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WO2018043476A1 - 筋萎縮性側索硬化症治療剤及び治療用組成物 - Google Patents

筋萎縮性側索硬化症治療剤及び治療用組成物 Download PDF

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WO2018043476A1
WO2018043476A1 PCT/JP2017/030899 JP2017030899W WO2018043476A1 WO 2018043476 A1 WO2018043476 A1 WO 2018043476A1 JP 2017030899 W JP2017030899 W JP 2017030899W WO 2018043476 A1 WO2018043476 A1 WO 2018043476A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
als
experimental example
therapeutic agent
ropinirole
ips cells
Prior art date
Application number
PCT/JP2017/030899
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
岡野　栄之
康希 藤森
博庸 奥野
Original Assignee
学校法人慶應義塾
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Filing date
Publication date
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Priority to ES17846481T priority patent/ES2973215T3/es
Priority to CN201780063645.1A priority patent/CN109843290A/zh
Priority to US16/328,636 priority patent/US20210113525A1/en
Priority to CA3038623A priority patent/CA3038623C/en
Priority to EP17846481.4A priority patent/EP3508202B1/en
Application filed by 学校法人慶應義塾 filed Critical 学校法人慶應義塾
Priority to PL17846481.4T priority patent/PL3508202T3/pl
Priority to CN202410549377.6A priority patent/CN118615281A/zh
Priority to DK17846481.4T priority patent/DK3508202T3/da
Priority to JP2018537293A priority patent/JPWO2018043476A1/ja
Publication of WO2018043476A1 publication Critical patent/WO2018043476A1/ja
Priority to JP2022024013A priority patent/JP7285599B2/ja

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for Amyotropic Lateral Sclerosis (ALS) and a composition for treating ALS.
  • ALS Amyotropic Lateral Sclerosis
  • This application claims priority on the basis of Japanese Patent Application No. 2016-172255 for which it applied to Japan on September 2, 2016, and uses the content here.
  • ALS is a neurodegenerative disease that causes severe muscle atrophy and muscle weakness, and is a type of motor neuron disease. In ALS, motor neuron-specific lesions are observed, and an extremely rapid pathological progression with a mean survival time of several years after onset is shown. There is no effective treatment for ALS, and it is desired to develop a therapeutic agent as soon as possible. Most of ALS is sporadic, but 10% of patients are familial and have clear genetic factors.
  • a mutant mouse called a wobbler mouse has been used as an ALS model because it grows and exhibits muscle atrophy of the forelimbs and face and eventually muscles of the hind limbs (see Non-Patent Document 1, for example).
  • Non-Patent Document 1 it is known that Wobbler mutations are not found in ALS patients.
  • SOD1 is known as one of the main causative genes of familial ALS, and transgenic mice introduced with mutant SOD1 (Non-patent Document 2) are used for drug discovery research. Drugs that indicate are not yet developed. Rather, most of the drugs selected by the SOD1-ALS model do not show usefulness in actual ALS patients. At present, the SOD1-ALS model is functioning as a model because of the difference between the SOD1-ALS model and actual clinical practice. There is concern that it may not be.
  • An object of the present invention is to provide an ALS therapeutic agent and an ALS therapeutic composition.
  • disease-specific iPS cells are the only means of reproducing in vitro the phenomenon that occurred in the patient's body, particularly in the nervous system.
  • disease-specific iPS cells it is possible to produce more accurate pathological models than existing cultured cells and pathological model mice.
  • central nervous system diseases by using neurons differentiated from iPS cells specific for central nervous system diseases, not only the pathological mechanism is clarified, but the neuron becomes a more accurate pathological model / drug efficacy evaluation model, which is effective. It becomes possible to select therapeutic drug candidates with high accuracy.
  • the present inventors induce differentiation of motor neurons from iPS cells derived from ALS patients, and administer the ALS therapeutic agent described later to motor neurons reflecting the pathology of ALS. It was clarified that the pathology of ALS in motor neurons was improved. Therefore, ALS can be treated with the ALS therapeutic agent described later.
  • ALS therapeutic agents described later are not only motor neurons that reflect the pathology of familial ALS, but also sporadic. It was clarified to improve the pathology of both motor neurons reflecting the pathology of sex ALS. Therefore, the ALS therapeutic agent described later has a therapeutic effect on both familial ALS and sporadic ALS.
  • the ALS treatment agent to be described later uses a phenotype found from an analysis using a pathological model using patient-derived iPS cells as an evaluation item, and a transitional phase in which the pathological phenotype is observed rather than the late stage close to cell death Since it is a compound obtained by screening using the pathological condition expressed in the above as an index, the therapeutic effect of ALS is high.
  • a therapeutic agent for ALS comprising, as an active ingredient, a compound represented by the following formula (1), a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof.
  • each R 1 independently represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a 4-hydroxyphenethyl group, and n represents an integer of 1 to 3.
  • R 1 is an n-propyl group.
  • [4] The compound according to any one of [1] to [3], wherein the compound represented by the formula (1) is 4- (2-di-n-propylaminoethyl) -2 (3H) -indole. ALS treatment.
  • the pharmaceutically acceptable salt of the compound represented by the formula (1) is 4- (2-di-n-propylaminoethyl) -2 (3H) -indole hydrochloride.
  • the ALS therapeutic agent according to any one of to [4].
  • [6] The ALS therapeutic agent according to any one of [1] to [5], which has a therapeutic effect on both familial ALS and sporadic ALS.
  • a composition for treating ALS comprising the ALS therapeutic agent according to any one of [1] to [5] and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • an ALS therapeutic agent and an ALS therapeutic composition can be provided.
  • Experimental Example I-2 it is a graph which shows the result of having measured the time-dependent change of the neurite length of a motor neuron. It is a graph which shows the ratio of the CV caspase 3 positive neuron in each motor neuron measured in Experimental example I-3. It is a graph which shows the LDH leak rate in each motor neuron measured in Experimental example I-4.
  • Experimental Example I-5 it is a graph which shows the result of having measured the ratio of the motor neuron by which localization to the cytoplasm of FUS protein was recognized.
  • Experimental Example I-6 it is a graph which shows the result of having measured the number of inclusion bodies of phosphorylated TDP-43 protein per each motor neuron.
  • FIG. 10 is a graph showing the number of stress granules per each motor neuron measured in Experimental Example I-7.
  • FIG. It is a graph which shows the time-dependent change of the LDH leakage rate in each motor neuron measured in Experimental example II-3. It is a graph which shows the time-dependent change of the ratio of the CV caspase 3 positive neuron in each motor neuron measured in Experimental example II-4.
  • 6 is a graph showing the change over time in the number of stress granules per each motor neuron measured in Experimental Example II-5. It is a graph which shows the neurite length of each motor neuron measured in Experimental Example III-1. It is a graph which shows the ratio of the CV caspase 3 positive neuron measured in Experimental example III-2.
  • the present invention provides a therapeutic agent for ALS comprising a compound represented by the following formula (1), a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof as an active ingredient.
  • each R 1 independently represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a 4-hydroxyphenethyl group, and n represents an integer of 1 to 3.
  • Examples of familial ALS that can be treated with the ALS therapeutic agent of this embodiment include ALS having a mutation in the FUS gene, ALS having a mutation in the TAR DNA-binding protein 43 kDa (TDP-43) gene, and the like. Moreover, as will be described later in Examples, the ALS therapeutic agent of the present embodiment has a therapeutic effect on both familial ALS and sporadic ALS.
  • n may be 1, 2 or 3.
  • R 1 may be a linear, branched or cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. More specifically, R 1 may be a methyl group, an ethyl group, or n- Examples include propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, cyclobutyl group, n-pentyl group, cyclopentyl group, n-hexyl group, cyclohexyl group and the like.
  • the compound represented by the above formula (1) may be 4- (2-di-n-propylaminoethyl) -2 (3H) -indole. That is, the compound represented by the above formula (1) may be ropinirole.
  • the chemical formula of ropinirole is shown in the following formula (2).
  • Ropinirole was developed as a treatment for Parkinson's disease because it has dopamine D2 receptor agonist activity on dopamine neurons. For this reason, clinical trials have already been completed, and safety when administered to a living body has been sufficiently confirmed. Since ropinirole is an existing drug with a clear medicinal mechanism, ALS therapeutics can be rapidly developed by expanding the indication.
  • ALS is a disease caused by motor neuron damage. It was a surprising result that compounds that are D2 receptor agonists show therapeutic effects in degenerative diseases of motor neurons that do not have D2 receptors. From the analysis of the medicinal efficacy mechanism of ropinirole, it can be expected to find clues to elucidating the pathological mechanism of ALS and the full pathology of ALS.
  • the ALS therapeutic agent of this embodiment may be a salt of the compound represented by the above formula (1), a solvate of the compound represented by the above formula (1), or the above formula (1).
  • the salt is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable salt.
