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JP2013525478A - 神経細胞のアポトーシス又は神経変性を阻害するための医薬組成物 - Google Patents

神経細胞のアポトーシス又は神経変性を阻害するための医薬組成物 Download PDF

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Abstract

【課題】神経細胞のアポトーシス又は神経変性を阻害するための医薬組成物の提供
【解決手段】提供されるものは、神経細胞のアポトーシス又は神経変性を阻害するための医薬組成物である。該医薬組成物は、神経細胞のアポトーシス又は神経変性に関連する疾患を効果的に予防又は治療する。
【選択図】図1

Description

本願は、韓国特許庁において2010年5月3日に提出された、韓国特許出願第10−2010−0041436号の利益を請求するが、その開示の全てが参照としてここに組み込まれる。
本発明は、神経細胞のアポトーシス又は神経変性を阻害するための医薬組成物に関する。
神経細胞(neurons)のアポトーシスは、神経発生のような正常な生理的機能において又は疾患のような病的過程において誘導され得る。神経細胞の発生過程の間、過剰な神経細胞が、シナプス前部とシナプス後部の間の最適で正確な連結のために、アポトーシスを介して除去される(Neuron,40巻:401−413頁(2003年);Neuron,20巻:633−647頁(1998年))。神経細胞の広範なアポトーシスは、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病及びパーキンソン病、脳卒中及び外傷のような神経変性疾患において観察される。これらの疾患の直接の原因は未だ見出されていないが、しかしながら、これはアポトーシスと関係するものであり、アポトーシスは、酸化的ストレス、カルシウム恒常性の異常調節、ミトコンドリアの機能障害、活性酸素種の発生、興奮毒性、カスパーゼ活性及び栄養不足(trophic deprivation)のような種々の要因により影響を受ける(Nature Reviews Molecular Cell Biology,1巻:120−130頁(2000年),Neurotoxicology and Teratology,24巻:675−682頁(2002年))。
パーキンソン病において、ミトコンドリアの機能障害が、カルシウムの分泌及び活性酸素種の発生を増加し、それにより、酸化的ストレスを誘導して抗酸化系の活性を低減することが報告されている。更に、グルタミン酸塩による興奮毒性とパーキンソン病の間の関連性に関する報告が存在する(Neurotoxicology and Teratology,24巻:675−682頁(2002年))。
アルツハイマー病において、神経細胞のアポトーシスが、酸化的ストレス、イオン恒常性の異常調節、成長因子遮断、アミロイドAβの蓄積、代謝障害、ミトコンドリアの機能障害、DNA損傷及びタンパク質凝集と関連することが報告されている(Nat.Rev.Neurosci.,7巻:278−294頁(2006年);Cerebellum,2巻:270−278頁(2003年))。
近年、種々な機構により誘導されるアポトーシスから神経細胞を保護するために使用される神経保護薬の種々のタイプが提案されている(Neurotoxicology and Teratology,24巻:675−682頁(2002年))。神経保護薬の例は、抗酸化剤、イオンキレート剤、遊離ラジカル捕捉剤、神経栄養因子、興奮性アミノ酸拮抗剤、生体エネルギー補助食品、免疫抑制剤及びタンパク質の凝集又は蓄積を防止する処方を含む。しかし、神経細胞のアポトーシス又は神経変性を効果的に阻害する薬剤は、未だ市販で入手可能ではなく、よって、神経細胞のアポトーシス又は神経変性を阻害するための医薬組成物を開発することに対する要求が依然として存在する。
Neuron,40巻:401−413頁(2003年) Neuron,20巻:633−647頁(1998年) Nature Reviews Molecular Cell Biology,1巻:120−130頁(2000年) Neurotoxicology and Teratology,24巻:675−682頁(2002年) Nat.Rev.Neurosci.,7巻:278−294頁(2006年) Cerebellum,2巻:270−278頁(2003年)
技術的課題
本発明は、神経細胞のアポトーシス又は神経変性を阻害するための医薬組成物を提供する。
本発明はまた、神経保護又は神経回復のための医薬組成物も提供する。
更なる観点が付随する本明細書中に部分的に記述されているが、部分的に、本明細書から明らかであるか又は提示された態様の実施により教示され得る。
課題の解決
本発明は、添付の図面を参照して詳細に説明される。
本発明は、神経細胞のアポトーシス又は神経変性を阻害するための医薬組成物であって、以下の式Iにより表される置換アゾール誘導体、その医薬的に許容される塩、該置換アゾール誘導体の異性体、該置換アゾール誘導体の溶媒和物及びそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物の治療有効量並びに医薬的に許容されるキャリアを含む組成物を提供する。
本発明はまた、神経保護のための医薬組成物であって、以下の式Iにより表される置換アゾール誘導体、その医薬的に許容される塩、該置換アゾール誘導体の異性体、該置換アゾール誘導体の溶媒和物及びそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物の治療有効量並びに医薬的に許容されるキャリアを含む組成物も提供する。
本発明はまた、神経回復のための医薬組成物であって、以下の式Iにより表される置換アゾール誘導体、その医薬的に許容される塩、該置換アゾール誘導体の異性体、該置換アゾール誘導体の溶媒和物及びそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物の治療有効量並びに医薬的に許容されるキャリアを含む組成物も提供する。
本発明はまた、神経変性疾患又は虚血−若しくは再灌流−関連疾患の予防又は治療のための医薬組成物であって、該組成物は、以下の式Iにより表される置換アゾール誘導体、その医薬的に許容される塩、該置換アゾール誘導体の異性体、該置換アゾール誘導体の溶媒和物及びそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物の治療有効量並びに医薬的に許容されるキャリアを含む組成物も提供する。
本発明はまた、脳卒中、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン−ALS−認知症症候群、ウィルソン病、多発性硬化症、進行性核上まひ、神経障害痛に関連する双極性障害、大脳皮質基底核変性症、統合失調症、注意欠陥多動性障害(ADHD)、認知症、筋萎縮性側索硬化症、網膜疾患、てんかん、卒中、一過性脳虚血発作、心筋虚血、筋虚血、脳に対する血流の延長停止に関する手術法により生じる虚血、頭部外傷、脊髄損傷、低酸素症及び鬱病からなる群より選択される疾患の予防又は治療のための医薬組成物であって、該組成物は、
以下の式I
式I
Figure 2013525478
(式中、Rは、置換されているか又は未置換の炭素原子数1ないし15のアリールアルキル基、置換されているか又は未置換の炭素原子数1ないし10のヘテロアリールアルキル基及び置換されているか又は未置換の直鎖の炭素原子数1ないし10のアルキル基からなる群より選択され;
Yは、O及び−N−R1からなる群より選択され;
1はH及び直鎖又は分岐鎖の炭素原子数1ないし3のアルキル基からなる群より選択される少なくとも1種を表し;
2は、H及びハロゲン原子からなる群より選択され;
Aは、N、O及びSからなる群より選択され;
Bは、C又はNを表し;
Zは、置換されているか又は未置換の複素環基、カーバメート基、−OC(=O)NR34、NH2、NR56、NC(=NH)NH2及び−NC(=O)NH2からなる群より選択され;
3及びR4は、それぞれ独立して、H;未置換であるか又はNH2及びNR78からなる群より選択される少なくとも1種で置換された炭素原子数1ないし5のアルキル基;未置換であるか又は炭素原子数1ないし3のアルキル基で置換された複素環からなる群より選択されるか、又は、R3及びR4は一緒になって、未置換であるか又は炭素原子数1ないし3のアルキル基で置換された5−又は7−員の複素環を形成し;
5及びR6は、それぞれ独立して、H;炭素原子数2ないし3のアルケニル基;炭素原子数2ないし3のアルキニル基;及び直鎖又は分岐鎖の、未置換であるか又は−OH、−C(O)NH2、炭素原子数1ないし3のアルコキシ基及びカーバメート基からなる群より選択される少なくとも1種で置換された炭素原子数1ないし7のアルキル基からなる群より選択されるか、又は、R5及びR6は一緒になって、置換されているか又は未置換の脂肪族環状アミン又は芳香族環状アミンを形成し;
7及びR8は、それぞれ独立して、H及び直鎖又は分岐鎖の炭素原子数1ないし3のアルキル基からなる群より選択される少なくとも1種を表し;
mは、0ないし4の範囲における整数を表し;及び
nは、0ないし5の範囲における整数を表す。)により表される置換アゾール誘導体、その医薬的に許容される塩、該置換アゾール誘導体の異性体、該置換アゾール誘導体の溶媒和物及びそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物の治療有効量並びに医薬的に許容されるキャリアを含む組成物も提供する。
本医薬組成物は、式Iで表される置換アゾール誘導体、その医薬的に許容される塩、該置換アゾール誘導体の異性体、該置換アゾール誘導体の溶媒和物及びそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物の治療有効量を含み得る。
ここで使用される用語“治療(treatment)”とは、神経細胞のアポトーシス又は神経変性により発生する疾患、障害又は状態を有していると診断されたことはないが、このような疾患、障害、又は状態にかかりやすい傾向のある動物において、疾患、障害又は状態が発生されることの予防、前記疾患、障害又は状態の抑制、即ち、発展の抑制及び前記疾患、障害又は状態の軽減、即ち、疾患、障害又は状態の退行の原因を含むと解釈すべきである。従って、ここで使用される用語“治療学的有効量(therapeuticallyeffectiveamount)”は、前記した薬理学的効果を達成するのに使用された十分な量を言及する。
式Iで表される置換アゾール誘導体は、本発明に関係する技術において、化合物合成の分野に関する当業者により、既知の化合物又はこれらから容易に製造できる化合物を用いて製造し得る。従って、以降に記載される式Iで表される置換アゾール誘導体の製造方法は、説明のみを目的とする例示的な態様であり、必要ならば、単位操作の順序は選択的に変えられ得るものであるが、発明の範囲を制限するものではない。
スキーム1:アゾールの合成
Figure 2013525478
Rは、ベンジル基であり得、及びR2、Z、B、m及びnは、上記で定義された通りであり得る。アゾールの一般的な合成法は、オキシム(II)が、出発物質であるアルデヒド(I)から製造され、製造されたオキシム化合物が、NaOClの存在においてアルキン又はニトリルと[3+2]環化付加に付されて、アゾール化合物(III又はIV)が得られ、及び所望の官能基がその後、アゾール化合物中に導入されて最終化合物(V)が得られるような手順において達成され得る。
スキーム2:チアゾールの合成
Figure 2013525478
Rは、ベンジル基であり得、及びR2、Z、B及びmは、上記で定義された通りであり得る。チアゾールの一般的な合成法は、オキサチアゾロン(VII)が、出発物質であるアミド(VI)から製造され、製造された化合物が、NaOClの存在においてアルキン又はニトリルと[3+2]環化付加に付されて、チアゾール化合物(VIII)が得られ、及び該地アゾール化合物は還元され(IX)及び所望の官能基が、その中に導入されて最終化合物(X)が得られるような手順において達成され得る。
スキーム3
Figure 2013525478
R、R2、Z、A、m及びBは、上記で定義された通りである。最終化合物(XIII)の一般的な合成法は、ヒドロキシフェニル誘導体(XII)が、出発物質である化合物(XI)の脱ベンジル化反応により製造され、及び所望の官能基がその中に導入されて、最終化合物(XIII)が得られるような手順において達成され得る。
スキーム4
Figure 2013525478
R、R1、R2、Z、A、m及びBは、上記で定義された通りである。最終化合物(XVI)の一般的な合成法は、アミノフェニル誘導体(XV)が、出発物質であるニトロフェニル誘導体(XIV)の還元により合成され、及び該合成された化合物がその後、所望のアルデヒドと還元的アミノ化に付されて、最終化合物(XVI)が得られるような手順において達成され得る。
