JP2015514437A - ヒト多能性幹細胞からの神経幹細胞およびドーパミン作動性ニューロンの誘導方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から神経幹細胞（ＮＳＣ）およびドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンを生成する化学的に定義された方法に部分的に基づく。本発明のＤＡニューロンは、ｈＰＳＣおよびＮＳＣから誘導され得る。本発明はまた、ヒト多能性幹細胞からの神経幹細胞およびドーパミン作動性ニューロンの誘導に有用な試薬およびキットを提供する。

Description

発明の分野
本発明は、概して、幹細胞に関し、より具体的には、ヒト多能性幹細胞から神経幹細胞およびドーパミン作動性ニューロンを誘導するための方法に関する。

背景情報
ヒト胚性幹細胞（ＥＳ）細胞は、非常に多くの細胞型に分化し得る多能性細胞である。幹細胞は、２つの重要な特徴によって他の細胞型とは区別される。第１に、それらは、時には長い不活性期間の後に、細胞分裂を通じてそれら自体を再生させることができる未分化細胞である。第２に、ある特定の生理学的または実験的条件下において、それらは、特別な機能を有する組織または器官特異的細胞になるように誘起することができる。腸および骨髄等のいくつかの器官において、幹細胞は、通常、消耗または損傷した組織の修復および置き換えを行うように分化する。しかしながら、膵臓および心臓等の他の器官では、幹細胞は、特定の条件下で分化するのみである。

胚発生の際、幹細胞は、外胚葉、中胚葉、および胚体内胚葉という３つの主要な細胞集団から、身体組織を形成する。中胚葉は、血球、内皮細胞、心筋および骨格筋、ならびに脂肪細胞を発生させる。胚体内胚葉は、肝臓、膵臓、および肺を生成する。外胚葉は、神経系、皮膚、および副腎組織を発生させる。

幹細胞の潜在的な用途は、薬物療法のための細胞および組織を作ることである。現在、臓器提供された器官および組織が、罹患または損傷したものを置き換えるために使用されることが多い。残念ながら、移植を必要とする人の数は、移植に利用できる器官の数をはるかに上回る。幹細胞は、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄損傷、熱傷、心臓疾患、糖尿病、および関節炎を含む、多種多様な疾患、状態、および障害を治療するための、再生可能な置き換え細胞および組織源の可能性を提供する。

パーキンソン病（ＰＤ）は、黒質緻密部における中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンの進行性変性によって引き起こされる神経学的障害である。ＤＡニューロンの変性は、とりわけ、震え、硬直、および運動緩慢といった症状をもたらす運動系の漸進的機能不全を引き起こす。現在のところ、ＰＤの治療法はなく、脳深部刺激およびレボドパ等の治療が一部の症状を緩和し得るとはいえ、それらは、時間とともに効力を失う傾向にある。しかしながら、ＤＡニューロンの消失が黒質（ＳＮ）に局在化されるという性質により、細胞置き換え療法はパーキンソン病（ＰＤ）患者を治療するための魅力的なアプローチとなっている。神経幹細胞（ＮＳＣ）およびＤＡニューロン等の神経性細胞の埋め込みは、ＰＤ動物モデルにおいて運動症状を改善することが既に示されている。幹細胞に基づくＰＤ治療法が現実となるためには、最終分化が患者の脳または培養下で起こるかどうかに応じてインサイチュまたはインビトロのいずれかで機能的ＤＡニューロンを生成する、均質なＮＳＣ集団の生成が可能であることが非常に重要である。

本発明は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から神経幹細胞（ＮＳＣ）およびドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンを生成する化学的に定義された方法に部分的に基づく。本発明のＤＡニューロンは、ｈＰＳＣおよびＮＳＣから誘導され得る。本発明はまた、ヒト多能性幹細胞からの神経幹細胞およびドーパミン作動性ニューロンの誘導に有用な試薬およびキットを提供する。

本発明は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を少なくとも１つの神経幹細胞誘起化合物で処理し、細胞を神経幹細胞マーカーについてアッセイすることによる、神経幹細胞（ＮＳＣ）の誘導を提供する。本発明はまた、新しく開発された化学指向性分化方法を用いて、細胞を増殖させて凍結保存することができる、安定なＮＳＣ期を介する堅固かつ再現可能な方式で、ｈＰＳＣからの高純度のＤＡニューロン集団の誘導を提供する。

一実施形態において、本発明は、神経幹細胞（ＮＳＣ）を生成する方法を提供する。本方法は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）をチェックポイントキナーゼ１（ＣＫ１）阻害剤および骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤で処理し、細胞を神経幹細胞マーカーについて分析することを含む。一態様において、ＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８である。別の態様において、ＢＭＰ阻害剤は、ドルソモルフィン、ＬＤ−１９３１８９、またはＤＭＨ−１であり得る。特定の態様において、ＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８であり、ＢＭＰ阻害剤はドルソモルフィンである；ＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８であり、ＢＭＰ阻害剤はＬＤ−１９３１８９である；およびＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８であり、ＢＭＰ阻害剤はＤＭＨ−１である。

ある態様において、ｈＰＳＣはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト単為生殖幹細胞（ｈｐＳＣ）、もしくは人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、またはそれらから誘導された細胞系である。

一態様において、神経幹細胞マーカーには、ＢＲＮ２、ＣＤ１１３、ＣＤ１５、ＣＸＣＲ４、ＤＣＸ、ＦＡＢＰ７、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＯ４、ＧＦＡＰ、ＬＭＸ１Ａ、ムサシ−１、ＭＡＰ２、ネスチン、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、ＴＵＢＢ３、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、もしくはＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。

別の態様において、ｈＰＳＣは、ＳＢ２１８０７８およびＤＭＨ−１で処理される。結果として得られるＮＣＳは、ＬＭＸ１ＡおよびＦＯＸ２Ａを発現し、腹側中脳神経外胚葉細胞である。腹側中脳神経外胚葉細胞は、ドーパミン作動性ニューロンの前駆体である。

一実施形態において、本発明は、神経幹細胞（ＮＳＣ）を提供する。本主題のＮＳＣは、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）をチェックポイントキナーゼ１（ＣＫ１）阻害剤および骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤で処理し、細胞を神経幹細胞マーカーについて分析することによって生成される。一態様において、ＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８である。別の態様において、ＢＭＰ阻害剤は、ドルソモルフィン、ＬＤ−１９３１８９、またはＤＭＨ−１であり得る。特定の態様において、ＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８であり、ＢＭＰ阻害剤はドルソモルフィンである；ＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８であり、ＢＭＰ阻害剤はＬＤ−１９３１８９である；およびＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８であり、ＢＭＰ阻害剤はＤＭＨ−１である。

ある態様において、ｈＰＳＣはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト単為生殖幹細胞（ｈｐＳＣ）、もしくは人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、またはそれらから誘導された細胞系である。

別の実施形態において、本発明は、ドーパミン作動性ニューロンを生成する方法を提供する。本方法は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）をチェックポイントキナーゼ１（ＣＫ１）阻害剤および骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤で処理すること、処理したｈＰＳＣを神経幹細胞マーカーについてアッセイすることによって神経幹細胞を識別すること、ＮＳＣを少なくとも１つのドーパミン作動性ニューロン誘起化合物で処理すること、ならびに細胞をドーパミン作動性ニューロン細胞マーカーについてアッセイすることを含む。ある特定の態様において、ＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８であり、ＢＭＰ阻害剤は、ドルソモルフィン、ＬＤ−１９３１８９、またはＤＭＨ−１である。好ましい態様において、ＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８であり、ＢＭＰ阻害剤はＤＭＨ−１である。

ある態様において、ｈＰＳＣはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト単為生殖幹細胞（ｈｐＳＣ）、もしくは人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、またはそれらから誘導された細胞系である。

本方法の一態様において、神経幹細胞マーカーは、ＢＲＮ２、ＣＤ１１３、ＣＤ１５、ＣＸＣＲ４、ＤＣＸ、ＦＡＢＰ７、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＯ４、ＧＦＡＰ、ＬＭＸ１Ａ、ムサシ−１、ＭＡＰ２、ネスチン、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、ＴＵＢＢ３、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、もしくはＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。

本方法のある特定の態様において、ドーパミン作動性ニューロン誘起化合物は、ホモキノリン酸、Ｌ−システインスルフィン酸、キヌレン酸、（Ｒ）−（＋）−ＨＡ−９６６、ｍ−クロロフェニルビグアニド塩酸塩、カルペプチン、ジマプリット二塩酸塩、８−ヒドロキシ−ＤＰＡＴ臭化水素酸塩、トランス−４−ヒドロキシクロトン酸、ファスジル塩酸塩、チオペラミド、レチノイン酸、ＡＭ５８０、ＴＴＮＰＢ、レモキシプリド塩酸塩、ＩＣＩ ２１５，００１塩酸塩、イミロキサン塩酸塩、スピペロン塩酸塩、ケンパウロン、ＣＬ ２１８８７２、ＣＶ １８０８、Ｒｏ １５−４５１３、リノピルジン二塩酸塩、ググルステロン、Ｃｈ ５５、３−ＭＡＴＩＤＡ、ＳＥＷ ２８７１、イメスリジン二臭化水素酸塩、ＬＹ ３６４９４７、トラニルシプロミン塩酸塩、（−）−シスチン、もしくはニルタミド、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。好ましい態様において、ドーパミン作動性ニューロン誘起化合物は、ググルステロンである。

本方法のさらなる態様において、ドーパミン作動性ニューロン細胞マーカーは、ＴＵＪ１、ＴＨ、Ｄａｔ、Ｆｏｘａ２、Ｎｕｒｒ−１、Ｇｉｒｋ２、ＭＡＰＴ、ＳＹＴ４、ＦＯＸＡ１、ＤＤＣ、ＡＳＣＬ１、ＰＩＮＫ１、ＰＡＸ５、ＬＭＸ１Ｂ、ＰＩＴＸ３、ＮＵＲＲ−１、ＬＭＸ１Ａ、ＥＮ１、ＰＡＸ２、ＴＦＦ３、ＰＩＴＸ２、ＤＣＸ、ＭＡＰ２、ＰＩＴＸ１、もしくはＶＭＡＴ２、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。

さらなる実施形態において、本発明は、ドーパミン作動性ニューロンを提供する。本主題のＤＡニューロンは、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）をチェックポイントキナーゼ１（ＣＫ１）阻害剤および骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤で処理し、処理したｈＰＳＣを神経幹細胞マーカーについてアッセイすることによって神経幹細胞を識別し、ＮＳＣを少なくとも１つのドーパミン作動性ニューロン誘起化合物で処理し、細胞をドーパミン作動性ニューロン細胞マーカーについて分析することによって生成される。ある特定の態様において、ＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８であり、ＢＭＰ阻害剤は、ドルソモルフィン、ＬＤ−１９３１８９、またはＤＭＨ−１である。好ましい態様において、ＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８であり、ＢＭＰ阻害剤はＤＭＨ−１である。

ある態様において、ｈＰＳＣはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト単為生殖幹細胞（ｈｐＳＣ）、もしくは人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、またはそれらから誘導された細胞系である。

本方法の一態様において、神経幹細胞マーカーは、ＢＲＮ２、ＣＤ１１３、ＣＤ１５、ＣＸＣＲ４、ＤＣＸ、ＦＡＢＰ７、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＯ４、ＧＦＡＰ、ＬＭＸ１Ａ、ムサシ−１、ＭＡＰ２、ネスチン、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、ＴＵＢＢ３、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、もしくはＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。

本方法のさらなる態様において、ドーパミン作動性ニューロン誘起化合物は、ホモキノリン酸、Ｌ−システインスルフィン酸、キヌレン酸、（Ｒ）−（＋）−ＨＡ−９６６、ｍ−クロロフェニルビグアニド塩酸塩、カルペプチン、ジマプリット二塩酸塩、８−ヒドロキシ−ＤＰＡＴ臭化水素酸塩、トランス−４−ヒドロキシクロトン酸、ファスジル塩酸塩、チオペラミド、レチノイン酸、ＡＭ５８０、ＴＴＮＰＢ、レモキシプリド塩酸塩、ＩＣＩ ２１５，００１塩酸塩、イミロキサン塩酸塩、スピペロン塩酸塩、ケンパウロン、ＣＬ ２１８８７２、ＣＶ １８０８、Ｒｏ １５−４５１３、リノピルジン二塩酸塩、ググルステロン、Ｃｈ ５５、３−ＭＡＴＩＤＡ、ＳＥＷ ２８７１、イメスリジン二臭化水素酸塩、ＬＹ ３６４９４７、トラニルシプロミン塩酸塩、（−）−シスチン、もしくはニルタミド、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。好ましい態様において、ドーパミン作動性ニューロン誘起化合物は、ググルステロンである。

