DE69934179T2

DE69934179T2 - Zusammensetzung enthaltend ein Antigen, ein TH-1 induzierendes Adjuvans und eine im Wasser schwer lösliche Aminosäure zur Verwendung in der Immunisierung

Info

Publication number: DE69934179T2
Application number: DE69934179T
Authority: DE
Inventors: Alan Worthing West Sussex Wheeler; Anthony Worthing West Sussex Berry
Original assignee: Allergy Therapeutics UK Ltd
Current assignee: Allergy Therapeutics UK Ltd
Priority date: 1998-09-21
Filing date: 1999-09-17
Publication date: 2007-04-19
Anticipated expiration: 2019-09-18
Also published as: US7815920B2; KR100642877B1; PT988862E; CA2282779C; GB2341801B; ATE346610T1; JP2010265330A; US20030007977A1; DK0988862T3; KR20000023273A; EP0988862A2; JP2000103745A; DE69934179D1; JP4743928B2; GB9922121D0; EP0988862B1; GB2341801A; AU4877799A; ES2277413T3; AU766251B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Formulierung insbesondere, jedoch nicht ausschließlich, zur Verwendung bei der Immunisierung.
Hintergrund der Erfindung
Das Immunsystem hat sich spezifisch entwickelt, um fremdes oder neues Material zu detektieren und aus einem Wirt zu eliminieren. Dieses Material kann viralen, bakteriellen oder parasitischen Ursprungs sein und kann entweder außerhalb oder innerhalb der Zellen des Wirts liegen, oder es kann neoplastischen Ursprungs sein.
Die Immunantwort auf ein Antigen erfolgt im allgemeinen entweder zellvermittelt (durch T-Zellen vermittelte Abtötung) oder humoral (Produktion von Antikörpern über die Erkennung eines ganzen Antigens). Das Muster der Zytokinproduktion durch TH-Zellen, die an einer Immunantwort beteiligt sind, kann einen Einfluß darauf haben, welche dieser Antwortarten vorherrscht: zellvermittelte Immunität (TH1) ist gekennzeichnet durch eine starke Produktion von IL-2 und IFNy, jedoch eine geringe Produktion von IL-4, wohingegen sich bei der humoralen Immunität (TH2) das Muster aus einer geringen Produktion von IL-2 und IFNy, jedoch einer starken Produktion von IL-4, IL-5 und IL-10 zusammensetzt. Da das Sekretionsmuster auf der Ebene des sekundären lymphoiden Organs oder der Zellen moduliert wird, kann die pharmakologische Manipulation des spezifischen TH-Zytokinmusters die Art und das Ausmaß der erzeugten Immunantwort beeinflussen.
Das TH1-TH2-Gleichgewicht bezieht sich auf die gegenseitige Umwandlung der beiden verschiedenen Formen von Helfer-T-Zellen. Die beiden Formen haben umfangreiche und gegensätzliche Auswirkungen auf das Immunsystem. Wenn eine Immunantwort TH1-Zellen begünstigt, steuern diese Zellen eine zelluläre Antwort, wohingegen TH2-Zellen eine von Antikörpern dominierte Antwort steuern. Der Antikörpertyp, der für einige allergische Reaktionen verantwortlich ist, wird durch TH2-Zellen induziert.
Impfungen stellen die am besten bekannte und erfolgreichste Anwendungsform immunologischer Grundsätze auf die menschliche Gesundheit dar. Damit ein Impfstoff eingebracht und angenommen werden kann, muß er natürlich wirksam sein, und die Wirksamkeit aller Impfstoffe wird von Zeit zu Zeit überprüft. Sie wird von vielen Faktoren beeinflußt. Ein wirksamer Impfstoff muß die richtige Art der Immunität induzieren, er muß bei Lagerung stabil sein und er muß eine ausreichende Immunogenität aufweisen. Insbesondere bei nicht-lebenden Impfstoffen ist es oft notwendig, ihre Immuno genität mit Hilfe eines Adjuvans zu steigern. Dies kann auch auf einige lebende, z.B. abgeschwächte, Impfstoffe zutreffen. Ein Adjuvans ist eine Substanz, die die Immunantwort auf ein Antigen verstärkt.
Während in den 20er Jahren durchgeführter Arbeiten zur Produktion tierischer Antiseren für die Humantherapie wurde herausgefunden, daß bestimmte Substanzen, besonders Aluminiumsalze, wenn sie zu einem Antigen zugegeben oder mit einem Antigen emulgiert werden, die Produktion von Antikörpern in hohem Maße steigern, d.h. sie wirken als Adjuvanzien. Aluminiumhydroxid wird beispielsweise mit Diphtherie- und Tetanustoxoiden noch immer weit verbreitet verwendet.
Die GB-A-1 377 074 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Copräzipitaten von Tyrosin mit einem darin dispergierten Allergen.
Die GB-A-1 492 973 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Copräzipitaten von Tyrosin mit einem darin dispergierten modifizierten Allergen. Das Allergen wurde durch Behandlung mit einem Mittel, wie Glutaraldehyd, welches die Bildung intramolekularer Verbindungen bewirkt und die Allergenität des Produkts im Vergleich zu dem unmodifizierten Allergen reduziert, modifiziert.
3-Des-O-acyliertes Monophosphoryllipid A ist aus der GB-A-2220211 (Ribi) bekannt. Chemisch betrachtet ist es ein Gemisch aus 3-des-O-acyliertem Monophosphoryllipid A mit 4, 5 oder 6 acylierten Ketten und wird von Ribi Immonochen Montana hergestellt. Eine bevorzugte Form von 3-des-O-acyliertem Monophosphoryllipid A ist in der internationalen Patentanmeldung Nr. 92/16556 offenbart.
Die internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 98/44947 beschreibt eine Formulierung zur Verwendung in der Desensibilisierungstherapie von Allergiepatienten, welche ein optional modifiziertes Allergen, Tyrosin und 3-des-O-acyliertes Monophosphoryllipid A umfaßt.
Es wurden beträchtliche Anstrengungen unternommen, um bessere Adjuvanzien insbesondere für T-Zell-vermittelte Antworten herzustellen, es soll jedoch betont werden, daß bislang nur wenige der in jüngerer Zeit entwickelten Adjuvanzien für den routinemäßigen Gebrauch am Menschen zugelassen wurden.