アゾール誘導体は、式Iで示されるアゾール誘導体に加えて、その医薬的に許容される塩、即ち、酸又は塩基の付加塩、及びその立体化学異性体を含み、該塩は、望ましくない効果を伴うことなく、それをもって投与された対象において本発明化合物の活性を維持するあらゆる塩であり得る。そのような塩は、無機塩又は有機塩であり得る。該塩の例は、酢酸、硝酸、アスパラギン酸、スルホン酸、硫酸、マレイン酸、グルタミン酸、ギ酸、コハク酸、リン酸、フタル酸、タンニン酸、酒石酸、臭化水素酸、プロピオン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、ステアリン酸、エシレート(esilate)、乳酸、重炭酸、重硫酸、重酒石酸、シュウ酸、酪酸、エデト酸カルシウム、カムシル酸、炭酸、クロロ安息香酸、クエン酸、エデト酸、トルエンスルホン酸、エジシル酸、エシル酸、フマル酸、グルセプト酸、パモ酸、グルコン酸、グリコリルアルサニル酸、メチルクエン酸、ポリガラクツロン酸、ヘキシルレゾルシノン酸、マロン酸、ヒドラバミン酸、塩酸、ヨウ化水素酸、ヒドロキシナフトエ酸、イセチオン酸、ラクトビオン酸、マンデル酸、エストル酸、粘液酸、ナプシル酸、ムコネッキ酸、p-ニトロメタンスルホン酸、ヘキサミン酸、パントテン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、サリチル酸、スルファミン酸、スルファニル酸、メタンスルホン酸及びテオクリン酸を含む。また、前記塩基性塩の形態は、例えば、アンモニウム塩、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム及びカルシウム塩のような、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩、ベンザチン、N−メチル−D−グルカミン及びヒドラバミン塩のような有機塩基の塩並びにアルギニン及びリジンのようなアミノ酸を有する塩を含む。それと同時に、塩の形態は適当な塩基又は酸で処理することによって、遊離形態に転換され得る。ここで使用される用語“付加塩”は式Iで表される置換アゾール誘導体又はその塩が形成し得る溶媒和物を含む。該溶媒和物は、水和物又はアルコール和物であり得る。
ここで使用される用語“式Iで表される置換アゾール誘導体の立体化学異性体”は、式Iで表される置換アゾール誘導体が有し得る全ての可能な形態を言及する。他に指定又は
言及が無い限り、式Iで表される置換アゾール誘導体の化学名は、基本分子構造の全てのジアステレオマー及びエナンチオマーを含む、全ての可能な立体化学異性体の混合物を示す。特に、各不斉中心は、R−又はS−配置の何れかを、及び、2価の環状(部分)飽和基上の置換基は、シス−又はトランス−配置を有し得る。二重結合を有する化合物は、E−又はZ−立体化学を有し得る。式Iで表される置換アゾール誘導体の全ての立体化学異性体は、本発明の範囲内に含まれ得ることが意図される。
上記の式Iの定義に従って、置換アゾール誘導体の例は、
カルバミン酸3−(4−ベンジルオキシ−フェニル)−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
カルバミン酸3−(4−ベンジルオキシ−フェニル)−[1,2,4]オキサジアゾール−5−イルメチルエステル、
カルバミン酸3−(4−ベンジルオキシ−フェニル)−イソチアゾール−5−イルメチルエステル、
カルバミン酸3−(4−ベンジルオキシ−フェニル)−[1,2,4]チアジアゾール−5−イルメチルエステル、
カルバミン酸3−(4−ベンジルオキシ−2−クロロ−フェニル)−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
カルバミン酸3−(4−ベンジルオキシ−3−クロロ−フェニル)−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
カルバミン酸3−(4−ベンジルオキシ−3−ブロモ−フェニル)−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
カルバミン酸3−(4−ベンジルオキシ−3−フルオロ−フェニル)−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
カルバミン酸3−(4−ベンジルオキシ−3,5−ジメチル−フェニル)−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
カルバミン酸3−[4−(1−フェニル−エトキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
カルバミン酸3−[4−(2−フルオロ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
カルバミン酸3−[4−(3−フルオロ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
カルバミン酸3−[4−(4−フルオロ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
カルバミン酸3−[4−(2,6−ジフルオロ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
カルバミン酸3−[4−(2,3−ジフルオロ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
カルバミン酸3−[4−(3,5−ジフルオロ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
カルバミン酸3−[4−(3,4−ジフルオロ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
カルバミン酸3−[4−(2,4,6−トリフルオロ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
カルバミン酸3−[4−(3−トリフルオロメチル−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
カルバミン酸3−[4−(3−クロロ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
カルバミン酸3−[4−(2−クロロ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
カルバミン酸3−[4−(4−クロロ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
カルバミン酸3−[4−(2,6−ジクロロ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
カルバミン酸3−[4−(2,5−ジクロロ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
カルバミン酸3−[4−(2−クロロ−5−フルオロ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
カルバミン酸3−[4−(3−ニトロ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
4−[4−(5−カルバモイルオキシメチル−イソキサゾール−3−イル)−フェノキシメチル]−安息香酸メチルエステル、
カルバミン酸3−[4−(4−メチル−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
カルバミン酸3−[4−(2−メチル−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
カルバミン酸3−[4−(3−メトキシ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
3−[4−(3−トリフルオロメチル−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
カルバミン酸3−[4−(4−イソプロピル−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、及び
カルバミン酸3−[4−(4−第三ブチル−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステルを含み得る。
これらの置換アゾール誘導体の製造方法は、本願の発明者により提出された韓国特許出願第2009−15856号中に開示されているが、その開示の全てが参照としてここに組み込まれる。
本発明の態様に従って、式Iで表される置換アゾール誘導体は、以下の式II
式II
Figure 2013525478
で表される、カルバミン酸3−(4−ベンジルオキシ−フェニル)−イソキサゾール−5−イルメチルエステル(CBI)であり得る。
一方、本発明の態様に従う医薬組成物は、医薬的に許容されるキャリアを含み得る。
一般的に配合物中に使用される、本医薬組成物における医薬的に許容されるキャリアは、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及びミネラル油などを含むが、これらに限定されない。本医薬組成物は
更に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤及び保存剤を含み得る。好適な医薬的に許容されるキャリア及び配合物は、Remington's Pharmaceutical Sciences (第19版, 1995年)に開示されている。
本発明の1態様に従う医薬組成物は、経口で又は非経口的に投与され得る。非経口投与は、静脈注射、皮下注射、筋肉注射、腹腔内注射、内皮投与、局所投与、経鼻投与、肺内投与及び直腸投与を含み得る。経口投与のため、消化を防止するために、医薬組成物から形成される活性薬物は、被覆され得るか又は医薬組成物は製剤化され得る。加えて、医薬組成物は、活性物質を標的細胞に移動させることが可能なデバイスにより投与され得る。
本発明の1態様に従う医薬組成物の好適な投与量は、多くの因子、例えば、製剤化方法、投与方法、患者の年齢、体重、性別、病状、食餌、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応選択性に依存し、所望する治療又は予防に有効である該医薬組成物の投与量は、通常の技術を有する医者により容易に決定及び処方し得る。
該医薬組成物は、本技術分野における周知の方法により、医薬的に許容されるキャリア及び/又は添加剤を用いて製剤化されて、単回投与形態に製造されるか又は多回投与容器中に収められる。その際、製剤は、油又は水性媒体の溶液、懸濁液又は乳化溶液、抽出物、粉末、顆粒、錠剤又はカプセルであり得、更に、分散剤又は安定化剤を含み得る。加えて、該医薬組成物は、個別の薬剤として又は他の薬剤と共に投与され得、従来の薬剤と連続して又は同時に投与され得る。
該医薬組成物は、神経細胞の死滅又は神経変性を阻害するために使用される。
ここで使用される用語“神経細胞”とは、は一つの細胞体(cell body)、細胞体から押し出された突起の一つ、即ち、軸索又は神経突起及びいくつかの樹上突起からなる動物細胞を言及し、該神経細胞の例は、感覚ニューロン、運動ニューロン及び介在ニューロンを含み得る。加えて、前記神経細胞は、中枢神経系、脳、脳幹、脊髄及び中枢神経系と末梢神経系のシナプス領域、神経支持細胞、グリア細胞及びシュワン細胞を構成する神経細胞を含み得る。
ここで使用される用語“神経細胞の死滅(death of neuron)”は、アポトーシス(apoptosis)による神経細胞の死滅を含むものと解釈される。加えて、ここで使用される用語“神経変性(neurodegeneration)”は、神経細胞の死滅を含む神経細胞の構造又は機能の段階的な変性を意味する。
神経細胞のアポトーシス又は神経変性が、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病のような種々の脳疾患を引き起こすという事実は、本技術分野において周知であり、これらの疾患の予防又は治療のために神経細胞のアポトーシスの機構に関する研究が実施されてきた。Nature Reviews Molecular Cell Biology 1巻、120-130頁 (2000年)及びJournal of Cellular and Molecular Medicine, 12巻、2263-2280頁 (2008年)は、神経細胞のアポトーシスがアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、虚血、脳卒中及び硬化症のような種々の疾患の原因であること、並びに酸化的ストレス及びミトコンドリアの機能障害を引き起こす神経細胞のアポトーシスの機構に関する研究を通して、神経変性性疾患の予防又は治療の方法が見出されたことを開示している。従って、神経細胞のアポトーシス又は神経変性を抑制する効果を有する化合物を含む医薬組成物が、上記した疾患の予防又は治療のために使用し得ることは、医薬分野の当業者により明確に理解される。
本発明の1態様に従う医薬組成物は、神経保護のために使用し得る。