本方法のさらなる態様において、ドーパミン作動性ニューロン細胞マーカーは、ＴＵＪ１、ＴＨ、Ｄａｔ、Ｆｏｘａ２、Ｎｕｒｒ−１、Ｇｉｒｋ２、ＭＡＰＴ、ＳＹＴ４、ＦＯＸＡ１、ＤＤＣ、ＡＳＣＬ１、ＰＩＮＫ１、ＰＡＸ５、ＬＭＸ１Ｂ、ＰＩＴＸ３、ＮＵＲＲ−１、ＬＭＸ１Ａ、ＥＮ１、ＰＡＸ２、ＴＦＦ３、ＰＩＴＸ２、ＤＣＸ、ＭＡＰ２、ＰＩＴＸ１、もしくはＶＭＡＴ２、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。

別の実施形態において、本発明は、ＮＳＣの誘導のためのキットを提供する。キットには、チェックポイントキナーゼ１（ＣＫ１）阻害剤および骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤、神経幹細胞マーカーを識別するための試薬、ならびにｈＰＳＣからＮＳＣを生成するための指示書が含まれ得る。一態様において、ＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８であり、ＢＭＰ阻害剤は、ドルソモルフィン、ＬＤ−１９３１８９、またはＤＭＨ−１である。ある特定の態様において、ＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８であり、ＢＭＰ阻害剤はドルソモルフィンである；ＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８であり、ＢＭＰ阻害剤はＬＤ−１９３１８９である；ＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８であり、ＢＭＰはＤＭＨ−１である。キットには、ＢＲＮ２、ＣＤ１１３、ＣＤ１５、ＣＸＣＲ４、ＤＣＸ、ＦＡＢＰ７、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＯ４、ＧＦＡＰ、ＬＭＸ１Ａ、ムサシ−１、ＭＡＰ２、ネスチン、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、ＴＵＢＢ３、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、またはＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５神経幹細胞マーカーを識別するための試薬が含まれ得る。

別の実施形態において、本発明は、ドーパミン作動性ニューロンの生成のためのキットを提供する。キットには、チェックポイントキナーゼ１（ＣＫ１）阻害剤および骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤、神経幹細胞マーカーを識別するための試薬、少なくとも１つのドーパミン作動性ニューロン誘起化合物、ドーパミン作動性ニューロン細胞マーカーを識別するための試薬、ならびにｈＰＳＣからドーパミン作動性ニューロンを生成するための指示書が含まれ得る。一態様において、ＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８であり、ＢＭＰ阻害剤はＤＭＨ−１であり、ドーパミン作動性ニューロン誘起化合物は、ググルステロンである。キットには、ＢＲＮ２、ＣＤ１１３、ＣＤ１５、ＣＸＣＲ４、ＤＣＸ、ＦＡＢＰ７、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＯ４、ＧＦＡＰ、ＬＭＸ１Ａ、ムサシ−１、ＭＡＰ２、ネスチン、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、ＴＵＢＢ３、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、またはＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５神経幹細胞マーカーを識別するための試薬が含まれ得る。キットにはまた、ＴＵＪ１、ＴＨ、Ｄａｔ、Ｆｏｘａ２、Ｎｕｒｒ−１、Ｇｉｒｋ２、ＭＡＰＴ、ＳＹＴ４、ＦＯＸＡ１、ＤＤＣ、ＡＳＣＬ１、ＰＩＮＫ１、ＰＡＸ５、ＬＭＸ１Ｂ、ＰＩＴＸ３、ＮＵＲＲ−１、ＬＭＸ１Ａ、ＥＮ１、ＰＡＸ２、ＴＦＦ３、ＰＩＴＸ２、ＤＣＸ、ＭＡＰ２、ＰＩＴＸ１、またはＶＭＡＴ２ドーパミン作動性ニューロン細胞マーカーを識別するための試薬が含まれ得る。

さらなる実施形態において、本発明は、神経学的疾患および障害の治療方法を提供する。本方法は、神経学的疾患または障害を有する対象にＮＳＣを投与することを含む。

さらなる実施形態において、本発明は、神経学的疾患および障害を治療する方法を提供する。本方法は、神経学的疾患または障害を有する対象にＮＳＣまたはＤＡニューロンを投与することを含む。

ハイスループットの神経誘起（ｎｅｕｒｏｉｎｄｉｃｔｉｏｎ）小分子スクリーニングアッセイを図示する。未分化のフィーダーフリーｈＰＳＣを、９６ウェルプレートに播き、小分子で処理した後、固定してＰＡＸ６発現について染色する。 小分子で処理したｈＰＳＣのＰＡＸ６発現についてのスクリーニングを示すグラフである。ドルソモルフィンと組み合わせてＳＢ２１８０７８で処理することにより、ＰＡＸ６の高度な発現がもたらされた。 ＳＢ２１８０７８と、ドルソモルフィン、ＤＭＨ−１、またはＬＤ１９３１８９とで処理したｈＰＳＣに対するＲＴ−ＰＣＲによる、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｐａｘ６、Ｏｔｘ２、Ｌｍｘ１、およびＦｏｘ２Ａの発現を示すグラフである。 ネスチンおよびムサシＩの発現を示す、７継代でのｈＰＳＣ由来のＮＳＣのＦＡＣｓ分析を示す。 小分子を通じたｈＰＳＣ由来のＮＳＣの生成を示し、（Ａ）ｈＰＳＣの神経誘起のための小分子スクリーニング戦略を示す図である。（Ｂ）ＳＢ２１８０７８およびＤＭＨ１で７日間処理し、ＰＡＸ６に関して染色したｈＰＳＣである。スケールバーは１００μｍである。（Ｃ）ネスチン、ムサシ、およびＰＡＸ６について染色した増殖したｈＰＳＣ−ＮＳＣである。スケールバーは１００μｍである。（Ｄ）ムサシ、ネスチン、ＰＡＸ６、およびＯＣＴ４について染色したｈＰＳＣ−ＮＳＣ集団のＦＡＣＳ分析である。（Ｅ）ｈＰＳＣからＮＳＣへの神経マーカーの発現誘起の倍率を示す、遺伝子発現マイクロアレイ分析である；ｎ＝２。（Ｆ）ＲＴ−ＰＣＲによるｈＰＳＣおよびｈＰＳＣ−ＮＳＣの遺伝子発現分析である。平均±標準誤差、両側スチューデントｔ検定：ｎ＝３〜５；α＝０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊Ｐ＜０．０５。 ググルステロンがＤＡニューロンの生成を促進することを示し、（Ａ）ｈＰＳＣ由来のＮＳＣ（ｈＰＳＣ−ＮＳＣ）のＤＡニューロンへの分化のための小分子スクリーニング戦略を示す図。（Ｂ）ググルステロン（ＧＳ）での３０日間の処理後のドーパミン作動性マーカーの染色である。スケールバーは１００μｍである。（Ｃ）ＴＨについて染色した誘導ＤＡニューロンのＦＡＣＳ分析である。（Ｄ）遺伝子発現マイクロアレイ分析によって判定される、ＮＳＣからＤＡニューロンへのドーパミン作動性マーカーの誘起倍率である；ｎ＝２。（Ｅ）ＲＴ−ＰＣＲによるＤＡニューロン、ＮＳＣ、および未分化ｈＰＳＣにおける相対的遺伝子発現である。平均±標準誤差、ＤＡニューロンおよびＮＳＣの発現をｈＰＳＣ対照と比較するダネット検定による１要因ＡＮＯＶＡ：ｎ＝３〜５；α＝０．０５；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊Ｐ＜０．０５。（Ｆ）ＧＳ処理したニューロンと対照細胞（ＧＳの代わりに１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ８および２μＭのプルモルファミンで１周間、および０．１％ＤＭＳＯで２週間処理ＮＳＣ）を対比させたドーパミン放出アッセイである。平均±標準誤差、両側スチューデントｔ検定：ｎ＝３；α＝０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１。（Ｇ）全細胞パッチクランプを行ったＧＳ処理ニューロンの代表的な位相差画像である。スケールバーは１０μｍである。（Ｈ）（Ｇ）において電圧固定モードで−６０から＋５０ｍＶの電圧ランプを細胞に適用することによって誘起されたナトリウム電流である。ランプのパラメータおよび波形は、電流トレース上に重ねて赤色で示す。青色の矢印は、刺激ランプが０ｍＶ値と交わる点を示す。（Ｉ）（ｇ）において電流固定モードで２００ミリ秒間５００ｐＡの注入で細胞から誘起された活動電位である。活動電位は、パッチクランプを行った２０個の細胞中７個に確認された。（Ｊ）ＧＳ処理ニューロンの細胞外微小電極アレイ（ＭＥＡ）記録であり、３つの代表的な電極の１０秒間の電圧トレースを示す。各電極の単一のスパイクを右に拡大する。（Ｋ）（ｊ）における電極のスパイク間の間隔ヒストグラムであり、（↓↓）はバースト内のスパイク間の間隔と関連するピークを示し、（↓）はバースト間またはバーストしていない電極の個々のスパイク間のより長い間隔のものを示す。記録は二連で行われた。

発明の詳細な説明
本発明は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から神経幹細胞（ＮＳＣ）およびドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンを生成する方法に部分的に基づく。本発明のＤＡニューロンは、ｈＰＳＣおよびＮＳＣから誘導され得る。本発明はまた、ヒト多能性幹細胞からの神経幹細胞およびドーパミン作動性ニューロンの誘導に有用な試薬およびキットを提供する。

本組成物および方法を説明する前に、本発明が、記載される特定の組成物、方法、および実験条件に限定されるものではなく、したがって、そのような組成物、方法、および条件は多様であり得ることを理解されたい。本明細書に使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるため、制限することを意図するものではないことも理解されたい。

本明細書および添付の特許請求の範囲に使用される際、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈により別途明確に示されない限り、複数形の参照を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、本開示等を読むことで当業者に明らかとなるであろう本明細書に記載される１つ以上の方法および／またはステップを含む。

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者により一般に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書に記載のものと同様もしくは同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料は、本明細書に説明される。

本発明は、ｈＰＳＣを少なくとも１つの神経幹細胞誘起化合物で処理し、神経幹細胞マーカーについて細胞をアッセイすることによる、神経幹細胞（ＮＳＣ）の誘導を提供する。本発明はまた、新しく開発された化学指向性分化方法を用いて、細胞を増殖させて凍結保存することができる、安定なＮＳＣ期を介する堅固かつ再現可能な方式で、ｈＰＳＣからの高純度のＤＡニューロン集団の誘導を提供する。

ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト単為生殖幹細胞（ｈｐＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含むがこれらに限定されない、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）からの神経幹細胞（ＮＳＣ）の生成は、神経学的疾患の細胞に基づく治療戦略の重要な構成要素である。しかしながら、ｈＰＳＣ由来のＮＳＣが治療法で利用可能となる前に、ＮＳＣの生成を再現可能かつ堅固に誘起する化学的に定義された培養条件を確立させる必要がある。ここで、ハイスループットのスクリーニングを行って、ｈＰＳＣのＮＳＣへの分化を誘起する小分子を識別した。チェックポイントキナーゼ１（ＣＫ１）の既報の阻害剤である小分子ＳＢ２１８０７８を、スクリーニングによって識別し、これを使用して、ｈＰＳＣをＮＳＣに分化させる化学的に定義された分化方法を確立させた。

本明細書に報告される化学的方法は、細胞療法または創薬のための成熟ニューロンにさらに分化し得る、ｈＰＳＣからの均質なＮＳＣ集団の生成を提供する。

ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト単為生殖幹細胞（ｈｐＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含むがこれらに限定されない、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）からのドーパミン作動性細胞（ＤＣ）の生成は、パーキンソン病の細胞に基づく治療戦略の重要な構成要素である。しかしながら、ｈＰＳＣ由来のＤＣが治療法で利用可能となる前に、ドーパミン作動性細胞分化を再現可能かつ堅固に誘起する化学的に定義された培養条件を確立する必要がある。ハイスループットのスクリーニングを行って、ｈＰＳＣ由来の神経幹細胞（ｈＰＳＣ−ＮＳＣ）のドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンへの分化を誘起する小分子を識別した。小分子をスクリーニングによって識別し、次いで、これを使用して、ｈＰＳＣ−ＮＳＣをドーパミン作動性細胞に分化させる化学的に定義された分化方法を確立させた。

本明細書に報告される化学的方法は、パーキンソン病等の神経学的疾患の細胞治療または創薬に使用することができる、ｈＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンを生成するための指示を提供する。さらに、ドーパミン作動性細胞分化の誘起物質として本明細書に報告される小分子は、強力なインビトロでのヒトドーパミンニューロン神経保護効果を有することがわかっており、パーキンソン病等の神経学的疾患の予防および／または進行に使用することができる。

ヒト多能性幹細胞のＤＡニューロンへの段階的分化を調節する新しい小分子が、識別されている。ステロイドであるググルステロンが、神経幹細胞のＤＡニューロンへの最も効果的な誘起物質であることがわかった。これらのニューロンは、広く特徴付けられ、機能的であると示されている。この新しいアプローチは、神経学的疾患の患者の治療に使用するために十分な量のニューロンを作製する実用的な手段を提供する。

