、３Ｈ−インドリルキノジリニル及びＮ−ピリジルウレアが含まれる。スピロ部分もこの定義の範囲内に含まれる。２つの環原子がオキソ（＝Ｏ）部分で置換されている複素環基の例はピリミジノイル及び１，１−ジオキソ−チオモルホリニルである。ここでの複素環基は本明細書に記載される一以上の置換基で独立に任意で置換される。
「ヘテロアリール」なる用語は、５員、６員又は７員環の一価芳香族基を意味し、窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される一又は複数のヘテロ原子を含む５−２０原子の縮合環系（少なくとも一が芳香族）を含む。ヘテロアリール基の例は、ピリジニル（例えば２−ヒドロキシピリジニルを含む）、イミダゾリル、イミダゾピリジニル、ピリミジニル（例えば４−ヒドロキシピリミジニルを含む）、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソキサゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、キノリニル、イソキノリニル、インドリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、シノリニル、インダゾリニル、インドリジニル、フタラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、イソインドリル、プテリジニル、プリニル、オキサジアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、フラザニル、ベンゾフラザニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、及びフロピリジニルである。ヘテロアリール基は本明細書に記載される一以上の置換基で独立に任意で置換される。
複素環基又はヘテロアリール基は、可能である場合、炭素で結合（炭素結合）しても窒素で結合（窒素結合）してもよい。例えば、限定ではなく、炭素結合した複素環又はヘテロアリールは、ピリジンの２位、３位、４位、５位、又は６位、ピリダジンの３位、４位、５位、又は６、ピリミジンの２位、４位、５位、又は６、ピラジンの２位、３位、５位、又は６位、フラン、テトラヒドロフラン、チオフラン、チオフェン、ピロール又はテトラヒドロピロールのの２位、３位、４位、又は５位、オキサゾール、イミダゾール又はチアゾールの２位、４位、又は５位、イソオキサゾール、ピラゾール、又はイソチアゾールの３位、４位、又は５位、アジリジンの２位又は３位、アゼチジンの２位、３位、又は４位、キノリンの２位、３位、４位、５位、６位、７位、又は８位、あるいはイソキノリンの１位、３位、４位、５位、６位、７位、又は８位で結合する。
例えば、限定ではなく、窒素が結合した複素環又はヘテロアリールは、アジリジン、アゼチジン、ピロール、ピロリジン、２−ピロリン、３−ピロリン、イミダゾール、イミダゾリジン、２−イミダゾリン、３−イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、２−ピラゾリン、３−ピラゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドール、インドリン、１Ｈ−インダゾールの１位、イソインドール又はイソインドリンの２位、モルホリンの４位、及びカルバゾール又はβ−カルボリンの９位で結合する。
用語「キラル」は、重ね合わせることができないという鏡像パートナーの性質を有する分子を指し、用語「アキラル」は、その鏡像パートナー上に重ね合わせることができる分子を指す。
用語「立体異性体」は、同一の化学構造を有するが、原子又は基の空間配置の点で異なる化合物を指す。
「ジアステレオマー」とは、二つ以上のキラル中心を持つ立体異性体であって、それらの分子が互いに鏡像関係にない立体異性体を指す。ジアステレオマーは、異なる物理的性質、例えば融点、沸点、スペクトル的性質及び反応性を有する。ジアステレオマーの混合物は、例えば電気泳動法及びクロマトグラフィーなどの高分解能分析手順の下で分離することができる。
「エナンチオマー」とは、重ね合わせることができない互いの鏡像である、化合物の二つの立体異性体を指す。
本明細書中で使用される立体化学的な規定及び規約は、一般に、 S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York；及びEliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New Yorkに従う。多くの有機化合物が、光学活性形態で存在し、すなわち、これらは平面偏光の平面を回転する能力を有する。光学的に活性な化合物の記載において、接頭語のＤ及びＬ、又はＲ及びＳは、そのキラル中心に関する分子の絶対配置を表示するために使用される。接頭語ｄ及びｌ又は（＋）及び（−）は、化合物による平面偏光の回転の符号を表し、（−）又はｌは、この化合物が左旋性であることを意味する。（＋）又はｄの接頭語を持つ化合物は、右旋性である。所定の化学構造について、これらの立体異性体は、互いに鏡像対称であることを除いて同一である。特定の立体異性体はまた、エナンチオマーと呼ばれ、そのような異性体の混合物は、しばしばエナンチオマー混合物と呼ばれる。エナンチオマーの５０：５０混合物は、ラセミ混合物もしくはラセミ体と呼ばれ、これは、化学反応もしくはプロセスにおいて立体選択性もしくは立体特異性が存在しない場合に生じ得る。「ラセミ混合物」及び「ラセミ体」なる用語は、光学活性を有さない、２つのエナンチオマー種の等モル濃度の混合物をいう。
「薬学的に受容可能な塩」なる語句は、本明細書中で使用される場合、抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の薬学的に受容可能な有機もしくは無機の塩をいう。典型的な塩としては、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酸性酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、及びパモ酸塩（ｐａｍｏａｔｅ）（すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエート）が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に受容可能な塩は、酢酸イオン、コハク酸イオンもしくは他の対イオンのような別の分子の包含を含み得る。対イオンは、親化合物上の電荷を安定化させる任意の有機部分もしくは無機部分であり得る。更に、薬学的に受容可能な塩は、１つより多くの荷電した原子をその構造内に有し得る。多数の荷電した原子がその薬学的に受容可能な塩の一部分である場合、多数の対イオンを有し得る。したがって、薬学的に受容可能な塩は、１以上の荷電した原子及び／又は１以上の対イオンを有し得る。
以下の略称が、本明細書中で使用され、指定された定義を有する：ＢＭＥはβ−メルカプトエタノール、ＢｏｃはＮ−（ｔ−ブトキシカルボニル）、ｃｉｔはシトルリン（２−アミノ−５−ウレイドペンタン酸）、ｄａｐはドラプロイン（ｄｏｌａｐｒｏｉｎｅ）、ＤＣＣは１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド、ＤＣＭはジクロロメタン、ＤＥＡはジエチルアミン、ＤＥＡＤはジエチルアゾジカルボキシレート、ＤＥＰＣはジエチルホスホリルシアニデート、ＤＩＡＤはジイソプロピルアゾジカルボキシレート、ＤＩＥＡはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ｄｉｌはドライソロイシン（ｄｏｌａｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）、ＤＭＡはジメチルアセトアミド、ＤＭＡＰは４−ジメチルアミノピリジン、ＤＭＥはエチレングリコールジメチルエーテル（もしくは１，２−ジメトキシエタン）、ＤＭＦはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯはジメチルスルホキシド、ｄｏｅはドラフェニン（ｄｏｌａｐｈｅｎｉｎｅ）、ｄｏｖはＮ，Ｎ−ジメチルバリン、ＤＴＮＢは５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、ＤＴＰＡはジエチレントリアミンペンタ酢酸、ＤＴＴはジチオトレイトール、ＥＤＣＩは１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩、ＥＥＤＱは２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン、ＥＳ−ＭＳはエレクトロスプレー質量分析、ＥｔＯＡｃは酢酸エチル、ＦｍｏｃはＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、ｇｌｙはグリシン、ＨＡＴＵはＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、ＨＯＢｔは１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ＨＰＬＣは高速液体クロマトグラフィー、ｉｌｅはイソロイシン、ｌｙｓはリジン、ＭｅＣＮ（ＣＨ３ＣＮ）はアセトニトリル、ＭｅＯＨはメタノール、Ｍｔｒは４−アニシルジフェニルメチル（もしくは４−メトキシトリチル）、ｎｏｒは（１Ｓ、２Ｒ）−（＋）−ノルエフェドリン、ＰＡＢはｐ−アミノベンジルカルバモイル、ＰＢＳはリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７）、ＰＥＧはポリエチレングリコール、Ｐｈはフェニル、Ｐｎｐはｐ−ニトロフェニル、ＭＣは６−マレイミドカプロイル、ｐｈｅはＬ−フェニルアラニン、ＰｙＢｒｏｐはブロモトリ−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、ＳＥＣはサイズ排除クロマトグラフィー、Ｓｕはスクシンイミド、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸、ＴＬＣは薄層クロマトグラフィー、ＵＶは紫外線、及びｖａｌはバリン。
システイン操作抗体
本発明の化合物は、野生型抗体又は親抗体の一以上のアミノ酸が、システインアミノ酸と置換される、システイン操作抗体を含む抗体−薬物コンジュゲートを含む。抗体の任意の形態は、そのように操作、すなわち変異導入されうる。例えば、親Ｆａｂ抗体断片は、システイン操作Ｆａｂを形成するように操作され得、本明細書中で「チオＦａｂ（チオＦａｂ）」と呼ばれる。同様に、親モノクローナル抗体は、「ＴｈｉｏＭａｂ（チオＭａｂ）」を形成するように操作され得る。一部位変異は、チオＦａｂにおいて１つの操作システイン残基を生じ、一方、ＩｇＧ抗体のダイマーの性質に起因して、一部位変異は、ＴｈｉｏＭａｂにおいて２つの操作システイン残基を生じる。置換された（「操作された」）システイン（Ｃｙｓ）残基を有する変異体は、新規に導入された操作チオール基の反応性について評価される。チオール反応性値は、０から１．０の範囲の相対的な数値の項であり、任意のシステイン操作抗体について測定され得る。本発明のシステイン操作抗体のチオール反応性値は、０．６〜１．０；０．７〜１．０；又は０．８〜１．０の範囲内である。
鎖内又は分子間ジスルフィド結合を形成しないシステインアミノ酸を、抗体中の反応性部位に操作しうる（Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan et al (2009) Blood 114(13):2721-2729；米国特許第７５２１５４１号；米国特許第７７２３４８５号；国際公開第２００９／０５２２４９号, Shen et al (2012) Nature Biotech., 30(2):184-191; Junutula et al (2008) Jour of Immun. Methods 332:41-52）。操作されたシステインチオールは、チオール反応性の、電子吸引基、例えばマレイミド又はα−ハロアミドを有する本発明のリンカー試薬又はリンカー−薬物中間体と反応して、システイン操作抗体（ＴｈｉｏＭａｂ）及び薬物部分とＡＤＣを形成しうる。
よって、薬剤部分の位置は設計され、制御され、既知でありうる。薬物負荷は、操作されたシステインチオール基が典型的には高収率でチオール反応性リンカー試薬又はリンカー−薬物中間体と反応するので、制御されうる。重鎖又は軽鎖上の単一部位の置換によりシステインアミノ酸を導入するために体を操作することにより対称抗体上に二つの新しいシステインが得られる。２に近く、コンジュゲーション生成物ＡＤＣの均一性に近い薬物負荷を達成することができる。
本発明のシステイン操作抗体は、好ましくは、野生型、親抗体のカウンターパートの抗原結合能力を保持する。従って、システイン操作抗体は、好ましくは特異的には、抗原に結合することが可能である。そのような抗原としては、例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、細胞表面レセプタータンパク質及び他の細胞表面分子、膜貫通タンパク質、シグナル伝達タンパク質、細胞生存調節因子、細胞増殖調節因子、組織発達又は分化関連付けられている分子（例えば、既知であるか又は機能性に寄与すると疑われるもの）、リンホカイン、サイトカイン、細胞周期の調節に関与する分子、脈管形成に関与する分子、及び血管新生に関連付けられている分子（例えば、既知であるか又は機能性に寄与すると疑われるもの）を含む。腫瘍関連抗原は、クラスター分化因子（すなわちＣＤタンパク質）である可能性がある。システイン操作抗体が結合することができる抗原は、上記のカテゴリの何れかのサブセットのメンバーであり得、前記カテゴリの他のサブセットは（対象の抗原に関して）異なる特性を持つ他の分子／抗原を含む。
システイン操作抗体は、鎖内ジスルフィド基の還元及び再酸化によるリンカー−薬物中間体とのコンジュゲーションのために調製される（実施例１９）。
癌の治療における本発明の抗体−薬物コンジュゲートに有用なシステイン操作抗体は、限定されないが、細胞表面レセプター及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する抗体を含む。腫瘍関連抗原は、当技術分野で知られており、当該技術分野で周知の方法及び情報を使用して、抗体を生成する際に使用するために調製することができる。癌の診断及び治療のための効果的な細胞標的を発見する試みにおいて、研究者は、一つ以上の正常な非癌細胞上に比べて癌細胞の一つ以上の特定の型の表面上に特異的に発現された膜貫通ポリペプチド又はそうでなければ腫瘍関連ポリペプチドを同定しようとしてきた。しばしば、そのような腫瘍関連ポリペプチドは、非癌細胞の表面上に比べてより豊富に癌細胞の表面に発現している。そのような腫瘍関連細胞表面の抗原ポリペプチドの同定は、抗体ベースの治療を経由して破壊するために癌細胞を特異的に標的とする能力を生じさせてきた。
腫瘍関連抗原ＴＡＡの例は、限定されないが、下にリストされたＴＡＡ（１）−（５１）を含む。便宜上、これらの抗原に関連する情報で当該技術分野で知られている全ては以下にリストされ、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の核酸及びタンパク質の配列同定規則に従い、名前、代替名、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号及び主要参照文献を含む。ＴＡＡ（１）−（５１）に対応する核酸とタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋなどの公共のデータベースで利用可能である。抗体により標的とされる腫瘍関連抗原は引用文献で同定された配列に対して少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を含むか、又は引用文献に記載の配列を有するＴＡＡとして、実質的に同一な生物学的特性又は特徴を示す全てのアミノ酸配列変異体及びアイソフォームを含む。たとえば、変異体配列を有するＴＡＡは、一般に、リストされた対応する配列を持つＴＡＡに特異的に結合する抗体に特異的に結合することができる。本明細書に具体的に引用される文献中の配列及び開示は参照により明示的に援用される。
腫瘍関連抗原：
（１）ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質レセプタータイプＩＢ，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２０３）
ten Dijke,P.,et al Science 264 (5155):101-104(1994),Oncogene 14 (11):1377-1382(1997)）；国際公開第２００４０６３３６２号（請求項２）；国際公開第２００３０４２６６１号（請求項１２）；米国特許出願公開第２００３１３４７９０−Ａ１号（頁３８−３９）；国際公開第２００２１０２２３５号（請求項１３；頁２９６）；国際公開第２００３０５５４４３号（頁９１−９２）；国際公開第２００２９９１２２号（実施例２；頁５２８−５３０）；国際公開第２００３０２９４２１号（請求項６）；国際公開第２００３０２４３９２号（請求項２；図１１２）；国際公開第２００２９８３５８号（請求項１；頁１８３）；国際公開第２００２５４９４０号（頁１００−１０１）；国際公開第２００２５９３７７号（頁３４９−３５０）；国際公開第２００２３０２６８号（請求項２７；頁３７６）；国際公開第２００１４８２０４号（実施例；図４）
ＮＰ＿００１１９４骨形成タンパク質レセプター，タイプＩＢ／ｐｉｄ＝ＮＰ＿００１１９４．１−
相互参照：ＭＩＭ：６０３２４８；ＮＰ＿００１１９４．１；ＡＹ０６５９９

（２）Ｅ１６（ＬＡＴ１，ＳＬＣ７Ａ５，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３４８６）
Biochem. Biophys. Res. Commun. 255 (2), 283-288 (1999), Nature 395 (6699):288-291 (1998), Gaugitsch, H.W., et al (1992) J. Biol. Chem. 267 (16):11267-11273）；国際公開第２００４０４８９３８号（実施例２）；国際公開第２００４０３２８４２号（実施例ＩＶ）；国際公開第２００３０４２６６１号（請求項１２）；国際公開第２００３０１６４７５号（請求項１）；国際公開第２００２７８５２４号（実施例２）；国際公開第２００２９９０７４号（請求項１９；頁１２７−１２９）；国際公開第２００２８６４４３号（請求項２７；頁２２２，３９３）；国際公開第２００３００３９０６号（請求項１０；頁２９３）；国際公開第２００２６４７９８号（請求項３３；頁９３−９５）；国際公開第２０００１４２２８号（請求項５；頁１３３−１３６）；米国特許出願公開第２００３２２４４５４号（図３）；国際公開第２００３０２５１３８号（請求項１２；頁１５０）；
ＮＰ＿００３４７７溶質担体ファミリー７（カチオン性アミノ酸輸送体，ｙ＋
システム），メンバー５／ｐｉｄ＝ＮＰ＿００３４７７．３−ホモサピエンス
相互参照：ＭＩＭ：６００１８２；ＮＰ＿００３４７７．３；ＮＭ＿０１５９２３；ＮＭ＿００３４８６＿１

（３）ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通型上皮抗原，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１２４４９）
Cancer Res. 61 (15), 5857-5860 (2001), Hubert, R.S., et al (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (25):14523-14528)；国際公開第２００４０６５５７７号（請求項６）；国際公開第２００４０２７０４９号（図１Ｌ）；欧州特許第１３９４２７４号（実施例１１）；国際公開第２００４０１６２２５号（請求項２）；国際公開第２００３０４２６６１号（請求項１２）；米国特許出願公開第２００３１５７０８９号（実施例５）；米国特許出願公開第２００３１８５８３０号（実施例５）；米国特許出願公開第２００３０６４３９７号（図２）；国際公開第２００２８９７４７号（実施例５；頁６１８−６１９）；国際公開第２００３０２２９９５号（実施例９；図１３Ａ，実施例５３；頁１７３，実施例２；図２Ａ）；
ＮＰ＿０３６５８１ 前立腺の６回膜貫通型上皮抗原
相互参照：ＭＩＭ：６０４４１５；ＮＰ＿０３６５８１．１；ＮＭ＿０１２４４９＿１

（４）０７７２Ｐ（ＣＡ１２５，ＭＵＣ１６，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ３６１４８６）
J. Biol. Chem. 276 (29):27371-27375 (2001)）；国際公開第２００４０４５５５３号（請求項１４）；国際公開第２００２９２８３６号（請求項６；図１２）；国際公開第２００２８３８６６号（請求項１５；頁１１６−１２１）；米国特許出願公開第２００３１２４１４０号（実施例１６）；相互参照：ＧＩ：３４５０１４６７；ＡＡＫ７４１２０．３；ＡＦ３６１４８６＿１

（５）ＭＰＦ（ＭＰＦ，ＭＳＬＮ，ＳＭＲ，巨核球増強因子、メソテリン，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５８２３）Yamaguchi, N., et al Biol. Chem. 269 (2), 805-808 (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20):11531-11536 (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (1):136-140 (1996), J. Biol. Chem. 270 (37):21984-21990 (1995)）；国際公開第２００３１０１２８３号（請求項１４）；（国際公開第２００２１０２２３５号（請求項１３；頁２８７−２８８）；国際公開第２００２１０１０７５号（請求項４；頁３０８−３０９）；国際公開第２００２７１９２８号（頁３２０−３２１）；国際公開第９４１０３１２号（頁５２−５７）；相互参照：ＭＩＭ：６０１０５１；ＮＰ＿００５８１４．２；ＮＭ＿００５８２３＿１

（６）Ｎａｐｉ２ｂ（ＮＡＰＩ−２Ｂ，ＮＡＰＩ−３Ｂ，ＮＰＴＩＩｂ，ＳＬＣ３４Ａ２，溶質輸送体ファミリー３４（リン酸ナトリウム），メンバー２，ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸トランスポーター３ｂ，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６４２４）
J. Biol. Chem. 277 (22):19665-19672 (2002), Genomics 62 (2):281-284 (1999), Feild, J.A., et al (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 258 (3):578-582）；国際公開第２００４０２２７７８号（請求項２）；欧州特許第１３９４２７４号（実施例１１）；国際公開第２００２１０２２３５号（請求項１３；頁３２６）；欧州特許第８７５５６９号（請求項１；頁１７−１９）；国際公開第２００１５７１８８号（請求項２０；頁３２９）；国際公開第２００４０３２８４２号（実施例ＩＶ）；国際公開第２００１７５１７７号（請求項２４；頁１３９−１４０）；
相互参照：ＭＩＭ：６０４２１７；ＮＰ＿００６４１５．１；ＮＭ＿００６４２４＿１

（７）Ｓｅｍａ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２，ＫＩＡＡ１４４５，Ｍｍ．４２０１５，ＳＥＭＡ５Ｂ，ＳＥＭＡＧ，セマフォリン ５ｂ Ｈｌｏｇ，セマドメイン（ｓｅｍａ ｄｏｍａｉｎ），７回トロンボスポンジン反復（１型及び１型様），膜貫通ドメイン（ＴＭ）及び短い細胞質ドメイン（セマフォリン）５Ｂ，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢ０４０８７８）
Nagase T., et al (2000) DNA Res. 7 (2):143-150）；国際公開第２００４０００９９７号（請求項１）；国際公開第２００３００３９８４号（請求項１）；国際公開第２００２０６３３９号（請求項１；頁５０）；国際公開第２００１８８１３３号（請求項１；頁４１−４３，４８−５８）；国際公開第２００３０５４１５２号（請求項２０）；国際公開第２００３１０１４００号（請求項１１）；
受託番号：Ｑ９Ｐ２８３；ＥＭＢＬ；ＡＢ０４０８７８；ＢＡＡ９５９６９．１．Ｇｅｎｅｗ；ＨＧＮＣ：１０７３７；

（８）ＰＳＣＡ ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ，Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ，ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２，ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２ 遺伝子，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ３５８６２８）；Ross et al (2002) Cancer Res. 62:2546-2553；米国特許出願公開第２００３１２９１９２号（請求項２）；米国特許出願公開第２００４０４４１８０号（請求項１２）；米国特許出願公開第２００４０４４１７９号（請求項１１）；米国特許出願公開第２００３０９６９６１号（請求項１１）；米国特許出願公開第２００３２３２０５６号（実施例５）；国際公開第２００３１０５７５８号（請求項１２）；米国特許出願公開第２００３２０６９１８号（実施例５）；欧州特許第１３４７０４６号（請求項１）；国際公開第２００３０２５１４８号（請求項２０）；
相互参照：ＧＩ：３７１８２３７８；ＡＡＱ８８９９１．１；ＡＹ３５８６２８＿１

（９）ＥＴＢＲ（エンドセリンタイプＢレセプター，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ２７５４６３）；
Nakamuta M., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 34-39, 1991; Ogawa Y., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 248-255, 1991; Arai H., et al Jpn. Circ. J. 56, 1303-1307, 1992; Arai H., et al J. Biol. Chem. 268, 3463-3470, 1993; Sakamoto A., Yanagisawa M., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 656-663, 1991; Elshourbagy N.A., et al J. Biol. Chem. 268, 3873-3879, 1993; Haendler B., et al J. Cardiovasc. Pharmacol. 20, s1-S4, 1992; Tsutsumi M., et al Gene 228, 43-49, 1999; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002; Bourgeois C., et al J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 3116-3123, 1997; Okamoto Y., et al Biol. Chem. 272, 21589-21596, 1997; Verheij J.B., et al Am. J. Med. Genet. 108, 223-225, 2002; Hofstra R.M.W., et al Eur. J. Hum. Genet. 5, 180-185, 1997; Puffenberger E.G., et al Cell 79, 1257-1266, 1994; Attie T., et al, Hum. Mol. Genet. 4, 2407-2409, 1995; Auricchio A., et al Hum. Mol. Genet. 5:351-354, 1996; Amiel J., et al Hum. Mol. Genet. 5, 355-357, 1996; Hofstra R.M.W., et al Nat. Genet. 12, 445-447, 1996; Svensson P.J., et al Hum. Genet. 103, 145-148, 1998; Fuchs S., et al Mol. Med. 7, 115-124, 2001; Pingault V., et al (2002) Hum. Genet. 111, 198-206；国際公開第２００４０４５５１６号（請求項１）；国際公開第２００４０４８９３８号（実施例２）；国際公開第２００４０４００００号（請求項１５１）；国際公開第２００３０８７７６８号（請求項１）；国際公開第２００３０１６４７５号（請求項１）；国際公開第２００３０１６４７５号（請求項１）；国際公開第２００２６１０８７号（図１）；国際公開第２００３０１６４９４号（図６）；国際公開第２００３０２５１３８号（請求項１２；頁１４４）；国際公開第２００１９８３５１号（請求項１；頁１２４−１２５）；欧州特許第５２２８６８号（請求項８；図２）；国際公開第２００１７７１７２号（請求項１；頁２９７−２９９）；米国特許出願公開第２００３１０９６７６号；米国特許第６５１８４０４号（図３）；米国特許第５７７３２２３号（請求項１ａ；Ｃｏｌ ３１−３４）；国際公開第２００４００１００４号；

（１０）ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４，仮想タンパク質 ＦＬＪ２０３１５，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７７６３）；
国際公開第２００３１０４２７５号（請求項１）；国際公開第２００４０４６３４２号（実施例２）；国際公開第２００３０４２６６１号（請求項１２）；国際公開第２００３０８３０７４号（請求項１４；頁６１）；国際公開第２００３０１８６２１号（請求項１）；国際公開第２００３０２４３９２号（請求項２；図９３）；国際公開第２００１６６６８９号（実施例６）；
相互参照：遺伝子座番号：５４８９４；ＮＰ＿０６０２３３．２；ＮＭ＿０１７７６３＿１

（１１）ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９，ＩＰＣＡ−１，ＰＣＡＮＡＰ１，ＳＴＡＭＰ１，ＳＴＥＡＰ２，ＳＴＭＰ，前立腺癌関連遺伝子１，前立腺癌関連タンパク質１，前立腺の６回膜貫通型上皮抗原２，６回膜貫通型前立腺タンパク質，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ４５５１３８）
Lab. Invest. 82 (11):1573-1582 (2002)）；国際公開第２００３０８７３０６号；米国特許出願公開第２００３０６４３９７号（請求項１；図１）；国際公開第２００２７２５９６号（請求項１３；頁５４−５５）；国際公開第２００１７２９６２号（請求項１；図４Ｂ）；国際公開第２００３１０４２７０号（請求項１１）；国際公開第２００３１０４２７０号（請求項１６）；米国特許出願公開第２００４００５５９８号（請求項２２）；国際公開第２００３０４２６６１号（請求項１２）；米国特許出願公開第２００３０６０６１２号（請求項１２；図１０）；国際公開第２００２２６８２２号（請求項２３；図２）；国際公開第２００２１６４２９号（請求項１２；図１０）；
相互参照：ＧＩ：２２６５５４８８；ＡＡＮ０４０８０．１；ＡＦ４５５１３８＿１

（１２）ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０，ＦＬＪ２００４１，ＴＲＰＭ４，ＴＲＰＭ４Ｂ，一過性レセプター電位カチオンチャネル，サブファミリーＭ，メンバー４，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７６３６）
Xu, X.Z., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (19):10692-10697 (2001), Cell 109 (3):397-407 (2002), J. Biol. Chem. 278 (33):30813-30820 (2003)）；米国特許出願公開第２００３１４３５５７号（請求項４）；国際公開第２０００４０６１４号（請求項１４；頁１００−１０３）；国際公開第２００２１０３８２号（請求項１；図９Ａ）；国際公開第２００３０４２６６１号（請求項１２）；国際公開第２００２３０２６８号（請求項２７；頁３９１）；米国特許出願公開第２００３２１９８０６号（請求項４）；国際公開第２００１６２７９４号（請求項１４；図１Ａ−Ｄ）；
相互参照：ＭＩＭ：６０６９３６；ＮＰ＿０６０１０６．２；ＮＭ＿０１７６３６＿１

（１３）ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ，ＣＲ１，ＣＲＧＦ，ＣＲＩＰＴＯ，ＴＤＧＦ１，奇形癌腫由来増殖因子，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３２０３又はＮＭ＿００３２１２）
Ciccodicola, A., et al EMBO J. 8 (7):1987-1991 (1989), Am. J. Hum. Genet. 49 (3):555-565 (1991））；米国特許出願公開第２００３２２４４１１号（請求項１）；国際公開第２００３０８３０４１号（実施例１）；国際公開第２００３０３４９８４号（請求項１２）；国際公開第２００２８８１７０号（請求項２；頁５２−５３）；国際公開第２００３０２４３９２号（請求項２；図５８）；国際公開第２００２１６４１３号（請求項１；頁９４−９５，１０５）；国際公開第２００２２２８０８号（請求項２；図１）；米国特許第５８５４３９９号（実施例２；Ｃｏｌ １７−１８）；米国特許第５７９２６１６号（図２）；
相互参照：ＭＩＭ：１８７３９５；ＮＰ＿００３２０３．１；ＮＭ＿００３２１２＿１

（１４）ＣＤ２１（ＣＲ２（補体レセプター２）又はＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エブスタインバーウイルスレセプター）又はＨｓ．７３７９２ Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ２６００４）
Fujisaku et al (1989) J. Biol. Chem. 264 (4):2118-2125); Weis J.J., et al J. Exp. Med. 167, 1047-1066, 1988; Moore M., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 9194-9198, 1987; Barel M., et al Mol. Immunol. 35, 1025-1031, 1998; Weis J.J., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5639-5643, 1986; Sinha S.K., et al (1993) J. Immunol. 150, 5311-5320；国際公開第２００４０４５５２０号（実施例４）；米国特許出願公開第２００４００５５３８号（実施例１）；国際公開第２００３０６２４０１号（請求項９）；国際公開第２００４０４５５２０号（実施例４）；国際公開第９１０２５３６号（図９．１−９．９）；国際公開第２００４０２０５９５号（請求項１）；
受託番号：Ｐ２００２３；Ｑ１３８６６；Ｑ１４２１２；ＥＭＢＬ；Ｍ２６００４；ＡＡＡ３５７８６．１．

（１５）ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ，ＣＤ７９β，ＩＧｂ（免疫グロブリン関連β（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｅｔａ）），Ｂ２９，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００６２６又は１１０３８６７４）
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (7):4126-4131, Blood (2002) 100 (9):3068-3076, Muller et al (1992) Eur. J. Immunol. 22 (6):1621-1625）；国際公開第２００４０１６２２５号（請求項２，図１４０）；国際公開第２００３０８７７６８号，米国特許出願公開第２００４１０１８７４号（請求項１，頁１０２）；国際公開第２００３０６２４０１号（請求項９）；国際公開第２００２７８５２４号（実施例２）；米国特許出願公開第２００２１５０５７３号（請求項５，頁１５）；米国特許第５６４４０３３号；国際公開第２００３０４８２０２号（請求項１，頁３０６及び３０９）；国際公開第９９／５５８６５８号，米国特許第６５３４４８２号（請求項１３，図１７Ａ／Ｂ）；国際公開第２０００５５３５１号（請求項１１，頁１１４５−１１４６）；
相互参照：ＭＩＭ：１４７２４５；ＮＰ＿０００６１７．１；ＮＭ＿０００６２６＿１

（１６）ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４，ＩＲＴＡ４，ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質１ａ），ＳＰＡＰ１Ｂ，ＳＰＡＰ１Ｃ，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３０７６４，ＡＹ３５８１３０）
Genome Res. 13 (10):2265-2270 (2003), Immunogenetics 54 (2):87-95 (2002), Blood 99 (8):2662-2669 (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17):9772-9777 (2001), Xu, M.J., et al (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (3):768-775；国際公開第２００４０１６２２５号（請求項２）；国際公開第２００３０７７８３６号；国際公開第２００１３８４９０号（請求項５；図１８Ｄ−１−１８Ｄ−２）；国際公開第２００３０９７８０３号（請求項１２）；国際公開第２００３０８９６２４号（請求項２５）；
相互参照：ＭＩＭ：６０６５０９；ＮＰ＿１１０３９１．２；ＮＭ＿０３０７６４＿１

（１７）ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１１７３０）
Coussens L., et al Science (1985) 230(4730):1132-1139); Yamamoto T., et al Nature 319, 230-234, 1986; Semba K., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6497-6501, 1985; Swiercz J.M., et al J. Cell Biol. 165, 869-880, 2004; Kuhns J.J., et al J. Biol. Chem. 274, 36422-36427, 1999; Cho H.-S., et al Nature 421, 756-760, 2003; Ehsani A., et al (1993) Genomics 15, 426-429；国際公開第２００４０４８９３８号（実施例２）；国際公開第２００４０２７０４９号（図１Ｉ）；国際公開第２００４００９６２２；国際公開第２００３０８１２１０；国際公開第２００３０８９９０４号（請求項９）；国際公開第２００３０１６４７５号（請求項１）；米国特許出願公開第２００３１１８５９２号；国際公開第２００３００８５３７号（請求項１）；国際公開第２００３０５５４３９号（請求項２９；図１Ａ−Ｂ）；国際公開第２００３０２５２２８号（請求項３７；図５Ｃ）；国際公開第２００２２２６３６号（実施例１３；頁９５−１０７）；国際公開第２００２１２３４１号（請求項６８；図７）；国際公開第２００２１３８４７号（頁７１−７４）；国際公開第２００２１４５０３号（頁１１４−１１７）；国際公開第２００１５３４６３号（請求項２；頁４１−４６）；国際公開第２００１４１７８７号（頁１５）；国際公開第２０００４４８９９号（請求項５２；図７）；国際公開第２０００２０５７９号（請求項３；図２）；米国特許第５８６９４４５号（請求項３；Ｃｏｌ ３１−３８）；国際公開第９６３０５１４号（請求項２；頁５６−６１）；欧州特許第１４３９３９３号（請求項７）；国際公開第２００４０４３３６１号（請求項７）；国際公開第２００４０２２７０９号；国際公開第２００１００２４４号（実施例３；図４）；
受託番号：Ｐ０４６２６；ＥＭＢＬ；Ｍ１１７６７；ＡＡＡ３５８０８．１．ＥＭＢＬ；Ｍ１１７６１；ＡＡＡ３５８０８．１．

（１８）ＮＣＡ（ＣＥＡＣＡＭ６，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１８７２８）；
Barnett T., et al Genomics 3, 59-66, 1988; Tawaragi Y., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 150, 89-96, 1988; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:16899-16903, 2002；国際公開第２００４０６３７０９；欧州特許第１４３９３９３号（請求項７）；国際公開第２００４０４４１７８号（実施例４）；国際公開第２００４０３１２３８号；国際公開第２００３０４２６６１号（請求項１２）；国際公開第２００２７８５２４号（実施例２）；国際公開第２００２８６４４３号（請求項２７；頁４２７）；国際公開第２００２６０３１７号（請求項２）；
受託番号：Ｐ４０１９９；Ｑ１４９２０；ＥＭＢＬ；Ｍ２９５４１；ＡＡＡ５９９１５．１．ＥＭＢＬ；Ｍ１８７２８；

（１９）ＭＤＰ（ＤＰＥＰ１，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＣ０１７０２３）
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26):16899-16903 (2002））；国際公開第２００３０１６４７５号（請求項１）；国際公開第２００２６４７９８号（請求項３３；頁８５−８７）；特公平５−００３７９０号公報（図６−８）；国際公開第９９４６２８４号（図９）；
相互参照：ＭＩＭ：１７９７８０；ＡＡＨ１７０２３．１；ＢＣ０１７０２３＿１

（２０）ＩＬ２０Ｒα（ＩＬ２０Ｒａ，ＺＣＹＴＯＲ７，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１８４９７１）；
Clark H.F., et al Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Mungall A.J., et al Nature 425, 805-811, 2003; Blumberg H., et al Cell 104, 9-19, 2001; Dumoutier L., et al J. Immunol. 167, 3545-3549, 2001; Parrish-Novak J., et al J. Biol. Chem. 277, 47517-47523, 2002; Pletnev S., et al (2003) Biochemistry 42:12617-12624; Sheikh F., et al (2004) J. Immunol. 172, 2006-2010；欧州特許第１３９４２７４号（実施例１１）；米国特許出願公開第２００４００５３２０号（実施例５）；国際公開第２００３０２９２６２号（頁７４−７５）；国際公開第２００３００２７１７号（請求項２；頁６３）；国際公開第２００２２２１５３号（頁４５−４７）；米国特許出願公開第２００２０４２３６６号（頁２０−２１）；国際公開第２００１４６２６１号（頁５７−５９）；国際公開第２００１４６２３２号（頁６３−６５）；国際公開第９８３７１９３号（請求項１；頁５５−５９）；
受託番号：Ｑ９ＵＨＦ４；Ｑ６ＵＷＡ９；Ｑ９６ＳＨ８；ＥＭＢＬ；ＡＦ１８４９７１；ＡＡＦ０１３２０．１．

（２１）ブレビカン（ＢＣＡＮ，ＢＥＨＡＢ，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ２２９０５３）
Gary S.C., et al Gene 256, 139-147, 2000; Clark H.F., et al Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002；米国特許出願公開第２００３１８６３７２号（請求項１１）；米国特許出願公開第２００３１８６３７３号（請求項１１）；米国特許出願公開第２００３１１９１３１号（請求項１；図５２）；米国特許出願公開第２００３１１９１２２号（請求項１；図５２）；米国特許出願公開第２００３１１９１２６号（請求項１）；米国特許出願公開第２００３１１９１２１号（請求項１；図５２）；米国特許出願公開第２００３１１９１２９号（請求項１）；米国特許出願公開第２００３１１９１３０号（請求項１）；米国特許出願公開第２００３１１９１２８号（請求項１；図５２）；米国特許出願公開第２００３１１９１２５号（請求項１）；国際公開第２００３０１６４７５号（請求項１）；国際公開第２００２０２６３４号（請求項１）；

（２２）ＥｐｈＢ２Ｒ（ＤＲＴ，ＥＲＫ，Ｈｅｋ５，ＥＰＨＴ３，Ｔｙｒｏ５，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４４４２）
Chan,J. and Watt, V.M., Oncogene 6 (6), 1057-1061 (1991) Oncogene 10 (5):897-905 (1995), Annu. Rev. Neurosci. 21:309-345 (1998), Int. Rev. Cytol. 196:177-244 (2000)）；国際公開第２００３０４２６６１号（請求項１２）；国際公開第２０００５３２１６号（請求項１；頁４１）；国際公開第２００４０６５５７６号（請求項１）；国際公開第２００４０２０５８３号（請求項９）；国際公開第２００３００４５２９号（頁１２８−１３２）；国際公開第２０００５３２１６号（請求項１；頁４２）；
相互参照：ＭＩＭ：６００９９７；ＮＰ＿００４４３３．２；ＮＭ＿００４４４２＿１

（２３）ＡＳＬＧ６５９（Ｂ７ｈ，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＸ０９２３２８）
米国特許出願公開第２００４０１０１８９９号（請求項２）；国際公開第２００３１０４３９９号（請求項１１）；国際公開第２００４０００２２１号（図３）；米国特許出願公開第２００３１６５５０４号（請求項１）；米国特許出願公開第２００３１２４１４０号（実施例２）；米国特許出願公開第２００３０６５１４３号（図６０）；国際公開第２００２１０２２３５号（請求項１３；頁２９９）；米国特許出願公開第２００３０９１５８０号（実施例２）；国際公開第２００２１０１８７号（請求項６；図１０）；国際公開第２００１９４６４１号（請求項１２；図７ｂ）；国際公開第２００２０２６２４号（請求項１３；図１Ａ−１Ｂ）；米国特許出願公開第２００２０３４７４９号（請求項５４；頁４５−４６）；国際公開第２００２０６３１７号（実施例２；頁３２０−３２１，請求項３４；頁３２１−３２２）；国際公開第２００２７１９２８号（頁４６８−４６９）；国際公開第２００２０２５８７号（実施例１；図１）；国際公開第２００１４０２６９号（実施例３；頁１９０−１９２）；国際公開第２０００３６１０７号（実施例２；頁２０５−２０７）；国際公開第２００４０５３０７９号（請求項１２）；国際公開第２００３００４９８９号（請求項１）；国際公開第２００２７１９２８号（頁２３３−２３４，４５２−４５３）；国際公開第０１１６３１８号；

（２４）ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原前駆体，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＪ２９７４３６）
Reiter R.E., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1735-1740, 1998; Gu Z., et al Oncogene 19, 1288-1296, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 275(3):783-788；国際公開第２００４０２２７０９号；欧州特許第１３９４２７４号（実施例１１）；米国特許出願公開第２００４０１８５５３号（請求項１７）；国際公開第２００３００８５３７号（請求項１）；国際公開第２００２８１６４６号（請求項１；頁１６４）；国際公開第２００３００３９０６号（請求項１０；頁２８８）；国際公開第２００１４０３０９号（実施例１；図１７）；米国特許出願公開第２００１０５５７５１号（実施例１；図１ｂ）；国際公開第２０００３２７５２号（請求項１８；図１）；国際公開第９８５１８０５号（請求項１７；頁９７）；国際公開第９８５１８２４号（請求項１０；頁９４）；国際公開第９８４０４０３号（請求項２；図１Ｂ）；
受託番号：Ｏ４３６５３；ＥＭＢＬ；ＡＦ０４３４９８；ＡＡＣ３９６０７．１．

（２５）ＧＥＤＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ２６０７６３）；
ＡＡＰ１４９５４脂肪腫ＨＭＧＩＣ融合パートナー様タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ−ｐａｒｔｎｅｒ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）／ｐｉｄ＝ＡＡＰ１４９５４．１ − ホモ・サピエンス
種：ホモサピエンス（ヒト）
国際公開第２００３０５４１５２号（請求項２０）；国際公開第２００３０００８４２号（請求項１）；国際公開第２００３０２３０１３号（実施例３，請求項２０）；米国特許出願公開第２００３１９４７０４号（請求項４５）；
相互参照：ＧＩ：３０１０２４４９；ＡＡＰ１４９５４．１；ＡＹ２６０７６３＿１

（２６）ＢＡＦＦ−Ｒ（Ｂ細胞活性化因子レセプター，ＢＬｙＳレセプター３，ＢＲ３，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１１６４５６）；ＢＡＦＦレセプター／ｐｉｄ＝ＮＰ＿４４３１７７．１ − ホモサピエンス
Thompson, J.S., et al Science 293 (5537), 2108-2111 (2001)；国際公開第２００４０５８３０９号；国際公開第２００４０１１６１１；国際公開第２００３０４５４２２号（実施例；頁３２−３３）；国際公開第２００３０１４２９４号（請求項３５；図６Ｂ）；国際公開第２００３０３５８４６号（請求項７０；頁６１５−６１６）；国際公開第２００２９４８５２号（Ｃｏｌ １３６−１３７）；国際公開第２００２３８７６６号（請求項３；頁１３３）；国際公開第２００２２４９０９号（実施例３；図３）；
相互参照：ＭＩＭ：６０６２６９；ＮＰ＿４４３１７７．１；ＮＭ＿０５２９４５＿１；ＡＦ１３２６００

（２７）ＣＤ２２（Ｂ細胞レセプターＣＤ２２−Ｂアイソフォーム，ＢＬ−ＣＡＭ，Ｌｙｂ−８，Ｌｙｂ８，ＳＩＧＬＥＣ−２，ＦＬＪ２２８１４，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＫ０２６４６７）；
Wilson et al (1991) J. Exp. Med. 173:137-146；国際公開第２００３０７２０３６号（請求項１；図１）；
相互参照：ＭＩＭ：１０７２６６；ＮＰ＿００１７６２．１；ＮＭ＿００１７７１＿１

（２８）ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ，ＣＤ７９α，免疫グロブリン関連アルファ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｌｐｈａ），免疫グロブリンベータ（ＣＤ７９Ｂ）と共有結合性に相互作用し、ＩｇＭ分子と表面上で複合体を形成し、Ｂ細胞分化に関与するシグナルを伝達するＢ細胞特異的タンパク質），等電点：４．８４，分子量：２５０２８ ＴＭ：２［Ｐ］遺伝子染色体：１９ｑ１３．２，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７７４．１０）
国際公開第２００３０８８８０８号；米国特許出願公開第２００３０２２８３１９号；国際公開第２００３０６２４０１号（請求項９）；米国特許出願公開第２００２１５０５７３号（請求項４、頁１３−１４）；国際公開第９９５８６５８号（請求項１３、図１６）；国際公開第９２０７５７４号（図１）；米国特許第５６４４０３３号； Ha et al (1992) J. Immunol. 148(5):1526-1531; Mueller et al (1992) Eur. J. Biochem. 22:1621-1625; Hashimoto et al (1994) Immunogenetics 40(4):287-295; Preud'homme et al (1992) Clin. Exp. Immunol. 90(1):141-146; Yu et al (1992) J. Immunol. 148(2) 633-637; Sakaguchi et al (1988) EMBO J. 7(11):3457-3464；

（２９）ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫レセプター１は、ＣＸＣＬ１３ケモカインによって活性化され、リンパ球遊走及び体液性防御において機能し、ＨＩＶ−２感染、おそらくエイズ、リンパ腫、骨髄腫、及び白血病の発症において役割を果たす、Ｇタンパク質共役型レセプター）；３７２アミノ酸，等電点：８．５４ 分子量：４１９５９ ＴＭ：７［Ｐ］遺伝子染色体：１１ｑ２３．３，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７０７．１）
国際公開第２００４０４００００号；国際公開第２００４０１５４２６号；米国特許出願公開第２００３１０５２９２号（実施例２）；米国特許第６５５５３３９号（実施例２）；国際公開第２００２６１０８７号（図１）；国際公開第２００１５７１８８号（請求項２０，頁２６９）；国際公開第２００１７２８３０号（頁１２−１３）；国際公開第２０００２２１２９号（実施例１，頁１５２−１５３，実施例２，頁２５４−２５６）；国際公開第９９２８４６８号（請求項１，頁３８）；米国特許第５４４００２１号（実施例２，ｃｏｌ ４９−５２）；国際公開第９４２８９３１号（頁５６−５８）；国際公開第９２１７４９７号（請求項７，図５）；Dobner et al (1992) Eur. J. Immunol. 22:2795-2799; Barella et al (1995) Biochem. J. 309:773-779；

（３０）ＨＬＡ−ＤＯＢ（ペプチドを結合しそれらをＣＤ４＋Ｔリンパ球に提示するＭＨＣクラスＩＩ分子（Ｉａ抗原）のベータサブユニット）；２７３アミノ酸，等電点：６．５６ 分子量：３０８２０ ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：６ｐ２１．３，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２１１１．１）
Tonnelle et al (1985) EMBO J. 4(11):2839-2847; Jonsson et al (1989) Immunogenetics 29(6):411-413; Beck et al (1992) J. Mol. Biol. 228:433-441; Strausberg et al (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899-16903; Servenius et al (1987) J. Biol. Chem. 262:8759-8766; Beck et al (1996) J. Mol. Biol. 255:1-13; Naruse et al (2002) Tissue Antigens 59:512-519；国際公開第９９５８６５８号（請求項１３，図１５）；米国特許第６１５３４０８号（Ｃｏｌ ３５−３８）；米国特許第５９７６５５１号（ｃｏｌ １６８−１７０）；米国特許第６０１１１４６号（ｃｏｌ １４５−１４６）；Kasahara et al (1989) Immunogenetics 30(1):66-68; Larhammar et al (1985) J. Biol. Chem. 260(26):14111-14119；

（３１）Ｐ２Ｘ５（プリンレセプターＰ２Ｘリガンド開口型イオンチャネル５は、細胞外ＡＴＰにより開閉されるイオンチャネルであり、シナプス伝達及び神経発生に関与する可能性があり、欠乏は、特発性排尿筋不安定性の病態生理の一因となり得る；４２２アミノ酸），等電点：７．６３，分子量：４７２０６ ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：１７ｐ１３．３，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２５５２．２）
Le et al (1997) FEBS Lett. 418(1-2):195-199；国際公開第２００４０４７７４９号；国際公開第２００３０７２０３５号（請求項１０）；Touchman et al (2000) Genome Res. 10:165-173；国際公開第２００２２２６６０号（請求項２０）；国際公開第２００３０９３４４４号（請求項１）；国際公開第２００３０８７７６８号（請求項１）；国際公開第２００３０２９２７７号（頁８２）；

（３２）ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２，Ｌｙｂ−２）ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＥＱＵＥＮＣＥ Ｆｕｌｌ ｍａｅａｉｔｙ．．．ｔａｆｒｆｐｄ（１．．３５９；３５９アミノ酸），等電点：８．６６，分子量：４０２２５ ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：９ｐ１３．３，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７７３．１）
国際公開第２００４０４２３４６号（請求項６５）；国際公開第２００３０２６４９３号（頁５１−５２，５７−５８）；国際公開第２０００７５６５５号（頁１０５−１０６）；Von Hoegen et al (1990) J. Immunol. 144(12):4870-4877; Strausberg et al (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899-16903；

（３３）ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５），ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質であり、Ｂ細胞の活性化及びアポトーシスを制御し、機能喪失は全身性エリテマトーデスの患者における疾患活性の上昇に関連する）；６６１アミノ酸，等電点：６．２０，分子量：７４１４７ ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：５ｑ１２，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５５７３．１）
米国特許出願公開第２００２１９３５６７号；国際公開第９７０７１９８号（請求項１１，頁３９−４２）；Miura et al (1996) Genomics 38(3):299-304; Miura et al (1998) Blood 92:2815-2822；国際公開第２００３０８３０４７号；国際公開第９７４４４５２号（請求項８，頁５７−６１）；国際公開第２０００１２１３０号（頁２４−２６）；

（３４）ＦｃＲＨ１（Ｆｃレセプター様タンパク質１，Ｃ２タイプＩｇ様ドメイン及びＩＴＡＭドメインを含む免疫グロブリンＦｃドメインについての推定上のレセプターであり、Ｂ−リンパ球分化において役割を有し得る）；４２９アミノ酸，等電点：５．２８，分子量：４６９２５ ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：１ｑ２１−１ｑ２２，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿４４３１７０．１）
国際公開第２００３０７７８３６号；国際公開第２００１３８４９０号（請求項６，図１８Ｅ−１−１８−Ｅ−２）；Davis et al (2001) Proc. Natl. Acad. Sci USA 98(17):9772-9777；国際公開第２００３０８９６２４号（請求項８）；欧州特許第１３４７０４６号（請求項１）；国際公開第２００３０８９６２４号（請求項７）；

（３５）ＩＲＴＡ２（免疫グロブリンスーパーファミリーレセプタートランスロケーション関連２（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ２）、Ｂ細胞発生及びリンパ腫形成において役割を有し得る推定上の免疫レセプター；一部のＢ細胞悪性腫瘍においてトランスロケーションによる遺伝子の調節解除が発生する）；９７７アミノ酸，等電点：６．８８ 分子量：１０６４６８ ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：１ｑ２１，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ヒト：ＡＦ３４３６６２，ＡＦ３４３６６３，ＡＦ３４３６６４，ＡＦ３４３６６５，ＡＦ３６９７９４，ＡＦ３９７４５３，ＡＫ０９０４２３，ＡＫ０９０４７５，ＡＬ８３４１８７，ＡＹ３５８０８５；マウス：ＡＫ０８９７５６，ＡＹ１５８０９０，ＡＹ５０６５５８；ＮＰ＿１１２５７１．１
国際公開第２００３０２４３９２号（請求項２，図９７）； Nakayama et al (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 277(1):124-127；国際公開第２００３０７７８３６号；国際公開第２００１３８４９０号（請求項３，図１８Ｂ−１−１８Ｂ−２）；

（３６）ＴＥＮＢ２（ＴＭＥＦＦ２，ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ，ＴＰＥＦ，ＨＰＰ１，ＴＲ，増殖因子のＥＧＦ／ヘレグリンファミリー及びフォリスタチンに関連する推定上の膜貫通型プロテオグリカン）；３７４アミノ酸，ＮＣＢＩ受託番号：ＡＡＤ５５７７６，ＡＡＦ９１３９７，ＡＡＧ４９４５１，ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０５７２７６；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ：２３６７１；ＯＭＩＭ：６０５７３４；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｑ９ＵＩＫ５；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１７９２７４；ＡＹ３５８９０７，ＣＡＦ８５７２３，ＣＱ７８２４３６
国際公開第２００４０７４３２０号（配列番号８１０）；特開２００４−１１３１５１号公報（配列番号２，４，８）；国際公開第２００３０４２６６１号（配列番号５８０）；国際公開第２００３００９８１４号（配列番号４１１）；欧州特許第１２９５９４４号（頁６９−７０）；国際公開第２００２３０２６８号（頁３２９）；国際公開第２００１９０３０４号（配列番号２７０６）；米国特許出願公開第２００４２４９１３０号；米国特許出願公開第２００４０２２７２７号；国際公開第２００４０６３３５５号；米国特許出願公開第２００４１９７３２５号；米国特許出願公開第２００３２３２３５０号；米国特許出願公開第２００４００５５６３号；米国特許出願公開第２００３１２４５７９号；Horie et al (2000) Genomics 67:146-152; Uchida et al (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:593-602; Liang et al (2000) Cancer Res. 60:4907-12; Glynne-Jones et al (2001) Int J Cancer. Oct 15;94(2):178-84；

（３７）ＰＭＥＬ１７（シルバーホモログ（ｓｉｌｖｅｒ ｈｏｍｏｌｏｇ）；ＳＩＬＶ；Ｄ１２Ｓ５３Ｅ；ＰＭＥＬ１７；（ＳＩ）；（ＳＩＬ）；ＭＥ２０；ｇｐ１００）ＢＣ００１４１４；ＢＴ００７２０２；Ｍ３２２９５；Ｍ７７３４８；ＮＭ＿００６９２８； McGlinchey, R.P. et al (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (33), 13731-13736; Kummer, M.P. et al (2009) J. Biol. Chem. 284 (4), 2296-2306；

（３８）ＴＭＥＦＦ１（ＥＧＦ様及び２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通型タンパク質１；Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ−１；Ｈ７３６５；Ｃ９ｏｒｆ２；Ｃ９ＯＲＦ２；Ｕ１９８７８；Ｘ８３９６１）ＮＭ＿０８０６５５；ＮＭ＿００３６９２； Harms, P.W. (2003) Genes Dev. 17 (21), 2624-2629; Gery, S. et al (2003) Oncogene 22 (18):2723-2727；

（３９）ＧＤＮＦ−Ｒａ１（ＧＤＮＦファミリーレセプターアルファ１；ＧＦＲＡ１；ＧＤＮＦＲ；ＧＤＮＦＲＡ；ＲＥＴＬ１；ＴＲＮＲ１；ＲＥＴ１Ｌ；ＧＤＮＦＲ−アルファ１；ＧＦＲ−ＡＬＰＨＡ−１；Ｕ９５８４７；ＢＣ０１４９６２；ＮＭ＿１４５７９３）ＮＭ＿００５２６４； Kim,M.H. et al (2009) Mol. Cell. Biol. 29 (8), 2264-2277; Treanor, J.J. et al (1996) Nature 382 (6586):80-83；

（４０）Ｌｙ６Ｅ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｅ；Ｌｙ６７，ＲＩＧ−Ｅ，ＳＣＡ−２，ＴＳＡ−１）ＮＰ＿００２３３７．１；ＮＭ＿００２３４６．２； de Nooij-van Dalen,A.G. et al (2003) Int. J. Cancer 103 (6), 768-774; Zammit,D.J. et al (2002) Mol. Cell. Biol. 22 (3):946-952；

（４１）ＴＭＥＭ４６（シサホモログ（ｓｈｉｓａ ｈｏｍｏｌｏｇ）２（アフリカツメガエル）；ＳＨＩＳＡ２）ＮＰ＿００１００７５３９．１；ＮＭ＿００１００７５３８．１； Furushima,K. et al (2007) Dev. Biol. 306 (2), 480-492; Clark,H.F. et al (2003) Genome Res. 13 (10):2265-2270；

（４２）Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｇ６Ｄ；Ｌｙ６−Ｄ，ＭＥＧＴ１）ＮＰ＿０６７０７９．２；ＮＭ＿０２１２４６．２； Mallya, M. et al (2002) Genomics 80 (1):113-123; Ribas,G. et al (1999) J. Immunol. 163 (1):278-287；

（４３）ＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型レセプター５；ＧＰＲ４９，ＧＰＲ６７）ＮＰ＿００３６５８．１；ＮＭ＿００３６６７．２；Salanti,G. et al (2009) Am. J. Epidemiol. 170 (5):537-545; Yamamoto,Y. et al (2003) Hepatology 37 (3):528-533；

（４４）ＲＥＴ（ｒｅｔプロトオンコジーン；ＭＥＮ２Ａ；ＨＳＣＲ１；ＭＥＮ２Ｂ；ＭＴＣ１；（ＰＴＣ）；ＣＤＨＦ１２；Ｈｓ．１６８１１４；ＲＥＴ５１；ＲＥＴ−ＥＬＥ１）ＮＰ＿０６６１２４．１；ＮＭ＿０２０９７５．４；Tsukamoto,H. et al (2009) Cancer Sci. 100 (10):1895-1901; Narita,N. et al (2009) Oncogene 28 (34):3058-3068；