  • inorganic acid salts such as hydrochloride, sulfate, hydrobromide, nitrate, phosphate, etc .; acetate, mesylate Organic salts such as succinate, maleate, fumarate, citrate and tartrate; alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as magnesium salt and calcium salt; aluminum Metal salts such as salts and zinc salts; ammonium salts such as ammonium salts and tetramethylammonium salts; organic amine addition salts such as morpholine and piperidine; amino acid addition salts such as glycine, phenylalanine, lysine, aspartic acid and glutamic acid .
  • the solvate of the compound represented by the above formula (1) and the solvate of the salt of the compound represented by the above formula (1) are not particularly limited as long as they are pharmaceutically acceptable solvates. Examples thereof include hydrates and organic solvates.
  • the ALS therapeutic agent of this embodiment may be 4- (2-di-n-propylaminoethyl) -2 (3H) -indole hydrochloride, that is, ropinirole hydrochloride.
  • composition for ALS treatment provides an ALS therapeutic composition comprising the ALS therapeutic agent described above and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the ALS therapeutic composition of the present embodiment may be formulated as a pharmaceutical composition, for example, orally in the form of tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc. It can be administered parenterally in the form of an agent, an external preparation for skin and the like. More specifically, examples of the external preparation for skin include dosage forms such as ointments and patches.
  • binders such as hypromellose, dextrin, macrogol 400, gelatin, corn starch, tragacanth gum, gum arabic, etc .
  • excipients such as lactose hydrate, D-mannitol, starch, crystalline cellulose, alginic acid Solvent for injections such as water, ethanol, glycerin
  • adhesives such as rubber adhesives, silicone adhesives, and the like.
  • the ALS treatment composition may contain an additive.
  • Additives include lubricants such as calcium stearate and magnesium stearate; sweeteners such as sucrose, lactose, saccharin and maltitol; flavoring agents such as peppermint and red mono oil; carmellose sodium, hydrogenated oil, light anhydrous silicic acid , Povidone, glycerin fatty acid ester, benzyl alcohol, phenol and other stabilizers; phosphate, sodium acetate and other buffers; solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol; yellow ferric oxide, ferric oxide, black oxidation Examples include colorants such as iron and titanium oxide.
  • composition for ALS treatment is formulated by combining the above-mentioned ALS therapeutic agent with the above-mentioned pharmaceutically acceptable carriers and additives as appropriate, and mixing them in a unit dosage form generally required for pharmaceutical practice.
  • ALS treatment composition of this embodiment one ALS therapeutic agent may be used alone, or two or more may be used in combination.
  • an appropriate daily dose of the composition for treating ALS is an amount containing the lowest dose of active ingredient (ALS therapeutic agent) effective for producing a therapeutic effect.
  • the above effective minimum dose is the activity of the active ingredient contained in the composition for ALS treatment, functional group modification that regulates fat solubility and water solubility, administration route, administration time, excretion rate of the specific active ingredient used
  • the dosage of the composition for treating ALS to a patient is an amount containing about 0.0001 to about 100 mg / kg body weight of the active ingredient per day.
  • the composition for treating ALS may be administered once a day or divided into about 2 to 4 times a day.
  • the dose of the ALS therapeutic composition is orally administered with 2 mg of the active ingredient once a day, and is increased every week.
  • the daily dose is preferably within the range not exceeding 16 mg of the active ingredient.
  • the present invention comprises a step of administering an effective amount of a compound represented by the above formula (1), a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof to a patient in need of treatment.
  • a method for treating ALS is provided.
  • examples of the compound represented by the formula (1), a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof are the same as those described above.
  • the present invention provides a compound represented by the above formula (1), a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof for the treatment of ALS.
  • examples of the compound represented by the formula (1), a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof are the same as those described above.
  • the present invention provides use of a compound represented by the above formula (1), a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof for producing an ALS therapeutic agent.
  • examples of the compound represented by the formula (1), a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof are the same as those described above.
  • iPS cells derived from healthy subjects iPS cells derived from ALS patients having mutations in FUS, and iPS cells derived from ALS patients having mutations in TDP-43 were differentiated into motor neurons.
  • the iPS cell lines used were as shown in Table 1, and all were derived from dermal fibroblasts.
  • each of the above cell lines was divided into SB431542 (CAS number: 301836-41-9) having a final concentration of 3 ⁇ M, CHIR99021 (CAS number: 252917-06-9) having a final concentration of 3 ⁇ M, and a final concentration of 3 ⁇ M.
  • the cells were cultured for 5 days in a medium containing Dorsorphin (CAS number: 866405-64-3) to induce differentiation-promoting pluripotent stem cells (DiSC). The medium was changed every day.
  • DiSC differentiation-promoting pluripotent stem cells
  • the obtained DiSC was dissociated into cells one by one and further cultured in a medium having the composition shown in Table 2 for 7 days in a hypoxic incubator.
  • the oxygen concentration was set to 5% (v / v).
  • the medium was changed every 2-3 days.
  • the cells were further cultured for 4 days in a medium having the composition shown in Table 3 in a low oxygen incubator.
  • the oxygen concentration was set to 5% (v / v).
  • the medium was changed every 2-3 days.
  • DAPT (CAS number: 208255-80-5) was added to the medium at a final concentration of 5 ⁇ M on the fourth day of culture in the medium having the composition shown in Table 3.
  • the cells were again dissociated one by one, and further cultured in the nerve differentiation-inducing medium having the composition shown in Table 4 for 5 to 40 days. This induced differentiation into motor neurons.
  • Neurogenic differentiation 1 Neurogenic differentiation 1
  • SRY-Box 1 SOX1
  • Oligoendrocycle Lineage Oligoendrocycle Lineage
  • Transcryption Factor 2 OLIGH3LET3, LIMHomeLET3
  • differentiation-induced motor neurons were immunostained to examine the expression of Gial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), ⁇ III-tubulin, HB9, and ChAT. As a result, it was confirmed from the results of immunostaining that iPS cells could be induced to differentiate into motor neurons.
  • GFAP Gial Fibrillary Acidic Protein
  • ⁇ III-tubulin ⁇ III-tubulin
  • ChAT ChAT
  • FIG. 1 is a graph showing measurement results of changes in neurite length over time.
  • the vertical axis represents neurite length (relative value), and the horizontal axis represents the number of days of culture from the start of differentiation induction.
  • the neurite length continuously increased in motor neurons differentiated from iPS cells derived from healthy subjects, whereas in motor neurons differentiated from iPS cells derived from ALS patients, about 40 days from the start of differentiation induction. It became clear that the neurite length was shortened with an eye peak. This result indicates that differentiation-induced motor neurons reflect the pathology of ALS.
  • Example I-3 (Analysis of cleaved caspase 3 positive rate) For each motor neuron 40 days after the initiation of differentiation induction induced by differentiation in Experimental Example I-1, an antibody against a cleaved type (Cleaved, CV) caspase 3 (hereinafter sometimes referred to as “CV caspase 3”) is used. Then, immunostaining was performed, and the percentage of cleaved (Cleaved, CV) caspase 3 (hereinafter sometimes referred to as “CV caspase 3”) positive neurons was measured.
  • CV caspase 3 positive neurons are neurons in which apoptosis is induced.
  • FIG. 2 is a graph showing the ratio of CV caspase 3-positive neurons in each motor neuron.
  • “**” indicates that there is a significant difference with a risk rate of less than 1%.
  • Example I-4 (Analysis of LDH leakage rate) Leakage of lactate dehydrogenase (LDH) from the cells was measured using each motor neuron on the 40th day from the start of differentiation induction induced by differentiation in Experimental Example I-1. The amount of LDH leaked into the medium is an indicator of cytotoxicity. A commercially available kit (model “LDH Cytotoxicity Detection Kit”, Takara Bio Inc.) was used to measure the LDH leakage rate.
  • FIG. 3 is a graph showing the measurement result (relative value) of the LDH leakage rate in each motor neuron.
  • “**” indicates that there is a significant difference with a risk rate of less than 1%.
  • FUS protein is an RNA binding protein localized in the nucleus.
  • ectopic localization of the FUS protein in the cytoplasm is observed in ALS patients having a mutation in FUS.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of measuring the percentage of neurons in which the localization of FUS protein was observed in each motor neuron.
  • “**” indicates that there is a significant difference with a risk rate of less than 1%.
  • motor neurons differentiated from iPS cells derived from healthy subjects compared to motor neurons differentiated from iPS cells derived from healthy subjects, motor neurons differentiated from iPS cells derived from ALS patients having a mutation in FUS (FUS-ALS) showed that FUS protein was converted to the cytoplasm. It was found that the percentage of neurons with localization was significantly higher.
  • FUS-ALS FUS-ALS
  • TDP-43 protein is an RNA binding protein localized in the nucleus. It is known that in ALS patients having a mutation in TDP-43, an abnormally phosphorylated TDP-43 protein inclusion body appears.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of measuring the number of inclusion bodies of phosphorylated TDP-43 protein (pTDP-43) per neuron in each motor neuron.
  • “**” indicates that there is a significant difference with a risk rate of less than 1%.
  • TDP-43-ALS TDP-43-ALS
  • FIG. 6 is a graph showing the measurement results of the number of stress granules per neuron in each motor neuron.