本明細書に記載される、神経幹細胞（ＮＳＣ）、ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロン、ならびに結果として得られる幹細胞およびニューロンを誘導する方法は、胚性幹細胞等のヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から生成される。本明細書に使用される際、「胚性」とは、単一の接合体で開始し、成長した配偶子細胞以外に多能性または全能性細胞を含まなくなった多細胞性構造で終了する、生物の成長期の範囲を指す。配偶子融合によって誘導される胚に加えて、「胚性」は、体細胞核移植によって誘導される胚も指す。ヒト幹細胞は、当該技術分野で既知の方法を使用して、実質的に分化することなく多能性状態で培養物中で維持することができる。そのような方法は、例えば、米国特許第５，４５３，３５７号、同第５，６７０，３７２号、同第５，６９０，９２６号、同第５，８４３，７８０号、同第６，２００，８０６号、および同第６，２５１，６７１号に記載され、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書に使用される際、「複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）」または「複能性細胞」とは、限定された数の他の特定の細胞型を発生し得る細胞型を指す。複能性細胞の例には、限定された数の他の細胞を発生し得る、外胚葉細胞、内胚葉細胞、中胚葉細胞、および神経幹細胞が挙げられる。

本明細書に使用される際、「多能性細胞」とは、別の分化組織型、すなわち、外胚葉、中胚葉、および内胚葉を生じ得る、未分化状態で長期間の理論上無期限な期間の間インビトロで維持することができる細胞を指す。ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）には、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト単為生殖幹細胞（ｈｐＳＣ）、および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が含まれるが、これらに限定されない。このようなｈＰＳＣを得る方法は、当該技術分野で周知である。

ｈＰＳＣを得る１つの方法は、単為生殖によるものである。「単為生殖」（「単為発生的に活性化される」および「単為生殖的に活性化される」は、本明細書に互換的に使用される）とは、卵母細胞の活性化が精子進入の不在下で起こることによるプロセスを指し、すべてが雌性起源であるＤＮＡを含む、卵母細胞または胚性細胞、例えば、卵割球の活性化によって得られる、栄養外胚葉および内部細胞塊を含む初期胚の成長を指す。関連する態様において、「単為生殖生物」とは、このような活性化によって結果として得られる細胞を指す。別の関連する態様において、「胚盤胞」とは、外部栄養膜細胞および内部細胞塊（ＩＣＭ）からできた中空の細胞球を含む、活性化された卵母細胞の受精したものの開裂期を指す。さらなる関連する態様において、「胚盤胞形成」とは、卵母細胞の受精または活性化後に、卵母細胞が、続いて外部栄養膜細胞およびＩＣＭからできた中空の細胞球に成長できる期間（例えば、５〜６日間）培地中で培養されるプロセスを指す。

ｈＰＳＣを得る別の方法は、核移植を通じたものである。本明細書に使用される際、「核移植」とは、ドナー細胞またはドナー細胞由来のＤＮＡを、典型的に同じかまたは異なる種の卵母細胞である好適なレシピエント細胞（移植または融合の前、最中、または後にその内因性核ＤＮＡを除去または不活性化するように処理される）に融合または移植することを指す。核移植に使用されるドナー細胞には、胚性および分化細胞、例えば、体細胞および生殖細胞が含まれる。ドナー細胞は、増殖細胞周期（Ｇ１、Ｇ２、Ｓ、もしくはＭ）または非増殖状態（Ｇ０もしくは静止状態）であり得る。好ましくは、ドナー細胞またはドナー細胞由来のＤＮＡは、増殖状態の哺乳動物細胞培養物、例えば、線維芽細胞培養物から誘導される。ドナー細胞は、任意選択的に、トランスジェニックであってもよい、すなわち、１つ以上の遺伝子付加、置換、または欠失修飾を含んでもよい。

ｈＰＳＣを得るためのさらなる方法は、人工多能性幹細胞が得られるように細胞を再プログラミングすることによるものである。Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ １３１，８６１−８７２（２００７））は、胚またはＥＳ（胚性幹）細胞を使用することなく分化細胞を再プログラミングし、ＥＳ細胞のものに類似する多能性および成長能力を有する誘起性多能性幹細胞を確立する方法を開示した。Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．は、分化線維芽細胞の種々の異なる核再プログラミング因子について記載しており、これらには、次の４つの遺伝子の生成物が含まれる：Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、およびＭｙｃファミリー遺伝子。

細胞の多能性状態は、好ましくは、適切な条件下で細胞を培養することによって、例えば、白血病阻害因子（ＬＩＦ）を含む線維芽細胞フィーダー層または別のフィーダー層もしくは培養物で培養することによって、維持される。そのような培養細胞の多能性状態は、種々の方法、例えば、（ｉ）多能性細胞の特徴を示すマーカーの発現を確認すること、（ｉｉ）多能性細胞の遺伝子型を発現する細胞を含有するキメラ動物の生成、（ｉｉｉ）インビボで別の分化細胞型の生成を伴う、動物、例えば、ＳＣＩＤマウスへの細胞の注入、ならびに（ｉｖ）インビトロでの胚様体および他の分化細胞型への細胞の分化の観察（例えば、フィーダー層またはＬＩＦの不在下で培養した場合）によって、確認することができる。

本発明に使用される細胞の多能性状態は、種々の方法によって確認することができる。例えば、細胞を、特徴的なＥＳ細胞マーカーの存在または不在について試験することができる。ヒトＥＳ細胞の場合、このようなマーカーの例は、上記に特定されており、ＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、およびＯＣＴ４が含まれ、当該技術分野で既知である。

また、多能性は、細胞を好適な動物、例えば、ＳＣＩＤマウスに注入し、分化細胞および組織の生成を観察することによって確認することができる。多能性を確認するさらに別の方法は、本主題の多能性細胞を用いてキメラ動物を生成し、導入された細胞の異なる細胞型への寄与を観察することである。

多能性を確認するなおも別の方法は、分化に有利な条件下（例えば、線維芽細胞フィーダー層の除去）で培養した場合に、胚様体および他の分化細胞型へのＥＳ細胞の分化を観察することである。この方法が利用されており、本主題の多能性細胞は、組織培養液中で、胚様体および別の分化細胞型を生じることが確認されている。

結果として得られる多能性細胞および細胞系、好ましくはヒト多能性細胞および細胞系は、多数の治療および診断用途を有する。そのような多能性細胞は、多数の疾患状態の治療において、細胞移植療法または遺伝子療法（遺伝子操作した場合）に使用することができる。

ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）には、ヒト胚性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、人工多能性幹細胞、およびそのような細胞によって生成された細胞系が含まれるが、これらに限定されない。ｈＰＳＣは、神経幹細胞を誘導することが所望されるときまで、通例の継代によって多能性状態で培養液中に維持される。

「ＮＳＣ」（「複能性神経幹細胞」とも称される）は、次の特性のうちの１つ以上を呈する：１）ネスチンの発現、２）Ｓｏｘ２の発現、３）ムサシ１の発現、４）単分子層または懸濁培養液中の神経球としてのいずれかで、自己再生を行う能力、５）ニューロン、ニューロンの特定のサブタイプ、星状細胞、および乏突起膠細胞に分化する能力、ならびに６）ＮＳＣに典型的な形態学的特徴。

ＮＳＣは、神経系の主要な表現型を生成する、自己再生する複能性細胞である。ＮＳＣは、主として、ニューロン、星状細胞、および乏突起膠細胞に分化する。

神経外胚葉（または神経の外胚葉もしくは神経管上皮）は、ノギン等のタンパク質から骨形態形成（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ）タンパク質阻害シグナルを受容し、それがこの組織からの神経系の成長をもたらす、外胚葉を表す用語である。外胚葉から発達した後、神経外胚葉は、３段階の成長を受ける：神経板への形質転換、神経溝（関連する神経襞を伴う）への形質転換、および神経管への形質転換。神経管の形成後、脳は、後脳、中脳、および前脳の３つの部分へと形成される。

神経幹細胞は、ＡＢＣＧ２、ＡＳＣＬ１／Ｍａｓｈ１、β−ＩＩＩチューブリン、ＢＭＩ−１、Ｂｒｇ１、ＢＲＮ２、ＣＤＣＰ１、ＣＤ１１３、ＣＤ１５、ＣＸＣＲ４、ＤＣＸ、ＦＡＢＰ、ＦＡＢＰ７／Ｂ−ＳＬＡＩＮ１、ＦＡＢＰ８／Ｍ−ＦＡＢＰ、ＦＧＦ Ｒ４、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＯ４、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−９、ＧＦＡＰ、Ｇｌｕｔ１、ＨＯＸＢ１、ＬＭＸ１Ａ、ＭＡＰ２、ムサシ−１、ムサシ−２、ネスチン、ＮｅｕｒｏＤ１、ノギン、Ｎｏｔｃｈ−１、Ｎｏｔｃｈ−２、ヌクレオステミン、乏突起膠細胞マーカーＯ４、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、ＰＤＧＦ Ｒα、プロミニン２、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、ＳＯＸ９、ＳＯＸ１１、ＳＯＸ２１、ＳＳＥＡ−１、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＴＵＢＢ３、ＴＲＡＦ−４、および／またはビメンチンを含むがこれらに限定されない、神経幹細胞マーカーの発現の増加を検出することによって識別することができる。

ネスチンは、主に中枢神経系（ＣＮＳ）の幹細胞で発現するが、ほぼすべての成熟ＣＮＳ細胞ではその発現が存在しないため、有用なマーカーである。転写因子ＳＯＸ２は、成長中のＣＮＳの神経上皮において高レベルで発現することが既知であり、神経幹細胞の増殖および分化に中心的に重要であると考えられる。

本発明は、ｈＰＳＣを少なくとも１つの神経幹細胞誘起化合物で処理し、細胞を神経幹細胞マーカーについてアッセイすることによる、神経幹細胞（ＮＳＣ）の誘導のための方法を提供する。

一実施形態において、本発明は、神経幹細胞（ＮＳＣ）を生成する方法を提供する。本方法は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）をチェックポイントキナーゼ１（ＣＫ１）阻害剤および骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤で処理し、細胞を神経幹細胞マーカーについて分析することを含む。一態様において、ＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８である。別の態様において、ＢＭＰ阻害剤は、ドルソモルフィン、ＬＤ−１９３１８９、またはＤＭＨ−１であり得る。特定の態様において、ＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８であり、ＢＭＰ阻害剤はドルソモルフィンである；ＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８であり、ＢＭＰ阻害剤はＬＤ−１９３１８９である；およびＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８であり、ＢＭＰ阻害剤はＤＭＨ−１である。

ある態様において、ｈＰＳＣはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト単為生殖幹細胞（ｈｐＳＣ）、もしくは人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、またはそれらから誘導された細胞系である。

一態様において、神経幹細胞マーカーには、ＢＲＮ２、ＣＤ１１３、ＣＤ１５、ＣＸＣＲ４、ＤＣＸ、ＦＡＢＰ７、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＯ４、ＧＦＡＰ、ＬＭＸ１Ａ、ムサシ−１、ＭＡＰ２、ネスチン、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、ＴＵＢＢ３、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、もしくはＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、またはこれらの組み合わせが含まれる。

実施例で例証されるように、本発明は、ＢＲＮ２、ＣＤ１１３、ＣＤ１５、ＣＸＣＲ４、ＤＣＸ、ＦＡＢＰ７、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＯ４、ＧＦＡＰ、ＬＭＸ１Ａ、ムサシ−１、ＭＡＰ２、ネスチン、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、ＴＵＢＢ３、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、およびＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５を発現するＮＳＣを提供する。

本明細書に使用される際、「神経幹細胞誘起化合物」は、ｈＰＳＣがＮＳＣになるように誘起する化合物である。そのような化合物には、チェックポイントキナーゼ阻害剤および骨形態形成タンパク質阻害剤が挙げられるがこれらに限定されない。

チェックポイント１キナーゼ（Ｃｈｋ１）は、細胞周期中、Ｇ２移行の制御に重要な役割を果たす。Ｇ１、Ｓ、およびＧ２における３つのチェックポイントは、ＤＮＡ損傷に応答して活性化される。ＤＮＡの損傷は、何らかの化学薬剤、または放射線、またはＤＮＡ複製によって誘起される。チェックポイントの役割は、ＤＮＡ損傷が起こった場合に、ＤＮＡ修復の時間を与えるために細胞周期の進行を遅延させることである。Ｇ１／Ｓチェックポイントは、ｐ５３依存性である。ＤＮＡ損傷が存在する場合、ｐ５３活性の急速な誘起が起こり、サイクリン依存性キナーゼ阻害および細胞周期停止を誘起して、Ｓ期での損傷したＤＮＡの複製を防止する。Ｇ１チェックポイントが欠落したｐ５３変異細胞においては、Ｇ２チェックポイントのみが、細胞周期進行の遅延をもたらし、ＤＮＡ修復経路の活性化を可能にすることができる。Ｃｈｋ１阻害剤は、Ｇ２チェックポイントを無効にする。

ＣＫ１阻害剤の例には、ＳＢ−２１８０７８、ヒメニアルジシン、デブロモヒメニアルジシン、ＰＤ０１６６２８５、１３−ヒドロキシ−１５−オキソゾアパト系（ｏｘｏｚｏａｐａｔ ｌｉｎｅ）、グラヌラチミド（ｇｒａｎｕｌａｔｉｍｉｄｅ）、イソグラヌラチミド（ｉｓｏｇｒａｎｕｌａｔｉｍｉｄｅ）、およびＳ２７８８８が挙げられるがこれらに限定されない。

骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）は、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーに属する多機能性成長因子である。もともとは骨および軟骨の形成を誘起する能力により発見されたＢＭＰは、現在では、中心的な形態形成シグナル群を構築し、体全体の組織構造を編成すると考えられている。ＢＭＰは、骨形態形成タンパク質受容体（ＢＭＰＲ）と称される細胞表面上の特異的な受容体と相互作用する。ＢＭＰＲを通したシグナル伝達は、結果としてタンパク質ＳＭＡＤファミリーのメンバーの動員をもたらす。ＢＭＰが関与するシグナル伝達経路である、ＢＭＰＲおよびＳｍａｄは、心臓、中枢神経系、および軟骨の成長、ならびに出生後の骨成長に重要である。それらは、胚発生の際、胚パターン形成および初期の骨格形成に重要な役割を有する。ＢＭＰシグナル伝達は、心臓、神経、および軟骨の成長に重要な役割を果たす。

ＢＭＰ阻害剤の例には、ドルソモルフィン、ＬＤ−１９３１８９、およびＤＭＨ−１が挙げられるがこれらに限定されない。

ｈＰＳＣ由来のＮＳＣは、当業者に周知の方法を使用して容易に識別することができる。これらの方法には、免疫組織化学、ＦＡＣＳ分析、およびＲＮＡ発現レベルの測定を使用して神経幹細胞マーカーを識別することが含まれる。

一実施形態において、本発明は、神経幹細胞を提供する。本主題のＮＳＣは、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）をチェックポイントキナーゼ１（ＣＫ１）阻害剤および骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤で処理し、細胞を神経幹細胞マーカーについて分析することによって生成される。一態様において、ＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８である。別の態様において、ＢＭＰ阻害剤は、ドルソモルフィン、ＬＤ−１９３１８９、またはＤＭＨ−１であり得る。特定の態様において、ＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８であり、ＢＭＰ阻害剤はドルソモルフィンである；ＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８であり、ＢＭＰ阻害剤はＬＤ−１９３１８９である；およびＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８であり、ＢＭＰ阻害剤はＤＭＨ−１である。

ある態様において、ｈＰＳＣはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト単為生殖幹細胞（ｈｐＳＣ）、もしくは人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、またはそれらから誘導された細胞系である。

一態様において、ＮＳＣは、ＢＲＮ２、ＣＤ１１３、ＣＤ１５、ＣＸＣＲ４、ＤＣＸ、ＦＡＢＰ７、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＯ４、ＧＦＡＰ、ＬＭＸ１Ａ、ムサシ−１、ＭＡＰ２、ネスチン、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、ＴＵＢＢ３、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、およびＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、またはこれらの任意の組み合わせであり得る神経幹細胞マーカーを発現する。

別の態様において、ｈＰＳＣは、ＳＢ２１８０７８およびＤＭＨ−１で処理される。結果として得られるＮＣＳは、ＬＭＸ１ＡおよびＦＯＸ２Ａを発現し、腹側中脳神経外胚葉細胞である。腹側中脳神経外胚葉細胞は、ドーパミン作動性ニューロンの前駆体である。

ＮＳＣが誘導された後、この細胞を、星状細胞、ニューロン、および乏突起膠細胞等の他の神経細胞型に分化する能力を保持した状態で、長期間の理論上無期限な期間の間、インビトロで維持することができる。実施例に記載されるように、ｈＰＳＣ由来のＮＳＣは、少なくとも７継代の間、ＮＳＣ培地においてマトリゲルコーティングプレートで成長させることができる。

実施例に示されるように、ハイスループットのスクリーニング戦略を用いて、ＳＢ２１８０７８およびＤＭＨ−１という２つの強力の神経誘起物質が識別されている（図５Ａ）。ｈＰＳＣ由来のＮＳＣ（ｈＰＳＣ−ＮＳＣ）集団は、ネスチン、ムサシ−１、ＰＡＸ６、ＦＡＢＰ７、ＢＲＮ２、ＳＯＸ３、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＣＸＣＲ４、ＤＣＸ、ＮＥＳ、ＭＳＩ、ＣＤ１１３、ＣＤ１５、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＯ４、ＧＦＡＰ、ＬＭＸ１Ａ、ＭＡＰ２、ＯＴＸ２、ＴＵＢＢ３、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、およびＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５神経幹細胞マーカーには陽性であり、ＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧ多能性マーカーには陰性であった（図３、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ、および５Ｆ）。ＦＡＢＰ７は、ＣＮＳ成長に関与する脳内脂肪酸結合タンパク質をコードし、ＮＳＣ中に高度に発現する。ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５は、α２，６−シアリルトランスフェラーゼをコードし、これは、細胞の血液脳関門通過を媒介する。さらに、ＳＢ２１８０７８およびＤＭＨ−１を用いて誘導されたＮＳＣは、ＬＭＸ１ＡおよびＦＯＸ２Ａを発現した。ＬＭＸ１ＡおよびＦＯＸ２Ａは、ドーパミン作動性ニューロンの前駆体である腹側中脳神経外胚葉細胞に発現する。これらのＮＳＣは、さらなる増殖、凍結保存、および分化に好適であり、ＤＡニューロンの実用的な源となっている。このように、本発明は、ｈＰＳＣからＮＳＣを生成する開示の方法を例証する。

本発明はまた、定義された化学的条件下におけるｈＰＳＣからのドーパミン作動性ニューロンの生成も提供する。

本明細書に使用される際、「分化」とは、細胞にある特定の特別な機能を獲得させ、ある特定の別の特別な機能ユニットに変化する能力を失わせるように、細胞に起こる変化を指す。分化の能力を有する細胞は、全能性、多能性、複能性細胞のいずれかであり得る。分化は、成熟した成体細胞に関して、部分的または全面的であり得る。

「分化細胞」は、特定の分化状態、すなわち、非胚性状態を有する、非胚性細胞を指す。３つの最短分化細胞型は、内胚葉、中胚葉、および外胚葉である。

ｈＰＳＣ由来のＮＳＣは、複能性であり、ニューロン、星状細胞、および乏突起膠細胞を含む、複数の神経細胞型へと分化し得る。

集合的に星状膠細胞としても知られる星状細胞は、脳および脊髄における特徴的な星形グリア細胞である。それらは、ヒトの脳内に最も豊富な細胞である。それらは、血液脳関門を形成する内皮細胞の生化学的補助、神経組織への栄養の提供、細胞外イオンバランスの維持、ならびに外傷後の脳および脊髄の修復および瘢痕化における役割を含む、多数の機能を行う。

ニューロンは、電気および化学信号を通じて情報を処理および伝達する、電気的興奮性細胞である。化学信号は、他の細胞への特別な接続部であるシナプスを介して発生する。ニューロンは、互いに接続して神経回路網を形成する。ニューロンは、脳、脊髄、および末梢神経節を含む神経系の中心構成要素である。多数の特化した種類のニューロンが存在する：感覚ニューロンは、感覚器官の細胞に作用する接触、音、光、および多数の他の刺激に応答し、それが、次いで、脊髄および脳にシグナルを送る。運動ニューロンは、脳および脊髄からシグナルを受容し、筋肉の収縮をもたらし、腺に作用する。介在ニューロンは、脳または脊髄の同じ領域内でニューロンを他のニューロンに接続する。数種類のニューロンが存在する：コリン作動性、ＧＡＢＡ作動性、グルタミン酸作動性、ドーパミン作動性、およびセロトニン作動性。

コリン作動性ニューロン。アセチルコリンは、シナプス前ニューロンからシナプス間隙に放出される。これは、リガンド開口型イオンチャネルおよび代謝調節型（ＧＰＣＲ）ムスカリン受容体の両方のリガンドとして機能する。ニコチン受容体は、ニコチンに結合するαおよびβサブユニットから構成される、五量体リガンド開口型イオンチャネルである。リガンド結合によりチャネルが開き、Ｎａ^＋流入して脱分極を引き起こし、シナプス前神経伝達物質放出の確率を高める。

ＧＡＢＡ作動性ニューロン-γアミノ酪酸。ＧＡＢＡは、ＣＮＳにおける２つの神経阻害物質のうちの１つであり、もう１つはグリシンである。ＧＡＢＡは、ＡＣｈに相同な機能を有し、アニオンチャネルを開閉して、Ｃｌ⁻イオンがシナプス後ニューロンに入ることを可能にする。Ｃｌ⁻は、ニューロン内での過分極を引き起こし、電圧がより負になるにつれて活動電位の発火確率を減少させる（活動電位が発火するためには、正電圧閾値に達する必要があることを思い起こされたい）。

グルタミン酸作動性ニューロン。グルタミン酸は、２つの主要な興奮性アミノ酸のうちの１つであり、もう１つはアスパラギン酸である。グルタミン酸受容体は、４つの分類のうちの１つであり、４つのうちの３つは、リガンド開口型イオンチャネルであり、そのうちの１つはＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲと称されることが多い）である。ＡＭＰＡおよびカイニン酸受容体はいずれも、迅速な興奮性シナプス伝達を媒介するＮａ＋カチオンチャネルに対して透過性のカチオンチャネルとして機能する。ＮＭＤＡ受容体は、Ｃａ^２＋により透過性である別のカチオンチャネルである。ＮＭＤＡ受容体の機能は、チャネル孔内で共アゴニストとして結合するグリシン受容体に依存する。ＮＭＤＡ受容体は、両方のリガンドが存在しなければ機能しない。代謝調節型受容体であるＧＰＣＲは、シナプス伝達およびシナプス後興奮性を調節する。グルタミン酸は、脳への血流が遮断された場合に興奮毒性を引き起こし、結果として脳の損傷をもたらし得る。血流が抑制されると、グルタミン酸は、シナプス前ニューロンから放出され、通常ストレス条件外で起こるものよりも多くのＮＭＤＡおよびＡＭＰＡ受容体活性化を引き起こし、シナプス後ニューロンに進入するＣａ^２＋およびＮａ^＋が上昇し、細胞損傷につながる。

ドーパミン作動性ニューロン。ドーパミンは、ｃＡＭＰおよびＰＫＡを増加させるＤ１型（Ｄ１およびＤ５）Ｇｓ共役型受容体、ならびにｃＡＭＰおよびＰＫＡを減少させるＧｉ共役型受容体を活性化させる、Ｄ２型（Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４）受容体に作用する、神経伝達物質である。ドーパミンは、気分および挙動と関連し、シナプス前および後両方の神経伝達を調節する。黒質内のドーパミンニューロンの消失は、パーキンソン病と関連付けられている。

セロトニン作動性ニューロン。セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン、５−ＨＴ）は、興奮性または阻害性として作用し得る。４つの５−ＨＴ受容体クラスのうち、３つはＧＰＣＲであり、１つはリガンド開口型カチオンチャネルである。セロトニンは、トリプトファンヒドロキシラーゼによってトリプトファンから合成され、次いで、芳香族酸デカルボキシラーゼによってさらに合成される。シナプス後ニューロンにおける５−ＨＴの欠如は、鬱と関連付けられている。プロザックおよびゾロフト等のシナプス前セロトニン輸送体を遮断する薬物が、治療に用いられている。

乏突起膠細胞は、別の種類の脳細胞である。乏突起膠細胞の主な機能は、一部の脊椎動物の中枢神経系（脳および脊髄）において、支持を提供し、軸索（神経細胞の長い突起）を隔離することである。乏突起膠細胞は、８０％が脂質で２０％がタンパク質であるミエリン鞘を作ることによって、これを行う。単一の乏突起膠細胞は、そのプロセスを５０軸索まで延ばし、各軸索の周囲におおよそ１μｍのミエリン鞘を取り巻くことができる。各乏突起膠細胞は、複数の隣接する軸索に１セグメントのミエリンを形成する。

適正な培養条件下において、主題のＮＳＣは、例えば、中脳ドーパミン作動性系統の遺伝子、例えば、Ｎｕｒｒ１およびＰｉｔｘ３といった、特定の神経系遺伝子を発現するように誘起され得る。

主題のＮＳＣは、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）を発現するニューロンに分化するように誘起され得る。ＴＨは、ドーパミン作動性ニューロンの既知のマーカーである。いくつかの実施形態において、主題のＮＳＣは、運動ニューロンに分化し、ここで、運動ニューロンは、ＨＢ９に陽性である。いくつかの実施形態において、主題のＮＳＣは、ＧＡＢＡ作動性ニューロンに分化し、ここで、ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、ＧＡＤ６７に陽性である。いくつかの実施形態において、主題の誘起ＮＳＣは、ドーパミン作動性ニューロンに分化し、ここで、ドーパミン作動性ニューロンは、ＴＨ陽性である。

