JP2010265330A - 処方物 - Google Patents

Abstract

【課題】 特にワクチンの分野の、免疫療法にて有用な、Ｈ１−ＴＨ２バランスをＴＨ１応答が都合のよいように偏向させることのできる新規な抗原処方物を提供することが望まれている。
【解決手段】 （Ａ）抗原；（Ｂ）ＴＨ１を誘発するアジュバント；および（Ｃ）貧水溶性アミノ酸またはその誘導体を有してなる組成物であって、抗原およびＴＨ１を誘発するアジュバントの溶液を、貧可溶性アミノ酸またはその誘導体の強酸水溶液中溶液と混合し、その間にその溶液の混合液を中和し、それにより貧可溶性アミノ酸、抗原およびアジュバントを共同沈降させることで得られる。
【選択図】なし

Description

本発明は、限定するものではないが、特に免疫化に用いるための新規な処方物に関する。

免疫系は、外来または新規な物質を宿主より検出し、排除するように特異的に進化している。この物質は、ウイルス、細菌または寄生体を起源とするものであってもよく、宿主の細胞外または細胞内に属していてもよく、あるいは新生物を起源とするものであってもよい。
抗原に対する免疫応答は、一般に、細胞性（Ｔ−細胞性攻撃）または体液性（抗原全体を認識することによる抗体産生）のいずれかである。免疫応答に関与しているＴＨ細胞がサイトカインを産生するパターンは、これらの応答型のいずれが優勢であるかで変化し得る：細胞性免疫（ＴＨ１）はＩＬ−２およびＩＦＮγの産生が高いが、ＩＬ−４産生が低いことで特徴付けられるのに対して、体液性免疫（ＴＨ２）では、そのパターンはＩＬ−２およびＩＦＮγが低く、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０が高い。分泌のパターンは第２のリンパ系器官または細胞のレベルで調節されるため、特異的なＴＨサイトカインパターンの薬理学的操作は形成する免疫応答の型および程度に影響を及ぼし得る。

ＴＨ１−ＴＨ２バランスとは、異なる２つの形態のヘルパーＴ細胞が相互変換することをいう。この２つの形態は免疫系において大掛かりな反対の作用を有する。免疫応答がＴＨ１細胞に好都合であるならば、その場合、これら細胞は細胞性応答を行うのに対して、ＴＨ２細胞は抗体を優勢とする応答を行うであろう。いくつかのアレルギー反応の原因となる抗体はＴＨ２細胞により誘発される。
ワクチン注射が、ヒトの健康に対する免疫学的原理の最もよく知られかつ最も成功している方法である。通常、導入されかつ承認されるには、ワクチンは効果的でなければならず、すべてのワクチンの効能は時に再検討される。多くの要因がそれに影響を及ぼす。効果的なワクチンは、免疫性を正しく誘発し、貯蔵にて安定しており、かつ十分な免疫原性を有していなければならない。特に、生ワクチン以外では、アジュバントを用いてその免疫原性をブーストすることが必要なことが多々ある。このことはある生ワクチン、例えば弱毒ワクチンに適用することもできる。アジュバントは抗原に対する免疫応答を強化する物質である。

ヒトの治療のために動物抗血清を製造するという１９２０年代の研究の間に、ある物質、特に抗原に加えられるか、あるいは抗原と一緒に乳化されたアルミニウム塩が、抗体産生を著しく強化すること、すなわち、アジュバントとして作用することが判明した。水酸化アルミニウムは、今でも、例えば、ジフテリアおよび破傷風トキソイドと一緒に広く使用されている。
ＧＢ−Ａ−１３７７０７４は、その中にアレルゲンを分散させた、チロシンの共同沈降体の製法を記載する。
ＧＢ−Ａ−１４９２９７３は、その中に修飾アレルゲンを分散させた、チロシンの共同沈降体の製法を記載する。アレルゲンは、分子内架橋を生じさせ、未修飾アレルゲンと比べて生成物のアレルギー原性を減少させる、グルタルアルデヒドなどの試薬で処理することにより修飾されている。

３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡがＧＢ−Ａ−２２２０２１１（Ｒｉｂｉ）より知られている。化学的には、それは、４、５または６アシル化鎖を有する３Ｄｅ−アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物であり、Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｏｎｏｃｈｅｎ Ｍｏｎｔａｎａが製造している。３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい形態は国際特許出願９２／１６５５６号に開示されている。
ＰＣＴ国際公開ＷＯ９８／４４９４７は、アレルギー患者の脱感作療法にて用いるための処方であって、修飾されていてもよいアレルゲン、チロシンおよび３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡを有してなる処方を記載する。

特に、Ｔ細胞性応答のための、より優れたアジュバントを産生しようとする試みがなされているが、これら近年のアジュバントは未だほとんどヒトに慣用的に用いられるとは認められていないことに留意すべきである。
アジュバントの効果が、主として２つの活性：リンパ球が抗原に曝されている部位における抗原の濃度（「デボット」効果）および、リンパ球の機能を調節する、サイトカンの誘導化によるのは明らかである。リポソームおよび免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などの新しい手段も、その中に取り込んだ抗原を抗原提示細胞に確実に輸送することにより同じ目的を達成する。マイコバクテリア細胞壁、エンドトキシンなどの細菌性産物は、サイトカインの形成を刺激することにより作用すると考えられる。サイトカイン誘発は、正規のワクチンに応答しないことが多い、免疫抵抗性減弱の患者にて特に有用であるかもしれない。そのようなサイトカイン誘発はまた、免疫応答を望ましい方向に向けることで、例えば、ＴＨ１またはＴＨ２細胞応答だけが望まれる疾患にて有用であるかもしれないと考えられる（Ｒｏｉｔｔら、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、第４版）。
本発明者らは、この度、ＴＨ１−ＴＨ２バランスをＴＨ１応答が都合のよいように偏向させることのできる新規な抗原処方物を提供するものである。その処方物は、特にワクチンの分野の、免疫療法にて有用である。さらに、免疫応答の研究および抗原の産生にも有用である。