  • “**” indicates that there is a significant difference with a risk rate of less than 1%.
  • the number of stress granules per neuron was significantly increased in motor neurons differentiated from iPS cells derived from ALS patients compared to motor neurons differentiated from iPS cells derived from healthy subjects. It became clear. This result further supports that differentiation-induced motor neurons reflect the pathology of ALS.
  • Example I-8 (Screening for ALS treatment) Using motoneurons induced to differentiate in Experimental Example I-1, neurite length, ectopic localization of FUS protein, formation of stress granules, LDH leakage rate, CV-caspase 3 positive rate, phosphorylated TDP- Drugs that restore the ALS phenotype were screened from existing drug libraries using the formation of inclusion bodies of 43 proteins as an index.
  • ropinirole was found as a promising therapeutic agent for ALS.
  • Tables 5 and 6 show the percent improvement in ALS phenotype by the addition of ropinirole to the medium.
  • ropinirole was added to the medium 35 to 40 days after the start of differentiation induction of each iPS cell. It is assumed that the 35th to 40th day from the start of differentiation induction corresponds to the early stage of ALS pathology.
  • the improvement rate (%) of the phenotype of ALS was calculated by the following calculation formula (1).
  • Improvement rate (%) (AB) / (AC) ⁇ 100 (1)
  • A represents a measured value of motor neurons induced to differentiate from ALS patient-derived iPS cells in the absence of ropinirole
  • B represents differentiation-induced iPS cells derived from ALS patients in the presence of ropinirole.
  • the measurement value of a motor neuron is represented
  • C represents the measurement value of a motor neuron induced to differentiate from an iPS cell derived from a healthy person in the absence of ropinirole.
  • Table 5 shows the results of adding ropinirole at final concentrations of 0.1, 1, and 10 ⁇ M to the medium of motor neurons induced to differentiate from iPS cells derived from an ALS patient (FUS-ALS) having a mutation in FUS.
  • the results of adding ropinirole at final concentrations of 0.1, 1, and 10 ⁇ M to the medium of motor neurons differentiated from iPS cells derived from an ALS patient (TDP-43-ALS) having a mutation in TDP-43 are shown.
  • ropinirole was found to show a marked improvement effect on both ALS having a mutation in FUS and ALS having a mutation in TDP-43.
  • Table 7 shows the results of adding ropinirole at final concentrations of 0.1, 1, 10 nM to the medium of motor neurons induced to differentiate from iPS cells derived from ALS patients (FUS-ALS) having a mutation in FUS.
  • the results of adding ropinirole at final concentrations of 0.1, 1, 10 nM to the culture medium of motor neurons differentiated from iPS cells derived from an ALS patient (TDP-43-ALS) having a mutation in TDP-43 are shown.
  • ropinirole showed an improvement effect on both ALS having a mutation in FUS and ALS having a mutation in TDP-43 even at a final concentration of 0.1-10 nM, particularly at 1-10 nM. It was clarified that any of the items showed a remarkable improvement effect.
  • Table 9 shows the results of adding each drug to the medium of motor neurons induced to differentiate from iPS cells derived from ALS patients (FUS-ALS) having a mutation in FUS.
  • Table 10 shows the results of adding each drug to the medium of motor neurons induced to differentiate from iPS cells derived from ALS patients (TDP-43-ALS) having a mutation in TDP-43.
  • ropinirole showed a more marked improvement effect on both ALS having a mutation in FUS and ALS having a mutation in TDP-43, compared with riluzole, edaravone and ceftriaxone.
  • Example I-9 Evaluation of the efficacy of ropinirole in the late stage of ALS
  • the efficacy of ropinirole was evaluated in the same manner as in Experimental Example I-8, except that the addition timing of ropinirole was changed on the 50th to 62nd day from the start of differentiation induction of each iPS cell.
  • the 50th to 62nd day from the start of differentiation induction is assumed to correspond to the later stage of the pathology of ALS.
  • Ropinirole was added to the medium of differentiation-induced motor neurons, and the time course of neurite length was measured. The neurite length was measured in the same manner as in Experimental Example I-2. Ropinirole was added to the medium at a final concentration of 1 ⁇ M.
  • FIG. 14 (a) is a graph showing the results of measuring changes over time in the neurite length of each motor neuron.
  • the vertical axis represents the neurite length (relative value)
  • the horizontal axis represents the number of culture days from the start of differentiation induction
  • “+ ROPI” represents the result of adding ropinirole to the medium.
  • FIG. 14B is an enlarged graph of a portion surrounded by a square in the graph of FIG.
  • FIG. 14C is a graph showing the neurite length of each motor neuron on the 50th and 62nd days from the start of differentiation induction.
  • “**” and “ ⁇ ” indicate that there is a significant difference at a risk rate of less than 1%
  • “+ ROPI” indicates that ropinirole is added to the medium.
  • FIG. 7 is a graph showing the change over time of the LDH leakage rate (relative value) in each motor neuron.
  • the horizontal axis indicates the number of days from the start of differentiation induction.
  • FIG. 8 is a graph showing changes over time in the proportion of CV caspase 3-positive neurons in each motor neuron.
  • the horizontal axis indicates the number of days from the start of differentiation induction.
  • FIG. 9 is a graph showing changes over time in the number of stress granules per neuron in each motor neuron.
  • the horizontal axis indicates the number of days from the start of differentiation induction.
  • iPS cells derived from healthy subjects were differentiated into motor neurons in the same manner as in Experimental Example I-1. Ropinirole was not added to the motor neuron medium. As iPS cells derived from healthy individuals, those similar to those used in Experimental Example I-1 were used.
  • FIG. 10 is a graph showing the measurement results of the neurite length of each motor neuron.
  • “**” and “ ⁇ ” indicate that there is a significant difference with a risk rate of less than 1%.
  • ropinirole it was revealed that the decrease in neurite length in motor neurons differentiated from SALS patient-derived iPS cells was significantly suppressed.
  • Example III-2 Analysis of CV caspase 3 positive rate
  • iPS cells derived from sporadic ALS (SALS) patients were differentiated into motor neurons, and then ropinirole at a final concentration of 1 ⁇ M was added to the medium. More specifically, ropinirole having a final concentration of 1 ⁇ M was added to the medium during the period from 35 to 40 days after the start of differentiation induction.
  • a group in which ropinirole was not added to the medium was prepared.
  • iPS cells derived from healthy subjects were differentiated into motor neurons in the same manner as in Experimental Example I-1. Ropinirole was not added to the motor neuron medium.
  • iPS cells derived from healthy individuals those similar to those used in Experimental Example I-1 were used.
  • FIG. 11 is a graph showing the measurement results of the ratio of CV caspase 3-positive neurons.
  • “**” and “ ⁇ ” indicate that there is a significant difference with a risk rate of less than 1%.
  • ropinirole the proportion of CV caspase 3-positive neurons in motor neurons differentiated from SALS patient-derived iPS cells was significantly reduced.
  • Example III-3 (Analysis of LDH leakage rate)
  • iPS cells derived from sporadic ALS (SALS) patients were differentiated into motor neurons, and then ropinirole at a final concentration of 1 ⁇ M was added to the medium. More specifically, ropinirole having a final concentration of 1 ⁇ M was added to the medium during the period from 35 to 40 days after the start of differentiation induction.
  • a group in which ropinirole was not added to the medium was prepared.
  • iPS cells derived from healthy subjects were differentiated into motor neurons in the same manner as in Experimental Example I-1. Ropinirole was not added to the motor neuron medium.
  • iPS cells derived from healthy individuals those similar to those used in Experimental Example I-1 were used.
  • FIG. 12 is a graph showing the measurement results of the LDH leakage rate.
  • “**” and “ ⁇ ” indicate that there is a significant difference with a risk rate of less than 1%.
  • ropinirole it was revealed that the LDH leakage rate in motor neurons differentiated from SALS patient-derived iPS cells was significantly reduced.
  • Example III-4 Analysis of stress granules
  • iPS cells derived from sporadic ALS (SALS) patients were differentiated into motor neurons, and then ropinirole at a final concentration of 1 ⁇ M was added to the medium. More specifically, ropinirole having a final concentration of 1 ⁇ M was added to the medium during the period from 35 to 40 days after the start of differentiation induction.
  • a group in which ropinirole was not added to the medium was prepared.
  • iPS cells derived from healthy subjects were differentiated into motor neurons in the same manner as in Experimental Example I-1. Ropinirole was not added to the motor neuron medium.
  • iPS cells derived from healthy individuals those similar to those used in Experimental Example I-1 were used.
  • FIG. 13 is a graph showing the measurement results of the number of stress granules.
  • “**” and “ ⁇ ” indicate that there is a significant difference with a risk rate of less than 1%.
  • ropinirole the number of stress granules in motor neurons differentiated from SAPS patient-derived iPS cells was significantly reduced.