ここで使用される用語“神経保護(neuroprotection)”は、アポトーシス又は変性から神経細胞を保護する神経系内の機構を意味し、特に、神経傷害を減少、抑制又は緩和する効果を意味し、また同様に、神経傷害により損傷された神経組織内の神経細胞を保護、
回復又は再生する効果も意味する。加えて、用語“神経保護”は、本発明に関係する当業者により一般的に使用される標準用語である(Neuro Report, 9巻、3955-3959頁(1998年); Chen, J-F., J. Neurosci., 21巻、RC143頁(2001年))。
ここで使用される用語“神経細胞の保護(protection of neuron cell)”は、神経外傷を減少又は改善する機構或いは神経外傷により損傷された神経細胞を保護又は回復する機構を意味する。加えて、ここで使用される用語“神経外傷(nervous insult)”は、種々の因子(例えば、代謝因子、毒性因子、神経毒性因子及び化学的因子)により引き起こされた神経細胞又は神経組織の損傷を意味する。神経外傷の例は、酸化的ストレス、カルシウム恒常性の異常調節、ミトコンドリアの機能障害、興奮毒性、カスパーゼ活性及び栄養不足を含み得る(Nature Reviews Molecular Cell Biology 1巻、120-130頁(2000年),
Neurotoxicology and Teratology 24巻、675-682頁(2002年))。該医薬組成物は、これらの種々の神経外傷による神経細胞のアポトーシス又は神経変性を抑制する効果又は該神経外傷から神経細胞を保護する効果を有する。例えば、上記した神経外傷の中で、酸化的ストレは神経細胞のアポトーシス又は変性と関連し、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、脱髄疾患(demyelinating diseases)、糖尿病性多発神経障害(diabetic polyneuropathy)、ダウン症候群、HIV神経障害、ハンチントン病、多系統萎縮症(multiple system atrophy)、パーキンソン病、脳卒中及び虚血再潅流損傷、タウオパチー(tauopathy)及び外傷性脳損傷(reactive oxygen species)のような種々の疾患を引き起こし得る。
一方、活性酸素種に対する抗酸化酵素の活性の増加が、神経保護の機構の一つであることもまた既知である(Free radical Biology & Medicine, 33巻(2号)、182-191頁(2002年))。従って、該医薬組成物は、活性酸素種の減少を誘導することにより酸化的ストレスを抑制し、それにより神経細胞のアポトーシスを妨げ、よって上記の種々の疾患の予防又は治療のために使用し得る。
従って、該医薬組成物は、神経保護的治療剤として使用し得るが、それは、脳又は脊髄が、虚血、発作、痙攣又は外傷により損傷されることを防止することを意図する医薬品又は化学品である。
本発明の1態様に従う医薬組成物は、神経回復のために使用し得る。
ここで使用される用語“神経回復”は、神経細胞から新しいシナプス連結の形成を促進することにより損傷された神経系を回復することを言及する。該神経回復は損傷された神経細胞にり引き起こされた機能不全の修復を意味し得る。例えば、該神経回復は、周囲の細胞との伝達のための神経細胞からの神経突起の形成及び成長を意味するか又はスパイン(spine)の数を増加することを意味する。
神経系の種々の疾患が神経回復により予防又は治療し得るという事実は本技術分野において周知である。Neurotoxicity Research, 2巻、71-84頁(2000年)は、神経回復において使用される医薬品により、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症及びアルツハイマー病のような特定の疾患の予防又は治療の可能性を開示しており、国際公開第07/022182号は、ハンチントン病等のような疾患が、中枢神経系の神経回復により治療され得ることを開示している。
前記のように、神経細胞のアポトーシス又は神経変性は、種々の神経外傷により引き起こされ及び種々の神経変性性疾患に関連するため、本発明の1態様に従う医薬組成物は、種々の神経外傷を阻害することにより該神経変性性疾患を予防又は治療する効果を有し得る。
本発明の1態様に従う医薬組成物は、神経変性性疾患又は虚血若しくは再潅流に関連する疾患の予防又は治療のために使用し得る。
該医薬組成物により治療し得る神経変性性疾患の例は、認知症、ハンチントン病、パー
キンソン病及び筋萎縮性側索硬化症を含み得るが、これらに制限されない。加えて、該医薬組成物により治療し得る、虚血若しくは再潅流に関連する疾患の例は、虚血性脳卒中、一過性虚血発作、心筋虚血、筋虚血及び脳に対する血流の延長停止に関する手術法により生じる虚血を含み得るが、これらに制限されない。
本発明の1態様に従う医薬組成物は、脳卒中、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン−ALS−認知症症候群、ウィルソン病、多発性硬化症、進行性核上まひ、神経障害痛に関連する双極性障害、大脳皮質基底核変性症、統合失調症、注意欠陥多動性障害(ADHD)、認知症、筋萎縮性側索硬化症、網膜疾患、てんかん、卒中、一過性脳虚血発作、心筋虚血、筋虚血、脳に対する血流の延長停止に関する手術法により生じる虚血、頭部外傷、脊髄損傷、低酸素症及び鬱病からなる群より選択される疾患の予防又は治療のために使用し得る。
本発明の1態様に従って、神経細胞のアポトーシス又は神経変性に関係する疾患を治療する方法であって、該方法は、対象を該医薬組成物と接触させることを含む方法が提供される。
該方法は、対象を該医薬組成物と接触させることを含む、神経細胞のアポトーシス又は神経変性を阻害する方法を含み得る。
該疾患は、脳卒中、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン−ALS−認知症症候群、ウィルソン病、多発性硬化症、進行性核上まひ、神経障害痛に関連する双極性障害、大脳皮質基底核変性症、統合失調症、注意欠陥多動性障害(ADHD)、認知症、筋萎縮性側索硬化症、網膜疾患、てんかん、卒中、一過性脳虚血発作、心筋虚血、筋虚血、脳に対する血流の延長停止に関する手術法により生じる虚血、頭部外傷、脊髄損傷、低酸素症及び鬱病からなる群より選択され得る。
該接触方法は、生体外(in vitro)又は生体内(in vivo)で遂行でき、接触方法が、生体内で遂行される場合、該方法は該医薬組成物を対象に投与することを含み得る。
該対象は、細胞、組織、器官又は個体であり得る。加えて、該投与方法は、該医薬組成物を好適な緩衝剤中に溶解し、その後、結果として生じた溶液を、細胞、組織又は器官と直接接触させるか又は個体に非経口投与することにより達成され得る。上記の治療方法において使用される医薬組成物及び投与方法の詳細な記載は、既に上記で提供されており、よって、それは過度な複雑性を避けるために、ここでは提供されない。
該医薬組成物が投与される対象は、全ての動物を含み得る。例えば、該動物はヒト、犬、猫、又はマウスであり得る。
本発明の1つ以上の態様が、以下の実施例を参照して更に詳細に記載される。これらの実施例は、単に説明を目的とするだけのものであり、本発明の1つ以上の態様の範囲を制限することを意図するものではない。
図面の簡単な説明
本発明の上記の及び他の特性と利点は、添付図面を参照してその例示的な態様を詳細に記載することにより、更に明らかになるだろう。
図1は、本発明の1態様に従う、CBIが投与されたMPTP−誘導サルのパーキンソン病の程度を示すグラフである。 図2は、本発明の1態様に従う、CBIが投与されたMPTP−誘導サルの内側線条体及び尾側線条体にドーパミン輸送体が存在しているか否かを示す顕微鏡写真である。 図3は、本発明の1態様に従う、CBIが投与されたMPTP−誘導マウスの尾懸垂試験結果を示すグラフである。 図4は、本発明の1態様に従う、CBIが投与されたMPTP−誘導マウスの線条体内のドーパミン濃度を示したグラフである。 図5は、本発明の1態様に従う、CBIが投与されたMPTP−誘導マウスの黒質の神経細胞の減少の程度を示すグラフである。 図6は、本発明の1態様に従う、抗体としてチロシンヒドロキシラーゼを用いる免疫組織化学染色及びクレシル・バイオレット染色により観察される、CBIが投与された6−OHDA−誘導ラットの黒質緻密部の神経細胞の減少の程度を示すグラフである。 図7は、本発明の1態様に従う、CBIが投与されたマロネート−誘導マウスの線条体が損傷から回復されるか否かを示す写真である。 図8は、本発明の1態様に従う、CBIが投与されたマロネート−誘導マウスの損傷した線条体の回復の程度を示すグラフである。 図9は、本発明の1態様に従う、CBIで処理されたMAO−B欠損SH−SY5Y細胞のアポトーシスの程度を示すグラフである。 図10は、本発明の1態様に従う、CBIで処理されたMAO−B欠損SH−SY5Y細胞中のBcl−2のmRNA量の測定結果を示すグラフである。 図11は、本発明の1態様に従う、CBIで処理されたMAO−B欠損SH−SY5Y細胞中のBcl−2及びBcl−xLタンパク質の量の測定結果を示す写真である。 図12は、本発明の1態様に従う、CBIで処理されたMAO−B欠損SH−SY5Y細胞中のBDNFのmRNA量の測定結果を示すグラフである。 図13は、本発明の1態様に従う、CBIで処理されたMAO−B欠損SH−SY5Y細胞中のGDNFのmRNA量の測定結果を示すグラフである。 図14は、本発明の1態様に従う、CBIで処理されたMAO−B欠損SH−SY5Y細胞中のNGFのmRNA量の測定結果を示すグラフである。 図15は、本発明の1態様に従う、CBIが投与されたマウスのNGFのmRNA量の測定結果を示すグラフである。 図16は、本発明の1態様に従う、CBI及びMPP+で処理されたMAO−B欠損SH−SY5Y細胞中のミトコンドリアの膜電位を示すグラフである。 図17は、本発明の1態様に従う、CBI及びMPP+で処理されたMAO−B欠損SH−SY5Y細胞中の細胞質シトクロムcの量の測定結果を示す写真である。 図18は、本発明の1態様に従う、CBI及びMPP+で処理されたMAO−B欠損SH−SY5Y細胞中のカスパーゼ3の活性の測定結果を示すグラフである。 図19は、本発明の1態様に従う、CBI及びMPP+で処理されたMAO−B欠損SH−SY5Y細胞中の活性酸素種の顕微鏡写真である。 図20は、本発明の1態様に従う、CBI及びMPP+で処理されたMAO−B欠損SH−SY5Y細胞中に存在する活性酸素種を示すグラフである。 図21は、本発明の1態様に従う、CBI及びMPP+で処理されたMAO−B欠損SH−SY5Y細胞中の、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)及びグルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)の活性の測定結果を示すグラフである。 図22は、本発明の1態様に従う、CBIが投与されたマウスの線条体及び黒質中のカタラーゼ、SOD及びGPxの活性の測定結果を示すグラフである。 図23は、本発明の1態様に従う、CBIが投与されたMPTP−誘導マウスの神経突起であるか否かを示す顕微鏡写真及び分析グラフである。 図24は、本発明の1態様に従う、CBIが投与されたMPTP−誘導マウスのスパインであるか否かを示す顕微鏡写真及び分析グラフである。
以下、一つ以上の具体例を実施例を通してより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、一つ以上の具体例を例示的に説明するためのものであり、発明の範囲がこれらの実施例に制限されるものではない。この関連で、本態様は異なる形態を有し得るものであり、ここに示した記載に限定されるように解釈されるべきではない。従って、該態様は、図を参照することにより、本明細書の観点を説明するためだけに以下に記載されるものである。
実施例1:カルバミン酸3−(4−ベンジルオキシ−フェニル)−イソキサゾール−5−イルメチルエステル(式II)
式II
Figure 2013525478
1.1. 4−ベンジルオキシ−ベンズアルデヒドオキシムの合成
4−ベンジルオキシベンズアルデヒド4.24g(20mmol)をエタノール及び水(3:1 100mL)の0.2M混合液に溶解し、続いて撹拌した。ここにNH2OH−HCl 2.78g(40mmol)及び酢酸ナトリウム2.46g(30mmol)を加え、室温で約30分間撹拌した。続いて、液体クロマトグラフィーにより反応の終結を確認し、水及びエタノールを減圧蒸留して、淡黄色の固体化合物を得た。この淡黄色の固体化合物を水と酢酸エチルで3回抽出し、有機溶媒層を減圧下で乾燥して粗生成物を得、その後、該粗生成物をヘキサン/酢酸エチル(10:1)で精製して、白色の固体化合物を得た。得られた固体はさらに精製することなく、次の反応に用いた。
1.2. [3−(4−ベンジルオキシ−フェニル)−イソキサゾール−5−イル]−メタノールの合成