本発明の一の態様によれば、
（Ａ）抗原；
（Ｂ）ＴＨ１を誘発するアジュバント；および
（Ｃ）貧可溶性アミノ酸またはその誘導体
を有してなる組成物が提供される。
抗原は、細菌もしくはウイルス、または他の病原体もしくは新生物から、あるいはその抗原性構造を有することが判っているものから誘導されるのが好ましい。
ＴＨ１を誘発するアジュバントは、ＭＰＬ、３−ＤＭＰＬまたはその誘導体であることが好ましい。
貧可溶性アミノ酸は、チロシン、トリプトファンまたはその誘導体であることが好ましい。
本発明はまた、医薬にて用いるための組成物を提供する。
好ましくは、該組成物はワクチンの形態である。

本発明はまた、細菌、ウイルス感染または癌などの他の疾患の治療または予防にて用いるための医薬の調製における上記した組成物の使用を提供する。
本発明はさらには、動物を本発明の組成物で免疫化することからなる、イムノグロブリンの製法を提供する。
本発明はまた、抗原とＴＨ１誘発のアジュバントの溶液を、貧可溶性アミノ酸またはその誘導体の水性強酸中溶液と混合し、その間にその溶液の混合液を中和し、それにより貧可溶性アミノ酸、抗原およびアジュバントを共同沈降させることからなる、本発明の組成物の製法を提供する。この方法はさらには医薬上許容される担体、希釈体または賦形剤を添加するようにしてもよい。

ＴＨ１−ＴＨ２バランスをＴＨ１応答が都合のよいように偏向させることのできる新規な抗原処方物を提供するものである。

本発明の種々の特徴および具体例を、以下の実施例を用いて説明するが、それらは本発明を限定するものではない。

（Ａ）抗原
最初、「抗原」なる語は、特定の抗体を産生するようにＢ細胞を誘発する分子について使用された。しかしながら、今では、その語は、免疫応答の適応因子により、すなわち、Ｂ細胞またはＴ細胞、あるいはその両方で特異的に認識することのできる分子を示すように用いられている。このような抗原は、機能抗体と、ＴおよびＢ細胞上の特定の受容体で反応する分子である。しかしながら、本発明者らは、伝統的に「アレルゲン」として知られているもの、すなわち、ＩｇＥ介在の過敏症を引き起こす物質、例えば、花粉、塵を排除する。
アレルギーは、肥満細胞に付着した先在するＩｇＥ抗体による環境抗原（アレルゲン）に対する応答である。即時過敏感反応は、喘息、枯草熱、血清病、系統的アナフィラキシーまたは接触性皮膚炎を引き起こす、肥満細胞産物（ヒスタミンなど）により産生される。このような過敏感反応には４つの型（Ｉ、II、IIIおよびIV型）がある。その最初の３つの型は抗体性であり；４番目は主としてＴ細胞およびマクロファージにより媒介される。すなわち、本発明はかかる環境抗原の使用に関するものではない。

このように、本発明で用いられる「抗原」は、好ましくは、アレルギー原因物質、例えば、花粉（例、ブタクサまたはシラカンバ花粉）、食料、昆虫毒、カビ、動物の下毛または家塵ダニ（Ｄ．ｆａｒｉｎａｅまたはＤ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）から由来の「アレルゲン」を包含しない。
本発明は、したがって、ＩｇＥまたはＩｇＧ１性応答よりもむしろ、細胞性のＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ媒介応答に関与することが多い、抗原に関連することがわかる。
本発明で用いられる抗原は、免疫原、すなわち、免疫細胞を活性化させ、その物に対する免疫応答を惹起する抗原であることが好ましい。
好ましい態様において、本発明はワクチンとして使用するための処方物に関し、抗原がそのようなワクチンにて有用なものである。

本発明において用いられる抗原は適当ないずれの抗原であってもよく、あるいは利用できるようになる適当ないずれの抗原であってもよい。
ワクチンに使用される抗原の型は多くの因子に依存する。一般に、微生物の抗原がワクチン中に多く残っていればいるほどよく、死菌よりも生菌の方が効果的な傾向にある。この例外がトキシンが病原的効果の原因である疾患である。この場合、ワクチンはトキシンまたはトキソイドだけを基準とすることができる。
本発明で用いられる抗原は、どのような生菌；無傷または生でない菌；亜細胞性フラグメント；トキソイド；組換えＤＮＡを基礎とする抗原または抗−遺伝子型あるいは合成抗原より誘導させることができる。抗原は天然または弱毒生物より誘導することができ、ウイルスまたは細菌に由来するものであってもよい。抗原の型は、莢膜多糖類、表面または内部抗原であってもよい。組換えＤＮＡを基礎とする場合、抗原はクローンし、発現させた遺伝子からまたは裸のＤＮＡから得ることができる。