  • Example III-5 (Efficacy evaluation of ropinirole using sporadic ALS model)
  • iPS cells derived from 24 sporadic ALS (SALS) patients were differentiated into motor neurons, and then ropinirole at a final concentration of 1 ⁇ M was added to the medium.
  • a group in which ropinirole was not added to the medium was prepared.
  • iPS cells derived from a healthy person were differentiated into motor neurons in the same manner as in Experimental Example I-1. Ropinirole was not added to the motor neuron medium.
  • iPS cells derived from healthy individuals those similar to those used in Experimental Example I-1 were used.
  • Table 12 below shows clinical information of patients from which the iPS cells used are derived.
  • each differentiated motor neuron is identified by the patient number from which it is derived.
  • ropinirole was added for 5 days.
  • the start time of ropinirole addition was different depending on the case, and was 30 to 70 days after the start of differentiation induction of each iPS cell.
  • FIG. 15 is a graph showing the measurement results of the ratio of CV caspase 3 positive neurons.
  • “**” and “ ⁇ ” indicate that there is a significant difference at a risk rate of less than 1%
  • “+ ROPI” indicates the result of adding ropinirole to the medium.
  • 22 cases were confirmed to have an increased CV caspase 3 positive rate.
  • the addition of ropinirole suppressed the increase in CV caspase 3 positive rate by 16 cases (72.73% of SALS cases).
  • an ALS therapeutic agent and an ALS therapeutic composition can be provided. Not only familial ALS but also sporadic ALS can be treated with the ALS therapeutic agent or ALS therapeutic composition of the present invention. Moreover, the pathological mechanism of ALS can be elucidated by analyzing the medicinal effect mechanism of the ALS therapeutic agent of the present invention on motor neurons differentiated from ALS patient-derived iPS cells.

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Abstract

下記式（１）［式（１）中、Ｒ１はそれぞれ独立に炭素数１～６のアルキル基又は４－ヒドロキシフェネチル基を表し、ｎは１～３の整数を表す。］で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、筋萎縮性側索硬化症治療剤。

Description

筋萎縮性側索硬化症治療剤及び治療用組成物
　本発明は、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｌａｔｅｒａｌ　Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＡＬＳ）治療剤及びＡＬＳ治療用組成物に関する。本願は、２０１６年９月２日に、日本に出願された特願２０１６－１７２２５５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　ＡＬＳは、重篤な筋肉の萎縮と筋力低下をきたす神経変性疾患であり、運動ニューロン病の一種である。ＡＬＳでは、運動ニューロン特異的に病変がみられ、発症後の平均生存期間が数年という極めて急速な病態進行を示す。ＡＬＳには有効な治療法が存在せず、一刻も早い治療剤の開発が望まれている。ＡＬＳは、その大半が孤発性であるが、患者の１割が家族性であり、明確な遺伝要因を有している。
　ｗｏｂｂｌｅｒマウスという突然変異マウスは、成長するとともに前肢や顔面の筋萎縮を示し、やがて後肢の筋萎縮を示すことから、ＡＬＳモデルとして使用されてきた（例えば、非特許文献１を参照。）。しかしながら、ＡＬＳ患者にはｗｏｂｂｌｅｒ変異は見られないことが知られている。
　また、家族性ＡＬＳの主たる原因遺伝子のひとつとしてＳＯＤ１が知られており、変異ＳＯＤ１を導入したトランスジェニックマウス（非特許文献２）が創薬研究に使用されているが、臨床において明確な治療効果を示す薬剤はまだ開発されていない。むしろＳＯＤ１－ＡＬＳモデルで選別された薬剤が実際のＡＬＳ患者では有用性を示さないケースが大半であり、現在ではＳＯＤ１－ＡＬＳモデルと実臨床のかい離から、ＳＯＤ１－ＡＬＳモデルがモデルとして機能していないのではないかと懸念されている。
　このように、従来は良好なＡＬＳモデルが存在しなかった。このことが、ＡＬＳの治療剤の開発が進んでいない一因であるといえる。
　ＡＬＳに限らず、有効な病態モデルが存在しない難病が存在する。これらの難病に対し、疾患ｉＰＳ細胞研究は近年病態モデルをもたらすものとして大いに期待されている。
Moser J. M., et al., The wobbler mouse, an ALS animal model., Mol. Genet. Genomics., 288 (5-6), 207-229, 2013. Julien J. P., Kriz J., Transgenic mouse models of amyotrophic lateral sclerosis, Biochimica et Biophysica Acta, 1762 (11-12),1013-1024, 2006.
　本発明は、ＡＬＳ治療剤及びＡＬＳ治療用組成物を提供することを目的とする。
　疾患特異的ｉＰＳ細胞は、特に神経系においては、患者の生体内で起きていた現象を生体外で再現する唯一の手段であるといっても過言ではない。疾患特異的ｉＰＳ細胞を用いることにより、既存の培養細胞や病態モデルマウスよりも正確な病態モデルの作製が可能である。特に、中枢神経疾患においては中枢神経疾患特異的ｉＰＳ細胞から分化させたニューロンを用いることにより、病態メカニズムを明らかにするだけでなく、該ニューロンがより正確な病態モデル・薬効評価モデルとなり、有効な治療薬候補を高精度に選別することが可能となる。
　実施例において後述するように、本発明者らは、ＡＬＳ患者由来のｉＰＳ細胞から運動ニューロンを分化誘導し、ＡＬＳの病態を反映した運動ニューロンに、後述するＡＬＳ治療剤を投与することにより、該運動ニューロンのＡＬＳの病態が改善することを明らかにした。したがって、後述するＡＬＳ治療剤によりＡＬＳを治療することができる。
　また、ＡＬＳ患者の大部分は孤発性であるところ、実施例において後述するように、発明者らは、後述するＡＬＳ治療剤が、家族性ＡＬＳの病態を反映する運動ニューロンだけでなく孤発性ＡＬＳの病態を反映する運動ニューロンの双方の病態を改善することを明らかにした。したがって、後述するＡＬＳ治療剤は、家族性ＡＬＳ及び孤発性ＡＬＳの双方に対する治療効果を有する。
　後述するＡＬＳ治療剤は、患者由来のｉＰＳ細胞を用いた病態モデルを用いた解析から見出した表現型を評価項目とし、細胞死に近い後期ではなく、病態表現型が観察されるようになる転換期に表出する病態を指標としてスクリーニングして得られた化合物であることから、ＡＬＳの治療効果が高い。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］下記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、ＡＬＳ治療剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 ［式（１）中、Ｒ１はそれぞれ独立に炭素数１～６のアルキル基又は４－ヒドロキシフェネチル基を表し、ｎは１～３の整数を表す。］
［２］上記式（１）中、ｎが２である、［１］に記載のＡＬＳ治療剤。
［３］上記式（１）中、Ｒ１がｎ－プロピル基である、［１］又は［２］に記載のＡＬＳ治療剤。
［４］上記式（１）で表される化合物が４－（２－ジ－ｎ－プロピルアミノエチル）－２（３Ｈ）－インドールである、［１］～［３］のいずれかに記載のＡＬＳ治療剤。
