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JP2014503187A - 身体からヘプシジンを除去するためのヘプシジン結合核酸の使用 - Google Patents

身体からヘプシジンを除去するためのヘプシジン結合核酸の使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、対象由来の体液中のヘプシジンレベルを低下させる方法に関するものであり、この方法は、ａ）ヘプシジンと結合可能な核酸分子を準備することと、ｂ）ヘプシジンと核酸分子との結合が可能な条件下で核酸分子と体液とを接触させて、ヘプシジンと核酸分子との複合体を形成させることと、ｃ）体液から複合体を除去すること、または体液からヘプシジンを除去することを含む。
【選択図】なし

Description

本発明は、体液中のヘプシジンレベルを低下させる方法、上記方法で使用する核酸分子、上記方法で使用する医療装置、対象の体液からヘプシジンを除去する方法で使用する核酸分子、貧血患者を治療する方法で使用する核酸分子、および前記方法のいずれかで使用し得る、担体に固定化された核酸分子を調製する方法に関する。
生物活性ヘプシジンは２５個のアミノ酸からなる（ヘプシジン−２５とも呼ばれる）。さらに、アミノ酸が２０個および２２個である短縮型で不活性な２種類の変異体、すなわちヘプシジン−２０およびヘプシジン−２２が同定された（Ｒｉｖｅｒａ，２００５）。活性な２５アミノ酸ペプチドホルモンは血液および尿中にみられる。ヘプシジンの別名は肝臓発現抗菌ペプチド（ｌｉｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ、略語：ＬＥＡＰ−１）および推定肝腫瘍退縮因子（ｐｕｔａｔｉｖｅ ｌｉｖｅｒ ｔｕｍｏｕｒ ｒｅｇｒｅｓｓｏｒ、略語：ＰＬＴＲ）である（Ｋｒａｕｓｅ，２０００；Ｐａｒｋ，２００１）。
ヘプシジンは鉄のホメオスタシスを調節する重要なシグナルである。ヘプシジン欠損およびヘプシジン過剰発現のマウスモデルで示されているように、ヒトヘプシジンのレベルが高いと血清鉄レベルが低下し、ヒトヘプシジンのレベルが低いと血清鉄レベルが増加する（Ｎｉｃｏｌａｓ，２００１；Ｎｉｃｏｌａｓ，２００２ａ；Ｎｉｃｏｌａｓ，２００２ｂ；Ｎｉｃｏｌａｓ，２００３）。さらに、ヘプシジン活性の欠如を生じるヘプシジン遺伝子の突然変異は、重篤な鉄過剰疾患である若年性ヘモクロマトーシスに関連する（Ｒｏｅｔｔｏ，２００３）。ヘプシジンを腹腔内に注射すると、用量依存性で長時間持続する血清鉄の減少がみられた（Ｒｉｖｅｒａ，２００５）。
鉄はあらゆる生物の成長と発達に必要な必須元素である。哺乳動物の鉄含有量は、鉄の吸収、鉄の再利用および鉄を貯蔵する細胞からの鉄の放出を制御することにより調節される。鉄は主として十二指腸および空腸上部で腸細胞により吸収される。
フィードバック機序により、鉄欠乏症の患者では鉄吸収が増加し、鉄過剰症の患者では鉄吸収が減少する。この機序で重要な化合物は、ヘプシジン受容体としても働いて鉄の放出を制御する鉄輸送体フェロポーチンである（Ａｂｂｏｕｄ，２０００；Ｄｏｎｏｖａｎ，２０００；ＭｃＫｉｅ，２０００）。この鉄排出タンパク質は、胎盤合胞体栄養細胞および腸細胞の基底膜ならびにマクロファージおよび肝細胞の細胞表面に存在する。
ヘプシジンは、このようなさまざまな細胞型で発現されたフェロポーチンと結合することにより上記細胞型からの鉄放出を阻害し、フェロポーチンのリン酸化、内部移行、ユビキチン化およびリソソーム分解を誘導して、フェロポーチンによる血液中への鉄の放出を減少させる（Ｎｅｍｅｔｈ，２００４ｂ；Ｄｅ Ｄｏｍｅｎｉｃｏ，２００７）。健常者では血漿鉄がヘモグロビン合成に消費されるため、血漿鉄レベルが低下し、ヘプシジン産生量が減少する。
急性および慢性の全身性炎症の場合、サイトカインがヘプシジン産生を誘導する。ヘプシジン遺伝子発現が、脊椎動物の自然免疫系の急性期応答を誘導する感染のような炎症性刺激後に著しく増加することが観察されている。マウスでは、ヘプシジン遺伝子発現がリポ多糖（Ｃｏｎｓｔａｎｔｅ，２００６）、テルペンチン（Ｎｅｍｅｔｈ，２００４ａ）およびＦｒｅｕｎｄ完全アジュバント（Ｆｒａｚｅｒ，２００４）、ならびにアデノウイルス感染により上方制御されることが示された。ヒトでは、炎症性サイトカインであるインターロイキン−６およびＬＰＳによりヘプシジン発現が誘導される（Ｎｅｍｅｔｈ，２００４ａ）。ほかにも、細菌感染症、真菌感染症およびウイルス感染症を含めた慢性炎症性疾患の患者で、ヘプシジン発現と炎症による貧血との間に強い相関関係がみられた。上記の条件下ではすべて、ヘプシジン濃度の増加がマクロファージ、肝貯蔵および十二指腸から血漿への鉄排出を阻害する。慢性炎症条件下では、低鉄血症が発現し、赤血球生成が鉄により制限されて、貧血が生じる（Ｗｅｉｓｓ，２００５；Ｗｅｉｓｓ，２００８；Ａｎｄｒｅｗｓ，２００８）。
腎臓に慢性炎症が生じて慢性の腎疾患、腎機能障害および／または腎不全になることがある。腎疾患の患者では貧血がよくみられる。正常な腎臓では、エリスロポエチンまたはＥＰＯと呼ばれるホルモンが産生されて、骨髄を刺激し、重要な臓器に酸素を運搬するのに必要な赤血球を適当な数だけ産生させる。これに対して、罹患した腎臓では多くの場合、十分なＥＰＯが産生されない。その結果、骨髄が産生する赤血球が少なくなる。貧血は、腎機能が正常の２０％〜５０％ほどの腎疾患の初期段階でも発現する。この部分的な腎機能の喪失は、慢性腎機能不全と呼ばれることが多い。腎機能の悪化に伴い貧血が悪化する。残存腎機能がわずか１０％程度になれば、透析または腎移植が必要な末期腎不全となる。末期腎不全のほぼ全患者に貧血がみられる。
多くの腎疾患患者では、ヘマトクリット値を十分なレベルまで上昇させるために、ＥＰＯと鉄の両方を補充することが必要である。患者の鉄レベルが低過ぎれば、ＥＰＯは役に立たず、患者は貧血の影響を受け続けるであろう。この治療法の一部として、好ましくはヘプシジンとヘプシジン結合化合物またはヘプシジン不活性化化合物が結合してヘプシジンのバイオアベイラビリティが低下することによる、血漿中のヘプシジンレベルの低下またはヘプシジンの不活性化が患者に有益なこともある。次いで、ヘプシジンの減少およびヘプシジンの不活性化が、マクロファージによる鉄の放出および鉄の吸収向上をもたらす。
しかし、ヘプシジンの循環レベルを低下させるために、ヘプシジン結合化合物およびヘプシジン不活性化化合物、好ましくは抗体のような高分子量化合物を腎機能障害の患者に投与すると、ヘプシジンと高分子量化合物との複合体が腎臓により迅速に排泄されない可能性がある。このような目的で抗体を使用する場合、投与抗体により誘発される二次免疫反応により、こうした抗体療法が患者の炎症を引き起こすことがある。上記のように、このような炎症はサイトカインを介してヘプシジン産生を誘発する。
したがって、本発明の基礎となる第一の課題は、ヘプシジンと特異的に相互作用する化合物を提供することである。より具体的には、本発明の基礎となる課題は、ヘプシジンと特異的に相互作用する核酸ベースの化合物を提供することである。
本発明の基礎となるさらなる課題は、対象のまたは対象由来の体液中のヘプシジンレベル（４）を低下させるための、対象の体液からヘプシジンを除去するための、および／または貧血患者を治療するための手段および方法を提供することである。
本発明の基礎となる上記のような課題は、添付の独立請求項の発明特定事項により解決される。好適な実施形態は従属請求項から理解され得る。
より具体的には、本発明の基礎となる課題は、第一の態様の第一の実施形態でもある第一の態様では、対象由来の体液中のヘプシジンレベルを低下させる方法により解決され、この方法は、
ａ）ヘプシジンと結合可能な核酸分子を準備することと、
ｂ）ヘプシジンと核酸分子との結合が可能な条件下で核酸分子と体液とを接触させて、ヘプシジンと核酸分子との複合体を形成させることと、
ｃ）体液から複合体を除去すること、または体液からヘプシジンを除去することと
を含む。
第一の態様の第一の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第二の実施形態では、核酸分子は、５’→３’方向に第一の末端ヌクレオチドストレッチと、中央部のヌクレオチドストレッチと、第二の末端ヌクレオチドストレッチとを含み、中央部のヌクレオチドストレッチは３２〜４０個のヌクレオチド、好ましくは３２〜３５個のヌクレオチドを含む。
第一の態様の第一の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第三の実施形態では、核酸分子は、５’→３’方向に第二の末端ヌクレオチドストレッチと、中央部のヌクレオチドストレッチと、第一の末端ヌクレオチドストレッチとを含み、中央部のヌクレオチドストレッチは３２〜４０個のヌクレオチド、好ましくは３２〜３５個のヌクレオチドを含む。
第一の態様の第二および第三の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第四の実施形態では、中央部のヌクレオチドストレッチは核酸分子とヘプシジンとの結合に必須である。
第一の態様の第二、第三および第四の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第五の実施形態では、中央部のヌクレオチドストレッチはヌクレオチド配列５’ＲＫＡＵＧＧＧＡＫＵＡＡＧＵＡＡＡＵＧＡＧＧＲＧＵＷＧＧＡＧＧＡＡＲ３’（配列番号１８２）または５’ＲＫＡＵＧＧＧＡＫＡＡＧＵＡＡＡＵＧＡＧＧＲＧＵＷＧＧＡＧＧＡＡＲ３’（配列番号１８３）を含む。
第一の態様の第二、第三、第四および第五の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第六の実施形態では、中央部のヌクレオチドストレッチはヌクレオチド配列５’ＲＫＡＵＧＧＧＡＫＵＡＡＧＵＡＡＡＵＧＡＧＧＲＧＵＷＧＧＡＧＧＡＡＲ３’（配列番号１８２）、好ましくはヌクレオチド配列５’ＧＵＡＵＧＧＧＡＵＵＡＡＧＵＡＡＡＵＧＡＧＧＡＧＵＵＧＧＡＧＧＡＡＧ３’（配列番号１８４）を含む。
第一の態様の第五および第六の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第七の実施形態では、第一の末端ヌクレオチドストレッチが５〜８個のヌクレオチドを含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチが５〜８個のヌクレオチドを含む。
第一の態様の第五、第六および第七の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第八の実施形態では、第一の末端ヌクレオチドストレッチと第二の末端ヌクレオチドストレッチが二本鎖構造を形成し、好ましくはこのような二本鎖構造は、第一の末端ヌクレオチドストレッチと第二の末端ヌクレオチドストレッチが互いにハイブリダイズすることにより形成される。
第一の態様の第五、第六、第七および第八の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第九の実施形態では、第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＢＳＢＣ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＶＢＶＹＸ４Ｘ５Ｘ６３’を含み、ここで、Ｘ１はＡであるかまたは存在せず、Ｘ２はＧであるかまたは存在せず、Ｘ３はＢであるかまたは存在せず、Ｘ４はＳであるかまたは存在せず、Ｘ５はＣであるかまたは存在せず、Ｘ６はＵであるかまたは存在しない。
第一の態様の第五、第六、第七、第八および第九の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第十の実施形態では、第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＢＳＢＣ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＶＢＶＢＸ４Ｘ５Ｘ６３’を含み、ここで、
ａ）Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＢであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５はＣであり、かつＸ６はＵであるか、
ｂ）Ｘ１は存在せず、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＢであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５はＣであり、かつＸ６はＵであるか、または
ｃ）Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＢであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５はＣであり、かつＸ６は存在しない。
第一の態様の第五、第六、第七、第八、第九および第十の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第十一の実施形態では、
ａ）第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＡＧＣＧＵＧＵＣ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＧＵＧＣＧＣＵ３’を含むか、
ｂ）第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＡＧＣＧＵＧＵＣ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＧＣＡＵＧＣＵ３’を含むか、
ｃ）第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＡＧＵＧＵＧＵＣ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＡＵＧＣＧＣＵ３’を含むか、
ｄ）第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＡＧＵＧＵＧＵＣ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＧＣＡＵＧＣＵ３’を含むか、
ｅ）第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＡＧＣＧＵＧＣＣ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＧＵＧＣＧＣＵ３’を含むか、または
ｆ）第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＡＧＣＧＣＧＣＣ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＧＣＧＣＧＣＵ３’を含む。
第一の態様の第五、第六、第七、第八および第九の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第十二の実施形態では、第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＢＳＢＣ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＶＢＶＹＸ４Ｘ５Ｘ６３’を含み、ここで、
ａ）Ｘ１は存在せず、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＢであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５はＣであり、かつＸ６は存在しないか、
ｂ）Ｘ１は存在せず、Ｘ２は存在せず、Ｘ３はＢであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５はＣであり、かつＸ６は存在しないか、または
ｃ）Ｘ１は存在せず、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＢであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５は存在せず、かつＸ６は存在しない。
第一の態様の第五、第六、第七、第八および第九の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第十三の実施形態では、第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＢＳＢＣ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＶＢＶＹＸ４Ｘ５Ｘ６３’を含み、ここで、Ｘ１は存在せず、Ｘ２は存在せず、Ｘ３はＢであるかまたは存在せず、Ｘ４はＳであるかまたは存在せず、Ｘ５は存在せず、かつＸ６は存在しない。
第一の態様の第十三の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第十三の実施形態では、
ａ）第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＣＧＣＧＣ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＣＧＣＧＣ３’を含むか、
ｂ）第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＧＵＧＵＣ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＧＣＡＵＣ３’を含むか、
ｃ）第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＧＣＧＵＣ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＧＣＧＣＣ３’を含むか、
ｄ）第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＣＧＣＣ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＧＣＧＣ３’を含むか、または
ｅ）第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＧＣＧＣ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＣＧＣＣ３’を含む。
第一の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三および第十四の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第十五の実施形態では、核酸は配列番号１１５〜１１９、配列番号１２１、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１７５または配列番号１７６のうちのいずれか１つによる核酸配列を含む。
第一の態様の第二、第三および第四の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第十六の実施形態では、中央部のヌクレオチドストレッチはヌクレオチド配列５’ＧＲＣＲＧＣＣＧＧＶＧＧＡＣＡＣＣＡＵＡＵＡＣＡＧＡＣＵＡＣＫＡＵＡ３’（配列番号１８５）または５’ＧＲＣＲＧＣＣＧＧＶＡＧＧＡＣＡＣＣＡＵＡＵＡＣＡＧＡＣＵＡＣＫＡＵＡ３’（配列番号１８６）を含む。
第一の態様の第二、第三、第四および第十六の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第十七の実施形態では、中央部のヌクレオチドストレッチはヌクレオチド配列５’ＧＲＣＲＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＡＣＣＡＵＡＵＡＣＡＧＡＣＵＡＣＫＡＵＡ３’（配列番号２１５）、好ましくはヌクレオチド配列５’ＧＡＣＡＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＡＣＣＡＵＡＵＡＣＡＧＡＣＵＡＣＧＡＵＡ３’（配列番号１８７）を含む。
第一の態様の第十六および第十七の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第十八の実施形態では、第一の末端ヌクレオチドストレッチが４〜７個のヌクレオチドを含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチが４〜７個のヌクレオチドを含む。
第一の態様の第十八の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第十九の実施形態では、第一の末端ヌクレオチドストレッチと第二の末端ヌクレオチドストレッチが二本鎖構造を形成し、好ましくはこのような二本鎖構造は、第一の末端ヌクレオチドストレッチと第二の末端ヌクレオチドストレッチが互いにハイブリダイズすることにより形成される。
第一の態様の第十六、第十七、第十八および第十九の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第二十の実施形態では、第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＢＳＮ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＮＳＶＳＸ４Ｘ５Ｘ６３’を含み、ここで、Ｘ１はＡであるかまたは存在せず、Ｘ２はＧであるかまたは存在せず、Ｘ３はＲであるかまたは存在せず、Ｘ４はＹであるかまたは存在せず、Ｘ５はＣであるかまたは存在せず、Ｘ６はＵであるかまたは存在しない。
第一の態様の第十六、第十七、第十八、第十九および第二十の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第二十一の実施形態では、第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＢＳＮ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＮＳＶＳＸ４Ｘ５Ｘ６３’を含み、ここで、
ａ）Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＲであり、Ｘ４はＹであり、Ｘ５はＣであり、かつＸ６はＵであるか、
ｂ）Ｘ１は存在せず、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＲであり、Ｘ４はＹであり、Ｘ５はＣであり、かつＸ６はＵであるか、または
ｃ）Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＲであり、Ｘ４はＹであり、Ｘ５はＣであり、かつＸ６は存在しない。
第一の態様の第十六、第十七、第十八、第十九、第二十および第二十一の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第二十二の実施形態では、
ａ）第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＡＧＧＣＵＣＧ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＧＧＧＣＣＵ３’を含むか、
ｂ）第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＡＧＧＣＣＣＧ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＧＧＧＣＣＵ３’を含むか、
ｃ）第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＡＧＧＣＵＵＧ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＧＡＧＣＣＵ３’を含むか、または
ｄ）第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＡＧＡＣＵＵＧ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＧＡＧＵＣＵ３’を含む。
第一の態様の第十六、第十七、第十八、第十九および第二十の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第二十三の実施形態では、第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＢＳＮ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＮＳＶＳＸ４Ｘ５Ｘ６３’を含み、ここで、
ａ）Ｘ１は存在せず、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＲであり、Ｘ４はＹであり、Ｘ５はＣであり、かつＸ６は存在しないか、
ｂ）Ｘ１は存在せず、Ｘ２は存在せず、Ｘ３はＲであり、Ｘ４はＹであり、Ｘ５はＣであり、かつＸ６は存在しないか、
ｃ）Ｘ１は存在せず、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＲであり、Ｘ４はＹであり、Ｘ５は存在せず、かつＸ６は存在しない。
第一の態様の第十六、第十七、第十八、第十九、第二十および第二十三の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第二十四の実施形態では、第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＧＣＵＣＧ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＧＧＧＣＣ３’を含む。
第一の態様の第十六、第十七、第十八、第十九および第二十の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第二十五の実施形態では、第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＢＳＮ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＮＳＶＳＸ４Ｘ５Ｘ６３’を含み、ここで、Ｘ１は存在せず、Ｘ２は存在せず、Ｘ３はＲであるかまたは存在せず、Ｘ４はＹであるかまたは存在せず、Ｘ５は存在せず、かつＸ６は存在しない。
第一の態様の第十六、第十七、第十八、第十九、第二十および第二十五の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第二十六の実施形態では、第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＧＣＣＧ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＧＧＣＣ３’を含むか、または第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＣＧＣＧ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＧＣＧＣ３’を含む。
第一の態様の第一、第二、第三、第四、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五および第二十六の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第二十七の実施形態では、核酸分子は配列番号１２２〜１２６、配列番号１５４、配列番号１５９、配列番号１６３または配列番号１７４のいずれか１つによる核酸配列を含む。
第一の態様の第二、第三および第四の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第二十八の実施形態では、中央部のヌクレオチドストレッチは、５’→３’方向にボックスＡと連結ヌクレオチドストレッチとボックスＢとを含むか、または５’→３’方向にボックスＢと連結ヌクレオチドストレッチとボックスＡとを含み、ここで、ボックスＡはヌクレオチド配列５’ＷＡＡＡＧＵＷＧＡＲ３’（配列番号１８８）を含み、連結ヌクレオチドストレッチは１０〜１８個のヌクレオチドを含み、かつボックスＢはヌクレオチド配列５’ＲＧＭＧＵＧＷＫＡＧＵＫＣ３’（配列番号１８９）を含む。
第一の態様の第二十八の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第二十九の実施形態では、ボックスＡは５’ＵＡＡＡＧＵＡＧＡＧ３’（配列番号１９９）、５’ＡＡＡＡＧＵＡＧＡＡ３’（配列番号２００）、５’ＡＡＡＡＧＵＵＧＡＡ３’（配列番号２０１）および５’ＧＧＧＡＵＡＵＡＧＵＧＣ３’（配列番号２０２）の群から選択されるヌクレオチド配列、好ましくは５’ＵＡＡＡＧＵＡＧＡＧ３’（配列番号１９９）を含む。
第一の態様の第二十八および第二十九の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第三十の実施形態では、ボックスＢは５’ＧＧＣＧＵＧＡＵＡＧＵＧＣ３’（配列番号２０３）、５’ＧＧＡＧＵＧＵＵＡＧＵＵＣ３’（配列番号２０４）、５’ＧＧＣＧＵＧＡＧＡＧＵＧＣ３’（配列番号２０５）、５’ＡＧＣＧＵＧＡＵＡＧＵＧＣ３’（配列番号２０６）および５’ＧＧＣＧＵＧＵＵＡＧＵＧＣ３’（配列番号２０７）の群から選択されるヌクレオチド配列、好ましくは５’ＧＧＣＧＵＧＡＵＡＧＵＧＣ３’（配列番号２０３）を含む。
第一の態様の第二十八、第二十九および第三十の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第三十一の実施形態では、連結ヌクレオチドストレッチは、５’→３’方向に第一の連結ヌクレオチドサブストレッチと、第二の連結ヌクレオチドサブストレッチと、第三の連結ヌクレオチドサブストレッチとを含み、第一の連結ヌクレオチドサブストレッチと第三の連結ヌクレオチドサブストレッチは、それぞれ互いに独立して３〜６個のヌクレオチドを含む。
第一の態様の第三十一の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第三十二の実施形態では、第一の連結ヌクレオチドサブストレッチと第三の連結ヌクレオチドサブストレッチが二本鎖構造を形成し、好ましくはこのような二本鎖構造は、第一の連結ヌクレオチドサブストレッチと第三の連結ヌクレオチドサブストレッチが互いにハイブリダイズすることにより形成される。
第一の態様の第三十一および第三十二の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第三十三の実施形態では、二本鎖構造は３〜６個の塩基対からなる。
第一の態様の第三十一、第三十二および第三十三の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第三十四の実施形態では、
ａ）第一の連結ヌクレオチドサブストレッチが５’ＧＧＡＣ３’、５’ＧＧＡＵ３’および５’ＧＧＡ３’の群から選択されるヌクレオチド配列を含み、かつ第三の連結ヌクレオチドサブストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＵＣＣ３’を含むか、
ｂ）第一の連結ヌクレオチドサブストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＣＡＧ３’を含み、かつ第三の連結ヌクレオチドサブストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＵＧＣ３’を含むか、
ｃ）第一の連結ヌクレオチドサブストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＧＧＣ３’を含み、かつ第三の連結ヌクレオチドサブストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＣＣＣ３’を含むか、
ｄ）第一の連結ヌクレオチドサブストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＡＣ３’を含み、かつ第三の連結ヌクレオチドサブストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＵＣ３’を含むか、
ｅ）第一の連結ヌクレオチドサブストレッチがヌクレオチド配列５’ＡＣＵＵＧＵ３’を含み、かつ第三の連結ヌクレオチドサブストレッチが５’ＧＣＡＡＧＵ３’および５’ＧＣＡＡＧＣ３’の群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、または
ｆ）第一の連結ヌクレオチドサブストレッチがヌクレオチド配列５’ＵＣＣＡＧ３’を含み、かつ第三の連結ヌクレオチドサブストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＵＧＧＡ３’を含み、
好ましくは、第一の連結ヌクレオチドサブストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＡＣ３’を含み、かつ第三の連結ヌクレオチドサブストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＵＣ３’を含む。
第一の態様の第三十一、第三十二、第三十三および第三十四の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第三十五の実施形態では、第二の連結ヌクレオチドサブストレッチは３〜５個のヌクレオチドを含む。
第一の態様の第三十一、第三十二、第三十三、第三十四および第三十五の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第三十六の実施形態では、第二の連結ヌクレオチドサブストレッチは５’ＶＢＡＡＷ３’、５’ＡＡＵＷ３’および５’ＮＢＷ３’の群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
第一の態様の第三十六の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第三十七の実施形態では、第二の連結ヌクレオチドサブストレッチはヌクレオチド配列５’ＶＢＡＡＷ３’、好ましくは５’ＣＧＡＡＡ３’、５’ＧＣＡＡＵ３’、５’ＧＵＡＡＵ３’および５’ＡＵＡＡＵ３’の群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
第一の態様の第三十六の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第三十八の実施形態では、第二の連結ヌクレオチドサブストレッチはヌクレオチド配列５’ＡＡＵＷ３’、好ましくはヌクレオチド配列５’ＡＡＵＵ３’または５’ＡＡＵＡ３’、より好ましくはヌクレオチド配列５’ＡＡＵＡ３’を含む。
第一の態様の第三十六の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第三十九の実施形態では、第二の連結ヌクレオチドサブストレッチはヌクレオチド配列５’ＮＢＷ３’を含み、好ましくは第二の連結ヌクレオチドサブストレッチは５’ＣＣＡ３’、５’ＣＵＡ３’、５’ＵＣＡ３’、５’ＡＣＡ３’、５’ＧＵＵ３’、５’ＵＧＡ３’および５’ＧＵＡ３’の群、より好ましくは５’ＣＣＡ３’、５’ＣＵＡ３’、５’ＵＣＡ３’、５’ＡＣＡ３’および５’ＧＵＵ３’の群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
第一の態様の第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八および第三十九の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第四十の実施形態では、連結ヌクレオチドストレッチは５’ＧＧＡＣＢＹＡＧＵＣＣ３’（配列番号２０８）、５’ＧＧＡＵＡＣＡＧＵＣＣ３’（配列番号２０９）、５’ＧＣＡＧＧＹＡＡＵＣＵＧＣ３’（配列番号２１０）、５’ＧＡＣＡＡＵＷＧＵＣ３’（配列番号２１１）、５’ＡＣＵＵＧＵＣＧＡＡＡＧＣＡＡＧＹ３’（配列番号２１２）、５’ＵＣＣＡＧＧＵＵＣＵＧＧＡ３’（配列番号１０９）、５’ＧＧＧＣＵＧＡＧＣＣＣ３’（配列番号１９０）、５’ＧＣＡＧＡＵＡＡＵＣＵＧＣ３’（配列番号１９１）および５’ＧＧＡＣＣＡＧＵＣＣ３’（配列番号１９２）の群から選択されるヌクレオチド配列を含み、好ましくは、連結ヌクレオチドストレッチは５’ＧＧＡＣＣＣＡＧＵＣＣ３’（配列番号１９３）、５’ＧＧＡＣＣＵＡＧＵＣＣ３’（配列番号１９４）、５’ＧＧＡＣＵＣＡＧＵＣＣ３’（配列番号１９５）、５’ＧＧＡＣＧＵＡＧＵＣＣ３’（配列番号２１４）、５’ＧＣＡＧＧＵＡＡＵＣＵＧＣ３’（配列番号１９６）、５’ＧＣＡＧＧＣＡＡＵＣＵＧＣ３’（配列番号１９７）、５’ＧＡＣＡＡＵＵＧＵＣ３’（配列番号１９８）および５’ＧＡＣＡＡＵＡＧＵＣ３’（配列番号１５７）の群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
第一の態様の第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九および第四十の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第四十一の実施形態では、第一の末端ヌクレオチドストレッチが４〜７個のヌクレオチドを含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチが４〜７個のヌクレオチドを含む。
第一の態様の第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十および第四十一の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第四十二の実施形態では、第一の末端ヌクレオチドストレッチと第二の末端ヌクレオチドストレッチが二本鎖構造を形成し、好ましくはこのような二本鎖構造は、第一の末端ヌクレオチドストレッチと第二の末端ヌクレオチドストレッチが互いにハイブリダイズすることにより形成される。
第一の態様の第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一および第四十二の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第四十三の実施形態では、第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＢＫＢＫ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＭＶＶＶＸ４Ｘ５Ｘ６３’を含み、ここで、Ｘ１はＧであるかまたは存在せず、Ｘ２はＳであるかまたは存在せず、Ｘ３はＶであるかまたは存在せず、Ｘ４はＢであるかまたは存在せず、Ｘ５はＳであるかまたは存在せず、Ｘ６はＣであるかまたは存在しない。