抗原は、例えば、交差結合剤、例えば、ジアルデヒド、さらに好ましくはグルタルアルデヒドと反応させることにより修飾させてもよい。
例えば、ワクチンに用いることができ、あるいは求められる微生物は、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、イルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、パステュレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、モラキセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、アクチノバシラス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ネイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、ヘモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）およびエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を包含する。

好ましいワクチンは、ワクチニア（痘瘡について）ワクチン；ボル・バシラス（ｖｏｌｅ ｂａｃｉｌｌｕｓ）（ＴＢについて）ワクチン；ポリオワクチン；麻疹ワクチン；ムンプスワクチン；風疹ワクチン；黄熱ワクチン；水痘−帯状疱疹ワクチン；ＢＣＧワクチン；狂犬病ワクチン；インフルエンザワクチン；Ａ型肝炎ワクチン；発疹チフスワクチン；百日咳ワクチン；腸チフスワクチン；コレラワクチン；ペストワクチン；ペヌモコッカス（ｐｅｎｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）ワクチン；髄膜炎菌ワクチン；ヘモフィラス・インフルエンザエワクチン；Ｂ型肝炎ワクチン；Ｃ型肝炎ワクチン；破傷風ワクチンおよびジフテリアワクチンを包含する。トキシンをベースとするワクチンは、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、コリネバクテリウム・ジフセリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、ビブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）およびクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）を包含する。

ワクチンが有用である他の主な疾患は、ＨＩＶ、ヘルペス、ウイルス、アデノウイルス、リノウイルス、スタフィロコッカス、Ａ群ストレプトコッカス、マイコバクテリウム・レプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、トレポネマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、クラミジア、カンジダ、ニューモシスチス、マラリア、トリパノソミアシス；シャガス病；住血吸虫症および糸状虫症を包含する。
腫瘍抗原の存在も明らかとなり、その結果、癌に対するワクチン処置の概念が生まれた。さらに、原則として、広範囲に及ぶ妊娠および他の再生ホルモンに対する免疫性を誘発することにより、妊娠および移植を妨げることもできる。

（Ｂ）ＴＨ１を誘発するアジュバント
「ＴＨ１を誘発するアジュバント」とは、抗原に対するＴＨ１応答を強化するアジュバントを意味する。
アジュバントのＴＨ１誘発アジュバントとしての有効性は、種々のアジュバントを有してなるワクチンにおいて、抗原の投与により得られるこの抗原に拮抗する抗体の特性を測定することにより決定することができる。
好ましくは、アジュバントは修飾リポ多糖類である。米国特許第４９１２０９４号に記載されるように、腸内細菌のリポ多糖類（ＬＰＳ）は強力な免疫刺激剤である。しかし、該物質はまた有害な、特に致死的な応答を惹起させ得る。今では、ＬＰＳに伴う内毒素活性の結果としてそのリピドＡ成分が得られることが知られている。したがって、本発明は、さらに好ましくはリピドＡの解毒作用誘導体としての用途を提供するものである。Ｒｉｂｉは、最初、精製された解毒内毒素（ＲＤＥ）として知られていたが、一リン酸化リピドＡ（ＭＰＬ）として知られるようになったリピドＡの誘導体を生成した。米国特許第４９１２０９４号に記載されるように、ＭＰＬはグラム陰性菌（例えば、サルモネラ種）のヘプトース不含変異体より得られるＬＰＳまたはリピドＡを中程度の強度の鉱酸溶液（例えば、０．１Ｎ塩酸）中で約３０分間還流することにより産生される。この処置により還元末端グルコサミンの１位でリン酸基の欠失が得られる。加えて、この処理の間にその核となる炭水化物が非還元グルコサミンの６’位より取り除かれる。

しかしながら、解毒リピドＡが非還元グルコサミンの６’位に付着したコア部を保持する、修飾ＬＰＳまたはリピドＡを用いることが好ましい。かかるＬＰＳおよびリピドＡの誘導体はまた、米国特許第４９１２０９４号に記載されている。さらに詳細には、米国特許第４９１２０９４号は、リポ多糖類の３’位で還元末端グルコサミンにエステル結合するリポ多糖類のβ−ヒドロキシミリスチン酸アシル残基だけを選択的に除去する方法であって、そのリポ多糖類をアルカリ性加水分解に付すことにより得られる修飾リポ多糖類を開示する。そのような脱−Ｏ−アシル化一リン酸化リピドＡ（ＭＰＬ）、ジリン酸化リピドＡ（ＤＰＬ）およびＬＰＳを本発明において用いることができる。このように好ましい具体例において、本発明は、還元末端グルコサミンの３’位が脱−Ｏ−アシル化されている、ＭＰＬ、ＤＰＬまたはＬＰＳを使用する。これらの化合物は、各々、３−ＤＭＰＬ、３−ＤＤＰＬおよび３−ＤＬＰＳとして知られている。

米国特許第４９８７２３７号において、式：

［式中、Ｒ^１およびＲ^２は水素であり、Ｒ^３はＣ、Ｈおよび、所望によりＯ、ＮおよびＳを含んでおり、１種以上の原子があるとしても、それらは同一または異なっていてもよく、Ｃ原子の総数が６０個を越えない、直鎖または分岐鎖炭化水素であり、環はＭＰＬ核を意味する］
で示されるＭＰＬの誘導体が記載されている。