Es scheint, daß die Wirkung von Adjuvanzien hauptsächlich auf zwei Aktivitäten zurückzuführen ist: die Konzentration von Antigen an einer Stelle, an der ihm Lymphozyten ausgesetzt sind (die "Depot"-Wirkung), und die Induktion von Zytokinen, die die Lymphozytenfunktion regulieren. Neuere Mittel, wie Liposome und immunstimulierende Komplexe (ISCOMS) erzielen den gleichen Zweck, indem sichergestellt wird, daß darin eingefangene Antigene an Antigen präsentierende Zellen ausgeliefert werden. Es wird davon ausgegangen, daß bakterielle Produkte, wie die Zellwände von Mycobakterien, Endotoxin usw., wirken, indem sie die Bildung von Zytokinen stimulieren. Die Induktion von Zytokinen kann bei Patienten mit geschwächter Immunreaktion, die auf normale Impfstoffe oft nicht reagieren, von besonderem Nutzen sein. Man hofft, daß eine solche Induktion von Zytokinen auch beim Steuern der Immunantwort in der gewünschten Richtung, z.B. bei Erkrankungen, bei denen nur eine Reaktion von TH1- oder TH2-Zellen gewünscht wird, von Nutzen ist (Roitt et al., "Immunology", 4. Aufl.).
Wir liefern nun eine neue Antigenformulierung, die das TH1-TH2-Gleichgewicht zugunsten einer TH1-Antwort kippen kann. Die Formulierung ist in der Immuntherapie, insbesondere auf dem Gebiet der Impfstoffe, von Nutzen. Sie ist auch bei der Untersuchung von Immunantworten und bei der Produktion von Antikörpern von Nutzen.
Erklärungen der Erfindung
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, welche folgendes umfaßt:

(A) ein Antigen,
(B) ein TH1 induzierendes Adjuvans und
(C) eine schwer lösliche Aminosäure oder ein Derivat davon.

Vorzugsweise ist das Antigen von einem Bakterium oder einem Virus oder einem anderen pathogenen Organismus oder von einem Neoplasma oder aus dem Wissen über ihre antigenen Strukturen abgeleitet.
Vorzugsweise ist das TH1 induzierende Adjuvans MPL, 3-DMPL oder ein Derivat oder Salz davon.
Vorzugsweise ist die schwer lösliche Aminosäure Tyrosin, Tryptophan oder ein Derivat davon.
Die vorliegende Erfindung liefert auch eine Zusammensetzung zur Verwendung in der Medizin.
Vorzugsweise liegt die Zusammensetzung in Form eines Impfstoffs vor.
Die vorliegende Erfindung liefert auch die Verwendung der vorgenannten Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention einer bakteriellen oder viralen Infektion oder einer anderen Erkrankung, wie Krebs.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Immunglobulins, welches das Immunisieren eines Tieres mit einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfaßt.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, welches das Mischen einer Lösung eines Antigens und des TH1 induzierenden Adjuvans mit einer Lösung der schwer löslichen Aminosäure oder des Derivats davon in einer starken wäßrigen Säure bei gleichzeitigem Neutralisieren des Lösungsgemischs umfaßt, wodurch die schwer lösliche Aminosäure, das Antigen und das Adjuvans copräzipitiert werden. Dieses Verfahren kann weiterhin die Zugabe eines pharmazeutisch verträglichen Trägers, Verdünnungsmittels oder Hilfsstoffs umfassen.
Ausführliche Beschreibung
Verschiedene weitere bevorzugte Merkmale und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden nun anhand nicht beschränkender Beispiele beschrieben.
(A) Antigen
Ursprünglich wurde der Begriff "Antigen" für jedes Molekül verwendet, welches B-Zellen dazu brachte, einen spezifischen Antikörper zu produzieren. Nun kann der Begriff jedoch auch verwendet werden, um jedes Molekül zu bezeichnen, welches mittels der adaptiven Elemente der Immunantwort, d.h. durch B-Zellen oder T-Zellen oder beide, spezifisch erkannt werden kann. Somit ist ein Antigen ein Molekül, welches mit einem zuvor gebildeten Antikörper oder mit bestimmten Rezeptoren auf T- und B-Zellen reagiert. Wir schließen jedoch die traditionell als "Allergene" bekannten Stoffe, d.h. Mittel, wie Pollen oder Staub, die eine IgE-vermittelte Überempfindlichkeit hervorrufen, aus.
Eine Allergie ist eine Reaktion auf ein Umweltantigen (Allergen), die darauf zurückzuführen ist, daß ein bereits existierender IgE-Antikörper an Mastzellen angehängt ist. Durch Mastzellprodukte (Histamin usw.) wird eine unmittelbare Überempfindlichkeitsreaktion ausgelöst, die Asthma, Heuschnupfen, Serumkrankheit, systemische Anaphylaxie oder Kontaktdermatitis verursacht. Es gibt vier Typen von Überempfindlichkeitsreaktionen (Typen I, II, III und IV). Die ersten drei werden durch Antikörper vermittelt, die vierte wird hauptsächlich durch T-Zellen und Makrophagen vermittelt. Somit betrifft die vorliegende Erfindung nicht die Verwendung eines solchen "Umweltantigens".
Somit umfaßt das in der vorliegenden Erfindung verwendete "Antigen" kein "Allergen", das von irgendeiner Allergien auslösenden Substanz, wie Pollen (z.B. Pollen von Ambrosia oder Birke), Nahrungsmitteln, Insektengift, Schimmel, Tierhaaren oder Hausstaubmilben (D. farinae oder D. pteronyssinus), abgeleitet ist.
Die vorliegende Erfindung kann daher so betrachtet werden, daß sie Antigene betrifft, die oft mit einer zellulären, durch IgG2a oder IgG2b vermittelten Antwort anstelle einer durch IgE oder IgG1 vermittelten Antwort einhergehen.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Antigen ist vorzugsweise ein Immunogen, d.h. ein Antigen, welches Immunzellen so aktiviert, daß sie eine Immunantwort gegen es selbst erzeugen.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Formulierung zur Verwendung als ein Impfstoff, und das Antigen ist ein Antigen, welches in einem solchen Impfstoff von Nutzen ist.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Antigen kann jedes geeignete Antigen sein, das verfügbar ist oder wird.
Die Art des in einem Impfstoff verwendeten Antigens ist von vielen Faktoren abhängig. Im allgemeinen ist es umso besser, je mehr Antigene des Mikroorganismus in dem Impfstoff enthalten sind, und lebende Organismen sind tendenziell wirkungsvoller als abgetötete Organismen. Ausnahmen zu dieser Regel bilden Erkrankungen, bei denen ein Toxin für irgendeine pathogene Wirkung verantwortlich ist. In diesem Fall kann der Impfstoff auf dem Toxin oder Toxoid alleine basieren.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Antigen kann von jedem lebenden Organismus, intakten oder nicht-lebenden Organismen, subzellulären Fragmenten, Toxoiden, Antigenen auf Basis rekombinanter DNA oder Anti-Idiotypen oder synthetischen Antigenen abgeleitet sein. Das Antigen kann von unbeeinflußten oder abgeschwächten Organismen abgeleitet sein, und diese können virale oder bakterielle Organismen sein. Die Art des Antigens kann ein Kapselpolysaccharid, ein Oberflächenantigen oder ein internes Antigen sein. Wenn das Antigen auf rekombinanter DNA basiert, kann es aus einem klonierten und exprimierten Gen oder nackter DNA erhalten werden.