第一の態様の第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二および第四十三の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第四十四の実施形態では、第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＢＫＢＫ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＭＶＶＶＸ４Ｘ５Ｘ６３’を含み、ここで、
ａ）Ｘ１はＧであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＶであり、Ｘ４はＢであり、Ｘ５はＳであり、かつＸ６はＣであるか、
ｂ）Ｘ１は存在せず、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＶであり、Ｘ４はＢであり、Ｘ５はＳであり、かつＸ６はＣであるか、または
ｃ）Ｘ１はＧであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＶであり、Ｘ４はＢであり、Ｘ５はＳであり、かつＸ６は存在しない。
第一の態様の第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三および第四十四の実施形態、好ましくは第一の態様の第四十四の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第四十五の実施形態では、第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＣＡＣＵＣＧ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＧＡＧＵＧＣ３’を含む。
第一の態様の第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二および第四十三の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第四十六の実施形態では、第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＢＫＢＫ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＭＶＶＶＸ４Ｘ５Ｘ６３’を含み、ここで、
ａ）Ｘ１は存在せず、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＶであり、Ｘ４はＢであり、Ｘ５はＳであり、かつＸ６は存在しないか、
ｂ）Ｘ１は存在せず、Ｘ２は存在せず、Ｘ３はＶであり、Ｘ４はＢであり、Ｘ５はＳであり、かつＸ６は存在しないか、または
ｃ）Ｘ１は存在せず、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＶであり、Ｘ４はＢであり、Ｘ５は存在せず、かつＸ６は存在しない。
第一の態様の第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三および第四十六の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第四十七の実施形態では、
ａ）第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＣＵＧＵＧ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＡＣＡＧＣ３’を含むか、
ｂ）第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＧＵＧＵＧ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＡＣＡＣＧ３’を含むか、
ｃ）第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＧＵＧＣＵ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＡＧＣＡＣＧ３’を含むか、
ｄ）第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＧＣＧＣＧ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＧＣＧＣＧ３’を含むか、
ｅ）第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＣＣＧＵＧ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＡＣＧＣＧ３’を含むか、
ｆ）第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＣＧＧＵＧ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＡＣＣＧＣ３’を含むか、
ｇ）第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＣＵＧＣＧ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＧＣＡＧＣ３’を含むか、
ｈ）第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＣＵＧＧＧ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＣＣＡＧＣ３’を含むか、または
ｉ）第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＣＧＧＣＧ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＧＣＣＧＣ３’を含む。
第一の態様の第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二および第四十三の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第四十八の実施形態では、第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＢＫＢＫ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＭＶＶＶＸ４Ｘ５Ｘ６３’を含み、ここで、Ｘ１は存在せず、Ｘ２は存在せず、Ｘ３はＶであるかまたは存在せず、Ｘ４はＢであるかまたは存在せず、Ｘ５は存在せず、かつＸ６は存在しない。
第一の態様の第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三および第四十八の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第四十九の実施形態では、第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＧＵＧ３’を含み、かつ第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＡＣＧ３’を含む。
第一の態様の第一、第二、第三、第四、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三、第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八および第四十九の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第五十の実施形態では、核酸分子は配列番号２９、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３９〜４１、配列番号４３、配列番号４６、配列番号１３７〜１４１または配列番号１７３のいずれか１つによる核酸配列を含む。
第一の態様の第一の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第五十一の実施形態では、核酸分子は、配列番号１２７〜１３１のいずれか１つによる核酸配列を含む。
第一の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三、第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十および第五十一の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第五十二の実施形態では、ヘプシジンはヒトヘプシジン−２５、ヒトヘプシジン−２２、ヒトヘプシジン−２０、サルヘプシジン−２５、サルヘプシジン−２２またはサルヘプシジン−２０、好ましくはヒトヘプシジン−２５である。
第一の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三、第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十、第五十一および第五十二の実施形態、好ましくは第一の態様の第五十二の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第五十三の実施形態では、ヘプシジンは配列番号１によるアミノ酸配列を有する。
第一の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三、第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十、第五十一、第五十二および第五十三の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第五十四の実施形態では、核酸分子は修飾基を含み、好ましくは、修飾基を含む核酸分子の生物体からの排泄速度が、ヘプシジンと結合可能で修飾基を含まない核酸分子に比べて減少している。
第一の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三、第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十、第五十一、第五十二および第五十三の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第五十五の実施形態では、核酸分子は修飾基を含み、好ましくは、修飾基を含む核酸分子の生物体内での滞留時間が、ヘプシジンと結合可能で修飾基を含まない核酸分子に比べて増加している。
第一の態様の第五十四および第五十五の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第五十六の実施形態では、修飾基は生分解性および非生分解性の修飾を含む群から選択され、好ましくは修飾基は、直鎖ポリ（エチレン）グリコール、分岐ポリ（エチレン）グリコール、ヒドロキシエチルデンプン、ペプチド、タンパク質、多糖、ステロール、ポリオキシプロピレン、ポリオキシアミダート、ポリ（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−グルタミンおよびポリエチレングリコールを含む群から選択される。
第一の態様の第五十六の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第五十七の実施形態では、修飾基は直鎖ポリ（エチレン）グリコールまたは分岐ポリ（エチレン）グリコールからなるＰＥＧ部分であり、ポリ（エチレン）グリコール部分の分子量は、好ましくは約２０，０００〜約１２０，０００Ｄａ、より好ましくは約３０，０００〜約８０，０００Ｄａ、最も好ましくは約４０，０００Ｄａである。
第一の態様の第五十六の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第五十八の実施形態では、修飾基はヒドロキシエチルデンプン部分であり、好ましくはヒドロキシエチルデンプン部分の分子量は、約１０，０００〜約２００，０００Ｄａ、より好ましくは約３０，０００〜約１７０，０００Ｄａ、最も好ましくは約１５０，０００Ｄａである。
第一の態様の第五十四、第五十五、第五十六、第五十七および第五十八の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第五十九の実施形態では、修飾基はリンカーを介して核酸分子と結合し、好ましくはリンカーは生分解性リンカーである。
第一の態様の第五十四、第五十五、第五十六、第五十七、第五十八および第五十九の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第六十の実施形態では、修飾基は、核酸分子の５’末端ヌクレオチドおよび／または３’末端ヌクレオチド、ならびに／あるいは核酸分子の５’末端ヌクレオチドと３’末端ヌクレオチドとの間にある核酸分子のヌクレオチドと結合している。
第一の態様の第五十四、第五十五、第五十六、第五十七、第五十八、第五十九および第六十の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第六十一の実施形態では、生物体は動物の身体またはヒトの身体、好ましくはヒトの身体である。
第一の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三、第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十、第五十一、第五十二、第五十三、第五十四、第五十五、第五十六、第五十七、第五十八、第五十九、第六十および第六十一の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第六十二の実施形態では、核酸分子のヌクレオチドまたは核酸分子を形成しているヌクレオチドはＬ−ヌクレオチドである。
第一の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三、第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十、第五十一、第五十二、第五十三、第五十四、第五十五、第五十六、第五十七、第五十八、第五十九、第六十、第六十一および第六十二の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第六十三の実施形態では、核酸分子はＬ−核酸である。
第一の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三、第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十、第五十一、第五十二、第五十三、第五十四、第五十五、第五十六、第五十七、第五十八、第五十九、第六十、第六十一、第六十二および第六十三の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第六十四の実施形態では、核酸分子は、ヘプシジンと結合可能な結合部分を少なくとも１つ含み、このような結合部分はＬ−ヌクレオチドからなる。
第一の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三、第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十、第五十一、第五十二、第五十三、第五十四、第五十五、第五十六、第五十七、第五十八、第五十九、第六十、第六十一、第六十二、第六十三および第六十四の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第六十五の実施形態では、方法は疾患を治療および／または予防するための方法であるか、あるいは方法は、疾患を治療および／または予防するための方法の一部分であるか、またはこのような方法に用いられるか、それに関連して用いられる。
第一の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三、第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十、第五十一、第五十二、第五十三、第五十四、第五十五、第五十六、第五十七、第五十八、第五十九、第六十、第六十一、第六十二、第六十三、第六十四および第六十五の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第六十六の実施形態では、核酸分子は担体に固定化されている。
第一の態様の第六十六の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第六十七の実施形態では、担体に固定化されている核酸分子はｅｘ ｖｉｖｏで存在する。
第一の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三、第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十、第五十一、第五十二、第五十三、第五十四、第五十五、第五十六、第五十七、第五十八、第五十九、第六十、第六十一、第六十二、第六十三、第六十四および第六十五の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第六十八の実施形態では、核酸分子は、第一の態様の第五十四、第五十五、第五十六、第五十七、第五十八、第五十九および第六十の実施形態のいずれか１つで明確にされる修飾基を含むことにより修飾され、修飾核酸分子を形成する。
第一の態様の第六十八の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第六十九の実施形態では、ヘプシジンと修飾核酸分子との複合体を修飾基に対するリガンドと接触させて、体液から複合体を除去する。
第一の態様の第六十八および第六十九の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第七十の実施形態では、修飾核酸分子は、修飾核酸分子と任意に追加の成分とを含む医薬組成物の一部分であり、追加の成分は、薬学的に許容される補形剤、薬学的に許容される担体および薬学的に活性な物質を含む群から選択される。
第一の態様の第六十九および第七十の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第七十一の実施形態では、リガンドは担体に固定化され、かつｅｘ ｖｉｖｏで存在する。
第一の態様の第六十六および第六十七の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第七十二の実施形態では、核酸分子は、前記核酸の３’末端または５’末端で担体に固定化されている。
第一の態様の第六十六、第六十七、第六十八、第六十九、第七十、第七十一および第七十二の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第七十三の実施形態では、核酸分子またはリガンドは共有結合、非共有結合、水素結合、ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ相互作用、クーロン力の相互作用、疎水性相互作用または配位結合により固定化されている。
第一の態様の第六十六、第六十七、第七十一、第七十二および第七十三の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第七十四の実施形態では、担体は、好ましくは有機高分子および／または無機高分子を含む固体担体である。
第一の態様の第七十四の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第七十五の実施形態では、固体担体は多孔質ガラス、粘土、セルロース、デキストラン、アクリル、アガロース、ポリスチレン、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、シリカビーズ、アクリル酸系アミノ担体およびメタクリル酸系アミノ担体からなる群より選択される。
第一の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三、第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十、第五十一、第五十二、第五十三、第五十四、第五十五、第五十六、第五十七、第五十八、第五十九、第六十、第六十一、第六十二、第六十三、第六十四および第六十五の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第七十六の実施形態では、体液が体液と透析液とを隔てる半透膜と接触し、ヘプシジンおよび／またはヘプシジンと核酸分子との複合体が半透膜を介して体液から透析液に拡散することにより、体液中のヘプシジレベルが低下する。
第一の態様の第七十六の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第七十七の実施形態では、核酸分子は修飾されていない。
第一の態様の第七十六および第七十七の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第七十八の実施形態では、ヘプシジンと非修飾核酸分子との複合体が体液から透析液に拡散する。
第一の態様の第七十六の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第七十九の実施形態では、核酸分子は、第一の態様の第五十四、第五十五、第五十六、第五十七、第五十八、第五十九および第六十の実施形態のいずれか１つで明確にされる修飾基を含み、修飾核酸分子を形成する。
第一の態様の第七十九の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第八十の実施形態では、修飾核酸分子は透析液中に存在する。
第一の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三、第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十、第五十一、第五十二、第五十三、第五十四、第五十五、第五十六、第五十七、第五十八、第五十九、第六十、第六十一、第六十二、第六十三、第六十四、第六十五、第六十六、第六十七、第六十八、第六十九、第七十、第七十一、第七十二、第七十三、第七十四、第七十五、第七十六、第七十七、第七十八、第七十九および第八十の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第八十一の実施形態では、体液は血液、血漿または血清である。
第一の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三、第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十、第五十一、第五十二、第五十三、第五十四、第五十五、第五十六、第五十七、第五十八、第五十九、第六十、第六十一、第六十二、第六十三、第六十四、第六十五、第六十六、第六十七、第六十八、第六十九、第七十、第七十一、第七十二、第七十三、第七十四、第七十五、第七十六、第七十七、第七十八、第七十九、第八十および第八十一の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第八十二の実施形態では、前記対象は腎機能障害を有する。
第一の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三、第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十、第五十一、第五十二、第五十三、第五十四、第五十五、第五十六、第五十七、第五十八、第五十九、第六十、第六十一、第六十二、第六十三、第六十四、第六十五、第六十六、第六十七、第六十八、第六十九、第七十、第七十一、第七十二、第七十三、第七十四、第七十五、第七十六、第七十七、第七十八、第七十九、第八十、第八十一および第八十二の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第八十三の実施形態では、方法はｅｘ ｖｉｖｏでの方法である。
第一の態様の第八十三の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第八十四の実施形態では、体液を、それが採取されるまたは採取された身体に戻さない。
第一の態様の第八十三および第八十四の実施形態の一実施形態でもある、第一の態様の第八十五の実施形態では、体液は貯蔵血液である。
本発明の基礎となる課題は、第二の態様の第一の実施形態でもある第二の態様では、担体に固定化された核酸分子を調製する方法により解決され、この核酸分子はヘプシジンと結合可能であり、この方法は、ヘプシジンと結合可能な核酸分子と、活性化された担体とを反応させて、核酸分子の３’末端、５’末端またはその両方と担体との間で結合を形成させることを含む。
第二の態様の第一の実施形態の一実施形態でもある、第二の態様の第二の実施形態では、方法は、活性化された担体をヘプシジン以外の体液成分とは共有結合しないようにブロックすることをさらに含む。
第二の態様の第一および第二の実施形態の一実施形態でもある、第二の態様の第三の実施形態では、担体はＳｅｐｈａｒｏｓｅである。
第二の態様の第三の実施形態の一実施形態でもある、第二の態様の第四の実施形態では、ＮＨＳ−エステルを用いてＳｅｐｈａｒｏｓｅ担体を活性化させる。
第二の態様の第四の実施形態の一実施形態でもある、第二の態様の第五の実施形態では、活性化されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ担体をエタノールアミン処理によりブロックする。
第二の態様の第一、第二、第三、第四および第五の実施形態の一実施形態でもある、第二の態様の第六の実施形態では、核酸分子はアミノ官能基部分を含み、かつ核酸分子は弱塩基性溶液中で、活性化されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ担体に固定化される。
第二の態様の第六の実施形態の一実施形態でもある、第二の態様の第七の実施形態では、アミノ官能基部分は３つのヘキサエチレングリコール部分を含み、この３つのヘキサエチレングリコール部分は核酸分子とアミノ官能基部分との間に配置されている。
本発明の基礎となる課題は、第三の態様の第一の実施形態でもある第三の態様では、担体に固定化された核酸分子であって、ヘプシジンと結合可能な核酸分子により解決される。
第三の態様の第一の実施形態の一実施形態でもある、第三の態様の第二の実施形態では、核酸分子は、第一の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三、第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十、第五十一、第五十二、第五十三、第五十四、第五十五、第五十六、第五十七、第五十八、第五十九、第六十、第六十一、第六十二、第六十三、第六十四、第六十五、第六十六、第六十七、第六十八、第六十九、第七十、第七十一、第七十二、第七十三、第七十四および第七十五の実施形態のいずれか１つに記載されている核酸分子であるか、またはこれを含む。
本発明の基礎となる課題は、第四の態様の第一の実施形態でもある第四の態様では、第一の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三、第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十、第五十一、第五十二、第五十三、第五十四、第五十五、第五十六、第五十七、第五十八、第五十九、第六十、第六十一、第六十二、第六十三、第六十四、第六十五、第六十六、第六十七、第六十八、第六十九、第七十、第七十一、第七十二、第七十三、第七十四、第七十五、第七十六、第七十七、第七十八、第七十九、第八十、第八十一、第八十一、第八十二、第八十三、第八十四および第八十五の実施形態のいずれかによる方法で使用する医療装置により解決される。
第四の態様の第一の実施形態の一実施形態でもある、第四の態様の第二の態様では、装置は、第一の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三、第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十、第五十一、第五十二、第五十三、第五十四、第五十五、第五十六、第五十七、第五十八、第五十九、第六十、第六十一、第六十二、第六十三、第六十四、第六十五、第六十六、第六十七、第六十八、第六十九、第七十、第七十一、第七十二、第七十三、第七十四、第七十五、第七十六、第七十七、第七十八、第七十九、第八十、第八十一、第八十一、第八十二、第八十三、第八十四および第八十五の実施形態のいずれか１つで明確にされる核酸分子ならびに／または第三の態様の第一および第二の実施形態のいずれか１つによる核酸分子を含む。
本発明の基礎となる課題は、第五の態様の第一の実施形態でもある第五の態様では、対象、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトの体液中のヘプシジンレベルを低下させる方法で使用する核酸分子により解決され、この核酸はヘプシジンと結合可能な核酸分子である。
第五の態様の第一の実施形態の一実施形態でもある、第五の態様の第二の実施形態では、核酸分子は、第一の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三、第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十、第五十一、第五十二、第五十三、第五十四、第五十五、第五十六、第五十七、第五十八、第五十九、第六十、第六十一、第六十二、第六十三、第六十四、第六十五、第六十六、第六十七、第六十八、第六十九、第七十、第七十一、第七十二、第七十三、第七十四、第七十五、第七十六、第七十七、第七十八、第七十九、第八十、第八十一、第八十一、第八十二、第八十三、第八十四および第八十五の実施形態のいずれか１つに記載されている核酸分子であるか、またはこれ含む。
本発明の基礎となる課題は、第六の態様の第一の実施形態でもある第六の態様では、対象の体液からヘプシジンを除去する方法で使用する核酸分子により解決され、この核酸分子は、第一の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三、第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十、第五十一、第五十二、第五十三、第五十四、第五十五、第五十六、第五十七、第五十八、第五十九、第六十、第六十一、第六十二、第六十三、第六十四、第六十五、第六十六、第六十七、第六十八、第六十九、第七十、第七十一、第七十二、第七十三、第七十四、第七十五、第七十六、第七十七、第七十八、第七十九、第八十、第八十一、第八十一、第八十二、第八十三、第八十四および第八十五の実施形態のいずれか１つで明確にされる核酸分子である。
第六の態様の第一の実施形態の一実施形態でもある、第六の態様の第二の実施形態では、方法は、第一の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三、第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十、第五十一、第五十二、第五十三、第五十四、第五十五、第五十六、第五十七、第五十八、第五十九、第六十、第六十一、第六十二、第六十三、第六十四、第六十五、第六十六、第六十七、第六十八、第六十九、第七十、第七十一、第七十二、第七十三、第七十四、第七十五、第七十六、第七十七、第七十八、第七十九、第八十、第八十一、第八十一、第八十二、第八十三、第八十四および第八十五の実施形態のいずれか１つで明確にされる方法である。
本発明の基礎となる課題は、第七の態様の第一の実施形態でもある第七の態様では、貧血患者を治療する方法で使用する核酸分子により解決され、この核酸分子は、第一の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三、第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十、第五十一、第五十二、第五十三、第五十四、第五十五、第五十六、第五十七、第五十八、第五十九、第六十、第六十一、第六十二、第六十三、第六十四、第六十五、第六十六、第六十七、第六十八、第六十九、第七十、第七十一、第七十二、第七十三、第七十四、第七十五、第七十六、第七十七、第七十八、第七十九、第八十、第八十一、第八十一、第八十二、第八十三、第八十四および第八十五の実施形態のいずれか１つで明確にされる核酸分子である。
第七の態様の第一の実施形態の一実施形態でもある、第七の態様の第二の実施形態では、治療は、好ましくはヘプシジンと核酸分子との相互作用により、患者の体液からヘプシジンを除去することを含む。
第七の態様の第二の実施形態の一実施形態でもある、第七の態様の第三の実施形態では、核酸分子が体外装置内に、好ましくは固定化されて存在し、体液が患者の身体から取り出されて体外装置の中を通過し、患者の体内に戻る。
第七の態様の第三の実施形態の一実施形態でもある、第七の態様の第四の実施形態では、体液は血液または血漿である。
本明細書に記載されている本発明による核酸の特徴は、核酸を単独でまたは任意の組合せで使用する本発明のいずれの態様でも実現され得る。
（９６ページ）
本発明をさらなる特徴、実施形態および利点が理解され得る図面、実施例および配列表により詳細に説明する。
Ａ型ヘプシジン結合核酸の配列のアライメントを示す図である。 Ａ型ヘプシジン結合核酸の配列のアライメントを示す図である。 Ａ型ヘプシジン結合核酸２２３−Ｃ５−００１の誘導体を示す図である。 Ａ型ヘプシジン結合核酸２２９−Ｂ１−００１の誘導体を示す図である。 Ｂ型ヘプシジン結合核酸の配列のアライメントを示す図である。 Ｂ型ヘプシジン結合核酸２３８−Ｄ４−００１の誘導体を示す図である。 Ｃ型ヘプシジン結合核酸の配列のアライメントを示す図である。 Ｃ型ヘプシジン結合核酸２３８−Ｃ４−００１の誘導体を示す図である。 他のヘプシジン結合核酸の配列のアライメントを示す図である。 ヘプシジン結合核酸２２３−Ｃ５−００１、２２９−Ｂ１−００２、２３８−Ｃ４−００６、２３８−Ｄ４−００１および２３８−Ｄ４−００８とヒトヘプシジン−２５、カニクイザルヘプシジン−２５、マーモセットヘプシジン−２５、マウスヘプシジン−２５およびラットヘプシジン−２５との結合に関するデータを示す図である。 ヘプシジン結合核酸２２３−Ｃ５−００１、２２９−Ｂ１−００２、２３８−Ｃ４−００６、２３８−Ｄ４−００１および２３８−Ｄ４−００８とヒトヘプシジン−２５、ヘプシジン−２２およびヘプシジン−２０との結合に関するデータを示す図である。 ヘプシジン結合核酸２２３−Ｃ５−００１−５’−ＰＥＧ、２２９−Ｂ１−００２−５’−ＰＥＧ、２３８−Ｃ４−００６−５’−ＰＥＧ、２３８−Ｄ４−００２−５’−ＰＥＧおよび２３８−Ｄ４−００８−５’−ＰＥＧとヒトヘプシジン−２５との結合に関するデータを示す図である。 ３７℃でビオチン化ヒトＬ−ヘプシジンと結合するヘプシジン結合核酸ＮＯＸ−Ｈ９４のシュピーゲルマー（＝２３８−Ｄ４−００８−５’−ＰＥＧ）のＫＤ値を示すＢｉａｃｏｒｅ ２０００のセンサグラムである。ビオチン化ヒトＬ−ヘプシジンはストレプトアビジン結合法によりストレプトアビジン結合センサーチップに３７℃で固定化したものであり、図中、反応（ＲＵ）が経時的に表されている。 シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｈ９４（＝２３８−Ｄ４−００８−５’−ＰＥＧ）のヘプシジン活性に対するｉｎ ｖｉｖｏでの効果を示す図である。ヒトヘプシジンを注射する前にシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｈ９４（＝２３８−Ｄ４−００８−５’−ＰＥＧ）を投与することにより、ヒトヘプシジンによる血清鉄の減少が完全に阻止されている。 炎症による貧血の動物モデル（カニクイザル）におけるシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｈ９４（＝２３８−Ｄ４−００８−５’−ＰＥＧ）の効果を示す図である。ＩＬ−６は非ヒト霊長類においてヘプシジン分泌を誘導し貧血をもたらし、この実験では、ヒトＩＬ−６が血清鉄濃度を溶媒／ＩＬ−６処置個体の投与前の値の２７％まで減少させ、ヒトＩＬ−６を注射する前にシュピーゲルマー２３８−Ｄ４−００８−５’−ＰＥＧを投与することにより血清鉄の減少が完全に阻止されている。 異なる担体と結合したヘプシジン結合核酸ＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノの量の計算結果を示す図である。次いで、測定されたＯＤを、イオン交換ＨＰＬＣによる決定に従ってＮ−ヒドロキシスクシンイミド（略語：ＨＯＳｕ）に起因するものとＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノに起因するものとに分ける。上清中のＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノによるＯＤを算出して合計し、担体と結合していない総ＯＤを出す。次いで、担体の総ＯＤを決定し、同様に担体への負荷量も決定する。 合わせた洗浄液上清のＩＥＸクロマトグラム（２６０ｎｍでの吸光度）を示す図である。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（略語：ＨＯＳｕ）およびＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノに起因するＯＤの量を容易に決定することが可能であり、この例では、総ＯＤの１５％が核酸分子に起因するものである。 標準校正試料の希釈とピペット操作のスキームを示す図である。 品質管理試料を１０倍ストック溶液として調製し、アッセイの被検試料と同様に希釈したことを示す図である。 被検試料の希釈およびピペット操作のスキームを示す図である。 使用した担体のインキュベーションの概要を示す図である。ヘプシジン−２５を添加したヒトプール血漿を、固定化されたＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧを含む担体とエタノールアミンでブロックされたＳｅｐｈａｒｏｓｅ担体（ＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧが結合していない、「ブロック」）ともに様々な濃度でインキュベートした。ヘプシジンとＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧの相対量も明記されている。インキュベーションでは、担体１５μｌ＋マトリックス１５０μｌを室温で２時間使用した。 競合ヘプシジンＥＬＩＳＡ（Ｂａｃｈｅｍ）を用いて決定されたヘプシジン量の決定を示す図である。「負荷」＝担体とのインキュベーション前のマトリックス中のヘプシジン量（％）；「未結合」＝インキュベーション後の上清中のヘプシジン量（％）；「洗浄液」＝合わせた洗浄画分中のヘプシジン量（％）である。