別法として、ＭＰＬ誘導体は、式：

［式中、

で示されるＭＰＬ誘導体の部分は、２−６０個の炭素原子を含有し、Ｒ^３はＣ、Ｈおよび所望によりＯ，ＮおよびＳを含んでおり、１種以上の原子があるとしても、それらは同一または異なっていてもよく、ｘは最低１であり、ｘ部分の炭素原子の総数が６０を越えないような数とすることができ、各部分の各Ｒ^３の構造が同一または異なっていてもよく、環がＭＰＬ核を意味する］
で示される。

利用可能であるか、または利用可能となるそのようなＬＰＳまたはリピドＡのすべての誘導体または塩を本発明にて用いてもよい。
ＴＨ１を誘発するアジュバントを投与前に組成物の他の成分と混合することができる。また、製品を製造する間に他の成分と一緒に処方することもできる。また、他の成分と異なる部位または時間に投与することもできる。投与は多数の経路によりものであってもよい。

（Ｃ）貧可溶性アミノ酸
アミノ酸は、アジュバントおよび抗原が免疫応答を生じさせることができるように水溶液に貧可溶性でなければならない。
大部分のアミノ酸は、結晶格子中に強い分子間力が作用する結果、水中にほんのわずかに溶けるだけである。例外がグリシン、プロリン、リシン、スレオニン、システインおよびアルギニンであり、それらは本当に水可溶性であり、本発明の一部を形成しない。アミノ酸の水溶性を以下の表に示す：

本発明にて用いられるアミノ酸の水溶性は、２５℃の水１００ｍｌ中、約１．１またはそれ以下のグラムであることが好ましい。チロシンまたはトリプトファンが特に好ましく、より不溶性のチロシンが好ましい。これらアミノ酸の誘導体、例えば、ベンジル−Ｏ−オクタデカノイル−Ｌ−チロシンもまた本発明の範囲内にある。
典型的には、共同沈降させるかまたは夫々、混合することにより、抗原をアミノ酸内に分散させ、および／またはアミノ酸上に吸着させる。

調製
本発明の組成物は、抗原の水溶液をアミノ酸の水性強酸中溶液と混合し、その溶液の混合液を中和し、それによりアミノ酸および抗原を共同沈降させ、生成物をＴＨ１を誘発するアジュバントと混合し、所望により生理学上許容される希釈体、賦形剤または担体を前記した混合の前後いずれかで添加することで調製してもよい。また、ＴＨ１を誘発するアジュバントを抗原と共同沈降させてもよい。投与前に組成物の他の成分と混合または共同沈降させるのと同様、ＴＨ１を誘発するアジュバントを他の成分と異なる部位および／または時に投与することもできる。
典型的には、好ましくはｐＨ７±１の、固体の溶媒和から得ることができる、抗原の水溶液を、アミノ酸の水性強酸中溶液と混合する。強酸は、通常、無機酸、好ましくは塩酸である。この工程で使用される抗原の溶液は、典型的には、０．１μｇ／ｍｌと１０００μｇ／ｍｌの、例えば、約４００μｇ／ｍｌの抗原タンパク質を有する。混合物中の抗原：アミノ酸の割合は、典型的には、１：４ｘ１０^５ないし１：１ｘ１０^２ｗ／ｗの範囲にある。

得られた抗原とアミノ酸の溶液の混合物を中和する。中和とは、ｐＨ値を４．０ないし７．５の範囲に調整することを意味する。中和はごく短時間に、または少なくとも長時間を要することなく、その溶液のｐＨを７．５よりも上であるとはっきりと判る程度まで上げることが望ましい。この条件は該溶液を激しく攪拌し、必要ならば必要量の塩基を用いるだけで合致させることができる。通常、種々の緩衝化剤を抗原の溶液に注意しながら添加し、混合および中和段階でのｐＨ調整を補助することができる。
中和を行うのに特に有用な方法は、アミノ酸および中和塩基を別々の溶液流で抗原の溶液と混ぜることである。加える溶液の流速はｐＨスタット、すなわち、反応混合物のｐＨが実質的に所定のレベルで一定であるように、溶液の一方または両方の流速を制御する装置により調節する。本発明者らは、正確なｐＨは抗原の特性により変化するが、最適な結果が、通常、ｐＨを６．５ないし７．５の範囲内に調整することで得られることを見出した。

中和した結果、抗原の溶液が吸蔵および／または吸着されている範囲内および／または上で、アミノ酸の迅速な沈降が起こる。沈降後、混合物を直ちに洗浄するか、または洗浄までに２、３時間または１日もしくは２日放置する。得られた沈降物を遠心分離または濾過により溶液から除去し、例えば、フェノール−セイラインで洗浄してもよく、要すれば、生理学的に許容される担体、賦形剤または希釈体に再び懸濁させてもよい。

後記する調製例３に記載の方法によりまたは超音波処理により溶解させたＭＰＬ（または他のＴＨ１を誘発するアジュバント）を、抗原のアミノ酸吸着体に添加する前に種々の手段により希釈することができる。ＭＰＬの調製物を、最初、典型的には０．５ｍｇ／ｍｌと４ｍｇ／ｍｌの間、例えば、１ｍｇ／ｍｌの濃度で調製する。ついで、それを５００μｇ／ｍｌと２０μｇ／ｍｌ、好ましくは１００μｇ／ｍｌの濃度に希釈することができる。この希釈体は精製水または１％と４％の間の、好ましくは２％のグリセロールを含有する水性グリセロール溶液中に製造することができる。ついで、このような希釈体を、前記調製のアミノ酸吸着体の懸濁液に加えることができる。便宜のため、ＭＰＬ溶液とアミノ酸吸着体の懸濁液の濃度は、各々、略等しい容量を混合して注射用の最終生成物が得られるように選択する。典型的な最終生成物は約１００μｇ／ｍｌの抗原および約２５０μｇ／ｍｌのＭＰＬを含有する。