Das Antigen kann durch Umsetzung beispielsweise mit einem Vernetzungsmittel, wie Dialdehyd, spezieller Glutaraldehyd, modifiziert werden.
Mikroorganismen, gegen die Impfstoffe erhältlich sind oder für die nach Impfstoffen gesucht wird, umfassen beispielsweise Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Yersinia, Vibrio, Aeromonas, Pasteurella, Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella, Flavobacterium, Bordetella, Actinobacillus, Neisseria, Brucella, Haemophilus und Escherichia coli.
Bevorzugte Impfstoffe umfassen Vakzinia (gegen Pocken), Wühlmaus-Bazillus (gegen TB), Polio, Masern, Mumps, Röteln, Gelbfieber, Varicella-Zoster, BCG, Tollwut, Grippe, Hepatitis A, Fleckfieber, Keuchhusten, Typhus, Cholera, Pest, Pneumokokken, Meningokokken, Haemophilus influenzae, Hepatitis B, Hepatitis C, Tetanus und Diphtherie. Impfstoffe auf Toxinbasis umfassen Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Vibrio cholerae und Clostridium perfringens.
Weitere wichtige Erkrankungen, gegen die Impfstoffe von Nutzen sein können, umfassen: HIV, Herpes, Viren, Adenoviren, Rhinoviren, Staphylokokken, Streptokokken der Gruppe A, Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, Chlamydia, Candida, Pneumocystis, Malaria, Trypanosomiase, Chagas'sche Krankheit, Schistosomiasis und Onchocerciasis.
Das Vorhandensein von Tumorantigenen wurde ebenfalls gezeigt, und als Ergebnis ist das Konzept der Impfung gegen Krebs entstanden. Grundsätzlich können auch Befruchtung und Implantation gestört werden, indem Immunität gegen eine breite Vielfalt von Schwangerschafts- und anderen Fortpflanzungshormonen induziert wird.
(B) TH1 induzierendes Adjuvans
Mit "TH1 induzierendes Adjuvans" meinen wir ein Adjuvans, welches die TH1-Antwort auf ein Antigen verstärkt.
Die Wirksamkeit eines Adjuvans als ein TH1 induzierendes Adjuvans kann bestimmt werden, indem man das Profil der Antikörper bestimmt, die gegen ein Antigen gerichtet sind, welches aus der Verabreichung dieses Antigens in Impfstoffen, die außerdem die verschiedenen Adjuvanzien umfassen, resultiert.
Vorzugsweise ist das Adjuvans ein modifiziertes Lipopolysaccharid. Wie es in dem US-Patent Nr. 4,912,094 beschrieben ist, stellen enterobakterielle Lipopolysaccharide (LPS) ein starkes immunstimulierendes Mittel dar. Sie können jedoch auch schädliche und manchmal tödliche Antworten auslösen. Es ist nun bekannt, daß die mit LPS assoziierten endotoxischen Aktivitäten auf seine Lipid A-Komponente zurückzuführen sind. Dementsprechend verwendet die vorliegende Erfindung bevorzugter ein entgiftetes Derivat von Lipid A. Ribi ImmunoChem hat ein Derivat von Lipid A hergestellt, welches ursprünglich als verbessertes entgiftetes Endotoxin (RDE) bekannt war, welches nun jedoch als Monophosphoryllipid A (MPL) bekannt geworden ist. Wie es in dem US-Patent Nr. 4,912,094 beschrieben ist, wird MPL hergestellt, indem LPS oder Lipid A, erhalten aus heptosefreien Mutanten von Gram-negativen Bakterien (z.B. Salmonella sp.), in Mineralsäurelösungen mäßiger Stärke (z.B. 0,1 N HCl) für einen Zeitraum von ungefähr 30 Minuten rückflußgekocht wird. Diese Behandlung führt zu einem Verlust des Phosphatrests an Position 1 des Glucosamins am reduzierenden Ende. Zusätzlich wird während dieser Behandlung der Kohlenhydratkern von der 6'-Position des nicht-reduzierenden Glucosamins entfernt.
Vorzugsweise wird jedoch ein modifiziertes LPS oder Lipid A verwendet, wobei das entgiftete Lipid A den Kernrest an die 6'-Position des nicht-reduzierenden Glucosamins angehängt behält. Solche Derivate von LPS und Lipid A sind auch in dem US-Patent Nr. 4,912,094 beschrieben. Genauer gesagt offenbart das US-Patent Nr. 4,912,094 ein modifiziertes Lipopolysaccharid, welches durch das Verfahren des selektiven Entfernens lediglich des (3-Hydroxymyristinsäureacylrests von Lipopolysaccharid, welches mit dem Glucosamin am reduzierenden Ende an Position 3' des Lipopolysaccharids esterverknüpft ist, erhalten wird, welches umfaßt, daß das Lipopolysaccharid einer alkalischen Hydrolyse unterzogen wird. Ein solches des-O-acyliertes Monophosphoryllipid A (MPL), Diphosphoryllipid A (DPL) und LPS können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Somit verwendet die vorliegende Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform MPL, DPL oder LPS, bei denen die 3'-Position des Glucosamins am reduzierenden Ende des-O-acyliert ist. Diese Verbindungen sind als 3-DMPL, 3-DDPL bzw. 3-DLPS bekannt.
In dem US-Patent Nr. 4,987,237 werden Derivate von MPL mit der folgenden Formel
beschrieben, wobei R¹ und R² H sind, R³ gerade- oder verzweigtkettiger Kohlenwasserstoff, bestehend aus C, H und optional O, N und S, ist, die, falls mehr als ein Atom vorhanden ist, gleich oder verschieden sein können, wobei die Gesamtzahl an C-Atomen 60 nicht überschreitet und der Kreis einen MPL-Kem darstellt.
Alternativ hat das MPL-Derivat die Formel
wobei das durch
repräsentierte Segment des Derivats 2–60 C-Atome enthält, und wobei R³ gerade- oder verzweigtkettiger Kohlenwasserstoff, bestehend aus C, H und optional O, N und S, ist, die, falls mehr als ein Atom vorhanden ist, gleich oder verschieden sein können, und x mindestens 1 ist und jede ganze Zahl sein kann, so daß die Gesamtzahl an C-Atomen in allen x Segmenten 60 nicht überschreitet, und wobei die chemische Struktur jedes R³ in jedem solchen Segment gleich oder verschieden sein kann und wobei der Kreis einen MPL-Kem darstellt.
Alle solche Derivate oder Salze von LPS oder Lipid A, die verfügbar sind oder werden, können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Vorzugsweise sind die Derivate und Salze pharmazeutisch verträgliche Derivate und Salze.