ニューロンは、ニューロンマーカーであるＴｕｊ１（β−ＩＩＩ−チューブリン）；ＭＡＰ−２（微小管結合タンパク質２、ＭＡＰ−１または−５等の他のＭＡＰ遺伝子も使用可能である）；抗軸索成長クローン；ＣｈＡＴ（コリンアセチルトランスフェラーゼ）；ＣｇＡ（抗クロマグラニン（ｃｈｒｏｍａｇｒａｎｉｎ）Ａ）；ＤＡＲＲＰ（ドーパミンおよびｃＡＭＰ調節型リンタンパク質）；ＤＡＴ（ドーパミン輸送体）；ＧＡＤ（グルタミン酸デカルボキシラーゼ）；ＧＡＰ（成長関連タンパク質）；抗ＨｕＣタンパク質；抗ＨｕＤタンパク質；．α．−インターネキシン；ＮｅｕＮ（ニューロン特異的核タンパク質）；ＮＦ（神経フィラメント）；ＮＧＦ（神経成長因子）；γ−ＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）；ペリフェリン；ＰＨ８；ＰＧＰ（タンパク質遺伝子産物）；ＳＥＲＴ（セロトニン輸送体）；シナプシン；Ｔａｕ（神経原線維変化タンパク質）；抗Ｔｈｙ−１；ＴＲＫ（チロシンキナーゼ受容体）；ＴＲＨ（トリプトファンヒドロキシラーゼ）；抗ＴＵＣタンパク質；ＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）；ＶＲＬ（バニロイド受容体様タンパク質）；ＶＧＡＴ（小胞状ＧＡＢＡ輸送体）、ＶＧＬＵＴ（小胞状グルタミン酸輸送体）の発現によって識別することができる。

主題のＮＳＣの分化を誘起することによって生成されたニューロンを、機能的基準に従って試験することができる。例えば、カルシウム流出は、神経伝達物質またはインビボでニューロンに作用することが既知の他の環境条件に応答して、任意の標準的な技術によって測定することができる。まず、集団内のニューロン様細胞を、形態学的基準によって、またはＮＣＡＭ等のマーカーによって識別する。次いで、神経伝達物質または条件を細胞に適用し、応答を監視する。さらに、細胞を標準的なパッチクランプ技術に供して、活動電位の根拠が存在するかどうか、および適用した電位と応答の間の遅延時間がどれほどであるかを判定する。主題のＮＳＣの分化物は、ニューロンの形態学的特徴を有する亜集団を含有する培養物を生成し得、ＮＣＡＭまたはＭＡＰ−２陽性であり、ＧＡＢＡ、アセチルコリン、ＡＴＰ、および高いナトリウム濃度、グルタミン酸、グリシン、アスコルビン酸、ドーパミン、またはノルエピネフリンのうちの１つ以上に対して応答を示す。いくつかの実施形態において、主題の分化ＮＣＡＭまたはＭＡＰ−２陽性物また、パッチクランプシステムにおいて活動電位を呈する。

ドーパミン作動性ニューロンのマーカーには、ＴＵＪ１、ＴＨ、Ｄａｔ、Ｆｏｘａ２、Ｎｕｒｒ−１、Ｇｉｒｋ２、ＭＡＰＴ、ＳＹＴ４、ＦＯＸＡ１、ＤＤＣ、ＡＳＣＬ１、ＰＩＮＫ１、ＰＡＸ５、ＬＭＸ１Ｂ、ＰＩＴＸ３、ＮＵＲＲ−１、ＬＭＸ１Ａ、ＥＮ１、ＰＡＸ２、ＴＦＦ３、ＰＩＴＸ２、ＤＣＸ、ＭＡＰ２、ＰＩＴＸ１、もしくはＶＭＡＴ２、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

星状細胞は、星状細胞のマーカーであるＧＦＡＰ（グリア細胞線維性酸性タンパク質）、Ｓ１００β等の発現によって識別される。

乏突起膠細胞は、主題の誘起ＮＳＣから生成され得る。乏突起膠細胞は、乏突起膠細胞マーカーＧＣ（ガラクトセレブロシド、ＧａｌＣとも称される）；ＭＢＰ（ミエリン塩基性タンパク質）；ＣＮＰａｓｅ（２'，３'−環状ヌクレオチド３'−ホスホジエステラーゼ［または−ホスホヒドロラーゼ］）；または乏突起膠細胞マーカー神経内分泌特異的タンパク質−４（ＮＳＰ４、レチキュロン（ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ）−４もしくはＲＴＮ４としても知られる）、ＲＩＰ（２'，３'−環状ヌクレオチド３'−ホスホジエステラーゼ）、ミエリン／乏突起膠細胞特異的タンパク質（ＭＯＳＰ）、乏突起膠細胞系統転写因子２（Ｏｌｉｇ２）、乏突起膠細胞マーカーＯ１、ＮｏｇｏＡ、または乏突起膠細胞マーカーＯ４の発現によって識別され得る。

本発明は、ＮＳＣからのＤＡニューロン分化についてのハイスループットのスクリーニングアッセイを提供する。

別の実施形態において、本発明は、ドーパミン作動性ニューロンを生成する方法を提供する。本方法は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）をチェックポイントキナーゼ１（ＣＫ１）阻害剤および骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤で処理すること、処理したｈＰＳＣを神経幹細胞マーカーについてアッセイすることによって神経幹細胞を識別すること、ＮＳＣを少なくとも１つのドーパミン作動性ニューロン誘起化合物で処理すること、ならびに細胞をドーパミン作動性ニューロン細胞マーカーについて分析することを含む。ある特定の態様において、ＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８であり、ＢＭＰ阻害剤は、ドルソモルフィン、ＬＤ−１９３１８９、またはＤＭＨ−１である。好ましい態様において、ＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８であり、ＢＭＰ阻害剤はＤＭＨ−１である。

ある態様において、ｈＰＳＣはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト単為生殖幹細胞（ｈｐＳＣ）、もしくは人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、またはそれらから誘導された細胞系である。

本方法の一態様において、神経幹細胞マーカーは、ＢＲＮ２、ＣＤ１１３、ＣＤ１５、ＣＸＣＲ４、ＤＣＸ、ＦＡＢＰ７、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＯ４、ＧＦＡＰ、ＬＭＸ１Ａ、ムサシ−１、ＭＡＰ２、ネスチン、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、ＴＵＢＢ３、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、もしくはＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。

本方法のさらなる態様において、ドーパミン作動性ニューロン誘起化合物は、ホモキノリン酸、Ｌ−システインスルフィン酸、キヌレン酸、（Ｒ）−（＋）−ＨＡ−９６６、ｍ−クロロフェニルビグアニド塩酸塩、カルペプチン、ジマプリット二塩酸塩、８−ヒドロキシ−ＤＰＡＴ臭化水素酸塩、トランス−４−ヒドロキシクロトン酸、ファスジル塩酸塩、チオペラミド、レチノイン酸、ＡＭ５８０、ＴＴＮＰＢ、レモキシプリド塩酸塩、ＩＣＩ ２１５，００１塩酸塩、イミロキサン塩酸塩、スピペロン塩酸塩、ケンパウロン、ＣＬ ２１８８７２、ＣＶ １８０８、Ｒｏ １５−４５１３、リノピルジン二塩酸塩、ググルステロン、Ｃｈ ５５、３−ＭＡＴＩＤＡ、ＳＥＷ ２８７１、イメスリジン二臭化水素酸塩、ＬＹ ３６４９４７、トラニルシプロミン塩酸塩、（−）−シスチン、もしくはニルタミド、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。好ましい態様において、ドーパミン作動性ニューロン誘起化合物は、ググルステロンである。

本方法のさらなる態様において、ドーパミン作動性ニューロン細胞マーカーは、ＴＵＪ１、ＴＨ、Ｄａｔ、Ｆｏｘａ２、Ｎｕｒｒ−１、Ｇｉｒｋ２、ＭＡＰＴ、ＳＹＴ４、ＦＯＸＡ１、ＤＤＣ、ＡＳＣＬ１、ＰＩＮＫ１、ＰＡＸ５、ＬＭＸ１Ｂ、ＰＩＴＸ３、ＮＵＲＲ−１、ＬＭＸ１Ａ、ＥＮ１、ＰＡＸ２、ＴＦＦ３、ＰＩＴＸ２、ＤＣＸ、ＭＡＰ２、ＰＩＴＸ１、もしくはＶＭＡＴ２、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。

さらなる実施形態において、本発明は、ドーパミン作動性ニューロンを提供する。本主題のＤＡニューロンは、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）をチェックポイントキナーゼ１（ＣＫ１）阻害剤および骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤で処理し、処理したｈＰＳＣを神経幹細胞マーカーについてアッセイすることによって神経幹細胞を識別し、ＮＳＣを少なくとも１つのドーパミン作動性ニューロン誘起化合物で処理し、細胞をドーパミン作動性ニューロン細胞マーカーについて分析することによって生成される。ある特定の態様において、ＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８であり、ＢＭＰ阻害剤は、ドルソモルフィン、ＬＤ−１９３１８９、またはＤＭＨ−１である。好ましい態様において、ＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８であり、ＢＭＰ阻害剤はＤＭＨ−１である。

ある態様において、ｈＰＳＣはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト単為生殖幹細胞（ｈｐＳＣ）、もしくは人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、またはそれらから誘導された細胞系である。

本方法の一態様において、神経幹細胞マーカーは、ＢＲＮ２、ＣＤ１１３、ＣＤ１５、ＣＸＣＲ４、ＤＣＸ、ＦＡＢＰ７、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＯ４、ＧＦＡＰ、ＬＭＸ１Ａ、ムサシ−１、ＭＡＰ２、ネスチン、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、ＴＵＢＢ３、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、もしくはＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。

本方法のさらなる態様において、ドーパミン作動性ニューロン誘起化合物は、ホモキノリン酸、Ｌ−システインスルフィン酸、キヌレン酸、（Ｒ）−（＋）−ＨＡ−９６６、ｍ−クロロフェニルビグアニド塩酸塩、カルペプチン、ジマプリット二塩酸塩、８−ヒドロキシ−ＤＰＡＴ臭化水素酸塩、トランス−４−ヒドロキシクロトン酸、ファスジル塩酸塩、チオペラミド、レチノイン酸、ＡＭ５８０、ＴＴＮＰＢ、レモキシプリド塩酸塩、ＩＣＩ ２１５，００１塩酸塩、イミロキサン塩酸塩、スピペロン塩酸塩、ケンパウロン、ＣＬ ２１８８７２、ＣＶ １８０８、Ｒｏ １５−４５１３、リノピルジン二塩酸塩、ググルステロン、Ｃｈ ５５、３−ＭＡＴＩＤＡ、ＳＥＷ ２８７１、イメスリジン二臭化水素酸塩、ＬＹ ３６４９４７、トラニルシプロミン塩酸塩、（−）−シスチン、もしくはニルタミド、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。好ましい態様において、ドーパミン作動性ニューロン誘起化合物は、ググルステロンである。

本方法のさらなる態様において、ドーパミン作動性ニューロン細胞マーカーは、ＴＵＪ１、ＴＨ、Ｄａｔ、Ｆｏｘａ２、Ｎｕｒｒ−１、Ｇｉｒｋ２、ＭＡＰＴ、ＳＹＴ４、ＦＯＸＡ１、ＤＤＣ、ＡＳＣＬ１、ＰＩＮＫ１、ＰＡＸ５、ＬＭＸ１Ｂ、ＰＩＴＸ３、ＮＵＲＲ−１、ＬＭＸ１Ａ、ＥＮ１、ＰＡＸ２、ＴＦＦ３、ＰＩＴＸ２、ＤＣＸ、ＭＡＰ２、ＰＩＴＸ１、もしくはＶＭＡＴ２、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。

実施例に示されるように、本開示の方法は、完全に機能的なドーパミン作動性ニューロンの生成をもたらした。ＤＡニューロンは、神経突起の伸張およびドーパミン放出を示した（図６Ａ）。ググルステロン（ＧＳ）は、最良のドーパミン作動性分化誘起物質のうちの１つとして識別された（図６Ａ）。ＧＳで処理した細胞は、神経突起の伸張を示し、ＴＵＪ１、ＴＨ、Ｄａｔ、Ｆｏｘａ２、Ｎｕｒｒ−１、およびＧｉｒｋ２（図６Ｂ）、ＭＡＰＴ、ＦＯＸＡ２、ＳＹＴ４、ＦＯＸＡ１、ＤＤＣ、ＡＳＣＬ１、ＰＩＮＫ１、ＰＡＸ５、ＬＭＸ１Ｂ、ＰＩＴＸ３、ＮＵＲＲ１、ＬＭＸ１Ａ、ＥＮ１、ＧＩＲＫ２、ＤＤＣ、およびＶＭＡＴ２（図６Ｂ、６Ｄ、および６Ｅ）を発現した。さらに、ＦＡＣＳ分析により、得られた細胞の９７％超が、ＴＨ陽性であったことが明らかとなった（図６Ｃ）。ＳＹＴ４（シナプトタグミン４）は、シナプス可塑性およびドーパミン放出に重要な役割を果たす。ＡＳＣＬ１は、腹側中脳に発現し、誘導細胞が適切な表現型のものであることを示す。全細胞パッチクランプ電気生理学（図６Ｇ、図６Ｈ、および図６Ｉ）は、ＤＡニューロンが、電圧固定モード（図６Ｈ）では内向きＮａ＋電流を示し、電流固定モード（図６Ｉ）では電流を注入したときに活動電位を発火したことを明らかにした。これは、本開示の方法を用いたｈＰＳＣからの完全に機能的なドーパミン作動性ニューロンの生成を実証する。