このように、本発明の処方物は直接投与してもよいが、好ましくはその処方物を医薬上許容される担体、賦形剤または希釈体と合し、ヒトまたは獣に使用することのできる、医薬組成物を製造する。適当な生理学上許容される担体および希釈体は、等張セイライン溶液、例えば、リン酸塩緩衝セイライン、フェノール−セイラインおよび滅菌水を包含する。組成物を非経口、筋肉内、静脈内または経皮投与用に処方してもよい。
本明細書に記載の投与経路および投与量は、当業者が個々の患者のための最適な投与経路および投与量ならびに条件を容易に決定することができるよう指針として示すにすぎない。

ワクチンの調製
本発明の処方物からワクチンを調製してもよい。活性成分としての抗原を含有するワクチンの調製は当業者に公知である。典型的には、そのようなワクチンを液体溶液または懸濁液として注射できるように調製する；注射前に液体に溶解または懸濁させるのに適当な固体形態を調製してもよい。調製物をさらに乳化させてもよく、あるいはその処方物をリポソーム中にカプセル化してもよい。前記したように、その処方物を、医薬上許容され、かつその処方物と混和する担体、希釈体および賦形剤と混合してもよい。かかる賦形剤は、例えば、水、セイライン、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびその組み合わせを包含する。
加えて、所望により、ワクチンはさらに少量の補助物質、例えば、湿潤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝化剤および／またはワクチンの効能を向上させる別のアジュバントを有していてもよい。

抗原とアジュバントの割合は、その両方が有効量で配合されるように広範囲にわたって変化することができる。都合よくは、０．２μｇ／ｍｌないし２００μｇ／ｍｌの範囲にある、好ましくは５μｇ／ｍｌないし５０μｇ／ｍｌの、最も好ましくは約１５μｇ／ｍｌの最終濃度の抗原を含むようにワクチンを処方する。
処方した後、そのワクチンを滅菌容器に入れ、次にそれを密封し、低温で、例えば４０℃で貯蔵してもよく、あるいは凍結乾燥させてもよい。凍結乾燥は、安定した形態で長期間貯蔵することができる。

ワクチンは、通常、例えば、経皮的または筋肉内のいずれかで注射することにより、非経口的に投与される。他の投与経路に適する別の処方物として坐剤、ある場合には、経口処方物が挙げられる。坐剤の場合、伝統的な結合剤および担体として、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが挙げられ；かかる坐剤は、活性成分を０．５％ないし１０％、好ましくは１％ないし２％の範囲にて含有する混合物より形成してもよい。経口処方物は、例えば、医薬品階級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどそのように一般的に使用される成分を有していてもよい。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性処方または散剤の形態を取り、１０％ないし９５％の、好ましくは２５％ないし７０％の活性成分を含有する。ワクチン組成物を凍結乾燥させる場合、その凍結乾燥させた物質を投与前に、例えば、懸濁液として復元させてもよい。復元は緩衝液にて行うことが好ましい。

患者に経口投与するためのカプセル、錠剤およびピルは、例えば、オイドラギット「Ｓ」、オイドラギット「Ｌ」、セルロースアセテート、セルロースアセテートフタレートまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースを有してなる腸溶性コーティング剤で被覆されていてもよい。
本発明で用いられる抗原は、中性のまたは塩の形態のワクチンに処方してもよい。医薬上許容される塩は酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基で形成される）および、例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸、あるいは酢酸、蓚酸、酒石酸およびマレイン酸などの有機酸で形成される酸付加塩を包含する。遊離カルボキシル基で形成される塩もまた、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジンおよびプロカインのような有機塩基から誘導してもよい。

ワクチンの投与量
ワクチンは投与処方と融和する方法にて、および予防的および／または治療的に効果的であるような用量にて投与される。投与すべき量は、一般に、１投与当たり抗原５μｇないし２５０μｇの範囲にあり、治療すべき対象、対象の免疫系の抗体の合成能および所望の保護度に依存する。好ましい範囲は１投与当たり約２０μｇから約４０μｇである。
適当な用量は約０．５ｍｌである。したがって、筋肉内注射の用量は、例えば、２０μｇの免疫原を０．５％アジュバントと混合して含む０．５ｍｌからなる。
投与するのに必要な活性成分の正確な量は顧問医の判断によって左右され、個々の対象に特有なものである。

ワクチンは一回の投与計画で投与してもよく、あるいは好ましくは複数の投与計画で投与してもよい。複数の投与計画は、ワクチン処置の一次投与を１−１０回の個々の用量で行い、つづいてその後、別の投与量を免疫応答を維持および／または強化するのに必要な間隔、例えば、第二投与については１ないし４ヶ月で投与し、必要ならば、その後の投与を数ヶ月後に行うものである。その投与方法はまた、少なくともある程度は、個体の要求により決定され、顧問医の判断に依存するであろう。
加えて、抗原を含むワクチンは、他の免疫調節剤、例えば、免疫グロブリンと一緒に投与してもよい。