4−ベンジルオキシ−ベンズアルデヒドオキシム2.27g(10mmol;92%純度)を塩化メチレン40mL(0.25M)に溶解し、その後、結果として生じた溶液に、プロパルギルアルコール1.77mL(30mmol)を加えた。その後、結果として生じた溶液に、10%NaOCl 13.7mL(20mmol)を滴下漏斗を用いて0℃で非常にゆっくり滴下した。NaOClの添加が終了した後、結果として生じた溶液を、温度をゆっくり室温まで昇温しながら約5時間撹拌した。続いて、液体クロマトグラフィーにより反応の終結を確認し、結果として生じた物を減圧蒸留に付して塩化メチレンを蒸発し、残余物に水200mLを加え、得られた固体をろ過した。ろ過された化合物を大量の水で洗浄し、ジエチルエーテルで洗浄して固体化合物を得た。得られた固体化合物を酢酸エチル/ヘキサン(1:2)で精製して、白色の固体の[3−(4−ベンジルオキシ−フェニル)−イソオキサゾール−5−イル]−メタノールを得た(収量:2.5g)。
1H−NMR(CDCl3,200MHz)δ7.7(d,2H),7.4(m,4H),7.1(d,2H),6.5(s,1H),5.1(s,2H),4.8(s,2H)
1.3. カルバミン酸3−(4−ベンジルオキシ−フェニル)−イソキサゾール−5−イルメチルエステルの合成
250mLフラスコに入れた、THF(50mL、0.2M)及び[3−(4−ベンジルオキシ−フェニル)−イソキサゾール−5−イル]−メタノール(2.813g、10mmol)の溶液に、クロロスルホニルイソシアネート1.04mL(12mmol)を−78℃でゆっくり加えた。続いて、液体クロマトグラフィーにより出発物質が完全に除去されたことを確認した後、水を結果として生じた反応溶液に加えた。1時間後、生じた溶液を減圧蒸留に付して、そこからTHFを蒸発し、結果として生じた物に水100mLを加え、得られた固体をろ過した。ろ過された固体は水100mLと酢酸エチル/ヘキサン(1:2)溶液で、それぞれ洗浄し、乾燥して、粗生成物3.4gを得た(純度:95.9%)。該粗生成物を1%メタノールを含む酢酸エチル/ヘキサン/塩化メチレン(1:4:1)溶液で精製して、カルバミン酸3−(4−ベンジルオキシ−フェニル)−イソキサゾール−5−イルメチルエステル(CBI)2.743gを99%の純度で得た。
1H−NMR(CDCl3,200MHz)δ7.7(d,2H),7.4(m,4H),7.1(d,2H),6.6(s,1H),5.2(s,2H),5.1(s,2H),4.8(brs,2H)
実施例2:MPTP−誘導サルを使用することによるCBIの神経保護効果の確認
1−メチル−4−フェニル−1,2,3,6−テトラヒドロピリジン(MPTP)は、パーキンソン病患者で観察されるものと類似した臨床的、生化学的及び病理的特徴を誘導すると報告されており、齧歯類及び霊長類のパーキンソン病のための動物モデルを作製するのに広範に使用される神経毒素として既知である(J. Neural Transm., 103巻、987-1041頁(1996年); Neurotoxicol. Teratol. 24巻、607-620頁(2002年))。MPTPは、モノアミンオキシダーゼ(MAO)−Bにより1−メチル−4−フェニル-ピリジニウム(MPP+)に転換され、MPP+はドーパミン輸送体(DAT)に高い親和性を有し、ミトコンドリアの機能障害及び酸化的ストレスを誘導し、結果としてドーパミンの生成を誘導するドーパミン性ニューロンのアポトーシスを生じる(J. Neurochem., 61巻、1191-1206頁(1993年); J. Neural Transm., 103巻、987-1041頁(1996年); Mov. Disord., 13巻、35-38頁(1998年); Restor. Neurol. Neurosci., 16巻、135-142頁(2000年))。
実験モデルとして、マカクザル(n=35、3ないし4歳)を使用した。該マカクザルサルを3群に分け、各群に0.2mg/kgのMPTPを静脈注射により投与した(1日1回、毎日、パーキンソン疾患スコアが8に達するまで又は14日間)。14日間の投与終了翌日、それぞれ3群に賦形剤(対照群)、1mg/kgのCBI及び1mg/kgのラサギリン(米国特許第5,457,133号に開示されたR(+)−N−プロパルギル−1−アミノインダン ラサギリンの製造方法を用いて製造された)を4週間経口投与し、パーキンソン疾患スコアの変化を測定した。加えて、ドーパミン作動薬としてのCBIの効果を確認するために、MPTP−誘導サルモデルから内側線条体及び尾側線条体に存在するドーパミン輸送体をドーパミン輸送体結合分析(dopamine transporter binding assay)に付した。
実施例2−1:パーキンソン病の程度の測定
パーキンソン病の程度は、4つの基準:a)可動範囲、b)運動機能低下、c)姿勢異常の程度及びd)震えに基づいて、サルの各群のビデオ撮影された行動を分析することにより測定された。パーキンソン疾患スコアは、(4−可動範囲)+運動機能低下+姿勢異常の程度+震えの和により評価された。従って、総合的なパーキンソン疾患スコアの最大値は10となる。該パーキンソン疾患スコアは2時間にわたって30分毎に10分間測定された。即ち、最も高いパーキンソン疾患スコアの最大値は40である。一方、4つの基準に基づいて遂行される評価方法は以下の通りであり、以下に示す評価スコアは、観察期間を通して観察された代表的な行動を示す:
a)可動範囲のスコア:0=動きなし;1=頭だけ動く;2=観察時間の30%以上を、運動なしに、頭、手足及び/又は胴体を動かす;3=観察時間の30%以下を歩く/歩るか、ケージの壁を登る;4=観察時間の30%以上を歩く/歩くか、ケージの壁を登る

b)運動機能低下のスコア:0=正常な動きの速度及び正常な動きの開始;1=動きが若干遅くなる;2=中程度の遅い動き、動きを開始して維持することが難しい、体が明確に固まる;3=運動不能、体が持続的に固まり、結果として動けない。
c)姿勢異常の程度のスコア:0=正常、姿勢が正しい、頭を持ち上げられる、正常なバランス;1=曲がった胴体、頭を持ち上げられる;2=曲がった胴体、首及び頭を持ち上げることができない、バランスを失う。
d)震えのスコア:0=ない;1=あり。
パーキンソン病の程度の測定結果として、CBIが投与されたサル群が、パーキンソン病の治療に使用される薬物として既知のラサギリンが投与されたサル群に比して、パーキンソン病の程度が顕著に低くなっていることが確認された(図1参照)。
実施例2−2:ドーパミン輸送体結合の分析
脳を各サル群から摘出し、脳幹をそこから分離し、その後大脳半球を正中線に沿って二等分した。組織を−45℃でイソペンタン中に浸漬し、急速に冷凍し、その後−80℃で貯蔵した。大脳半球の冠状切片を、−17℃において低温保持装置中で20μmの厚さで製作し、その後解凍した。解凍された生成物をゼラチンでコートされたスライド上に載置し、スライド上で乾燥し、その後−80℃で貯蔵した。
ドーパミン輸送体結合のために、[125I]−(E)−N−(3−ヨードプロ−2−フェニル)−2βカルボキシメチル−3β(4'−メチルフェニル)−ノルトロパン(PE2I)の放射性元素を用いる標識化が、ドーパミン神経末端を確認するために使用される慣用の方法に従ってスタンニル(stannyl)前駆体から遂行された(D. Guilloteau等, 1998年)。結果として生じた物を精製して、2000Ci/mmolの活性を有する、[125I]PE2Iの輸送体が添加されない形態(no-carrier-addedform)を得た。関連技術で開示された方法を使用することにより、大脳半球の冠状切片を、pH7.4のホスフェート緩衝液(NaH2PO4 10.14mM、NaCl 137mM、KCl 2.7mM、KH2PO4 1.76mM)中の100pM[125I]PE2Iを用いて、90分間25℃で培養した(S. Chalon等, 1999年; E. Bezard等, 2001年)。隣接した切片を100のコカイン(Sigma, St Louis, MO)の存在下で培養して、非特異的結合を確認した。培養後、切片を4℃で20分間、ホスフェート緩衝液で2回洗浄し、4℃で蒸留水で1秒間濯いだ。得られた切片を室温で乾燥し、その後X線カセット中の調整にされた[125I]−マイクロスケール(Amersham)と一緒に、β放射能−敏感性フィルム(Hyperfilm s max, Amersham, Buckingamshire, UK)に3日間露出して、所望の領域に結合された放射能を測定した。
図2で示されるように、CBIが投与されたサル群は、それらの中央線条体及び尾側線条体中に多数のドーパミン輸送体を提示し、CBIと同量のラサギリンが投与されたサル群により提示されたものより顕著に多い量のドーパミン輸送体を提示した。この結果は、CBIがドーパミン性ニューロンのアポトーシスを效果的に阻害し、それにより、MPTPによるドーパミン輸送体の損失が、対照群又はラサギリンが投与されたサル群よりも相対的に少ないことを示す。この結果から、CBIが、パーキンソン病の進行を阻害することを含む、神経保護を実行できることが確認された。
実施例3:MPTP−誘導マウスモデルを用いるCBIの神経保護効果
実験モデルとして、C57BL/6マウス(n=94、8週齢;雄性)を使用した(亜株:C57BL/6NCrljBgi, ORIENT BIO INC.)。該マウスに、30mg/kgのMPTPを腹腔内注射により1日1回、4日間投与し、最終投与日から4日後に、該マウスを3群に分け、賦形剤(対照群)、1mg/kgのCBI及び1mg/kgのラサギリンに、それぞれ1日1回、10日間経口投与した。最終投与翌日、尻尾懸垂テスト(TST)を各群に行い、線条体(striatum)と黒質脳組織を各群のマウスから摘出し、それにより線条体におけるドーパミン及びその代謝産物の濃度及び黒質(substantia nigra)における神経細
胞の減少の程度を測定した。
実施例3−1:尻尾懸垂テストによるマウスの行動分析
MPTP及び薬物投与による行動損失の誘発の程度を測定するために、尻尾懸垂テストを行った。TSTは、前記の化合物をそれぞれ3群に投与した7日後に、幅1cmの円形ステンレス棒を35cm高さにある左右が黒色の木材で遮蔽された幅16cm、高さ40cmのケージに固定するという方法で遂行された。マウスの運動時間を秒単位で6分間測定し、それにより該化合物の効能を評価した。
TST分析の結果として、MPTPが投与されたマウス群は有意な行動損失を示したものの、CBIが投与されたMPTP−誘導マウス群は正常マウスと同じ程度の行動を示し、ラサギリンが投与されたMPTP−誘導マウス群と比べて優れた行動回復能力を示すことが確認された(図3参照)。
実施例3−2:線条体内のドーパミン及びその代謝産物の量の測定
上記のMPTP及び化合物の投与に従って線条体内のドーパミン及びそのドーパミン代謝産物の量の変化を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により測定した。上記の化合物をそれぞれ3群に投与した7日後、各群のマウスを頚椎脱臼により犠牲し、直ちに脳組織を摘出した。該脳組織から線条体を採取し、0.5mLのHPLC分析希釈液(0.1Mの過塩素酸、0.1mM EDTA)を線条体に添加し、その後、超音波処理装置を使用して組織ホモジネートを調製した。該ホモジネートを12,000rpmで15分間遠心分離し、上清をニトロセルロース膜ろ紙(0.2μm、ミリポア)でろ過した。HPLC分析のために、HR−80カラム(80mm×4.6mm、粒径:3μm、ESA、USA)を使用し、移動相(0.07M リン酸二水素ナトリウム、1mM オクタスルホン酸ナトリウム、0.1μm EDTA、5%アセトニトリル、pH3.2)の流速を0.7mL/分に保持し、電気化学検出器(Coulochem III、ESA、USA)の電極電位はE1=−100mV、E2=350mVとした。
実験を通して線条体内のドーパミン濃度を分析した結果として、ラサギリンが投与されたマウス群は正常マウスに比べて約40%のドーパミン濃度の回復を示したが、一方、CBIが投与されたMPTP−誘導マウス群は正常マウスに比べて約70%のドーパミン濃度の回復を示したことが確認された(図4参照)。
実施例3−3:チロシンヒドロキシラーゼの抗体を用いる免疫組織化学染色
上記の化合物の投与に従う線条体及び黒質中のチロシンヒドロキシラーゼ(tyrosine hydroxylase)に対する抗体の発現における変化を、免疫組織化学染色により測定した。各群のマウスをペントバルビタールナトリウム(50mg/kg)で麻酔し、該マウスの胸廓を開け、心臓内へ200mLの0.1M PBS(pH7.4)を潅流し、それにより血管内の血液を除去した。血液を十分に除去した後、250−300mLの4%パラホルムアルデヒド/PBS固定液を心臓内へ潅流し、脳を摘出し、該脳を24時間冷蔵条件でパラホルムアルデヒド/PBS固定液で後固定(postfixation)に付した。続いて、該脳組織をPBSで十分に洗浄して固定液を除去し、凍結の間の氷の結晶(ice crystal)の生成を防止するために、得られた脳組織を30%スクロース溶液中に収納し、それが沈むまでその中に貯蔵した。得られた組織を凍結用包埋剤(OCT compound)で包埋し、−40℃で冷凍し、クリオスタット(Cryostat)(Reichert Frigocut model 2000)を使用して、線条体と黒質を含む中脳領域の連続冠状切片を、厚さ40μmで製作した。該冠状切片を30分間3%H22/PBS中に維持し、その後30分間0.3%Triton X−100及び3%ウシ血清アルブミンを含む0.1M PBS中に維持された。ドーパミンを含む細胞を選択的に染色するために、該切片を室温で一夜、1次抗体としての抗−マウスモノクロナールTH(Chemicon International, Temecula, CA; 1:500)と反応させ、ビオチン化されたヤギ−抗−マウスIgG(Vector Lab, Burlingame, CA, 1:200)を2次抗体として使用した。続いて、アビジン−ビオチン結合を、Vectasta