本発明は、ヘプシジンと高い親和性で特異的に結合する化合物として核酸を作成することが可能であるという驚くべき知見に基づくものであり、ここでは、ヒトヘプシジン−２５は配列番号１によるアミノ酸配列を有する塩基性タンパク質である。
本発明においては、本発明による核酸は核酸分子である。したがって、核酸および核酸分子という用語は、別途明記されない限り同義語として明細書で使用される。またこのような核酸は、本明細書では本発明による核酸分子、本発明による核酸、本発明の核酸または本発明の核酸分子と称することが好まれる。
詳細は特許請求の範囲および実施例１で述べるが、さらに驚くべきことに、本発明者らはヘプシジンと結合可能な様々な核酸分子を多数特定することができ、それによりほとんどの核酸を、本明細書ではボックスとも称されるヌクレオチドストレッチによって特徴付けることができた。ヘプシジンと結合可能な各種核酸分子は、前記ボックスとさらにいくつかの構造的特徴および要素に基づき、Ａ型、Ｂ型およびＣ型のヘプシジン結合核酸としてそれぞれ分類することが可能である。
種類の異なるヘプシジン結合核酸は異なるヌクレオチドストレッチを含む。したがって、種類の異なるヘプシジン結合核酸は、異なるヘプシジンペプチドに対する異なった結合の性質を示す。実施例で示されるように、本発明によるヘプシジン結合核酸はヒトヘプシジン−２５、ヒトヘプシジン−２２、ヒトヘプシジン−２０、カニクイザルヘプシジン−２５およびマーモセットヘプシジン−２５と結合する。
本明細書でヘプシジンと称されるものはいずれも、別途明記されない限りヘプシジン−２５のことであるということを認識するべきである。
ヘプシジンと結合する種類の異なるヘプシジン結合核酸分子は、３種類の異なるヌクレオチドストレッチ、すなわち第一の末端ヌクレオチドストレッチ、中央部のヌクレオチドストレッチおよび第二の末端ヌクレオチドストレッチを含む。本発明のヘプシジン結合核酸分子は一般に、５’末端と３’末端に末端ヌクレオチドストレッチ、すなわち第一の末端ヌクレオチドストレッチおよび第二の末端ヌクレオチドストレッチ（５’−末端ヌクレオチドストレッチおよび３’−末端ヌクレオチドストレッチとも称する）を含む。第一の末端ヌクレオチドストレッチと第二の末端ヌクレオチドストレッチは原則的に、塩基相補性によって互いにハイブリダイズすることが可能であり、それにより、ハイブリダイゼーションの際に二本鎖構造が形成される。しかし、生理的条件下および／または非生理的条件下で、このようなハイブリダイゼーションが分子内で必ずしも起こるわけではない。ヘプシジン結合核酸分子の３種類のヌクレオチドストレッチである第一の末端ヌクレオチドストレッチ、中央部のヌクレオチドストレッチおよび第二の末端ヌクレオチドストレッチは、５’→３’方向に第一の末端ヌクレオチドストレッチ、中央部のヌクレオチドストレッチ、第二の末端ヌクレオチドストレッチの順で互いに配置されている。あるいは、５’→３’方向に第二の末端ヌクレオチドストレッチ、中央部のヌクレオチドストレッチ、第一の末端ヌクレオチドストレッチの順で互いに配置されている。
異なるヘプシジン結合核酸分子間での定められたボックスまたはストレッチの配列の相違がヘプシジンとの結合親和性に影響する。本発明の様々なヘプシジン結合核酸分子の結合分析に基づけば、中央部のストレッチとそれを形成しているヌクレオチドが個々に、より好ましくはその全体がヘプシジンとの結合に必須である。
「ストレッチ」および「ヌクレオチドストレッチ」という用語は、別途明記されない限り、本明細書では同義語として使用される。
好適な実施形態では、本発明による核酸は単一核酸分子である。さらなる実施形態では、核酸分子は多数の単一核酸分子として、または多数の単一核酸分子種として存在する。
本発明による核酸分子は、好ましくはホスホジエステル結合を介して互いに共有結合したヌクレオチドからなるのが好ましいということを当業者は認識するであろう。
本発明においては、２種類以上のストレッチまたはその一部分（１つまたは複数）を含む本発明による核酸は原則的に、互いにハイブリダイズすることが可能である。このようなハイブリダイゼーションにより二本鎖構造が形成される。このようなハイブリダイゼーションは、特にｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ条件下では生じる場合も生じない場合もあることを当業者は認識するであろう。また、このようなハイブリダイゼーションの場合、必ずしも２つのストレッチの全長にわたってハイブリダイゼーションが起こるわけではないが、少なくとも塩基対形成の規則に基づけば、原則的にこのようなハイブリダイゼーションとそれによる二本鎖構造形成は起こり得る。本明細書において好ましく使用される二本鎖構造とは、２本以上の別個の核酸分子鎖により、または単一の核酸分子鎖内で空間的に分離した２つのストレッチにより形成される核酸分子または構造の一部分のことであり、その構造内には、好ましくはＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋの塩基対合則に従って塩基対を形成している塩基対が少なくとも１個、好ましくは２個以上存在する。また、Ｈｏｏｇｓｔｅｎ塩基対のような他の塩基対がこのような二本鎖構造内に存在するか、またはそれを形成することがあり得ることも当業者は認識するであろう。また、２つのストレッチがハイブリダイズするという特徴は、好ましくは、このようなハイブリダイゼーションが２つのストレッチの塩基相補性によって起こると推測されることを示すということも認識するべきである。
好適な実施形態では、本明細書で使用される用語の配置は、本明細書に開示される核酸に関連して本明細書に記載されている構造的または機能的な特徴または要素の順序または配列を意味するものである。
当業者は、本発明による核酸がヘプシジンと結合可能であることを認識するであろう。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、ヘプシジンとの結合は、特許請求される核酸分子の三次元構造の特性または要素の組合せによるものであり、こうした特性または要素は、それを形成するヌクレオチドの一次配列の配向および折畳みパターンにより生じるものであると本発明者らは考える。個々の特性または要素は各種の異なる個々の配列により形成され得るものであり、その差異がどの程度であるかは、個々の要素または特性が形成することになる三次元構造によって異なるということは明らかである。特許請求される核酸の全体的な結合特性は、各種要素および特性の相互作用により個々に生じるものであり、これが最終的には特許請求される核酸とその標的、すなわちヘプシジンとの相互作用をもたらす。同様にいかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、Ｂ型およびＣ型ヘプシジン結合核酸に特徴的な中央部のストレッチ、ならびにＡ型ヘプシジン結合核酸に特徴的な第一のストレッチであるボックスＡおよび第二のストレッチであるボックスＢは、特許請求される核酸とヘプシジンとの結合を仲介するのに重要であると思われる。したがって、本発明による核酸はヘプシジンとの相互作用およびヘプシジンの検出に適している。また当業者は、本発明による核酸がヘプシジンに対するアンタゴニストであることも認識するであろう。このため、本発明による核酸は、ヘプシジンに関連する、またはそれを原因とする任意の疾患または状態の治療および予防にそれぞれ適している。このような疾患および状態については、ヘプシジンが前記疾患および状態に関与または関連していることを個々に立証する先行技術、ならびに参照により本明細書に組み込まれ、本発明による核酸の治療的および診断的使用の科学的根拠を提供する先行技術から理解され得る。
本発明においては、本発明による核酸は核酸分子である。したがって、核酸および核酸分子という用語は、別途明記されない限り、明細書では同義語として使用される。本出願の一実施形態では、核酸および核酸分子は、核酸分子を形成する連続ヌクレオチドがすべて、１個または２個以上の共有結合によって互いに結合または連結していることを特徴とする核酸分子を含む。より具体的には、このようなヌクレオチドは、それぞれが好ましくはホスホジエステル結合などの結合を介して他の２個のヌクレオチドと結合または連結し、連続ヌクレオチドのストレッチを形成する。ただし、このような配置で、両端のヌクレオチド、すなわち、好ましくは５’末端および３’末端のヌクレオチドがそれぞれ１個のヌクレオチドと結合しているのは、このような配置が直鎖状であって環状の配置ではない、したがって環状分子ではなく直鎖状分子であるという条件下のときだけである。
本出願の別の実施形態では、核酸および核酸分子は、少なくとも２群の連続ヌクレオチドを含み、各群の連続ヌクレオチド内では、各ヌクレオチドが、好ましくはホスホジエステル結合などの結合を介して他の２個のヌクレオチドと結合または連結し、連続ヌクレオチドのストレッチを形成する。ただし、このような配置では、前記少なくとも２群の連続ヌクレオチドそれぞれの両端のヌクレオチド、すなわち、好ましくは５’末端および３’末端のヌクレオチドがそれぞれ１個のヌクレオチドとだけ結合している。しかし、このような実施形態では、２群の連続ヌクレオチドは、共有結合、好ましくは前記２個のヌクレオチドのうち１個のヌクレオチドの糖部分と前記２個のヌクレオチドまたはヌクレオシドの他方のリン酸部分との間で形成される共有結合を介して一方の群の１個のヌクレオチドと別のまたは他方の群の１個のヌクレオチドとを結合させる共有結合を介して、互いに結合または連結しているわけではない。しかし、別の実施形態では、２群の連続ヌクレオチドは、共有結合、好ましくは前記２個のヌクレオチドのうち１個のヌクレオチドの糖部分と前記２個のヌクレオチドまたはヌクレオシドの他方のリン酸部分との間で形成される共有結合を介して一方の群の１個のヌクレオチドと別のまたは他方の群の１個のヌクレオチドとを結合させる共有結合を介して、互いに結合または連結している。少なくとも２群の連続ヌクレオチドは、共有結合を介しては結合していないことが好ましい。別の好適な実施形態では、少なくとも２群は、ホスホジエステル結合とは異なる共有結合を介して結合している。さらに別の実施形態では、少なくとも２群は、ホスホジエステル結合である共有結合を介して結合している。さらに、２群の連続ヌクレオチドは共有結合を介して互いに結合または連結しており、共有結合は、２群の連続ヌクレオチドの第一群の３’末端のヌクレオチドと、２群の連続ヌクレオチドの第二群の５’末端のヌクレオチドの間で形成されているか、または共有結合は、２群の連続ヌクレオチドの第一群の５’末端のヌクレオチドと、２群の連続ヌクレオチドの第二群の３’末端のヌクレオチドの間で形成されていることが好ましい。
また本発明による核酸は、本明細書に開示される特定の配列と実質的に相同な核酸も含むものとする。実質的に相同であるという用語は、相同性が少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％であり、最も好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を上回るものであると理解されるべきである。
本発明による核酸中に存在する相同なヌクレオチドの実際の割合は、核酸中に存在するヌクレオチドの総数によって決まる。修飾の割合は、核酸中に存在するヌクレオチドの総数に基づくものであり得る。
２つの核酸分子間の相同性は当業者に既知の方法で決定され得る。より具体的には、指定されたプログラムパラメータに基づいた参照配列に対する試験配列（１つまたは複数）のパーセント配列相同性の計算に配列比較アルゴリズムを用い得る。試験配列は、異なる核酸分子と相同であると考えられるか、またはそれと相同であるか否かを、また相同である場合はその程度も試験する配列または核酸分子であることが好ましく、このような異なる核酸分子は参照配列とも呼ばれる。一実施形態では、参照配列は本明細書に記載の核酸分子、好ましくは配列番号２９〜４３、配列番号４５〜４８、配列番号１１０〜１５６、配列番号１５８〜１７６または配列番号１７９〜１８１のいずれか１つによる配列を有する核酸分子である。比較のために配列の最適アライメントを、例えばＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，１９８１）、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アライメントアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０）、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性検索法（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，１９８８）、コンピュータによる上記アルゴリズムの実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）または目視による調査により行うことができる。
パーセント配列同一性の決定に適したアルゴリズムの１つの例が、ベーシックローカルアライメント検索ツール（以下「ＢＬＡＳＴ」と呼ぶ）で使用するアルゴリズムであり、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０およびＡｌｔｓｃｈｕｌら，１９９７）を参照されたい。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、以下「ＮＣＢＩ」と呼ぶ）により一般に公開されている。ＮＣＢＩから入手可能なソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列用）およびＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸配列用）を用いた配列同一性の決定で使用するデフォルトパラメータは、ＭｃＧｉｎｎｉｓら（ＭｃＧｉｎｎｉｓら，２００４）により記載されている。
また本発明による核酸は、本明細書に開示されヌクレオチド配列により定義される核酸に対してある程度の同一性を有する核酸も含むものとする。より好ましくは、本発明は、本明細書に開示されヌクレオチド配列により定義される核酸またはその一部分に対して少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％の、また最も好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を上回る同一性を有する核酸分子も含む。
本発明の核酸または本発明による核酸という用語は両用語とも互換的に使用されるものであり、本明細書に開示される核酸配列またはその一部分を、好ましくは核酸または前記部分がヒトヘプシジンとの結合に関与する程度まで含む核酸も含むものとする。一実施形態では、このような核酸は本明細書に記載の核酸分子あるいはその誘導体および／または代謝産物のうちの１つであり、このような誘導体および／または代謝産物は本明細書に記載の核酸分子に比べて短縮されていることが好ましい。短縮は本明細書に開示される核酸の一端または両端に関連し得る。また、短縮は核酸の内部のヌクレオチド配列に関連し得る、すなわち、短縮は５’末端ヌクレオチドと３’末端ヌクレオチドの間のヌクレオチド（１つまたは複数）にそれぞれ関連し得る。さらに、短縮は、本明細書に開示される核酸の配列からの最低で１個のヌクレオチドの削除を含むものとする。また、短縮は本発明の核酸（１つまたは複数）の２つ以上のストレッチにも関連し得るものであり、ストレッチは最低で１ヌクレオチドの長さであり得る。本発明による核酸の結合は、日常の実験を用いて、あるいは本明細書に記載されている方法、好ましくは本明細書の実施例の部分に記載されている方法を使用または導入することによって当業者により決定され得る。
本発明による核酸はＤ−核酸またはＬ−核酸のどちらであってもよい。好ましくは、本発明の核酸はＬ−核酸である。さらに、核酸の１つまたは複数の部分がＤ−核酸として存在するか、または核酸の少なくとも１つまたは複数の部分がＬ−核酸であることも可能である。核酸の「部分」という用語は、最低で１個のヌクレオチドを意味するものとする。したがって、特に好適な実施形態では、本発明による核酸はＬ−ヌクレオチドからなり、かつ少なくとも１個のＤ−ヌクレオチドを含む。このようなＤ−ヌクレオチドは、核酸の他の部分または標的、すなわちヘプシジンとの相互作用にかかわり本発明による核酸を定めるストレッチ、好ましくはその一部分とは異なる部分と結合していることが好ましい。好ましくは、このようなＤ−ヌクレオチドは、任意のストレッチの末端または本発明による任意の核酸の末端に個々に結合している。さらなる好適な実施形態では、このようなＤ−ヌクレオチドは、好ましくは本発明による核酸にＰＥＧおよびＨＥＳのような修飾または修飾基を結合させる、スペーサーまたはリンカーとして働き得る。
また、核酸配列（１つまたは複数）全体が本明細書に記載されている任意の核酸分子がそれぞれ、特定のヌクレオチド配列（１つまたは複数）に限定されることも本発明の実施形態の範囲内にある。換言すれば、「（〜を）含む」という用語は、このような実施形態では、（〜を）含有するまたは（〜から）なるという意味で解釈されるものとする。
また本発明においては、本発明による核酸はこれよりも長い核酸の一部分であって、この長い核酸は複数の部分を含み、このような部分の少なくとも１つは本発明による核酸またはその一部分である。上記長い核酸の他の部分（１つまたは複数）は、１つまたは複数のＤ−核酸であっても１つまたは複数のＬ−核酸であってもよい。本発明に関連して任意の組合せを使用し得る。単独でのまたは組み合わせた、長い核酸の上記他の部分（１つまたは複数）は、それ全体としてまたは特定の組合せとして、結合、好ましくはヘプシジンとの結合とは異なる機能を示し得る。可能性のある機能の１つが、他の分子との相互作用を可能にすることであり、この場合、他の分子はヘプシジンとは異なる分子、例えば固定化、架橋、検出または増幅などのための分子であることが好ましい。本発明のさらなる実施形態では、本発明による核酸は、本発明の複数の核酸を個々の部分として、または組み合わさった部分として含む。このような本発明の複数の核酸を含む核酸も、長い核酸という用語に包含される。
本明細書で使用されるＬ−核酸またはＬ−核酸分子とは、Ｌ−ヌクレオチドからなる、好ましくは完全にＬ−ヌクレオチドからなる核酸または核酸分子のことである。
本明細書で使用されるＤ−核酸またはＤ−核酸分子とは、Ｄ−ヌクレオチドからなる、好ましくは完全にＤ−ヌクレオチドからなる核酸または核酸分子のことである。
また、別途明記されていなければ、どのヌクレオチド配列も５’→３’方向に本明細書に記載されている。
本明細書で好ましく使用されるヌクレオチドの任意の位置は、配列、ストレッチまたはサブストレッチの５’末端に対して定められるまたは言及されるものである。したがって、２番目のヌクレオチドとは、それぞれ配列、ストレッチおよびサブストレッチの５’末端から数えて２番目のヌクレオチドのことである。また、これに従えば、最後から２番目のヌクレオチドとは、それぞれ配列、ストレッチおよびサブストレッチの３’末端から数えて２番目のヌクレオチドのことである。
本発明の核酸がＤ−ヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチドまたはその両方の組合せ（例えば、無作為な組合せまたは少なくとも１個のＬ−ヌクレオチドと少なくとも１個のＤ−核酸とからなる定められたストレッチの配列）のいずれからなるものであっても、核酸はデゾキシリボヌクレオチド（１つまたは複数）、リボヌクレオチド（１つまたは複数）またはその組合せからなるものであり得る。
本発明の核酸をＬ−核酸として設計すると、いくつかの理由で有利である。Ｌ−核酸は天然の核酸の鏡像異性体である。しかし、Ｄ−核酸は水溶液中での安定性が低く、特に生体系または生物試料中ではヌクレアーゼが広く存在するため安定性が低い。天然のヌクレアーゼ、特に動物細胞のヌクレアーゼはＬ−核酸を分解することができない。このためＬ−核酸の生物学的半減期は、動物およびヒトの身体を含めたこのような系でもきわめて長い。Ｌ−核酸は分解されないため、ヌクレアーゼ分解産物が生成されることはなく、したがってそこから生じる副作用がみられない。この側面は、Ｌ−核酸をヘプシジンの存在が関連する疾患および／または障害の治療法で使用される事実上すべての他の化合物と明確に区別するものである。Ｗａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対合とは異なる機序により標的分子と特異的に結合するＬ−核酸、すなわち部分的または完全にＬ−ヌクレオチドからなり、特にその部分がアプタマーと標的分子との結合に関与しているアプタマーはシュピーゲルマーとも呼ばれる。アプタマー自体は当業者に公知であり、特に「Ｔｈｅ Ａｐｔａｍｅｒ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」（Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ編，２００６）記載されている。
また本発明においては、本発明による核酸は、Ｄ−核酸、Ｌ−核酸、Ｄ，Ｌ−核酸のいずれとして存在しても、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡであっても、一本鎖または二本鎖の核酸として存在し得る。本発明の核酸は通常、一次配列により定まる二次構造を示し、三次構造も形成し得る一本鎖の核酸である。しかし、本発明の核酸は、それが別々の２本の鎖であっても、好ましくは共有結合により互いに結合していても、互いに相補的または部分的に相補的な２本の鎖が互いにハイブリダイズしているという意味で二本鎖であり得る。
本発明の核酸は修飾されていてもよい。このような修飾は核酸の単一のヌクレオチドに関連するものであってよく、当該技術分野で公知である。このような修飾の例は、特にＶｅｎｋａｔｅｓａｎら（Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ，Ｋｉｍら，２００３）およびＫｕｓｓｅｒ（Ｋｕｓｓｅｒ，２０００）により記載されている。このような修飾は、核酸を構成する個々のヌクレオチドの２’位にあるＨ原子、Ｆ原子またはＯ−ＣＨ３基もしくはＮＨ２基であり得る。また、本発明による核酸は少なくとも１個のＬＮＡヌクレオチドを含み得る。一実施形態では、本発明による核酸はＬＮＡヌクレオチドからなる。
一実施形態では、本発明による核酸は多数の部分に分かれた核酸であり得る。本明細書で使用される多数の部分に分かれた核酸とは、少なくとも２本の分離した核酸鎖からなる核酸のことである。この少なくとも２本の核酸鎖は、標的分子に対するリガンドとなる機能単位を形成する。少なくとも２本の核酸鎖は、本発明の核酸分子を切断して２本の鎖を作成することにより、または本発明の核酸、すなわち核酸全体の第一の部分に対応する一方の核酸と、核酸全体の第二の部分に対応する他方の核酸とを合成することにより、本発明の任意の核酸から得られたものであり得る。切断と合成の両方を、上で例に挙げた２本以上の鎖が存在する多数の部分に分かれた核酸の作成に適用され得ることを認識するべきである。換言すれば、少なくとも２本の分離した核酸鎖は通常、互いに相補的でハイブリダイズする２本の鎖とは異なるものであるが、前記少なくとも２本の別々の核酸鎖の間にはある程度の相補性が存在し、それにより前記分離した鎖のハイブリダイゼーションが生じることがある。
最後に、本発明においては、本発明による核酸の完全に閉じた構造、すなわち環状構造が実現される。すなわち、一実施形態では、本発明による核酸は、好ましくは共有結合により閉じた状態となり、より好ましくはこのような共有結合は、本明細書に開示される核酸配列またはその任意の誘導体の５’末端と３’末端との間で形成される。
本発明による核酸が好ましいＫＤ値の範囲を示すという上の結果を裏付ける、実施例４に記載の表面プラズモン共鳴を使用して、本発明による核酸分子の結合定数を決定することが可能である。個々の核酸分子と標的（本発明の場合はヘプシジン）との間の結合の強度を表す適当な尺度の１つが、いわゆるＫＤ値と呼ばれるものであり、これ自体もそれを決定するための方法も当業者に公知である。
本発明による核酸が示すＫＤ値は１μＭ未満であることが好ましい。約１μＭのＫＤ値は、核酸と標的との非特異的な結合の特徴であると考えられている。当業者により認識されるように、本発明による核酸のような一群の化合物のＫＤ値は特定の範囲にある。上に挙げた約１μＭのＫＤはＫＤ値の上限として好ましいものである。標的と結合する核酸のＫＤの下限は最低で約１０ピコモル／Ｌであるか、またはそれ以上であり得る。本発明においては、ヘプシジンと結合する個々の核酸のＫＤ値がこの範囲にあるのが好ましい。この範囲にある第一の数値と、この範囲にある第二の数値をそれぞれ任意に選択することにより好適な範囲を定めることができる。好適な上限ＫＤ値は２５０ｎＭおよび１００ｎＭであり、好適な下限ＫＤ値は５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭおよび１０ｐＭである。より好適な上限ＫＤ値は２．５ｎＭ、より好適な下限ＫＤ値は４００ｐＭである。
本発明による核酸分子結合特性に加え、本発明による核酸分子は個々の標的分子（本発明の場合はヘプシジン）の機能を阻害する。ヘプシジンの機能（例えば、既に記載されているような個々の受容体の刺激）の阻害は、本発明による核酸分子とヘプシジンが結合して、本発明による核酸分子とヘプシジンとの複合体を形成することによりにもたらされる。このような核酸分子とヘプシジンとの複合体は、通常はヘプシジンにより刺激される受容体を刺激することができない。したがって、本発明による核酸分子による受容体機能の阻害はヘプシジンにより刺激可能な個々の受容体からは独立したものであり、本発明による核酸分子によってヘプシジンによる受容体の刺激を妨害することにより生じるものである。
治療スキームでの前記核酸の使用を可能にする、本発明による核酸が好ましい阻害定数を示すという上の結果を裏付けるものである、実施例５に記載されている方法を使用して、本発明による核酸分子の阻害定数を決定することが可能である。標的（本発明の場合はヘプシジン）とそれぞれの受容体との相互作用に対する個々の核酸分子の阻害作用の強度を表す適当な尺度の１つが、いわゆる半最大阻害濃度（ＩＣ５０と略記）であり、これ自体もそれを決定するための方法も当業者に公知である。
本発明による核酸分子が示すＩＣ５０値は１μＭ未満であることが好ましい。約１μＭのＩＣ５０値は、核酸分子による標的機能の非特異的阻害の特徴であると考えられている。当業者により認識されるように、本発明による核酸分子のような一群の化合物のＩＣ５０値は特定の範囲にある。上に挙げた約１μＭのＩＣ５０はＩＣ５０値の上限として好ましいものである。標的と結合する核酸分子のＩＣ５０の下限は最低で約１０ピコモル／Ｌであるか、またはそれ以上であり得る。本発明においては、ヘプシジンと結合する個々の核酸のＩＣ５０値がこの範囲にあるのが好ましい。この範囲にある第一の数値と、この範囲にある第二の数値をそれぞれ任意に選択することにより好適な範囲を定めることができる。好適な上限ＩＣ５０値は２５０ｎＭおよび１００ｎＭであり、好適な下限ＩＣ５０値は５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭおよび１０ｐＭである。より好適な上限ＩＣ５０値は５ｎＭであり、より好適な下限ＩＣ５０値は１ｎＭである。
本発明による核酸分子は標的分子と結合可能である限り、任意の長さであってよい。当業者は、本発明による核酸に好適な長さがあることを認識するであろう。長さは通常、１５〜１２０ヌクレオチドの間である。当業者は、本発明による核酸の長さとして１５〜１２０の間の任意の整数が可能であることを認識するであろう。本発明による核酸の長さとしてより好適な範囲は、約２０〜１００ヌクレオチド、約２０〜８０ヌクレオチド、約２０〜６０ヌクレオチド、約２０〜５０ヌクレオチドおよび約３０５０ヌクレオチドの長さである。
本発明においては、本明細書に開示される核酸は、好ましくは高分子量部分である、かつ／または好ましくは、特に動物体内、好ましくはヒト体内での滞留時間に関して核酸の特性の改変を可能にする部分を含む。このような修飾の特に好適な実施形態は、本発明による核酸のＰＥＧ化およびＨＥＳ化である。本明細書で使用されるＰＥＧはポリ（エチレングリコール）を、ＨＥＳはヒドロキシエチルデンプンを表す。本明細書で好ましく使用されるＰＥＧ化は本発明による核酸の修飾であって、本発明による核酸と結合したＰＥＧ部分からなる修飾である。本明細書で好ましく使用されるＨＥＳ化は本発明による核酸の修飾であって、本発明による核酸と結合したＨＥＳ部分からなる修飾である。直鎖ポリ（エチレン）グリコール、分岐ポリ（エチレン）グリコール、ヒドロキシエチルデンプン、ペプチド，タンパク質，多糖，ステロール，ポリオキシプロピレン，ポリオキシアミダート，ポリ（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−グルタミンおよびポリエチレングリコールなどの修飾、ならびにこのような修飾を用いた核酸の修飾工程は欧州特許出願ＥＰ １ ３０６ ３８２号に記載されており、上記出願の開示は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
高分子量部分からなる、またはこれを含む修飾の分子量は、約２，０００〜２５０，０００Ｄａ、好ましくは２０，０００〜２００，０００Ｄａであることが好ましい。このような高分子量部分がＰＥＧである場合、分子量は好ましくは２０，０００〜１２０，０００Ｄａ、より好ましくは４０，０００〜８０，０００Ｄａである。このような高分子量部分がＨＥＳである場合、分子量は好ましくは２０，０００〜２００，０００Ｄａ、より好ましくは４０，０００〜１５０，０００Ｄａである。ＨＥＳ修飾の工程は、例えば独国特許出願ＤＥ １ ２００４ ００６ ２４９．８号に記載されており、上記出願の開示は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明においては、ＰＥＧおよびＨＥＳをともに、特許出願ＷＯ２００５／０７４９９３号、ＷＯ２００３／０３５６６５号およびＥＰ１４９６０７６号に詳細に記載されているように直鎖型または分岐型で使用し得る。原則的に、このような修飾を本発明の核酸分子の任意の位置に施すことができる。好ましくは、このような修飾を本発明による核酸分子の５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチドおよび／または５’ヌクレオチドと３’ヌクレオチドの間の任意のヌクレオチドに施す。
修飾ならびに好ましくはＰＥＧおよび／またはＨＥＳ部分を直接的に、または好ましくはリンカーを介して間接的に本発明の核酸分子に結合させることができる。また本発明においては、本発明による核酸分子は１つ以上の修飾、好ましくは１つ以上のＰＥＧおよび／またはＨＥＳ部分を含む。一実施形態では、個々のリンカー分子は、２つ以上のＰＥＧ部分またはＨＥＳ部分を本発明による核酸分子と結合させる。本発明に関連して使用されるリンカーそれ自体は直鎖状であっても分岐状であってもよい。このようなリンカーは当業者に公知であり、特許出願ＷＯ２００５／０７４９９３号、ＷＯ２００３／０３５６６５号およびＥＰ１４９６０７６号に詳細に記載されている。
好適な実施形態では、リンカーは生分解性リンカーである。生分解性リンカーは、本発明による核酸の修飾を解除することにより、特に動物体内、好ましくはヒト体内での滞留時間に関して、本発明による核酸の特性の改変を可能にする。生分解性リンカーの使用は、本発明による核酸の滞留時間の制御を強化し得るものである。このような生分解性リンカーの好適な実施形態は、特に限定されないが、国際特許出願ＷＯ２００６／０５２７９０号、ＷＯ２００８／０３４１２２号、ＷＯ２００４／０９２１９１号およびＷＯ２００５／０９９７６８号に記載されている生分解性リンカーである。
一実施形態では、リンカーは、アミノ基１個とヘキサエチレングリコール（ＨＥＧと略記）部分２個とを次のような構造：アミノ−ＨＥＧ−ＨＥＧで含むリンカーである。好適な実施形態では、リンカーを本発明による核酸分子の５’末端または３’末端、より好ましくは本発明による核酸分子の５’末端にコンジュゲートして、次のような構造：５’−アミノ−ＨＥＧ−ＨＥＧ−本発明による核酸分子の５’末端ヌクレオチドを生じさせる。
本発明においては、修飾また修飾基は生分解性の修飾であり、この生分解性の修飾を直接的に、または好ましくはリンカーを介して間接的に本発明の核酸分子に結合させることができる。生分解性の修飾は、本発明による核酸の修飾を解除または分解することにより、特に動物体内、好ましくはヒト体内での滞留時間に関して、本発明による核酸の特性の改変を可能にする。生分解性の修飾の使用は、本発明による核酸の滞留時間の制御を強化し得るものである。このような生分解性の修飾の好適な実施形態は、特に限定されないが、国際特許出願ＷＯ２００２／０６５９６３号、ＷＯ２００３／０７０８２３号、ＷＯ２００４／１１３３９４号およびＷＯ２０００／４１６４７号、好ましくはＷＯ２０００／４１６４７号の１８ページ、４〜２４行目に記載されているように生分解性である。
上記修飾以外に、他の修飾を使用して本発明による核酸の特性を改変してもよく、このような他の修飾はタンパク質、コレステロールのような脂質、およびアミラーゼ、デキストランなどのような糖鎖の群から選択され得る。
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明による核酸を高分子量部分、例えばポリマー、より具体的には、好ましくは生理的に許容される、本明細書に開示される１種類または複数種のポリマーなどで修飾することにより、排泄動力学が変化するものと思われる。より具体的には、このように修飾された本発明の核酸の分子量が増加することにより、および本発明の核酸が特にＬ型の場合に代謝作用を受けないことにより、動物体内、好ましくは哺乳動物体内、より好ましくはヒト体内からの排泄が減少するものと思われる。排泄は通常、腎臓を介して行われるため、本発明者らは、このように修飾された核酸の糸球体ろ過速度が、このような高分子量の修飾を有さない核酸に比べて著しく減少する結果、動物体内での滞留時間が増加するものと推測する。このことに関連して、このような高分子量の修飾にもかかわらず、本発明による核酸の特異性が悪影響を受けないということは特に注目すべきことである。したがって、本発明による核酸は特に、通常は薬学的に活性な化合物に期待できない驚くべき特性を有するため、本発明による核酸の徐放をもたらすために、徐放をもたらす医薬製剤を必ずしも必要としない。むしろ、高分子量部分を含む修飾型の本発明による核酸は、その修飾により、既に徐放性製剤から放出された場合と同じように作用するため、それ自体が既に徐放性製剤として使用可能である。したがって、本明細書に開示されるような本発明による核酸分子の修飾（１つまたは複数）ならびにそれを含む修飾本発明による核酸分子および任意の組成物は、その明確な、好ましくは制御された薬物動態および生体内分布をもたらし得る。循環中での滞留時間および組織への分布もこれに含まれる。このような修飾は特許出願ＷＯ２００３／０３５６６５号に詳細に記載されている。
このように修飾された本発明による核酸分子、好ましくはＰＥＧまたはＨＥＳ−修飾核酸分子の腎排泄は、高分子量部分、好ましくはＰＥＧまたはＨＥＳ部分により非修飾核酸に比べて遅くなる。患者が腎機能障害に罹患していれば、その分腎排泄が遅くなる可能性が高くなる。
したがって、本発明による核酸が修飾、特にＰＥＧまたはＨＥＳのような高分子量の修飾を全く含まない場合も本発明に含まれる。
本発明では、本発明の基礎となる課題は、対象由来の体液中のヘプシジンレベルを低下させる方法により解決され、この方法は、
ａ）ヘプシジンと結合可能な核酸分子を準備することと、
ｂ）ヘプシジンと核酸分子との結合が可能な条件下で核酸分子と体液とを接触させて、ヘプシジンと核酸分子との複合体を形成させることと、
ｃ）体液から複合体を除去すること、または体液からヘプシジンを除去することと
を含む。
本発明の第一の好適な実施形態では、ヘプシジン結合核酸は担体に固定化されており、好ましくは担体にヘプシジン結合核酸が固定化されている。前記担体はｅｘ ｖｉｖｏで、例えば医療装置内、好ましくはアフェレーシス用の医療装置内に存在する。このような医療装置内で、ヘプシジンを含む体液が担体と接触して、ヘプシジンとヘプシジン結合核酸との複合体を形成する。固定化されたヘプシジン結合核酸により、ヘプシジンを体液から除去することができる。
本発明の第二の好適な実施形態では、ヘプシジン結合核酸は、親和性による固定化によって、例えば、修飾と結合しさらに担体と結合するリガンドによって、修飾ヘプシジン結合核酸の固定化を可能にする修飾を含む。担体に固定化されたこのような修飾ヘプシジン結合核酸とリガンドを使用することにより、このような修飾ヘプシジン結合核酸をｉｎ ｖｉｖｏで（体液中で）使用することが可能となる。体液中では、修飾ヘプシジン結合核酸がヘプシジンと結合し、ｉｎ ｖｉｖｏでその機能を阻害する。ヘプシジンと修飾ヘプシジン結合核酸との複合体は、担体に結合したリガンドによる修飾の親和性による固定化によって、体内から除去される。前記担体はｅｘ ｖｉｖｏで、例えば医療装置内、好ましくはアフェレーシス用の医療装置内に存在する。
本発明の第三の好適な実施形態では、体液が半透膜と接触し、体液が膜の片側に、透析液が前記膜の反対側にあり、ヘプシジンおよび／またはヘプシジンとヘプシジン結合核酸との複合体が半透膜を介して体液から透析液に拡散する。この場合、ヘプシジン結合核酸は修飾されていない。このような方法を用いることにより、ヘプシジン結合核酸をｉｎ ｖｉｖｏで（体液中で）使用することが可能となる。体液中では、ヘプシジン結合核酸がヘプシジンと結合し、ｉｎ ｖｉｖｏでその機能を阻害する。ヘプシジンとヘプシジン結合核酸との複合体は体内から除去される。前記担体はｅｘ ｖｉｖｏで、例えば医療装置内、好ましくは透析用の医療装置内に存在する。