（４５）ＬＹ６Ｋ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ；ＬＹ６Ｋ；ＨＳＪ００１３４８；ＦＬＪ３５２２６）ＮＰ＿０５９９９７．３；ＮＭ＿０１７５２７．３； Ishikawa,N. et al (2007) Cancer Res. 67 (24):11601-11611; de Nooij-van Dalen,A.G. et al (2003) Int. J. Cancer 103 (6):768-774；

（４６）ＧＰＲ１９（Ｇタンパク質共役型レセプター１９；Ｍｍ．４７８７）ＮＰ＿００６１３４．１；ＮＭ＿００６１４３．２；Montpetit, A. and Sinnett,D. (1999) Hum. Genet. 105 (1-2):162-164; O'Dowd, B.F. et al (1996) FEBS Lett. 394 (3):325-329；

（４７）ＧＰＲ５４（ＫＩＳＳ１レセプター；ＫＩＳＳ１Ｒ；ＧＰＲ５４；ＨＯＴ７Ｔ１７５；ＡＸＯＲ１２）ＮＰ＿１１５９４０．２；ＮＭ＿０３２５５１．４； Navenot, J.M. et al (2009) Mol. Pharmacol. 75 (6):1300-1306; Hata, K. et al (2009) Anticancer Res. 29 (2):617-623；

（４８）ＡＳＰＨＤ１（アスパラギン酸β−ヒドロキシラーゼドメイン含有１；ＬＯＣ２５３９８２）ＮＰ＿８５９０６９．２；ＮＭ＿１８１７１８．３； Gerhard, D.S. et al (2004) Genome Res. 14 (10B):2121-2127；

（４９）チロシナーゼ（ＴＹＲ；ＯＣＡＩＡ；ＯＣＡ１Ａ；チロシナーゼ；ＳＨＥＰ３）ＮＰ＿０００３６３．１；ＮＭ＿０００３７２．４； Bishop,D.T. et al (2009) Nat. Genet. 41 (8):920-925; Nan, H. et al (2009) Int. J. Cancer 125 (4):909-917；

（５０）ＴＭＥＭ１１８（リングフィンガータンパク質，膜貫通型２；ＲＮＦＴ２；ＦＬＪ１４６２７）ＮＰ＿００１１０３３７３．１；ＮＭ＿００１１０９９０３．１； Clark, H.F. et al (2003) Genome Res. 13 (10):2265-2270; Scherer,S.E. et al (2006) Nature 440 (7082):346-351

（５１）ＧＰＲ１７２Ａ（Ｇタンパク質共役型レセプター１７２Ａ；ＧＰＣＲ４１；ＦＬＪ１１８５６；Ｄ１５Ｅｒｔｄ７４７ｅ）ＮＰ＿０７８８０７．１；ＮＭ＿０２４５３１．３； Ericsson, T.A. et al (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (11):6759-6764; Takeda, S. et al (2002) FEBS Lett. 520 (1-3):97-101．
親抗体はまた、アルブミン結合ペプチド（ＡＢＰ）配列を有する融合タンパク質であってもよい（Dennis et al. (2002) “Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins" J Biol Chem. 277:35035-35043；国際公開第０１／４５７４６号）。本発明の抗体は、（ｉ） Dennis et al (2002) J Biol Chem. 277:35035-35043の表ＩＩＩ及びＩＶ、頁３５０３８；（ｉｉ）米国特許出願公開第２００４０００１８２７号の［００７６］；及び（ｉｉｉ）国際公開第０１／４５７４６号の頁１２−１３に記載のＡＢＰ配列を有する融合タンパク質を含み、その全てが参照により本明細書に援用される。
突然変異によるシステイン操作抗体を調製するため、出発ポリペプチドのアミノ酸配列変異体をコードするＤＮＡが当技術分野で公知の種々の方法により調製される。これらの方法は、ポリペプチドをコードする前に調製したＤＮＡの部位特異的（又はオリゴヌクレオチド介在性）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、及びカセット変異誘発による調製を含むがこれらに限定されない。組換え抗体の変異体は、制限断片の操作によって、又はは合成オリゴヌクレオチドとの重複伸長ＰＣＲによっても構築されうる。変異誘発プライマーは、システインのコドンの置換をコードする。標準的な変異誘発法が、そのような変異システイン操作抗体をコードするＤＮＡを生成するために用いることができる。一般的なガイダンスは、Sambrook et al Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989;及びAusubel et al Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, N.Y., 1993に見出すことができる。
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号で説明したように、組換え法及び組成物を用いて製造することができる。一実施態様において、単離された核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。更なる実施態様において、そのような核酸を含む一以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様において、宿主細胞は以下を含む（例えば、以下で形質転換される）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二ベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様において、方法は、上記のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、及び必要に応じて、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。
組換え生産のために、例えば上述したように、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために一以上のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は細菌で産生することができる。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、第５７８９１９９号及び第５８４０５２３号を参照。（また、大腸菌における抗体の発現を説明している、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254も参照）。発現の後、抗体は可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され、更に精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、そのグリコシル化経路が、「ヒト化」されている菌類や酵母菌株を含む抗体をコードするベクターのための、適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の生成をもたらす。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)を参照。グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。米国特許第５９５９１７７号、米国特許第６０４０４９８号、米国特許第６４２０５４８号、米国特許第７１２５９７８号、米国特許第６４１７４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載している）に記載されるもののような植物細胞培養物もまた宿主として利用することができる。脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適応された哺乳動物細胞株は有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３細胞又は２９３細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスのセルトリ細胞（Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えば、Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ− ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。
部位特異的変異誘発法は、置換変異体、すなわち変異タンパク質を作製するための一つの方法である（Carter (1985) et al Nucleic Acids Res. 13:4431-4443; Ho et al (1989) Gene (Amst.) 77:51-59；及びKunkel et al (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488）。出発ＤＮＡは、望ましい変異をコードするオリゴヌクレオチドをその出発ＤＮＡの一本鎖に最初にハイブリダイズすることで改変される。ハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーとしてハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドを使用し、テンプレートとして出発ＤＮＡの一本鎖を使用して、第二鎖全体を合成するために使用される。従って、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドが得られた二本鎖ＤＮＡに組み込まれる。部位特異的変異誘発法は、変異を誘発されるべきタンパク質を発現プラスミド内で発現する遺伝子内で行うことができ、得られたプラスミドは配列が決定され、望まれるシステイン置換変異生成の導入を確認する（Liu et al (1998) J. Biol. Chem. 273:20252-20260）。部位特異的プロトコールや形式は広く入手可能なもの、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）多重部位特異的変異生成キット（ストラタジーン、ラホーヤ、カリフォルニア州）である。
ＰＣＲ突然変異誘発はまた、出発ポリペプチドのアミノ酸配列変異体を作るのに適している。Higuchi, (1990) in PCR Protocols, pp.177-183, Academic Press; Ito et al (1991) Gene 102:67-70; Bernhard et al (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132; 及びVallette et al (1989) Nuc. Acids Res. 17:723-733を参照。簡単に説明すると、ＰＣＲにおける出発物質としてテンプレートＤＮＡの少量が用いられる場合、テンプレートＤＮＡの対応する領域とは配列が若干異なるプライマーが、プライマーがテンプレートとは異なる場所においてのみ、テンプレート配列とは異なる特異的ＤＮＡ断片の比較的多量を産生するために用いることができる。
変異体を調製するための別の方法であるカセット式変異誘発は、Wells et al (1985) Gene 34:315-323により記載される技術にもとずく。出発材料は、変異されるべき出発ポリペプチドを含むプラスミド（又は他のベクター）である。変異されるべき出発ＤＮＡのコドンが同定される。同定された変異部位のそれぞれの側にユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位が存在する必要がある。そのような制限酵素部位が存在しない場合、それらは出発ポリペプチドＤＮＡの適切な場所でそれらを導入するために、上記オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発法を用いて生成される場合がある。プラスミドＤＮＡは、それを線形化するために、これらの部位で切断される。制限部位間のＤＮＡの配列をコードするが、望まれる変異を含む二本鎖オリゴヌクレオチドは、標準的な方法を用いて合成され、ここでオリゴヌクレオチドの二本鎖は別々に合成され、標準的な技術を用いて一緒にハイブリダイズされる。この二本鎖オリゴヌクレオチドは、カセットと呼ばれる。このカセットは、それが直接プラスミドにライゲーションすることができるように、線状プラスミドの両端と一致する５’及び３’の両端を持つように設計されている。このプラスミドは、今や変異ＤＮＡ配列を含む。コードされたシステインの置換を含む変異体ＤＮＡは、ＤＮＡ配列決定により確認することができる。
単一の変異はまた、ＰＣＲに基づく変異誘発によって、テンプレートとして二本鎖プラスミドＤＮＡを用いたオリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発によって生成される（Sambrook and Russel, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; Zoller et al (1983) Methods Enzymol. 100:468-500; Zoller, M.J. and Smith, M. (1982) Nucl. Acids Res. 10:6487-6500）。
ある実施態様において、一以上のアミノ酸改変を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入することができ、それによってＦｃ領域変異体を生成する。Ｆｃ領域の変異体は、１つ又は複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域の配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでもよい。
ある実施態様において、本発明は、インビボにおける抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣなど）が不要又は有害である用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体を意図している。インビトロ及び／又はインビボでの細胞毒性アッセイを、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠くが（それゆえ、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認するために行うことができる。
ＣＢＩ二量体薬物部分
本発明の抗体−薬物コンジュゲート化合物は、ＣＢＩ二量体薬物部分Ｄを含む。ＣＢＩ二量体薬物部分は、二つのＣＢＩ薬物単位又は１つのＣＢＩ薬物単位及び一つのＰＢＤ薬物単位から構成され得る。
ＣＢＩ二量体薬物部分Ｄは式：
Figure 2017503010
を有し、
ここで
Ｒ１は、Ｈ，Ｐ（Ｏ）３Ｈ２，Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂから選択され；
Ｒ２は、Ｈ，Ｐ（Ｏ）３Ｈ２，Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂから選択され；
Ｒａ及びＲｂは、Ｈ及び一以上のＦで任意置換されたＣ１−Ｃ６アルキルから独立に選択され，
又はＲａ及びＲｂは、５又は６員複素環基を形成し；
Ｔは、Ｃ３−Ｃ１２アルキレン，Ｙ，（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン），（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン），（Ｃ２−Ｃ６アルケニレン）−Ｙ−（Ｃ２−Ｃ６アルケニレン）及び（Ｃ２−Ｃ６アルキニレン）−Ｙ−（Ｃ２−Ｃ６アルキニレン）から選択されるテザー基であり；
ここで、ＹはＯ、Ｓ、ＮＲ１、アリール、及びヘテロアリールから独立に選択され；
ここで、アルキレン、アルケニレン、アリール、及びヘテロアリールは、Ｆ，ＯＨ，Ｏ（Ｃ１−Ｃ６アルキル），ＮＨ２，ＮＨＣＨ３，Ｎ（ＣＨ３）２，ＯＰ（Ｏ）３Ｈ２，及びＣ１−Ｃ６アルキルで独立に任意置換され、ここでアルキルは、一以上のＦで任意置換され；
又はアルキレン、アルケニレン、アリール及びヘテロアリールは、Ｌへの結合で独立に任意置換され；
Ｄ’は
Figure 2017503010
から選択される薬物部分であり、
ここで波線はＴへの結合部位を示し；
Ｘ１及びＸ２は、Ｏ及びＮＲ３から独立に選択され、ここでＲ３は、Ｈ及び一以上のＦで任意置換されたＣ１−Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ４は、Ｈ，ＣＯ２Ｒであり、ここでＲはＣ１−Ｃ６アルキル又はベンジルであり；及び
Ｒ５は、Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキルである。
ある実施態様において、Ｙは、フェニル、ピリジル、１−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール、又は［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジンである。
ＣＢＩ二量体薬物部分Ｄ化合物は、表３のリンカーＣＢＩ薬物中間体を調製するために有用である表１のものを含む。
Figure 2017503010
Figure 2017503010
Figure 2017503010
ＣＢＩ二量体薬物部分Ｄ化合物を調製するために有用なテザー試薬は表２のものが含まれる。
Figure 2017503010
Figure 2017503010
リンカー
本発明の抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）化合物は、式：
Figure 2017503010
を有するリンカーＬを含み、
ここで、Ｓｔｒは抗体に共有結合したストレッチャー単位であり；Ｐｅｐは２から１２個のアミノ酸残基の任意のペプチド単位であり、Ｓｐは二量体の薬物部分に共有結合した任意のスペーサー単位であり、ｍ及びｎは０及び１から独立に選択され；
例示的な実施態様において、Ｓｔｒは、１，３−二置換、ピロリジン−２，５−ジオン（スクシンイミド）式：
Figure 2017503010
を有し、
ここで、Ｒ６は、Ｃ１−Ｃ１０アルキレン，Ｃ３−Ｃ８カルボシクリル，Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル），アリーレン，Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−アリーレン，アリーレン−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン，Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−（Ｃ３−Ｃ８カルボシクリル），（Ｃ３−Ｃ８カルボシクリル）−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン，Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクリル，Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクリル），（Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクリル）−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン，Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ８）−Ｃ２−Ｃ６アルキレン−Ｎ（Ｒ８），Ｎ（Ｒ８）−（Ｃ２−Ｃ６アルキレン）及び（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２からなる群から選択され；ここでＲ８は、Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、ｒは１から１０の範囲の整数である。
Ｓｔｒストレッチャー単位の１，３−二置換型、ピロリジン−２，５−ジオンの実施態様が、表４に記載されるもののようなリンカー−薬物中間体のマレイミド基との抗体のシステインチオールのコンジュゲーションから形成することができる。
別の例示的な実施態様において、Ｓｔｒは式：
Figure 2017503010
を有し、
ここで、Ｒ７は、Ｃ１−Ｃ１０アルキレン，Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−Ｏ，Ｎ（Ｒ８）−（Ｃ２−Ｃ６アルキレン）−Ｎ（Ｒ８），Ｎ（Ｒ８）−（Ｃ２−Ｃ６アルキレン），及び（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２から選択され；ここでＲ８はＨ又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、ｒは１から１０の範囲の整数である。
別の例示的な実施態様において、Ｓｔｒは式：
Figure 2017503010
を有し、
ここで、Ｒ９は、Ｃ１−Ｃ１０アルキレン，Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−Ｏ，（Ｃ２−Ｃ６アルキレン）−Ｎ（Ｒ８），及び（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２から選択され；ここでＲ８は、Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、ｒは１から１０の範囲の整数である。
別の例示的な実施態様において、Ｌは、抗体のシステインアミノ酸とジスルフィド結合を形成し、Ｒ９は、Ｃ２−Ｃ６アルキレン−Ｏであり、ここでアルキレンは、Ｆ，ＯＨ，Ｏ（Ｃ１−Ｃ６アルキル），ＮＨ２，ＮＨＣＨ３，Ｎ（ＣＨ３）２，ＯＰ（Ｏ）３Ｈ２，及びＣ１−Ｃ６アルキルと任意置換され、ここでアルキルは一以上のＦと任意置換される。
リンカー試薬及びリンカー−薬物中間体は、２から１２個以上のアミノ酸残基のペプチド単位を有していてもよい。
例示的な実施態様において、ｍが１であり、Ｐｅｐは、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、リジン、アルギニン、バリン、及びシトルリンから独立に選択される２から１２個のアミノ酸残基を含む。
例示的な実施態様において、Ｐｅｐはバリン−シトルリンである。
ペプチド−リンカー試薬は、記載されるように調製された（国際公開第２０１２１１３８４７号；米国特許第７６５９２４１号；米国特許第７４９８２９８号；米国特許出願公開第２００９／０１１１７５６号；米国特許出願公開第２００９／００１８０８６号；米国特許第６２１４３４５号； Dubowchik et al (2002) Bioconjugate Chem. 13(4):855-869）。
例示的な実施態様において、Ｓｐは、パラ−アミノベンジル又はパラ−アミノベンジルオキシカルボニルを含む。
表３は、表４のリンカーＣＢＩ薬物中間体を調製するために有用な例示的なリンカー試薬を示す。
Figure 2017503010
ＡＤＣに有用なリンカー−薬物中間体
抗体−薬物コンジュゲートを調製するための抗体へのコンジュゲーションに有用なリンカー−薬物中間体は、式：
Figure 2017503010
を有し、
ここで、
Ｘは、マレイミド、チオール、アミノ、ブロミド、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ヨウ化物、ヒドロキシル、カルボキシル、ピリジルジスルフィド、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドから選択される反応性官能基である。
Ｌは、式：
Figure 2017503010
を有するリンカーであり；
ここで、Ｓｔｒは反応性官能基Ｘに共有結合したストレッチャー単位であり；Ｐｅｐは２から１２個のアミノ酸残基の任意のペプチド単位であり、Ｓｐは二量体の薬物部分に共有結合した任意のスペーサー単位であり、ｍ及びｎは０及び１から独立に選択され；
Ｄは式：
Figure 2017503010
を有する二量体薬物部分であり、
ここで
Ｒ１は、Ｈ，Ｐ（Ｏ）３Ｈ２，Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ，又はＬへの結合から選択され；
Ｒ２は、Ｈ，Ｐ（Ｏ）３Ｈ２，Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ，又はＬへの結合から選択され；
Ｒａ及びＲｂは、Ｈ及び一以上のＦで任意置換されたＣ１−Ｃ６アルキルから独立に選択され、又はＲａ及びＲｂは、５又は６員複素環基を形成し；
Ｔは、Ｃ３−Ｃ１２アルキレン，Ｙ，（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン），（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン），（Ｃ２−Ｃ６アルケニレン）−Ｙ−（Ｃ２−Ｃ６アルケニレン）及び（Ｃ２−Ｃ６アルキニレン）−Ｙ−（Ｃ２−Ｃ６アルキニレン）から選択されるテザー基であり；
ここで、ＹはＯ、Ｓ、ＮＲ１、アリール、及びヘテロアリールから独立に選択され；
ここで、アルキレン、アルケニレン、アリール、及びヘテロアリールは、Ｆ，ＯＨ，Ｏ（Ｃ１−Ｃ６アルキル），ＮＨ２，ＮＨＣＨ３，Ｎ（ＣＨ３）２，ＯＰ（Ｏ）３Ｈ２，及びＣ１−Ｃ６アルキルで独立に任意置換され、ここでアルキルは、一以上のＦで任意置換され；
又はアルキレン、アルケニレン、アリール及びヘテロアリールは、Ｌへの結合で独立に任意置換され；
Ｄ’は、
Figure 2017503010
から選択される薬物部分であり、
ここで波線はＴへの結合部位を示し；
Ｘ１及びＸ２は、Ｏ及びＮＲ３から独立に選択され、ここでＲ３は、Ｈ及び一以上のＦで任意置換されたＣ１−Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ４は、Ｈ，ＣＯ２Ｒ、又はＬへの結合であり、ここでＲはＣ１−Ｃ６アルキル又はベンジルであり；及び
Ｒ５は、Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキルである。
実施例１〜１８及び図１〜２４に例示されるように、表４のリンカー−薬物中間体は、リンカー試薬とＣＢＩ二量体薬物部分を結合させることによって調製された。
Figure 2017503010
Figure 2017503010
Figure 2017503010
Figure 2017503010
Figure 2017503010
Figure 2017503010
Figure 2017503010
Figure 2017503010
Figure 2017503010
Figure 2017503010
抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）
本発明の抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）化合物は、強力なＣＢＩ二量体薬物部分に連結された腫瘍関連抗原に特異的な抗体を含み、癌を含む多数ｕの過剰増殖性疾患に効果的な治療活性を有するものが含まれる。薬物部分の生物学的活性は、抗体との結合によって調節される。本発明のＡＤＣは、ＣＢＩ二量体薬物又は毒素の有効量を腫瘍細胞又は部位に選択的に送達し、それによって治療指数（「治療ウインドウ」）を増加させつつ、より大きな選択性、すなわちより低い有効用量を達成することができる。例示的な実施態様において、ＡＤＣ化合物は、ＣＢＩ二量体薬物部分に、リンカーによりコンジュゲートした、すなわち共有結合したシステイン操作抗体を含む。
本発明の抗体−薬物コンジュゲート化合物は、式：
Figure 2017503010
を有し、
ここで、
Ａｂは抗体であり；
Ｌは、式：
Figure 2017503010
を有するリンカーであり；
ここで、Ｓｔｒは抗体に共有結合したストレッチャー単位であり；Ｐｅｐは２から１２個のアミノ酸残基の任意のペプチド単位であり、Ｓｐは二量体の薬物部分に共有結合した任意のスペーサー単位であり、ｍ及びｎは０及び１から独立して選択され；
ｐは１から８の整数であり；
Ｄは式：
Figure 2017503010
を有する二量体薬物部分であり、
ここで
Ｒ１は、Ｈ，Ｐ（Ｏ）３Ｈ２，Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ，又はＬへの結合から選択され；
Ｒ２は、Ｈ，Ｐ（Ｏ）３Ｈ２，Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ，又はＬへの結合から選択され；
Ｒａ及びＲｂは、Ｈ及び一以上のＦで任意置換されたＣ１−Ｃ６アルキルから独立に選択され，
又はＲａ及びＲｂは、５又は６員複素環基を形成し；
Ｔは、Ｃ３−Ｃ１２アルキレン，Ｙ，（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン），（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン），（Ｃ２−Ｃ６アルケニレン）−Ｙ−（Ｃ２−Ｃ６アルケニレン）及び（Ｃ２−Ｃ６アルキニレン）−Ｙ−（Ｃ２−Ｃ６アルキニレン）から選択されるテザー基であり；
ここで、ＹはＯ、Ｓ、ＮＲ１、アリール、及びヘテロアリールから独立に選択され；
ここで、アルキレン、アルケニレン、アリール、及びヘテロアリールは、Ｆ，ＯＨ，Ｏ（Ｃ１−Ｃ６アルキル），ＮＨ２，ＮＨＣＨ３，Ｎ（ＣＨ３）２，ＯＰ（Ｏ）３Ｈ２，及びＣ１−Ｃ６アルキルで独立に任意置換され、ここでアルキルは、一以上のＦで任意置換され；
又はアルキレン、アルケニレン、アリール及びヘテロアリールは、Ｌへの結合で独立に任意置換され；
Ｄ’は
Figure 2017503010
から選択される薬物部分であり、
ここで波線はＴへの結合部位を示し；
Ｘ１及びＸ２は、Ｏ及びＮＲ３から独立して選択され、ここでＲ３は、Ｈ及び一以上のＦで任意置換されたＣ１−Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ４は、Ｈ，ＣＯ２Ｒであり、ここでＲはＣ１−Ｃ６アルキル又はベンジルであり；及び
Ｒ５はＨである。
一実施態様において、Ｒａ及びＲｂは、Ｎ−メチルピペラジニル、モルホリニル、ピペリジル、及びピロリジニルから選択される５又は６員複素環基を形成する。
一実施態様において、薬物部分はほとんどの哺乳動物細胞種に見られるリソソームプロテアーゼであるカテプシンＢにより切断可能なプロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーを介して抗体に結合されうる（米国特許第６２１４３４５号； Dubowchik et al (2002) Bioconj. Chem. 13:855-869）。本発明は、任意の特定の作用機序によって限定又は定義されないが、ＡＤＣは、リンカーが切断されるまで薬物が不活性であるという点で、プロドラッグとして作用してもよい。ＡＤＣは、疾患が従来の化学療法によっては不十分に治療され得る腫瘍細胞の位置で特異的に活性薬物を濃縮することができる。他の実施態様において、薬物部分は、ジスルフィド基又はスクシンイミジル基などのような官能性を含むことができる非ペプチドの非プロテアーゼ切断可能リンカーを介して抗体に結合される。
反応性のリンカー部分を介して抗体分子にコンジュゲートすることができる薬物部分の数は、本明細書に記載される方法によって導入される遊離システイン残基の数によって制限され得る。従って典型的なＡＤＣは、１、２、３、又は４つの操作されたシステインアミノ酸を有する抗体を含む（Lyon, R. et al (2012) Methods in Enzym. 502:123-138）。
一実施態様において、抗体−薬物コンジュゲート化合物は、式：
Figure 2017503010
を有し、
ここで、ＡＡ１及びＡＡ２は、アミノ酸側鎖から独立に選択される。アミノ酸側鎖は、Ｈ，−ＣＨ３，−ＣＨ２（Ｃ６Ｈ５），−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２，−ＣＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、及び−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２から独立に選択される。
一実施態様において、抗体−薬物コンジュゲート化合物は、式：
Figure 2017503010
を有する。
一実施態様において、抗体−薬物コンジュゲート化合物は、式：
Figure 2017503010
を有する。
一実施態様において、抗体−薬物コンジュゲート化合物は、式：
Figure 2017503010
を有する。
一実施態様において、抗体−薬物コンジュゲート化合物は、式：
Figure 2017503010
を有する。
一実施態様において、抗体−薬物コンジュゲート化合物は、式：
Figure 2017503010
を有する。
一実施態様において、抗体−薬物コンジュゲート化合物は、式：
Figure 2017503010
を有する。
一実施態様において、抗体−薬物コンジュゲート化合物は、式：
Figure 2017503010
を有する。
一実施態様において、抗体−薬物コンジュゲート化合物は、式：
Figure 2017503010
を有する。
ここで、Ｒ７は、Ｈ及びＣ１−Ｃ１２アルキルから独立に選択される。
一実施態様において、ｐは約１、２、３、又は４である。
一実施態様において、ｐは２である。
一実施態様において、Ｄは、表１に記載の化合物から選択される部分又はその誘導体である。
一実施態様において、Ｄは、表４に記載の化合物から選択される部分又はその誘導体である。
一実施態様において、本発明は、表５に記載の分子から選択されたコンジュゲートに関する。
ＡＤＣの薬物負荷
薬物負荷は、抗体あたりのＣＢＩ薬物部分の平均数である。薬物負荷は、抗体（Ａｂ）あたり１から８の薬物におよび得る。すなわち、ここで、１、２、３、４、５、６、７、及び８の薬物部分が抗体に共有結合され得る。ＡＤＣの組成物は、１〜８個の範囲の薬物にコンジュゲートした抗体の集団を含む。コンジュゲート反応からのＡＤＣの調製における抗体あたりの薬物の平均数は、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、電気泳動及びＨＰＬＣなどの一般的な手段により特徴づけられ得る。ｐの観点からＡＤＣの量的分布もまた決定され得る。ＥＬＩＳＡにより、ＡＤＣの特定の調製物におけるｐの平均値を決定することができる（Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Sanderson et al (2005) Clin. Cancer Res. 11:843-852）。しかし、ｐ（薬物）値の分布は、抗体−抗原結合及びＥＬＩＳＡの検出限界によって識別可能ではない。また、薬物部分が重鎖若しくは軽鎖断片、又は特定のアミノ酸残基など抗体に結合されている場合、抗体−薬物コンジュゲートの検出のためのＥＬＩＳＡアッセイは判断しない。場合によっては、均一なＡＤＣの分離、精製、及び特徴づけ（ｐは他の薬物負荷を伴うＡＤＣからの特定の何らかの値である）は、逆相ＨＰＬＣ又は電気泳動などの手段により達成され得る。
幾つかの抗体−薬物コンジュゲートの場合、ｐは抗体の結合部位の数によって限定され得る。例えば、抗体は一又は複数のシステインチオール基のみを有するか、又はそれを介してリンカーが結合する一又は複数の十分に反応性のチオール基を有することができる。より高い薬物負荷、例えばｐ＞５は、特定の抗体−薬物コンジュゲートの凝集、不溶化、毒性、又は細胞透過性の喪失を引き起こすことがある。
典型的には、理論的最大値を下回る薬物部分がコンジュゲート反応の間に抗体にコンジュゲートされる。抗体は、例えば、リンカー−薬物中間体（Ｘ−Ｌ−Ｄ）又はリンカー試薬と反応しない多くのリジン残基を含むことができる。最も反応性のリジン基のみ、アミン反応性リンカー試薬と反応し得る。また、最も反応性のシステインチオール基のみが、チオール反応性リンカー試薬又はリンカー−薬物中間体と反応し得る。一般に、抗体は、もしあれば、薬物部分に連結することができる多くの遊離及び反応性のシステインチオール基を含まない。化合物の抗体におけるほとんどのシステインチオール残基はジスルフィド架橋として存在し、部分的又は完全な還元条件下でジチオスレイトール（ＤＴＴ）又はＴＣＥＰなどの還元剤で還元されなければならない。ＡＤＣの負荷（薬剤／抗体比率、「ＤＡＲ」）は、例えば、（ｉ）抗体に対してリンカー薬物中間体又はリンカー試薬のモル過剰量を限定すること、（ｉｉ）コンジュゲートの反応時間又は温度を限定すること、及び（ｉｉｉ）システインチオール修飾のための部分的又は限定的還元条件を含む、幾つかの異なる方法で制御され得る。
抗体の一以上の求核又は求電子基が、リンカー−薬物中間体、又はリンカー試薬、続いてＣＢＩ二量体薬物部分試薬と反応する場合、次いで、得られた生成物は、抗体に結合した薬物部分の分布、例えば、１、２、３などを有するＡＤＣ化合物の混合物である。ポリマー逆相（ＰＬＲＰ）及び疎水性相互作用（ＨＩＣ）などの液体クロマトグラフィー法は、薬物負荷値によって混合物中の化合物を分離することができる。単一薬物負荷値（ｐ）を有するＡＤＣの調製物を単離することができるが、しかし、薬物部分は、抗体上の異なる部位で、リンカーを介して結合させることができるため、これらの単一負荷値のＡＤＣは依然として不均一な混合物であり得る。したがって、本発明の抗体−薬物コンジュゲート組成物は、抗体が一以上の薬物部分を有し、薬物部分が種々のアミノ酸残基で抗体に結合され得る抗体−薬物コンジュゲート化合物の混合物を含む。
抗体−薬物コンジュゲートを調製する方法
本発明の典型的な抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）化合物１０１−１３９が、実施例２０に従って、表４に示されるようにリンカー−薬物中間体５１−６８をから調製された。
Figure 2017503010
Figure 2017503010
Figure 2017503010
抗ＮａＰｉ２ｂ抗体
表５のＡＤＣの抗ＮａＰｉ２ｂ抗体は、米国特許第８，５３５，６７５号に従って、３つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３）及び３つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３）を含む：
ＨＶＲ−Ｌ１ ＲＳＳＥＴＬＶＨＳＳＧＮＴＹＬＥ （配列番号７５）
ＨＶＲ−Ｌ２ ＲＶＳＮＲＦＳ （配列番号７６）
ＨＶＲ−Ｌ３ ＦＱＧＳＦＮＰＬＴ （配列番号７７）
ＨＶＲ−Ｈ１ ＧＦＳＦＳＤＦＡＭＳ （配列番号７８）
ＨＶＲ−Ｈ２ ＡＴＩＧＲＶＡＦＨＴＹＹＰＤＳＭＫＧ （配列番号７９）
ＨＶＲ−Ｈ３ ＡＲＨＲＧＦＤＶＧＨＦＤＦ （配列番号８０）
表５のＡＤＣの抗ＮａＰｉ２ｂ抗体は、配列番号８１に示される軽鎖可変領域（ＶＬ）及び配列番号８２に示される重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。

ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＥＴＬＶＨＳＳＧＮＴＹＬＥＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＲＶＳＮＲＦＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＦＱＧＳＦＮＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号８１）

ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＦＳＤＦＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＴＩＧＲＶＡＦＨＴＹＹＰＤＳＭＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＲＧＦＤＶＧＨＦＤＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号８２）
幾つかの実施態様において、本発明は、（ａ）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＮａＰｉ２ｂ抗体を提供する。
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗ＮａＰｉ２ｂ抗体を提供する。一実施態様において、抗体は、配列番号８０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。その他の実施態様において、抗体は、配列番号８０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。更なる実施態様において、抗体は、配列番号８０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。更なる実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
その他の態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）（ｉ）配列番号７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
その他の態様において、本発明は、（ａ）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。
上記実施態様の何れかにおいて、抗ＮａＰｉ２ｂ抗体はヒト化される。一実施態様において、抗ＮａＰｉ２ｂ抗体は、上記実施態様の何れかにおけるＨＶＲを含み、更に、ヒトアクセプターフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。ある実施態様において、ヒトアクセプターフレームワークは、ヒトＶＬカッパＩコンセンサス（ＶＬＫＩ）フレームワーク及び／又はＶＨフレームワークＶＨ１である。ある実施態様において、ヒトアクセプターフレームワークは、以下の変異の何れか一を含む、ヒトＶＬカッパＩコンセンサス（ＶＬＫＩ）フレームワーク及び／又はＶＨフレームワークＶＨ１である。
別の態様において、抗ＮａＰｉ２ｂ抗体は、配列番号８２のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。ある実施態様において、配列番号８２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＮａＰｉ２ｂ抗体はＮａＰｉ２ｂへ結合する能力を保持する。ある実施態様において、総計１から１０のアミノ酸が、配列番号８２において、置換され、挿入され、及び／又は欠失している。ある実施態様において、総計１から５のアミノ酸が、配列番号８２において、置換され、挿入され、及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）起きる。任意で、抗ＮａＰｉ２ｂ抗体は、配列番号８２のＶＨ配列を、その配列の翻訳後修飾を含め、包含する。特定の実施態様において、ＶＨは、（ａ）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される一、二、又は三つのＨＶＲを含む。
別の態様において、抗ＮａＰｉ２ｂ抗体が提供され、ここで該抗体は配列番号８１のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ある実施態様において、配列番号８１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＮａＰｉ２ｂ抗体はＮａＰｉ２ｂへ結合する能力を保持する。ある実施態様において、総計１から１０のアミノ酸が、配列番号８１において、置換され、挿入され、及び／又は欠失している。ある実施態様において、総計１から５のアミノ酸が、配列番号８１において、置換され、挿入され、及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）起きる。任意で、抗ＮａＰｉ２ｂ抗体は、配列番号８１のＶＬ配列を、その配列の翻訳後修飾を含め、包含する。特定の実施態様において、ＶＬは、（ａ）配列番号７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される一、二、又は三つのＨＶＲを含む。
別の態様において、抗ＮａＰｉ２ｂ抗体が提供され、抗体は、上記の実施態様の何れかに記載のＶＨ、及び上記の実施態様の何れかに記載のＶＬを含む。
一実施態様において、抗体は、配列番号８２及び配列番号８１のそれぞれＶＨ及びＶＬ配列を、それらの配列の翻訳後修飾を含み含む。
更なる態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される抗ＮａＰｉ２ｂ抗体と同一エピトープに結合する抗体である。例えば、ある実施態様において、配列番号８２のＶＨ配列及び配列番号８１のＶＬ配列を含む抗ＮａＰｉ２ｂ抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。
本発明の更なる態様では、上記実施態様の何れかに記載の抗ＮａＰｉ２ｂ抗体は、ヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一実施態様において、抗ＮａＰｉ２ｂ抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）２断片である。その他の態様において、抗体は、全長抗体、例えば、本明細書において定義されるＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２ａ抗体又は他の抗体クラス又はアイソタイプである。
更なる態様にて、以下で説明されるように、上記実施態様の何れかに記載の抗ＮａＰｉ２ｂ抗体は、単独又は組み合わせで、任意の特徴を組み込むことができる。
抗ＣＤ２２抗体
表５のＡＤＣの抗ＣＤ２２抗体は、米国特許第８２２６９４５号に従って、３つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３）及び３つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３）を含む：
ＨＶＲ−Ｌ１ ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＶＧＮＴＦＬＥ （配列番号１）
ＨＶＲ−Ｌ２ ＫＶＳＮＲＦＳ （配列番号２）
ＨＶＲ−Ｌ３ ＦＱＧＳＱＦＰＹＴ （配列番号３）
ＨＶＲ−Ｈ１ ＧＹＥＦＳＲＳＷＭＮ （配列番号４）
ＨＶＲ−Ｈ２ ＧＲＩＹＰＧＤＧＤＴＮＹＳＧＫＦＫＧ （配列番号５）
ＨＶＲ−Ｈ３ ＤＧＳＳＷＤＷＹＦＤＶ （配列番号６）
抗ＭＵＣ１６抗体
表５のＡＤＣの抗ＭＵＣ１６抗体は、米国特許第７９８９５９５号に従って、３つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３）及び３つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３）を含む：
ＨＶＲ−Ｌ１ ＫＡＳＤＬＩＨＮＷＬＡ （配列番号７）
ＨＶＲ−Ｌ２ ＹＧＡＴＳＬＥＴ （配列番号８）
ＨＶＲ−Ｌ３ ＱＱＹＷＴＴＰＦＴ （配列番号９）
ＨＶＲ−Ｈ１ ＧＹＳＩＴＮＤＹＡＷＮ （配列番号１０）
ＨＶＲ−Ｈ２ ＧＹＩＳＹＳＧＹＴＴＹＮＰＳＬＫＳ （配列番号１１）
ＨＶＲ−Ｈ３ ＡＲＷＴＳＧＬＤＹ （配列番号１２）
表５のＡＤＣの抗ＭＵＣ１６抗体は、配列番号１３の可変重鎖配列及び配列番号１４の可変軽鎖配列を含む。
Ｅ Ｖ Ｑ Ｌ Ｖ Ｅ Ｓ Ｇ Ｇ Ｇ Ｌ Ｖ Ｑ Ｐ Ｇ Ｇ Ｓ Ｌ Ｒ Ｌ Ｓ Ｃ Ａ Ａ Ｓ Ｇ Ｙ Ｓ Ｉ Ｔ Ｎ Ｄ Ｙ Ａ Ｗ Ｎ Ｗ Ｖ Ｒ Ｑ Ａ Ｐ Ｇ Ｋ Ｇ Ｌ Ｅ Ｗ Ｖ Ｇ Ｙ Ｉ Ｓ Ｙ Ｓ Ｇ Ｙ Ｔ Ｔ Ｙ Ｎ Ｐ Ｓ Ｌ Ｋ Ｓ Ｒ Ｆ Ｔ Ｉ Ｓ Ｒ Ｄ Ｔ Ｓ Ｋ Ｎ Ｔ Ｌ Ｙ Ｌ Ｑ Ｍ Ｎ Ｓ Ｌ Ｒ Ａ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ Ｖ Ｙ Ｙ Ｃ Ａ Ｒ Ｗ Ｔ Ｓ Ｇ Ｌ Ｄ Ｙ Ｗ Ｇ Ｑ Ｇ Ｔ Ｌ Ｖ Ｔ Ｖ Ｓ Ｓ （配列番号１３）

Ｄ Ｉ Ｑ Ｍ Ｔ Ｑ Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ Ｌ Ｓ Ａ Ｓ Ｖ Ｇ Ｄ Ｒ Ｖ Ｔ Ｉ Ｔ Ｃ Ｋ Ａ Ｓ Ｄ Ｌ Ｉ Ｈ Ｎ Ｗ Ｌ Ａ Ｗ Ｙ Ｑ Ｑ Ｋ Ｐ Ｇ Ｋ Ａ Ｐ Ｋ Ｌ Ｌ Ｉ Ｙ Ｇ Ａ Ｔ Ｓ Ｌ Ｅ Ｔ Ｇ Ｖ Ｐ Ｓ Ｒ Ｆ Ｓ Ｇ Ｓ Ｇ Ｓ Ｇ Ｔ Ｄ Ｆ Ｔ Ｌ Ｔ Ｉ Ｓ Ｓ Ｌ Ｑ Ｐ Ｅ Ｄ Ｆ Ａ Ｔ Ｙ Ｙ Ｃ Ｑ Ｑ Ｙ Ｗ Ｔ Ｔ Ｐ Ｆ Ｔ Ｆ Ｇ Ｑ Ｇ Ｔ Ｋ Ｖ Ｅ Ｉ Ｋ Ｒ （配列番号１４）
一実施態様において、本発明のＡＤＣの抗ＭＵＣ１６抗体は、配列番号１５−３２から選択される軽鎖配列又は配列番号３３−４６から選択される重鎖配列に位置する一以上の遊離システインアミノ酸残基を含む、システイン操作ＴｈｉｏＭａｂである。
Figure 2017503010
Figure 2017503010
Figure 2017503010
Figure 2017503010
一実施態様において、抗ＭＵＣ１６システイン操作ＴｈｉｏＭａｂは、配列番号４７の重鎖配列を含むヒト化抗体である。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＳＩＴＮＤＹＡＷＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＹＩＳＹＳＧＹＴＴＹＮＰＳＬＫＳＲＦＴＩＳＲＤＴＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＴＳＧＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＣＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
（配列番号４７）
一実施態様において、抗ＭＵＣ１６システイン操作ＴｈｉｏＭａｂは、配列番号４８の軽鎖配列を含むヒト化抗体である。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＤＬＩＨＮＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧＡＴＳＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＷＴＴＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
（配列番号４８）
一実施態様において、抗ＭＵＣ１６システイン操作ＴｈｉｏＭａｂは、配列番号４９の重鎖配列を含むキメラ抗体である。
ＤＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＮＰＳＱＳＬＳＬＴＣＴＶＴＧＹＳＩＴＮＤＹＡＷＮＷＩＲＱＦＰＧＮＫＬＥＷＭＧＹＩＮＹＳＧＹＴＴＹＮＰＳＬＫＳＲＩＳＩＴＲＤＴＳＫＮＱＦＦＬＨＬＮＳＶＴＴＥＤＴＡＴＹＹＣＡＲＷＤＧＧＬＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＣＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
（配列番号４９）
一実施態様において、抗ＭＵＣ１６システイン操作ＴｈｉｏＭａｂは、配列番号５０の軽鎖配列を含むキメラ抗体である。
ＤＩＱＭＴＱＳＳＳＦＬＳＶＳＬＧＧＲＶＴＩＴＣＫＡＳＤＬＩＨＮＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＮＡＰＲＬＬＩＳＧＡＴＳＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＮＤＹＴＬＳＩＡＳＬＱＴＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＷＴＴＰＦＴＦＧＳＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
（配列番号５０）
抗ＨＥＲ２抗体
ある実施態様において、表５のＡＤＣは、抗ＨＥＲ２抗体を含む。本発明の一実施態様において、本発明のＡＤＣの抗ＨＥＲ２抗体は、ヒト化抗ＨＥＲ２抗体、例えば、米国特許第５８２１３３７号の表３に記載されるｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１，ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２，ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３，ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４，ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５，ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６，ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７及びｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８を含む。それらの抗体は、ＨＥＲ２に結合するマウス抗体（４Ｄ５）の相補性決定領域を有するヒトフレームワーク領域を含む。ヒト化抗体ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８は、商品名ハーセプチン（登録商標）で市販されるトラスツズマブとも呼ばれる。本発明の別の実施態様において、本発明のＡＤＣの抗ＨＥＲ２抗体は、米国特許第７８６２８１７号に記載されているように、ヒト化抗ＨＥＲ２抗体、例えば、ヒト化２Ｃ４を含む。典型的なヒト化２Ｃ４抗体は、商品名ＰＥＲＪＥＴＡ（登録商標）で市販されるペルツズマブである。
表５のＡＤＣを調製するために使用されるシステイン操作Ｔｈｉｏｍａｂ抗体は、重鎖の１１８アラニン部位（ＥＵ番号付け）に導入されたシステイン残基を有する。この部位は、連続番号付けによって１２１又はＫａｂａｔの番号付けによって１１４の番号が付けられる。
抗ＣＤ３３抗体
表５のＡＤＣの抗ＣＤ３３抗体１５Ｇ１５．３３は、３つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３）及び３つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３）を含む
ＨＶＲ−Ｌ１ ＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＮＹＬＤ （配列番号５１）
ＨＶＲ−Ｌ２ ＬＧＶＮＳＶＳ （配列番号５２）
ＨＶＲ−Ｌ３ ＭＱＡＬＱＴＰＷＴ （配列番号５３）
ＨＶＲ−Ｈ１ ＮＨＡＩＳ （配列番号５４）
ＨＶＲ−Ｈ２ ＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ （配列番号５５）
ＨＶＲ−Ｈ３ ＥＷＡＤＶＦＤ （配列番号５６）
表５のＡＤＣの抗ＣＤ３３抗体１５Ｇ１５．３３は、配列番号５７の軽鎖可変領域及び／又は配列番号５８の重鎖可変領域を含む。
ＥＩＶＬＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＶＮＳＶ
ＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＡＬＱＴＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
（配列番号５７）

ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＩＦＳＮＨＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹ
ＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＦＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＷＡＤＶＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
（配列番号５８）
抗ＣＤ３３抗体９Ｃ３及び他の実施態様
９Ｃ３−ＨＶＲ Ｌ１ ＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧ （配列番号５９）
９Ｃ３−ＨＶＲ Ｌ２ ＡＡＳＳＬＱＳ （配列番号６０）
９Ｃ３−ＨＶＲ Ｌ３ ＬＱＨＮＳＹＰＷＴ （配列番号６１）
９Ｃ３−ＨＶＲ Ｈ１ ＧＮＹＭＳ （配列番号６２）
９Ｃ３−ＨＶＲ Ｈ２ ＬＩＹＳＧＤＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ （配列番号６３）
９Ｃ３−ＨＶＲ Ｈ３ ＤＧＹＹＶＳＤＭＶＶ （配列番号６４）
９Ｃ３ ＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦ
ＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＮＳＹＰＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
（配列番号６５）
９Ｃ３ ＶＨ
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＡＬＩＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＦＴＩＳＧＮＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＬＩＹＳＧＤＳＴＹＹＡＤＳ
ＶＫＧＲＦＮＩＳＲＤＩＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＶＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＤＧＹＹＶＳＤＭＶＶＷＧＫＧＴＴＶＴＶＳＳ
（配列番号６６）
９Ｃ３．２ ＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦ
ＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＮＳＹＰＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
（配列番号６７）
９Ｃ３．２ ＶＨ
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＡＬＩＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＦＴＩＳＧＮＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＬＩＹＳＧＤＳＴＹＹＡＤＳ
ＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＩＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＶＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＤＧＹＹＶＳＤＭＶＶＷＧＫＧＴＴＶＴＶＳＳ
（配列番号６８）
９Ｃ３．３ ＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦ
ＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＮＳＹＰＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
（配列番号６９）
９Ｃ３．３ ＶＨ
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＡＬＩＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＦＴＩＳＧＮＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＬＩＹＳＧＤＳＴＹＹＡＤＳ
ＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＩＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＶＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＤＧＹＹＶＳＤＭＶＶＷＧＫＧＴＴＶＴＶＳＳ
（配列番号７０）
９Ｃ３．４ ＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦ
ＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＮＳＹＰＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
（配列番号７１）
９Ｃ３．４ ＶＨ
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＡＬＩＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＦＴＩＳＧＮＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＬＩＹＳＧＤＳＴＹＹＡＤＳ
ＶＫＧＲＦＡＩＳＲＤＩＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＶＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＤＧＹＹＶＳＤＭＶＶＷＧＫＧＴＴＶＴＶＳＳ
（配列番号７２）
幾つかの実施態様において、本発明は、（ａ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＣＤ３３抗体を提供する。
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、抗体は、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。その他の実施態様において、抗体は、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、及び配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。更なる実施態様において、抗体は、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。更なる実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
その他の態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）（ｉ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
その他の態様において、本発明は、（ａ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。
上記実施態様の何れかにおいて、抗ＣＤ３３抗体はヒト化される。一実施態様において、抗ＣＤ３３抗体は、上記実施態様の何れかにおけるＨＶＲを含み、更に、ヒトアクセプターフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。ある実施態様において、ヒトアクセプターフレームワークは、ヒトＶＬカッパＩコンセンサス（ＶＬＫＩ）フレームワーク及び／又はＶＨフレームワークＶＨ１である。ある実施態様において、ヒトアクセプターフレームワークは、以下の変異の何れか一を含む、ヒトＶＬカッパＩコンセンサス（ＶＬＫＩ）フレームワーク及び／又はＶＨフレームワークＶＨ１である。
その他の態様において、抗ＣＤ３３抗体は、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０又は配列番号７２のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。ある実施態様において、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０及び／又は配列番号７２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％、又は９９％同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＣＤ３３抗体はＣＤ３３へ結合する能力を保持する。ある実施態様において、総計１から１０のアミノ酸が、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０又は配列番号７２において、置換され、挿入され、及び／又は欠失している。ある実施態様において、総計１から５のアミノ酸が、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０又は配列番号７２において、置換され、挿入され、及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）起きる。任意で、抗ＣＤ３３抗体は、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０及び／又は配列番号７２のＶＨ配列を、その配列の翻訳後修飾を含め、包含する。特定の実施態様において、ＶＨは、（ａ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される一、二、又は三つのＨＶＲを含む。
その他の態様において、抗ＣＤ３３抗体が提供され、その抗体は、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９及び／又は配列番号７１のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ある実施態様において、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９及び／又は配列番号７１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％、又は９９％同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＣＤ３３抗体はＣＤ３３へ結合する能力を保持する。ある実施態様において、総計１から１０のアミノ酸が、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９及び／又は配列番号７１において、置換され、挿入され、及び／又は欠失している。ある実施態様において、総計１から５のアミノ酸が、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９及び／又は配列番号７１において、置換され、挿入され、及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）起きる。任意で、抗ＣＤ３３抗体は、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９及び／又は配列番号７１のＶＬ配列を、その配列の翻訳後修飾を含め、包含する。特定の実施態様において、ＶＬは、（ａ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される一、二、又は三つのＨＶＲを含む。
別の態様において、抗ＣＤ３３抗体が提供され、抗体は、上記の実施態様の何れかに記載のＶＨ、及び上記の実施態様の何れかに記載のＶＬを含む。
一実施態様において、抗体は、配列番号６６及び配列番号６５のそれぞれＶＨ及びＶＬ配列を、それらの配列の翻訳後修飾を含み含む。一実施態様において、抗体は、配列番号６８及び配列番号６７のそれぞれＶＨ及びＶＬ配列を、それらの配列の翻訳後修飾を含み含む。一実施態様において、抗体は、配列番号７０及び配列番号６９のそれぞれＶＨ及びＶＬ配列を、それらの配列の翻訳後修飾を含み含む。一実施態様において、抗体は、配列番号７２及び配列番号７１のそれぞれＶＨ及びＶＬ配列を、それらの配列の翻訳後修飾を含み含む。
更なる態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される抗ＣＤ３３抗体と同一エピトープに結合する抗体である。例えば、ある実施態様において、配列番号６６，配列番号６８，配列番号７０，及び／又は配列番号７２のＶＨ配列及び配列番号６５，配列番号６７，配列番号６９，及び／又は配列番号７１のＶＬ配列をそれぞれ含む抗ＣＤ３３抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。
本発明の更なる態様では、上記実施態様の何れかに記載の抗ＣＤ３３抗体は、ヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一実施態様において、抗ＣＤ３３抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）２断片である。その他の態様において、抗体は、全長抗体、例えば、本明細書において定義されるＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２ａ抗体又は他の抗体クラス又はアイソタイプである。
更なる態様にて、以下で説明されるように、上記実施態様の何れかに記載の抗ＣＤ３３抗体は、単独又は組み合わせで、任意の特徴を組み込むことができる。
インビトロの細胞増殖アッセイ
一般に、抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の細胞毒性又は細胞増殖抑制効果は、細胞培養培地中で、レセプタータンパク質、例えばＨＥＲ２を有する哺乳動物細胞を細胞培地中でＡＤＣの抗体に曝露し；その細胞を約６時間から約５日間のある期間にわたって培養し；細胞生存率を測定することにより測定される。細胞ベースのインビトロアッセイが、本発明のＡＤＣの生存率（増殖）、細胞毒性、及びアポトーシスの誘導（カスパーゼ活性化）を測定するために用いられる。
抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）のインビトロでの効力を細胞増殖アッセイにより測定した（実施例２１）。ＡＤＣは、腫瘍細胞増殖の阻害において驚くべきかつ予想外の効力を示した。ＡＤＣの効力は、細胞の標的抗原の発現と相関していた。図２５−３０のデータは、試験したコンジュゲートは、細胞の表面に発現される特異的抗原に結合し、インビトロでこれらの細胞の死を引き起こすことが可能であることを実証している。
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）ルミネセンス細胞生存率アッセイは、鞘翅目ルシフェラーゼの組換え発現に基づいた市販の（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、均質なアッセイ法である（米国特許第５５８３０２４号；５６７４７１３号及び５７００６７０号）。この細胞増殖アッセイは、代謝的に活性な細胞の指標である存在するＡＴＰの定量に基づいて、培養中の生存細胞の数を決定する（Crouch et al (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88；米国特許第６６０２６７７号）。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイは、９６ウェル形式で行い、自動化ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に適応させた（Cree et al (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404）。均質なアッセイ法では、血清添加培地で培養した細胞に直接単一試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬）を追加することを含む。細胞洗浄、培地の除去及び複数のピペッティング工程は必要ない。システムは、試薬の添加及び混合の１０分後に３８４−ウェルフォーマット中僅か１５細胞／ウェルを検出した。細胞は、ＡＤＣで連続的に処理され得るか、又はそれらはＡＤＣで処理されてＡＤＣから分離されても良い。一般に、細胞は短時間、すなわち３時間処理され、連続的に処理された細胞と同様の効力の作用を示した。
均質な「添加−混合−測定」の形式は、細胞の溶解と、存在するＡＴＰの量に比例する発光シグナルの生成とをもたらす。ＡＴＰの量は培養物中に存在する細胞の数に正比例する。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイは、使用される細胞の型及び培地に依存して、一般には５時間よりも長い半減期を有する、ルシフェラーゼ反応により生成される「グロー型」の発光シグナルを生成する。生細胞は相対的な発光単位（ＲＬＵ）に反映される。基質であるカブトムシルシフェリンは、組み換えホタルルシフェラーゼによって酸化的に脱炭酸され、ＡＴＰがＡＭＰに付随して転換され、光子が生成する。
細胞ベースのインビトロアッセイが、本発明のＡＤＣの生存率（増殖）、細胞毒性、及びアポトーシスの誘導（カスパーゼ活性化）を測定するために用いられる。一般に、抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の細胞毒性又は細胞増殖抑制効果は、細胞培地中でＨｅｒ２又はＭＵＣ１６ポリペプチドなどの抗原を発現する哺乳動物細胞をＡＤＣに曝露し；その細胞を約６時間から約５日間のある期間にわたって培養し；細胞生存率を測定することにより測定される。抗ＭＵＣ１６ ＡＤＣの細胞増殖アッセイのために有用な哺乳動物細胞は、（１）ＭＵＣ１６ポリペプチドを発現する細胞株ＯＶＣＡＲ−３；（２）ＭＵＣ１６ポリペプチドの一部をその細胞表面上に安定して発現するように操作されたＰＣ３由来細胞株（ＰＣ３／ＭＵＣ１６）；（３）ＭＵＣ１６ポリペプチドを発現しない親ＰＣ３細胞株；及び（４）；ＭＵＣ１６ポリペプチドを発現しないが、外因性ＭＵＣ１６発現を駆動するために使用されるベクターを保有するＰＣ３細胞株（ＰＣ３／ｎｅｏ）を含む。
図２５は、ＳＫ−ＢＲ−３の３日目のインビトロ細胞生存率対Ｔｈｉｏ ｈｕ 抗ＣＤ２２ ＨＣ Ａ１２１Ｃ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−（ＣＢＩ二量体）１０１及びＴｈｉｏ ｈｕ 抗Ｈｅｒ２ ＨＣ Ａ１２１Ｃ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−（ＣＢＩ二量体）１０２の濃度（μｇ／ｍｌ）のプロットにおける抗体−薬物コンジュゲートの有効性を示す。ＨＥＲ２抗原はＳＫＢＲ３細胞において高度に発現される。抗Ｈｅｒ２ ＡＤＣ１０２は、線形、非用量応答性殺細胞活性を示すが、一方、対照の、オフターゲットの抗ＣＤ２２ ＡＤＣ１０１はあまり活性を示さない。
図２６は、ＳＫ−ＢＲ−３の３日目のインビトロ細胞生存率対Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗Ｈｅｒ２ ４Ｄ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−（ＣＢＩ−ＰＢＤ）１０３及びＴｈｉｏ Ｈｕ 抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−（ＣＢＩ−ＰＢＤ）１０４の濃度（μｇ／ｍｌ）のプロットにおける抗体−薬物コンジュゲートの有効性を示す。抗Ｈｅｒ２ ＡＤＣ １０３は、線形、非用量応答性殺細胞活性を示すが、一方、対照の、オフターゲットの抗ＣＤ２２ ＡＤＣ １０４はあまり活性を示さない。
図２７は、ＳＫ−ＢＲ−３の３日目のインビトロ細胞生存率対Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−（ＣＢＩ二量体）１１６及びＴｈｉｏ Ｈｕ 抗Ｈｅｒ２ ４Ｄ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−（ＣＢＩ二量体）１１７の濃度（μｇ／ｍｌ）のプロットにおける抗体−薬物コンジュゲートの有効性を示す。抗Ｈｅｒ２ ＡＤＣ １１７は、線形、非用量応答性殺細胞活性を示すが、一方、対照の、オフターゲットの抗ＣＤ２２ ＡＤＣ １１６はあまり活性を示さない。
図２８は、ＥＯＬ−１の３日目のインビトロ細胞生存率対中程度の用量応答性殺細胞活性を示すＴｈｉｏ Ｈｕ抗ＣＤ３３ １５Ｇ１５．３３ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ＭＭＥＤ−（ＣＢＩ二量体ｐｈｏｓ）１２５の濃度（μｇ／ｍｌ）のプロットにおける抗体−薬物コンジュゲートの有効性を示す。
図２９は、ＥＯＬ−１の３日目のインビトロ細胞生存率対Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＭＵＣ１６ ３Ａ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ＥＤ−（ＣＢＩ二量体ＤＶＢ ｄｉｐｈｏｓ）１２６及びＴｈｉｏ Ｈｕ 抗ＣＤ３３ １５Ｇ１５．３３ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ＥＤ−（ＣＢＩ二量体ＤＶＢ ｄｉｐｈｏｓ）１２７の濃度（μｇ／ｍｌ）のプロットにおける抗体−薬物コンジュゲートの有効性を示す。抗ＣＤ３３ ＡＤＣ １２７は、強力な、用量応答性殺細胞活性を示すが、一方、対照の、オフターゲットの抗ＭＵＣ１６ ＡＤＣ １２６はあまり活性を示さない。
図３０は、ＥＯＬ−１の３日目のインビトロ細胞生存率対Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＣＤ３３ １５Ｇ１５．３３ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ＥＤ−（ＣＢＩ二量体 ＤＶＢ ｄｉｐｈｏｓ）１２７，Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＣＤ３３ １５Ｇ１５．３３ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ＥＤ−（ＣＢＩ二量体 ＤＶＢ ｐｈｏｓ）１２９，及びＴｈｉｏ Ｈｕ 抗ＭＵＣ１６ ３Ａ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ＥＤ−（ＣＢＩ二量体ＤＶＢ ｐｈｏｓ）１３０の濃度（μｇ／ｍｌ）のプロットにおける抗体−薬物コンジュゲートの有効性を示す。抗ＣＤ３３ ＡＤＣ １２７及び１２９は、強力な、用量応答性殺細胞活性を示すが、一方、対照の、オフターゲットの抗ＭＵＣ１６ ＡＤＣ １３０はあまり活性を示さない。
インビボでの有効性
本発明の抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）のインビボでの有効性は、マウスにおける腫瘍異種移植研究によって測定することができる（実施例２２）。抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）のインビボでの有効性は、マウスにおける腫瘍増殖阻害を測定した（実施例２１）。ＡＤＣは、腫瘍増殖の阻害において驚くべきかつ予想外の効力を示した。ＡＤＣの有効性は、腫瘍細胞の標的抗原の発現と相関していた。
抗体−薬物コンジュゲートの有効性は、げっ歯類における癌細胞の同種移植片及び異種移植片を移植し、ＡＤＣを用いて腫瘍を治療することによってインビボで測定された。可変性の結果が、細胞株、癌細胞上に存在するレセプターへのＡＤＣの抗体結合の特異性、投薬計画、及びその他の要因に応じて予想される。ＡＤＣのインビボでの有効性は、Ｈｅｒ２、ＭＵＣ１６、及びＣＤ３３などの腫瘍関連抗原を中等度から高レベル発現するトランスジェニック外植マウスモデルを用いて測定された。被験体を、ＡＤＣを用いて１回処置し、３〜６週間以上モニターし、腫瘍倍加までの時間、対数細胞死滅及び腫瘍の縮小を測定した。フォローアップ用量−応答及び複数用量実験が行われた。
例えば、本発明の抗ＨＥＲ２ ＡＤＣのインビボでの有効性は、高発現性ＨＥＲ２トランスジェニック外植マウスモデルにより測定することができる（Phillips et al (2008) Cancer Res. 68:9280-90）。同種移植片は、ハーセプチン（登録商標）療法に反応しないか又は応答し難いＦｏ５ ｍｍｔｖトランスジェニックマウスから増殖される被験体は、特定の用量レベル（ｍｇ／ｋｇ）でのＡＤＣにより及びプラセボ緩衝液対照（ビヒクル）により一度処置され、２週間以上にわたってモニターされ、腫瘍倍加までの時間、対数細胞死滅及び腫瘍の縮小が測定された。
図３１は、ＩＶで１回、（１）ビヒクル：ヒスチジン緩衝液＃８：２０ｍＭヒスチジン酢酸，ｐＨ５．５，２４０ｍＭスクロース，０．０２％ ＰＳ２０，（２）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ＭＭＥＤ−（ＣＢＩ二量体ｐｈｏｓ）１１０，（３）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−（ＣＢＩ二量体 ＭｅＰｉｐ）１０８，（４）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−（ＣＢＩ二量体 ｐｈｏｓ）１１１，（５）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗Ｈｅｒ２ ４Ｄ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ＭＭＥＤ−（ＣＢＩ二量体 ｐｈｏｓ）１０９，（６）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗Ｈｅｒ２ ４Ｄ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−（ＣＢＩ二量体 ＭｅＰｉｐ）１０７，（７）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗Ｈｅｒ２ ４Ｄ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−（ＣＢＩ二量体 ｐｈｏｓ）１１２を投与された後の、ＣＲＬ ｎｕ／ｎｕマウスの乳房脂肪パッドに接種されたＭＭＴＶ−ＨＥＲ２ Ｆｏ５トランスジェニック乳腺腫瘍においてインビボでフィットされた経時的腫瘍体積変化のプロットにおける抗体−薬物コンジュゲートの有効性を示す。ＡＤＣは１０ｍｇ／ｋｇで投与された。
図３２は、ＩＶで１回、（１）ビヒクル：ヒスチジン緩衝液＃８：２０ｍＭヒスチジン酢酸，ｐＨ５．５，２４０ｍＭスクロース，０．０２％ ＰＳ ２０，（２）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＤＳＥ−（ＣＢＩ二量体 ｐｈｏｓ）１２０，１０ｍｇ／ｋｇ，（３）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＤＳＥ−（ＣＢＩ二量体 ｐｈｏｓ）１２２，１０ｍｇ／ｋｇ，（４）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＣＤ２２ １０Ｆ４ｖ３ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−（Ｎ１０，ＰＢＤ−ＣＢＩ ＭｅＰｉｐ）１２４，１０ｍｇ／ｋｇ，（５）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗Ｈｅｒ２ ４Ｄ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＤＳＥ−（ＣＢＩ二量体 ｐｈｏｓ）１１９，３ｍｇ／ｋｇ，（６）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗Ｈｅｒ２ ４Ｄ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＤＳＥ−（ＣＢＩ二量体 ｐｈｏｓ）１１９，１０ｍｇ／ｋｇ，（７）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗Ｈｅｒ２ ４Ｄ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＤＳＰ−（ＣＢＩ二量体 ｐｈｏｓ）１２１，３ｍｇ／ｋｇ，（８）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗Ｈｅｒ２ ４Ｄ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＤＳＰ−（ＣＢＩ二量体 ｐｈｏｓ）１２１，１０ｍｇ／ｋｇ （９）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗Ｈｅｒ２ ４Ｄ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−（Ｎ１０，ＰＢＤ−ＣＢＩ ＭｅＰｉｐ）１２３，３ｍｇ／ｋｇ，（１０）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗Ｈｅｒ２ ４Ｄ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−（Ｎ１０，ＰＢＤ−ＣＢＩ ＭｅＰｉｐ）１２３、１０ｍｇ／ｋｇを投与された後の、ＣＲＬ ｎｕ／ｎｕマウスの乳房脂肪パッドに接種されたＭＭＴＶ−ＨＥＲ２ Ｆｏ５トランスジェニック乳腺腫瘍においてインビボでのフィットされた経時的腫瘍体積変化のプロットにおける抗体−薬物コンジュゲートの有効性を示す。
図３３は、ＩＶで１回、（１）ビヒクル：ヒスチジン緩衝液 ＃８：２０ｍＭヒスチジン酢酸，ｐＨ５．５，２４０ｍＭスクロース，０．０２％ ＰＳ ２０，（２）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＣＤ３３ １５Ｇ１５．３３ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ＥＤ−（ＣＢＩ二量体 ＤＶＢ ｄｉｐｈｏｓ）１２７，３ｍｇ／ｋｇ，（３）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＭＵＣ１６ ３Ａ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ＥＤ−（ＣＢＩ二量体ＤＶＢ ｄｉｐｈｏｓ）１２６，３ｍｇ／ｋｇ，（４）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＭＵＣ１６ ３Ａ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ＥＤ−（ＣＢＩ二量体 ＤＶＢ ｄｉｐｈｏｓ）１２６，１ｍｇ／ｋｇを投与された後の、Ｃ．Ｂ−１７ ＳＣＩＤマウスに接種されたＯＶＣＡＲ３Ｘ２．１ヒト卵巣腫瘍においてインビボでのフィットされた経時的腫瘍体積変化のプロットにおける抗体−薬物コンジュゲートの有効性を示す。
ＡＤＣ１２６の抗ＭＵＣ１６抗体は、３Ａ５及び１１Ｄ１０変異体を含み、国際公開第２００７／００１８５１号；米国特許第７９８９５９５号；米国特許第８４４９８８３号に記載され、その内容は参考として援用される。３Ａ５モノクローナル抗体は、ＯＶＣＡＲ−３スキャッチャード分析によって４３３ｐＭの親和性でＭＵＣ１６ポリペプチドの複数の部位に結合する（Chen et al (2007) Cancer Res. 67(10): 4924-4932）。
図３４は、ＩＶで１回、２０μｇ／ｍ２で、（１）ビヒクル：ヒスチジン緩衝液＃８：２０ｍＭヒスチジン酢酸，ｐＨ５．５，２４０ｍＭスクロース，０．０２％ ＰＳ ２０，（２）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＣＤ３３ １５Ｇ１５．３３ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ＭＭＥＤ−（ＣＢＩ二量体ｐｈｏｓ）１２５，（３）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＣＤ３３ １５Ｇ１５．３３ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ＥＤ−（ＣＢＩ 二量体 ＤＶＢ ｄｉｐｈｏｓ）１２７，（４）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＭＵＣ１６ ３Ａ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ＭＭＥＤ−（ＣＢＩ二量体ｐｈｏｓ）１２８，（５）Ｔｈｉｏ Ｈｕ 抗ＭＵＣ１６ ３Ａ５ ＨＣ Ａ１１８Ｃ−ＭＣ−ＥＤ−（ＣＢＩ二量体ＤＶＢ ｄｉｐｈｏｓ）１２６を投与された後の、Ｃ．Ｂ−１７ ＳＣＩＤマウスに接種されたＨＬ−６０ヒト急性骨髄性白血病においてインビボでのフィットされた経時的腫瘍体積変化のプロットにおける抗体−薬物コンジュゲートの有効性を示す。
抗体−薬剤コンジュゲートの投与
本発明の抗体−薬剤コンジュゲートは治療されるべき疾患に適した任意の経路で投与され得る。ＡＤＣは典型的には非経口的に、すなわち点滴、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内及び硬膜外に投与される。
薬学的製剤
本発明の治療用抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の薬学的製剤は、典型的には、非経口投与、すなわちボーラス、静脈内、腫瘍内注射用に、薬学的に許容される非経口ビヒクルとともに単位用量の注射可能形態で調製される。所望の程度の純度を有する抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、任意で凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で薬学的に許容される希釈剤、担体、賦形剤又は安定剤（Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) 16th edition, Osol, A. Ed.）と混合される。
抗体−薬物コンジュゲート治療
本発明の抗体−薬物コンジュゲートは、例えば腫瘍抗原の過剰発現によって特徴付けられる種々の疾患又は障害を治療するために用いられ得る。典型的な病気又は過剰増殖性疾患には、良性又は悪性固形腫瘍、白血病及びリンパ系悪性腫瘍などの血液疾患が含まれる。他には、神経細胞、グリア、星状、視床下部、マクロファージ、上皮性、間質性、胞胚腔（ｂｌａｓｔｏｃｏｅｌｉｃ）、炎症性、血管新生及び自己免疫性を含む免疫に関する障害を含む。
一般に、治療されるべき疾患又は障害は、癌などの過剰増殖性疾患である。ここで治療されるべき癌の例には、細胞腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又は悪性リンパ腫を含むがこれらに限定されない。このような癌のより具体的な例には、扁平上皮癌（例えば上皮の扁平細胞癌）、小細胞肺癌を含む肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃腸癌を含む胃（ｇａｓｔｒｉｃ、ｓｔｏｍａｃｈ）癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、大腸癌、直腸癌、大腸直腸癌、子宮内膜ないし子宮細胞腫、唾液腺細胞腫、腎臓癌又は腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝細胞腫、食道細胞腫、肝細胞腫、肛門部の細胞腫、陰茎細胞腫、並びに頭部及び頚部の癌が含まれる。
ＡＤＣ化合物が治療において用いられ得る自己免疫性疾患は、リウマチ性疾患（例えば、関節リウマチ、シェーグレン症候群、強皮症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及びループス腎炎などの狼瘡、多発性筋炎／皮膚筋炎、クリオグロブリン血症、抗リン脂質抗体症候群、及び乾癬の関節炎など）、変形性関節症、自己免疫性胃腸及び肝臓疾患（例えば、炎症性腸疾患（例えば潰瘍性大腸炎及びクローン病）、自己免疫性胃炎及び悪性貧血、自己免疫性肝炎、原発性胆管萎縮症、原発性硬化性胆管炎、及び小児脂肪便病など）、血管炎（例えば、チャング−シュトラウス血管炎、ウェゲナー肉芽腫症及び多発性動脈炎を含むＡＮＣＡ−関連血管炎）、自己免疫性神経学的疾患（例えば、多発性硬化症、眼球クローヌスミオクローヌス症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、パーキンソン病、アルツハイマー病、及び自己免疫性多発性神経炎など）、腎臓疾患（例えば、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、及びベルガー病など）、自己免疫性皮膚科疾患（例えば、乾癬、蕁麻疹、蕁麻疹、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、及び皮膚紅班性狼瘡など）、血液系疾患（例えば、血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、輸血後の紫斑病、及び自己免疫溶血性貧血など）、アテローム性動脈硬化、ブドウ膜炎、自己免疫性聴覚疾患（例えば、内耳疾患及び聴力障害など）、ベーチェット病、レイノー症候群、臓器移植及び自己免疫性内分泌系疾患（例えば、インスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）などの糖尿病関連の自己免疫性疾患、アジソン病及び自己免疫性甲状腺疾患（例えばグレーブス病及び甲状腺炎）など）が含まれる。より好ましい前記疾患には、例えば、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、ＡＮＣＡ関連血管炎、狼瘡、多発性硬化症、シェーグレン症候群、グレーブス病、ＩＤＤＭ、悪性貧血、甲状腺炎及び糸球体腎炎が含まれる。
疾患の予防又は治療のために、ＡＤＣの適量は、上記のように治療する疾患のタイプ、疾患の重症度及び過程、予防を目的としてか治療を目的として分子を投与するのか、現在の治療法、患者の病歴、及び抗体への反応、注意深い医師の判断により決定されるであろう。分子は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１から２０ｍｇ／ｋｇ）の分子が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な一日当たりの用量は上記した要因に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。患者に投与されるべきＡＤＣの典型的な投与量は患者の体重の約０．１から約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。
製造品
本発明の他の実施態様において、上述した障害の治療に有用な物質を含む製造品又は「キット」が提供される。製造品は、容器とラベル又は容器上にある又は容器に付属する添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ブリスター包装等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な物質から形成されうる。容器は、疾患の治療のために有効である抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）及び無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤はＡＤＣである。ラベル又は添付文書は、組成物ががんのような選択した症状の治療のために使用されることを示している。或いは、又は加えて、製造品は、薬学的に許容可能な緩衝液、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器を更に含んでもよい。製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的及び使用者の観点から望まれる他の材料を更に含んでもよい。
実施例１ （Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル ２−（２−ブロモ−Ｎ−メチルアセトアミド）エチル（メチル）カルバメート ５１
L. F. Tietze, J. M. von Hof, M. Mueller, B. Krewer, I. Schuberth, Angew. Chem. Int. Ed. (2010) 49:7336-7339の手順に従って、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート５１ａは、ＨＣｌで脱保護され、グルタロイルジクロリドでアシル化された（図１）。分取ＨＰＬＣの代わりに、反応溶媒を真空下で除去し、得られた残留物をメタノールで粉砕し、オフホワイトの固体として、１，５−ビス（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）ペンタン−１，５−ジオン５１ｂを得た（収率５１％）。Ｒｆ＝０．５０（酢酸エチル／石油エーテル＝２：１）．ＮＭＲ及びＭＳのデータは報告されている値と同じである。［α］Ｄ ２６＝−４６．３°（ｃ＝０．４１，ＤＭＡ）．
氷浴で冷却されたＤＭＡ（５ｍＬ）中の５１ｂの溶液（６５０ｍｇ，１．１５ｍｍｏｌ）に、ＤＩＰＥＡ（０．４０ｍＬ，２．３１ｍｍｏｌ）及び４−ニトロフェニルクロロホルメート（３０２ｍｇ，１．５０ｍｍｏｌ）が添加された。混合物を室温まで温めて一晩攪拌した後で、ｔｅｒｔ−ブチル メチル（２−（メチルアミノ）エチル）カルバメート（６５２ｍｇ，３．００ｍｍｏｌ）が添加された。混合物を７時間室温で撹拌し、次いで酢酸エチルと冷希ＮａＨＣＯ３水溶液との間で再分配した。水相を酢酸エチルで３回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、セライトを通して濾過した。溶媒を除去し、残留物を更に、酢酸エチルと石油エーテルの勾配混合物（ｖ／ｖ １：１から４：１）、次いで溶離液として酢酸エチルのを使用するカラムクロマトグラフィーにより精製し、オフホワイトの固体として、Ｂｏｃ （Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル メチル（２−（メチルアミノ）エチル）カルバメート５１ｃ（３５９ｍｇ，４０％）を得た；ｍｐ １５７℃（ｄｅｃ．）．［α］Ｄ ２６＝−４５．４°（ｃ＝１．０８，酢酸エチル）．１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）（回転異性体の混合物） δ１０．３５（ｓ，１Ｈ），８．２５（ｓ，１Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），７．８７−７．７７（ｍ，２Ｈ），７．５８（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．５０−７．４２（ｍ，２Ｈ），７．３１（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），４．４２（ｔ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，１Ｈ），４．３６−４．３１（ｍ，２Ｈ），４．２５（ｄ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，１Ｈ），４．１９−４．１３（ｍ，２Ｈ），４．０５（ｄｄ，Ｊ＝２．９，１１．０Ｈｚ，１Ｈ），３．９８（ｄｄ，Ｊ＝２．６，１０．９Ｈｚ，１Ｈ），３．９２（ｄｄ，Ｊ＝７．２，１０．９Ｈｚ，１Ｈ），３．７９（ｄｄ，Ｊ＝８．５，１０．２Ｈｚ，１Ｈ），３．６９（ｂｒ ｓ，１Ｈ），３．５２−３．４２（ｍ，３Ｈ），３．２１−２．７９（ｍ，６Ｈ，２ＮＭｅ），２．７５−２．６７（ｍ，２Ｈ），２．６４−２．５８（ｍ，２Ｈ），２．００−１．９３（ｍ，２Ｈ），１．４４−１．３５（ｍ，９Ｈ，Ｂｕｔ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ７７７．２８０１（Ｍ＋Ｈ）．Ｃ４１Ｈ４７Ｃｌ２Ｎ４Ｏ７ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ７７７．２８１６．
また、同じクロマトグラフィー分離から得られるのは、ビス−Ｂｏｃで保護された５１ｄ及び白色固体として保護されていない回収された開始物質５１ｂであった（１５ｍｇ，２％）。５１ｄ（４２９ｍｇ，３７％）がオフホワイトの固体として得られた。［α］Ｄ ２６＝−３２．０°（ｃ＝１．００，酢酸エチル）．１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）（回転異性体の混合物）δ８．２５（ｓ，２Ｈ），７．９５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．８７−７．７６（ｍ，２Ｈ），７．５８（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．４４（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），４．４１（ｔ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，２Ｈ），４．３２（ｂｒ ｓ，２Ｈ），４．２４（ｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ，２Ｈ），４．０６−４．０３（ｍ，２Ｈ），３．９８（ｄｄ，Ｊ＝７．３，１０．８Ｈｚ，２Ｈ），３．６９（ｂｒ ｓ，２Ｈ），３．５２−３．４３（ｍ，６Ｈ），３．２１−２．７９（ｍ，１２Ｈ，４ＮＭｅ），２．７５−２．６９（ｍ，２Ｈ），２．６６−２．５８（ｍ，２Ｈ），１．９９−１．９５（ｍ，２Ｈ），１．４４−１．３５（ｍ，１８Ｈ，２Ｂｕｔ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ１０１３．３９９１（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ５１Ｈ６４Ｃｌ２Ｎ６ＮａＯ１０ ｒｅｑｕｉｒｅｓ １０１３．３９９１．
氷浴で冷却されたＤＣＭ（３ｍＬ）中の５１ｃの溶液（２００ｍｇ，０．２６ｍｍｏｌ）に、トリフルオロ酢酸、ＴＦＡ（１．５ｍＬ）が滴下して添加された。混合物は室温まで温められ、２時間攪拌された。全ての揮発性成分が除去され、オフホワイトの固体として、（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イルメチル（２−（メチルアミノ）エチル）カルバメート５１ｅの粗トリフルオロ酢酸塩を得て、これは直接使用された。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）（回転異性体の混合物）δ１０．３６（ｓ，１Ｈ），８．６４（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．４８（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．３５（ｓ，１Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｓ，１Ｈ），７．９７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．９４−７．８８（ｍ，１Ｈ），７．７８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６１−７．５７（ｍ，２Ｈ），７．５１−７．４５（ｍ，２Ｈ），７．３４−７．３０（ｍ，１Ｈ），４．４３（ｔ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，１Ｈ），４．３６−４．３１（ｍ，２Ｈ），４．２６（ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ），４．１８−４．１４（ｍ，２Ｈ），４．０６（ｄｄ，Ｊ＝２．９，１１．０Ｈｚ，１Ｈ），４．００（ｄｄ，Ｊ＝２．７，１０．８Ｈｚ，１Ｈ），３．９４（ｄｄ，Ｊ＝７．５，１１．０Ｈｚ，１Ｈ），３．８９−３．８４（ｍ，１Ｈ），３．７９（ｄｄ，Ｊ＝８．１，１０．８Ｈｚ，１Ｈ），３．６３（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），３．３３−３．３０（ｍ，６Ｈ，２ＮＭｅ），２．７８−２．５５（ｍ，６Ｈ），２．００−１．９４（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ６７７．２３０６（Ｍ＋Ｈ）．Ｃ３６Ｈ３９Ｃｌ２Ｎ４Ｏ５ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ６７７．２２９２．
−５℃で、ＴＨＦ中の５１ｅの溶液（４ｍＬ）に、ＤＩＰＥＡの液滴を添加し、続いてブロモアセチルブロミド（３４μＬ，０．３９ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、次いでＤＩＰＥＡの残り（合計で４４８μＬ，２．５７ｍｍｏｌ）を添加した。混合物は室温まで温められ、１時間攪拌された。全ての揮発性成分をロータリーエバポレーター、次いで、高真空ポンプで除去した。得られた残留物を酢酸エチルと共に攪拌し、濾液をクロマトグラフィーカラムにロードする前に、不溶固体が濾過された。酢酸エチル及び石油エーテルの勾配混合物（ｖ／ｖ １：４から１：１）が溶離液として使用され、オフホワイトの固体として、（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル ２−（２−ブロモ−Ｎ−メチルアセトアミド）エチル（メチル）カルバメート ５１（８０ｍｇ，３９％）；ｍｐ １６７−１７０℃．［α］Ｄ ２６＝−６４．０°（ｃ＝０．２５，酢酸エチル）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）（回転異性体の混合物）δ１０．３９（ｓ，１Ｈ），８．２５−８．２０（ｍ，１Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｓ，１Ｈ），７．９６（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．８９（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，０．３４Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，０．６６Ｈ），７．７８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５８（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．５１−７．４５（ｍ，２Ｈ），７．３１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），４．４２（ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ），４．３６−４．３１（ｍ，１Ｈ），４．２４（ｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ，１Ｈ），４．１８−４．０９（ｍ，３Ｈ（ＣＨ２Ｂｒを含む）），４．０７−４．０３（ｄｄ，Ｊ＝２．８，１０．９Ｈｚ，１Ｈ），４．００−３．９７（ｄｄ，Ｊ＝２．６，１０．８Ｈｚ，１Ｈ），３．９６−３．９１（ｍ，１Ｈ），３．８２−３．７５（ｍ，１Ｈ），３．７０−３．６８（ｍ，１Ｈ），３．５８−３．４３（ｍ，３Ｈ），３．２６−２．８９（ｍ，６Ｈ，２ＮＭｅ），２．７８−２．６７（ｍ，２Ｈ），２．６５−２．５５（ｍ，２Ｈ），１．９９−１．９２（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ８１９．１３１６（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ３８Ｈ３８ＢｒＣｌ２Ｎ４Ｏ６ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ８１９．１３２２．
実施例２ （１１Ｓ，１１ａＳ）−ｔｅｒｔ−ブチル ８−（６−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−６−オキソヘキシルオキシ）−１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−５−オキソ−２，３，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシレート ５２
実施例６の実験手順に従って、リンカー−薬物中間５２が調製された（図７及び８）。ＨＰＬＣ：純度９６．７％；ｍｐ ２１０ｏＣ（ｄｅｃ．）；１Ｈ ＮＭＲ［（ＣＤ３）２ＳＯ］δ１０．０３（ｓ，１Ｈ（Ｄ２Ｏと交換可能）），８．２３−８．１１（ｍ，２Ｈ），８．０９（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ（Ｄ２Ｏと交換可能）），７．８５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．８０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ（Ｄ２Ｏと交換可能）），７．６６（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．５９−７．４４（ｍ，３Ｈ），７．３８（ｂｒｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０４（ｓ，１Ｈ），６．９９（ｓ，２Ｈ），６．６９（ｓ，１Ｈ），６．３８（ｂｒ ｓ，１Ｈ（Ｄ２Ｏと交換可能）），５．９９（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ（Ｄ２Ｏと交換可能）），５．４９−５．３４（ｍ，３Ｈ；Ｄ２Ｏ交換後、ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），５．２０（ｓ，２Ｈ），４．４４−４．３０（ｍ，２Ｈ），４．２６−４．１３（ｍ，３Ｈ），４．１０−３．９１（ｍ，３Ｈ），３．８８−３．７６（ｍ，１Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），３．５３−３．４４（ｍ，１Ｈ），３．４１−３．２０（ｍ，４Ｈ（水ピークにより部分的に不明瞭）），３．０９−２．８８（ｍ，２Ｈ），２．６６−２．４２（ｍ，２Ｈ（ＤＭＳＯピークにより部分的に不明瞭）），２．２５−１．２４（ｍ，２１Ｈ），１．３１（ｓ，９Ｈ），１．２４−１．１１（ｍ，２Ｈ），０．８６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．８２（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）．元素分析（Ｃ５５Ｈ７１ＣｌＮ８Ｏ１１・Ｈ２Ｏ）Ｃａｌｃ：Ｃ，６１．５３；Ｈ，６．８５；Ｎ，１０．４４．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，６１．３９；Ｈ，７．１１；Ｎ，１０．１５．
実施例３ Ｎ−（（Ｒ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｒ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル）−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド ５３
室温（ｒ．ｔ．）でＴＨＦ−Ｈ２Ｏ（１５０ｍＬ／７５ｍＬ）中の（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル１−（クロロメチル）−５−（ジフェニルメチレンアミノ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート５３ａ（１．００ｇ，２．０１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に酢酸（５０ｍＬ）が添加され、混合物を一晩撹拌した（図２）。１９．５時間後、ＴＨＦを真空下で除去し、混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、その層を十分に振盪し、次いで分離した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（４×）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒を真空下で除去した。ヘキサン：ＥｔＯＡｃ１００：０から９０：１０を用いたシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによる精製により、オレンジ色のゲル状固体として、（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル ５−アミノ−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート５３ｂ（３８２ｍｇ，５７％）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）８．０１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６４（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４２−７．３８（ｍ，１Ｈ），７．３７（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．２２−７．１８（ｍ，１Ｈ），５．９１（ｓ，２Ｈ），４．０８−３．９１（ｍ，４Ｈ），３．６６（ｄｄ，Ｊ＝１０．６，８．２Ｈｚ，１Ｈ），１．５３（ｓ，９Ｈ）．
乾燥ＤＭＡ中で５３ｂ（３８０ｍｇ，１．１４ｍｍｏｌ）、（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸（３６１ｍｇ，１．７１ｍｍｏｌ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ．ＨＣｌ，７６５ｍｇ，３．９９ｍｍｏｌ）及びパラ−トルエンスルホン酸（ＴｓＯＨ，４９ｍｇ，０．２８５ｍｍｏｌ）の混合物（１０ｍＬ）が、室温で一晩、窒素下で攪拌された。１７時間後、溶媒を真空下で除去した。粗生成物をＤＣＭ：ヘキサン７５：２５から１００：０次いでＤＣＭ：ＭｅＯＨ９９：１から９７：３を用いてシリカゲル上でカラムクロマトグラフィーによって精製し、生成物含有画分を乾燥するまで蒸発させた。次いで、得られた物質をＥｔＯＡｃに溶解し、有機層をＨ２Ｏ（２ｘ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒を除去し、黄色い固体として、（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル １−（クロロメチル）−５−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ５３ｃ（２８２ｍｇ，４７％）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）９．８６（ｓ，１Ｈ），８．２４（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．９９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．５５−７．５１（ｍ，１Ｈ），７．４３−７．３９（ｍ，１Ｈ），７．０１（ｓ，２Ｈ），４．２１−４．１１（ｍ，２Ｈ），４．０８−４．００（ｍ，２Ｈ），３．８７（ｄｄ，Ｊ＝１０．９，６．９Ｈｚ，１Ｈ），３．４２（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），２．４５（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．６９−１．６２（ｍ，２Ｈ），１．５６−１．５４（ｍ，２Ｈ），１．５４（ｓ，９Ｈ），１．３５−１．２８（ｍ，２Ｈ）．
トリフルオロ酢酸（３．９ｍＬ）及びＨ２Ｏ（０．１ｍＬ）が、０℃で、ＤＣＭ（４ｍＬ）中の５３ｃ（６６ｍｇ，０．１２５ｍｍｏｌ）の溶液に添加された。混合物は、０℃で１時間２０分間攪拌され、次いで、氷及びＨ２Ｏが添加された。混合物は、０℃で飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でｐＨ８に塩基性化された。有機層と水層は分離され、有機層をＨ２Ｏ（１×）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒を真空下で除去し、黄色の固体として、（Ｒ）−Ｎ−（１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル）−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド ５３ｄ（５０ｍｇ，９４％）を得て、これは精製せずに次の工程で使用された。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）９．７０（ｓ，１Ｈ），７．８７（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．６４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｄｄｄ，Ｊ＝８．１，６．９，１．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２１−７．１５（ｍ，２Ｈ），７．０１（ｓ，２Ｈ），５．９２（ｓ，１Ｈ），４．０２−３．９６（ｍ，１Ｈ），３．８５（ｄｄ，Ｊ＝１０．８，３．５Ｈｚ，１Ｈ），３．６９（ｔ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），３．６３−３．５５（ｍ，２Ｈ），３．４２（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），２．４２（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．６４（ｔｄ，Ｊ＝１５．２，７．６Ｈｚ，２Ｈ），１．５５（ｔｄ，Ｊ＝１４．５，７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．３５−１．２６（ｍ，２Ｈ）．
乾燥ＤＭＡ中で５３ｄ（５０ｍｇ，０．１１７ｍｍｏｌ）、（Ｒ）−５−（１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタン酸 ５３ｅ（５６ｍｇ，０．１６１ｍｍｏｌ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩ＥＤＣＩ．ＨＣｌ（５８ｍｇ，０．３０３ｍｍｏｌ）及びＴｓＯＨ（８ｍｇ，０．０４６５ｍｍｏｌ）の混合物（２ｍＬ）が、室温で一晩、窒素下で攪拌された。１９時間後、混合物をＨ２Ｏで希釈し、溶液から固体が沈殿した。水性懸濁液が、ＥｔＯＡｃ（１×），ＤＣＭ（１×），ＤＣＭ：ＭｅＯＨ９５：５（１×）を用いて抽出され、混合有機物は乾燥され（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒を真空下で除去した。粗生成物は、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ１００：０から９４：６を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製され、黄色い固体として、Ｎ−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル）−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド ５３（１５ｍｇ，１７％，ＨＰＬＣ純度：８２．３％）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）１０．３５（ｓ，１Ｈ），９．８８（ｓ，１Ｈ），８．５８（ｓ，１Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），７．９６（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．９２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５１−７．４７（ｍ，１Ｈ），７．４６−７．４２（ｍ，１Ｈ），７．３３−７．３０（ｍ，１Ｈ），７．０１（ｓ，２Ｈ），４．４２−４．２８（ｍ，３Ｈ），４．２５−４．１３（ｍ，３Ｈ），４．０１（ｄｄｄ，Ｊ＝１９．６，１０．９，２．６Ｈｚ，２Ｈ），３．９０（ｄｄ，Ｊ＝１０．９，７．５Ｈｚ，１Ｈ），３．７９（ｄｄ，Ｊ＝１０．８，８．１Ｈｚ，１Ｈ），３．４３（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），２．７７−２．５７（ｍ，４Ｈ），２．４６−２．４３（ｍ，２Ｈ），２．０１−１．９６（ｍ，２Ｈ），１．７０−１．６２（ｍ，２Ｈ），１．６０−１．５３（ｍ，２Ｈ），１．３６−１．２８（ｍ，２Ｈ）．ＨＲＭＳｍ／ｚ７７７．２１８６［（Ｍ＋Ｎａ）＋，Ｃ４１Ｈ４０Ｃｌ２Ｎ４ＮａＯ６として計算：７７７．２２１７］．
実施例３ａ １−（（Ｓ）−５−アミノ−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）ペンタン−１，５−ジオン ５３ｊ
１０％Ｐｄ／Ｃ（１．５ｇ）が、−２０℃で、窒素下で、ＴＨＦ−２５％ＮＨ４ＨＣＯ２水溶液（６０ｍＬ／２３ｍＬ）中の（Ｓ）−５−（５−（ベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタン酸５７ｃ（２．００ｇ，４．５７ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に添加された（図３）。反応混合物を３．５時間、−１５から−１０℃で撹拌した。次いで、反応混合物を一晩−２０℃に保った。１７．５時間後、混合物を−１０℃に温め、５時間、−１から−５℃で撹拌した。次いで、混合物を０℃に温め、そして、３０分間この温度で撹拌し、次いでＭｅＯＨで希釈し、セライトを通して濾過し、セライトプラグをＭｅＯＨで洗浄し（３×）、固体が溶液から沈殿するまで、溶媒を真空下で濃縮した。次いで、これはＨ２Ｏ（１５０ｍＬ）及びヘキサン（１５０ｍＬ）で希釈され、濃縮ＨＣｌでｐＨ１に酸性化されつつ室温で撹拌された。混合物を更に３０分間撹拌し、固体を濾過により回収し、Ｈ２Ｏ及びヘキサンで洗浄し、乾燥し、ベージュ色の固体として、（Ｓ）−５−（１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタン酸５３ｈ（１．４３ｇ，９０％）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）１２．０７（ｂｒ ｓ，１Ｈ），１０．３５（ｓ，１Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．９８（ｓ，１Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．５０−７．４６（ｍ，１Ｈ），７．３３−７．２９（ｍ，１Ｈ），４．３０（ｔ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ），４．１４−４．１２（ｍ，２Ｈ），３．９８（ｄｄ，Ｊ＝１０．９，２．８Ｈｚ，１Ｈ），３．７８（ｄｄ，Ｊ＝１０．８，７．８Ｈｚ，１Ｈ），２．６３−２．４５（ｍ，２Ｈ），２．３５（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．８９−１．７８（ｍ，２Ｈ）．
塩化水素ガス（ＨＣｌ）が、室温で、乾燥ジオキサン（１２ｍＬ）（３Ａ以上のモレキュラーシーブ）中の（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル１−（クロロメチル）−５−（ジフェニルメチレンアミノ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート５３ｆ（４２５ｍｇ，０．８５５ｍｍｏｌ）の溶液を通してバブリングされた。（図３）。溶液から固体が沈殿し、溶媒は１５分後に真空下で除去された。粗固体の（Ｓ）−１−（クロロメチル）−Ｎ−（ジフェニルメチレン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−アミン５３ｇは精製せずに次の工程で使用された。乾燥ＤＭＡ（１０ｍＬ）が、窒素下、室温で、５３ｇ、（Ｓ）−５−（１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタン酸５３ｈ（３２７ｍｇ，０．９４１ｍｍｏｌ），ＥＤＣＩ．ＨＣｌ（５７３ｍｇ，２．９９ｍｍｏｌ）及び３Ａ（オングストローム）モレキュラーシーブの混合物に添加された。２日と１９．５時間後、溶媒を真空下で除去した。粗物質は、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ１００：０から９０：１０を使用して、シリカ上でゲルカラムクロマトグラフィーによって精製され、次いで物質は再びヘキサン：ＤＣＭ１００：０から５０：５０から０：１００、次いでＤＣＭ：ＭｅＯＨ９９：１から９８：２を使用してクロマトグラフされ、１−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（ジフェニルメチレンアミノ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）ペンタン−１，５−ジオン５３ｉを得た（１９３ｍｇ，３１％、５３ｆから２工程かけて）。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）１０．３５（ｓ，１Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），８．００（ｓ，１Ｈ），７．８４（ｔ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），７．７９−７．７４（ｍ，３Ｈ），７．６２−７．５７（ｍ，２Ｈ），７．５４−７．４６（ｍ，４Ｈ），７．４０−７．３６（ｍ，１Ｈ），７．３３−７．２９（ｍ，１Ｈ），７．２７−７．２２（ｍ，３Ｈ），７．０９−７．０８（ｍ，２Ｈ），４．３４−４．２６（ｍ，２Ｈ），４．２２−４．１２（ｍ，４Ｈ），４．０１−３．９７（ｍ，２Ｈ），３．８３−３．７６（ｍ，２Ｈ），２．６９−２．５０（ｍ，４Ｈ），１．９３−１．８６（ｍ，２Ｈ）．ＨＲＭＳｍ／ｚ７２６．２２６４［（Ｍ＋Ｈ）＋，Ｃ４４Ｈ３８Ｃｌ２Ｎ３Ｏ３として計算：７２６．２２８５］．
室温（ｒ．ｔ．）でＴＨＦ−Ｈ２Ｏ（２４ｍＬ／１２ｍＬ）中５３ｉ（１９０ｍｇ，０．２６１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、酢酸（ＨＯＡｃ，８ｍＬ）が添加され、混合物を一晩撹拌した。１９時間後、混合物をＨ２Ｏで希釈し、固体が沈殿した。ＴＨＦを真空下で除去し、水性懸濁液は中性になるまでＤＩＰＥＡで処理された。固体を乾燥させ、濾過により回収し、Ｈ２Ｏで洗浄した。固体をＤＭＦ（１．５ｍＬ）に溶解し、固体を沈殿させ、ＭｅＯＨで希釈した。溶媒をデカントし、ヘキサン：ＤＣＭ９０：１０を固体に添加し、懸濁液を振盪し、溶媒をデカントした。このプロセスは、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ９０：１０、続いてヘキサン単独を用いて繰り返された。次いで、固体をＤＭＦ／ＴＨＦ中に溶解し、シリカゲルに吸着させ、生成物をＤＣＭ：ＭｅＯＨ１００：０から９０：１０を用いて溶出した。物質は分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ−ＭＡＸＲＰ４μ，２１．２０×２５０ｍｍ；流速：１３ｍＬ／分；移動相：溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ／ＴＦＡｐＨ２．５，溶媒Ｂ：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ９０：１０；方法：アイソクラティック：溶媒Ａ：溶媒Ｂ２０：８０，１５分；波長：２５４ｎｍ、３３０ｎｍ）により更に精製され、白色固体として、１−（（Ｓ）−５−アミノ−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）ペンタン−１，５−ジオン ５３ｊ，３０ｍｇ，２２％，ＨＰＬＣ純度：８７．９％）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）１０．３６（ｓ，１Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），８．０４−８．０２（ｍ，２Ｈ），７．７９−７．７７（ｍ，２Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．５１−７．４７（ｍ，１Ｈ），７．４２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．３４−７．３０（ｍ，１Ｈ），７．２３（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），５．９１（ｓ，２Ｈ），４．３６−４．２６（ｍ，２Ｈ），４．１９−４．１３（ｍ，３Ｈ），４．０８−４．０４（ｍ，１Ｈ），４．０１−３．９３（ｍ，２Ｈ），３．７９（ｄｄ，Ｊ＝１０．７，８．２Ｈｚ，１Ｈ），３．７０（ｄｄ，Ｊ＝１０．５，８．９Ｈｚ，１Ｈ），２．７５−２．６６（ｍ，２Ｈ），２．６３−２．５４（ｍ，２Ｈ），２．００−１．９３（ｍ，２Ｈ）．ＨＲＭＳｍ／ｚ５８４．１４５６［（Ｍ＋Ｎａ）＋，Ｃ３１Ｈ２９Ｃｌ２Ｎ３ＮａＯ３として計算：５８４．１４７８］．［α］Ｄ ２８＝−３７．６ｏ（ｃ＝０．５５９，ＤＭＳＯ）．
実施例３ｂ １−（（Ｒ）−５−アミノ−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−（（Ｒ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）ペンタン−１，５−ジオン ５３ｐ
トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ，０．５４ｍＬ，３．８９ｍｍｏｌ）及びトリフルオロメタンスルホン酸無水物（０．６０ｍＬ，３．６０ｍｍｏｌ）が、０℃でＤＣＭ（１００ｍＬ）中の（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート５３ｋの攪拌溶液に添加された（図４）。反応物を、２０分間、０℃で攪拌し、次いで、Ｈ２Ｏで希釈し、層を分離し、水層をＤＣＭ（１×）で抽出した。混合した有機層を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒を真空下で除去した。ヘキサン：ＥｔＯＡｃ１００：０から９６：４を用いたシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによる精製は、オレンジ色の泡状固体として、（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル １−（クロロメチル）−５−（トリフルオロメチルスルホニルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ５３ｌ（１．３０ｇ，９３％）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）８．３０（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．０３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６２−７．５８（ｍ，１Ｈ），７．５３−７．４９（ｍ，１Ｈ），４．３２（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．２０−４．１５（ｍ，１Ｈ），４．０９−４．０３（ｍ，１Ｈ），３．９２（ｄｄ，Ｊ＝１１．２，２．８Ｈｚ，１Ｈ），３．５４−３．４９（ｍ，１Ｈ），１．６１（ｓ，９Ｈ）．
乾燥ＴＨＦ（６０ｍＬ、脱気）中の５３ｌの溶液（１．３０ｇ，２．７９ｍｍｏｌ）が、窒素下で、Ｃｓ２ＣＯ３（１．２７ｇ，３．９１ｍｍｏｌ），ＢＩＮＡＰ（２０９ｍｇ，０．３３６ｍｍｏｌ）及びＰｄ（ＯＡｃ）２（６３ｍｇ，０．２８１ｍｍｏｌ）の混合物に添加された。次いでジフェニルメタンアミン（０．５６ｍＬ、３．３４ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を窒素下で一晩還流した。２０時間後、反応温度を６０−６５℃に低下させ、反応物を１日間窒素下でこの温度で撹拌した。追加のＴＨＦ（１０ｍＬ）が添加され、その混合物を別の日に同じ温度で撹拌し、再び混合物に更にＴＨＦ（２５ｍＬ）を添加した。別の日の後、Ｐｄ（ＯＡｃ）２（１９ｍｇ，０．０８４６ｍｍｏｌ），ＢＩＮＡＰ（５２ｍｇ，０．０８３５ｍｍｏｌ）及びＴＨＦ（３０ｍＬ）の追加部分が添加され、その混合物を窒素下で一晩７０℃で加熱した。更なる２８時間後、Ｐｄ（ＯＡｃ）２（３１ｍｇ，０．１３８ｍｍｏｌ），ＢＩＮＡＰ（１０４ｍｇ，０．１６７ｍｍｏｌ）の追加部分が再び添加され、反応は２２時間続けられた。次いで、反応混合物を室温に冷却し、ＤＣＭで希釈し、セライトを通して濾過し、洗浄液に色が存在しなくなるまでセライトプラグをＤＣＭで洗浄し、濾液を真空下で蒸発させた。ヘキサン：ＤＣＭ１００：０から５０：５０を用いたシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによる精製は、黄色い泡状固体として、（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル １−（クロロメチル）−５−（ジフェニルメチレンアミノ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ５３ａ（１．１９ｇ，８５％）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）７．８５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．８０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７５（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．６１−７．５７（ｍ，１Ｈ），７．５４−７．４９（ｍ，３Ｈ），７．３７−７．３３（ｍ，１Ｈ），７．３０−７．２３（ｍ，３Ｈ），７．０６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），４．１３−４．０２（ｍ，２Ｈ），４．００−３．９４（ｍ，２Ｈ），３．７７（ｄｄ，Ｊ＝１０．９，７．５Ｈｚ，１Ｈ），１．４６（ｓ，９Ｈ），１Ｈ（観測されず）。［α］Ｄ ２７＝＋１０１ｏ（ｃ＝１．０４，ＤＣＭ）．
塩化水素ガス（ＨＣｌ（ｇ））が、室温で、乾燥ジオキサン（１０ｍＬ）（３Ａ以上のモレキュラーシーブ）中の５３ａ（３００ｍｇ，０．６０４ｍｍｏｌ）の溶液を通してバブリングされた。１０分後、溶液から固体が沈殿し、溶媒は２０分後に真空下で除去された。粗固体（Ｒ）−１−（クロロメチル）−Ｎ−（ジフェニルメチレン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−アミン ５３ｍを、精製せずに次の工程に使用した。
炭素上のパラジウム、１０％Ｐｄ／Ｃ（６９０ｍｇ）が、−１０℃で、窒素下で、ＴＨＦ−２５％ＮＨ４ＨＣＯ２水溶液（４０ｍＬ／１６ｍＬ）中の（Ｒ）−５−（５−（ベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタン酸５３ｎ（１．３８ｇ，３．１５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に添加された。反応混合物を３時間、−１０から−５℃で撹拌した。次いで、反応混合物を一晩−２０℃に保った。−２０℃で１５時間後、混合物を、ＭｅＯＨで希釈し、セライトで濾過し、セライトプラグをＭｅＯＨで洗浄し、そして溶媒は、真空下で、固体が溶液から沈殿するまで濃縮された。次いで、懸濁液はＨ２Ｏ（１３０ｍＬ）及びヘキサン（１００ｍＬ）で希釈され、濃縮ＨＣｌでｐＨ１に酸性化されつつ室温で撹拌された。混合物を、３０分間攪拌し沈降させ、ヘキサンをデカントした。追加のヘキサン（１２０ｍＬ）が添加され、混合物は更に３０分間撹拌され、ヘキサンを再びデカントし、次いで固体を濾過により収集し、Ｈ２Ｏ及びヘキサンで洗浄し、乾燥し、ベージュ色の固体として、（Ｒ）−５−（１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタン酸 ５３ｅ（９２５ｍｇ，８４％）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）１２．０６（ｂｒ ｓ，１Ｈ），１０．３５（ｓ，１Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．９８（ｓ，１Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．５０−７．４６（ｍ，１Ｈ），７．３３−７．２９（ｍ，１Ｈ），４．３０（ｔ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，１Ｈ），４．１４−４．１２（ｍ，２Ｈ），３．９８（ｄｄ，Ｊ＝１０．９，２．８Ｈｚ，１Ｈ），３．７８（ｄｄ，Ｊ＝１０．８，７．９Ｈｚ，１Ｈ），２．６３−２．４５（ｍ，２Ｈ），２．３５（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．８９−１．７８（ｍ，２Ｈ）．
乾燥ＤＭＡ（８ｍＬ）が、窒素下、室温で、前の反応からの５３ｍ、５３ｅ（２４１ｍｇ，０．６９３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ．ＨＣｌ（４０４ｍｇ，２．１１ｍｍｏｌ）及び３Ａモレキュラーシーブの混合物に添加された。反応混合物は一晩撹拌された。１９．５時間後、混合物をＨ２Ｏで希釈し、得られた懸濁液を濾過した。水性濾液をＥｔＯＡｃで抽出し（３×）、濾過した固体をＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨに溶解し、ＥｔＯＡｃ抽出物と混合した。混合した有機溶液をシリカゲルに吸着させ、生成物は、ヘキサン：ＤＣＭ５０：５０から０：１００、次いでＤＣＭ：ＭｅＯＨ９９．５：０．５から９７：３を用いて溶出され、暗黄色固体として、１−（（Ｒ）−１−（クロロメチル）−５−（ジフェニルメチレンアミノ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−（（Ｒ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）ペンタン−１，５−ジオン ５３ｏ（１５５ｍｇ，３５％，５３ａから２工程かけて）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）１０．３５（ｓ，１Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），８．００（ｓ，１Ｈ），７．８５（ｔ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），７．７９−７．７４（ｍ，３Ｈ），７．６２−７．５７（ｍ，２Ｈ），７．５４−７．４６（ｍ，４Ｈ），７．４０−７．３６（ｍ，１Ｈ），７．３３−７．２９（ｍ，１Ｈ），７．２７−７．２２（ｍ，３Ｈ），７．０９−７．０８（ｍ，２Ｈ），４．３４−４．２７（ｍ，２Ｈ），４．２２−４．１１（ｍ，４Ｈ），４．０２−３．９７（ｍ，２Ｈ），３．８３−３．７６（ｍ，２Ｈ），２．６９−２．５１（ｍ，４Ｈ），１．９３−１．８５（ｍ，２Ｈ），ＮＭＲスペクトルは、５３ｉのそれと一致した。ＨＲＭＳｍ／ｚ７４８．２０７７［（Ｍ＋Ｎａ）＋，Ｃ４４Ｈ３７Ｃｌ２Ｎ３ＮａＯ３として計算：７４８．２１０４］．
室温（ｒ．ｔ．）でＴＨＦ−Ｈ２Ｏ（１２ｍＬ／６ｍＬ）中５３ｏ（８０ｍｇ，０．１１０ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、酢酸（ＨＯＡｃ，４ｍＬ）が添加され、混合物を一晩撹拌した。１８時間後、混合物をＨ２Ｏで希釈し、固体が沈殿した。ＴＨＦは、真空下で除去され、水性懸濁液はｐＨ８になるまでＤＩＰＥＡで処理され、更なる固体の沈殿を生じた。固体を濾過により回収し、乾燥させ、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ１００：０から９７：３を使用するシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーにより精製し、黄褐色の固体として、１−（（Ｒ）−５−アミノ−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−（（Ｒ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）ペンタン−１，５−ジオン ５３ｐ（２０ｍｇ，３２％）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）１０．３６（ｓ，１Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．０４−８．０２（ｍ，２Ｈ），７．７９−７．７７（ｍ，２Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．５１−７．４７（ｍ，１Ｈ），７．４２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．３４−７．３０（ｍ，１Ｈ），７．２３（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），５．９１（ｓ，２Ｈ），４．３６−４．２６（ｍ，２Ｈ），４．１９−４．１３（ｍ，３Ｈ），４．０８−４．０４（ｍ，１Ｈ），４．０１−３．９３（ｍ，２Ｈ），３．７９（ｄｄ，Ｊ＝１０．７，８．３Ｈｚ，１Ｈ），３．７１（ｄｄ，Ｊ＝１０．５，８．９Ｈｚ，１Ｈ），２．７５−２．６６（ｍ，２Ｈ），２．６３−２．５３（ｍ，２Ｈ），２．００−１．９３（ｍ，２Ｈ）、ＮＭＲスペクトルは、５３ｊのそれと一致した。
実施例４ Ｎ−（４−（（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（６−（（Ｓ）−７−メトキシ−５−オキソ−２，３，５，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８−イルオキシ）ヘキサノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イルオキシ）メチル）フェニル）−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド ５４
無水ＴＨＦ（１４０ｍＬ）中の、Ｔｅｒｃｅｌｅｔａｌ（２００３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ４６：２１３２−２１５１の手順により調製された（Ｓ）−（２−アミノ−４−ヒドロキシ−５−メトキシフェニル）（２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−イル）メタノン５４ａ（７．６ｇ，２８．６ｍｍｏｌ）とジ−ｔ−ブチルジカーボネート（１２．４８ｇ，５７．２ｍｍｏｌ）の混合物が、１８時間、窒素雰囲気中で還流下で撹拌された。反応混合物は室温まで冷却され、２ＮのＮａＯＨ（５７．２ｍＬ，１１４ｍｍｏｌ）及びＭｅＯＨ（７０ｍＬ）が添加された。混合物を、６時間、室温で撹拌した。揮発物は、３５−４０℃（浴温度）で、減圧下で蒸発させた。氷水（２５０ｍＬ）が添加され、０℃でｐＨは８−９に調整された。混合物を石油エーテル−酢酸エチル（２０：１）（２ｘ４００ｍＬ）と共に室温で１５分間攪拌した。有機層は分離され、廃棄された。水層をＤＣＭ（４×３００ｍＬ）で抽出し、混合した抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で蒸発させ、ピンクホワイトの固体として、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル ５−ヒドロキシ−２−（２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボニル）−４−メトキシフェニルカルバメート ５４ｂ（９．３６ｇ，８９％）を得た；ｍｐ １５４−１５６ｏＣ；１Ｈ ＮＭＲ［（ＣＤ３）２ＳＯ］δ９．５１（ｓ，１Ｈ），８．９０（ｓ，１Ｈ），７．２７（ｓ，１Ｈ），６．９１（ｓ，１Ｈ），４．７３（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），４．１６−４．０２（ｍ，１Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ），３．６４−３．３４（ｍ，４Ｈ），１．９９−１．６０（ｍ，４Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ）．元素分析（Ｃ１８Ｈ２６Ｎ２Ｏ６）Ｃａｌｃ：Ｃ，５９．００；Ｈ，７．１５；Ｎ，７．６５．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，５８．９４；Ｈ，７．３１；Ｎ，７．３９．