［５］上記式（１）で表される化合物の薬学的に許容される塩が４－（２－ジ－ｎ－プロピルアミノエチル）－２（３Ｈ）－インドール塩酸塩である、［１］～［４］のいずれかに記載のＡＬＳ治療剤。
［６］家族性ＡＬＳ及び孤発性ＡＬＳの双方に対する治療効果を有する、［１］～［５］のいずれかに記載のＡＬＳ治療剤。
［７］［１］～［５］のいずれかに記載のＡＬＳ治療剤及び薬学的に許容される担体を含有する、ＡＬＳ治療用組成物。
　本発明によれば、ＡＬＳ治療剤及びＡＬＳ治療用組成物を提供することができる。
実験例Ｉ－２において、運動ニューロンの神経突起長の経時変化を測定した結果を示すグラフである。 実験例Ｉ－３において測定した、各運動ニューロンにおけるＣＶカスパーゼ３陽性ニューロンの割合を示すグラフである。 実験例Ｉ－４において測定した、各運動ニューロンにおけるＬＤＨ漏出率を示すグラフである。 実験例Ｉ－５において、ＦＵＳタンパク質の細胞質への局在が認められた運動ニューロンの割合を測定した結果を示すグラフである。 実験例Ｉ－６において、各運動ニューロン１個あたりのリン酸化ＴＤＰ－４３タンパク質の封入体の数を測定した結果を示すグラフである。 実験例Ｉ－７において測定した、各運動ニューロン１個あたりのストレス顆粒の数を示すグラフである。 実験例ＩＩ－３において測定した、各運動ニューロンにおけるＬＤＨ漏出率の経時変化を示すグラフである。 実験例ＩＩ－４において測定した、各運動ニューロンにおけるＣＶカスパーゼ３陽性ニューロンの割合の経時変化を示すグラフである。 実験例ＩＩ－５において測定した、各運動ニューロン１個あたりのストレス顆粒の数の経時変化を示すグラフである。 実験例ＩＩＩ－１において測定した、各運動ニューロンの神経突起長を示すグラフである。 実験例ＩＩＩ－２において測定した、ＣＶカスパーゼ３陽性ニューロンの割合を示すグラフである。 実験例ＩＩＩ－３において測定した、各運動ニューロンのＬＤＨ漏出率を示すグラフである。 実験例ＩＩＩ－４において測定した、各運動ニューロンのストレス顆粒の数を示すグラフである。 （ａ）は、実験例Ｉ－９において測定した、各運動ニューロンの神経突起長の経時変化を示すグラフである。（ｂ）は、（ａ）のグラフの四角で囲んだ部分を拡大したグラフである。（ｃ）は、実験例Ｉ－９において測定した、分化誘導開始から５０日目及び６２日目における各運動ニューロンの神経突起長を示すグラフである。 実験例ＩＩＩ－５において測定した、各運動ニューロンにおけるＣＶカスパーゼ３陽性ニューロンの割合を示すグラフである。
［ＡＬＳ治療剤］
　１実施形態において、本発明は、下記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、ＡＬＳ治療剤を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 ［式（１）中、Ｒ１はそれぞれ独立に炭素数１～６のアルキル基又は４－ヒドロキシフェネチル基を表し、ｎは１～３の整数を表す。］
　本実施形態のＡＬＳ治療剤により治療することができる家族性ＡＬＳとしては、ＦＵＳ遺伝子に変異を有するＡＬＳ、ＴＡＲ　ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　４３ｋＤａ（ＴＤＰ－４３）遺伝子に変異を有するＡＬＳ等が挙げられる。また、実施例において後述するように、本実施形態のＡＬＳ治療剤は、家族性ＡＬＳ及び孤発性ＡＬＳの双方に対する治療効果を有する。
　本実施形態のＡＬＳ治療剤において、上記式（１）中、ｎは１であってもよく、２であってもよく、３であってもよい。
　また、上記式（１）中、Ｒ１は、炭素数１～６の直鎖状、分岐状若しくは環状のアルキル基であってもよく、より具体的には、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロブチル基、ｎ－ペンチル基、シクロペンチル基、ｎ－ヘキシル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。
　本実施形態のＡＬＳ治療剤において、上記式（１）で表される化合物は４－（２－ジ－ｎ－プロピルアミノエチル）－２（３Ｈ）－インドールであってもよい。すなわち、上記式（１）で表される化合物はロピニロールであってもよい。ロピニロールの化学式を下記式（２）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　ロピニロールは、ドーパミンニューロンへのドーパミンＤ２受容体アゴニスト活性を有することから、パーキンソン病治療薬として開発されたものである。このため、すでに治験が終了しており、生体に投与した場合の安全性が十分に確認されている。ロピニロールは薬効メカニズムが明らかな既存薬であることから、適応拡大により迅速にＡＬＳ治療剤を開発することができる。
　ＡＬＳは運動ニューロンの障害により生じる疾患である。Ｄ２受容体を有しない運動ニューロンの変性疾患にＤ２受容体アゴニストである化合物が治療効果を示すことは驚くべき結果であった。ロピニロールの薬効メカニズムの解析からＡＬＳの病態メカニズム及びＡＬＳの病態の全容解明への糸口が見出されることも期待できる。
　本実施形態のＡＬＳ治療剤は、上記式（１）で表わされる化合物の塩であってもよく、上記式（１）で表わされる化合物の溶媒和物であってもよく、上記式（１）で表わされる化合物の塩の溶媒和物であってもよい。
　塩としては、薬学的に許容される塩であれば特に制限されず、例えば、塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、メシル酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩等の有機酸塩；ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、亜鉛塩等の金属塩；アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩等のアンモニウム塩；モルホリン、ピペリジン等の有機アミン付加塩；グリシン、フェニルアラニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸付加塩等が挙げられる。
　また、上記式（１）で表わされる化合物の溶媒和物、上記式（１）で表わされる化合物の塩の溶媒和物としては、薬学的に許容される溶媒和物であれば特に制限されず、例えば、水和物、有機溶媒和物等が挙げられる。
　本実施形態のＡＬＳ治療剤は、４－（２－ジ－ｎ－プロピルアミノエチル）－２（３Ｈ）－インドール塩酸塩、すなわちロピニロール塩酸塩であってもよい。
［ＡＬＳ治療用組成物］
　１実施形態において、本発明は、上述したＡＬＳ治療剤及び薬学的に許容される担体を含有する、ＡＬＳ治療用組成物を提供する。
　本実施形態のＡＬＳ治療用組成物は、医薬組成物として製剤化されていてもよく、例えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等の形態で経口的に、あるいは、注射剤、坐剤、皮膚外用剤等の形態で非経口的に投与することができる。皮膚外用剤としては、より具体的には、軟膏剤、貼付剤等の剤型が挙げられる。
　薬学的に許容される担体としては、通常医薬組成物の製剤に用いられるものを特に制限なく用いることができる。より具体的には、例えば、ヒプロメロース、デキストリン、マクロゴール４００、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤；乳糖水和物、Ｄ－マンニトール、デンプン、結晶性セルロース、アルギン酸等の賦形剤；水、エタノール、グリセリン等の注射剤用溶剤；ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等の粘着剤等が挙げられる。
　ＡＬＳ治療用組成物は添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン、マルチトール等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；カルメロースナトリウム、硬化油、軽質無水ケイ酸、ポビドン、グリセリン脂肪酸エステル、ベンジルアルコール、フェノール等の安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；黄色三二酸化鉄、三二酸化鉄、黒酸化鉄、酸化チタン等の着色剤等が挙げられる。
　ＡＬＳ治療用組成物は、上述したＡＬＳ治療剤と、上述した薬学的に許容される担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。本実施形態のＡＬＳ治療用組成物において、ＡＬＳ治療剤は１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
　一般的には、ＡＬＳ治療用組成物の適切な１日あたりの投与量は、治療効果を生む上で有効な最低投与量の有効成分（ＡＬＳ治療剤）を含む量である。上記の有効な最低投与量は、ＡＬＳ治療用組成物が含有する有効成分の活性、脂溶性・水溶性を規定する官能基修飾、投与経路、投与時間、使用される特定の有効成分の排出率、治療期間、併用される他の薬物、化合物及び／又は物質、年齢、性別、体重、病気、健康状態及び患者の既往症、及び医術において周知の他の要素を含む様々な要素に依存する。通常、患者に対するＡＬＳ治療用組成物の投与量は、１日あたり約０．０００１～約１００ｍｇ／ｋｇ体重の有効成分を含む量である。ＡＬＳ治療用組成物は、１日１回又は２～４回程度に分けて投与すればよい。
　特に、ＡＬＳ治療剤が式（２）で表される化合物である場合においては、ＡＬＳ治療用組成物の投与量は、１日１回２ｍｇの有効成分を経口投与し、１週間ごとに増量し、１日量１６ｍｇの有効成分を超えない範囲で経口投与する量であることが好ましい。
［その他の実施形態］
　１実施形態において、本発明は、上記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物の有効量を、治療を必要とする患者に投与する工程を含む、ＡＬＳの治療方法を提供する。本実施形態の治療方法において、上記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物としては、上述したものと同様のものが挙げられる。