本発明の第四の好適な実施形態では、体液が半透膜と接触し、体液が膜の片側に、透析液が前記膜の反対側にある。この場合、ヘプシジン結合核酸は修飾されており、修飾は好ましくは高分子量の修飾である。高分子量の修飾の大きさにより、このような修飾ヘプシジン結合核酸は半透膜を透過することができない。したがって、修飾ヘプシジン結合核酸は透析液中に存在し、ヘプシジンは半透膜を透過して、透析液中の修飾ヘプシジン結合核酸と結合する。これによりヘプシジンとヘプシジン結合核酸との複合体が体内から除去される。前記担体はｅｘ ｖｉｖｏで、例えば医療装置内、好ましくは透析用の医療装置内に存在する。
アフェレーシスという用語は、血液を対象から取り出して装置の中を通過させ、特定の成分を取り除いて残りの成分を対象に戻す処置を指す。当業者に公知のように、アフェレーシスは、生体分子と固定化されたそのリガンドとの相互作用、例えば抗体抗原相互作用により、疾患の原因となる生体分子を除去するために使用されている。すなわち、リガンドが吸着カラムに固定化されており、アフェレーシス装置を用いて取り出された血液がそのカラムを循環する。血液中に存在する疾患の原因となる生体分子は固定化されたリガンドと特異的に結合して保持され、血液の残りは対象に戻される。
疾患のｅｘ ｖｉｖｏ治療のためのこのような方法および装置については、Ｔｅｒｍａｎら（米国特許第４，２１５，６８８号）が記載している。対象から血液を取り出し、その血液から血漿を分離して、免疫吸着物質が固定化されたビーズの入ったシリンダ内を通過させる。処置済みの血漿を血液と再び一緒にして対象に戻す。同様に米国特許第４，６８５，９００号には、スペーサー部分を介して担体上にグラフトされそこから伸びている生体特異的ポリマーの入ったチャンバ内を体液が通過するシステムが記載されている。生体特異的ポリマー、例えばヒドロゲルが特定の病的エフェクターと化学的に結合して、体液からその病的エフェクターを除去する。処置終了時に体液を対象に戻す。アフェレーシス処置の固定化リガンドとして使用される部分の例には、抗体および抗原（国際公開第０５１０７８０２号および米国特許第４，３７５，４１４号を参照されたい）、微生物リガンド（米国特許第４，６１４，５１３号）、生体分子特異的ポリマー、例えばヒドロゲル（上を参照されたい）および分子インプリント材料（国際公開第０６０１７７６３号を参照されたい）がある。
本発明の第一および第二の好適な実施形態は、例えばアフェレーシスでの使用で知られている、固体担体に固定化されたヘプシジン結合核酸を準備するものである。この実施形態は特に、例えば固体担体に結合させると驚くほど安定で、かつその機能性を保持するヘプシジン結合核酸を準備するものである。機能性は、ヘプシジン結合核酸が明確な二次元および／または三次元構造を形成し、高い親和性と特異性で標的分子のヘプシジンと結合することができることを意味する。アフェレーシス装置を用いて、血液を対象から取り出し、ヘプシジン結合核酸が固定化されている担体の入ったカラム内を循環させる。処置済みの血液を対象に戻す。血漿を血液から分離して、ヘプシジン結合核酸が固定化されている固体担体の入ったカラム内を循環させるのが好ましい。処置済みの血漿を血液と再び一緒にして対象に戻す。血液からフィブリノーゲン、凝固因子および細胞を取り除いて血清を得るとさらに好ましい。血清は、ヘプシジン結合核酸が固定化されている固体担体の入ったカラムを循環する。血清を血液と再び一緒にして対象に戻す。
このような方法には利点がいくつかある。第一に、この方法は特異性が高い。疾患の原因となる生体分子、特にヘプシジンが標的となる。第二に、アフェレーシスの方法は試験室で日常的な手順で実施されるため、この方法は便利である。
透析処置時に、血液が半透膜の片側を流れ、透析液または特殊な透析液が膜の反対側を流れる。当該技術分野で公知のように、半透膜は、溶質および小分子だけを通過させ、大型分子および細胞は通さない様々な大きさの細孔を有する薄い材料からなる。適切な透析液は当業者に公知である。透析法の原理は、溶質が半透膜を通過して拡散することにある。透析装置は腎不全が認められる対象で使用される。通常は健常な腎臓により排泄される老廃物および水が透析装置により除去される。透析の形式としては、血液透析、腹膜透析とそれに関連する処置、血液ろ過および血液透析ろ過が挙げられる。
血液透析は、外部の透析器と呼ばれる半透膜を備えたフィルタにより血液を体外で循環させることよって、溶質および水を除去するものである。血流は一方向に流れ、透析液はそれと反対方向に流れる。血液と透析液の向流により血液と透析液との間の溶質の濃度勾配が最大になることで、血液から溶質が除去されやすくなる。血液中の溶質の濃度は望ましくない高さであるが、透析液では溶質の濃度が低いか、または溶質が存在せず、また透析液が常に入れ替わることにより、膜の透析液側での望ましくない溶質の濃度が低く維持される。透析液のカリウムやカルシウムのようなミネラルのレベルは、健常血液での普通の濃度とほぼ同じである。透析器膜間の静水圧を増加させることにより限外ろ過が生じる。これは通常、透析器の透析液区画に負圧を加えることにより行われる。この圧力勾配により水および溶解した溶質が血液から透析液に移動し、典型的な３〜５時間の処置の間に数リットルの余分な液を除去することが可能となる。
血液ろ過は血液透析とほぼ同じ処置であるが、異なる原理を利用したものである。血液は、透析と同様に透析器または「血液ろ過器」によりくみ出されるが、透析液は使用しない。圧力勾配を付与することで、水が、溶解した物質を多数「引きずり」ながら透過性の高い膜を速く通過する。ここで重要なのは、血液透析では除去されにくい分子量の大きな物質が一緒に引きずられるということである。この過程で失われる塩類および水は、処置時に体外の回路に注入される「置換液」で置換される。
血液透析ろ過は、１つの過程で血液透析と血液ろ過を組み合わせる複数の方法を述べるために使用される用語である。高流量透析器の血液区画を通って血液をくみ出し、高速の限外ろ過を使用するため、血液から透析液へ水および溶質が高速で移動することになり、置換液を血液回路に直接注入してこれを置換しなければならない。しかし、透析液も透析器の透析液区画を流れる。この組合せは、大分子量の溶質も小分子量の溶質も十分除去されるため理論的に有用である。
本発明の第三の実施形態では、透析の前にヘプシジン結合核酸を対象に投与し、ヘプシジンの活性を阻止する。高分子量部分で修飾されていないヘプシジン結合核酸の場合、透析処置時にヘプシジンとヘプシジン結合核酸との複合体が、当業者に公知のように、適当な半透膜をその分子の濃度の高い領域から低い領域に横断する。最終的には、対象の血液中のヘプシジン濃度が低下する結果となる。高分子量部分で修飾されたヘプシジン結合核酸では、非修飾ヘプシジン結合核酸の透析膜通過を促進するために、透析処置の前または透析処置中に高分子量部分を除去しなければならない。高分子量部分の除去は、ヘプシジン結合核酸のヌクレオチドと高分子量部分との間の切断可能なリンカーにより、または高分子量部分が結合している末端でのヘプシジン結合核酸の切断により行うことができる。このような切断は、核酸分子に特異的な核酸酵素、好ましくはＲＮＡまたはＤＮＡ酵素により可能である。
本発明の第四の実施形態では、適切な透析液（例えば、透析法で使用する透析液）は、高分子量部分で修飾されたヘプシジン結合核酸を追加で含有し、好ましくは高分子量部分は、ＰＥＧおよびＨＥＳの群から選択される。ヘプシジンが半透膜を通って透析液に拡散する際に、ヘプシジン結合核酸と複合体を形成する。この複合体は大きすぎるため、膜を通って戻ってくることができない。その結果、透析処置の間にヘプシジンレベルが徐々に低下する。
固定化という用語は、担体に化合物、好ましくはヘプシジン結合核酸を結合させることを意味する。
ヘプシジン結合核酸をヘプシジン結合核酸の３’末端または５’末端を介して担体に結合させる、または固定化する。ヘプシジン結合核酸を直接的に、またはリガンドを用いて間接的に固定化する。本発明によるヘプシジンと結合するヘプシジン結合核酸の担体への固定化は、各種固定化に関連する必要に応じて、共有結合、非共有結合、水素結合、ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ相互作用、クーロン力の相互作用および／または疎水性相互作用、配位結合ならびにその組合せを含む群からから選択され得る。
本発明の一実施形態では、ヘプシジン結合核酸が固定化される担体は固相、マトリックスまたは固体担体である。
コンジュゲーションという用語はヘプシジン結合核酸と担体との間の共有結合を意味する。
固定化されたヘプシジン結合核酸の好適な実施形態では、有機高分子および無機高分子を含む群から選択される固相、マトリックスまたは固体担体は材料を含む。
また、固体または多孔質材料であり得る固相は特に、核酸の結合または固定化のためのマトリックスとして適している。このようなマトリックスは、例えば記載されている 「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｐ．Ｄ．Ｇ．Ｄｅａｎ，Ｗ．Ｓ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｆ．Ａ．Ｍｉｄｄｌｅ（編）， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）に記載されており、アガロース、多孔質微粒子粘土（酸化アルミニウム）、セルロース、デキストラン（高分子グルコースポリマー）、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ（商標）（Ｒｏｈｍ Ｐｈａｒｍａ（「ｏ」にウムラウト有り）社、オキシラン誘導体化アクリルビーズ；メタクリルアミド、メチレン−ビス−アクリルアミド、メタクリル酸グリシジルおよび／またはアリル−グリシジルエーテルのコポリマー）、ガラス、ガラス表面が通常、シラン含有化合物により誘導体化されている多孔質ガラス（ＣＰＧと略記）、メタクリル酸ヒドロキシアルキル、ポリアクリルアミド、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）（例えばＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製のデキストラン系ゲル、）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（架橋アガロース、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）（各種リンカー／スペーサーおよび各種官能基、例えばＮＨＳエステル基、ＣＮＢｒ活性化基、アミノ基、カルボキシ基、活性化チオール基、エポキシ基などを有するＳｅｐｈａｒｏｓｅが入手可能である（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｓｗｅｄｅｎ １９９３を参照されたい））、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（球状のアリル−デキストランとＮ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミド）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（球状の架橋アガロースとデキストラン、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）、トリスアクリル、常磁性粒子、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）（ＴｏｓｏＨａａｓ社製、半硬質、マクロ多孔質の球状マトリックス）、ナイロン系マトリックス、ｔｅｎｔａｇｅｌ（Ｒａｐｐ ｐｏｌｙｍｅｒｓ社製）、ポリエチレングリコールまたはポリオキシエチレンで修飾された低架橋ポリスチレンマトリックスからなり、ポリエチレングリコールまたはポリオキシエチレン単位が各種官能基を保持するコポリマー、ポリスチレンがある。
その他のマトリックスには、例えばシリカゲル、アルモシリケート、ベントナイト、多孔質セラミックス、各種酸化金属、ヒドロキシアパタイト、フィブロイン（天然絹糸）、アルギン酸塩、カラギーン、コラーゲンおよびポリビニルアルコールがある。
ほかにも、官能化または誘導体化された膜または表面をマトリックスとして用いることもできる。
適当な官能基を用いてマトリックスを誘導体化することにより、既に予め活性化されたマトリックスまたは適当な物質を添加して活性化する必要のあるマトリックスが得られる。マトリックス誘導体化するために使用し得る不活性官能基の例には、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、リン酸基、ヒドロキシ基などがある。マトリックスの誘導体化の活性化の例には、官能基、例えばヒドラジド、アジド、アルデヒド、ブロモアセチル、１，１’−カルボニルジイミダゾール、臭化シアン、エピクロロヒドリン、エポキシド（オキシラン）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをはじめとするあらゆる可能な活性エステル、過ヨウ素酸、ピリジルジスルフィドをはじめとする混合ジスルフィド、トシルクロリド、トレシルクロリド、ビニルスルホニル、ベンジルハロゲン化物、イソシアナート、光反応性基などの基がある。
血漿および好ましくは全血も通過させ得るマトリックスはすべて、アフェレーシスに特に適したものであり、このようなものとして、例えばメタクリル酸に基づく有機高分子、例えば架橋糖構造に基づく天然ポリマーまたは例えばガラス構造（ＣＰＧ、多孔質ガラス）に基づく無機高分子などがある。プラズマフェレーシスまたはアフェレーシスに適する、リガンド、すなわち核酸、好ましくは機能性核酸で修飾された固相をガラス、プラスチックまたは金属製の筐体に充填して、アフェレーシス装置を形成する。
固定化は好ましくは、化学的固定化、親和性による固定化または磁性による固定化であり得る。
特に好ましい形態の固定化は、以下に挙げる相互作用に基づく化学的固定化であり、このような相互作用をもたらす一方の要素はヘプシジン結合核酸であり、このような相互作用をもたらす他方の要素は担体に固定化されている。特に限定されるものではないが、実施方法が当業者に公知であるものの例を以下に挙げる：
アミンと活性化カルボン酸、
アミンと活性化カルバミン酸エステル、
アミンとイソシアナート／イソチオシアナート、
アミンとハロゲン化物、
アミンとマレイミド部分、
アミンとアルデヒド／ケトン、
ヒドロキシルアミンまたはヒドラジドとケトン／アルデヒド、
ヒドラジン誘導体と活性化カルボン酸、
ヒドラジンとイソシアナート／イソチオシアナート、
ヒドラジンとハロゲン化物、
ヒドラジンとマレイミド部分、
ヒドラジンとアルデヒド／ケトン：
ヒドラジンとアルデヒド／ケトン、次いで還元的アミノ化
チオールとハロゲン化物、
チオールとマレイミド、
チオールと活性化チオール、
チオールとビニルスルホンなどのＭｉｃｈａｅｌ付加反応、
アジドとアルキンとＣｕ塩などの「クリックケミストリー」相互作用パートナー（Ｋｏｌｂら，２００１）、
アルキルまたはアリールＰ（ＩＩＩ）部分を用いたＳｔａｕｄｉｎｇｅｒ反応によるアジドと活性化カルボン酸、
求電子性トラップに付着したアジドと三価ホスフィン（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション）、
アジドとホスフィノチオールエステル―無痕跡型Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション、
イミンを形成し、次いで対応するアミンに任意に還元され得るアジドとアルデヒド／ケトン＋ＰＰｈ３（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ）、
アミンとカルボキシル基―
カルボン酸官能基とアミン、ヒドラジンのようなアミノ官能基、
Ｃｉｓ−ジオール（例えば、ＲＮＡ分子の３’末端上に存在するもの）がジ−アルデヒドに酸化され、次いで、例えばホウ水素化物による還元後に、例えばアミンまたはヒドラジン誘導体を有する環状アミンを形成、
チオエステルとシステイン―天然のライゲーションおよび誘導体、
ホスホチオアートとα−ハロカルボニル含有コンジュゲート、
例えばリン酸活性化によりリン酸とアミンからホスホルアミダート、
例えば活性化によりリン酸とアルコールからホスホジエステル、
アルデヒドから第二級アミンの形成（ホウ水素化物による還元後）、ヒドラジノ基からヒドラゾンの形成、セミカルバジドからセミカルバゾンの形成、
システイン誘導体とチオエステルペプチド
エポキシドとアミン
Ｄｉｅｌｓ Ａｌｄｅｒ反応などのペリ環化反応を生じるアルケン／アルキンとジエン／ジイン
アルデヒドとヒドロキシルアミンとの反応によるオキシム形成、
ヒドロキシまたはアミノとエポキシド。
上記反応またはその少なくとも一部は、特にＨｅｒｍａｎｓｏｎ（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，２００８）により記載されている。
特に好ましい形態の固定化は、以下に挙げる相互作用に基づく親和性による固定化であり、このような相互作用をもたらす要素の一方は、好ましくは修飾を含むヘプシジン結合核酸であり、このような相互作用をもたらす他方の要素は担体に固定化されているリガンドであり、リガンドはヘプシジン結合核酸またはこれに結合している修飾と結合する：ビオチン−アビジン相互作用、ビオチン−ニュートラアビジン相互作用、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用、抗体と抗原またはハプテンとの相互作用、核酸分子がＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡまたはその組合せからなる、２つのオリゴヌクレオチド間の相互作用、カルモジュリンとカルモジュリン結合ペプチドの相互作用、アルブミンとシブラコンブルー（Ｃｉｂｒａｃｏｎ Ｂｌｕｅ）の相互作用、金属キレート剤と金属キレート化担体の相互作用。
本発明による核酸および／または本発明によるアンタゴニストを薬剤、医薬組成物または医療装置の作成または製造に使用してもよい。さらに、本発明による核酸は本発明の核酸分子でもあり、これを本明細書に開示される任意の各方法で、特に対象由来の体液中のヘプシジンレベルを低下させる任意の方法で、対象の体液からヘプシジンを除去する任意の方法で、および／または貧血患者を治療する任意の方法で、それぞれ特に本明細書に開示される通りに使用することができる。
本発明によるこのような薬剤または医薬組成物は、少なくとも１つの本発明の核酸を、任意に少なくとも１つの追加の薬学的に活性な化合物とともに含有し、好ましくは本発明の核酸は、それ自体が薬学的に活性な化合物として作用する。好適な実施形態では、このような薬剤または医薬組成物は少なくとも１つの薬学的に許容される単体を含む。このような担体は、例えば水、緩衝液、ＰＢＳ、グルコース溶液、好ましくは５％グルコース平衡塩類溶液、デンプン、糖、ゼラチンまたは他の許容される担体物質であってよい。このような担体は一般に当業者に公知である。当業者は、本発明の薬剤のまたはこれに関連する任意の実施形態、使用および態様も本発明の医薬組成物に適用可能であり、その逆も同様であるということを認識するであろう。
本発明によるヘプシジン結合核酸を使用することができる医療装置は、透析用の医療装置、血液透析用の医療装置、血液ろ過用の医療装置、血液透析ろ過用の医療装置、アフェレーシス用の医療装置および吸着装置の群から選択されるが、これらに限定されない。
アフェレーシス装置の個々の構成要素は当業者に公知である。市販のアフェレーシスシステムの例には、カネカ社のｌｉｐｏｓｏｒｂｅｒシステム、血液吸着機器４００８ＡＤＳを備えたＦｒｅｓｅｎｉｕｓ社（Ｂａｄ Ｈｏｍｂｕｒｇ）のＤＡＬＩシステム（脂質を直接吸着する）、Ｂ．Ｂｒａｕｎ社（Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ）のＨ．Ｅ．Ｌ．Ｐシステム（ヘパリンにより体外でＬＤＬを沈降させる）、ＰｌａｓｍａＳｅｌｅｃｔ社（Ｔｅｔｅｒｏｗ）のＩｇ−Ｔｈｅｒａｓｏｒｂシステム、Ｒｈｅｏｓｏｒｂシステムがある。透析装置の各種構成要素は当業者に公知である。適当な透析液は当業者に公知である。本発明の実施に適用可能な適切な細孔径を有する適当な膜も当該技術分野で公知である。それぞれ本発明によるまたは本発明に従って調製される核酸、医薬組成物、薬剤および医療装置を使用するまたは使用することを意図する治療および／または予防の対象となる適応症、疾患および障害は、個々の発症機序へのヘプシジンの直接的または間接的な関与に起因するものである。
導入部分で述べたように、ヘプシジンは鉄のホメオスタシスを調節する重要なシグナルであるが、ヘプシジン欠損およびヘプシジン過剰発現のマウスモデルで示されているように、ヒトヘプシジンのレベルが高いと血清鉄レベルが低下し、ヒトヘプシジンのレベルが低いと血清鉄レベルが増加する（Ｎｉｃｏｌａｓ，２００１；Ｎｉｃｏｌａｓ，２００２ａ；Ｎｉｃｏｌａｓ，２００２ｂ Ｎｉｃｏｌａｓ，２００３）。
また本明細書でも述べたように、ヘプシジンがフェロポーチンと結合すると直ちにフェロポーチンが内部移行し、次いで血清鉄の減少が長時間継続（Ｒｉｖｅｒａ，２００５）し、この血清鉄の減少が貧血を引き起こす。貧血は循環血液中のヘモグロビンの絶対量が減少することと定義され、低ヘモグロビンにより発症する疾患の一症状であることが多く、それ自体が単独で診断されることはない。貧血は赤血球の産生および／または寿命が減少する医学的状態により生じる。さらに貧血は、失血による生じることもある。
したがって、貧血の発現を理解するために、基礎となる機序に基づいて、貧血を病因学的に３種類に分類すると以下のようになる：
ａ）赤血球産生の減少
ｂ）赤血球破壊の増加
ｃ）失血。
しかし、この３つの種類、すなわち赤血球産生の減少、赤血球破壊の増加および失血は厳密に相互に区別されるものではなく、同時にみられることもあれば、互いに独立してみられることもある。
多くの疾患では、前記機序の組合せにより貧血を生じ得る。したがって、ヘプシジンの無効化が多くの貧血状態に有用であり得る。
本発明によるヘプシジン結合核酸はヒトヘプシジンと相互作用するか、またはこれと結合するため、当業者は、本発明によるヘプシジン結合核酸が本明細書に記載されているヒトおよび動物の任意の疾患の治療、予防および／または診断に使用され得ることを理解するであろう。これに関連して、本発明による核酸分子が本明細書に記載されている任意の疾患、障害または状態の治療および予防に使用され得ることを認識するべきである。
いかなる理論にも拘束されることを望むわけではないが、本発明による核酸分子を各種の疾患、障害および状態に関連して使用する理論的根拠を以下に記載することにより、本発明による核酸分子の特許請求される治療的、予防的および診断的適用性が妥当であることを示す。不必要な繰返しを避けるために、当業者に公知のように、また本明細書にも概説されているように、ヘプシジン−フェロポーチン相互作用が関与することから、特許請求される治療および／または予防効果を得るために、本発明による核酸分子で前記相互作用に対処し得ることを認識するべきである。
したがって、本発明による薬剤を使用し得る治療および／または予防の対象となる疾患および／または障害および／または疾患状態としては、特に限定されないが、貧血、低鉄血症、異食症、ヘプシジンレベルが上昇した状態が挙げられる。
好ましくは貧血は、鉄芽球性貧血、低色素性小球性貧血、慢性の疾患および／または障害に起因する貧血、炎症に起因する貧血、遺伝性障害に起因する貧血、急性感染症に起因する貧血、ならびに／あるいは鉄の代謝および／またはホメオスタシスの遺伝子変異に起因する貧血の群から選択される。
貧血の原因となり得る各種の慢性疾患および／または障害は、慢性炎症、癌、自己免疫疾患および／または自己免疫障害、慢性感染症、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症および肝硬変の群から選択される。この限りにおいて、本発明の核酸により治療し得る貧血は、前記各種の慢性疾患および／または障害のいずれか１つに起因するか、またはこれに関連する貧血である。さらに、貧血は癌治療、好ましくは化学療法に起因するものであり得る。
慢性炎症のサブグループには慢性腎疾患、慢性閉塞性肺疾患、多発性硬化症、変形性関節症、糖尿病、肥満症、脳血管疾患、うっ血性心疾患、うっ血性心不全、心筋梗塞、冠動脈疾患、末梢閉塞性動脈疾患、膵炎、血管炎があり、慢性腎疾患には腎疾患、慢性腎不全（ｃｈｒｏｎｉｃ ｒｅｎａｌ ｆａｉｌｕｒｅ、ｃｈｒｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｆａｉｌｕｒｅ）および／または腎透析もしくは腎移植に起因する腎疾患が含まれる。
癌のサブグループには肝細胞癌、リンパ腫、多発性骨髄腫、頭頸部癌、乳癌、結腸直腸癌、非骨髄癌、腎細胞癌、非小細胞肺癌、腫瘍および脳腫瘍がある。
自己免疫疾患および／または自己免疫障害のサブグループには関節リウマチ、過敏性腸症候群、全身性エリテマトーデスおよびクローン病がある。
慢性感染症のサブグループにはウイルス感染症、ウイルス性疾患、細菌感染および真菌感染症があり、ウイルス感染症には、特に限定されないが、肝炎およびＨＩＶ感染症が含まれ、細菌感染には、特に限定されないが、ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）感染症が含まれる。
炎症に起因する貧血は網状赤血球産生指数が低いことを特徴とする正球性または小球性の貧血であり、総鉄結合能（ＴＩＢＣ）が低いか、または正常である。炎症に起因する貧血の場合は、ヘプシジン、急性期タンパク質をはじめとする炎症マーカー（例えば、Ｃ反応性タンパク質）が増加する。炎症に起因する貧血は、炎症による貧血とも呼ばれる。
貧血の原因となり得る各種遺伝性障害はキャッスルマン病、シュニッツラー症候群、鉄不応性鉄欠乏性貧血（マトリプターゼ−２（ＴＭＰＲＳＳ６）変異）、無トランスフェリン血症、先天性赤血球生成障害性貧血および異常ヘモグロビン症の群から選択される。
貧血の原因となり得る各種急性感染症はウイルス感染症、細菌感染症および真菌感染症の群から選択され、ウイルス感染症、細菌感染症および真菌感染症は個々に、または互いに組み合わさって、敗血症を引き起こし得る。
「ヘプシジンレベルが上昇した状態」という用語は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、このような哺乳動物の正常なヘプシジンレベルに比べて体内のヘプシジンレベルが上昇している状態、例えば、その哺乳動物の正常な血清ヘプシジンレベルに比べて血清ヘプシジンが上昇している状態などを指す。正常な血清ヘプシジンレベルは、ヒトの場合で約５４ｎｇ／ｍＬである（ＤＲＧ Ｄｉａｇｏｎｓｔｉｃｓ社（Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が市販するヘプシジンの酵素結合免疫測定の使用者マニュアルを参照されたい）。血清ヘプシジンレベルの上昇は、特に酵素結合免疫測定法（ＤＲＧ Ｄｉａｇｏｎｓｔｉｃｓ社（Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の市販キット）により決定することが可能である。
したがって、本発明による薬剤を使用し得る好適な患者としては、特に限定されないが、エリスロポエチン療法をはじめとする赤血球を刺激する治療法を受けており、好ましくはエリスロポエチンに対して低応答性を示す患者が挙げられ、より好ましくは、その患者は慢性腎疾患を有するか、または癌に罹患しており、癌は肝細胞癌、リンパ腫、多発性骨髄腫、頭頸部癌、乳癌、結腸直腸癌、非骨髄癌、腎細胞癌、非小細胞肺癌、腫瘍および脳腫瘍の群から選択されるものである。
さらなる実施形態では、本発明による薬剤は、追加の薬学的に活性な化合物を含む。このような追加の薬学的に活性な化合物は、ヘプシジンまたはフェロポーチンの活性、濃度または発現を調節し得るものであることが好ましい。好ましくは、このような化合物はプロヘプシジン切断プロテアーゼ阻害剤、プロヘプシジン抗体、例えばフェロポーチン抗体のようなフェロポーチンアンタゴニスト、ＪＡＫ２阻害剤、ＧＤＦ１５、ＢＭＰモジュレーター、可溶性ヘモジュベリンまたはＴＧＦ−β阻害物質である。
本発明による核酸を含む薬剤とともに、またはこれに含ませて使用し得る他の追加の薬学的に活性な化合物は、貧血および／または炎症性状態の治療で知られている化合物ならびに／あるいはこれに使用される化合物であり、ここでは、炎症性状態の治療は貧血に良い影響を及ぼす。このような薬学的に活性な化合物は、鉄補給剤、ビタミン補給剤、赤血球産生刺激剤、抗生物質、抗炎症性生物製剤、免疫系抑制剤、抗血栓溶解剤、スタチン、 昇圧剤および変力性化合物を含む群から選択される。
鉄補給剤の非限定的な例には硫酸第一鉄、グルコン酸第一鉄、鉄デキストラン、グルコン酸第二鉄ナトリウム、カルボキシマルトース第二鉄、水酸化鉄・ポリマルトース、フマル酸鉄、ショ糖・鉄および水酸化鉄・スクロースがある。
ビタミン補給剤の非限定的な例にはビタミンＣ、葉酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ６およびビタミンＤがある。
赤血球産生刺激剤の非限定的な例にはエリスロポエチン、エポエチン、ダルベポエチン、ＣＥＲＡ、ＨＩＦプロリル−ヒドロキシラーゼ阻害剤（例えば、ＦＧ−２２１６およびＦＧ−４５９２）をはじめとする赤血球生成刺激剤がある。
抗生物質の非限定的な例にはアミノグリコシド、β−ラクタム抗生物質、ペプチド抗生物質、グリアーゼ（ｇｒｙａｓｅ）阻害剤、リンコサミド、マクロライド抗生物質、ニトロイミダゾール誘導体、ポリペプチド抗生物質、スルホンアミド、テトラサイクリンおよびトリメトプリムがある。
抗炎症性生物製剤の非限定的な例には、
ａ）ＩＬ−６−受容体アンタゴニスト、例えばトシリズマブまたはアトリズマブなど、
ｂ）ＴＮＦ−アンタゴニスト、例えばエタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブなど、
ｃ）ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、例えばアナキンラなど、
ｄ）ＣＤ２０結合分子、例えばリツキシマブおよびイブリツマブなど
がある。
免疫系抑制剤の非限定的な例にはアザチオプリン、ブレキナル、カルシニューリン阻害剤、クロラムブシル、シクロスポリンＡ、デオキシスペルグアリン、レフルノミド、メトトレキサート、ミゾリビン、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン、タクロリムスおよびサリドマイドがある。
抗炎症剤の非限定的な例には、ロフルミラストのようなＰＤＥ４阻害剤、ならびに副腎皮質ステロイド剤、例えばプレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、トリアムシノロン、ベタメタゾン、発泡剤（ｅｆｆｅｒｖｅｓｃｅｎｔ）、ブデソニド、シクレソニドおよびフルチカゾンなどがある。
抗血栓溶解剤の非限定的な例には、ドロトレコギンαのような活性化ヒトタンパク質Ｃがある。
スタチンの非限定的な例にはアトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンがある。
昇圧剤および変力性化合物の非限定的な例にはノルアドレナリン、バソプレッシンおよびドブタミンがある。
さらなる実施形態では、本発明による薬剤は、好ましくは鉄と結合して、これを哺乳動物の身体、特にヒトの身体の組織または循環中から除去することができる化合物である、追加の薬学的に活性な化合物を含む。このような薬学的に活性な化合物は、好ましくは鉄キレート化合物の群から選択される。このような化合物と本発明による核酸分子とを組み合わせることで、生理的ヘプシジン濃度がさらに減少して、細胞の鉄負荷量が減少する。
鉄キレート化合物の非限定的な例にはクルクミン、デフェロキサミン、デフェラシロクスおよびデフェリプロンがある。
最後に、追加の薬学的に活性な物質は鉄代謝および／または鉄ホメオスタシスのモジュレーターであってもよい。あるいはまたは加えて、このような追加の薬学的に活性な物質は追加の、好ましくは２種目の本発明による核酸である。あるいは、この薬剤は、ヘプシジンとは異なる標的分子と結合するかまたは本発明による核酸の１つとは異なる機能を示す、少なくとも１つ以上の核酸を含む。好ましくは、このような少なくとも１つ以上の核酸は、１つまたは複数の本明細書に開示される追加の薬学的に活性な化合物のうちの１つとほぼ同じまたは全く同じ機能を示す。
本発明においては、本発明による核酸を含む薬剤は、本明細書では本発明による薬剤とも呼ばれ、原則的に、前記疾患の治療での薬剤の使用に関連して開示される任意の疾患の予防に代替または追加として使用される。したがって、個々の疾患に対する個々のマーカーは当業者に公知である。好ましくは、個々のマーカーはヘプシジンである。
本発明の薬剤の一実施形態では、このような薬剤は、本明細書に開示される任意の疾患、特に本発明の薬剤が使用されるべき疾患の他の治療法と併用するためのものである。
本明細書で好ましく使用される「併用療法」または「共同療法」は、本発明の薬剤と少なくとも第二の薬剤の投与を、上記治療剤、すなわち本発明の薬剤と前記第二の薬剤の協同作用から有益な効果を得ることが意図される治療計画の一部として包含する。併用での上記治療剤の投与は通常、定められた期間（通常は、選択される組合せに応じて、分、時間、日または週単位）にわたって行われる。
しかし、「併用療法」は一般に、偶発的におよび無作為に本発明の併用となる別個の単独療法計画の一部として、２種類以上の治療剤を投与することを包含ものではない。「併用療法」は、上記治療剤を逐次的に投与すること、すなわち各治療剤を異なる時間に投与すること、および上記治療剤またはそのうちの少なくとも２種類を実質的に同時に投与することを包含するものとする。実質的な同時投与は、例えば、一定比率の各治療剤を含む単一カプセルを１個、または各治療剤の単一カプセルを複数個対象に投与することにより行うことができる。
治療剤逐次投与または実質的な同時投与は、特に限定されないが、局所経路、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路および粘膜組織からの直接吸収を含めた任意の適当な経路で行うことができる。治療剤を同じ経路で投与しても異なる経路で投与しても追い。例えば、特定の組合せの治療的に有効な薬剤のうち、第一の治療剤を注射により投与し、他の治療剤を局所的に投与してもよい。
あるいは、例えば、全治療剤を局所的に投与してもよく、また全治療剤を注射により投与してもよい。治療剤を投手する順序は、別途明記されない限り重要ではない。併用療法が非薬物治療をさらに含む場合、治療剤の併用と非薬物治療の組合せから有益な効果が得られる限り、非薬物治療を任意の適当な時間に行ってよい。例えば、適当な場合を挙げれば、非薬物治療を数日間、場合によっては数週間、一時的に中止したまま治療剤を投与しても、有益な効果が得られる。
上記の一般用語で概説したように、本発明による薬剤は原則的に、当業者に公知の任意の形態で投与することができる。好適な投与経路は全身投与、より好ましくは非経口投与、好ましくは注射による投与である。あるいは、薬剤を局所的に投与してもよい。他の投与経路には、効率的かつ最も侵襲性の少ない投与経路で行われる筋肉内、腹腔内、皮下、経口、鼻腔内、気管内および肺が含まれる。
非経口投与は一般に、皮下、筋肉内または静脈内への注射および注入に用いられる。さらに、非経口投与の１つのアプローチは、一定レベルの用量を維持するための徐放または持続放出システムの埋植を用いるものであり、当業者には公知である。
さらに、適当な鼻腔内溶媒、吸入剤を局所的に使用した鼻腔内経路により、または当業者に公知の経皮形態の経皮パッチを使用した経皮経路により本発明の好適な薬剤を投与することができる。経皮送達システムの形態で投与するためには、投与は通常、投与計画を通して間欠的ではなく連続的なものとなる。他の好適な局所製剤としてはクリーム剤、軟膏剤、ローション剤、エアロゾルスプレーおよびゲル剤が挙げられ、ここでは、有効成分の濃度は通常、０．０１％〜１５％（ｗ／ｗまたはｗ／ｖ）の範囲となる。
本発明の薬剤は一般に、特に限定されないが、好ましくは薬学的に許容される媒質に溶解または分散させた本発明の核酸分子を含めた、治療に有効な量の活性成分（１つまたは複数）を含む。薬学的に許容される媒質または担体としては、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌薬剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。活性な薬物にこのような媒質および物質を使用することは、当該技術分野で公知である。また、本発明の薬剤に補助有効成分を組み込んでもよい。
さらなる態様では、本発明は医薬組成物に関する。このような医薬組成物は、少なくとも１つの本発明による核酸と、好ましくは薬学的に許容される溶媒とを含む。このような溶媒は、当該技術分野で使用される、および／または当該技術分野で公知の任意の溶媒または任意の結合剤であってよい。より具体的には、このような結合剤または溶媒は、本明細書に開示される薬剤の製造に関連して述べられる任意の結合剤または溶媒である。さらなる実施形態では、医薬組成物は追加の薬学的に活性な物質を含む。
薬剤および医薬組成物の調製はそれぞれ、本開示を踏まえれば当業者に公知のことである。このような組成物は通常、溶液もしくは懸濁液の注射剤として、注射前に液体に溶解もしくは懸濁させるのに適した固形剤として、経口投与用の錠剤などの固体として、徐放性のカプセル剤として、または点眼剤、クリーム剤、ローション剤、軟膏剤、吸入剤などを含めた現在使用されている他の任意の形態で調製され得る。手術野の特定部位を処置するために、外科医、内科医または医療従事者が生理食塩水ベースの洗浄剤のような無菌製剤を使用することも特に有用であり得る。また微小装置、微粒子またはスポンジにより組成物を送達してもよい。
本発明による医薬組成物または薬剤は、無菌化されている、かつ／または補助剤、例えば保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を調節する塩および／または緩衝剤などを含有するものであってよい。さらに本発明による医薬組成物または薬剤は、治療に有効な他の物質を含有していてもよい。組成物は従来の混合法、造粒法またはコーティング法に従って調製され、通常、有効成分を約０．１％〜７５％、好ましくは約１％〜５０％含有する。
液体、特に注射用組成物は、例えば溶解させること、分散させることなどにより調製され得る。活性化合物を薬学的に純粋な溶媒、例えば水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、グリセロール、エタノールなどに溶解させるか、またはこれと混合して、注射用の溶液または懸濁液を形成する。さらに、注射前に液体に溶解させるのに適した固形剤を製剤化してもよい。