乾燥ＤＭＡ（７ｍＬ）中、５４ｂ（２．８８ｇ，７．８７ｍｍｏｌ）とＴｅｒｃｅｌｅｔａｌ（２００３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ４６：２１３２−２１５１の手順により調製された２，２，２−トリクロロエチル６−ブロモヘキサノエート（３．８６ｇ，１１．８ｍｍｏｌ）の溶液に、無水Ｋ２ＣＯ３（２．６１ｇ，１８．９ｍｍｏｌ）が添加された。得られた混合物を、６８時間、室温で撹拌した。それを氷水（６００ｍＬ）に注ぎ、生成物を酢酸エチル（６００ｍＬ）中に抽出した。抽出物を、冷（０℃）の２ＮのＮａ２ＣＯ３水溶液（２×４００ｍＬ）及び水（４００ｍＬ）で連続的に洗浄し、次いで、乾燥させた（ＭｇＳＯ４）。溶媒を蒸発させると褐色油を与え、これはＳｉＯ２カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ：酢酸エチル＝２：１）により精製され、淡黄色の泡状物として、純粋な（Ｓ）−２，２，２−トリクロロエチル ６−（５−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４−（２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボニル）−２−メトキシフェノキシ）ヘキサノエート ５４ｃ（３．６２ｇ，７６％）を得た；ｍｐ ３６−３９ｏＣ；１Ｈ ＮＭＲ［（ＣＤ３）２ＳＯ］δ９．９０（ｓ，１Ｈ），７．３３（ｓ，１Ｈ），６．９３（ｓ，１Ｈ），４．８９（ｓ，２Ｈ），４．７４（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），４．１７−４．０２（ｍ，１Ｈ），３．９４（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ），３．６３−３．２６（ｍ，４Ｈ），２．５５−２．４６（ｍ，２Ｈ（ＤＭＳＯピークにより部分的に不明瞭）），２．００−１．５５（ｍ，８Ｈ），１．５３−１．３６（ｍ，１１Ｈ）．元素分析（Ｃ２６Ｈ３７Ｎ２Ｏ８）Ｃａｌｃ：Ｃ，５１．０３；Ｈ，６．０９；Ｎ，４．５８．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，５１．３３；Ｈ，６．２１；Ｎ，４．３５．
乾燥ＤＣＭ（１２ｍＬ）中の５４ｃ（３．６２ｇ，５．９２ｍｍｏｌ）の溶液に、デス・マーチン・ペルヨージナン（ＤＭＰ：１，１，１−トリアセトキシ−１，１−ジヒドロ−１，２−ベンズヨードキソール−３（１Ｈ）−オン、ＣＡＳＲｅｇ．Ｎｏ．８７４１３−０９−０）（３．２７ｇ，７．７０ｍｍｏｌ）が室温で１５分間少量ずつ添加された。反応混合物を、４５分間、室温で撹拌した。それをＤＣＭ（８００ｍＬ）で希釈し、１０％Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（１００ｍＬ）、冷（０ｏＣ）ＮａＨＣＯ３溶液（４００ｍＬ）、及び水（３００ｍＬ）で連続的に洗浄し、次いで乾燥（ＭｇＳＯ４）した。溶媒を蒸発させると琥珀色の固体を与え、これはＳｉＯ２カラムクロマトグラフィー（石油エーテル−酢酸エチル＝３：４）により精製され、粘着性の泡状物として、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル １１−ヒドロキシ−７−メトキシ−５−オキソ−８−（６−オキソ−６−（２，２，２−トリクロロエトキシ）ヘキシルオキシ）−２，３，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシレート ５４ｄ（２．６１ｇ，７２％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ［（ＣＤ３）２ＳＯ］δ７．０３（ｓ，１Ｈ），６．６７（ｓ，１Ｈ），６．３８（ｓ，１Ｈ），５．４１（ｓ，１Ｈ），４．８９（ｓ，２Ｈ），４．０６−３．８７（ｍ，２Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），３．５２−３．４３（ｍ，１Ｈ），３．４２−３．２８（ｍ，１Ｈ（水ピークにより部分的に不明瞭）），３．２７−３．２０（ｍ，１Ｈ），２．０８−１．８２（ｍ，５Ｈ），１．８１−１．７１（ｍ，２Ｈ），１．７１−１．６１（ｍ，２Ｈ），１．５３−１．４０（ｍ，３Ｈ），１．３１（ｓ，９Ｈ）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚＣ２６Ｈ３５Ｃｌ３Ｎ２ＮａＯ８として計算：６３１．１３５１， ｆｏｕｎｄ ：６３１．１３６１［ＭＮａ＋］．
アセトン−水（３：２）（１００ｍＬ）中の５４ｄの撹拌溶液（１．８０ｇ，２．９５ｍｍｏｌ）に、窒素下で、Ｚｎ（７．７２ｇ，１１８ｍｍｏｌ）及びＮＨ４Ｃｌ（６．３２ｇ，１１８ｍｍｏｌ）が添加された。混合物を室温で２８時間撹拌した。上清をデカントし、Ｚｎ残留物はＮａＨＣＯ３水溶液（３×１００ｍＬ）で洗浄された。洗浄液及び上清を合わせ、ＤＣＭで攪拌した（３００ｍＬ、次いで２×１００ｍＬ）。ＤＣＭ層は分離され、廃棄された。水層は、０℃で、濃塩酸でｐＨ＜１に酸性化された。生成物はＤＣＭ中に抽出され（４００ｍＬ；２ｘ２００ｍＬ）、乾燥し（ＭｇＳＯ４）され、蒸発させ、無色の泡状物として、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル ８−（５−ヒドロペルオキシヘキサ−５−エニルオキシ）−１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−５−オキソ−２，３，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシレート ５４ｅ（１．３４ｇ，９５％）を得た；ｍｐ ６５−６７ｏＣ；１Ｈ ＮＭＲ［（ＣＤ３）２ＳＯ］δ１１．９９（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．０４（ｓ，１Ｈ），６．６７（ｓ，１Ｈ），６．３７（ｂｒ ｓ，１Ｈ），５．４１（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，１Ｈ），４．０６−３．８７（ｍ，２Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），３．５３−３．１９（ｍ，３Ｈ（水ピークにより部分的に不明瞭）），２．２２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．０９−１．８１（ｍ，４Ｈ），１．８０−１．６７（ｍ，２Ｈ），１．６２−１．４９（ｍ，２Ｈ），１．４９−１．３７（ｍ，２Ｈ），１．３１（ｓ，９Ｈ）．元素分析（Ｃ２４Ｈ３４Ｎ２Ｏ８・１／４Ｈ２Ｏ）Ｃａｌｃ：Ｃ，５９．６８；Ｈ，７．２０；Ｎ，５．８０．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，５９．３７；Ｈ，７．２０；Ｎ，５．６２．
ＤＭＡ（７ｍＬ）中の５４ｅ（１．１６ｇ，２．４２ｍｍｏｌ）、（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（４−ニトロベンジルオキシ）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール ５４ｆ（８９３ｍｇ，２．４２ｍｍｏｌ），ＥＤＣＩ．ＨＣｌ（１．３９ｇ，７．２６ｍｍｏｌ）、及び無水ＴｓＯＨ（８３ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ）は、４時間、窒素雰囲気下で室温で攪拌された。水（１２０ｍＬ）が添加され、混合物は室温で１５分間撹拌された。沈殿した固体は濾過され、水（４ｘ４０ｍＬ）、０．０１％ＮＨ４ＯＨ（４ｘ４０ｍＬ）、及び石油エーテル（４ｘ４０ｍＬ）で連続的に洗浄され、次いで乾燥され、淡黄色の固体として、Ｎ−Ｂｏｃ−（Ｓ）−８−（６−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（４−ニトロベンジルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−６−オキソヘキシルオキシ）−１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−２，３，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−５（１０Ｈ）−オン ５４ｇ（１．７１ｇ，８５％）を得た；ｍｐ １３０−１３３ｏＣ；１Ｈ ＮＭＲ［（ＣＤ３）２ＳＯ］δ８．３０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），８．２３（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），８．１８（ｓ，１Ｈ），７．９２−７．８２（ｍ，３Ｈ），７．５７（ｔｄ，Ｊ＝８．２，１．１Ｈｚ，１Ｈ），７．４３（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．０３（ｓ，１Ｈ），６．６９（ｓ，１Ｈ），６．３９（ｂｒ ｓ，１Ｈ），５．５１−５．３５（ｍ，３Ｈ），４．３６（ｔ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，１Ｈ），４．２８−４．１５（ｍ，２Ｈ），４．１０−３．９０（ｍ，３Ｈ），３．８５（ｄｄ，Ｊ＝１１．１，７．８Ｈｚ，１Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），３．５２−３．４２（ｍ，１Ｈ），３．４２−３．２０（ｍ，２Ｈ（水ピークにより部分的に不明瞭）），２．６８−２．５０（ｍ，２Ｈ（ＤＭＳＯピークにより部分的に不明瞭）），２．１１−１．９５（ｍ，１Ｈ），１．９５−１．７５（ｍ，５Ｈ），１．
７５−１．６１（ｍ，２Ｈ），１．５９−１．４５（ｍ，２Ｈ），１．３１（ｓ，９Ｈ）．元素分析（Ｃ４４Ｈ４９ＣｌＮ４Ｏ１０）Ｃａｌｃ：Ｃ，６３．７２；Ｈ，５．９６；Ｎ，６．７６．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，６３．３３；Ｈ，５．９７；Ｎ，６．９２．
ＴＨＦ（９０ｍＬ）、アセトン（７０ｍＬ）、及び水（４０ｍＬ）の混合物中の５４ｇの撹拌溶液（１．７０ｇ，２．０５ｍｍｏｌ）に、窒素下で、Ｚｎ（２．６８ｇ，４１．０ｍｍｏｌ）及びＮＨ４Ｃｌ（４．３９ｇ，８２．０ｍｍｏｌ）が添加された。混合物を、室温で４５分間撹拌し、次いでセライトを通して濾過し、ＴＨＦで数回洗浄した濾液は室温で減圧下で約６０ｍＬに濃縮された。０．０１％のＮＨ４ＯＨ（４００ｍＬ）の溶液が添加され、混合物は室温で１５分間撹拌された。固体を回収し、０．０１％ＮＨ４ＯＨ（３ｘ１００ｍＬ）、水（３ｘ１００ｍＬ）及び石油エーテル（３ｘ１００ｍＬ）で連続的に洗浄された。固体は乾燥されて５４ｄのアニリン誘導体（１．１６ｇ，１００％）を与え、乾燥ＤＭＡ（２ｍＬ）中で６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸（２５３ｍｇ，１．２０ｍｍｏｌ），ＥＤＣＩ．ＨＣｌ（５７６ｍｇ，３．００ｍｍｏｌ）及び無水ＴｓＯＨ（３４．４ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ）で処理された。混合物を、室温で窒素下で１７時間撹拌した。ＮａＨＣＯ３溶液（５０ｍＬ）が添加され、混合物を室温で３０分間撹拌した。固体を収集し、水で洗浄し、乾燥させ、シリカカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ：酢酸エチル＝１：１）により精製し、黄色の固体として、純粋な（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル ８−（６−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（４−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）ベンジルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−６−オキソヘキシルオキシ）−１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−５−オキソ−２，３，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシレート ５４ｈ（１９４ｍｇ，３３％）を得た；ｍｐ １２８−１３２ｏＣ；１Ｈ ＮＭＲ［（ＣＤ３）２ＳＯ］δ９．９１（ｓ，１Ｈ），８．２０−８．１１（ｍ，２Ｈ），７．８４（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．６２（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．５４（ｂｒｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．４７（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．３８（ｂｒｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．０４（ｓ，１Ｈ），７．００（ｓ，２Ｈ），６．６９（ｓ，１Ｈ），６．３８（ｂｒ ｓ，１Ｈ），５．４５−５．３７（ｍ，１Ｈ），５．２０（ｓ，２Ｈ），４．３６（ｔ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ，１Ｈ），４．２６−４．１３（ｍ，２Ｈ），４．１０−３．９２（ｍ，３Ｈ），３．８８−３．７９（ｍ，１Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），３．５２−３．３０（ｍ，４Ｈ），３．２４（ｂｒｔ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），２．６６−２．５０（ｍ，２Ｈ（ＤＭＳＯピークにより部分的に不明瞭）），２．２８（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），２．０８−１．９５（ｍ，１Ｈ），１．９５−１．７６（ｍ，５Ｈ），１．７６−１．６４（ｍ，２Ｈ），１．６４−１．２０（ｍ，８Ｈ），１．３１（ｓ，９Ｈ）．元素分析（Ｃ５４Ｈ６２ＣｌＮ５Ｏ１１）Ｃａｌｃ：Ｃ，６５．３５；Ｈ，６．３０；Ｎ，７．０６．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，６５．０８；Ｈ，６．３９；Ｎ，６．６７．
窒素雰囲気下で−１０から−１１℃で攪拌されたＤＣＭ（１５ｍＬ）中のＮ−（４−（（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（６−（（Ｓ）−７−メトキシ−５−オキソ−２，３，５，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８−イルオキシ）ヘキサノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イルオキシ）メチル）フェニル）−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド ５４ｈ（２０４ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）の溶液に、２．５％の水を含有するＴＦＡ（１５ｍｌ）が（３０分かけて）滴下された。添加後、混合物を４時間、更にこの温度で撹拌した。混合物を、氷、ＤＣＭ、及び十分に飽和したＮａＨＣＯ３溶液の混合物に注ぎ、０℃でｐＨ７−８を得た。混合物を室温で１５分間撹拌した。ＤＣＭ層を分離し、更にＮａＨＣＯ３水溶液及び水で洗浄し、次いで乾燥した（ＭｇＳＯ４）。溶媒を２５℃（浴温度）で蒸発させ、黄色の固体を得た（１７２ｍｇ，９４％の材料が回収された）。この粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｓｙｎｅｒｇｉ−ＭａｘＲＰカラム）により精製し（３０％ギ酸アンモニウム緩衝液ｐＨ＝３．５；７０％水性（１０％）アセトニトリル；流速：１３ｍＬ／分で溶出）、５４（３０ｍｇ，１６％）を得た，ＨＰＬＣ：９８．８％純度；ｍｐ １９０ｏＣ（ｄｅｃ．）；［α２０ Ｄ＋３２０ｏ（ｃ０．１００，ＤＣＭ）；１Ｈ ＮＭＲ［ＣＤＣｌ３］δ８．２９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），８．１８（ｓ，１Ｈ），７．６９−７．６３（ｍ，２Ｈ），７．６１−７．４４（ｍ，６Ｈ），７．３７（ｂｒｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），６．８２（ｓ，１Ｈ），６．６６（ｓ，２Ｈ），５．２４（ｓ，２Ｈ），４．３４−４．１９（ｍ，２Ｈ），４．１９−４．００（ｍ，３Ｈ），３．９９−３．９２（ｍ，１Ｈ），３．８９（ｓ，３Ｈ），３．８６−３．７８（ｍ，１Ｈ），３．７６−３．７０（ｍ，１Ｈ），３．６３−３．４９（ｍ，３Ｈ），３．４２（ｔ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，１Ｈ），２．６８−２．４７（ｍ，２Ｈ），２．４０−２．２７（ｍ，３Ｈ），２．１２−１．９２（ｍ，５Ｈ），１．９２−１．８２（ｍ，２Ｈ），１．８２−１．７１（ｍ，２Ｈ），１．７１−１．５４（ｍ，４Ｈ（水ピークにより部分的に不明瞭）），１．４３−１．３２（ｍ，２Ｈ）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚＣ４９Ｈ５２ＣｌＮ５ＮａＯ８として計算：８９６．３３９７， ｆｏｕｎｄ ：８９６．３３７５［ＭＮａ＋］．
実施例５ Ｎ−（（Ｓ）−１−（（Ｓ）−１−（４−（（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イルオキシ）メチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イルアミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド ５５
室温で、炭酸カリウム、Ｋ２ＣＯ３（２．５０ｇ，１８．１ｍｍｏｌ）が、ＤＭＦ（１２ｍＬ）中の（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル １−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ５１ａ（２．０１ｇ，６．０２ｍｍｏｌ）及び１−（ブロモメチル）−４−ニトロベンゼン（５．２０ｇ，２４．１ｍｍｏｌ）に添加された（図６）。反応混合物を室温で２時間撹拌し、次いで、ＥｔＯＡｃ及びＨ２Ｏで希釈し、層を分離した。有機層をＨ２Ｏ（３×）、かん水（１×）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒を真空下で除去した。ヘキサン：ＥｔＯＡｃ１００：０から９６：４を用いたシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによる２回の精製により、山吹色固体として、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル １−（クロロメチル）−５−（４−ニトロベンジルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ５５ａ（２．１７ｇ，７７％）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）８．３１−８．２７（ｍ，３Ｈ），７．８５（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．７２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．５４（ｄｄｄ，Ｊ＝８．２，６．８，１．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３８（ｄｄｄ，Ｊ＝８．２，６．８，１．１Ｈｚ，１Ｈ），４．２８−４．２５（ｍ，１Ｈ），４．１６−４．１０（ｍ，１Ｈ），４．０２−３．９２（ｍ，２Ｈ），３．４５（ｔ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ，１Ｈ），１．６０（ｓ，９Ｈ）．ＨＲＭＳｍ／ｚ４９１．１３３８［（Ｍ＋Ｎａ）＋，Ｃ２５Ｈ２５ＣｌＮ２ＮａＯ５として計算：４９１．１３４４］．
還元法Ａ：５５ａ（１．５３ｇ，３．２６ｍｍｏｌ）が、ＴＨＦ−アセトン（７５ｍＬ／６０ｍＬ）に溶解された。５５ａが溶解するとＨ２Ｏ（３０ｍＬ）が添加された。ＮＨ４Ｃｌ（１０．５ｇ，１９６ｍｍｏｌ）及びＺｎ粉末（６．４０ｇ，９７．９ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を１時間窒素下で室温で撹拌した。次いで、反応混合物を、セライトを通して濾過し、セライトプラグをＤＣＭで洗浄し、混合した濾液をＨ２Ｏ（１ｘ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）で洗浄し、溶媒を真空下で除去し、オレンジ色の固体として化合物５５ｂを得た。粗生成物を精製せずに次の工程に使用した。
還元法Ｂ：ＴＨＦ−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（１５０ｍＬ／５０ｍＬ／２０ｍＬ）中の５５ａの溶液にマーキュリー−アルミニウムアマルガムが添加された。１５分後、反応混合物を、ＤＣＭで希釈し、セライトを通して濾過し、セライトプラグをＤＣＭで洗浄した。有機物を、Ｈ２Ｏで洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒を真空下で除去し、オレンジ色の固体として、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル ５−（４−アミノベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ５５ｂを得た。生成物を精製せずに次の工程に使用した。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）８．０６（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），７．８０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．５３−７．４９（ｍ，１Ｈ），７．３４−７．３０（ｍ，１Ｈ），７．１９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），６．６０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），５．１６（ｓ，２Ｈ），５．０４（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，２Ｈ），４．１８−４．０５（ｍ，３Ｈ），４．００−３．９７（ｍ，１Ｈ），３．８１（ｄｄ，Ｊ＝１０．９，６．９Ｈｚ，１Ｈ），１．５６（ｓ，９Ｈ），１Ｈ（観測されず）。
ＤＭＡ（１５ｍＬ）中の（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−５−ウレイドペンタン酸（Ｆｍｏｃ−Ｌ−シトルリン、３．２６ｇ，８．２０ｍｍｏｌ）及び２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ，ＣＡＳＲｅｇ．Ｎｏ．１６３５７−５９−８，３．１２ｇ，１２．６ｍｍｏｌ）の混合物が、室温で窒素下で２０分間攪拌された。次いでＤＭＡ（１５ｍＬ）中の５５ｂ（２．７７ｇ，６．３１ｍｍｏｌ）の溶液が添加され、得られた混合物を窒素で洗浄し、一晩攪拌したままにした。１６時間後、反応混合物を氷の上に注ぎ、Ｈ２Ｏで希釈した。得られた沈殿物を濾過し、Ｈ２Ｏで洗浄し、ＤＣＭ／ＭｅＯＨに溶解し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒を真空下で除去した。粗生成物を粉砕することによって精製し、生成物はヘキサン：ＥｔＯＡｃ９４：６により沈殿させ、溶媒をデカントし、そのプロセスは、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ９０：１０、次いでヘキサン：ＥｔＯＡｃ９５：５を用いて繰り返された。材料は、その後、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ１００：０から９５：５を使用してシリカゲル上でカラム処理され、黄色い固体として、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル ５−（４−（（Ｓ）−２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ５５ｃ（４．２３ｇ，７９％、５５ａから２工程かけて、ＨＰＬＣ純度：９５．３％）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）１０．１２（ｓ，１Ｈ），８．１２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８９（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．７７−７．７４（ｍ，２Ｈ），７．７０−７．６７（ｍ，３Ｈ），７．５５−７．４９（ｍ，３Ｈ），７．４２（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３７−７．３１（ｍ，３Ｈ），６．００（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），５．４３（ｓ，２Ｈ），５．２２（ｓ，２Ｈ），４．２９−４．２７（ｍ，２Ｈ），４．２４−４．０５（ｍ，６Ｈ），４．０１−３．９８（ｍ，１Ｈ），３．８２（ｄｄ，Ｊ＝１０．９，７．０Ｈｚ，１Ｈ），３．０９−２．９２（ｍ，２Ｈ），１．７４−１．３５（ｍ，４Ｈ），１．５５（ｓ，９Ｈ）．ＨＲＭＳｍ／ｚ８４０．３１０１［（Ｍ＋Ｎａ）＋，Ｃ４６Ｈ４８ＣｌＮ５ＮａＯ７として計算：８４０．３１３４］．
ピペリジン（１．５ｍＬ，１０％ｖ／ｖ）が、室温でＤＭＦ（１５ｍＬ）中の５５ｃ（４．１８ｇ，５．１１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に添加された。反応混合物を１時間撹拌した。得られた懸濁液は、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ９０：１０（１００ｍＬ）で希釈され、１０分間攪拌した。二つの層が形成され、最上層をデカントした。保持された下部層中の溶媒を真空下で除去した。ＤＣＭ：ＭｅＯＨ１００：０から８５：１５を用いたシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによる精製は、黄色の粉末として、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル ５−（４−（（Ｓ）−２−アミノ−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ５５ｄ（２．９７ｇ，９７％，ＨＰＬＣ純度：９９．１％）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）９．９３（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．１２（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．５５−７．４８（ｍ，３Ｈ），７．３７−７．３３（ｍ，１Ｈ），５．９４（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），５．３７（ｓ，２Ｈ），５．２２（ｓ，２Ｈ），４．１９−４．０５（ｍ，４Ｈ），４．０１−３．９８（ｍ，１Ｈ），３．８２（ｄｄ，Ｊ＝１０．９，７．０Ｈｚ，１Ｈ），３．０４−２．９１（ｍ，２Ｈ），１．７１−１．３６（ｍ，４Ｈ），１．５５（ｓ，９Ｈ），３Ｈ（観測されず）。ＨＲＭＳｍ／ｚ５９６．２６２７［（Ｍ＋Ｈ）＋，Ｃ３１Ｈ３９ＣｌＮ５Ｏ５として計算：５９６．２６３４］．
ＤＭＡ（１５ｍＬ）中の（Ｓ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−３−メチルブタノアート（Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＳｕ，３．１９ｇ，７．３１ｍｍｏｌ）及び５５ｄ（２．９１ｇ，４．８７ｍｍｏｌ）の混合物が、窒素下、室温で一晩攪拌された。２０時間後、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ８０：２０（１５０ｍＬ）が添加され、その懸濁液を３０分間撹拌した。次いで、溶媒を、固体を残してデカントした。これはヘキサン：ＥｔＯＡｃ７５：２５を用いて複数回繰り返された。次いで固体はＤＣＭ：ＭｅＯＨ７５：２５に懸濁され、そして懸濁液を超音波処理した。懸濁液をヘキサン（２００ｍＬ）で希釈し、固体を濾過し、ヘキサン：ＥｔＯＡｃを６５：３５で洗浄し、乾燥させ、オレンジ色の粉末として、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル ５−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ５５ｅ（３．７９ｇ，８５％，ＨＰＬＣ純度：９２．４％）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）１０．１２（ｓ，１Ｈ），８．１４−８．１２（ｍ，２Ｈ），７．８９（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７５（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．５５−７．４８（ｍ，３Ｈ），７．４５−７．３０（ｍ，６Ｈ），５．９８（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），５．４１（ｓ，２Ｈ），５．２２（ｓ，２Ｈ），４．４５（ｄｄ，Ｊ＝１３．６，７．７Ｈｚ，１Ｈ），４．３６−４．０４（ｍ，６Ｈ），４．０２−３．９０（ｍ，２Ｈ），３．８２（ｄｄ，Ｊ＝１０．８，６．９Ｈｚ，１Ｈ），３．０８−２．９１（ｍ，２Ｈ），２．０５−１．９６（ｍ，１Ｈ），１．７６−１．３４（ｍ，４Ｈ），１．５５（ｓ，９Ｈ），０．８９（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．８６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）．ＨＲＭＳｍ／ｚ９３９．３８０８［（Ｍ＋Ｎａ）＋，Ｃ５１Ｈ５７ＣｌＮ６ＮａＯ８として計算：９３９．３８１９］．
Ｂｏｃ除去法Ａ：０℃で、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の５５ｅの懸濁液（６８５ｍｇ，０．７４７ｍｍｏｌ）に、ＴＦＡ（９．５ｍＬ）を少量ずつ添加した。反応混合物を１時間４５分間０℃で攪拌した。次いでＮＨ３水溶液（０．２５％、１００ｍＬ）が０℃で混合物に少量ずつ添加され、次いでｐＨが９−１０になるまで濃縮されたＮＨ３水溶液が添加された。ヘキサン：ＥｔＯＡｃ９０：１０が次いで添加され、混合物は０℃で４０分間攪拌され、懸濁液を超音波処理し、沈殿物を濾過により回収し、Ｈ２Ｏ，Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ８０：２０，ヘキサン：ＥｔＯＡｃ６０：４０，ヘキサン：Ｅｔ２Ｏ５０：５０、ヘキサンで洗浄し、乾燥させ、褐色の固体として、（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル （Ｓ）−１−（（Ｓ）−１−（４−（（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イルオキシ）メチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イルアミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イルカルバメート ５５ｆ（３６４ｍｇ，６０％）を得た。
Ｂｏｃ除去法Ｂ：ＤＣＭ（４０ｍＬ）中のＢＦ３．Ｅｔ２Ｏ（０．０７ｍＬ，０．５５２ｍｍｏｌ）が０℃で５５ｅの懸濁液に添加された。１時間５０分後懸濁液は、室温で真空下でほんの僅かのＤＣＭが残るまで濃縮された。沈殿が溶解するまで少量のＭｅＯＨが添加され、次いで溶液をＨ２Ｏで希釈した。固体が析出し、Ｈ２Ｏをデカントした。ヘキサン：ＥｔＯＡｃ９０：１０（２０ｍＬ）が添加され、そして懸濁液は超音波処理され、固体を濾過により回収した。固体がＨ２Ｏ及びヘキサンにより洗浄され、乾燥され、茶色の固体として、（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル （Ｓ）−１−（（Ｓ）−１−（４−（（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イルオキシ）メチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イルアミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イルカルバメート ５５ｆ（６６ｍｇ，７０％）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）１０．１０（ｓ，１Ｈ），８．１２（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），８．００（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．８９（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．７４（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．６４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．５８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．４６−７．３７（ｍ，５Ｈ），７．３４−７．３０（ｍ，２Ｈ），７．１３−７．０９（ｍ，１Ｈ），６．５５（ｓ，１Ｈ），５．９７（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），５．４１（ｓ，２Ｈ），５．１７（ｓ，２Ｈ），４．４３（ｄｄ，Ｊ＝１３．０，７．５Ｈｚ，１Ｈ），４．３４−４．２１（ｍ，３Ｈ），３．９５−３．９０（ｍ，２Ｈ），３．８３（ｄｄ，Ｊ＝１０．７，３．４Ｈｚ，１Ｈ），３．７０−３．６６（ｍ，１Ｈ），３．６１−３．５１（ｍ，２Ｈ），３．０８−２．９０（ｍ，２Ｈ），２．０４−１．９６（ｍ，１Ｈ），１．７６−１．３３（ｍ，４Ｈ），０．８９（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．８６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），２Ｈ（観測されず）。ＨＲＭＳｍ／ｚ８３９．３２６６［（Ｍ＋Ｎａ）＋，Ｃ４６Ｈ４９ＣｌＮ６ＮａＯ６として計算：８３９．３２９４］．
ＤＭＡ（１０ｍＬ）中の５５ｆ（４８５ｍｇ，０．５９３ｍｍｏｌ），５３ｈ（２０６ｍｇ，０．５９３ｍｍｏｌ），ＥＤＣＩ．ＨＣｌ（２９３ｍｇ，１．４８ｍｍｏｌ）及びＴｓＯＨ（２６ｍｇ，０．１５１ｍｍｏｌ）の混合物は窒素で洗浄され、一晩室温で攪拌された。１９．５時間後、反応混合物はＨ２Ｏで希釈され、得られた固体は濾過により回収され、Ｈ２Ｏ及びヘキサン：ＥｔＯＡｃ５０：５０で洗浄された。ＤＣＭ：ＭｅＯＨ１００：０から９０：１０を用いたシリカゲルのプラグ上で濾過カラムクロマトグラフィーは、次の工程で未精製で使用される
（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル （Ｓ）−１−（（Ｓ）−１−（４−（（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イルオキシ）メチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イルアミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イルカルバメート ５５ｇ（３９１ｍｇ）を得た。ＨＲＭＳｍ／ｚ１１４４．４１６９［（Ｍ−Ｈ）＋，Ｃ６４Ｈ６４Ｃｌ２Ｎ７Ｏ９として計算：１１４４．４１４８］．
ピペリジン（０．３９ｍＬ，３．９５ｍｍｏｌ）が、室温でＤＭＦ（６ｍＬ）中の５５ｇの懸濁液（９１０ｍｇ，０．７９３ｍｍｏｌ）に添加された。１０分後、混合物は真空下で濃縮された。ＤＣＭ：ＭｅＯＨ９５：５から８５：１５を用いるシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーによる精製と続く分取ＨＰＬＣによる更なる精製（カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ−ＭＡＸＲＰ４μ，２１．２０×２５０ｍｍ；流速：１２ｍｌ／分；移動相Ａ：Ｈ２Ｏ／ＴＦＡｐＨ２．４７，溶媒Ｂ：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ９０：１０；方法：勾配、溶媒Ａ：溶媒Ｂ６０：４０から２２：７８から６０：４０，２４分；波長：２５４ｎｍ，３３０ｎｍ）は、クリーム色の固体として、（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（４−（（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イルオキシ）メチル）フェニル）−５−ウレイドペンタンアミド トリフルオロアセタート ５５ｈ（７５ｍｇ，９％）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）１０．３５（ｓ，１Ｈ），１０．２４（ｓ，１Ｈ），８．６９（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），８．２０（ｓ，１Ｈ），８．１５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），８．０９−８．０２（ｍ，４Ｈ），７．８６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．５７−７．４７（ｍ，３Ｈ），７．４０−７．３７（ｍ，１Ｈ），７．３４−７．３０（ｍ，１Ｈ），６．０４（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），５．４８（ｂｒ ｓ，２Ｈ），５．２２（ｓ，２Ｈ），４．５７−４．５１（ｍ，１Ｈ），４．４０−４．３３（ｍ，２Ｈ），４．２５−４．１４（ｍ，４Ｈ），４．０３−３．９８（ｍ，２Ｈ），３．８５（ｄｄ，Ｊ＝１０．７，７．６Ｈｚ，１Ｈ），３．７９（ｄｄ，Ｊ＝１０．３，８．６Ｈｚ，１Ｈ），３．６６（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），３．０９−２．９７（ｍ，２Ｈ），２．７５−２．５７（ｍ，４Ｈ），２．１１−２．０６（ｍ，１Ｈ），２．０１−１．９６（ｍ，２Ｈ），１．７８−１．７０（ｍ，１Ｈ），１．６８−１．５８（ｍ，１Ｈ），１．５３−１．４０（ｍ，２Ｈ），０．９５（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．９４（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）．ＨＲＭＳｍ／ｚ９２４．３６７２［（Ｍ＋Ｈ）＋，Ｃ４９Ｈ５６Ｃｌ２Ｎ７Ｏ７として計算：９２４．３６１３］．
ＤＭＦ（３ｍＬ）中のジイソプロピルエチルアミン、ＤＩＰＥＡ（１０ｍｇ，０．０７７４ｍｍｏｌ）が、５５ｈ（７４ｍｇ，０．０７１２ｍｍｏｌ）及び２，５−ジオキソピロリジン−１−イル ６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノエート（３３ｍｇ，０．１０７ｍｍｏｌ）に添加され、得られた混合物は窒素下で室温で攪拌された。５．５時間後、追加の部分のＤＩＰＥＡ（０．９ｍｇ，０．００６９３ｍｍｏｌ）及び２，５−ジオキソピロリジン−１−イル ６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノエート（４．４ｍｇ，０．０１４３ｍｍｏｌ）が添加された。更に１時間後、追加の部分の２，５−ジオキソピロリジン−１−イル ６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノエート（８ｍｇ，０．０２５９ｍｍｏｌ）が添加され、混合物は一晩−２０℃に保たれた。１５時間後、混合物は室温に温められ、追加の部分の２，５−ジオキソピロリジン−１−イル ６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノエート（４．４ｍｇ，０．０１４３ｍｍｏｌ）が添加された。更に１時間後、追加の部分の２，５−ジオキソピロリジン−１−イル ６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノエート（７．５ｍｇ，０．０２４３ｍｍｏｌ）が添加された。１時間後、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ９５：５（２５ｍＬ）、続いてＤＣＭ（５ｍＬ）が添加され、混合物は２０分間撹拌された。この期間にわたり、溶液から固体が沈殿した。混合物を沈降させ、次いで溶媒がデカントされた。次いで、ヘキサン：ＤＣＭ９５：５が添加され、懸濁液は撹拌され、静置され、溶媒がデカントされ、固体は乾燥された。分取ＨＰＬＣによる精製（カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ−ＭＡＸＲＰ４μ，２１．２０×２５０ｍｍ；流速：１３ｍｌ／分；移動相Ａ：Ｈ２Ｏ／ＴＦＡｐＨ２．４７，溶媒Ｂ：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ９０：１０；方法：アイソクラチック、溶媒Ａ：溶媒Ｂ３５：６５、３５分；波長：２５４ｎｍ、３３０ｎｍ）は、淡黄色粉末として、Ｎ−（（Ｓ）−１−（（Ｓ）−１−（４−（（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イルオキシ）メチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イルアミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド ５５（１３．７ｍｇ，１７％，ＨＰＬＣ純度：９２．５％）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）１０．３５（ｓ，１Ｈ），１０．０２（ｓ，１Ｈ），８．１９（ｓ，１Ｈ），８．１５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），７．８６（ｓ，１Ｈ），７．８１−７．７７（ｍ，２Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．５７−７．５３（ｍ，１Ｈ），７．５０−７．４７（ｍ，３Ｈ），７．４０−７．３６（ｍ，１Ｈ），７．３３−７．３０（ｍ，１Ｈ），６．９９（ｓ，２Ｈ），５．９７（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），５．４０（ｂｒ ｓ，２Ｈ），５．２１（ｓ，２Ｈ），４．４２−４．３２（ｍ，３Ｈ），４．２２−４．１４（ｍ，４Ｈ），４．０３−３．９８（ｍ，２Ｈ），３．８７−３．７７（ｍ，２Ｈ），３．３４（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），３．０７−３．０５（ｍ，２Ｈ），２．７６−２．５９（ｍ，４Ｈ），２．２２−２．０８（ｍ，２Ｈ），２．０２−１．９２（ｍ，３Ｈ），１．７４−１．５７（ｍ，２Ｈ），１．５１−１．３３（ｍ，６Ｈ），１．２３−１．１４（ｍ，３Ｈ），０．８５（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．８２（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）．ＨＲＭＳｍ／ｚ１１１５．４１７０［（Ｍ−Ｈ）＋，Ｃ５９Ｈ６５Ｃｌ２Ｎ８Ｏ１０として計算：１１１５．４２０６］．
実施例６ Ｎ−（（Ｓ）−１−（（Ｓ）−１−（４−（（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（６−（（Ｓ）−７−メトキシ−５−オキソ−２，３，５，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８−イルオキシ）ヘキサノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イルオキシ）メチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イルアミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド ５６
（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル ８−（６−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（４−ニトロベンジルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−６−オキソヘキシルオキシ）−１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−５−オキソ−２，３，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシレート５４ｇ（８２９ｍｇ，１．００ｍｍｏｌ）が（上記５４ｈの合成について報告された方法により）対応するアニリンへ還元され（Ｚｎ／ＮＨ４Ｃｌ）、乾燥ＤＭＡ（３ｍＬ）に溶解された。この溶液に、（Ｓ）−２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−５−ウレイドペンタン酸（Ｆｍｏｃ−Ｌ−シトルリン，１．１９ｇ，３．００ｍｍｏｌ）及び２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリンＥＥＤＱ（０．９９ｇ，４．００ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＡ（４ｍＬ）中で室温で４０分間攪拌することにより形成された混合物が添加された。最終反応混合物は室温で窒素雰囲気下で１９時間撹拌された。混合物に水が注がれ室温で５時間撹拌された。固体が回収され、水で複数回洗浄され、乾燥させ、シリカカラムクロマトグラフィー（０−５％からのＤＣＭ−ＭｅＯＨ勾配）により精製され、ベージュ色の固体として、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル ８−（６−（（Ｓ）−５−（４−（（Ｓ）−２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−６−オキソヘキシルオキシ）−１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−５−オキソ−２，３，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシレート ５６ａ（０．９１ｇ，７７％），ｍｐ １７２ｏＣ；１Ｈ ＮＭＲ［（ＣＤ３）２ＳＯ］δ１０．１０（ｓ，１Ｈ），８．２２−８．１１（ｍ，２Ｈ），７．９４−７．６２（ｍ，８Ｈ），７．５９−７．４６（ｍ，３Ｈ），７．４６−７．２７（ｍ，５Ｈ），７．０４（ｓ，１Ｈ），６．６９（ｓ，１Ｈ），６．３９（ｂｒ ｓ，１Ｈ），５．９９（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），５．５１−５．３２（ｍ，３Ｈ），５．２２（ｓ，２Ｈ），４．４２−３．９０（ｍ，１０Ｈ），３．８８−３．７５（ｍ，１Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），３．５３−３．１８（ｍ，３Ｈ），３．１５−２．８７（ｍ，２Ｈ），２．６６−２．４４（ｍ，２Ｈ（ＤＭＳＯピークにより部分的に不明瞭）），２．１１−１．２０（ｍ，１４Ｈ），１．３１（ｓ，９Ｈ）を得た。元素分析（Ｃ６５Ｈ７２ＣｌＮ７Ｏ１２・１／２Ｈ２Ｏ）Ｃａｌｃ：Ｃ，６５．７３；Ｈ，６．２０；Ｎ，８．２６．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，６５．６４；Ｈ，６．１９；Ｎ，８．２７．
０℃で、窒素雰囲気下で、乾燥ＤＭＡ（９ｍＬ）中のＮ−Ｆｍｏｃ５６ａ（０．９１ｇ，０．７７ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、ＤＭＡ（１．０ｍｍｏｌ（ｍＬ溶液あたり））中のピペリジンの溶液（３．８５ｍＬ，３．８５ｍｍｏｌ）が添加された。添加後、混合物はこの温度で２時間更に攪拌され、次いで、酢酸エチル−石油エーテル（１：１０）（１５０ｍＬ）の混合物に注がれ、３０分間０℃で撹拌された。溶媒は不溶性物質からデカントされ廃棄された。洗浄工程は、室温で追加の酢酸エチル−石油エーテル（１：３）（２ｘ１５０ｍＬ）を用いて繰り返された。固体は回収され、酢酸エチル−石油エーテル（１：３）で洗浄され、乾燥され、無色の固体として、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル ８−（６−（（Ｓ）−５−（４−（（Ｓ）−２−アミノ−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−６−オキソヘキシルオキシ）−１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−５−オキソ−２，３，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシレート ５６ｂ（０．７３ｇ，９９％）；ｍｐ ２２３ｏＣ（ｄｅｃ．）；１Ｈ ＮＭＲ［（ＣＤ３）２ＳＯ］δ１０．６０−９．３０（ｂｒ ｓ，３Ｈ），８．２４−８．１２（ｍ，２Ｈ），７．８４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．５４（ｂｒｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５０（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．３９（ｂｒｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０４（ｓ，１Ｈ），６．６９（ｓ，１Ｈ），６．３９（ｂｒ ｓ，１Ｈ），５．９３（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），５．４７−５．２８（ｍ，３Ｈ），５．２１（ｓ，２Ｈ），４．３６（ｔ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，１Ｈ），４．２８−４．１３（ｍ，２Ｈ），４．１０−３．９２（ｍ，３Ｈ），３．９０−３．７７（ｍ，１Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），３．５４−３．２０（ｍ，３Ｈ（水ピークにより部分的に不明瞭）），３．０６−２．８９（ｍ，２Ｈ），２．７０−２．４９（ｍ，３Ｈ（ＤＭＳＯピークにより部分的に不明瞭）），２．１０−１．２５（ｍ，１４Ｈ），１．３１（ｓ，９Ｈ）を得た。元素分析（Ｃ５０Ｈ６２ＣｌＮ７Ｏ１０・３／４Ｈ２Ｏ）Ｃａｌｃ：Ｃ，６１．９１；Ｈ，６．６０；Ｎ，１０．１１．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，６２．０５；Ｈ，６．９６；Ｎ，１０．０８．
乾燥ＤＭＡ（７ｍＬ）中のアミン５６ｂ（０．７３ｇ，０．７６３ｍｍｏｌ）及び（Ｓ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−３−メチルブタノアート（Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｏｓｕ，０．５０ｇ，１．１５ｍｍｏｌ）の混合物が室温で窒素雰囲気下で１８時間攪拌された。溶媒は不溶性物質からデカントされ、洗浄工程は追加の酢酸エチル−石油エーテル（１：１）（２×１００ｍＬ）を用いて繰り返された。無色の固体は乾燥され、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル ８−（６−（（Ｓ）−５−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−６−オキソヘキシルオキシ）−１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−５−オキソ−２，３，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシレート ５６ｃ（０．８９ｇ，９１％）；ｍｐ １９１ｏＣ（ｄｅｃ．）；１Ｈ ＮＭＲ［（ＣＤ３）２ＳＯ］δ１０．１１（ｓ，１Ｈ），８．２２−８．０８（ｍ，３Ｈ），７．９２−７．８１（ｍ，３Ｈ），７．７４（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．６５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．５４（ｂｒｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．４８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．４６−７．３５（ｍ，４Ｈ），７．３２（ｂｒｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．０４（ｓ，１Ｈ），６．６９（ｓ，１Ｈ），６．３９（ｂｒ ｓ，１Ｈ），５．９７（ｂｒ ｓ，１Ｈ），５．４７−５．３４（ｍ，３Ｈ），５．２１（ｓ，２Ｈ），４．５３−４．１３（ｍ，７Ｈ），４．１０−３．７５（ｍ，５Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），３．５３−３．２０（ｍ，３Ｈ（水ピークにより部分的に不明瞭）），３．１０−２．８７（ｍ，２Ｈ），２．６９−２．４５（ｍ，２Ｈ（ＤＭＳＯピークにより部分的に不明瞭）），２．１０−１．２５（ｍ，１５Ｈ），１．３１（ｓ，９Ｈ），０．８８（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．８５（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）を得た。元素分析（Ｃ７０Ｈ８１ＣｌＮ８Ｏ１３・３／４Ｈ２Ｏ）Ｃａｌｃ：Ｃ，６５．１０；Ｈ，６．４４；Ｎ，８．６８．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，６４．８５；Ｈ，６．４８；Ｎ，８．６７．
０℃で、窒素雰囲気下で、乾燥ＤＭＡ（６ｍＬ）中のＮ−Ｆｍｏｃ化合物５６ｃ（０．８９ｇ，０．７０ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、ＤＭＡ中のピペリジンの溶液（１．０ｍｍｏｌ（ｍＬ溶液あたり））（３．４８ｍＬ，３．４８ｍｍｏｌ）が添加された。添加後、混合物はこの温度で１．５時間更に攪拌された。酢酸エチル−石油エーテル（１：１０）（９０ｍＬ）の混合物が添加され、混合物は０℃で１０分間撹拌された。溶媒層は不溶性物質からデカントされ廃棄された。洗浄工程は、室温で追加の酢酸エチル−石油エーテル（１：２）（２ｘ９０ｍＬ）を用いて繰り返された。無色の固体が後に残され、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル ８−（６−（（Ｓ）−５−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−６−オキソヘキシルオキシ）−１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−５−オキソ−２，３，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシレート ５６ｄ（０．６８ｇ，９３％）を得た；ｍｐ ２２５ｏＣ（ｄｅｃ．）；１Ｈ ＮＭＲ［（ＣＤ３）２ＳＯ］δ１０．１６（ｓ，１Ｈ（Ｄ２Ｏと交換可能）），８．２３−８．０７（ｍ，３Ｈ，Ｄ２Ｏ交換後２Ｈ），７．８４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．５９−７．４５（ｍ，３Ｈ），７．３７（ｂｒｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．０４（ｓ，１Ｈ），６．６９（ｓ，１Ｈ），６．３８（ｂｒ ｓ，１Ｈ（Ｄ２Ｏと交換可能）），５．９６（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ（Ｄ２Ｏと交換可能）），５．４５−５．３０（ｍ，３Ｈ，Ｄ２Ｏ交換後ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），５．２１（ｓ，２Ｈ），４．４１（ｂｒ ｓ，Ｄ２Ｏ交換後ｄｄ，Ｊ＝８．４，５．４Ｈｚ，１Ｈ），４．３６（ｂｒｔ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ，１Ｈ），４．２６−４．１３（ｍ，２Ｈ），４．１０−３．９１（ｍ，３Ｈ），３．８８−３．７６（ｍ，１Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），３．５３−３．４３（ｍ，１Ｈ），３．４１−３．２０（ｍ，２Ｈ），３．０９−２．８８（ｍ，３Ｈ），２．７０−２．５０（ｍ，２Ｈ（ＤＭＳＯピークにより部分的に不明瞭）），２．１０−１．２０（ｍ，１５Ｈ），１．３１（ｓ，９Ｈ），０．８８（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），０．７９（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），２Ｈ（観測されず）。元素分析（Ｃ５５Ｈ７１ＣｌＮ８Ｏ１１・Ｈ２Ｏ）Ｃａｌｃ：Ｃ，６１．５３；Ｈ，６．８５；Ｎ，１０．４４．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，６１．３９；Ｈ，７．１１；Ｎ，１０．１５．
乾燥ＤＭＡ（６ｍＬ）中のアミン５６ｄ（０．６８ｇ，０．６４ｍｍｏｌ）及び２，５−ジオキソピロリジン−１−イル６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノアート（マレイミド−Ｏｓｕ，０．５０ｇ，１．６１ｍｍｏｌ）の混合物が、０℃で窒素雰囲気下で、１時間攪拌された。酢酸エチル−石油エーテルの混合物（１：２）（９０ｍＬ）が添加され、混合物が０℃で１５分間攪拌された。溶媒層は不溶性物質からデカントされ廃棄された。洗浄工程は、室温で追加の酢酸エチル−石油エーテル（１：１）（９０ｍＬ）を用い、続いて純粋な酢酸エチル（５０ｍＬ）を用いて繰り返された。後に残されたベージュ色の固体は乾燥され、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル ８−（６−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−６−オキソヘキシルオキシ）−１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−５−オキソ−２，３，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシレート ５２（０．７２ｇ，９０％）を得た；ＨＰＬＣ：純度９６．７％；ｍｐ ２１０ｏＣ（ｄｅｃ．）；１Ｈ ＮＭＲ［（ＣＤ３）２ＳＯ］δ１０．０３（ｓ，１Ｈ（Ｄ２Ｏと交換可能）），８．２３−８．１１（ｍ，２Ｈ），８．０９（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，（Ｄ２Ｏと交換可能），１Ｈ），７．８５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．８０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，Ｈ（Ｄ２Ｏと交換可能），），７．６６（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．５９−７．４４（ｍ，３Ｈ），７．３８（ｂｒｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０４（ｓ，１Ｈ），６．９９（ｓ，２Ｈ），６．６９（ｓ，１Ｈ），６．３８（ｂｒ ｓ，１Ｈ（Ｄ２Ｏと交換可能）），５．９９（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ（Ｄ２Ｏと交換可能）），５．４９−５．３４（ｍ，３Ｈ，Ｄ２Ｏ交換後ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），５．２０（ｓ，２Ｈ），４．４４−４．３０（ｍ，２Ｈ），４．２６−４．１３（ｍ，３Ｈ），４．１０−３．９１（ｍ，３Ｈ），３．８８−３．７６（ｍ，１Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），３．５３−３．４４（ｍ，１Ｈ），３．４１−３．２０（ｍ，４Ｈ（水ピークにより部分的に不明瞭）），３．０９−２．８８（ｍ，２Ｈ），２．６６−２．４２（ｍ，２Ｈ（ＤＭＳＯピークにより部分的に不明瞭）），２．２５−１．２４（ｍ，２１Ｈ），１．３１（ｓ，９Ｈ），１．２４−１．１１（ｍ，２Ｈ），０．８６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．８２（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）を得た。元素分析（Ｃ５５Ｈ７１ＣｌＮ８Ｏ１１・Ｈ２Ｏ）Ｃａｌｃ：Ｃ，６１．５３；Ｈ，６．８５；Ｎ，１０．４４．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，６１．３９；Ｈ，７．１１；Ｎ，１０．１５．
−１０から−１２℃（浴温度）で、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中のＮ−ｔＢｏｃ誘導体５２（１２５ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、ＴＦＡ中の２．５％の水の溶液（１０ｍＬ）が１０分間かけて滴下された。添加後、混合物を３時間、更にこの温度で撹拌した。冷（−２５℃）酢酸エチル−石油エーテル（１：１０）（３００ｍＬ）が添加され、続いて−１０℃（浴温度）でＮａＨＣＯ３の飽和水溶液がゆっくり添加され、ｐＨ６−７を与えた。有機層が除去され、洗浄工程は、追加の酢酸エチル−石油エーテル（１：１）（３００ｍＬ）を用いて繰り返された。固体が回収され、水及び酢酸エチルで複数回連続的に洗浄され、乾燥させ、淡黄色の固体（１０２ｍｇ）として粗生成物を得た。これは、分取ＨＰＬＣ［ジェネンテック］により精製され、Ｎ−（（Ｓ）−１−（（Ｓ）−１−（４−（（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（６−（（Ｓ）−７−メトキシ−５−オキソ−２，３，５，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８−イルオキシ）ヘキサノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イルオキシ）メチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イルアミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド ５６（４．１ｍｇ，３．６％）を得た；
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚＣ６０Ｈ７２ＣｌＮ９ＮａＯ１１として計算：１１５２．４９３２， ｆｏｕｎｄ ：１１５２．４９０６［ＭＮａ＋］．
Ｃ６０Ｈ７３ＣｌＮ９Ｏ１１として計算：１１３０．５１１３， ｆｏｕｎｄ ：１１３０．５０７７［ＭＨ＋］．
実施例７ （Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（ホスホノオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル ２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ−メチルヘキサンアミド）エチル（メチル）カルバメート５７
室温でＤＭＦ（５ｍＬ）中の（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル １−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ５１ａ（２．００ｇ，５．９９ｍｍｏｌ）の溶液に、臭化ベンジル（７．１３ｍＬ，５９．９０ｍｍｏｌ）、ヨウ化カリウムＫＩ（５０ｍｇ，０．３０ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウムＫ２ＣＯ３（４．１４ｇ，３０．００ｍｍｏｌ）が添加された。図９を参照。混合物は２時間撹拌され、次いで酢酸エチルで希釈された。沈殿物が濾過された。濾液は酢酸エチルと水との間で再分配された。水相を酢酸エチルで３回抽出した。混合された有機抽出物を水及びかん水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、セライトを通して濾過した。溶媒はロータリーエバポレーターにより除去され、過剰の臭化ベンジルは排出された。得られた残留物は、溶離液として酢酸エチルと石油エーテルの混合物（Ｖ／Ｖ１：１０）を用いてカラムクロマトグラフィーにより精製され、白色固体として、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル ５−（ベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ５７ａ（１．９７ｇ，７８％）；ｍｐ １８６−１８８℃を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８．２９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．８６（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．６５（ｄ，Ｊ＝８．２９Ｈｚ，１Ｈ），７．５５−７．４９（ｍ，３Ｈ），７．４５−７．４１（ｍ，２Ｈ），７．３８−７．３１（ｍ，２Ｈ），５．２６（ｓ，２Ｈ），４．２６（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．１３（ｔ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，１Ｈ），４．００−３．９２（ｍ，２Ｈ），３．４４（ｔ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，１Ｈ），１．６１（ｓ，９Ｈ）ｐｐｍ．ＬＲＭＳ（ＡＰＣＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ４２４．８（Ｍ＋Ｈ）．Ｃ２５Ｈ２７ＣｌＮＯ３ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ４２４．２．（Boger D., Ishizakilb T., Kitos P. and Suntornwat O., (1990) J. Org. Chem., 55, 5823-5832.）
酢酸エチル及び石油エーテルの混合物（ｖ／ｖ１：１）によるでさらなる溶出は、黄色油として、図９に示されるシクロプロピル生成物（３４５ｍｇ，１９％）を得た。（Lajiness J. and Boger D., (2011) J. Org. Chem., 76, 583-587.）
氷浴で冷却されたＤＣＭ（１５ｍＬ）中の５７ａの溶液（１．６０ｇ，３．７７ｍｍｏｌ）に、ジオキサン中の４ＮのＨＣｌ（４０ｍＬ）が添加された。混合物は室温まで温められ、３時間撹拌された。全ての揮発性成分は排出され、塩酸塩として、（Ｓ）−５−（ベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール５７ｂを得た。塩はＴＨＦ（１５ｍＬ）に溶解され、氷浴中で冷却された。グルタル酸無水物（６４６ｍｇ，５．６６ｍｍｏｌ），ＤＭＡＰ（４６ｍｇ，０．３８ｍｍｏｌ）及びピリジン（５ｍＬ）が添加され、得られた混合物は室温で４時間撹拌された。全ての揮発性成分が排出された後、残留物は希釈ＮａＨＣＯ３水溶液に溶解され、酢酸エチルで３回洗浄された。水相は１ＮのＨＣｌを用いてｐＨ２に酸性化され、酢酸エチルで３回抽出された。混合した酢酸エチル抽出物は水及びかん水で洗浄され、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ＭｅＯＨ及び酢酸エチル（ｖ／ｖ １：１０）の混合物を用いたシリカゲルパッド洗浄を通して濾過された。溶媒が除去され、オフホワイトの固体として、（Ｓ）−５−（５−（ベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタン酸 ５７ｃ（９７８ｍｇ，５９％）を得た。
−１０℃で、ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の５７ｃの溶液（９７８ｍｇ，２．２３ｍｍｏｌ）に、２５％水性ギ酸アンモニウム（２０ｍＬ）、続いてＰｄ−Ｃ触媒（１０％、湿潤、５００ｍｇ）が添加され、混合物は７時間−１０℃で撹拌された。追加のＰｄ−Ｃ触媒（５００ｍｇ）が添加され、その混合物は同じ温度で一晩撹拌された。
触媒はセライトを通して濾過され、セライトはＴＨＦで洗浄された。ＴＨＦは、濾液から排出され、残りの水溶液は酢酸エチルで３回抽出された。混合された抽出物を水及びかん水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過した。溶媒を除去して、オフホワイトの固体として、（Ｓ）−５−（１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタン酸 ５３ｈ（４８７ｍｇ，６３％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１２．０８（ｂｒ ｓ，１Ｈ），１０．３５（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．９８（ｓ，１Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．５０−７．４６（ｍ，１Ｈ），７．３３−７．２９（ｍ，１Ｈ），４．３０（ｔ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，１Ｈ），４．１４−４．１２（ｍ，２Ｈ），３．９８（ｄｄ，Ｊ＝２．８，１０．９Ｈｚ，１Ｈ），３．７８（ｄｄ，Ｊ＝７．８，１０．８Ｈｚ，１Ｈ），２．６３−２．５４（ｍ，２Ｈ），２．３４（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．９９−１．８３（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ．ＬＲＭＳ（ＡＰＣＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ３４８．６（Ｍ＋Ｈ）．Ｃ１８Ｈ１９ＣｌＮＯ４ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ３４８．１．
ＴＨＦ（１５ｍＬ）中の５３ｈの溶液（５００ｍｇ，１．４４ｍｍｏｌ）に、テトラゾール（アセトニトリル中に３％、５１ｍＬ，１７．２５ｍｍｏｌ）、続いてジ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル ホスホルアミジット（５．７３ｍＬ，１７．２５ｍｍｏｌ）が添加された。混合物は室温で一晩撹拌され、次いで、氷浴中で冷却され、Ｈ２Ｏ２（３０％水溶液，３．５３ｍＬ，３４．５ｍｍｏｌ）が滴下された。得られた混合物は室温まで温められ、５時間撹拌された。反応物は、氷浴で冷却しながら１０％水性亜硫酸ナトリウムの添加によりクエンチされた。有機揮発性物質はロータリーエバポレーターで除去され、懸濁油を含む水相を得た。石油エーテルが添加され、混合物は半時間攪拌された。形成されら沈殿物は濾過により回収され、水及び石油エーテルで洗浄され、真空下で乾燥させ、オフホワイトの泡として、（Ｓ）−５−（１−（クロロメチル）−５−（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタン酸 ５７ｄ（６６０ｍｇ，８５％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１２．０７（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．５６（ｓ，１Ｈ），８．０４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６０−７．５６（ｍ，１Ｈ），７．５０−７．４６（ｍ，１Ｈ），４．３８（ｔ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，１Ｈ），４．３２−４．２６（ｍ，１Ｈ），４．２０−４．１８（ｍ，１Ｈ），４．０２（ｄｄ，Ｊ＝２．９，１１．０Ｈｚ，１Ｈ），３．９０（ｄｄ，Ｊ＝７．１，１１．０Ｈｚ，１Ｈ），２．６７−２．５３（ｍ，２Ｈ），２．３４（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．８７−１．７８（ｍ，２Ｈ），１．４８１及び１．４７６（２×ｓ，１８Ｈ）ｐｐｍ．３１ＰＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ−１５．４６ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ５６２．１７１９（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ２６Ｈ３５ＣｌＮＮａＯ７Ｐ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ５６２．１７３２．
氷浴中で冷却されたＤＣＭ（２０ｍＬ）中の６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸（１．００ｇ，４．７３ｍｍｏｌ）の懸濁液に、１滴のＤＭＦが添加され、次いで塩化オキサリル（２．０３ｍＬ，２３．６７ｍｍｏｌ）が滴下された。図１０を参照。混合物は室温まで温められ、一晩攪拌され、暗褐色の溶液を得た。全ての揮発性成分は、ロータリーエバポレーター、次いで、高真空ポンプで除去された。得られた残留物はＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解され、溶媒はロータリーエバポレーター、次いで、高真空ポンプで除去された。上記の溶解及び除去手順はもう一度繰り返され、暗褐色の油として粗６−マレイミドカプロイル塩化物を得た。氷浴中で冷却されたＤＣＭ（５ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチルメチル（２−（メチルアミノ）エチル）カルバメートの溶液（８９１ｍｇ，４．７３ｍｍｏｌ）に、上記で作製されたＤＣＭ（２０ｍＬ）中の粗６−マレイミドカプロイル塩化物の溶液が滴下された。得られた混合物は室温まで温められ、一晩攪拌された。ＤＣＭは除去され、残留物は酢酸エチルに溶解された。溶液はＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し、冷たい５％クエン酸水溶液及びかん水で洗浄し、次いで、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、酢酸エチルを用いたシリカゲルパッド洗浄を通して濾過された。溶媒が除去され、褐色油として、ｔｅｒｔ−ブチル ２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ−メチルヘキサンアミド）エチル（メチル）カルバメート５７ｅを得た；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）（回転異性体の混合物）δ７．００６＆７．００５（２×ｓ，１Ｈ），３．３９−３．３６（ｍ，４Ｈ），３．２９−３．２５（ｍ，２Ｈ），２．９２−２．７５（ｍ，６Ｈ，２ＮＭｅ），２．２１（ｔ，Ｊ＝７．３８Ｈｚ，２Ｈ），１．５０−１．４４（ｍ，４Ｈ），１．３７（ｓ，９Ｈ），１．２４−１．１６（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ３８２．２３３８（Ｍ＋Ｈ）．Ｃ１９Ｈ３２Ｎ３Ｏ５ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ３８２．２３３６．
氷浴で冷却されたＤＣＭ（５ｍＬ）中の５１ｅの溶液（２７４ｍｇ，０．７２ｍｍｏｌ）に、ＴＦＡ（５ｍＬ）が滴下して添加された。混合物は同じ温度で２時間温められ、全ての揮発性成分はロータリーエバポレーター、次いで、高真空ポンプで除去された。得られた残留物、６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（２−（メチルアミノ）エチル）ヘキサンアミド トリフルオロアセタート ５７ｆはそのまま使用された。
室温で、５１ａ（２００ｍｇ，０．６０ｍｍｏｌ）がＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解され、ＤＩＰＥＡ（０．３ｍＬ，１．７２ｍｍｏｌ）、続いて４−ニトロフェニルクロロホルマート（１４５ｍｇ，０．７２ｍｍｏｌ）が添加され、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル １−（クロロメチル）−５−（（４−ニトロフェノキシ）カルボニルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ５７ｇを形成した。混合物を５時間撹拌した後、ＤＣＭ（５ｍＬ）中の粗い５７ｆ及びＤＩＰＥＡ（０．７ｍＬ，４．０２ｍｍｏｌ）の溶液が添加され、明るい黄色の溶液が得られ、これを一晩撹拌した。全ての揮発性成分が除去された。残留物は酢酸エチルに溶解され、５％アンモニア水溶液及びかん水で洗浄された。得られた粗物質は、酢酸エチル、ＤＣＭ、及び石油エーテル（ｖ／ｖ／ｖ １：２：１）の混合物、続いて酢酸エチル及びＤＣＭ（ｖ／ｖ １：２）を溶離液として使用するカラムクロマトグラフィーにより更に精製され、オフホワイトの固体として、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル １−（クロロメチル）−５−（（２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ−メチルヘキサンアミド）エチル）（メチル）カルバモイルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ５７ｈを得た；ｍｐ ５３−５６℃．１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）（回転異性体の混合物）δ８．０４（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．８６−７．７８（ｍ，１Ｈ），７．７２−７．６８（ｍ，１Ｈ），７．５３−７．４８（ｍ，１Ｈ），７．４０−７．３４（ｍ，１Ｈ），６．６７（ｓ，２Ｈ），４．２５（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．４６−４．１０（ｍ，１Ｈ），４．０６−３．９８（ｍ，１Ｈ），３．９２−３．７２（明らかなｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，１Ｈ），３．７２−３．４２（ｍ，７Ｈ），３．２８，３．１０，３．０９，２．９９（４×ｓ，６Ｈ，２ＮＭｅ），２．３８−２．２１（ｍ，２Ｈ），１．６７−１．５４（ｍ，４Ｈ），１．５７（ｓ，９Ｈ），１．３３−１．２５（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ６４１．２７２８（Ｍ＋Ｈ）．Ｃ３３Ｈ４２ＣｌＮ４Ｏ７ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ６４１．２７３７．
氷浴で冷却されたＤＣＭ（２ｍＬ）中の５７ｈの溶液（１１０ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）に、ＴＦＡ（２ｍＬ）が滴下して添加された。混合物は同じ温度で２時間温められ、次いで、全ての揮発性成分が除去された。得られた残留物は、酢酸エチルと冷希釈ＮａＨＣＯ３水溶液との間で再分配された。水相を酢酸エチルで３回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、セライトを通して濾過した。溶媒が除去され、黄色い固体として、（Ｓ）−１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル ２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ−メチルヘキサンアミド）エチル（メチル）カルバメート ５７ｉ（８６ｍｇ，９２％）を得て、これが更に精製することなくそのまま使用された；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）（回転異性体の混合物）δ７．７６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６３−７．５９（ｍ，１Ｈ），７．４８−７．４１（ｍ，１Ｈ），７．２５−７．２０（ｍ，１Ｈ），６．７９（ｓ，１Ｈ），６．６８（ｓ，２Ｈ），４．０１−３．９４（ｍ，１Ｈ），３．８８−３．７８（ｍ，３Ｈ），３．７４−３．６８（ｍ，２Ｈ），３．６２−３．４７（ｍ，５Ｈ），３．２８，３．１０，３．０６，３．００（４×ｓ，６Ｈ，２ＮＭｅ），２．３８−２．２１（ｍ，２Ｈ），１．６９−１．５０（ｍ，４Ｈ），１．３３−１．２５（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ５４１．２２１７（Ｍ＋Ｈ）．Ｃ２８Ｈ３４ＣｌＮ４Ｏ５ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ５４１．２２１２．
氷浴中で冷却されたＤＭＡ（３ｍＬ）中の５７ｉの溶液（８３ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）に、（Ｓ）−５−（１−（クロロメチル）−５−（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタン酸 ５７ｄ（９９ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ塩酸塩（８８ｍｇ，０．４６ｍｍｏｌ）、次いでｐ−トルエンスルホン酸（２．６ｍｇ，０．０１５ｍｍｏｌ）が添加された。図１１を参照。混合物は室温まで温められ、一晩攪拌された。混合物は、酢酸エチルと冷希釈ＮａＨＣＯ３水溶液との間で再分配された。水相を酢酸エチルで３回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、セライトを通して濾過した。溶媒は除去され、得られた残留物は石油エーテルで粉砕された。得られた固体は、ＤＣＭ及びイソプロパノールから再沈殿され、黄色い固体として、（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル ２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ−メチルヘキサンアミド）エチル（メチル）カルバメート ５７ｊ（１１６ｍｇ，７１％）；ｍｐ ８１℃（ｄｅｃ．）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）（回転異性体の混合物）δ８．６３（ｓ，１Ｈ），８．３６（ｓ，１Ｈ），８．２３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．８９−７．８２（ｍ，１Ｈ），７．７２−７．６７（ｍ，２Ｈ），７．５４−７．５０（ｍ，２Ｈ），７．４３−７．３９（ｍ，２Ｈ），６．６６（ｓ，２Ｈ），４．３４−４．２５（ｍ，４Ｈ），４．１０−４．０５（ｍ，２Ｈ），３．９８−３．９３（ｍ，２Ｈ），３．７２−３．６９（ｍ，２Ｈ），３．５０−３．４６（ｍ，５Ｈ），３．２８，３．１０，３．０９，２．９９（４×ｓ，６Ｈ，２ＮＭｅ），２．７９−２．７３（ｍ，２Ｈ），２．７０−２．６２（ｍ，２Ｈ），２．３８−２．３２（ｍ，１Ｈ），２．２７−２．２０（ｍ，３Ｈ），１．６７−１．５４（ｍ，３Ｈ），１．５６（ｓ，９Ｈ），１．５５（ｓ，９Ｈ），１．３３−１．２５（ｍ，４Ｈ）ｐｐｍ．３１ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ−１５．７１ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ１０８４．３７５５（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ５４Ｈ６６Ｃｌ２Ｎ５ＮａＯ１１Ｐ ｒｅｑｕｉｒｅｓ １０８４．３７６６．
氷浴で冷却されたＤＣＭ（１ｍＬ）中の５７ｊの溶液（５５ｍｇ，０．０５２ｍｍｏｌ）に、ＴＦＡ（１ｍＬ）が滴下して添加された。混合物は同じ温度で１．５時間温められ、次いで、全ての揮発性成分が除去された。得られた残留物は、ＤＣＭ及び酢酸エチルから再沈殿され、灰色の固体として、（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（ホスホノオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル ２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ−メチルヘキサンアミド）エチル（メチル）カルバメート ５７３３ｍｇ，６７％，ＨＰＬＣ純度：８９％）を得た；ｍｐ １９１−１９４℃（ｄｅｃ．）．１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）（回転異性体の混合物）δ８．４９（ｓ，１Ｈ），８．２３−８．２１（ｍ，１Ｈ），８．１０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．９５−７．７６（ｍ，３Ｈ），７．５９−７．５３（ｍ，２Ｈ），７．４５−７．３９（ｍ，２Ｈ），６．９７，６．９６，６．９４，６．９０（４×ｓ，２Ｈ（合計），マレイミド基），４．３４−４．２１（ｍ，４Ｈ），４．０６−４．０１（ｍ，２Ｈ），３．９５−３．８５（ｍ，２Ｈ），３．７１−３．６１（ｍ，２Ｈ），３．５４−３．３０（ｍ，５Ｈ），３．２３，３．１８，３．０４，３．００，２．９７，２．９５，２．８９，２．８５（８×ｓ，６Ｈ （合計），２ＮＭｅ），２．３７−２．２８（ｍ，２Ｈ），２．１９（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），２．００−１．９５（ｍ，２Ｈ），１．５０−１．４０（ｍ，５Ｈ），１．２５−１．１５（ｍ，５Ｈ）ｐｐｍ．３１ＰＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ−５．７９ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ９７２．２４８８（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ４６Ｈ５０Ｃｌ２Ｎ５ＮａＯ１１Ｐ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ９７２．２５１４．
実施例８ （Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル ４−メチルピペラジン−１−カルボキシレート ５８
ＣＨ２Ｃｌ２（８０ｍＬ）中の（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（４−（（Ｓ）−２−（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル １−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ５１ａ（３．３３８ｇ，１０ｍｍｏｌ）、４−メチルピペラジン−１−カルボニルクロリド塩酸塩（５．９８ｇ，３０ｍｍｏｌ），Ｅｔ３Ｎ（３．５ｇ，３５ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（１．３４ｇ，１１ｍｍｏｌ）の混合物が室温で２日間攪拌された。図１２を参照。混合物は水で洗浄され、溶媒を乾燥させ、真空下で除去され、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル １−（クロロメチル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ５８ａ（Boger D.L. et al, Synthesis, (1999), 1505-1509）を定量的収率で得た：ｍｐ ９８℃；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８．１１（ｂｒ，１Ｈ），７．８４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５０（ｄｄｄ，Ｊ＝８．２，６．９，１．１Ｈｚ，１Ｈ），７．３７（ｄｄｄ，Ｊ＝８．１，６．９，１．０Ｈｚ，１Ｈ），４．３４−４．２０（ｍ，１Ｈ），４．１７−４．１０（ｍ，１Ｈ），４．０１−３．９８（ｍ，１Ｈ），３．９４（ｄｄ，Ｊ＝９．６，２．４Ｈｚ，１Ｈ），３．８７−３．８０（ｂｒ，２Ｈ），３．６８−３．６０（ｂｒ，２Ｈ），３．４７（ｔ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，１Ｈ），２．５７−２．４８（ｍ，４Ｈ），２．８３（ｓ，３Ｈ），１．５８（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ（ＡＰＣＩ＋）ｍ／ｚ４６１．２ＭＨ＋．元素分析ＣａｌｃｄｆｏｒＣ２４Ｈ３０ＣｌＮ３Ｏ４：Ｃ，６２．７；Ｈ，６．６；Ｎ，９．１．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，６２．５；Ｈ，６．８；Ｎ，９．２％．
ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）中の５８ａの溶液（２．３０ｇ，５ｍｍｏｌ）が、０℃で４時間、過剰のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理され、その混合物は冷ＮＨ３水溶液で中和された。ヘキサンで希釈すると、固体の沈殿を生じ、これは濾過により回収され、水及びヘキサンで洗浄され、乾燥され、（Ｓ）−１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル ４−メチルピペラジン−１−カルボキシレート ５８ｂ（１．６０ｇ，８９％）を得た：ｍｐ １４４−１４７℃；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．６９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４５（ｄｄｄ，Ｊ＝８．３，６．９，１．２Ｈｚ，１Ｈ），７．２５（ｄｄｄ，Ｊ＝８．４，６．８，１．２Ｈｚ，１Ｈ），６．８２（ｓ，１Ｈ），５．３０（ｓ，１Ｈ），４．１７−４．０５（ｍ，２Ｈ），４．０３−３．９６（ｍ，２Ｈ），３．８９−３．７７（ｍ，４Ｈ），３．５４（ｔ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ，１Ｈ），３．２０−２．９０（ｍ，４Ｈ），２．７６（ｓ，３Ｈ）．元素分析ＣａｌｃｄｆｏｒＣ１９Ｈ２２ＣｌＮ３Ｏ２：Ｃ，６３．４；Ｈ，６．２；Ｎ，１１．７．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，６３．２；Ｈ，６．２；Ｎ，１１．５％．
ジオキサン（３０ｍＬ）中の溶液５５ａ（４．６８９ｇ，１０ｍｍｏｌ）はＨＣｌ（ジオキサン中に４Ｍ、１０ｍＬ）で処理され、混合物は室温で一晩撹拌された。水酸化アンモニウムが添加され、溶媒が除去され、（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（４−ニトロベンジルオキシ）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール５４ｆを得て、ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）中のグルタル酸無水物（３．４ｇ，３０ｍｍｏｌ）と混合された。０℃に冷却後、Ｅｔ３Ｎ（５．０５ｇ，５０ｍｍｏｌ）が添加され、混合物はゆっくりと温められ、室温で一晩撹拌された。希釈ＨＣｌが添加されて固体を得て、これを濾過により回収し、水及びＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、乾燥し、（Ｓ）−５−（１−（クロロメチル）−５−（４−ニトロベンジルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタン酸 ５８ｃ（２．９５ｇ，６１％）を得た：１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．０７（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．３０（ｂｒｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），８．２４（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），８．１７（ｓ，１Ｈ），７．８９−７．８５（ｍ，３Ｈ），７．５７（ｄｄｄ，Ｊ＝８．２，６．９，１．１Ｈｚ，１Ｈ），７．４３（ｄｄｄ，Ｊ＝８．１，７．１，１．０Ｈｚ，１Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．３４（ｔ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，１Ｈ），４．２５−４．１３（ｍ，２Ｈ），４．０１（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，２．８Ｈｚ，１Ｈ），３．８５（ｄｄ，Ｊ＝１０．９，７．４Ｈｚ，１Ｈ），２．６６−２．５７（ｍ，１Ｈ），２．５５−２．４６（ｍ，１Ｈ），２．３５（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），１．８７−１．７９（ｍ，２Ｈ）．
ＤＭＡ（２５ｍＬ）中の５８ｂ（１．３３ｇ，３．７ｍｍｏｌ）と５８ｃ（１．６３ｇ，３．３８ｍｍｏｌ）及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ．ＨＣｌ，３．２６ｇ，１７．０ｍｍｏｌ）の混合物が室温で一晩撹拌された。混合物はＮａＨＣＯ３水溶液で希釈され、得られた沈殿物は水及びメタノールで連続的に洗浄され乾燥された。シリカ上でクロマトグラフィー処理され、最初にＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ９：１、次いでＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ４：１で溶出され、（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（４−ニトロベンジルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル ４−メチルピペラジン−１−カルボキシレート ５８ｄ（０．９８ｇ，３５％）を得た：１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８．３５（ｓ，１Ｈ），８．３３−８．２７（ｍ，３Ｈ），８．１７（ｓ，１Ｈ），７．８５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．７３−７．６８（ｍ，４Ｈ），７．５８−７．４９（ｍ，２Ｈ），７．４５−７．３８（ｍ，２Ｈ），５．３３（ｑ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，２Ｈ），４．３９−４．２７（ｍ，４Ｈ），４．１４−４．０６（ｍ，２Ｈ），４．０１−３．９５（ｍ，２Ｈ），３．８３−３．７７（ｍ，２Ｈ），３．６４−３．５９（ｍ，２Ｈ），３．４８（ｄｔ，Ｊ＝１０．５，７．３Ｈｚ，２Ｈ），２．８５−２．６５（ｍ，４Ｈ），２．５５−２．４７（ｍ，４Ｈ），２．３８（ｓ，３Ｈ），２．２８−２．２１（ｍ，２Ｈ）．
０℃で、ＴＨＦ（３５ｍＬ）、ＭｅＯＨ（１５ｍＬ）及び水（５ｍＬ）の混合物中の５８ｄの懸濁液（０．４１ｇ，５ｍｍｏｌ）は、アルミニウムアマルガム（２ｇ）で処理され、撹拌した混合物は３時間かけて室温まで温められた。ＭｅＯＨで希釈した後、混合物はセライトを通じて濾過され、濾液は蒸発乾固され、（Ｓ）−３−（５−（（Ｓ）−５−（４−アミノベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル ４−メチルピペラジン−１−カルボキシレート ５８ｅ（０．３１ｇ，７８％）を得て、これが次の工程で直接使用された：１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８．３７（ｓ，１Ｈ），８．２６（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．１８（ｓ，１Ｈ），７．８６（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．４９−７．４３（ｍ，２Ｈ），７．３９（ｂｒｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．３４−７．２６（ｍ，３Ｈ），６．６８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），５．１０（ｑ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ，２Ｈ），４．３２−４．１５（ｍ，４Ｈ），４．０７−３．９７（ｍ，２Ｈ），３．９４−３．９０（ｍ，２Ｈ），３．８６−３．７９（ｍ，２Ｈ），３．６６−３．６０（ｍ，２Ｈ），３．５０−３．４０（ｍ，２Ｈ），２．７７−２．５８（ｍ，４Ｈ），２．５６−２．４８（ｍ，４Ｈ），２．２７（ｓ，３Ｈ），２．２２−２．１４（ｍ，２Ｈ）．
２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ，０．５８ｇ，２．３ｍｍｏｌ）及び（Ｓ）−２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−５−ウレイドペンタン酸（Ｆｍｏｃ−Ｌ−ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ，０．６９ｇ，１．７ｍｍｏｌ）の混合物は、全固体が溶解するまで１０分間窒素下で乾燥ＤＭＡ中で攪拌された。図１３を参照。粗い５８ｅ（０．３１ｇ，０．３９ｍｍｏｌ）が添加され、撹拌が一晩続けられた。混合物はＥｔＯＡｃで希釈され、水が添加され、生成物を沈殿させ、これを濾過により回収し、沸騰するＭｅＯＨ中で粉砕しし、粗い（Ｓ）−３−（５−（（Ｓ）−５−（４−（（Ｓ）−２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル−４−メチルピペラジン−１−カルボキシレート ５８ｆ（０．６２ｇ，＞１００％）を得て、これが室温で３０分間、乾燥ＤＭＦ（２０ｍＬ）中のピペリジン（５０ｍｇ，０．５９ｍｍｏｌ）で処理された。ＥｔＯＡｃ、ヘキサン及び水で希釈すると、沈殿物が得られ、これは濾過により回収され、ヘキサン及び水で洗浄され、粗い（Ｓ）−３−（５−（（Ｓ）−５−（４−（（Ｓ）−２−アミノ−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル−４−メチルピペラジン−１−カルボキシレート ５８ｇ（０．３３ｇ，８９％，ＨＰＬＣにより純度８５％）を得て、これが乾燥ＤＭＡ（１０ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＳｕ（Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌ−バリンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル０．２３ｇ，０．５３ｍｍｏｌ）の１．５当量で一晩処理された。ＥｔＯＡｃ及び水で希釈して固体が得られ、これは濾過により回収され、乾燥され、粗い（Ｓ）−３−（５−（（Ｓ）−５−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル−４−メチルピペラジン−１−カルボキシレート ５８ｈ（０．３８ｇ，８５％）を得た：１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１０．１１（ｓ，１Ｈ），８．２４−８．１１（ｍ，３Ｈ），７．９６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．９０−７．８０（ｍ，４Ｈ），７．７４（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．６５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．６１−７．５３（ｍ，２Ｈ），７．５０−７．３６（ｍ，６Ｈ），７．３２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），５．９７（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），５．４０（ｓ，２Ｈ），５．２０（ｓ，２Ｈ），４．４４−４．１９（ｍ，９Ｈ），４．０８−３．８１（ｍ，５Ｈ），３．７４−３．７０（ｂｒ，２Ｈ），３．５０−３．４２（ｂｒ，２Ｈ），３．０７−２．８９（ｍ，２Ｈ），２．７７−２．５５（ｍ，４Ｈ），２．５２−２．３６（ｍ，４Ｈ），２．２５（ｓ，３Ｈ），２．０３−１．９４（ｍ，３Ｈ），１．７６−１．５３（ｍ，２Ｈ），１．４９−１．３０（ｍ，２Ｈ），０．８７（ｄｄ，Ｊ＝１１．２，６．８Ｈｚ，６Ｈ）．
粗い５８ｈ（０．３８ｇ，０．３ｍｍｏｌ）を、１時間室温でＤＭＦ中でピペリジンと反応させ、混合物はＥｔＯＡｃ及び水で希釈され、固体が得られ、これが回収され、乾燥され、（Ｓ）−３−（５−（（Ｓ）−５−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル ４−メチルピペラジン−１−カルボキシレート ５８ｉ（０．２３ｇ，７３％，ＨＰＬＣにより純度８３％）を得た：１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ９．３４（ｂｒ，１Ｈ），８．３５（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．２８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），８．１４（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），７．８６（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．７５（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．６５−７．６０（ｍ，２Ｈ），７．５４−７．４７（ｍ，２Ｈ），７．４６−７．３３（ｍ，４Ｈ），７．２９（ｔｄ，Ｊ＝７．４，１．３Ｈｚ，１Ｈ），５．２０（ｂｒ ｓ，２Ｈ），５．１７−５．０９（ｍ，１Ｈ），４．８２−４．７３（ｍ，１Ｈ），４．５９−４．５０（ｍ，１Ｈ），４．３３−４．１５（ｍ．３Ｈ），４．０７−４．０１（ｍ，１Ｈ），３．９８−３．９０（ｍ，２Ｈ），３．８６−３．７６（ｍ，３Ｈ），３．６５−３．５７（ｍ，２Ｈ），３．５５−３．３９（ｍ，３Ｈ），３．２５（ｂｒ ｓ，１Ｈ），２．８１−２．６０（ｍ，３Ｈ），２．５９−２．４１（ｍ，６Ｈ），２．３７（ｓ，３Ｈ），２．２７−２．１６（ｍ，３Ｈ），１．５５−１．４８（ｍ，２Ｈ），０．９８（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．８３（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）．
乾燥ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の粗い５８ｉ（０．１０５ｇ，０．１ｍｍｏｌ）及び２，５−ジオキソピロリジン−１−イル６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸（６２ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）の混合物が室温で一晩撹拌され、混合物はＥｔＯＡｃ及び水で希釈され、固体が得られ、これが回収されて乾燥され、粗物質（７０ｍｇ，ＨＰＬＣにより純度７１％）が得られ、これがｐｒｅｐ−ＨＰＬＣにより精製され、（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル ４−メチルピペラジン−１−カルボキシレート ５８を得た。ＭＳｍ／ｚ１２４３．４［（Ｍ＋Ｈ）＋，Ｃ６５Ｈ７６Ｃｌ２Ｎ１０Ｏ１１として計算：１２４３．５］．
実施例９ （Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル−二水素リン酸塩 ５９
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル−５−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ５５（１．００ｇ，１．０９ｍｍｏｌ）の溶液に、ピペリジン（１．０８ｍＬ，１０．９０ｍｍｏｌ）が添加された。図１４を参照。混合物は室温で２時間温められ、次いで、全ての揮発性成分が排出された。得られた残留物はエーテルで粉砕され、白色固体として、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル ５−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ５９ａ（７００ｍｇ，９２％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１０．１７（ｓ，１Ｈ），８．１７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），８．１２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．５５−７．４９（ｍ，３Ｈ），７．３７−７．３３（ｍ，１Ｈ），５．９８（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），５．４１（ｓ，２Ｈ），５．２２（ｓ，２Ｈ），４．５１−４．４８（ｍ，１Ｈ），４．１９−３．９８（ｍ，４Ｈ），３．８４−３．８０（ｍ，１Ｈ），３．０８−２．９０（ｍ，３Ｈ），１．９９−１．９１（ｍ，２Ｈ），１．７５−１．６５（ｍ，２Ｈ），１．５５（ｓ，９Ｈ），１．４９−１．３３（ｍ，２Ｈ），０．８９（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．８０（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ．
ＤＭＳＯ（１０ｍＬ）中の５９ａ（６８８ｍｇ，０．９９ｍｍｏｌ）、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸（ＳｕＯＭＣ，３２０ｍｇ，１．０４ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（１９０μＬ，１．０９ｍｍｏｌ）の混合物は一晩室温で攪拌された。全ての揮発性成分排出された。得られた残留物は酢酸エチルで粉砕され、オフホワイトの固体として、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル １−（クロロメチル）−５−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ５９ｂ（８３２ｍｇ，９５％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１０．０３（ｓ，１Ｈ），８．１３−８．０８（ｍ，２Ｈ），７．８３−７．７９（ｍ，２Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．５５−７．４８（ｍ，３Ｈ），７．３５（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），６．９９（ｓ，２Ｈ），５．９７（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），５．４１（ｓ，２Ｈ），５．２１（ｓ，２Ｈ），４．４３−４．３８（ｍ，１Ｈ），４．２２−３．９８（ｍ，４Ｈ），３．８４−３．８０（ｍ，１Ｈ），３．３８−３．３３（ｍ，３Ｈ），３．０８−２．９０（ｍ，２Ｈ），２．２４−２．０６（ｍ，２Ｈ），２．０１−１．９１（ｍ，１Ｈ），１．７４−１．１４（ｍ，１０Ｈ），１．５５（ｓ，９Ｈ），０．８６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．８３（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ９１０．３８９７（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ４６Ｈ５８ＣｌＮ７ＮａＯ９ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ９１０．３８７７．
氷浴で冷却されたＤＣＭ（２ｍＬ）中の５７ｂの懸濁液（１００ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）に、ＴＦＡ（２ｍＬ）が添加された。混合物は３時間氷浴中で攪拌された。全ての揮発性成分が排出された。得られた残留物はＴＨＦに溶解され、酢酸エチルと冷５％アンモニア水溶液との間で再分配された。水相を酢酸エチルで３回抽出した。混合された有機抽出物は、水及びかん水で洗浄され、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥され、セライトを通じて濾過され、溶媒が除去され、緑がかった茶色の固体として、Ｎ−（（Ｓ）−１−（（Ｓ）−１−（４−（（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イルオキシ）メチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イルアミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド ５９ｃ（８０ｍｇ，９０％）が得られ、これが直接使用された。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１０．０２（ｓ，１Ｈ），８．０９−８．０７（ｍ，１Ｈ），７．９９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．８０（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．６５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３８（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），７．０９（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），６．９９（ｓ，２Ｈ），５．９７（ｂｒ ｓ，１Ｈ），５．４１（ｓ，２Ｈ），５．１６（ｓ，２Ｈ），４．４６−４．３５（ｍ，１Ｈ），４．２１−４．１７（ｍ，１Ｈ），３．９６−３．８７（ｍ，１Ｈ），３．８４−３．８０（ｍ，１Ｈ），３．７０−３．６５（ｍ，１Ｈ），３．６０−３．４９（ｍ，１Ｈ），３．３８−３．３３（ｍ，３Ｈ），３．０６−２．９２（ｍ，２Ｈ），２．２２−２．０８（ｍ，２Ｈ），２．０２−１．９２（ｍ，１Ｈ），１．７５−１．１４（ｍ，１０Ｈ），０．８６（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．８２（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ８１０．３３３２（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ４１Ｈ５０ＣｌＮ７ＮａＯ７ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ８１０．３３５２．
室温で、ＤＭＡ（３ｍＬ）中の５９ｃ（７５ｍｇ，０．０９５ｍｍｏｌ）及び（Ｓ）−５−（１−（クロロメチル）−５−（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタン酸 ５７ｄ（６２ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＥＤＣＩ塩酸塩（４０ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）、次いで、パラ−トルエンスルホン酸（１．６ｍｇ，０．００９５ｍｍｏｌ）が添加された。混合物を５時間撹拌した後、更なるＥＤＣＩ塩酸塩（３５ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）が添加され、混合物は一晩撹拌された。全ての揮発性成分排出された。得られた残留物はＴＨＦに溶解され、酢酸エチルと冷希釈ＮａＨＣＯ３水溶液との間で再分配された。水相を酢酸エチルで３回抽出した。混合された有機抽出物は、水及びかん水で洗浄され、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥され、セライトを通じて濾過され、溶媒が除去され、茶色い固体として、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル−リン酸 ５９（１０４ｍｇ，８３％）が得られ、これが直接使用された。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１０．０３（ｓ，１Ｈ），８．６０（ｓ，１Ｈ），８．１９−７．３８（ｍ，１４Ｈ），６．８７（ｓ，２Ｈ），５．９７（ｂｒ ｓ，１Ｈ），５．４０（ｓ，２Ｈ），５．２０（ｂｒ ｓ，２Ｈ），４．４５−３．８２（ｍ，１０Ｈ），３．３８−３．３３（ｍ，３Ｈ），３．０７−２．９０（ｍ，２Ｈ），２．７５−２．５０（ｍ，２Ｈ），２．２０−２．０８（ｍ，４Ｈ），２．０２−１．９２（ｍ，２Ｈ），１．７５−１．１０（ｍ，１２Ｈ），１．４８（ｓ，１８Ｈ），０．８６−０．８２（ｍ，６Ｈ）ｐｐｍ．３１ＰＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ−１５．４６ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ１３３１．５０７１（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ６７Ｈ８３Ｃｌ２Ｎ８ＮａＯ１３Ｐ ｒｅｑｕｉｒｅｓ １３３１．５０８６．
氷浴で冷却されたＤＣＭ（２ｍＬ）中の５９ｄの懸濁液（９５ｍｇ，０．０７３ｍｍｏｌ）に、ＴＦＡ（１ｍＬ）が添加された。混合物は１．５時間氷浴中で攪拌された。全ての揮発性成分が排出された。得られた残留物は酢酸エチルで粉砕され、青灰色の固体（７７ｍｇ，９０％）が得られ、更に分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ−ＭａｘＲＰ４μ，２５０×２１．２０ｍｍ：移動相：Ａ／Ｂ＝３０：７０（Ａ：Ｈ２Ｏ−ＴＦＡｐＨ２．５６，Ｂ：９０％水中のアセトニトリル）；流速１３ｍＬ／分）により精製され、オフホワイトの固体として、（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル−二水素リン酸塩５９（５ｍｇ，ＨＰＬＣ純度９７％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１０．０４（ｓ，１Ｈ），８．４９（ｓ，１Ｈ），８．１９−８．０９（ｍ，４Ｈ），７．８７−７．８１（ｍ，２Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．５６−７．４８（ｍ，４Ｈ），７．４０−７．３６（ｍ，２Ｈ），６．９８（ｓ，２Ｈ），６．０１（ｂｒ ｓ，１Ｈ），５．４３（ｂｒ ｓ，２Ｈ），５．２２（ｓ，２Ｈ），４．４２−３．３４（ｍ，２Ｈ），４．２５−４．１２（ｍ，４Ｈ），４．０３−３．９８（ｍ，２Ｈ），３．８８−３．８１（ｍ，２Ｈ），３．３８−３．３３（ｍ，３Ｈ），３．１０−２．９０（ｍ，２Ｈ），２．７５−２．５５（ｍ，４Ｈ），２．２０−２．０８（ｍ，２Ｈ），２．００−１．９２（ｍ，２Ｈ），１．７５−１．１０（ｍ，１２Ｈ），０．８８−０．８１（ｍ，６Ｈ）ｐｐｍ．３１ＰＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ−５．６０ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ１２１９．３７９４（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ５９Ｈ６
７Ｃｌ２Ｎ８ＮａＯ１３Ｐ ｒｅｑｕｉｒｅｓ １２１９．３８３４.
実施例１０ Ｎ−（（Ｓ）−１−（（Ｓ）−１−（４−（（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イルオキシ）メチル）フェニルアミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イルアミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド ６０
（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル−二水素リン酸塩 ５９は酵素的に脱リン酸化され、６０を得た。
実施例１１ ２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）エチル（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（ホスホノオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル カルバメート ６１
乾燥ＤＣＭ（３０ｍＬ）中のトリホスゲンの溶液（１３６ｍｇ，０．４５８ｍｍｏｌ）が、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル−５−アミノ−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ６１ａ（１５０ｍｇ，０．４５１ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（３８６ｍｇ，３．１６ｍｍｏｌ）の混合物に室温で添加された。図１５を参照。４５分後に、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）エタノール（Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．（２００６）１２：３６５５−３６７１）の溶液（３５０ｍｇ，１．８７ｍｍｏｌ）が添加され、反応混合物は一晩撹拌された。２０時間後、混合物をＭｅＯＨ（３０ｍＬ）で希釈し、溶媒を真空下で除去した。ヘキサン：ＤＣＭ１００：０から０：１００、次いでＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ１００：０から９５：５を使用するシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによる精製は、化合物６１ｂと出発物質２−（ピリジン−２−イルジスルホニル）エタノールの混合物（３８９ｍｇ）を得た。この混合物が次の工程で使用された。ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中のＴＢＤＭＳＣｌ（２６２ｍｇ，１．７４ｍｍｏｌ）の溶液が、０℃で、ＤＭＦ（４ｍＬ）中の生成物６１ｂ、２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）エタノール及びイミダゾール（１１８ｍｇ，１．７４ｍｍｏｌ）に添加された。混合物は室温に温められ、４５分間撹拌され、次いでＥｔＯＡｃ及びＨ２Ｏで希釈された。この層は分離され、有機層をＨ２Ｏ（３×）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒を真空下で除去した。ヘキサン：ＤＣＭ５０：５０から０：１００、次いでＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ９８：２から９４：６を使用したシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによる精製は、淡黄色の泡状固体として、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル １−（クロロメチル）−５−（（２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）エトキシ）カルボニルアミノ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ６１ｂ（１９０ｍｇ，７７％、６１ａから２工程かけて）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）８．４９（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．４８−８．４７（ｍ，１Ｈ），７．８４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７１（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），７．６３（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），７．５４−７．５０（ｍ，１Ｈ），７．４０（ｄｄｄ，Ｊ＝８．２，６．８，１．１Ｈｚ，１Ｈ），７．０９（ｄｄｄ，Ｊ＝７．３，４．９，１．０Ｈｚ，１Ｈ），６．９３（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．４８（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），４．３１−４．２７（ｍ，１Ｈ），４．１５−４．１０（ｍ，１Ｈ），４．０４−３．９８（ｍ，１Ｈ），３．９１（ｄｄ，Ｊ＝１１．１，２．４Ｈｚ，１Ｈ），３．４５（ｔ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ，１Ｈ），３．１３（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），１．６０（ｓ，９Ｈ）．
０℃で、ＤＣＭ（９．５ｍＬ）中の６１ｂ（１８０ｍｇ，０．３３０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（４．８ｍＬ）がゆっくりと添加され、混合物はこの温度で１時間撹拌された。次いで、反応混合物はＤＣＭ及びＨ２Ｏで希釈され、ｐＨが７−８になるまで飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で中和された。層は分離され、有機層をＨ２Ｏ（１×）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒を真空下で除去し、黄色の固体として、（Ｓ）−２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）エチル−１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イルカルバメート ６１ｃ（１１３ｍｇ，７７％）が得られ、これは精製せずに次の工程で使用された。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）９．５２（ｓ，１Ｈ），８．４８−８．４６（ｍ，１Ｈ），７．８８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８３−７．７８（ｍ，２Ｈ），７．６４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｄｄｄ，Ｊ＝８．１，６．９，１．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２５（ｄｄｄ，Ｊ＝６．５，４．８，２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｄｄｄ，Ｊ＝８．２，６．８，１．０Ｈｚ，１Ｈ），７．０９（ｓ，１Ｈ），５．９４（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．３３（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），４．０２−３．９６（ｍ，１Ｈ），３．８５（ｄｄ，Ｊ＝１０．８，３．５Ｈｚ，１Ｈ），３．７０（ｔ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），３．６３−３．５５（ｍ，２Ｈ），３．１８（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ）．
ＤＭＡ（６ｍＬ）中の（Ｓ）−５−（１−（クロロメチル）−５−（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタン酸 ５７ｄ（１３５ｍｇ，０．２５０ｍｍｏｌ）の溶液が、室温で窒素下で、６１ｃ（１１０ｍｇ，０．２４７ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ．ＨＣｌ（１１６ｍｇ，０．６０５ｍｍｏｌ）の混合物に添加され、その混合物は一晩撹拌された。１８．５時間後、ＤＭＡ（０．５ｍＬ）中の５７ｄ（４０ｍｇ，０．０７４１ｍｍｏｌ）及び固体ＥＤＣＩ．ＨＣｌ（２８．４ｍｇ，０．１４８ｍｍｏｌ）の追加溶液が、窒素下、室温で攪拌された。更に６時間後、ＤＭＡ（０．５ｍＬ）中の５７ｄ（７ｍｇ，０．０１３０ｍｍｏｌ）の追加部分及び固体ＥＤＣＩ．ＨＣｌ（２４ｍｇ，０．１２５ｍｍｏｌ）が添加され、混合物は更に２日間と１６．５時間攪拌された。次いで、混合物はＨ２Ｏで希釈され、固体が沈殿した。固体は、濾過により回収され、Ｈ２Ｏ、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、Ｈ２Ｏ及びヘキサンで洗浄された。固体はＥｔＯＡｃに溶解され、溶液を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３×）及びＨ２Ｏ（１×）で洗浄し、次いで乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒を真空下で除去した。次いで固体はＤＣＭに再溶解され、更なる飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３×）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒を真空下で除去した。固体は、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ９５：５から９０：１０で粉砕され、ベージュ色の固体として、２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）エチル（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イルカルバメート ６１ｄ（１１７ｍｇ，ＨＰＬＣ純度：８６．１％）が得られ、これは精製せずに次の工程で使用された。ＨＲＭＳｍ／ｚ９８９．２２８９［（Ｍ＋Ｎａ）＋，Ｃ４７Ｈ５３Ｃｌ２Ｎ４ＮａＯ８ＰＳ２として計算：９８９．２３１２］．
ＴＦＡ（１ｍＬ）が、０℃でＤＣＭ（２ｍＬ）中の６１ｄの撹拌溶液に滴下され、混合物は７０分間この温度で撹拌された。次いで、溶媒は２５℃にて真空下で除去された。得られた黒色残留物はＤＣＭに溶解され、溶液はＥｔＯＡｃで希釈された。ＤＣＭは真空下で除去され、ＥｔＯＡｃ中の懸濁液を得た。固体が濾過により回収され、ＥｔＯＡｃとヘキサンで粉砕され、乾燥し、緑色の固体を得た。これは、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ−ＭＡＸＲＰ４μ，２１．２０×２５０ｍｍ；流速：１２ｍｌ／分；移動相：溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ／ＴＦＡｐＨ２．６，溶媒Ｂ：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ９０：１０；方法：勾配，溶媒Ａ：溶媒Ｂ６０：４０から２：９８，２４分；波長：２５４ｎｍ，３３０ｎｍ）により更に精製され、６１が得られた（１６ｍｇ，８％、６１ｃから２工程かけて、ＨＰＬＣ純度：９７．２％）。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）９．６９（ｓ，１Ｈ），８．５７−８．４６（ｍ，３Ｈ），８．０９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．９１（ｄｄ，Ｊ＝８．３，２．４Ｈｚ，２Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，２Ｈ），７．５９−７．５２（ｍ，２Ｈ），７．４７−７．４０（ｍ，２Ｈ），７．２７−７．２３（ｍ，１Ｈ），４．４２−４．２２（ｍ，８Ｈ），４．０６−４．０１（ｍ，２Ｈ），３．９０（ｔｄ，Ｊ＝１１．２，７．４Ｈｚ，２Ｈ），３．１９（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．７７−２．５９（ｍ，４Ｈ），２．０１−１．９４（ｍ，２Ｈ）．２つのプロトンは観測されなかった。３１ＰＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）−６．０１．ＨＲＭＳｍ／ｚ８７７．１０５３［（Ｍ＋Ｎａ）＋，Ｃ３９Ｈ３７Ｃｌ２Ｎ４ＮａＯ８ＰＳ２として計算：８７７．１０６０］．［α］Ｄ ２４＝−４２．３ｏ（ｃ＝０．２１３，ＤＭＳＯ）．
実施例１２ ２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロピル（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（ホスホノオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イルカルバメート ６２
トリエチルアミン、Ｅｔ３Ｎ（０．９２ｍＬ，６．６２ｍｍｏｌ）及びトリフルオロメタンスルホン酸無水物（１．０３ｍＬ，６．１１ｍｍｏｌ）が、０℃で、ＤＣＭ（１６０ｍＬ）中の５１ａ（１．７０ｇ，５．０９ｍｍｏｌ）の溶液に添加された。図１６を参照。反応物を、２０分間、０℃で攪拌し、次いで、Ｈ２Ｏで希釈し、層を分離し、水層をＤＣＭ（１×）で抽出した。混合した有機層を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒を真空下で除去した。ヘキサン：ＥｔＯＡｃ１００：０から９５：５を用いたシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによる精製により、ベージュ色の泡状固体として、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（クロロメチル）−５−（トリフルオロメチルスルホニルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ６２ａ（２．２０ｇ，９３％）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）８．３０（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．０３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６２−７．５９（ｍ，１Ｈ），７．５３−７．４９（ｍ，１Ｈ），４．３２（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．２１−４．１５（ｍ，１Ｈ），４．０９−４．０３（ｍ，１Ｈ），３．９２（ｄｄ，Ｊ＝１１．２，２．８Ｈｚ，１Ｈ），３．５４−３．４９（ｍ，１Ｈ），１．６１（ｓ，９Ｈ）．
乾燥ＴＨＦ（６０ｍＬ）中の６２ａ（２．１５ｇ，４．６１ｍｍｏｌ）の溶液が、窒素下で、密封管中で、Ｃｓ２ＣＯ３（２．１０ｇ，６．４４ｍｍｏｌ），ＢＩＮＡＰ（４３０ｍｇ，０．６９０ｍｍｏｌ）及びＰｄ（ＯＡｃ）２（１５５ｍｇ，０．６９０ｍｍｏｌ）の混合物に添加された。ジフェニルメタンアミン（１．０ｍＬ，５．９８ｍｍｏｌ）が反応混合物に添加され、１０分間混合物に窒素がバブリングされた。密封されたチューブは、４日間、６０−６５℃で加熱された。次いで、反応混合物を室温に冷却し、ＤＣＭで希釈し、セライトを通して濾過し、洗浄液に色が存在しなくなるまでセライトプラグをＤＣＭで洗浄し、濾液を真空下で蒸発させた。ヘキサン：ＤＣＭ１００：０から５０：５０を用いたシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによる残留物の精製により、黄色泡状固体として、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（クロロメチル）−５−（ジフェニルメチレンアミノ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ５３ｆ（２．０９ｇ，９１％）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）７．８５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７５（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），７．６１−７．５７（ｍ，１Ｈ），７．５４−７．４９（ｍ，３Ｈ），７．３７−７．３３（ｍ，１Ｈ），７．３０−７．２３（ｍ，３Ｈ），７．０６（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），４．１４−４．０２（ｍ，２Ｈ），３．９９−３．９４（ｍ，２Ｈ），３．７７（ｄｄ，Ｊ＝１０．８，７．４Ｈｚ，１Ｈ），１．４６（ｓ，９Ｈ），１Ｈ（観測されず）。ＨＲＭＳｍ／ｚ４９７．１９８４［（Ｍ＋Ｈ）＋，Ｃ３１Ｈ３０ＣｌＮ２Ｏ２として計算：４９７．１９９０］．［α］Ｄ ２８＝−１０１．５ｏ（ｃ＝０．９９５，ＤＣＭ）．
室温（ｒ．ｔ．）でＴＨＦ及びＨ２Ｏ（１９５ｍＬ／９８ｍＬ）中５３ｆ（１．３０ｇ，２．６２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、氷酢酸、ＨＯＡｃ（６５ｍＬ）が添加され、混合物が一晩撹拌された。１８時間後、反応混合物は真空下で濃縮され、３０℃以上に加熱することなく、ほとんどのＴＨＦを除去した。次いで、混合物はＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で希釈され、有機層が分離され、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄され（４×、洗浄液のｐＨが８になるまで）、乾燥され（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒は真空下で除去された。ヘキサン：ＤＣＭ１００：０から９０：１０を用いたシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによる残留物の精製により、黄色泡状固体として、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル−５−アミノ−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ６１ａ（５０３ｍｇ，５８％）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）８．０１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６４（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４０（ｄｄｄ，Ｊ＝８．１，６．８，０．９Ｈｚ，１Ｈ），７．３６（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．２０（ｄｄｄ，Ｊ＝８．１，６．８，１．１Ｈｚ，１Ｈ），５．９１（ｓ，２Ｈ），４．１１−３．９１（ｍ，４Ｈ），３．６６（ｄｄ，Ｊ＝１０．６，８．２Ｈｚ，１Ｈ），１．５３（ｓ，９Ｈ）．
乾燥ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の２−メルカプトプロパン酸（３．０２ｇ，２８．５ｍｍｏｌ）の溶液が、０℃で乾燥ＴＨＦ（４０ｍＬ）中のＬｉＡｌＨ４（１．２９ｇ，３４．０ｍｍｏｌ）の攪拌懸濁液に滴下された。反応混合物は室温に温められ、３時間撹拌された。次いで、混合物を０℃に冷却し、Ｈ２Ｏ（５ｍＬ）及び５％ＮａＯＨ水溶液（３ｍＬ）でクエンチされた。混合物は０℃で２０分間攪拌され、セライトを通じて濾過し、セライトプラグはＥｔ２Ｏ（３ｘ）で洗浄し、混合した有機物は乾燥され（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過され、溶媒が除去されて、２−メルカプトプロパン−１−オール（９４４ｍｇ）を得て、これは精製せずに次の工程で使用された。ＭｅＯＨ（７ｍＬ）中の１，２−ジ（ピリジン−２−イル）ジスルファン（Bioorg. Med. Chem. Lett. (2011) 21:4985-4988.）（４７０ｍｇ，５．１０ｍｍｏｌ）の溶液が室温でＭｅＯＨ（４ｍＬ）中の２−メルカプトプロパン−１−オールの溶液に添加され、混合物は一晩攪拌された。１７．５時間後、溶媒を真空下で除去した。ヘキサン：ＤＣＭ５０：５０から０：１００、次いでＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ９９：１から７５：２５を使用するアルミナ（中性）上のカラムクロマトグラフィーによる精製により、黄色油として、２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパン−１−オール（５２８ｍｇ，１８％，２−メルカプトプロパン酸から２工程かけて）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）８．５０（ｄｄｄ，Ｊ＝５．０，１．８，０．９Ｈｚ，１Ｈ），７．５７（ｄｄｄ，Ｊ＝８．０，７．４，１．８Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｔｄ，Ｊ＝８．１，１．０Ｈｚ，１Ｈ），７．１５（ｄｄｄ，Ｊ＝７．４，５．０，１．１Ｈｚ，１Ｈ），５．９３（ｄｄ，Ｊ＝８．８，５．８Ｈｚ，１Ｈ），３．６８（ｄｄｄ，Ｊ＝１２．５，８．８，３．８Ｈｚ，１Ｈ），３．４０（ｄｄｄ，Ｊ＝１２．４，７．８，５．８Ｈｚ，１Ｈ），３．１４−３．０６（ｍ，１Ｈ），１．３１（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）．
乾燥ＤＣＭ（４０ｍＬ）中のトリホスゲンの溶液（１２７ｍｇ，０．４２８ｍｍｏｌ）が、６１ａ（２５０ｍｇ，０．７５１ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（５５１ｍｇ，４．５１ｍｍｏｌ）の混合物に室温で添加された。すぐに黄色い固体が沈殿した。３０分後に、ＤＣＭ（６ｍＬ）中の２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパン−１−オール（４２０ｍｇ，２．０９ｍｍｏｌ）の溶液が添加され、沈殿物は溶解された。反応混合物は一晩攪拌したままにした。１８時間後、１ＭのＮａＯＨ（３０ｍＬ）が添加され、混合物は撹拌された。次いで、層は分離され、有機層は乾燥され（Ｎａ２ＳＯ４）、ＭｅＯＨ（１５ｍＬ）で希釈され、シリカゲルに吸収された。生成物は、ヘキサン：ＤＣＭ１００：０から５０：５０から０：１００、次いでＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ９９：１から９２：８を使用して溶出された。次いで、物質は、ヘキサン：ＤＣＭ１００：０から５０：５０から０：１００、次いでＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ９８：２から９５：５を使用して、シリカゲル上で再びクロマトグラム処理された。これは、６２ｂ及び２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパン−１−オール（３８５ｍｇ）を得た。この混合物が次の工程で使用された。ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＴＢＤＭＳＣｌ（８１ｍｇ，０．５３５ｍｍｏｌ）の溶液が、０℃で、ＤＭＦ（２ｍＬ）中の６２ｂ及び２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパン−１−オール、及びイミダゾールの攪拌混合物に添加された。混合物は室温に温められ、５０分間撹拌され、次いでＥｔＯＡｃ及びＨ２Ｏで希釈された。混合物は攪拌され、層が分離され、有機層をＨ２Ｏ（３×）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒を真空下で除去した。ヘキサン：ＤＣＭ５０：５０から０：１００、次いでＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ９５：５から９４：６を使用したシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによる精製は、淡黄色の泡状固体として、（１Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（クロロメチル）−５−（（２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロポキシ）カルボニルアミノ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ６２ｂ（２９５ｍｇ，７０％、６１ａから２工程かけて）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）８．４９（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．４６（ｄｄｄ，Ｊ＝４．８，１．７，０．８Ｈｚ，１Ｈ），７．８６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７５−７．７３（ｍ，２Ｈ），７．６４−７．６０（ｍ，１Ｈ），７．５４（ｄｄｄ，Ｊ＝８．１，６．９，１．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４２（ｄｄｄ，Ｊ＝８．２，６．８，１．１Ｈｚ，１Ｈ），７．０８（ｄｄｄ，Ｊ＝７．４，４．９，０．８Ｈｚ，１Ｈ），６．９７（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．３７−４．２８（ｍ，３Ｈ），４．１７−４．１１（ｍ，１Ｈ），４．０５−３．９９（ｍ，１Ｈ），３．９２（ｄｄ，Ｊ＝１１．１，２．５Ｈｚ，１Ｈ），３．４７（ｔ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ，１Ｈ），３．３８−３．３０（ｍ，１Ｈ），１．６２（ｓ，９Ｈ），１．４１（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）．ＨＲＭＳｍ／ｚ５８２．１２６５［（Ｍ＋Ｎａ）＋，Ｃ２７Ｈ３０ＣｌＮ３ＮａＯ４Ｓ２として計算：５８２．１２５８］．
０℃で、ＤＣＭ（１４ｍＬ）中の６２ｂ（２８５ｍｇ，５０９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（７ｍＬ）がゆっくりと添加され、混合物はこの温度で１時間撹拌された。次いで、反応混合物はＤＣＭ及びＨ２Ｏで希釈され、ｐＨが７になるまで飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で中和された。層は分離され、有機層をＨ２Ｏ（１×）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒を真空下で除去し、黄色の固体として、（Ｓ）−１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イルカルバメート ２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロピル ６２ｃ（２２０ｍｇ，９４％）が得られ、これは精製せずに次の工程で使用された。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）９．５２（ｓ，１Ｈ），８．４５（ｄｄｄ，Ｊ＝４．８，１．７，０．８Ｈｚ，１Ｈ），７．８８（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．８５−７．８３（ｍ，１Ｈ），７．７９−７．７５（ｍ，１Ｈ），７．６４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｄｄｄ，Ｊ＝８．１，６．８，１．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２３（ｄｄｄ，Ｊ＝７．３，４．８，１．０Ｈｚ，１Ｈ），７．１５（ｄｄｄ，Ｊ＝８．１，６．８，１．０Ｈｚ，１Ｈ），７．０８（ｓ，１Ｈ），５．９３（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．２４−４．１３（ｍ，２Ｈ），４．０２−３．９６（ｍ，１Ｈ），３．８５（ｄｄ，Ｊ＝１０．８，３．５Ｈｚ，１Ｈ），３．７０（ｔ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），３．６３−３．５５（ｍ，２Ｈ），３．４３−３．３６（ｍ，１Ｈ），１．３４（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）．
ＤＭＡ（１０ｍＬ）中の（Ｓ）−５−（１−（クロロメチル）−５−（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタン酸 ５７ｄ（３６５ｍｇ，０．６７６ｍｍｏｌ）の溶液が、６２ｃ（２１５ｍｇ，０．４６７ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ．ＨＣｌ（２６８ｍｇ，１．４０ｍｍｏｌ）の混合物に室温で添加された。ＴｓＯＨが添加され（１６ｍｇ，０．０９２９ｍｍｏｌ）、混合物を窒素下（及び３Ａモレキュラーシーブ上で）、一晩撹拌された。２７．５時間後、混合物をＥｔＯＡｃ及びＨ２Ｏで希釈し、よく振盪し、層を分離した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３×）、かん水（１×）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒を真空下で除去した。得られた残留物はＤＣＭに溶解され、溶液から固体が沈殿するまでヘキサンで希釈された。溶媒は真空下で除去され、固体はヘキサン：ＥｔＯＡｃ９５：５で粉砕され、黄褐色の固体として、２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロピル（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イルカルバメート ６２ｄ（３７２ｍｇ）が得られ、これは精製せずに次の工程で使用された。ＨＲＭＳｍ／ｚ１００３．２４４５［（Ｍ＋Ｎａ）＋，Ｃ４８Ｈ５５Ｃｌ２Ｎ４ＮａＯ８ＰＳ２として計算：１００３．２４６８］．
０℃で、ＤＣＭ（７ｍＬ）中の６２ｄ（上述で調製）の攪拌溶液に、ＴＦＡ（３．５ｍＬ）をゆっくり添加した。混合物はこの温度で１時間撹拌された。次いで、溶媒を２５℃にて真空下で除去した。得られた暗緑色の残留物はＤＣＭに溶解され、溶液はＥｔＯＡｃで希釈され、溶液から固体を沈殿させた。溶媒は、３０℃で真空下で除去され、残留物は再びＤＣＭに溶解され、ＥｔＯＡｃで希釈された。ＤＣＭは真空下で除去され、ＥｔＯＡｃ中の懸濁液を得た。固体が濾過により回収され、次いで固体はＥｔＯＡｃ及びヘキサンで洗浄され、乾燥され、緑色の固体を得た。これは、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ−ＭＡＸＲＰ４μ，２１．２０×２５０ｍｍ；流速：１２ｍｌ／分；移動相：溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ／ギ酸アンモニウム緩衝液ｐＨ３．５，溶媒Ｂ：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ９０：１０；方法：勾配，溶媒Ａ：溶媒Ｂ２５：７５から０：１００，１９分かけて）により更に精製され、クリーム粉末として、２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロピル（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（ホスホノオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イルカルバメート ６２（７８ｍｇ，１９％、６２ｃから２工程かけて，ＨＰＬＣ純度：８７．４％）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）９．６９（ｓ，１Ｈ），８．５６（ｓ，１Ｈ），８．４８（ｓ，１Ｈ），８．４４（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，１Ｈ），８．１５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），８．００（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．９０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８５−７．７６（ｍ，３Ｈ），７．５５−７．４８（ｍ，２Ｈ），７．４４−７．４０（ｍ，１Ｈ），７．３６−７．３２（ｍ，１Ｈ），７．２４−７．２１（ｍ，１Ｈ），４．４１−４．１４（ｍ，８Ｈ），４．０５−３．９９（ｍ，２Ｈ），３．９１（ｄｄ，Ｊ＝１０．８，７．２Ｈｚ，１Ｈ），３．８５−３．８１（ｍ，１Ｈ），３．３７−３．２８（ｍ，１Ｈ），２．７４−２．５７（ｍ，４Ｈ），１．９８−１．９５（ｍ，２Ｈ），１．３４（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），２つのプロトンは観測されなかった。３１ＰＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）−５．０９．ＨＲＭＳｍ／ｚ８９１．１２２１［（Ｍ＋Ｎａ）＋，Ｃ４０Ｈ３９Ｃｌ２Ｎ４ＮａＯ８ＰＳ２として計算：８９１．１２１６］
実施例１３ （Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル ２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ−メチルヘキサンアミド）エチル（メチル）カルバメート ６３
（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（ホスホノオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル ２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ−メチルヘキサンアミド）エチル（メチル）カルバメート ５７は酵素的に脱リン酸化され６３を得た。
実施例１４ ２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）エチル（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イルカルバメート ６４
２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）エチル（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（５−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（ホスホノオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−５−オキソペンタノイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イルカルバメート ６１は酵素的に脱リン酸化され６４を得た。
実施例１５ （１１ａＳ）−４−（（Ｓ）−６−アミノ−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）ヘキサンアミド）ベンジル ８−（６−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−６−オキソヘキシルオキシ）−１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−５−オキソ−２，３，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシレート ６５
乾燥ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の（Ｓ）−２，２，２−トリクロロエチル６−（５−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４−（２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボニル）−２−メトキシフェノキシ）ヘキサン酸５４ｃの攪拌溶液に、無水酢酸（１．２９ｍＬ，１３．６ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２．２７ｍＬ，１６．３ｍｍｏｌ）が室温で添加された。図１７を参照。反応混合物は更に４時間撹拌された。乾燥ＭｅＯＨ（１．５ｍＬ）が添加され、混合物は３０分間撹拌された。酢酸エチル（２００ｍＬ）が添加され、酢酸エチル層が分離され、水で数回洗浄された。酢酸エチル溶液は乾燥され（ＭｇＳＯ４）、蒸発させ、淡黄色の接着剤として、（Ｓ）−２，２，２−トリクロロエチル ６−（４−（２−（アセトキシメチル）ピロリジン−１−カルボニル）−５−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２−メトキシフェノキシ）ヘキサン酸 ６５ａ（１．８ｇ，１００％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ［（ＣＤ３）２ＳＯ］δ８．８２（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．２７（ｓ，１Ｈ），６．８６（ｓ，１Ｈ），４．８９（ｓ，２Ｈ），４．３９−４．２０（ｍ，３Ｈ），３．９３（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），３．５０−３．３３（ｍ，２Ｈ），２．１０−１．９４（ｍ，４Ｈ），１．９２−１．６１（ｍ，７Ｈ），１．５３−１．４２（ｍ，２Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ），２Ｈ（ＤＭＳＯピークにより部分的に不明瞭）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚＣ２８Ｈ３９Ｃｌ３Ｎ２ＮａＯ９として計算：６７５．１６１３， ｆｏｕｎｄ ：６７５．１６０３［ＭＮａ＋］．Ｃａｌｃ．ｆｏｒＣ２８Ｈ４０Ｃｌ３Ｎ２Ｏ９：６５３．１７９４， ｆｏｕｎｄ ：６５３．１７７８［ＭＨ＋］．
アセトン（２０ｍＬ）、及び水（１２ｍＬ）及びＴＨＦ（１２ｍＬ）の混合物中の６５ａ（１．７６ｇ，２．６９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、窒素下で、Ｚｎ（７．０６ｇ，１０８ｍｍｏｌ）及びＮＨ４Ｃｌ（１１．６ｇ，２１６ｍｍｏｌ）が添加された。混合物を室温で２３時間撹拌した。酢酸エチル（１００ｍＬ）が添加され、混合物は１５分間撹拌された。有機層はデカントされた。抽出は、追加の酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で繰り返された。混合有機溶液は水（２×１００ｍＬ）で洗浄され、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、セライトを通じて濾過し、蒸発させ、粘着性の無色の泡状物として、（Ｓ）−６−（４−（２−（アセトキシメチル）ピロリジン−１−カルボニル）−５−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２−メトキシフェノキシ）ヘキサン酸 ６５ｂ（１．３６ｇ，９６％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ［（ＣＤ３）２ＳＯ］δ１１．４９（非常にｂｒ ｓ，１Ｈ），８．８３（ｓ，１Ｈ），７．２７（ｓ，１Ｈ），６．８６（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．３９−４．０２（ｍ，３Ｈ），３．９３（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），３．５１−３．３３（ｍ，２Ｈ（水ピークにより部分的に不明瞭）），２．２１（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），２．１１−１．９３（ｍ，４Ｈ），１．９０−１．６６（ｍ，５Ｈ），１．６２−１．５０（ｍ，２Ｈ），１．５０−１．３５（ｍ，２Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ）。元素分析（Ｃ２６Ｈ３８Ｎ２Ｏ９．）Ｃａｌｃ：Ｃ，５９．７６；Ｈ，７．３３；Ｎ，５．３６．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，５９．６６；Ｈ，７．４９；Ｎ，５．２９．
乾燥ＤＭＡ（５ｍＬ）中の６５ｂ（０．８７ｇ，２．４１ｍｍｏｌ）及び（Ｓ）−１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル ４−メチルピペラジン−１−カルボキシレート ５８ｂ（１．２６ｇ，２．４１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、０℃で、窒素下、ｐ−ジオキサン（１．２１ｍＬ，４．８２ｍｍｏｌ）中の４ＭのＨＣｌ、続いてＥＤＣＩ．ＨＣｌ（１．３９ｇ，７．２３ｍｍｏｌ）及び無水ＴｓＯＨ（８３ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ）が添加された。反応混合物は、２１時間窒素下で０℃で攪拌され、次いで、酢酸エチル（５００ｍＬ）及び水（５００ｍＬ）の間で分配された。酢酸エチル層が分離され、水層は更に酢酸エチル（２００ｍＬ）で抽出された。混合された酢酸エチル抽出物は、水（２００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２×２００ｍＬ）及び水（２００ｍＬ）で連続的に洗浄された。酢酸エチル層は乾燥され、蒸発させ、ベージュ色の固体泡として、（Ｓ）−３−（６−（４−（（Ｓ）−２−（アセトキシメチル）ピロリジン−１−カルボニル）−５−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２−メトキシフェノキシ）ヘキサノイル）−１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル ４−メチルピペラジン−１−カルボキシレート６５ｃを得た；ｍｐ ８４−８７ｏＣ；１Ｈ ＮＭＲ［（ＣＤ３）２ＳＯ］δ８．８４（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．２１（ｓ，１Ｈ），７．９５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．８１（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．５８（ｂｒｔ，Ｊ＝７．７，１Ｈ），７．４６（ｂｒｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．２９（ｓ，１Ｈ），６．８６（ｓ，１Ｈ），４．４０（ｔ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ），４．３６−３．８６（ｍ，１０Ｈ），３．８３−３．７４（ｍ，１Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ），３．５４−３．３６（ｍ，４Ｈ），２．６７−２．３４（ｍ，６Ｈ（ＤＭＳＯピークにより部分的に不明瞭）），２．２６（ｓ，３Ｈ），２．０２（ｂｒ ｓ，３Ｈ），１．９３−１．６２（ｍ，８Ｈ），１．６０−１．４７（ｍ，２Ｈ），１．４２（ｓ，９Ｈ）．元素分析（Ｃ４５Ｈ５８ＣｌＮ５Ｏ１０・１ １／２Ｈ２Ｏ）Ｃａｌｃ：Ｃ，６０．６３；Ｈ，６．９０；Ｎ，７．８６．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，６０．３９；Ｈ，６．６６；Ｎ，８．０８．
０℃で、窒素雰囲気下で、ＤＣＭ（２０ｍＬ）中の６５ｃ（２．１７ｇ，２．５１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、ＴＦＡ（２０ｍＬ）が添加された。添加後、混合物は、２．５時間、この温度で更に撹拌された。混合物は、０℃で、ＮａＨＣＯ３（５０ｇ）、水（７００ｍＬ）及びＤＣＭ（５００ｍＬ）の混合物に注がれ、１５分間撹拌された（ｐＨは約８）。ＤＣＭ層は分離され、ＮａＨＣＯ３水溶液（２００ｍＬ）及び水（２００ｍＬ）で洗浄され、次いで乾燥された（ＭｇＳＯ４）。溶媒を蒸発させ、淡褐色固体泡として、（Ｓ）−３−（６−（４−（（Ｓ）−２−（アセトキシメチル）ピロリジン−１−カルボニル）−５−アミノ−２−メトキシフェノキシ）ヘキサノイル）−１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル ４−メチルピペラジン−１−カルボキシレート ６５ｄを得た；ｍｐ ６２ｏＣ；１Ｈ ＮＭＲ［（ＣＤ３）２ＳＯ］δ８．２１（ｓ，１Ｈ），７．９５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．８１（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．５７（ｂｒｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．４６（ｂｒｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），６．６７（ｓ，１Ｈ），６．３７（ｓ，１Ｈ），５．０９（ｓ，２Ｈ），４．４１（ｔ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，１Ｈ），４．３６−４．２０（ｍ，３Ｈ），４．１７−４．００（ｍ，３Ｈ），３．９７−３．８６（ｍ，３Ｈ），３．８１−３．７０（ｍ，２Ｈ），３．６３（ｓ，３Ｈ），３．５４−３．３２（ｍ，５Ｈ），２．６６−２．３４（ｍ，６Ｈ（ＤＭＳＯピークにより部分的に不明瞭）），２．２６（ｓ，３Ｈ），２．０８−１．９６（ｍ，１Ｈ），２．１０（ｓ，３Ｈ），１．９３−１．６３（ｍ，７Ｈ），１．５７−１．４５（ｍ，２Ｈ）．元素分析（Ｃ４０Ｈ５０ＣｌＮ５Ｏ８・１／２Ｈ２Ｏ）Ｃａｌｃ：Ｃ，６２．１３；Ｈ，６．６５；Ｎ，９．０６．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，６２．１２；Ｈ，６．７６；Ｎ，８．７７．
乾燥ＤＭＡ（１０ｍＬ）中の（Ｓ）−２−（アリルオキシカルボニルアミノ）−６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサン酸６５ｅ６５ｅ（３．３０ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）及びＥＥＤＱ（３．７１ｇ，１５．０ｍｍｏｌ）の混合物は、室温で、窒素下、１５分間攪拌された。図１８を参照。この予め調製された混合物に、４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）メチル）アニリン（ＤＭＦ中で対応するｐ−ニトロベンジルアルコール及びＴＢＤＭＳＣｌから調製され；その後乾燥ＤＭＡ（３ｍＬ）中でＺｎ／ＮＨ４Ｃｌ）（２．３７ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）を使用して還元された）の溶液が添加された。最終反応混合物は、２３時間、窒素下、室温で攪拌された。混合物は、酢酸エチル（５００ｍＬ）及び水（５００ｍＬ）の間で分配された。酢酸エチル層は分離され、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×２００ｍＬ）及び水（３００ｍＬ）で洗浄され、次いで乾燥された（ＭｇＳＯ４）。溶媒を蒸発させて、橙色の油状物が得られ、シリカカラムクロマトグラフィー（１０−１５％の石油エーテル−酢酸エチルの勾配）により精製し、粘着性のベージュ色の固体泡としてＴＢＤＭＳ保護リジン６５ｆ（４．８７ｇ，８９％）を得た；；１Ｈ ＮＭＲ［（ＣＤ３）２ＳＯ］δ９．９７（ｓ，１Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝８．５０Ｈｚ，２Ｈ），７．４４（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．２１（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），６．７５（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ），５．９９−５．８２（ｍ，１Ｈ），５．２８（ｂｒｄ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ，１Ｈ），５．１７（ｂｒｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，１Ｈ），４．６４（ｓ，２Ｈ），４．４６（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），４．１２−４．０２（ｍ，１Ｈ），２．９３−２．８３（ｍ，２Ｈ），１．７０−１．５２（ｍ，２Ｈ），１．４６−１．２０（ｍ，４Ｈ），１．３５（ｓ，９Ｈ），０．８９（ｓ，９Ｈ），０．０６（ｓ，６Ｈ）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚＣ２８Ｈ４７Ｎ３ＮａＯ６Ｓｉとして計算：５７２．３１２６， ｆｏｕｎｄ ：５７２．３１３６［ＭＮａ＋］．
ＴＨＦ（３０ｍＬ）中の６５ｆ（４．８１ｇ，８．７５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、室温で、ＴＨＦ（１７．５ｍＬ，１７．５ｍｍｏｌ）中のフッ化テトラブチルアンモニウムの１Ｍ溶液が添加された。添加後、混合物は更に２．５時間この温度で撹拌された。ＮＨ４Ｃｌ水溶液（３００ｍＬ）が添加され、生成物は酢酸エチル（５００ｍＬ）中に抽出された。酢酸エチルを水（２×１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥した（ＭｇＳＯ４）。溶媒を蒸発させて、ベージュ色の固体としてベンジルアルコールリジン６５ｇ（３．８１ｇ，１００％）を得た；ｍｐ １０１−１０３ｏＣ；１Ｈ ＮＭＲ［（ＣＤ３）２ＳＯ］δ９．９４（ｓ，１Ｈ），７．５２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．４４（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．２３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），６．７６（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），５．９７−５．８４（ｍ，１Ｈ），５．２９（ｂｒｄ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ，１Ｈ），５．１７（ｂｒｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ），５．０８（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），４．４７（ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，２Ｈ），４．４３（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），４．１３−４．０３（ｍ，１Ｈ），２．９６−２．８２（ｍ，２Ｈ），１．７２−１．５２（ｍ，２Ｈ），１．４６−１．２０（ｍ，４Ｈ），１．３６（ｓ，９Ｈ）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚＣ２２Ｈ３３Ｎ３ＮａＯ６として計算：４５８．２２６２， ｆｏｕｎｄ ：４５８．２２７２［ＭＮａ＋］；Ｃ２２Ｈ３３Ｎ３ＫＯ６として計算：４７４．２００１， ｆｏｕｎｄ ：４７４．１９９８［ＭＫ＋］．
乾燥ＤＣＭ（１５ｍＬ）中の６５ｄ（７６４ｍｇ，１．００ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（３６７ｍｇ，３．００ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、室温で窒素下で、乾燥ＤＣＭ中のジホスゲンの溶液（０．０５ｍｍｏｌ／ｍＬあたり，１２ｍＬ，０．６０ｍｍｏｌ）が添加され、混合物は更に２０分間撹拌された。図１９を参照。この混合物に、乾燥ＤＣＭ（８０ｍＬ）中の６５ｇ（３．９７ｇ，９．１３ｍｍｏｌ）の溶液が添加された。最終反応混合物は、４８時間、窒素下、室温で攪拌された。混合物は、酢酸エチル（５００ｍＬ）及び水（３００ｍＬ）の間で分配された。酢酸エチル層が分離され、水層は酢酸エチル（２×２００ｍＬ）で抽出された。混合された酢酸エチル溶液は追加の水（２×１００ｍＬ）で洗浄され、乾燥された（ＭｇＳＯ４）。３０℃（浴温度）で溶媒を蒸発させるとオレンジ色の油が得られ、シリカカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル−ＭｅＯＨ＝１０：１）により精製し、淡いオレンジ色の固体として、（Ｓ）−３−（６−（４−（（Ｓ）−２−（アセトキシメチル）ピロリジン−１−カルボニル）−５−（（４−（（Ｓ）−２−（アリルオキシカルボニルアミノ）−６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサンアミド）ベンジルオキシ）カルボニルアミノ）−２−メトキシフェノキシ）ヘキサノイル）−１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル ４−メチルピペラジン−１−カルボキシレート ６５ｈ（１．０４ｇ，８５％）を得た；ｍｐ ９０−９３ｏＣ；１Ｈ ＮＭＲ［（ＣＤ３）２ＳＯ］δ１０．０４（ｓ，１Ｈ），９．１０（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．２１（ｓ，１Ｈ），７．９５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．８１（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．６３−７．５３（ｍ，３Ｈ），７．５１−７．４２（ｍ，２Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．２１（ｂｒ ｓ，１Ｈ），６．８５（ｂｒ ｓ，１Ｈ），６．７９−６．７２（ｍ，１Ｈ），５．９７−５．８３（ｍ，１Ｈ），５．２９（ｂｒｄ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ，１Ｈ），５．１７（ｂｒｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ），５．０８−４．９６（ｍ，２Ｈ），４．５２−４．３７（ｍ，３Ｈ），４．３７−３．８５（ｍ，１０Ｈ），３．８３−３．６６（ｍ，２Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），３．５４−３．４１（ｍ，２Ｈ），３．４１−３．２３（ｍ，２Ｈ（水ピークにより部分的に不明瞭）），２．９５−２．８３（ｍ，２Ｈ），２．６６−２．３４（ｍ，６Ｈ（ＤＭＳＯピークにより部分的に不明瞭）），２．２５（ｓ，３Ｈ），２．０７−１．９２（ｍ，４Ｈ），１．８７−１．４５（ｍ，１１Ｈ），１．４５−１．２０（ｍ，４Ｈ），１．３５（ｓ，９Ｈ）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚＣ６３Ｈ８２ＣｌＮ８Ｏ１５として計算：１２２５．５５８３， ｆｏｕｎｄ ：１２２５．５５５７［ＭＨ＋］；Ｃ６３Ｈ８１ＣｌＮ８ＮａＯ１５として計算：１２４７．５４０２， ｆｏｕｎｄ ：１２４７．５４０１［ＭＮａ＋］；Ｃ６３Ｈ８１ＣｌＫＮ８Ｏ１５として計算：１２６３．５１４２， ｆｏｕｎｄ ：１２６３．５１４１［ＭＫ＋］．
ＤＣＭ（２０ｍＬ）及びＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中の６５ｈ（１．０１ｇ，０．８２４ｍｍｏｌ）及びＫ２ＣＯ３（１．１４ｇ，８．２４ｍｍｏｌ）の混合物は室温で１時間４０分間撹拌された。混合物はＤＣＭ（２００ｍＬ）で希釈され、１０分間氷水（２００ｍＬ）で攪拌された。ＤＣＭ層は分離され、水層はＤＣＭ（２×１００ｍＬ）で抽出された。混合されたＤＣＭ溶液は追加の水（２００ｍＬ）で洗浄され、乾燥された（ＭｇＳＯ４）。２５℃（浴温度）で溶媒を蒸発させるとベージュ色の固体として、（Ｓ）−３−（６−（５−（（４−（（Ｓ）−２−（アリルオキシカルボニルアミノ）−６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサンアミド）ベンジルオキシ）カルボニルアミノ）−４−（（Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボニル）−２−メトキシフェノキシ）ヘキサノイル）−１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル ４−メチルピペラジン−１−カルボキシレート ６５ｉ（０．９４ｇ，９６％）を得た；ｍｐ １０４−１０７ｏＣ；１Ｈ ＮＭＲ［（ＣＤ３）２ＳＯ］δ１０．０４（ｓ，１Ｈ），９．１７（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．２１（ｓ，１Ｈ），７．９５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．６３−７．５３（ｍ，３Ｈ），７．５１−７．４２（ｍ，２Ｈ），７．３８−７．２１（ｍ，３Ｈ），６．９３（ｓ，１Ｈ），５．３２（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），５．９８−５．８３（ｍ，１Ｈ），５．３０（ｂｒｄ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ，１Ｈ），５．１７（ｂｒｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，１Ｈ），５．０３（ｓ，２Ｈ），４．７３（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），４．５２−４．３６（ｍ，３Ｈ），４．３６−４．１７（ｍ，２Ｈ），４．１７−３．８５（ｍ，６Ｈ），３．８３−３．６６（ｍ，２Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ），３．６１−３．４０（ｍ，４Ｈ），３．４０−３．２０（ｍ，２Ｈ（水ピークにより部分的に不明瞭）），２．９４−２．８３（ｍ，２Ｈ），２．６７−２．３４（ｍ，６Ｈ（ＤＭＳＯピークにより部分的に不明瞭）），２．２５（ｓ，３Ｈ），１．９６−１．４５（ｍ，１２Ｈ），１．４５−１．２０（ｍ，４Ｈ），１．３５（ｓ，９Ｈ）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚＣ６１Ｈ８０ＣｌＮ８Ｏ１４として計算：１１８３．５４７７， ｆｏｕｎｄ ：１１８３．５４４５［ＭＨ＋］；Ｃ６１Ｈ７９ＣｌＮ８ＮａＯ１４として計算：１２０５．５２９６， ｆｏｕｎｄ ：１２０５．５２５６［ＭＮａ＋］；Ｃ６１Ｈ７９ＣｌＫＮ８Ｏ１４として計算：１２２１．５０３６， ｆｏｕｎｄ ：１２２１．５０２６［ＭＫ＋］．
乾燥ＤＣＭ（２０ｍＬ）中の６５ｉ（０．９２ｇ，０．７８ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、０℃で、デス・マーチン・ペルヨージナン（ＤＭＰ：１，１，１−トリアセトキシ−１，１−ジヒドロ−１，２−ベンズヨードキソール−３（１Ｈ）−オン，ＣＡＳＲｅｇ．Ｎｏ．８７４１３−０９−０）（４９２ｍｇ，１．１６ｍｍｏｌ）が少量ずつ（８分間かけて）添加された。添加が完了した後、反応混合物は、０℃で２時間、次いで室温で４５時間更に攪拌された。混合物はＤＣＭ（１００ｍＬ）で希釈され、室温で、１０分間、１０％Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（１００ｍＬ）で攪拌された。得られた混合物は、ＤＣＭ（４００ｍＬ）及び飽和ＮａＨＣＯ３溶液（４００ｍＬ）との間で分配された。ＤＣＭ層は分離され、水層はＤＣＭ（２×２００ｍＬ）で更に抽出された。混合されたＤＣＭ溶液は、ＮａＨＣＯ３水溶液（２００ｍＬ）及び水（２００ｍＬ）で更に洗浄され、次いで乾燥された（ＭｇＳＯ４）。２５℃（浴温度）で溶媒を蒸発させ、淡褐色の固体が得られ、これはＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーにより精製され（ＤＣＭ−酢酸エチル−ＭｅＯＨ＝１５：１５：１、１５：１５：３までの勾配）、淡黄色固体として、（Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（アリルオキシカルボニルアミノ）−６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサンアミド）ベンジル ８−（６−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−６−オキソヘキシルオキシ）−１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−５−オキソ−２，３，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシレート ６５ｊ（０．６４ｇ，７０％）を得た；ｍｐ １３７ｏＣ（ｄｅｃ．）；１Ｈ ＮＭＲ［（ＣＤ３）２ＳＯ］δ１０．０２（ｓ，１Ｈ），８．２１（ｓ，１Ｈ），７．９５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．６５−７．３８（ｍ，５Ｈ），７．１８（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），７．０３（ｓ，１Ｈ），６．８２−６．６３（ｍ，２Ｈ），６．４９（不明瞭に分離したｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ（Ｄ２Ｏと交換可能）），５．９６−５．８２（ｍ，１Ｈ），５．４６（不明瞭に分離したｄｄ，Ｊ＝９．８，４．７Ｈｚ，Ｄ２Ｏ交換後ｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，１Ｈ），５．２７（ｂｒｄ，Ｊ＝１７．１Ｈｚ，１Ｈ），５．２１−５．１０（ｍ，２Ｈ），４．８１（ｂｒｄ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ，１Ｈ），４．５１−４．１７（ｍ，５Ｈ），４．１３−３．８４（ｍ，４Ｈ），３．８４−３．６７（ｍ，２Ｈ），３．７７（ｓ，３Ｈ），３．５５−３．２０（ｍ，６Ｈ（水ピークにより部分的に不明瞭）），２．６６−２．３０（ｍ，６Ｈ（ＤＭＳＯピークにより部分的に不明瞭）），２．２６（ｓ，３Ｈ），２．１０−１．２０（ｍ，１６Ｈ），１．３５（ｓ，９Ｈ）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚＣ６１Ｈ７８ＣｌＮ８Ｏ１４として計算：１１８１．５３２１， ｆｏｕｎｄ ：１１８１．５２８６［ＭＨ＋］；Ｃ６１Ｈ７７ＣｌＮ８ＮａＯ１４として計算：１２０３．５１４０， ｆｏｕｎｄ ：１２０３．５１３０［ＭＮａ＋］；Ｃ６１Ｈ７７ＣｌＫＮ８Ｏ１４として計算：１２１９．４８７９， ｆｏｕｎｄ ：１２１９．４８６１［ＭＫ＋］．