　１実施形態において、本発明は、ＡＬＳの治療のための上記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を提供する。本実施形態の治療方法において、上記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物としては、上述したものと同様のものが挙げられる。
　１実施形態において、本発明は、ＡＬＳ治療剤を製造するための上記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物の使用を提供する。本実施形態の治療方法において、上記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物としては、上述したものと同様のものが挙げられる。
　次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
＜Ｉ．家族性ＡＬＳ患者由来のｉＰＳ細胞を用いた検討＞
［実験例Ｉ－１］
（運動ニューロンへの分化）
　家族性ＡＬＳには、ＦＵＳ遺伝子の変異が原因であるものと、ＴＤＰ－４３遺伝子の変異が原因であるものが存在することが知られている。
　そこで、健常者由来のｉＰＳ細胞、ＦＵＳに変異を有するＡＬＳ患者由来のｉＰＳ細胞、及びＴＤＰ－４３に変異を有するＡＬＳ患者由来のｉＰＳ細胞を運動ニューロンに分化させた。使用したｉＰＳ細胞株は表１の通りであり、いずれも皮膚線維芽細胞に由来するものであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　具体的には、まず、上記の各細胞株を、終濃度３μＭのＳＢ４３１５４２（ＣＡＳ番号：３０１８３６－４１－９）、終濃度３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ番号：２５２９１７－０６－９）、及び終濃度３μＭのＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（ＣＡＳ番号：８６６４０５－６４－３）を含有する培地で５日間培養し、分化促進型多能性幹細胞（ＤｉＳＣ）を誘導した。培地は毎日交換した。以下、分化誘導開始時とは、ＤｉＳＣ誘導の開始時を指すものとする。
　続いて、得られたＤｉＳＣを細胞１個ずつに解離させ、低酸素インキュベーター中、表２に示す組成の培地で更に７日間培養した。酸素濃度は５％（ｖ／ｖ）に設定した。培地は２～３日おきに交換した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　続いて、低酸素インキュベーター中、表３に示す組成の培地で更に４日間培養した。酸素濃度は５％（ｖ／ｖ）に設定した。培地は２～３日おきに交換した。表３に示す組成の培地で培養４日目に、終濃度５μＭとなるようにＤＡＰＴ（ＣＡＳ番号：２０８２５５－８０－５）を培地に添加した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表３に示す組成の培地で培養１４日目に、再度細胞１個ずつに解離させ、表４に示す組成の神経分化誘導培地で更に５～４０日間培養した。これにより、運動ニューロンへの分化が誘導された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　分化誘導した運動ニューロンを用いて、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　１　（ＮｅｕｒｏＤ１）、ＳＲＹ－Ｂｏｘ　１（ＳＯＸ１）、Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　Ｌｉｎｅａｇｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　２（ＯＬＩＧ２）、ＬＩＭ　Ｈｏｍｅｏｂｏｘ　３（ＬＨＸ３）、ＩＳＬＥＴ１、ＨＢ９、Ｃｈｏｌｉｎｅ　ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣｈＡＴ）の各遺伝子の発現レベルを検討した。陽性対照として脊髄組織を使用した。その結果、得られた運動ニューロンは、脊髄と近似した遺伝子発現パターンを示していることが確認された。この結果から、ｉＰＳ細胞を運動ニューロンに分化誘導できたことが確認された。
　また、分化誘導した運動ニューロンを免疫染色し、Ｇｌｉａｌ　Ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ　Ａｃｉｄｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＡＰ）、βＩＩＩ－チューブリン、ＨＢ９、ＣｈＡＴの発現を検討した。その結果、免疫染色の結果からも、ｉＰＳ細胞を運動ニューロンに分化誘導できたことが確認された。
［実験例Ｉ－２］
（神経突起長の解析）
　実験例Ｉ－１で分化誘導した各運動ニューロンについて、神経突起長の経時変化を測定した。神経突起長の経時測定にはバイオステーションＣＴ（ニコン社）を使用した。図１は、神経突起長の経時変化の測定結果を示すグラフである。縦軸は神経突起長（相対値）を示し、横軸は分化誘導開始からの培養日数を示す。その結果、健常者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンでは神経突起長が継続的に伸びたのに対し、ＡＬＳ患者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンでは、分化誘導開始から約４０日目をピークとして神経突起長が短縮することが明らかとなった。この結果は、分化誘導した運動ニューロンがＡＬＳの病態を反映していることを示す。
［実験例Ｉ－３］
（切断型カスパーゼ３陽性率の解析）
　実験例Ｉ－１で分化誘導した、分化誘導開始から４０日目の各運動ニューロンを、切断型（Ｃｌｅａｖｅｄ、ＣＶ）カスパーゼ３（以下、「ＣＶカスパーゼ３」という場合がある。）に対する抗体を用いて免疫染色し、切断型（Ｃｌｅａｖｅｄ、ＣＶ）カスパーゼ３（以下、「ＣＶカスパーゼ３」という場合がある。）陽性ニューロンの割合を計測した。ＣＶカスパーゼ３陽性ニューロンは、アポトーシスが誘導されたニューロンである。
　図２は、各運動ニューロンにおけるＣＶカスパーゼ３陽性ニューロンの割合を示すグラフである。図中、「＊＊」は、危険率１％未満で有意差が存在することを示す。その結果、健常者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンと比較して、ＡＬＳ患者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンでは、ＣＶカスパーゼ３陽性ニューロンの割合が有意に高いことが明らかとなった。この結果は、分化誘導した運動ニューロンがＡＬＳの病態を反映していることを更に支持するものである。
［実験例Ｉ－４］
（ＬＤＨ漏出率の解析）
　実験例Ｉ－１で分化誘導した、分化誘導開始から４０日目の各運動ニューロンを用いて、細胞からの乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の漏出を測定した。培地へのＬＤＨの漏出量は細胞傷害性の指標となる。ＬＤＨ漏出率の測定には市販のキット（型式「ＬＤＨ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ」、タカラバイオ社）を使用した。
　図３は、各運動ニューロンにおけるＬＤＨ漏出率の測定結果（相対値）を示すグラフである。図中、「＊＊」は、危険率１％未満で有意差が存在することを示す。その結果、健常者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンと比較して、ＡＬＳ患者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンでは、ＬＤＨ漏出率が有意に高いことが明らかとなった。この結果は、分化誘導した運動ニューロンがＡＬＳの病態を反映していることを更に支持するものである。
［実験例Ｉ－５］
（ＦＵＳタンパク質の局在の解析）
　ＦＵＳタンパク質は、核内に局在するＲＮＡ結合タンパク質である。これに対し、ＦＵＳに変異を有するＡＬＳ患者では、ＦＵＳタンパク質の細胞質内への異所性局在が認められることが知られている。
　そこで、実験例Ｉ－１で分化誘導した、分化誘導開始から４０日目の各運動ニューロンを免疫染色し、ＦＵＳタンパク質の細胞質への局在を検討した。
　図４は、各運動ニューロンにおいて、ＦＵＳタンパク質の細胞質への局在が認められたニューロンの割合を測定した結果を示すグラフである。図中、「＊＊」は、危険率１％未満で有意差が存在することを示す。
　その結果、健常者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンと比較して、ＦＵＳに変異を有するＡＬＳ患者（ＦＵＳ－ＡＬＳ）由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンでは、ＦＵＳタンパク質の細胞質への局在が認められたニューロンの割合が有意に高いことが明らかとなった。
　一方、ＴＤＰ－４３に変異を有するＡＬＳ患者（ＴＤＰ－４３－ＡＬＳ）由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンでは、ＦＵＳタンパク質の細胞質への局在の有意な上昇は認められなかった。
　この結果は、分化誘導した運動ニューロンが、ＦＵＳに変異を有するＡＬＳの病態を反映していることを更に支持するものである。
［実験例Ｉ－６］
（リン酸化されたＴＤＰ－４３タンパク質の封入体の形成）
　ＴＤＰ－４３タンパク質は、核内に局在するＲＮＡ結合タンパク質である。ＴＤＰ－４３に変異を有するＡＬＳ患者では、異常にリン酸化されたＴＤＰ－４３タンパク質の封入体の出現が見られることが知られている。
　そこで、実験例Ｉ－１で分化誘導した、分化誘導開始から４０日目の各運動ニューロンを免疫染色し、リン酸化されたＴＤＰ－４３タンパク質封入体の形成を検討した。
　図５は、各運動ニューロンにおいて、ニューロン１個あたりのリン酸化ＴＤＰ－４３タンパク質（ｐＴＤＰ－４３）の封入体の数を測定した結果を示すグラフである。図中、「＊＊」は、危険率１％未満で有意差が存在することを示す。