また本発明の薬剤および核酸分子をそれぞれ、小さな一枚膜リポソーム、大きな一枚膜リポソームおよび多重膜リポソームのようなリポソーム送達システムの形態で投与してもよい。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンを含有する各種のリン脂質から形成され得る。いくつかの実施形態では、当業者に公知のことであるが、脂質成分の膜が薬物の水溶液と水和し、薬物を封入した脂質層を形成する。例えば、本発明による核酸分子を、当該技術分野で公知の方法を用いて構築される脂溶性化合物または非免疫原性の高分子量化合物との複合体として得ることができる。さらにリポソームは、標的化のためにこのような核酸分子をその表面に有し、細胞殺作用を仲介するために細胞毒性物質を内部に保有し得る。核酸関連の複合体の例が米国特許第６，０１１，０２０号に記載されている。
また本発明の薬剤および核酸分子をそれぞれ、標的化可能な薬物担体としての可溶性ポリマーと組み合わせてもよい。このようなポリマーとしてはポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパナミドフェノール（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌａｓｐａｎａｍｉｄｅｐｈｅｎｏｌ）、またはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリジンが挙げられる。さらに本発明の薬剤および核酸分子をそれぞれ、薬物の放出制御をもたらすのに有用な種類の生分解性ポリマー、例えばポリ乳酸、ポリεカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリラート、およびヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマーと結合させてもよい。
また、投与される医薬組成物および薬剤はそれぞれ、必要に応じて、ある量の、通常は少量の非毒性補助物質、例えば湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤をはじめとする物質、例えば酢酸ナトリウムおよびオレイン酸トリエタノールアミンなどを含有していてもよい。
本発明の核酸分子および薬剤をそれぞれ用いた投与計画は、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別および医学的状態、治療するべき状態の重症度、投与経路、患者の腎機能および肝機能、ならびに使用する具体的な本発明による核酸またはその塩を含めた各種の要素に応じて選択される。通常の知識を有する医師または獣医師は、状態進行の予防、阻止または停止に必要な薬物の有効量を容易に決定し処方することができる。
本発明による核酸の有効な血漿中レベルは、本明細書に開示される任意の疾患の治療において、好ましくは５００ｆＭ〜５００μＭの範囲である。
本発明の核酸分子および薬剤をそれぞれ、好ましくは毎日１回、２日または３日ごとに１回、毎週１回、２週間ごとに１回、毎月１回または３か月ごとに１回投与し得る。
本発明においては、本明細書に記載の薬剤は本明細書に開示される医薬組成物を構成する。
さらなる態様では、本発明は治療を必要とする対象を治療するための方法に関するものであり、この方法は、薬学的有効量の少なくとも１つの本発明による核酸を投与することを含む。一実施形態では、対象は疾患に罹患しているか、またはこのような疾患を発現するリスクがあり、疾患は本明細書に開示される疾患のいずれか１つ、特に本発明による核酸のいずれかを薬剤の製造に使用することに関連して開示される疾患のいずれか１つである。
本発明による核酸およびアンタゴニストを薬剤として、または薬剤の製造に使用し得るだけでなく、特に炎症を起こした局所的な皮膚病変へのヘプシジンの関与に関連して、美容上の目的でも使用し得ることを理解するべきである。したがって、本発明による核酸、薬剤および／または医薬組成物を使用し得る治療または予防の対象となるさらなる状態または疾患は、炎症を起こした局所的な皮膚病変である。
好適な実施形態では、本明細書で好ましく使用される治療という用語は、加えてまたは代わりに予防および／または追跡調査を包含する。
本明細書で好ましく使用される疾患および障害という用語は、別途明記されない限り互換的に使用されるものとする。
本明細書で使用される含むという用語は、好ましくは、その用語に後続する、またはそれにより記述される発明特定事項を限定することを意図するものではない。しかし、別の実施形態では、含むという用語は、その用語に後続する、またはそれにより記述される発明特定事項を内に含むという意味で、したがって限定するものとして理解されるものとする。
本発明による核酸は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００８／０５２７７４号に記載されている通りに、捕捉プローブおよび検出プローブを用いた工程により検出および定量化され得る。
本発明による核酸分子および本明細書で使用される標的分子ヘプシジンの各種配列番号、化学的性質、その実際の配列および内部参照番号を以下の表にまとめる。
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 実施例
実施例１：ヒトヘプシジンと結合する核酸
ビオチン化ヒトＤ−ヘプシジン−２を標的として用いて、ヒトヘプシジン、具体的にはヒトヘプシジン−２５、ヒトヘプシジン−２２およびヒトヘプシジン−２０と結合する核酸をいくつか作成することができた。そのヌクレオチド配列を図１〜９に示す。核酸をアプタマーで、すなわち、ビオチン化ヒトＤ−ヘプシジン−２５との直接プルダウンアッセイ（実施例３）、競合プルダウンアッセイ（実施例３）および／または表面プラズモン共鳴測定（実施例４）を用いてＤ−核酸レベルで、またはシュピーゲルマーレベルで、すなわち、競合プルダウンアッセイ（実施例３）、表面プラズモン共鳴測定（実施例４）および／またはｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（実施例５および６）により、ヒトヘプシジン−２５（ヒトＬ−ヘプシジン−２５）の天然の立体配置を有するＬ−核酸レベルで特徴付けた。シュピーゲルマーおよびアプタマーは実施例２に記載されている通りに合成したものであった。
このように作成された核酸分子は様々な配列モチーフを示したが、ここでは大きく３つの種類が確認され、これをＡ型、Ｂ型およびＣ型ヘプシジン結合核酸と定め、図１〜８に示す。
ヌクレオチド配列モチーフの定義には、以下のような多義ヌクレオチドに対するＩＵＰＡＣの略号を用いた：
Ｓ 強い水素結合 ＧまたはＣ；
Ｗ 弱い水素結合 ＡまたはＵ；
Ｒ プリン ＧまたはＡ；
Ｙ ピリミジン ＣまたはＵ；
Ｋ ケト ＧまたはＵ；
Ｍ イミノ ＡまたはＣ；
Ｂ Ａではない Ｃ、ＵまたはＧ；
Ｄ Ｃではない Ａ、ＧまたはＵ；
Ｈ Ｇではない Ａ、ＣまたはＵ；
Ｖ Ｕではない Ａ、ＣまたはＧ；
Ｎ 全ヌクレオチド Ａ、Ｇ、ＣまたはＵ
別途明記されない限り、ストレッチおよびボックスの任意の核酸配列または配列はそれぞれ、５’−３’方向で示されている。
１．１ Ａ型ヘプシジン結合核酸
図１、図２、図３および図４に示されるように、Ａ型ヘプシジン結合核酸は中央部のヌクレオチドストレッチを１つ含み、中央部のヌクレオチドストレッチは、潜在的なヘプシジン結合モチーフを定めるヌクレオチドストレッチ（本明細書ではヌクレオチドボックスとも呼ばれる）を少なくとも２つ、すなわち第一のヌクレオチドストレッチであるボックスＡおよび第二のヌクレオチドストレッチであるボックスＢを含む。
第一のヌクレオチドストレッチであるボックスＡと第二のヌクレオチドストレッチであるボックスＢは、連結ヌクレオチドストレッチにより互いに連結されている。
連結ヌクレオチドストレッチ内では、一部のヌクレオチドが互いにハイブリダイズ可能であり、ハイブリダイゼーションの際に二本鎖構造が形成される。しかし、このようなハイブリダイゼーションが分子内で必ずしも生じるわけではない。
一般に、Ａ型ヘプシジン結合核酸は５’末端および３’末端に末端ヌクレオチドストレッチ、すなわち第一の末端ヌクレオチドストレッチおよび第二の末端ヌクレオチドストレッチを含む。第一の末端ヌクレオチドストレッチと第二の末端ヌクレオチドストレッチは互いにハイブリダイズ可能であり、ハイブリダイゼーションの際に二本鎖構造が形成される。しかし、このようなハイブリダイゼーションが分子内で必ずしも生じるわけではない。
Ａ型ヘプシジン結合核酸の５つのヌクレオチドストレッチ、すなわちボックスＡ、ボックスＢ、連結ヌクレオチドストレッチ、第一の末端ヌクレオチドストレッチおよび第二の末端ヌクレオチドストレッチは、以下のような異なる配置で互いに配置され得る：第一の末端ヌクレオチドストレッチ−ボックスＡ−連結ヌクレオチドストレッチ−ボックスＢ−第二の末端ヌクレオチドストレッチ、または第一の末端ヌクレオチドストレッチ−ボックスＢ−連結ヌクレオチドストレッチ−ボックスＡ−第二の末端ヌクレオチドストレッチ。
しかし、Ａ型ヘプシジン結合核酸５つのヌクレオチドストレッチ、すなわちボックスＡ、ボックスＢ、連結ヌクレオチドストレッチ、第一の末端ヌクレオチドストレッチおよび第二の末端ヌクレオチドストレッチは、互いに以下のようにも配置され得る：第二の末端ヌクレオチドストレッチ−ボックスＡ−連結ヌクレオチドストレッチ−ボックスＢ−第一の末端ヌクレオチドストレッチまたは第二の末端ヌクレオチドストレッチ−ボックスＢ−連結ヌクレオチドストレッチ−ボックスＡ−第一の末端ヌクレオチドストレッチ。
定められるボックスまたはヌクレオチドストレッチの配列はＡ型ヘプシジン結合核酸の間で異なっていてもよく、これがヒトヘプシジン、特にヒトヘプシジン−２５との結合親和性に影響を与える。様々なＡ型ヘプシジン結合核酸の結合分析に基づけば、以下に記載するボックスＡおよびＢならびにそのヌクレオチド配列は、個々に、より好ましくはその全体がヒトヘプシジン、特にヒトヘプシジン−２５との結合に不可欠である。
本発明によるＡ型ヘプシジン結合核酸を図１〜４に示す。これらすべてをアプタマーおよび／またはシュピーゲルマーとして、ヒトヘプシジン−２５、より正確にはビオチン化ヒトＤ−ヘプシジン−２５およびビオチン化ヒトＬ−ヘプシジン−２４との結合能に関してそれぞれ試験した。ヒトヘプシジン−２５との結合親和性が特徴付けられた最初のＡ型ヘプシジン結合核酸はヘプシジン結合核酸２２３−Ｃ５−００１である。ヒトヘプシジン−２５に対する平衡結合定数ＫＤを表面プラズモン共鳴測定により決定した（シュピーゲルマー配列で決定されたＫＤ＝２．７ｎＭ、図１１）。ヒトヘプシジン−２５に加え、ヘプシジン結合核酸２２３−Ｃ５−００１は、ほぼ同じ結合親和性でヒトヘプシジン−２０と結合する（図１１）。
Ａ型ヘプシジン結合核酸２２３−Ｃ５−００１の誘導体２２３−Ｃ５−００２、２２３−Ｃ５−００７および２２３−Ｃ５−００８は、競合プルダウンアッセイでＡ型ヘプシジン結合核酸２２３−Ｃ５−００１に比べて低い結合親和性を示した（図３）。しかし、ヘプシジン結合核酸２２３−Ｃ５−００６は、同じアッセイ形式において２２３−Ｃ５−００１とほぼ同じヒトヘプシジン−２５との結合性を示した（図３）。
Ａ型ヘプシジン結合核酸２２３−Ｂ５−００１、２２３−Ａ５−００１、２２３−Ａ３−００１、２２３−Ｆ５−００１、２２３−Ｇ４−００１、２２３−Ａ４−００１、２２９−Ｃ２−００１、２２９−Ｂ４−００１、２２９−Ｅ２−００１、２２９−Ｂ１−００１、２２９−Ｇ１−００１、２２９−Ｃ４−００１、２３８−Ａ１−００１、２３８−Ｅ２−００１、２３７−Ａ７−００１、２３６−Ｇ２−００１、２３６−Ｄ１−００１、２２９−Ｄ１−００１および２２９−Ｅ１−００１をアプタマーとして、Ａ型ヘプシジン結合核酸２２３−Ｃ５−００１との競合プルダウンアッセイで試験した。この試験では、最初に直接プルダウンアッセイを用いて、放射性標識したアプタマー２２３−Ｃ５−００１の結合親和性を決定した。Ａ型ヘプシジン結合核酸２２３−Ｃ５−００１と核酸２２９−Ｅ１−００１との間では結合の競合がみられなかった（図２）。この結果から、核酸２２９−Ｅ１−００１のヒトヘプシジン−２５に対する結合親和性が全くないか、またはきわめて低いことが推測される。Ａ型ヘプシジン結合核酸２２３−Ｂ５−００１、２２３−Ａ５−００１、２２３−Ａ３−００１、２２３−Ａ４−００１、２２９−Ｃ２−００１、２２９−Ｂ４−００１、２２９−Ｅ２−００１、２２９−Ｃ４−００１、２３８−Ａ１−００１、２３８−Ｅ２−００１、２３７−Ａ７−００１、２３６−Ｇ２−００１および２３６−Ｄ１−００１は、競合プルダウンアッセイでＡ型ヘプシジン結合核酸２２３−Ｃ５−００１に比べて低い結合親和性を示した（図１）。Ａ型ヘプシジン結合核酸２２３−Ｆ５−００１、２２３−Ｇ４−００１、２２９−Ｇ１−００１および２２９−Ｄ１−００１は２２３−Ｃ５−００１とほぼ同じ結合親和性を示した（図１、２）。Ａ型ヘプシジン結合核酸２２９−Ｂ１−００１では、２２３−Ｃ５−００１よりも高いビオチン化ヒトＤ−ヘプシジン−２５に対する結合親和性がみられた（図１）。したがって、Ａ型ヘプシジン結合核酸２２９−Ｂ１−００１の特徴付けをさらに行った。Ａ型ヘプシジン結合核酸２２９−Ｂ１−００１の平衡結合定数ＫＤを表面プラズモン共鳴測定により決定した（シュピーゲルマー配列で決定されたＫＤ＝１．２５ｎＭ、データ不掲載）。
Ａ型ヘプシジン結合核酸２２９−Ｂ１−００１の誘導体２２９−Ｂ１−００３、２２９−Ｂ１−００４、２２９−Ｂ１−００５および２２９−Ｂ１−００６は、競合プルダウンアッセイでＡ型ヘプシジン結合核酸２２９−Ｂ１−００１に比べて低い結合親和性を示した（図４）。しかし、Ａ型ヘプシジン結合核酸２２９−Ｂ１−００２、２２９−Ｂ１−００７、２２９−Ｂ１−００８、２２９−Ｂ１−００９、２２９−Ｂ１−０１０および２２９−Ｂ１−０１１は、同じアッセイ形式で２２９−Ｂ１−００１に比べてほぼ同じか、またはわずかに向上したヒトヘプシジン−２５との結合性を示した（図４）。
Ａ型ヘプシジン結合核酸２２９−Ｂ１−００２の特徴付けをさらに行った。Ａ型ヘプシジン結合核酸２２９−Ｂ１−００２の平衡結合定数ＫＤを表面プラズモン共鳴測定により決定した（シュピーゲルマー配列で決定されたＫＤ＝１．４７ｎＭ、図１０および１１）。
さらにＡ型ヘプシジン結合核酸２２９−Ｂ１−００２の結合特異性／選択性を以下に挙げるヘプシジン分子で試験した：ヒトヘプシジン−２５、カニクイザルヘプシジン−２５、マウスヘプシジン−２５、ラットヘプシジン−２５、ヒトヘプシジン−２２およびヒトヘプシジン−２０（図１０および１１）。Ａ型ヘプシジン結合核酸２２９−Ｂ１−００２は、ヒトヘプシジン−２５、カニクイザルヘプシジン−２５、ヒトヘプシジン−２２およびヒトヘプシジン−２０に対してはほぼ同じ結合性を示し、マウスヘプシジン−２５およびラットヘプシジン−２５に対しては結合性を示さない（図１０および１１）。
Ａ型核酸２２９−Ｅ１−００１以外の本発明によるＡ型ヘプシジン結合核酸はすべて、第一のストレッチであるボックスＡを含んでいる。Ａ型ヘプシジン結合核酸２２９−Ｄ１−００１では、ボックスＡの３’末端が第二の末端ストレッチ５’末端と連結されている（図２）。他のＡ型ヘプシジン結合核酸ではすべて、ボックスＡの５’末端が第一の末端ストレッチの３’末端と連結されている（図１〜４）。ボックスＡを含むＡ型ヘプシジン結合核酸は、ボックスＡの配列５’ＷＡＡＡＧＵＷＧＡＲ３’（配列番号１８８）を共通にもつ。ボックスＡの配列５’ＡＡＡＡＧＵＡＧＡＡ３’（配列番号２００）および５’ＡＡＡＡＧＵＵＧＡＡ３’（配列番号２０１）をそれぞれ含むＡ型ヘプシジン結合核酸２２９−Ｃ４−００１／２３６−Ｇ２−００１および２３６−Ｄ１−００１を除けば、Ａ型ヘプシジン結合核酸のボックスＡの配列はすべて５’ＵＡＡＡＧＵＡＧＡＧ３’（配列番号１９９）である。
Ａ型ヘプシジン結合核酸２３６−Ｄ１−００１（図２を参照）以外のＡ型ヘプシジン結合核酸はすべて、配列５’ＲＧＭＧＵＧＷＫＡＧＵＫＣ３’（配列番号１８９）のボックスＢを含んでいる。Ａ型ヘプシジン結合核酸２３６−Ｄ１−００１は、他のＡ型ヘプシジン結合核酸のボックスのコンセンサス配列とは異なるボックスＢ、すなわち５’ＧＧＧＡＵＡＵＡＧＵＧＣ３’（配列番号２０２）を含んでいる。ボックスＡを含まない核酸２２９−Ｅ１−００１は上述のようにヒトヘプシジン−２５と結合しないか、またはそれとの結合性が弱いことから、ボックスＢ以外にもボックスＡがヒトヘプシジン−２５との結合、特にヒトヘプシジン−２５との高親和性結合に不可欠であると推測される。Ａ型ヘプシジン結合核酸２２９−Ｄ１−００１では、ボックスＢの５’末端が第一の末端ストレッチの３’末端と連結されている（図２）。ヘプシジン結合核酸２２９−Ｅ１−００１を除く他のＡ型ヘプシジン結合核酸ではすべて、ボックスＢの３’末端が第二の末端ストレッチの５’末端と連結されている（図１、３および４）。以下のような様々なボックスＢの配列を有するヘプシジン結合核酸が、ヒトヘプシジン−２５との高い結合親和性を示した：
ａ）２２９−Ｂ１−００１とその誘導体、２２３−Ｃ５−００１とその誘導体、２２３−Ｂ５−００１、２２３−Ａ５−００１、２２３−Ａ３−００１、２２３−Ｆ５−００１、２２３−Ｇ４−００１、２２３−Ａ４−００１、２３８−Ｅ２：５’ＧＧＣＧＵＧＡＵＡＧＵＧＣ３’（配列番号２０３）；
ｂ）２２９−Ｂ４−００１、２２９−Ｃ２−００１、２２９−Ｅ２−００１：５’ＧＧＡＧＵＧＵＵＡＧＵＵＣ３’（配列番号２０４）；
ｃ）２２９−Ｇ１−００１：５’ＧＧＣＧＵＧＡＧＡＧＵＧＣ３’（配列番号２０５）；
ｄ）２２９−Ｃ４−００１、２３６−Ｇ２−００１：５’ＡＧＣＧＵＧＡＵＡＧＵＧＣ３’（配列番号２０６）；
ｅ）２３８−Ａ１−００１：５’ＧＧＣＧＵＧＵＵＡＧＵＧＣ３’（配列番号２０７）；
ｆ）２３６−Ｄ１−００１：５’ＧＧＧＡＵＡＵＡＧＵＧＣ３’（配列番号２０２）。
ボックスＡとボックスＢとを含むヘプシジン結合核酸は、１０〜１８ヌクレオチドの連結ヌクレオチドストレッチにより互いに連結されている。連結ヌクレオチドストレッチは、５’→３’方向に第一の連結ヌクレオチドサブストレッチと、第二の連結ヌクレオチドサブストレッチと、第三の連結ヌクレオチドサブストレッチとを含み、好ましくは第一の連結ヌクレオチドサブストレッチと第三の連結ヌクレオチドサブストレッチが任意に互いにハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションの際に二本鎖構造が形成される。しかし、このようなハイブリダイゼーションが分子内で必ずしも生じるわけではない。第一の連結ヌクレオチドサブストレッチと第三の連結ヌクレオチドサブストレッチのヌクレオチドが互いにハイブリダイズする場合、両ストレッチの間に互いにハイブリダイズしないヌクレオチドのループ（すなわち、第二のサブストレッチ）が形成される。ヘプシジン結合核酸の連結ヌクレオチドストレッチの第一のヌクレオチドサブストレッチと第三のヌクレオチドサブストレッチは、ヌクレオチドを３個（２２９−Ｂ１−００１とその誘導体、２２９−Ｇ１−００１を参照）、４個（２２３−Ｃ５−００１とその誘導体、２２３−Ｂ５−００１、２２３−Ａ５−００１、２２３−Ａ３−００１、２２３−Ｆ５−００１、２２３−Ｇ４−００１、２２３−Ａ４−００１、２２９−Ｃ２−００１、２２９−Ｂ４−００１、２２９−Ｅ２−００１、２３８−Ａ１−００１、２３８−Ｅ２−００１、２３７−Ａ７−００１を参照）、５個（２２９−Ｄ１−００１）または６個（２２９−Ｃ４−００１、２３６−Ｇ２−００１）含む。Ａ型結合核酸２３６−Ｄ１−００１は１８ヌクレオチドの連結ヌクレオチドストレッチを含むが、前記連結ヌクレオチドストレッチの特有の配列により、その連結ヌクレオチドストレッチを第一の連結ヌクレオチドサブストレッチ、第二の連結ヌクレオチドサブストレッチ、第三の連結ヌクレオチドサブストレッチに分類することができない。
ヘプシジン結合核酸２２３−Ｃ５−００１とその誘導体、２２３−Ｂ５−００１、２２３−Ａ５−００１、２２３−Ａ３−００１、２２３−Ｆ５−００１、２２３−Ｇ４−００１、２３８−Ｅ２−００１および２２３−Ａ４−００１でみられるように、連結ヌクレオチドストレッチの第一のサブストレッチは配列５’ＧＧＡＣ３’、５’ＧＧＡＵ３’または５’ＧＧＡ３’を含み、連結ヌクレオチドストレッチの第三のサブストレッチはヌクレオチド配列５’ＧＵＣＣ３’を含んでいる。ほかに連結ヌクレオチドストレッチの第一と第三のサブストレッチの組合せには、
ａ）５’ＧＣＡＧ３’と５’ＣＵＧＣ３’（２２９−Ｃ２−００１、２２９−Ｂ４−００１、２２９−Ｅ２−００１、２３７−Ａ７−００１）
ｂ）５’ＧＡＣ３’と５’ＧＵＣ３’（２２９−Ｂ１−００１とその誘導体、２２９−Ｇ１−００１）
ｃ）５’ＡＣＵＵＧＵ３’と５’ＧＣＡＡＧＵ３’（２２９−Ｃ４−００１）
ｄ）５’ＡＣＵＵＧＵ３’と５’ＧＣＡＡＧＣ３’（２３６−Ｇ２−００１）
ｅ）５’ＵＣＣＡＧ３’と５’ＣＵＧＧＡ３’（２２９−Ｄ１−００１）
ｆ）５’ＧＧＧＣ３’と５’ＧＣＣＣ３’（２３８−Ａ１−００１）がある。
図１、２、３および４に示されるように、連結ヌクレオチドストレッチの第二のサブストレッチは３〜５個のヌクレオチドを含み、その種々の配列は、以下に挙げるようにきわめて多様である：５’ＣＧＡＡＡ３’、５’ＧＣＡＡＵ３’、５’ＧＵＡＡＵ３’、５’ＡＡＵＵ３’、５’ＡＵＡＡＵ３’、５’ＡＡＵＡ３’、５’ＣＣＡ３’、５’ＣＵＡ３’、５’ＵＣＡ３’、５’ＡＣＡ３’、５’ＧＵＵ３’、５’ＵＧＡ３’および５’ＧＵＡ３’。ヘプシジン結合核酸の連結ヌクレオチドストレッチの第二のサブストレッチは、一般配列５’ＶＢＡＡＷ３’、５’ＡＡＵＷ３’または５’ＮＢＷ３’にまとめられる。
しかし、結合親和性が最も高いヘプシジン結合核酸は、連結ヌクレオチドストレッチの第二のサブストレッチとして以下の配列を含む：
ａ）５’ＡＡＵＵ３’（２２９−Ｂ１とその誘導体）
ｂ）５’ＣＣＡ３’（２２３−Ｃ５とその誘導体）
ｃ）５’ＣＵＡ３’（２２３−Ｆ５−００１）
ｄ）５’ＵＣＡ３’（２２３−Ｇ４−００１）
ｅ）５’ＡＡＵＡ３’（２２９−Ｇ１−００１）。
上述のように、連結ストレッチの第一のサブストレッチと第三のサブストレッチのヌクレオチド配列は互いに関連している。さらに、連結ヌクレオチドストレッチの第二のサブストレッチのヌクレオチド配列は第一と第三のヌクレオチドサブストレッチの特定のペアと関連し、ヘプシジン結合核酸の連結ヌクレオチドストレッチの以下の配列または一般配列を生じる：
ａ）５’ＧＧＡＣＢＹＡＧＵＣＣ３’（配列番号２０８）（２２３−Ｃ５−００１、２２３−Ｃ５−００２、２２３−Ｃ５−００６、２２３−Ｃ５−００７、２２３−Ｂ５−００１、２２３−Ａ５−００１、２２３−Ａ３−００１、２２３−Ｆ５−００１、２２３−Ｇ４−００１、２３８−Ｅ２−００１）、好ましくは５’ＧＧＡＣＣＣＡＧＵＣＣ３’（配列番号１９３）、５’ＧＧＡＣＣＵＡＧＵＣＣ３’（配列番号１９４）もしくは５’ＧＧＡＣＵＣＡＧＵＣＣ３’（配列番号１９５）もしくは５’ＧＧＡＣＧＵＡＧＵＣＣ３’（配列番号２１４）、より好ましくは５’ＧＧＡＣＣＣＡＧＵＣＣ３’（配列番号１９３）、５’ＧＧＡＣＣＵＡＧＵＣＣ３’（配列番号１９４）もしくは５’ＧＧＡＣＵＣＡＧＵＣＣ３’（配列番号１９５）；
ｂ）５’ＧＧＡＵＡＣＡＧＵＣＣ３’（配列番号２０９）（２２３−Ａ４−００１）；
ｃ）５’ＧＣＡＧＧＹＡＡＵＣＵＧＣ３’（配列番号２１０）（２２９−Ｃ２−００１、２２９−Ｂ４−００１、２２９−Ｅ２−００１）、好ましくは５’ＧＣＡＧＧＵＡＡＵＣＵＧＣ３’（配列番号１９６）もしくは５’ＧＣＡＧＧＣＡＡＵＣＵＧＣ３’（配列番号１９７）、より好ましくは５’ＧＣＡＧＧＵＡＡＵＣＵＧＣ３’（配列番号１９６）；
ｄ）５’ＧＡＣＡＡＵＷＧＵＣ３’（配列番号２１１）（２２９−Ｂ１−００１とその誘導体、２２９−Ｇ１−００１）、好ましくは５’ＧＡＣＡＡＵＵＧＵＣ３’（配列番号１９８）もしくは５’ＧＡＣＡＡＵＡＧＵＣ３’（配列番号１５７）；
ｅ）５’ＡＣＵＵＧＵＣＧＡＡＡＧＣＡＡＧＹ３’（配列番号２１２）（２２９−Ｃ４−００１、２３６−Ｇ２−００１）；
ｆ）５’ＵＣＣＡＧＧＵＵＣＵＧＧＡ３’（配列番号１０９）（２２９−Ｄ１−００１）；
ｇ）５’ＧＧＧＣＵＧＡＧＣＣＣ３’（配列番号１９０）（２３８−Ａ１−００１）；
ｈ）５’ＧＣＡＧＡＵＡＡＵＣＵＧＣ３’（配列番号１９１）（２３７−Ａ７−００１）；または
ｉ）５’ＧＧＡＣＣＡＧＵＣＣ３’（配列番号１９２）（２２３−Ｃ５−００８）。
上述のように、Ａ型結合核酸２３６−Ｄ１−００１の連結ヌクレオチドストレッチを第一の連結ヌクレオチドサブストレッチ、第二の連結ヌクレオチドサブストレッチおよび第三の連結ヌクレオチドサブストレッチに分類することはできない。しかし、Ａ型結合核酸２３６−Ｄ１−００１の連結ヌクレオチドストレッチの配列は５’ＡＵＵＵＧＵＵＧＧＡＡＵＣＡＡＧＣＡ３’（配列番号２１５）である。
Ａ型ヘプシジン結合核酸の第一および第二の末端ヌクレオチドストレッチは、ヌクレオチドを４個（例えば、２２９−Ｃ４−００１），５個（例えば、２２３−Ｃ５−００７），６個（例えば、２２９−Ｂ１−００１）または７個（例えば、２２３−Ｃ５−００１）を含み、上記ストレッチは任意に互いにハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションの際に二本鎖構造が形成される。この二本鎖構造は４〜７個の塩基対からなるものであり得る。しかし、このようなハイブリダイゼーションが分子内で必ずしも生じるわけではない。
試験した全ヘプシジン結合核酸の第一および第二の末端ヌクレオチドストレッチを合わせると、第一の末端ヌクレオチドストレッチと第二の末端ヌクレオチドストレッチの一般式は５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＢＫＢＫ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）および５’ＭＶＶＶＸ４Ｘ５Ｘ６３’（第二の末端ヌクレオチドストレッチ）となり、式中、
Ｘ１はＧであるかまたは存在せず、Ｘ２はＳであるかまたは存在せず、Ｘ３はＶであるかまたは存在せず、Ｘ４はＢであるかまたは存在せず、Ｘ５はＳであるかまたは存在せず、かつＸ６はＣであるかまたは存在せず、
好ましくは、
ａ）Ｘ１はＧであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＶであり、Ｘ４はＢであり、Ｘ５はＳであり、かつＸ６はＣであるか、
ｂ）Ｘ１は存在せず、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＶであり、Ｘ４はＢであり、Ｘ５はＳであり、かつＸ６はＣであるか、
ｄ）Ｘ１はＧであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＶであり、Ｘ４はＢであり、Ｘ５はＳであり、かつＸ６は存在しないか、
ｅ）Ｘ１は存在せず、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＶであり、Ｘ４はＢであり、Ｘ５はＳであり、かつＸ６は存在しないか、
ｆ）Ｘ１は存在せず、Ｘ２は存在せず、Ｘ３はＶであり、Ｘ４はＢであり、Ｘ５はＳであり、かつＸ６は存在しないか、
ｇ）Ｘ１は存在せず、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＶであり、Ｘ４はＢであり、Ｘ５は存在せず、かつＸ６は存在しないか、または
ｆ）Ｘ１は存在せず、Ｘ２は存在せず、Ｘ３はＶであるかもしくは存在せず、Ｘ４はＢであるかもしくは存在せず、Ｘ５は存在せず、Ｘ６は存在しない。
しかし、結合親和性が最も高いヘプシジン結合核酸は、以下のような第一と第二の末端ヌクレオチドストレッチの組合せを含む：
ａ）２２３−Ｃ５−００１、２２３−Ｆ５−００１、２２３−Ｇ４−００１：５’ＧＣＡＣＵＣＧ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）と５’ＣＧＡＧＵＧＣ３’（第二の末端ヌクレオチドストレッチ）；
ｂ）２２９−Ｂ１−００２：５’ＧＣＵＧＵＧ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）と５’ＣＡＣＡＧＣ３’（第二の末端ヌクレオチドストレッチ）；
ｃ）２２９−Ｂ１−００１、２２９−Ｇ１−００１：５’ＣＧＵＧＵＧ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）と５’ＣＡＣＡＣＧ３’（第二の末端ヌクレオチドストレッチ）；
ｄ）２２９−Ｄ１−００１：５’ＣＧＵＧＣＵ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）と５’ＡＧＣＡＣＧ３’（第二の末端ヌクレオチドストレッチ）；
ｅ）２２３−Ｃ５−００６：５’ＣＧＣＧＣＧ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）と５’ＣＧＣＧＣＧ３’（第二の末端ヌクレオチドストレッチ）
ｆ）２２９−Ｂ１−００７：５’ＧＣＣＧＵＧ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）と５’ＣＡＣＧＧＣ３’（第二の末端ヌクレオチドストレッチ）
ｇ）２２９−Ｂ１−００８：５’ＧＣＧＧＵＧ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）と５’ＣＡＣＣＧＣ３’（第二の末端ヌクレオチドストレッチ）
ｈ）２２９−Ｂ１−００９：５’ＧＣＵＧＣＧ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）と５’ＣＧＣＡＧＣ３’（第二の末端ヌクレオチドストレッチ）
ｉ）２２９−Ｂ１−０１０：５’ＧＣＵＧＧＧ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）と５’ＣＣＣＡＧＣ３’（第二の末端ヌクレオチドストレッチ）
ｊ）２２９−Ｂ１−０１１：５’ＧＣＧＧＣＧ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）と５’ＣＧＣＣＧＣ３’（第二の末端ヌクレオチドストレッチ）。
ヘプシジン結合核酸がシュピーゲルマーとして機能することを証明するために、Ａ型ヘプシジン結合核酸２２３−Ｃ５−００および２２９−Ｂ１−００２を、５’末端にアミノ基を含むシュピーゲルマーとして合成した。アミノ修飾したシュピーゲルマー２２３−Ｃ５−００１−５’−アミノおよび２２９−Ｂ１−００２−５’−アミノに４０ｋＤａのＰＥＧ部分を結合させて、Ａ型ヘプシジン結合核酸２２３−Ｃ５−００１−５’−ＰＥＧおよび２２９−Ｂ１−００２−５’−ＰＥＧを得た。シュピーゲルマーの合成およびＰＥＧ化については実施例２に記載されている。
シュピーゲルマー２２３−Ｃ５−００１−５’−ＰＥＧおよび２２９−Ｂ１−００２の平衡結合定数ＫＤは、表面プラズモン共鳴測定により以下のように決定された（図１２）：
２２３−Ｃ５−００１−５’−ＰＥＧ：ＫＤ＝４．４４ｎＭ；
２２９−Ｂ１−００２−５’−ＰＥＧ：ＫＤ＝１．９２ｎＭ。
シュピーゲルマー２２３−Ｃ５−００１−５’−ＰＥＧがｉｎ ｖｉｖｏでヘプシジンの機能を阻害する／これに拮抗するか否かを試験した。シュピーゲルマー２２３−Ｃ５−００１−５’−ＰＥＧがｉｎ ｖｉｖｏでの使用に適用可能であるか否かを炎症貧血の動物モデルで試験し、ここでは、血清鉄減少を引き起こすというヒトヘプシジン−２５の既知の特性を利用した（実施例５）。
１．２ Ｂ型ヘプシジン結合核酸
図５および６に示されるように、Ｂ型ヘプシジン結合核酸は、潜在的なヘプシジン結合モチーフを定める中央部のヌクレオチドストレッチを１つ含む。
一般に、Ｂ型ヘプシジン結合核酸は５’末端および３’末端に末端ヌクレオチドストレッチ、すなわち第一の末端ヌクレオチドストレッチおよび第二の末端ヌクレオチドストレッチを含む。第一の末端ヌクレオチドストレッチと第二の末端ヌクレオチドストレッチは互いにハイブリダイズ可能であり、ハイブリダイゼーションの際に二本鎖構造が形成される。しかし、このようなハイブリダイゼーションが分子内で必ずしも生じるわけではない。
Ｂ型ヘプシジン結合核酸の３つのストレッチ、すなわち第一の末端ヌクレオチドストレッチ、中央部のヌクレオチドストレッチおよび第二の末端ヌクレオチドストレッチは、以下のような異なる配置で互いに配置され得る：第一の末端ヌクレオチドストレッチ−中央部のヌクレオチドストレッチ−第二の末端ヌクレオチドストレッチ、または第二の末端ヌクレオチドストレッチ−中央部のヌクレオチドストレッチ−第一の末端ヌクレオチドストレッチ。
定められるストレッチの配列はＢ型ヘプシジン結合核酸の間で異なっていてもよく、 これがヒトヘプシジン、特にヒトヘプシジン−２５との結合親和性に影響を与える。様々なヘプシジン結合核酸の結合分析に基づけば、以下に記載する中央部のヌクレオチドストレッチとそのヌクレオチド配列は、個々に、より好ましくはその全体がヒトヘプシジン−２５との結合に不可欠である。
本発明によるＢ型ヘプシジン結合核酸を図５および６に示す。これらすべてをアプタマーまたはシュピーゲルマーとして、ヒトヘプシジン−２５、より正確にはビオチン化ヒトＤ−ヘプシジン−２５およびビオチン化ヒトＬ−ヘプシジン−２５との結合能に関してそれぞれ試験した。
Ｂ型ヘプシジン結合核酸２３８−Ｄ２−００１、２３８−Ｄ４−００１、２３８−Ｈ１−００１、２３８−Ａ２−００１、２３８−Ｇ２−００１、２３８−Ｇ４−００１、２３８−Ｇ３−００１をアプタマーとして、Ａ型ヘプシジン結合核酸２２９−Ｂ１−００１との競合プルダウンアッセイで試験した。競合プルダウンアッセイでＡ型ヘプシジン結合核酸２２９−Ｂ１−００１に比べて低い結合親和性を示したのは、Ｂ型ヘプシジン結合核酸２３８−Ｇ４−００１だけであった（図５）。Ｂ型ヘプシジン結合核酸２３８−Ｄ２−００１、２３８−Ｄ４−００１、２３８−Ｈ１−００１、２３８−Ａ２−００１、２３８−Ｇ２−００１および２３８−Ｇ３−００１は、Ａ型ヘプシジン結合核酸２２９−Ｂ１−００１に比べて向上した結合親和性を示した（図５）。Ｂ型ヘプシジン結合核酸２３８−Ｄ４−００１の特徴付けをさらに行った。シュピーゲルマー２３８−Ｄ４−００１の平衡結合定数ＫＤを表面プラズモン共鳴測定により決定した（ＫＤ＝０．５１ｎＭ；図５）。
Ｂ型ヘプシジン結合核酸２３８−Ｄ４−００１の誘導体２３８−Ｄ４−００３、２３８−Ｄ４−００５、２３８−Ｄ４−００７、２３８−Ｄ４−００９、２３８−Ｄ４−０１０、２３８−Ｄ４−０１１および２３８−Ｄ４−０１３は、競合プルダウンアッセイで（または表面プラズモン共鳴測定により示される）Ｂ型ヘプシジン結合核酸２３８−Ｄ４−００１に比べて低い結合親和性を示した（図６）。しかし、ヘプシジン結合核酸２３８−Ｄ４−００２、２３８−Ｄ４−００４、２３８−Ｄ４−００６、２３８−Ｄ４−００８および２３８−Ｄ４−０１２は、同じアッセイ形式で２３８−Ｄ４−００１とほぼ同じヒトヘプシジンとの結合性を示した（図６）。シュピーゲルマー２３８−Ｄ４−００２、２３８−Ｄ４−００６および２３８−Ｄ４−００８の平衡結合定数ＫＤを表面プラズモン共鳴測定により決定した。算出された２３８−Ｄ４−００１誘導体の平衡結合定数は、２３８−Ｄ４−００１自体で示されたものと同じ範囲にあった（図６）。
さらに、Ｂ型ヘプシジン結合核酸２３８−Ｄ４−００１および２３８−Ｄ４−００８の結合選択性を以下に挙げるヘプシジン分子で試験した：ヒトヘプシジン−２５、カニクイザルヘプシジン−２５、マーモセットヘプシジン−２５（２３８−Ｄ４−００８のみ）、マウスヘプシジン−２５、ラットヘプシジン−２５、ヒトヘプシジン−２２（２３８−Ｄ４−００８では試験せず）およびヒトヘプシジン−２０（図１０および１１）。Ｂ型ヘプシジン結合核酸２３８−Ｄ４−００１および２３８−Ｄ４−００８は、ヒトヘプシジン−２５、ヒトヘプシジン−２２、ヒトヘプシジン−２０およびカニクイザルヘプシジン−２５に対してはほぼ同じ結合性を示し、マーモセットヘプシジン−２５に対してはこれより弱い結合性を示し、マウスヘプシジン−２５およびラットヘプシジン−２５に対しては結合性を示さない（図１０および１１）。
本発明によるＢ型ヘプシジン結合核酸は、中央部のヌクレオチドストレッチの配列５’ＲＫＡＵＧＧＧＡＫＵＡＡＧＵＡＡＡＵＧＡＧＧＲＧＵＷＧＧＡＧＧＡＡＲ３’（配列番号１８２）または５’ＲＫＡＵＧＧＧＡＫＡＡＧＵＡＡＡＵＧＡＧＧＲＧＵＷＧＧＡＧＧＡＡＲ３’（配列番号１８３）を共通にもつ。ヒトヘプシジン−２５に対して同じ結合親和性を示したＢ型ヘプシジン結合核酸２３８−Ｄ４−００１とその誘導体は、中央部のヌクレオチドストレッチの配列５’ＧＵＡＵＧＧＧＡＵＵＡＡＧＵＡＡＡＵＧＡＧＧＡＧＵＵＧＧＡＧＧＡＡＧ３’（配列番号１８４）を含むコンセンサス配列を共通にもつ。
Ｂ型ヘプシジン結合核酸の第一および第二の末端ヌクレオチドストレッチは、ヌクレオチドを５個（２３８−Ｄ４−００４、２３８−Ｄ４−００５、２３８−Ｄ４−００８、２３８−Ｄ４−００９）、６個（２３８−Ｄ４−００２、２３８−Ｄ４−００３、２３８−Ｄ４−００６、２３８−Ｄ４−００７、２３８−Ｄ４−０１０、２３８−Ｄ４−０１１、２３８−Ｄ４−０１２、２３８−Ｄ４−０１３）または８個（２３８−Ｄ２−００１、２３８−Ｄ４−００１、２３８−Ｈ１−００１、２３８−Ａ２−００１、２３８−Ｇ２−００１、２３８−Ｇ４−００１、２３８−Ｇ３−００１）含み、上記ストレッチは任意に互いにハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションの際に二本鎖構造が形成される。この二本鎖構造は５〜８個の塩基対からなるものであり得る。しかし、このようなハイブリダイゼーションが分子内で必ずしも生じるわけではない。
試験した全Ｂ型ヘプシジン結合核酸の第一および第二の末端ヌクレオチドストレッチを合わせると、第一の末端ヌクレオチドストレッチおよび第二の末端ヌクレオチドストレッチ一般式は、５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＢＳＢＣ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）および５’ＧＶＢＶＢＸ４Ｘ５Ｘ６３’（第二の末端ヌクレオチドストレッチ）となり、式中、
Ｘ１はＡであるかまたは存在せず、Ｘ２はＧであるかまたは存在せず、Ｘ３はＢであるかまたは存在せず、Ｘ４はＳであるかまたは存在せず、Ｘ５はＣであるかまたは存在せず、かつＸ６はＵであるかまたは存在せず、
好ましくは、
ａ）Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＢであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５はＣであり、かつＸ６はＵであるか、
ｂ）Ｘ１は存在せず、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＢであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５はＣであり、かつＸ６はＵであるか、