本発明の処方物を用いる抗体の調製
本発明の組成物は、さらにアジュバントを使用することなく、直接的に免疫原として使用し、抗血清およびモノクローナル抗体を生成してもよい。
本発明は、このように、抗原特異的免疫グロブリン産生の誘発方法であって、
ａ）動物を本発明の処方物で免疫化する工程；および
ｂ）その動物の血清から該組成物の一連の抗原に特異的な免疫グロブリンを回収する工程
からなる方法を提供する。
抗体産生に用いられる動物は、一般に、その目的に利用されるいずれの動物、特に哺乳動物であってもよい。特に、指示される動物は、マウス、ラット、モルモットおよびウサギである。

免疫処理は確立された技法に従って行う（「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（１９８８） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ、米国を参照のこと）。精製された組成物（約１ｍｇ）をウサギに注射した。０．５ｍｇの組成物のブースター注射を最初の注射から４週間後に行った。抗体をウサギの血清から単離し、反応性について試験する。選択された抗原との選択的結合能を有する抗体はこの方法により得られる。
さらに詳しくは、抗原を有してなる本発明の処方物を用い、ポリクローナルおよびモノクローナルの両方の抗体を産生することができる。ポリクローナル抗体が望ましい場合、選択された動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）を免疫化する。その免疫化された動物からの血清を集め、公知技法に従って試験する。血清が他の抗原に対するポリクローナル抗体を含んでいる場合、そのポリクローナル抗体はイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。ポリクローナル抗血清を産生し、かつ処理する方法は、当該分野において公知である。

本発明にて用いた抗原に拮抗するモノクローナル抗体もまた当業者であれば容易に産生することができる。ハイブリドーマを用いてモノクローナル抗体を産生する一般的方法が周知である。不変的な抗体産生細胞系は、細胞融合により、またＢリンパ球の癌遺伝子ＤＮＡとの直接形質転換あるいはエプステイン−バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルスとのトランスフェクションなどの他の方法によっても創製することができる。抗原に拮抗して産生されたモノクローナル抗体のパネルを種々の特性について、すなわちイソタイプおよびエピトープ結合性についてスクリーニングすることができる。
別法として、例えば、ファージがそのコート表面に多種の補体決定領域（ＣＤＲ）を有するｓｃＦｖフラグメントを発現する、ファージ提示ライブラリーをスクリーニングすることが挙げられる。この方法は当該分野にて周知である。

抗原に拮抗する、モノクローナルおよびポリクローナルの両方の抗体は、診断において特に有用であり、中和している抗体は受動免疫療法にて有用である。特に、モノクローナル抗体を用いて、抗−イディオタイプ抗体を惹起してもよい。抗−イディオタイプ抗体は、それに対する保護が望まれる感染物質の抗原の「内部イメージ」を担持している免疫グロブリンである。
抗−イディオタイプ抗体を惹起する方法は当該分野にて知られている。これらの抗−イディオタイプ抗体もまた、治療ならびに抗原の免疫原領域を解明するのに有用である。
本発明の目的のために、「抗体」なる語は、特記しない限り、標的とする抗原に対する結合活性を保持している全抗体のフラグメントを包含する。かかるフラグメントは、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）_２フラグメントならびに単鎖抗体（ｓｃＦｖ）を包含する。さらには、抗体およびそのフラグメントは、例えばＥＰ−Ａ−２３９４００に記載される、ヒト化抗体であってもよい。
本発明を以下の実施例を用いて説明するが、それは単なる説明であって本発明を限定するものではない。

参考例
調製例１
アレルゲン実験として８ｍｇのオボアルブミン（ＸＯＡ）を混合することで２０ｍｌのＥＶＡＮＳ溶液に溶かした。次に、６．９ｍｌのリン酸緩衝液を混合しながら添加した。溶液を磁気攪拌棒を含む１００ｍｌのビーカーに入れる。磁気攪拌器を用いて混合しながら、２４％ｗ／ｖのチロシンを含有する６．９ｍｌの３．２Ｎ水酸化ナトリウムおよび６．９ｍｌの３．８Ｎ塩酸を５分間にわたって同時に滴下し、沈降物を形成させた。混合物をさらに５分間攪拌し、ついで５０ｍｌの遠心管に移し、２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離に付した。遠心分離した後、上澄をデカンテーションし、ペレット状の沈降物を４０ｍｌのリン酸緩衝液に再び懸濁させた。その混合物を２５００ｒｐｍで５分間遠心分離に付した。遠心分離した後、上澄をデカンテーションし、沈降物を４０ｍｌのリン酸緩衝液に再び懸濁させた。その混合物を２５００ｒｐｍで５分間遠心分離に付した。遠心分離した後、上澄をデカンテーションし、ペレット状の沈降物を、０．４％ｖ／ｖグリセロールおよび０．０１％ｗ／ｖチメロサールを保存料として含有する、４０ｍｌのリン酸緩衝セイライン（ｐＨ７．２）に再び懸濁させた。その最終生成物は約４０ｍｇ／ｍｌのチロシン吸着物を含有した。ＸＯＡが１００％チロシン吸着物に結合すると仮定すると、ＸＯＡはその最終生成物中に２００μｇ／ｍｌで存在した。必要となるまでそのＸＯＡチロシン吸着物を４℃で貯蔵した。