Das TH1 induzierende Adjuvans kann vor der Verabreichung mit den anderen Komponenten der Zusammensetzung gemischt werden. Alternativ kann es während der Herstellung des Produkts zusammen mit den anderen Komponenten formuliert werden. Alternativ kann es an einer anderen Stelle oder zu einem anderen Zeitpunkt als die anderen Komponenten verabreicht werden. Die Verabreichung kann auf einer Reihe von Verabreichungswegen erfolgen.
(C) Schwer lösliche Aminosäure
Die Aminosäure muß in wäßriger Lösung schwer löslich sein, so daß das Adjuvans und das Antigen eine Immunantwort erzeugen können.
Die meisten Aminosäuren sind in Wasser nur schwer löslich, was auf die im Kristallgitter wirkenden starken intermolekularen Kräfte zurückzuführen ist. Ausnahmen bilden Glycin, Prolin, Lysin, Threonin, Cystein und Arginin, die alle in Wasser relativ löslich sind und nicht Teil der Erfindung sind. Die Wasserlöslichkeit von Aminosäuren ist in der nachstehenden Tabelle angegeben:
Vorzugsweise beträgt die Wasserlöslichkeit der in der Erfindung verwendeten Aminosäure etwa 1,1 oder weniger g/100 ml H₂O bei 25°C. Besonders bevorzugt sind Tyrosin oder Tryptophan; das unlöslichere Tyrosin wird bevorzugt. Derivate dieser Aminosäuren liegen ebenfalls innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung, wie beispielsweise Benzyl-O-octadecanoyl-L-tyrosin. Vorzugsweise ist das Derivat ein pharmazeutisch verträgliches Derivat.
Typischerweise ist das Antigen in der Aminosäure dispergiert und/oder an sie adsorbiert, z.B. mittels Copräzipitation bzw. Mischen.
Herstellung
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann durch Mischen einer wäßrigen Lösung des Antigens mit einer Lösung der Aminosäure in einer starken wäßrigen Säure, Neutralisieren des Lösungsgemischs, dadurch Copräzipitieren der Aminosäure und des Antigens, Mischen des Produkts mit dem TH1 induzierenden Adjuvans und optional Zugeben eines physiologisch verträglichen Verdünnungsmittels, Hilfsstoffs oder Trägers vor oder nach dem zuvor genannten Mischen hergestellt werden. Alternativ kann das TH1 induzierende Adjuvans mit dem Antigen copräzipitiert werden. Genauso wie das TH1 induzierende Adjuvans vor der Verabreichung mit den anderen Komponenten der Zusammensetzung gemischt oder copräzipitiert werden kann, so kann es auch an einer anderen Stelle und/oder zu einem anderen Zeitpunkt verabreicht werden als die anderen Komponenten.
Typischerweise wird eine wäßrige Lösung des Antigens, die vorzugsweise einen pH-Wert von 7 ± 1 hat und aus der Solvatisierung eines Feststoffs erhalten werden kann, mit einer Lösung der Aminosäure in einer starken wäßrigen Säure gemischt. Die starke Säure ist für gewöhnlich eine anorganische Säure, vorzugsweise Salzsäure. Die in dieser Stufe verwendete Antigenlösung enthält typischerweise zwischen 0,1 μg/ml und 1000μg/ml Antigenprotein, beispielsweise etwa 400 μg/ml. Das Verhältnis von Antigen:Aminosäure in dem Gemisch liegt typischerweise im Bereich von 1:4 × 10⁵ bis 1:1 × 10² m/m.
Das resultierende Lösungsgemisch aus Antigen und Aminosäure wird neutralisiert. Neutralisation bedeutet eine Einstellung des pH-Werts auf einen Wert im Bereich von 4,0 bis 7,5. In wünschenswerter Weise steigt der pH-Wert der Lösung während der Neutralisation zu keinem Zeitpunkt oder zumindest nicht für einen längeren Zeitraum auf einen Wert deutlich über 7,5 an. Diese Bedingung kann dadurch erfüllt werden, daß die Lösung kräftig gerührt wird und nur die erforderliche Menge an Base verwendet wird, falls dies gewünscht ist. In geeigneter Weise können verschiedene Puffermittel zu den Antigenlösungen zugegeben werden, um die Kontrolle des pH-Werts während der Stufen des Mischens und des Neutralisierens zu unterstützen.
Ein besonders geeignetes Verfahren zur Durchführung der Neutralisation besteht darin, daß man separate Ströme der Lösung von Aminosäure und neutralisierender Base in die Antigenlösung einfließen läßt. Die Fließgeschwindigkeiten der zugegebenen Lösungen werden über den pH-Status gesteuert, d.h. mit einer Ausrüstung, die den Fluß einer der oder beider Lösungen so reguliert, daß der pH-Wert des Reaktionsgemischs auf einem vorbestimmten Niveau im wesentlichen konstant bleibt. Wir haben herausgefunden, daß optimale Ergebnisse für gewöhnlich durch eine pH-Wert-Kontrolle im Bereich von 6,5 bis 7,5 erzielt werden, wenngleich der präzise pH-Wert der Beschaffenheit des Antigens entsprechend variieren kann.
Das Ergebnis der Neutralisation ist die unmittelbare Präzipitation der Aminosäure, in der und/oder auf der die Antigenlösung eingeschlossen und/oder adsorbiert wird. Nach der Präzipitation wird das Gemisch entweder unmittelbar gewaschen oder vor dem Waschen für einen Zeitraum von einigen Stunden bis zu einem Tag oder zwei Tagen stehen gelassen.
Das resultierende Präzipitat kann mittels Zentrifugation oder Filtration aus der Lösung entfernt und beispielsweise mit Phenol-Salzlösung gewaschen werden, ehe es, falls erforderlich, in einem physiologisch verträglichen Träger, Hilfsstoff oder Verdünnungsmittel resuspendiert wird.
MPL (oder ein anderes TH1 induzierendes Adjuvans), welches unter Verwendung des in Zubereitung 3 unten beschriebenen Verfahrens oder durch Bestrahlung mit Ultraschall gelöst wurde, kann vor seiner Zugabe zu Aminosäureadsorbaten von Antigenen auf verschiedene Weisen verdünnt werden. Die Herstellung von MPL erfolgt anfänglich bei einer Konzentration von typischerweise zwi schen 0,5 mg pro ml und 4 mg pro ml, beispielsweise 1 mg pro ml. Es kann dann auf eine Konzentration zwischen 500 μg/ml und 20 μg/ml, vorzugsweise 100 μg/ml, verdünnt werden. Diese Verdünnung kann in reinem Wasser oder in einer wäßrigen Glycerollösung, die zwischen 1 % und 4%, vorzugsweise 2% Glycerol enthält, durchgeführt werden. Solche Verdünnungen können dann zu einer Suspension des Aminosäureadsorbats, die wie oben beschrieben hergestellt wurde, zugegeben werden. Der Einfachheit halber kann die Konzentration der MPL-Lösung bzw. der Suspension des Aminosäureadsorbats so gewählt werden, daß von jeder ungefähr gleiche Volumina gemischt werden, um das Endprodukt für die Injektion zu erhalten. Ein typisches Endprodukt enthält etwa 100 μg/ml Antigen und etwa 250 μg/ml MPL.