０℃で、窒素雰囲気下で、乾燥ＤＣＭ（１５ｍＬ）中の６５ｊ（６２３ｍｇ，０．５３ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、ピロリジン（０．８６ｍＬ，１０．５ｍｍｏｌ）、続いてＰｄ（Ｐｈ３Ｐ）４（３０ｍｇ，９．８％Ｐｄ）が添加された。添加後、反応混合物は、室温で５時間更に攪拌された。混合物は石油エーテル（１００ｍＬ）で希釈され、室温で３０分間撹拌された。溶媒は、不溶性物質からデカントされ、洗浄工程はＤＣＭ−石油エーテル（１：１０）（１００ｍＬ）で繰り返された。後に残された粘着性の固体はＤＣＭ（２００ｍＬ）に溶解され、水（３×１００ｍＬ）で洗浄され、次いで、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、ベースライン物質を除去するために短いたＳｉＯ２カラムに通された。必要とされる化合物を、ＤＣＭ−ＭｅＯＨ勾配を（２から５％）を用いて溶出した。２５℃（浴温度）で溶媒を蒸発させて、淡黄色固体泡（４７２ｍｇ，８２％）を得て、これが次の工程で直接使用された。この粗アミンは、乾燥ＤＭＡ（８ｍＬ）中でＦｍｏｃ−ｖａｌ−Ｏｓｕ（Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌ−ｖａｌｉｎｅＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル，５５０ｍｇ，１．２６ｍｍｏｌ）により室温で窒素雰囲気下で処理され、混合物は５時間撹拌された。酢酸エチル−石油エーテル（１：１０、１００ｍＬ）が添加され、混合物は室温で２０分間撹拌された。溶媒は不溶性物質からデカントされ、洗浄工程は追加の酢酸エチル−石油エーテル（１：１０、２×５０ｍＬ）で繰り返された。後に残された粘着性の固体は乾燥され、ＳｉＯ２カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ−酢酸エチル−ＭｅＯＨ＝２０：１０：３）により精製され、無色の固体として、（Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサンアミド）ベンジル ８−（６−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−６−オキソヘキシルオキシ）−１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−５−オキソ−２，３，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシレート ６５ｋ（２４６ｍｇ，４７％）を得た；ｍｐ １４３ｏＣ（ｄｅｃ．）；１Ｈ ＮＭＲ［（ＣＤ３）２ＳＯ］δ１０．０３（ｓ，１Ｈ（Ｄ２Ｏと交換可能）），８．２１（ｓ，１Ｈ），８．０５（ｂｒｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ（Ｄ２Ｏと交換可能）），７．９５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．８７（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．８１（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），７．６２−７．２５（ｍ，１０Ｈ，Ｄ２Ｏ交換後９Ｈ），７．１８（不明瞭に分離したｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），７．０４（ｓ，１Ｈ），６．７０（ｂｒ ｓ，２Ｈ，Ｄ２Ｏ交換後１Ｈ），６．５０（ｂｒ ｓ，１Ｈ（Ｄ２Ｏと交換可能）），５．５３−５．４０（ｍ，Ｄ２Ｏ交換後ｄ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，１Ｈ），５．１５（ｂｒｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，１Ｈ），４．８２（ｂｒｄ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ，１Ｈ），４．４６−４．１６（ｍ，７Ｈ），４．０７−３．８５（ｍ，４Ｈ），３．８３−３．６７（ｍ，２Ｈ），３．７６（ｓ，３Ｈ），３．５６−３．２３（ｍ，５Ｈ（水ピークにより部分的に不明瞭）），２．９３−２．７９（ｍ，２Ｈ），２．６４−２．３２（ｍ，６Ｈ（ＤＭＳＯピークにより部分的に不明瞭）），２．２５（ｓ，３Ｈ），２．０９−１．２０（ｍ，１７Ｈ），１．３５（ｓ，９Ｈ），０．８７（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ），０．８３（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚＣ７７Ｈ９３ＣｌＮ９Ｏ１５として計算：１４１８．６４７４， ｆｏｕｎｄ ：１４１８．６４２０［ＭＨ＋］；Ｃ７７Ｈ９２ＣｌＮ９ＮａＯ１５として計算：１４４０．６２９４， ｆｏｕｎｄ ：１４４０．６２３１［ＭＮａ＋］；Ｃ７７Ｈ９２ＣｌＫＮ９Ｏ１５として計算：１４５６．６０３３， ｆｏｕｎｄ ：１４５６．６０２１［ＭＫ＋］．
０℃で、窒素雰囲気下で、乾燥ＤＭＡ（２ｍＬ）中の６５ｋ（２２４ｍｇ，０．１５８ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド中のピペリジンの溶液（ＤＭＡ，１．０ｍｍｏｌ（ｍＬあたり），１．５８ｍＬ，１．５８ｍｍｏｌ）が添加された。図２０を参照。添加後、混合物はこの温度で更に１時間４５分攪拌された。酢酸エチル−石油エーテル（１：５，５０ｍＬ）の混合物が添加され、混合物は０℃で２０分間撹拌された。溶媒層は不溶性物質からデカントされ廃棄された。洗浄工程は、室温で追加の酢酸エチル−石油エーテル（１：５，２ｘ３０ｍＬ）を用いて繰り返された。後に残された淡黄色固体は乾燥され、（Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサンアミド）ベンジル ８−（６−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−６−オキソヘキシルオキシ）−１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−５−オキソ−２，３，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシレート ６５ｌ（１７３ｍｇ，９９％）を得た；ｍｐ ７４ｏＣ（ｄｅｃ．）；１Ｈ ＮＭＲ［（ＣＤ３）２ＳＯ］δ１０．０９（ｓ，１Ｈ（Ｄ２Ｏと交換可能）），８．２１（ｓ，１Ｈ），８．０８（ｂｒ ｓ，１Ｈ（Ｄ２Ｏと交換可能）），７．９６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８１（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６６−７．４２（ｍ，４Ｈ），７．１９（不明瞭に分離したｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．０４（ｓ，１Ｈ），６．７１（ｂｒ ｓ，２Ｈ，Ｄ２Ｏ交換後１Ｈ），６．４９（ｂｒ ｓ，１Ｈ（Ｄ２Ｏと交換可能）），５．５２−５．４０（ｍ，Ｄ２Ｏ交換後ｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ，１Ｈ），５．１６（ｂｒｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ，１Ｈ），４．８１（ｂｒｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，１Ｈ），４．４９−４．１８（ｍ，４Ｈ），４．１０−３．８５（ｍ，３Ｈ），３．８５−３．６７（ｍ，２Ｈ），３．７７（ｓ，３Ｈ），３．５９−３．２２（ｍ，５Ｈ（水ピークにより部分的に不明瞭）），３．０３−２．９７（ｍ，Ｄ２Ｏ交換後ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），２．９１−２．８１（ｍ，２Ｈ），２．７１−２．３３（ｍ，７Ｈ（ＤＭＳＯピークにより部分的に不明瞭）），２．２５（ｓ，３Ｈ），２．１１−１．２０（ｍ，１７Ｈ），１．３４（ｓ，９Ｈ），０．８６（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ），０．７６（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），２Ｈ（観測されず）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚＣ６２Ｈ８３ＣｌＮ９Ｏ１３として計算：１１９６．５７９３， ｆｏｕｎｄ ：１１９６．５８０４［ＭＨ＋］；Ｃ６２Ｈ８２ＣｌＮ９ＮａＯ１３として計算：１２１８．５６１３， ｆｏｕｎｄ ：１２１８．５６１２［ＭＮａ＋］；Ｃ６２Ｈ８２ＣｌＫＮ９Ｏ１３として計算：１２３４．５３５２， ｆｏｕｎｄ ：１２３４．５３５９［ＭＫ＋］．
乾燥ＤＭＡ（６ｍＬ）中の６５ｌ（１７３ｍｇ，０．１５８ｍｍｏｌ）及び２，５−ジオキソピロリジン−１−イル２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノアート（マレイミド−Ｏｓｕ，１２２ｍｇ，０．３９５ｍｍｏｌ）の混合物が、０℃で窒素雰囲気下で、１時間４５分攪拌された。酢酸エチル−石油エーテルの混合物（１：５，５０ｍＬ）が添加され、得られた混合物が０℃で１５分間攪拌された。溶媒層は不溶性物質からデカントされ廃棄された。洗浄工程は、室温で追加の酢酸エチル−石油エーテル（１：５，２ｘ３０ｍＬ）を用いて繰り返された。後に残された固体は乾燥され、シリカカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ−酢酸エチル−ＭｅＯＨ＝２０：１０：３）により精製され、淡黄色の固体として、（Ｓ）−４−（（Ｓ）−６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）ヘキサンアミド）ベンジル ８−（６−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−６−オキソヘキシルオキシ）−１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−５−オキソ−２，３，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシレート ６５ｍ（１５２ｍｇ，６９％）を得た；ＨＰＬＣ：純度９０．６％；ｍｐ １２０ｏＣ；１Ｈ ＮＭＲ［（ＣＤ３）２ＳＯ］δ９．９５（ｓ，Ｄ２Ｏ，１Ｈ（Ｄ２Ｏと交換可能）），８．２１（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ（Ｄ２Ｏと交換可能）），７．９５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８５−７．７３（ｍ，２Ｈ，Ｄ２Ｏ交換後１Ｈ），７．６３−７．５０（ｍ，３Ｈ），７．４６（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），７．１７（不明瞭に分離したｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．０４（ｓ，１Ｈ），６．９８（ｓ，２Ｈ），６．８１−６．６６（ｍ，２Ｈ，Ｄ２Ｏ交換後１Ｈ），６．４９（不明瞭に分離したｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ（Ｄ２Ｏと交換可能）），５．５１−５．４１（ｍ，Ｄ２Ｏ交換後ｄ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，１Ｈ），５．１５（ｄ，Ｊ＝１２．６Ｈｚ，１Ｈ），４．８１（ｂｒｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ，１Ｈ），４．４１（ｔ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，１Ｈ），４．３７−４．２７（ｍ，２Ｈ），４．２７−４．１３（ｍ，２Ｈ），４．１０−３．８５（ｍ，３Ｈ），３．８５−３．６３（ｍ，２Ｈ），３．７７（ｓ，３Ｈ），３．６０−３．２１（ｍ，８Ｈ（水ピークにより部分的に不明瞭），１Ｈ），２．９２−２．８１（ｍ，２Ｈ），２．６７−２．３３（ｍ，６Ｈ（ＤＭＳＯピークにより部分的に不明瞭）），２．２６（ｓ，３Ｈ），２．２３−１．１１（ｍ，２５Ｈ），１．３０（ｓ，９Ｈ），０．８４（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．８１（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚＣ７２Ｈ９４ＣｌＮ１０Ｏ１６として計算：１３８９．６５３２， ｆｏｕｎｄ ：１３８９．６４７８［ＭＨ＋］；Ｃ７２Ｈ９４ＣｌＮ１０ＮａＯ１６として計算：７０６．３２１２， ｆｏｕｎｄ ：７０６．３２４４［ＭＨ＋Ｎａ＋］；Ｃ７２Ｈ９３ＣｌＮ１０Ｎａ２Ｏ１６として計算：７１７．３１２２， ｆｏｕｎｄ ：７１７．３１２１［ＭＮａ＋Ｎａ＋］．
０℃（浴温度）で、ＤＣＭ（０．４ｍＬ）中の６５ｍ（３２．２ｍｇ，０．０２３ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、窒素下で、ＴＦＡ（０．８ｍＬ）が添加され、続いてＴＦＡ中の２％の水の溶液（０．８ｍＬ）が添加された。添加後、混合物は更に８時間この温度で撹拌された。酢酸エチル−石油エーテル（１：５，２５ｍＬ）が添加され、混合物は０℃で１５分間攪拌された。沈殿した固体は回収され、酢酸エチル−石油エーテル（１．５、２×３０ｍｌ）で洗浄され、乾燥させて粗生成物（３０ｍｇ）を得て、これが分取ＨＰＬＣ［ＳｙｎｅｒｇｉＭａｘＲＰカラム；水−ＴＦＡ（ｐＨ＝２．５６；９５％から５５％）／１０％Ｈ２Ｏ（ＣＨ３ＣＮ（５％から４５％）中）；流速：１２ｍＬ／分］により精製され、ガラス状固体として、（Ｓ）−４−（（Ｓ）−６−アミノ−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）ヘキサンアミド）ベンジル ８−（６−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−６−オキソヘキシルオキシ）−１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−５−オキソ−２，３，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシレート ６５をビス−トリフルオロ酢酸塩（２２．２ｍｇ，６４％）として得た；ＨＰＬＣ：純度９７．１％；ｍｐ １１４ｏＣ；［α］Ｄ＋４３．６ｏ（ｃ０．２７５，ＭｅＯＨ）；１Ｈ ＮＭＲ［（ＣＤ３）２ＳＯ］δ９．９７（ｓ，１Ｈ），９．９０（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．７３（ｂｒ ｓ，２Ｈ），８．２７（ｓ，１Ｈ），８．０９（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），８．０４−７．９３（ｍ，２Ｈ），７．８９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．７４−７．５０（ｍ，５Ｈ），７．４６（ｂｒｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．２２（ｍ，２Ｈ），７．０４（ｓ，１Ｈ），７．００（ｓ，２Ｈ），６．７５（ｓ，１Ｈ），６．５１（ｂｒ ｓ，１Ｈ），５．５２−５．４０（ｍ，１Ｈ），５．１８−５．０４（ｍ，１Ｈ），４．９４−４．８２（ｍ，１Ｈ），４．４８−３．７０（ｍ，１４Ｈ），３．４３−３．２０（ｍ，４Ｈ（水ピークにより部分的に不明瞭）），３．１７−３．０５（ｍ，３Ｈ），２．８９（ｓ，３Ｈ），２．８２−２．７０（ｍ，２Ｈ），２．６６−２．４８（ｍ，２Ｈ（ＤＭＳＯピークにより部分的に不明瞭）），２．２５−１．０８（ｍ，２５Ｈ），０．９１−０．７７（ｍ，６Ｈ），２Ｈ（観測されず）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚＣ６７Ｈ８６ＣｌＮ１０Ｏ１４として計算：１２８９．６００８， ｆｏｕｎｄ ：１２８９．５９７５［ＭＨ＋］；Ｃ６７Ｈ８５ＣｌＮ１０ＮａＯ１４として計算：１３１１．５８２７， ｆｏｕｎｄ ：１３１１．５７７２［ＭＮａ＋］；Ｃ６７Ｈ８５ＣｌＮ１０Ｎａ２Ｏ１４として計算：６６７．２８６０， ｆｏｕｎｄ ：６６７．２８７４［ＭＮａ＋Ｎａ＋］；Ｃ６７Ｈ８６ＣｌＮ１０ＮａＯ１４として計算：６５６．２９５０， ｆｏｕｎｄ ：６５６．２９６３［ＭＨ＋Ｎａ＋］；Ｃ６７Ｈ８７ＣｌＮ１０Ｏ１４として計算：６４５．３０４０， ｆｏｕｎｄ ：６４５．３０５２［ＭＨ＋Ｈ＋］．
実施例１６ Ｎ−（３−（２，５−ビス（（Ｅ）−３−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ホスホノキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−３−オキソプロパ−１−エニル）フェニルアミノ）−３−オキソプロピル）−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド ６６
氷浴中で冷却されたＤＣＭ（１５ｍＬ）中の、実施例７の５１ａから調製された（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル５−（ベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ５７ａの溶液（１．５９５ｇ，３．７６ｍｍｏｌ）に、ジオキサン（４０ｍＬ）中の４ＮのＨＣｌが添加された。図２１を参照。混合物は室温まで温められ、２時間攪拌された。全ての揮発性成分は排出された。得られた残留物は、酢酸エチルと５％の冷アンモニア水溶液との間で再分配された。水相を酢酸エチルで３回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、セライトを通して濾過した。溶媒は除去され、茶色のガム状物として、（Ｓ）−５−（ベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール ５７ｂを得て、これが直接使用された； １Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ８．０４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．５３（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．４５−７．３４（ｍ，４Ｈ），７．１４（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），６．６０（ｓ，１Ｈ），５．２４（ｓ，２Ｈ），３．９６−３．９２（ｍ，１Ｈ），３．８４（ｄｄ，Ｊ＝３．４，１０．７Ｈｚ，１Ｈ），３．７０（ｔ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），３．６０（ｄｄ，Ｊ＝２．４，１０．０Ｈｚ，１Ｈ），３．５５（ｔ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，１Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ３２４．１１５０（Ｍ＋Ｈ）．Ｃ２０Ｈ１９ＣｌＮＯ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ３２４．１１５０.
中間体５７ｂは氷浴中で冷却され、ピリジン（１５ｍＬ）、続いてトリフルオロ酢酸無水物（３．１４ｍＬ，２２．５７ｍｍｏｌ）が添加された。得られた混合物は１０分間撹拌され、氷が添加された。混合物は酢酸エチルと水との間で再分配された。水相を酢酸エチルで３回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、セライトを通して濾過した。溶媒は除去され、得られた残留物は、溶離液として酢酸エチルと石油エーテルの混合物（ｖ／ｖ １：１０）を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製され、白色固体として、（Ｓ）−１−（５−（ベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−２，２，２−トリフルオロエタノン ６６ａ（１．１１ｇ，７０％）を得た；ｍｐ １６７−１７０℃．１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８．３７（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），８．０５（ｓ，１Ｈ），７．７２（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６１−７．５４（ｍ，３Ｈ），７．４９−７．４２（ｍ，３Ｈ），７．３９−７．３５（ｍ，１Ｈ），５．３０（ＡＢｑ，Ｊ＝１１．７，１５．７Ｈｚ，２Ｈ），４．６３−４．５９（ｍ，１Ｈ），４．４３−４．３８（ｍ，１Ｈ），４．１５−４．０９（ｍ，１Ｈ），３．９７−３．９３（ｍ，１Ｈ），３．４９（ｄｄ，Ｊ＝９．９，１１．３Ｈｚ，１Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ４４２．０７９９（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ２２Ｈ１７ＣｌＦ３ＮＮａＯ２ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ４４２．０７９５．
−１０℃で、ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の６６ａ（１．１０ｇ，２．６２ｍｍｏｌ）の溶液に、２５％水性ギ酸アンモニウム（２０ｍＬ）、続いてＰｄ−Ｃ触媒（１０％、湿潤、５５０ｍｇ）が添加され、混合物は２時間撹拌され、その後追加のＰｄ−Ｃ触媒（５５０ｍｇ）が添加された。得られた混合物は一晩、−１０℃で撹拌され、触媒はセライトを通して濾過された。ＴＨＦは濾液から除去され、残留物は酢酸エチルと水との間で再分配された。水相を酢酸エチルで３回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、セライトを通して濾過した。溶媒は除去され、得られた残留物は、溶離液として酢酸エチルと石油エーテルの混合物（ｖ／ｖ １：５）を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製され、オフホワイトの固体として、（Ｓ）−１−（１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−２，２，２−トリフルオロエタノン ６６ｂ（７５８ｍｇ，８８％）を得た；ｍｐ ２０９−２１２℃．１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８．３３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．１０（ｓ，１Ｈ），７．８５（ｓ，１Ｈ），７．６４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６０−７．５６（ｍ，１Ｈ），７．５１−７．４７（ｍ，１Ｈ），４．６０−４．５６（ｍ，１Ｈ），４．４１−４．３６（ｍ，１Ｈ），４．００−３．９５（ｍ，１Ｈ），３．９３−３．９０（ｍ，１Ｈ），３．４４（ｄｄ，Ｊ＝９．８，１１．３Ｈｚ，１Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ３５２．０３３１（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ１５Ｈ１１ＣｌＦ３ＮＮａＯ２ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ３５２．０３２３．
ＴＨＦ（１５ｍＬ）中の６６ｂ（２５０ｍｇ，０．７６ｍｍｏｌ）の溶液に、テトラゾール（アセトニトリル中に３％，１３．５ｍＬ，４．５５ｍｍｏｌ）、続いてジ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミジット（１．５１ｍＬ，４．５５ｍｍｏｌ）が添加された。混合物は室温で一晩撹拌され、次いで、氷浴中で冷却され、Ｈ２Ｏ２（３０％水溶液，０．７８ｍＬ，７．５８ｍｍｏｌ）が滴下された。得られた混合物は室温まで温められ、５時間撹拌された。反応物は、氷浴で冷却しながら１０％水性亜硫酸ナトリウムの添加によりクエンチされた。有機揮発性物質はロータリーエバポレーターで除去された。得られた混合物は酢酸エチルと水との間で再分配された。水相を酢酸エチルで３回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、セライトを通して濾過した。溶媒は除去され、得られた残留物は、溶離液として酢酸エチル及び石油エーテルの勾配混合物（ｖ／ｖ １：６から１：３）を用いるＦｌｏｒｉｓｉｌ（登録商標）（ＵＳＳｉｌｉｃａ）カラムクロマトグラフィーにより精製され、無色の油状物として、（Ｓ）−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル １−（クロロメチル）−３−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル リン酸 ６６ｃ（３６７ｍｇ，９３％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ８．４４（ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ，１Ｈ），８．１１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），８．０６（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６９−７．６５（ｍ，１Ｈ），７．６３−７．５９（ｍ，１Ｈ），４．６１−４．５６（ｍ，１Ｈ），４．４６−４．４１（ｍ，１Ｈ），４．１５−４．１２（ｍ，１Ｈ），４．０６−４．００（ｍ，１Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）ｐｐｍ．３１ＰＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ−１５．５４ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ５４４．１２３６（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ２３Ｈ２８ＣｌＦ３ＮＮａＯ５Ｐ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ５４４．１２３８．
氷浴で冷却されたＭｅＯＨ（２ｍＬ）中の６６ｃ（２３９ｍｇ，０．４６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＣｓＣＯ３（２９８ｍｇ，０．９２ｍｍｏｌ）及び数滴の水が添加された。混合物は１時間氷浴中で撹拌され、次いで酢酸エチルと水との間で再分配された。水相を酢酸エチルで３回抽出した。混合された有機抽出物を水及びかん水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、セライトを通して濾過し、溶媒が除去された。得られた残留物は酢酸エチルに溶解され、Ｆｌｏｒｉｓｉｌ（登録商標）（ＵＳＳｉｌｉｃａ）カラムクロマトグラフィーのパッドを通して濾過され、オフホワイトのガム状物として、（Ｓ）−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル １−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル リン酸 ６６ｄ（１８３ｍｇ，９４％）を得て、これが精製せずに次の工程で使用された；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ８．０８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．４６−７．４２（ｍ，１Ｈ），７．２５−７．２１（ｍ，１Ｈ），７．１３（ｄ，Ｊ＝０．８Ｈｚ，１Ｈ），４．００−３．９３（ｍ，１Ｈ），３．８７−３．７８（ｍ，２Ｈ），３．５４−３．４２（ｍ，２Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ）ｐｐｍ．３１ＰＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ−１５．５８ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ４２６．１５８７（Ｍ＋Ｈ）．Ｃ２１Ｈ３０ＣｌＮＯ４Ｐ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ４２６．１５９５．
２，５−ジブロモニトロベンゼン（５．０ｇ，１７．８ｍｍｏｌ）及びアクリル酸ｔ−ブチル（７．７５ｍＬ，５３．４０ｍｍｏｌ）がトリエチルアミン（５０ｍＬ）に溶解された。図２２を参照。フラスコは溶液を通して窒素ガスをバブリングすることにより流され、次いでトリ−ｐ−トリルホスフィン（４３３ｍｇ，１．４２ｍｍｏｌ）及び酢酸パラジウム（８０ｍｇ，０．３６ｍｍｏｌ）が窒素気流下で添加された。混合物は窒素下で一晩還流で撹拌された。トリエチルアミンは排出された。得られた残留物は酢酸エチルに溶解され、シリカゲルのパッドを通して濾過された。濾液は濃縮され、クロマトグラフィーカラムにロードされた。酢酸エチルと石油エーテルの混合物（１：１０）が溶離剤として使用され、白色固体として、（２Ｅ，２’Ｅ）−ｔｅｒｔ−ブチル ３，３’−（２−ニトロ−１，４−フェニレン）ジアクリル酸 ６６ｅ（５．８５ｇ，８８％）を得た；ｍｐ １２３−１２４℃．１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８．１４（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，１Ｈ），７．９９（ｄ，Ｊ＝１５．８Ｈｚ，１Ｈ），７．７４（ｄｄ，Ｊ＝１．７，８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５８（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），６．５０（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３６（ｄ，Ｊ＝１５．８Ｈｚ，１Ｈ），１．５８（ｓ，９Ｈ），１．５６（ｓ，９Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ３９８．１５７４（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ２０Ｈ２５ＮＮａＯ６ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ３９８．１５７４．
氷浴で冷却されたアセトン（４０ｍＬ）中の６６ｅ（５．８５ｇ，１５．５８ｍｍｏｌ）の溶液に、亜鉛粉末（８．１５ｇ，１２５．０ｍｍｏｌ）、続いて水中（２０ｍＬ）のＮＨ４Ｃｌ（３．３３ｇ，６２．３０ｍｍｏｌ）の溶液が添加された。混合物は室温で１時間撹拌された。追加の亜鉛粉末（４．００ｇ）及び水中（１０ｍＬ）の追加のＮＨ４Ｃｌ（１．７ｇ）が添加された。１時間後、酢酸エチル（１００ｍＬ）が添加され、上部の透明な溶液はデカンティングにより回収された。洗浄及びデカンティング工程は更に２回繰り返された。混合された有機溶液を水、続いてかん水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、シリカゲルのパッドを通して濾過した。溶媒が除去され、黄色のガム状物として、（２Ｅ，２’Ｅ）−ｔｅｒｔ−ブチル ３，３’−（２−アミノ−１，４−フェニレン）ジアクリル酸 ６６ｆ（５．４６ｇ，１００％）を得た；ｍｐ ７３−７５℃．１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．６８（ｄ，Ｊ＝１５．８Ｈｚ，１Ｈ），７．４６（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．９２（ｄｄ，Ｊ＝１．５，８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．８１（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，１Ｈ），６．３３（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３１（ｄ，Ｊ＝１５．８Ｈｚ，１Ｈ），３．９９（ｂｒ ｓ，２Ｈ），１．５３（ｓ，９Ｈ），１．５１（ｓ，９Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ３６８．１８３０（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ２０Ｈ２７ＮＮａＯ４ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ３６８．１８３２．
ＤＭＡ（２５ｍＬ）中の６６ｆ（２．７３ｇ，７．９０ｍｍｏｌ），３−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）プロパン酸（Ｆｍｏｃ−ベタ−アラニン，３．６９ｇ，１１．８５ｍｍｏｌ），ＥＤＣＩ塩酸塩（７．５８ｇ，３９．５０ｍｍｏｌ）及びｐ−トルエンスルホン酸（１３６ｍｇ，０．７９ｍｍｏｌ）の混合物は室温で一晩撹拌された。混合物は酢酸エチルと水との間で再分配された。水相を酢酸エチルで３回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、セライトを通して濾過した。溶媒が除去され、白色固体として、（２Ｅ，２’Ｅ）−ｔｅｒｔ−ブチル ３，３’−（２−（３−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）プロパンアミド）−１，４−フェニレン）ジアクリル酸 ６６ｇ（４．８９ｇ，９７％）を得た；ｍｐ １０２−１０５℃．１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．８７（ｓ，１Ｈ），７．７０−７．６６（ｍ，２Ｈ），７．６２−７．５２（ｍ，４Ｈ），７．４４（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．３８−７．３４（ｍ，３Ｈ），７．２９−７．２５（ｍ，２Ｈ），６．４１（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３４（ｄ，Ｊ＝１５．７Ｈｚ，１Ｈ），４．４２（ｂｒ ｓ，２Ｈ），４．１９（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），３．５９（ｂｒ ｓ，２Ｈ），２．６７（ｂｒ ｓ，２Ｈ），１．５３（ｓ，９Ｈ），１．５１（ｓ，９Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）はｍ／ｚ６６１．２８７８（Ｍ＋Ｎａ）を見いだした。Ｃ３８Ｈ４２Ｎ２ＮａＯ７ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ６６１．２８８４．
氷浴で冷却されたＤＣＭ（４ｍＬ）中の６６ｇ（５３０ｍｇ，０．８３ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（１ｍＬ，１２．９８ｍｍｏｌ）が添加された。混合物は室温まで温められ、一晩攪拌され、白色の懸濁液を得た。酢酸エチルが添加され、より多くの固体を沈殿させ、これを濾過により回収し、酢酸エチルと石油エーテルで洗浄し、白色固体として、（２Ｅ，２’Ｅ）−３，３’−（２−（３−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）プロパンアミド）−１，４−フェニレン）ジアクリル酸 ６６ｈ（４０４ｍｇ，９２％）を得た。ｍｐ ２８２℃（ｄｅｃ．）．１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１２．４６（ｂｒ ｓ，１Ｈ），９．９２（ｓ，１Ｈ），７．８９−７．８４（ｍ，３Ｈ），７．７４−７．６８（ｍ，４Ｈ），７．５８−７．５４（ｍ，２Ｈ），７．４４−７．３８（ｍ，３Ｈ），７．３１−７．２８（ｍ，２Ｈ），６．５４（ｄｄ，Ｊ＝３．２，１６．０Ｈｚ，２Ｈ），４．３０（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），４．２２（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），３．３０（ｂｒ ｓ，２Ｈ），２．８３−２．７９（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ５４９．１６４３（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ３０Ｈ２６Ｎ２ＮａＯ７ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ５４９．１６３２．
ＤＭＡ（２ｍＬ）中の６６ｄ（１７８ｍｇ，ｃｒｕｄｅ，ｃａ．０．４２ｍｍｏｌ），６６ｈ（５５ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ），ＥＤＣＩ塩酸塩（１６０ｍｇ，０．８４ｍｍｏｌ）及びｐ−トルエンスルホン酸（１．８ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ）の混合物は室温で一晩撹拌された。混合物は、酢酸エチルと冷希釈ＮａＨＣＯ３水溶液との間で再分配された。水相を酢酸エチルで３回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、セライトを通して濾過した。溶媒は除去され、残留物は、ＭｅＯＨ及び酢酸エチルの勾配混合物（ｖ／ｖ ０．２５−５％）を用いるＦｌｏｒｉｓｉｌ（登録商標）（ＵＳＳｉｌｉｃａ）カラムクロマトグラフィーにより精製され、黄色い固体として、（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル ３−（２，５−ビス（（Ｅ）−３−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−３−オキソプロパ−１−エニル）フェニルアミノ）−３−オキソプロピルカルバメート ６６ｉ（６２ｍｇ，４４％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１０．０４（ｓ，１Ｈ），８．６７（ｓ，２Ｈ），８．１１−８．０５（ｍ，３Ｈ），７．９７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．８８−７．８２（ｍ，４Ｈ），７．７８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７３−７．６７（ｍ，３Ｈ），７．６３−７．５８（ｍ，２Ｈ），７．５３−７．４７（ｍ，３Ｈ），７．３８（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３０−７．２４（ｍ，４Ｈ），４．６０−４．５０（ｍ，４Ｈ），４．４２−４．３５（ｍ，２Ｈ），４．３０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），４．２２（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），４．０６−３．９３（ｍ，４Ｈ），３．４０−３．３３（ｍ，２Ｈ），２．６３−２．５９（ｍ，２Ｈ），１．５０（２×ｓ，１８Ｈ），１．４７（２×ｓ，１８Ｈ）ｐｐｍ．３１ＰＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ−１５．４５ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ１３４１．４６７７（Ｍ＋Ｈ）．Ｃ７２Ｈ８１Ｃｌ２Ｎ４Ｏ１３Ｐ２ ｒｅｑｕｉｒｅｓ １３４１．４６４７．
ＤＭＦ（１ｍＬ）中の６６ｉ（６０ｍｇ，０．０４５ｍｍｏｌ）の溶液に、ピペリジン（４４μＬ，０．４５ｍｍｏｌ）が添加された。混合物は室温で３時間温められ、次いで、全ての揮発性成分が排出された。得られた残留物はエーテル及び石油エーテルの混合物（ｖ／ｖ １：１）で粉砕され、白色固体として、遊離アミン６６ｊ（４４ｍｇ，９６％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ８．６８（ｓ，２Ｈ），８．１１−８．０５（ｍ，３Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．９１−７．８６（ｍ，２Ｈ），７．７８−７．８５（ｍ，１Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，１Ｈ），７．６３−７．５８（ｍ，２Ｈ），７．５１（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，２Ｈ），４．６６−４．５２（ｍ，４Ｈ），４．４４−４．３５（ｍ，２Ｈ），４．０７−３．９５（ｍ，４Ｈ），２．９５（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．５６−２．５０（ｍ，２Ｈ），１．５０−１．４９（ｍ，３６Ｈ）ｐｐｍ．３１ＰＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ−１５．４２，１５．４５ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ１１１９．３９８１（Ｍ＋Ｈ）．Ｃ５７Ｈ７１Ｃｌ２Ｎ４Ｏ１１Ｐ２ ｒｅｑｕｉｒｅｓ １１１９．３９６６．
ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中の５９ａ（４０ｍｇ，０．０３６ｍｍｏｌ）、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル ６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸（ＳｕＯＭＣ，１２ｍｇ，０．０３７ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（６．８μＬ，０．０３９ｍｍｏｌ）の混合物は一晩室温で攪拌され、全ての揮発性成分は排出された。得られた残留物はエーテルで粉砕され、黄色い固体として、ビス （ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスファート） Ｎ−（３−（２，５−ビス（（Ｅ）−３−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−３−オキソプロパ−１−エニル）フェニルアミノ）−３−オキソプロピル）−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド ６６ｋ（３２ｍｇ，６７％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１０．０２（ｓ，１Ｈ），８．６７（ｓ，２Ｈ），８．１１−８．０５（ｍ，３Ｈ），７．９８−７．９２（ｍ，３Ｈ），７．８５−７．７５（ｍ，２Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，１Ｈ），７．６３−７．５８（ｍ，２Ｈ），７．５１（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．２６（ｄｄ，Ｊ＝４．４，１５．４Ｈｚ，２Ｈ），６．９６（ｓ，２Ｈ），４．６６−４．５２（ｍ，４Ｈ），４．４４−４．３５（ｍ，２Ｈ），４．０７−３．９５（ｍ，４Ｈ），３．４５−３．３０（ｍ，４Ｈ），２．５２−２．５０（ｍ，２Ｈ），２．０８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．５０−１．４０（ｍ，４０Ｈ），１．３３−１．２５（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ．３１ＰＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ−１５．４２，１５．４５ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ１３３４．４５１５（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ６７Ｈ８１Ｃｌ２Ｎ５ＮａＯ１４Ｐ２ ｒｅｑｕｉｒｅｓ １３３４．４５２５．
氷浴で冷却されたＤＣＭ（１ｍＬ）中の６６ｋ（３０ｍｇ，０．０２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（１ｍＬ，１２．９８ｍｍｏｌ）が添加された。混合物は室温まで温められ、３時間攪拌された。全ての揮発成分は排出され、得られた残留物は酢酸エチルで粉砕され、黄色い固体として、Ｎ−（３−（２，５−ビス（（Ｅ）−３−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ホスホノキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−３−オキソプロパ−１−エニル）フェニルアミノ）−３−オキソプロピル）−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド ６６（２０ｍｇ，８０％，ＨＰＬＣ純度９５％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．５９（ｓ，２Ｈ），８．１６−８．０８（ｍ，３Ｈ），７．９７−７．９０（ｍ，３Ｈ），７．８８−７．７３（ｍ，２Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝１４．５Ｈｚ，１Ｈ），７．６１−７．５５（ｍ，２Ｈ），７．４６（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），７．２９−７．２４（ｄ，Ｊ＝１４．０Ｈｚ，２Ｈ），６．９７（ｓ，２Ｈ），４．６２−４．５２（ｍ，３Ｈ），４．４０−４．３０（ｍ，３Ｈ），４．０５−３．９０（ｍ，４Ｈ），３．４３−３．３７（ｍ，２Ｈ），３．２４−３．１８（ｍ，２Ｈ），２．６１−２．５５（ｍ，２Ｈ），２．０８（ｂｒ ｓ，２Ｈ），１．５４−１．４４（ｍ，４Ｈ），１．２７−１．１５（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ．３１ＰＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ−５．８１ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩｎｅｇａｔｉｖｅ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ１０８６．２０６７（Ｍ−Ｈ）．Ｃ５１Ｈ４８Ｃｌ２Ｎ５Ｏ１４Ｐ２ ｒｅｑｕｉｒｅｓ １０８６．２０５６．
実施例１７ Ｎ−（３−（２，５−ビス（（Ｅ）−３−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−３−オキソプロパ−１−エニル）フェニルアミノ）−３−オキソプロピル）−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド ６７
ＤＣＭ（３０ｍＬ）中の（２Ｅ，２’Ｅ）−ｔｅｒｔ−ブチル３，３’−（２−（３−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）プロパンアミド）−１，４−フェニレン）ジアクリル酸 ６６ｇ（４．８９ｇ，７．６６ｍｍｏｌ）の溶液に、ピペリジン（４．５ｍＬ，４５．５０ｍｍｏｌ）が添加された。図２３を参照。混合物は室温で５時間温められ、次いで、全ての揮発性成分がロータリーエバポレーターによって除去された。溶離液として酢酸エチル、次いでＴＥＡ，ＭｅＯＨ、酢酸エチル（ｖ／ｖ １：１０：１００）の混合物を使用するカラムクロマトグラフィーにより、白色固体として、（２Ｅ，２’Ｅ）−ｔｅｒｔ−ブチル３，３’−（２−（３−アミノプロパンアミド）−１，４−フェニレン）ジアクリル酸 ６７ａ（２．３３ｇ，７３％）を得た。ｍｐ ６２−６３℃．１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１１．０４（ｓ，１Ｈ），８．３２（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，１Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝１５．７Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝１６．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２４（ｄｄ，Ｊ＝１．５，８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．４２（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３４（ｄ，Ｊ＝１５．７Ｈｚ，１Ｈ），３．１８（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），２．５２（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），１．５３（ｓ，１８Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ４１７．２３９４（Ｍ＋Ｈ）．Ｃ２３Ｈ３３Ｎ２Ｏ５ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ４１７．２３８４．
ＤＭＳＯ（１０ｍＬ）中の６７ａ（１．００ｇ，２．４０ｍｍｏｌ）、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル ６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸（ＳｕＯＭＣ，７４０ｍｇ，２．４０ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（４６０μＬ，２．６４ｍｍｏｌ）の混合物は一晩室温で攪拌された。全ての揮発性成分排出された。得られた残留物は、溶離液として酢酸エチルと石油エーテルの混合物（ｖ／ｖ ２：１）、続いて酢酸エチルを単独でを用いるカラムクロマトグラフィーにより精製され、白色固体として、（２Ｅ，２’Ｅ）−ｔｅｒｔ−ブチル ３，３’−（２−（３−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）プロパンアミド）−１，４−フェニレン）ジアクリル酸 ６７ｂ（１．００ｇ，６８％）を得た。ｍｐ ６９−７２℃．１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．９５（ｓ，１Ｈ），７．７３（ｓ，１Ｈ），７．６５（ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，１Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．５３（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．６９（ｂｒ ｓ，１Ｈ），６．６４（ｓ，２Ｈ），６．３９（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３８（ｄ，Ｊ＝１５．８Ｈｚ，１Ｈ），３．６８−３．６３（ｍ，２Ｈ），３．４３（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），２．６９（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），２．２１（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），１．６７−１．５０（ｍ，４Ｈ），１．５３（ｓ，９Ｈ），１．５２（ｓ，９Ｈ），１．３１−１．２４（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ６３２．２９３１（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ３３Ｈ４３Ｎ３ＮａＯ８ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ６３２．２９４２．
氷浴で冷却されたＤＣＭ（４ｍＬ）中の６７ｂ（５００ｍｇ，０．８２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（２ｍＬ）が滴下して添加された。混合物は室温まで温められ、４時間攪拌された。全ての揮発性成分は排出された後に、得られた残留物は酢酸エチルで粉砕され、白色固体として、（２Ｅ，２’Ｅ）−３，３’−（２−（３−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）プロパンアミド）−１，４−フェニレン）ジアクリル酸 ６７ｃ（３８０ｍｇ，９３％）を得た。ｍｐ ２５７−２６１℃．１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１２．４７（ｓ，２Ｈ），９．９０（ｓ，１Ｈ），７．８９−７．８３（ｍ，２Ｈ），７．７１−７．６７（ｍ，２Ｈ），７．５７−７．５３（ｍ，２Ｈ），６．９９（ｓ，２Ｈ），６．５３（ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，２Ｈ），３．３６−３．３０（ｍ，４Ｈ），２．５４−２．５０（ｍ，２Ｈ），２．０６（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），１．５２−１．４２（ｍ，４Ｈ），１．２２−１．１７（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ５２０．１６８３（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ２５Ｈ２７Ｎ３ＮａＯ８ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ５２０．１６９０．
氷浴中で冷却されたＤＣＭ（５ｍＬ）中の、実施例７の５１ａから調製された（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート５１ａ（２９８ｍｇ，０．８９ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン（１０ｍＬ）中の４ＮのＨＣｌが添加された。混合物は室温まで温められ、３時間撹拌された。全ての揮発性成分は排出され、塩酸塩として、（Ｓ）−１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−オール６７ｄが得られ、６７ｃ（１８５ｍｇ，０．３７ｍｍｏｌ），ＥＤＣＩ塩酸塩（４２８ｍｇ，２．２３ｍｍｏｌ），ｐ−トルエンスルホン酸（６ｍｇ，０．０３７ｍｍｏｌ）及びＤＭＡ（５ｍＬ）が添加された。混合物が室温で６時間撹拌された後、追加のＥＤＣＩ塩酸塩（２８５ｍｇ，１．４９ｍｍｏｌ）及びｐ−トルエンスルホン酸（６ｍｇ，０．０３７ｍｍｏｌ）が添加された。混合物は一晩攪拌され、次いで酢酸エチルと水との間で再分配された。水相を酢酸エチルで３回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、セライトを通して濾過した。溶媒は除去され、得られた残留物は溶離液としてＭｅＯＨ及び酢酸エチルの勾配混合物（ｖ／ｖ １−１５％）を使用するカラムクロマトグラフィーにより更に精製され、黄色い固体として、６７（１６０ｍｇ，４６％，ＨＰＬＣ純度９６％）を得た；ｍｐ ２３０−２３４℃（ｄｅｃ）．１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１０．４３（ｓ，１Ｈ），１０．４０（ｓ，１Ｈ），１０．００（ｓ，１Ｈ），８．１４−８．０８（ｍ，５Ｈ），７．９５（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．８３−７．７５（ｍ，５Ｈ），７．６８（ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ，１Ｈ），７．５２（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３５（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．２８−７．２３（ｄｄ，Ｊ＝５．２，１５．２Ｈｚ，２Ｈ），６．９５（ｓ，２Ｈ），４．５８−４．４５（ｍ，４Ｈ），４．２９−４．２０（ｍ，２Ｈ），４．０４−３．９７（ｍ，２Ｈ），３．８８−３．８０（ｍ，２Ｈ），３．４３−３．３７（ｍ，２Ｈ），３．２３（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），２．６０−２．５６（ｍ，２Ｈ），２．０９（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．５０−１．４０（ｍ，２Ｈ），１．４０−１．３０（ｍ，２Ｈ），１．２４−１．１４（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）はｍ／ｚ９５０．２６７２（Ｍ＋Ｎａ）を見いだした。Ｃ５１Ｈ４７Ｃｌ２Ｎ５ＮａＯ８ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ９５０．２６９４．
実施例１８ （Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（（Ｅ）−３−（４−（（Ｅ）−３−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−３−オキソプロパ−１−エニル）−２−（３−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）プロパンアミド）フェニル）アクリロイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル 二水素リン酸塩 ６８
氷浴中で冷却されたＭｅＯＨ及び酢酸エチル（１ｍＬ）中の（Ｓ）−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル １−（クロロメチル）−３−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル−リン酸 ６６ｃ（１２５ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＣｓＣＯ３（２９８ｍｇ，０．９２ｍｍｏｌ）及び数滴の水が添加された。混合物は１時間氷浴中で撹拌され、次いで酢酸エチルと水との間で再分配された。水相を酢酸エチルで３回抽出した。混合された有機抽出物を水及びかん水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、セライトを通して濾過し、溶媒が除去された。得られた残留物は酢酸エチルに溶解され、Ｆｌｏｒｉｓｉｌ（登録商標）（ＵＳＳｉｌｉｃａ）のパッドを通して濾過された。溶媒を除去するとオフホワイトのガム状物として、（Ｓ）−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル １−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル リン酸 ６６ｄが得られ、これが精製せずに次の工程で使用された。
氷浴中で冷却されたＤＣＭ（２ｍＬ）中の、実施例７の５１ａから調製された（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル １−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−カルボキシレート ５１ａ（８０ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン（４ｍＬ）中の４ＮのＨＣｌが添加された。混合物は室温まで温められ、２時間撹拌された。全ての揮発性成分は排出され、（Ｓ）−１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−オール ６７ｄは直接使用された。
塩−氷浴中（−１０℃）で冷却されたＤＭＡ（２ｍＬ）中の６６ｄ及び６７ｄの溶液（各々は上記のように調製）に、（２Ｅ，２’Ｅ）−３，３’−（２−（３−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）プロパンアミド）−１，４−フェニレン）ジアクリル酸 ６７ｃ（１１９ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）、次いでＥＤＣＩ塩酸塩（２７６ｍｇ，１．４４ｍｍｏｌ）及びｐ−トルエンスルホン酸（４ｍｇ，０．０２４ｍｍｏｌ）が添加された。混合物は室温まで温められ、一晩攪拌され、その後、氷上に注がれた。得られた沈殿物は濾過により回収され、水で洗浄され、真空下で乾燥された。ＭｅＯＨ及びＤＣＭの勾配混合物（ｖ／ｖ ２−１０％）を使用するＦｌｏｒｉｓｉｌ（登録商標）（ＵＳＳｉｌｉｃａ）クロマトグラフィーカラムによる精製により黄色い固体（５０ｍｇ）が得られ、これはＬＣ−ＭＳにより、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（（Ｅ）−３−（４−（（Ｅ）−３−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−３−オキソプロパ−１−エン−１−イル）−２−（３−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）プロパンアミド）フェニル）アクリロイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル）リン酸 ６８ａ及びジ−ｔｅｒｔ−ブチル（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（（Ｅ）−３−（４−（（Ｅ）−３−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−３−オキソプロパ−１−エン−１−イル）−３−（３−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）プロパンアミド）フェニル）アクリロイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル）リン酸６８ｂ（ＨＰＬＣによりそれぞれ２０％及び２３％）、６７（ＨＰＬＣにより４４％）、及び６６（ＨＰＬＣにより８％）の混合物として同定された。混合物は分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ−ＭＡＸ（登録商標）ＲＰ４μ、２５０×２１．２０ｍｍ；移動相：Ａ／Ｂ＝２５％から０％まで（Ａ：ギ酸アンモニウムｐＨ３．４５、Ｂ：水中の９０％のアセトニトリル）：流速１２ｍＬ／分、勾配法；波長：２５４ｎｍ、３２５ｎｍ）により更に精製され、黄色い固体として、６８ａ及び６８ｂの混合物（１８ｍｇ，８％）を得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）はｍ／ｚ１１４２．３５７７（Ｍ＋Ｎａ）を見いだした。Ｃ５９Ｈ６４Ｃｌ２Ｎ５ＮａＯ１１Ｐ ｒｅｑｕｉｒｅｓ １１４２．３６０９．
氷浴で冷却されたＤＣＭ（０．５ｍＬ）中の６８ａと６８ｂ（１７ｍｇ，０．０１５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（０．５ｍＬ）が滴下して添加された。混合物は室温まで温められ、３時間攪拌された。全ての揮発性成分は排出された。得られた残留物は酢酸エチルで粉砕され、オレンジ色の固体として、（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（（Ｅ）−３−（４−（（Ｅ）−３−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−３−オキソプロパ−１−エニル）−２−（３−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）プロパンアミド）フェニル）アクリロイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル 二水素リン酸塩 ６８及びリン酸位置異性体、（Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（（Ｅ）−３−（４−（（Ｅ）−３−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−３−オキソプロパ−１−エニル）−３−（３−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）プロパンアミド）フェニル）アクリロイル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル 二水素リン酸塩 ６８ｃの混合物を得た（１１ｍｇ，７２％，ＨＰＬＣ純度：９５％，異性体の比率は１：１）。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１０．４５（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．５８（ｓ，１Ｈ），８．１５−７．２３（ｍ，１７Ｈ），６．９５（ｓ，２Ｈ），４．６０−３．８０（ｍ，１０Ｈ），３．４３−３．３７（ｍ，２Ｈ），３．２７−３．１８（ｍ，２Ｈ），２．６０−２．５０（ｍ，２Ｈ），２．１０−２．００（ｍ，２Ｈ），１．５５−１．３５（ｍ，４Ｈ），１．２０−１．１０（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ．３１ＰＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ−５．８１ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩｎｅｇａｔｉｖｅ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ１００６．２３９４（Ｍ−Ｈ）．Ｃ５１Ｈ４７Ｃｌ２Ｎ５Ｏ１１Ｐ ｒｅｑｕｉｒｅｓ １００６．２３９２．
実施例２３ Ｎ−（３−（２，５−ビス（（Ｅ）−３−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−３−オキソプロパ−１−エニル）フェニルアミノ）−３−オキソプロピル）−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド（化合物第６９号、表４、図３７）
ＤＭＡ（２ｍＬ）中の１（新たに上記の手順により作製）の１９２ｍｇ（０．５３ｍｍｏｌ）に、２（１００ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ），ＥＤＣＩ塩酸塩（２３１ｍｇ，１．２１ｍｍｏｌ）及びｐ−トルエンスルホン酸（３．５ｍｇ，０．０２０ｍｍｏｌ）が添加された。混合物は一晩撹拌され、次いでアンモニア水と氷の混合物に注がれた。得られた沈殿物は濾過により回収され、水で洗浄され、乾燥され、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製された。ＭｅＯＨ及びＤＣＭの反応混合物（ｖ／ｖ １−１５％）が溶離液として使用され、黄色い固体として、Ｎ−（３−（２，５−ビス（（Ｅ）−３−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニルオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−３−オキソプロパ−１−エニル）フェニルアミノ）−３−オキソプロピル）−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド（３０ｍｇ，１３％，ＨＰＬＣ純度９６％）を得た。ｍｐ ２６８℃（ｄｅｃ）．１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８．６０（ｓ，１Ｈ），８．４６（ｓ，１Ｈ），８．４２（ｓ，１Ｈ），７．８７−７．８４（ｍ，３Ｈ），７．７５−７．６０（ｍ，５Ｈ），７．４０−７．３３（ｍ，５Ｈ），７．２２（ｂｒ ｓ，１Ｈ），６．７７（ｔ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，２Ｈ），６．５６（ｓ，２Ｈ），４．４６−４．４０（ｍ，２Ｈ），４．３０−４．２５（ｍ，２Ｈ），４．１１−４．００（ｍ，２Ｈ），３．９５−３．９０（ｍ，７Ｈ），３．６８（明らかなｓ，６Ｈ），３．５３−３．４６（ｍ，３Ｈ），３．３８（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），２．７３（明らかなｓ，２Ｈ），２．５９−２．５５（ｍ，８Ｈ），２．４２（ｓ，６Ｈ），２．２８（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），１．５６−１．４９（ｍ，２Ｈ），１．３１−１．２３（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ１１８０．４４１６（Ｍ＋Ｈ）．Ｃ６３Ｈ６８Ｃｌ２Ｎ９Ｏ１０ ｒｅｑｕｉｒｅｓ １１８０．４４１６．
実施例２４ ２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロピル２，５−ビス（（Ｅ）−３−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（ホスホノオキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−３−オキソプロパ−１−エニル）フェニルカルバメート（表４、化合物番号７２、図３８）
１（新たに上記の手順により作製）の２０７ｍｇ（０．４９ｍｍｏｌ）に、２（７０ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ），ＥＤＣＩ塩酸塩（２３３ｍｇ，１．２２ｍｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸（３ｍｇ，０．０１５ｍｍｏｌ）及びＤＭＡ（０．５ｍＬ）が添加された。混合物を一晩撹拌した後、ＤＭＡのほとんどが真空下で除去され、残留物は酢酸エチルと水との間で再分配された。水相を酢酸エチルで３回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、セライトのパッドを通して濾過した。溶媒が除去され、得られた残留物は最小限のＤＣＭに溶解され、ヘプタンを添加することによって沈殿させ、粗生成物（１５６ｍｇ）が得られ、これは更に分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ−ＭａｘＲＰ４μ、２５０×２１．２０ｍｍ；移動相：Ａ／Ｂ＝２５％から１％まで（Ａ：ギ酸アンモニウムｐＨ３．４５、Ｂ：水中の９０％のアセトニトリル）：流速１２ｍＬ／分、勾配法；波長：２５４ｎｍ、３２５ｎｍ）により精製され、黄色い固体として、３（７８ｍｇ，４０％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ９．６７（ｓ，１Ｈ），８．６７（ｓ，２Ｈ），８．４３（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，１Ｈ），８．１１−８．０６（ｍ，３Ｈ），７．９７（明らかなｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．９２（ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，１Ｈ），７．８４−７．７６（ｍ，３Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，２Ｈ），７．６１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．５１（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．２８（ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，１Ｈ），７．２７（ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，１Ｈ），７．２３−７．１９（ｍ，１Ｈ），４．６２−４．５３（ｍ，４Ｈ），４．４３−４．３７（ｍ，２Ｈ），４．２３−４．１３（ｍ，２Ｈ），４．０５−３．９５（ｍ，４Ｈ），３．４２−３．３７（ｍ，１Ｈ），１．５１（ｓ，９Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ），１．３４（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ．３１ＰＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ−１５．４６（ｓ）ａｎｄ−１５．４８（ｓ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ１２９７．３４７１（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ６３Ｈ７４Ｃｌ２Ｎ４ＮａＯ１２Ｐ２Ｓ２ ｒｅｑｕｉｒｅｓ １２９７．３４８９．
氷浴で冷却されたＤＣＭ（２ｍＬ）中の３（６０ｍｇ，０．０４７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（１ｍＬ，６．４９ｍｍｏｌ）が添加された。混合物は室温まで温められ、３時間攪拌された。全ての揮発成分は排出され、得られた残留物は酢酸エチルで粉砕され、黄色い固体として、４（４９ｍｇ，９９％，ＨＰＬＣ純度１００％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ９．６５（ｓ，１Ｈ），８．５９（ｓ，２Ｈ），８．４６−８．４４（ｍ，１Ｈ），８．１５−８．０８（ｍ，３Ｈ），７．９６−７．９０（ｍ，３Ｈ），７．８２−７．７０（ｍ，３Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ），７．５９（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），７．４８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．３１−７．２２（ｍ，３Ｈ），５．７５（ｓ，１Ｈ），４．６４−４．５３（ｍ，４Ｈ），４．４０−４．３３（ｍ，３Ｈ），４．２５−４．１５（ｍ，３Ｈ），４．０６−３．９３（ｍ，３Ｈ），１．３５−１．３２（ｍ，３Ｈ）ｐｐｍ．３１ＰＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ−５．９５（ｓ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ１０７３．０９４９（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ４７Ｈ４２Ｃｌ２Ｎ４ＮａＯ１２Ｐ２Ｓ２ ｒｅｑｕｉｒｅｓ １０７３．０９８５．
実施例２５ ［（１Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−［（Ｅ）−３−［４−［（Ｅ）−３−［（１Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ホスホノオキシ−１，２−ジヒドロベンゾ［ｅ］インドール−３−イル］−３−オキソ−プロパ−１−エニル］−２−［２−［２−（２，５−ジオキソピロール−１−イル）エトキシ］エトキシ］フェニル］プロパ−２−エノイル］−１，２−ジヒドロベンゾ［ｅ］インドール−５−イル］二水素リン酸塩（化合物番号７８、表４、図３９）
中間体３
１（新たに上記の手順により作製）の７６ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）に、２（１８ｍｇ，０．０４５ｍｍｏｌ），ＥＤＣＩ塩酸塩（６９ｍｇ，０．３６ｍｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸（０．８ｍｇ，０．００５ｍｍｏｌ）及びＤＭＡ（０．２５ｍＬ）が添加された。混合物を一晩撹拌した後、ＤＭＡのほとんどが真空下で除去され、残留物は酢酸エチルと水との間で再分配された。水相を酢酸エチルで３回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、セライトのパッドを通して濾過した。溶媒が除去され、得られた残留物は最小限のＤＣＭに溶解され、ヘプタンを添加することによって沈殿させ、粗生成物（５４ｍｇ）が得られ、これは更に分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ−ＭａｘＲＰ４μ，２５０×２１．２０ｍｍ；移動相：Ａ／Ｂ＝２０％から１％まで（Ａ：ギ酸アンモニウムｐＨ３．４５、Ｂ：水中の９０％のアセトニトリル）：流速１２ｍＬ／分、勾配法；波長：２５４ｎｍ、３２５ｎｍ）により精製され、黄色い固体として、３（１７ｍｇ，３０％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８．７２（ｂｒ ｓ，２Ｈ），８．２３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．９６（ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ，１Ｈ），７．８３（ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，１Ｈ），７．７１（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．５４−７．５０（ｍ，３Ｈ），７．４２−７．３９（ｍ，２Ｈ），７．２６−７．１２（ｍ，３Ｈ），６．９５−６．８８（ｍ，１Ｈ），６．６７（ｓ，２Ｈ），４．５７−４．５２（ｍ，２Ｈ），４．４７−４．３８（ｍ，２Ｈ），４．２８−４．２４（ｍ，２Ｈ），４．１６−４．０９（ｍ，２Ｈ），４．００−３．９４（ｍ，４Ｈ），３．７８（明らかなｓ，４Ｈ），３．５５−．３４８（ｍ，２Ｈ），１．５７（ｓ，３６Ｈ）ｐｐｍ．３１ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ−１５．６４（ｓ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ１２３８．３８６２（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ６２Ｈ７３Ｃｌ２Ｎ３ＮａＯ１４Ｐ２ ｒｅｑｕｉｒｅｓ １２３８．３８３７．
氷浴で冷却されたＤＣＭ（１ｍＬ）中の３（１６ｍｇ，０．０１３ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（０．５ｍＬ，３．２４ｍｍｏｌ）が添加された。混合物は室温まで温められ、３時間攪拌された。全ての揮発性成分は排出され、得られた残留物は酢酸エチルで粉砕され、黄色い固体として、化合物７８（１３ｍｇ，１００％，ＨＰＬＣ純度１００％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ８．６０（ｓ，２Ｈ），８．１２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．９５−７．８７（ｍ，４Ｈ），７．７２（ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ，１Ｈ），７．６１−７．５７（ｍ，２Ｈ），７．５３−７．４５（ｍ，４Ｈ），７．３８−７．３２（ｍ，２Ｈ），６．９７（ｓ，２Ｈ），４．６０−４．４８（ｍ，４Ｈ），４．３０−４．２８（ｍ，４Ｈ），４．０８−３．８８（ｍ，６Ｈ），３．６８−３．５８（ｍ，４Ｈ）．３１ＰＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ−５．９４（ｓ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ１０１４．１３０１（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ４６Ｈ４１Ｃｌ２Ｎ３ＮａＯ１４Ｐ２ ｒｅｑｕｉｒｅｓ １０１４．１３３３．
実施例２６ ［（１Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−［（Ｅ）−３−［４−［（Ｅ）−３−［（１Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ホスホノオキシ−１，２−ジヒドロベンゾ［ｅ］インドール−３−イル］−３−オキソ−プロパ−１−エニル］−２−［２−（２，５−ジオキソピロール−１−イル）エトキシ］フェニル］プロパ−２−エノイル］−１，２−ジヒドロベンゾ［ｅ］インドール−５−イル］二水素リン酸塩（化合物番号７９、表４、図４０）
中間体３
１（新たに上記の手順により作製）の５２ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）に、２（１１ｍｇ，０．０３１ｍｍｏｌ），ＥＤＣＩ塩酸塩（３５ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸（０．５ｍｇ，０．００３ｍｍｏｌ）及びＤＭＡ（０．２５ｍＬ）が添加された。混合物を一晩撹拌した後、ＤＭＡのほとんどが真空下で除去され、残留物は酢酸エチルと水との間で再分配された。水相を酢酸エチルで３回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、セライトのパッドを通して濾過した。溶媒が除去され、得られた残留物は最小限のＤＣＭに溶解され、ヘプタンを添加することによって沈殿させ、粗生成物（７１ｍｇ）が得られ、これは更に分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ−ＭａｘＲＰ４μ，２５０×２１．２０ｍｍ；移動相：Ａ／Ｂ＝２０％から１％まで（Ａ：ギ酸アンモニウムｐＨ３．４５、Ｂ：水中の９０％のアセトニトリル）：流速１２ｍＬ／分、勾配法；波長：２５４ｎｍ、３００ｎｍ）により精製され、黄色い固体として、３（１５ｍｇ，４２％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８．７１（ｂｒ ｓ，２Ｈ），８．２５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．９５（ｄ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，１Ｈ），７．８３（ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．６０−７．５２（ｍ，３Ｈ），７．４６−７．４０（ｍ，２Ｈ），７．２８−７．２０（ｍ，２Ｈ），７．１３−６．９９（ｍ，２Ｈ），６．７８（ｓ，２Ｈ），４．６４−４．６０（ｍ，２Ｈ），４．５１−４．４５（ｍ，２Ｈ），４．３８−４．３２（ｍ，２Ｈ），４．１５−４．０５（ｍ，４Ｈ），４．００−３．９５（ｍ，２Ｈ），３．５７−３．４９（ｍ，２Ｈ），１．５８（ｓ，３６Ｈ）ｐｐｍ．３１ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ−１５．６７（ｓ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ１１９４．３６０６（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ６０Ｈ６９Ｃｌ２Ｎ３ＮａＯ１３Ｐ２ ｒｅｑｕｉｒｅｓ １１９４．３５７５．
化合物番号７９
氷浴で冷却されたＤＣＭ（０．５ｍＬ）中の３（１３ｍｇ，０．０１１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（０．２ｍＬ，１．３０ｍｍｏｌ）が添加された。混合物は室温まで温められ、０．５時間攪拌された。ジエチルエーテルが添加され、沈殿物を得て、これは濾過され、酢酸エチルで洗浄され、黄色い固体として、４（化合物番号７９）（８．４ｍｇ，８０％，ＨＰＬＣ純度９０％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ８．５９（ｓ，２Ｈ），８．１３（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．９７−７．８２（ｍ，４Ｈ），７．７１（ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ，１Ｈ），７．６０−７．５２（ｍ，３Ｈ），７．４９−７．４４（ｍ，３Ｈ），７．３５−７．２４（ｍ，２Ｈ），７．０８（ｓ，２Ｈ），４．６５−４．５０（ｍ，４Ｈ），４．４０−４．３０（ｍ，４Ｈ），４．０５−３．９０（ｍ，６Ｈ）．３１ＰＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ−５．８１（ｓ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ９７０．１０３６（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ４４Ｈ３７Ｃｌ２Ｎ３ＮａＯ１３Ｐ２ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ９７０．１０７１．
実施例２７ ２−（２−ピリジルジスルファニル）プロピル−Ｎ−［１−（クロロメチル）−３−［５−［１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロベンゾ［ｅ］インドール−３−イル］−５−オキソ−ペンタノイル］−１，２−ジヒドロベンゾ［ｅ］インドール−５−イル］カルバメート（化合物番号８０、表４、図４１）
乾燥ＤＭＡ（２ｍＬ）中の６２ｃ（（３１．０ｍｇ，０．０６７４ｍｍｏｌ，新たに上記の手順により作製）、５３ｈ（２３．０ｍｇ，０．０６７４ｍｍｏｌ，新たに上記の手順により作製）、ＥＤＣＩ．ＨＣｌ（３８．７ｍｇ，０．２０２ｍｍｏｌ）及びＴｓＯＨ（２．３ｍｇ，０．０１３５ｍｍｏｌ）の混合物は、窒素下で、室温で一晩攪拌された。１８時間後、反応混合物はＥｔＯＡｃ及びＨ２Ｏで希釈され、良く混合された。この層は分離され、有機層をＨ２Ｏ（３×）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒を真空下で除去した。粗生成物はＤＣＭ：ＭｅＯＨ１００：０から９８：２を使用するシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより精製され、続いてジイソプロピルエーテルで粉砕され、クリーム色の固体として、化合物１（化合物番号８０、２６．０ｍｇ、４９％，ＨＰＬＣ純度：９５．２％）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）１０．３６（ｓ，１Ｈ），９．６９（ｓ，１Ｈ），８．５６（ｓ，１Ｈ），８．４４（ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，１Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），８．０２−８．００（ｍ，２Ｈ），７．９２（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．８５−７．７７（ｍ，３Ｈ），７．５７−７．５３（ｍ，１Ｈ），７．５１−７．４７（ｍ，１Ｈ），７．４５−７．４１（ｍ，１Ｈ），７．３４−７．３０（ｍ，１Ｈ），７．２４−７．２１（ｍ，１Ｈ），４．４２−４．２９（ｍ，３Ｈ），４．２５−４．１３（ｍ，５Ｈ），４．０５−３．９７（ｍ，２Ｈ），３．９１（ｄｄ，Ｊ＝１１，７．２Ｈｚ，１Ｈ），３．７９（ｄｄ，Ｊ＝１１，８．３Ｈｚ，１Ｈ），３．４３−３．３６（ｍ，１Ｈ），２．７７−２．５６（ｍ，４Ｈ），２．０１−１．９３（ｍ，２Ｈ），１．３４（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）．ＨＲＭＳｍ／ｚ８１１．１５４２［（Ｍ＋Ｎａ）＋，Ｃ４０Ｈ３８Ｃｌ２Ｎ４ＮａＯ５Ｓ２として計算：８１１．１５５３］．
実施例２８ ２−（２−ピリジルジスルファニル）プロピル ３−［６−［１−（クロロメチル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）オキシ−１，２−ジヒドロベンゾ［ｅ］インドール−３−イル］−６−オキソ−ヘキソキシ］−６−ヒドロキシ−２−メトキシ−１１−オキソ−６ａ，７，８，９−テトラヒドロ−６Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−カルボキシレート，及び２−（２−ピリジルジスルファニル）プロピル ３−［６−［１−（クロロメチル）−５−ホスホノオキシ−１，２−ジヒドロベンゾ［ｅ］インドール−３−イル］−６−オキソ−ヘキソキシ］−６−ヒドロキシ−２−メトキシ−１１−オキソ−６ａ，７，８，９−テトラヒドロ−６Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−カルボキシレート、及び２−（２−ピリジルジスルファニル）プロピル ３−［６−［１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロベンゾ［ｅ］インドール−３−イル］−６−オキソ−ヘキソキシ］−６−ヒドロキシ−２−メトキシ−１１−オキソ−６ａ，７，８，９−テトラヒドロ−６Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−カルボキシレート（化合物番号８１〜８３、表４、図４２〜４３）
Figure 2017503010