ｃ）Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＢであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５はＣであり、かつＸ６は存在しないか、
ｄ）Ｘ１は存在せず、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＢであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５はＣであり、かつＸ６は存在しないか、
ｅ）Ｘ１は存在せず、Ｘ２は存在せず、Ｘ３はＢであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５はＣであり、かつＸ６は存在しないか、
ｆ）Ｘ１は存在せず、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＢであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５は存在せず、かつＸ６は存在しないか、または
ｇ）Ｘ１は存在せず、Ｘ２は存在せず、Ｘ３はＢであるかもしく存在せず、Ｘ４はＳであるかもしくは存在せず、Ｘ５は存在せず、かつＸ６は存在しない。
しかし、結合性が最も高いＢ型ヘプシジン結合核酸は、以下のような第一と第二の末端ヌクレオチドストレッチの組合せを含む：
ａ）２３８−Ｄ２−００１：５’ＡＧＣＧＵＧＵＣ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）と５’ＧＧＵＧＣＧＣＵ３’（第二の末端ヌクレオチドストレッチ）、
ｂ）２３８−Ｄ４−００１：５’ＡＧＣＧＵＧＵＣ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）と５’ＧＧＣＡＵＧＣＵ３’（第二の末端ヌクレオチドストレッチ）、
ｃ）２３８−Ｈ１−００１：５’ＡＧＵＧＵＧＵＣ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）と５’ＧＡＵＧＣＧＣＵ３’（第二の末端ヌクレオチドストレッチ）、
ｄ）２３８−Ａ２−００１：５’ＡＧＵＧＵＧＵＣ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）と５’ＧＧＣＡＵＧＣＵ３’（第二の末端ヌクレオチドストレッチ）、
ｅ）２３８−Ｇ２−００１：５’ＡＧＣＧＵＧＣＣ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）と５’ＧＧＵＧＣＧＣＵ３’（第二の末端ヌクレオチドストレッチ）、
ｆ）２３８−Ｇ３−００１：５’ＡＧＣＧＣＧＣＣ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）と５’ＧＧＣＧＣＧＣＵ３’（第二の末端ヌクレオチドストレッチ）、
ｇ）２３８−Ｄ４−００２：５’ＧＣＧＣＧＣ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）と５’ＧＣＧＣＧＣ３’（第二の末端ヌクレオチドストレッチ）、
ｈ）２３８−Ｄ４−００６：５’ＧＧＵＧＵＣ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）と５’ＧＧＣＡＵＣ３’（第二の末端ヌクレオチドストレッチ）、
ｉ）２３８−Ｄ４−０１２：５’ＧＧＣＧＵＣ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）と５’ＧＧＣＧＣＣ３’（３’−末端ヌクレオチドストレッチ）、
ｊ）２３８−Ｄ４−００８：５’ＧＣＧＣＣ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）と５’ＧＧＣＧＣ３’（第二の末端ヌクレオチドストレッチ）、
ｋ）２３８−Ｄ４−００４：５’ＧＧＣＧＣ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）と５’ＧＣＧＣＣ３’（第二の末端ヌクレオチドストレッチ）。
Ｂ型ヘプシジン結合核酸がシュピーゲルマーとして機能することを証明するために、ヘプシジン結合核酸２３８−Ｄ４−００２および２３８−Ｄ４−００８を、５’末端にアミノ基を含むシュピーゲルマーとして合成した。アミノ修飾したシュピーゲルマー２３８−Ｄ４−００２−５’−アミノおよび２３８−Ｄ４−００８−５’−アミノに４０ｋＤａのＰＥＧ部分を結合させて、ヘプシジン結合核酸２３８−Ｄ４−００２−５’−ＰＥＧおよび２３８−Ｄ４−００８−５’ＰＥＧを得た。シュピーゲルマーの合成およびＰＥＧ化については実施例２に記載されている。
シュピーゲルマー２３８−Ｄ４−００２−５’−ＰＥＧおよび２３８−Ｄ４−００８−５’−ＰＥＧの平衡結合定数ＫＤは、表面プラズモン共鳴測定により以下のように決定された（図１２）：
２３８−Ｄ４−００２−５’−ＰＥＧ：０．５３ｎＭ、
２３８−Ｄ４−００８−５’−ＰＥＧ：０．６４ｎＭ。
シュピーゲルマー２３８−Ｄ４−００８−５’−ＰＥＧがｉｎ ｖｉｖｏでヘプシジンの機能を阻害する／これに拮抗するか否かを試験した。シュピーゲルマー２３８−Ｄ４−００８−５’−ＰＥＧがｉｎ ｖｉｖｏでの使用に適用可能であるか否かを炎症貧血の動物モデルで試験し、ここでは、血清鉄減少を引き起こすというヒトヘプシジン−２５の既知の特性を利用した（実施例５、図１４）。さらにシュピーゲルマー２３８−Ｄ４−００８−５’−ＰＥＧを炎症性貧血の別の動物モデル（カニクイザル）で試験したが、この試験は、非ヒト霊長類においてＩＬ−６がヘプシジン分泌を誘発して貧血を引き起こすものである。この実験では、ヒトＩＬ−６が血清鉄濃度の減少をもたらす（実施例６、図１５）。
１．３ Ｃ型ヘプシジン結合核酸
図７および８に示されるように、Ｃ型ヘプシジン結合核酸は、潜在的なヘプシジン結合モチーフを定める中央部のヌクレオチドストレッチを１つ含む。
一般に、Ｃ型ヘプシジン結合核酸は５’末端および３’末端に末端ストレッチ、すなわち第一の末端ヌクレオチドストレッチおよび第二の末端ヌクレオチドストレッチを含む。第一の末端ヌクレオチドストレッチと第二の末端ヌクレオチドストレッチは互いにハイブリダイズ可能であり、ハイブリダイゼーションの際に二本鎖構造が形成される。しかし、このようなハイブリダイゼーションが分子内で必ずしも生じるわけではない。
Ｃ型ヘプシジン結合核酸の３つのヌクレオチドストレッチ、すなわち第一の末端ヌクレオチドストレッチ、中央部のヌクレオチドストレッチおよび第二の末端ヌクレオチドストレッチは、以下のような異なる配置で互いに配置され得る：第一の末端ヌクレオチドストレッチ−中央部のヌクレオチドストレッチ−第二の末端ヌクレオチドストレッチ、または第二の末端ヌクレオチドストレッチ−中央部のヌクレオチドストレッチ−第一の末端ヌクレオチドストレッチ。
定められるストレッチの配列はＣ型ヘプシジン結合核酸の間で異なっていてもよく、これがヒトヘプシジン、特にヒトヘプシジン−２５との結合親和性に影響を与える。様々なＣ型ヘプシジン結合核酸の結合分析に基づけば、以下に記載する中央部のヌクレオチドストレッチとそのヌクレオチド配列は、個々に、より好ましくはその全体がヒトヘプシジンとの結合に不可欠である。
本発明によるＣ型ヘプシジン結合核酸を図７および８に示す。これらすべてをアプタマーまたはシュピーゲルマーとして、ヒトヘプシジン−２５、より正確にはビオチン化ヒトＤ−ヘプシジン−２５およびビオチン化ヒトＬ−ヘプシジン−２５との結合能に関してそれぞれ試験した。
Ｃ型ヘプシジン結合核酸２３８−Ｃ４−００１、２３８−Ｅ３−００１、２３８−Ｆ２−００１、２３８−Ａ４−００１および２３８−Ｅ１−００１をアプタマーとして、Ａ型ヘプシジン結合核酸２２９−Ｂ１−００１との競合プルダウンアッセイで試験した。Ｃ型ヘプシジン結合核酸はＡ型ヘプシジン結合核酸２２９−Ｂ１−００１に比べて向上した結合親和性を示した（図７）。Ｃ型ヘプシジン結合核酸２３８−Ｃ４−００１の特徴付けをさらに行った。シュピーゲルマー２３８−Ｃ４−００１の平衡結合定数ＫＤを表面プラズモン共鳴測定により決定した（ＫＤ＝０．９ｎＭ；図７）。
Ｃ型ヘプシジン結合核酸２３８−Ｃ４−００１の誘導体２３８−Ｃ４−００３、２３８−Ｃ４−００４、２３８−Ｃ４−００５、２３８−Ｃ４−００７、２３８−Ｃ４−００８、２３８−Ｃ４−００９、２３８−Ｃ４−０１１、２３８−Ｃ４−０１２、２３８−Ｃ４−０１３、２３８−Ｃ４−０１４、２３８−Ｃ４−０２４、２３８−Ｃ４−０２５および２３８−Ｃ４−０６２は、競合プルダウンアッセイまたはプラズモン共鳴測定でヘプシジン結合核酸２３８−Ｃ４−００１または２３８−Ｃ４−００６に比べて低い結合親和性を示した（図８）。しかし、ヘプシジン結合核酸２３８−Ｃ４−００２、２３８−Ｃ４−００６および２３８−Ｃ４−０１０は、同じアッセイで２３８−Ｃ４−００１とほぼ同じヒトヘプシジン−２５との結合性を示した（図８）。シュピーゲルマー２３８−Ｃ４−００２および２３８−Ｃ４−００６の平衡結合定数ＫＤを表面プラズモン共鳴測定により決定した。算出された２３８−Ｃ４−００１誘導体の平衡結合定数は、２３８−Ｃ４−００１自体で示されたものと同じ範囲にあった（図８）。
さらに、Ｃ型ヘプシジン結合核酸２３８−Ｃ４−００６の結合特異性／選択性を以下に挙げるヘプシジン分子で試験した：ヒトヘプシジン−２５、カニクイザルヘプシジン−２５、マーモセットヘプシジン−２５、マウスヘプシジン−２５、ラットヘプシジン−２５、ヒトヘプシジン−２２およびヒトヘプシジン−２０（図１０および１１）。Ｃ型ヘプシジン結合核酸２３８−Ｃ４−００６は、ヒトヘプシジン−２５、ヒトヘプシジン−２２、ヒトヘプシジン−２０およびカニクイザルヘプシジン−２５に対してはほぼ同じ結合を示し、マーモセットヘプシジン−２５、マウスヘプシジン−２５およびラットヘプシジン−２５に対しては結合性を示さない（図１０および１１）。
本発明によるＣ型ヘプシジン結合核酸は、中央部のヌクレオチドストレッチの配列５’ＧＲＣＲＧＣＣＧＧＶＧＧＡＣＡＣＣＡＵＡＵＡＣＡＧＡＣＵＡＣＫＡＵＡ３’（配列番号１８５）または５’ＧＲＣＲＧＣＣＧＧＶＡＧＧＡＣＡＣＣＡＵＡＵＡＣＡＧＡＣＵＡＣＫＡＵＡ３’（配列番号１８６）を共通にもつ。同じ結合親和性を示したＣ型ヘプシジン結合核酸２３８−Ｃ４−００１とその誘導体２３８−Ｃ４−００２、２３８−Ｃ４−００５、２３８−Ｃ４−０１０およびＣ型ヘプシジン結合核酸２３８−Ｅ３−００１、２３８−Ｆ２−００１、２３８−Ａ４−００１、２３８−Ｅ１−００１はすべて、コンセンサス配列 ５’ＧＲＣＲＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＡＣＣＡＵＡＵＡＣＡＧＡＣＵＡＣＫＡＵＡ３’（配列番号２１６）、好ましくはコンセンサス配列５’ＧＡＣＡＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＡＣＣＡＵＡＵＡＣＡＧＡＣＵＡＣＧＡＵＡ３’（配列番号１８７）を共通にもつ。
Ｃ型ヘプシジン結合核酸の第一および第二の末端ヌクレオチドストレッチは、ヌクレオチドを４個（２３８−Ｃ４−００４、２３８−Ｃ４−０１１、２３８−Ｃ４−０１２、２３８−Ｃ４−０１３、２３８−Ｃ４−０１４）、５個（２３８−Ｃ４−００３、２３８−Ｃ４−００５、２３８−Ｃ４−００６、２３８−Ｃ４−００７、２３８−Ｃ４−００８、２３８−Ｃ４−００９、２３８−Ｃ４−０１０、２３８−Ｃ４−０２４、２３８−Ｃ４−０２５、２３８−Ｃ４−０６２）、６個（２３８−Ｃ４−００２）または７個（２３８−Ｃ４−００１、２３８−Ｅ３−００１、２３８−Ｆ２−００１、２３８−Ａ４−００１、２３８−Ｅ１−００１）含み、上記ストレッチは任意に互いにハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションの際に二本鎖構造が形成される。この二本鎖構造は４〜７個の塩基対からなるものであり得る。しかし、このようなハイブリダイゼーションが分子内で必ずしも生じるわけではない。
試験した全Ｃ型ヘプシジン結合核酸の第一および第二の末端ヌクレオチドストレッチを合わせると、第一の末端ヌクレオチドストレッチおよび第二の末端ヌクレオチドストレッチの一般式は、５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＢＳＮ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）および５’ＮＳＶＳＸ４Ｘ５Ｘ６３’（第二の末端ヌクレオチドストレッチ）であり、式中、
Ｘ１はＡであるかまたは存在せず、Ｘ２はＧであるかまたは存在せず、Ｘ３はＲであるかまたは存在せず、Ｘ４はＹであるかまたは存在せず、Ｘ５はＣであるかまたは存在せず、Ｘ６はＵであるかまたは存在せず、
好ましくは、
ａ）Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＲであり、Ｘ４はＹであり、Ｘ５はＣであり、かつＸ６はＵであるか、
ｂ）Ｘ１は存在せず、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＲであり、Ｘ４はＹであり、Ｘ５はＣであり、かつＸ６はＵであるか、
ｃ）Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＲであり、Ｘ４はＹであり、Ｘ５はＣであり、かつＸ６は存在しないか、
ｄ）Ｘ１は存在せず、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＲであり、Ｘ４はＹであり、Ｘ５はＣであり、かつＸ６は存在しないか、
ｅ）Ｘ１は存在せず、Ｘ２は存在せず、Ｘ３はＲであり、Ｘ４はＹであり、Ｘ５はＣであり、かつＸ６は存在しないか、
ｆ）Ｘ１は存在せず、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＲであり、Ｘ４はＹであり、Ｘ５は存在せず、かつＸ６は存在しないか、または
ｇ）Ｘ１は存在せず、Ｘ２は存在せず、Ｘ３はＲであるかもしくは存在せず、Ｘ４はＹであるかもしくは存在せず、Ｘ５は存在せず、かつＸ６は存在しない。
しかし、結合性が最も高いＣ型ヘプシジン結合核酸は、以下のような第一と３’−末端のヌクレオチドストレッチの組合せを含む：
ａ）２３８−Ｃ４−００１、２３８−Ｅ３−００１：５’ＡＧＧＣＵＣＧ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）と５’ＣＧＧＧＣＣＵ３’（第二の末端ヌクレオチドストレッチ）、
ｂ）２３８−Ｆ２−００１：５’ＡＧＧＣＣＣＧ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）と５’ＣＧＧＧＣＣＵ３’（第二の末端ヌクレオチドストレッチ）、
ｃ）２３８−Ａ４−００１：５’ＡＧＧＣＵＵＧ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）と５’ＣＧＡＧＣＣＵ３’（第二の末端ヌクレオチドストレッチ）、
ｄ）２３８−Ｅ１−００１：５’ＡＧＡＣＵＵＧ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）と５’ＣＧＡＧＵＣＵ３’（第二の末端ヌクレオチドストレッチ）、
ｅ）２３８−Ｃ４−００２：５’ＧＧＣＵＣＧ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）と５’ＣＧＧＧＣＣ３’（第二の末端ヌクレオチドストレッチ）、
ｆ）２３８−Ｃ４−００６：５’ＧＧＣＣＧ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）と５’ＣＧＧＣＣ３’（第二の末端ヌクレオチドストレッチ）
ｇ）２３８−Ｃ４−０１０：５’ＧＣＧＣＧ３’（第一の末端ヌクレオチドストレッチ）と５’ＣＧＣＧＣ３’（第二の末端ヌクレオチドストレッチ）。
ヘプシジン結合核酸がシュピーゲルマーとして機能することを証明するために、ヘプシジン結合核酸２３８−Ｃ４−００６を、５’末端にアミノ基を含むシュピーゲルマーとして合成した。アミノ修飾したシュピーゲルマー２３８−Ｃ４−００６−５’−アミノに４０ｋＤａのＰＥＧ部分を結合させて、Ｃ型ヘプシジン結合核酸２３８−Ｃ４−００６−５’−ＰＥＧを得た。シュピーゲルマーの合成およびＰＥＧ化については実施例２に記載されている。
シュピーゲルマー２３８−Ｃ４−００６−５’−ＰＥＧの平衡結合定数ＫＤは、表面プラズモン共鳴測定により０．７６ｎＭと決定された（図１２）。
１．４ 他のヘプシジン結合核酸
Ａ型、Ｂ型およびＣ型ヘプシジン結合核酸に関係しないその他のヘプシジン結合核酸を図９に示す。これらのヘプシジン核酸の結合親和性をプラズモン共鳴測定およびＡ型ヘプシジン結合核酸２２９−Ｇ１−００１との競合結合実験により決定した。全核酸がＡ型ヘプシジン結合核酸２２９−Ｇ１−００１よりも弱い結合親和性を示した（図９）。
実施例２：アプタマーおよびシュピーゲルマーの合成および誘導体化
小規模な合成
２’ＴＢＤＭＳ ＲＮＡホスホラミダイト化学（ＤａｍｈａおよびＯｇｉｌｖｉｅ，１９９３）を用いたＡＢＩ３９４合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）での固相合成により、アプタマー（Ｄ−ＲＮＡ核酸）およびシュピーゲルマー（Ｌ−ＲＮＡ核酸）を生成した。Ｄ立体配置およびＬ立体配置のｒＡ（Ｎ−Ｂｚ）−、ｒＣ（Ａｃ）−、ｒＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−およびｒＵ−ホスホラミダイトをＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から購入し、ゲル電気泳動によりアプタマーおよびシュピーゲルマーを精製した。
大規模な合成および修飾
２’ＴＢＤＭＳ ＲＮＡホスホラミダイト化学（ＤａｍｈａおよびＯｇｉｌｖｉｅ，１９９３）を用いたＡｋｔａＰｉｌｏｔ１００（「Ａ」にウムラウト有り）合成装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）での固相合成により、シュピーゲルマーを生成した。Ｌ−ｒＡ（Ｎ−Ｂｚ）−、Ｌ−ｒＣ（Ａｃ）−、Ｌ−ｒＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−およびＬ−ｒＵ−ホスホラミダイトをＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から購入した。異なる５’−アミノ修飾物質、例えば５’−アミノ−ＨＥＧ−ＨＥＧリンカーをＡｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。未修飾シュピーゲルマーまたは５’−アミノ修飾シュピーゲルマーの合成をＬ−ｒｉｂｏＧ、Ｌ−ｒｉｂｏＣ、Ｌ−ｒｉｂｏＡまたはＬ−ｒｉｂｏＵで修飾した細孔径１０００ÅのＣＰＧ （Ｌｉｎｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｇｌａｓｇｏｗ、ＵＫ）から開始した。カップリング（１サイクル当たり１５分）には、アセトニトリル中０．３Ｍのベンジルチオテトラゾール（ＣＭＳ−Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ａｂｉｎｇｄｏｎ、ＵＫ）と、アセトニトリル中０．１Ｍの各ホスホラミダイト溶液３．５等量とを用いた。酸化−キャッピングサイクルを用いた。さらに、オリゴヌクレオチド合成用の標準的な溶媒および試薬をＢｉｏｓｏｌｖｅ社（Ｖａｌｋｅｎｓｗａａｒｄ、ＮＬ）から購入した。シュピーゲルマーをＤＭＴ−ＯＮで合成し、脱保護の後、Ｓｏｕｒｃｅ１５ＲＰＣ溶媒（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いた調製用ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した（Ｗｉｎｃｏｔｔら，１９９５）。８０％酢酸を用いて５’ＤＭＴ基を除去した（ＲＴで３０分）。次いで、２ＭのＮａＯＡｃ水溶液を加え、５Ｋの再生セルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いた接線流ろ過によりシュピーゲルマーを脱塩した。
シュピーゲルマーのＰＥＧ化
シュピーゲルマーのｉｎ ｖｉｖｏでの血漿中滞留時間を長くするために、シュピーゲルマーを５’末端で４０ｋＤａのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分と共有結合させた。
シュピーゲルマーの５’−ＰＥＧ化
ＰＥＧ化（ＰＥＧ化の方法の詳細な技術に関しては、欧州特許出願ＥＰ １ ３０６ ３８２号を参照されたい）では、精製した５’アミノ修飾シュピーゲルマーをＨ２Ｏ（２．５ｍｌ）とＤＭＦ（５ｍｌ）と緩衝液Ａ（５ｍｌ；クエン酸・Ｈ２Ｏ［７ｇ］、ホウ酸［３．５４ｇ］、リン酸［２．２６ｍｌ］および１Ｍ ＮａＯＨ［３４３ｍｌ］を混合し、水を加えて最終体積１１にして調製；１Ｍ ＨＣｌでｐＨ＝８．４に調整）の混合物に溶かした。
シュピーゲルマー溶液のｐＨを１Ｍ ＮａＯＨにより８．４にした。次いで、最大収率が７５〜８５％に達するまで、４０ｋＤａのＰＥＧ−ＮＨＳエステル（Ｊｅｎｋｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｌｌｅｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）を３７℃で０．２５等量を３０分ごとに６回加えた。ＰＥＧ−ＮＨＳエステルを加える間、反応混合物のｐＨを１Ｍ ＮａＯＨで８〜８．５に維持した。
反応混合物に尿素溶液（８Ｍ）４ｍｌと緩衝液Ｂ（Ｈ２Ｏ中０．１Ｍの酢酸トリエチルアンモニウム）４ｍｌとを混合し、これを９５℃まで１５分間加熱した。次いで、アセトニトリル勾配（緩衝液Ｂ；緩衝剤液Ｃ：アセトニトリル中０．１Ｍの酢酸トリエチルアンモニウム）を用いたＳｏｕｒｃｅ１５ＲＰＣ溶媒（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によるＲＰ−ＨＰＬＣでＰＥＧ化シュピーゲルマーを精製した。５％の緩衝液Ｃで過剰なＰＥＧが溶出し、１０〜１５％の緩衝液ＣでＰＥＧ化シュピーゲルマーが溶出した。純度が９５％を超える（ＨＰＬＣによる評価）生成物画分を合わせ、４０ｍｌの３Ｍ ＮａＯＡＣと混合した。ＰＥＧ化シュピーゲルマーを接線流ろ過（５Ｋの再生セルロース膜、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）により脱塩した。
実施例３：ヘプシジンに対する結合定数の決定（プルダウンアッセイ）
直接プルダウンアッセイ
ビオチン化ヒトＤ−ヘプシジン−２５（配列番号７）に対するヘプシジン結合核酸のアプタマー（Ｄ−ＲＮＡ核酸）としての親和性をプルダウンアッセイ形式で３７℃で測定した。アプタマーは、［γ−３２Ｐ］標識ＡＴＰ（Ｈａｒｔｍａｎｎ Ａｎａｌｙｔｉｃ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて５’−リン酸をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により標識したものであった。標識アプタマーの比放射能は２００，０００〜８００，０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌであった。低濃度で平衡状態に達するように、アプタマーを変性および再結合後に、選択緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１３７ｍＭ ＮａＣｌ；５ｍＭ ＫＣｌ；１ｍＭ ＭｇＣｌ２；１ｍＭ ＣａＣｌ２；０．１％［ｗ／ｖｏｌ］Ｔｗｅｅｎ−２０）中、濃度２０ｐＭ、３７℃で様々な量のビオチン化ヒトＤ−ヘプシジンとともに２〜１２時間インキュベートした。使用済みのプラスチック製品または固定化マトリックスの表面に結合パートナーが吸着するのを防ぐために、ヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）１０μｇ／ｍｌと酵母ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＵＳＡ）１０μｇ／ｍｌを選択緩衝液に補充した。ビオチン化ヒトＤ−ヘプシジンの濃度範囲を３２ｐＭ〜５００ｎＭに設定し、総反応体積は１ｍｌであった。ビオチン化ヒトＤ−ヘプシジンおよびアプタマーとビオチン化ヒトＤ−ヘプシジンとの複合体を、選択緩衝液で予め平衡化し総体積１２μｌで再懸濁させたニュートラアビジンまたはストレプトアビジンＵｌｔｒａｌｉｎｋ Ｐｌｕｓ粒子（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＵＳＡ）６μｌで固定化した。粒子をサーモミキサー中、各温度で３０分間、懸濁状態に保った。上清の分離と適当な洗浄の後に、固定化された放射能をシンチレーションカウンターで定量した。結合の百分率をビオチン化ヒトＤ−ヘプシジンの濃度に対してプロットし、１：１の化学量論を仮定してソフトウェアアルゴリズム（ＧＲＡＦＩＴ；Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ；Ｓｕｒｒｅｙ Ｕ．Ｋ．）を用いて解離定数を得た。
アプタマー競合プルダウンアッセイ
様々なヘプシジン結合核酸のアプタマーを比較するために、競合により序列化するアッセイを行った。これを行うために、利用できる最も類縁のアプタマーを放射性標識し（上を参照されたい）参照物質として用いた。変性および再結合後に、これを０．８ｍｌの選択緩衝液中、ニュートラアビジンアガロースまたはストレプトアビジンＵｌｔｒａｌｉｎｋ Ｐｌｕｓ（ともにＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）へ固定化および競合なしでの洗浄を行った後のビオチン化ヒトＤ−ヘプシジン−２５との結合が約５〜１０％となる条件下、３７℃でビオチン化ヒトＤ−ヘプシジンとともにインキュベートした。変性および再結合した過剰な非標識Ｄ−ＲＮＡアプタマー変異体を様々な濃度（例えば、１０、５０および２５０ｎＭ）まで標識参照アプタマーとともに加え、結合反応を並行させた。被検アプタマーが標的との結合に関して参照アプタマーと競合するため、結合特性に従って結合シグナルが減少した。次いで、このアッセイで最も活性が高かったアプタマーを新たな参照物質として、さらなるアプタマー変異体の比較分析に用いることができた。
シュピーゲルマー競合プルダウンアッセイ
さらに、ヘプシジン結合シュピーゲルマーの親和性を解析するために競合プルダウンアッセイを行った。これを行うために、ビオチン化ヒトＬ−ヘプシジン−２５と結合するシュピーゲルマーを用いた。シュピーゲルマーの５’末端にＤ立体配置のグアノシン残基をさらに２個加えることで、シュピーゲルマーをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより放射性標識することができた（上を参照されたい）。変性および再結合後に、標識シュピーゲルマーおよび０．０３２〜５００ｎＭの範囲の競合分子（様々なヘプシジン種、切断型のヘプシジンまたはシュピーゲルマー；下を参照されたい）の５倍希釈物一組を、選択緩衝液０．８ｍｌ中、３７℃で２〜４時間、一定量のビオチン化ヒトＬ−ヘプシジンとともにインキュベートした。選択されたペプチド濃度において、最終的に最低競合分子濃度で約５〜１０％の放射性標識シュピーゲルマーの結合が得られるようにした。１つの型の競合プルダウンアッセイでは、変性および再結合した過剰な非標識Ｌ−ＲＮＡシュピーゲルマー変異体を競合分子として使用し、未修飾型およびＰＥＧ化型のものを試験した。別のアッセイ方法では、各種の種由来の非ビオチン化Ｌ−ヘプシジン−２５（例えばヒトＬ−ヘプシジン−２５、カニクイザルＬ−ヘプシジン−２５、マーモセットＬ−ヘプシジン−２５またはラットＬ−ヘプシジン−２５など）または非ビオチン化Ｎ末端切断型Ｌ−ヘプシジン−２０およびＬ−ヘプシジン−２２を、シュピーゲルマーとの結合に関してビオチン化Ｌ−ヘプシジンと競合させた。ビオチン化Ｌ−ヘプシジン−２５および結合シュピーゲルマーを１．５〜３μｌのストレプトアビジンＵｌｔｒａｌｉｎｋ Ｐｌｕｓマトリックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＵＳＡ）に固定化し、洗浄およびシンチレーションカウントを行った後（上を参照されたい）、結合した放射性標識シュピーゲルマーの正規化した百分率を競合分子の対応する濃度に対してプロットした。得られた解離定数をＧｒａＦｉｔソフトウェアを用いて算出した。
実施例４：表面プラズモン共鳴測定による結合解析
Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、ビオチン化ヒトＤ−ヘプシジン−２５に対するヘプシジン結合核酸のアプタマーの結合およびビオチン化ヒトＬ−ヘプシジン−２０に対するヘプシジン結合核酸のシュピーゲルマーの結合を、ヒト、ラットおよびマウスＬ−ヘプシジン２５に対する結合とともに解析した。
機器を３７℃の持続温度に設定した。各実験の開始前に、製造者の使用説明書に従いＤＥＳＯＲＢ法を用いてＢｉａｃｏｒｅを洗浄した。メンテナンスチップをドッキングした後、ＤＥＳＯＲＢ溶液１（０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、ＳＤＳ）、ＤＥＳＯＲＢ溶液２（５０ｍＭグリシン、ｐＨ９．５）、最後に脱気したＭｉｌｌｉＱ水で連続的に機器を準備した。次いで、０．１Ｍ ＮａＯＣｌを用いてＳＡＮＡＴＩＺＥ法を実施してシステムを準備した後、ＭｉｌｌｉＱ水で準備した。
ビオチン化したヒトＤ−ヘプシジン−２５、ヒトＬ−ヘプシジン−２０、ならびにヒト、ラットおよびマウスＬ−ヘプシジン−２５（ペプチドはすべてＢＡＣＨＥＭ社のカスタム合成による）をねじ口バイアル中、１ｍｇ／ｍｌの無脂肪酸ＢＳＡとともに１ｍＭの濃度で水に溶かし、使用時まで４℃で保管した。
カルボキシメチル化デキストランマトリックスを備えたセンサーチップ（Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５、ＧＥ、ＢＲ−１０００−１４）をドッキングした後、Ｂｉａｃｏｒｅ機器をＭｉｌｌｉＱ水、次いでＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ液［ｐＨ７．４］、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０；ＧＥ、ＢＲ−１００１−８８）で準備し、安定なベースラインがみられるまで平衡化した。ペプチドが他のフローセルにキャリーオーバーしないように、フローセル（ＦＣ）をフローセル４から始めてフローセル１まで固定化した。
０．４Ｍ ＥＤＣ（Ｈ２Ｏに溶かした１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド；ＧＥ、ＢＲ−１０００−５０）と０．１Ｍ ＮＨＳ（Ｈ２Ｏに溶かしたＮ−ヒドロキシスクシンイミド；ＧＥ、ＢＲ−１０００−５０）の１：１混合物１００μｌをＱＵＩＣＫＩＮＪＥＣＴコマンドを用いて１０μｌ／分の流量で注入した。ＮＨＳ／ＥＤＣ注入後のＲＵの増加（ＣＭ５チップでは通常、５００〜６００ＲＵ）によりフローセルの活性化をモニターした。
可溶性ニュートラアビジンを水に溶かして１ｍｇ／ｍｌの濃度とし、ＨＢＳ−ＥＰで５０μｇ／ｍｌに希釈した後、ＭＡＮＵＡＬＩＮＪＥＣＴコマンドを用いて１０μｌ／分の流量で注入した。共有結合で固定化されたニュートラアビジンの観察された最大量は約１０．０００〜１５．０００ＲＵであった。１Ｍエタノールアミン塩酸塩（ＧＥ、ＢＲ−１０００−５０）７０μｌを１０μｌ／分の流量で注入することによりフローセルをブロックした。通常この方法により、非共有結合で結合しているペプチド／タンパク質が除去される。５０ｍＭ ＮａＯＨ溶液を１０〜３０μｌを注入することにより、非共有結合で結合しているニュートラアビジンを除去した。ビオチン化したヒトＤ−ヘプシジン−２５、ヒトＬ−ヘプシジン−２０、ならびにヒト、ラットおよびマウスＬ−ヘプシジン−２５をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で直接希釈して最終濃度１０〜２０ｎＭとし、直ちにボルテックスした。この試料１０００μｌを直径９ｍｍのガラスバイアル（Ｇｌａｓｓ Ｖｉａｌｓ、直径９ｍｍ、ＧＥ、ＢＲ−１００２−０７）に移し、ＭＡＮＵＡＬＩＮＪＥＣＴコマンドを用いて１０μｌ／分の流量で注入した。結合実験では最大５０００反応単位（ＲＵ）、速度論的評価では５００〜１５００ＲＵのビオチン化したヒトＤ−ヘプシジン−２５、ヒトＬ−ヘプシジン−２０、ならびにヒト、ラットおよびマウスＬ−ヘプシジン−２５をフローセルに固定化した。次いで、ビオチン化したヒトＤ−ヘプシジン−２５、ヒトＬ−ヘプシジン−２０、ならびにヒト、ラットおよびマウスＬ−ヘプシジン−２５とＢｉａｃｏｒｅチューブなどの表面との非特異的相互作用によるビオチン化したヒトＤ−ヘプシジン−２５、ヒトＬ−ヘプシジン−２０、ならびにヒト、ラットおよびマウスＬ−ヘプシジン−２５のキャリーオーバを防ぐために、フローセルを１Ｍ ＮａＣｌ（Ａｍｂｉｏｎ、カタログ番号ＡＭ９７５９）で洗浄した。ブロックした対照フローセルとしてＦＣ１を用いた。
最後に、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で１：１０に希釈した飽和ビオチン溶液（Ｂｉｏｔｉｎ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｂ−４５０１ Ｌｏｔ ６８Ｈ１３７３）２０μｌを２０μｌ／分の流量で注入することにより、全センサーフローセル（ＦＣ１からＦＣ４まで）をブロックした。脱気したランニング緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２および０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）でセンサーチップを２回準備し、ベースラインが安定するまで３０μｌ／分で平衡化した。
解析を行うためには通常、ヘプシジン結合核酸のアプタマー／シュピーゲルマーを水で希釈して１００μＭのストック濃度（ＵＶ測定による定量）とし、水浴またはサーモミックスで３０秒間、９５℃まで加熱し、氷上で急速に冷却して、均一に溶解した溶液を確保した。
ランニング緩衝液で希釈した１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６３、７．８、３．９および０ｎＭの濃度の一連のアプタマー注入により、動力学的パラメータおよび解離定数を評価した。全実験において、会合時間を３６０秒、解離時間を３６０秒に定め、Ｋｉｎｊｅｃｔコマンドを用いて流量３０μｌ／分、３７℃で解析を行った。アッセイはダブルリファレンスで行い、ＦＣ１を（ブロックされた）表面対照として使用し（各アプタマー濃度のバルク効果）、分析物なしでの一連の緩衝液注入により緩衝液自体のバルク効果を決定した。データの解析および解離定数（ＫＤ）の算出を、Ｌａｎｇｍｕｉｒの１：１化学量論適合アルゴリズムを用いたＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．０ソフトウェア（ＢＩＡＣＯＲＥ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）により行った。
実施例５：ｉｎ ｖｉｖｏでのヘプシジン結合シュピーゲルマーの活性
慢性疾患による貧血に関しては現在のところ、炎症誘発性サイトカイン、特にＩＬ−６により肝細胞でのヘプシジンの合成および放出が刺激されると考えられている。次いでヘプシジンが、鉄輸送体であるフェロポーチンを発現する様々な種類の細胞と結合する。この相互作用によりヘプシジン−フェロポーチン複合体の内部移行および分解が誘導され、次いで血清鉄が減少する。血清鉄の慢性的な減少が赤血球生成に悪影響を及ぼし、最終的には貧血が発症する。ヒトヘプシジン−２５がマウスにおいて血清鉄減少を誘導するという既知の特性（Ｒｉｖｅｒａ，２００５）を炎症による貧血のモデルとして用いた。シュピーゲルマーの活性をｉｎ ｖｉｖｏで試験するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでヒト−ヘプシジン−２５により低鉄血症状態を誘導した。このモデルでシュピーゲルマーを特徴付けるために、マウスにシュピーゲルマーによる予防的処置を施行してｈｕ−ヘプシジンの作用を阻止した。
方法
雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（Ｅｌｅｖａｇｅ Ｊａｎｖｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ、６週齢、１群当たりｎ＝６〜７）に抗ヘプシジンシュピーゲルマー（１０〜２０ｍｌ／ｋｇ体重）または溶媒（５％グルコース、１０〜２０ｍｌ／ｋｇ体重）の単回静脈内注射を施行した。３０分後に合成ヒトヘプシジン−２５（Ｂａｃｈｅｍ、Ｗｅｉｌ ａｍ Ｒｈｅｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号Ｈ−５９２６）を１〜２ｍｇ／ｋｇ体重の用量で腹腔内に注射した（１０ｍｌ／ｋｇ体重）。ヘプシジン注射の２時間後に血液を採取した。鉄量決定および全血球計算用に血清および血漿の試料をそれぞれ得た。各個体の血清鉄、ヘモグロビン値、ヘマトクリット値、白血球数、赤血球数、血小板数、平均血球体積および平均赤血球ヘモグロビン値を決定した。
結果
合成ヒト−ヘプシジン−２５の注射により血清鉄の急激な減少がみられた。注射の２時間後に血清鉄濃度は溶媒処置個体の値の５６％に減少した。上記ｉｎ ｖｉｖｏでの結果は、これよりヘプシジン用量の高いほぼ同じ実験で約２５％の減少を報告したＲｉｖｅｒａら（Ｒｉｂｅｒａら）により発表されたデータと一致するものである。図１４に示されるように、ヒトヘプシジンを注射する前にシュピーゲルマー２３９−Ｄ４−００８−５’−ＰＥＧを投与することにより、血清鉄の減少が完全に阻止される（対照の９８％）。
実施例６：ヒトインターロイキン−６で刺激したカニクイザルにおけるヘプシジン結合シュピーゲルマーの活性