in elite ABC kit(Vector Lab, Burlingame, CA)を使用して誘導し、該組織において、3,4−ジアミノベンジジン(DAB)を使用して顕色を遂行した。得られた組織をPBSに入れ、スライドガラス上に載せ、得られたものを乾燥し、その後、カバーガラスでカバーした。得られたものにおける中脳領域の黒質を、200倍の倍率で、デジタルカメラ付き顕微鏡(オリンパス BX-60, オリンパス光学, 東京, 日本)を使用して観察し、チロシンヒドロキシラーゼに対する抗体に陽性反応を示す細胞を観察し、記録し、Graph pad Prism 4 programを用いて統計分析(一元配置分散分析(One-way ANOVA))を実施した。
上記のように、チロシンヒドロキシラーゼに対する抗体を用いる免疫組織化学染色により、黒質中の神経細胞における減少の程度を分析した結果として、CBIが投与されたMPTP−誘導マウスの群は、ラサギリンが投与されたMPTP−誘導マウスの群と同程度の黒質中の神経細胞の減少の程度を示した(図5参照)。この結果から、CBIがドーパミン作動薬として機能し、それにより神経保護の遂行が可能となり、ドーパミン作動薬として従来既知であるラサギリンより優れた効果を有することが確認された。
実施例4:6−OHDA−誘導ラットモデルを用いることによるCBIの神経保護効果の確認
6−ヒドロキシドーパミン(6−OHDA)は、ヒドロキシルラジカルの生成を増加させ、それにより黒質及び線条体の神経細胞の変性を誘導する神経毒素として既知である。ヒドロキシルラジカルは、神経細胞の末端部分を迅速に破壊(J. Neural. Transm., 103:987-1041(1996); J. Neurosci., 19:1284-1293(1999))し、それにより黒質緻密部(SNpc)中の細胞の漸進的な損失を引き起こし、そのような損失は、初期のパーキンソン病患者において観察される黒質及び線条体の漸進的な変性と類似することが知られている(Brain Res., 26巻、301-307頁(1991年); Neurosci., 59巻、401-415頁(1994年); Neurosci., 67巻、631-647頁(1995年); Neurosci., 72巻、641-653頁(1996年))。
実験モデルとして、ORIENT BIO INC.により供給されたウィスターラット(賦形剤及びCBI n=7、ラサギリン n=6;6週齢;20匹の雄性ラット)を用いた。20μg/μLの6−OHDAを含む溶液3μLの片側注射を、各ラットの線条体(位置:前面−1.0mm、背面−3.0mm、後腹部面−5.0mm)において行い、それにより線条体内の神経細胞の変性を誘導した。ラットを3群に分け、賦形剤(対照群)、1mg/kgのCBI及び1mg/kgのラサギリンを、6−OHDA投与1時間前及び1日おきに1回で6週間、それぞれ3群に経口投与した。最終投与日から4週、5週及び6週後に、アポモルヒネ−誘導回転試験を各群において行った。アポモルヒネ−誘導回転試験は、各群のラットに0.5mg/kgのアポモルヒネを腹腔内注射により投与し、各群のラットを回転チャンバーに置き、その回転動作を45分間記録し、それにより各群のラットの1分当りの回転数を測定してその平均値を決定するという方法で遂行した。加えて、アポモルヒネ−誘導回転試験を遂行した後、最終投与日から6週間後、各群のラットを犠牲し、それにより黒質緻密部の神経細胞における減少の程度を、チロシンヒドロキシラーゼに対する抗体を用いる免疫組織化学染色及びクレシル・バイオレット染色を使用して確認した。上記の実施例3−3に記載されたようにして、黒質を含む中脳領域の連続冠状切片を製作し、該切片をPBSに入れ、得られた切片をシランでコートされたスライドガラスに装着して乾燥し、該スライドガラスをキシレン、100%アルコール、95%アルコール、70%アルコール及び蒸留水中に、それぞれ5分、2分、1分、1分及び2分間入れた。続いて、得られたスライドガラスを1%クレシル・バイオレット溶液に5分間浸漬し、蒸留水、70%アルコール、95%アルコール、100%アルコール及びキシレンで、それぞれ2分、1分、1分、2分及び5分間洗浄し、該スライドガラスをカバーガラスでカバーし、デジタルカメラ付き顕微鏡(オリンパス BX-60, オリンパス光学, 東京, 日本)を用いて観察した。中脳領域の黒質を200倍の倍率で観察し、クレシル・バイオレットに対して陽性反応を示す細胞を観察して記録し、その後Graph pad Prism 4 programを用いて統計分析(一元配置分散分析(One-way ANOVA))を行った。
図6に示されるように、CBIが投与された6−OHDA−誘導ラットの群は神経細胞の減少において顕著に減少された程度を示し、ラサギリンが投与された6−OHDA−誘導ラットの群に対して優れた効果を有することが確認された。
実施例5:マロネート−誘導マウスモデルを用いることによるCBIの神経保護効果の確認
マロネートは、ミトコンドリアの酵素であるコハク酸デヒドロゲナーゼの可逆的な阻害剤であり、ミトコンドリアの電子伝達系を抑制して興奮毒性ニューロンの変性を誘導するか、または線条体からのドーパミン放出を増加させて、線条体の損失を引き起こすことが知られている。ミトコンドリアにおける生体エネルギー欠乏は、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病及び筋萎縮性側索硬化症のような種々の神経変性性疾患の病理現象と関連しており(Ann. Neurol., 58巻、495-505頁(2005年); Nat. Rev. Neurosci., 7巻、278-294頁(2006年))、動物の線条体中へのマロネートの注入は、局所虚血やハンチントン病において観察されるものと類似した損失を引き起こす(Experimental Neurology, 178巻、301-305頁(2002年))。これは、神経細胞の幾つかの群に代謝ストレスを引き起こし、結果として黒質ドーパミン細胞及び線条体の両方の細胞体のドーパミン量が減少する(J. Neurochem., 61巻、1147-1150頁(1993年); Brain Res., 773巻、223-226頁(1997年); Neuroscience, 96巻、309-316頁(2000年))。
実験モデルとして、ICRマウス(n=34、10週齢;雄性)を用いた。各マウスにエクテシン5mL/kgを腹腔内注射で投与して麻酔し、定位装置の二つの水平調節器を両方の外耳道から0mmに固定し、該定位装置中でマウスの頭蓋骨を穿孔した。対照群として0.2mg/mLアスコルビン酸を用い、マロネート2.4umole/2を病変群及び化合物処理群へ、右側線条体(ブレグマ)から、前(AP)へ0.5mm、横(ML)へ1.2mm、硬膜から下(DV)へ3.1mmにおいて、1μL/分の速度でハミルトン注射器(10μL、26G針)を用いて注入した。マロネートが投与された群を2群に分け、0.5mL/kgの賦形剤(n=12)及び5mg/kgのCBI(n=14)を、それぞれ2群へ手術2時間前に腹腔内注射により投与し、再度、手術後1時間、1日、2日及び3日、即ち、全部で5回投与した。マロネートをマウスの線条体に注入し、該マウスを3日後に犠牲し、該マウスの脳を摘出して切片を製作した。その後、該切片を、2,3,5−トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)で染色した。
図7及び図8で示されるように、CBIがマロネートにより誘導された線条体中の神経細胞のアポトーシスを抑制し、それにより線条体の損傷された領域が顕著に減少することが確認された。従って、該結果は、CBIがミトコンドリアの損傷により引き起こされる神経細胞のアポトーシスを緩和することを示す。
実施例6:神経細胞の抗−アポトーシスによるCBIの神経保護効果の確認
脳卒中、脳損傷、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、アルツハイマー病及びパーキンソン病のような多くの神経変性性疾患は、神経細胞のアポトーシスにより特徴付けられ(The New England Journal of Medicine, 348巻、1365頁(2003年))、慢性の神経変性性疾患は幾つかの内的又は外的因子によるアポトーシス経路の誘導により引き起こされることが知られている。神経細胞のアポトーシスにおいて引き起こされる生化学的、分子生物学的変化を説明するために、神経細胞のアポトーシスの幾つかの段階において多角的な機構を示す物質又は神経保護薬物の治療を捜す取り組みが行われてきた(CNS drugs, 19巻、723頁(2005年); Nat. Rev. Neurosci., 7巻295頁(2006年))。
図6ないし10を参照して、CBIが幾つかの内的又は外的因子により引き起こされる神経細胞のアポトーシスを阻害し、それにより神経変性性疾患において治療効果を示すことが確認される。
この態様において、MAO−B欠損のヒト神経芽腫(neuroblastoma)SH−SY5Y細胞(韓国細胞株銀行)を用いた。該ヒト神経芽腫細胞のアポトーシスは血清飢餓(serum starvation)によって誘発された。正常培地中で培養されたMAO−B欠損のヒト神経
芽腫SH−SY5Y細胞を6−ウェルプレートに1.8×105細胞数/ウェルの濃度で分注し、1日間培養した後、該培地を、CBI(0.1、1及び10)を含む無血清培地、ラサギリン(0.1、1及び10)を含む無血清培地又は前記CBI又はラサギリンをいずれも含まない無血清培地に交替し、該細胞を更に37℃で48時間5%のCO2中で培養した。続いて、神経細胞のアポトーシスを引き起こさなかった対照群と比較して、死滅細胞の数を百分率で示した。
図9で示されるように、アポトーシスが誘発された神経細胞にCBIが投与されたとき、神経細胞のアポトーシスの程度が減少したことが確認された。特に、アポトーシスが誘発された神経細胞に10のCBIが投与されたとき、アポトーシスが誘発された神経細胞に10のラサギリンが投与された場合よりも、神経細胞のアポトーシスのより高い減少の程度、即ち、約33%の減少の程度を示すことが確認された。
一方、アポトーシスを媒介又は阻害するための方法において、種々の情報伝達タンパク質が含まれ、その代表的な例は、Bcl−2遺伝子ファミリータンパク質である(Journal of Bioenergetics and Biomembranes, 37巻、179-190頁(2005年); J. Cell Mol. Med.,
7巻、249-257頁(2003年); Genes and Development, 13巻、1899-1911頁(1999年))。従って、前記のように、0.1、1及び10のCBI又は0.1、1及び10のラサギリンをそれぞれアポトーシスが誘発された細胞へ添加し、得られた細胞を更に37℃で24時間5%のCO2中で培養し、mRNAを該培養細胞から抽出するか、又は細胞抽出物をそこから得て、それによりBcl−2mRNAの量及びBcl−2とBcl−xLタンパク質の量を測定した。Bcl−2mRNAの量は、リアルタイムRT−PCRにより測定し、Bcl−2とBcl−xLタンパク質量はウェスタンブロット法にり測定した。
SH−SY5Y細胞の総RNAを、SH−SY5Y細胞を無血精培地で24時間、CBI又はラサギリンで処理した後、RNeasy MiniKit(Qiagen)を用いて抽出した。2μgの総RNAをHigh Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)を用いて逆転写し、Bcl−2に対するTaqManプローブ(Applied Biosystems,USA)でリアルタイムPCR((Applied Biosystems, 7500 Real Time PCR SYSTEM)を行った。内部対照として、18S
RNAに対するmRNAを増幅した。標的遺伝子のmRNA水準の相対的な定量はddCt方法(Takekawa, 1998)により決定した。