乾燥ＤＭＡ（１５ｍＬ）中の１（１．４０ｇ，４．００ｍｍｏｌ、以下の文献の手順に従って調製：Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００３，４６，２１３２−２１５１）、２（１．３１ｇ，５．２２ｍｍｏｌ、以下の文献の手順に従って調製：国際公開第２００４０６５４９１号（Ａ１））及びＫ２ＣＯ３（８２９ｍｇ，６．００ｍｍｏｌ）の混合物は室温で４３時間攪拌された。次いで、混合物はＥｔＯＡｃ及びＨ２Ｏで希釈され、良く混合され、層は分離された。有機層をＨ２Ｏ（３×）、かん水（１×）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒を真空下で除去した。粗生成物は、ＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ５０：５０から６７：３３から１００：０を使用してシリカ上のカラムクロマトグラフィーによって精製され、黄色の油状物として、化合物３（１．７４ｇ，８４％）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）８．７７（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．７９（ｓ，１Ｈ），６．８２（ｓ，１Ｈ），６．０２−５．９２（ｍ，１Ｈ），５．３６（ｄｑ，Ｊ＝１７．２，１．５Ｈｚ，１Ｈ），５．２６（ｄｑ，Ｊ＝１０．４，１．２Ｈｚ，１Ｈ），４．６９−４．６０（ｍ，２Ｈ），４．４７−４．３９（ｍ，１Ｈ），４．２８（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．０９−４．０５（ｍ，２Ｈ），３．８３（ｓ，３Ｈ），３．９０−３．８０（ｍ，１Ｈ），３．７４−３．７０（ｍ，１Ｈ），３．６５−３．５９（ｍ，１Ｈ），３．５４−３．４７（ｍ，１Ｈ），２．２５（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．２０−２．１５（ｍ，１Ｈ），１．９３−１．８４（ｍ，３Ｈ），１．８１−１．７２（ｍ，１Ｈ），１．７０−１．６３（ｍ，３Ｈ），１．５３−１．４７（ｍ，２Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）．ＨＲＭＳｍ／ｚ５４３．２６６６［（Ｍ＋Ｎａ）＋，Ｃ２７Ｈ４０Ｎ２ＮａＯ８として計算：５４３．２６７７］．
Figure 2017503010
Ｅｔ３Ｎ（１．３２ｍＬ，９．４７ｍｍｏｌ）が、室温で乾燥ＤＭＦ（６ｍＬ）中の３（８２１ｍｇ，１．５８ｍｍｏｌ）の溶液に添加された。無水酢酸（０．７５ｍＬ，７．９３ｍｍｏｌ）が添加され、混合物は室温で４．５時間撹拌された。反応混合物は０℃に冷却され、乾燥ＭｅＯＨ（１ｍＬ）が添加され、混合物は１５分間０℃で撹拌された。ＥｔＯＡｃ（１２０ｍＬ）が添加され、混合物はＨ２Ｏ（２×）、かん水（１×）で洗浄され、乾燥され（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒は真空下で除去され、化合物４（８９１ｍｇ，定量的）が得られ、これは精製せずに次の工程で使用された。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）８．８８（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．８２（ｓ，１Ｈ），６．８１（ｓ，１Ｈ），６．０１−５．９１（ｍ，１Ｈ），５．３６（ｄｑ，Ｊ＝１７．２，１．５Ｈｚ，１Ｈ），５．２５（ｄｑ，Ｊ＝１０．４，１．３Ｈｚ，１Ｈ），４．６５−４．６２（ｍ，２Ｈ），４．６１−４．５４（ｍ，１Ｈ），４．３２−４．２２（ｍ，２Ｈ），４．０９−４．０６（ｍ，２Ｈ），３．８３（ｓ，３Ｈ），３．５５−３．４７（ｍ，２Ｈ），２．２６−２．２３（ｍ，２Ｈ），２．１８−２．１２（ｍ，１Ｈ），２．０７（ｓ，３Ｈ），１．９７−１．７７（ｍ，５Ｈ），１．７０−１．６３（ｍ，２Ｈ），１．５４−１．４７（ｍ，２Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）．ＨＲＭＳｍ／ｚ５８５．２７７４［（Ｍ＋Ｎａ）＋，Ｃ２９Ｈ４２Ｎ２ＮａＯ９として計算：５８５．２７８３］．
Figure 2017503010
ピロリジン（１．６ｍＬ，１９．２ｍｍｏｌ）が、室温で乾燥ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の４（１．０６ｇ，１．８８ｍｍｏｌ）の溶液に添加された。次いで、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（１０９ｍｇ，０．０９４３ｍｍｏｌ）が添加され、反応混合物は室温で４０分間攪拌された。反応混合物は０．２５ＭＨＣｌ溶液（２ｘ７５ｍＬ）で洗浄され、乾燥され（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒は真空下で除去された。粗生成物は、ＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ５０：５０から１００：０を使用してシリカ上のカラムクロマトグラフィーによって精製され、黄色の油状物として、化合物５（７２６ｍｇ，８１％）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）６．６７（ｓ，１Ｈ），６．３５（ｓ，１Ｈ），５．０８（ｓ，２Ｈ），４．３５−４．３０（ｍ，１Ｈ），４．１３−４．０６（ｍ，２Ｈ），３．８７（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．６３（ｓ，３Ｈ），３．５０−３．４４（ｍ，１Ｈ），３．４２−３．３５（ｍ，１Ｈ），２．２１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．０７−２．００（ｍ，１Ｈ），２．０１（ｓ，３Ｈ），１．８９−１．８２（ｍ，１Ｈ），１．７７−１．６７（ｍ，４Ｈ），１．５９−１．５１（ｍ，２Ｈ），１．４４−１．３６（ｍ，２Ｈ），１．３９（ｓ，９Ｈ）．ＨＲＭＳｍ／ｚ５０１．２５７３［（Ｍ＋Ｎａ）＋，Ｃ２５Ｈ３８Ｎ２ＮａＯ７として計算：５０１．２５７１］．
Figure 2017503010
ジホスゲン（０．２２ｍＬ，１．８２ｍｍｏｌ）が、窒素下で、室温で乾燥ＤＭＦ（２５ｍＬ）中の５（７２６ｍｇ，１．５２ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（５５７ｍｇ，４．５６ｍｍｏｌ）の混合物に添加された。３０分後に、乾燥ＤＣＭ（２５ｍＬ）中の６の溶液（２．６０ｇ，１２．９ｍｍｏｌ；新たに上記の手順により作製−数字はアルコールに以前は割り当てられていない）が添加され、混合物は室温で一晩撹拌された。１８時間後、反応混合物は、Ｈ２Ｏ（１×）で洗浄され、乾燥され（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒は真空下で除去された。粗生成物は、ＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ１００：０から９５：５から９４：６を使用してシリカ上のカラムクロマトグラフィーによって過剰の６が溶出するまで精製され、次いでＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ７０：３０を使用して精製され、淡黄色の油状物として、化合物７（９２０ｍｇ，８６％）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）９．１６（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．４５−８．４３（ｍ，１Ｈ），７．８３−７．７８（ｍ，２Ｈ），７．２５−７．２１（ｍ，１Ｈ），７．１５（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ），６．８７（ｓ，１Ｈ），４．２９（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．１７−３．９９（ｍ，４Ｈ），３．９２（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），３．４２−３．３０（ｍ，３Ｈ），２．２０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．０６−１．９５（ｍ，４Ｈ），１．８３（ｂｒ ｓ，１Ｈ），１．７７−１．６８（ｍ，４Ｈ），１．５８−１．４９（ｍ，２Ｈ），１．４３−１．３６（ｍ，２Ｈ），１．３９（ｓ，９Ｈ），１．２９（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）．ＨＲＭＳｍ／ｚ７０６．２８３２［（Ｍ＋Ｈ）＋，Ｃ３４Ｈ４８Ｎ３Ｏ９Ｓ２として計算：７０６．２８２６］．
Figure 2017503010
ＤＣＭ−ＭｅＯＨ（３４ｍＬ／１７ｍＬ）中の７（９４９ｍｇ，１．３４ｍｍｏｌ）及びＫ２ＣＯ３（１．８５ｇ，１３．４ｍｍｏｌ）の混合物が室温で４５分間攪拌された。混合物はＤＣＭで希釈され、氷Ｈ２Ｏ（２００ｍＬ）中に注がれ、よく混合され、層は分離された。水層はＤＣＭで抽出され（１×）、混合した有機層は乾燥され（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒は真空下で除去された。粗生成物は、ＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ１００：０から５０：５０を使用してシリカ上のカラムクロマトグラフィーによって精製され、淡黄色の油状物として、化合物８（８０８ｍｇ，９１％）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）９．２０（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．４４（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ），７．８１−７．８０（ｍ，２Ｈ），７．２５−７．２０（ｍ，２Ｈ），６．９４（ｓ，１Ｈ），４．７５（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．１７−３．９９（ｍ，３Ｈ），３．９２（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），３．６０−３．４６（ｍ，２Ｈ），３．３７−３．２０（ｍ，３Ｈ），２．２０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．９３−１．７６（ｍ，３Ｈ），１．７５−１．６８（ｍ，３Ｈ），１．５８−１．５１（ｍ，２Ｈ），１．４４−１．３６（ｍ，２Ｈ），１．３９（ｓ，９Ｈ），１．２９（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）．ＨＲＭＳｍ／ｚ６６４．２７２１［（Ｍ＋Ｈ）＋，Ｃ３２Ｈ４６Ｎ３Ｏ８Ｓ２として計算：６６４．２７２４］．
Figure 2017503010
（ジアセトキシヨード）ベンゼン（２５９ｍｇ，０．８０４ｍｍｏｌ）が、室温で乾燥ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の８（３４９ｍｇ，０．５２６ｍｍｏｌ）及びＴＥＭＰＯ（８２．２ｍｇ，０．５２６ｍｍｏｌ）の混合物に添加され、反応混合物は一晩撹拌された。２４時間後、混合物はＤＣＭと飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液で希釈され、良く混合された。この層は分離され、有機層は、飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液（１×）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１×）で洗浄され、乾燥され（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒は真空下で除去された。粗生成物は、ＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ７０：３０から１００：０を使用してシリカ上のカラムクロマトグラフィーによって精製され、白色泡として、化合物９（２４８ｍｇ，７１％）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）８．４５−８．４３（ｍ，１Ｈ），７．７９−７．６９（ｍ，１Ｈ），７．５１−７．４８（ｍ，１Ｈ），７．２４−７．２０（ｍ，１Ｈ），７．１０（ｓ，１Ｈ），６．９６及び６．９１（２ｓ，１Ｈ），６．５５（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），５．４６（ｄｄ，Ｊ＝８．９，６．１Ｈｚ，１Ｈ），４．３１−４．２１（ｍ，１Ｈ），４．０２−３．８４（ｍ，３Ｈ），３．８０及び３．７９（２ｓ，３Ｈ），３．５２−３．４６（ｍ，１Ｈ），３．４０−３．１８（ｍ，３Ｈ），２．１９−２．１３（ｍ，２Ｈ），２．０９−２．００（ｍ，１Ｈ），１．９６−１．８５（ｍ，３Ｈ），１．７０−１．６７（ｍ，２Ｈ），１．５６−１．４５（ｍ，２Ｈ），１．４０−１．３４（ｍ，２Ｈ），１．３８及び１．３７（２ｓ，９Ｈ），１．１５−１．１０（ｍ，３Ｈ）．ＨＲＭＳｍ／ｚ６６２．２５９２［（Ｍ＋Ｈ）＋，Ｃ３２Ｈ４４Ｎ３Ｏ８Ｓ２として計算：６６２．２５６４］．
Figure 2017503010
ジオキサン（１１ｍＬ）中の９（２５４ｍｇ，０．３８４ｍｍｏｌ）及び４ＭのＨＣｌの混合物が室温で１時間１５分間攪拌された。溶媒は２５〜３０℃で真空下で除去され、化合物１０（１６２ｍｇ，７０％）を得て、これは精製せずに次の工程で使用された。
Figure 2017503010
乾燥ＤＭＡ（５ｍＬ）中の１０（１６１ｍｇ，０．２６６ｍｍｏｌ）、５８ｂ（１９５ｍｇ，０．５４２ｍｍｏｌ，新たに上記の手順により作製）、ＥＤＣＩ．ＨＣｌ（２５３ｍｇ，１．３２ｍｍｏｌ）及びＴｓＯＨ（１９．５ｍｇ，０．１１３ｍｍｏｌ）の混合物は、窒素下で、室温で一晩攪拌された。２３時間後、反応混合物はＥｔＯＡｃ及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で希釈され、良く混合された。層は分離され、水層はＥｔＯＡｃ（１×）で抽出された。混合された有機層をＨ２Ｏ（１×）、かん水（１×）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒を真空下で除去した。粗生成物はＤＣＭ：ＭｅＯＨ１００：０から９３：７を使用するシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより精製され、その物質はＤＣＭ：ＭｅＯＨ９９：１から９４：６を使用して再びカラム処理され、淡黄色の泡として、化合物１１（化合物番号８１，１１８ｍｇ，４７％，ＨＰＬＣ純度：９８．０％）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）８．４３−８．４１（ｍ，１Ｈ），８．２２（ｓ，１Ｈ），７．９６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７３−７．６６（ｍ，１Ｈ），７．６１−７．５６（ｍ，１Ｈ），７．５１−７．４５（ｍ，２Ｈ），７．２２−７．１７（ｍ，１Ｈ），７．１０（ｓ，１Ｈ），６．９７及び６．９２（２ｓ，１Ｈ），６．５６（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），５．４６（ｄｄ，Ｊ＝９．１，６．２Ｈｚ，１Ｈ），４．４２−４．２０（ｍ，４Ｈ），４．０５−３．７６（ｍ，７Ｈ），３．８０及び３．７９（２ｓ，３Ｈ），３．５２−３．４７（ｍ，１Ｈ），３．３８−３．１１（ｍ，４Ｈ），２．０９−１．９９（ｍ，１Ｈ），１．９４−１．８８（ｍ，３Ｈ），１．７７−１．７４（ｍ，２Ｈ），１．６５−１．６２（ｍ，２Ｈ），１．４８−１．４２（ｍ，２Ｈ），１．３５−１．２３（ｍ，１Ｈ），１．１５−１．１０（ｍ，３Ｈ），９Ｈ（ＤＭＳＯピークにより部分的に不明瞭）．ＨＲＭＳｍ／ｚ９６９．３０７０［（Ｍ＋Ｎａ）＋，Ｃ４７Ｈ５５ＣｌＮ６ＮａＯ９Ｓ２として計算：９６９．３０５３］．
Figure 2017503010
乾燥ＤＭＡ（５ｍＬ）中の１０（１６２ｍｇ，０．２６７ｍｍｏｌ）、６６ｄ（１７８ｍｇ，０．４１８ｍｍｏｌ，新たに上記の手順により作製）、ＥＤＣＩ．ＨＣｌ（１８４ｍｇ，０．９６０ｍｍｏｌ）及びＴｓＯＨ（１１ｍｇ，０．０６３９ｍｍｏｌ）の混合物は、窒素下で、室温で一晩攪拌された。１８．５時間後、反応混合物はＥｔＯＡｃ及びＨ２Ｏで希釈され、良く混合された。層は分離され、有機層は飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１×）、Ｈ２Ｏ（１×）、かん水（１×）で洗浄され、乾燥され（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒は真空下で除去された。粗生成物は、ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ１００：０から９５：５を使用してシリカ上のカラムクロマトグラフィーによって精製され、黄色の残留物を得た。これは、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ−ＭＡＸＲＰ４μ，２１．２０×２５０ｍｍ；流速：１２ｍｌ／分；移動相：溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ／ギ酸アンモニウム緩衝液ｐＨ３．４５，溶媒Ｂ：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ９０：１０；方法：勾配，溶媒Ａ：溶媒Ｂ９０：１０から１０：９０から０：１００，３０分かけて）により更に精製され、白い泡として１２（８９．３ｍｇ，３３％，ＨＰＬＣ純度：９９．５％）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）８．５６（ｓ，１Ｈ），８．４３−８．４１（ｍ，１Ｈ），８．０４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７３−７．６７（ｍ，１Ｈ），７．６０−７．５６（ｍ，１Ｈ），７．５１−７．４５（ｍ，２Ｈ），７．２２−７．１７（ｍ，１Ｈ），７．１０（ｓ，１Ｈ），６．９８及び６．９２（２ｓ，１Ｈ），６．５５（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），５．４７−５．４４（ｍ，１Ｈ），４．４０−４．３６（ｍ，１Ｈ），４．３０−４．１９（ｍ，３Ｈ），４．０４−３．８６（ｍ，４Ｈ），３．８６−３．７５（ｍ，１Ｈ），３．８０及び３．７９（２ｓ，３Ｈ），３．５２−３．４６（ｍ，１Ｈ），３．３８−３．２２（ｍ，３Ｈ），３．２１−３．１５（ｍ，１Ｈ），２．０９−１．９９（ｍ，１Ｈ），１．９４−１．８５（ｍ，３Ｈ），１．７８−１．７４（ｍ，２Ｈ），１．６９−１．６０（ｍ，２Ｈ），１．５５−１．４０（ｍ，２Ｈ），１．４７ａｎｄ１．４７（２ｓ，１８Ｈ），１．２８−１．２３（ｍ，１Ｈ），１．１５−１．１０（ｍ，３Ｈ）．ＨＲＭＳｍ／ｚ１０３５．３１６２［（Ｍ＋Ｎａ）＋，Ｃ４９Ｈ６２ＣｌＮ４ＮａＯ１１ＰＳ２として計算：１０３５．３１７５］．
Figure 2017503010
乾燥ＤＣＭ（２ｍＬ）中の１２（８４．０ｍｇ，０．０８２９ｍｍｏｌ）及びＴＦＡ（１ｍＬ）の混合物が室温で４０分間攪拌された。次いで、溶媒は２５℃で真空下で除去され、緑色の残留物を得た。残留物はＤＣＭに溶解され、溶液はＥｔＯＡｃで希釈され、ＤＣＭは真空下で除去され、白色の固体を得て、残りの溶媒はデカントされた。このプロセスは繰り返され、得られた固体はＥｔＯＡｃで粉砕され、乾燥され、白色の固体として、化合物１３（化合物番号８２，４３．８ｍｇ，５９％，ＨＰＬＣ純度：９３．８％）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）８．４７（ｓ，１Ｈ），８．４４−８．４２（ｍ，１Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．９０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．７４−７．６８（ｍ，１Ｈ），７．５８−７．５４（ｍ，１Ｈ），７．５１−７．４８（ｍ，１Ｈ），７．４７−７．４３（ｍ，１Ｈ），７．２２−７．１８（ｍ，１Ｈ），７．１０（ｓ，１Ｈ），６．９８ａｎｄ６．９３（２ｓ，１Ｈ），５．４６（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，１Ｈ），４．３９−４．１８（ｍ，４Ｈ），４．０４−３．９５（ｍ，３Ｈ），３．９０−３．８５（ｍ，１Ｈ），３．８４−３．７６（ｍ，１Ｈ），３．８０及び３．８０（２ｓ，３Ｈ），３．５２−３．４７（ｍ，１Ｈ），３．４０−３．２７（ｍ，３Ｈ），３．２１−３．１５（ｍ，１Ｈ），２．１０−２．０２（ｍ，１Ｈ），１．９４−１．８８（ｍ，３Ｈ），１．７８−１．７４（ｍ，２Ｈ），１．６９−１．６０（ｍ，２Ｈ），１．４８−１．４２（ｍ，２Ｈ），１．３５−１．２３（ｍ，１Ｈ），１．１６−１．１０（ｍ，３Ｈ），３Ｈ（観測されず）。ＨＲＭＳｍ／ｚ９２３．１９３８［（Ｍ＋Ｎａ）＋，Ｃ４１Ｈ４６ＣｌＮ４ＮａＯ１１ＰＳ２として計算：９２３．１９２３］．
Figure 2017503010
乾燥ＤＭＡ（３ｍＬ）中の１０（４５．０ｍｇ，０．０７４３ｍｍｏｌ），６７ｄ（２４．３ｍｇ，新たに上記の手順により作製）、ＥＤＣＩ．ＨＣｌ（４２．７ｍｇ，０．２２３ｍｍｏｌ）及びＴｓＯＨ（３ｍｇ，０．０１７４ｍｍｏｌ）の混合物は、窒素下で、室温で５時間攪拌された。６７ｄ（２４．３ｍｇ，０．０８９９ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ．ＨＣｌ（１６．０ｍｇ，０．０８３５ｍｍｏｌ）の付加的部分が混合物に添加され、反応物をは室温で撹拌された。２２時間後、反応混合物は、ＥｔＯＡｃで希釈され、Ｈ２Ｏ（２×）、かん水（１×）で洗浄され、乾燥され（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒は真空下で除去された。粗生成物は、ＥｔＯＡｃを使用してシリカ上のカラムクロマトグラフィーによって精製され、緑色の粉末を得た。これは、ＥｔＯＡｃをもう一度使用するシリカゲル上でカラムクロマトグラフィーを行って更に精製され、ベージュ色の固体として、化合物１４（化合物番号８３，８．３ｍｇ，１３．５％，ＨＰＬＣ純度：８１．２％）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）１０．３３（ｓ，１Ｈ），８．４３−８．４２（ｍ，１Ｈ），８．０７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．９８（ｓ，１Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７４−７．６７（ｍ，１Ｈ），７．５０−７．４６（ｍ，２Ｈ），７．３３−７．２９（ｍ，１Ｈ），７．２４−７．１８（ｍ，１Ｈ），７．１０（ｓ，１Ｈ），６．９８及び６．９２（２ｓ，１Ｈ），６．５６（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），５．４７−５．４４（ｍ，１Ｈ），４．３３−４．２１（ｍ，２Ｈ），４．１５−４．１３（ｍ，２Ｈ），４．０５−３．９３（ｍ，３Ｈ），３．９０−３．７５（ｍ，２Ｈ），３．８０及び３．７９（２ｓ，３Ｈ），３．５２−３．４７（ｍ，１Ｈ），３．３８−３．１３（ｍ，４Ｈ），２．１０−１．９９（ｍ，１Ｈ），１．９４−１．８９（ｍ，３Ｈ），１．７７−１．７４（ｍ，２Ｈ），１．６６−１．６２（ｍ，２Ｈ），１．５２−１．４１（ｍ，２Ｈ），１．３２−１．２４（ｍ，１Ｈ），１．１５−１．１０（ｍ，３Ｈ）．ＨＲＭＳｍ／ｚ８４３．２２５８［（Ｍ＋Ｎａ）＋，Ｃ４１Ｈ４５ＣｌＮ４ＮａＯ８Ｓ２として計算：８４３．２２６０］．
実施例２９ （１Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（（２Ｅ）−３−｛４−（（１Ｅ）−３−｛（１Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−［（６−メチル−β−Ｄ−グルコピラヌロノシル）オキシ］−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３−イル｝−３−オキソ−１−プロペニル）−２−［（３−｛［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル］アミノ｝プロパノイル）アミノ］フェニル｝−２−プロペノイル）−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル メチルβ−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸（化合物番号８４、表４、図４４）
トリクロロアセトイミド酸（１）は文献の手順に従って調製された： L. Lazar, E. Mezoe, M. Herczeg, A. Liptak, S. Antus, A. Borbas, Tetrahedron 2012, 68, 7386-7399; L. Tietze, H. Schuster, K. Schmuck, I. Schuberth, F. Alves, Bioorg. & Med. Chem. 2008, 16, 6312-6318.
無水ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中のトリクロロアセトイミド酸（１）（３６０ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ），フェノール−ＣＢＩ（２，最初の特許出願中の化合物５１ａ）（２００ｍｇ，０．６０ｍｍｏｌ）及び活性化モレキュラーシーブ４Å（１ｇ）の懸濁液は室温で１時間攪拌された。混合物はー１０℃へ冷却され、次いでＢＦ３ ．ＯＥｔ２（４０μｌ，０．３ｍｍｏｌ）が滴下された。温度は、１時間、−１０℃と−５℃の間に保持され、次いで、これは０℃で３０分間撹拌された。続いてＢＦ３ ．ＯＥｔ２（０．２４ｍＬ，１．８ｍｍｏｌ）が０℃で滴下され、温度を室温に上昇させ、それを２時間撹拌した。次いで、懸濁液はセライト上で濾過され、溶媒を蒸発させて、粗ＣＢＩ−グルクロニド（３）を得て、これは精製せずに次の工程で使用された。無水ＤＭＡ（４ｍＬ）中のアミン（３）及びビス酸（４、最初の特許出願中の化合物６６ｈ）（１２６ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）の溶液は０℃に冷却された。次いで、ｐＴｓＯＨ（１７ｍｇ，０．０９６ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ．ＨＣｌ（２７６ｍｇ，１．４４ｍｍｏｌ）が添加され、温度を室温に上昇させ、それを１６時間撹拌した。溶媒は減圧下で除去され、残留物はカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ０−２％）次いで（ＳｉＯ２，ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ１−２％）により精製され、黄色い固体として、（１Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（（２Ｅ）−３−｛４−（（１Ｅ）−３−｛（１Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−［（２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−６−メチル−β−Ｄ−グルコピラヌロノシル）オキシ］−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３−イル｝−３−オキソ−１−プロペニル）−２−［（３−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝プロパノイル）アミノ］フェニル｝−２−プロペノイル）−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸（５）（１２７ｍｇ，２７％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，［（ＣＤ３）２ＳＯ］）ｄ１０．０４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．３８（ｂｒ ｓ，２Ｈ），８．１１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．９７（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．９３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．８３−７．８８（ｍ，４Ｈ），７．７８（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．６８−７．７２（ｍ，３Ｈ），７．５９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．４５−７．４８（ｍ，３Ｈ），７．３８（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．２５−７．２９（ｍ，４Ｈ），５．８５（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），５．８３（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），５．６２−５．６５（ｍ，２Ｈ），５．３２（ｔ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），５．１４（ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ），４．７８（ｔ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），４．５５（ｍ，４Ｈ），４．３１−４．３８（ｍ，４Ｈ），４．２２（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），４．０１−４．０３（ｍ，２Ｈ），３．９１−３．９６（ｍ，２Ｈ），３．６５（ｓ，３Ｈ），３．６３（ｓ，３Ｈ），３．３６−３．３８（ｍ，２Ｈ），２．５９−２．６４（ｍ，２Ｈ），１．９８−２．０３（ｍ，１８Ｈ）；ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ８２Ｈ７９Ｃｌ２Ｎ４Ｏ２５として計算：（Ｍ＋Ｈ）＋ｍ／ｚ１５９１．４， ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ１５９１．４；Ｃ８２Ｈ７８Ｃｌ２Ｎ４Ｏ２５として計算：Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ）＋ｍ／ｚ１６１３．４， ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ１６１３．４．
無水ＤＭＦ（５ｍＬ）中の誘導体（５）（１１０ｍｇ，０．０７ｍｍｏｌ）及びピペリジン（４６８ｍＬ，０．７ｍｍｏｌ）の溶液は室温で３０分間撹拌された。溶媒は室温で減圧下で除去され、残留物は冷Ｅｔ２Ｏで粉砕され、粗い（１Ｓ）−３−｛（２Ｅ）−３−［２−［（３−アミノプロパノイル）アミノ］−４−（（１Ｅ）−３−｛（１Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−［（２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−６−メチル−β−Ｄ−グルコピラヌロノシル）オキシ］−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３−イル｝−３−オキソ−１−プロペニル）フェニル］−２−プロペノイル｝−１−（クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸（６）（８６ｍｇ，９０％）を得て、これは精製せずに次の工程で使用された。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，［（ＣＤ３）２ＳＯ］ｄ８．３８（ｂｒ ｓ，２Ｈ），８．１０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．９４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．９０（ｓ，１Ｈ），７．８８（ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ，１Ｈ），７．７６（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５９（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．４７（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．２７（ｄｄ，Ｊ＝３．４，１５．３Ｈｚ，２Ｈ），５．８５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），５．８４（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），５．６３−５．６８（ｍ，２Ｈ），５．３２（ｄｄ，Ｊ＝７．８，９．６Ｈｚ，２Ｈ），５．１４（ｄｔ，Ｊ＝１．５，９．６Ｈｚ，２Ｈ），４．７９（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ），４．５６−４．６０（ｍ，４Ｈ），４．２９−４．４１（ｍ，２Ｈ），４．０２−４．０４（ｍ，２Ｈ），３．９２−３．９７（ｍ，２Ｈ），３．６７（ｓ，６Ｈ），２．９３（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．０３−２．０４（ｍ，１８Ｈ），２Ｈ（ＤＭＳＯピーク下），ＮＨ及びＮＨ２は観測されなかった。
ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）の（１：１）混合物中のアミン（６）（１１０ｍｇ，０．０８ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、０℃で、ＭｅＯＨ（１ｍＬ）中のＮａＯＭｅ（８．７ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ）の溶液が滴下され、反応混合物は２時間０℃で攪拌された。次いで、ＡｃＯＨ（８滴）が添加され、溶媒は室温で減圧下で除去され、高真空下で乾燥され、オレンジ色の固体として、（１Ｓ）−３−｛（２Ｅ）−３−［２−［（３−アミノプロパノイル）アミノ］−４−（（１Ｅ）−３−｛（１Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−［（６−メチル−β−Ｄ−グルコピラヌロノシル）オキシ］−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３−イル｝−３−オキソ−１−プロペニル）フェニル］−２−プロペノイル｝−１−（クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル メチル−β−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸（７）を得て、これは精製せずに次の工程で使用された。無水ＤＭＦ（５ｍＬ）中のアミン（７）とＮ−スクシンイミジル−６−マレイミドヘキサン酸（２４ｍｇ，０．０７７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液にＤＩＥＡ（７８ｍＬ，０．１ｍｍｏｌ）が添加され、混合物は室温で一晩撹拌された。次いで、溶媒は室温で減圧下で除去され、残留物はカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ１０−２０％）次いで２回（ＳｉＯ２，ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ１５％）により精製され、黄色い固体として、（１Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−（（２Ｅ）−３−｛４−（（１Ｅ）−３−｛（１Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−［（６−メチル−β−Ｄ−グルコピラヌロノシル）オキシ］−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３−イル｝−３−オキソ−１−プロペニル）−２−［（３−｛［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル］アミノ｝プロパノイル）アミノ］フェニル｝−２−プロペノイル）−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル メチル−β−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸 ８（化合物番号８４）（３１ｍｇ，３４％）を得た。ＨＰＬＣ純度９５．９％；１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，［（ＣＤ３）２ＳＯ］ｄ１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．３２（ｓ，２Ｈ），８．３１（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），８．０９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．８９−７．９５（ｍ，３Ｈ），７．８４（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５８（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．４３（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．２７（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，２Ｈ），６．９６（ｓ，２Ｈ），５．６７（ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ），５．６６（ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ），５．４５（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），５．３５（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，２Ｈ），５．１６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），４．５２−４．６２（ｍ，４Ｈ），４．３３（ｂｒ ｓ，２Ｈ），３．９９−４．０４（ｍ，４Ｈ），３．９３（ｄｄ，Ｊ＝７．４，１０．５Ｈｚ，２Ｈ），３．６８（ｓ，３Ｈ），３．６７（ｓ，３Ｈ），３．３７−３．４８（ｍ，８Ｈ），２．５７−２．６１（ｍ，２Ｈ），２．０９（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），１．４１−１．５４（ｍ，４Ｈ），１．１４−１．２３（ｍ，４Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ６５Ｈ６７Ｃｌ２Ｎ５ＮａＯ２０として計算：（Ｍ＋Ｎａ＋）ｍ／ｚ１３３０．３６４９； ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ１３３０．３６００．
実施例３０ （Ｓ）−（１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジイル）ビス（（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）メタノン）（化合物番号１５、表１、図４５）
ＮＭＰ（１０ｍＬ）中の１（５００ｍｇ，３．２２ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジ−ｔｅｒｔ−ブチル アセタール（２，５．２４ｇ，２５．７７ｍｍｏｌ）が１００℃まで加熱され、一晩撹拌された。ほとんどの揮発性成分は減圧下で除去され、得られた残留物は酢酸エチルと水との間で再分配された。水相を酢酸エチルで３回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、シリカのパッドを通して濾過した。溶媒は除去され、３は、蒼白色の結晶性固体（３３１ｍｇ，３８％）として得られた；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１２．２６（ｓ，１Ｈ），６．６８（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，２Ｈ），１．５１（ｓ，１８Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ２９０．１３６２（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ１４Ｈ２１ＮＮａＯ４ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ２９０．１３６３．
ＭｅＣＮ（１ｍＬ）中の３（５０ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ），Ｋ２ＣＯ３（５２ｍｇ，０．３７ｍｍｏｌ），ＭｅＩ（０．１２ｍＬ，１．８７ｍｍｏｌ）及びヨウ化テトラブチルアモニウム（３．５ｍｇ，０．００９４ｍｍｏｌ）と水（０．０１ｍＬ）の混合物は３５〜４０℃で加熱され、３日間攪拌された。反応混合物は酢酸エチルと水との間で再分配された。水相を酢酸エチルで３回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、シリカのパッドを通して濾過した。溶媒は除去され、４は、蒼白色の油状物として得られ、これは、数時間で無色の結晶性固体となった；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ６．７７（ｓ，２Ｈ），４．２１（ｓ，３Ｈ），１．５６（ｓ，１８Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ３０４．１５１２（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ１５Ｈ２３ＮＮａＯ４ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ３０４．１５１９．
ＤＣＭ（１ｍＬ）中の４（４５ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ）の溶液に、室温で、ＴＦＡ（０．５ｍＬ，６．４９ｍｍｏｌ）が添加された。混合物は３時間撹拌され、ピンク色の溶液を得た。全ての揮発性成分は排出され、得られた残留物は石油エーテルで粉砕され、ピンク色の固体として５（２５ｍｇ，９３％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１２．８１（ｓ，２Ｈ），６．８０（ｓ，２Ｈ），４．１５（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩｎｅｇａｔｉｖｅ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ１６８．０３０６（Ｍ−Ｈ）．Ｃ７Ｈ６ＮＯ４ ｒｅｑｕｉｒｅｓ １６８．０３０２．
ＤＣＭ（２ｍＬ）中のＢｏｃ−ＣＢＩ−ＯＨ（Ｃｏｍｐ５１ａ，１３０ｍｇ，０．３９ｍｍｏｌ）の溶液に、室温で、ジオキサン中の４ＮのＨＣｌ（２ｍＬ）が添加された。混合物は２．５時間撹拌された。全ての揮発性成分は排出され、得られた残留物（６）はそのまま直接使用された。
ＤＭＡ（２ｍＬ）中の６（上記で作製）、５（２２ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ塩酸塩（１５０ｍｇ，０．７８ｍｍｏｌ）及びｐ−トルエンスルホン酸（２．２ｍｇ，０．０１３ｍｍｏｌ）の混合物は室温で一晩撹拌された。ほとんどの揮発性成分は除去され、得られた残留物は酢酸エチルと水との間で再分配された。水相を酢酸エチルで３回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、セライトのパッドを通して濾過した。溶媒は除去され、得られた残留物は溶離液としてＭｅＯＨ及びＤＣＭ（ｖ／ｖ ２％）の混合物を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製され、オフホワイトの固体として、７（化合物番号１５、表１）（６０ｍｇ，７７％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１０．４３（ｓ，２Ｈ），８．１２（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．８３（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．７３（ｂｒ ｓ，２Ｈ），７．５２（ｄｄ，Ｊ＝１．０，８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．３７（ｄｄ，Ｊ＝０．４，８．０Ｈｚ，２Ｈ），６．７７（ｓ，２Ｈ），４．６２−４．５７（ｍ，２Ｈ），４．３１−４．２７（ｍ，２Ｈ），４．１０−４．０７（ｍ，２Ｈ），４．０２−４．００（ｍ，２Ｈ），３．８８−３．８５（ｍ，５Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ６２２．１２５５（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ３３Ｈ２７Ｃｌ２Ｎ３ＮａＯ４ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ６２２．１２７１．
実施例３１ Ｎ−（２，５−ビス（（Ｅ）−３−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）−３−オキソプロパ−１−エニル）フェニル）アセトアミド（化合物番号１６、表１、図４６）
氷浴中のＴＨＦ（５ｍＬ）及びピリジン（５ｍＬ）中の１（６６ｆ，５００ｍｇ，１．４５ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化アセチル（０．５０ｍＬ，７．０３ｍｍｏｌ）が添加された。混合物は室温まで温められ、一晩攪拌された。全ての揮発性成分は排出され、得られた残留物は酢酸エチルと重炭酸ナトリウム水溶液との間で再分配された。水相を酢酸エチルで３回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、セライトのパッドを通して濾過した。溶媒は除去され、得られた残留物は、溶離液として酢酸エチルと石油エーテルの混合物（ｖ／ｖ １：２）を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製され、オフホワイトの固体として、２（４７５ｍｇ，８５％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８．００（ｓ，１Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝１５．８Ｈｚ，１Ｈ），７．５５−７．５１（ｍ，２Ｈ），７．３１（明らかなｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．４０（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３７（ｄ，Ｊ＝１５．８Ｈｚ，１Ｈ），２．２５（ｓ，３Ｈ），１．５４（ｓ，９Ｈ），１．５３（ｓ，９Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ４１０．１９２１（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ２２Ｈ２９ＮＮａＯ５ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ４１０．１９３８．
ＤＣＭ（５ｍＬ）中の２（４７０ｍｇ，１．２１ｍｍｏｌ）の溶液に、室温で、ＴＦＡ（２．５ｍＬ，３２．４０ｍｍｏｌ）が添加された。混合物は３時間撹拌され、白色懸濁液を得た。追加のＤＣＭが添加され、より多くの固体を沈殿させ、これを濾過により回収し、酢酸エチル及び石油エーテルで洗浄した。３は白色固体（２９０ｍｇ，８７％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１２．４０（ｂｒ ｓ，２Ｈ），９．８９（ｓ，１Ｈ），７．８５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．７０（明らかなｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，２Ｈ），７．５７−７．５３（ｍ，２Ｈ），６．５４（ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，１Ｈ），６．５３（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），２．０９（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ２９８．０６７２（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ１４Ｈ１３ＮＮａＯ５ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ２９８．０６８６．
ＤＣＭ（３ｍＬ）中のＢｏｃ−ＣＢＩ−ＯＨ（Ｃｏｍｐ５１ａ，２９１ｍｇ，０．８７ｍｍｏｌ）の溶液に、室温で、ジオキサン中の４ＮのＨＣｌ（３ｍＬ）が添加された。混合物は２．５時間撹拌された。全ての揮発性成分は排出され、得られた残留物（４）はそのまま直接使用された。
ＤＭＡ（３ｍＬ）中の４（上記で作製）、３（８０ｍｇ，０．２９ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ塩酸塩（３３４ｍｇ，１．７４ｍｍｏｌ）及びｐ−トルエンスルホン酸（５ｍｇ，０．０２９ｍｍｏｌ）の混合物は室温で一晩撹拌された。全ての揮発性成分は排出され、得られた残留物はメタノールで数回粉砕され、粗生成物（１２３ｍｇ）を得て、これをＴＨＦに溶解させ、ＭｅＯＨの添加により沈殿させ、黄色の固体として５（化合物番号１６、表１）（９６ｍｇ，４７％，ＨＰＬＣ純度９７％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１０．４３（ｓ，２Ｈ），９．９７（ｓ，１Ｈ），８．１２−８．０７（ｍ，５Ｈ），７．８５−７．８１（ｍ，４Ｈ），７．７４（明らかなｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ），７．６８（ｄ，Ｊ＝１５．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３５（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．２６（ｄｄ，Ｊ＝３．２，１５．３Ｈｚ，２Ｈ），４．５８−４．４６（ｍ，４Ｈ），４．２８−４．２２（ｍ，２Ｈ），４．０５−３．９８（ｍ，２Ｈ），３．８８−３．８２（ｍ，２Ｈ），２．１５（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ７２８．１６６２（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ４０Ｈ３３Ｃｌ２Ｎ３ＮａＯ５ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ７２８．１６８９．
実施例３２ （Ｓ，２Ｅ，２’Ｅ）−３，３’−（２−メトキシ−１，４−フェニレン）ビス（１−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）プロパ−２−エン−１−オン）（化合物番号１７、表１、図４７）
ドライアイス−ＭｅＣＮ浴中のー３０℃から−４０℃での乾燥ＴＨＦ（１２ｍＬ）中の１（２．５０ｇ，１３．３０ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ２下で、三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート（ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ，４．９２ｍＬ，３９．９０ｍｍｏｌ）が滴下された。混合物を１０分間−３０℃で撹拌した後、ｔＢｕＯＮＯ（２．３９ｍＬ，１９．９４ｍｍｏｌ）が滴下された。反応混合物は室温まで温められ、１．５時間攪拌され、懸濁液を得た。石油エーテル（５０ｍＬ）が添加され、追加の沈殿物を得た。上清はデカンテーションにより除去され、残された固体は石油エーテルで洗浄され、白色の固体を得た。この固体は乾燥ＭｅＣＮ（２０ｍＬ）に溶解され、氷浴中で冷却された。ＫＩ（１１．００ｇ，６６．２６ｍｍｏｌ）及びＩ２（６．００ｇ，２３．６４ｍｍｏｌ）が添加された。反応混合物は室温で４時間撹拌され、その後飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液（５０ｍＬ）が添加され、反応をクエンチした。混合物を酢酸エチルで３回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、セライトのパッドを通して濾過した。溶媒は除去され、得られた残留物は、溶離液として酢酸エチルと石油エーテルの混合物（ｖ／ｖ １：９）を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製され、蒼白色の固体として、２（２．８３ｇ，７１％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．５０（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１６（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），６．８４（ｄｄ，Ｊ＝２．２，８．５Ｈｚ，１Ｈ），５．３９（ｓ，１Ｈ）ｐｐｍ．
再蒸留トリエチルアミン（５ｍＬ）中の２（５００ｍｇ，１．６７ｍｍｏｌ），ｔｅｒｔ−ブチルアクリレート（０．７２８ｍＬ，５．０２ｍｍｏｌ），酢酸パラジウム（ＩＩ）（７．５ｍｇ，０．０３３ｍｍｏｌ）及びトリ−オルト−トリルホスフィン（４１ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）はＮ２下で一晩還流で加熱され、濃い灰色の懸濁液を得た。全ての揮発性成分が排出された。得られた残留物は酢酸エチルに溶解され、沈殿物は濾過された。濾液を蒸発させ、得られた残留物は、溶離液として酢酸エチルと石油エーテルの混合物（ｖ／ｖ １：６）を使用するカラムクロマトグラフィーにより精製され、オフホワイトの固体として、３（１６０ｍｇ，２８％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１０．４３（ｓ，１Ｈ），７．７５（ｄ，Ｊ＝１６．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），７．１８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．０７（ｄ，Ｊ＝０．８Ｈｚ，１Ｈ），６．５６（ｄ，Ｊ＝１６．４Ｈｚ，１Ｈ），６．４１（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ），１．４８３（ｓ，９Ｈ），１．４７８（ｓ，９Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ３６９．１６８７（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ２０Ｈ２６ＮａＯ５ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ３６９．１６７２．
ＤＭＦ（２ｍＬ）中の３（１６０ｍｇ，０．４６ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｋ２ＣＯ３（２５４ｍｇ，１．８４ｍｍｏｌ）及びＭｅＩ（０．２８ｍＬ，４．５０ｍｍｏｌ）が添加された。混合物は一晩、室温で撹拌され、沈殿物は濾過された。得られた濾液を水、続いてかん水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、セライトのパッドを通して濾過した。溶媒は除去され、得られた残留物は、溶離液として酢酸エチルと石油エーテルの混合物（ｖ／ｖ １：１０）を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製され、無色の油状物として、４（７２ｍｇ，４３％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．８７（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，１Ｈ），７．４９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．１０（ｄｄ，Ｊ＝１．３，８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．００（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ），６．４７（ｄ，Ｊ＝１６．１Ｈｚ，１Ｈ），６．３８（ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，１Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），１．５３９（ｓ，９Ｈ），１．５３３（ｓ，９Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ３８３．１８３８（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ２１Ｈ２８ＮａＯ５ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ３８３．１８２９．
ＤＣＭ（２ｍＬ）中の４（７０ｍｇ，０．１９ｍｍｏｌ）の溶液に、室温で、ＴＦＡ（１ｍＬ，１２．９８ｍｍｏｌ）が添加された。混合物は２．５時間撹拌され、白色懸濁液を得た。全ての揮発性成分は排出され、得られた残留物はＤＣＭで粉砕され、白色の固体として５（４１ｍｇ，８５％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１２．４１（ｂｒ ｓ，２Ｈ），７．８０（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５８（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３０（ｄｄ，Ｊ＝１．０，８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．４７（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３８（ｄ，Ｊ＝１６．１Ｈｚ，１Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ２７１．０５７３（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ１３Ｈ１２ＮａＯ５ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ２７１．０５７７．
ＤＣＭ（２ｍＬ）中のＢｏｃ−ＣＢＩ−ＯＨ（Ｃｏｍｐ５１ａ，１６１ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ）の溶液に、室温で、ジオキサン中の４ＮのＨＣｌ（２ｍＬ）が添加された。混合物は２．５時間撹拌された。全ての揮発性成分は排出され、得られた残留物（６）はそのまま直接使用された。
ＤＭＡ（１ｍＬ）中の６（上記で作製）、５（４０ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ塩酸塩（１８５ｍｇ，０．９７ｍｍｏｌ）及びｐ−トルエンスルホン酸（２．８ｍｇ，０．０１６ｍｍｏｌ）の混合物は室温で一晩撹拌された。全ての揮発性成分は排出され、得られた残留物はメタノールで粉砕され、黄色の固体を得て、これをＴＨＦに溶解させ、メタノールの添加により沈殿させ、黄色の固体として７（化合物番号１７、表１）（４５ｍｇ，４１％，ＨＰＬＣ純度９８％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１０．４３（ｓ，２Ｈ），８．１２−８．１０（ｍ，４Ｈ），８．００−７．９５（ｍ，２Ｈ），７．８５−７．８０（ｍ，２Ｈ），７．７２（ｄ，Ｊ＝１５．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５４−７．５０（ｍ，４Ｈ），７．３７−７．２６（ｍ，４Ｈ），４．５７−４．４５（ｍ，４Ｈ），４．２８−４．２２（ｍ，２Ｈ），４．００−３．９９（ｍ，５Ｈ），３．９０−３．８３（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ７０１．１５９６（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ３９Ｈ３２Ｃｌ２Ｎ２ＮａＯ５ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ７０１．１５８０．
実施例３３ （Ｓ，２Ｅ，２’Ｅ）−３，３’−（１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジイル）ビス（１−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）プロパ−２−エン−１−オン）（化合物番号１８、表１、図４８）
１は文献の方法を使用して調製された（参考：Russ J Org Chem, 2007, 43, 855-860）。
２
ＭｅＣＮ（２ｍＬ）中の１（５０ｍｇ，０．４１ｍｍｏｌ），Ｋ２ＣＯ３（１１２ｍｇ，０．８１ｍｍｏｌ），ＭｅＩ（０．２５ｍＬ，４．０６ｍｍｏｌ）及びヨウ化テトラブチルアモニウム（７．５ｍｇ，０．０２０ｍｍｏｌ）と水（０．０２ｍＬ）の混合物は４０℃で加熱され、３時間攪拌された。ほとんどの揮発性成分は減圧下で除去され、得られた残留物は酢酸エチルと水との間で再分配された。水相を酢酸エチルで３回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、シリカのパッドを通して濾過した。溶媒は除去され、白色の固体として２（４７ｍｇ，８４％）が得られ；報告されたものと同一の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを得た（参考：C. E. Loader, G. H. Barnett and H. J. Anderson, Can. J. Chem., 1982, 60, 383）。
４
ＤＣＭ（３ｍＬ）中の２（４０ｍｇ，０．２９ｍｍｏｌ）及びメチル（トリフェニルホスホラニリデン）アセタート（３，４００ｍｇ，１．２０ｍｍｏｌ）の混合物は２日間攪拌され、黄色い溶液を得た。混合物は、溶離液として酢酸エチルと石油エーテルの勾配混合物（ｖ／ｖ ＝１：５，１：４及び１：３）を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製され、黄色い固体として４（６３ｍｇ，８７％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．６１（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，２Ｈ），６．７０（ｓ，２Ｈ），６．２６（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．７９（ｓ，６Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ２７２．０８９８（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ１３Ｈ１５ＮＮａＯ４ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ２７２．０８９３．
５
ＥｔＯＨ（２ｍＬ）及びＴＨＦ（１ｍＬ）中の４（６０ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）及びＫＯＨ（１００ｍｇ，１．７８ｍｍｏｌ）の混合物は、７０℃で２時間攪拌された。混合物を乾燥するまで減圧下で蒸発させた。得られた残留物は水に溶解されｐＨ５まで１ＮのＨＣｌで酸性化され、黄色の沈殿物を得、これを濾過によって回収し、その後、水及び石油エーテルで洗浄され、黄色の固体として５（５１ｍｇ，９６％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１２．２０（ｓ，２Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，２Ｈ），６．８９（ｓ，２Ｈ），６．３０（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．７０（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ２４４．０５９０（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ１１Ｈ１１ＮＮａＯ４ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ２４４．０５８０．
７
ＤＣＭ（２ｍＬ）中のＢｏｃ−ＣＢＩ−ＯＨ（Ｃｏｍｐ５１ａ，２００ｍｇ，０．６０ｍｍｏｌ）の溶液に、室温で、ジオキサン中の４ＮのＨＣｌ（１０ｍＬ）が添加された。混合物は２時間撹拌された。全ての揮発性成分は排出され、得られた残留物（６，ｃｏｍｐ６７ｄ）はそのまま直接使用された。
ＤＭＡ（２ｍＬ）中の６（上記で作製）、５（４９ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ塩酸塩（２５５ｍｇ，１．３３ｍｍｏｌ）及びｐ−トルエンスルホン酸（３．８ｍｇ，０．０２２ｍｍｏｌ）の混合物は室温で一晩撹拌された。溶媒は除去され、得られた残留物は、ＭｅＯＨと酢酸エチルの混合物（ｖ／ｖ ３％）を使用するカラムクロマトグラフィーにより精製され、粗生成物は酢酸エチルにより粉砕され、オレンジ色の固体として７（６０ｍｇ，４１％，ＨＰＬＣ１００％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１０．４１（ｓ，２Ｈ），８．１１（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，４Ｈ），７．８１（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝１４．９Ｈｚ，２Ｈ），７．５０（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３３（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．１２（ｓ，２Ｈ），７．０１（ｄ，Ｊ＝１４．９Ｈｚ，２Ｈ），４．４９−４．４２（ｍ，４Ｈ），４．２４−４．１９（ｍ，２Ｈ），４．０１−３．９７（ｍ，２Ｈ），３．８５−３．８２（ｍ，５Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩｎｅｇａｔｉｖｅ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ６５０．１６００（Ｍ−Ｈ）．Ｃ３７Ｈ３０Ｃｌ２Ｎ３Ｏ４ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ６５０．１６１９．
実施例３４ （Ｓ）−３，３’−（２−メトキシ−１，４−フェニレン）ビス（１−（（Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル）プロパ−２−イン−１−オン）（化合物番号１９、表１、図４９）
２
化合物２は、米国特許第２００７／４９７５８号に記載されたものに基づいて修飾された手順により合成された。ＤＣＭ（１００ｍＬ）中の１（５．５０ｇ，２５．００ｍｍｏｌ）及び酢酸銀（Ｉ）（６．２６ｇ，３７．５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ＤＣＭ（１５０ｍＬ）中のヨード溶液（６．９８ｇ，２７．５０ｍｍｏｌ）が滴下された。得られた混合物は室温で一晩撹拌され、次いでセライトのパッドを通して濾過された。濾液を蒸発させ、得られた残留物は、溶離液として酢酸エチルと石油エーテルの混合物（ｖ／ｖ １：１０）を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製され、白色の固体として、２（９６６ｍｇ，１１％）を得た；；ｍｐ ９７−９９℃．１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．３４２（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．３３９（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．００（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．３Ｈｚ，１Ｈ），５．３２（ｓ，１Ｈ）ｐｐｍ．１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００．６ＭＨｚ）δ１５５．７０，１３９．４６（ＣＨ），１３１．８０（ＣＨ），１２４．４４（ＣＨ），９４．６５，８５．５２ｐｐｍ．
３
ＤＭＦ（４ｍＬ）中の２（２７０ｍｇ，０．７８ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｋ２ＣＯ３（１６２ｍｇ，１．１７ｍｍｏｌ）及びＭｅＩ（０．２４ｍＬ，３．９０ｍｍｏｌ）が添加された。混合物は室温で２時間攪拌された。混合物はシリカゲルのパッドを通して濾過され、濾液を蒸発させて、無色油状物として３（２７７ｍｇ，９９％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．４５（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．０９（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ），７．０４（ｄｄ，Ｊ＝１．８，８．１Ｈｚ，１Ｈ），３．８７（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ．
４
再蒸留トリエチルアミン（５ｍＬ）中の３（２７４ｍｇ，０．７６ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチルプロピオル酸（０．３１４ｍＬ，２．２８ｍｍｏｌ），ヨウ化銅（Ｉ）（５．８ｍｇ，０．０３０ｍｍｏｌ），酢酸パラジウム（ＩＩ）（３．４ｍｇ，０．０１５ｍｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン（１２ｍｇ，０．０４６ｍｍｏｌ）はＮ２下で一晩６０℃で加熱され、浅黒い懸濁液を得た。全ての揮発性成分が排出された。得られた残留物はＤＣＭに溶解され、沈殿物は濾過された。濾液を蒸発させ、得られた残留物は、溶離液としてＤＣＭと石油エーテルの混合物（ｖ／ｖ １：１）を使用するカラムクロマトグラフィーにより精製され、オフホワイトの固体として、４（１９５ｍｇ，７２％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．４８（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．１３（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．０６（ｓ，１Ｈ），３．８９（ｓ，３Ｈ），１．５４５（ｓ，９Ｈ）及び１．５１４（ｓ，９Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ３７９．１５１０（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ２１Ｈ２４ＮａＯ５ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ３７９．１５１６．
５
ＤＣＭ（２ｍＬ）中の４（１００ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）の溶液に、室温で、ＴＦＡ（１ｍＬ，１２．９８ｍｍｏｌ）が添加された。混合物は２．５時間撹拌され、白色懸濁液を得た。全ての揮発性成分は排出され、得られた残留物はＤＣＭと石油エーテルの混合物（ｖ／ｖ＝１：１）で粉砕され、白色の固体として５（６６ｍｇ，８５％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１３．９２（ｂｒ ｓ，２Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．３７（明らかなｓ，１Ｈ），７．２５（ｄｄ，Ｊ＝１．１，７．９Ｈｚ，１Ｈ），３．９０（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ．
７
ＤＣＭ（３ｍＬ）中のＢｏｃ−ＣＢＩ−ＯＨ（Ｃｏｍｐ５１ａ，２６７ｍｇ，０．８０ｍｍｏｌ）の溶液に、室温で、ジオキサン中の４ＮのＨＣｌ（３ｍＬ）が添加された。混合物は２．５時間撹拌された。全ての揮発性成分は排出され、得られた残留物（６）はそのまま直接使用された。
ＤＭＡ（１ｍＬ）中の６（上記で作製）、５（６５ｍｇ，０．２７ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ塩酸塩（３０６ｍｇ，１．６０ｍｍｏｌ）及びｐ−トルエンスルホン酸（４．６ｍｇ，０．０２７ｍｍｏｌ）の混合物は室温で一晩撹拌された。全ての揮発性成分は排出され、得られた残留物はメタノールで粉砕され、黄色の固体を得て、これをＴＨＦに溶解させ、メタノールの添加により沈殿させ、黄色の固体として７（１４０ｍｇ，７８％，ＨＰＬＣ純度９９％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１０．５２（ｓ，２Ｈ），８．１２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．９０−７．８５（ｍ，４Ｈ），７．７６（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．５６−７．５０（ｍ，３Ｈ），７．４１−７．３７（ｍ，３Ｈ），４．６３−４．４９（ｍ，４Ｈ），４．２９−４．２１（ｍ，２Ｈ），４．０９−４．０６（ｍ，２Ｈ），４．０１（ｓ，３Ｈ），３．９９−３．９４（ｍ，１Ｈ），３．９１−３．８６（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ） ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ６９７．１２６７（Ｍ＋Ｎａ）．Ｃ３９Ｈ２８Ｃｌ２Ｎ２ＮａＯ５ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ６９７．１２６７．
実施例１９ 還元及び再酸化によるコンジュゲーションのためのシステイン操作抗体の調製
特定の条件下で、システイン操作抗体は、ＤＴＴ（クレランド試薬、ジチオトレイトール）又はＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩；Getz et al (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA）などの還元剤で処理することにより、表４のものなどの本発明のリンカー−薬物中間体とのコンジュゲーションのための反応を行い得る。ＣＨＯ細胞で発現される全長システイン操作モノクローナル抗体（ＴｈｉｏＭａｂ）（Gomez et al (2010) Biotechnology and Bioeng. 105(4):748-760; Gomez et al (2010) Biotechnol. Prog. 26:1438-1445）は、例えば、約５０倍過剰のＤＴＴで室温で一晩還元され、新たに導入されたシステイン残基と培養培地中に存在するシステインとの間に形成され得るジスルフィド結合を還元する。
軽鎖アミノ酸はＫａｂａｔに従って番号付けされる（Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, (1991) 5th Ed., US Dept of Health and Human Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD）。重鎖アミノ酸は、Ｋａｂａｔシステムと記された場合を除いてＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる（Edelman et al (1969) Proc. Natl. Acad of Sciences 63(1):78-85）。一文字アミノ酸略語が使用される。
ＣＨＯ細胞で発現された全長のシステイン操作モノクローナル抗体（ＴｈｉｏＭａｂ）は、細胞培養条件によって、システイン付加体（システイン）を有するか又は操作されたシステインにグルタチオン付加される。操作されたシステインの反応性チオール基を遊離させるために、ＴｈｉｏＭａｂを、ｐＨが約８．０にて、５００ｍＭのホウ酸ナトリウム及び５００ｍＭ塩化ナトリウムに溶解させ、１ｍＭのＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（Getz et al (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA）の約５０〜１００倍過剰で約１〜２時間３７℃で還元する。あるいは、ＤＴＴを還元試薬として用いることができる。鎖間ジスルフィド結合の形成は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるか、又は逆相ＨＰＬＣ ＰＬＲＰカラムクロマトグラフィーを変性させるの何れかによってモニターした。還元されたＴｈｉｏＭａｂは１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５で希釈され、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＦＦカラム上にロードされ、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含むＰＢＳ、又は１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５で溶出した。
ジスルフィド結合は、再酸化を行うことで、親Ｍａｂに存在するシステイン残基の間で再確立された。溶出され還元されたＴｈｉｏＭａｂは、室温で一晩、ｐＨ７で３時間若しくは５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ中でｐＨ７．５で３時間、１５×若しくは２ｍＭのデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）で、又は２ｍＭの硫酸銅水溶液（ＣｕＳＯ４）で処理された。当技術分野で知られている他のオキシダント、すなわち酸化剤、及び酸化条件が使用されてもよい。周囲の空気酸化もまた有効であり得る。この穏やかな、部分酸化工程は、高忠実度で効率的に鎖内ジスルフィドを形成する。緩衝液はセファデックスＧ２５樹脂上で溶出によって交換され、１ｍＭのＤＴＰＡを含むＰＢＳで溶出される。チオール／Ａｂの値が、溶液の２８０ｎｍでの吸光度から還元された抗体濃度を決定すること及びＤＴＮＢ（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）との反応によるチオール濃度を決定すること、及び４１２ｎｍでの吸光度の決定によりチェックされる。
液体クロマトグラフィー／質量分析は、拡張された質量範囲でＴＳＱ量子トリプル四重極ＴＭ質量分析計で行った（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。サンプルは７５℃に加熱したＰＲＬＰ−Ｓ（登録商標）、１０００Ａ、マイクロボアカラム（５０ｍｍ×２．１ｍｍ，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｈｒｏｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ）でクロマトグラフィーにかけた。３０−４０％のＢの直線勾配（溶媒Ａ：０．０５％ＴＦＡ水溶液：アセトニトリル中０．０４％のＴＦＡ）が用いられ、溶離液は、エレクトロスプレー源を使用して直接イオン化された。データは、Ｘｃａｌｉｂｕｒ（登録商標）データシステムによって収集され、デコンボリューションは、ＰｒｏＭａｓｓ（登録商標）（Ｎｏｖａｔｉａ，ＬＬＣ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）を用いて行った。ＬＣ／ＭＳ分析の前に、抗体又は薬剤コンジュゲート（５０マイクログラム）がＰＮＧａｓｅ Ｆ（２単位／ｍｌ；ＰＲＯｚｙｍｅ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）により３７℃で２時間処理され、Ｎ結合型糖を除去した。
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）のサンプルが、ブチルＨＩＣ ＮＰＲカラム（２．５ミクロンの粒子サイズ、４．６ｍｍ×３．５ｃｍ）（東ソーバイオサイエンス）に注入され、０．８ｍｌ／分で０から７０％のＢの線形勾配で溶出した（Ａ：５０ｍＭリン酸カリウム中１．５Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ７、Ｂ：５０ｍＭのリン酸カリウムｐＨ７、２０％イソプロパノール）。多波長検出器とＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウエアを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣシステムが、抗体当たりの薬剤の異なる比率を有する抗体種を分離し、定量化するために使用された。
実施例２０ 抗体へのリンカー薬物中間体のコンジュゲーション
実施例１９の還元と再酸化法の後、抗体をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）緩衝液に溶解し、氷上で冷却した。マレイミド又はブロモ酢酸などのチオール反応性官能基を含む、限定されないが表４の５１〜５８を含む、リンカー−薬物中間体の、過剰の約１．５モルから２０当量がＤＭＳＯに溶解され、アセトニトリルと水で希釈され、ＰＢＳ中で冷却され還元され再酸化された抗体に添加された。約１時間後、過剰のマレイミドを添加して反応を停止させ、未反応抗体のチオール基を覆った。コンジュゲーション混合物がロードされ、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ Ｆｆカラムを通して溶出され、過剰な薬物−リンカー中間体及び他の不純物を除去した。反応混合物を遠心限外濾過により濃縮し、システイン操作抗体−薬物コンジュゲートを精製し、ＰＢＳ中でのＧ２５樹脂を通する溶出によって脱塩し、無菌条件下で０．２μｍのフィルターを通して濾過し、貯蔵のために凍結した。
上記の手順で、表３のシステイン操作型抗体−薬物コンジュゲートが調製された。
実施例２１ インビトロ細胞増殖アッセイ
ＡＤＣの有効性は、以下のプロトコルを用いて細胞増殖アッセイにより測定した（ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ ＧＬＯＴＭ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＴＢ２８８；Mendoza et al (2002) Cancer Res. 62:5485-5488）：
１．培地に約１０４細胞（ＳＫＢＲ−３，ＢＴ４７４，ＭＣＦ７又はＭＤＡ−ＭＢ−４６８）を含む細胞培養物の１００μｌのアリコートを、９６ウェルの不透明壁のプレートの各ウェルに沈着させた。
２．コントロールウェルは細胞無しで培地を含有して調製した。
３．ＡＤＣを実験ウェルに添加し、３−５日間インキュベートした。
４．プレートを約３０分間室温にて平衡化した。
５．各ウェル中に存在する細胞培養培地の容積に等しい容積のＣＥＬＬＴＩＴＥＲ ＧＬＯＴＭ試薬を加えた。
６．内容物をオービタルシェーカーで２分間混合して細胞溶解を誘導した。
７．プレートは、発光シグナルを安定化させるために１０分間室温でインキュベートした。
８．発光を記録し、ＲＬＵ＝相対発光単位としてグラフにて報告された。
データは、標準偏差誤差バーと共に、反復の各組について発光の平均値としてプロットされている。プロトコルはＣＥＬＬＴＩＴＥＲ ＧＬＯＴＭ発光細胞の変形である。
培地：ＳＫ−ＢＲ−３は５０／５０／１０％ＦＢＳ／グルタミン／２５０μｇ／ｍＬ Ｇ−４１８で生育し、ＯＶＣＡＲ−３はＲＰＭＩ／２０％ＦＢＳ／グルタミンで生育する。
実施例２２ 高発現ＨＥＲ２トランスジェニック外植マウス及び他の腫瘍モデルにおける腫瘍増殖阻害、インビボでの有効性
第０日目の単一処置の前に、腫瘍は確立され、体積で１５０〜２００ｍｍ３まで増殖させた。腫瘍体積は、次式に従ってキャリパーを用いて測定した：Ｖ（ｍｍ３）＝０．５Ａ×Ｂ２、ここでＡ及びＢは、それぞれ、長い及び短い直径である。腫瘍体積が３０００ｍｍ３に到達する前に、又は腫瘍が切迫した潰瘍の兆候を示したとき、マウスを安楽死させた。各実験群（１群あたり１０匹のマウス）から収集されたデータは、平均±ＳＥとして表した。
Ｆｏ５マウス乳腺腫瘍モデルが、前述のように単一用量の静脈注射後に、本発明の抗体−薬物コンジュゲートのインビボ有効性を評価するために採用され（Phillips GDL, Li GM, Dugger DL, et al. Targeting HER2-Positive Breast Cancer with Trastuzumab-DM1, an Antibody-Cytotoxic Drug Conjugate. (2008) Cancer Res. 68:9280-90）、参照により本明細書に組み込まれる。抗Ｈｅｒ２ ＡＤＣは、図３１及び３２に示されるように、Ｆｏ５モデル、ヒトＨＥＲ２遺伝子が、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ−ＨＥＲ２）の転写制御下で乳腺上皮において過剰発現されるトランスジェニックマウスモデルを用いて試験された。ＨＥＲ２過剰発現は乳腺腫瘍の自発的な増殖を引き起こす。これらの樹立動物（樹立＃５［Ｆｏ５］）の一匹の乳腺腫瘍は腫瘍断片（〜２×２ｍｍの大きさ）の連続移植によってＦＶＢマウスの後の世代に伝播される。全ての研究は、実験動物の管理と使用に関するガイドラインに従って実施された。各抗体−薬物コンジュゲート（単一用量）は、研究の開始、及び移植後第１４日に９匹の動物に静脈内投与した。初期腫瘍サイズは約２００ｍｍ３の体積であった。本発明による抗体−薬物コンジュゲートとコントロールによる時間の経過による腫瘍増殖阻害の測定は図３１〜３４に示される。
ＯＶＣＡＲ−３乳房脂肪パッド移植有効性モデルが、単回静脈内投与後の腫瘍体積を評価し、腹腔内腫瘍を有するマウスから切除され、その後、レシピエントマウスの乳房脂肪パッドに連続的に継代された腫瘍を用いて、記載されているように（Chen et al. (2007) Cancer Res 67:4924-4932）使用された。
抗Ｎａｐｉ２Ｂ抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の有効性は、Ｉｇｒｏｖ−１（ヒト卵巣癌）のマウス異種移植モデルにおいて調べられた。
メスのＣ．Ｂ−１７ ＳＣＩＤベージュマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）はそれぞれ、００万のＩｇｒｏｖ−１細胞を胸部乳房脂肪パッド領域に接種された。異種移植腫瘍が１００〜３００ｍｍ３の平均腫瘍容積に達したとき（第０日と称す）、動物は、各々７〜１０匹ずつの群に無作為化され、ＡＤＣの単回静脈内注射を受けた。マウスの腫瘍及び体重は、研究を通して週に１〜２回測定された。マウスは、体重の減少が、その出発重量の＞２０％であった場合速やかに安楽死させた。全ての動物は、腫瘍が３０００ｍｍ３に達したか、切迫した潰瘍の兆候を示す前に、安楽死させた。抗Ｎａｐｉ２Ｂ抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ１３４）は、ビヒクル群と比較して腫瘍増殖の用量依存的阻害を実証した。非標的性対照（ＡＤＣ１３５）は、腫瘍増殖には影響を与えなかった（図３６）。
抗ＣＤ３３抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の有効性は、ＨＬ−６０又はＥＯＬ−１（ヒト急性骨髄性白血病）のマウス異種移植モデルにおいて調べられた。ＨＬ−６０細胞株は、ＡＴＣＣから入手され（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、ＥＯＬ−１細胞株は、ＤＳＭＺに由来する（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ；Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
メスのＣ．Ｂ−１７ ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）はそれぞれ、ＨＬ−６０又はＥＯＬ−１の５００万細胞を脇腹領域に皮下接種された。異種移植腫瘍が１００〜３００ｍｍ３の平均腫瘍容積に達したとき（第０日と称す）、動物は、各々７〜１０匹ずつの群に無作為化され、ＡＤＣの単回静脈内注射を受けた。ＡＤＣの投与の前の約４時間で、動物は、腹腔内に、腫瘍細胞の可能な非特異的抗体結合部位をブロックする抗ｇＤ対照抗体の過剰量（３０ｍｇ／ｋｇ）が投与された。マウスの腫瘍及び体重は、研究を通して週に１〜２回測定された。マウスは、体重の減少が、その出発重量の＞２０％であった場合速やかに安楽死させた。全ての動物は、腫瘍が３０００ｍｍ３に達したか、切迫した潰瘍の兆候を示す前に、安楽死させた。
前述の発明は、明確な理解の目的のために例示及び実施例によってある程度詳細に説明されてきたが、これらの説明や例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。明細書全体を通して引用された全ての特許、特許出願、及び参考文献は、出典明示により援用される。