慢性疾患による貧血におけるインターロイキン−６（ＩＬ−６）の主な役割は、ＩＬ−６受容体抗体のトシリズマブを用いて明らかにされている。この抗体による治療の有効性はキャッスルマン病の患者（Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ，２００８）およびカニクイザルの関節炎モデル（Ｈａｓｈｉｚｕｍｅ，２００９）で示されている。ＩＬ−６が非ヒト霊長類においてヘプシジン分泌を誘導して貧血をもたらすという既知の特性を炎症による貧血の別のモデルとして用いた（Ａｓａｎｏ，１９９０；Ｋｌｕｇ，１９９４）。抗ヘプシジンシュピーゲルマーの有効性を示す評価項目として、パラメータであるヘモグロビン値の代わりに血清鉄含有量を選択した。カニクイザルにおいてヒト組換えＩＬ−６により低鉄血症状態を誘導した。このモデルは、合成ヒトヘプシジンを用いた他のすべての実験と同様に抗ヘプシジンシュピーゲルマーも内因性ヘプシジンと結合するということを示すのに重要なものであった。シュピーゲルマーの活性をｉｎ ｖｉｖｏで試験するために、カニクイザルにおいてヒト−組換えＩＬ−６により低鉄血症状態を誘導した。このモデルでシュピーゲルマーを特徴付けるために、カニクイザルにシュピーゲルマーによる予防的処置を施行してカニクイザル−ヘプシジンの作用を阻止した。
方法
雄性カニクイザル（Ｒｏｂｅｒｔｏ Ｃ．Ｈａｒｔｅｌｕｓｔ、Ｔｉｌｂｕｒｇ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、３４〜３８か月齢、１群当たりｎ＝３）に抗ヘプシジンシュピーゲルマー（１ｍｌ／ｋｇ体重）または溶媒（５％グルコース、１ｍｌ／ｋｇ体重）の単回静脈内注射を施行した。３０分後に組換えヒトＩＬ−６（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を１０μｇ／ｋｇ体重の用量で皮下に注射した（１ｍｌ／ｋｇ体重）。ＩＬ−６注射の８時間後に血液を採取した。鉄量決定および全血球計算用に血清および血漿の試料をそれぞれ得た。各個体の血清鉄、ヘモグロビン値、ヘマトクリット値、白血球数、赤血球数、血小板数、平均血球体積および平均赤血球ヘモグロビン値を決定した。
結果
組換えヒトＩＬ−６の注射により血清鉄の減少がみられた。注射の８時間後に血清鉄濃度は投与前の溶媒処置個体／ＩＬ−６処置個体の値の２７％に減少した。図１５に示されるように、ヒトＩＬ−６を注射する前にシュピーゲルマー２３８−Ｄ４−００８−５’−ＰＥＧを投与することにより、血清鉄の減少が完全に阻止される。
実施例７：血液透析ろ過でのヘプシジン結合核酸の使用
この実験では、分子質量１４．６０２ダルトンのヘプシジン結合核酸（シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｈ９４−００２、ＰＥＧ修飾されていないシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｈ９４の誘導体）、透過性の高い透析膜および高対流条件を用いて、ヒト全血のｉｎ ｖｉｔｒｏでの血液透析ろ過におけるシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｈ９４−００２の除去を示した。
方法
シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｈ９４−００２を５％グルコースに溶かし、１０ｍｇ／ｍｌのストック溶液とした。
使用した透析器はＰｈｙｌｔｈｅｒ ＨＦ１７ＳＤ、Ｆａ．Ｂｅｌｌｃｏ（Ｍｉｒａｎｄｏｌａ、Ｉｔａｌｙ、表面積１．７ｍ２、蒸気滅菌済み、ロット：０９０３１７０００５）であった。ＥＮ １２８３に記載されている手順に従って、ヒト供血者の血液による実験を行った。簡潔に述べれば、実験開始時に供血者の全血プール（１０Ｕ／ｍｌのヘパリン）をヘマトクリット値３２±２％（実際の平均：２９．８±０．２）に標準化した。実験開始時の実際の総タンパク質濃度の平均は６７±１ｇ／ｌであった。Ｎｉｋｋｉｓｏ透析モニターＤＢＢ−０３（Ｎｉｋｋｉｓｏ Ｍｅｄｉｃａｌ ＧｍｂＨ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により生理食塩水１Ｌを１回通過させ、生理食塩水１Ｌを再循環させて（１００ｍｌ／分、２０分間）、透析器を洗浄した。
上記のように標準化した血液５２４ｍｌを用いて血液透析ろ過実験を３回行った。ＱＢ（ＱＢは血流速度）は５００ｍｌ／分、ＱＤ（ＱＤは透析液流速）は７００ｍｌ／分、ＱＦ（Ｑｆはろ過流速）は１００ｍｌ／分であった。透析実験開始後、条件の平衡化を２８分間行った。２８分後に、比較タンパク質であるβ２−ミクログロビン（Ｍｒ＝１１．８００）と、シスタチンＣ（Ｍｒ＝１３．３００）と、ミオグロビン（Ｍｒ＝１７．６００）と、レチノール結合タンパク質（Ｍｒ＝２１．０００）とを含有する尿毒症患者の濃縮血液ろ液と事前に混合したシュピーゲルマーストック溶液を回路に加えた。したがって、モル質量を１４．６０２と仮定すれば、２８分後の時点での血液プール中のシュピーゲルマー濃度は３μＭであった。３０分後、３２分後および３４分後の時点で、透析器の注入口（Ｃａ）および排出口（Ｃｖ）から試料を採取した。動力学的なクリアランス算出による測定精度の向上が得られる可能性があることから、３１分後、３３分後および３５分後に透析器の注入口（Ｃａ）から追加の試料を採取した。シュピーゲルマーの回収率を決定することができるように、実験開始の３０分後から６０分後の間に全透析液体積（１５Ｌ）からアリコートを採取した。
タンパク質濃度をレーザーネフェロメトリー（ＢＮ ＰｒｏＳｐｅｃ、Ｄａｄｅ−Ｂｅｈｒｉｎｇ、Ｍａｒｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により測定した。下の表および図にタンパク質β２−ミクログロビン、シスタチンＣ、ミオグロビンおよびレチノール結合タンパク質のクリアランスを、ｎ＝９（３回の実験のそれぞれ３つの時点）から算出された平均クリアランスとして表す。
国際公開第２００８／０５２７７４号に記載されているサンドイッチハイブリダイゼーション法によりシュピーゲルマーの濃度を測定した（実施例９）。
血漿水クリアランス（ａ／ｖクリアランス）を以下の方程式により算出した：
Ｃｌ血漿＝ＱＢ（１−０．０１０７×ＴＰ）（（ＳＰＣ×Ｈｃｔ＋（１−Ｈｃｔ））（（Ｃａ−Ｃｖ）／Ｃａ）＋（ＱＵ×Ｃｖ／Ｃａ））［ｍｌ／分］
（式中、ＱＢは血流速度、ＱＵＦは限外ろ過速度（１０ｍｌ／分）、ＣｖおよびＣａは静脈（透析器排出口）および動脈（透析器注入口）の溶質濃度、Ｈｃｔは試料採取時の患者のヘマトクリット値、ＴＰは試料採取時の総タンパク質濃度［ｇ／Ｌ］である）。血液細胞からの溶質移行を説明するために、溶質分配係数（略語：ＳＰＣ）（β２ｍ、シスタチンＣ、ミオグロビン、レチノール結合タンパク質に対するもの）を０とした。
結果
Figure 2014503187
考察
タンパク質β２−ミクログロビン（Ｍｒ１１．８００）、シスタチンＣ（Ｍｒ１３．３００）、ミオグロビン（Ｍｒ１７．６００）およびレチノール結合タンパク質（Ｍｒ２１．０００）のクリアランスを決定し、透析実験の妥当性を示した。タンパク質クリアランスは使用した透析器に関して知られている範囲内にある。シュピーゲルマーは球状タンパク質としてふるまうわけではなく、このことはクリアランス値が分子量のほぼ同じタンパク質マーカー（例えば、シスタチンＣ）の範囲ではなく、レチノール結合タンパク質の範囲にあることを説明するものである。
用いた条件下では、分子質量１４．６０２のシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｈ９４−００２の透析液中へのクリアランスおよび除去を明確に測定することができた。透析液からの回収量は約５０％であった。
実施例８：固体担体に固定化したシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｈ９４を用いた、ヘプシジンを含有するヒト血清試料からのヘプシジンの除去
ヘプシジン結合核酸をアフェレーシス処置に使用することができるか否かを試験するために、ヘプシジン結合シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノを用いた。ＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノはＮＯＸ−Ｈ９４シュピーゲルマー配列を５’アミノ修飾した誘導体であり、分子のシュピーゲルマー部分とアミノ官能基との間にヘキサエチレングリコール部分が３つ挿入されている。このアミノ官能基はシュピーゲルマーとＳｅｐｈａｒｏｓｅ担体とを共有結合させるための柄として用いられる。
本明細書に記載されている実験では、ヘプシジン結合シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノを、活性化された固体担体（この場合、ＮＨＳ−エステルで活性化されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ担体）に結合させた。結合工程の後、生体液の含有物が共有結合できないように、担体の活性化された部位をブロックする物質で担体を処理した。次いで、担体を洗浄してから、結合溶液、ブロッキング液および洗浄液中のＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノの量を、ＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノの吸光度単位（略語：ＯＤ）を算出することにより決定した（図１６）。結合反応の副生成物であるＮ−ヒドロキシスクシンイミドも２６０ｎｍでの吸光度をもつため、陰イオン交換ＨＰＬＣクロマトグラムにより結合溶液、ブロッキング液および洗浄液を解析して（図１７）、溶液中の残りの物質に起因する２６０ｎｍでの吸光度の百分率を決定する必要があった（図１６）。担体と結合したヘプシジン結合シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノの量を、出発物質であるＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノの量と、結合溶液、ブロッキング液および洗浄液中で決定されたＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノの量との差として算出した（図１６）。
次いで、担体を様々な量のヘプシジンを加えたヒト血清とともにインキュベートした。インキュベーション後、競合ＥＬＩＳＡアッセイを用いて上清中のヘプシジンの量を決定した。ビーズを遠心分離で圧縮し上清を慎重に除去することにより、ビーズから上清を除去した。次いで担体を、脱脂し、脱線維素し、ヘプシジン除去したヒト血清で３回洗浄した。この洗浄液を合わせてヘプシジン量を決定した。
ヘプシジン添加ヒト血清と、ＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノが結合していないＳｅｐｈａｒｏｓｅ担体とのインキュベーションを繰り返すことにより、担体との非特異的なヘプシジン結合の決定を検証した。生体液の含有物が共有結合できないように、エタノールアミンで処理することにより、この固体担体試料の活性化ＮＨＳエステル基をブロックした。ブロックした担体を、ＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノが結合した担体で使用したときと同量のヘプシジンを加えたヒト血清とともにインキュベートした。インキュベーション後、競合ＥＬＩＳＡアッセイを用いて上清中のヘプシジン量を決定した。ビーズを遠心分離で圧縮し上清を慎重に除去することにより、ビーズから上清を除去した。次いで担体を、脱脂し、脱線維素し、ヘプシジン除去したヒト血清で３回洗浄した。この洗浄液を合わせてヘプシジン量を決定した。
プロトコル
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ担体へのシュピーゲルマーの固定化
ＮＨＳ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（１６〜２３μｍｏｌ ＮＨＳ／ｍｌ溶媒、＃１７−０９０６−０１、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ）２００μｌを１ｍＭの冷ＨＣｌ（１ｍＬ）で洗浄した。担体を遠心分離で圧縮し上清を除去することにより、ＨＣｌ溶液を除去した。この担体に、シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノをＴｈｅｏｒｅｌｌ ＆ Ｓｔｅｎｈａｇｅｎ’ｓ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ緩衝液ｐＨ８．２５（３３ｍＭクエン酸ナトリウム、３３ｎＭリン酸ナトリウム、５７ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．２５）に溶かした０．３１４μｍｏｌ／ｍｌ溶液（３１．４ｎｍｏｌ、１２．３ＯＤ）１００μｌを直ちに加えた。懸濁液を２５℃で２時間、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｃｏｍｆｏｒｔ機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でインキュベートし、担体を圧縮して上清を除去した。結合溶液である上清をさらなる解析用に保存した。次いで、担体をＰＢＳ緩衝液で洗浄した後（３×１００μｌ）、０．５Ｍエタノールアミンと０．５Ｍ ＮａＣｌとを含有する溶液（ｐＨ８．３）で予洗した（１ ×３００μｌ）。合わせた洗浄液である上清をさらなる解析用に保存した。０．５Ｍエタノールアミンと０．５Ｍ ＮａＣｌとを含有する溶液（ｐＨ８．３）３００μｌを加え、２５℃で２時間、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｃｏｍｆｏｒｔ機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でインキュベートすることにより担体のＮＨＳエステル活性化部位をブロックし、担体を圧縮して上清であるブロッキング液を採取し、解析用に保存した。次いで、担体を滅菌水で洗浄した後（１×１００μｌ）、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）（Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ、ＢｉｏＣｈｅｍｉｃａ）および０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）により３×１００μｌで交互に洗浄した。最後に担体を１×３００μｌで滅菌水により洗浄し、洗浄液を合わせた。さらなる解析用に保存しておいた結合溶液の上清、合わせた洗浄液およびブロッキング液を以下のように処理した：２６０ｎｍでの吸光度単位を測定し（図１６）、次いで、試料を陰イオン交換ＨＰＬＣ（ＤＮＡ−Ｐａｃ ＰＡ２００カラム、４×２５０ｍｍ、Ｄｉｏｎｅｘ社製、移動相Ａ：２５ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＮａＣｌＯ４、１０％ＡＣＮ；移動相Ｂ：２５ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５００ｍＭ ＮａＣｌＯ４、０％ＡＣＮ。勾配：２０〜５５％のＢで１９分間、カラム温度８５℃）で解析し、ＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノに起因する試料中のＯＤの百分率を決定した。クロマトグラムの例に関しては図１７を参照されたい。担体と結合したヘプシジン結合シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノの量を、出発物質であるＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノの量と、結合溶液、ブロッキング液および洗浄液中で決定されたＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノの量との差として算出した（図１６）。
対照として使用するブロックされた担体の調製
ＮＨＳ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（１６〜２３μｍｏｌ ＮＨＳ／ｍｌ溶媒、＃１７−０９０６−０１、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）１ｍＬを５ｍＬの使い捨てカラム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に入れた。イソプロパノール保存液を取り除き、０．５Ｍエタノールアミンと０．５Ｍ ＮａＣｌとを含有する溶液（ｐＨ８．３）２ｍＬで担体を洗浄した。溶液を取り除き、再び０．５Ｍエタノールアミンと０．５Ｍ ＮａＣｌとを含有する溶液（ｐＨ８．３）２ｍＬを加えた。カラムを密閉して４時間振盪し、溶液を取り出し、担体を滅菌水で洗浄した後（１×２ｍＬ）、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）（Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ，ＢｉｏＣｈｅｍｉｃａ）および０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）により４×３ｍＬで交互に洗浄した。最後に担体を１×３ｍＬで滅菌水により洗浄した。
ヘプシジン添加ヒト血清の調製
ヒトプール血漿（リチウム−ヘパリン−血漿、個々の女性１５人および男性１５人の血漿に由来するプール、ＰＬＨＩ−１２３−Ｅ、ロット番号Ｅ７０８２３８およびＥ８０８２３８、Ｓｅｒａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ＵＫ）に、水に溶かしたヘプシジンの１０μＭストック溶液を用いてヘプシジン−２５（ロット番号１０２５８５４、Ｂａｃｈｅｍ）を加え、最終濃度を別個に５０ｎＭおよび５００ｎＭとした。
担体とヘプシジン添加ヒト血清とのインキュベーション
ＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノと結合した担体１５μＬおよびエタノールアミンでブロックしたＳｅｐｈａｒｏｓｅ担体（ＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノは結合していない）１５μＬをそれぞれ、５０ｎＭまたは５００ｎＭヘプシジン（「負荷ヘプシジン」と呼ぶ、図２０Ｂを参照されたい）を添加した血漿１５０μＬとともに、サーモシェーカー中、２５℃、５５０ｒｐｍで攪拌しながら２時間インキュベートした。インキュベーション後、試料を小型遠心分離機で５秒間遠心分離し、上清を新たなチューブに移した（「未結合ヘプシジン」と呼ぶ、図２０Ｂを参照されたい）。担体を２回活性炭処理済みでヘプシジンを含まない、脱線維素および脱脂を行ったヒト血清（＃１００５．ＨＳｄｃｓ，Ｎｏｖａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、ＵＳＡ）５０μＬで３回洗浄し、洗浄画分を新たなチューブにまとめて採取した（「洗浄」と呼ぶ、図２０Ｂを参照されたい）。
ヒト血清中のヘプシジンレベルの決定
Ｂａｃｈｅｍ社のＥＬＩＳＡキット（ヘプシジン−２５、ヒト、ＥＩＡ、ヒト血清／血漿用のＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ−ｆｒｅｅキット、Ｂａｃｈｅｍ Ｌｔｄ．、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＬＬＣ、Ｓ−１３３７）を用いて試料中のヘプシジンを決定した。製造者のプロトコルＩＩに従ってＥＬＩＳＡを行ったが、プロトコルと異なる部分のみを以下に記す。図１８に記載されているように、１０％ブランクマトリックスをアッセイ希釈液（ＢＤ Ｂｉｏ ＢＤ ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＯｐｔＥＩＡ（商標）＃５５５２１３）で段階希釈することにより１０点標準曲線を作成した。図１９に示されるように、品質管理試料を、ヘプシジンをブランクマトリックスに加えた１０倍ストック溶液として調製した。品質管理試料は、検量曲線に従って高レベル（ＨｉＱＣ）、中レベル（ＭｅＱＣ）および低レベル（ＬｏＱＣ）の試料として設計され、これに定量上限（ＵＬＯＱ）試料および定量下限（ＬＬＯＱ）試料が加えられている。アッセイ用には、ストックをマトリックスを含まないアッセイ希釈液で１：１０に希釈した（ストック溶液２５μＬ＋アッセイ希釈液２２５μＬ）。図１９に示されるように、被検試料をその予想されるヘプシジン濃度に合わせて希釈した。
結果
実験の節に記載されているプロトコルを用いて、ヘプシジン結合核酸であるシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノを共有結合により担体と効率的に結合させた。製造者のプロトコルに従いエタノールアミン溶液を用いて担体の活性部位をブロックした。この後に担体を洗浄した。２６０ｎｍでの吸光度単位（略語：ＯＤ）を測定することにより、担体と結合したＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノの量を決定することができたが（図１６）、このとき、結合反応の副生成物であるＮ−ヒドロキシスクシンイミドも２６０ｎｍでの吸光度をもつため、さらに結合溶液、合わせた洗浄液およびブロッキング液も陰イオン交換ＨＰＬＣクロマトグラムにより解析して（図１７）、溶液中に残ったＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノに起因する２６０ｎｍでの吸光度の百分率を決定した（図１６および１７）。図からわかるように、測定されたＯＤのうちＮ−ヒドロキシスクシンイミドを除いたＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノ出発物質に相当するＯＤの百分率は低く（図１６）、出発物質ＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノの１２．３ＯＤ（３１．４ｎｍｏｌに相当）のうち９．４ＯＤ（２４ｎｍｏｌに相当）がＮＨＳ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅと結合していた。これは１ｍＬのＳｅｐｈａｒｏｓｅに１２０ｎｍｏｌのＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧが負荷されたことに相当する（図１６）。
ＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノと結合した担体１５μＬ（結合したＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノ３ｎｍｏｌに相当）を、５０ｎＭのヘプシジン（０．００７５ｎｍｏｌのヘプシジンに相当）または５００ｎＭのヘプシジン（０．０７５ｎｍｏｌのヘプシジンに相当）を添加した各血漿１５０μＬとともにインキュベートした（図２０Ａ、「反応Ａ」および「反応Ｂ」の行を参照されたい）。エタノールアミンでブロックされたＳｅｐｈａｒｏｓｅ担体（ＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノ修飾が結合していない）をプロトコルに従い調製して対照として使用し、ヘプシジンと担体との非特異的結合をモニターした。エタノールアミンでブロックされたＳｅｐｈａｒｏｓｅ担体（ＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノが結合していない）１５μＬを、５０ｎＭのヘプシジン（０．００７５ｎｍｏｌのヘプシジンに相当）または５００ｎＭのヘプシジン（０．０７５ｎｍｏｌのヘプシジンに相当）を添加した各血漿１５０μＬとともにインキュベートした（図２０Ａ、「反応Ｃ」および「反応Ｄ」の行を参照されたい）。ヘプシジンを添加した血漿と、ＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノが結合した担体１５μＬまたはエタノールアミンでブロックされたＳｅｐｈａｒｏｓｅ担体（ＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノが結合していない）１５μＬとのインキュベーション後に決定されたヘプシジンの量を図２０Ｂにまとめる。図２０Ｂから容易にわかるように、上清中で決定されたヘプシジンの量（「未結合ヘプシジン（％）」および「洗浄されたヘプシジン（％）」）は、ＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノが結合した担体が、ヘプシジンを添加した血漿からヘプシジンをほぼ完全に除去することを示している（図２０Ｂ、「反応Ａ」および「反応Ｂ」の行を参照されたい）。これに対して、エタノールアミンでブロックされたＳｅｐｈａｒｏｓｅ担体（ＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノが結合していない）では、低いヘプシジン結合能しかみられなかった（図２０Ｂ、「反応Ｃ」および「反応Ｄ」の行を参照されたい）。したがって、上記の結果から、固定化されたＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノが生体液からヘプシジンを除去することは明らかである。
要約すれば、上記原理を適用することにより、担体に固定化されたＮＯＸ−Ｈ９４−３×ＨＥＧ−アミノが生体液中のヘプシジンを効果的に除去し得ることが示された。
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ＭｃＧｉｎｎｉｓ Ｓ．，Ｍａｄｄｅｎ Ｔ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００４）ＢＬＡＳＴ：ａｔ ｔｈｅ ｃｏｒｅ ｏｆ ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ａｎｄ ｄｉｖｅｒｓｅ ｓｅｔ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ２０−５．
Ｎｉｃｏｌａｓ Ｇ，Ｂｅｎｎｏｕｎ Ｍ，Ｄｅｖａｕｘ Ｉ，Ｂｅａｕｍｏｎｔ Ｃ，Ｇｒａｎｄｃｈａｍｐ Ｂ，Ｋａｈｎ Ａ，Ｖａｕｌｏｎｔ Ｓ（２００１）Ｌａｃｋ ｏｆ ｈｅｐｃｉｄｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｖｅｒｅ ｔｉｓｓｕｅ ｉｒｏｎ ｏｖｅｒｌｏａｄ ｉｎ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ２（ＵＳＦ２）ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９８（１５）：８７８０−８７８５
Ｎｉｃｏｌａｓ Ｇ，Ｂｅｎｎｏｕｎ Ｍ，Ｐｏｒｔｅｕ Ａ，Ｍａｔｉｖｅｔ Ｓ，Ｂｅａｕｍｏｎｔ Ｃ，Ｇｒａｎｄｃｈａｍｐ Ｂ，Ｓｉｒｉｔｏ Ｍ，Ｓａｗａｄｏｇｏ Ｍ，Ｋａｈｎ Ａ，Ｖａｕｌｏｎｔ Ｓ（２００２ａ）Ｓｅｖｅｒｅ ｉｒｏｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｅｍｉａ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｌｉｖｅｒ ｈｅｐｃｉｄｉｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９９（７）：４５９６−４６０１
Ｎｉｃｏｌａｓ Ｇ，Ｃｈａｕｖｅｔ Ｃ，Ｖｉａｔｔｅ Ｌ，Ｄａｎａｎ ＪＬ，Ｂｉｇａｒｄ Ｘ，Ｄｅｖａｕｘ Ｉ，Ｂｅａｕｍｏｎｔ Ｃ，Ｋａｈｎ Ａ，Ｖａｕｌｏｎｔ Ｓ（２００２ｂ）Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｉｒｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｅｐｔｉｄｅ ｈｅｐｃｉｄｉｎ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ａｎｅｍｉａ，ｈｙｐｏｘｉａ，ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１０（７）：１０３７−１０４４
Ｎｉｃｏｌａｓ Ｇ，Ｖｉａｔｔｅ Ｌ，Ｌｏｕ ＤＱ，Ｂｅｎｎｏｕｎ Ｍ，Ｂｅａｕｍｏｎｔ Ｃ，Ｋａｈｎ Ａ，Ａｎｄｒｅｗｓ ＮＣ，Ｖａｕｌｏｎｔ Ｓ（２００３）Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｈｅｐｃｉｄｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｉｒｏｎ ｏｖｅｒｌｏａｄ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３４（１）：９７−１０１
Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ Ｎ，Ｔｅｒａｏ Ｋ，Ｍｉｍａ Ｔ，Ｎａｋａｈａｒａ Ｈ，Ｔａｋａｇｉ Ｎ，Ｋａｋｅｈｉ Ｔ（２００８）Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｓ ｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６（ＩＬ−６）ａｎｄ ｓｏｌｕｂｌｅ ＩＬ−６ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｆｔｅｒ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ−ＩＬ−６ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ，ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｃａｓｔｌｅｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｌｏｏｄ １１２（１０）：３９５９−３９６４．
Ｐａｒｋ ＣＨ，Ｖａｌｏｒｅ ＥＶ，Ｗａｒｉｎｇ ＡＪ，Ｇａｎｚ Ｔ（２００１）Ｈｅｐｃｉｄｉｎ，ａ ｕｒｉｎａｒｙ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６（１１）：７８０６−７８１０
Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８），Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：２４４４．
Ｒｉｖｅｒａ Ｓ，Ｎｅｍｅｔｈ Ｅ，Ｇａｂａｙａｎ Ｖ，Ｌｏｐｅｚ ＭＡ，Ｆａｒｓｈｉｄｉ Ｄ，Ｇａｎｚ Ｔ（２００５）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｈｅｐｃｉｄｉｎ ｃａｕｓｅｓ ｒａｐｉｄ ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｈｙｐｏｆｅｒｒｅｍｉａ ａｎｄ ｉｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ｉｎ ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｏｒｇａｎｓ．Ｂｌｏｏｄ １０６（６）：２１９６−２１９９
Ｒｏｅｔｔｏ Ａ，Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ Ｇ，Ｐｏｌｉｔｏｕ Ｍ，Ａｌｂｅｒｔｉ Ｆ，Ｇｉｒｅｌｌｉ Ｄ，Ｃｈｒｉｓｔａｋｉｓ Ｊ，Ｌｏｕｋｏｐｏｕｌｏｓ Ｄ，Ｃａｍａｓｃｈｅｌｌａ Ｃ（２００３）Ｍｕｔａｎｔ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｈｅｐｃｉｄｉｎ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｅｖｅｒｅ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３３（１）：２１−２２
Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１），Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２
Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ Ｎ．，Ｋｉｍ Ｓ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｏｖｅｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋｓ ｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏｗａｒｄ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １０（１９）：１９７３−９１．
Ｗｅｉｓｓ Ｇ（２００８）Ｉｒｏｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ａｎｅｍｉａ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ
Ｗｅｉｓｓ Ｇ，Ｇｏｏｄｎｏｕｇｈ ＬＴ（２００５）Ａｎｅｍｉａ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５２（１０）：１０１１−１０２３
本明細書、特許請求の範囲、配列表および／または図面に開示されている本発明の特徴は単独でも、それを任意に組み合わせても、本発明をその様々な形態で実現するための資料となり得る。

Claims (104)

  1. 対象由来の体液中のヘプシジンレベルを低下させる方法であって、
    ａ）ヘプシジンと結合可能な核酸分子を準備することと、
    ｂ）ヘプシジンと前記核酸分子との結合が可能な条件下で前記核酸分子と体液とを接触させて、ヘプシジンと前記核酸分子との複合体を形成させることと、
    ｃ）前記体液から前記複合体を除去すること、または前記体液から前記ヘプシジンを除去することと
    を含む方法。
  2. 前記核酸分子が、５’→３’方向に第一の末端ヌクレオチドストレッチと、中央部のヌクレオチドストレッチと、第二の末端ヌクレオチドストレッチとを含み、前記中央部のヌクレオチドストレッチが３２〜４０個のヌクレオチド、好ましくは３２〜３５個のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記核酸分子が、５’→３’方向に第二の末端ヌクレオチドストレッチと、中央部のヌクレオチドストレッチと、第一の末端ヌクレオチドストレッチとを含み、前記中央部のヌクレオチドストレッチが３２〜４０個のヌクレオチド、好ましくは３２〜３５個のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記中央部のヌクレオチドストレッチが核酸分子とヘプシジンとの結合に必須である、請求項２〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記中央部のヌクレオチドストレッチが、ヌクレオチド配列５’ＲＫＡＵＧＧＧＡＫＵＡＡＧＵＡＡＡＵＧＡＧＧＲＧＵＷＧＧＡＧＧＡＡＲ３’（配列番号１８２）または５’ＲＫＡＵＧＧＧＡＫＡＡＧＵＡＡＡＵＧＡＧＧＲＧＵＷＧＧＡＧＧＡＡＲ３’（配列番号１８３）を含む、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記中央部のヌクレオチドストレッチが、ヌクレオチド配列５’ＲＫＡＵＧＧＧＡＫＵＡＡＧＵＡＡＡＵＧＡＧＧＲＧＵＷＧＧＡＧＧＡＡＲ３’（配列番号１８２）、好ましくはヌクレオチド配列５’ＧＵＡＵＧＧＧＡＵＵＡＡＧＵＡＡＡＵＧＡＧＧＡＧＵＵＧＧＡＧＧＡＡＧ３’（配列番号１８４）を含む、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記第一の末端ヌクレオチドストレッチが５〜８個のヌクレオチドを含み、前記第二の末端ヌクレオチドストレッチが５〜８個のヌクレオチドを含む、請求項５〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記第一の末端ヌクレオチドストレッチと前記第二の末端ヌクレオチドストレッチが二本鎖構造を形成し、好ましくはこのような二本鎖構造が、前記第一の末端ヌクレオチドストレッチと前記第二の末端ヌクレオチドストレッチが互いにハイブリダイズすることにより形成される、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＢＳＢＣ３’を含み、前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＶＢＶＹＸ４Ｘ５Ｘ６３’を含む、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法であって、
    Ｘ１がＡであるかまたは存在せず、Ｘ２がＧであるかまたは存在せず、Ｘ３がＢであるかまたは存在せず、Ｘ４がＳであるかまたは存在せず、Ｘ５がＣであるかまたは存在せず、Ｘ６がＵであるかまたは存在しない方法。
  10. 前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＢＳＢＣ３’を含み、前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＶＢＶＢＸ４Ｘ５Ｘ６３’を含む、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法であって、
    ａ）Ｘ１がＡであり、Ｘ２がＧであり、Ｘ３がＢであり、Ｘ４がＳであり、Ｘ５がＣであり、かつＸ６がＵであるか、
    ｂ）Ｘ１が存在せず、Ｘ２がＧであり、Ｘ３がＢであり、Ｘ４がＳであり、Ｘ５がＣであり、かつＸ６がＵであるか、または
    ｃ）Ｘ１がＡであり、Ｘ２がＧであり、Ｘ３がＢであり、Ｘ４がＳであり、Ｘ５がＣであり、かつＸ６が存在しない
    方法。
  11. ａ）前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＡＧＣＧＵＧＵＣ３’を含み、かつ前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＧＵＧＣＧＣＵ３’を含むか、
    ｂ）前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＡＧＣＧＵＧＵＣ３’を含み、かつ前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＧＣＡＵＧＣＵ３’を含むか、