　その結果、健常者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンと比較して、ＴＤＰ－４３に変異を有するＡＬＳ患者（ＴＤＰ－４３－ＡＬＳ）由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンでは、ニューロン１個あたりのリン酸化ＴＤＰ－４３タンパク質の封入体の数が有意に増加していることが明らかとなった。
　一方、ＦＵＳに変異を有するＡＬＳ患者（ＦＵＳ－ＡＬＳ）由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンでは、リン酸化ＴＤＰ－４３タンパク質の封入体の数の有意な増加は認められなかった。
　この結果は、分化誘導した運動ニューロンが、ＴＤＰ－４３に変異を有するＡＬＳの病態を反映していることを更に支持するものである。
［実験例Ｉ－７］
（ストレス顆粒の解析）
　実験例Ｉ－１で分化誘導した、分化誘導開始から４０日目の各運動ニューロンを用いて、ストレス顆粒の形成を検討した。ストレス顆粒の検出は、ストレス顆粒のマーカーであるＧ３ＢＰの免疫染色により行った。
　図６は、各運動ニューロンにおける、ニューロン１個あたりのストレス顆粒の数の測定結果を示すグラフである。図中、「＊＊」は、危険率１％未満で有意差が存在することを示す。その結果、健常者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンと比較して、ＡＬＳ患者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンでは、ニューロン１個あたりのストレス顆粒の数が有意に増加していることが明らかとなった。この結果は、分化誘導した運動ニューロンがＡＬＳの病態を反映していることを更に支持するものである。
［実験例Ｉ－８］
（ＡＬＳ治療剤のスクリーニング）
　実験例Ｉ－１で分化誘導した運動ニューロンを用いて、神経突起長、ＦＵＳタンパク質の異所性局在、ストレス顆粒の形成、ＬＤＨ漏出率、ＣＶ－カスパーゼ３陽性率、リン酸化されたＴＤＰ－４３タンパク質の封入体の形成等を指標として、ＡＬＳの表現型を回復させる薬物を、既存薬ライブラリーからスクリーニングした。
　スクリーニングの結果、有望なＡＬＳ治療剤として、ロピニロールが見出された。表５及び６に、ロピニロールの培地への添加による、ＡＬＳの表現型の改善率（％）示す。ここで、ロピニロールは、各ｉＰＳ細胞の分化誘導開始から３５～４０日目に培地に添加した。なお、分化誘導開始から３５～４０日目はＡＬＳの病態初期の段階に相当すると想定される。
　ＡＬＳの表現型の改善率（％）は次の計算式（１）によって算出した。
　改善率（％）＝（Ａ－Ｂ）／（Ａ－Ｃ）×１００　…（１）
［式（１）中、Ａはロピニロール非存在下における、ＡＬＳ患者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンの測定値を表し、Ｂはロピニロール存在下における、ＡＬＳ患者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンの測定値を表し、Ｃはロピニロール非存在下における、健常者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンの測定値を表す。］
　表５に、ＦＵＳに変異を有するＡＬＳ患者（ＦＵＳ－ＡＬＳ）由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンの培地に終濃度０．１、１、１０μＭのロピニロールを添加した結果を示し、表６に、ＴＤＰ－４３に変異を有するＡＬＳ患者（ＴＤＰ－４３－ＡＬＳ）由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンの培地に終濃度０．１、１、１０μＭのロピニロールを添加した結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表５及び６に示すように、ロピニロールは、ＦＵＳに変異を有するＡＬＳ及びＴＤＰ－４３に変異を有するＡＬＳの双方に対する顕著な改善効果を示すことが明らかとなった。
　続いて、上記と同様にして、より低濃度のロピニロールを投与した場合の薬効を評価した。表７に、ＦＵＳに変異を有するＡＬＳ患者（ＦＵＳ－ＡＬＳ）由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンの培地に終濃度０．１、１、１０ｎＭのロピニロールを添加した結果を示し、表８に、ＴＤＰ－４３に変異を有するＡＬＳ患者（ＴＤＰ－４３－ＡＬＳ）由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンの培地に終濃度０．１、１、１０ｎＭのロピニロールを添加した結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表７及び８に示すように、ロピニロールは、終濃度０．１～１０ｎＭにおいてもＦＵＳに変異を有するＡＬＳ及びＴＤＰ－４３に変異を有するＡＬＳの双方に対する改善効果を示し、特に１～１０ｎＭにおいてはいずれの項目においても顕著な改善効果を示すことが明らかとなった。
　また、下記表９及び１０に、ロピニロールの代わりに既存のＡＬＳ治療薬であるリルゾール及びエダラボン、以前にＡＬＳの臨床試験に用いられた薬剤であるセフトリアキソンを添加した以外は上記と同様の検討を行った結果を示す。各薬剤はそれぞれ終濃度１０μＭで培地に添加した。
　表９は、ＦＵＳに変異を有するＡＬＳ患者（ＦＵＳ－ＡＬＳ）由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンの培地に各薬剤を添加した結果である。また、表１０は、ＴＤＰ－４３に変異を有するＡＬＳ患者（ＴＤＰ－４３－ＡＬＳ）由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンの培地に各薬剤を添加した結果である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　その結果、ロピニロールは、リルゾール、エダラボン及びセフトリアキソンと比較して、ＦＵＳに変異を有するＡＬＳ及びＴＤＰ－４３に変異を有するＡＬＳの双方に対するより顕著な改善効果を示すことが明らかとなった。
［実験例Ｉ－９］
（ＡＬＳの病態後期におけるロピニロールの薬効評価）
　ロピニロールの添加時期を各ｉＰＳ細胞の分化誘導開始から５０～６２日目に変更した点以外は実験例Ｉ－８と同様にして、ロピニロールの薬効を評価した。分化誘導開始から５０～６２日目はＡＬＳの病態後期の段階に相当すると想定される。
　具体的には、ＦＵＳに変異を有するＡＬＳ患者（ＦＵＳ－ＡＬＳ）由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロン、及びＴＤＰ－４３に変異を有するＡＬＳ患者（ＴＤＰ－４３－ＡＬＳ）由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンの培地にロピニロールを添加し、神経突起長の経時変化を測定した。神経突起長の測定は実験例Ｉ－２と同様にして行った。ロピニロールは終濃度１μＭで培地に添加した。
　図１４（ａ）は、各運動ニューロンの神経突起長の経時変化を測定した結果を示すグラフである。図１４（ａ）中、縦軸は神経突起長（相対値）を示し、横軸は分化誘導開始からの培養日数を示し、「＋ＲＯＰＩ」はロピニロールを培地に添加した結果であることを示す。また、図１４（ｂ）は、図１４（ａ）のグラフの四角で囲んだ部分を拡大したグラフである。また、図１４（ｃ）は、分化誘導開始から５０日目及び６２日目における各運動ニューロンの神経突起長を示すグラフである。図１４（ｃ）中、「＊＊」及び「††」は危険率１％未満で有意差が存在することを示し、「＋ＲＯＰＩ」はロピニロールを培地に添加した結果であることを示す。
　その結果、分化誘導開始から５０～６２日目においても、ロピニロールを添加することにより、神経保護作用（神経突起長の維持）が認められた。この結果は、ＡＬＳの病態後期の段階においてもロピニロールがＡＬＳの病態の改善効果を有することを示す。
＜ＩＩ．孤発性ＡＬＳ患者由来のｉＰＳ細胞を用いた検討＞
［実験例ＩＩ－１］
（運動ニューロンへの分化）
　実験例Ｉ－１と同様にして、孤発性ＡＬＳ（Ｓｐｏｒａｄｉｃ－ＡＬＳ、以下「ＳＡＬＳ」という場合がある。）患者由来のｉＰＳ細胞を運動ニューロンに分化させた。使用したｉＰＳ細胞は、いずれも皮膚線維芽細胞に由来するものであった。使用したｉＰＳ細胞が由来する患者の臨床情報を表１１に示す。以下、分化させた各運動ニューロンをそれが由来する患者番号で識別する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
［実験例ＩＩ－２］
（神経突起長の解析）
　実験例ＩＩ－１で分化誘導した各運動ニューロンについて、実験例Ｉ－２と同様にして神経突起長の経時変化を解析した。その結果、分化誘導開始から４０～４５日において、それまで伸長を続けていた神経突起長が短縮することが明らかとなった。この結果は、分化誘導した運動ニューロンがＡＬＳの病態を反映していることを示す。
［実験例ＩＩ－３］
（ＬＤＨ漏出率の解析）
　実験例ＩＩ－１で分化誘導した各運動ニューロンを用いて、細胞からのＬＤＨの漏出率を経時的に測定した。ＬＤＨ漏出率の測定は実験例Ｉ－４と同様にして行った。
　図７は、各運動ニューロンにおけるＬＤＨ漏出率（相対値）の経時変化を示すグラフである。横軸は分化誘導開始からの日数を示す。その結果、孤発性ＡＬＳ患者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンでは、ＬＤＨ漏出率が経時的に上昇することが明らかとなった。この結果は、分化誘導した運動ニューロンがＡＬＳの病態を反映していることを更に支持するものである。
［実験例ＩＩ－４］
（ＣＶカスパーゼ３陽性率の解析）
　実験例ＩＩ－１で分化誘導した各運動ニューロンを用いて、実験例Ｉ－３と同様にして、ＣＶカスパーゼ３陽性ニューロンの割合を経時的に測定した。