ウェスタンブロット法のために、SH−SY5Y細胞をRIPA緩衝液(50mM Tris−ClpH7.4、1%NP−40、0.25%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%SDS、150mM NaCl、1mM EDTA)で溶解し、その後、遠心分離して細胞抽出物を得た。続いて、該細胞抽出物を定量化し、同量の細胞抽出物をSDS−PAGEゲルに負荷し、電気泳動した後、該ゲルをニトロセルロース膜に移し、該膜を、それぞれ、本技術分野において周知の方法を用いることにより1:5000に希釈された、Bcl−2に対する抗体(Cat#: 2872, Cell Signaling, USA)及びBcl−xLに対する抗体(Cat#: 2762, Cell Signaling, USA)を用いてブロットし、Bcl−2及びBcl−xLタンパク質の発現量を、ECLキット(Amersham Pharmacia)を用いて確認した。対照群としては、β−アクチンに対する抗体((Cat#: A2228, Sigma, USA)を対照として使用し、β−アクチンタンパク質の発現量を確認した。
図10及び図11で示されるように、アポトーシスが誘発された神経細胞にCBIが投与された場合、抗−アポトーシスの機能を有するBcl−2のmRNAの量は、対照よりも1.5ないし2倍多く、Bcl−2タンパク質の量もまた、対照よりも1.5ないし2倍多いことが確認された。加えて、別の抗−アポトーシスタンパク質であるBcl−xLの量もまた、対照よりも多いことが確認された。該結果から、CBIが神経細胞のアポトーシスを阻害する効果を有し、これにより神経保護効果を有することが確認された。
実施例7:神経栄養因子の発現誘導によるCBIの神経保護効果の確認
神経栄養因子は、神経細胞の発達、再生、治癒において重要な役割を果すタンパク質で、神経栄養因子の例は、脳−由来神経栄養因子((BDNF)、グリア細胞株由来神経栄
養因子(GDNF)及び神経成長因子(NGF)を含む。該神経栄養因子の誘導は、神経細胞のアポトーシスの阻害を可能とする(Nature medicine, 15巻、331-337頁(2009年); Brain Research Bulletin, 57巻、817-822頁(2002年); The Journal of Neuroscience, 21巻、8108-8118頁(2001年); The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 322巻、59-69頁(2007年); TRENDS in Pharmacological Sciences, 27巻、619-625頁(2006年))。
実施例6と同様の方法を用いることにより、0.1、1及び10のCBI又は0.1、1及び10のラサギリンを、それぞれ、アポトーシスが誘発された細胞に添加し、得られた細胞を、更に37℃で24時間5%のCO2中で培養し、該培養細胞からmRNAを抽出し、それにより、BDNF、GDNF及びNGFのmRNA量をリアルタイムRT−PCRにより測定した。
図12ないし図14で示されるように、アポトーシスが誘発された神経細胞をCBIで処理した場合、BDNF、GDNF及びNGFのmRNA量は、それぞれ、対照よりも1.5ないし2倍、4ないし8倍及び2ないし2.5倍多いことが確認された。
加えて、神経栄養因子がCBIの処理により誘導されるか否かをin vivoにおいて確認するために、C57BL/6マウス(n=12、8週齢の雄性、ORIENT BIO INC.)を使用した。該マウスを3群(各群n=4)に分け、賦形剤(対照)、1mg/kgのCBI及び1mg/kgのラサギリンに、神経毒素の処理を行うことなく、それぞれ3群に1日に1回、8日間経口投与し、最終投与翌日に、各群のマウスから線条体及び黒質組織を摘出した。摘出された組織の細胞からmRNAを抽出し、それにより、NGFのmRNA量をリアルタイムRT−PCRにより測定した。
図15で示されるように、マウス群がCBIで処理された場合、線条体中のNGFのmRNA量が、他のマウス群よりも、約1.7倍ないし2.5倍多いことが確認された。特に、マウス群がCBIで処理された場合、線条体中のNGFの発現が、ラサギリンで処理されたマウス群においてより、顕著に高いことが確認された。該結果は、CBIが神経細胞の神経栄養因子の発現を誘導し、それにより神経細胞のアポトーシスを阻害し得ることを示す。
実施例8:神経細胞中のミトコンドリアの機能向上によるCBIの神経保護効果の確認
この態様において、MAO−B欠損ヒト神経芽種SH−SY5Y細胞(韓国細胞株銀行)を用いた。該細胞を37℃で24時間、5%のCO2でDMEM培地中で培養した。培養された細胞を5群に分け、各群に2mMの1−メチル−4−フェニルピリジニウム(MPP+)を添加し、該5群の3群に、それぞれ、1nM、10nM及び50nMのCBIで処理し、他の2群の一方を10nMのラサギリンで処理し、CBI又はラサギリンで処理された4群を、更に37℃で24時間、5%のCO2中で培養した。そこへMPP+だけが添加された1群を上記と同じ条件で培養した。続いて、製造業者のプロトコルに従って、MitoPTtmキット(Immunochemistry Technology社)を用いて、ミトコンドリアの膜電位(transmembrane potential)を決定した。ミトコンドリアの膜電位は蛍光プレートリーダー(Tecan社, Austria)を用いて確認した。ミトコンドリアの膜電位が低い場合、緑色蛍光を表示し、一方、それが高い場合、赤色蛍光を表示する。よって、RFU値(赤色蛍光値/緑色蛍光値)を該結果から決定し、該結果を図16に示した。
MPP+は、ミトコンドリアの膜電位を下げ、それによりミトコンドリア膜の不安定性を誘導する。ミトコンドリア膜の透過性上昇(membrane permeabilization)は、アポトーシスの過程において必須であり、よって、ミトコンドリア膜の安定性は、抗−アポトーシスの機構となり得る(Brain Res. Rev., 29巻、1-25頁(1999年))。図16で示されるように、神経細胞にMPP+が添加された場合、ミトコンドリアの膜電位は、CBIの処理により濃度依存的に安定化され、ミトコンドリアの膜電位の安定化効果は、CBIと同じ濃度のラサギリンで処理された神経細胞の群においてより、約2倍以上高いことが確認された。
上記のように、脳卒中、脳損傷、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、ア
ルツハイマー病及びパーキンソン病のような多くの神経変性性疾患は、神経細胞のアポトーシスにより特徴付けられ(The New England Journal of Medicine, 348巻、1365頁(2003年))、神経細胞のアポトーシスは幾つかの内的又は外的因子によるアポトーシス経路の誘導により引き起こされる。加えて、ミトコンドリアの膜の安定性は、抗−アポトーシスの機構であり、神経細胞のアポトーシスがBcl−2又はBcl−xLタンパク質により阻害され、ミトコンドリア膜が該タンパク質により安定化されることは既知である。(Biochem Biophys Res Commun., 304巻(3号)、433-435頁(2003年); N Engl J Med., 348巻(14号)、1365-1375頁(2003年); Brain Res Rev., 29巻(1号)、1-25頁(1999年); Journal of
Neurological Sciences, 283巻、240-320頁(2009年))。従って、該結果は、CBIがミトコンドリアの膜電位を安定化し、それにより上記の神経変性性疾患を予防又は治療し得ることを示す。
加えて、アポトーシスは、ミトコンドリアからシトクロムcの放出及びカスパーゼ3の活性化の機構により引き起こされることが知られている(The New England journal of Medicine, 348巻、1365-1375頁(2003年))。CBIの処理によるミトコンドリアの膜電位の安定性が神経細胞の抗−アポトーシスと関連するか否かを確認するために、細胞抽出物を細胞群から得、それにより、細胞質内のシトクロムcの量及びカスパーゼ3の活性を測定した。
実施例8−1:シトクロムcの放出の測定
SH−SY5Y細胞を実施例7に記載したのと同様の条件下で培養し、その後、PBSで洗浄した。高浸透圧緩衝液(20mM HEPES、10mM KCl、2mM MgCl2、1mM EDTA)にプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)及びホスファターゼ阻害剤カクテル(Roche)を添加し、SH−SY5Y細胞を得られた溶液の100μLで処理し、その後、均一に懸濁した。得られたものを氷上に30分間放置し、その後、12,000rpmで20分間遠心分離した。続いて、該上清の同量をSDS−PAGEゲルに負荷した後、電気泳動し、該ゲルをニトロセルロース膜に移し、該膜を、本技術分野において周知の方法を用い、1:2000に希釈されたシトクロムc(Santacruz, sc13156)を使用してブロットし、シトクロムcの発現をECLキット(Amersham Pharmacia)を用いて評価した。
図17で示されるように、神経細胞にMPP+が添加された場合、細胞質内のシトクロムcの量がCBIの処理により減少し、ミトコンドリアから放出されたシトクロムcの量が、CBIと同量のラサギリンで処理されたMPP+が添加された神経細胞の場合よりも少ないことが確認された。
実施例8−2:カスパーゼ3/7の活性の測定
上記と同様の条件下、SH−SY5Y細胞を5×105細胞数/ウェルの濃度で、96ウェル−プレート中で培養し、該細胞を2mMのMPP+及びCBI(1、5、10及び50nM)又はラサギリン(50nM)で処理し、得られた細胞を24時間培養した。続いて、100μLのApo−ONEカスパーセ3/7試薬(Promega, G7790)をそこへ添加して一緒に混合し、得られたものを更に4時間培養した。培養終了後、蛍光プレートリーダー(GeminiXPS, Molecular Devices)を使用することにより、励起(excitation)波長495nm及び発光(emission)波長521nmで蛍光を測定した。図18で示されるように、カスパーゼ3の活性がラサギリンで処理された細胞の場合と同様に、CBIの処理により減少されたことが確認された。
実施例8の結果から、CBIが神経細胞中のミトコンドリア膜を安定化し、それによりミトコンドリアからのシトクロムcの放出を防止し、従ってカスパーゼ3の活性を減少し、それにより細胞のアポトーシスを阻害することが確認された。
上記したように、脳卒中、脳損傷、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、アルツハイマー病及びパーキンソン病のような多くの神経変性性疾患は、神経細胞のアポトーシスのより特徴付けられ、よって、該結果は、CBIが神経細胞のアポトーシスを阻
害し、それにより前記神経変性性疾患を予防又は治療し得ることを示す。
実施例9:神経細胞の活性酸素種を阻害することによるCBIの神経保護効果の確認
この態様において、MAO−B欠損ヒト神経芽種SH−SY5Y細胞(韓国細胞株銀行)を用いた。該細胞を37℃で24時間、5%のCO2でDMEM培地中において培養した。培養された細胞を3群に分け、各群に2mMのMPP+を添加し、該3群のうちの1群を50nMのCBIで処理し、他の2群の一方を50nMのラサギリンで処理し、該3群を更に、37℃で24時間、5%のCO2で培養した。そこにMPP+だけが添加された群を、前記と同じ条件下で培養した。続いて、該細胞を、活性酸素種を検出可能な蛍光染料である2,7−ジクロロフルオレセインジアセテート(DCF−DA)で染色し、その後、共焦点顕微鏡(株式会社ニコン、日本)を用いて観察した。
図19及び図20で示されるように、神経細胞にMPP+が添加された場合、活性酸素種は、CBIと同じ濃度のラサギリンで処理されたMPP+が添加された神経細胞の場合と同様に、CBIの処理により顕著に減少した。
細胞中の活性酸素種の発生及び増加は、アポトーシスを誘導することが知られており、よって、上記の結果から、CBIが活性酸素種の減少を誘導し、それによりアポトーシスを阻害することが確認された。このような酸化的ストレスは、神経細胞のアポトーシス又は神経変性性疾患と関連する種々の疾患、例えば、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、脱髄疾患(demyelinating diseases)、糖尿病性多発神経障害(diabetic polyneuropathy),ダウン症候群、HIV神経障害、ハンチントン病、多系統萎縮症(multiple system atrophy)、パーキンソン病、脳卒中及び虚血再潅流損傷、タウオパシー(tauopathy)及び外傷性脳損傷を引き起こすことが知られており(Free radical Biology & Medicine, 33(2):182-191(2002))、よって、該結果は、CBIが活性酸性種の減少を誘導し、それにより酸化的ストレスを阻害し、従って神経細胞のアポトーシスを防止し、よって種々の神経変性性疾患の予防又は治療のために使用されることを示す。
実施例10:抗酸化酵素の活性増加によるCBIの神経保護効果の確認