Obwohl die Formulierung der Erfindung direkt verabreicht werden kann, wird die Formulierung somit vorzugsweise mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Hilfsstoff oder Verdünnungsmittel kombiniert, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zu erzeugen, die für den Gebrauch in der Human- oder Veterinärmedizin vorgesehen sein kann. Geeignete physiologisch verträgliche Träger und Verdünnungsmittel umfassen isotonische Salzlösungen, beispielsweise phosphatgepufferte Salzlösung, Phenol-Salzlösung und steriles Wasser. Die Zusammensetzungen können für die parenterale, intramuskuläre, intravenöse, subkutane, intraokulare oder transdermale Verabreichung formuliert werden.
Die hier beschriebenen Verabreichungswege und Dosierungen sind nur als Anleitung vorgesehen, da ein erfahrener Arzt leicht den optimalen Verabreichungsweg und die optimale Dosierung für einen bestimmten Patienten und einen bestimmten Zustand bestimmen kann.
Herstellung von Impfstoffen
Aus der Formulierung der vorliegenden Erfindung können Impfstoffe hergestellt werden. Die Herstellung von Impfstoffen, die ein Antigen als aktiven Inhaltsstoff enthalten, ist Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Typischerweise werden solche Impfstoffe als Injektionen, entweder als flüssige Lösungen oder als Suspensionen, hergestellt, es können aber auch feste Formen hergestellt werden, die zum Lösen oder Suspendieren in Flüssigkeit vor der Injektion geeignet sind. Die Zubereitung kann auch emulgiert werden, oder die Formulierung kann in Liposomen eingekapselt werden. Wie es oben erwähnt wurde, kann die Formulierung mit Trägern, Verdünnungsmitteln und Hilfsstoffen gemischt werden, die pharmazeutisch verträglich und mit der Formulierung kompatibel sind. Solche Hilfsstoffe sind beispielsweise Wasser, Salzlösung, Dextrose, Glycerol, Ethanol oder dergleichen und Kombinationen davon.
Zusätzlich kann der Impfstoff, falls dies gewünscht ist, geringe Mengen an Hilfssubstanzen, wie Benetzungs- oder Emulgiermittel, pH-Puffermittel und/oder weitere Adjuvanzien, die die Wirksamkeit des Impfstoffs verstärken, enthalten.
Das Verhältnis von Antigen und Adjuvans kann über einen breiten Bereich variiert werden, solange beide in wirksamen Mengen vorhanden sind. In geeigneter Weise werden die Impfstoffe so formuliert, daß sie eine Endkonzentration an Antigen im Bereich von 0,2 μg/ml bis 200 μg/ml, vorzugsweise 5 μg/ml bis 50 μg/ml, am meisten bevorzugt etwa 15 μg/ml, enthalten.
Nach der Formulierung kann der Impfstoff in einen sterilen Behälter gegeben werden, der dann dicht verschlossen und bei niedrigen Temperaturen, beispielsweise 40°C, gelagert wird, oder er kann gefriergetrocknet werden. Die Lyophilisierung erlaubt eine Langzeitlagerung in stabilisierter Form.
Die Impfstoffe werden herkömmlicherweise parenteral mittels Injektion, beispielsweise entweder subkutan oder intramuskulär, verabreicht. Zusätzliche Formulierungen, die für andere Verabreichungsmodi geeignet sind, umfassen Suppositorien und in einigen Fällen orale Formulierungen. Für Suppositorien können traditionelle Bindemittel und Träger beispielsweise Polyalkylenglycole oder Triglyceride umfassen; solche Suppositorien können aus Gemischen, die den aktiven Inhaltsstoff in einer Menge im Bereich von 0,5% bis 10%, vorzugsweise von 1 % bis 2% enthalten, gebildet werden. Orale Formulierungen umfassen normalerweise verwendete Hilfsstoffe, wie beispielsweise Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Zellulose, Magnesiumcarbonat und dergleichen in pharmazeutischer Güte. Diese Zusammensetzungen haben die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Formulierungen mit langsamer Freisetzung oder Pulvern und enthalten 10% bis 95%, vorzugsweise 25% bis 70% an aktivem Inhaltsstoff. Wenn die Impfstoffzusammensetzung lyophilisiert wird, kann das lyophilisierte Material vor der Verabreichung rekonstituiert werden, z.B. als eine Suspension. Die Rekonstitution findet vorzugsweise in Puffer statt.
Kapseln, Tabletten und Pillen für die orale Verabreichung an einen Patienten können mit einer magensaftresistenten Beschichtung versehen werden, die beispielsweise Eudragit "S", Eudragit "L", Zelluloseacetat, Zelluloseacetatphthalat oder Hydroxypropylmethylzellulose umfaßt.
Die in der Erfindung verwendeten Antigene können in neutraler Form oder in Form von Salzen in den Impfstoff formuliert werden. Pharmazeutisch verträgliche Salze umfassen die Säureadditionssalze (gebildet mit freien Aminogruppen des Peptids), die mit anorganischen Säuren, wie beispielsweise Salz- oder Phosphorsäuren, oder organischen Säuren, wie Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure und Maleinsäure, gebildet werden. Mit den freien Carboxylgruppen gebildete Salze können auch von anorganischen Basen, wie beispielsweise Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium oder Eisenhydroxiden, und organischen Basen, wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin und Procain, abgeleitet sein.
Dosierung und Verabreichung von Impfstoffen
Die Impfstoffe werden in einer Weise, die mit der Dosierungsformulierung kompatibel ist, und in einer prophylaktisch und/oder therapeutisch wirksamen Menge verabreicht. Die zu verabreichende Menge, die im allgemeinen im Bereich von 5 μg bis 250 μg Antigen pro Dosis liegt, ist abhängig von dem zu behandelnden Subjekt, von der Fähigkeit des Immunsystems des Subjekts zur Synthese von Antikörpern und von dem gewünschten Grad der Schutzwirkung. Ein bevorzugter Bereich beträgt etwa 20 μg bis etwa 40 μg pro Dosis.
Eine geeignete Dosisgröße ist etwa 0,5 ml. Dementsprechend umfaßt eine Dosis für die intramuskuläre Injektion beispielsweise 0,5 ml, enthaltend 20 μg Immunogen im Gemisch mit 0,5% Adjuvans.
Die genauen Mengen an aktivem Inhaltsstoff, die für die Verabreichung erforderlich sind, können von der Beurteilung durch den Arzt abhängen und sind für jedes Subjekt besonders.