    ｃ）前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＡＧＵＧＵＧＵＣ３’を含み、かつ前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＡＵＧＣＧＣＵ３’を含むか、
    ｄ）前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＡＧＵＧＵＧＵＣ３’を含み、かつ前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＧＣＡＵＧＣＵ３’を含むか、
    ｅ）前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＡＧＣＧＵＧＣＣ３’を含み、かつ前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＧＵＧＣＧＣＵ３’を含むか、または
    ｆ）前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＡＧＣＧＣＧＣＣ３’を含み、かつ前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＧＣＧＣＧＣＵ３’を含む、
    請求項５〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＢＳＢＣ３’を含み、前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＶＢＶＹＸ４Ｘ５Ｘ６３’を含む、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法であって、
    ａ）Ｘ１が存在せず、Ｘ２がＧであり、Ｘ３がＢであり、Ｘ４がＳであり、Ｘ５がＣであり、かつＸ６が存在しないか、
    ｂ）Ｘ１が存在せず、Ｘ２は存在せず、Ｘ３がＢであり、Ｘ４がＳであり、Ｘ５がＣであり、かつＸ６が存在しないか、または
    ｃ）Ｘ１が存在せず、Ｘ２がＧであり、Ｘ３がＢであり、Ｘ４がＳであり、Ｘ５が存在せず、かつＸ６が存在しない
    方法。
  13. 前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＢＳＢＣ３’を含み、前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＶＢＶＹＸ４Ｘ５Ｘ６３’を含む、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法であって、
    Ｘ１が存在せず、Ｘ２が存在せず、Ｘ３がＢであるかまたは存在せず、Ｘ４がＳであるかまたは存在せず、Ｘ５が存在せず、Ｘ６が存在しない方法。
  14. ａ）前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＣＧＣＧＣ３’を含み、かつ前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＣＧＣＧＣ３’を含むか、
    ｂ）前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＧＵＧＵＣ３’を含み、かつ前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＧＣＡＵＣ３’を含むか、
    ｃ）前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＧＣＧＵＣ３’を含み、かつ前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＧＣＧＣＣ３’を含むか
    ｄ）前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＣＧＣＣ３’を含み、かつ前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＧＣＧＣ３’を含むか、または
    ｅ）前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＧＣＧＣ３’を含み、かつ前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＣＧＣＣ３’を含む、
    請求項１３に記載の方法。
  15. 前記核酸が、配列番号１１５〜１１９、配列番号１２１、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１７５または配列番号１７６のいずれか１つによる核酸配列を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記中央部のヌクレオチドストレッチが、ヌクレオチド配列５’ＧＲＣＲＧＣＣＧＧＶＧＧＡＣＡＣＣＡＵＡＵＡＣＡＧＡＣＵＡＣＫＡＵＡ３’（配列番号１８５）または５’ＧＲＣＲＧＣＣＧＧＶＡＧＧＡＣＡＣＣＡＵＡＵＡＣＡＧＡＣＵＡＣＫＡＵＡ３’（配列番号１８６）を含む、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記中央部のヌクレオチドストレッチが、ヌクレオチド配列５’ＧＲＣＲＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＡＣＣＡＵＡＵＡＣＡＧＡＣＵＡＣＫＡＵＡ３’（配列番号２１５）、好ましくはヌクレオチド配列５’ＧＡＣＡＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＡＣＣＡＵＡＵＡＣＡＧＡＣＵＡＣＧＡＵＡ３’（配列番号１８７）を含む、請求項２〜４および１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記第一の末端ヌクレオチドストレッチが４〜７個のヌクレオチドを含み、前記第二の末端ヌクレオチドストレッチが４〜７個のヌクレオチドを含む、請求項１６〜１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記第一の末端ヌクレオチドストレッチと前記第二の末端ヌクレオチドストレッチが二本鎖構造を形成し、好ましくはこのような二本鎖構造が、第一の末端ヌクレオチドストレッチと第二の末端ヌクレオチドストレッチが互いにハイブリダイズすることにより形成される、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＢＳＮ３’を含み、前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＮＳＶＳＸ４Ｘ５Ｘ６３’を含む、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法であって、
    Ｘ１がＡであるかまたは存在せず、Ｘ２がＧであるかまたは存在せず、Ｘ３がＲであるかまたは存在せず、Ｘ４がＹであるかまたは存在せず、Ｘ５がＣであるかまたは存在せず、Ｘ６がＵであるかまたは存在しない方法。
  21. 前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＢＳＮ３’を含み、前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＮＳＶＳＸ４Ｘ５Ｘ６３’を含む、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の方法であって、
    ａ）Ｘ１がＡであり、Ｘ２がＧであり、Ｘ３がＲであり、Ｘ４がＹであり、Ｘ５がＣであり、かつＸ６がＵであるか、
    ｂ）Ｘ１が存在せず、Ｘ２がＧであり、Ｘ３がＲであり、Ｘ４がＹであり、Ｘ５がＣであり、かつＸ６がＵであるか、
    ｃ）Ｘ１がＡであり、Ｘ２がＧであり、Ｘ３がＲであり、Ｘ４がＹであり、Ｘ５がＣであり、かつＸ６が存在しない
    方法。
  22. ａ）前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＡＧＧＣＵＣＧ３’を含み、かつ前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＧＧＧＣＣＵ３’を含むか、
    ｂ）前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＡＧＧＣＣＣＧ３’を含み、かつ前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＧＧＧＣＣＵ３’を含むか、
    ｃ）前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＡＧＧＣＵＵＧ３’を含み、かつ前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＧＡＧＣＣＵ３’を含むか、または
    ｄ）前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＡＧＡＣＵＵＧ３’を含み、かつ前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＧＡＧＵＣＵ３’を含む、
    請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＢＳＮ３’を含み、前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＮＳＶＳＸ４Ｘ５Ｘ６３’を含む、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の方法であって、
    ａ）Ｘ１が存在せず、Ｘ２がＧであり、Ｘ３がＲであり、Ｘ４がＹであり、Ｘ５がＣであり、かつＸ６が存在しないか、
    ｂ）Ｘ１が存在せず、Ｘ２が存在せず、Ｘ３がＲであり、Ｘ４がＹであり、Ｘ５がＣであり、かつＸ６が存在しないか、または
    ｃ）Ｘ１が存在せず、Ｘ２がＧであり、Ｘ３がＲであり、Ｘ４がＹであり、Ｘ５が存在せず、かつＸ６が存在しない
    方法。
  24. 前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＧＣＵＣＧ３’を含み、前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＧＧＧＣＣ３’を含む、請求項１６〜２０および２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＢＳＮ３’を含み、前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＮＳＶＳＸ４Ｘ５Ｘ６３’を含む、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の方法であって、
    Ｘ１が存在せず、Ｘ２が存在せず、Ｘ３がＲであるかまたは存在せず、Ｘ４がＹであるかまたは存在せず、Ｘ５が存在せず、Ｘ６が存在しない方法。
  26. 前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＧＣＣＧ３’を含み、かつ前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＧＧＣＣ３’を含むか、または
    前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＣＧＣＧ３’を含み、かつ前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＧＣＧＣ３’を含む、請求項１６〜２０および２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記核酸分子が、配列番号１２２〜１２６、配列番号１５４、配列番号１５９、配列番号１６３または配列番号１７４のいずれか１つによる核酸配列を含む、請求項１〜４および１６〜２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記中央部のヌクレオチドストレッチが、５’→３’方向にボックスＡと連結ヌクレオチドストレッチとボックスＢとを含むか、または５’→３’方向にボックスＢと連結ヌクレオチドストレッチとボックスＡとを含む、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法であって、
    前記ボックスＡがヌクレオチド配列５’ＷＡＡＡＧＵＷＧＡＲ３’（配列番号１８８）を含み、前記連結ヌクレオチドストレッチが１０〜１８個のヌクレオチドを含み、前記ボックスＢがヌクレオチド配列５’ＲＧＭＧＵＧＷＫＡＧＵＫＣ３’（配列番号１８９）を含む方法。
  29. 前記ボックスＡが、５’ＵＡＡＡＧＵＡＧＡＧ３’（配列番号１９９）、５’ＡＡＡＡＧＵＡＧＡＡ３’（配列番号２００）、５’ＡＡＡＡＧＵＵＧＡＡ３’（配列番号２０１）および５’ＧＧＧＡＵＡＵＡＧＵＧＣ３’（配列番号２０２）の群から選択されるヌクレオチド配列、好ましくはヌクレオチド配列５’ＵＡＡＡＧＵＡＧＡＧ３’（配列番号１９９）を含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記ボックスＢが、５’ＧＧＣＧＵＧＡＵＡＧＵＧＣ３’（配列番号２０３）、５’ＧＧＡＧＵＧＵＵＡＧＵＵＣ３’（配列番号２０４）、５’ＧＧＣＧＵＧＡＧＡＧＵＧＣ３’（配列番号２０５）、５’ＡＧＣＧＵＧＡＵＡＧＵＧＣ３’（配列番号２０６）および５’ＧＧＣＧＵＧＵＵＡＧＵＧＣ３’（配列番号２０７）の群から選択されるヌクレオチド配列、好ましくはヌクレオチド配列５’ＧＧＣＧＵＧＡＵＡＧＵＧＣ３’（配列番号２０３）を含む、請求項２８および２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記連結ヌクレオチドストレッチが、５’→３’方向に第一の連結ヌクレオチドサブストレッチと、第二の連結ヌクレオチドサブストレッチと、第三の連結ヌクレオチドサブストレッチとを含み、前記第一の連結ヌクレオチドサブストレッチと前記第三の連結ヌクレオチドサブストレッチが、それぞれ互いに独立して３〜６個のヌクレオチドを含む、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記第一の連結ヌクレオチドサブストレッチと前記第三の連結ヌクレオチドサブストレッチが二本鎖構造を形成し、好ましくはこのような二本鎖構造が、前記第一の連結ヌクレオチドサブストレッチと前記第三の連結ヌクレオチドサブストレッチが互いにハイブリダイズすることにより形成される、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記二本鎖構造が３〜６個の塩基対からなる、請求項３１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法であって、
    ａ）前記第一の連結ヌクレオチドサブストレッチが、５’ＧＧＡＣ３’、５’ＧＧＡＵ３’および５’ＧＧＡ３’の群から選択されるヌクレオチド配列を含み、かつ前記第三の連結ヌクレオチドサブストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＵＣＣ３’を含むか、
    ｂ）前記第一の連結ヌクレオチドサブストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＣＡＧ３’を含み、かつ前記第三の連結ヌクレオチドサブストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＵＧＣ３’を含むか、
    ｃ）前記第一の連結ヌクレオチドサブストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＧＧＣ３’を含み、かつ前記第三の連結ヌクレオチドサブストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＣＣＣ３’を含むか、
    ｄ）前記第一の連結ヌクレオチドサブストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＡＣ３’を含み、かつ前記第三の連結ヌクレオチドサブストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＵＣ３’を含むか、
    ｅ）前記第一の連結ヌクレオチドサブストレッチがヌクレオチド配列５’ＡＣＵＵＧＵ３’を含み、かつ前記第三の連結ヌクレオチドサブストレッチが、５’ＧＣＡＡＧＵ３’および５’ＧＣＡＡＧＣ３’の群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、または
    ｆ）前記第一の連結ヌクレオチドサブストレッチがヌクレオチド配列５’ＵＣＣＡＧ３’を含み、かつ前記第三の連結ヌクレオチドサブストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＵＧＧＡ３’を含み、
    好ましくは前記第一の連結ヌクレオチドサブストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＡＣ３’を含み、かつ前記第三の連結ヌクレオチドサブストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＵＣ３’を含む
    方法。
  35. 前記第二の連結ヌクレオチドサブストレッチが３〜５個のヌクレオチドを含む、請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記第二の連結ヌクレオチドサブストレッチが、５’ＶＢＡＡＷ３’、５’ＡＡＵＷ３’および５’ＮＢＷ３’の群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記第二の連結ヌクレオチドサブストレッチが、ヌクレオチド配列５’ＶＢＡＡＷ３’、好ましくは５’ＣＧＡＡＡ３’、５’ＧＣＡＡＵ３’、５’ＧＵＡＡＵ３’および５’ＡＵＡＡＵ３’の群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記第二の連結ヌクレオチドサブストレッチが、ヌクレオチド配列５’ＡＡＵＷ３’、好ましくはヌクレオチド配列５’ＡＡＵＵ３’または５’ＡＡＵＡ３’、より好ましくはヌクレオチド配列５’ＡＡＵＡ３’を含む、請求項３６に記載の方法。
  39. 前記第二の連結ヌクレオチドサブストレッチがヌクレオチド配列５’ＮＢＷ３’を含み、好ましくは前記第二の連結ヌクレオチドサブストレッチが、５’ＣＣＡ３’、５’ＣＵＡ３’、５’ＵＣＡ３’、５’ＡＣＡ３’、５’ＧＵＵ３’、５’ＵＧＡ３’および５’ＧＵＡ３’の群、より好ましくは５’ＣＣＡ３’、５’ＣＵＡ３’、５’ＵＣＡ３’、５’ＡＣＡ３’および５’ＧＵＵ３’の群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項３６に記載の方法。
  40. 前記連結ヌクレオチドストレッチが、５’ＧＧＡＣＢＹＡＧＵＣＣ３’（配列番号２０８）、５’ＧＧＡＵＡＣＡＧＵＣＣ３’（配列番号２０９）、５’ＧＣＡＧＧＹＡＡＵＣＵＧＣ３’（配列番号２１０）、５’ＧＡＣＡＡＵＷＧＵＣ３’（配列番号２１１）、５’ＡＣＵＵＧＵＣＧＡＡＡＧＣＡＡＧＹ３’（配列番号２１２）、５’ＵＣＣＡＧＧＵＵＣＵＧＧＡ３’（配列番号１０９）、５’ＧＧＧＣＵＧＡＧＣＣＣ３’（配列番号１９０）、５’ＧＣＡＧＡＵＡＡＵＣＵＧＣ３’（配列番号１９１）および５’ＧＧＡＣＣＡＧＵＣＣ３’（配列番号１９２）の群から選択されるヌクレオチド配列を含み、好ましくは前記連結ヌクレオチドストレッチが、５’ＧＧＡＣＣＣＡＧＵＣＣ３’（配列番号１９３）、５’ＧＧＡＣＣＵＡＧＵＣＣ３’（配列番号１９４）、５’ＧＧＡＣＵＣＡＧＵＣＣ３’（配列番号１９５）、５’ＧＧＡＣＧＵＡＧＵＣＣ３’（配列番号２１４）、５’ＧＣＡＧＧＵＡＡＵＣＵＧＣ３’（配列番号１９６）、５’ＧＣＡＧＧＣＡＡＵＣＵＧＣ３’（配列番号１９７）、５’ＧＡＣＡＡＵＵＧＵＣ３’（配列番号１９８）および５’ＧＡＣＡＡＵＡＧＵＣ３’（配列番号１５７）の群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項２８〜３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記第一の末端ヌクレオチドストレッチが４〜７個のヌクレオチドを含み、前記第二の末端ヌクレオチドストレッチが４〜７個のヌクレオチドを含む、請求項２８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記第一の末端ヌクレオチドストレッチと前記第二の末端ヌクレオチドストレッチが二本鎖構造を形成し、好ましくはこのような二本鎖構造が、第一の末端ヌクレオチドストレッチと第二の末端ヌクレオチドストレッチが互いにハイブリダイズすることにより形成される、請求項２８〜４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＢＫＢＫ３’を含み、前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＭＶＶＶＸ４Ｘ５Ｘ６３’を含む、請求項２８〜４２のいずれか１項に記載の方法であって、
    Ｘ１がＧであるかまたは存在せず、Ｘ２がＳであるかまたは存在せず、Ｘ３がＶであるかまたは存在せず、Ｘ４がＢであるかまたは存在せず、Ｘ５がＳであるかまたは存在せず、Ｘ６がＣであるかまたは存在しない方法。
  44. 前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＢＫＢＫ３’を含み、前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＭＶＶＶＸ４Ｘ５Ｘ６３’を含む、請求項２８〜４３のいずれか１項に記載の方法であって、
    ａ）Ｘ１がＧであり、Ｘ２がＳであり、Ｘ３がＶであり、Ｘ４がＢであり、Ｘ５がＳであり、かつＸ６がＣであるか、
    ｂ）Ｘ１が存在せず、Ｘ２がＳであり、Ｘ３がＶであり、Ｘ４がＢであり、Ｘ５がＳであり、かつＸ６がＣであるか、または
    ｃ）Ｘ１がＧであり、Ｘ２がＳであり、Ｘ３がＶであり、Ｘ４がＢであり、Ｘ５がＳであり、かつＸ６が存在しない
    方法。
  45. 前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＣＡＣＵＣＧ３’を含み、前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＧＡＧＵＧＣ３’を含む、請求項２８〜４４のいずれか１項、好ましくは請求項４４に記載の方法。
  46. 前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＢＫＢＫ３’を含み、前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＭＶＶＶＸ４Ｘ５Ｘ６３’を含む、請求項２８〜４３のいずれか１項に記載の方法であって、
    ａ）Ｘ１が存在せず、Ｘ２がＳであり、Ｘ３がＶであり、Ｘ４がＢであり、Ｘ５がＳであり、かつＸ６が存在しないか、
    ｂ）Ｘ１が存在せず、Ｘ２が存在せず、Ｘ３がＶであり、Ｘ４がＢであり、Ｘ５がＳであり、かつＸ６が存在しないか、または
    ｃ）Ｘ１が存在せず、Ｘ２がＳであり、Ｘ３がＶであり、Ｘ４がＢであり、Ｘ５が存在せず、かつＸ６が存在しない
    方法。
  47. ａ）前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＣＵＧＵＧ３’を含み、かつ前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＡＣＡＧＣ３’を含むか、
    ｂ）前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＧＵＧＵＧ３’を含み、かつ前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＡＣＡＣＧ３’を含むか、
    ｃ）前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＧＵＧＣＵ３’を含み、かつ前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＡＧＣＡＣＧ３’を含むか、
    ｄ）前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＧＣＧＣＧ３’を含み、かつ前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＧＣＧＣＧ３’を含むか、
    ｅ）前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＣＣＧＵＧ３’を含み、かつ前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＡＣＧＣＧ３’を含むか、
    ｆ）前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＣＧＧＵＧ３’を含み、かつ前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＡＣＣＧＣ３’を含むか、
    ｇ）前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＣＵＧＣＧ３’を含み、かつ前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＧＣＡＧＣ３’を含むか、
    ｈ）前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＣＵＧＧＧ３’を含み、かつ前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＣＣＡＧＣ３’を含むか、または
    ｉ）前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＧＣＧＧＣＧ３’を含み、かつ前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＧＣＣＧＣ３’を含む、請求項２８〜４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＢＫＢＫ３’を含み、前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＭＶＶＶＸ４Ｘ５Ｘ６３’を含む、請求項２８〜４３のいずれか１項に記載の方法であって、
    Ｘ１が存在せず、Ｘ２が存在せず、Ｘ３がＶであるかまたは存在せず、Ｘ４がＢであるかまたは存在せず、Ｘ５が存在せず、Ｘ６が存在しない方法。
  49. 前記第一の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＧＵＧ３’を含み、前記第二の末端ヌクレオチドストレッチがヌクレオチド配列５’ＣＡＣＧ３’を含む、請求項２８〜４３および４８のいずれか１項に記載の方法。
  50. 前記核酸分子が、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３９〜４１、配列番号４３、配列番号４６、配列番号１３７〜１４１または配列番号１７３のいずれか１つによる核酸配列を含む、請求項１〜４および２８〜４９および４８のいずれか１項に記載の方法。
  51. 前記核酸分子が、配列番号１２７〜１３１のいずれか１つによる核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
  52. 前記ヘプシジンが、ヒトヘプシジン−２５、ヒトヘプシジン−２２、ヒトヘプシジン−２０、サルヘプシジン−２５、サルヘプシジン−２２またはサルヘプシジン−２０、好ましくはヒトヘプシジン−２５である、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の方法。
  53. 前記ヘプシジンが、配列番号１によるアミノ酸配列を有する、請求項１〜５２のいずれか１項、好ましくは請求項５２に記載の方法。
  54. 前記核酸分子が修飾基を含み、好ましくは、前記修飾基を含む前記核酸分子の生物体からの排泄速度が、ヘプシジンと結合可能で前記修飾基を含まない核酸分子に比べて減少している、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
  55. 前記核酸分子が修飾基を含み、好ましくは、前記修飾基を含む前記核酸分子の生物体内での滞留時間が、ヘプシジンと結合可能で前記修飾基を含まない核酸分子に比べて増加している、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
  56. 前記修飾基が、生分解性および非生分解性の修飾を含む群から選択され、好ましくは前記修飾基が、直鎖ポリ（エチレン）グリコール、分岐ポリ（エチレン）グリコール、ヒドロキシエチルデンプン、ペプチド、タンパク質、多糖、ステロール、ポリオキシプロピレン、ポリオキシアミダート、ポリ（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−グルタミンおよびポリエチレングリコールを含む群から選択される、請求項５４および５５に記載の方法。
  57. 前記修飾基が、直鎖ポリ（エチレン）グリコールまたは分岐ポリ（エチレン）グリコールからなるＰＥＧ部分であり、前記ポリ（エチレン）グリコール部分の分子量が、好ましくは約２０，０００〜約１２０，０００Ｄａ、より好ましくは約３０，０００〜約８０，０００Ｄａ、最も好ましくは約４０，０００Ｄａである、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記修飾基がヒドロキシエチルデンプン部分であり、前記ヒドロキシエチルデンプン部分の分子量が、好ましくは約１０，０００〜約２００，０００Ｄａ、より好ましくは約３０，０００〜約１７０，０００Ｄａ、最も好ましくは約１５０，０００Ｄａである、請求項５６に記載の方法。．
  59. 前記修飾基がリンカーを介して前記核酸分子と結合し、好ましくは前記リンカーが生分解性リンカーである、請求項５４〜５８のいずれかに記載の方法。
  60. 前記修飾基が、前記核酸分子の５’末端ヌクレオチドおよび／または３’末端ヌクレオチド、ならびに／あるいは前記核酸分子の５’末端ヌクレオチドと３’末端ヌクレオチドとの間にある前記核酸のヌクレオチドと結合している、請求項５４〜５９のいずれか１項に記載の方法。
  61. 前記生物体が、動物の身体またはヒトの身体、好ましくはヒトの身体である、請求項５４〜６０のいずれか１項に記載の方法。
  62. 前記核酸分子のヌクレオチドまたは前記核酸分子を形成しているヌクレオチドがＬ−ヌクレオチドである、請求項１〜６１のいずれか１項に記載の方法。
  63. 前記核酸分子がＬ−核酸である、請求項１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. 前記核酸分子が、ヘプシジンと結合可能な結合部分を少なくとも１つ含み、このような結合部分がＬ−ヌクレオチドからなる、請求項１〜６３のいずれか１項に記載の方法。
  65. 疾患を治療および／または予防するための方法であるか、あるいは疾患を治療および／または予防するための方法の一部分であるか、あるいはこのような方法に用いられるか、またはそれに関連して用いられる、請求項１〜６４のいずれか１項に記載の方法。
  66. 前記核酸分子が担体に固定化されている、請求項１〜６５のいずれかに記載の方法。
  67. 担体に固定化されている前記核酸分子がｅｘ ｖｉｖｏで存在する、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記核酸分子が、請求項５４〜６０のいずれか１項で明確にされる修飾基を含むことにより修飾され、修飾核酸分子を形成する、請求項１〜６５のいずれかに記載の方法。
  69. ヘプシジンと前記修飾核酸分子との複合体を前記修飾基に対するリガンドと接触させて、前記体液から前記複合体を除去する、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記修飾核酸分子が、前記修飾核酸分子と任意に追加の成分とを含む医薬組成物の一部分であり、前記追加の成分が、薬学的に許容される補形剤、薬学的に許容される担体および薬学的に活性な物質を含む群から選択される、請求項６８および６９のいずれかに記載の方法。
  71. 前記リガンドが、担体に固定化されかつｅｘ ｖｉｖｏで存在する、請求項６９〜７０のいずれか１項に記載の方法。
  72. 前記核酸分子が、前記核酸の３’末端または５’末端で前記担体に固定化されている、請求項６６および６７のいずれかに記載の方法。
  73. 前記核酸分子または前記リガンドが、共有結合、非共有結合、水素結合、ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ相互作用、クーロン力の相互作用、疎水性相互作用または配位結合により固定化されている、請求項６６〜７２のいずれかに記載の方法。
  74. 前記担体が、好ましくは有機高分子および／または無機高分子を含む固体担体である、請求項６６〜６７、７１〜７３のいずれかに記載の方法。
  75. 前記固体担体が、多孔質ガラス、粘土、セルロース、デキストラン、アクリル、アガロース、ポリスチレン、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、シリカビーズ、アクリル酸系アミノ担体およびメタクリル酸系アミノ担体からなる群より選択される、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記体液が前記体液と透析液とを隔てる半透膜と接触し、ヘプシジンおよび／またはヘプシジンと前記核酸分子との複合体が前記半透膜を介してを前記体液から前記透析液に拡散することにより、前記体液中のヘプシジンレベルが低下する、請求項１〜６５のいずれかに記載の方法。
  77. 前記核酸分子が修飾されていない、請求項７６に記載の方法。
  78. ヘプシジンと前記非修飾核酸分子の前記複合体が、前記体液から前記透析液に拡散する、請求項７６〜７７のいずれかに記載の方法。
  79. 前記核酸分子が、請求項５４〜６０のいずれか１項で明確にされる修飾基を含み、修飾核酸分子を形成する、請求項７６に記載の方法。
  80. 前記修飾核酸分子が前記透析液中に存在する、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記体液が血液、血漿または血清である、請求項１〜８０のいずれかに記載の方法。
  82. 前記対象が腎機能障害を有する、請求項１〜８１のいずれかに記載の方法。
  83. 前記方法がｅｘ ｖｉｖｏでの方法である、請求項１〜８２のいずれか１項に記載の方法。
  84. 前記体液を、前記体液が採取されるまたは採取された身体に戻さない、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記体液が貯蔵血液である、請求項８３〜８４のいずれか１項に記載の方法。
  86. 担体に固定化された核酸分子を調製する方法であって、
    前記核酸分子がヘプシジンと結合可能であり、
    ヘプシジンと結合可能な核酸分子と、活性化された担体とを反応させて、前記核酸分子の３’末端、５’末端またはその両方と前記担体との間で結合を形成させることを含む
    方法。
  87. 前記活性化された担体を、ヘプシジン以外の体液成分とは共有結合しないようにブロックすることをさらに含む、請求項８６に記載の方法。
  88. 前記担体がＳｅｐｈａｒｏｓｅである、請求項８６〜８７に記載の方法。
  89. ＮＨＳ−エステルを用いて前記Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ担体を活性化させる、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記活性化されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ担体を、エタノールアミン処理によりブロックする、請求項８９に記載の方法。
  91. 前記核酸分子がアミノ官能基部分を含み、かつ前記核酸分子が、弱塩基性溶液中で、活性化されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ担体に固定化される、請求項８６〜９０のいずれかに記載の方法。
  92. 前記アミノ官能基部分が、３つのヘキサエチレングリコール部分を含み、前記３つのヘキサエチレングリコール部分が、前記核酸分子と前記アミノ官能基部分との間に配置されている、請求項９１に記載の方法。
  93. 担体に固定化された核酸分子であって、ヘプシジンと結合可能な核酸分子。
  94. 請求項１〜７５のいずれか１つに記載の核酸分子であるか、またはこれを含む、請求項９３に記載の核酸分子。
  95. 請求項１〜８５のいずれかに記載の方法で使用する、医療装置。
  96. 請求項１〜８５のいずれか１つで明確にされる核酸分子および／または請求項９３〜９４のいずれか１つに記載の核酸分子を含む、請求項９５に記載の医療装置。
  97. 対象、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトの体液中のヘプシジンレベルを低下させる方法で使用する核酸分子であって、前記核酸が、ヘプシジンと結合可能な核酸分子である核酸分子。
  98. 請求項１〜８５のいずれか１項に記載の核酸分子であるか、またはこれを含む、請求項９７に記載の核酸分子。
  99. 対象の体液からヘプシジンを除去する方法で使用する核酸分子であって、請求項１〜８５のいずれか１項で明確にされる核酸分子である核酸分子。
  100. 前記方法が、請求項１〜８５のいずれか１項で明確にされる方法である、請求項９９に記載の核酸分子。
  101. 貧血患者を治療する方法で使用する核酸分子であって、１〜８５のいずれか１項で明確にされる核酸分子である核酸分子。
  102. 前記治療が、好ましくはヘプシジンと前記核酸分子との相互作用により、前記患者の体液からヘプシジンを除去することを含む、請求項１０１に記載の核酸分子。
  103. 前記核酸分子が体外装置内に、好ましくは固定化されて存在し、前記体液が前記患者の身体から取り出されて、前記体外装置の中を通過し、前記患者の体内に戻る、請求項１０２に記載の核酸分子。
  104. 前記体液が血液または血漿である、請求項１０３に記載の核酸分子。
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