この態様において、MAO−B欠損ヒト神経芽種SH−SY5Y細胞(韓国細胞株銀行)を用いた。該SH−SY5Y細胞を1.8×105細胞数/ウェルの濃度で6−ウェルプレート中に分注し、その後、37℃で24時間5%のCO2で培養した。得られた細胞を3群に分け、各群に2mMのMPP+を添加し、該3群のうちの2群をそれぞれ0.1で処理し、得られたものを更に37℃で24時間、5%のCO2で培養した。MPP+で処理されなかった対照群を上記と同様の条件下で培養した。続いて、細胞抽出物を該細胞から得、これにより抗酸化酵素、即ち、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)及びグルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)の活性を測定した。
図21で示されるように、MPP+が添加された神経細胞は、MPP+が添加されなかった細胞群に比べて、カタラーゼ及びGPxの活性が減少する傾向を示し、CBIで処理されたMPP+が添加された神経細胞は、抗酸化酵素の減少された活性において増加を示した。特に、GPxの活性が対照においてよりも約2.5倍ないし4倍高かったことが確認された。
加えて、抗酸化酵素の活性がCBIの処理により増加するか否かをin vivoで確認するために、C57BL/6マウス(n=12)、8ないし9週齢の雄性)を用いた(ORIENT BIO INC.)。C57BL/6マウスを3群(各群n=4)に分け、賦形剤(対照)、1mg/kgのCBI及び1mg/kgのラサギリンを、それぞれ3群に、神経毒素の処理することなく、8日間経口投与し、最終投与翌日に、各群のマウスから線条体及び黒質組織を摘出した。細胞抽出物を該組織の細胞から得、これにより、カタラーゼ、SOD及びGPxの活性を測定した。
図22で示されるように、CBIが投与されたマウスの群において、SODの活性における顕著な変化はなかったが、しかし、カタラーゼの活性は線条体において約13%上昇し、GPxの活性は黒質において約28%上昇した。
細胞中の活性酸素種の発生及び増加は、アポトーシスを誘導することが知られており、また、抗酸化酵素は該活性酸素種を分解することが知られており、よって、該結果から、CBIが神経細胞中の抗酸化酵素の活性、特に、黒質中のGPxの活性を増加し、それにより、活性酸素種の減少を誘導し、従ってアポトーシスを阻害できることが確認された。加えて、該結果は、CBIが活性酸性種の減少を誘導し、それにより酸化的ストレスを阻害して神経細胞のアポトーシスを防止し、よって上記の種々の疾患の予防又は治療のために使用し得ることを示す。
実施例11:CBIの神経細胞回復効果の確認
実験モデルとして、C57BL/6マウス(n=8/群(計4群)、8週齢;雄性)を用いた(亜株: C57BL/6NCrljBgi, ORIENT BIO INC.より入手可能)。30mg/kgのMPTPを該マウスに腹腔内注射により1日1回、4日間投与し、最終投与日から4日後、該マウスを3群(n=4)に分け、賦形剤(対照)、1mg/kgのCBI及び1mg/kgのラサギリンをそれぞれ、該3群に1日1回、10日間経口投与した。最終投与翌日に、線条体及び黒質組織を各群のマウスから摘出した。該組織中の神経突起の数及び神経細胞当たりのスパイン(spine)の数が増加するか否かを観察するために、ビブラトーム(vibratome)を用いて線条体又は黒質を含む200μMの厚さの冠状スライスを製作した。各群のマウスを犠牲し、各群から脳を摘出し、その後、カルボゲン(carbogen)(5%CO2及び95%O2)でバブルリングされた冷たい高濃度のスクロース解剖緩衝液(87mM NaCl、2.5mM KCl、1.25mM NaH2PO4、25mM NaHCO3、1mM CaCl2、3mM MgCl2、10mM デキストロース、及び75mM スクロース)中に置いた。ビブラトームを遂行する間、スライスチャンバーをカルボゲン化されたスクロース解剖緩衝液で均一に満たした。スライス工程が完了した後、全スライスをPBSで洗浄し、PBS溶液中4%のパラホルムアルデヒドで固定した。固定された脳スライスを、1.5%アガロース(PBS中)ブロック上に置いた。その写真をZeiss LSMイメージブラウザソフトウェア(Carl Zeiss Microimaging, Germany, version 4.0 SP2)を用い、共焦点蛍光顕微鏡(ZEISS LSM 510 META)を使用して得た。
図23及び図24で示されるように、MPTP−誘導マウスがCBIで処理された場合、神経突起の数が増加し、スパインの数もまた正常細胞の水準まで回復した。特に、ラサギリンが投与されたMPTP−誘導マウスの群の場合、スパインの数の増加は観察されたが、しかし、神経突起における増加は統計的有意性を示さなかった。該結果から、CBIがアポトーシスを阻害し、同様に、神経可塑性(neural plasticity)を促進する効果も有することが確認された。
実施例12:CBIの投与及びCBIを含む錠剤の製造(予想)
本発明に従う医薬組成物は、神経細胞のアポトーシス又は神経変性を阻害するか、又は神経保護若しくは神経回復において使用される。該医薬組成物の臨床的に好適な投与量(経口投与)は、成人において25mgないし100mgである。
該投与量に基づいて、以下の表1で示された成分を含む錠剤を、通常的な方法を使用して製造した。賦形剤としてアビセル(Avicel)102(微細結晶形セルロース)を使用した。
Figure 2013525478
該成分の好適な投与量は、体重60kgの成人のために、1日当り該成分を含む錠剤1個又は2個である。
本発明の1つ以上の態様に従って、医薬組成物は神経細胞のアポトーシス又は神経変性と関連する疾患を效果的に予防又は治療し得る。
本発明は、その例示的な態様を参照して具体的に示され及び記載されているが、以下の請求項により定義される本発明の精神及び範囲から逸脱すること無く、様々な変更及び修正がなされ得ることは当業者により理解される。

Claims (9)

  1. 神経細胞のアポトーシス又は神経変性を阻害するための医薬組成物であって、該組成物は、
    以下の式I
    式I
    Figure 2013525478
    (式中、Rは、置換されているか又は未置換の炭素原子数1ないし15のアリールアルキル基、置換されているか又は未置換の炭素原子数1ないし10のヘテロアリールアルキル基及び置換されているか又は未置換の直鎖の炭素原子数1ないし10のアルキル基からなる群より選択され;
    Yは、O及び−N−R1からなる群より選択され;
    1はH及び直鎖又は分岐鎖の炭素原子数1ないし3のアルキル基からなる群より選択される少なくとも1種を表し;
    2は、H及びハロゲン原子からなる群より選択され;
    Aは、N、O及びSからなる群より選択され;
    Bは、C又はNを表し;
    Zは、置換されているか又は未置換の複素環基、カーバメート基、−OC(=O)NR34、NH2、NR56、NC(=NH)NH2及び−NC(=O)NH2からなる群より選択され;
    3及びR4は、それぞれ独立して、H;未置換であるか又はNH2及びNR78からなる群より選択される少なくとも1種で置換された炭素原子数1ないし5のアルキル基;未置換であるか又は炭素原子数1ないし3のアルキル基で置換された複素環からなる群より選択されるか、又は、R3及びR4は一緒になって、未置換であるか又は炭素原子数1ないし3のアルキル基で置換された5−又は7−員の複素環を形成し;
    5及びR6は、それぞれ独立して、H;炭素原子数2ないし3のアルケニル基;炭素原子数2ないし3のアルキニル基;及び直鎖又は分岐鎖の、未置換であるか又は−OH、−C(O)NH2、炭素原子数1ないし3のアルコキシ基及びカーバメート基からなる群より選択される少なくとも1種で置換された炭素原子数1ないし7のアルキル基からなる群より選択されるか、又は、R5及びR6は一緒になって、置換されているか又は未置換の脂肪族環状アミン又は芳香族環状アミンを形成し;
    7及びR8は、それぞれ独立して、H及び直鎖又は分岐鎖の炭素原子数1ないし3のアルキル基からなる群より選択される少なくとも1種を表し;
    mは、0ないし4の範囲における整数を表し;及び
    nは、0ないし5の範囲における整数を表す。)により表される置換アゾール誘導体、その医薬的に許容される塩、該置換アゾール誘導体の異性体、該置換アゾール誘導体の溶媒和物、該置換アゾール誘導体の水和物及びそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物の治療有効量並びに医薬的に許容されるキャリアを含む組成物。
  2. 神経保護のための医薬組成物であって、
    以下の式I
    式I
    Figure 2013525478
    (式中、Rは、置換されているか又は未置換の炭素原子数1ないし15のアリールアルキル基、置換されているか又は未置換の炭素原子数1ないし10のヘテロアリールアルキル基及び置換されているか又は未置換の直鎖の炭素原子数1ないし10のアルキル基からなる群より選択され;
    Yは、O及び−N−R1からなる群より選択され;
    1はH及び直鎖又は分岐鎖の炭素原子数1ないし3のアルキル基からなる群より選択される少なくとも1種を表し;
    2は、H及びハロゲン原子からなる群より選択され;
    Aは、N、O及びSからなる群より選択され;
    Bは、C又はNを表し;
    Zは、置換されているか又は未置換の複素環基、カーバメート基、−OC(=O)NR34、NH2、NR56、NC(=NH)NH2及び−NC(=O)NH2からなる群より選択され;
    3及びR4は、それぞれ独立して、H;未置換であるか又はNH2及びNR78からなる群より選択される少なくとも1種で置換された炭素原子数1ないし5のアルキル基;未置換であるか又は炭素原子数1ないし3のアルキル基で置換された複素環からなる群より選択されるか、又は、R3及びR4は一緒になって、未置換であるか又は炭素原子数1ないし3のアルキル基で置換された5−又は7−員の複素環を形成し;
    5及びR6は、それぞれ独立して、H;炭素原子数2ないし3のアルケニル基;炭素原子数2ないし3のアルキニル基;及び直鎖又は分岐鎖の、未置換であるか又は−OH、−C(O)NH2、炭素原子数1ないし3のアルコキシ基及びカーバメート基からなる群より選択される少なくとも1種で置換された炭素原子数1ないし7のアルキル基からなる群より選択されるか、又は、R5及びR6は一緒になって、置換されているか又は未置換の脂肪族環状アミン又は芳香族環状アミンを形成し;
    7及びR8は、それぞれ独立して、H及び直鎖又は分岐鎖の炭素原子数1ないし3のアルキル基からなる群より選択される少なくとも1種を表し;
    mは、0ないし4の範囲における整数を表し;及び
    nは、0ないし5の範囲における整数を表す。)により表される置換アゾール誘導体、その医薬的に許容される塩、該置換アゾール誘導体の異性体、該置換アゾール誘導体の溶媒和物及びそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物の治療有効量並びに医薬的に許容されるキャリアを含む組成物。
  3. 神経回復のための医薬組成物であって、
    以下の式I
    式I
    Figure 2013525478
    (式中、Rは、置換されているか又は未置換の炭素原子数1ないし15のアリールアルキル基、置換されているか又は未置換の炭素原子数1ないし10のヘテロアリールアルキル基及び置換されているか又は未置換の直鎖の炭素原子数1ないし10のアルキル基からなる群より選択され;
    Yは、O及び−N−R1からなる群より選択され;
    1はH及び直鎖又は分岐鎖の炭素原子数1ないし3のアルキル基からなる群より選択される少なくとも1種を表し;
    2は、H及びハロゲン原子からなる群より選択され;
    Aは、N、O及びSからなる群より選択され;
    Bは、C又はNを表し;
    Zは、置換されているか又は未置換の複素環基、カーバメート基、−OC(=O)NR34、NH2、NR56、NC(=NH)NH2及び−NC(=O)NH2からなる群より選択され;
    3及びR4は、それぞれ独立して、H;未置換であるか又はNH2及びNR78からなる群より選択される少なくとも1種で置換された炭素原子数1ないし5のアルキル基;未置換であるか又は炭素原子数1ないし3のアルキル基で置換された複素環からなる群より選択されるか、又は、R3及びR4は一緒になって、未置換であるか又は炭素原子数1ないし3のアルキル基で置換された5−又は7−員の複素環を形成し;
    5及びR6は、それぞれ独立して、H;炭素原子数2ないし3のアルケニル基;炭素原子数2ないし3のアルキニル基;及び直鎖又は分岐鎖の、未置換であるか又は−OH、−C(O)NH2、炭素原子数1ないし3のアルコキシ基及びカーバメート基からなる群より選択される少なくとも1種で置換された炭素原子数1ないし7のアルキル基からなる群より選択されるか、又は、R5及びR6は一緒になって、置換されているか又は未置換の脂肪族環状アミン又は芳香族環状アミンを形成し;
    7及びR8は、それぞれ独立して、H及び直鎖又は分岐鎖の炭素原子数1ないし3のアルキル基からなる群より選択される少なくとも1種を表し;
    mは、0ないし4の範囲における整数を表し;及び