調製例２
１，２−ジパルミトイル−ＳＮ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）の無水エタノール中４ｍｇ／ｍｌ溶液を調製した。１．０ｍｇのＭＰＬ（登録商標）−ＴＥＡ（トリエチルアミン）塩を可溶化させるのに、２７μｌのＤＰＰＣを加えてＭＰＬ（登録商標）を溶かした。ＭＰＬ（登録商標）は上記したように調製してもよい。窒素流を緩やかにそのバイアルに流すことでエタノールを除去した。次に、乾燥ＭＰＬ（登録商標）／ＤＰＰＣ混合物中のＭＰＬ（登録商標）１ｍｇに対して、１．０ｍｌの発熱物質不含注射用水を加えた。透明になるまで、その溶液をソニケーター浴中、６０−７０℃で超音波処理した。ついで、ＭＰＬ（登録商標）／ＤＰＰＣ溶液をＳＦＣＡ２９０−４５２０Ｎａｌｇｅｎｅ０．２μｍフィルターを介して濾過することで濾過滅菌した。そのＭＰＬ（登録商標）／ＤＰＰＣ溶液を１．０ｍｇ／ｍｌで発熱物質除去バイアルに無菌分配し、ＭＰＬ（登録商標）−ＡＦ（DPPCに溶かしたＭＰＬ（登録商標））とラベルし、４℃で貯蔵した。

生物学的活性
マウスにおけるＴＨ１誘発活性はＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ抗体の産生と等しく、ＴＨ２誘発活性はＩｇＧ１抗体およびＩｇＥ抗体の産生と同等であると考えることができる。
そこで、例えば、マウスにて実験を行い、ニワトリの卵より由来の周知のアレルゲンである、オボアルブミン（ＸＯＡ）に対するアレルゲン特異的抗体の特性を測定した。ＭＰＬ＋ＸＯＡ＋チロシンを有してなる処方物は、ＭＰＬ＋ＸＯＡ、ＸＯＡ＋チロシンまたはＸＯＡ単独の場合よりもより優れた抗体特性を刺激した。
一群８匹の６−８週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスに、以下のワクチンの一を０．２ｍｌで鼠蹊部に皮下注射した。

ＸＯＡ＋チロシン
前記した調製例１にて調製したＸＯＡチロシン吸着物を、注射する３０分以内に等容量のリン酸緩衝セイラインで希釈した。
ＸＯＡ＋チロシン＋ＭＰＬ
前記した調製例１にて調製したＸＯＡチロシン吸着物を、注射する３０分以内に等容量のリン酸緩衝セイライン中５００μｇ／ｍｌのＭＰＬ（登録商標）−ＡＦで希釈した。
ＸＯＡ＋ＭＰＬ
ＸＯＡを２００μｇ／ｍｌでリン酸緩衝セイラインに溶かし、注射する３０分以内に等容量のリン酸緩衝セイライン中５００μｇ／ｍｌのＭＰＬ（登録商標）−ＡＦで希釈した。
ＸＯＡ単独
ＸＯＡを２００μｇ／ｍｌでリン酸緩衝セイラインに溶かし、等容量のリン酸緩衝セイラインで希釈した。

２１日後、４群のマウスに新たに調製したワクチン０．２ｍｌでブースター処理した。ブースター処理した１４日後、マウスを放血させて血清を分離し、アッセイするまでー７０℃で貯蔵した。
その血清を、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．（米国、ＡＬ、バーミンガム）より入手し、製造業者の指示に従って使用される、西洋ワサビ接合ヤギ抗−マウスＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２ａおよびＩｇＧ_２ｂ抗体を用いる通常のＥＬＩＳＡ法によりアッセイした。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ力価は、Ａ_４９０で＞０．１ＯＤユニットの読みが得られる相互の血清希釈度を意味する。
血清ＩｇＥレベルを、抗−ＩｇＥ捕獲ＥＬＩＳＡを用い、つづいてビオチニル化オボアルブミンプローブを用いて測定した。西洋ワサビ接合ストレパビジン調製物を添加した後の結合を測定した。結果をＡ_４９０でのＯＤユニットとして報告する。

結果
特に重要なことは、アレルゲン＋チロシン＋ＭＰＬの組み合わせが、他の組み合わせほど抗原特異的ＩｇＥ抗体を誘発しないことである。さらには、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂのＩｇＧ１抗体に対する割合は大きく、初めの２つの抗体で最高レベルのイソタイプが、他のいずれの群のマウスよりも抗原＋チロシン＋ＭＰＬを付与したマウス実験で見られることとも一致する。これはこの群では他の群のマウスにて誘発される割合と比較してＴＨ１細胞誘発のＴＨ２細胞誘発に対する割合が大きいことを示すものである。

調製例Ａ
Ｂ型肝炎ウイルス抗原性を示す精製されたポリペプチド（かかるポリペプチドの製法に関する詳細はＥＰ−Ａ−０１８２４４２およびＷＯ９８／４４９４７に見ることができる）の中和溶液に、ｐＨ７±１のリン酸緩衝溶液を添加する。塩酸中の１倍容量の１−チロシン（２４ｇのＬ−チロシンを１００ｍｌの３．８Ｍ塩酸に溶かして調製）および１倍容量の３．２Ｍ水酸化ナトリウムを同時に４倍容量の抗原溶液に激しく攪拌しながら添加することにより、抗原溶液をチロシンと一緒に共同沈降させる。こうして形成した懸濁液を遠心分離に付し、緩衝セイライン（ｐＨ６±１）で繰り返し洗浄する。

調製例Ｂ
ＸＯＡを肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原性を示すポリペプチドと置き換える以外、参考例の調製例１と同様にした。