Claims (37)

  1. 式：
    Figure 2017503010
    を有する抗体−薬物コンジュゲート化合物であって、
    ここで、
    Ａｂは抗体であり；
    Ｌは、式：
    Figure 2017503010
    を有するリンカーであり；
    ここでＳｔｒは抗体に共有結合したストレッチャー単位であり；Ｐｅｐは２から１２個のアミノ酸残基の任意のペプチド単位であり、Ｓｐは二量体の薬物部分に共有結合した任意のスペーサー単位であり、ｍ及びｎは０及び１から独立に選択され；
    ｐは１から８の整数であり；
    Ｄは式：
    Figure 2017503010
    を有する二量体薬物部分であり、
    ここで
    Ｒ１は、Ｈ、Ｐ（Ｏ）３Ｈ２、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、又はＬへの結合から選択され；
    Ｒ２は、Ｈ、Ｐ（Ｏ）３Ｈ２、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、又はＬへの結合から選択され；
    Ｒａ及びＲｂは、Ｈ及び一以上のＦで任意置換されたＣ１−Ｃ６アルキルから独立に選択され、
    又はＲａ及びＲｂは、５又は６員複素環基を形成し；
    Ｔは、Ｃ３−Ｃ１２アルキレン、Ｙ、（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）、（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）、（Ｃ２−Ｃ６アルケニレン）−Ｙ−（Ｃ２−Ｃ６アルケニレン）及び（Ｃ２−Ｃ６アルキニレン）−Ｙ−（Ｃ２−Ｃ６アルキニレン）から選択されるテザー基であり；
    ここで、ＹはＯ、Ｓ、ＮＲ１、アリール、及びヘテロアリールから独立に選択され；
    ここで、アルキレン、アルケニレン、アリール、及びヘテロアリールは、Ｆ、ＯＨ、Ｏ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、ＮＨ２、ＮＨＣＨ３、Ｎ（ＣＨ３）２、ＯＰ（Ｏ）３Ｈ２、及びＣ１−Ｃ６アルキルで独立に任意置換され、ここでアルキルは、一以上のＦで任意置換され；
    又はアルキレン、アルケニレン、アリール及びヘテロアリールは、Ｌへの結合で独立に任意置換され；
    Ｄ’は
    Figure 2017503010
    から選択される薬物部分であり、
    ここで波線はＴへの結合部位を示し；
    Ｘ１及びＸ２は、Ｏ及びＮＲ３から独立して選択され、ここでＲ３は、Ｈ及び一以上のＦで任意置換されたＣ１−Ｃ６アルキルから選択され；
    Ｒ４は、Ｈ、ＣＯ２Ｒ、又はＬへの結合であり、ここでＲはＣ１−Ｃ６アルキル又はベンジルであり；且つ
    Ｒ５は、Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキルであり；ここで抗体はＮａｐｉ２ｂに結合する、抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  2. Ｓｔｒが式：
    Figure 2017503010
    を有し、
    ここで、Ｒ６は、Ｃ１−Ｃ１０アルキレン、Ｃ３−Ｃ８カルボシクリル、Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、アリーレン、Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−アリーレン、アリーレン−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン、Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−（Ｃ３−Ｃ８カルボシクリル）、（Ｃ３−Ｃ８カルボシクリル）−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン、Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクリル、Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクリル）、（Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクリル）−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン、Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ８）−Ｃ２−Ｃ６アルキレン−Ｎ（Ｒ８）、Ｎ（Ｒ８）−（Ｃ２−Ｃ６アルキレン）及び（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２からなる群から選択され；ここでＲ８は、Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、ｒは１から１０の範囲の整数である、請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  3. Ｒ６が（ＣＨ２）５である、請求項２に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  4. ｍが０であり、ｎが０である、請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  5. ｍが０であり、ｎが１である、請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  6. Ｓｔｒが式：
    Figure 2017503010
    を有し、
    ここで、Ｒ７は、Ｃ１−Ｃ１０アルキレン、Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−Ｏ、Ｎ（Ｒ８）−（Ｃ２−Ｃ６アルキレン）−Ｎ（Ｒ８）、Ｎ（Ｒ８）−（Ｃ２−Ｃ６アルキレン）、及び（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２から選択され；ここでＲ８はＨ又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、ｒは１から１０の範囲の整数である、請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  7. Ｓｔｒが式：
    Figure 2017503010
    を有し、
    ここで、Ｒ９は、Ｃ１−Ｃ１０アルキレン、Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−Ｏ、（Ｃ２−Ｃ６アルキレン）−Ｎ（Ｒ８）、及び（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２から選択され；ここでＲ８はＨ又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、ｒは１から１０の範囲の整数である、請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  8. Ｌは、抗体のシステインアミノ酸とジスルフィド結合を形成し、Ｒ９は、Ｃ２−Ｃ６アルキレン−Ｏであり、ここでアルキレンは、Ｆ、ＯＨ、Ｏ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、ＮＨ２、ＮＨＣＨ３、Ｎ（ＣＨ３）２、ＯＰ（Ｏ）３Ｈ２、及びＣ１−Ｃ６アルキルと任意置換され、ここでアルキルは一以上のＦと任意置換される、請求項７に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  9. ｍが１であり、ｎが１である、請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  10. ｍが１であり、Ｐｅｐが、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、リジン、アルギニン、バリン、及びシトルリンから独立に選択される２から１２個のアミノ酸残基を含む、請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  11. Ｐｅｐがバリン−シトルリンである、請求項１０に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  12. ｎが１であり、Ｓｐがパラ−アミノベンジル又はパラ−アミノベンジルオキシカルボニルを含む、請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  13. 式：
    Figure 2017503010
    を有し、
    ここで、ＡＡ１及びＡＡ２は、アミノ酸側鎖から独立に選択され；ｐは１から８の整数である、請求項９に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  14. アミノ酸側鎖は、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２（Ｃ６Ｈ５）、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、−ＣＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、及び−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２から独立に選択される、請求項１３に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  15. 式：
    Figure 2017503010
    を有する、請求項１４に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  16. 式：
    Figure 2017503010
    を有する、請求項１５に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  17. 式：
    Figure 2017503010
    を有する、請求項１６に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  18. 式：
    Figure 2017503010
    を有する、請求項９に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  19. 式：
    Figure 2017503010
    を有する、請求項１８に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  20. 式：
    Figure 2017503010
    を有する、請求項９に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  21. 式：
    Figure 2017503010
    を有する、請求項２０に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  22. 式：
    Figure 2017503010
    を有し、
    ここで、Ｒ７はＨ及びＣ１−Ｃ１２アルキルから独立に選択される、請求項２０に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  23. Ｒａ及びＲｂが、Ｎ−メチルピペラジニル、モルホリニル、ピペリジル、及びピロリジニルから選択される５又は６員複素環基を形成する、請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  24. Ｔが、Ｃ３−Ｃ５アルキレンである、請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  25. Ｔが、（ＣＨ２）３、（ＣＨ２）４及び（ＣＨ２）５から選択される、請求項２４に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  26. Ｔが、（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）であり、Ｙが、Ｌへの結合で置換されるフェニルである、請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  27. Ｔが、（Ｃ２−Ｃ６アルケニレン）−Ｙ−（Ｃ２−Ｃ６アルケニレン）であり、Ｙが、Ｌへの結合で置換されるフェニルである、請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  28. Ｙが、フェニル、ピリジル、１−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール、及び［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジンから選択される、請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  29. Ｄ’が
    Figure 2017503010
    である、請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  30. Ｄ’が
    Figure 2017503010
    である、請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  31. Ｄ’が
    Figure 2017503010
    である、請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  32. 抗体が、３つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３）及び３つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３）を含み、
    ＨＶＲ−Ｌ１が配列番号７５のアミノ酸配列を含み；
    ＨＶＲ−Ｌ２が配列番号７６のアミノ酸配列を含み；
    ＨＶＲ−Ｌ３が配列番号７７のアミノ酸配列を含み；
    ＨＶＲ−Ｈ１が配列番号７８のアミノ酸配列を含み；
    ＨＶＲ−Ｈ２が配列番号７９のアミノ酸配列を含み；及び
    ＨＶＲ−Ｈ３が配列番号８０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  33. 抗体が、配列番号８１のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域又は配列番号８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項３２に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  34. 抗体が、配列番号８１のアミノ酸配列を含む軽鎖超可変領域、配列番号８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項３２に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
  35. 請求項１から４４の何れか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物、及び薬学的に許容される担体、流動促進剤、希釈剤、又は賦形剤を含む薬学的組成物。
  36. 請求項３５に記載の薬学的組成物の治療的有効量を患者に投与することを含む、癌を治療する方法。
  37. ａ）請求項３５に記載の薬学的組成物；及び
    ｂ）使用説明書
    を含む、癌を治療するためのキット。
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