    nは、0ないし5の範囲における整数を表す。)により表される置換アゾール誘導体、その医薬的に許容される塩、該置換アゾール誘導体の異性体、該置換アゾール誘導体の溶媒和物及びそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物の治療有効量並びに医薬的に許容されるキャリアを含む組成物。
  4. 神経変性疾患又は虚血−若しくは再灌流−関連疾患の予防又は治療のための医薬組成物であって、該組成物は、
    以下の式I
    式I
    Figure 2013525478
    (式中、Rは、置換されているか又は未置換の炭素原子数1ないし15のアリールアルキル基、置換されているか又は未置換の炭素原子数1ないし10のヘテロアリールアルキル基及び置換されているか又は未置換の直鎖の炭素原子数1ないし10のアルキル基からなる群より選択され;
    Yは、O及び−N−R1からなる群より選択され;
    1はH及び直鎖又は分岐鎖の炭素原子数1ないし3のアルキル基からなる群より選択される少なくとも1種を表し;
    2は、H及びハロゲン原子からなる群より選択され;
    Aは、N、O及びSからなる群より選択され;
    Bは、C又はNを表し;
    Zは、置換されているか又は未置換の複素環基、カーバメート基、−OC(=O)NR34、NH2、NR56、NC(=NH)NH2及び−NC(=O)NH2からなる群より選択され;
    3及びR4は、それぞれ独立して、H;未置換であるか又はNH2及びNR78からなる群より選択される少なくとも1種で置換された炭素原子数1ないし5のアルキル基;未置換であるか又は炭素原子数1ないし3のアルキル基で置換された複素環からなる群より選択されるか、又は、R3及びR4は一緒になって、未置換であるか又は炭素原子数1ないし3のアルキル基で置換された5−又は7−員の複素環を形成し;
    5及びR6は、それぞれ独立して、H;炭素原子数2ないし3のアルケニル基;炭素原子数2ないし3のアルキニル基;及び直鎖又は分岐鎖の、未置換であるか又は−OH、−C(O)NH2、炭素原子数1ないし3のアルコキシ基及びカーバメート基からなる群より選択される少なくとも1種で置換された炭素原子数1ないし7のアルキル基からなる群より選択されるか、又は、R5及びR6は一緒になって、置換されているか又は未置換の脂肪族環状アミン又は芳香族環状アミンを形成し;
    7及びR8は、それぞれ独立して、H及び直鎖又は分岐鎖の炭素原子数1ないし3のアルキル基からなる群より選択される少なくとも1種を表し;
    mは、0ないし4の範囲における整数を表し;及び
    nは、0ないし5の範囲における整数を表す。)により表される置換アゾール誘導体、その医薬的に許容される塩、該置換アゾール誘導体の異性体、該置換アゾール誘導体の溶媒和物及びそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物の治療有効量並びに医薬的に許容されるキャリアを含む組成物。
  5. 脳卒中、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン−ALS−認知症症候群、ウィルソン病、多発性硬化症、進行性核上まひ、神経障害痛に関連する双極性障害、大脳皮質基底核変性症、統合失調症、注意欠陥多動性障害(ADHD)、認知症、筋萎縮性側索硬化症、網膜疾患、てんかん、卒中、一過性脳虚血発作、心筋虚血、筋虚血、脳に対する血流の延長停止に関する手術法により生じる虚血、頭部外傷、脊髄損傷、低酸素症及び鬱病からな
    る群より選択される疾患の予防又は治療のための医薬組成物であって、該組成物は、
    以下の式I
    式I
    Figure 2013525478
    (式中、Rは、置換されているか又は未置換の炭素原子数1ないし15のアリールアルキル基、置換されているか又は未置換の炭素原子数1ないし10のヘテロアリールアルキル基及び置換されているか又は未置換の直鎖の炭素原子数1ないし10のアルキル基からなる群より選択され;
    Yは、O及び−N−R1からなる群より選択され;
    1はH及び直鎖又は分岐鎖の炭素原子数1ないし3のアルキル基からなる群より選択される少なくとも1種を表し;
    2は、H及びハロゲン原子からなる群より選択され;
    Aは、N、O及びSからなる群より選択され;
    Bは、C又はNを表し;
    Zは、置換されているか又は未置換の複素環基、カーバメート基、−OC(=O)NR34、NH2、NR56、NC(=NH)NH2及び−NC(=O)NH2からなる群より選択され;
    3及びR4は、それぞれ独立して、H;未置換であるか又はNH2及びNR78からなる群より選択される少なくとも1種で置換された炭素原子数1ないし5のアルキル基;未置換であるか又は炭素原子数1ないし3のアルキル基で置換された複素環からなる群より選択されるか、又は、R3及びR4は一緒になって、未置換であるか又は炭素原子数1ないし3のアルキル基で置換された5−又は7−員の複素環を形成し;
    5及びR6は、それぞれ独立して、H;炭素原子数2ないし3のアルケニル基;炭素原子数2ないし3のアルキニル基;及び直鎖又は分岐鎖の、未置換であるか又は−OH、−C(O)NH2、炭素原子数1ないし3のアルコキシ基及びカーバメート基からなる群より選択される少なくとも1種で置換された炭素原子数1ないし7のアルキル基からなる群より選択されるか、又は、R5及びR6は一緒になって、置換されているか又は未置換の脂肪族環状アミン又は芳香族環状アミンを形成し;
    7及びR8は、それぞれ独立して、H及び直鎖又は分岐鎖の炭素原子数1ないし3のアルキル基からなる群より選択される少なくとも1種を表し;
    mは、0ないし4の範囲における整数を表し;及び
    nは、0ないし5の範囲における整数を表す。)により表される置換アゾール誘導体、その医薬的に許容される塩、該置換アゾール誘導体の異性体、該置換アゾール誘導体の溶媒和物及びそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物の治療有効量並びに医薬的に許容されるキャリアを含む組成物。
  6. 前記置換アゾール誘導体は、
    カルバミン酸3−(4−ベンジルオキシ−フェニル)−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
    カルバミン酸3−(4−ベンジルオキシ−フェニル)−[1,2,4]オキサジアゾール−5−イルメチルエステル、
    カルバミン酸3−(4−ベンジルオキシ−フェニル)−イソチアゾール−5−イルメチルエステル、
    カルバミン酸3−(4−ベンジルオキシ−フェニル)−[1,2,4]チアジアゾール−5−イルメチルエステル、
    カルバミン酸3−(4−ベンジルオキシ−2−クロロ−フェニル)−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
    カルバミン酸3−(4−ベンジルオキシ−3−クロロ−フェニル)−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
    カルバミン酸3−(4−ベンジルオキシ−3−ブロモ−フェニル)−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
    カルバミン酸3−(4−ベンジルオキシ−3−フルオロ−フェニル)−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
    カルバミン酸3−(4−ベンジルオキシ−3,5−ジメチル−フェニル)−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
    カルバミン酸3−[4−(1−フェニル−エトキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
    カルバミン酸3−[4−(2−フルオロ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
    カルバミン酸3−[4−(3−フルオロ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
    カルバミン酸3−[4−(4−フルオロ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
    カルバミン酸3−[4−(2,6−ジフルオロ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
    カルバミン酸3−[4−(2,3−ジフルオロ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
    カルバミン酸3−[4−(3,5−ジフルオロ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
    カルバミン酸3−[4−(3,4−ジフルオロ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
    カルバミン酸3−[4−(2,4,6−トリフルオロ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
    カルバミン酸3−[4−(3−トリフルオロメチル−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
    カルバミン酸3−[4−(3−クロロ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
    カルバミン酸3−[4−(2−クロロ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
    カルバミン酸3−[4−(4−クロロ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
    カルバミン酸3−[4−(2,6−ジクロロ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
    カルバミン酸3−[4−(2,5−ジクロロ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
    カルバミン酸3−[4−(2−クロロ−5−フルオロ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
    カルバミン酸3−[4−(3−ニトロ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
    4−[4−(5−カルバモイルオキシメチル−イソキサゾール−3−イル)−フェノキシメチル]−安息香酸メチルエステル、
    カルバミン酸3−[4−(4−メチル−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
    カルバミン酸3−[4−(2−メチル−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
    カルバミン酸3−[4−(3−メトキシ−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
    3−[4−(3−トリフルオロメチル−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、
    カルバミン酸3−[4−(4−イソプロピル−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステル、及び
    カルバミン酸3−[4−(4−第三ブチル−ベンジルオキシ)−フェニル]−イソキサゾール−5−イルメチルエステルからなる群より選択される請求項1ないし5の何れか1項に記載の医薬組成物。
  7. 前記置換アゾール誘導体は、
    以下の式II
    式II
    Figure 2013525478
    で表される化合物である請求項1ないし5の何れか1項に記載の医薬組成物。
  8. 神経細胞のアポトーシス又は神経変性に関係する疾患を治療する方法であって、
    該方法は、対象を請求項1ないし5の何れか1項に記載の医薬組成物と接触させることを含む方法。
  9. 前記疾患は、脳卒中、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン−ALS−認知症症候群、ウィルソン病、多発性硬化症、進行性核上まひ、神経障害痛に関連する双極性障害、大脳皮質基底核変性症、統合失調症、注意欠陥多動性障害(ADHD)、認知症、筋萎縮性側索硬化症、網膜疾患、てんかん、卒中、一過性脳虚血発作、心筋虚血、筋虚血、脳に対する血流の延長停止に関する手術法により生じる虚血、頭部外傷、脊髄損傷、低酸素症及び鬱病からなる群より選択される請求項8記載の方法。
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