Der Impfstoff kann in einem Einzeldosisregime oder bevorzugt in einem Mehrfachdosisregime verabreicht werden. Ein Mehrfachdosisregime ist ein Regime, bei dem ein erster Impfdurchgang mit 1–10 separaten Dosen durchgeführt werden kann, gefolgt von weiteren Dosen, die in anschließenden Zeitintervallen verabreicht werden, wie es erforderlich ist, um die Immunantwort aufrechtzuerhalten und zu verstärken, beispielsweise in Zeitintervallen von 1 bis 4 Monaten für eine zweite Dosis und notwendigenfalls einer weiteren Dosis bzw. weiteren Dosen nach mehreren Monaten. Das Dosisregime bestimmt sich zumindest teilweise auch aus den Bedürfnissen des Individuums und ist abhängig von der Beurteilung durch den Arzt.
Zusätzlich kann der das Antigen (die Antigene) enthaltende Impfstoff zusammen mit anderen immunregulatorischen Mitteln, wie beispielsweise Immunglobulinen, verabreicht werden.
Herstellung von Antikörpern unter Verwendung der Formulierung der Erfindung
Die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können ohne die Verwendung weiterer Adjuvanzien direkt als Immunogene verwendet werden, um Antiseren und monoklonale Antikörper zu erzeugen. Die Erfindung liefert somit ein Verfahren zum Induzieren einer antigenspezifischen Produktion von Immunglobulin, welches die folgenden Stufen umfaßt:

a) Immunisieren eines Tieres mit einer Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung und
b) Gewinnen von Immunglobulin, welches für eine Region des Antigens aus der Zusammensetzung spezifisch ist, aus dem Serum des Tieres.

Die für die Antikörperproduktion verwendeten Tiere können alle Tiere sein, die normalerweise zu diesem Zweck eingesetzt werden, insbesondere Säuger. Besonders angezeigt sind Mäuse, Ratten, Meerschweinchen und Kaninchen.
Die Immunisierung wird gemäß etablierter Techniken durchgeführt (siehe "Antibodies, A Laboratory Manual", von E. Harlow und D. Lane (1988) Cold Spring Harbor, USA). Die gereinigte Zusammensetzung (etwa 1 mg) wurde einem Kaninchen injiziert. Eine Injektion von 0,5 mg der Zusammensetzung zur Auffrischung wurde 4 Wochen nach der ersten Injektion vorgenommen. Antikörper werden aus dem Kaninchenserum isoliert und auf ihre Reaktivität getestet. Durch dieses Verfahren werden Antikörper gewonnen, die selektiv an das gewählte Antigen binden können.
Spezieller kann die das Antigen umfassende Formulierung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper herzustellen. Wenn polyklonale Antikörper gewünscht sind, wird ein ausgewählter Säuger (z.B. Maus, Kaninchen, Ziege, Pferd usw.) immunisiert. Serum aus dem immunisierten Tier wird gesammelt und gemäß bekannter Verfahren behandelt. Wenn das Serum polyklonale Antikörper gegen andere Antigene enthält, können die polyklonalen Antikörper mittels Immunaffinitätschromatographie gereinigt werden. Techniken zur Herstellung und Verarbeitung polyklonaler Antiseren sind auf dem Gebiet bekannt.
Monoklonale Antikörper, die gegen die in der Erfindung verwendeten Antigene gerichtet sind, können von Fachleuten auf dem Gebiet ebenfalls leicht hergestellt werden. Das allgemeine Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper unter Verwendung von Hybridomen ist gut bekannt. Unsterbliche Antikörper produzierende Zellinien können mittels Zellfusion sowie auch durch andere Techniken, wie die direkte Transformation von B-Lymphozyten mit onkogener DNA oder Transfektion mit Epstein-Barr-Virus, erzeugt werden. Auswahlen von monoklonalen Antikörpern, die gegen Antigene erzeugt wurden, können hinsichtlich verschiedener Eigenschaften, beispielsweise hinsichtlich Isotyp- und Epitopaffinität, gescreent werden.
Eine alternative Technik umfaßt das Screenen von Phagen-Display-Bibliotheken, wobei beispielsweise die Phagen scFv-Fragmente auf der Oberfläche ihrer Hülle mit einer großen Vielzahl von komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) exprimieren. Diese Technik ist auf dem Gebiet gut bekannt.
Sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper, die gegen Antigene gerichtet sind, sind bei der Diagnose von besonderem Nutzen, und diejenigen mit neutralisierender Wirkung sind bei der passiven Immuntherapie von Nutzen. Insbesondere monoklonale Antikörper können verwendet werden, um anti-idiotypische Antikörper zu züchten. Anti-idiotypische Antikörper sind Immunglobuline, die ein "inneres Bild" des Antigens des infektiösen Mittels, gegen das eine Schutzwirkung gewünscht ist, enthalten.
Techniken zum Züchten anti-idiotypischer Antikörper sind auf dem Gebiet bekannt. Diese anti-idiotypischen Antikörper können auch zur Behandlung sowie zur Erforschung der immunogenen Regionen von Antigenen geeignet sein.
Für Zwecke dieser Erfindung umfaßt der Begriff "Antikörper", wenn es nicht anders angegeben ist, Fragmente von ganzen Antikörpern, die ihre Bindungsaktivität für ein Zielantigen beibehalten. Solche Fragmente umfassen Fv-, F(ab')- und F(ab')2-Fragmente sowie Einzelketten-Antikörper (scFv). Weiterhin können die Antikörper und Fragmente davon humanisierte Antikörper sein, wie sie beispielsweise in der EP-A-239400 beschrieben sind.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele beschrieben, die lediglich beispielhaft und nicht beschränkend sein sollen.
Vergleichsbeispiel 1
Zubereitung 1
Acht mg Ovalbumin (XOA) als Modellallergen wurden durch Mischen in 20 ml EVANS-Lösung gelöst. Als nächstes wurden 6,9 ml Phosphatpuffer unter Mischen zugegeben. Die Lösung wurde in ein 100 ml-Becherglas gegeben, welches eine Magnetrührstange enthielt. Während des Mischens unter Verwendung eines Magnetrührers wurden 6,9 ml 3,2 N NaOH und 6,9 ml 3,8 N HCl, enthaltend 24% m/V Tyrosin, gleichzeitig über einen Zeitraum von 5 Minuten tropfenweise zugegeben, um ein Präzipitat zu bilden. Das Gemisch wurde für weitere 5 Minuten gerührt und dann in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen überführt und für 10 Minuten bei 2500 U.p.M. zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand dekantiert, und das pelletierte Präzipitat wurde in 40 ml Phosphatpuffer resuspendiert. Das Gemisch wurde für 5 Minuten bei 2500 U.p.M. zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand zentrifugiert, und das Präzipitat wurde in 40 ml Phosphatpuffer resuspendiert. Das Gemisch wurde für 5 Minuten bei 2500 U.p.M. zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand dekantiert, und das pelletierte Präzipitat wurde in 40 ml phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,2, enthaltend 0,4% V/V Glycerol und 0,01 % m/V Thimerosal als Konservierungsmittel, resuspendiert. Das Endprodukt enthielt ungefähr 40 mg/ml Tyrosinadsorbat. Unter der Annahme einer 100%-igen Bindung von XOA an das Tyrosinadsorbat lag das XOA in einer Menge von 200 μg/ml in dem Endprodukt vor. Das XOA-Tyrosin-Adsorbat wurde bei 4°C bis zum Gebrauch gelagert.