調製例Ｃ
参考例の調製例２と同様にして行った。

生物学的活性
マウスにおけるＴＨ１誘発活性はＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ抗体の産生と等しく、ＴＨ２誘発活性はＩｇＧ１抗体およびＩｇＥ抗体の産生と同等であると考えることができる。
そこで、例えば、マウスにて実験を行い、周知のアレルゲンである、抗原（ＨＢＶ）に対する抗原特異的抗体の特性を測定した。ＭＰＬ＋ＨＢＶ＋チロシンを有してなる処方物は、ＭＰＬ＋ＨＢＶ、ＨＢＶ＋チロシンまたはＨＢＶ単独の場合よりもより優れた抗体特性を刺激した。
一群８匹の６−８週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスに、以下のワクチンの一を０．２ｍｌで鼠蹊部に皮下注射した。

ＨＢＶ＋チロシン
前記した調製例Ａにて調製したＨＢＶチロシン吸着物を、注射する３０分以内に等容量のリン酸緩衝セイラインで希釈した。
ＨＢＶ＋チロシン＋ＭＰＬ
前記した調製例Ａにて調製したＨＢＶチロシン吸着物を、注射する３０分以内に等容量のリン酸緩衝セイライン中５００μｇ／ｍｌのＭＰＬ（登録商標）−ＡＦで希釈した。
ＨＢＶ＋ＭＰＬ
ＨＢＶを２００μｇ／ｍｌでリン酸緩衝セイラインに溶かし、注射する３０分以内に等容量のリン酸緩衝セイライン中５００μｇ／ｍｌのＭＰＬ（登録商標）−ＡＦで希釈した。
ＨＢＶ単独
ＨＢＶを２００μｇ／ｍｌでリン酸緩衝セイラインに溶かし、等容量のリン酸緩衝セイラインで希釈した。

２１日後、４群のマウスに新たに調製したワクチン０．２ｍｌでブースター処理した。ブースター処理した１４日後、マウスを放血させて血清を分離し、アッセイするまでー７０℃で貯蔵した。その血清を、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．（米国、ＡＬ、バーミンガム）より入手し、製造業者の指示に従って使用される、西洋ワサビ接合ヤギ抗マウスＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２ａおよびＩｇＧ_２ｂ抗体を用いる通常のＥＬＩＳＡ法によりアッセイした。ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２ａおよびＩｇＧ_２ｂ力価は、Ａ_４９０で＞０．１ＯＤユニットの読みを与える相互の血清希釈度を意味する。血清ＩｇＥレベルを、抗−ＩｇＥ捕獲ＥＬＩＳＡを用い、つづいてビオチニル化オボアルブミンプローブを用いて測定した。西洋ワサビ接合ストレパビジン調製物を添加した後の結合を測定した。特に重要なことは、抗原＋チロシン＋ＭＰＬの組み合わせが、他の組み合わせほど抗原特異的ＩｇＥ抗体を誘発しないことである。さらには、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂのＩｇＧ１抗体に対する割合は大きく、初めの２つの抗体で最高レベルのイソタイプが、他のいずれの群のマウスよりも抗原＋チロシン＋ＭＰＬを付与したマウス実験で見られることとも一致する。これはこの群では他の群のマウスにて誘発される割合と比較してＴＨ１細胞誘発のＴＨ２細胞誘発に対する割合が大きいことを示すものである。
引用文献を出典明示により本明細書の一部とする。

Claims (14)

1. （Ａ）抗原；
   （Ｂ）ＴＨ１を誘発するアジュバント；および
   （Ｃ）貧水溶性アミノ酸またはその誘導体
   を有してなる組成物。
2. 抗原が細菌、ウイルスまたは新生物より誘導される請求項１記載の組成物。
3. 抗原が、抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有してなるポリペプチドまたはベクターの形態であり、そのポリヌクレオチドの発現を可能とする調節配列に機能的に連結している、請求項１または請求項２記載の組成物。
4. ＴＨ１を誘発するアジュバントがＭＰＬ、３−ＤＭＰＬまたはその誘導体もしくは塩である、前記した請求項のいずれか１つに記載の組成物。
5. 貧可溶性アミノ酸がチロシン、トリプトファンまたはその誘導体である、前記した請求項のいずれか１つに記載の組成物。
6. 医薬としての用途の前記した請求項のいずれか１つに記載の組成物。
7. 前記したいずれかの請求項に記載の組成物と、医薬上許容される担体、希釈体または賦形剤とを有してなる医薬組成物。
8. 請求項１ないし６のいずれか１つに記載の組成物と、医薬上許容される担体、希釈体または賦形剤とを有してなるワクチン組成物。
9. ヒトまたは動物における細菌もしくはウイルス感染または癌に対する罹病性を治療、予防または減少させる方法であって、ヒトまたは動物に、有効量の前記いずれかの請求項に記載の組成物を投与してなる方法。
10. 抗原を認識する抗体を産生するための方法における請求項１ないし８のいずれか１つに記載の組成物の使用。
11. 抗原を認識する抗体の産生方法であって、請求項１ないし８のいずれか１つに記載の組成物を哺乳動物に投与してなる方法。
12. ヒトまたは動物における細菌もしくはウイルス感染または癌の治療法であって、ヒトまたは動物に請求項１０または１１の記載に従って製造した有効量の抗体を投与してなる方法。
13. 請求項１ないし６のいずれか１つに記載の組成物の製法でって、抗原およびＴＨ１を誘発するアジュバントの溶液を、貧可溶性アミノ酸またはその誘導体の強酸水溶液中溶液と混合し、その間にその溶液の混合液を中和し、それにより貧可溶性アミノ酸、抗原およびアジュバントを共同沈降させることを特徴とする方法。
14. さらに医薬上許容される担体、希釈体または賦形剤を添加してなる請求項１３記載の方法。