ＮＳＣは、神経学的疾患および障害の治療に極めて重要な役割を果たし得る。神経変性は、ニューロンの死滅を含む、ニューロンの構造または機能の進行性消失の包括的な用語である。パーキンソン病、アルツハイマー病、およびハンチントン病を含む、多数の神経変性疾患は、神経変性プロセスの結果として生じ、進行性の神経系機能不全を特徴とする。神経学的疾患および障害には、アルツハイマー病および他の認知症、脳の癌、変性性神経疾患、脳炎、癲癇、遺伝性脳障害、頭部および脳の奇形、水頭症、脳卒中（Ｓｔｒｏｋｅ）、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳまたはルーゲーリック病）、ハンチントン病、プリオン病、発作（ｓｔｒｏｋｅ）等が挙げられるがこれらに限定されない。

神経幹細胞は、死につつあるニューロンの移動および置き換えに関与することが示されている。さらに、マウスにおいて脳卒中時の海馬幹細胞の役割が解明されている。これらの結果は、ＮＳＣが、傷害の結果として成体の脳に関与し得ることを示した。さらに、ＮＳＣが指向性様式で脳の腫瘍に移動することが示されている。さらに、傷害に対するＮＳＣの応答の分子機序について研究がなされた。傷害の際に放出されるＳＤＦ−１ａ等のケモカインは、ヒトおよびマウスのＮＳＣがマウスにおいて傷害領域へ指向的に移動することに関与していた。傷害環境において作用する追加の機序、ならびに急性および慢性疾患時にそれらがどのようにＮＳＣの応答に影響を及ぼすかについての探求は、精力的な研究の問題である。

さらなる実施形態において、本発明は、神経学的疾患および障害の治療方法を提供する。本方法は、神経学的疾患または障害を有する対象にＮＳＣを投与することを含む。

さらなる実施形態において、本発明は、神経学的疾患および障害を治療する方法を提供する。本方法は、神経学的疾患または障害を有する対象にＮＳＣまたはＤＡニューロンを投与することを含む。

別の実施形態において、本発明は、ＮＳＣの生成のためのキットを提供する。キットには、チェックポイントキナーゼ１（ＣＫ１）阻害剤および骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤、神経幹細胞マーカーを識別するための試薬、ならびにｈＰＳＣからＮＳＣを生成するための指示書が含まれ得る。一態様において、ＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８であり、ＢＭＰ阻害剤は、ドルソモルフィン、ＬＤ−１９３１８９、またはＤＭＨ−１である。ある特定の態様において、ＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８であり、ＢＭＰ阻害剤はドルソモルフィンである；ＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８であり、ＢＭＰ阻害剤はＬＤ−１９３１８９である；ＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８であり、ＢＭＰはＤＭＨ−１である。キットには、ＢＲＮ２、ＣＤ１１３、ＣＤ１５、ＣＸＣＲ４、ＤＣＸ、ＦＡＢＰ７、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＯ４、ＧＦＡＰ、ＬＭＸ１Ａ、ムサシ−１、ＭＡＰ２、ネスチン、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、ＴＵＢＢ３、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、またはＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５神経幹細胞マーカーを識別するための試薬が含まれ得る。

別の実施形態において、本発明は、ドーパミン作動性ニューロンの生成のためのキットを提供する。キットには、チェックポイントキナーゼ１（ＣＫ１）阻害剤および骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤、神経幹細胞マーカーを識別するための試薬、少なくとも１つのドーパミン作動性ニューロン誘起化合物、ドーパミン作動性ニューロン細胞マーカーを識別するための試薬、ならびにｈＰＳＣからドーパミン作動性ニューロンを生成するための指示書が含まれる。一態様において、ＣＫ１阻害剤はＳＢ２１８０７８であり、ＢＭＰ阻害剤はＤＭＨ−１であり、ドーパミン作動性ニューロン誘起化合物は、ググルステロンである。キットには、ＢＲＮ２、ＣＤ１１３、ＣＤ１５、ＣＸＣＲ４、ＤＣＸ、ＦＡＢＰ７、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＯ４、ＧＦＡＰ、ＬＭＸ１Ａ、ムサシ−１、ＭＡＰ２、ネスチン、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、ＴＵＢＢ３、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、またはＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５神経幹細胞マーカーを識別するための試薬が含まれ得る。キットにはまた、ＴＵＪ１、ＴＨ、Ｄａｔ、Ｆｏｘａ２、Ｎｕｒｒ−１、Ｇｉｒｋ２、ＭＡＰＴ、ＳＹＴ４、ＦＯＸＡ１、ＤＤＣ、ＡＳＣＬ１、ＰＩＮＫ１、ＰＡＸ５、ＬＭＸ１Ｂ、ＰＩＴＸ３、ＮＵＲＲ−１、ＬＭＸ１Ａ、ＥＮ１、ＰＡＸ２、ＴＦＦ３、ＰＩＴＸ２、ＤＣＸ、ＭＡＰ２、ＰＩＴＸ１、またはＶＭＡＴ２ドーパミン作動性ニューロン細胞マーカーを識別するための試薬が含まれ得る。

以下の実施例は、本発明を例示することを意図するものであり、本発明を制限することを意図するものではない。

実施例１
ｈＰＳＣの成長
ハイスループットのスクリーニング戦略を用いて、ＳＢ２１８０７８およびＤＭＨ−１という２つの強力な神経誘起物質を識別した（図５Ａ）。ＳＢ２１８０７８は、胚性幹細胞の分化を刺激することが示されているスタウプリミドの構造的相同体であり、ＤＭＨ−１は、ｈＰＳＣにおける神経の変換を効率的に誘起するドルソモルフィンの相同体である。ＮＳＣを誘導するために、マトリゲル上で成長させたｈＰＳＣをＳｔｅｍＰｒｏ培地から５μＭのＳＢ２１８０７８および１μＭのＤＭＨ−１を補充したＮ２Ｂ２７培地に移すことによって、原始神経上皮を誘起した。これらの神経誘起物質の存在下において６日後に、神経誘起の初期マーカーであるＰａｘ６が、大幅に上方調節された（図３および５Ｂ）。７日目に、神経化した（ｎｅｕｒａｌｉｚｅｄ）ｈＰＳＣを、ＮＳＣ培地に移し、次いで、解離させて増殖性ＮＳＣを誘導した。４継代後、ｈＰＳＣ由来のＮＳＣ（ｈＰＳＣ−ＮＳＣ）集団は、ネスチンに９８％陽性、ムサシ−１に９６％陽性、ＰＡＸ６に９５％陽性、ＯＣＴ４に０％陽性であった（図５Ｃおよび図５Ｄ）。遺伝子発現マイクロアレイ分析により、ＦＡＢＰ７、ＢＲＮ２、ＳＯＸ３、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＣＸＣＲ４、ＤＣＸ、ＮＥＳ、およびＭＳＩを含む推定上のＮＳＣマーカーの上方調節が明らかとなった（図５Ｅ）。ＦＡＢＰ７は、ＣＮＳ成長に関与する脳内脂肪酸結合タンパク質をコードし、ＮＳＣ中に高度に発現する。ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５は、α２，６−シアリルトランスフェラーゼをコードし、これは、細胞の血液脳関門通過を媒介する。リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）データは、さらに、ＮＳＣマーカーの上方調節を確認し、最も重要なことに多能性マーカーＯＣＴ−４およびＮＡＮＯＧの完全な下方調節が明らかとなり（図５Ｆ）、高度に富化された神経幹細胞集団が得られたという結論に至った。これらのＮＳＣは、さらなる増殖、凍結保存、および分化に好適であり、ＤＡニューロンの実用的な源となっている。

具体的には、ｈＰＳＣ系［ヒト胚性幹細胞系ＷＡ−０９ならびにヒト単為生殖幹細胞系ＬＬＣ２ＰおよびＬＬＣ１２ＰＨ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、まず、胚性幹細胞培地［ノックアウトＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＧｌｕｔａＭａｘ−Ｉ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテリシンＢ（１００Ｕ／１００μｇ／２５０ｎｇ）（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、および５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）］において、マイトマイシン−Ｃ不活性化マウス胚性線維芽細胞（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィーダー層で維持した。細胞を、５〜７日毎に分割比１：４または１：６でディスパーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて継代した。次いで、ｈＰＳＣをマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）コーティングプレートに移し、Ｓｔｅｍ Ｐｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）［ＧｌｕｔａＭＡＸを有するＤＭＥＭ／Ｆ１２、１×ＳＴＥＭＰＲＯ ｈＥＳＣ ＳＦＭ成長補充物質、１．８％ウシ血清アルブミン、８ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ、および０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール］で成長させた。

実施例２
フィーダーフリーのｈＰＳＣ成長
ｈＰＳＣ系ＬＬＣ１２ＰＨを、次いで、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）コーティングプレートに移し、Ｓｔｅｍ Ｐｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）［ＧｌｕｔａＭＡＸを有するＤＭＥＭ／Ｆ１２、１×ＳＴＥＭＰＲＯ ｈＥＳＣ ＳＦＭ成長補充物質、１．８％ウシ血清アルブミン、８ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ、および０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール］で成長させた。

実施例３
ハイスループットの神経誘起ｈＰＳＣスクリーニングアッセイ
フィーダーフリー培地条件下で成長させた未分化ｈＰＳＣを、Ｎ２Ｂ２７培地［ノックアウトＤＭＥＭ／Ｆ１２、１×ＧｌｕｔａＭａｘ、１×Ｎ２／Ｂ２７補充物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］において、ＳＢ２１８０７８（５μＭ）に加えてＤＭＨ−１（１μＭ）からなる化合物で７日間処理することによって、ｈＰＳＣ−ＮＳＣを誘導した。神経化したｈＰＳＣを、次いで、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）で解離させ、ＮＳＣ培地［ノックアウトＤＭＥＭ／Ｆ１２、２％ＳｔｅｍＰｒｏ神経補充物質、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ、２０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、および２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ］においてマトリゲルコーティングプレートで４継代以上成長させ、純度の高い均質なｈＰＳＣ−ＮＳＣ集団を生成した。

実施例４
ハイスループットのドーパミンニューロン細胞分化スクリーニングアッセイ
ＤＡニューロンを得るために、ｈＰＳＣ−ＮＳＣを、まず、７日間、１００ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ８および２μＭプルモルファミンとともにＤＡ前駆体にプライムし、次いで、最終的なドーパミン作動性分化を誘起する小分子のスクリーニングに使用した（図６Ａ）。ＤＡ前駆体を、２０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播き、２．５μＭで２週間、小分子ライブラリ（Ｔｏｃｒｉｓ １１２０の生物学的に活性な化合物）で処理した（図６Ａ）。ドーパミン作動性分化を、神経突起の伸張およびドーパミン放出についてのＥＬＩＳＡによって評価した（図６Ａ）。このスクリーニングにより、天然に存在するステロイドであるググルステロン（ＧＳ）が、最良のドーパミン作動性分化誘起物質の中から識別された（図６Ａ）。３０日間の分化後、ＧＳで処理したニューロンは、複雑な神経突起伸張を伴って成熟していたと見られた。この段階では、誘導細胞は、主要なニューロンマーカーのβ−ＩＩＩ−チューブリン（ＴＵＪ１）だけでなく、重要なＤＡニューロンマーカーであるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ドーパミン輸送体（Ｄａｔ）、Ｆｏｘａ２、Ｎｕｒｒ−１、およびＧｉｒｋ２も発現した（図６Ｂ）。さらに、ＦＡＣＳ分析により、得られた細胞の９７％超が、ＴＨ陽性であったことが明らかとなった（図６Ｃ）。遺伝子発現マイクロアレイ分析により、ＭＡＰＴ、ＦＯＸＡ２、ＳＹＴ４、ＦＯＸＡ１、ＤＤＣ、ＡＳＣＬ１、およびＰＩＮＫ１等、ドーパミン作動性およびニューロン関連マーカーの上方調節が示された（図６Ｄ）。ＳＹＴ４（シナプトタグミン４）は、シナプス可塑性およびドーパミン放出に重要な役割を果たす。ＡＳＣＬ１は、腹側中脳に発現し、誘導細胞が適切な表現型のものであることを示す。ｈＰＳＣ、ＮＳＣ、ＤＡニューロン、および黒質由来組織の遺伝子発現のさらなる分析により、ｈＰＳＣ由来のＤＡニューロンが、ＳＮ中に存在する細胞へと神経分化を受ける細胞の遺伝子発現の特徴的な特性の要素を取得したこと、ならびにそれらが、成長的にはＮＳＣ後かつＳＮ前の段階に位置することが明らかとなった。ＲＴ−ＰＣＲは、さらに、ＰＡＸ５、ＬＭＸ１Ｂ、ＰＩＴＸ３、ＮＵＲＲ１、ＬＭＸ１Ａ、ＥＮ１、ＧＩＲＫ２、ＤＤＣ、およびＶＭＡＴ２等のマーカーの特徴的な発現を有するＤＡニューロンの同一性を確認した（図６Ｅ）。最も重要なことには、対照細胞（ＧＳの代わりにＦＧＦ８およびプルモルファミンで１週間、ならびに０．１％ＤＭＳＯで２週間処理したＮＳＣ）と比較して、ＧＳ処理細胞は、ＥＬＩＳＡによって判定されるドーパミン分泌に５倍の増加を示した（図６Ｆ）。全細胞パッチクランプ電気生理学（図６Ｇ、図６Ｈ、および図６Ｉ）は、９０日間のＧＳ処理の後、ＤＡニューロンが、電圧固定モード（図６Ｈ）では内向きＮａ＋電流を示し、電流固定モード（図６Ｉ）では電流を注入したときに活動電位を発火したことを明らかにした。自発的活動電位を、微小電極アレイ（ＭＥＡ）システムを使用してＧＳ処理ニューロンの全培養物において記録した（図６Ｊ）。ＭＥＡ皿中の全６４個の電極のおおよそ３分の１が、中等度の活性を示した（＞５スパイク／分）。これらのニューロンは、２つの基本的な発火表現型によって特徴付けられる：周期的なスパイクのバーストを発するものおよび単一のスパイクを定期的に発するもの（図６Ｊおよび図６Ｋ）。