Zubereitung 2
Eine 4 mg/ml-Lösung von 1,2-Dipalmitoyl-SN-glycero-3-phosphocholin (DPPC) in absolutem Ethanol wurde hergestellt. Für jedes 1,0 mg an zu lösendem MPL^®-TEA-(Triethylamin) Salz wurden 27 μl DPPC zugegeben, um das MPL^® zu lösen. MPL kann wie oben beschrieben hergestellt werden. Der Ethanol wurde durch sanftes Einblasen eines N₂-Stroms in das Glasfläschchen entfernt. Als nächstes wurde 1,0 ml pyrogenfreies Wasser für die Injektion für jedes mg MPL^® in dem trockenen MPL^®/DPPC-Gemisch zugegeben. Die Lösung wurde in einem Ultraschallbad bei 60–70°C mit Ultraschall bestrahlt, bis sie klar war. Die MPL^®/DPPC-Lösung wurde dann mittels Filtration durch einen SFCA 290-4520 Nalgene 0,2 μm-Filter sterilfiltriert. Die MPL^®/DPPC-Lösung wurde in einer Menge von 1,0 mg/ml in entpyrogenisierte Glasfläschchen, die mit MPL^®-AF (MPL, gelöst in dem oberflächenaktiven Stoff DPPC) beschriftet waren, steril abgezogen und bei 4°C gelagert.
Biologische Aktivität
Die TH1 induzierende Aktivität in Mäusen kann mit der Produktion von IgG2a- und IgG2b-Antikörpern gleichgesetzt werden, und die TH2 induzierende Aktivität kann mit der Produktion von IgG1-Antikörpern und IgE-Antikörpern gleichgesetzt werden.
Daher wurde beispielsweise ein Experiment in Mäusen durchgeführt, um die Profile der allergenspezifischen Antikörper gegen ein beispielhaftes Ovalbumin (XOA), welches ein gut bekanntes, von Hühnereiern abgeleitetes Allergen ist, zu zeigen. Es wurde bestätigt, daß eine aus MPL + XOA + Tyrosin bestehende Formulierung ein vorteilhafteres Antikörperprofil stimulierte als MPL + XOA, XOA + Tyrosin oder XOA alleine.
Gruppen von 8 weiblichen BALB/c-Mäusen im Alter von 6–8 Wochen wurden in der Leistengegend subkutan 0,2 ml eines der nachfolgenden Impfstoffe injiziert.
XOA + Tyrosin
Das in Zubereitung 1 oben hergestellte XOA-Tyrosin-Adsorbat wurde innerhalb von 30 Minuten vor der Injektion mit einem gleichen Volumen phosphatgepufferter Salzlösung verdünnt.
XOA + Tyrosin + MPL
Das in Zubereitung 1 oben hergestellte XOA-Tyrosin-Adsorbat wurde innerhalb von 30 Minuten vor der Injektion mit einem gleichen Volumen MPL^®-AF in einer Menge von 500 μg/ml in phosphatgepufferter Salzlösung verdünnt.
XOA + MPL
XOA wurde innerhalb von 30 Minuten vor der Injektion in einer Menge von 200 μg/ml in phosphatgepufferter Salzlösung gelöst und mit einem gleichen Volumen MPL^®-AF in einer Menge von 500 μg/ml in phosphatgepufferter Salzlösung verdünnt.
XOA alleine XOA wurde in einer Menge von 200 μg/ml in phosphatgepufferter Salzlösung gelöst und mit einem gleichen Volumen phosphatgepufferter Salzlösung verdünnt.
Einundzwanzig Tage später erhielten die vier Gruppen von Mäusen eine Auffrischimpfung mit 0,2 ml frisch hergestellten Impfstoffen. Vierzehn Tage nach der Auffrischimpfung wurde den Mäusen Blut abgenommen, und die Seren wurden abgetrennt und bis zum Testen bei –70°C gelagert.
Die Seren wurden mittels konventioneller ELISA-Technik unter Verwendung von mit Meerrettichperoxidase konjugierten Ziege-Anti-Maus-IgG₁-, -IgG_2a- und IgG_2b-Antikörpern, gekauft von Southern Biotechnology Inc. (Birmingham, AL, USA) und verwendet gemäß der Anleitung des Herstellers, getestet. Die IgG1-, IgG2a- und IgG2b-Titer repräsentieren die reziproke Serumverdünnung, die einen Auslesewert von > 0,1 OD-Einheiten bei A₄₉₀ liefert.
Die Mengen von Serum-IgE wurden unter Verwendung eines Anti-IgE-Einfang-ELISA, gefolgt von der Verwendung einer biotinylierten Ovalbuminsonde, gemessen. Die Bindung wurde nach der Zugabe einer mit Meerrettichperoxidase konjugierten Streptavidinzubereitung gemessen. Die Ergebnisse sind als OD-Einheiten bei A₄₉₀ angegeben.
Von besonderer Bedeutung ist die Tatsache, daß die Kombination von Allergen + Tyrosin + MPL weniger antigenspezifische IgE-Antikörper induziert als die anderen Kombinationen. Weiterhin ist das Verhältnis von IgG2a- oder IgG2b-Antikörpern zu IgG1-Antikörpern konsistent mit den größten Mengen der beiden vorherigen Antikörperisotypen, die in dem Experiment in den Mäusen, die Antigen + Tyrosin + MPL erhielten, zu beobachten waren, und größer als in irgendeiner anderen Gruppe von Mäusen. Dies ist ein Hinweis auf ein besseres Verhältnis der TH1-Zell-Induktion gegenüber der TH2-Zell-Induktion in dieser Gruppe im Vergleich zu demjenigen, die in den anderen Gruppen von Mäusen induziert wurde.
Beispiele gemäß der vorliegenden Erfindung
Zubereitung A
Zu einer neutralen Lösung von gereinigtem Polypeptid, welches eine Hepatitis B-Virus-Antigenität zeigt (Einzelheiten darüber, wie ein solches Polypeptid herzustellen ist, sind in der EP-A-0 182 442 und in der WO 98/44947 zu finden), wird Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7 ± 1 zugegeben. Die Antigenlösung wird durch die gleichzeitige Zugabe eines Volumens 1-Tyrosin in HCl (hergestellt durch Lösen von 24 g L-Tyrosin auf 100 ml mit 3,8 M HCl) und eines Volumens 3,2 M NaOH zu vier Volumen Antigenlösung unter kräftigem Schütteln mit Tyrosin copräzipitiert. Die so gebildete Suspension wurde zentrifugiert und wiederholt mit gepufferter Salzlösung bei einem pH-Wert von 6 ± 1 gewaschen.