　図８は、各運動ニューロンにおけるＣＶカスパーゼ３陽性ニューロンの割合の経時変化を示すグラフである。横軸は分化誘導開始からの日数を示す。その結果、孤発性ＡＬＳ患者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンでは、ＣＶカスパーゼ３陽性ニューロンの割合が経時的に上昇することが明らかとなった。この結果は、分化誘導した運動ニューロンがＡＬＳの病態を反映していることを更に支持するものである。
［実験例ＩＩ－５］
（ストレス顆粒の解析）
　実験例ＩＩ－１で分化誘導した各運動ニューロンを用いて、実験例Ｉ－７と同様にして、ストレス顆粒の形成を経時的に測定した。
　図９は、各運動ニューロンにおける、ニューロン１個あたりのストレス顆粒の数の経時変化を示すグラフである。横軸は分化誘導開始からの日数を示す。その結果、孤発性ＡＬＳ患者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンでは、ストレス顆粒の数が経時的に増加することが明らかとなった。この結果は、分化誘導した運動ニューロンがＡＬＳの病態を反映していることを更に支持するものである。
＜ＩＩＩ．孤発性ＡＬＳモデルを用いたロピニロールの薬効評価＞
［実験例ＩＩＩ－１］
（神経突起長の解析）
　実験例ＩＩ－１と同様にして、孤発性ＡＬＳ（ＳＡＬＳ）患者由来のｉＰＳ細胞を運動ニューロンに分化させた後、培地に終濃度１μＭのロピニロールを添加した。より詳細には、分化誘導開始から３５～４０日目の期間、培地に終濃度１μＭのロピニロールを添加した。また、対照として、ロピニロールを培地に添加しなかった群を用意した。また、比較のために、健常人由来のｉＰＳ細胞を、実験例Ｉ－１と同様にして運動ニューロンに分化させた。この運動ニューロンの培地にはロピニロールを添加しなかった。健常人由来のｉＰＳ細胞としては、実験例Ｉ－１で用いたものと同様のものを用いた。
　続いて、分化誘導開始から４０日目の各運動ニューロンについて、実験例Ｉ－２と同様にして神経突起長を測定した。
　図１０は、各運動ニューロンの神経突起長の測定結果を示すグラフである。図中、「＊＊」及び「††」は、危険率１％未満で有意差が存在することを示す。その結果、ロピニロールの存在下では、ＳＡＬＳ患者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンにおける神経突起長減少が、有意に抑制されることが明らかとなった。
　この結果は、ロピニロールが、家族性ＡＬＳだけでなく、孤発性ＡＬＳの治療にも有効であることを示す。
［実験例ＩＩＩ－２］
（ＣＶカスパーゼ３陽性率の解析）
　実験例ＩＩ－１と同様にして、孤発性ＡＬＳ（ＳＡＬＳ）患者由来のｉＰＳ細胞を運動ニューロンに分化させた後、培地に終濃度１μＭのロピニロールを添加した。より詳細には、分化誘導開始から３５～４０日目の期間、培地に終濃度１μＭのロピニロールを添加した。また、対照として、ロピニロールを培地に添加しなかった群を用意した。また、比較のために、健常人由来のｉＰＳ細胞を、実験例Ｉ－１と同様にして運動ニューロンに分化させた。この運動ニューロンの培地にはロピニロールを添加しなかった。健常人由来のｉＰＳ細胞としては、実験例Ｉ－１で用いたものと同様のものを用いた。
　続いて、分化誘導開始から４０日目の各運動ニューロンについて、実験例Ｉ－３と同様にして、ＣＶカスパーゼ３陽性ニューロンの割合を測定した。
　図１１は、ＣＶカスパーゼ３陽性ニューロンの割合の測定結果を示すグラフである。図中、「＊＊」及び「††」は、危険率１％未満で有意差が存在することを示す。その結果、ロピニロールの存在下では、ＳＡＬＳ患者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンにおけるＣＶカスパーゼ３陽性ニューロンの割合が有意に低下することが明らかとなった。
　この結果は、ロピニロールが、家族性ＡＬＳだけでなく、孤発性ＡＬＳの治療にも有効であることを更に支持するものである。
［実験例ＩＩＩ－３］
（ＬＤＨ漏出率の解析）
　実験例ＩＩ－１と同様にして、孤発性ＡＬＳ（ＳＡＬＳ）患者由来のｉＰＳ細胞を運動ニューロンに分化させた後、培地に終濃度１μＭのロピニロールを添加した。より詳細には、分化誘導開始から３５～４０日目の期間、培地に終濃度１μＭのロピニロールを添加した。また、対照として、ロピニロールを培地に添加しなかった群を用意した。また、比較のために、健常人由来のｉＰＳ細胞を、実験例Ｉ－１と同様にして運動ニューロンに分化させた。この運動ニューロンの培地にはロピニロールを添加しなかった。健常人由来のｉＰＳ細胞としては、実験例Ｉ－１で用いたものと同様のものを用いた。
　続いて、分化誘導開始から４０日目の各運動ニューロンについて、実験例Ｉ－４と同様にして、ＬＤＨ漏出率を測定した。
　図１２は、ＬＤＨ漏出率の測定結果を示すグラフである。図中、「＊＊」及び「††」は、危険率１％未満で有意差が存在することを示す。その結果、ロピニロールの存在下では、ＳＡＬＳ患者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンにおけるＬＤＨ漏出率が有意に低下することが明らかとなった。
　この結果は、ロピニロールが、家族性ＡＬＳだけでなく、孤発性ＡＬＳの治療にも有効であることを更に支持するものである。
［実験例ＩＩＩ－４］
（ストレス顆粒の解析）
　実験例ＩＩ－１と同様にして、孤発性ＡＬＳ（ＳＡＬＳ）患者由来のｉＰＳ細胞を運動ニューロンに分化させた後、培地に終濃度１μＭのロピニロールを添加した。より詳細には、分化誘導開始から３５～４０日目の期間、培地に終濃度１μＭのロピニロールを添加した。また、対照として、ロピニロールを培地に添加しなかった群を用意した。また、比較のために、健常人由来のｉＰＳ細胞を、実験例Ｉ－１と同様にして運動ニューロンに分化させた。この運動ニューロンの培地にはロピニロールを添加しなかった。健常人由来のｉＰＳ細胞としては、実験例Ｉ－１で用いたものと同様のものを用いた。
　続いて、分化誘導開始から４０日目の各運動ニューロンについて、実験例Ｉ－７と同様にして、ストレス顆粒の数を測定した。
　図１３は、ストレス顆粒の数の測定結果を示すグラフである。図中、「＊＊」及び「††」は、危険率１％未満で有意差が存在することを示す。その結果、ロピニロールの存在下では、ＳＡＬＳ患者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した運動ニューロンにおけるストレス顆粒の数が有意に低下することが明らかとなった。
　この結果は、ロピニロールが、家族性ＡＬＳだけでなく、孤発性ＡＬＳの治療にも有効であることを更に支持するものである。
［実験例ＩＩＩ－５］
（孤発性ＡＬＳモデルを用いたロピニロールの薬効評価）
　実験例ＩＩ－１と同様にして、２４症例の孤発性ＡＬＳ（ＳＡＬＳ）患者由来のｉＰＳ細胞を運動ニューロンに分化させた後、培地に終濃度１μＭのロピニロールを添加した。また、比較のために、ロピニロールを培地に添加しなかった群を用意した。また、対照として、健常人由来のｉＰＳ細胞を、実験例Ｉ－１と同様にして運動ニューロンに分化させたものを使用した。この運動ニューロンの培地にはロピニロールを添加しなかった。健常人由来のｉＰＳ細胞としては、実験例Ｉ－１で用いたものと同様のものを用いた。
　下記表１２に、使用したｉＰＳ細胞が由来する患者の臨床情報を示す。以下、分化させた各運動ニューロンをそれが由来する患者番号で識別する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　いずれの運動ニューロンにおいても、ロピニロールの添加期間は５日間とした。ロピニロールの添加開始時期は症例により異なっており、各ｉＰＳ細胞の分化誘導開始から３０～７０日目のいずれかであった。
　続いて、ロピニロールを添加してから５日目の各運動ニューロンについて、実験例Ｉ－３と同様にしてＣＶカスパーゼ３陽性ニューロンの割合を測定した。
　図１５は、ＣＶカスパーゼ３陽性ニューロンの割合の測定結果を示すグラフである。図中、「＊＊」及び「††」は、危険率１％未満で有意差が存在することを示し、「＋ＲＯＰＩ」はロピニロールを培地に添加した結果であることを示す。その結果、２４症例のＳＡＬＳモデルのうち、ＣＶカスパーゼ３陽性率の増加が確認された症例は２２症例であった。また、これらの２２症例のうち、ロピニロールの添加によりＣＶカスパーゼ３陽性率の増加が抑制された症例は１６症例であった（ＳＡＬＳ症例の７２．７３％）。
　この結果は、ロピニロールが、家族性ＡＬＳだけでなく、孤発性ＡＬＳの治療にも有効であることを更に支持するものである。
　本発明によれば、ＡＬＳ治療剤及びＡＬＳ治療用組成物を提供することができる。本発明のＡＬＳ治療剤又はＡＬＳ治療用組成物によって、家族性ＡＬＳだけでなく孤発性ＡＬＳも治療することができる。また、ＡＬＳ患者由来ｉＰＳ細胞から分化させた運動ニューロンに対する、本発明のＡＬＳ治療剤の薬効メカニズムを解析することにより、ＡＬＳの病態メカニズムを解明することができる。

Claims (7)

  1. 　下記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）治療剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式（１）中、Ｒ１はそれぞれ独立に炭素数１～６のアルキル基又は４－ヒドロキシフェネチル基を表し、ｎは１～３の整数を表す。］
  2. 　前記式（１）中、ｎが２である、請求項１に記載のＡＬＳ治療剤。
  3. 　前記式（１）中、Ｒ１がｎ－プロピル基である、請求項１又は２に記載のＡＬＳ治療剤。
  4. 　前記式（１）で表される化合物が４－（２－ジ－ｎ－プロピルアミノエチル）－２（３Ｈ）－インドールである、請求項１～３のいずれか一項に記載のＡＬＳ治療剤。
  5. 　前記式（１）で表される化合物の薬学的に許容される塩が４－（２－ジ－ｎ－プロピルアミノエチル）－２（３Ｈ）－インドール塩酸塩である、請求項１～４のいずれか一項に記載のＡＬＳ治療剤。
  6. 　家族性ＡＬＳ及び孤発性ＡＬＳの双方に対する治療効果を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載のＡＬＳ治療剤。
  7. 　請求項１～５のいずれか一項に記載のＡＬＳ治療剤及び薬学的に許容される担体を含有する、ＡＬＳ治療用組成物。
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