本方法は、具体的には、ｈＥＳＣ−Ｈ９−ＮＳＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｈＰＳＣ−ＮＳＣの両方を、ＮＢ培地［ＮｅｕｒｏＢａｓａｌ培地、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ、１×Ｎ２／Ｂ２７補充物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］において７日間プルモルファミン（２μＭ）およびＦＧＦ８（１００ｎｇ／ｍＬ）で処理することを伴った。プルモルファミンおよびＦＧＦ８での７日間の処理の後、ＮＳＣを、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）で解離させ、２０，０００細胞／ｍＬでマトリゲルコーティング９６ウェルプレートに播き、２．５μＭの最終濃度で２週間小分子ライブラリ（Ｔｏｒｃｒｉｓ １１２０の生物学的に活性な化合物）で処理した（図６Ａ）。小分子で処理した２週間後に、すべてのウェルを目視観察し、神経突起密度に基づいてスコア付けした。小分子で処理した２週間後に、すべてのウェルを目視観察し、神経突起密度およびドーパミン放出に基づいてスコア付けした。神経突起密度を測定するために、細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、Ｃｅｌｌａｖｉｓｔａ細胞イメージングシステム（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、無作為に選択した領域から位相差画像を取得した。神経突起密度を、Ｃｅｌｌａｖｉｓｔａ密度ソフトウェア画像処理プログラムを用いて測定した。各実験条件を、二連のウェルで行い、少なくとも３回の独立した実験を実行して、最終結果を得た。

上位の神経突起誘起物質（表１）（０．１％ＤＭＳＯで処理した対照と比較して最も高い密度の神経突起を含有するウェル）から馴化培地を収集し、ドーパミンＥＬＩＳＡアッセイ（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ）を用いて分析した。１ウェル当たり５０，０００の細胞を含有する試料から馴化培地を収集し、３０００ＲＰＭで遠心分離して細胞残屑を除去した。次いで、上清を収集し、市販のドーパミンＥＬＩＳＡアッセイキット（ＣｕｓａＣｏｓｍｏ Ｂｉｏ）を用いてドーパミンの定量について分析した。データの分析を、マイクロタイタープレートリーダー（ＢＩＯ−ＴＥＫ Ｓｙｎｅｒｇｙ ２）を用いて行った。示される結果は、３回の独立した実験（ｎ＝３）からのものであり、平均±標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）として表され、統計学的分析は、統計学的有意差Ｐ＜０．０５、信頼度９５％（α＝０．０５）で両側スチューデントｔ検定を用いて行った。さらに、各ウェルからの全ＲＮＡを収集し、ｈＰＳＣ−ＮＳＣからのＴｕＪ１、ＭＡＰ２、ＴＨ、ＧＲＫ２、ＥＮ１、ＤＡＴ、ＡＡＤＣ、ＰＡＸ２、ＮＵＲＲ１、ＰＩＴＸ３、およびＬＭＸ１Ｂの発現についてＲＴ−ＰＣＲによって分析した（表２）。ＲＴ−ＰＣＲデータの分析は、上位ヒットのすべてが、２週間の処理の後、成熟したドーパミンニューロンと関連する遺伝子を発現することを示した。ＥＬＩＳＡデータの分析は、上位の小分子神経突起誘起物質が、対照の未処理細胞（１．５ｎｇ／ｍＬ）よりも高いレベルのドーパミンを生成したことを示した。ググルステロンで処理したｈＰＳＣ−ＮＳＣが、最も高いレベルのドーパミンの自発的放出を誘起した（図５Ａ）。ケンパウロン（３３％）、ググルステロン（３５％）、キヌレン酸（１９％）、イメドスリジン二臭化水素酸塩（Ｉｍｍｅｄｔｈｒｉｄｉｎｅ Ｄｉｈｙｄｒｏｂｒｏｍｉｄｅ）（２１％）、およびジマプリット二塩酸塩（１８％）での化学処理によって生成されたＴＨ陽性細胞の割合は、標準的なドーパミン作動性分化培地（ＢＤＮＦ ２０ｎｇ／ｍＬ、ＧＤＮＦ ２０ｎｇ／ｍＬ、ｃＡＭＰ ２００μＭ、アスコルビン酸２００μＭ、ＴＧＦβ３ ２ｎｇ／ｍＬ、およびＤＡＰＴ）を用いて１か月以上分化させたｈＰＳＣ−ＮＳＣから得られたＴＨ陽性細胞の１５％よりも高かった。

全細胞パッチクランプ電気生理学方法。電気生理学的記録のために、細胞を、Ｏｌｙｍｐｕｓの倒立顕微鏡上に載置した記録チャンバに移した。記録の最中、温度を３１〜３２℃に維持し、細胞を、ｐＨ７．３０および３１５ｍＯｓｍで、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭグルコースとともに１ｍｌ／分の一定流量で灌流した。全細胞記録を、ｐＨ７．３０および２９０ｍＯｓｍで、１３０ｍＭ Ｋ−グルコン酸塩、５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭスクロース、０．３ｍＭ ＥＧＴＡ、３ｍＭ ＭｇＡＴＰを充填した先端抵抗が２〜３ＭΩのホウケイ酸電極を用いて取得した。データは、ＨＥＫＡ ＥＰＣ−１０デジタイザ／増幅器を使用して取得した。全細胞アクセスが達成された直後に静止膜電位を記録し、細胞を、次いで、３〜５分間平衡化させた。次いで、−７０ｍＶの静止膜電位から、細胞を、電流固定モードにおいて０．２Ｈｚで送達される２００ミリ秒の電流注入により脱分極させ、振幅を５０ｐＡから最大１０００ｐＡまで増加させて、活動電位を誘起した。内向きまたは外向き電流の存在を、電圧ランプを適用することによって判定した。不安定な記録構成を有する細胞または直列抵抗が１５ＭΩよりも大きくなったものは、この研究から除外した。２０個の異なる細胞を記録し、パッチクランプした７個の細胞から活動電位を得た。

マイクロアレイ分析方法。全ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従って二連の試料ペレット（ＲＮｅａｓｙ；Ｑｉａｇｅｎ）から収集したものから抽出した。ＲＮＡの数（Ｑｕｂｉｔ ＲＮＡ ＢＲ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔｓ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および品質（ＲＮＡ６０００ Ｎａｎｏ Ｋｉｔ；Ａｇｉｌｅｎｔ）は、さらなる処理の前に各試料について最適であることが判定された。１つの試料につき２００ｎｇのＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従ってＩｌｌｕｍｉｎａ Ｔｏｔａｌ Ｐｒｅｐ ＲＮＡ増幅キットを用いて増幅させ、上述のように定量化した。１つの試料につき７５０ｎｇのビオチニル化ＲＮＡを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨＴ−１２ｖ４発現ビーズチップにハイブリダイズし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｉＳｃａｎビーズアレイスキャナでスキャンし、ＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏおよびｌｕｍｉバイオコンダクターパッケージで品質管理を行った。すべてのＲＮＡプロセシングおよびマイクロアレイハイブリダイゼーションは、製造業者のプロトコルに従って行った。ＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏでは、プローブを少なくとも１つの試料において０．０１のＰ値が検出されたものに限定し、Ｒでの正規化のために出力した。未加工のプローブ発現値を、ｌｕｍｉ Ｒ／バイオコンダクターパッケージに実装されているロバストスプライン正規化（ｒｏｂｕｓｔ ｓｐｌｉｎｅ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）（ＲＳＮ）を用いて、変換および正規化した。ベン図を得るために、Ｑｌｕｃｏｒｅ Ｏｍｎｉ Ｅｘｐｌｏｒｅｒを用いた。細胞型のペア（ｈＰＳＣと黒質、ｈＰＳＣとＮＳＣ、およびｈＰＳＣとドーパミン作動性ニューロン）間で分化発現した転写物を、Ｐ値のカットオフ＜０．０５および分散のカットオフ＞０．００５で両側スチューデントｔ検定を用いて識別した。分化発現したプローブのセットを、次いで、互いに比較した。遺伝子発現アレイデータは、受託指定番号ＧＳＥ４２２６５の下に、ＮＣＢＩ ＧＥＯデータベースで利用可能である。

統計学的分析。結果は、標準±標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）として表し、統計学的分析は、２つの群を比較するための両側スチューデントｔ検定、または複数群を対照と比較するためのダネット検定を用いた１要因ＡＮＯＶＡにより、信頼度９５％（α＝０．０５）を用いて行った。すべての検定に対する統計学的有意差の基準は、Ｐ＜０．０５であった。

追加の方法
ＲＴ−ＰＣＲ分析
それぞれ約１００万の細胞を用いた少なくとも三連の試料からの全ＲＮＡを、製造業者の説明（Ｑｉａｇｅｎ）に従ってＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ自動精製システムまたはＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキットのいずれかを用いて単離した。全ＲＮＡを、ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏｒａｄ）およびＰｘ２ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）での逆転写に使用した。遺伝子発現を分析するために、ＰＣＲ反応を、１回の反応につき１／２５のｃＤＮＡならびにＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｉｍｅｒ ＡｓｓａｙおよびＱｕａｎｔｉｔｅｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて二連で行った。ｑＰＣＲを、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ Ｑ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて９５℃で５分間、９２℃で５秒間、６０℃で２０秒間、３７サイクル行った後、メルト法により５０℃から９９℃まで各ステップ１℃ずつ上昇させてアンプリコンの特異性を試験した。相対的定量化を、標準曲線に対して実行し、定量化した値をＰＰＩＧによって判定された入力に対して正規化した。分析に使用したプライマーを、付録の表Ｓ１に列挙する。結果は、平均±標準誤差で表されるものとして表し、統計学的分析は、２つの群を比較するための両側スチューデントｔ検定、または複数の群を対照と比較するためのダネット検定を用いた１要因ＡＮＯＶＡにより、信頼度９５％（α＝０．０５）を用いて行い、Ｐ＜０．０５を有意であるとみなした。

免疫細胞化学
１つの試料につき１００，０００の細胞を、室温で１０分間、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５％正常ロバ血清、および１％ＢＳＡにおいて、室温で１時間透過処理およびブロッキングした。細胞を、ＰＢＳ中の０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２％ＢＳＡにおいて、４℃で一晩、一次抗体とともにインキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、室温で１時間、ＰＢＳ中の０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５％正常ロバ血清、および１％ＢＳＡにおいて、二次抗体とともにインキュベートした。核をＤＡＰＩで染色した。使用したすべての抗体を、付録の表Ｓ２に列挙する。少なくとも３回の独立した実験からの代表的な画像を示す。

フローサイトメトリー
フローサイトメトリー分析については、１つの試料につき１００万の細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅを用いて採取し、ＰＢＳで洗浄し、室温で３０分間４％パラホルムアルデヒドで固定した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、室温で１時間、ＰＢＳ中の０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５％正常ロバ血清、および１％ＢＳＡでブロッキングした。次いで、細胞を、ＰＢＳ中の０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５％正常ロバ血清、および１％ＢＳＡにおいて、４℃で一晩、一次抗体とともにインキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、室温で１時間、ＰＢＳ中の．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５％正常ロバ血清、および１％ＢＳＡにおいて、二次抗体とともにインキュベートした。試料を、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｉｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）４色フローサイトメーターで泳動させ、データをＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏ（商標）ソフトウェア（ｖ６．０）で分析した。使用した抗体を、付録の表Ｓ２に列挙する。３回の独立した実験からの代表的な結果を示す。