Zubereitung B
Wie Zubereitung 1 des Vergleichsbeispiels, mit der Ausnahme, daß XOA durch ein Polypeptid ersetzt wird, welches Hepatitisvirus-(HBV-)Antigenität zeigt.
Zubereitung C
Siehe Zubereitung 2 des Vergleichsbeispiels.
Biologische Aktivität
Die TH1 induzierende Aktivität in Mäusen kann mit der Produktion von IgG2a- und IgG2b-Antikörpern gleichgesetzt werden, und die TH2 induzierende Aktivität kann mit der Produktion von IgG1-Antikörpern und IgE-Antikörpern gleichgesetzt werden.
Daher wird beispielsweise ein Experiment in Mäusen durchgeführt, um die Profile der antigenspezifischen Antikörper gegen ein beispielhaftes Antigen (HBV), welches ein gut bekanntes Antigen ist, zu zeigen. Es wird bestätigt, daß eine aus MPL + HBV + Tyrosin bestehende Formulierung ein vorteilhafteres Antikörperprofil stimulierte als MPL + HBV, HBV + Tyrosin oder HBV alleine.
Gruppen von 8 weiblichen BALB/c-Mäusen im Alter von 6–8 Wochen wurden in der Leistengegend subkutan 0,2 ml eines der folgenden Impfstoffe injiziert.
HBV + Tyrosin
Das in Zubereitung A oben hergestellte HBV-Tyrosin-Adsorbat wurde innerhalb von 30 Minuten vor der Injektion mit einem gleichen Volumen phosphatgepufferter Salzlösung verdünnt.
HBV + Tyrosin + MPL
Das in Zubereitung A oben hergestellte HBV-Tyrosin-Adsorbat wurde innerhalb von 30 Minuten vor der Injektion mit einem gleichen Volumen MPL^®-AF in einer Menge von 500 μg/ml in phosphatgepufferter Salzlösung verdünnt.
HBV + MPL
HBV wurde innerhalb von 30 Minuten vor der Injektion in einer Menge von 200 μg/ml in phosphatgepufferter Salzlösung gelöst und mit einem gleichen Volumen von MPL^®-AF in einer Menge von 500 μg/ml in phosphatgepufferter Salzlösung verdünnt.
HBV alleine
HBV wurde in einer Menge von 200 μg/ml in phosphatgepufferter Salzlösung gelöst und mit einem gleichen Volumen phosphatgepufferter Salzlösung verdünnt.
Einundzwanzig Tage später erhalten die vier Gruppen von Mäusen eine Auffrischimpfung mit 0,2 ml frisch hergestellten Impfstoffen. Vierzehn Tage nach der Auffrischimpfung wird den Mäusen Blut abgenommen, und die Seren werden abgetrennt und bis zum Testen bei –70°C gelagert. Die Seren werden mittels herkömmlicher ELISA-Technik unter Verwendung von mit Meerrettichperoxidase konjugierten Ziege-Anti-Maus-IgG₁-, -IgG_2a-, und -IgG_2b-Antikörpern, gekauft von Southern Biotechnology Inc. (Birmingham, AL, USA) und verwendet gemäß der Anleitung des Herstellers, getestet. Die IgG₁-, IgG_2a und IgG_2b-Titer repräsentieren die reziproke Serumverdünnung, die einen Auslesewert von > 0,1 OD-Einheiten bei A₄₉₀ liefert. Die Mengen an Serum-IgE werden unter Verwendung eines Anti-IgE-Einfang-ELISA, gefolgt von der Verwendung einer biotinylierten Ovalbuminsonde, gemessen. Die Bindung wird nach der Zugabe einer mit Meerrettichperoxidase konjugierten Streptavidinzubereitung gemessen. Von besonderer Bedeutung ist die Tatsache, daß die Kombination von Antigen + Tyrosin + MPL möglicherweise weniger antigenspezifische IgE-Antikörper induziert als die anderen Kombinationen. Weiterhin ist möglicherweise das Verhältnis der IgG2a- oder IgG2b-Antikörper zu den IgG1-Antikörpern konsistent mit den größten Mengen der beiden erstgenannten Antikörperisotypen, die in dem Experiment in den Mäusen, die Antigen + Tyrosin + MPL erhalten, zu beobachten sind, und größer als in irgendeiner anderen Gruppe von Mäusen. Dies ist ein Hinweis auf ein besseres Verhältnis der TH1-Zell-Induktion gegenüber der TH2-Zell-Induktion in dieser Gruppe im Vergleich zu derjenigen, die in den anderen Gruppen von Mäusen induziert wird.

Claims

Zusammensetzung, welche folgendes umfaßt: (A) ein von einem Bakterium, einem Virus oder einem Neoplasma abgeleitetes Antigen, (B) ein TH1-induzierendes Adjuvans und (C) eine in Wasser schwer lösliche Aminosäure oder ein Derivat davon.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Antigen in der Form eines Polypeptids vorliegt oder in der Form eines Vektors, der ein Polynukleotid umfaßt, welches ein antigenisches Polypeptid codiert und funktionsfähig mit einer regulatorischen Sequenz, die die Expression des Polynukleotids gestattet, verknüpft ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das TH1-induzierende Adjuvans MPL, 3-DMPL oder ein Derivat davon ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die schwer lösliche Aminosäure Tyrosin, Tryptophan oder ein Derivat davon ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche zur Verwendung in der Medizin.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche die Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff umfaßt.
Impfstoffzusammensetzung, welche die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 6 oder 7, die für die parenterale Verabreichung ausgestaltet ist.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Verhinderung oder Reduzierung der Anfälligkeit gegenüber bakterieller oder viraler Infektion oder Krebs in einem Menschen oder einem Tier.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 bei einem Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, die das Antigen erkennen.
Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, die das Antigen erkennen, wobei das Verfahren das Verabreichen einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 an einen nicht-menschlichen Säuger umfaßt.
Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, welches das Mischen einer Lösung eines Antigens und des TH1-induzierenden Adjuvans mit einer Lösung der schwer löslichen Aminosäure oder des Derivats davon in einer starken wäßrigen Säure während des Neutralisierens des Gemischs von Lösungen umfaßt, wodurch die schwer lösliche Aminosäure, das Antigen und das Adjuvans copräzipitiert werden.
Verfahren nach Anspruch 12, welches weiterhin das Zugeben eines pharmazeutisch verträglichen Trägers, Verdünnungsmittels oder Hilfsstoffs umfaßt.