微小電極アレイ（ＭＥＡ）システム
培養したｈＰＳＣ由来のＤＡニューロンからの細胞外電圧記録を、分化９５日目に、３７℃で２．５μＭのググルステロンを補充したＮＢ培地［ＮｅｕｒｏＢａｓａｌ培地、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ、１×Ｎ２／Ｂ２７補充物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］において、Ｍｕｓｅ微小電極アレイ（ＭＥＡ）システム（Ａｘｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて作製した。ＭＥＡ皿の表面は、２００μｍの極間間隔で、ナノ細孔白金から構成される８×８グリッド（合計６４個の電極）の直径３０μｍの丸型細胞外電極を含有していた。

ＭＥＡ皿は、滅菌脱イオン水で３回すすぎ、７０％エタノールで１回すすぎ、１００％エタノールで１回すすぐことによって、滅菌した。次いで、皿にキャップをして蓋付きペトリ皿に逆さまに入れ、５０℃で４〜５時間乾燥させた。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のベースコーティングを、ホウ酸ナトリウム緩衝液（１５ｍＭ；ｐＨ８．４）中の５００ｍｌの濾過した（０．２２μｍのフィルター）０．１％ＰＥＩを各皿に添加し、室温で１時間インキュベートすることによって沈殿させた。ＰＥＩ溶液を吸引した直後に、皿を１ｍｌの脱イオン水で４回洗浄し、組織培養フードにおいて一晩空気乾燥させた。ノックアウトＤＭＥＭ／Ｆ１２中に１：３０希釈した滅菌マトリゲル溶液７５μｌを、電極グリッドに直接添加し、皿を、組織培養インキュベーターにおいて３７℃で１時間インキュベートした。次いで、マトリゲル溶液を除去し、おおよそ１００，０００の細胞を含有するＮＢ培地中の２．５μＭのググルステロン５０μｌを、ＭＥＡの表面に播き、３７℃で３０分間インキュベートして、細胞を付着させた。ＤＡニューロンは、ＮＢ培地中の２．５μＭのググルステロンにおいてマトリゲル上で６５日間、事前に培養されており、機械的粉砕によってプレートから除去された。３０分間インキュベートした後、５５０μｌのＮＢ培地をＭＥＡウェルに添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。培地を交換し、その後３〜４日毎に交換した。

電圧データを、２００〜５０００Ｈｚのハードウェアフィルター帯域で１２．５ｋＨｚにおいてすべての電極で同時にサンプリングし、ＡｘＩＳソフトウェア（Ａｘｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてコンピュータに保存した。ニューロンのスパイクを検出する前に高周波数の電気ノイズを除去するために、未加工のシグナルを２００〜２５００Ｈｚの単一次数のＢｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ帯域通過フィルターを用いてソフトウェアで処理した。活動電位のスパイクを、ベースラインの電極ノイズの標準偏差の±５倍に設定した検出閾値で識別した。この閾値は、概して、７．５〜１１．２５μＶに等しい。色分けしたスパイクレートのマップをＡｘＩＳを用いて作製した。スパイクのラスタープロットおよびスパイク間の間隔ヒストグラムについては、検出されたスパイクのタイムスタンプをＮｅｕｒｏｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＮＥＸ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に出力した。２回の独立した記録を行った。

本発明は、上述の実施例を参照して記載されているが、修正および変形が、本発明の精神および範囲内に包含されることを理解されたい。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ制限される。

Claims (29)

1. 神経幹細胞（ＮＳＣ）を生成する方法であって、
   （ａ）ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を、チェックポイントキナーゼ１（ＣＫ１）阻害剤および骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤で処理することと、
   （ｂ）該細胞を神経幹細胞マーカーについて分析することと
   を含む、方法。
2. 前記ＣＫ１阻害剤が、ＳＢ２１８０７８である、請求項１に記載の方法。
3. ＢＭＰ阻害剤が、ドルソモルフィン、ＬＤ−１９３１８９、およびＤＭＨ−１からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
4. 前記ＣＫ１阻害剤がＳＢ２１８０７８であり、前記ＢＭＰ阻害剤がドルソモルフィンである、請求項１に記載の方法。
5. 前記ＣＫ１阻害剤がＳＢ２１８０７８であり、前記ＢＭＰ阻害剤がＬＤ−１９３１８９である、請求項１に記載の方法。
6. 前記ＣＫ１阻害剤がＳＢ２１８０７８であり、前記ＢＭＰ阻害剤がＤＭＨ−１である、請求項１に記載の方法。
7. 前記神経幹細胞マーカーが、ＢＲＮ２、ＣＤ１１３、ＣＤ１５、ＣＸＣＲ４、ＤＣＸ、ＦＡＢＰ７、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＯ４、ＧＦＡＰ、ＬＭＸ１Ａ、ムサシ−１、ＭＡＰ２、ネスチン、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、ＴＵＢＢ３、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、およびＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
8. 請求項１に記載の方法によって誘導される、神経幹細胞。
9. 前記ＣＫ１阻害剤が、ＳＢ２１８０７８である、請求項８に記載の神経幹細胞。
10. 前記ＢＭＰ阻害剤が、ドルソモルフィン、ＬＤ−１９３１８９、およびＤＭＨ−１からなる群から選択される、請求項８に記載の神経幹細胞。
11. 前記ＣＫ１阻害剤がＳＢ２１８０７８であり、前記ＢＭＰ阻害剤がドルソモルフィンである、請求項８に記載の神経幹細胞。
12. 前記ＣＫ１阻害剤がＳＢ２１８０７８であり、前記ＢＭＰ阻害剤がＬＤ−１９３１８９である、請求項８に記載の神経幹細胞。
13. 前記ＣＫ１阻害剤がＳＢ２１８０７８であり、前記ＢＭＰ阻害剤がＤＭＨ−１である、請求項８に記載の神経幹細胞。
14. 前記細胞が、ＢＲＮ２、ＣＤ１１３、ＣＤ１５、ＣＸＣＲ４、ＤＣＸ、ＦＡＢＰ７、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＯ４、ＧＦＡＰ、ＬＭＸ１Ａ、ムサシ−１、ＭＡＰ２、ネスチン、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、ＴＵＢＢ３、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、およびＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される神経幹細胞マーカーを発現する、請求項８に記載の神経幹細胞。
15. ヒト多能性幹細胞からドーパミン作動性ニューロンを生成する方法であって、
    （ａ）ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を、チェックポイントキナーゼ１（ＣＫ１）阻害剤および骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤で処理することと、
    （ｂ）神経幹細胞マーカーを識別することによって、神経幹細胞を識別することと、
    （ｃ）ＮＳＣを、少なくとも１つのドーパミン作動性ニューロン誘起化合物で処理することと、
    （ｄ）該細胞をドーパミン作動性ニューロン細胞マーカーについて分析することと
    を含む、方法。
16. 前記ＣＫ１阻害剤が、ＳＢ２１８０７８であり、前記ＢＭＰ阻害剤が、ドルソモルフィン、ＬＤ−１９３１８９、およびＤＭＨ−１からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
17. 前記ＣＫ１阻害剤がＳＢ２１８０７８であり、前記ＢＭＰ阻害剤がＤＭＨ−１である、請求項１５に記載の方法。
18. 前記神経幹細胞マーカーが、ＢＲＮ２、ＣＤ１１３、ＣＤ１５、ＣＸＣＲ４、ＤＣＸ、ＦＡＢＰ７、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＯ４、ＧＦＡＰ、ＬＭＸ１Ａ、ムサシ−１、ＭＡＰ２、ネスチン、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、ＴＵＢＢ３、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、およびＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
19. 前記ドーパミン作動性ニューロン誘起化合物が、ホモキノリン酸、Ｌ−システインスルフィン酸、キヌレン酸、（Ｒ）−（＋）−ＨＡ−９６６、ｍ−クロロフェニルビグアニド塩酸塩、カルペプチン、ジマプリット二塩酸塩、８−ヒドロキシ−ＤＰＡＴ臭化水素酸塩、トランス−４−ヒドロキシクロトン酸、ファスジル塩酸塩、チオペラミド、レチノイン酸、ＡＭ５８０、ＴＴＮＰＢ、レモキシプリド塩酸塩、ＩＣＩ ２１５，００１塩酸塩、イミロキサン塩酸塩、スピペロン塩酸塩、ケンパウロン、ＣＬ ２１８８７２、ＣＶ １８０８、Ｒｏ １５−４５１３、リノピルジン二塩酸塩、ググルステロン、Ｃｈ ５５、３−ＭＡＴＩＤＡ、ＳＥＷ ２８７１、イメスリジン二臭化水素酸塩、ＬＹ ３６４９４７、トラニルシプロミン塩酸塩、（−）−シスチン、およびニルタミド、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
20. 前記ドーパミン作動性ニューロン誘起化合物が、ググルステロンである、請求項１５に記載の方法。
21. 前記ドーパミン作動性ニューロン細胞マーカーが、ＴＵＪ１、ＴＨ、Ｄａｔ、Ｆｏｘａ２、Ｎｕｒｒ−１、Ｇｉｒｋ２、ＭＡＰＴ、ＳＹＴ４、ＦＯＸＡ１、ＤＤＣ、ＡＳＣＬ１、ＰＩＮＫ１、ＰＡＸ５、ＬＭＸ１Ｂ、ＰＩＴＸ３、ＮＵＲＲ−１、ＬＭＸ１Ａ、ＥＮ１、ＰＡＸ２、ＴＦＦ３、ＰＩＴＸ２、ＤＣＸ、ＭＡＰ２、ＰＩＴＸ１、およびＶＭＡＴ２からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
22. 請求項１５に記載の方法によって生成される、ドーパミン作動性ニューロン。
23. 前記ＣＫ１阻害剤がＳＢ２１８０７８であり、前記ＢＭＰ阻害剤がＤＭＨ−１である、請求項２２に記載のドーパミン作動性ニューロン。
24. 前記ＮＳＣが、ＢＲＮ２、ＣＤ１１３、ＣＤ１５、ＣＸＣＲ４、ＤＣＸ、ＦＡＢＰ７、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＯ４、ＧＦＡＰ、ＬＭＸ１Ａ、ムサシ−１、ＭＡＰ２、ネスチン、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、ＴＵＢＢ３、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、およびＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される神経幹細胞マーカーを発現する、請求項２２に記載のドーパミン作動性ニューロン。
25. 前記ドーパミン作動性ニューロン誘起化合物が、ホモキノリン酸、Ｌ−システインスルフィン酸、キヌレン酸、（Ｒ）−（＋）−ＨＡ−９６６、ｍ−クロロフェニルビグアニド塩酸塩、カルペプチン、ジマプリット二塩酸塩、８−ヒドロキシ−ＤＰＡＴ臭化水素酸塩、トランス−４−ヒドロキシクロトン酸、ファスジル塩酸塩、チオペラミド、レチノイン酸、ＡＭ５８０、ＴＴＮＰＢ、レモキシプリド塩酸塩、ＩＣＩ ２１５，００１塩酸塩、イミロキサン塩酸塩、スピペロン塩酸塩、ケンパウロン、ＣＬ ２１８８７２、ＣＶ １８０８、Ｒｏ １５−４５１３、リノピルジン二塩酸塩、ググルステロン、Ｃｈ ５５、３−ＭＡＴＩＤＡ、ＳＥＷ ２８７１、イメスリジン二臭化水素酸塩、ＬＹ ３６４９４７、トラニルシプロミン塩酸塩、（−）−シスチン、およびニルタミドからなる群から選択される、請求項２２に記載のドーパミン作動性ニューロン。
26. 前記ドーパミン作動性ニューロン誘起化合物が、ググルステロンである、請求項２５に記載のドーパミン作動性ニューロン。
27. 前記ドーパミン作動性ニューロン細胞マーカーが、ＴＵＪ１、ＴＨ、Ｄａｔ、Ｆｏｘａ２、Ｎｕｒｒ−１、Ｇｉｒｋ２、ＭＡＰＴ、ＳＹＴ４、ＦＯＸＡ１、ＤＤＣ、ＡＳＣＬ１、ＰＩＮＫ１、ＰＡＸ５、ＬＭＸ１Ｂ、ＰＩＴＸ３、ＮＵＲＲ−１、ＬＭＸ１Ａ、ＥＮ１、ＰＡＸ２、ＴＦＦ３、ＰＩＴＸ２、ＤＣＸ、ＭＡＰ２、ＰＩＴＸ１、およびＶＭＡＴ２からなる群から選択される、請求項２２に記載のドーパミン作動性ニューロン。
28. ＮＳＣの生成のためのキットであって、
    （ａ）チェックポイントキナーゼ阻害剤（ＣＫ１）および骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤と、
    （ｂ）神経幹細胞マーカーについてアッセイするための試薬と、
    （ｃ）ｈＰＳＣからのＮＳＣの誘導のための指示書と
    を含む、キット。
29. ドーパミン作動性ニューロンの生成のためのキットであって、
    （ａ）チェックポイントキナーゼ阻害剤（ＣＫ１）および骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤と、
    （ｂ）神経幹細胞マーカーについてアッセイするための試薬と、
    （ｃ）少なくとも１つのドーパミン作動性ニューロン誘起化合物と、
    （ｄ）ドーパミン作動性ニューロン幹細胞マーカーについてアッセイするための試薬と、
    （ｅ）ｈＰＳＣからのドーパミン作動性ニューロンの生成のための指示書と
    を含む、キット。

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